HU228401B1

HU228401B1 - Smallpox vaccine

Info

Publication number: HU228401B1
Application number: HU0303878A
Authority: HU
Inventors: Richard A Weltzin; Thomas P Monath
Original assignee: Acambis
Priority date: 2001-04-23
Filing date: 2002-04-23
Publication date: 2013-03-28
Also published as: US6723325B1; CZ20033184A3; JP2005503126A; EA007656B1; MA26270A1; IL158549A0; CN1527722A; MXPA03009711A; CZ305819B6; US20060153873A1; HUP0303878A3; EP1381389B1; JP4397591B2; KR20040063083A; WO2002085411A1; BR0209145A; US7115270B2; NZ529265A; ES2546612T3; CA2444747C

Description

A találmány himlő elleni vakcinálásra alkalmazható készítményekre vonatkozik,

ÁBlálBáELMMss·

A himlőt okozó varioia vírus az O/hopomras nemzetségbe tarozik, ide tartoznak a rostomhlrolö, tehénhimlő és a vaecinia vírusok· is. A fö varioia törzsek áhaí okozott betegségre jellemző az alacsony fertőző dózis (IS-IÖO viriotí), hosszú inkubációs periódus (átlagosan 12 nap), láz, szervi tünetek, gyors kifejlet gennyhólyagos állapotig, az érintettek 30%-áíg terjedő halálozás és a túlélők arcának forradásos volta. A betegség a légzőszervek útján emberről-emberre, kontaktussal (cseppek formájában) és esetleg aeroszol formájában terjed,

A XX. század első felében a himlő volt világszerte a morbiditás és mortalitás fö oka. Részben az állati vírushordozók hiányának köszönhetően azonban a vakolna (élő, legyengített vaecinia vírus) szisztematikus alkalmazása nagymértékben hatékony volt a betegség leküzdésében. 1967. és 1977. között a himlő megszüntetése érdekében végrehajtott globális program a természetes betegség eliminálását eredményezte [Fenner er of, WHO, Genf, 1460, oldal (1988)1. A himlő hiánya és a vaccmiával kapcsolatos káros hatások kockázata miatt megszüntették a gyermekek, kórházi és katonai személyzet ratin vakeinálását, és jelenleg csak a laboratóriumokban vaecinia és ezzel rokon vírusokkal dolgozó munkatársakat Immunizálják. így a világon a lakosság j elentős része nem rendelkezik himlő elleni Immunitással, A lakosság fennmaradó része csekély rezlduális immunitást mutat, mivel a vaecinia elleni immunitás a primer vafcelnálás után 5 évig, és az újravakolnál ás röáts 20 éviiéi rövidebb Ideig tart, A himlő megszűnése és a vakcinálás leállítása tehát a lakosság sebezhetőségét hozta, varioia vírus alkalmazásával végrehajtóit álcázott támadással vagy biológiai háborúval szemben. Ha egy ilyen esemény bekövetkezik, a járványos terjedésta. lakosság immungátja nem korlátozná (Láncét, 353:1539 (1999) szerkesztőségi cikk; Henderson, Őfcí'ewce 283:1279-1289 (1999); Henderson el al, J.A.M.A., 281:2127-2137 (1999)).

A. környezetbeli himlő megszüntetésének bizonytalan volta miatt szükséghelyzetekben való télhasználás céljára tartalékoltak vakcinákat. így például az Amerikai Egyesült Államokban eredetileg 155 ÖOÖ fiola, a Wyeth Laboratories cég által gyártott vakcinái (normál esetben 15,5 millió dózist) tartalékoltak a. Centers fór Disease Control and Preveafion (CSX, Atlanta, Georgia, USA) ellenőrzése mellett. A National Vaccines Advisory Cornmiítee 1999 januárjában tartott gyűléséit a CÍ)C beszámolt a nemzeti hunlövakeína-tár állapotáról. Ekkor a Wyeth által tartott 15,5 millió dózisból 3,4 millió esetén hiányzott a minőségellenőrzési vizsgálat, és 10,3 ntthio túl volt az utolsó kontroll vizsgálatkor meghatározott kiterjesztett lejárati időn, így 1,7 mill ió olyan dózis maradt, amely kielégítette a forgalomba közhatóság feltételeit (Lel>uc, Presentation to the National Vaccines Advisory Cotnraettes, Washington D.C., 1999. január 11-12.). A korlátozott ellátás mellett az a tény, hogy a. vakcina 100 dózist tartalmazó fiolákba vau csomagolva, csökkenti az eloszthatóságot és fokozza a lehetőségét annak, hogy szükséghelyzetben veszteségek keletkeznek.

Az HSA tartalékai mellett vakcina-készleteket (Elsiet, Elstree ta) tárolnak a National Instltote of Public iiealíh, Bilthoven, Hollandia intézetnél, továbbá más országok is rendelkeznek himlő-vakcina készletekkel, amelyek a. megszüntetés Idején 309 millió dózist tehettek ki Azonban a tárolási stabilitás terén jelentkező hasonló problémák ezeket a készleteket 50 millió dózis alá csökkentették {Henderson, Scmnce, 283:1279-1282 (I999)j.

99647-9259 Slúkov

A.taíáteány.róyidísgnertetése

A ttiláltewya! a vacclhlá vírus stabil törzsek biztosítjuk, melyeket olyas tenyésztett. sejtekből izoláltunk, amelyekbe» ötyvax® volt szaporítva, és amelyek olyan jellemzőket mutatnak, melyek alkalmassá teszik őket, hogy himlő elleni humán vakdnálásra használjuk, A találmánnyal az ilyen törzsek generálására, valamint a törzsek hímlo-iertozés: és betegség megelőzésére szolgáló módszereket biztosítunk.

Ennek megfelelően a találmánnyal egyrészt legyengíteti vaecisia vírus klónozott törzsét biztosítjuk, amelyet olyan, tenyésztett sejtekből izolálnak, amelybe» Dryvax® volt tenyésztve, és az említett törzs embernek adagolva, variola vírus elleni védő vagy terápiás immanválasz ítdukálására hatékony mennyiségben, emberre nézve kellően legyengített.

A klónozott törzsek lényegében véve ugyanolyan vlruleneiával és/vagy Ímmunogenítással rendelkezhetek, mint a Dryvax®. A vaeeínía vírust előnyösen lényegében véve ugyanolyan vagy annál nagyobb menysyiségbett állítjuk elő sejttenyészetekbe iuokulálva, mint a Dryvax®~t, és/vagy restrikciós esdonuklázokkal emésztve .fényegében véve ugyanolyan emésztési mintázattal rendelkezik, mint a Dryvax®.

A klónozott törzs továbbá megfelelő áihímodelleken vagy embereken tesztelve lényegében véve ugyanolyan vírulenciával és/vagy ízmsuHOgenítással rendelkezhet, mint az ACAM1ŐÖÖ jel» yacctata vírus törzs (ATCC intézetnél .PTÁ-3321· számon 2ÖŐ1. április 19-én deponálva; lásd 2, Időst alább). Az: ilyen: vaccinia vírust előnyösen lényegében véve ugyanolyan vagy annál nagyobb mennyiségben állítjuk elő sejttenyészetekbe mokutálva, mint sz ACAMIÖOÖ jelű vaecmia vírus törzset, és/vagy restrikciós endonukleázokkai emésztve lényegében véve ugyanolyan emésztési mintázattal rendelkezik, mint az ÁCAM1ÖŐÖ jelű vacoinia vírus törzs. A találmány szerinti vaeeínía vírus egy példája az ACAMÍ ööö jelű törzs (ATCC deponálási szám PTÁ-3321).

A találmány tehát olyan gyógyszerkészítményre vonatkozik, amely vaccinia vírus ismertetett klónozott törzsét tartalmazza, gyógyszsnészetíleg elfogadható vivöanyoggal vagy hlgítöanyagga! együtt.

A taláíbrány szerinti gyógyszerkészítmény felhasználható váriéin vírus fertőzés megelőzésére ás kezelésére, amelynek során & betegnek a fenti gyógyszerkészítményt adagoljuk. A gyógyszerkészítményt a betegnek - például bekarcolással - például 1 x lö⁴ és 1 x 1Ö° plakk-kápző egység (PíTi) mennyiségben adagolhatjuk, .A találmány szerinti gyógyszerkészítményben alkalmazható legyengített uaccinia vírus klónozott törzsének előállítására alkalmas' eljárás például abban áll, hogy (i) EryvaxéM szaporítunk sejttonyesztö rendszerben, és (ii) a sejttenvésztő rendszerből a vaecinia vírus egy klónozod törzsét izoláljuk, amely lényegében véve ugyanolyan virulencíávai, ímmunogenítással, tenyészetben növekedési jelientzökkel és endonukieázos emésztési mintázattal rendelkezik, mist a Bryvax® vagy az, ACAM1.Ö68 je.lő vsceinia vírus törzs. A vaeeínía vírus viruleneíája ebben az eljárásban példán! nyúl bőrén vagy' szopós egér neurovlruieneia tesztben tesztelhető. A íenyészetben növekedési jellemzők például humán díploíd (MRC-5) rejtek alkalmazásával határozhatók meg. Az ezen módszerrel azonosított vaccmsa vírus előnyősért embernek adagolva, vsríola vírus ellesi védő vagy' terápiás ímmmtváhsz mdakáláxára hatékony mennyiségben, emberre nézve kellően avlrulens.

A találmány szerinti tuegoldás számos előnyt biztosit. így például korábban a himlő-vakcinát ögy állították elő, hogy vaceima vírust borjak bőrébe inokolákak, majd a borjak bőrét lekaparták a vírus összegytíjísse érdekében. A kapott nyers viruspreparátumot múíhnállsan tisztították mielőtt emberek vakeinálására használtál-;, miáltal fennállt a patogénekkel való szennyezettség lehetősége, Á találmány szerinti vakcinákat viszont sejttenyészíö rendszerben állítjuk elő, ami a vakcinagyártás modem szabványelóirásaínak megtelek és a kapott térΜ· <

mék aagytíszíaságú, így megszűnik ez a veszély. Emellett a ktöaozott vírusok, például a találmány szerinti vírusok alkalmazásának előnye, hogy a vírusok kevert: populációjával ellentétben nem valószínű, hogy az ilyen vírusok jellemzői változnak a szaporítás és a vskeinagyártás során, Valóban kimutattuk, hogy a találmány szerinti vírus a sejttenyészetben való isméiéit passzálások és szaporodás során megtartja fenotípusát, szennyeződésektől mentes, valamint alkalmas arra, hogy nagyléptékű vakctnagyáriásh.oz: alkalmas mennyiségben termeljük sejtienyészetben.

A találmány szerinti megoldás további jellegzetességei és előnyei kitűnnek a részletes ismertetésből, rajzokból és igénypontokból,

A rajzok rövid ismertetése

Az 1A-ID ábrán bemutatott graískonsorozat olyan kísérletek eredményeit ábrázolja, amelyekben szopós egereket oltottunk a megadott vacciaia klönokkal, poliklonális vaccinia vírus preparátummal, illetve Ötyvax®-szai. A túlélő egerek számát, valamint az oltás utáui átlagos túlélési időt ábrázoltuk,

A 2. ábra a találmány szerinti vaceíma kiónok Hfodllf restrikciós enzimes emésztéssel végzett elemzési eredményét mutatja, a poliklonális vírus preparátummal -és Dryvsx®~szai összehasonlítva,

A találmány legyengíteti vaceíaia vírus, himlő (azaz variola vírus) elleni vakcinálásban alkalmazható, klónozott törzseit tartalmazó gyógyszerkészítményre vonatkozik. Amint az alábbiakban ismertetjük, a találmány szerint alkalmazható legyengített vaccinia törzseket úgy állítjuk elő, hogy vaccinia klónokat izolálunk olyan sejtteayészetekfeől, amelyekben Dry vas® volt szaporítva.

A találmány szerinti vakcinák a -jelenleg az Amerikai Egyesüli Államok Élelmiszer és Gyógyszer Hatósága (US Food and Drug Admímstraíioa - FDÁ) áltol engedélyezett, és borjú bőrén termelt vaccinia vírusok kevert populációjából álló - Dryvax®>-hől (New York City Board of Health törzs, Wyetb Laboratories) származnak és ahhoz hasonló jellemzőkkel rendelkeznek. A vakcittáknak elfogadhatóan legyengíted vkufenciá» val kell rendelkezniük az emberre nézve, akit ezekkel vakcinátok. A legyengífettség elfogadható szintje lehet például ahhoz hasonló (azaz statisztikailag szignifikáns módon attól nem különböző) szint, mint amely Dryvax® esetén megfigyelhető, és az alábbiakban ismertetendő ínvöro és 1« vivő fesztekkel meghatározható. A vaccinia vírus egy jellemző tulajdonsága a neurotropizmus, vagyis az: a képesség, hogy a központi idegrendszer sejtjeiben tud szaporodni és gyulladást (azaz agy^elógyüiladást) okozni, A találmány szerinti vakcinák előnyösen nem mutatnak nagyobb mértékű nenrotropízmust, stint a Ehyvax®, és a kezelt személyeknél nem okoznak vakcinátás utáni agyvelőgyulladást.

Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti vakcinákat és eljárásokattmódszereket,

A találmány szerinti vakcinák alkahnazásának: elsődleges indikációja á himlő megelőzése bíoterrorizmus vagy biológiai háború esetén himlőnek kitett vagy potenciálisan kitett lakosság körében, A találmány szerinti vakcinák hatékonysága előnyösen magas (>95%), és a vakcina védelmet nyújt a vírusnak mind emherrőlemberre való terjedésével, mind biológiai fegyverekből származó nagydózisd aeroszolt* elsődleges hatásával szentben. Tekintettel erre a fő Indikációra, a találmány szerinti vakcinák alkalmazhatók például himlő (vaceinia) vakcina új nemzeti tartalékkészletánek képzésére, és a gyártás hosszú időn keresztöl évente folytatható a folyamatosan frissített törzstortalék fenntartására.

A vakcinát rutin alkalmazásra szánjak, kivéve a laboratóriumi munkatársakat, akik vaccinia, tehénhimlő, majomhimlö, variola vagy az f>?áopoa:viritó nemzetség más tagjai hatásának vannak kitéve. Egyébként a vakcinák szükségállapot körülményei között hozhatók forgalomba, a nemzeti biztonsági és népegészségügyi hatóságok által meghatározott módon, ilyen szükséghelyzetben a vaeeiniával kapcsolatos káros eseteknek a kockázatát kiegyensúlyozná az a potenciális haszon, amely az egyének himlő elleni védelméből és a társadalom ezen betegség eltévedésével szembeni védelméből adódik. Elismert tény, hogy a vakcinák szükséghelyzetben való alkalmazását nehéz ellenőrizni, igy a vakeinálás utáni agyvelogyulladás magasabb kockázatának kitett: gyermekek kapnának vakcinákat, és figyelmen kívül lennének hagyva az elővigyázatossági rendszabályok és kontraindikációk az ez utóbbiak alapos kockázatát matató személyek (pl. ekcémás tünetekkel rendelkezők, várandós anyák és immaoszuppreszszlős kezelésben részesülök) esetén. Ezen okok miatt fontos, hogy a találmány szerinti, sej ttenyészéiből származó vakcinák ne legyenek vfruiensebbek, mint a jelenleg engedé lyezett termék.

Az előre pontosan meg nem jósolható eseményektől iüggően dönteni lehet arróí, hogy bizonyos csoportok, igy katonai személyzet, civil egészségügyi személyzet és az úgy nevezett ‘elsődleges válaszadók’ megelőző kezelést kapjanak, E csoportoknál a vakcinák velejáró és nagyon, fontos biztonsági profilját fokozzuk a termék körültekintő alkalmazásával és azzal, hogy nem alkalmazzak a káros esetek kockázati tényezőjét mutató személyek, esetén. Ilyen körülmények között a lő kockázatot az autoinokuláció, szero-vaceinia és véletlenszerű fertőzés jelend, amelyek mind önkorlátozó káros esetek. Kicsi a kockázata más, alapos kockázattal rendelkező személyek véletlenszerű, fertőzésének.

Természetesen, amennyiben az országban vagy a világban változnának a körülmények, a lakosság további tagjainak (pl. gyermekeknek), sőt a teljes lakosságnak a rutin vakcinálása is kívánatos lehet, és a találmány szerinti vakcina ilyen célra is alkalmazható,

A. találmány szerinti vakcinákat úgy állítjuk elő, hogy vaccinla vírus kívánt törzsét (pl, ACAMIÖOO törzs; ATCC deponálási szám; ΡΤΑ-332'i) sejttestyésztő rendszerben szaporítjuk, majd a tenyésztett törzset standard módszerekkel izoláljak a rendszerből. így például a törzs: diploid humán tüdő fibrobiaszr sejtekben:, pl, MRC-5 sejtekben, primer csirkeembrió Ehroblaszt sejtekben vagy bármilyen más, szakember által meghatározható alkalmas sejttípusban tenyészthető. A tenyésztés történhet bármilyen alkalmas rendszerben, például a Nane Cell Factóry® rendszerben.

A tisztított vírus iiofilizálhafé későbbi felhasználáshoz, vagy pedig azonnal gyógyszer oldat formájában elkészíthető, Számos, gyógyszerészetileg elfogadható oldat ismert, amelyek vakcinagyáfáshoz alkalmazhatók, és amelyeket szakember egyszerűen adaptálhat a találmány szerinti megoldáshoz [lásd például: tenk EhirosvííCiJKö'cíd Sciences (18, kiadás), szerk.: A. Oennaro, 199ö, felack Pubiishing Co., Hasion, PA]. A vírusok azonban egyszerűen hígíthatok fiziológiása» elfogadható oldattal, például síeril kooyhasóoldattói vagy steril pufiéról! konyhasőoldattal, adjaváss jelenlétében vagy a nélkül. Adott esetben a gyógyszerészetileg elfogadható oltóit tartalmazhat viszkozitást szabályozó komponenst (pl, glicerint) és/vagy bakterlcid tulajdonságú komponenst (pl, fenolt). A vakcinák ICf-lÖ^ plakk-képző egység (PFU)/ml, például lő* PFU/ml koncentrációban tárolhatók.

A találmány szerinti vakcinák a betegeknek például bekarcolásos útón, standard módszerekkel adagolhatok. Ilyen megközelítésben például kettéágazó tü alkahnazható. A vakcinát azonban bármely más, szak* *·«

ember .számára elfogadható standard úton is adagoljuk. így például a vakcina adagolható .szuhkutáu vagy iniradermáhs injekcióban. A vakcina egy átlagos testmérete felnőttnek adagolt mennyisége lehet például 1 x Ki⁴ - 1 x Hé PFU, közelebbié! 1 x IO^S PFU.

A vakeinálást előnyösen a variola fertőzés bármilyen lehetősége előtt végezzük, azonban a vakclaálás végezhető olyan betegek esetén is, akik varsoia fertőzésnek voltak kitéve, ilyenkor a vakeínálást előnyösen a fertőzéstől számított néhány napon belől végezzük. Λ vakclnálás az ember életében csak egyszer végezhető, vagy pedig végezhető istnéielten, bizonyos időközönként, így például néhány évenként (pl. 5-1Ő évenként), amint azt egy szakember megfelelőnek tartja.

A találmány tárgykörébe vaeeinia vakcina jelöltek azonosítására szolgáló módszerek is tartoznak, Ezek a jelöltek ágy azonosíthatók, hogy klónozott törzseket izolálunk Dryvax&Assal inoknlált sejtteayészetböl·, inaid a kiőnokat az. alábbiakban ismertetendő is vöro vagy m w módszerek bármelyikével jellemezzük. így például a. jelölt v&ecma törzs a Dryvax®-szsi összehasonlítható a ptakkok méretére, sejtíenyészetbeií kihozatali·» (pb M1RC-S sejtek alkalmazásával), nyaiak feőréa mutatott viruienciára, szopós egér neurovoleaciára vagy egér-fertőzést modellbe® védőképességre nézve. Előnyös jelöltek azok, amelyeknek vindenclája ugyauelyan vagy kisebb mértékű, mint a Dravax®-é, és amelyek ugyanolyan vagy alacsonyabb színtű védSíntninmíást indukálnak, mint a Dryvax®, továbbá ugyanolyan vagy nagyobb mértékű növekedési jellemzőket mutatnak, mint a Dryvax®.

Találmányunk megalkotása előtt olyan törzsek Izolálása, amelyek vakcina jelöltként sikeres jellemzőkkel rendelkeznek, megjósolhatatlan vök, mivel a vacciaia hosszas passzálása a variánsok sokszoros alpepulácíójának létrejöttét eredményezte (azaz genetikai rajzás: történt), potenciálisan különböző biológiai tulajdonságokkal. Áz is bizonytalan volt, hogy egyetlen, plakk-íisstltassal (azaz biológiai klónozással) izolált variáns ugyanazon fenntípnsos jellemzőkkel fog-e rendelkezni, mint az eredeti kevert: vünspepnlációhan levő sok variáns összessége. Találmányunk megalkotása előtt valójában: meglepő lett volna egy ilyen tény,

A találmány szerinti vakcinák kifejlesztését és prekhnlksí jellemzését az alábbiakban ismertetjük.

Amint a fentiekben említettük, Dryvax® a jelenleg az FDA által engedélyezett vaeeinia vakcina, amely a New York City öoarel of Health (NYCBH) törzsből készült, és amelyet Wyeth-Lederle cég 1982-ig szarvasmarha-borjú oltóanyag módszerrel termelt (lásd még: Á.TCC deponálási szám: V'R-325). A Drayvax® élő, legyengített vacemsa vírusokból áll, és nem létezik seittenyészeton előállított termékként. A vaeeinia vírus himlő vakcina-törzsét adaptáhnk humán tüdő Shrohlaszt sejtek laboratóriumi tenyészeteinek szabályozott körülményes között történő szaporításhoz. Sejttenyészeten előállított vakcina kifejlesztéséhez a Dryvax®-!. el kellett választani & potenciális járulékos vírnsszennyezodésektől, amit haíárhigííásos passzálással végeztünk, klónozással vagy a nélkül, amint az alábbiakban részletezzük. A Dryvax®-baft levő variánsok (genetikai rajzás) keverékéből azokat a vakcina jelölteket választottak ki, amelyek állatokban hasonló biológiai jellemzőkéi mutatnak, és genotniáhsan hasonlónk az engedélyezett vakcinához, ami nagymértékben biztosítja, hogy klinikáikig olyan hatékonyak, mint az eredeti botjúoltőanyag termék,.

Az adaptálás egyik stratégiája szerint, a vaccsnía vírust klónoztuk, a vírus esetleges, a borjú bőréről származó szennyező mikroorganizmusoktől való izolálás érdekében. Ezzel a stratégiával hat klánt izoláltunk. A

klónozott vírusok különbőzé jellemzőkkel rendelkeztek, a Dtyvax^-hoz viszonyítva klsebb-nagyobfe vírutenciávai. Meglepő módon úgy taféfoík, hogy a Dryv&xl>-ban levő variánsok keverékét tekintve, három kiönt találtunk, amelyek az áriatokon végrehajtott vlruleuclatesztckhen hasonlóak voltak a DtyvaxSMioz, és sejttenyészeten végzett növekedési sebességben első fokon különböztek. E törzsek bármelyike - valamint, más, hasonló jellemzőkkel rendelkező törzsek - használhatók a találmány érteimében himlő vakcinálásí módszerekben.

Egy másik stratégia szerint a vírust nem klónoztuk, azon feltételezés alapján, hogy az e módszerrel kapott vírus esetén várhatólag nagyobb a valószínűsége annak, hegy hasonlóképpen fog viselkedni, mint az a törzs, amelyből származik, Meglepő módon azonban úgy találtuk, hogy a klónozás nélkül kapott törzs - miközben az f.u rtfro tesztekben hasonló volt a Bryvaxáő-hoz - nem rendelkezett a vakcina törzs jellemzőivel, viszont ténylegesen virnlensebb volt laboratóriumi állatokban.. Ezért fejlesztésre fordítandó erőinket a klónozott, a Dryvax<< vakéba törzséhez hasonló jellemzőkkel rendelkező virusökra irányítottuk. Áz általunk végzett .jellemzési eljárást az alábbiakban ismertetjük.

ÖryvaxtsM inokuiátesk MK.C-5 sejtek tenyészetébe, és plakk-tisztitással hat vaeeinia vírus törzset kaptunk, Mindegyik kiónt kétszer újraklónoztsk, hogy biztosítsuk a kioualítast és a szennyezésektől való mentességei. A Dryvax<>-t ezenkívül többszörös fertőzési (MOi) dózisban, sejtenként 0,001. PFU dózisban Is ínokniőltek M.RC-5 sejttenyészetbe, hogy sem-klónozott Cpohklonálísj vírusprepsrátuinöt is kapjunk. Ezt a vb rosprepsrátemot azután MRC-5 sejtekben alacsony MOi. dózissal még kétszer passzáiíuk. Mind a hat klánt és a pollklonáiis preparátumot elemeztük te viteo és in viv& jellemzőikre nézve, különféle összehasonlító vizsgálatokban Oryvax® mellett, Közelebbről: az egyes klánokat és a pollklonáiis preparátumot vizsgáltuk piakk-morfológiára, MRC-S sejtekben termeli kihozatalra, restrikciós endonnkleázos térképezési mintázatra, uyuiak bőrén himiőhólyagok képzésére és egér neurovlruieneíára Késve. A klánok egy részét tovább teszteltük egerekben védőlmnmnítás inönfcálására nézve. A cél az volt, hogy olyan vakcina törzset szelektáljuk a Dryvax^-csoportból, amely biológiailag a Dryvax^tez hasonló. Áz l, táblázatban összefoglaltuk a vizsgálatok eredményét vaecinla vírus, jelölt telte-mrtii

Teszt	Eredmények (Dryvax®-hoz viszonyítva minőségi vizsgálatokban)
	Dryvax®	'1, klón	2, klón	3. klón	4. klón	5 . klón	6. klón	Poli
P lakk mérete (átlag, mm)	0,42	0,43	Ö.4Ó	0,36	0,Ő5	0,25	0,27	0,46 :
Kihozataí MRC-5*-ben	4,0	13,5	7,0	10,6	15,6	4,7	1,5 :	7,0 ;
RE elemzés		n.a.	u.a.	u.n.	u.a.	u.a.	n.a, ;	u.a.
Nyál bőrteszt		magas.	u.a.	magas	o.n.	magas	u.a.	magas
Szopós egér nenrovlrtdencla		magas	u.a.	magas	u.a.	magas	u.a.	magas
immutiogerdtás egérben		S.Í.	u.a.	u.a.	u.a.	n.í.	u.t.	nx

*pfuftn x lő* nm. - ugyanolyan n,i. - nem teszteltük

A fenti vizsgálatokkal a 2. és 4. klón esetén találtak olyan jellemzőket, amelyek azt mutatják, hogy ezek alkalmasak áj hiöd&vsk£ínáhan való felhasználásra. A ő. klón szintén megfelelő jellemzőkkel rendelkezik, azonban nem növekszik olyan jók ml»t a 2. és 4, klán,

Ssoí'ői ezé?' «eK?'öS^fírwhí?JCít? /esz;

Felnőtt egerek érzéketlenek voltak a nem-módosított Dryvax®”Szal történő istrakraniális (IC) inoknlálásra, ezért szopós egereken végzendő tesztet dölgoztuok ki, 3-4 napos szopós egereknek a vírus tízszeres hígítását injektáltuk, és meghatároztuk a túlélési időket. Három kísérletet folytattunk, mindegyikben standardként DryvaxáM használtunk. Megfigyeltük, hogy DryvaK®-szal IC irtokuláh szopós egereknél minden esetben végzetes agyvelőgyuiladás fejlődött ki, LD₅₀ - ~ 1,0 log_K. FFU-értékkel és átlagosan hét nap posztulásig eltelt idővel. Úgy találtuk tehát, hogy ez a teszt alkalmazható arra, hogy összehasonlítsak a vakcina jelöltek, valamint az eredeti Dryvax® neuroviraleneíaját. A. kísérletek eredményét a 2. táblázatban foglaltuk össze, és a fölélő egerek számát, valamint az átlagos túlélési időt az. 1A - 1D ábrán ábrázoltok,

2. táblázat

Vakcirsa jelöltek siessroviföleneiájsi szopós egerek esetén

Kísérlet	Vírus	Paraméter
I-W	UV	ÁST'	(SD>
1	Dryvax®	1,6S	3,03	7,78	0,19)
	Poiiklonáhs	<1,3	1,94	Ó,Ő9	<U4)
	1. kíört	<2,3	<2,3	4,20	(1,03)
2	Dryvax#	1,3	2,1	6,67	(0,71)
	2. klón	1,55	2,25	6,80	<2,74)
	3. klón	<1,3	<1,3	5,00	0,16)
	4. klón	2,59	3,10	6,11	(1,36)
3	Dryvax®	2,4	4,15	S,64	(3,42)
	5. klón	<1,3	<1,3	4,03	(1,08)
	6. klón	1,57	2,47	7,73	(4,63)

^!5ö%-os imraeerehrális letális dózis 8,02 ml tnekulumra számítva a fertőzés utáni lő. napon ^!9ö%-os imraeerehrális letális dózis 0,82 ml mokulumra számítva a fertőzés utáni lő. napon ^Átlagos túlélési idő, nap (standard deviáció) -iO-iőO 1.¾ értéknél

További fesztekkel vizsgálható a vakcina jelöltek vlfuleacíája. így például kidolgoztunk egy oyulak bőrért végzett viraiencia tesztet A tesztet nem-passzált Dryvax® ortradermáBs alkalmazásával fejlesztettük ki, amely dózistól föggő himlőhólyag iéziókaí okozott, amelyekre börpir, megkeményedett szövet és néhány esetben centrális lézió volt jellemző. Alkalmazható még például a majom neunovirulencia teszt is. £ tesztben a klónozott, Dryvax®-hől származó jelöltek a viríts lépcsőzetes dózisainak IC inoknlálásáva! Dryvax®~szai összehasonlítva vizsgálhatók.

Kifejlesztettünk továbbá egy egereken végzett fertőzési modellt a védőképesség tesztelésére. E modeliben vaccím's WR. törzset alkalmaztok 6-8 hetes egerek iníranazális (IN) fertőzésére. Az HW-érték: -4,5 iog_i(> P.FU, és az átlag©» túlélési idő 6-7 sáp a fertőzéstől számítva. A teszt kellőképpen erős ahhoz, hogy preklioikai védőképesség! vizsgálatokban alkalmazzuk vj vakcina jelöltek esetén. Más hasonló modellek is alkalmazhatók, más Ovhopaevk-ííAok például tehénhimlő: vírus felhasználásával.

A Dsryvax® és a 2. -és 4. klón azon képességét vizsgáltak, hogy védöimumnüásí indukálnak vacctma WR fertőzéssel szemben egerekben, A 3. kiónt arra. nézve is vizsgáltak, hogy egy nagyobb vírulenciát matató klón magasabb szintű immunválaszt vált-e ki. Négyhetes egereket immunizáltunk a vírusok lépcsőzetes- dózisaival. Á vírusokat a bőrbe kettéágazó tövei végzett bekarcolással íxmkuláituk, ami az emberek 'Dryvsx-®-szal történő inokulái ásónak módszere. Az immunizálás után három héttel az egereket IN úton vnccmla WR 6,5 log:₀PFÜ (Ihö LDio) .dózásával fertőztük. A fertőzés után 14 sápon át ügyeltük a túlélési Időt, Az összes vírus törzs esetén a dózisra adott válaszként védőfeatás volt megfigyelhető, és mindegyik kión legalább olyan mértékű védőhatást mutatott, mint a Dryvas®, A kilósok között nem mutatkozott különbség a védő aktivitás tekintetében. A különböző hnmuuizáló dózisok esetén kapott átlagos túlélési időket a 3, tábláztán, valamint az 50%-os védödózísokat (PD_5<5) a 4. táblázatban foglaltak össze.

Immunizált egerek túlélési ideje vuetínia WR 16$ tl>_í(1 dózisával végzett fertőzés után

Immunizáló dózis (logss mi/rnl)	Átlagos túlélési idő (nap)	4. klóit
Dryvastkí	ΐ 3. klón	2. klón
	8	1.4.0 \| u.L	14,8	S.Í.
r	14,0	{ 14,0	14,0	14,0
	6	12,0	1 14,8 i	12,4	12,4
	5	7, δ	? 8,8	7,2	70,
	4	5,2	{ 5,2 4..........................	7,8	5,4
	3	\ó	i 5,4	5_?4	4,8
		5 ‘Λ*-	1..........4..........	.-«,Λ-	n,k

Eferyvax® és vakcina jelöltek 50%-os vúdődőzísa

Főse 0og_!8 FFU)
©ryvax®	3. klón	2. klón	4. klón
5,5	5,2	5,4	5,5

Dryvsj;®~feöl és az egyes vakcina jelöltekből származó DNS mintákat tisztítottuk, és ffendin-ntai restrikciós ondónak léázos emésztésnek vétettük alá annak meghatározására, hogy van-e genetikai különbség a β-φ törzsek között, Amint a 2. ábrán bemutatóit emésztett geuonuáhs DNS elekíraforézises elemzéséből látható, n> találtunk különbséget.

Dryvax® replikáeiójának vizsgálatát végeztük, MRC-5 sejtekben, valamint printer cslrkeembrtó fibrobiaszt (CEF) sejtekben mutatkozó kihezatalra nézve. A kihezatál CEF sejtekben alacsonyabb volt, mint MRC-5 sejtekben. így az MRC-5 sejteket választottuk szabszírátként a vakcina kifejlesztéséhez. A jelöltek tesztelhetek CEF vagy más sejtekben a vakeina-kibozataim nézve,

Az MRC-5 sejtek tenyésztéséhez használt tápkőzegeket színiét! összehasonlítottuk. Egyformán jó eredméstyekeí kaptunk Williams E tápközeg, minimális esszenciális tápközeg (MÉM)-és Dttlbeceo-féíe MÉM eseté®. A sejtek életképessége vagy növekedése szempontjából s tápközegek további borjiiembrió-szérommal (FBS), sem-esszenciális aminosavakkal, vitaminokkal és uáíriem-piníváttísl való kiegészítése nem hozott előnyöket a 10% FBS-t tartalmazó tápközeghez képest. Megfelelő volt az MRC-5 növekedési kinetika tsz alkalmas sejlstlröséggel végzett indításnál'. Az indítási sejtsürSség 2 x i8⁴ sejt/cnd volt. A. hasadásig eltelt: idő 3-5 nap volt, és a populáció megduplázódása hasadásonként 1-1,5 volt. Meghatároztuk a sejtbankok termelése és a sejtexpanzió módszerét a vísostenyésztésbez, A sejtek szétválasztásához a standard, tripszto.es kezeléssel végzett módszer mutatkozott alkalmasnak. Alternatívaként megfelelőnek. mutatkozott a bakteriális pronáz alkalmazásával végzett módszer, ami azzal az előnnyel járhat, hogy elkerüljük az állati eredetű termékek használatát a termelésben.

A találmány szerinti megoldás további megvalósítási módjait a következő igénypontokban mulatjuk be.

* »♦

Claims

SZABADALMI 1GÉMV FONTOK

L Gyógyszerkészítmény, amely tartalmaz (í) egy legyengített vaecinia vírus klónozott törzset, olyas tenyésztett sejtekből izolálva, amelyekben ACA.MIGÖÖ (ATCC PTA-3321) vagy ezek származéka volt tenyésztve, és az említett törzs emberre nézve kellően legyengített, embernek varíola vírus elles védő vagy terápiás immunválasz indnkálásához hatékony mennyiségben adagolva; és (íi) győgyszerészetlleg elfogadható vivőanyagot vagy higítőanyagot, ahol az említett vaecinia yuw ugyanolyan vlrulenciát mutat, mist sz ACAMIÖÖG jelű vaecinia vírus törzs (ATCC deponálási szám; PTA-3321), áltól az említett vaecinia vírus ugyanolyan imrounogenifást mutat, mint az ACAM1GÖŐ jelű vacciuia vírus törzs (ATCC deponálási szám; PTA-3321), és áltól -az említett vaecinia vírus restrikciós endonukfeázokkal emésztve ugyanolyan emésztési mintázatot mutat, mintáz ACAMWÖÖ jelű vaecinia vírus törzs (ATCC deponálási szám; PTA-3321),
2. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, abból az említett vaecinia vírus ugyanolyan virulesciát mutat, mint a Dryvax®.
3. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, ahol az említett vaecinia vírus ugyanoíyasr ímmunogenítást mutat, mist a Dryvaz®.
4. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, ahol az említett vacclKÍa vírus sejitsnyészetekbe ísokuiálva ugyanolyan vagy nttgyobó mennyiségben termelődik, mint a Dryvax®\
5. Az 1, igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, ahol az említett vaecinia vírus- restrikciós esdonukieázokkal emésztve ugyímolyan emésztési mintázatot mutat, mint a Bryvaxék.

é. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, ahol az említett vaecinia vírus sejttenyészetekbe inokuiálva ugyanolyan vagy' nagyobb mennyiségben termelődik, mint az ACAMÍÖÖÖ jelö vaecinia vírus törzs (ATCC deponálási szám: FTA-3321).
7. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, ahol az említett vaecinia vírus sz ACAMÍÖÖÖ jelű vaecinia vírus törzs (ATCC deponálási szám: PTA-3321),

S. Az előző igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény egy személyben variola vírus Fertőzés kezelésére vagy megelőzésére történő alkalmazásra.
9. Gyógyszerkészítmény, amely tartalmaz; (i) egy legyengített vaecinia vírus klónozott törzset, olyan tenyésztett sejtekből izolálva, amelyekben Dryvax® vagy ACA-M.100G (ATCC PTA-3321) vagy ezek származéka volt tenyésztve, és az említett törzs emberre nézve kellően legyengített, embernek varíola vírus ellen védő vagy terápiás immun válasz índokáíásához hatékony mennyiségben adagolva; és (ti) gyógyszerészeíile-g elfogadható vivő-anyagot vagy Itígítöanyagot, ahol az említett gyógyszerkészítmény egy személyben varíola vírus fertőzés kezelésére vagy megelőzésére történő alkalmazásra való, ahol az említett vaecinia vírus ugyanolyan víroíenciát mutat, mint az ACAMÍÖÖÖ jelű vaecinia vírus törzs (ATCC deponálási szám: PTA-3321), ahol az említett vacemla vírus ugyanolyan ímmunogenitást mutat, mint az ACÁMI-0Ö0 jelű vaecinia vírus törzs (ATCC deponálási szám: PTA-3321), és ahol az említett vaecínía viríts restrikciós endonnkleázokkal emésztve ugyanolyan emésztési mintázatot matat, mint az ACAMIÖOÖ jelit vaccirtía vírus törzs (ATCC deponálási szám: PTA-332I)..

lő. A 8. vagy 9. igénypont szerinti győgyszeAészdsnény, ahol az említett gyógyszeakészítmény hekarcolással történő adagolásra való,

II. A 8. vagy 9. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, ahol az. említett gyógyszerkészítmény 1 x l^:G* - I x ΙΟ⁶ plakk-képzó egység mennyiségben történő adagolásra való.