CN102559609A

CN102559609A - 用于预防艾滋病的重组腺病毒疫苗

Info

Publication number: CN102559609A
Application number: CN2010105783372A
Authority: CN
Inventors: 于湘晖; 孔维; 詹杨; 于彬
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2010-12-08
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明提供一种用于预防艾滋病的复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗，它包含了可编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的核苷酸序列。本重组腺病毒疫苗所含有的转录单位编码的是HIV-1B/C重组型的完整核心蛋白Gag、编码酶类蛋白的Pol和外膜蛋白Env。此外，为了基因表达效率的提高，本重组腺病毒最终选择的为修饰过的Gag、Pol基因及野生型的Env基因。

Description

用于预防艾滋病的重组腺病毒疫苗

技术领域

本发明涉及一种新的疫苗，尤其是，所述疫苗为含有编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的经过人工修饰的Gag、Pol和野生的Env核苷酸序列的重组腺病毒。这些疫苗在体内施用时用作病毒蛋白抗原生物合成的转录单位。

背景技术

艾滋病被认为是世界上直接威胁人类健康的第一大传染病，联合国艾滋病联合规划署发表的《2004全球艾滋病疫情年度报告》指出，目前全球有3800万名艾滋病病毒携带者，2003年共有290万人死于艾滋病。2003年，亚洲地区共有110万人被感染，50多万人死于艾滋病，该地区目前共有740万名艾滋病毒携带者。2003年底，中国有艾滋病病毒感染者约84万，其中艾滋病患者约8万例。报告感染数波及31个省、自治区、直辖市。虽然近几年抗艾滋病药物的“鸡尾酒”疗法在发达国家有效地控制了HIV的蔓延，但是昂贵的价格(在我国该药物价格大约为3000-10000元人民币/人/月)，耐药病毒株的产生，长期用药的副作用以及最终无法彻底清除患者体内病毒等方面的不利因素显示，只有艾滋病疫苗才能真正有效地预防和控制艾滋病。所以艾滋病疫苗研制势在必行。

国内外有关方面研究现状

用HIV-1疫苗防治AIDS被国际上认为是目前最行之有效的方法，已成为世界上许多科研机构研究的热点。目前，关于艾滋病疫苗的生产国际上尚属空白。而HIV-1疫苗的研制工作在国外已有多家大型科研机构、制药公司正开展进行。

自八十年代发现艾滋病以来，人们就开始进行艾滋病疫苗的研究。一般来说，减毒活疫苗和灭活疫苗能产生较好免疫保护性反应，但安全性较差，不适用于作为艾滋病疫苗。随着人类对艾滋病认识的不断提高，九十年代初人们意识到CTL(Cytotoxic T Lymphocytes细胞毒性T细胞，即细胞免疫应答)的重要性，越来越多的证据显示阳性CD8介导的CTL在控制艾滋病毒感染中起举足轻重的作用。因此人们开始研究用重组病毒载体疫苗来诱导CTL，然后用胞膜蛋白亚单位疫苗增强免疫来诱导中和抗体，力图从体液免疫和细胞免疫两方面来诱导人体对艾滋病毒的保护反应。但由于免疫强度有限，而用重组载体疫苗又难以进行多次增强免疫，所以在动物模型和人体试验结果都显示了较低的对HIV的免疫保护反应。

与其他病毒载体相比，腺病毒载体具有许多独特的优点：①腺病毒颗粒相对稳定，病毒基因组重排频率低，外源基因插入段在病毒复制几个周期后仍可保持不变，易用于重组DNA操作；②安全性较好，腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低；③腺病毒基因组较大(36kb)，绝大多数基因组(约35kb)均能被外源基因取代，插入大片段外源性基因的潜力大；④有较大的宿主范围，对于受体细胞是否处于分裂期要求不严格；⑤腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并有效表达成活性蛋白。因此，第一代复制缺陷型腺病毒载体在动物模型中显示了高效的临床前转导效率和良好的效果。

国内研究艾滋病疫苗的队伍主要有中国预防医学科学院、卫生部艾滋病预防与控制中心和病毒学研究所、清华大学、中国科学院微生物所及一些部队院校等。

发明内容

本发明提供一种用于预防艾滋病的重组腺病毒疫苗(A-GPE)。

本发明采取的技术方案是：该预防艾滋病的重组腺病毒疫苗一种含有转录单位的经过重组的腺病毒，所述转录单位编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白序列，该人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白序列是具有免疫原性的人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)抗原，其中转录单位指导抗原的合成。本发明的一个重要方面，采用的腺病毒是复制缺陷型腺病毒。在本发明的另一个重要方面，所含有的转录单位编码的是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重组型的结构蛋白，进一步包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白Gag、编码酶类蛋白的Pol和外膜蛋白Env。其各氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4所述。

本发明所述的重组的腺病毒是非复制型的。

本发明可作为一种用于预防艾滋病的复制缺陷型的重组腺病毒载体疫苗，它包含了可编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的核苷酸序列。

在本发明的一个重要实施方案中，包含由穿梭质粒pDC316-GPE与5型腺病毒重组而成，穿梭质粒pDC316-GPE包含了编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的核苷酸序列，穿梭质粒pDC316-GPE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，其中编码GagPol的核苷酸序列来源于经过修饰的野生型人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的GagPol的核苷酸序列，而编码Env蛋白的核苷酸序列则来源于未经修饰的野生型人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的Env的核苷酸序列。

本发明提供了一种药用组合物，为含有转录单位的经过重组的腺病毒和一种可药用的载体。它的一个重要实施方案中含有转录单位的经过重组的腺病毒A-GPE与生理盐水的滴度体积比为：10⁶-10¹⁰pfu/ml，每次注射0.1ml，注射1次。

本发明提供了一种抗原，其由含有转录单位的经过重组的腺病毒表达产生，该表达产生的是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的结构蛋白Gag、Pol和Env。

本发明的优点在于：(1)表达水平高；(2)感染多种细胞，使抗原有效地提呈到不同的组织；(3)安全性好；(4)疫苗靶抗原包括了几乎所有的HIV-1结构蛋白，如GagPol和Env，更好的诱导人体产生对HIV有效的免疫保护。

附图说明

图1、穿梭质粒pDC316-GPE示意图。该质粒共含有10770bp，包括ITR与loxP两段与腺病毒载体的同源序列，正是由于这两段同源序列的存在，使该重组穿梭质粒pDC316-GPE和腺病毒包装质粒在细胞内能发生同源重组，从而构建了重组腺病毒载体疫苗A-GPE。

图2、A-GPE示意图。HIV-1结构基因表达框架重组到Ad-5的骨架序列中，基因表达的启动子采用MCMV。

图3gagpol基因重组腺苗病毒在哺乳动物细胞中的表达情况。

含有gagpol基因的重组病毒感染HEK293细胞，感染48-72小时后收集细胞，用WESTEN BLOT检测蛋白表达情况。LANE 1：空白对照；LANE 2：未修饰的gagpol基因表达产物；LANE 3：修饰的gagpol基因表达产物。

图4A-GPE在哺乳动物细胞中的表达。

人HEK293细胞被A-GPE感染。蛋白表达用WESTERN BLOT分析。实验所用抗体为广西壮族自治区HIV-1阳性血清。LANE 1：标准蛋白分子量；LANE2：空白对照；LANE 3：A-GPE表达产物；LANE 4：标准病毒(广西壮族自治区HIV-1高发区病毒样品)。

具体实施方式

实施例1

抗原的选择与修饰

1、目的基因的选择

目前中国主要的HIV-1流行株为B/C重组型HIV-1。

选择的HIV-1中国流行株gagpol基因序列如SEQ ID NO：6，

选择的HIV-1中国流行株env基因序列如SEQ ID NO：7，

我们这里用于构建艾滋病疫苗的HIV-1目的基因就是根据上述B/C重组亚型的基因序列为基础，然后对gagpol进行了全序列人工合成，该合成的基因所表达的氨基酸序列与野生的HIV-1中国流行株gagpol基因表达的氨基酸序列一致，但基因表达效率则大大提高。

以上述修饰过的gagpol和野生的env基因作为目标抗原的基因，它们的表达产物组成了HIV-1最主要的结构蛋白，因此它们是抗原基因的最佳选择。

2、抗原基因gagpol的修饰

2.1方法：根据我们以前研究的结果发现，HIV-1 gag，pol基因内存在许多抑制因子。这些抑制因子是以A和T为主组成，造成HIV-1 mRNA不稳定，不能从细胞核转制到细胞浆，从而影响蛋白表达。去除抑制因子的办法就是在不影响氨基酸编码的前提下，将Codon第三位的A或T尽量改为C或G。

2.2过程：GPCINS、ENVCINS分别代表合成的全新的gagpol和env基因GPCINS基因序列合成引物：

F1：GTGGGCGACGCCTACTTCAGCGTGCCCCTGGATAAGGACTTCCGGAAGTACACCGCCTTCACCATCCCCAGCGTGAACAATGAGACC

R1：TGCACTGGAAGATGGCGGGGCTGCCCTTCCAGCCCTGGGGCAGCACGTTGTACTGGTACCGGATGCCGGGGGTCTCATTGTTCACGC

F2：GACTTCTGGGAGGTGCAGCTGGGCATCCCCCACCCCGCCGGCCTGAAGAAAAAGAAAAGCGTGACCGTGCTGGACGTGGGCGACGC

R2：CAGATCGTCCATGTACTGGTAGATCACGATGTCGGGGTTCTGCTTCCGGAAGGGCTCCAGGATCTTGGTCATGCTGCACTGGAAGATGGC

F3：CATCTTCGCCATCCGGAAGAAAGACAGCTCCAAGTGGCGGAAGCTGGTGGACTTCCGGGAGCTGAACAAGCGGACCCAGGACTTCTGGGA

R3：TTCAGGAGGTGCTCCCGCAGTTCCTCGATCTTGGTCCGGTGCTGGCCGATCTCCAGGTCGCTGCCCACGTACAGATCGTCCATGTACTGG

F4：CCGCCATCTGCGACGAGATGGAAAAGGAGGGCAAGATCACCAAGATCGGCCCCGACAACCCCTACAACACCCCCATCTTCGCCATCCG

R4：GGTGCAGCTCGTAGCCCATCCACAGGAAGGGAGGCTCCTTCTGGTGTTTCTTGTCGGGTGTGGTGAAGCCCCACTTCAGGAGGTGCTCCC

F5：TGAAGCTGAAGCCCGGCATGGACGGCCCCAAGGTGAAGCAGTGGCCCCTGACCGAGGAAAAGATCAAGGCCCTGACCGCCATCTGCG

R5：CAGCTTCTGGATGTCGTTCACGGTCCAGCTGTCCTTCTCGGGCAGCTGGATGGGCTGCACGGTCCACTTGTCGGGGTGCAGCTCGTAGCC

F6：CATTGGCCGGAACATGCTGACCCAGCTGGGCTGCACCCTGAACTTCCCCATCAGCCCCATCGAGACCGTGCCCGTGAAGCTGAAGCC

R6：CCGCAGGAGCTTGCACAGCTGCCGCACCTTGATGCCGGGGTAGATCTGGCTGGCCCAGTTCAGCTTGCCCACCAGCTTCTGGATGTCGTT

F7：GAGCAGATCCCCATTGAGATCTGCGGCAAGAAAGCCATCGGCACCGTGCTGGTGGGCCCCACCCCCGTGAACATCATTGGCCGGAAC

R7：TCTCCCGGTTCTCGGCCAGTTCCAGCTCGGCTTCCTCGGTCAGGGGCACGATGTCGGTCAGGGCCTTGGCGCCCCGCAGGAGCTTGC

F8：GTGAACCTGCCCGGCAAGTGGAAGCCCAAGATGATCGGCGGGATCGGAGGCTTCATCAAGGTGCGGCAGTACGAGCAGATCCCCAT

R8：TTGGCCCTGCTTCTGGATCTCGGCGATCAGCTCCTTGCTGGGGTCATAGTAGGCGCCGTGCACGGGCTCCTTCAGGATCTCCCGGTTCTC

F9：CTTGTCTCAATAAAAGTAGGGGGCCAGATAAAAGAGGCTCTCCTGGACACCGGCGCCGATGACACCGTGCTGGAGGAAGTGAACCTGCCC

R9：GGTCCGCATCTTGGCGTACTTGCCGGTCTTCAGGTTCTTGAAGGGCTCCTGGTAGATCTGGTAGGTCCACTGGTCTTGGCCCTGCTTCTG

F10：CCGAAGCAGGAACCGAAAGACAGGGAACCCTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTTGTCTCAATAAAAGTAGGG

R10：GCCCCAAATCACGATGCTCTCCATGGCGATCTTCTGCACGGCCTCGGTCAGCTGCTTCACGTCGTTGGTGTGGGCGGTCCGCATCTTGGC

F11：GGGAATTTTCTCCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGCAGAGAGCTTCAGGTTCGAGGAGACAACCCCAGCTCCGAAGCAGGAA

R11：GTGGCCTGCCAGTAGTCGGTCCACCAGGTCTCCCAGGTCTCCTTCTGGATGGGCAGCCGGAACTTGGGGATCTTGCCCCAAATCACGATG

F12：TGAAAGACTGTACTGAAAGGCAGGCGAATTTTTTAGGGAAATTTTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTTCTCCAGAGC

R12：GGGGTCCTTCTCCAGCTGGTACCACAGCTTCACCAGGGGAGGGGTGTTCACGAACTCCCACTCGGGGATCCAGGTGGCCTGCCAGTAGTC

F13：GCCACATCGCCAAGAACTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAAGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGACACCAAATGAAAGACTGTACTGAAA

R13：ACGTAGCCGGCCTTGCCGATCTTGGTCTCCCGGTTAGCGGCGCCGTCCACGTAGAAGGTCTCCACGCCGGCGATGGGGTCCTTCTCCAGC

F14：ACACCATCCTGATGCAGCGGAGCAACTTCAAGGGCAGCAAACGGATCGTGAAGTGCTTCAACTGTGGCAAGGAGGGCCACATCGCCAAGA

R14：TAGATGGCCTGCAGCTCGGTCTTCTGGTTGGTTGTGTCGGTCAGGCTCACGATTTTCTTCCGGCCTCTGTCGGTCACGTAGCCGGCCTTG

F15：ACCGCCTGCCAGGGCGTGGGAGGCCCCAGCCACAAGGCCCGGGTGCTGGCTGAGGCCATGAGCCAGACCTCCAACACCATCCTGATGCAG

R15：CTGAATGATGCCCAGGGCGTACTGGCTGTCGGTCACGATGTTCACCTCGCTGCCGCTGTCCTGCAGGGCGATGTAGATGGCCTGCAGCTC

F16：AGAATGCCAACCCCGACTGCAAGACCATCCTGCGGGCCCTGGGCAGCGGCGCCTCCCTGGAAGAGATGATGACCGCCTGCCAGG

R16：TACACCCGCTCTTTCTTGATCAGCTGCTCAATGATCTGGTTCACCAGCTCGCTCTCGCTCTTGTCGGGCTGGGCCTGAATGATGCCCAGG

F17：ATTCTTTAAGACCCTGCGGGCCGAGCAGGCCACCCAGGACGTGAAGAACTGGATGACCGACACCCTGCTCGTGCAGAATGCCAA

R17：ATGCCGTTGCTCACCAGCTTGTCCACCTGCTCGTTGCCCCCGATGCCCTTGTGGGCGGGCACCCAGCTCAGGTACACCCGCTCTTTCTTG

F18：GCGGATGTACAGCCCCACCTCCATCCTGGACATCAAGCAGGGCCCTAAGGAGCCCTTCCGGGACTACGTGGATAGATTCTTTAAGACCCT

R18：GCCCGCCAGTTGCTGTGGTACTTCTCGTGTTCCTCCTGGGCCTTGTCGATGCCGTCCAGGAACAGCACCTTCCGGATGCCGTTGCTCACC

F19：GATGACCAACAATCCTCCCATCCCAGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATTATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCC

R19：CTTCAGCTGACACTGGTCGCAGCTGGCCACGATCTCCTTGGCCACGATGGGAGGCAGGTTGAAGTCGCTGGCCATGGCCCGCCAGTTGCT

F20：TGGCCAGATGCGGGAGCCCAGAGGCAGCGACATCGCCGGCACCACATCCAGCCTGCAGGAGCAGATCGGCTGGATGACCAACAATCCTCC

R20：CCCTCCAGGTGGGTGCAGTCCAGCTGCCAGATGCCGGGGCTGCAGTCCACCTGGCCGTGCATGGCCTCGCCCTTCAGCTGACACTGGTCG

F21：TGCTGAAGGACACCATCAACGAGGAAGCCGCTGAGTGGGACCGGCTGCACCCCGTGCACGCCGGCCCCGTGGCCCCTGGCCAGATGCGGG

R21：TGGCCGGTCTCGGCGGGGATCACCTCGGCCTCGATGTAGCCGCTGGCCACGTGGACGGCCACCAGAATGATCTTGCCCTCCAGGTGGGTG

F22：AGCGAGGGCGCCACCCCCCAGGACCTGAACACCATGCTGAACACCGTGGGCGGGCACCAGGCTGCCATGCAGATGCTGAAGGACACCATC

R22：AGTTGCTGCCGTTGTCGGTGTGGATCACCTTCACGGGCCACCGGCCGGCCAGCTTCAGGATGAAGTAGGCGGTCTCCTGGCCGGTCTCGG

23：CGGACCCTGAACGCCTGGGTGAAGGTCGTGGAGGAAAAGGCCTTCAGCCCCGAGGTGATCCCTATGTTCACCGCCCTGAGCGAGGGCGCC

R23：GGGGTTGTAGGGGATGCCGAACTCTTGCTGGATGCCGGCCCACCAGCAGGCTGCCTTCACAGCGGCGCTGGTGAAGTTGCTGCCGTTGTC

F24：CGACGAGAAGGTGAGCCAGAACTACCCCATCGTGCAGAACCCCCAGGGCCAGATGGTGCACCAGCCTCTGAGCCCCCGGACCCTGAACGC

R24：TCGGCCTGGTCCCGCACCTGGCCGATCAGCTTTTTCAGCTCCTTGTTCATGCTCTCCACCACGCCCTGGCTCTGGGGGTTGTAGGGGATG

F25：AGGCCCTGGACAAGATCGAGGAAGAGCAGAACAAGATCCAGCAAAAGACCCAGCAGGCCAAGAAAGCCGACGAGAAGGTGAGC

R25：AGCCTCCGATCCCGCCCTTCCGCTTGAAGTTGTGGATGAACACGGCCATCTGCACGGCGGTCTTCAGGTGCTCGGCCTGGTCCC

F26：ACCGAGGAACTGCGGAGCCTGTTCAACACCGTGGCCACCCTGTACTGCGTGCACGAGGAAATCGAGGTGCGGGACACCAAGGAGGCCCTG

R26：GGATCTTAATGATCTGCTTCTGCAGCTCCCGGGTCTGGATGTCGGTGGCGATAATGTCCACGATCCGCTCGCCGGCGCTGTAGCCTCCGA

F27：GGCCTCCTGGAGACCAGCGAAGGCTGCAAGCAGATCATTAAGCAGCTGCAACCCGCCCTGCAGACCGGCACCGAGGAACTGCGG

R27：AGAGCAGCTTGGCGGGGCCCTTCCAGATGGGGTCCCGGCTGTCTCTATAGTACACCCGGAAGTTCTGGATCTTAATGATCTGCTTC

F28：TGAGACCCGGAGGCAAGAAACACTACATGCTGAAGCACCTGGTGTGGGCCAGCCGGGAGCTGGAAAGATTCGCCCTGAACCCCGGCCTCC

R28：TGATAATCTTGGCCTTCCGTCTGGGCACGACCTTGATGTCGCTGTTGTCCTGGATCACGACGGCGCCCTCGCCCTTCCAGAGCAGCTTGG

F29：

ATGGGCGCCCGGGCCAGCATCCTGCGGGGAGGCAAGCTGGACAAATGGGAGAAGATCCGGCTGAGACCCGGAGGCA

R29：

TCAGTCCTCATCCTGCCGGCCGGCCACGCAGTCGGCGCCGGCCATCTGCTTGCCGTAGTCCTTGATAATCTTGGCCTTCC

1.F代表正向引物，R代表反向引物；

2.下划线_部分为引物与模板互补部分；

3.下划线

部分为引入的新限制性核酸内切酶(RE)位点xba I，为引入的新RE位点BamH I；

4.基因合成的原理及过程：

本合成HIV基因采用聚合酶链式反应法，即PCR法。PCR法是用一对与模板DNA互补的单链寡聚DNA作为引物，通过“加温变性-退火-延伸”这一周期的多次循环，使与引物互补的模板DNA引物之间的区段得到扩增。扩增的产物应该包括引物序列，如果在引物的末端含有一段非互补的序列，它们也能够被包含在扩增的产物序列中。因此，可以利用这种原理在一段DNA的两端按照合成引物的序列延长该DNA片段，经过多轮PCR即可达到合成HIV基因之目的。

第一轮PCR的目的是合成该基因中间的一段DNA序列，所以设计合成一对引物F1和R1，F1为正向引物，R1为反向引物，F1与所要合成的基因的中间部分的有义链序列一致，R1与所要合成的基因的中间部分的反义链序列一致，且它们的3’端互补(见引物序列的下划线处)，因此，第一轮PCR不需要加入模板，只需要加入Taq酶缓冲液、4种dNTP、引物F1、引物R1、Taq酶，补加水至一定体积，按照PCR的“加温变性-退火-延伸”的程序进行多次循环。

第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，引物为F2和R2，F2将使扩增产物向5’端延长，R2将使扩增产物向3’端延长，该轮PCR产物为F2与R2之间的区段。

第三轮PCR以第二轮PCR产物为模板，引物为F3和R3，其余操作过程与第二轮PCR相同。以后与此类同，经过29轮PCR可合成GPCINS基因。

2.3抗原修饰的结果

合成的全新gagpol(GPCINS)基因序列如SEQ ID NO：5。

我们对gagpol修饰前后的核苷酸序列进行了比较，为了增加gagpol抗原的表达水平，修饰前后核苷酸序列变化较大，但核苷酸长度没有变化，为4280bp。合成后我们用FseI限制性内切酶切去了整合酶3’端531个碱基对，新的gagpol核苷酸长度为3730bp，从1至3730个碱基对中修饰后碱基变化个数为994，突变率为26.6％。基因修饰前后Gag氨基酸序列与野生型完全一致。

我们对pol基因中的protease蛋白酶活性中心进行了失活突变(Pol第336位天门冬氨酸突变为组氨酸)，目的是使protease失去活性，从而也消除了逆转录酶保持活性的可能性。另外，由于我们用FseI限制性内切酶切去了整合酶3’端531个碱基对，从而使整合酶完全失去活性，同时，由于修饰后整合酶基因所表达的蛋白与HIV-1病毒整合酶基因所表达的蛋白有较大的区别，这一点也可以用来区分该疫苗在人体内引起的免疫反应与HIV-1病毒感染引起的免疫反应的不同。

实施例2

重组腺苗A-GPE的构建

1、构建过程

用于构建重组腺苗所用的gagpol基因为实施例1中修饰过的gagpol基因，构建重组腺苗所用的env基因为野生型env基因，腺病毒为人体内复制缺陷型腺病毒。

上述HIV-1中国流行株(区域性)的gagpol和env基因被克隆到中间质粒pDC316中，构成pDC316-GPE。如图1所示：pDC316-GPE质粒中，利用穿梭质粒中多克隆酶切位点将修饰过的gagpol基因和野生型env基因连接到穿梭质粒pDC316中，得到质粒pDC316-GPE。

重组穿梭质粒pDC316-GPE全序列如SEQ ID NO：1

利用Lipofection2000(INVITROGEN产品)将pDC316-GPE与腺病毒包装质粒共转染到HEK293细胞中。利用Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒A-GPE。形成如图2所示的A-GPE重组病毒。

以上被感染细胞培养7-10天后，收集细胞，冻融裂解细胞，离心除细胞残渣，保留上清。

取一定量上清，再次感染HEK293细胞，培养2-3天后，筛选，重复此筛选2-3轮，得到不含野生型腺病毒的A-GPE。

将此A-GPE大量感染HEK293细胞进行扩增、纯化、滴度检测。

该重组疫苗所编码的抗原蛋白的氨基酸序列如下：

Gag氨基酸序列如SEQ ID NO：2

Pol氨基酸序列如SEQ ID NO：3

Env氨基酸序列如SEQ ID NO：4

我们比较测定序列与理论序列，没有发现任何突变或插入基因，表达框架正确，没有出现错位。

2、重组腺苗在哺乳动物细胞中抗原表达

2.1、试验材料和仪器：

抗原在哺乳动物细胞中表达：6孔板、CO₂培养箱、HEK293细胞；丙烯酰胺和N，N`-亚甲双丙烯酰胺(购于Sigma公司)；底物显色液(购于Sigma公司)；

细胞裂解液：DTT 0.617g，SDS 0.8g，1M Tris-HCl pH6.83.2ml，甘油4ml，bromphenol 0.08g，H₂O 12.8ml；(化学试剂均购于Sigma公司)

Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸(电泳级)(pH8.3)，0.1％SDS；(化学试剂均购于Sigma公司)

转移缓冲液：39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％SDS(电泳级)，20％甲醇；(化学试剂均购于Sigma公司)

5％脱脂奶粉溶液：10g脱脂奶粉，200ml 1×PBST；(化学试剂均购于Sigma公司)

HIV-1人阳性抗血清：广西壮族自治区疾病控制中心提供；

抗HIV-1P24蛋白单克隆抗体(美国NIH试剂中心提供)；

抗Env羊抗血清：美国国立卫生研究院(NIH)试剂中心提供

抗体稀释液：100-150μl HIV-1人阳性抗血清(或抗Env羊抗血清、抗HIV-1P24蛋白单克隆抗体)加入到10-15ml 3％脱脂奶粉溶液中；

PBS-T：含0.05％TWEEN 20的PBS(TWEEN 20购于Sigma公司)；

二抗液：碱性磷酸酶偶联兔抗人IgG抗体、碱性磷酸酶偶联兔抗鼠IgG抗体和碱性磷酸酶偶联兔抗羊IgG抗体购于Jackson ImmunoResearchLaboratories，INC.

2.2、实验方法和步骤：

2.2.1重组腺苗(A-GPE)感染HEK293细胞株：

①于6孔板内每孔加入1.0×10⁶个细胞，1.5ml培养基，置37℃，5％CO₂培养箱培养约24小时。

②弃去培养液，加入不含血清的培养基，各孔内以A-GPE感染培养的细胞，M-GPE用量为5-10pfu/细胞，留一孔不加A-GPE做对照。轻晃混匀，37℃培养3小时。

③补加1ml10％血清的培养基，混匀。

④置37℃，5％CO₂培养箱培养48-72小时。

2.2.2细胞裂解

①弃去培养液，每孔以2ml PBS洗细胞。

②每孔加入1ml PBS，以细胞刮将细胞刮下转移至具塞小离心管中，1000转/分钟离心5分钟，弃去上清。

③向离心管中加入细胞裂解液100μl，摇匀，100℃煮沸10分钟，11800转/分钟，离心20分钟，取上清于另一离心管中。

2.2.3电泳

①胶板的配制：

10％聚丙烯酰胺分离胶10ml：30％丙烯酰胺溶液3.3ml，1.5mol/LTris(pH8.8)2.5ml，10％SDS 0.1ml，10％过硫酸铵0.1ml，TEMED 0.004ml；5％浓缩胶溶液5ml：30％丙烯酰胺溶液0.83ml，1.0mol/L Tris(pH6.8)0.63ml，10％SDS0.05ml，10％过硫酸铵0.05ml，TEMED 0.005ml。

迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加1cm)。用巴斯德吸管小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层异丙醇(当丙烯酰胺浓度＞10％时)。将凝胶垂直放置于室温下。

分离胶聚合完全后(30分钟)，倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺。尽可能排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留液体。

在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的Telfon梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。

浓缩胶聚合完全后(30分钟)，小心移出Telfon梳子，立即用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺。如有必要，使用注射器上的注射针头把浓缩胶上加样槽之间的齿弄直。把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。

②每孔加入样品或对照品15μl，将电泳装置与电源相接(正极应接下槽)。凝胶上所加电压为200V。当电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部(约需40分钟)，然后关闭电源。

③从电泳装置上卸下玻璃板，放在纸巾上，撬开玻璃板。紧靠最左边一孔(第一槽)凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。

2.2.4免疫印迹

①切6张Whatman 3MM滤纸和1张硝酸纤维素膜(Millipo HAWP或相应的滤膜)，其大小都应与凝胶大小完全吻合；以转移缓冲液浸泡硝酸纤维素膜、滤纸。用软铅笔在滤膜一角作好标记。将凝胶于去离子水中略漂洗一下。

②安装转移装置：

采用simi-dry(Biorad产品)方法把电泳胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。安装方法：由底层依次安装：底部电极(阳极)、3层滤纸、一张硝酸纤维素膜、凝胶、3层滤纸、顶部电极(阴极)。凝胶左下角置于硝酸纤维素膜标记处。排除所有气泡。

③连接电源，15V转移30分钟，断开电源。

④卸下装置，取出硝酸纤维素膜，放入5％脱脂奶粉溶液中，室温摇床摇1小时。

⑤弃去脱脂奶粉溶液，以1×PBST 15ml，室温摇床洗膜15分钟。

⑥分别加入稀释的人HIV-1阳性血清(抗Env羊抗血清、抗HIV-1P24蛋白单克隆抗体)10-15ml，室温摇床振荡1小时，弃去阳性血清，硝酸纤维素膜以双蒸水冲洗两次。

⑦以1×PBST 15ml，室温洗膜三次，每次5分钟。

⑧弃去PBST，加入二抗液10μl，1×PBST 20ml，室温摇床振荡45分钟。

⑨取出膜，弃去液体；以1×PBST洗膜，弃去洗液；再以1×PBST洗膜，摇床振摇10分钟。

显色：弃去液体，加入底物显色液20ml。

终止反应：显色清晰后弃去显色液，加水适量，振摇，弃去水，将硝酸纤维素膜取出，晾干。

2.3.1修饰和未修饰的gagpol基因在Ad-5中表达的区别

修饰的和非修饰的gagpol基因被同时重组到MVA载体中。利用相同的病毒浓度感染HEK293细胞。用以比较修饰和未修饰的gagpol基因在MVA中表达的区别。结果如图3所示：修饰的gagpol基因在表达水平上远远高于未修饰的gagpol基因。所以在以后的研究中，我们始终采用修饰的gagpol基因。

实施例3

A-GPE的抗原性研究

试验材料和仪器、试验方法和步骤：同实施例2中2重组腺苗在哺乳动物细胞中抗原表达。

结果：为检测A-GPE的抗原性是否与中国的流行毒株的抗原性一致，我们用A-GPE感染HEK293细胞来表达HIV-1抗原，并且采用免疫印迹的方法确认上述表达的抗原是否被中国的流行(来源于广西壮族自治区HIV-1高发区)毒株抗血清在免疫印迹试验中所识别。同时用HIV-1中国流行株(来源于广西壮族自治区HIV-1高发区)病毒抗原作为阳性对照。试验结果如图4所示。

A-GPE所表达蛋白能够被中国流行(区域性)的抗血清所识别并与对应的标准病毒抗原性一致。

实施例4

药用组合物

A-GPE与生理盐水的滴度体积比为：10⁹pfu/ml，每次注射0.1ml，注射1次。

实施例5

药用组合物

A-GPE与生理盐水的滴度体积比为：10⁸pfu/ml，每次注射0.1ml，注射1次。

Claims

1.一种含有转录单位的经过重组的腺病毒，所述转录单位编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白序列，该人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白序列是具有免疫原性的人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)抗原，其中转录单位指导抗原的合成。

2.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的腺病毒，采用的腺病毒是5型复制缺陷型腺病毒(5type replication defective adenovirus，Ad-5)。

3.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的腺病毒，所含有的转录单位编码的是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)B/C重组型的结构蛋白。

4.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的腺病毒，其转录单位所编码的结构蛋白包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的完整核心蛋白Gag、编码酶类蛋白的Pol和外膜蛋白Env，其各氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4所述。

5.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的腺病毒是非复制型的。

6.如权利要求5所述的含有转录单位的经过重组的腺病毒，可作为一种用于预防艾滋病的非复制型重组腺病毒载体疫苗，它包含了可编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的核苷酸序列。

7.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的腺病毒，为AdMax包装系统。通过Cre/loxP获得重组病毒，此过程发生在293细胞中，从而避免在细菌中重组。将克隆了如权利要求1所述的含有转录单位的穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染HEK293细胞，利用Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。

8.如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的腺病毒，由穿梭质粒pDC316-GPE与腺病毒重组而成，穿梭质粒pDC316-GPE包含了编码人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)结构蛋白的核苷酸序列，穿梭质粒pDC316-GPE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，其中编码GagPol的核苷酸序列来源于经过修饰的野生型人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的GagPol的核苷酸序列，而编码Env蛋白的核苷酸序列则来源于未经修饰的野生型人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的Env的核苷酸序列。

9.一种药用组合物，其中含有如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组的腺病毒和一种可药用的载体。

10.一种抗原，其由如权利要求1所述的含有转录单位的经过重组腺病毒表达产生，该表达产生的是人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的蛋白Gag、Pol和Fnv。