JP5988463B2 - Ｍｖａによる病原体からの即時保護 - Google Patents

Description

本発明は、病原体からの即時保護（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を与えるための修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ｍｏｄｉｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）の使用に関する。

痘瘡の原因因子である天然痘（Ｖａｒｉｏｌａ）ウイルス（ＶＡＲＶ）を含むポックスウイルスは、高病原性の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡウイルスである。痘瘡は２０世紀だけで３億例を超える死亡を引き起こしたと見積られる。従来のワクチン接種プログラムによって天然病原体としてのＶＡＲＶは根絶されたものの、人畜共通性ポックスウイルス感染（例えばサル痘）、偶発的放出によるＶＡＲＶの再出現、またはポックスウイルスによるバイオテロ攻撃の可能性という筋書きを考えると、その感染および／または保護の機序に関する知識を強化することは、依然として不可欠であり得る。

オルトポックスウイルス（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）属には、遺伝的類似性および免疫学的交差反応性に基づいて、ヒト痘瘡の原因因子ＶＡＲＶ、マウス痘を引き起こすエクトロメリア（Ｅｃｔｒｏｍｅｌｉａ）ウイルス（ＥＣＴＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＰＶ）、およびワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）など、いくつかの類縁ウイルスが含まれる。これらのうち、ＥＣＴＶ、ＭＰＸＶ、およびＶＡＣＶは、ヒト痘瘡のモデル感染として、動物で使用される。いくつかのＶＡＣＡ株がマウスで使用され、誘導される免疫応答およびポックスウイルスが使用する免疫抑制機序に関する大量の証拠が、ＶＡＣＶを使って解明されている。しかし、ＶＡＣＶはマウスの天然病原体ではなく、ＶＡＣＶウエスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ；ＷＲ）株のようなマウス適応株が一般に使用されるにもかかわらず、マウスを致死的に感染させるには、高用量が必要である（非特許文献１）。サルにおけるＭＰＸＶには、サルの方が進化的にはるかにヒトに近いという利点がある。しかし、マウスにおけるＶＡＣＶモデルの場合と同様に、サルを致死的に感染させるには、非生理学的な高いウイルス用量が必要である。したがって、どちらの動物モデルも、ヒトにおけるＶＡＲＶ感染症の末期をより大きく反映しているとみなされる（非特許文献２；非特許文献３）。オルトポックスウイルス感染モデルのなかで、マウスのＥＣＴＶ感染は際立っている。それは、その自然宿主に感染する種特異的ウイルスであり、低いウイルス用量の接種後に、死をもたらす転帰、ヒトのＶＡＲＶ感染でも記載された特徴を引き起こし得るからである（非特許文献２；非特許文献４）。これらの理由から、このモデルは、ＶＡＲＶによるヒト感染に最も近いモデルである。

病原体は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を介して免疫系によって検出される。このパターン認識受容体にはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のファミリーが含まれる。ＴＬＲ７ならびにＴＬＲ８および９は、それぞれ核酸ＲＮＡおよびＤＮＡを認識する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。ヘルペスウイルスやアデノウイルスのような二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスは、ＴＬＲ９依存的経路によって検出され得る（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。しかし、今までのウイルス感染研究において、ＴＬＲ９非存在下での感受性の増加が示されないか、わずかな増加しか示されなかった理由の説明におそらくなるであろう、強力な代替認識経路が存在する（非特許文献１１；非特許文献１０；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１２）。

多くのＴＬＲが細胞の外膜に配置されて、細菌細胞壁成分のような危険信号について細胞外間隙を監視しているのに対して、ＴＬＲ３、７、８および９からなる一群のＴＬＲはエンドソームに付随し、エンドソーム内腔を核酸について監視している（非特許文献１５）。ＴＬＲ３、７および８がＲＮＡを認識するのに対して、ＴＬＲ９はＤＮＡを認識する（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。

ＴＬＲ９の発現は種内で異なる。ヒトの場合、Ｂ細胞および形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）はＴＬＲ９を発現させ、ＴＬＲ９刺激に応答するが、通常型ＤＣ（ｃＤＣ）はそうでないのに対し、マウスにおけるＴＬＲ９発現はそれほど限定されていない。Ｂ細胞およびｐＤＣの他に、マウスｃＤＣと、さらにはマクロファージも、ＴＬＲ９を発現させ、ＴＬＲ９ライゲーションに応答することが知られている（非特許文献２０）。当初、ＴＬＲ９の天然リガンドは細菌ゲノムＤＮＡであると定義されたが、種特異的モチーフが隣接した非メチル化ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（多くの場合、ホスホロチオエートで安定化されたもの）（ＣｐＧ−ＯＤＮ）がＴＬＲ９の人工的リガンドとして確立された（非特許文献１８；非特許文献２２）。

この間、ＣｐＧ含有天然および人工リガンドのリストは、化学組成が異なり、ＩＦＮ−Ｉ誘導能を含む生物学的作用も著しく異なる、細菌プラスミドＤＮＡおよび数タイプのＣｐＧ−ＯＤＮに拡大されている（非特許文献２３；非特許文献２４）。取込みが強化される条件下では、非ＣｐＧ含有または完全メチル化ＤＮＡならびに脊椎動物ＤＮＡも、ＴＬＲ９アゴニストとして作用することが示されている（非特許文献２５；非特許文献２６）。

ポックスウイルスは複数の免疫抑制戦略を進化させてきた。これは、ポックスウイルスゲノムが免疫抑制機能を持つ分子を数多くコードしているという事実によって立証される。これらには、可溶性サイトカインおよびケモカイン受容体、ならびに細胞内シグナリングカスケードを妨害する数多くの分子が含まれる（非特許文献２７）。最近、ポックスウイルスによって発現される分子が、ＴＬＲシグナリングカスケードのメンバーをターゲットとすることが示され、ポックスウイルスに関するＴＬＲ依存的認識経路の役割が示唆された（非特許文献２８）。実際、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）の認識におけるＴＬＲ２の役割が提唱されている（非特許文献２９）。

修飾ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）ウイルスは、ポックスウイルス科のオルトポックスウイルス属の一メンバーであるワクシニアウイルスと近縁である。ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）をニワトリ胚線維芽細胞で５１６代にわたって連続継代することによって作出された（概要については非特許文献３０を参照されたい）。これらの長期間にわたる継代の結果として、得られたＭＶＡウイルスではそのゲノム配列のうち約３１キロ塩基が欠失しており、宿主細胞は鳥類細胞に強く制限されると記載された（非特許文献３１）。得られたＭＶＡは著しく非病原性であることが、さまざまな動物モデルで示されている（非特許文献３２）。また、このＭＶＡ株は、ヒト痘瘡疾患に対する免疫を与えるためのワクチンとして、臨床試験において試験された（非特許文献３３、非特許文献３４）。これらの研究には高リスク患者を含めて１２０，０００人を超える人々が関与し、これらの研究からＭＶＡは、ワクシニアに基づくワクチンと比較して、良好な免疫原性を維持しつつ、低下したビルレンスまたは感染性を持つことが判明した。その後、数十年の間に、ＭＶＡは、それを組換え遺伝子発現用のウイルスベクターとして使用するために、そしてまた組換えワクチンとして使用するために、工学的に改変されてきた（非特許文献３５）。

これに関して、ＭＶＡがヒトおよび哺乳動物では著しく弱毒化されていて非病原性であることは、Ｍａｙｒらが１９７０年代に証明したにもかかわらず、哺乳動物細胞株およびヒト細胞株では残存複製（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が起こり得るので、これらの細胞ではＭＶＡが完全には弱毒化されていないことを、最近報告されたいくつかの観察事実（非特許文献３６；非特許文献３７；特許文献１；非特許文献３８）が示していることは、極めて思いがけないことである。これらの刊行物で報告された結果は、さまざまなＭＶＡ株を使って得られたものであると考えられる。使用されたウイルスは、その性質、特にさまざまな細胞株におけるそれらの成長挙動が、本質的に異なるからである。

成長挙動は、いくつかあるウイルス弱毒化指標の一つと認識されている。一般にウイルス株は、宿主細胞内での増殖的複製に関して、その能力を失うか、低下した能力しか持たない場合に、弱毒化されたとみなされる。ＭＶＡがヒト細胞および哺乳動物細胞内で完全には複製不能でないという上述の観察事実は、ヒトワクチンとしての、または組換えワクチン用ベクターとしての、ＭＶＡの絶対的安全性に疑問を投げかける。

特にワクチンならびに組換えワクチンにとって、そのワクチンベクターウイルスの効力と安全性のバランスは、極めて重要である。

特許文献２に記載されているように、安全性が強化された新規ＭＶＡ株が開発されている。これらの株は、以下に挙げる有利な性質の少なくとも一つを持つことを特徴とする：（ｉ）ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）ではインビトロで増殖的複製能を持つが、ヒト細胞株では、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ、ヒト胎児腎臓細胞株２９３、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ、およびヒト子宮頚部腺癌細胞株ＨｅＬａにおいてそうであるように、増殖的複製能を持たない；
（ｉｉ）成熟ＢおよびＴ細胞を産生する能力を持たず、したがって重度の免疫欠陥を持ち、複製ウイルスに対する感受性が高いマウスモデルにおいて、複製することができない；および
（ｉｉｉ）ＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンと比較して、少なくとも同じレベルの特異的免疫応答を、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンで誘導する。

開発された株の一つが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されている。この株は特許文献２の明細書では一貫して「ＭＶＡ−ＢＮ」と呼ばれている。

「増殖的複製能を持たない」または「複製不能」という用語は、そのウイルスが、細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ番号８５１２０６０２）、１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ番号９１１１２５０２）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）およびＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６（３）：７６１−７１（１９８８））などのヒト細胞株において、いくつかの具体的ＭＶＡ株に関して特許文献２の実施例１で概説されているような条件下で、１未満の増幅比を示すことを意味する。

特許文献２によれば、「インビボで複製することができない」とは、ヒトおよび特許文献２に記載のマウスモデルにおいて複製しないウイルスを指す。

ＭＶＡを送達ベクターとして使用するプライム／ブーストレジメンが弱い免疫応答しか誘導せず、ＤＮＡプライム／ＭＶＡブーストレジメンより劣っていることを示唆する報告は数多くなされている（非特許文献３９）。これらの研究では、どの研究においても、特許文献２に従って開発されたワクシニアウイルスとは異なるＭＶＡ株が使用されている。ＭＶＡをプライム投与およびブースト投与に使用した場合に得られる弱い免疫応答の説明として、プライム投与中にＭＶＡに対して生成された抗体が、２回目の免疫化で与えられるＭＶＡを中和して、免疫応答の効果的なブーストを妨げるという仮説が立てられている。これに対し、ＤＮＡプライム／ＭＶＡブーストレジメンは、高アビディティ応答を生成させるのに優れていると報告されている。なぜならこのレジメンは、免疫応答を効果的にプライムするというＤＮＡの能力をＭＶＡの性質と組み合わせて、ＭＶＡに対する既存の免疫性の非存在下で、この応答をブーストするからである。ＭＶＡおよび／またはワクシニアに対する既存の免疫性が免疫応答のブースティングを妨げるのであれば、ワクチンまたは治療薬としてのＭＶＡの使用が、（痘瘡に対するワクチン接種を受けたことがある個体では特に）限定された効力を持つことになるのは、明らかである。しかし、特許文献２によるワクシニアウイルス株、ならびに異種遺伝子を保因する対応組換えウイルスを使用すれば、ネイティブな動物でも、ポックスウイルスに対して既存の免疫性を持つ動物でも、まずは免疫応答を効率よくプライムし、次に免疫応答を効率よくブーストすることができる。したがって、特許文献２に記載の開発された株は、ＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンと比較して、少なくとも実質的に同じレベルの免疫性を、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンで誘導することができる。

ワクシニアウイルスは、特許文献２に記載されている２つのアッセイの一方、または両方で測定されるＣＴＬ応答が、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンにおいて、ＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンと比較して、少なくとも実質的に同じである場合に、ＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンと比較して、少なくとも実質的に同じレベルの免疫性をワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンで誘導するとみなされる。

特許文献２に従って開発されたワクシニアウイルスの成長挙動、特にＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の成長挙動は、これらの株が、ヒト細胞株における弱毒化およびインビボ複製の不在に関して、今までに特徴づけられた他のどのＭＶＡ分離株よりも、はるかに優れていることを示す。したがってこれらの株は、より安全な製品、例えばワクチンまたは医薬の開発にとって、理想的な候補である。

免疫応答は、外来物質または微生物が生体に侵入した時に、免疫系によって立ち上げられる。定義上、免疫応答は特異的反応と非特異的反応に分けられるが、両者は密接にクロスリンクしている。非特異的免疫応答は、広範囲にわたる多様な外来物質および感染性因子に対する即時防御である。特異的免疫応答は、生物がある物質に初めて攻撃された場合に、誘導期の後に立ち上げられる防御である。特異的免疫応答は効率が高く、ある特定感染から回復した個体がその特定感染から保護されるという事実の原因である。したがって、同じ感染性因子または極めて類似する感染性因子による２回目の感染は、この因子に対する「既存の免疫性」が既に存在するので、はるかに軽い症状を引き起こすか、または全く症状を引き起こさない。そのような免疫性および免疫記憶は長期間持続し、場合によっては生涯持続することさえある。したがってワクチン接種によって免疫記憶の誘導が起こり得る。

「免疫系」とは、外来物質および微生物に対する生物の防御に関与する複雑な器官を意味する。免疫系は、いくつかの細胞タイプ（例えばリンパ球および白血球に由来する他の細胞など）を含む細胞部分と、小さなペプチドおよび補体因子を含む液性部分とを含む。

従来のワクチン接種戦略は、適応免疫応答（抗体、ＣＴＬ）を誘導することにより、効果的で長期間持続する保護を誘導することができる。しかし実質的な保護は、数日後〜数ヶ月後に、最適にはブーストレジメンを使用して、初めて達成され得るのであって、その間、その個体は感染に対して感受性のままである。

ＭＶＡは、ヒトでは非複製ウイルスであり、さまざまな度合の免疫偏向を持つ人々（ＨＩＶ、アレルギー、アトピー性皮膚炎、一定の薬物処置）に、全身適用経路でさえ投与することができる。これらの免疫偏向の例では、専門の抗ウイルス免疫細胞集団（ｐＤＣ）が数的に減少しているか、その機能的性質に変化を来していて、それがウイルス感染のリスクを増加させ得る。

致命的ポックスウイルスからの保護の現状は、ワクチン接種によるものである。これらのアプローチでは、病原性ポックスウイルスへの潜在的暴露の前に、個体を、弱毒化された（病原性の低い）ポックスウイルスに暴露する。ワクチン接種は、キラーＴ細胞（ＣＴＬ）および抗体のような適応免疫応答ならびに関連ワクチン接種ウイルスに対する記憶を誘導する。これは、病原性ウイルスに対するいくらかの反応性をもたらし、それが、反復暴露時の保護および記憶応答の迅速な復活につながる。しかし、適応免疫応答は発達するのに時間を要し、最適になるのは、ワクチン接種ウイルスの反復投与で免疫応答をブーストした後である。

最近、ワクシニアウイルス・ウエスタンリザーブ株（ＶＶ−ＷＲ）を使った暴露の数日（遅くとも２日）前に、ワクチン接種ウイルスとしてＭＶＡを使用することにより、ある程度の保護を達成できると報告された（特許文献３、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。類似する結果が別のグループによって公表されており、そこでは、暴露後処置では動物を保護できなかったことも示された（非特許文献４０）。保護レベルは、ＶＶ−ＷＲへの暴露の２日前にワクチン接種した場合で１×ＬＤ５０、ＶＶ−ＷＲへの暴露の３日前にワクチン接種した場合で１２．５×ＬＤ５０だった（同文献）。

非特許文献４１は、抗ウイルス処置および痘瘡ワクチン接種が致死的サル痘ウイルス感染に及ぼす効果を比較した。彼らは、現在推奨されている痘瘡ワクチン（Ｅｌｓｔｒｅｅ−ＲＩＶＭ）の標準的ヒト用量を使って、サルを、サル痘ウイルス感染の２４時間後にワクチン接種した場合に、死亡率の有意な低下は観察されなかったと報告した。

米国特許第５，１８５，１４６号 国際公開第０２／４２４８０号 国際公開第２００６／０８９６９０号

Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２７６１−２７６７（１９９０） Ｆｅｎｎｅｒ，Ｆ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ａｒｉｔａ，Ｉ．，Ｊｅｚｅｋ，Ｚ．およびＬａｄｎｙｉ，Ｉ．Ｄ．「Ｓｍａｌｌｐｏｘ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ」ジュネーブ：世界保健機関（１９８８） Ｍｏｒｔｉｍｅｒ，Ｐ．Ｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３６，６２２−６２９（２００３） Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｄ．Ｊ．およびＢｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２６４５−２６５９（２００５） Ｈｅｍｍｉ，Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ４０８，７４０−７４５（２０００） Ｄｉｅｂｏｌｄ，Ｓ．Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３，１５２９−１５３１（２００４） Ｈｅｉｌ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３，１５２６−１５２９（２００４） Ｂａｓｎｅｒ−Ｔｓｃｈａｋａｒｊａｎ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．８，１３００−１３０６（２００６） Ｌｕｎｄ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８，５１３−５２０（２００３） Ｋｒｕｇ，Ａ．ら，Ｂｌｏｏｄ １０３，１４３３−１４３７（２００４） Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，１１４１６−１１４２１（２００４） Ｔａｂｅｔａ，Ｋ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，３５１６−３５２１（２００４） Ｚｈｕ，Ｊ．ら，Ｂｌｏｏｄ １０９，６１９−６２５（２００７） Ｄｅｌａｌｅ，Ｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５，６７２３−６７３２（２００５） Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．およびＢａｕｅｒ，Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：２６５−２６８（２００６） Ｄｉｅｂｏｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：１５２９−１５３（２００４） Ｈｅｉｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：１５２６−１５２９（２００４） Ｈｅｍｍｉら，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−７４５（２０００） Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら，Ｎａｔｕｒｅ ４１３：７３２−７３８（２００１） Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６３：１１０３−１１１０（２００２） Ｂａｕｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９８：９２３７−９２４２（２００１） Ｓｐｉｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：５９０８−５９１２（２００３） Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．５：４７１−４８４（２００６） Ｙａｓｕｄａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：６１２９−６１３６（２００５） Ｍｅａｎｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １１５：４０７−４１７（２００５） Ｓｅｅｔ，Ｂ．Ｔ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１，３７７−４２３（２００３） Ｂｏｗｉｅ，Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，１０１６２−１０１６７（２０００） Ｚｈｕ，Ｊ．ら，Ｂｌｏｏｄ １０９，６１９−６２５（２００７） Ｍａｙｒ，Ａ．ら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３，６−１４（１９７５） Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０３１−１０３８（１９９１） Ｍａｙｒ，Ａ．およびＤａｎｎｅｒ，Ｋ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５−３４（１９７８） Ｍａｙｒら，Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ，Ａｂｔ．Ｏｒｇ．Ｂ １６７，３７５−３９０（１９８７） Ｓｔｉｃｋｌら，Ｄｔｓｃｈ．Ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２（１９７４） Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１０３２−４０（１９９４） Ｂｌａｎｃｈａｒｄら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９，１１５９−１１６７（１９９８） ＣａｒｒｏｌｌおよびＭｏｓｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３８，１９８−２１１（１９９７） Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５５（５），５６９（１９９９） Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４；３９７−４０２（１９９８） Ｓｔａｉｂ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ８７，２９１７−２９２１（２００６） Ｓｔｉｔｔｅｌａａｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４３９：７４５−７４８（２００６）

したがって当技術分野では、痘瘡などの病原体からの即時保護のための試薬および方法が求められている。

本発明は、動物において感染性因子に対する免疫応答を誘導するための方法であって、その感染性因子による感染の３６時間前からその感染性因子による感染の７２時間後までの間に、その動物に、ポックスウイルスを含む免疫原性組成物を投与することを含む方法を包含する。

さらにまた本発明は、動物において感染性因子に対する免疫応答を誘導するための、ポックスウイルスを含む免疫原性組成物の調製を目的とする、前記ポックスウイルスの使用であって、前記免疫原性組成物がその感染性因子による感染の３６時間前からその感染性因子による感染の７２時間後までの間に動物に投与される前記使用を包含する。

本発明は、動物において感染性因子に対する免疫応答を誘導するためのポックスウイルスも包含する。さらにまた本発明は、動物において感染性因子に対する免疫応答を誘導するための前記ポックスウイルスを含む免疫原性組成物を包含する。好ましい実施形態では、前記ポックスウイルスまたは前記ポックスウイルスを含む免疫原性組成物が、感染性因子による感染の３６時間前から感染性因子による感染の７２時間後までの間に動物に投与されるものである。

好ましい実施形態では、ポックスウイルスが、感染性因子による感染の３６時間前から感染性因子による感染の４８時間後までの間に投与される。

好ましい実施形態では、ポックスウイルスが動物中で複製不能である。

好ましい実施形態では、ポックスウイルスが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）である。

好ましい実施形態では、動物がヒトである。

好ましい実施形態では、感染性因子が複製可能なポックスウイルスである。

ある実施形態では、ＭＶＡが、１０^５〜５×１０^８ ＴＣＩＤ５０の用量で投与される。好ましい実施形態では、ＭＶＡが静脈内、鼻腔内、筋肉内、または皮下に投与される。

ある実施形態では、ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である。ＭＶＡは組換えＭＶＡであることができ、少なくとも一つの抗原エピトープをコードする少なくとも一つの異種核酸配列を含むことができる。抗原エピトープは感染性因子の抗原エピトープであることができる。感染性因子は、ウイルス、真菌、病原性単細胞真核および原核生物、ならびに寄生生物から選択することができる。好ましい実施形態では、ウイルスが、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、および出血熱を引き起こすウイルスから選択される。もう一つの好ましい実施形態では、感染性因子が炭疽菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）である。

ある実施形態では、免疫原性組成物が、感染性因子による感染の２４時間前から感染性因子による感染の２４時間後までの間に投与される。免疫原性組成物は、感染性因子による感染と同時に投与することもできる。ＭＶＡを含む免疫原性組成物の動物への投与は、感染性因子による感染の０〜２４時間前または感染性因子による感染の０〜４８時間後であることができる。

本発明は、ヒトを含む動物において感染性因子に対する免疫応答を誘導するためのキットであって、活性物質としてポックスウイルスを含む免疫原性組成物を含み、前記ポックスウイルスがヒトを含む前記動物中で複製不能であるキットも包含する。

好ましくは、前記キットは、ＭＶＡを含む免疫原性組成物と、感染性因子への暴露の０時間前〜３６時間前の一時点、または感染性因子への暴露の０時間後〜７２時間後の一時点で、免疫原性組成物を送達するようにという取扱説明とを含む。ある実施形態では、ＭＶＡが、用量１０^５〜５×１０^８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である。

ある実施形態では、感染性因子が痘瘡である。もう一つの実施形態では、感染性因子が炭疽菌である。感染性因子は、別個のバイアルに入れて、キット内に含めてもよい。

好ましい実施形態において、本発明は、ＭＶＡを含む免疫原性組成物と、痘瘡への暴露後できるだけ早くその免疫原性組成物を送達するようにという取扱説明とを含むキットを包含する。

上記の概要および以下の詳細な説明はどちらも、単に本発明を例示し、説明するものであって、特許請求される発明を限定するものではない。

本発明は、図面を参照することで、より完全に理解される。

図１ａおよびｂは、活性ポックスウイルスまたは不活化ポックスウイルスに応答して起こる樹状細胞（ＤＣ）成熟の解析を表す。表示のとおり活性ポックスウイルス（左側パネル）もしくは不活性ポックスウイルス（右側パネル）、ａ）ＣＶＡ、ＥＣＴＶ、ＣＰＸＶ、ｂ）ＭＶＡ、ＳＦＶ、ＣＮＰＶと共に（陰影付きのヒストグラム）、または刺激なし（中空のヒストグラム）で、インキュベートした後の、ＦＬ−ＤＣでのＣＤ４０またはＣＤ６９の発現を示すフローサイトメトリーヒストグラム。少なくとも３回（ＣＶＡ、ＥＣＴＶ、ＭＶＡ）または２回（ＣＰＸＶ、ＳＦＶ、ＣＮＰＶ）の実験のうち、代表的な１回の実験を示す。 図２ａ〜ｅは、インビトロでのポックスウイルス感染に対するＴＬＲ９欠損型ＤＣまたは野生型ＤＣの応答を表す。ａ）表示のとおりＣＶＡ、ＥＣＴＶもしくはＭＶＡと共に（陰影付きのヒストグラム）、または刺激なし（中空のヒストグラム）で、インキュベートした後の、野生型マウス（左側パネル）またはＴＬＲ９欠損マウス（右側パネル）のＦＬ−ＤＣでのＣＤ４０またはＣＤ６９の発現を示すフローサイトメトリーヒストグラム。野生型活性化に関する類似のヒストグラムは図１の一部である。ＴＬＲ９欠損マウス（中空のカラム）または野生型マウス（塗りつぶしたカラム）のｂ）ＦＬ−ＤＣまたはｃ）ＧＭ−ＤＣを、活性ＭＶＡ（左側パネル）またはＵＶ不活化ＭＶＡ（右側パネル）で刺激し、上清をＩＦＮ−αおよびＩＬ−６ についてＥＬＩＳＡで分析した。ｄ）表示のとおりＴＬＲ９欠損マウスまたは野生型マウスの選別されたＦＬ−ｐＤＣおよびｃＤＣを、ＭＶＡ（塗りつぶしたカラム）またはＥＣＴＶ（中空のカラム）で刺激し、上清をＩＦＮ−αおよびＩＬ−６についてＥＬＩＳＡで分析した。ｅ）全骨髄細胞を活性ＭＶＡ（斜線付きのカラム）、ＵＶ不活化ＭＶＡ（水平線付きのカラム）、またはＣｐＧ−２２１６（黒いカラム）で刺激し、上清をＩＦＮ−αについてＥＬＩＳＡで分析した。少なくとも２回の実験のうちの代表的な実験を示す。 図３ａおよびｂは、ＥＣＴＶ感染に対する野生型マウスおよびＴＬＲ９欠損マウスの生存を表す。野生型マウス（ａ）およびＴＬＲ９欠損マウス（ｂ）を、表示のとおりさまざまな用量のＥＣＴＶ（マウス１匹あたりのＴＣＩＤ５０数）に、ｉ．ｎ．感染させ、少なくとも４週間は生存を監視した。実験は表示した数のマウスで行われ、データは、野生型マウスの場合は各ウイルス用量について少なくとも３回の独立した実験を（ａ）、またＴＬＲ９−ＫＯマウスの場合は１Ｅ＋０２の用量については７回の実験（ｂ）、他の用量については１回の実験（ｂ）を表す。野生型マウス（ａ）における１Ｅ＋０４の用量およびＴＬＲ９−ＫＯマウス（ｂ）における１Ｅ＋０２の用量に関するデータは、他の実験の死亡対照マウスを含む。 図４は、致死用量のＥＣＴＶと同時に与えられた場合に、ＭＶＡが野生型マウスを保護することを表す。野生型マウスを表示のとおり致死用量のＥＣＴＶにｉ．ｎ．感染させ、それと同時に１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡをｉ．ｎ．接種するか（黒い記号）、または接種せず（灰色の四角）、４週間にわたって生存を監視した。実験は表示した数のマウスを使って行われ、データは２回の個別の実験の結果を表す。 図５は、致死用量のＥＣＴＶと同時に与えられた場合に、ＭＶＡがＴＬＲ９欠損マウスを保護することを表す。ＴＬＲ９欠損マウスを表示のとおり致死用量のＥＣＴＶにｉ．ｎ．感染させ、それと同時に１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡをｉ．ｎ．接種するか（黒い記号）、または接種せず（灰色の四角）、４週間にわたって生存を監視した。実験は表示した数のマウスを使って行われた。 図６ａおよびｂは、皮下適用された場合に、ＭＶＡがＴＬＲ９欠損マウスおよび野生型マウスを致死的ＥＣＴＶチャレンジから保護することを表す。ａ）ＴＬＲ９欠損マウスを１Ｅ＋０２ ＴＣＩＤ５０のＥＣＴＶにｉ．ｎ．感染させ、それと同時に１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡをｓ．ｃ．接種するか（黒い四角）、または接種しなかった（灰色の四角）。ｂ）野生型マウスを１Ｅ＋０４ ＴＣＩＤ５０のＥＣＴＶにｉ．ｎ．感染させ、それと同時に、１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ（黒い四角）または対応する量の１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ５０のＵＶ不活化ＣＶＡ（黒い三角）をｓ．ｃ．接種した。４週間にわたって生存を監視した。実験は表示した数のマウスと使って行われ、データは、ＭＶＡを投与した野生型マウスについては２回の個別の実験の結果を、そしてＵＶ不活化ＣＶＡを投与した野生型マウスまたはＭＶＡを投与したＴＬＲ９欠損マウスについては１回の実験の結果を表す。 図７は、致死用量のＥＣＴＶと同時に与えられた場合に、ＭＶＡがＩＦＮ−Ｉ−Ｒ欠損マウスを部分的に保護することを表す。ＩＦＮ−Ｉ−Ｒ欠損マウスを、表示のとおり致死用量のＥＣＴＶにｉ．ｎ．感染させ、それと同時に１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ５０のＭＶＡをｉ．ｎ．接種するか（黒い記号）、または接種せず（灰色の記号）、４週間にわたって生存を監視した。実験は表示した数のマウスを使って行われ、データは、（１Ｅ＋０２および１Ｅ＋０３）のチャレンジ用量については少なくとも２回の独立した実験の結果を、また１Ｅ＋０４および１Ｅ＋０５のチャレンジ用量については１回の実験の結果を表す。 図８は、たとえＭＶＡの存在下であっても、ＥＣＴＶ感染に対する長期生存は、適応免疫応答に依存することを表す。ＲＡＧ−１欠損マウスを、表示した用量のＥＣＴＶにｉ．ｎ．感染させ、それと同時に１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡをｉ．ｎ．接種するか（黒い記号）、または接種せず（灰色の記号）、４週間にわたって生存を監視した。実験は表示した数のマウスを使って行った。 図９ａおよびｂは、致死用量のＥＣＴＶによる感染後に適用された場合に、ＭＶＡがＴＬＲ９欠損マウスを治療的に保護することを表す。ＴＬＲ９欠損マウスを１Ｅ＋０２ ＴＣＩＤ_５０ ＥＣＴＶにｉ．ｎ．感染させた。２４時間（ａ）または４８時間もしくは７２時間（ｂ）という表示の時間後に、ＥＣＴＶ感染マウスに１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡをｉ．ｎ．接種するか（黒い記号）、接種せず（灰色の四角）、４週間にわたって生存を監視した。実験は表示した数のマウスを使って行われ、データは、３回の個別の実験（ａ）または１回の実験（ｂ）の結果を集積したものを表す。ａ）の９匹の対照マウスには、ｂ）の３匹の対照マウスが含まれることに注意されたい。

以下に、本発明の実施形態（代表的実施形態）について詳しく言及することとし、その例を添付の図面および実施例の項に例示する。

種特異的な高病原性マウスポックスウイルス・エクトロメリアを鼻腔内に適用する動物モデルを使用した。ヒト種に高度に特異的な天然痘のように、エクトロメリアはマウスに対して高度に特異的である。エクトロメリアと天然痘は、どちらも免疫抑制戦略の大きなパネルを使用し、これらは、他の病原性ポックスウイルス、例えば「ワクシニアウイルス・ウエスタンリザーブ」と比較すると、ＭＶＡから進化的により遠く離れている。さらにまた、どちらのウイルスも、それぞれの特異的宿主において高病原性（少ないウイルス数で感染を確立し、感染した個体の多くで死を引き起こすことができる）である。重要なことに、天然痘とエクトロメリアはどちらも、自然の感染方法として、呼吸経路によってその宿主を感染させることができる。これらの理由から、マウスにおけるエクトロメリア感染は、天然痘によるヒトの感染のよいモデル系である。

高度に致死的な用量のマウスポックスウイルスと一緒にＭＶＡを同時投与すると、マウスはその致命的暴露から即時的に保護されることが、動物での実験によって証明される。免疫適格マウスは、致死用量の少なくとも４７倍のエクトロメリアに暴露された場合に、これらの条件下で感染を乗り切った。

また、免疫欠陥マウスをエクトロメリア感染モデルに使用した。あるモデルでは、マウスが抗ウイルス受容体ＴＬＲ９を欠く（ＴＬＲ９−ＫＯ）。ＴＬＲ９−ＫＯマウスのｐＤＣは、ＤＮＡおよびＤＮＡウイルスに対して、通常の抗ウイルス的方法では応答することができない。これらのマウスは、エクトロメリア感染に対する感受性が激しく増加していることがわかった（免疫適格マウスより感受性が１００倍以上高い）。

単離された細胞を使ったインビトロでの研究により、ＭＶＡは、この専門の抗ウイルスｐＤＣには、それほど依存しないことがわかった。本明細書に記載のデータにより、ＭＶＡは抗ウイルス機構の誘導をもたらす追加の免疫刺激経路を使用できることが示された。そこで、ＭＶＡがインビトロで見出された代替経路によってＴＬＲ９−ＫＯマウスを保護することもできるかどうかを解析した。実際、高度に致命的な用量のエクトロメリアと同時にＭＶＡを適用したところ、ＴＬＲ９−ＫＯマウスは、致死用量の少なくとも５００倍のエクトロメリアから即時的に保護された。

Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）に対する応答性を欠くもう一つの免疫欠陥マウスモデルを試験した。これらのサイトカインはウイルス感染一般を乗り切るには不可欠であると考えられる。意外なことに、致命的用量のエクトロメリアによる感染時にＭＶＡを適用すると、ある程度の保護が見られた。このように本発明は、正常個体ならびに免疫欠陥個体を、本来なら致命的である病原体から保護する。

以前の研究とは対照的に、エクトロメリアで得られた本明細書に記載のデータは、（病原性ポックスウイルスと同時に、または病原性ポックスウイルス後に、保護ＭＶＡを与えることで）即時保護が達成され得ることを示している。その保護レベルには、はるかに速く到達する（同時／事後と遅くとも２日前）だけでなく、その保護レベルは、はるかに効果的でもある。免疫適格マウスでは、保護係数（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）が４７×ＬＤ５０を超える。さらにまた、免疫欠陥マウスにおける保護が５００×ＬＤ５０の係数を超えることも証明する。マウスにおけるエクトロメリア感染は、ヒトにおける天然痘感染との相関に現在利用することができる最善の感染モデルである。

ポックスウイルスがＴＬＲ９依存的認識経路およびＴＬＲ９非依存的認識経路によって認識されることも、ここに示す。ここでは、エクトロメリアウイルスのような病原性ポックスウイルスは、ＴＬＲ９非依存的経路による認識を効果的に抑制するが、それでもなお、ＴＬＲ９によってある程度認識されることを証明する。

形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）が、ＴＬＲ９（病原性ＤＮＡを認識する）を介して大量の抗ウイルス性および免疫調節性サイトカインＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）を産生する唯一の細胞であるのに対して、他の細胞は、ＴＬＲ９に依存しない異なる経路で、低レベルのＩＦＮ−Ｉを産生することができる。

ここでは、エクトロメリアウイルスのような一部の病原性ポックスウイルスが、線維芽細胞および通常型ｃＤＣのＴＬＲ９非依存的ＩＦＮ−Ｉ産生を完全に消滅させるのに対して、ｐＤＣのＴＬＲ９駆動型ＩＦＮ−Ｉ産生は低下するだけで、阻止されるわけではないことを記載する。マウス特異的ポックスウイルス・エクトロメリアを使ったインビボ感染研究により、ＴＬＲ９を欠くマウスでは感受性が１００倍以上増加していることが明らかになった。ウイルス感染と戦うために不可欠であることが知られているＩＦＮ−Ｉに応答することができないマウスでは、同様の感受性および致死動態（ｄｅａｔｈ ｋｉｎｅｔｉｃ）が見出されなかった。病原性ウイルスがＴＬＲ９非依存的認識を効果的に阻害するような条件下では、ＴＬＲ９依存的ウイルス認識およびＩＦＮ−Ｉ産生の重要性が本質的になると結論づけられる。したがってここでは、ＴＬＲ９が、ポックスウイルスに対する防御にとって重要な、そしてインビボで大いに意味のある、ＰＲＲであることを証明する。

哺乳動物中で複製する能力を失っている高度に弱毒化されたポックスウイルスＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）は、ロバストな適応免疫応答の強力な誘導物質であり、ワクチン接種された個体は、種特異的ポックスウイルス（例えばマウス痘、サル痘、ワクシニア）から保護される。しかし、適応免疫応答の効果的な誘導は数日〜数週間を要し、その間、個体はこれらの病原体への暴露から保護されていない状態のままである。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）が先天免疫保護サイトカイン（例えばＩＦＮ−Ｉ）の産生を、重要なことにＴＬＲ９依存的経路とＴＬＲ９非依存的経路の両方によって誘導することを、ここに示す。ＭＶＡによるこの先天免疫保護サイトカインの産生は、多数の病原体から保護するための戦略に使用することができる非特異的免疫応答である。

ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）を高病原性マウスポックスウイルス・エクトロメリアと同時投与したところ、免疫適格マウスは致死用量の少なくとも４７倍にあたる用量のエクトロメリアから保護された。ＴＬＲ９の非存在下で、ＭＶＡは、致死用量の少なくとも５００倍にあたる用量のエクトロメリアに対して、即時保護を誘導した。ＩＦＮ−Ｉに対する応答性を欠くマウスでさえ、ＭＶＡ投与によって保護され得ることが、実験により、さらに証明される。ＭＶＡは病原性ポックスウイルスと同時に適用されるか病原性ポックスウイルス後に適用された場合に保護するので、本明細書に記載する結果は、ある程度の生存利益（１×ＬＤ５０）を得るにはＭＶＡが病原性ウイルスへの暴露の遅くとも２日前に適用される必要があることを示す以前のデータ（国際公開第２００６／０８９６９０号およびＳｔａｉｂら，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２９１７−２９２１（２００６））よりも、はるかに速く、しかもはるかに顕著な（＞５００×ＬＤ５０）即時保護を示す。

致死的エクトロメリア感染と前後して行われるＭＶＡの投与は、免疫適格マウスおよびＴＬＲ９欠損マウスにおいて、死からの確実な即時保護につながった。この即時保護は、ＩＦＮ−Ｉ受容体欠損マウスおよびＲａｇ−１欠損マウスでそれぞれ示されるように、機能的なＩＦＮ−Ｉ経路には部分的に依存するに過ぎなかったが、適応免疫応答には完全に依存した。重要なことに、ＭＶＡは、本来なら致死的であるエクトロメリアウイルス感染の丸２日後に投与された場合にも、ＴＬＲ９欠損マウスを救った。このようにＭＶＡは、免疫適格動物ならびに免疫欠陥動物において、致死的ポックスウイルス感染からの確実な即時保護、そしてさらには暴露後保護を誘導した。

ＭＶＡは即時的に保護するだけでなく、誘導される保護は長期間持続するものでもある。ＭＶＡの１回適用だけで処置されたＴＬＲ９を欠くマウス（ＬＤ５０＝１９）は、９週間後に高致死用量のエクトロメリア（＞５００×ＬＤ５０）をチャレンジした場合に、保護された。

ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）は強い適応免疫応答（例えば高い中和抗体価）を誘導するだけでなく、致死的ポックスウイルスによるチャレンジからの著しく有効で、しかも重要なことに、即時的な保護につながるＩＦＮ−Ｉを産生する樹状細胞を含む細胞による、強い先天免疫応答も誘導する。このようにＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）は先天免疫応答と適応免疫応答を橋渡しし、それが、致死的ポックスウイルスチャレンジに対する即時的で長期間持続する保護をもたらす。この保護は、他の病原体にも、その病原体の抗原エピトープを発現させる組換えＭＶＡを使用することによって拡大することができる。

これらの研究において、ＭＶＡは、感染と前後して与えられた場合にマウスを致死的ＥＣＴＶ感染から保護しただけでなく、丸２日後および３日後の適用でも、マウスを致死的ＥＣＴＶ感染から部分的に保護した。オルトポックスウイルスナイーブ個体における暴露後ワクチン接種に関する科学的証拠は今までなかった（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ，Ｐ．Ｐ．２００３「Ｃａｎ ｐｏｓｔｅｘｐｏｓｕｒｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｓｍａｌｌｐｏｘ ｓｕｃｃｅｅｄ？」Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３６：６２２−６２９）。感染後ワクチン接種の潜在的成功に関する公的健康サイト（例えばＷＨＯ）の言説は、おそらく痘瘡に対するワクチン接種を過去に受けたことがある個体に関してであり、それゆえに、おそらく既存の適応記憶応答を迅速に強化するブーストワクチン接種に言及したものである。しかし、天然病原体としての天然痘の根絶に１９８０年代に成功した後、広範なワクチン接種は中止され、現在、世界人口の大半は一度もワクチン接種を受けたことがない。そのうえ、以前の研究は、ＭＶＡではない完全に複製可能なポックスウイルスによるワクチン接種を受けた患者で行われた。

マウスでＶＡＣＶ−ＷＲを使用する動物モデルまたはサルでＭＰＸＶを使用する動物モデルは治療的保護を示していない（Ｓｔｉｔｔｅｌａａｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：７８４５−７８５１（２００５）；Ｓｔａｉｂら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２９１７−２９２１（２００６））。

記載されたモデルと今回の知見との相違は、いくつかの理由によって説明することができるだろう。マウスにおけるＶＡＣＶ−ＷＲおよびサルにおけるＭＰＸＶは、各モデル動物に致死的感染を起こすために適用する必要がある非生理的に高い用量ゆえに、痘瘡感染の末期だけを反映したモデルであるとみなされる。しかし、マウスのＥＣＴＶ致死的感染は、呼吸経路によって低いウイルス用量で誘導することができ、自然の痘瘡感染の始まりに、より似ている。さらにまた、ＶＡＣＶ−ＷＲはマウスにおいて、マウスにおけるＥＣＴＶ感染やヒトにおけるＶＡＲＶ感染に特有の特徴ではない高い神経毒性、体重および体温の激減などといった病変を誘発する。この理由および他の考え得る理由から、感染動物の極めて迅速な死が起こるが、これもまた、ＥＣＴＶモデルや自然痘瘡感染時には見られないことである。

サルにおけるＭＰＸＶチャレンジの場合、治療的ワクチン接種はＶＡＣＶ−Ｅｌｓｔｒｅｅを使って行われた。ＶＡＣＶ−Ｅｌｓｔｒｅｅが阻害的であるかどうかを調べたところ、他のＶＡＣＶ株でも見られるように、インビトロでのＤＣ成熟およびサイトカイン産生が阻害されることがわかった。治療的保護には、適応免疫応答が発達するための時間を橋渡しするために、抗ウイルス性サイトカインを含む先天免疫機構の確実な誘導がおそらく必要であることを考えると、ＭＶＡのような非阻害的オルトポックスウイルスの治療的適用は、ＭＰＸＶに感染したサルでも有益である場合がある。実際、Ｓｔａｉｂとその共同研究者（２００６）は、ＶＡＣＶ−ＷＲによるチャレンジの遅くとも２日前に適用した場合、マウスは、ＶＡＣＶ−ＥｌｓｔｒｅｅよりもＭＶＡによって、より良く保護されることを示している（Ｓｔａｉｂら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２９１７−２９２１（２００６））。このように、先天免疫機構の誘導が重要な役割を果たす病原性オルトポックスウイルス感染モデルでは、ＭＶＡには、ＶＡＣＶ−Ｅｌｓｔｒｅｅと比較して、保護上の利点があるようだ。

本発明は、正常個体ならびに免疫欠陥個体において、種特異的ポックスウイルスによる極めて高用量の暴露に対して、ロバストで、そして最も重要なことには、即時的な保護を誘導する。そのうえ、この保護は長期間持続する。したがって本発明は、致命的ポックスウイルス感染からの迅速な保護が必要とされる状況（例えば痘瘡または他の病原性ポックスウイルスへのテロ行為によるまたは事故による暴露）において、理想的な処置を提供する。

本発明は、他の病原体の大きなパネルに対する緊急ツールとしてのＭＶＡおよび組換えＭＶＡの使用も包含する。本発明はさらに、病原体の大きなパネルに対する緊急ツールとしての他の弱毒化ウイルスおよび細菌を包含する。また、本発明は、治療的介入にも使用することができ、病原体（例えば痘瘡）への暴露後の緊急ツール（例えばＭＶＡ）を与える。

本発明は、ヒトを含む動物において保護的免疫応答を迅速に誘導するためのワクチンの調製を目的とする、そのヒトを含む動物において複製不能であるポックスウイルスの使用を包含する。

本発明は、ヒトを含む動物において保護的免疫応答を迅速に誘導するための、そのヒトを含む動物において複製不能であるポックスウイルスを含むワクチンも包含する。

ある実施形態において、本発明は、ヒトを含む動物において保護的免疫応答を迅速に誘導するための方法であって、そのヒトを含む動物において複製不能であるポックスウイルスをそのヒトを含む動物に投与するステップを含む方法を包含する。

「複製不能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」という用語は、国際公開第０２／４２４８０号の実施例１にいくつかの特定ＭＶＡ株について概説されている条件下で、そのウイルスが、細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ番号８５１２０６０２）、１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ番号９１１１２５０２）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）およびＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６（３）：７６１−７１（１９８８））などのヒト細胞株において、１未満の増幅比を示すこと、ならびにそのウイルスがヒトおよび国際公開第０２／４２４８０号に記載のマウスモデル中で複製しないことを意味する。

ある実施形態において、本発明は、保護的免疫応答が２日未満で生成される、上記の使用、ワクチンまたは方法を包含する。

ある実施形態では、ポックスウイルスが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）、特にＭＶＡ ５７５、ＭＶＡ ５７２および、好ましくは、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である。

本発明は、ウイルスがクローン化精製ウイルスである、上記の使用、ワクチンまたは方法も包含する。特に本発明は、無血清培養プロセスで得られたウイルスを包含する。

ある実施形態では、ポックスウイルスが１０^５〜５×１０^８ ＴＣＩＤ_５０の用量で投与される。ポックスウイルス、特にＭＶＡは、例えば経口、鼻腔、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、子宮内および／または皮下適用によって投与することができる。小動物では、免疫化のための接種が、好ましくは非経口的に、または経鼻的に行われるのに対し、より大きな動物またはヒトでは、皮下、筋肉内または経口接種が好ましい。

本発明に関して「動物」という用語はヒトも包含する。より一般的には、動物は脊椎動物、好ましくはヒトを含む哺乳類動物である。動物の具体例は、イヌ、ネコなどのペット、経済的に重要な動物、例えば子ウシ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、および他の動物、例えばマウス、ラットである。本発明は、経済的に重要な鳥、例えば七面鳥、カモ、ガチョウおよび雌鶏にも、その鳥の細胞に感染する能力を持つがその細胞中で感染性子孫ウイルスに複製される能力は持たないウイルスを使用するのであれば、使用することができる。本明細書で使用する「家畜」という用語は、好ましくは、哺乳類の家畜、より好ましくはイヌ、ネコ、子ウシ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、シカを指す。

好ましくは、免疫応答は、ポックスウイルス感染（好ましくは痘瘡感染）に対する保護的免疫応答である。保護的免疫応答は、好ましくは、１、５、１０、２５、５０、１００、２５０、または５００ ＬＤ５０という用量の痘瘡から保護することができる。

ある実施形態では、ポックスウイルスが組換えポックスウイルス、好ましくは組換えＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である。

ポックスウイルスは少なくとも一つの異種核酸配列を含むことができる。本願で使用する「異種」という用語は、自然界でそのウイルスと密接に関連して見出されることが通常はない核酸配列の任意の組合せを指す。好ましくは、異種核酸配列は、少なくとも一つの抗原、抗原エピトープ、および／または治療化合物をコードする配列である。組換えウイルス中の異種核酸がコードする「治療化合物」は、例えばアンチセンス核酸などの治療核酸、または所望の生物学的活性を持つペプチドもしくはタンパク質であることができる。抗原エピトープおよび／または抗原は、感染性因子の抗原エピトープおよび／または抗原であることができる。感染性因子は、ウイルス、真菌、病原性単細胞真核または原核生物、および寄生生物であることができる。ウイルスは、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスのファミリーから選択するか、または出血熱を引き起こすウイルスから選択することができる。感染性因子は炭疽菌であることができる。

異種核酸配列の挿入は、好ましくは、ウイルスゲノムの非必須領域に行われる。あるいは、異種核酸配列は、ウイルスゲノムの天然欠失部位（ＭＶＡについてはＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６に開示されている）に挿入される。ポックスウイルスゲノムなどのウイルスゲノム中に異種配列を挿入する方法は当業者には知られている。

さらにもう一つの実施形態によれば、本発明は、ワクチンまたは医薬品として使用するための本発明の組換えポックスウイルスに関する。

ある実施形態では、ＭＶＡウイルスが、以下に挙げる有利な性質の少なくとも一つ、二つ、または好ましくは三つを持つことを特徴とする株である：
（ｉ）ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）ではインビトロで増殖的複製能を持つが、ヒト細胞株では、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ、ヒト胎児腎臓細胞株２９３、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ、およびヒト子宮頚部腺癌細胞株ＨｅＬａにおいてそうであるように、増殖的複製能を持たない；
（ｉｉ）成熟ＢおよびＴ細胞を産生する能力を持たず、したがって重度の免疫欠陥を持ち、複製ウイルスに対する感受性が高いマウスモデルにおいて、複製することができない；および
（ｉｉｉ）ＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンと比較して、少なくとも同じレベルの特異的免疫応答を、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンで誘導する。

免疫原性組成物を調製するには、本発明のＭＶＡワクシニアウイルスを生理学的に許容できる形態に変換する。これは、痘瘡に対するワクチン接種に用いられるＭＶＡワクチンの調製（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ら，Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９：２３８６−２３９２（１９７４）に記載されているもの）における経験に基づいて行うことができる。典型的には、アンプル（好ましくはガラスアンプル）で、約１０^６〜１０^８個の組換えＭＶＡ粒子を、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥する。凍結乾燥物は、非経口投与に適した増量剤（例えばマンニトール、デキストラン、ショ糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドン）または他の助剤（例えば酸化防止剤、安定剤など）を含有することができる。次に、ガラスアンプルを封止する。このガラスアンプルは、好ましくは−２０℃未満の温度で、数ヶ月間保存することができる。

投与または治療には、凍結乾燥物を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは生理食塩水に溶解し、非経口的に、例えば筋肉内接種によって投与することができる。本発明の免疫原性組成物、ワクチンまたは治療薬は、好ましくは筋肉内に注射される（Ｍａｙｒ，Ａ．ら，Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．，Ｉ．Ａｂｔ．Ｏｒｉｇ．Ｂ １６７：３７５−３９０（１９７８））。当業者は公知の方法で投与様式、用量および投与回数を最適化することができる。外来抗原に対する適当な免疫応答を得るために、免疫原性組成物、ワクチンまたは治療薬を、適宜、１回、またはさまざまな期間にわたって複数回、投与するとよい。

ある実施形態では、ポックスウイルスが不活化オルトポックスウイルスである。好ましくは、オルトポックスウイルスは、ＵＶ照射によって不活化される。好ましい実施形態では、オルトポックスウイルスがＣＶＡ、ＥＣＴＶ、またはＣＰＸＶである。

ある病原体に対して、即時保護が得られるように、個体をワクチン接種するための方法を提供することが、本発明の目的である。ある実施形態では、病原体暴露に前後して、個体にＭＶＡ、好ましくはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）をワクチン接種する。好ましくは、暴露の２日前から暴露の３日後までの間に、ワクチン接種を行う。より好ましくは、暴露の２日前から暴露の１日後までの間に、ワクチン接種を行う。より一層好ましくは、暴露の１日前から暴露の１日後までの間に、ワクチン接種を行う。ワクチン接種は暴露の２日前、３６時間前、１日前、１２〜２４時間前、または０〜１２時間前に行うことができる。ワクチン接種は、暴露時に行うか、暴露の０〜１２時間後、暴露の１２〜２４時間後、暴露の１日後、暴露の２日後、暴露の０〜３６時間後、暴露の０〜４８時間後、暴露の０〜６０時間後、暴露の０〜７２時間後、暴露の３日後、暴露の４日後に行うこともでき、さらには暴露の１０日後であっても行うことができる。

本発明は、動物において感染性因子に対する免疫応答を誘導するための方法であって、その動物に、ＭＶＡ（好ましくはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標））を含む免疫原性組成物を、感染性因子による感染の２〜０日前、もしくは１〜０日前、または感染性因子による感染前の、これらの日数に含まれる時間の他の任意の組合せ（例えば４８〜３６、４８〜２４、３６〜２４、２４〜１２、１２〜０時間など）の時点で、投与することを含む方法を包含する。ある実施形態では、感染性因子が複製可能なポックスウイルスである。好ましい実施形態では、動物がヒトである。

本発明は、動物において感染性因子に対する免疫応答を誘導するための方法であって、その動物に、ＭＶＡ（好ましくはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標））を含む免疫原性組成物を、感染性因子による感染の０〜３日後、０〜２日後、０〜１日後、もしくは１〜２日後、または感染性因子による感染後の、これらの日数に含まれる時間の他の任意の組合せ（例えば０〜１２、１２〜２４、２４〜３６、２４〜４８、２４〜７２、３６〜４８、４８〜６０、４８〜７２時間など）の時点で、投与することを含む方法を包含する。ある実施形態では、感染性因子が複製可能なポックスウイルスである。好ましい実施形態では、動物がヒトである。

本発明はさらに、上記の方法、ならびにＭＶＡ（好ましくはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標））を含む免疫原性組成物と、感染性因子への暴露の２〜０日前（暴露の２、１、または０日前、ならびに暴露の３６、１２、６、３、または１時間前を含む）の時点でその免疫原性組成物を送達するようにという取扱説明とを含むキットの使用を包含する。その時点は、感染性因子による感染前の、これらの日数に含まれる時間の任意の組合せ（例えば４８〜３６、４８〜２４、３６〜２４、２４〜１２、１２〜０時間など）内にあることができる。

本発明は、上記の方法、ならびにＭＶＡ（好ましくはＭＶＡ−ＢＮ（登録商標））を含む免疫原性組成物と、感染性因子への暴露の０〜３日後（暴露の０、１、２、または３日後、ならびに暴露の１、３、６、１２、３６、または６０時間後を含む）の時点でその免疫原性組成物を送達するようにという取扱説明とを含むキットの使用も包含する。その時点は、感染性因子による感染後の、これらの日数に含まれる時間の任意の組合せ（例えば０〜１２、１２〜２４、２４〜３６、２４〜４８、２４〜７２、３６〜４８、４８〜６０、４８〜７２時間など）内にあることができる。

本発明は、動物において保護的免疫応答を誘導するためのキットも包含する。好ましくは、前記免疫応答は、本明細書で定義する感染性因子に向けられる。ある実施形態では、キットがポックスウイルスを含む免疫原性組成物を含み、前記ポックスウイルスが前記動物において複製不能である。好ましい実施形態では、前記ポックスウイルスが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）である。キットは、免疫原性組成物の送達に関する取扱説明も含み得る。ＭＶＡは好ましくはＭＶＡ−ＢＮである。好ましくは、免疫原性組成物が１０^５〜５×１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌのＭＶＡを含有する。好ましい実施形態では、動物がヒトである。免疫原性組成物の送達に関する取扱説明は、感染性因子への暴露前または暴露後のさまざまな時点における送達を指示することができる。これらの時点には、感染性因子への暴露の２日前から感染性因子への暴露の３日後までの時点が含まれ得る。ある実施形態では、取扱説明が、感染性因子への暴露後に、好ましくは感染性因子（好ましくは痘瘡）への暴露後できるだけ早く、ＭＶＡを送達するように指示する。キットはさらに、別個のバイアルに入った本明細書に定義する感染性因子と、ヒトを含む動物へのその感染性因子の送達に関する取扱説明とを含んでもよい。感染性因子は、好ましくは、炭疽菌または痘瘡から選択される。

この文脈において、「暴露」とは、感染性因子そのものとの接触、または感染性因子を保因する動物（ヒト）との接触を意味する。例えば取扱説明は、感染性因子への暴露の３６、２４、１２、６、３、もしくは１時間〜０時間前、または感染性因子への暴露の０〜１、３、６、１２、２４、３６、４８、６０、もしくは７２時間後に、免疫原性組成物が送達され得るように指示することができる。例えば、取扱説明は、感染性因子による感染の４８〜３６、４８〜２４、３６〜２４、２４〜１２、１２〜０前など、または感染性因子による感染の０〜１２、１２〜２４、２４〜３６、２４〜４８、２４〜７２、３６〜４８、４８〜６０、４８〜７２後などの送達を指示することができる。好ましくは、感染性因子は痘瘡または炭疽菌である。取扱説明は、ＭＶＡを静脈内、筋肉内、および／または皮下投与するように指示することができる。取扱説明は、ＭＶＡを鼻腔内投与するように指示することができる。

病原体は好ましくはウイルスまたは細菌である。好ましい実施形態では、病原体がポックスウイルス、好ましくは天然痘ウイルスである。

ある実施形態では、個体が健康なヒトである。もう一つの実施形態では、個体が、免疫欠陥を持つヒト、例えばＨＩＶ−１感染個体、アトピー性皮膚炎を持つ個体、免疫抑制剤を服用している患者、またはアレルギーを持つ個体である。

宿主域が制限され高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株である修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）は、ヒトおよび試験された他の哺乳動物中で増えることができない。しかし、非許容細胞におけるウイルス遺伝子発現は損なわれていないので、本発明の組換えＭＶＡウイルスは、例外的に安全で効率の良い発現ベクターとして使用することができる。

痘瘡の原因因子である天然痘ウイルスを含むポックスウイルスは、免疫応答を抑制するために複数の戦略を発達させてきた。本発明は、ポックスウイルスがｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９依存的経路ならびにＴＬＲ９非依存的経路によって認識されることを示す証拠を提供する。病原性ポックスウイルスは通常型樹状細胞（ＤＣ）が利用するＴＬＲ９非依存的経路によるそれらの認識を効果的に抑制したが、ＴＬＲ９を介して形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）によって検出された。ＴＬＲ９の欠如は、インビトロでのＤＣ応答を抑止し、マウスポックスウイルスであるエクトロメリアウイルス（ＥＣＴＶ）による感染に対するマウスの感受性を激しく増加させた。感染時の修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）−ＢＮ（登録商標）の同時投与は、ＴＬＲ９またはインターフェロンＩ型受容体（ＩＦＮ−Ｉ−Ｒ）の非存在下でさえ、ＥＣＴＶからの確実な即時保護につながった。ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）は、ＥＣＴＶによる感染後に投与された場合にも、マウスを救った。このように、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）は、免疫適格マウスならびに免疫欠陥マウスにおいて、致死的ＥＣＴＶ感染からの確実な即時保護、そしてさらには暴露後保護を誘導した。

下記実施例１〜１１に提示するデータは、ポックスウイルスが、他のｄｓＤＮＡウイルスファミリーについて以前に示されたように、ＴＬＲ９依存的認識経路ならびにＴＬＲ９非依存的認識経路によって検出されることを証明している。ヒト細胞における複製能を失っている高度に弱毒化されたＶＡＣＶであるＭＶＡは、ｐＤＣにより、ＴＬＲ９依存的経路とＴＬＲ９非依存的経路の両方で認識されることがわかったが、ｃＤＣでは、ＴＬＲ９非依存的経路によってのみ認識された。この知見は、ＨＳＶ−１で得られた先の知見と合致している（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １０１，１１４１６−１１４２１（２００４））。しかし、際立って対照的なことに、ＶＡＣＶ、ＥＣＴＶまたはＣＰＸＶのいくつかの株を含む病原性ポックスウイルスの認識は、ＴＬＲ９およびｐＤＣに決定的に依拠しており、これはおそらく、これらのウイルスがＴＬＲ９非依存的経路によるそれらの認識を阻害する強力な能力を持つからだろう。ｐＤＣまたはＴＬＲ９の非存在下では、この阻害能が、免疫認識を、したがってＤＣによる応答を、インビトロでほぼ完全に抑止した。これは、ＴＬＲ９欠損マウスが野生型マウスより１００倍以上高い感受性を持つ、ＥＣＴＶによるインビボ感染モデルをもたらした。

不活化ＶＡＣＶ、ＣＰＸＶおよびＥＣＴＶウイルスに対する応答はＴＬＲ９の存在に依存するので、これらのウイルスはおそらくＴＬＲ９依存的活性化経路とＴＬＲ９非依存的活性化経路の両方を阻害するのだろう。目を引くことに、ＴＬＲ９の非存在下では、ＤＣ成熟（ＣＤ６９発現）という最も高感度な読出しでさえ消滅したので、この阻害は事実上絶対的だった。Ａ４６ＲおよびＡ５２ＲのＶＡＣＶ産物など、ポックスウイルスがコードするいくつかの阻害遺伝子（Ｂｏｗｉｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：１０１６２−１０１６７（２０００）；Ｈａｒｔｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：３４３−３５１（２００３）；Ｓｔａｃｋら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：１００７−１０１８（２００５））は、ＴＬＲシグナリング分子の阻害に関連づけられている。ＥＣＴＶ、ＣＶＡ、ＣＰＸＶおよびＭＶＡの遺伝子比較は、４つのウイルスの全てがＡ４６Ｒのホモログを持つことを示す（Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８８：３２４９−３２５９（２００７））。ＣＶＡおよびＣＰＸＶはＡ５２Ｒのホモログも発現させるが、ＭＶＡはこの構成要素を欠いている。本発明者らがこの研究に使用したＥＣＴＶモスクワ（Ｍｏｓｃｏｗ）株は、おそらく機能的ではないであろう断片化されたＡ５２Ｒ遺伝子を持つ（Ｃｈｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１７：１６５−１８６（２００３））。ＴＬＲ９依存的認識経路およびＴＬＲ９非依存的認識経路によるＤＣ活性化の阻害におけるＡ４６ＲおよびＡ５２Ｒの潜在的役割を解明するために、Ａ４６ＲおよびＡ５２Ｒを欠くまたはそれらを発現する組換えＶＡＣＶが構築された。内在性Ａ４６Ｒに加えてＡ５２Ｒを発現させる組換えＭＶＡ（したがってこれは阻害性ＣＶＡ（Ａ４６ＲとＡ５２Ｒを内在的に発現させる）と似ている）は、ＤＣ成熟およびサイトカイン誘導の解析によって判定したところ、野生型ＭＶＡと比較して有意な阻害の増加を一切示さなかった。対照的に、Ａ４６ＲとＡ５２Ｒをどちらも発現させないＣＶＡの欠失突然変異体は、その阻害能を失わなかった。これは、Ａ５２Ｒ欠損ＶＡＣＶがＤＣ成熟に対する阻害活性を依然として保っていたことを示す先に公表されたデータと一致している（Ｄｒｉｌｌｉｅｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８５：２１６７−２１７５（２００４））。総合すると、これらのデータは、Ａ４６Ｒ（非阻害性ＭＶＡが内在的に発現させるもの）とＡ５２Ｒがどちらも、この研究において定義されるＴＬＲ９依存的認識またはＴＬＲ９非依存的認識の主要な阻害構成要素ではないことを示唆している。

ＭＶＡに対する応答におけるＴＬＲ９非依存的認識の性質は、他のＤＮＡウイルスに対する応答における認識経路と同様に、今なお判然としない（Ｉｓｈｉｉら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５２５−５３２（２００６））。しかし最近の報告により、ＴＬＲ関連アダプター分子ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦならびにＰＫＲの存在に対する絶対的依存性は除外される（Ｚｈｕら，Ｂｌｏｏｄ １０９：６１９−６２５（２００７）；Ｗａｉｂｌｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１２１０２−１２１１０（２００７））。最近、ＤＮＡの新しい細胞内センサー（ＤＡＩ）が同定された（Ｔａｋａｏｋａら，Ｎａｔｕｒｅ ４４８：５０１−５０５（２００７））。ＤＡＩをサイレンシングするｓｉＲＮＡの存在下または非存在下で細胞を感染させることにより、トランスフェクトされたＤＮＡまたはＨＳＶ−１に対する応答はＤＡＩにある程度依存するが、ＲＮＡに対する応答はそうでないことが示された。しかし、ＨＳＶ−１に対する応答は減少するものの、抑止されるわけではなく（ポックスウイルスに対する応答は調べられていない）、さらなるＤＮＡウイルス認識経路の存在が示唆された。他の研究者は、マウス胚線維芽細胞が、ＭＶＡ（遺伝子Ｅ３Ｌを欠くもの）に、非古典的ＩκＢキナーゼファミリーメンバーＴＢＫ１およびＩＫＫｉの存在に依存せずに応答すること（Ｉｓｈｉｉら，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：４０−４８（２００６））、およびＭＶＡに応答して起こるＩＦＮ−αの誘導がウイルス増殖およびＤＮＡ複製には依存しないこと（Ｗａｉｂｌｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１２１０２−１２１１０（２００７））を示している。

ＨＳＶのＴＬＲ９非依存的認識の場合、細胞タイプが異なれば要件も異なる場合があることを、最近の刊行物が示唆している。ｃＤＣでは、ＩＦＮ応答は、ウイルス複製には依存しなかったが、ウイルス侵入には依存した。対照的に、マクロファージおよび線維芽細胞では、ＩＦＮ−Ｉ産生がウイルス侵入と複製の両方に依存し、その上さらに、機能的なミトコンドリアシグナリングタンパク質経路にも依存し、このことは、ＲＮＡ構成要素が関与する可能性を示唆する（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１３３１５−１３３２４（２００７）；Ｗｅｂｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５０５９−５０６４（２００６））。したがって、ＤＮＡウイルスの免疫学的認識は、少なくともＲＮＡウイルスの認識と同程度に、冗長（ｒｅｄｕｎｔａｎｔ）であるらしい。異なるウイルスが発達させた抑制機構、ポックスウイルスが使用する機構の一部は、おそらく、冗長なＤＮＡウイルス認識経路の発達に非常に大きな進化的圧力をかけただろう。

ポックスウイルスは２つのサブファミリー、すなわち昆虫などの無脊椎動物に感染するポックスウイルス（エントモポックスウイルス亜科）と、脊椎動物に感染するポックスウイルス（チョルドポックスウイルス亜科）に、分割される。脊椎動物は、全ての種とは言わないまでも、多くの種が、高病原性ポックスウイルスに対抗して生き残るために、進化の過程で常に戦ってきた。現在、爬虫類、鳥類および哺乳動物の多くの異なる種に感染するポックスウイルスが知られている。魚ほど古い脊椎動物でもＣｐＧ−ＤＮＡ刺激に応答することが知られており、ＴＬＲ９の発現が示唆される。ＴＬＲ９系は、ＩＦＮ−Ｉ産生にＴＬＲ９を使用する専門のＤＣサブセットｐＤＣと共に、ポックスウイルス感染の検出とそれに対する防御に関する強い進化的圧力下で最適化されたと推測することができるだろう。

マウス細胞とヒト細胞におけるＴＬＲ９発現は著しく異なる。どちらの種でも、ｐＤＣおよびＢ細胞はＴＬＲ９に関して陽性であり、ＴＬＲ９刺激に応答するが、マウスのｃＤＣサブセットおよびマクロファージもＴＬＲ９を発現させる。そのうえ、一つの種内でさえ、異なる細胞タイプはＴＬＲ９リガンドに対して違った形で選択的に応答する。これにはｐＤＣのユニークなＩＦＮ−α産生能が含まれるだけでなく、異なるＴＬＲ９アゴニストに対するＢ細胞の選択的な応答にも、これが示される。マウスＢ細胞は、Ｂ型ＣｐＧ−ＯＤＮに対して活性化され増殖するが、Ａ型ＣｐＧ−ＯＤＮまたは精製プラスミドＤＮＡに対してはそうでないことが、以前、記載された（Ｓｐｉｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：５９０８−５９１２（２００３））。考え得る一つの説明は、異なるＴＬＲ９リガンドの細胞タイプ特異的な取込みおよびエンドソームプロセシングだろう。これは、この研究で使用されたｃＤＣが、それらはＴＬＲ９を発現させ人工ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ−ＯＤＮに応答するにもかかわらず、ＭＶＡに応答して起こるＴＬＲ９非依存的刺激だけを示し、ＴＬＲ９依存的刺激は何も示さなかった理由の説明にも、おそらくなるだろう。

ＭＶＡによって誘導される免疫保護はＴＬＲ９応答を欠く状況において明らかに意味があり、したがってＭＶＡに応答して起こる免疫活性化はＴＬＲ９またはｐＤＣのみに依存するわけではなかった。ｐＤＣの数および機能が損なわれ、したがってＴＬＲ９依存的ＩＦＮ−Ｉ産生が損なわれるという、ヒトに関して記載された状態では、ｐＤＣまたはＩＦＮ−Ｉ非依存的免疫活性を誘導するＭＶＡのこの特徴が重要になり得る。これらには、がんおよび移植患者、免疫抑制剤を服用している人々、およびＨＩＶを持つ人々（抗ウイルス処置を受けている人々を含む）が含まれる（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４，２３９６−２４０３（２００５）；Ｄｏｎａｇｈｙ，Ｈ．ら，Ｂｌｏｏｄ ９８，２５７４−２５７６（２００１）；Ｃｈｅｈｉｍｉ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，４７９６−４８０１（２００２）；Ｂｏｏｒ，Ｐ．Ｐ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．６，２３３２−２３４１（２００６）；Ｓｉｅｇａｌ，Ｆ．Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ７８，１１５−１２３（１９８６））。さらにまた、アレルギーのような一部の免疫状態は、ウイルス誘発性ＩＦＮ−Ｉ産生の減少に関連する（Ｂｕｆｅら，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：８２−８８（２００２））。注目すべきことに、これらの状態の大半は、複製可能な痘瘡ワクチンの適用に関して禁忌とされている。

ＭＶＡはＩＦＮ−Ｉ−Ｒ欠損マウスをＥＣＴＶ感染からある程度保護できることを本発明者らは見出したが（図７）、従来の痘瘡ワクチンウイルスであるドライバックス（Ｄｒｙｖａｘ）の適用は、ＥＣＴＶチャレンジを行わなくても、これらのマウスを殺した。この知見は、他の免疫欠陥マウスにおけるＶＡＣＶワイエス（Ｗｙｅｔｈ）に対する致死性に関する以前の報告と合致した（Ｗｙａｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：４５９０−４５９５（２００４）；Ｐｅｒｅｒａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：８７７４−８７８３（２００７））。

この研究では、致死用量のＥＣＴＶと同時に与えられたＭＶＡが、適用部位とは無関係に（図６）、野生型マウスおよびＴＬＲ９欠損マウスを死から保護したことを証明し（図４、図５）、そのプロトコールを「即時保護（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）」と呼ぶ。これらの知見は、ＭＶＡが確実な先天免疫応答を誘導し、したがって適応免疫応答が発達するのに必要な時間を橋渡しすることを示している。

先天的保護相の機序を明確にするために、ＩＦＮ−Ｉに対する応答性を欠くマウスに、即時保護プロトコールを適用した。高用量暴露時に、これらのマウスは野生型マウスと同じようには保護されなかったことから、ＩＦＮ−Ｉは保護の一部であることが示唆された。しかし、ＩＦＮ−Ｉ−Ｒマウスは、それより低い用量だがそれでもなお致死的である用量のＥＣＴＶに対して保護されたことから、即時保護プロトコールの先天相では他の機序がＩＦＮ−Ｉの代わりを務め得ることが明らかに証明された。

ＥＣＴＶからの保護におけるＴＮＦ−αの役割は、ＥＣＴＶ感染に対するＴＮＦ受容体欠損マウスの増加した感受性ならびにＴＮＦ−αをコードするＶＡＣＶの弱毒化によって、以前に示された（Ｒｕｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１５９１−１５９６（１９９７））。同様の方法を使って、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−λ、ＣＤ４０Ｌ、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０、ＮＯおよび補体について、抗ウイルス活性が報告された（Ｅｓｔｅｂａｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２６４５−２６５９（２００５）；Ｒａｍｓｈａｗら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５９：１１９−１３５（１９９７）；Ｂａｒｔｌｅｔｔら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：１５８９−１５９６（２００５）；Ｎｉｅｍｉａｌｔｏｗｓｋｉら，Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．３８：２９９−３０７（１９９４））。可溶性構成要素とは別に、ＮＫ細胞の誘導のような細胞性先天機序も、ＥＣＴＶ感染を含むポックスウイルスによる感染時に重要な役割を果たすようである（Ｐａｒｋｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：４０７０−４０７９（２００７））。これらの機序および他の機序は、ＭＶＡが媒介する即時保護に関与し得る。

即時保護プロトコールが適応免疫応答の非存在下で持続的保護を誘導できないこと（図８）から、生存は最終的には適応免疫応答に依存することが明白に示された。ＲＡＧ−１欠損マウスにおける延命も、確実な保護的先天機序の持続時間の多少のしるしにはなったが、従来のワクチン接種戦略について先に述べたように、病原性ポックスウイルス感染を乗り切るには最終的にはウイルスを排除するために適応機序を必要とする。この必要条件から考えて、適応免疫応答が同時に効果的にトリガーされるのでなければ、ＩＦＮ−Ｉ、ＴＬＲリガンドまたは他の非特異的先天性刺激の適用のような先天機序の誘導だけでは、致死的ポックスウイルス感染からの保護に十分であるとは思われない。オルトポックスウイルス抗原を保有し、おそらくはＴＬＲ９を介して活性化する、ＵＶ不活化ＣＶＡを使った実験（図６ｂ）では、免疫適格マウスにおいて、多少の限定された保護が達成され得ることが示唆された。しかし、活性ＭＶＡで処置されたマウスが無症状のままであったのとは全く対照的に、全てのマウスが少なくとも病気になったという事実は、活性ＭＶＡによる保護の方がはるかに確実であることを示した。

ＴＬＲ９は、ポックスウイルスに関して、不可欠でありインビボで大きな意味を持つ認識分子であると同定された。重要なことに、これは、健康な個体および免疫欠陥個体において、潜在的に死をもたらすポックスウイルス感染に対して即時的および治療的介入を行うための一方法としての、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）の使用の証拠になる。

ここでは、ポックスウイルス科のメンバーがＴＬＲ非依存的認識経路によって認識されるという以前のデータが確認される（Ｚｈｕ，Ｊ．ら，Ｂｌｏｏｄ １０９，６１９−６２５（２００７））。しかし、ポックスウイルスがＴＬＲ９依存的経路によっても認識されることを示す。ＥＣＴＶのようないくつかのポックスウイルスは、ＴＬＲ９非依存的経路による認識を効果的に抑制するが、ＴＬＲ９では依然として認識される。

形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）は、ヒトおよびマウスにおいて、ＴＬＲ９経路によって多量のＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）を産生する唯一の細胞であり、一方、通常型ＤＣ（ｃＤＣ）を含む他の細胞は、ＴＬＲ９に依存しない異なる経路によってＩＦＮ−Ｉを産生することができる。ポックスウイルスがＴＬＲ９非依存的ＩＦＮ−Ｉ産生を完全に消滅させ、ＤＣの成熟に影響を及ぼすのに対して、ＴＬＲ９が駆動するｐＤＣのＩＦＮ−Ｉ産生は完全には阻止されないことを、ここに示す。

天然のマウス病原体ＥＣＴＶを使ったインビボ研究により、ＴＬＲ９の欠如は感染に対するマウスの感受性を１００倍以上高くすることが明らかになった。同様の感受性および致死動態は、ウイルス感染の管理に不可欠であると考えられるＩＦＮ−Ｉに応答することができないマウスに見出すことができた（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４，１９１８−１９２１（１９９４））。したがって、病原性ＤＮＡウイルスがそれらのＴＬＲ９非依存的認識を効果的に阻害する条件下では、ＴＬＲ９依存的ウイルス認識の役割、ＩＦＮ−Ｉ産生が、したがってｐＤＣが、少なくとも感染時の一次防御機序にとって、極めて重要になる。

哺乳動物中で複製する能力を失っている高度に弱毒化されたオルトポックスウイルスＭＶＡは、ロバストな適応免疫応答の強力な誘導物質であり、ワクチン接種された個体は、オルトポックスウイルス属に含まれる他のポックスウイルス種（例えばサル痘ウイルス（ＭＰＸＶ））から保護される（Ｅａｒｌ，Ｐ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ４２８，１８２−１８５（２００４）；Ｓｔｉｔｔｅｌａａｒ，Ｋ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｖｉｒ．７９，７８４５−７８５１（２００５））。哺乳動物中では複製することができないので、ＭＶＡは、高度に免疫欠陥を持つ個体でも、ワクチン候補として試験される（Ｇｈｅｒａｒｄｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２９２５−２９３ ６；Ｓｔａｉｂら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２９１７−２９２１（２００６））。しかし、適応免疫応答の効果的な誘導には数日〜数週間を要し、以前の報告により、病原性ポックスウイルスに対する限られた延命効果は、チャレンジウイルスへの暴露の遅くとも２日前にワクチン接種ウイルスを適用しなければ達成できないことが示されている（Ｓｔａｉｂ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７，２９１７−２９２１（２００６））。

ＭＶＡ−ＢＮが、インビトロで、ＴＬＲ９依存的経路とＴＬＲ９非依存的経路の両方によって、先天免疫保護サイトカイン（例えばＩＦＮ−Ｉ）の産生を誘導することを、ここに示す。ＥＣＴＶなどのポックスウイルスとは異なり、ＭＶＡは、ＴＬＲ９非依存的経路によってそれを認識するというＤＣの能力を阻害しなかった。この性質は、より阻害的な表現型を示したポックスウイルスからの保護に役立ち得る。

高用量の高病原性および種特異的マウス痘ウイルスＥＣＴＶと同時に行われるＭＶＡ−ＢＮの投与は、免疫適格マウスだけでなく、ＴＬＲ９を欠くマウスまたはＩ型インターフェロンに対する応答性を欠くマウスも、死亡から保護した。機能的なＩＦＮ−Ｉ応答を伴わないマウスは、低および中ＥＣＴＶチャレンジに対して保護されたが、より高用量を使用した場合には感染に屈し、保護の一機序にＩＦＮ−Ｉが関与すること、そしてそれが、他の手段によってある程度代替され得ることを示した。しかし、適応免疫応答を欠くマウス（Ｒａｇ−１欠損マウス）の場合、ＭＶＡ投与にはある程度の一時的利点しかなく、全てのマウスが最終的には死亡したことから、致死的ポックスウイルス感染からの総合的な保護にとって適応免疫応答の誘導は不可欠であることが示された。このようにＭＶＡは、インビボで、ＴＬＲ９非依存的経路による免疫応答を、この認識を強力に阻害するポックスウイルスの存在下でさえ、活性化することができた。重要なことに、ＭＶＡ−ＢＮの暴露後適用でさえ、ＴＬＲ９欠損マウスは、ＥＣＴＶによる致死的感染に対して、死から保護された。

この研究は、ポックスウイルスの認識およびポックスウイルスに対する防御にとって、ＴＬＲ９が重要な、そしてインビボで大いに意味のある、ＰＲＲであることを証明する。そのうえ、免疫系が欠陥を持つ条件下でさえ、ＭＶＡ−ＢＮは先天免疫応答および適応免疫応答を活性化し、それらを橋渡しして、長期間持続するだけでなく重要なことに即時的かつ治療的な、致死的ポックスウイルスチャレンジからの保護をもたらす。

提示するデータは、ポックスウイルスが、ｄｓＤＮＡウイルスの他のファミリーについて以前示されたように、ＴＬＲ９依存的認識経路でもＴＬＲ９非依存的認識経路でも検出されることを、明確に証明している。ヒト細胞中で複製する能力を失っている高度に弱毒化されたＶＡＣＶであるＭＶＡは、ｐＤＣにより、ＴＬＲ９依存的経路とＴＬＲ９非依存的経路の両方で認識されることがわかったが、ｃＤＣでは、ＴＬＲ９非依存的経路によってのみ認識された。ＭＶＡのＵＶ不活化後は、ｐＤＣとｃＤＣとからなる混合集団が、ＴＬＲ９の存在下でのみ、サイトカインを産生した（図２ｂ）。この知見は、活性ウイルスが、ＴＬＲ９に依存しないいくつかのＤＣサブセットおよびマクロファージにおいて、インビトロでＩＦＮ−αを誘導したのに対して、ｐＤＣはＴＬＲ９依存的経路も使用し、それが不活化ＨＳＶをも認識したという、ＨＳＶ−１に関する本発明者らの以前の知見とよく似ていた（Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１１４１６−１１４２１（２００４））。使用した不活化方法（ＨＳＶ−１の場合は熱不活化、ＭＶＡの場合は強いＵＶ照射）が、異なる細胞構成要素へのウイルスの選択的取込みをもたらした可能性はある（活性ウイルスが細胞質およびエンドソームに取り込まれるのに対して、不活化ウイルスの取込みはエンドソーム経路に限定される場合がある）。これは不活化後の完全なＴＬＲ９依存性の説明になり得る。

しかし、ＭＶＡとは際立って対照的なことに、ＶＡＣＶ、ＥＣＴＶまたはＣＰＸＶのいくつかの株を含む病原性ポックスウイルスの認識は、これらのウイルスがＴＬＲ９非依存的経路によるそれらの認識を阻害する強力な能力を持つため、ＴＬＲ９およびｐＤＣに決定的に依拠することをここに示す。ｐＤＣまたはＴＬＲ９の非存在下では、この阻害能が、免疫認識を、したがってＤＣによる応答を、インビトロでほぼ完全に抑止した。これらインビトロでの知見は、ＴＬＲ９欠損マウスが野生型マウスより１００倍以上高い感受性を持つ、ＥＣＴＶによるインビボ感染モデルをもたらした（図３）。ＴＬＲ９欠損マウスにおける他のｄｓＤＮＡウイルス感染モデルは、ＨＳＶ−１感染の場合のように感受性の増加を示さないか、またはＭＣＭＶ感染の場合のように狭い範囲内で中等度の増加を示すに過ぎなかった（Ｋｒｕｇら，Ｂｌｏｏｄ １０３：１４３３−１４３７（２００４）；Ｔａｂｅｔａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：３５１６−３５２１（２００４）；Ｄｅｌａｌｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：６７２３−６７３２（２００５））。

この研究により、ＴＬＲ９は、ポックスウイルスにとって重要な、そしてインビボで大いに意味のある、認識分子であると定義される。重要なことに、これは、健康な個体および免疫欠陥個体において、潜在的に死をもたらすポックスウイルス感染に対して即時的および治療的介入を行うための一方法としての、ＭＶＡ−ＢＮの使用の証拠になる。

効率の良い並外れて安全な発現ベクターとして役立ち得る組換えポックスウイルス（ＭＶＡウイルスを含むがこれに限定されるわけではない）を使用することが、本発明のさらにもう一つの目的である。ある実施形態において、本発明は、外来抗原（好ましくは病原性因子のもの）をコードする遺伝子を含有する組換えＭＶＡウイルス、およびそのようなウイルスを生理学的に許容できる形態で含有するワクチンに関する。本発明は、そのような組換えＭＶＡワクシニアウイルスまたはワクチンの調製方法、ならびにそのような病原性因子によって引き起こされる感染を予防するための、これらのワクチンの使用にも関係する。

本発明のＭＶＡウイルスは、異種ポリペプチドを発現させる組換えＭＶＡであることもできる。ＭＶＡゲノム内の天然の欠失、例えば欠失ＩＩ（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ＩＩ）またはＩＧＲに隣接するＭＶＡ ＤＮＡ配列に挟まれた、外来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡコンストラクトを、ＭＶＡに感染させた細胞中に導入して、相同組換えを起こさせることができる。ＤＮＡコンストラクトが真核細胞中に導入され、外来ＤＮＡがウイルスＤＮＡと組換えを起こしたら、所望の組換えワクシニアウイルスを自体公知の方法で、好ましくはマーカーを利用して、分離することができる（Ｎａｋａｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：１５９３−１５９６（１９８２）；Ｆｒａｎｋｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１９１８−１９２４（１９８５）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｆｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０３−３４０９（１９８５）；Ｆａｔｈｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９７−１０５（１９８６）参照）。

ある実施形態では、免疫適格マウスにおいて、ＭＶＡがマウスをマウスポックスウイルス・エクトロメリア（＞４７×ＬＤ５０）から即時的に保護する。

ある実施形態では、ＭＶＡが、ＴＬＲ９による、さらにまたＴＬＲ９非依存的経路による、樹状細胞における免疫応答を誘導する。対照的に、エクトロメリアウイルスのような病原性ポックスウイルスは、ＴＬＲ９非依存的認識を効率的に阻害するので、認識はＴＬＲ９に依存する。

ある実施形態では、ＴＬＲ９を欠く免疫欠陥マウス（ＴＬＲ９−ＫＯ）がエクトロメリア感染に対して１００倍高い感受性を持つ。

ある実施形態では、ＭＶＡが、ＴＬＲ９−ＫＯマウスをマウスポックスウイルス・エクトロメリア（＞５００×ＬＤ５０）から即時的に保護する。

ある実施形態では、ＭＶＡが、免疫欠陥マウス（ＩＦＮ−Ｉに対する応答性を欠くもの）をエクトロメリアウイルスによる低〜中チャレンジから保護する（２５匹中２４匹のマウスが本来なら致命的である１Ｅ＋０２または１Ｅ＋０３のエクトロメリアへの暴露を乗り切った）。

ある実施形態では、ＭＶＡの１回だけの適用によって達成される保護が長期間持続する。９週間後に、エクトロメリア（＞５００×ＬＤ５０）による初回感染からの保護が依然として存在する。

本発明のより良い理解の一助となるように、以下に詳細な実施例を記載する。しかし本発明はこれらの実施例によって限定されない。

本発明の他の実施形態は、本明細書に開示する本発明の明細および実施を考慮すれば、当業者には明白だろう。本明細書および実施例は単なる例示とみなされるものとし、本発明の真の範囲および要旨は、後述の請求項によって示される。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに例証する。ここに記載する実施例が、本発明によって提供される技術の利用可能性をこれらの実施例に限定するような形では決して解釈されないことは、当業者にはよく理解されるだろう。

＜実施例１＞
実験方法
以下の項は、本明細書に記載する全ての実施例において使用した方法の要約である。

動物モデル
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスはＨａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ（ドイツ・ボルヒェン）から購入した。記述されているように、１２９／ＳｖバックグラウンドでＴＬＲ９欠損マウスを作製し、少なくとも８世代にわたってＣ５７ＢＬ／６に戻し交配した（Ｈｅｍｍｉ，Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ４０８、７４０−７４５（２０００）；Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｈ．ら）。１２９／Ｓｖマウス系統とＣ５７ＢＬ／６マウス系統はどちらも、ＥＣＴＶ感染に対して比較的高い抵抗性を示すと考えられる（Ｔｓｃｈａｒｋｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：９５−１０４（２００５））。しかし、感染モデルにおいて系統バックグラウンドが影響を持つ可能性を排除するために、１２９／Ｓｖバックグランドを持つマウスをＥＣＴＶにｉ．ｎ．感染させたところ、実際にそれらはＣ５７ＢＬ／６マウスに見られる比較的抵抗性の表現型を示し、例えば１Ｅ＋０２ ＴＣＩＤ５０ の用量では１匹のマウスも死なず、３Ｅ＋０３の用量でさえ大半のマウスは生き残った。ＩＦＮ−Ｉ−Ｒ欠損マウス（Ａ１２９）マウスは元々はＭｉｃｈｅｌ Ａｇｕｅｔ博士（チューリッヒ大学）から入手したものであり（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４，１９１８−１９２１（１９９４））、それを８世代にわたってＣ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配した。ＲＡＧ−１欠損マウスはＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、チューリッヒにある動物施設で繁殖させた。

ウイルス
この研究に使用したＭＶＡは、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃによって開発され、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託（Ｖ０００８３００８）されたＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である。１１日齢孵化病原体フリー鶏卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、米国マサチューセッツ州）から調製し、１０％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ−１６４０で培養した初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で、ＭＶＡを増殖させ、力価測定した。ＣＶＡおよびＣＮＰＶはＡ．Ｍａｙｒ教授（ドイツ・ミュンヘン大学獣医学部）のご厚意により提供されたものであり、ＣＥＦで増殖させ、力価測定した。ＥＣＴＶモスクワ株およびＣＰＸＶブライトン（Ｂｒｉｇｈｔｏｎ）株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）からそれぞれＶＲ−１３７２およびＶＲ−３０２として入手したものであり、Ｖｅｒｏ Ｃ１００８細胞（ＥＣＡＣＣ ８５０２０２０６）で増殖させ、力価測定した。ＳＦＶはＡＴＣＣから入手（ＶＲ−３６４）したものであり、ＡＴＣＣから入手したウサギ角膜細胞株ＳＩＲＣ（ＣＣＬ−６０）で増殖させ、力価測定した。

細胞株は全て、１０％ＦＣＳを補足した、抗生物質を含まない、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ・カールスルーエ）で維持した。動物実験で使用したウイルスは全て、スクロースクッションで２回精製した。ウイルスのＵＶ不活化には、濃縮ウイルスストックを、滅菌条件下に、ＵＶチャンバ（Ｇｅｎｅｌｉｎｋｅｒ ＧＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ドイツ・ミュンヘン）で、１５分間、ＵＶ照射した。この処理により、組換えウイルスの導入効率は、元のウイルス活性の２％未満に低下した。
インビトロ実験
インビトロ生成Ｆｌｔ３リガンド依存的ＤＣ（ＦＬ−ＤＣ）は、本質的に以前記述されたように作製し、選別した（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，１１４１６−１１４２１（２００４））。要約すると、骨髄細胞をマウス組換えＦＬの存在下で８日間培養した。得られた細胞は＞９０％ＣＤ１ １ｃ陽性であり、細胞の２０〜６０％は形質細胞様表現型（ＣＤ１ １ｃ^ｐｏｓＣＤ４５ＲＡ^ｈｉｇｈＢ２２０^ｈｉｇｈＣＤ１ １ｂ^ｌｏｗ）を示した。ＦＬ−ＤＣは分離せずに使用するか、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使ってｐＤＣとｃＤＣに選別して使用した。インビトロ生成ＧＭ−ＤＣは、記述されているように（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，１１４１６−１１４２１（２００４））、骨髄細胞をマウス組換えＧＭ−ＣＳＦ（Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ、ドイツ・オッフェンバッハ）の存在下で培養することによって作製した。細胞を、ＣＤ１ １ｃ、Ｂ２２０、ＣＤ４０およびＣＤ６９に特異的な抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。最終洗浄液には死細胞をラベルするためにヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ）を含めた。フローサイトメトリー解析はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で行い、Ｗｅａｓｅｌソフトウェア（Ｔｈｅ Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、オーストラリア・メルボルン）を使って解析した。表示のウイルスまたは対照としてのＣｐＧ−２２１６（０．５μＭまたは１μＭ）と共に、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で１８〜２４時間インキュベートした後に、細胞培養上清を収集し、以前記載されたように市販のＥＬＩＳＡ試薬を使って、ＩＦＮ−ＩおよびＩＬ−６の分泌を測定した（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｈ．ら，（２００４））。

インビボ実験および統計
マウスをケタミン／キシラミンで麻酔し、ウイルスをｉ．ｎ．滴下注入により、５０μｌの総体積で適用した。表示のＥＣＴＶ希釈液を単独で、または１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡと組み合わせて適用した。皮下注射を鼠径部に行って、総量１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡまたは対応する量のＵＶ不活化ＣＶＡを、各２５０μｌの体積で２回注射することにより、適用した。感染マウスの健康状態を少なくとも１日１回はチェックし、深刻な病気の症状または２５％を超える体重減少を伴う動物を安楽死させた。ポックスウイルス特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞応答を決定するために、野生型またはＴＬＲ９欠損マウスを、５Ｅ＋０７ ＴＣＩＤ_５０または１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ_５０のＭＶＡに静脈内感染させた。免疫化の７日後に脾臓を収集し、その臓器を７０μｍフィルターで機械的に破壊することにより、単細胞懸濁液を調製した。脾細胞および末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を赤血球溶解バッファー（０．１４Ｍ ＮＨ_４Ｃｌおよび０．０１７Ｍ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．２）で処理し、２回洗浄し、解析した。免疫優性Ｂ８ＲペプチドＴＳＹＫＦＥＳＶを負荷したＰｒｏ５（登録商標）Ｈ−２Ｋｂペンタマー（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、英国オックスフォード）で細胞を染色した（Ｔｓｃｈａｒｋｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：９５−１０４（２００５））。ペンタマー染色は、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１９および抗ＮＫ１ １抗体と組み合わせて、製造者のプロトコールに従って行った。細胞内サイトカイン染色のために、細胞懸濁液を、１μｇ／ｍｌ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下、１μｇ／ｍｌ Ｂ８Ｒペプチドで、５時間刺激した。その後、細胞を抗ＣＤ８で表面染色し、次に、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で同時に固定／透過処理し、最後に、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−ＩおよびＩＬ−２に対する抗体で染色した。血清中のポックスウイルス特異的抗体を、ＥＬＩＳＡにより、ＭＶＡ粗抽出物を抗原とし、ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ドイツ）を検出抗体として測定した。動物実験は全てバイエルン州政府によって承認された。ＬＤ_５０の算出にはＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの方法を使用した。

＜実施例２＞
ＶＡＣＶ、ＣＰＸＶおよびＥＣＴＶの不活化はＤＣ成熟を増加させるが、ＭＶＡ、ＣＮＰＶおよびＳＦＶの不活化はＤＣ成熟を増加させない
ＶＡＣＶのいくつかの株はｃＤＣの成熟を阻害し、一方、ＭＶＡに応答して成熟が起こることが、以前に記述された（Ｅｎｇｅｌｍａｙｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：６７６２−６７６８（１９９９）；Ｄｒｉｌｌｉｅｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８５：２１６７−２１７５（２００４））。これらの研究ではｐＤＣの非存在下におけるｃＤＣの役割しか解析されなかったので、エクスビボマウス脾臓ｃＤＣおよびｐＤＣに良く似たＤＣからなるＦｌｔ３リガンド（ＦＬ）生成マウスＤＣを使用して（Ｎａｉｋら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：６５９２−６５９７（２００５））、両ＤＣタイプの活性化を調べた。異なるＶＡＣＶの異なる刺激活性が、ウイルスがコードする構成成分による刺激または活性阻害の欠如に起因するかどうかを試験するために、ＦＬ−ＤＣを、いくつかの異なるポックスウイルス株と共に（活性ウイルスとして、またはＵＶ不活化後に）、インキュベートした。ＶＡＣＶアンカラ株（ＣＶＡ）、ＥＣＴＶおよびＣＰＸＶに応答して起こるＤＣの活性化は、活性ウイルスに応答して起こるＤＣの活性化と比較して、ウイルスＵＶ不活化後に増幅された（図１ａ）。これらの初期データは、ＤＣに作用する阻害構成要素が、これらのウイルスによって作られることを示した。対照的に、ＭＶＡならびにカナリア痘ウイルス（ＣＮＰＶ）およびウサギショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）に応答して起こるＣＤ４０、ＣＤ６９およびＣＤ８６のアップレギュレーションによって測定したＤＣ活性化は、ＵＶ不活化後に増加せず（図１ｂおよび未掲載データ）、これらのウイルスは活性阻害構成要素を欠くことが示唆された。ＤＣ成熟の他にも、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６を含むサイトカインの産生も、ＣＶＡ、ＥＣＴＶおよびＣＰＸＶのＵＶ不活化後は増加したが、ＭＶＡ、ＣＮＰＶおよびＳＦＶのＵＶ不活化後には増加しなかったことから、成熟に限らず、ウイルス認識およびＤＣ機能の幅広い阻害が示唆された。

＜実施例３＞
ＣＶＡおよびＥＣＴＶの認識は排他的にＴＬＲ９に依存するが、ＭＶＡの認識はそうではない
ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスのようなｄｓＤＮＡウイルスは、ＴＬＲ９依存的認識経路およびＴＬＲ９非依存的認識経路によって認識され得ることが、以前に示されている（Ｂａｓｎｅｒ−Ｔｓｃｈａｋａｒｊａｎら，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．８：１３００−１３０６（２００６）；Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１１４１６−１１４２１（２００４））。ポックスウイルスの認識におけるＴＬＲ９の役割を解明するために、野生型動物またはＴＬＲ９欠損動物のＦＬ−ＤＣを生成させた。ＴＬＲ９の非存在下では、ＤＣは、ＣＤ４０およびＣＤ６９のアップレギュレーションの欠如によってモニターしたところ、活性ＣＶＡまたはＥＣＴＶに応答して有意に成熟することがなく、これらのウイルスの認識に関して強いＴＬＲ９依存性を示した。しかし、ＴＬＲ９の非存在下で、ＭＶＡは、ＣＤ６９のロバストなアップレギュレーションを誘導したが、ＣＤ４０のアップレギュレーションは著しく減少したことから（図２ａ）、ＭＶＡに対する応答はＴＬＲ９非依存的認識イベントとＴＬＲ９依存的認識イベントの両方に基づくことが示唆された。

ＦＬ−ＤＣは、ＴＬＲ９活性化に応答して多量のＩＦＮ−αを産生する唯一の細胞タイプとして知られるｐＤＣと、ＴＬＲ９に応答して多量のＩＦＮ−αを産生することはできないことが知られているｃＤＣを、どちらも含有する。野生型マウスおよびＴＬＲ９欠損マウスのＦＬ−ＤＣを活性ＭＶＡと共にインキュベートしたところ、用量に依存するロバストな量のＩＦＮ−αおよびＩＬ−６が産生され、ＭＶＡに関するＴＬＲ９非依存的認識経路の存在が証明された（図２ｂ）。しかし、ＵＶ不活化ＭＶＡはＩＦＮ−αおよびＩＬ−６を野生型ＦＬ−ＤＣでのみ誘導し、ＴＬＲ９欠損ＦＬ−ＤＣでは誘導せず、ＭＶＡの認識はＴＬＲ９依存的構成要素も利用するという成熟データによって示唆された認識が補強された（図２ｂ）。

ＧＭ−ＣＳＦを使ってインビトロで生成させたＤＣは、活性ＤＮＡウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ））に応答してＩＦＮ−αを産生することができるが、不活化ウイルスまたはＣｐＧ−ＯＤＮには応答しない、ｃＤＣのみのＤＣ集団（ＧＭ−ＤＣ）をもたらした（Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１１４１６−１１４２１（２００４））。ＧＭ−ＤＣを活性ＭＶＡと共にインキュベートすると、野生型細胞およびＴＬＲ９欠損細胞におけるＩＦＮ−αおよびＩＬ−６産生が誘導され、活性ＭＶＡのＴＬＲ９非依存的認識が証明された。ＵＶ不活化ＭＶＡとのインキュベーション後には、ＩＦＮ−α産生も構成的レベルを上回るＩＬ−６も検出されず（図２ｃ）、ＭＶＡに応答して起こるＴＬＲ９依存的認識がこれらの細胞では機能的でないことが潜在的に示された。

＜実施例４＞
ＥＣＴＶの認識は排他的にＴＬＲ９およびｐＤＣに依存するが、ＭＶＡの認識はそうではない
ＦＬ−ＤＣ中の二つの主要ＤＣサブセットの個々の活性化プロファイルを明確にするために、ｐＤＣとｃＤＣを選別し、ＥＣＴＶおよびＭＶＡに感染させ、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−６産生を測定した。野生型ｐＤＣはＥＣＴＶとＭＶＡの両方に対してＩＦＮ−αを産生し、ＥＣＴＶに対して極めてわずかなＩＬ−６を産生した。しかし、ｃＤＣまたはＴＬＲ９欠損ｐＤＣは、ＩＦＮ−αをＭＶＡに応答して産生しただけで、ＥＣＴＶに対しては産生しなかった（図２ｄ）。野生型ｃＤＣおよびＴＬＲ９欠損ｃＤＣは、ＭＶＡに応答して多量のＩＬ−６を産生したが、ＥＣＴＶに対してはそうでなかった。これらの結果は、ＤＣ成熟で得られた観察事実（図２ａ）を強化し、ＥＣＴＶの効果的な認識がＴＬＲ９の存在に依存すること、特にＥＣＴＶによるＩＦＮ−α産生がｐＤＣに依存することを証明している。ＥＣＴＶは他のＴＬＲ９非依存的経路による認識を明らかに阻害する。他方、ｐＤＣとｃＤＣの両方によるＭＶＡの認識は、追加のＴＬＲ９非依存的機序から構成される。

インビトロ生成ＦＬ−ＤＣに加えて、エクスビボ分離ｐＤＣ含有細胞集団を解析するために、インビボでのｐＤＣの豊富な供給源である野生型およびＴＬＲ９欠損型の全骨髄細胞を、活性ＭＶＡまたはＵＶ不活化ＭＶＡで、対照としてのＣｐＧ−ＯＤＮと並行して刺激した。ＦＬ−ＤＣでの結果と同様に、活性ＭＶＡが野生型およびＴＬＲ９欠損型の骨髄細胞においてロバストなＩＦＮ−α産生を誘導したのに対し、ＴＬＲ９の欠如により、ＵＶ不活化ＭＶＡおよびＣｐＧ−ＯＤＮに応答して起こるＩＦＮ−α産生は完全に抑止された（図２ｅ）。したがってこれらのデータにより、ＭＶＡは、新鮮分離骨髄細胞により、ＵＶ感受性のＴＬＲ９非依存的経路およびＴＬＲ９依存的経路で認識されることが証明された。

＜実施例５＞
ＴＬＲ９欠損マウスはＥＣＴＶ感染に対する感受性が激しく増加している
インビトロでのＴＬＲ９によるＤＮＡウイルスの認識は以前の報告によって明確に証明されているが、マウスの生存にとってのＴＬＲ９のインビボ関連性はあまり明らかでない。ＴＬＲ９欠損マウスは、ＨＳＶを使った感染モデルにおいて、生存率に相違を示さないか、またはマウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）を使った感染モデルにおいて、狭い範囲内での限定された生存率の相違を示した（Ｋｒｕｇら，Ｂｌｏｏｄ １０３：１４３３−１４３７（２００４）；Ｔａｂｅｔａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：３５１６−３５２１（２００４）；Ｄｅｌａｌｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：６７２３−６７３２（２００５））。ＥＣＴＶのようなポックスウイルスによるインビトロでのＴＬＲ９非依存的認識の強い抑制（図１、図２）を考慮して、これらのウイルスによる感染を乗り切るには、ＴＬＲ９が重要な因子であるだろうという仮説を立てた。これを検証するために、ヒト痘瘡感染を可能なかぎり模倣したマウス感染モデル、すなわち鼻腔内経路によるＥＣＴＶ感染モデルを使用した。ヒトにおけるＶＡＲＶ感染と同様に、ＥＣＴＶは高度に種特異的であり、わずかなウイルス用量を使用するだけで、暴露後に気道を介して効果的に感染することができる天然のマウス病原体である。また、これは、ＶＡＲＶと同様に、免疫抑制分子の大きなパネルを保持している（Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｄ．Ｊ．およびＢｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２６４５−２６５９（２００５））。

比較的高用量のＥＣＴＶ（１Ｅ＋０４組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０））を使った初期実験により、ＴＬＲ９欠損マウスは野生型マウスより少なくとも２日早く死亡することが証明された。感受性をさらに評価し、ＬＤ_５０を定量化するために、ＴＬＲ９欠損マウスおよび野生型マウスを、さまざまな用量のＥＣＴＶに感染させた。ＴＬＲ９欠損マウスはわずか３Ｅ＋０１ ＴＣＩＤ_５０でも感染後に全て死亡したが、１Ｅ＋０１ ＴＣＩＤ_５０では接種後に１匹も死亡しなかった（図３ｂ）。対照的に、１Ｅ＋０２ ＴＣＩＤ_５０による感染後に死亡した野生型マウスはなく、１Ｅ＋０４ ＴＣＩＤ_５０を使用した場合にのみ、全てのマウスがエクトロメリア感染に屈した（図３ａ）。３Ｅ＋０２〜３Ｅ＋０３ ＴＣＩＤ_５０の用量を使用した野生型マウスでの実験間には多少のばらつきがあり、これは部分的に性別特異的で、雄マウスの方が雌マウスより感受性が高かった。ＴＬＲ９欠損マウスについては１９ ＴＣＩＤ_５０というＬＤ_５０、野生型マウスについては約２１２０ ＴＣＩＤ_５０というＬＤ_５０が算出された。このようにＴＬＲ９欠損マウスは、ＥＣＴＶ感染に対して、野生型マウスより１００倍以上高い感受性を持つ。したがって、インビトロデータと強く一致して、ＴＬＲ９はＥＣＴＶ感染に対する免疫応答の不可欠な構成要素である。

＜実施例６＞
ＭＶＡは野生型マウスおよびＴＬＲ９欠損マウスを致死的ＥＣＴＶチャレンジから即時的に保護する
インビトロ実験により、ＥＣＴＶがＤＣによる認識を効果的に抑制するのに対して、ＭＶＡはＤＣを活性化することが証明された（図１）。そこで、病原体と同時に与えられたＭＶＡは、免疫系を活性化し、その結果として、病原性ポックスウイルスを潜在的に管理する免疫応答を誘導する場合があるという仮説を立てた。実際、１Ｅ＋０５ ＴＣＩＤ_５０という高致死用量のＥＣＴＶによるチャレンジと同時に、またはその直後に与えられたＭＶＡは、野生型マウスを死亡から完全に保護したのに対し、対照マウスは１Ｅ＋０４ ＴＣＩＤ_５０という１０分の１の用量で、全てが死亡した（図４）。
ＭＶＡはインビトロで免疫細胞の強いＴＬＲ９非依存的活性化を誘導したので、次に、ＭＶＡがＴＬＲ９欠損マウスをＥＣＴＶ感染から保護し得るかどうかを試験した。野生型マウスで見られた保護と同様に（図４）、ＭＶＡはＴＬＲ９欠損マウスを高致死用量のＥＣＴＶ感染から即時的に保護した。無処置の対照マウスが１Ｅ＋０２ ＴＣＩＤ_５０で全て死亡したのに対して、ＭＶＡ処置マウスは全て、ＴＬＲ９欠損マウスに関するＬＤ_５０の５００倍を超える用量に近い１Ｅ＋０４ ＴＣＩＤ_５０によるチャレンジさえ乗り切った（図５）。高用量のＥＣＴＶ（３Ｅ＋０３および１Ｅ＋０４ ＴＣＩＤ_５０）によるチャレンジを受けたＴＬＲ９欠損マウスは、２〜３週間後に尾病変を発症し、それは４週間後に消失することが観察された。他の点では無症状なＴＬＲ９欠損マウスにおける尾病変により、ＭＶＡ誘導性免疫応答は、重篤なＥＣＴＶ誘導性疾患および死亡を防止できるが、最初の数週間はウイルスを完全には除去できないことが示された。

＜実施例７＞
ＭＶＡを異なる部位に適用してもマウスを致死的ＥＣＴＶ感染から保護することができる 野生型マウスおよびＴＬＲ９欠損マウスにおける即時保護がＥＣＴＶ感染と同じ部位へのＭＶＡの同時投与に絶対的に依存するかどうかを確かめるために、マウスに致死用量のＥＣＴＶを鼻腔内的にチャレンジし、ＭＶＡを皮下注射によって適用した。ＭＶＡを皮下部位に適用した場合（図６）、ＴＬＲ９欠損マウス（図６ａ）および野生型マウス（図６ｂ）は、病気の徴候を何も示さず、致死的ＥＣＴＶ感染を乗り切った。このようにＥＣＴＶと同じ部位へのＭＶＡの同時投与は、即時保護によって不可欠ではなかった。

＜実施例８＞
不活化オルトポックスウイルスは致死的ＥＣＴＶ感染からの保護に関してＭＶＡよりも効率が低い
本発明者らのインビトロ実験により、ＵＶ不活化オルトポックスウイルスは排他的にＴＬＲ９アゴニストとして作用し、ＴＬＲ９非依存的な形で刺激する能力は失っていることが示唆されている（図２）。オルトポックスウイルス抗原の存在下で起こる、この「ＴＬＲ−９のみ」の刺激が、何らかの保護を開始するかどうかを調べるために、野生型マウスに致死用量のＥＣＴＶをチャレンジし、１Ｅ＋０８ ＴＣＩＤ_５０に相当するＵＶ不活化ＣＶＡを皮下適用した。チャレンジを受けた５匹のマウスのうち、１匹は１１日目に死亡したが、他のマウスは生き残った（図６ｂ）。しかし、同じ用量の活性ＭＶＡを皮下に投与されたマウスとは対照的に、不活化ＣＶＡで処置されたマウスは全て、傾眠を含む強い病気の徴候を示し、チャレンジの第４週まで治癒しない尾病変を発症した。このように不活化オルトポックスウイルスは、ウイルス抗原および潜在的ＴＬＲ９リガンドを提供するものの、活性ＭＶＡによって達成されるロバストな保護より劣った保護を誘導するようである。

＜実施例９＞
致死的ＥＣＴＶチャレンジからのＭＶＡによる即時保護は部分的にＩＦＮ−Ｉに依存しない
ＭＶＡの投与が他の免疫欠陥マウスを即時的に保護できるかどうかを解明するために、そしてまた、保護の機序を明らかにするために、ポックスウイルス感染を含むいくつかのウイルス感染に対して高度に感受性であることが知られているＩＦＮ−Ｉ受容体（ＩＦＮ−Ｉ−Ｒ）欠損マウスを使って、実験を行った（２６）。初期実験により、ＴＬＲ９欠損マウスと同様に、ＩＦＮ−Ｉ−Ｒ欠損マウスは、１Ｅ＋０２ ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶによるチャレンジ後に、全て死亡することが証明された。ＥＣＴＶに対するインビトロでのＩＦＮ−α産生はＴＬＲ９に依存するが、ＭＶＡに対するインビトロでのＩＦＮ−α産生はそうではないので、ＭＶＡが誘導するＩＦＮ−αは、ＴＬＲ９欠損マウスにおける即時保護の必須部分であるという仮説を立てた。しかし、無処置対照ＩＦＮ−Ｉ−Ｒ欠損マウスが１Ｅ＋０２ ＴＣＩＤ_５０ ＥＣＴＶのチャレンジで１０日以内に死亡したのに対して、即時的なＭＶＡ処置は、驚いたことに、ＩＦＮ−Ｉ−Ｒ欠損マウスを、１Ｅ＋０２および１Ｅ＋０３ ＴＣＩＤ_５０ ＥＣＴＶによるチャレンジから保護した（図７）。１Ｅ＋０２ ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶをチャレンジした合計１５匹のＩＦＮ−Ｉ−Ｒマウスのうち、１匹は足が腫脹し、倫理的理由から３週間後に安楽死させる必要があったが、他の１４匹と、１Ｅ＋０３ ＥＣＴＶをチャレンジした１０匹のマウスの全ては、４週間以上にわたって無症状だった。しかし、より高用量のＥＣＴＶでは、ＩＦＮ−Ｉ−Ｒ欠損マウスの保護は、はるかにロバストでなくなった。１Ｅ＋０４ ＥＣＴＶをチャレンジしたＩＦＮ−Ｉ−Ｒマウスの約半数は死亡し、１Ｅ＋０５ ＥＣＴＶをチャレンジしたＩＦＮ−Ｉ−Ｒマウスは全て死亡した（図７）。これらの高用量は、同じバックグラウンドを持つ野生型マウスがＭＶＡの存在下で生き残ることができたウイルスチャレンジに相当するので、ＭＶＡによる即時保護の機序の一つは、ＩＦＮ−Ｉによって媒介されると結論した。しかし、ＭＶＡは機能的なＩＦＮ−Ｉ系の非存在下でもマウスを低および中用量の致死的ＥＣＴＶ感染から保護することができたので、ある程度の保護がＩＦＮ−Ｉ非依存的機序によって媒介されることは明らかである。

＜実施例１０＞
ＥＣＴＶ感染におけるＭＶＡによる即時保護は適応免疫応答に依存する
ＭＶＡは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答および抗体形成（これらはどちらも病原性オルトポックスウイルスからの保護の一因になる）を含む強い適応免疫応答を誘導することが知られている（Ｗｙａｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：４５９０−４５９５（２００４））。ＴＬＲ９欠損マウスがＤＮＡワクチン接種時に安定なＣＴＬ応答および抗体応答を開始できることは、以前に示されており、したがってこれらのマウスは確実な適応免疫応答を開始する総合的能力を持つことが証明されている（Ｓｐｉｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：５９０８−５９１２（２００３）；Ｂａｂｉｕｋら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１３：１１４−１２０（２００４））。

ＴＬＲ９の不在がポックスウイルスに対する適応免疫応答に影響を及ぼすかどうかを調べるために、ＭＶＡを適用し、ポックスウイルスに対する抗体を血清においてＥＬＩＳＡで測定し、ポックスウイルス特異的ＣＴＬ応答を脾細胞および末梢血細胞においてＢ８Ｒに対するペンタマー染色によって測定した。ＴＬＲ９欠損マウスは、ロバストなポックスウイルス特異的抗体応答およびＣＴＬ応答を開始し、ＭＶＡワクチン接種に応答して起こる適応免疫応答がＴＬＲ９の存在には依存しないことを示した。

次に、測定された適応免疫応答がＥＣＴＶ感染に対して長期間持続する保護になるかどうか、したがって、ＴＬＲ９欠損マウスにおいてＭＶＡが誘導する保護が即時的であるだけでなく（図５）、長期間持続するものでもあるかどうかを調べた。最初のチャレンジの９週間後に、上述の実験で得たＴＬＲ９欠損マウス（図５）と、９週間前にＭＶＡだけを与えておいたマウスとに、１Ｅ＋０４ ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶを使って再チャレンジを行った。９週間前にＭＶＡを単独でまたはＥＣＴＶと組み合わせて単回投与されていたＴＬＲ９欠損マウスは全て、１Ｅ＋０４ ＴＣＩＤ_５０のＥＣＴＶによるチャレンジを乗り切った。即時保護で観察されたように、ＭＶＡ処置後のＴＬＲ９欠損マウスの長期間持続する保護は、ＬＤ_５０の５００倍を超えた。これらの実験により、ＭＶＡによる従来のワクチン接種時にＴＬＲ９欠損マウスはポックスウイルス感染に対しておそらくは適応免疫応答に依存する実質的な免疫保護を開始し、それを持続させる能力を持つことが証明された。

即時保護プロトコールにおける適応免疫応答の役割を立証するために、Ｒａｇ−１欠損マウスにＭＶＡの存在下または非存在下でＥＣＴＶをチャレンジした（図８）。Ｒａｇ−１欠損マウスは成熟Ｂ細胞およびＴ細胞を欠き、それゆえに抗体およびＣＴＬを産生することができない。ＭＶＡを同時投与しない場合、Ｒａｇ−１欠損マウスはＥＣＴＶチャレンジ（１Ｅ＋０２および１Ｅ＋０３）に応答して迅速に死亡した。ＭＶＡで同時処置すると、Ｒａｇ−１マウスの生存期間は数日間延びたが、最終的には全てのマウスが死亡し、ＥＣＴＶを乗り切るには、直ちに適用したＭＶＡの存在下でさえ、適応免疫応答が実際のところ決定的に重要であることが証明された。

＜実施例１１＞
ＥＣＴＶによる感染の２日後に適用された場合にＭＶＡはＴＬＲ９欠損マウスを完全に救う
痘瘡感染に関するＷＨＯ勧告には、暴露後できるだけ迅速なワクチン接種が含まれる。しかし、痘瘡に対する暴露後ワクチン接種の成功については逸話的歴史的情報しか存在せず、ほとんどの場合、個体のワクチン接種前状況は不明だった（Ｆｅｎｎｅｒ，Ｆ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ａｒｉｔａ，Ｉ．，Ｊｅｚｅｋ，Ｚ．，およびＬａｄｎｙｉ，Ｉ．Ｄ．「Ｓｍａｌｌｐｏｘ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ」（ジュネーブ：世界保健機関；１９８８）；Ｍｏｒｔｉｍｅｒ，Ｐ．Ｐ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３６，６２２−６２９（２００３））。そのうえ、感染モデルとしてサルにおけるＭＰＸＶまたはマウスにおけるＶＡＣＶを使用した動物モデルでは、暴露後ワクチン接種に有意な延命効果は観察されなかった（Ｓｔｉｔｔｅｌａａｒら，Ｎａｔｕｒｅ ４３９：７４５−７４８（２００６）；Ｓｔａｉｂら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２９１７−２９２１（２００６））。このように本発明の結果は予想外である。

このシナリオと、ＥＣＴＶの鼻腔内感染モデルがヒトにおける痘瘡感染の良い動物モデルとみなされるという事実とを考慮して（Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｄ．Ｊ．およびＢｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２６４５−２６５９（２００５））、ＭＶＡによる致死的ＥＣＴＶ感染からのロバストな即時保護を、ＭＶＡによる治療的暴露後介入に拡大することができるかどうかを解析した。図９に示すように、致死用量のＥＣＴＶへの暴露の２日後までに与えられたＭＶＡは、明白な病気の徴候を何も示さずに、ＴＬＲ９欠損マウスを死亡から完全に保護した（図９および未掲載データ）。致死用量のＥＣＴＶの３日後になってからＭＶＡ処置を受けた群でも一部のマウスは生き残った（図９ｂ）。これらのデータは、暴露後処置としての使用による、種特異的オルトポックスウイルス感染に対する死亡からの保護を示している。
本願は特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．動物において感染性因子に対する免疫応答を誘導するための、ポックスウイルスを含む免疫原性組成物の調製を目的とする、前記ポックスウイルスの使用であって、前記免疫原性組成物がその感染性因子による感染の３６時間前からその感染性因子による感染の７２時間後までの間にその動物に投与され、前記ポックスウイルスがその動物中で複製不能である使用。
２．動物において感染性因子に対する免疫応答を誘導するための方法であって、その感染性因子による感染の３６時間前からその感染性因子による感染の７２時間後までの間に、その動物に、ポックスウイルスを含む免疫原性組成物を投与することを含み、前記ポックスウイルスがその動物中で複製不能である方法。
３．ポックスウイルスを含む免疫原性組成物が感染性因子による感染の３６時間前から感染性因子による感染の４８時間後までの間に投与される、上記１または２に記載の使用または方法。
４．動物がヒトである、上記１〜３のいずれか一項に記載の使用または方法。
５．ポックスウイルスが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ：ＭＶＡ）である、上記１〜４のいずれか一項に記載の使用または方法。
６．感染性因子が複製可能なポックスウイルスである、上記１〜５のいずれか一項に記載の使用または方法。
７．ＭＶＡが１０ ^５ 〜５×１０ ^８ ＴＣＩＤ５０の用量で投与される、上記５に記載の使用または方法。
８．ＭＶＡが１０ ^７ 〜５×１０ ^８ ＴＣＩＤ５０の用量で投与される、上記７に記載の使用または方法。
９．ＭＶＡが静脈内、鼻腔内、筋肉内、または皮下に投与される、上記５に記載の使用または方法。
１０．ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である、上記５に記載の使用または方法。
１１．ＭＶＡが組換えＭＶＡである、上記５に記載の使用または方法。
１２．ＭＶＡが少なくとも一つの抗原エピトープをコードする少なくとも一つの異種核酸配列を含む、上記１１に記載の使用または方法。
１３．抗原エピトープが感染性因子の抗原エピトープである、上記１２に記載の使用または方法。
１４．感染性因子がウイルス、真菌、病原性単細胞真核および原核生物、ならびに寄生生物から選択される、上記１３に記載の使用または方法。
１５．ウイルスがインフルエンザウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、および出血熱を引き起こすウイルスから選択される、上記１４に記載の使用または方法。
１６．感染性因子が炭疽菌である、上記１４に記載の使用または方法。
１７．免疫原性組成物が感染性因子による感染の２４時間前から感染性因子による感染の４８時間後までの間に投与される、上記６に記載の使用または方法。
１８．免疫原性組成物が感染性因子による感染の０〜２４時間前に投与される、上記１７に記載の使用または方法。
１９．免疫原性組成物が感染性因子による感染の０〜４８時間後に投与される、上記１７に記載の使用または方法。
２０．感染性因子が炭疽菌である、上記１８または１９のいずれか一項に記載の使用または方法。
２１．ヒトを含む動物において感染性因子に対する免疫応答を誘導するためのポックスウイルスを含む免疫原性組成物であって、前記ポックスウイルスがヒトを含む前記動物中で複製不能である免疫原性組成物。
２２．前記免疫原性組成物が、ヒトを含む動物に、感染性因子による感染の３６時間前から感染性因子による感染の７２時間後までの間に投与される、上記２１に記載の免疫原性組成物。
２３．ポックスウイルスが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）である、上記２１または２２に記載の免疫原性組成物。
２４．ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である、上記２３に記載の免疫原性組成物。
２５．ヒトを含む動物において保護的免疫応答を迅速に誘導するためのポックスウイルスを含むワクチンであって、ポックスウイルスがヒトを含む前記動物中で複製不能であるワクチン。
２６．ポックスウイルスが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）である、上記２５に記載のワクチン。
２７．ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である、上記２６に記載のワクチン。
２８．ヒトを含む動物において保護的免疫応答を迅速に誘導するためのワクチンの調製を目的とするポックスウイルスの使用であって、そのポックスウイルスがヒトを含む前記動物中で複製不能である使用。
２９．ポックスウイルスが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）である、上記２８に記載の使用。
３０．ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である、上記２９に記載の使用。
３１．ヒトを含む動物において感染性因子に対する免疫応答を誘導するためのキットであって、ポックスウイルスを含む免疫原性組成物を含み、前記ポックスウイルスがヒトを含む前記動物中で複製不能であるキット。
３２．前記免疫原性組成物が感染性因子への暴露の０時間前から３６時間前までの間の時点でヒトを含む前記動物に送達される、上記３１に記載のキット。
３３．前記免疫原性組成物が感染性因子への暴露の０時間後から７２時間後までの間の時点でヒトを含む前記動物に送達される、上記３１に記載のキット。
３４．前記ポックスウイルスが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）である、上記３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
３５．ＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である、上記３４に記載のキット。
３６．ＭＶＡが１０ ^５ 〜５×１０ ^８ ＴＣＩＤ５０の用量のＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）である、上記３５に記載のキット。
３７．ＭＶＡが組換えＭＶＡである、上記３４に記載のキット。
３８．感染性因子が痘瘡である、上記３１〜３７のいずれか一項に記載のキット。
３９．感染性因子が炭疽菌である、上記３７に記載のキット。
４０．ＭＶＡを含む免疫原性組成物と、痘瘡への暴露後できるだけ早く、その免疫原性組成物をヒトに送達するようにという取扱説明とを含むキット。

Claims (14)

1. ヒトにおいて痘瘡に対する保護的免疫応答を誘導するための、修飾ワクシニア・アンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ：ＭＶＡ）を含む免疫原性組成物の調製を目的とする、前記ＭＶＡの使用であって、前記免疫原性組成物が痘瘡への暴露後０〜４８時間の範囲内でそのヒトに投与される、使用。
2. ＭＶＡウイルスが１０^５〜５×１０^８ ＴＣＩＤ５０の用量で投与される、請求項１に記載の使用。
3. ＭＶＡウイルスが１０^７〜５×１０^８ ＴＣＩＤ５０の用量で投与される、請求項２に記載の使用。
4. ＭＶＡウイルスが静脈内、鼻腔内、筋肉内、または皮下に投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
5. ＭＶＡウイルスがＭＶＡ−ＢＮである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
6. ＭＶＡウイルスが組換えＭＶＡウイルスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
7. 免疫原性組成物が痘瘡への暴露後０〜２４時間の間に投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
8. ヒトにおいて痘瘡に対する保護的免疫応答を誘導するための、修飾ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）を含むワクチンであって、前記ワクチンが痘瘡への暴露後０〜４８時間の範囲内でそのヒトに投与される、ワクチン。
9. ＭＶＡウイルスが１０ ^５ 〜５×１０ ^８ ＴＣＩＤ５０の用量で投与される、請求項８に記載のワクチン。
10. ＭＶＡウイルスが１０ ^７ 〜５×１０ ^８ ＴＣＩＤ５０の用量で投与される、請求項９に記載のワクチン。
11. ワクチンが静脈内、鼻腔内、筋肉内、または皮下に投与される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のワクチン。
12. ＭＶＡウイルスがＭＶＡ−ＢＮである、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のワクチン。
13. ＭＶＡウイルスが組換えＭＶＡウイルスである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のワクチン。
14. ワクチンが痘瘡への暴露後０〜２４時間の間に投与される、請求項８〜１３のいずれか一項に記載のワクチン。

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