TW202204627A - 腺病毒之大負載併合 - Google Patents

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美國弗莱德哈欽森癌症研究中心
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Abstract

本發明提供可容納或含有大轉位子負載、例如多達40 kb之轉位子負載的重組腺病毒載體及腺病毒基因體。該等腺病毒載體及基因體可遞送大轉位子負載至目標基因體中，例如用於基因療法。

Description

腺病毒之大負載併合
本發明尤其提供可容納或含有大轉位子負載、例如多達40 kb之轉位子負載的重組腺病毒載體及腺病毒基因體。腺病毒載體及基因體中之某些可遞送大轉位子負載至目標基因體中，例如用於基因療法。
基因療法呈現許多挑戰。病毒載體係基因療法之一種手段。在一些情況下，用於基因療法之病毒載體之研發中的各種挑戰包括載體負載容量、轉殖基因併合至目標細胞基因體中之效率、轉殖基因表現之細胞類型特異性、轉殖基因表現量及併合之位置效應。使用病毒載體之基因療法的各種方法需要消耗資源之步驟——自個體移除細胞及在向個體投與細胞之前離體工程改造及/或擴增細胞。至少出於此等原因，且尤其鑒於利用病毒載體之療法之數目的增長，極需要改良之病毒載體設計。
血紅素病係全世界最普遍之遺傳病症之一，值得注意地，在低度開發國家中出生之患者的存活率顯著降低。血紅素病之實例包括鐮形血球貧血症及地中海貧血症。患者特異性血液幹細胞/祖細胞(HSPC)基因療法具有治療血紅素病之極大潛力。
此外，世界衛生組織已識別超過80種原發性免疫缺乏疾病。此等疾病之特徵在於免疫系統中之內在缺陷，其中在一些狀況下，身體不能產生任何或足夠的抵抗感染之抗體。在其他狀況下，對抗感染之細胞防禦不能恰當地工作。通常，原發性免疫缺乏為遺傳性病症。
繼發性或後天性免疫缺乏並非遺傳基因異常之結果，而是在免疫系統因免疫系統以外之因素而受損之個體中發生。實例包括創傷、病毒、化學療法、毒素及污染。後天性免疫缺乏症候群(AIDS)為由病毒人類免疫缺乏病毒(HIV)引起之繼發性免疫缺乏病症的實例，其中T淋巴球耗乏使得身體無法對抗感染。
X性聯嚴重複合免疫缺乏症(SCID-X1)係由共同的γ鏈基因(γC)之突變引起的細胞及體液免疫耗乏，其導致T及自然殺手(NK)淋巴球之缺乏及非功能性B淋巴球之存在。SCID-X1在生命前兩年係致命的，除非免疫系統例如經由骨髓移植(BMT)或基因療法復原。
因為大部分個體缺乏BMT或非自體基因療法之匹配供體，所以通常使用成熟T細胞耗乏之單倍體相合親本骨髓；然而，併發症包括移植物抗宿主疾病(GVHD)；無法產生足夠抗體，因此需要長期進行免疫球蛋白置換；由於不能植入造血幹細胞及祖細胞(HSPC)而造成T細胞後期損失；慢性疣；及淋巴球失調。
范康尼氏貧血(Fanconi anemia，FA)係引起骨髓衰竭之遺傳性血液病症。其部分特徵係DNA修復機制缺陷。至少20% FA患者出現諸如急性骨髓白血病之癌症，及皮膚、肝臟、胃腸道及婦科系統之癌症。皮膚及胃腸道腫瘤通常係鱗狀細胞癌。出現癌症之患者之平均年齡為白血病15歲，肝臟腫瘤16歲，及其他腫瘤23歲。
已探索使用活體內基因療法進行治療，其包括向患者直接遞送病毒載體。活體內基因療法係簡單而有吸引力之方法，因為其可能不需要任何基因毒性調節(或可能需要較少基因毒性調節)或離體細胞加工，且因此可在全世界許多機構，包括開發中國家中之機構採用，因為該療法可經由注射投與，類似於在全世界已進行之用於遞送疫苗之方法。
腺病毒由於其基因體尺寸中等、易於操縱、高效價、寬目標細胞範圍及高感染性而尤其適用作基因轉移載體。病毒基因體之兩端含有100至200個鹼基對反向重複序列(ITR)，ITR為病毒DNA複製及包裝所必需的順式元件。基因體之早期(E)及晚期(L)區域含有不同轉錄單元，該等單元由病毒DNA複製起點分隔。E1區域(E1A及E1B)編碼負責病毒基因體及少數細胞基因之轉錄之調控的蛋白質。E2區域(E2A及E2B)之表現引起用於病毒DNA複製之蛋白質的合成。此等蛋白質參與DNA複製、晚期基因表現及宿主細胞關閉。晚期基因之產物，包括大部分病毒衣殼蛋白，僅在大量加工由主要晚期啟動子(MLP)發出之單一初級轉錄物之後表現。MLP在感染晚期期間尤其有效，且由此啟動子發出之所有mRNA具有5'-三聯前導序列(TPL)序列，使其成為轉譯之較佳mRNA。
對於成功的基因療法，在無併合之位置效應及轉錄沉默的情況下，轉移基因必須在所需組織或細胞中表現量高。基因座控制區域(LCR)尤其適合於此任務，因為LCR之特徵在於其能夠在異位染色體位點處以組織特異性及複本數依賴性方式增強連接之基因之表現至生理水準。LCR之組分通常共定位至表現細胞之染色質中之DNA水解酶I超敏(HS)位點。個別HS處之核心決定子由多個普遍存在及譜系特異性之轉錄因子結合位點之陣列構成。
本發明尤其包括腺病毒載體及腺病毒基因體、包括兩種或更多種本發明之腺病毒載體及/或腺病毒基因體之系統及此類腺病毒載體、腺病毒基因體及系統之用途。在某些實施例中，本發明包括包含例如1 kb至40 kb之轉位子負載的腺病毒載體及/或腺病毒基因體。在本發明之某些實施例中，轉位酶可引起例如多達40 kb之轉位子負載併合至目標細胞之基因體中。因此，本發明尤其包括能夠將腺病毒供體載體中存在之多達40 kb之負載併合至目標細胞基因體中的載體、基因體及系統。如熟習此項技術者將瞭解，載體在其中及本身併合之容量為基因療法系統之一個非常重要之特徵，此至少部分因為併合容量限制治療負載之長度及/或複雜性。
本發明中識別的長及/或複雜核酸負載之某些實例包括包含長基因座控制區域之負載。由於其長度問題，長基因座控制區域在歷史上不適合包括於腺病毒負載中，但包括但不限於包含長基因座控制區域之長及/或複雜核酸負載的長及/或複雜核酸負載可根據本文所揭示之載體、基因體及系統併合至目標細胞基因體中。
因此，在一個實施例中，提供一種腺病毒供體載體，其包括：(a)腺病毒衣殼；及(b)線性雙股DNA基因體，其包括：(i)至少10 kb之轉位子負載；(ii)側接該轉位子負載之轉位子反向重複序列(IR)；及(iii)側接該等轉位子反向重複序列之重組酶正向重複序列(DR)。
另一實施例為一種腺病毒供體基因體，其包括：(a)至少10 kb之轉位子負載；(b)側接該轉位子負載之轉位子反向重複序列(IR)；及(c)側接該等轉位子反向重複序列之重組酶正向重複序列(DR)。
亦提供一種腺病毒轉位系統，其包括：(a)如本文所述之腺病毒供體載體；及(b)腺病毒支撐載體，其包括(i)腺病毒衣殼；及(ii)腺病毒支撐基因體，其包括編碼轉位酶之核酸序列。
又一實施例為一種腺病毒轉位系統，其包括：(a)如本文所述之腺病毒供體基因體；及(b)腺病毒支撐基因體，其包括編碼轉位酶之核酸序列。
此外，提供一種腺病毒產生系統，其包括：(a)包括如本文所述之腺病毒供體基因體之核酸；及(b)包括腺病毒輔助基因體之核酸，該腺病毒輔助基因體包括條件性包裝元件。
其他實施例為細胞(例如造血幹細胞)，其包括根據本文所述之各種實施例中之任一者的載體、基因體或系統。
亦描述細胞(例如造血幹細胞)，其在其基因體中包括本文所述之任何實施例之轉位子負載，其中在該細胞之基因體中存在的轉位子負載由轉位子反向重複序列側接。
又一實施例為一種產生腺病毒之細胞，其包括根據本文所述之實施例中之任一者的腺病毒產生系統，視情況其中該細胞為HEK293細胞。
一種修飾細胞之方法，該方法包括使該細胞與根據本文所述之實施例中之任一者的載體、基因體或系統接觸。
一種修飾個體之細胞之方法，該方法包括向該個體投與根據本文所述之實施例中之任一者的載體、基因體或系統。
另一實施例為一種修飾個體之細胞之方法，其在不自該個體分離細胞下進行，該方法包括向該個體投與根據本文所述之實施例中之任一者的載體、基因體或系統。
亦提供治療有需要之個體之疾病或病狀的方法，該方法包括向該個體投與根據本文所述之實施例中之任一者的載體、基因體或系統。
在至少一個態樣中，本發明提供一種腺病毒供體載體，其包括：(a)腺病毒衣殼；及(b)線性雙股DNA基因體，其包括：(i)至少10 kb之轉位子負載；(ii)側接該轉位子負載之轉位子反向重複序列(IR)；及(iii)側接該等轉位子反向重複序列之重組酶正向重複序列(DR)。
在至少一個態樣中，本發明提供一種腺病毒供體基因體，其包括：(a)至少10 kb之轉位子負載；(b)側接該轉位子負載之轉位子反向重複序列(IR)；及(c)側接該等轉位子反向重複序列之重組酶正向重複序列(DR)。
在至少一個態樣中，本發明提供一種腺病毒轉位系統，其包括：(a)實施例1之腺病毒供體載體；及(b)腺病毒支撐載體，其包括(i)腺病毒衣殼；及(ii)腺病毒支撐基因體，其包括編碼轉位酶之核酸序列。
在至少一個態樣中，本發明提供一種腺病毒轉位系統，其包括：(a)實施例2之腺病毒供體基因體；及(b)腺病毒支撐基因體，其包括編碼轉位酶之核酸序列。
在至少一個態樣中，本發明提供一種腺病毒產生系統，其包括：(a)包括實施例2之腺病毒供體基因體之核酸；及(b)包括腺病毒輔助基因體之核酸，該腺病毒輔助基因體包括條件性包裝元件。
在各種實施例中，轉位子負載包括長LCR，視情況其中該長LCR為包括β-球蛋白LCR HS1至HS5之β-球蛋白長LCR。在各種實施例中，長LCR具有至少27 kb之長度。在各種實施例中，轉位子負載包括表1中所闡述之LCR。在各種實施例中，轉位子負載具有至少15 kb、至少16 kb、至少17 kb、至少18 kb、至少19 kb、至少20 kb、至少21 kb、至少22 kb、至少23 kb、至少24 kb、至少25 kb、至少30 kb、至少35 kb、至少38 kb或至少40 kb之長度。在各種實施例中，轉位子負載具有10 kb-35 kb、10 kb-30 kb、15 kb-35 kb、15 kb-30 kb、20 kb-35 kb或20 kb-30 kb之長度。在各種實施例中，轉位子負載具有10 kb-32.4 kb、15 kb-32.4 kb或20 kb-32.4 kb之長度。
在各種實施例中，轉位子負載包括編碼蛋白質之核酸序列，視情況其中該蛋白質為治療性蛋白質。在各種實施例中，蛋白質係選自由β球蛋白替代蛋白及γ-球蛋白替代蛋白組成之群。在各種實施例中，蛋白質為第八因子替代蛋白。在各種實施例中，編碼該蛋白質之核酸序列與啟動子可操作地連接，視情況其中該啟動子為β球蛋白啟動子。
在各種實施例中，轉位子反向重複序列為睡美人(SB)反向重複序列，視情況其中該SB反向重複序列為pT4反向重複序列。在各種實施例中，轉位酶為睡美人(SB)轉位酶，視情況其中該轉位酶為睡美人100x (SB100x)。在各種實施例中，重組酶正向重複序列為FRT位點。在各種實施例中，腺病毒支撐基因體包括編碼重組酶之核酸。在各種實施例中，重組酶為FLP重組酶。在各種實施例中，轉位子負載包括β-球蛋白長LCR，該轉位子負載包括與β-球蛋白啟動子可操作地連接之編碼β-球蛋白之核酸序列，該等反向重複序列為SB反向重複序列，且該等重組酶正向重複序列為FRT位點。
在各種實施例中，轉位子負載包括選擇卡匣，視情況其中該選擇卡匣包括編碼mgmtP140K 之核酸序列。
在各種實施例中，腺病毒衣殼經修飾以增加對CD46之親和力，視情況其中該腺病毒衣殼為Ad35++衣殼。
在各種實施例中，腺病毒輔助基因體之條件性包裝元件包括由重組酶正向重複序列側接之包裝序列。
在各種實施例中，側接條件性包裝元件之包裝序列的重組酶正向重複序列為LoxP位點。
在各種實施例中，本發明提供一種細胞，其包括根據本發明之載體、基因體或系統。
在各種實施例中，本發明提供一種細胞，其在其基因體中包括根據本發明之轉位子負載，其中在該細胞之基因體中存在的轉位子負載由轉位子反向重複序列側接。
在各種實施例中，細胞為造血幹細胞。
在各種實施例中，本發明提供一種產生腺病毒之細胞，其包括根據本發明之腺病毒產生系統，視情況其中該細胞為HEK293細胞。
在各種實施例中，本發明提供一種修飾細胞之方法，該方法包括使細胞與根據本發明之載體、基因體或系統接觸。
在各種實施例中，本發明提供一種修飾個體之細胞之方法，該方法包括向該個體投與根據本發明之載體、基因體或系統。
在各種實施例中，本發明提供一種修飾個體之細胞之方法，其在不自該個體分離細胞下進行，該方法包括向該個體投與根據本發明之載體、基因體或系統。
在各種實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體之疾病或病狀的方法，該方法包括向該個體投與根據本發明之載體、基因體或系統。
在各種實施例中，腺病毒供體載體經靜脈內投與至個體。
在各種實施例中，該方法包括向該個體投與動員劑，視情況其中該動員劑包括顆粒球-群落刺激因子(G-CSF)、CXCR4拮抗劑及CXCR2促效劑中之一或多者。在各種實施例中，CXCR4拮抗劑為AMD3100。在各種實施例中，CXCR2促效劑為GRO-β。
在各種實施例中，轉位子負載包括選擇卡匣且該方法包括向個體投與選擇劑。在各種實施例中，選擇卡匣編碼mgmtP140K 且選擇劑為O6 BG/BCNU。
在各種實施例中，該方法引起至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%表現CD46之細胞中併合及/或表現轉位子負載之至少一個複本。在各種實施例中，該方法引起至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%造血幹細胞及/或紅血球系Ter119+ 細胞中併合及/或表現轉位子負載之至少一個複本。在各種實施例中，該方法引起包括轉位子負載之至少1個複本之細胞的基因體中併合轉位子負載之平均至少2個複本。在各種實施例中，該方法引起包括轉位子負載之至少1個複本之細胞的基因體中併合轉位子負載之平均至少2.5個複本。在各種實施例中，該方法引起由轉位子負載編碼之蛋白質以參考量之至少約20%的量表現，視情況其中該參考為內源性參考蛋白在該個體中或參考群體中之表現。在各種實施例中，該方法引起由轉位子負載編碼之蛋白質以參考量之至少約25%的量表現，視情況其中該參考為內源性參考蛋白在該個體中或參考群體中之表現。
在各種實施例中，個體為罹患中間型地中海貧血症之個體，其中該轉位酶負載包括包含β球蛋白LCR HS1至HS5之β球蛋白長LCR及與β球蛋白啟動子可操作地連接之編碼β球蛋白替代蛋白及/或γ-球蛋白替代蛋白之核酸序列。在各種實施例中，個體為罹患血友病之個體，其中該轉位酶負載包括包含β球蛋白LCR HS1至HS5之β球蛋白長LCR及與β球蛋白啟動子可操作地連接之編碼第八因子替代蛋白之核酸序列。在各種實施例中，個體中該蛋白質之表現減少中間型地中海貧血症之至少一種症狀及/或治療中間型地中海貧血症。 定義
一個、 一種、 該 ：如本文所用，「一個」、「一種」和「該」係指一個或超過一個(亦即，至少一個)該冠詞之文法對象。藉助於實例，「一種要素」揭示正好一種要素之實施例及包括超過一種要素之實施例。
約 ： 如本文所用，術語「約」當在提及一個值時使用時係指在上下文中與所提及之值類似的值。一般而言，在熟悉上下文的情況下，熟習此項技術者應瞭解該上下文中由「約」所涵蓋之相關變化程度。舉例而言，在一些實施例中，術語「約」可涵蓋在所提及之值的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小之內的一系列值。
投藥 / 投與 (Administration) ： 如本文所用，術語「投藥/投與」通常係指向個體或系統投與組合物以達成本身為該組合物或包括於該組合物中之藥劑的遞送。
過繼性細胞療法 ：如本文所用，「過繼性細胞療法」或「ACT」涉及具有治療活性之細胞轉移至個體、例如需要治療病狀、病症或疾病之個體中。在一些實施例中，ACT包括在細胞之離體及/或活體外工程改造及/或擴增之後轉移至個體之細胞中。
親和力 ：如本文所用，「親和力」係指特定結合劑(例如病毒載體)及/或其結合部分與結合目標(例如細胞)之間的非共價相互作用總和的強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指結合劑與其結合目標(例如病毒載體與病毒載體之目標細胞)之間的1:1相互作用。熟習此項技術者瞭解親和力變化可藉由與參考比較(例如相對於參考增加或減少)來描述，或可經由數值描述。親和力可以此項技術中已知之多種方式加以量測及/或表示，包括(但不限於)平衡解離常數(KD )及/或平衡締合常數(KA )。KD 為k解離 /k締合 之商，而KA 為k締合 /k解離 之商，其中k締合 係指例如病毒載體與目標細胞之締合速率常數，且k解離 係指例如病毒載體自目標細胞之解離。可使用熟習此項技術者已知之技術測定k締合 及k解離 。
藥劑 ：如本文所用，術語「藥劑」可指任何化學實體，包括但不限於原子、分子、化合物、胺基酸、多肽、核苷酸、核酸、蛋白質、蛋白複合物、液體、溶液、醣、多醣、脂質或其組合或複合物中的任一或多者。
同種異體 ：如本文所用，術語「同種異體」係指源自一個個體之任何物質，接著將其引入至另一個體中，例如同種異體T細胞移植。
之間 或 自 ：如本文所用，術語「之間」係指所指示上部邊界與下部邊界或第一邊界與第二邊界之間的內容，包括邊界。類似地，當在值範圍之上下文中使用時，術語「自」指示該範圍包括屬於所指示之上部邊界與下部邊界或第一邊界與第二邊界之間的內容，包括邊界。
結合 ：如本文所用，術語「結合」係指兩種或更多種試劑之間或之中的非共價締合。「直接」結合涉及試劑之間的物理接觸；間接結合涉及藉助於與一或多種中間試劑物理接觸之物理相互作用。兩種或更多種試劑之間的結合可在多種背景中之任一者下進行及/或評估，包括在相互作用之試劑以隔離形式或在更複雜系統之背景下(例如在與載體試劑共價或以其他方式締合及/或在生物系統或細胞中時)研究的情況。
癌症 ：如本文所用，術語「癌症」係指細胞展現相對異常、失控及/或自發之生長，使得其顯示異常升高之增殖速率及/或特徵為顯著喪失對細胞增殖之控制之異常生長表型的病狀、病症或疾病。在一些實施例中，癌症可包括一或多種腫瘤。在一些實施例中，癌症可為或包括癌變前(例如良性)、惡性、轉移前、轉移性及/或非轉移性細胞。在一些實施例中，癌症可為或包括實體腫瘤。在一些實施例中，癌症可為或包括血液腫瘤。
嵌合抗原受體 ：如本文所用，「嵌合抗原受體」或「CAR」係指一種經工程改造之蛋白質，其包括(i)細胞外域，其包括結合目標抗原之部分；(ii)跨膜域；及(iii)胞內信號傳導域，其在CAR由細胞外結合部分與目標抗原之結合刺激時發送活化信號。已經基因工程改造以表現嵌合抗原受體之T細胞可稱為CAR T細胞。因此，舉例而言，當某些CAR由T細胞表現時，CAR細胞外結合部分與目標抗原之結合可活化T細胞。CAR亦稱為嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體。
組合療法 ：如本文所用，術語「組合療法」係指向個體投與兩種或更多種藥劑或方案，使得兩種或更多種藥劑或方案一起治療該個體之病狀、病症或疾病。在一些實施例中，兩種或更多種治療劑或方案可同時、相繼或以重疊給藥方案投與。熟習此項技術者應瞭解組合療法包括但不需要兩種藥劑或方案一起以單一組合物形式及同時投與。
控制表現或活性 ：如本文所用，若第二元件(例如蛋白質或編碼諸如蛋白質之藥劑的核酸)之表現或活性完全或部分依賴於第一元件(例如蛋白質，諸如轉錄因子，或核酸序列，諸如啟動子)在至少一組條件下的狀態(例如存在、不存在、構形、化學修飾、相互作用或其他活性)，則第一元件「控制」或「驅動」第二元件之表現或活性。表現或活性之控制可為實質控制或活性，例如其中在至少一組條件下第一元件之狀態之變化可引起第二元件之表現或活性與參考對照相比變化至少10% (例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍)。
對應於：如本文所用，術語「對應於」可用以經由與適當參考化合物或組合物比較來標明化合物或組合物中結構元素之位置/標識。舉例而言，在一些實施例中，聚合物中之單體殘基(例如多肽中之胺基酸殘基或聚核苷酸中之核酸殘基)可識別為「對應於」適當參考聚合物中之殘基。舉例而言，熟習此項技術者瞭解，所提供多肽或聚核苷酸序列中之殘基通常根據相關參考序列之流程命名(例如編號或標記) (即使例如此類名稱不反映所提供序列之文字編號)。藉助於說明，若參考序列在位置100-110處包括特定胺基酸模體，且第二相關序列在位置110-120處包括相同模體，則第二相關序列之模體位置可稱為「對應於參考序列之位置100-110」。熟習此項技術者瞭解，對應位置可容易例如藉由序列比對來鑑別，且此類比對通常藉由多種已知工具、策略及/或算法中之任一者實現，包括但不限於軟體程式，諸如BLAST、CS-BLAST、CUDASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM或SWIPE。
給藥方案 ：如本文所用，術語「給藥方案」可指投與個體之一或多種相同或不同單位劑量的集合，通常包括複數個單位劑量，各單位劑量之投與與其他單位劑量之投與相隔一段時間。在各種實施例中，給藥方案之一或多個或所有單位劑量可相同或可變化(例如隨時間推移增加、隨時間推移減少或根據個體及/或根據行醫者之決定調節)。在各種實施例中，各劑量之間的一或多個或所有時間段可相同或可變化(例如隨時間推移增加、隨時間推移減少或根據個體及/或根據從醫者之決定調節)。在一些實施例中，既定治療劑具有推薦給藥方案，其可涉及一或多次劑量。通常，市售藥物之至少一種推薦給藥方案為熟習此項技術者已知。在一些實施例中，給藥方案在跨相關群體投與時引起所期望或有益結果(亦即為治療方案)。
下游 及上游 ：如本文所用，術語「下游」意謂第一DNA區域相對於第二DNA區域更接近包括第一DNA區域及第二DNA區域之核酸之C端。如本文所用，術語「上游」意謂第一DNA區域相對於第二DNA區域更接近包括第一DNA區域及第二DNA區域之核酸之N端。
經工程改造 ：如本文所用，術語「經工程改造」係指已人為操控之態樣。舉例而言，當兩個或更多個不以自然界中之順序連接在一起之序列經人為操控以在經工程改造之聚核苷酸中彼此直接連接時，該聚核苷酸視為「經工程改造」。熟習此項技術者應瞭解，「經工程改造」之核酸或胺基酸序列可為重組核酸或胺基酸序列。在一些實施例中，經工程改造之聚核苷酸包括在自然界中發現與第一序列可操作地連接但在自然界中未發現與第二序列可操作地連接，在經工程改造之聚核苷酸中人為與第二序列可操作地連接的編碼序列及/或調節序列。在一些實施例中，若細胞或生物體經操縱以使得其遺傳資訊改變(例如，例如藉由轉型、交配、體細胞雜交、轉染、轉導或其他機制引入先前不存在的新遺傳物質，或例如藉由取代、缺失或交配改變或移除先前存在的遺傳物質)，則認為其「經工程改造」。作為慣例且如熟習此項技術者所理解，經工程改造之聚核苷酸或細胞之完全或不完全後代或複本通常仍稱為經「工程改造」，即使直接操縱係對先前實體進行。
賦形劑 ：如本文所用，「賦形劑」係指可包括於醫藥組合物中例如以提供或促成所需稠度或穩定效果之非治療劑。在一些實施例中，適合醫藥賦形劑可包括例如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇或其類似方法。
表現 ：如本文所用，「表現」係個別及/或累計指促使自諸如蛋白質之編碼之試劑之核酸序列產生的一或多種生物過程。表現特別包括轉錄及轉譯中之任一者或兩者。
片段 ：如本文所用，「片段」係指包括參考試劑(有時稱為「親本」試劑)之離散部分及/或由參考試劑之離散部分組成的結構。在一些實施例中，片段缺乏一或多個在參考試劑中發現之部分。在一些實施例中，片段包括一或多個在參考試劑中發現之部分或由該一或多個部分組成。在一些實施例中，參考試劑為諸如聚核苷酸或多肽之聚合物。在一些實施例中，聚合物之片段包括參考聚合物之至少3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、220個、230個、240個、250個、275個、300個、325個、350個、375個、400個、425個、450個、475個、500個或更多個單體單元(例如殘基)或由該等單體單元組成。在一些實施例中，聚合物之片段包括至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、25%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多在參考聚合物中發現之單體單元(例如殘基)或由該等單體單元組成。參考聚合物之片段不一定與參考聚合物之對應部分一致。例如，參考聚合物之片段可為殘基序列與參考聚合物至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、25%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致之聚合物。片段可藉由或可不藉由參考試劑之物理片段化來產生。在一些情況下，片段藉由參考試劑之物理片段化來產生。在一些情況下，片段不藉由參考試劑之物理片段化來產生且可實際上例如藉由重新合成或其他方式產生。
基因、轉殖基因 ：如本文所用，術語「基因」係指為或包括編碼序列(亦即，編碼表現產物、諸如RNA產物及/或多肽產物之DNA序列)，視情況連同控制編碼序列表現之調控序列中之一些或全部的DNA序列。在一些實施例中，基因包括非編碼序列，諸如但不限於內含子。在一些實施例中，基因可包括編碼(例如外顯子)與非編碼(例如內含子)序列。在一些實施例中，基因包括作為啟動子之調控序列。在一些實施例中，基因包括以下中之一者或兩者：(i)在諸如源基因體之參考背景下在編碼序列上游延伸預定數目個核苷酸的DNA核苷酸；及(ii)在諸如源基因體之參考背景下在編碼序列下游延伸預定數目個核苷酸的DNA核苷酸。在各種實施例中，核苷酸之預定數目可為500 bp、1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、10 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、75 kb或100 kb。如本文所用，「轉殖基因」係指基因相對於存在該基因或可藉由工程改造而置放該基因的參考背景而言係非內源性或天然的。
基因產物或表現產物 ：如本文所用，術語「基因產物」或「表現產物」通常係指自基因(加工前及/或加工後)轉錄之RNA或由自基因轉錄之RNA編碼的多肽(修飾前及/或修飾後)。
宿主細胞、目標細胞 ：如本文所用，「宿主細胞」係指引入外源性DNA (重組或以其他方式)、諸如轉殖基因之細胞。熟習此項技術者應瞭解，「宿主細胞」可為最初引入外源性DNA的細胞及/或其完全或不完全的子代或複本。在一些實施例中，宿主細胞包括一或多種病毒基因或轉殖基因。在一些實施例中，預期或潛在宿主細胞可稱為目標細胞。
一致性：如本文所用，術語「一致性」係指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的整體相關性。用於計算與兩個所提供之序列之間的一致性百分比的方法係此項技術中已知的。舉例而言，兩個核酸或多肽序列之一致性百分比的計算可例如藉由出於最佳比較目的比對兩個序列(或一個或兩個序列之互補序列)來進行(例如可將間隙引入第一及第二序列中之一個或兩個中以便最佳比對，且出於比較目的可忽略非一致序列)。隨後比較相應位置處之核苷酸或胺基酸。當第一序列中之一個位置由與第二序列中對應位置相同之殘基(例如核苷酸或胺基酸)佔據時，則分子在彼位置處一致。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共有之一致位置數目的函數，視情況考慮為了兩個序列之最佳比對而可能需要引入之間隙的數目及各間隙的長度。序列之比較及兩個序列之間的一致性百分比的確定可使用計算演算法，諸如BLAST (鹼基局部比對檢索工具)實現。
「改善」、「增加」、「抑制」或「減少」 ：如本文所用，術語「改善」、「增加」、「抑制」及「減少」及其語法同等物指示相對於參考之定性或定量差異。
經分離： 如本文所用，術語「經分離」係指如下物質及/或實體：(1)已與最初產生時(無論在自然界中及/或在實驗環境中)與其相關聯的至少一些組分分離；及/或(2)人為設計、產生、製備及/或製造。經分離物質及/或實體可與約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%的最初與其相關聯之其他組分分離。在一些實施例中，經分離藥劑為約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%純。如本文所用，若物質實質上不含其他組分，則其為「純的」。在一些實施例中，如熟習此項技術者所瞭解，在與諸如一或多種載劑或賦形劑(例如緩衝劑、溶劑、水等)之某些其他組分組合後物質仍可視為「經分離」或甚至「純的」；在此類實施例中，在不包括此類載劑或賦形劑下計算物質之分離百分比或純度。僅給出一個實例，在一些實施例中，自然界中存在之生物聚合物(諸如多肽或聚核苷酸)，當a)藉助於其衍生起源或來源，不與在自然界中在其天然狀態中伴隨其之組分中的一些或全部相關聯；b)其實質上不含與在自然界中產生其之物種相同的物種之其他多肽或核酸；c)由來自不為在自然界中產生其之物種的細胞或其他表現系統的組分表現或另外與該等組分相關聯時，視為「經分離」。因此，舉例而言，在一些實施例中，化學合成或在與在自然界中產生其之系統不同的細胞系統中合成的多肽視為「經分離 」之多肽。或者或另外，在一些實施例中，已經歷一或多種純化技術之多肽可在其已與a)在自然界中與其相關聯；及/或b)在最初產生時與其相關聯之其他組分分離的程度上視為「經分離」之多肽。
可操作地連接 ：如本文所用，「可操作地連接」係指至少第一元件與第二元件相關聯，使得組成元件處於允許其以其預期方式起作用的關係。舉例而言，若調控序列及編碼序列以允許藉由調控序列控制編碼序列之表現的方式相關聯，則核酸調控序列「可操作地連接」至核酸編碼序列。在一些實施例中，「可操作地連接 」之調控序列直接或間接地與編碼序列共價相關聯(例如在單個核酸中)。在一些實施例中，調控序列控制編碼序列呈反式之表現且在與編碼序列相同之核酸中包括調控序列並非可操作連接之要求。
醫藥學上可接受 ： 如本文所用，應用於用於調配如本文所揭示之組合物之一或多種或所有組分的術語「醫藥學上可接受」意謂各組分必須與組合物之其他成分相容且對其接受者無害。
醫藥學上可接受之載劑 ： 如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指促進藥劑(例如，醫藥劑)調配、改良藥劑之生體可用率或促進藥劑自個體之一個器官或部分輸送至另一個器官或部分的醫藥學上可接受之物質、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑囊封物質。可充當醫藥學上可接受之載劑的物質之一些實例包括：糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂(cocoa butter)及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如丙三醇、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；褐藻酸；無熱原質水；等張生理食鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；pH緩衝溶液；聚酯、聚碳酸酯及/或聚酸酐；及醫藥調配物中所用之其他無毒相容物質。
醫藥組合物： 如本文所用，術語「醫藥組合物」係指活性劑連同一或多種醫藥學上可接受之載體一起調配的組合物。
啟動子 ： 如本文所用，「啟動子」或「啟動子序列」可為直接或間接(例如經由結合啟動子之蛋白質或物質)參與編碼序列之轉譯起始及/或持續合成能力的DNA調控區。啟動子可在適合條件下在一或多種轉錄因子及/或調控部分與啟動子結合後起始編碼序列之轉譯。參與編碼序列轉錄起始之啟動子「可操作地連接」至編碼序列。在某些情況下，啟動子可為或包括DNA調控區，其自轉譯起始位點(在其3'端)延伸至上游(5'方向)位置，使得如此指定之序列包括起始轉譯事件所必需的最小數目之鹼基或元件中之一者或兩者。啟動子可為、包括諸如強化子及抑制子序列之表現控制序列或可操作地與之相關聯或可操作地連接。在一些實施例中，啟動子可為誘導性的。在一些實施例中，啟動子可為組成型啟動子。在一些實施例中，條件型(例如誘導型)啟動子可為單向或雙向的。啟動子可為或包括與已知在特定物種之基因體中出現之序列一致的序列。在一些實施例中，啟動子可為或包括雜交啟動子，其中含有轉錄調控區之序列可自一個來源獲得且含有轉錄起始區之序列可自第二來源獲得。用於連接控制元件至轉殖基因內之編碼序列的系統為此項技術中所熟知的(通用分子生物及重組DNA技術描述於Sambrook, Fritsch, 和Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。
參考 ： 如本文所用，術語「參考」係指進行比較所相對於之標準或對照。例如，在一些實施例中，試劑、樣品、序列、個體、動物或個人、或其群體、或其量度或特徵性代表與參考、試劑、樣品、序列、個體、動物或個體、或其群體、或其量度或特徵性代表相比較。在一些實施例中，參考為量測值。在一些實施例中，參考為確立之標準或期望值。在一些實施例中，參考為歷史參考。參考可為定量或定性的。通常，如熟習此項技術者將理解，參考及與其比較之值表示在可比條件下的量測。熟習此項技術者應瞭解何時存在足以證明依賴性及/或比較的相似性。在一些實施例中，適當參考可為試劑、樣品、序列、個體、動物或個體、或其群體，在熟習此項技術者識別作為可比之條件下，例如以便評估一或多個特定變數(例如存在或不存在藥劑或條件)或其量度或特徵性代表。
調控序列 ： 如本文所用，在核酸編碼序列表現之上下文中，調控序列為控制編碼序列之表現的核酸序列。在一些實施例中，調控序列可控制或影響基因表現之一或多個態樣(例如，細胞類型特異性表現、誘導型表現等)。
個體 ： 如本文所用，術語「個體」係指生物體，通常哺乳動物(例如人類、大鼠或小鼠)。在一些實施例中，個體患有相關疾病、病症或病狀。在一些實施例中，個體易患疾病、病症或病狀。在一些實施例中，個體呈現疾病、病症或病狀之一或多個症狀或特徵。在一些實施例中，個體未罹患疾病、病症或病狀。在一些實施例中，個體未呈現疾病、病症或病狀之任何症狀或特徵。在一些實施例中，個體具有一或多個特點，該一或多個特點之特徵在於易患疾病、病症或病狀或具有罹患疾病、病症或病狀之風險。在一些實施例中，個體為已測得疾病、病症或病狀及/或已投與療法之個體。在一些情況下，人類個體可互換稱為「患者」或「個體」。
治療劑 ： 如本文所用，術語「治療劑」係指在向個體投與時引發所需藥理學作用之任何藥劑。在一些實施例中，若藥劑在適當群體中展現統計顯著效果，則其視為治療劑。在一些實施例中，適當群體可為模型生物體群體或人類群體。在一些實施例中，適當群體可由各種標準定義，諸如特定年齡組、性別、基因背景、先前存在之臨床病狀等。在一些實施例中，治療劑為可用於治療疾病、病症或病狀之物質。在一些實施例中，治療劑為在可出售以向人類投與之前已經或需要由政府機構批准之藥劑。在一些實施例中，治療劑為醫學處方所需要以用於向人類投與之藥劑。
治療有效量 ： 如本文所用，「治療有效量」係指產生投與其所期望之作用之量。在一些實施例中，該術語係指當根據治療給藥方案向罹患或易患疾病、病症及/或病狀之群體投與時足以治療該疾病、病症及/或病狀的量。在一些實施例中，治療有效量為降低疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀之發生率及/或嚴重程度，及/或延遲其發作的量。一般技術者將瞭解術語「治療有效量」實際上不需要在特定個體中實現成功治療。確切而言，治療有效量可為當向需要此類治療之患者投與時在相當大數目之個體中提供特定所期望之藥理學反應的該量。在一些實施例中，提及治療有效量可為提及如在一或多個具體組織(例如受疾病、病症或病狀影響之組織)或流體(例如血液、唾液、血清、汗液、淚液、尿液等)中所量測之量。一般技術者將瞭解，在一些實施例中，治療有效量之特定藥劑或療法可在單次給藥中調配及/或投與。在一些實施例中，治療有效之藥劑可以複數個劑量，例如作為給藥方案之一部分調配及/或投與。
治療 ： 如本文所用，術語「治療(treatment)」(亦為「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指投與部分或完全緩解、改善、減輕、抑制特定疾病、病症或病狀之一或多種症狀、特點及/或病因、延遲其發作、降低其嚴重程度及/或降低其發病率或經投與以便實現任何此類結果的療法。在一些實施例中，此類治療可對不展現相關疾病、病症或病狀之徵象的個體及/或僅展現疾病、病症或病狀之早期徵象的個體進行。或者或另外，此類治療可對展現相關疾病、病症及/或病狀之一或多種確立徵象的個體進行。在一些實施例中，治療可對已診斷為罹患相關疾病、病症及/或病狀之個體進行。在一些實施例中，治療可對已知具有一或多種在統計學上與相關疾病、病症或病狀發展風險增加相關的易感性因素之個體進行。
單位劑量 ： 如本文所用，術語「單位劑量」係指以單一劑量及/或以醫藥組合物之物理離散單元投與之量。在許多實施例中，單位劑量含有預定量之活性劑，例如預定病毒滴度(給定體積中病毒、病毒體或病毒粒子之數目)。在一些實施例中，單位劑量含有整個單一劑量之藥劑。在一些實施例中，投與超過一個單位劑量以達成總單一劑量。在一些實施例中，需要或者認為需要投與多個單位劑量，以便達成預期作用。單位劑量可為例如含有預定量之一或多種治療部分之一定體積的液體(例如可接受之載劑)、預定量之呈固體形式之一或多種治療部分、含有預定量之一或多種治療部分之持續釋放調配物或藥物遞送裝置等。應瞭解，單位劑量可以除治療部分之外亦包括各種組分中之任一者的調配物形式存在。舉例而言，可包括可接受之載劑(例如醫藥學上可接受之載劑)、稀釋劑、穩定劑、緩衝劑、防腐劑等。熟習此項技術者應瞭解，在多個實施例中，特定治療劑之總適當日劑量可包括單位劑量之一部分或複數個單位劑量，且可例如由開業醫師根據合理的醫學判斷來決定。在一些實施例中，任何特定患者或生物體之特定有效劑量將視多種因素而定，該等因素包括所治療之病症及病症之嚴重程度；所用特定化合物之活性；所用特定組合物；患者之年齡、體重、整體健康、性別及膳食；投與時間及所用特定活性化合物之排泄率；治療持續時間；與所用特定化合物組合或同時使用之藥物及/或額外療法；及醫學技術中熟知之類似因素。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年4月13日申請之美國臨時申請案第63/009,298號的在先申請日之優先權及益處，該臨時申請案以全文引用之方式併入本文中。 關於聯邦政府資助研究或開發的陳述
本發明係在政府支持下在由美國國家衛生研究院(the National Institutes of Health)授予的授權號HL128288及HL136135下進行。在本發明中政府具有某些權利。
本發明尤其包括腺病毒載體、腺病毒載體基因體及其組合及用途。本發明之腺病毒載體及腺病毒載體基因體可包括多達例如20、25、30或甚至超過30 kb之轉位子負載，且此外在各種實施例中，成功地將此類大轉位子負載併合至宿主細胞之基因體中。如熟習此項技術者將瞭解，載體在其中及本身併合之容量為基因療法系統之一個非常重要之特徵，此至少部分因為併合容量限制治療負載之長度及/或複雜性。因此，本文所提供之方法及組合物尤其提供一種使用腺病毒載體進行有效基因療法之平台，該平台允許將例如20、25、30或甚至超過30 kb之核酸負載轉位併合至宿主細胞基因體中。如熟習此項技術者將自本發明瞭解且如由本文中之各種實施例所例示，此類併合容量允許以相比各種先前系統可能之複雜度及多樣性更大的複雜度及多樣性對治療負載進行工程改造。
本發明之方法及組合物克服了先前所瞭解的對併合容量之某些限制。某些此類限制與病毒載體類型相關。舉例而言，慢病毒載體負載容量為約9 kb，逆轉錄病毒負載容量為約8 kb，且腺相關病毒(AAV)負載容量為約5 kb。先前瞭解到其他此類限制是轉位所固有的。舉例而言，研究顯示，轉位子併合視長度而定，亦即，隨著長度增加，轉位能力迅速降低，此現象在此項技術中有時稱為「長度依賴性」。鑒於此等當前期望，本文所揭示之組合物及方法打破先前所瞭解之對腺病毒轉位併合容量之限制的發現係本發明及本文所提供之實例所展現的出人意料之結果。據本發明者所知，此工作表示首次證明了如本文所提供之方法及組合物可併合本文所揭示之各種特定尺寸之轉位子負載。舉例而言，此發現如下所例示：併合包括大調控區(基因座控制區域，或「LCR」)之轉位子負載，以改良轉殖基因表現。然而，為避免任何疑義，熟習此項技術者應瞭解此類例證代表本文所提供之腺病毒組合物及方法之高轉位併合容量的更普遍發現，及其在包括尤其基因療法領域之各種領域中之意義。
現如下以更多支持性細節描述本發明之態樣：(I)病毒載體負載併合至目標細胞基因體中；(II)大負載之類型；(III)長LCR；(IV)與長LCR可操作地連接之編碼序列；(V)轉位酶；(VI)調控組件；(VII)載體；(VIII)調配物；(IX)應用；(X)示例性實施例；(XI)實驗實例；及(XII)結束段落。
(I) 病毒載體負載併合至目標細胞基因體中
基因療法通常需要將所需核酸負載併合至目標細胞之基因體中。鑒於可藉由各種基因療法治療之病狀多樣性，已構想用於設計核酸負載之許多策略。然而，實際上，治療負載之遞送在許多情況下因大負載難以併合至目標細胞基因體而受到限制。舉例而言，慢病毒載體負載容量為約9 kb，逆轉錄病毒負載容量為約8 kb，且腺相關病毒(AAV)負載容量為約5 kb。考慮到當前對能夠表現大基因、利用大人類調控序列及/或表現多種基因之負載的關注，此等為相當大之限制。此外，如熟習此項技術者所充分瞭解，各病毒平台與各種不同特徵相關聯，該等特徵使各平台獨特地更適合或更不適合於各種用途，該等因素可包括(不限於)接受者免疫反應(例如，發炎及/或與預先存在之抗體的相互作用)、載體產生困難、細胞轉導功效、負載併合功效、轉殖基因表現特徵、靶向之細胞類型、基因毒性(例如致癌)之風險及其他，其中任一個或所有因素均可由研究人員及行醫者在各種背景下獨特地權衡。本發明認識到，在一或多個系統中使用某些已知之組合物及方法進行之轉位子負載併合的效率視目標細胞類型、質體骨架及/或轉位子長度中之一或多者而定，且在至少某些本發明之組合物及方法，例如包括腺病毒基因體之組合物及方法中某些此類依賴性降低或消除，該腺病毒基因體包括由SB反向重複序列側接之轉位子負載(例如，例如在人類個體細胞，例如造血幹細胞中及/或活體內療法中，用於藉由SB100x轉位酶或另一SB轉位酶轉位)。
腺病毒載體屬於最常用之基因療法載體。舉例而言，根據至少一些報導，腺病毒載體係最常用於癌症基因療法之載體。實際上，超過400種基因療法試驗已使用人類Ad載體起始及/或完成，例如用於疫苗用途、治療性轉殖基因引入及/或癌症治療。影響及/或至少部分負責基因療法中之腺病毒載體之流行率的腺病毒載體之各種優點係此項技術中已知的。然而，即使在常用載體之情況下，基因療法仍係有困難之挑戰，至少部分因為長期表型校正需要治療性轉殖基因之足夠有效且足夠穩定的併合及表現。
儘管已知一些腺病毒載體具有高達約36-37 kb之高選殖容量，但物理上產生攜帶大負載之載體的能力不反映該載體有效介導負載併合至目標細胞基因體中的能力。實際上，通常為26-45 kb之線性雙股DNA基因體(例如對於Ad5為約36 kb)的腺病毒載體基因體通常不天然地併合至宿主細胞基因體中。相反地，腺病毒載體之特徵在於病毒基因體在宿主細胞中之游離型維持。雖然游離型維持將插入效應之風險降至最低，但游離型基因體通常無法被目標細胞及目標細胞子代充分保留，屬於熟習此項技術者已知之其他困難。至少出於此等原因，已努力產生不同於其天然對應物之腺病毒載體，其經工程改造以併合至宿主細胞基因體中。此等方法同樣並非沒有挑戰。舉例而言，某些併合腺病毒載體之一個問題為以基因毒性效應為特徵之併合位點偏好。
對將負載併合至宿主細胞基因體中之腺病毒載體進行工程改造的一種方式為產生併合病毒雜交載體。併合病毒雜交載體將有效轉導目標細胞之載體的基因元件與穩定併合載體負載之載體的基因元件組合。例如與腺病毒載體組合使用的所關注的併合元件已包括噬菌體併合酶PHiC31、逆轉錄轉位子、逆轉錄病毒(例如LTR介導或逆轉錄病毒併合酶介導)、鋅指核酸酶、DNA結合域-逆轉錄病毒併合酶融合蛋白、AAV (例如AAV-ITR或AAV-Rep蛋白介導)及睡美人(SB)轉位酶。
類似於載體本身，併合病毒雜交載體之併合系統具有其自身之獨特優點及缺點，包括特徵性位置併合模式及負載容量。舉例而言，研究顯示，轉位子之併合視長度而定；隨著長度增加，轉位能力迅速降低，此現象在此項技術中有時稱為「長度依賴性」。在SB轉位酶之情況下，研究已顯示，每添加1 kb之轉位子(負載)長度，SB轉位子功效降低30%且高於約9 kb時完全喪失。儘管一些研究指示保留一小部分SB轉位子併合，多達至少約10 kb，但證據表明，相對於較小對應物，較大SB轉位子將無法有效地併合。經修飾以增強併合功效之某些SB系統亦具有顯著之長度依賴性效應，轉位子併合水準大量降低(Turchiano等人,PLOS One , 9: e112712, 2014)。
本發明尤其提供，本發明者意外地發現，多達至少約30 kb至約35 kb之轉位子負載可併合至宿主細胞基因體中，具有足夠用於治療用途之功效。在各種實施例中，本發明提供用於併合大負載(例如多達至少約30 kb至約35 kb)之載體、基因體及系統，其包括腺病毒基因體，該腺病毒基因體包括由SB反向重複序列側接之轉位子負載，該等SB反向重複序列又由FRT重組位點側接，使得包括轉位子負載之基因體或其一部分在重組酶存在下環化，本發明者已發現其可在SB轉位酶存在下將大轉位子負載併合至目標細胞基因體中。本發明進一步提供，此類組合物足夠有效例如用於併合及轉殖基因表現，從而實現活體內療法。此等顯著發現與長度依賴性及併合功效之先前概念形成鮮明對比，打開了先前認為無法實現之腺病毒載體之治療及研究用途的大門。
(II) 大負載之類型
在特定實施例中，本文所揭示之本發明有助於大轉位子負載之遞送及併合。大負載包括連接於長LCR之編碼序列，包括例如本文所述之彼等編碼序列。在特定實施例中，負載為至少10 kb。在特定實施例中，負載為至少10 kb、15 kb、20 kb、25 kb、30 kb、35 kb、40 kb或更多。在特定實施例中，負載具有10 kb-35 kb、10 kb-30 kb、15 kb-35 kb、15 kb-30 kb、20 kb-35 kb或20 kb-30 kb之長度。在特定實施例中，負載具有10 kb-32.4 kb、15 kb-32.4 kb或20 kb-32.4 kb之長度。在特定實施例中，負載編碼單一長(大)蛋白質。在特定實施例中，負載編碼多種蛋白質；例如兩種或更多種蛋白質，諸如兩種、三種、四種或五種蛋白質或更多。在負載編碼多種蛋白質之實施例中，所編碼之任何個別蛋白質無需獨立地視為「大」或「長」；而是應瞭解，腺病毒載體攜帶之整個負載為「大」即可，即使其含有大量較小的個別蛋白質編碼序列。在特定實施例中，負載包括長LCR。
(III) 長 LCR
將大負載併合至宿主細胞基因體中之能力打開了併合先前認為太大而無法有效用於治療用途之構築體的大門。除能夠併合大負載之即刻顯而易見之一般效用以外，一類大負載包括包含長基因座控制區域(或長LCR)之負載。在一些情況下，比由用於基因療法之至少某些現有載體系統(諸如慢病毒及AAV系統)調節之區域大的調控區可用於實現治療有效轉殖基因自負載表現及/或增加表現量(例如，在產生編碼轉殖基因表現產物之mRNA及/或由轉殖基因編碼之轉殖基因表現產物的數目或頻率方面)及/或表現特異性(例如，在表現時序及/或表現之細胞或組織特異性方面)。
不希望受任何特定科學理論束縛，人類基因體例如經由形成環而組織為三維結構，其包括調控區(諸如轉錄因子結合位點及其控制表現之編碼區)之間的長距離直接及/或間接相互作用。在許多情況下，此等長距離相互作用在拓樸關聯域(TAD)之情形下發生。TAD被視為染色體組織之功能單元，其可促進強化子與其他調控區的相互作用以控制轉錄。TAD由邊界分界，認為該等邊界限制強化子及啟動子之搜尋空間且防止形成不合需要之調控接觸點。在此等域之兩側的TAD邊界在不同哺乳動物細胞類型之間且甚至在整個物種中保守。
由於其在基因體中之重要作用，且尤其其在組織影響基因及轉殖基因表現之核酸序列及蛋白質方面的作用，因此TAD可用於增加基因療法之安全性及/或功效。TAD自身太大而無法包括於任何現有之病毒載體中。TAD之中值尺寸為880 kb。然而，已鑑別出在TAD內存在的捕捉TAD之基因或轉殖基因表現效應中之一些或全部的某些功能元件且尺寸適合於包括於本文所揭示之腺病毒載體中，但在許多情況下仍然太大而無法包括於諸如慢病毒及AAV載體之某些其他載體中。在一些情況下，包括TAD之一或多個核酸序列的調控序列可稱為LCR。LCR已經工程改造以具有各種長度，例如在一些情況下具有相對較短之長度以包括於具有相對較小負載容量之載體中，諸如慢病毒或AAV載體。然而，不希望受任何特定理論束縛，熟習此項技術者瞭解，較長序列有較大容量來賦予相關基因或轉殖基因對其全部或部分來源於或其序列全部或部分基於之內源性序列的有利表現效應。因此，一些LCR已經工程改造以具有相對較短之長度，例如5 kb或更少、6 kb或更少、7 kb或更少、8 kb或更少或9 kb或更少。相比之下，本發明認識到長LCR (例如9 kb或更多、10 kb或更多、11 kb或更多、12 kb或更多、13 kb或更多、14 kb或更多、15 kb或更多、20 kb或更多、25 kb或更多、或30 kb或更多之調控序列)可使用本文所提供之載體、基因體及方法併合至宿主細胞基因體中。在各種實施例中，長LCR包括長度範圍具有選自5 kb、6 kb、7 kb、8 kb、9 kb、10 kb、11 kb、12 kb、13 kb、14 kb、15 kb、16 kb、17 kb、18 kb、19 kb、20 kb、21 kb、22 kb、23 kb、24 kb、25 kb、26 kb、27 kb、28 kb、29 kb及30 kb中之任一者之下限及選自30 kb、31 kb、32 kb、33 kb、34 kb、35 kb、36 kb、37 kb、38 kb、39 kb及40 kb中之任一者之上限的調控序列。長LCR亦可具有本文所提供之任何LCR之任何長度，此類長度在各種實施例中可視為下限或上限。
LCR之實例包括表1中所示之彼等LCR。除非另有指示或如熟習此項技術者將清楚，否則參考基因體為GRCh38參考基因體，諸如GRCH38/hg38或GRCh38.p13。
表 1 ：
LCR 示例性組織表現
β-球蛋白LCR 紅血球
免疫球蛋白重鏈LCR B細胞
T細胞受體α/δ LCR T細胞
腺苷去胺酶LCR 富集於血液、腸及淋巴組織中
載脂蛋白E/C-1 LCR 腎上腺、肝臟
Th2細胞介素LCR Th2細胞
CD2 LCR T細胞
S100β LCR 腦星形膠質細胞
生長激素LCR 腦垂腺
載脂蛋白B LCR 腸、肝臟
β肌凝蛋白重鏈LCR 心肌、骨骼肌
MHC I類HLA-B7 LCR 所有細胞
角蛋白18 LCR 上皮細胞
MHC I類HLA G LCR 所有細胞
補體組分C4A/B LCR 肝臟
紅綠視覺色素LCR (視蛋白LCR) 視錐細胞
CD4 LCR Cd4+ t細胞
α-乳白蛋白LCR 乳腺
肌間線蛋白LCR 心肌、骨骼肌、平滑肌
CYP19/芳香酶LCR 多種組織
C-fes原癌基因LCR 骨髓細胞，包括巨噬細胞及嗜中性球
α-球蛋白基因座控制區域 紅血球
核因子紅血球系2樣1 (NFE2L1) LCR 紅血球
β-球蛋白LCR在至少若干方面示範至少一些LCR。舉例而言，如同許多其他LCR，β-球蛋白LCR增強可操作地連接之基因或轉殖基因的表現(例如增加轉錄、增加轉譯及/或增加細胞或組織特異性)且包括熟習此項技術者瞭解之介導LCR之表現效應的DNA水解酶超敏感(HS)區域。另外，如同許多其他LCR，β-球蛋白LCR可完整或部分地使用，例如其中其可用於包括β-球蛋白LCR序列之核酸中，該β-球蛋白LCR序列包括所有β-球蛋白LCR HS區域(HS1-HS5)或包括β-球蛋白LCR HS區域之子集(例如HS1-HS4)。
關於染色體11上之智人β-球蛋白區域之一示例性核酸序列以Genbank寄存編號NG_000007提供。在一些情況下，β-球蛋白長LCR可為或包括位於基因座中之第一(胚胎)球蛋白基因5'的6 kb至22 kb之序列。β-球蛋白長LCR可包括5個DNA水解酶I超敏感位點，5'HS 1至5。Li等人,Blood , 100(9):3077-3086, 2002。NG_000007提供描繪基因座控制區域內之DNA水解酶I高敏感性位點HS1、HS2、HS3及HS4之限制位點(例如HS2之SnaBI及BstXI限制位點、HS3之HindIII及BamHI限制位點以及HS4之BamHI及BanII限制位點)的位置，且以全文引用之方式併入本文中，尤其對於超敏感位點位置。HS1之序列及位置例如以下所描述：Pasceri等人, Ann NY Acad. Sci. 1998; 850:377-381；Pasceri等人,Blood . 92:653-663, 1998；及Milot等人,Cell . 87:105-114, 1996。在特定實施例中，HS2區自基因座控制區域之位置16,671延伸至17,058。HS2之SnaBI及BstXI限制位點分別位於位置17,093及16,240。HS3區自基因座控制區域之位置12,459延伸至13,097。HS3之BamHI及HindIII限制位點分別位於位置12,065及13,360。HS4區自基因座控制區域之位置9,048延伸至9,713。HS4之BamHI及BanII限制位點分別位於位置8,496及9,576。
本文所揭示之特定實施例利用β-球蛋白LCR之微型部分。微型部分包括少於全部5個HS區，諸如HS1、HS2、HS3、HS4及/或HS5，只要LCR不包括β-球蛋白LCR之全部5個區段即可。本發明之實例1中所利用之4.3 kb HS1-HS4 LCR提供微型LCR之一個實例。其他微型LCR可包括例如HS1、HS2及HS3；HS2、HS3及HS4；HS3、HS4及HS5；HS1、HS3及HS5；HS1、HS2及HS5；及HS1、HS4及HS5。關於微型LCR之額外實例，參見Sadelain等人,Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 92: 6728-6732, 1995；及Lebouich等人,EMBO J. 13: 3065-3076, 1994。特定實施例可利用β-球蛋白LCR與β-球蛋白啟動子之組合。在特定實施例中，此組合產生5.9 kb LCR-啟動子組合。關於LCR，本文中可互換地使用「微型」與「微小」。
本文所揭示之特定實施例利用基因座控制區域(LCR)之長部分。長β-球蛋白LCR可包括HS1、HS2、HS3、HS4及HS5。在特定實施例中，長LCR包括包含β-球蛋白LCR之HS1、HS2、HS3、HS4及HS5的大約21.5 kb序列。長β-球蛋白LCR可與β-球蛋白啟動子偶合以驅動高蛋白質表現量。
特定實施例可包括人類染色體11 (SEQ ID NO: 6)之位置5292319-5270789 (21,531 bp)作為長β-球蛋白LCR，如GRCH38/hg38中所列舉。在各種實施例中，長LCR之總長度可等於或大於18 kb、18.5 kb、19 kb、19.5 kb、20 kb、20.5 kb、21 kb、21.5 kb或21.531 kb。在各種實施例中，長LCR之總長度可等於或大於SEQ ID NO: 6之長度的70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在各種實施例中，長LCR可以包括SEQ ID NO: 6之至少18 kb、18.5 kb、19 kb、19.5 kb、20 kb、20.5 kb、21 kb或21.5 kb。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可為或包括與SEQ ID NO: 6之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸。在各種實施例中，長LCR與天然基因體序列之不同之處可能在於其包括一或多個限制位點，諸如XhoI限制位點(參見例如SEQ ID NO: 98，其中示例性XhoI位點(斜體)提供於位置10655-10661處)。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可包括HS1、HS2、HS3、HS4及HS5。
在各種實施例中，Ad35載體系統可包括例如包括如GRCh38中列舉之人類染色體11 (SEQ ID NO: 7)之位置5228631-5227018 (1614 bp)的可轉位轉殖基因插入物作為β-球蛋白啟動子。在各種實施例中，β-球蛋白啟動子之總長度可等於或大於例如1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb、1.5 kb、1.6 kb或1.609 kb。在各種實施例中，β-球蛋白啟動子可包括SEQ ID NO: 7之至少1.0 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb、1.5 kb、1.6 kb或1.609 kb。在各種實施例中，β-球蛋白啟動子之總長度可等於或大於在表現受β-球蛋白LCR調控之基因(包括但不限於ε (HBE1)、G-γ (HBG2)、A-γ (HBG1)、δ (HBD)及β (HBB)球蛋白基因及/或血紅素β基因座(11:5,225,463-5,227,070，互補序列)中存在之一或多個基因)上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游之核酸序列的例如100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1 kb、1.5 kb、2 kb、2.5 kb、3 kb、4 kb或5 kb。在各種實施例中，β-球蛋白啟動子之總長度可等於或大於在染色體11 NC_000011.10位置5227021之上游，例如緊鄰上游之核酸序列的例如100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1 kb、1.5 kb、2 kb、2.5 kb、3 kb、4 kb或5 kb。在各種實施例中，β-球蛋白啟動子之總長度可等於或大於SEQ ID NO: 7之長度的70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，β-球蛋白啟動子可為或包括具有與參考基因體中存在之β-球蛋白啟動子序列之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列的核酸，視情況其中該β-球蛋白啟動子包括SEQ ID NO: 7之序列。
在各種實施例中，β-球蛋白LCR，諸如長β-球蛋白LCR引起紅血球中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之β-球蛋白啟動子可操作地連接。
免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR為增強可操作地連接之編碼序列之表現(例如增加轉錄、增加轉譯及/或增加細胞或組織特異性)的示例性LCR。當與包括完整免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR序列及/或包括其表現調控片段之免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR在免疫球蛋白重鏈(IgH)基因座之3'Cα區中包括四個DNA水解酶I超敏感位點(HS1、HS2、HS3及HS4)，充當增強型基因座控制區域(LCR)。因此，免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR可為包括所有HS1-HS4之完整免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR，或可為包括超敏感位點HS1-HS4之子集的其表現調控片段。此等HS位點映射至IgH C基因之約10-30 kb且可在短暫轉染分析中引起淋巴細胞特異性及發育調控之強化子元件。已觀察到，此核酸序列可在與伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)及漿細胞瘤細胞株中之c-myc基因連接時引導類似表現模式。在伯基特淋巴瘤及漿細胞瘤中，出現B細胞LCR控制c-myc，因為出現引起c-myc基因變得與IgH序列並置之特徵性染色體易位，由此導致異常的c-myc轉錄。B細胞LCR之額外描述可見於例如Madisen等人,Mol Cell Biol. 18(11):6281-92, 1998；Giannini等人,J. Immunol. 150:1772–1780, 1993; Madisen & Groudine,Genes Dev. 8:2212–2226, 1994；及Michaelson等人,Nucleic Acids Res. 23:975-981, 1995。
特定實施例可包括免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR位置染色體14-NC_000014.9(105586437-106879844，互補序列) (1,293,408 bp)或其表現調控片段。在各種實施例中，免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR之總長度可等於或大於免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR位置105586437-106879844的70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在各種實施例中，免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR可包括免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR位置105586437-106879844之至少10 kb、15 kb、16 kb、17 kb、18 kb、19 kb、20 kb、21 kb、22 kb、23 kb、24 kb、25 kb、26 kb、27 kb、28 kb、29 kb或30 kb。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可為或包括與免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR位置105586437-106879844之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的核酸。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR且視情況包括在人類基因體中通常與免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR。在各種實施例中，與免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR可操作地連接之基因為免疫球蛋白重鏈基因。在各種實施例中，免疫球蛋白重鏈基因啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，免疫球蛋白重鏈基因啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在免疫球蛋白重鏈基因上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為免疫球蛋白重鏈基因之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR (諸如長免疫球蛋白重鏈基因座B細胞LCR)引起B細胞中可操作地連接之編碼序列的表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之免疫球蛋白重鏈基因啟動子可操作地連接。
另一示例性LCR為T細胞受體α/δ基因座之T細胞LCR，其增強可操作地連接之編碼序列的表現。在T細胞受體(TCR) α/δ基因座中，LCR可調控有差異之組織及發育表現以及TCR α及δ基因之重排。當與包括T細胞受體α/δ基因座LCR序列之完整T細胞LCR及/或包括其表現調控片段的T細胞受體α/δ基因座LCR之T細胞LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。T細胞受體α/δ基因座LCR之T細胞LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導T細胞受體α/δ基因座LCR之T細胞LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。T細胞LCR經鑑別為TCR α/δ基因座之3'的包括八個T細胞特異性核酸酶超敏感域(HS1至HS8)之區域。因此，T細胞受體α/δ基因座LCR之T細胞LCR可為T細胞受體α/δ基因座LCR之完整T細胞LCR，包括所有HS1-HS8，或可為包括超敏感位點HS1-HS8之子集的其表現調控片段。在轉殖基因小鼠中觀察到，與此區域連接之TCR α基因表現量高，與併合位點無關，且與基因複本數相關。此轉殖基因在α β T細胞子集中表現，但不在γ δ T細胞子集中表現且在發育期間適當時間活化。LCR功能至少需要HS-2至HS-6。B細胞LCR之額外描述可見於例如Diaz等人,Immunity 1(3):207-17, 1994。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括T細胞受體α/δ基因座LCR之T細胞LCR且視情況包括在人類基因體中通常與T細胞受體α/δ基因座LCR之T細胞LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之T細胞受體α/δ基因座LCR之T細胞LCR。在各種實施例中，與T細胞受體α/δ基因座LCR之T細胞LCR可操作地連接的基因為染色體14上之TCRα，NC_000014.9(21621904. .22552132)，或染色體14上之TCR δ基因座，NC_000014.9 (22422546. .22466577)。在各種實施例中，TCR α或TCR δ啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，TCR α或TCR δ啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在TCR α或TCR δ上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與T細胞受體α/δ基因座LCR之T細胞LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為TCR α或TCR δ之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，T細胞受體α/δ基因座LCR之T細胞LCR (諸如T細胞受體α/δ基因座LCR之長T細胞LCR)引起T細胞中可操作地連接之編碼序列的表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之TCR α或TCR δ啟動子可操作地連接。
腺苷去胺酶LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整腺苷去胺酶LCR序列及/或包括其表現調控片段之腺苷去胺酶LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。腺苷去胺酶LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導腺苷去胺酶LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。腺苷去胺酶LCR包括超敏感位點1-6。因此，腺苷去胺酶LCR可為完整腺苷去胺酶LCR，包括所有HS1-HS6，或可為包括超敏感位點HS1-HS6之子集的其表現調控片段。
特定實施例可包括人類染色體20之腺苷去胺酶LCR位置NC_000020.11 44629004-44651567 (22,564 bp)或其表現調控片段。在各種實施例中，腺苷去胺酶LCR之總長度可等於或大於腺苷去胺酶LCR位置44629004-44651567之70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在各種實施例中，腺苷去胺酶LCR可包括腺苷去胺酶LCR位置44629004-44651567之至少10 kb、15 kb、16 kb、17 kb、18 kb、19 kb、20 kb、21 kb或22 kb。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可為或包括與腺苷去胺酶LCR位置44629004-44651567之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括腺苷去胺酶LCR且視情況包括在人類基因體中通常與腺苷去胺酶LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之腺苷去胺酶LCR。在各種實施例中，與腺苷去胺酶LCR可操作地連接之基因為腺苷去胺酶(20:44,619,518-44,651,757，互補序列)。在各種實施例中，腺苷去胺酶啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，腺苷去胺酶啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在腺苷去胺酶上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與腺苷去胺酶LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體20-NC_000020.11 44651607處腺苷去胺酶之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，腺苷去胺酶LCR (諸如長腺苷去胺酶LCR)引起血液、腸及淋巴組織中之一或多者中可操作地連接之編碼序列的表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之腺苷去胺酶啟動子可操作地連接。
載脂蛋白E/C LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整載脂蛋白E/C LCR序列及/或包括其表現調控片段之載脂蛋白E/C LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。載脂蛋白E/C LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導載脂蛋白E/C LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。載脂蛋白E/C LCR包括超敏感位點1-6。因此，載脂蛋白E/C LCR可為完整載脂蛋白E/C LCR，包括所有HS1-HS6，或可為包括超敏感位點HS1-HS6之子集的其表現調控片段。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括載脂蛋白E/C LCR且視情況包括在人類基因體中通常與載脂蛋白E/C LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之載脂蛋白E/C LCR。在各種實施例中，與載脂蛋白E/C LCR可操作地連接之基因為載脂蛋白E (19:44,905,795-44,909,394)。在各種實施例中，載脂蛋白E啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，載脂蛋白E啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在載脂蛋白E上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與載脂蛋白E/C LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體19-NC_000019.10 (44906625)處載脂蛋白E之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，載脂蛋白E/C LCR，例如長載脂蛋白E/C LCR引起紅血球中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之載脂蛋白E/C啟動子可操作地連接。
Th2細胞介素LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整Th2細胞介素LCR序列及/或包括其表現調控片段之Th2細胞介素LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。Th2細胞介素LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導Th2細胞介素LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。Th2細胞介素LCR包括超敏感位點RHS5-RHS7。因此，Th2細胞介素LCR可為完整Th2細胞介素LCR，包括所有RHS5-RHS7，或可為包括超敏感位點RHS5-RHS7之子集的其表現調控片段。
特定實施例可包括人類染色體5之Th2細胞介素LCR位置NC_000005.10 (132629263-132642195) (12,933 bp)或其表現調控片段。在各種實施例中，Th2細胞介素LCR之總長度可等於或大於Th2細胞介素LCR位置132629263-132642195之70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在各種實施例中，Th2細胞介素LCR可包括Th2細胞介素LCR位置132629263-132642195之至少1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、6 kb、7 kb、8 kb、9 kb、10 kb、11 kb或12 kb。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可為或包括與Th2細胞介素LCR位置132629263-132642195之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括Th2細胞介素LCR且視情況包括在人類基因體中通常與Th2細胞介素LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之Th2細胞介素LCR。在各種實施例中，與Th2細胞介素LCR可操作地連接之基因為Th2細胞介素，例如IL-4、IL-13或IL-5。在各種實施例中，Th2細胞介素啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，Th2細胞介素啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在Th2細胞介素上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。
在各種實施例中，Th2細胞介素LCR，諸如長Th2細胞介素LCR引起T細胞中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之Th2細胞介素啟動子可操作地連接。
CD2 LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整CD2 LCR序列及/或包括其表現調控片段之CD2 LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。CD2 LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導CD2 LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。CD2 LCR包括超敏感位點1-3。因此，CD2 LCR可為完整CD2 LCR，包括所有HS1-HS3，或可為包括超敏感位點HS1-HS3之子集的其表現調控片段。
特定實施例可包括人類染色體1之CD2 LCR位置NC_000001.11 116769217-116774826 (5,610 bp)或其表現調控片段。在各種實施例中，CD2 LCR之總長度可等於或大於CD2 LCR位置116769217-116774826之70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在各種實施例中，CD2 LCR可包括CD2 LCR位置116769217-116774826之至少1 kb、2 kb、3 kb、4 kb或5 kb。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可為或包括與CD2 LCR位置116769217-116774826之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括CD2 LCR且視情況包括在人類基因體中通常與CD2 LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之CD2 LCR。在各種實施例中，與CD2 LCR可操作地連接之基因為CD2 (1:116,754,429-116,769,228)。在各種實施例中，CD2啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，CD2啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在CD2上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與CD2 LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體1-NC_000001.11 (116754493)處CD2之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，CD2 LCR，諸如長CD2 LCR引起T細胞中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之CD2啟動子可操作地連接。
S100β LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整S100β LCR序列及/或包括其表現調控片段之S100β LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。S100β LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導S100β LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括S100β LCR且視情況包括在人類基因體中通常與S100β LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之S100β LCR。在各種實施例中，與S100β LCR可操作地連接之基因為S100β (21:46,598,603-46,605,242，互補序列)。在各種實施例中，S100β啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，S100β啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在S100β上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與S100β LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為S100β之第一編碼核苷酸(染色體21 - NC_000021.9 (46602415))。
在各種實施例中，S100β LCR，諸如長S100β LCR引起腦星形膠質細胞中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之S100β啟動子可操作地連接。
生長激素LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整生長激素LCR序列及/或包括其表現調控片段之生長激素LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。生長激素LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導生長激素LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。生長激素LCR包括超敏感位點1-5。因此，生長激素LCR可為完整生長激素LCR，包括所有HS1-HS5，或可為包括超敏感位點HS1-HS5之子集的其表現調控片段。
特定實施例可包括人類染色體17之生長激素LCR位置NC_000017.11 (63917193-63958852) (41,660 bp)或其表現調控片段。在各種實施例中，生長激素LCR之總長度可等於或大於生長激素LCR位置63917193-63958852之70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在各種實施例中，生長激素LCR可包括生長激素LCR位置63917193-63958852之至少10 kb、15 kb、16 kb、17 kb、18 kb、19 kb、20 kb、21 kb、22 kb、23 kb、24 kb、25 kb、26 kb、27 kb、28 kb、29 kb或30 kb。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可為或包括與生長激素LCR位置63917193-63958852之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括生長激素LCR且視情況包括在人類基因體中通常與生長激素LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之生長激素LCR。在各種實施例中，與生長激素LCR可操作地連接之基因為GH1 (生長激素1)、CSHL1 (絨毛膜生長催乳素激素樣1)、CSH1 (絨毛膜生長催乳素激素1 (胎盤催乳激素))、GH2 (生長激素2)或CSH2 (絨毛膜生長催乳素激素2)。在各種實施例中，GH1、CSHL1、CSH1、GH2或CSH2啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，GH1、CSHL1、CSH1、GH2或CSH2啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在GH1、CSHL1、CSH1、GH2或CSH2上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與生長激素LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為生長激素(17:63,917,202-63,918,838，互補序列)位置NC_000017.11 (63918776)之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，生長激素LCR，諸如長生長激素LCR引起腦垂腺中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之GH1、CSHL1、CSH1、GH2或CSH2啟動子可操作地連接。
載脂蛋白B LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整載脂蛋白B LCR序列及/或包括其表現調控片段之載脂蛋白B LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。載脂蛋白B LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導載脂蛋白B LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括載脂蛋白B LCR且視情況包括在人類基因體中通常與載脂蛋白B LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之載脂蛋白B LCR。在各種實施例中，與載脂蛋白B LCR可操作地連接之基因為APOB (2:21,001,428-21,044,072，互補序列)。在各種實施例中，APOB啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，APOB啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在APOB上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，通常與人類基因體中之載脂蛋白B LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為位置染色體2-NC_000002.12 (21043945)處APOB之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，載脂蛋白B LCR，例如長載脂蛋白B LCR引起腸及/或肝臟中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之APOB啟動子可操作地連接。
β肌凝蛋白重鏈LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整β肌凝蛋白重鏈LCR序列及/或包括其表現調控片段之β肌凝蛋白重鏈LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。β肌凝蛋白重鏈LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導β肌凝蛋白重鏈LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。β肌凝蛋白重鏈LCR包括超敏感位點1及2。因此，β肌凝蛋白重鏈LCR可為包括HS1與HS2之完整β肌凝蛋白重鏈LCR，或可為包括超敏感位點(HS1或HS2)之子集的其表現調控片段。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括β肌凝蛋白重鏈LCR且視情況包括在人類基因體中通常與β肌凝蛋白重鏈LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之β肌凝蛋白重鏈LCR。在各種實施例中，與β肌凝蛋白重鏈LCR可操作地連接之基因為β肌凝蛋白重鏈(14:23,412,739-23,435,676，互補序列)。在各種實施例中，β肌凝蛋白重鏈啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，β肌凝蛋白重鏈啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在β肌凝蛋白重鏈上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與β肌凝蛋白重鏈LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體14 - NC_000014.9 (23433732)處β肌凝蛋白重鏈之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，β肌凝蛋白重鏈LCR，例如長β肌凝蛋白重鏈LCR引起心肌及/或骨骼肌中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之β肌凝蛋白重鏈啟動子可操作地連接。
I類MHC HLA-B7 LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整I類MHC HLA-B7 LCR序列及/或包括其表現調控片段之I類MHC HLA-B7 LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。I類MHC HLA-B7 LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導I類MHC HLA-B7 LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括I類MHC HLA-B7 LCR且視情況包括在人類基因體中通常與I類MHC HLA-B7 LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之I類MHC HLA-B7 LCR。在各種實施例中，與I類MHC HLA-B7 LCR可操作地連接之基因為I類MHC HLA-B7。在各種實施例中，I類MHC HLA-B7啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，I類MHC HLA-B7啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在I類MHC HLA-B7上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。
在各種實施例中，I類MHC HLA-B7 LCR，例如長I類MHC HLA-B7 LCR引起許多細胞類型中可操作地連接之編碼序列之表現或廣泛表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之I類MHC HLA-B7啟動子可操作地連接。
I類MHC HLA-G LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整I類MHC HLA-G LCR序列及/或包括其表現調控片段之I類MHC HLA-G LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。I類MHC HLA-G LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導I類MHC HLA-G LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括I類MHC HLA-G LCR且視情況包括在人類基因體中通常與I類MHC HLA-G LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之I類MHC HLA-G LCR。在各種實施例中，與I類MHC HLA-G LCR可操作地連接之基因為I類MHC HLA-G。在各種實施例中，I類MHC HLA-G啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，I類MHC HLA-G啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在I類MHC HLA-G上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。
在各種實施例中，I類MHC HLA-G LCR，例如長I類MHC HLA-G LCR引起許多細胞類型中可操作地連接之編碼序列之表現或廣泛表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之I類MHC HLA-G啟動子可操作地連接。
角蛋白18 LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整角蛋白18 LCR序列及/或包括其表現調控片段之角蛋白18 LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。角蛋白18 LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導角蛋白18 LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。角蛋白18 LCR包括超敏感位點1-4。因此，角蛋白18 LCR可為完整角蛋白18 LCR，包括所有HS1-HS4，或可為包括超敏感位點HS1-HS4之子集的其表現調控片段。
特定實施例可包括人類染色體12之角蛋白18 LCR位置NC_000012.12 (52948039-52956706) (8,668 bp)或其表現調控片段。在各種實施例中，角蛋白18 LCR之總長度可等於或大於角蛋白18 LCR位置52948039-52956706之70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在各種實施例中，角蛋白18 LCR可包括角蛋白18 LCR位置52948039-52956706之至少1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、6 kb、7 kb或8 kb。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可為或包括與角蛋白18 LCR位置52948039-52956706之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括角蛋白18 LCR且視情況包括在人類基因體中通常與角蛋白18 LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之角蛋白18 LCR。在各種實施例中，與角蛋白18 LCR可操作地連接之基因為角蛋白18 (12:52,948,870-52,952,905)。在各種實施例中，角蛋白18啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，角蛋白18啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在角蛋白18上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與角蛋白18 LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體12 - NC_000012.12 (52949174)處角蛋白18之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，角蛋白18 LCR，諸如長角蛋白18 LCR引起上皮細胞中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之角蛋白18啟動子可操作地連接。
補體組分C4A/B LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整補體組分C4A/B LCR序列及/或包括其表現調控片段之補體組分C4A/B LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。補體組分C4A/B LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導補體組分C4A/B LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括補體組分C4A/B LCR且視情況包括在人類基因體中通常與補體組分C4A/B LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之補體組分C4A/B LCR。在各種實施例中，與補體組分C4A/B LCR可操作地連接之基因為C4A (6:31,982,056-32,002,680)。在各種實施例中，C4A啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，C4A啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在C4A上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與補體組分C4A/B LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體6 - NC_000006.12 (31982108)處C4A之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，補體組分C4A/B LCR，諸如長補體組分C4A/B LCR引起肝臟中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之C4A啟動子可操作地連接。
紅綠色素顏料(視蛋白) LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整紅綠視覺色素(視蛋白) LCR序列及/或包括其表現調控片段之紅綠視覺色素(視蛋白) LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。紅綠視覺色素(視蛋白) LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導紅綠視覺色素(視蛋白) LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。紅綠視覺色素(視蛋白) LCR包括超敏感位點1-3。因此，紅綠視覺色素(視蛋白) LCR可為完整紅綠視覺色素(視蛋白) LCR，包括所有HS1-HS3，或可為包括超敏感位點HS1-HS3之子集的其表現調控片段。
特定實施例可包括人類染色體X之紅綠視覺色素(視蛋白)LCR位置NC_000023.11(154137727-154144286) (6,560 bp)或其表現調控片段。在各種實施例中，紅綠視覺色素(視蛋白) LCR之總長度可等於或大於紅綠視覺色素(視蛋白) LCR位置154137727-154144286之70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在各種實施例中，紅綠視覺色素(視蛋白) LCR可包括紅綠視覺色素(視蛋白) LCR位置154137727-154144286之至少1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb或6 kb。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可為或包括與紅綠視覺色素(視蛋白) LCR位置154137727-154144286之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括紅綠視覺色素(視蛋白) LCR且視情況包括在人類基因體中通常與紅綠視覺色素(視蛋白)LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之紅綠視覺色素(視蛋白) LCR。在各種實施例中，與紅綠視覺色素(視蛋白) LCR可操作地連接之基因為長波敏感視蛋白1 (X:154,144,242-154,159,031)(OPN1LW)、中波敏感視蛋白1 (OPN1MW)、OPN1MW2或OPN1MW3。在各種實施例中，OPN1LW、OPN1MW、OPN1MW2或OPN1MW3啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，OPN1LW、OPN1MW、OPN1MW2或OPN1MW3啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在OPN1LW、OPN1MW、OPN1MW2或OPN1MW3上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與紅綠視覺色素(視蛋白) LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為在染色體X-NC_000023.11 (154144284)處OPN1LW或在染色體X-NC_000023.11 (154182678)處OPN1MW之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，紅綠視覺色素(視蛋白) LCR，例如長紅綠視覺色素(視蛋白) LCR引起視錐細胞中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之OPN1LW、OPN1MW、OPN1MW2或OPN1MW3啟動子可操作地連接。
α-球蛋白LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整α-球蛋白LCR序列及/或包括其表現調控片段之α-球蛋白LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。α-球蛋白LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導α-球蛋白LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。α-球蛋白LCR包括超敏感位點MCS-R1至MCS-R4。因此，α-球蛋白LCR可為完整α-球蛋白LCR，包括所有MCS-R1至MCS-R4，或可為包括超敏感位點MCS-R1至MCS-R4之子集的其表現調控片段。
特定實施例可包括人類染色體16之α-球蛋白LCR位置NC_000016.10 (87808-152854) (65,047 bp)或其表現調控片段。在各種實施例中，α-球蛋白LCR之總長度可等於或大於α-球蛋白LCR位置87808-152854之70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在各種實施例中，α-球蛋白LCR可包括α-球蛋白LCR位置87808-152854之至少10 kb、15 kb、16 kb、17 kb、18 kb、19 kb、20 kb、21 kb、22 kb、23 kb、24 kb、25 kb、26 kb、27 kb、28 kb、29 kb或30 kb。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可為或包括與α-球蛋白LCR位置87808-152854之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括α-球蛋白LCR且視情況包括在人類基因體中通常與α-球蛋白LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之α-球蛋白LCR。在各種實施例中，與α-球蛋白LCR可操作地連接之基因為α-球蛋白基因簇(主要α-球蛋白基因座：16:172,875-173,709)內之HBZ (血紅素，ζ)、HBA2 (血紅素，α2)、HBA1 (血紅素，α1)或HBQ1 (血紅素，θ1)。在各種實施例中，HBZ (血紅素，ζ)、HBA2 (血紅素，α2)、HBA1 (血紅素，α1)或HBQ1 (血紅素，θ1)啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，HBZ (血紅素，ζ)、HBA2 (血紅素，α2)、HBA1 (血紅素，α1)或HBQ1 (血紅素，θ1)啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在HBZ (血紅素，ζ)、HBA2 (血紅素，α2)、HBA1 (血紅素，α1)或HBQ1 (血紅素，θ1)上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與α-球蛋白LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為HBA1染色體16 - NC_000016.10 (176717)、HBA2染色體16 - NC_000016.10 (172913)、HBZ染色體16 - NC_000016.10 (152910)或HBQ1染色體16 - NC_000016.10 (180487)之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，α-球蛋白LCR，例如長α-球蛋白LCR引起紅血球中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之啟動子可操作地連接。
肌間線蛋白LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整肌間線蛋白LCR序列及/或包括其表現調控片段之肌間線蛋白LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。肌間線蛋白LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導肌間線蛋白LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。肌間線蛋白LCR包括超敏感位點1-5。因此，肌間線蛋白LCR可為完整肌間線蛋白LCR，包括所有HS1-HS5，或可為包括超敏感位點HS1-HS5之子集的其表現調控片段。
特定實施例可包括人類染色體2之肌間線蛋白LCR位置NC_000002.12 (219399709-219418452)(18,743 bp)或其表現調控片段。在各種實施例中，肌間線蛋白LCR之總長度可等於或大於肌間線蛋白LCR位置219399709-219418452之70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在各種實施例中，肌間線蛋白LCR可包括肌間線蛋白LCR位置219399709-219418452之至少10 kb、15 kb、16 kb、17 kb或18 kb。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可為或包括與肌間線蛋白LCR位置219399709-219418452之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括肌間線蛋白LCR且視情況包括在人類基因體中通常與肌間線蛋白LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之肌間線蛋白LCR。在各種實施例中，與肌間線蛋白LCR可操作地連接之基因為肌間線蛋白(2:219,418,376-219,426,733)。在各種實施例中，肌間線蛋白啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，肌間線蛋白啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在肌間線蛋白上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與肌間線蛋白LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體2-NC_000002.12 (21941863)處肌間線蛋白之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，肌間線蛋白LCR，例如長肌間線蛋白LCR引起心肌、骨骼肌及/或平滑肌中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之肌間線蛋白啟動子可操作地連接。
核因子紅血球系2樣1 (NFE2L1) LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整NFE2L1 LCR序列及/或包括其表現調控片段之NFE2L1 LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。NFE2L1 LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導NFE2L1 LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。
特定實施例可包括人類染色體17之NFE2L1 LCR位置NC_000017.11 (48048359-48061545) (13,186 bp)或其表現調控片段。在各種實施例中，NFE2L1 LCR之總長度可等於或大於NFE2L1 LCR位置48048359-48061545之70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在各種實施例中，NFE2L1 LCR可包括NFE2L1 LCR位置48048359-48061545之至少10 kb、11 kb、12 kb或13 kb。在本文所提供之各種實施例中之任一者中，長LCR可為或包括與NFE2L1 LCR位置48048359-48061545之對應相連部分具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括NFE2L1 LCR且視情況包括在人類基因體中通常與NFE2L1 LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之NFE2L1 LCR。在各種實施例中，與NFE2L1 LCR可操作地連接之基因為NFE2L1 (17:48,048,358-48,061,544)。在各種實施例中，NFE2L1啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，NFE2L1啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在NFE2L1上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與NFE2L1 LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體17 - NC_000017.11 (48051119)處NFE2L1之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，NFE2L1 LCR，諸如長NFE2L1 LCR引起紅血球中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之NFE2L1啟動子可操作地連接。
CD4 LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整CD4 LCR序列及/或包括其表現調控片段之CD4 LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。CD4 LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導CD4 LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。CD4 LCR包括多達17個超敏感位點DH1-DH17。因此，CD4 LCR可為完整CD4 LCR，包括所有DH1-DH17，或可為包括超敏感位點DH1-DH17之子集的其表現調控片段。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括CD4 LCR且視情況包括在人類基因體中通常與CD4 LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之CD4 LCR。在各種實施例中，與CD4 LCR可操作地連接之基因為CD4 (12:6,789,527-6,820,809)。在各種實施例中，CD4啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，CD4啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在CD4上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與CD4 LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體12 - NC_000012.12 (6800139)處CD4之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，CD4 LCR，諸如長CD4 LCR引起CD4+ T細胞中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之CD4啟動子可操作地連接。
α-乳白蛋白LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整α-乳白蛋白LCR序列及/或包括其表現調控片段之α-乳白蛋白LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。α-乳白蛋白LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導α-乳白蛋白LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括α-乳白蛋白LCR且視情況包括在人類基因體中通常與α-乳白蛋白LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之α-乳白蛋白LCR。在各種實施例中，與α-乳白蛋白LCR可操作地連接之基因為α-乳白蛋白(12:48,567,683-48,571,882)。在各種實施例中，α-乳白蛋白啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，α-乳白蛋白啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在α-乳白蛋白上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與α-乳白蛋白LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體12 - NC_000012.12 (48570020)處α-乳白蛋白之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，α-乳白蛋白LCR，諸如長α-乳白蛋白LCR引起乳腺中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之α-乳白蛋白啟動子可操作地連接。
CYP19/芳香酶LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整CYP19/芳香酶LCR序列及/或包括其表現調控片段之CYP19/芳香酶LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。CYP19/芳香酶LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導CYP19/芳香酶LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括CYP19/芳香酶LCR且視情況包括在人類基因體中通常與CYP19/芳香酶LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之CYP19/芳香酶LCR。在各種實施例中，與CYP19/芳香酶LCR可操作地連接之基因為CYP19A1 (15:51,208,056-51,338,595)。在各種實施例中，CYP19A1啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，CYP19A1啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在CYP19A1上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與CYP19/芳香酶LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體15 - NC_000015.10 (51242912)處CYP19A1之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，CYP19/芳香酶LCR，諸如長CYP19/芳香酶LCR引起各種多種組織中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之CYP19A1啟動子可操作地連接。
C-fes原癌基因LCR為增強可操作地連接之編碼序列表現的一種示例性LCR。當與包括完整C-fes原癌基因LCR序列及/或包括其表現調控片段之C-fes原癌基因LCR可操作地連接時，編碼序列之表現可得到增強。C-fes原癌基因LCR包括熟習此項技術者瞭解的介導C-fes原癌基因LCR之表現增強效應中之至少一些的DNA水解酶超敏感位點(HS)。
在各種實施例中，Ad35載體可例如在包括C-fes原癌基因LCR且視情況包括在人類基因體中通常與C-fes原癌基因LCR可操作地連接之基因之啟動子的負載中包括如本文所提供之C-fes原癌基因LCR。在各種實施例中，與C-fes原癌基因LCR可操作地連接之基因為FES (15:90,884,420-90,895,775)。在各種實施例中，FES啟動子之總長度可等於或大於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb。在各種實施例中，FES啟動子包括至少100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、1.0 kb、1.5 kb、2.0 kb、2.5 kb、3.0 kb、4.0 kb或5.0 kb，與例如在參考基因體中在FES上游，例如緊靠其第一編碼核苷酸上游的對應核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，在人類基因體中通常與C-fes原癌基因LCR可操作地連接之基因之編碼序列的第一編碼核苷酸為染色體15 - NC_000015.10 (90885046)處FES之第一編碼核苷酸。
在各種實施例中，C-fes原癌基因LCR，諸如長C-fes原癌基因LCR引起包括巨噬細胞及嗜中性球之骨髓細胞中可操作地連接之編碼序列之表現。在各種實施例中，可操作地連接之編碼序列亦與如本文所闡述或此項技術中另外已知之FES啟動子可操作地連接。
(IV) 與長 LCR 可操作地連接之編碼序列
(IV-b) 蛋白質療法 ， 例如蛋白質 / 酶替代療法
在特定實施例中，與長LCR可操作地連接之編碼序列包括編碼治療性蛋白質之轉殖基因。編碼序列係指編碼如本文所述之一或多種治療性蛋白質的核酸序列(可與聚核苷酸或核苷酸序列互換使用)。此定義包括各種序列多形現象、突變及/或序列變異體，其中此類改變不會實質上影響編碼之一或多種治療性蛋白質之功能。編碼序列或「基因」不僅可包括編碼序列，且亦包括調控區，諸如啟動子、強化子及終止區。該術語進一步可包括所有內含子及自mRNA轉錄物剪接之其他DNA序列以及由替代性剪接位點產生之變異體。編碼分子之基因序列可為引導一或多種治療性蛋白質表現之DNA或RNA。此等核酸序列可為轉錄成RNA之DNA股序列或轉譯成蛋白質之RNA序列。核酸序列包括全長核酸序列以及來源於全長蛋白質之非全長序列。序列亦可包括可引入以在特定細胞類型中提供密碼子偏好的天然序列之簡併密碼子。
編碼一或多種治療性蛋白質之基因序列可容易地藉由合成或重組方法由相關胺基酸序列製備。在特定實施例中，編碼此等序列中之任一者的基因序列亦可在編碼序列之5'及/或3'末端具有一或多個限制酶位點，以便容易切除編碼序列之基因序列及用編碼不同序列之另一基因序列進行置換。在特定實施例中，編碼序列之基因序列可經密碼子優化以在哺乳動物細胞中表現。治療性蛋白質之編碼序列在本文中稱為治療性基因。
治療性基因可經選擇以提供針對在特定實施例中係遺傳性之病狀的治療有效反應。在特定實施例中，病狀可為格雷氏病(Grave's Disease)、類風濕性關節炎、惡性貧血、多發性硬化症(MS)、發炎性腸病、全身性紅斑狼瘡(SLE)、腺苷去胺酶缺乏症(ADA-SCID)或嚴重複合型免疫缺乏疾病(SCID)、維斯科特-奧爾德里奇症候群(Wiskott-Aldrich syndrome，WAS)、慢性肉芽腫病(CGD)、范康尼氏貧血(FA)、巴騰病(Battens disease)、腎上腺腦白質營養不良(ALD)或異染性腦白質營養不良(MLD)、肌肉萎縮症、肺泡性蛋白沈積症(PAP)、丙酮酸激酶缺乏症、施-戴-布三氏貧血(Schwachman-Diamond-Blackfan anemia)、先天性角化不良、囊腫性纖維化、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)或肌肉萎縮性側索硬化(盧·賈里格氏病(Lou Gehrig's disease))。在特定實施例中，視病狀而定，治療性基因可為編碼功能已中斷之蛋白質的基因及/或功能已中斷之基因。
示例性治療性基因及基因產物包括：針對CD4、CD5、CD7、CD52等之抗體；抗體；針對IL1、IL2、IL6之抗體；針對在自體反應性T細胞上特異性存在之TCR的抗體；IL4；IL10；IL12；IL13；IL1Ra；sIL1RI；sIL1RII；針對TNF之抗體；ABCA3；ABCD1；ADA；AK2；APP；精胺酸酶；芳基硫酸酯酶A；A1AT；CD3D；CD3E；CD3G；CD3Z；CFTR；CHD7；嵌合抗原受體(CAR)；CIITA；CLN3；補體因子CORO1A；CTLA；C1抑制劑；C9ORF72；DCLRE1B；DCLRE1C；誘餌受體；DKC1；DRB1*1501/DQB1*0602；肌縮蛋白；酶；第八因子、FANC家族基因(FancA、FancB、FancC、FancD1 (BRCA2)、FancD2、FancE、FancF、FancG、FancI、FancJ (BRIP1)、FancL、FancM、FancN (PALB2)、FancO (RAD51C)、FancP (SLX4)、FancQ (ERCC4)、FancR (RAD51)、FancS (BRCA1)、FancT (UBE2T)、FancU (XRCC2)、FancV (MAD2L2)及FancW (RFWD3))；Fas L；FUS；GATA1；球蛋白家族基因(亦即γ-球蛋白)；F8；麩醯胺酸酶；HBA1；HBA2；HBB；IL7RA；JAK3；LCK；LIG4；LRRK2；NHEJ1；NLX2.1；中和抗體；ORAI1；PARK2；PARK7；phox；PINK1；PNP；PRKDC；PSEN1；PSEN2；PTPN22；PTPRC；P53；丙酮酸激酶；RAG1；RAG2；RFXANK；RFXAP；RFX5；RMRP；核糖體蛋白；SFTPB；SFTPC；SOD1；可溶性CD40；STIM1；sTNFRI；sTNFRII；SLC46A1；SNCA；TDP43；TERT；TERC；TINF2；泛素2；WAS；WHN；ZAP70；γC；及本文所述之其他治療性基因。
治療有效量可對免疫及其他血細胞及/或小神經膠質細胞提供功能，或視所治療之病狀而定，可抑制淋巴球活化，誘導淋巴球凋亡，消除淋巴球之多個子集，抑制T細胞活化，消除或抑制自體反應性T細胞，抑制Th-2或Th-1淋巴球活性，拮抗IL-1或TNF，減少發炎，誘導對刺激劑之選擇性耐受性，減少或消除免疫介導之病狀；及/或減少或消除免疫介導之病狀之症狀。治療有效量亦可提供功能性DNA修復機制；表面蛋白質表現；端粒維持；溶酶體功能；脂質或諸如澱粉樣蛋白之其他蛋白質的分解；允許核糖體功能；及/或允許否則將不發育之成熟血球譜系(諸如巨噬細胞、其他白血球類型)之發育。
作為另一實例，可選擇提供針對與紅血球及凝血相關之疾病之治療有效反應的治療性基因。在特定實施例中，疾病為血紅素病，如地中海貧血症或鐮狀細胞疾病/特性。治療性基因可為例如誘導或增加血紅素產生之基因；誘導或增加β-球蛋白、γ-球蛋白或α-球蛋白產生之基因；或增加體內細胞對氧之利用性的基因。治療性基因可為例如HBB或CYB5R3。示例性有效治療可例如增加血球計數、改善血球功能或增加患者細胞氧合。在另一特定實施例中，疾病為血友病。治療性基因可為例如增加凝固/凝血第八因子或凝固/凝血因子IX產生、引起凝血第八因子或凝血因子IX之正常型式產生的基因、減少針對凝固/凝血第八因子或凝固/凝血因子IX之抗體產生的基因或引起血凝塊適當形成之基因。示例性治療性基因包括F8及F9。例示性有效治療可例如增加或誘發產生凝固/凝血第八因子及IX產生，改善凝固/凝血第八因子及IX之作用，或減少個體中之凝血時間。
以下參考文獻描述功能性球蛋白基因之特定示例性序列。參考文獻1-4與α型球蛋白序列相關且參考文獻4-12與β型球蛋白序列(包括β及γ球蛋白序列)相關：(1) GenBank寄存編號Z84721 (1997年3月19日)；(2) GenBank寄存編號NM_000517 (2000年10月31日)；(3) Hardison等人,J. Mol. Biol. 222(2):233-249, 1991；(4) A Syllabus of Human Hemoglobin Variants (1996), Titus等人, The Sickle Cell Anemia Foundation出版, Augusta, GA (線上在globin.cse.psu.edu可得)；(5) GenBank寄存編號J00179 (1993年8月26日)；(6) Tagle等人,Genomics 13(3):741-760, 1992；(7) Grovsfeld等人,Cell 51(6):975-985, 1987；(8) Li等人,Blood 93(7):2208-2216, 1999；(9) Gorman等人,J. Biol. Chem .275(46):35914-35919, 2000；(10) Slightom等人,Cell 21(3):627-638, 1980；(11) Fritsch等人,Cell 19(4): 959-972, 1980；(12) Marotta等人,J. Biol. Chem . 252(14):5040-5053, 1977。關於編碼球蛋白之基因的額外編碼及非編碼區域，參見例如Marotta等人,Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol . 19, 165-175, 1976, Lawn等人,Cell 21 (3), 647-651, 1980, 及Sadelain等人,PNAS . 92:6728-6732, 1995。
血紅素次單元β之一種示例性胺基酸序列提供於例如NCBI寄存編號P68871。β-球蛋白之一種示例性胺基酸序列提供於例如NCBI寄存編號NP_000509。
作為另一實例，可選擇提供針對溶酶體貯積病之治療有效反應的治療性基因。在特定實施例中，溶酶體貯積病為I型黏多糖病(MPS)；MPS II或亨特症候群(Hunter Syndrome)；MPS III或聖菲利波症候群(Sanfilippo syndrome)；MPS IV或莫奎症候群(Morquio syndrome)；MPS V；MPS VI或馬普蘭-拉米症候群(Maroteaux-Lamy syndrome)；MPS VII或斯利症候群(sly syndrome)；α-甘露糖苷貯積病；β-甘露糖苷貯積病；I型肝糖貯積病，亦稱為GSDI、方基蓋氏病(von Gierke disease)或泰-薩克斯病(Tay Sachs)；龐貝症(Pompe disease)；高歇氏病(Gaucher disease)；法布立病(Fabry disease)。治療性基因可為例如編碼或誘導酶產生，或以其他方式引起黏多醣在溶酶體中降解之基因。示例性治療性基因包括IDUA或艾杜糖苷、IDS、GNS、HGSNAT、SGSH、NAGLU、GUSB、GALNS、GLB1、ARSB及HYAL1。溶酶體貯積病之示例性有效基因療法可例如編碼或誘導負責降解溶酶體中多種物質之酶的產生；減少、消除、預防或延遲多種器官，包括頭部(例如頭小畸形症)、肝臟、脾、舌或聲帶中的腫脹；減少腦中之流體；減少心瓣異常；預防或擴張呼吸道變窄及預防相關上呼吸道病狀，如感染及睡眠呼吸中止症；減少、消除、預防或延遲神經元破壞及/或相關症狀。
作為另一實例，可選擇提供針對過度增生性疾病之治療有效反應的治療性基因。在特定實施例中，過度增生性疾病為癌症。治療性基因可為例如腫瘤抑制基因、誘導細胞凋亡之基因、編碼酶之基因、編碼抗體之基因或編碼激素之基因。示例性治療性基因及基因產物包括(除本文中其他地方所列出之彼等治療性基因及基因產物外) 101F6、123F2 (RASSF1)、53BP2、abl、ABLI、ADP、aFGF、APC、ApoAI、ApoAIV、ApoE、ATM、BAI-1、BDNF、Beta*(BLU)、bFGF、BLC1、BLC6、BRCA1、BRCA2、CBFA1、CBL、C-CAM、CNTF、COX-1、CSFIR、CTS-1、胞嘧啶去胺酶、DBCCR-1、DCC、Dp、DPC-4、E1A、E2F、EBRB2、erb、ERBA、ERBB、ETS1、ETS2、ETV6、Fab、FCC、FGF、FGR、FHIT、fms、FOX、FUS1、FYN、G-CSF、GDAIF、基因21 (NPRL2)、基因26 (CACNA2D2)、GM-CSF、GMF、gsp、HCR、HIC-1、HRAS、hst、IGF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、ING1、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、IRF-1、JUN、KRAS、LUCA-1 (HYAL1)、LUCA-2 (HYAL2)、LYN、MADH4、MADR2、MCC、mda7、MDM2、MEN-I、MEN-II、MLL、MMAC1、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、neu、NF-1、NF-2、NGF、NOEY1、NOEY2、NRAS、NT3、NT5、OVCA1、p16、p21、p27、p57、p73、p300、PGS、PIM1、PL6、PML、PTEN、raf、Rap1A、ras、Rb、RB1、RET、rks-3、ScFv、scFV ras、SEM A3、SRC、TALI、TCL3、TFPI、血小板反應蛋白、胸苷激酶、TNF、TP53、trk、T-VEC、VEGF、VHL、WT1、WT-1、YES及zac1。示例性有效基因療法可抑制或消除腫瘤，導致癌細胞數目減少，腫瘤尺寸減小，減緩或消除腫瘤生長，或緩解由腫瘤引起之症狀。
作為另一實例，可選擇提供針對感染性疾病之治療有效反應的治療性基因。在特定實施例中，感染性疾病為人類免疫缺乏病毒(HIV)。治療性基因可為例如使免疫細胞對HIV感染具抗性或使免疫細胞能夠經由免疫重建有效中和病毒之基因；編碼由免疫細胞表現之蛋白質的基因之多形現象；有利於對抗在患者中未表現之感染的基因；編碼感染物、受體或共受體之基因；編碼受體或共受體之配位體的基因；病毒複製必需之病毒及細胞基因，包括；編碼核糖核酸酶、反義RNA、小干擾RNA (siRNA)或誘餌RNA以阻斷某些轉錄因子之作用的基因；編碼顯性陰性病毒蛋白、細胞內抗體、細胞內趨化因子之基因及自殺基因。示例性治療性基因及基因產物包括α2β1；αvβ3；αvβ5；αvβ63；BOB/GPR15；Bonzo/STRL-33/TYMSTR；CCR2；CCR3；CCR5；CCR8；CD4；CD46；CD55；CXCR4；胺基肽酶-N；HHV-7；ICAM；ICAM-1；PRR2/HveB；HveA；α-肌營養不良蛋白聚糖；LDLR/α2MR/LRP；PVR；PRR1/HveC；及層黏連蛋白受體。用於治療HIV之治療有效量例如可增加個體對HIV之免疫性，改善與AIDS或HIV相關之症狀，或誘導個體中針對HIV之先天性或適應性免疫反應。針對HIV之免疫反應可包括產生抗體且預防AIDS及/或改善受試者之AIDS或HIV感染之症狀，或降低或消除HIV感染性及/或毒性。
(IV-c) 抗體、 CAR 及 TCR
除治療性基因及/或基因產物之外，編碼序列亦可編碼治療性分子，諸如抗體、對一或多種癌症抗原具有特異性之嵌合抗原受體分子及/或對一或多種癌症抗原具有特異性之T細胞受體。
已在免疫系統之基因工程改造T細胞中取得顯著進展以靶向且殺死不合需要之細胞類型，諸如癌細胞。許多此等T細胞已經基因工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)構築體。CAR為包括允許經基因修飾之T細胞識別及殺死癌細胞之若干不同子組分的蛋白質。子組分包括至少一種細胞外組分及細胞內組分。
細胞外組分包括特異性結合在不合需要之細胞之表面上優先存在的標記物之結合域。當結合域結合此類標記物時，細胞內組分引導T細胞破壞所結合之癌細胞。結合域通常為來源於單株抗體(mAb)之單鏈可變片段(scFv)，但其可基於包括抗體樣抗原結合位點之其他格式。
細胞內組分基於包括效應子域而提供活化信號。第一代CAR利用CD3ζ之細胞質區作為效應子域。第二代CAR利用CD3ζ與分化簇28 (CD28)或4-1BB (CD137)組合，而第三代CAR在細胞內效應子域內利用CD3ζ與CD28及4-1BB組合。
CAR一般亦包括一或多個用於在分子內達成多種目的之連接子序列。舉例而言，跨膜域可用於將CAR之細胞外組分連接至細胞內組分。可撓性連接子序列通常稱為間隔子區，其在結合域之膜近端，可用於在結合域與細胞膜之間建立額外距離。此可有益於基於與膜之接近度而降低結合之位阻。視目標細胞標記物而定，可使用更緊密之間隔子或更長間隔子。其他潛在CAR子組分更詳細地描述於本文其他地方。CAR之組分現另外詳細地描述如下：結合域；細胞內信號傳導組分；連接子；跨膜域；接合胺基酸；及包括標籤卡匣之控制特徵。關於結合域之描述亦與作為治療性分子之抗體相關。
結合域 . 結合域包括結合於細胞標記物以形成複合物之任何物質。結合域之選擇可視界定目標細胞之表面的細胞標記物類型及數目而定。結合域之實例包括細胞標記物配位體、受體配位體、抗體、肽、肽適體、受體(例如T細胞受體)、嵌合抗原受體(CAR)或其組合及經工程改造之片段或格式。
抗體為結合域之一個實例且包括完整抗體或抗體之結合片段，例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2 及單鏈(sc)形式及特異性結合於細胞標記物之其片段。抗體或抗原結合片段可包括多株抗體、單株抗體、人類抗體、人類化抗體、合成抗體、非人類抗體、重組抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、微型抗體及線性抗體之全部或一部分。
抗體由兩種基因(重鏈基因及輕鏈基因)產生。一般而言，抗體包括重鏈之兩個相同複本及輕鏈之兩個相同複本。在可變重鏈及可變輕鏈內，稱為互補決定區(CDR)之區段指示抗原決定基結合。各重鏈具有三個CDR (亦即，CDRH1、CDRH2及CDRH3)且各輕鏈具有三個CDR (亦即，CDRL1、CDRL2及CDRL3)。CDR區由構架殘基(FR)側接。
在一些情況下，結合域宜來源於將最終使用其之相同物種。舉例而言，對於用於人類而已，抗原結合域宜包括人類抗體、人類化抗體或其片段或經工程改造之形式。來自人類來源之抗體或人類化抗體在人類中具有降低之免疫原性或無免疫原性且與非人類抗體相比具有較低數目之非免疫原性抗原決定基。抗體及其經工程改造之片段一般經選擇在人類個體中具有降低程度之抗原性或無抗原性。
在特定實施例中，結合域包括人類化抗體或其經工程改造之片段。在特定實施例中，非人類抗體經人類化，其中抗體之一或多個胺基酸殘基經修飾以增加與人類中天然產生之抗體或其片段的相似性。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其通常取自「輸入」可變域。如本文所提供，人類化抗體或抗體片段包括來自非人類免疫球蛋白分子之一或多個CDR，及其中構成構架之胺基酸殘基完全或大部分來源於人類生殖系的構架區。在一個態樣中，抗原結合域經人類化。人類化抗體可使用此項技術中已知之多種技術產生，此等技術包括CDR移植(參見例如歐洲專利第EP 239,400號；WO 91/09967；以及US 5,225,539、US 5,530,101及US 5,585,089)、面飾(veneering)或表面再修飾(resurfacing)(參見例如EP 592,106及EP 519,596；Padlan,Molecular Immunology , 28(4/5):489-498, 1991；Studnicka等人,Protein Engineering , 7(6):805-81, 19944；及Roguska等人,PNAS , 91:969-973, 1994)、鏈改組(參見例如美國專利第5,565,332號)及以下中所揭示之技術：例如美國公開案第2005/0042664號、美國公開案第2005/0048617號、美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、WO 9317105；Tan等人, J. Immunol ., 169:1119-25, 2002；Caldas等人,Protein Eng ., 13(5):353-60, 2000；Morea等人,Methods , 20(3):267-79, 2000；Baca等人,J. Biol. Chem ., 272(16): 10678-84, 1997；Roguska等人,Protein Eng ., 9(10):895-904, 1996；Couto等人,Cancer Res ., 55 (23 Supp):5973s-5977s, 1995；Couto等人,Cancer Res., 55(8):1717-22, 1995；Sandhu,Gene , 150(2):409-10, 1994；及Pedersen等人,J. Mol. Biol., 235(3):959-73, 1994。通常，構架區中之構架殘基將經來自CDR供體抗體之對應殘基取代以改變，例如提高細胞標記物結合。此等構架取代藉由此項技術中熟知之方法鑑別，例如藉由將CDR與構架殘基之相互作用模型化以鑑別對細胞標記物結合而言重要之構架殘基，且進行序列比較以鑑別特定位置上不尋常之構架殘基。(參見例如美國專利第5,585,089號；及Riechmann等人,Nature , 332:323, 1988)。
具有特異性結合細胞標記物之結合域的抗體可使用以下方法製備：獲得單株抗體之方法、噬菌體呈現方法、產生人類或人類化抗體之方法或使用經工程改造以產生如一般技術者已知之抗體的轉殖基因動物或植物的方法(參見例如US 6,291,161及US 6,291,158)。可利用部分或完整合成抗體之噬菌體呈現庫且可針對可結合於細胞標記物之抗體或其片段進行篩選。舉例而言，結合域可藉由針對特異性結合細胞標記物之Fab片段篩選Fab噬菌體庫來鑑別(參見Hoet等人,Nat. Biotechnol . 23:344, 2005)。亦可利用人類抗體之噬菌體呈現庫。另外，在適宜系統(例如小鼠、HuMAb mouse® (GenPharm Int'l. Inc., Mountain View, CA)、TC mouse® (Kirin Pharma Co. Ltd., Tokyo, JP)、KM-mouse® (Medarex, Inc., Princeton, NJ)、駱馬、雞、大鼠、倉鼠、兔等)中使用細胞標記物作為免疫原發展融合瘤之傳統策略可用於發展結合域。一旦鑑別，即可分離及/或測定抗體之胺基酸序列及編碼該抗體之基因序列。
在一些情況下，scFv可根據此項技術中已知之方法製備(參見例如Bird等人,Science 242:423-426 1988；及Huston等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988)。可藉由例如使用可撓性多肽連接子將抗體之VH及VL區連接在一起產生ScFv分子。若採用短多肽連接子(例如5-10個胺基酸)，則防止鏈內摺疊。亦需要鏈間摺疊使兩個可變區連在一起以形成功能性抗原決定基結合位點。關於連接子取向及尺寸之實例，參見例如Hollinger等人,Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 1993；美國公開案第2005/0100543號、美國公開案第2005/0175606號、美國公開案第2007/0014794號以及WO2006/020258及WO2007/024715。更具體而言，用於連接scFv之VL及VH的連接子序列之長度一般為五至35個胺基酸。在特定實施例中，VL-VH連接子包括五至35個、十至30個胺基酸或15至25個胺基酸。連接子長度之變化可保持或增強活性，從而在活性研究中產生優良功效。scFv通常用作CAR之結合域。
基於抗體之結合域格式之額外實例包括基於scFv之奪取抗體(grababody)及可溶性VH域抗體。此等抗體僅使用重鏈可變區形成結合區。參見例如Jespers等人,Nat. Biotechnol . 22:1161, 2004；Cortez-Retamozo等人,Cancer Res . 64:2853, 2004；Baral等人,Nature Med . 12:580, 2006；及Barthelemy等人,J. Biol. Chem . 283:3639, 2008。
在特定實施例中，本發明之結合域中之VL區來源於或基於已知單株抗體之VL且與已知單株抗體之VL相比，含有一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)插入、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)缺失、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸取代(例如保守胺基酸取代)或上述變化之組合。插入、缺失或取代可在VL區中之任何地方，包括在此區域之胺基端或羧基端或兩端，其限制條件為各CDR包括零變化或至多一個、兩個或三個變化且其限制條件為含有經修飾VL區之結合域仍可以類似於野生型結合域之親和力特異性結合其目標。
在特定實施例中，本發明之結合域VH區可來源於或基於已知單株抗體之VH且與已知單株抗體之VH相比，含有一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)插入、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)缺失、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸取代(例如保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代)或上述變化之組合。插入、缺失或取代可在VH區中之任何地方，包括在此區域之胺基端或羧基端或兩端，其限制條件為各CDR包括零變化或至多一個、兩個或三個變化且其限制條件為含有經修飾VH區之結合域仍可以類似於野生型結合域之親和力特異性結合其目標。
在特定實施例中，結合域包括或為與輕鏈可變區(VL)或重鏈可變區(VH)或兩者之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致的序列，其中各CDR相對於特異性結合於所關注之細胞標記物之單株抗體或其片段或衍生物包括零變化或最多一個、兩個或三個變化。
結合域之一替代來源包括編碼隨機肽庫之序列，或編碼替代非抗體骨架之環區域中之多種經工程改造之胺基酸的序列，諸如單鏈(sc) T細胞受體(scTCR)(參見Lake等人,Int. Immunol . 11:745, 1999；Maynard等人,J. Immunol. Methods 306:51, 2005；US 8,361,794)、血纖維蛋白原域(參見例如Weisel等人,Science 230:1388, 1985)、孔尼茲域(Kunitz domain)(參見例如US 6,423,498)、經設計之錨蛋白重複蛋白(DARPins；Binz等人,J. Mol. Biol . 332:489, 2003及Binz等人,Nat. Biotechnol . 22:575, 2004)、纖維結合蛋白結合域(纖連蛋白或單功能抗體；Richards等人,J. Mol. Biol. 326:1475, 2003；Parker等人,Protein Eng. Des. Selec . 18:435, 2005及Hackel等人,J. Mol. Biol . 381:1238-1252, 2008)、半胱胺酸結微蛋白(Vita等人,Proc. Nat ' l. Acad. Sci. (USA) 92:6404-6408, 1995；Martin等人,Nat. Biotechnol. 21:71, 2002及Huang等人,Structure 13:755, 2005)、三十四肽重複域(Main等人,Structure 11:497, 2003及Cortajarena等人,ACS Chem. Biol. 3:161, 2008)、富含白胺酸之重複域(Stumpp等人,J. Mol. Biol . 332:471, 2003)、脂質運載蛋白域(參見例如WO 2006/095164；Beste等人,Proc. Nat ' l. Acad. Sci. (USA) 96:1898, 1999及Schönfeld等人,Proc. Nat ' l. Acad. Sci. (USA) 106:8198, 2009)、V樣域(參見例如US 2007/0065431)、C型凝集素域(Zelensky及Gready,FEBS J . 272:6179, 2005；Beavil等人,Proc. Nat ' l. Acad. Sci. (USA) 89:753, 1992及Sato等人,Proc. Nat ' l. Acad. Sci. (USA) 100:7779, 2003)、mAb2或具有抗原結合域之Fc區(Fcab™ (F-Star Biotechnology, Cambridge UK；參見例如WO 2007/098934及WO 2006/072620)、犰狳重複蛋白(參見例如Madhurantakam等人,Protein Sci. 21: 1015, 2012；WO 2009/040338)、阿菲林(affilin)(Ebersbach等人,J. Mol. Biol. 372: 172, 2007)、親和抗體、高親和性多聚體、打結素、非諾莫(fynomer)、阿曲聚體(atrimer)、細胞毒性T淋巴球相關蛋白-4(Weidle等人,Cancer Gen. Proteo. 10:155, 2013)或其類似物(Nord等人,Protein Eng . 8:601, 1995；Nord等人,Nat. Biotechnol . 15:772, 1997；Nord等人,Euro. J. Biochem . 268:4269, 2001；Binz等人,Nat. Biotechnol . 23:1257, 2005；Boersma & Plückthun,Curr. Opin. Biotechnol. 22:849, 2011)。
肽適體包括在兩端附接至蛋白質骨架之肽環(其對細胞標記物具有特異性)。此雙重結構限制使肽適體之結合親和力增加至與抗體相當之水準。可變環長度通常為8至20個胺基酸且骨架可為穩定、可溶、小且無毒之任何蛋白質。可使用不同系統，諸如酵母雙雜交系統(例如Gal4酵母雙雜交系統)或LexA相互作用陷阱系統來進行肽適體選擇。
在特定實施例中，結合域為包括Vα/β及Cα/β鏈(例如Vα-Cα、Vβ-Cβ、Vα-Vβ)或包括對細胞標記物肽-MHC複合物具有特異性之Vα-Cα、Vβ-Cβ、Vα-Vβ的sc T細胞受體(scTCR)。
在特定實施例中，經工程改造之結合域包括來源於或基於Vα、Vβ、Cα或Cβ之Vα、Vβ、Cα或Cβ區且與所提及之Vα、Vβ、Cα或Cβ相比，包括一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)插入、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)缺失、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸取代(例如保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代)或上述變化之組合。插入、缺失或取代可在VL 、VH 、Vα、Vβ、Cα或Cβ區中之任何地方，包括在此等區域之胺基端或羧基端或兩端，其限制條件為各CDR包括零變化或至多一個、兩個或三個變化且其限制條件為含有經修飾Vα、Vβ、Cα或Cβ區之目標結合域仍可以類似於野生型之親和力及作用特異性結合其目標。
在特定實施例中，經工程改造之結合域包括與已知或經鑑別之結合域之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致的序列，其中各CDR相對於特異性結合於靶向之細胞標記物之已知或經鑑別之結合域或其片段或衍生物包括零變化或最多一個、兩個或三個變化。
所給定CDR或FR之確切胺基酸序列邊界可容易使用多種熟知方案中之任一者確定，包括以下文獻中所述之方案：Kabat等人 (1991) 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (Kabat編號方案)；Al-Lazikani等人, J Mol Biol 273: 927-948, 1997 (Chothia編號方案)；Maccallum等人,J Mol Biol 262: 732-745, 1996 (接觸編號方案)；Martin等人,Proc. Natl. Acad. Sci ., 86: 9268-9272, 1989 (AbM編號方案)；Lefranc等人,Dev Comp Immunol 27(1): 55-77, 2003 (IMGT編號方案)；以及Honegger及Pluckthun,J Mol Biol 309(3): 657-670, 2001 (「Aho」編號方案)。給定CDR或FR之邊界可視鑑別所用之方案而變化。舉例而言，Kabat方案係基於結構比對，而Chothia方案係基於結構資訊。Kabat與Chothia兩者方案之編號均基於最常見抗體區序列長度，其中在一些抗體中出現由插入字母(例如「30a」)表示之插入及缺失。兩種方案將某些插入及刪除(「插入刪除」)置於不同位置，產生不同編號。接觸方案係基於對複雜晶體結構之分析，且在多個方面與Chothia編號方案類似。在特定實施例中，本文揭示之抗體CDR序列係根據Kabat編號。
CAR為經設計以結合於某些目標且引發反應之經工程改造之受體。CAR包括若干不同子組分，當在細胞上表現時，其允許經基因修飾之細胞識別及殺死不合需要之細胞，諸如癌細胞或病毒感染之細胞。子組分包括至少一種細胞外組分及細胞內組分。細胞外組分包括特異性結合在不合需要之細胞之表面上優先存在的標記物之結合域。當結合域結合此類標記物時，細胞內組分活化經基因修飾之細胞破壞所結合之細胞。CAR另外包括使細胞外組分連接至細胞內組分之跨膜域及可增加CAR功能之其他子組分。舉例而言，包括一或多個連接子序列(諸如間隔子區域)可允許CAR具有額外構形可撓性，通常增加結合域結合目標細胞標記物之能力。
CAR之細胞外域包括結合域。結合域如先前所論述且可包括抗體、scFv、配位體、肽、肽適體或受體。
在特定實施例中，經工程改造之CAR包括與已知或經鑑別之TCR Vα、Vβ、Cα或Cβ之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致的序列，其中各CDR相對於特異性結合於靶向之細胞標記物之TCR或其片段或衍生物包括零變化或最多一個、兩個或三個變化。
在特定實施例中，經工程改造之CAR包括來源於或基於已知或經鑑別之TCR (例如高親和力TCR)之Vα、Vβ、Cα或Cβ的Vα、Vβ、Cα或Cβ區且與已知或經鑑別之TCR之Vα、Vβ、Cα或Cβ相比，包括一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)插入、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)缺失、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸取代(例如保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代)或上述變化之組合。插入、缺失或取代可在Vα、Vβ、Cα或Cβ區中之任何地方，包括在此等區域之胺基端或羧基端或兩端，其限制條件為各CDR包括零變化或至多一個、兩個或三個變化且其限制條件為含有經修飾Vα、Vβ、Cα或Cβ區之目標結合域仍可以類似於野生型之親和力及作用特異性結合其目標。
在特定實施例中，CAR之結合域包括或為與輕鏈可變區(VL)或重鏈可變區(VH)或兩者之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致的序列，其中各CDR相對於特異性結合於所關注之細胞標記物之單株抗體或其片段或衍生物包括零變化或最多一個、兩個或三個變化。
在特定實施例中，本發明之CAR中之VL區來源於或基於已知單株抗體之VL且與已知單株抗體之VL相比，含有一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)插入、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)缺失、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸取代(例如保守胺基酸取代)或上述變化之組合。插入、缺失或取代可在VL區中之任何地方，包括在此區域之胺基端或羧基端或兩端，其限制條件為各CDR包括零變化或至多一個、兩個或三個變化且其限制條件為含有經修飾VL區之結合域仍可以類似於野生型結合域之親和力特異性結合其目標。
在特定實施例中，本發明之CAR中之結合域VH區可來源於或基於已知單株抗體之VH且與已知單株抗體之VH相比，含有一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)插入、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)缺失、一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸取代(例如保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代)或上述變化之組合。插入、缺失或取代可在VH區中之任何地方，包括在此區域之胺基端或羧基端或兩端，其限制條件為各CDR包括零變化或至多一個、兩個或三個變化且其限制條件為含有經修飾VH區之結合域仍可以類似於野生型結合域之親和力特異性結合其目標。
與前列腺癌相關之特定細胞標記物包括PSMA、WT1、ProstateStem細胞抗原(PSCA)及SV40 T。與乳癌相關之特定細胞標記物包括HER2及ERBB2。與卵巢癌相關之特定細胞標記物包括L1-CAM、MUC16之細胞外域(MUC-CD)、葉酸結合蛋白(葉酸受體)、Lewis Y、間皮素及WT-1。與胰臟癌相關之特定細胞標記物包括間皮素、CEA及CD24。與多發性骨髓瘤相關之特定細胞標記物包括BCMA、GPRC5D、CD38及CS1。與白血病及/或淋巴瘤相關之特定標記物包括CLL-1、CD123、CD33及PD-L1。
在特定實施例中，CAR之結合域結合細胞標記物Her2。在特定實施例中，結合HER2之結合域來源於曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin)。在特定實施例中，結合域包括可變輕鏈，其包含包括SEQ ID NO: 8之CDRL1序列、包括SEQ ID NO: 9之CDRL2序列及包括SEQ ID NO: 10之CDRL3序列；及可變重鏈，其包含包括SEQ ID NO: 11之CDRH1序列、包括SEQ ID NO: 12之CDRH2序列及包括SEQ ID NO: 13之CDRH3序列。
在特定實施例中，CAR之結合域結合細胞標記物PD-L1。在特定實施例中，結合PD-L1之結合域來源於派姆單抗(pembrolizumab)或FAZ053 (Novartis)中之至少一者。在特定實施例中，結合域包括可變輕鏈，其包含包括SEQ ID NO: 14之CDRL1序列、包括SEQ ID NO: 15之CDRL2序列及包括SEQ ID NO: 16之CDRL3序列；及可變重鏈，其包含包括SEQ ID NO: 17之CDRH1序列、包括SEQ ID NO: 18之CDRH2序列及包括SEQ ID NO: 19之CDRH3序列。
PD-L1之一種示例性結合域可包括或來源於阿維魯單抗(Avelumab)或阿特珠單抗(Atezolizumab)。在特定實施例中，阿維魯單抗之可變重鏈包括SEQ ID NO: 20。
在特定實施例中，阿維魯單抗之可變輕鏈包括SEQ ID NO: 21。
在特定實施例中，阿維魯單抗之CDR區包括：CDRH1 (SEQ ID NO: 22)；CDRH2 (SEQ ID NO: 23)；CDRH3 (SEQ ID NO: 24)；CDRL1 (SEQ ID NO: 25)；CDRL2 (SEQ ID NO: 26)；及CDRL3 (SEQ ID NO: 27)。
在特定實施例中，阿特珠單抗之可變重鏈包括SEQ ID NO: 28。在特定實施例中，阿特珠單抗之可變輕鏈包括SEQ ID NO: 29。
在特定實施例中，阿特珠單抗之CDR區包括：CDRH1 (SEQ ID NO: 30)；CDRH2 (SEQ ID NO: 31)；CDRH3 (SEQ ID NO: 32)；CDRL1 (SEQ ID NO: 33)；CDRL2 (SEQ ID NO: 34)；及CDRL3 (SEQ ID NO: 35)。
在特定實施例中，CAR之結合域結合細胞標記物PSMA。在特定實施例中，結合域包括可變輕鏈，其包含包括SEQ ID NO: 36之CDRL1序列、包括SEQ ID NO: 37之CDRL2序列、包括SEQ ID NO: 38之CDRL3序列。在特定實施例中，結合域包括可變重鏈，其包含包括SEQ ID NO: 39之CDRH1序列、包括SEQ ID NO: 40之CDRH2序列及包括SEQ ID NO: 41之CDRH3序列。
在特定實施例中，CAR之結合域結合細胞標記物MUC16。在特定實施例中，結合域為人類或人類化的且包括可變輕鏈，其包含包括SEQ ID NO: 42之CDRL1序列、包括GAS之CDRL2序列、包括SEQ ID NO: 43之CDRL3序列。在特定實施例中，結合域為人類或人類化的且包括可變重鏈，其包含包括SEQ ID NO: 44之CDRH1序列、包括SEQ ID NO: 45之CDRH2序列及包括SEQ ID NO: 46之CDRH3序列。
在特定實施例中，CAR之結合域結合細胞標記物FOLR。在特定實施例中，結合FOLR之結合域來源於伐吐珠單抗(farletuzumab)。在特定實施例中，結合域包括可變輕鏈，其包含包括SEQ ID NO: 47之CDRL1序列、包括SEQ ID NO: 48之CDRL2序列及包括SEQ ID NO: 49之CDRL3序列；及可變重鏈，其包含包括SEQ ID NO: 50之CDRH1序列、包括SEQ ID NO: 51之CDRH2序列及包括SEQ ID NO: 52之CDRH3序列。
間皮素之一種示例性結合域可包括或來源於阿瑪西單抗(Amatuximab)。
在特定實施例中，阿瑪西單抗之可變重鏈包括SEQ ID NO: 53。在特定實施例中，阿瑪西單抗之可變輕鏈包括SEQ ID NO: 54。
在特定實施例中，阿瑪西單抗之CDR區包括：CDRH1 (SEQ ID NO: 55)；CDRH2 (SEQ ID NO: 56)；CDRH3 (SEQ ID NO: 57)；CDRL1 (SEQ ID NO: 58)；CDRL2 (SEQ ID NO: 59)；及CDRL3 (SEQ ID NO: 60)。
亦考慮例如藉由結合於感染物抗原而對感染性疾病病原體具有特異性之結合域。此等包括例如由病毒感染細胞表現之病毒抗原或其他病毒標記物。示例性病毒包括腺病毒、沙粒狀病毒、崩芽病毒(bunyavirus)、冠狀病毒、黃病毒、漢坦病毒(hantavirus)、肝炎病毒、疱疹病毒、乳突狀瘤病毒、副黏病毒、微小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒、正黏液病毒、逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、棒狀病毒、輪狀病毒、海綿狀病毒或披衣病毒(togavirus)。在額外實施例中，病毒抗原標記物包括由CMV、感冒病毒、艾司坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒、流感病毒、A型、B型及C型肝炎病毒、單純疱疹病毒、HIV病毒、流感病毒、日本腦炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道融合性病毒、風疹病毒、天花病毒、水痘帶狀疱疹病毒或西尼羅河病毒表現之肽。
作為進一步特定實例，巨細胞病毒抗原包括包膜糖蛋白B及CMV pp65；艾司坦-巴爾抗原包括EBV EBNAI、EBV P18及EBV P23；肝炎抗原包括HBV之S、M及L蛋白質、HBV之pre-S抗原、HBCAG DELTA、HBV HBE、C型肝炎病毒RNA、HCV NS3及HCV NS4；單純疱疹病毒抗原包括即刻早期蛋白及糖蛋白D；HIV抗原包括gag、pol及env基因之基因產物，諸如HIV gp32、HIV gp41、HIV gp120、HIV gp160、HIV P17/24、HIV P24、HIV P55 GAG、HIV P66 POL、HIV TAT、HIV GP36、Nef蛋白及逆轉錄酶；流感抗原包括紅血球凝集素及神經胺糖酸苷酶；日本腦炎病毒抗原包括蛋白E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A及80%E；麻疹抗原包括麻疹病毒融合蛋白；狂犬病抗原包括狂犬病糖蛋白及狂犬病核蛋白；呼吸道融合性病毒抗原包括RSV融合蛋白及M2蛋白；輪狀病毒抗原包括VP7sc；風疹抗原包括蛋白E1及E2；且水痘帶狀疱疹病毒抗原包括gpI及gpII。額外特定示例性病毒抗原序列包括：Nef (66-97) (SEQ ID NO: 61)；Nef (116-145) (SEQ ID NO: 62)；Gag p17 (17-35) (SEQ ID NO: 63)；Gag p17-p24 (253-284) (SEQ ID NO: 64)；及Pol 325-355 (RT 158-188) (SEQ ID NO: 65)。關於病毒抗原之額外實例，參見Fundamental Virology, 第二版, 編輯Fields, B. N.及Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)。
細胞內信號傳導組分 . CAR之細胞內或者細胞質信號傳導組分負責表現CAR之細胞的活化。術語「細胞內信號傳導組分」或「細胞內組分」因此意謂包括足以轉導活化信號之細胞內域之任何部分。所表現之CAR之細胞內組分可包括效應子域。效應子域為融合蛋白或受體之細胞內部分，其在接收適當信號時可直接或間接促進細胞中之生物或生理反應。在某些實施例中，效應子域為當結合時接收信號之蛋白質或蛋白質複合物之一部分，或其直接結合於目標分子，觸發來自效應子域之信號。當效應子域含有一或多個信號傳導域或模體(諸如基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM))時，其可直接促進細胞反應。在其他實施例中，效應子域將藉由與一或多種直接促進細胞反應之其他蛋白質(諸如協同刺激域)締合而間接促進細胞反應。
效應域可在結合於由癌細胞表現之細胞標記物後提供經修飾細胞之至少一種功能之活化。經修飾之細胞之活化可包括分化、增殖及/或活化或其他效應功能中之一或多者。在特定實施例中，效應子域可包括細胞內信號傳導組分，包括T細胞受體及協同刺激域，其可包括來自共受體或協同刺激分子之細胞質序列。
效應子域可包括一個、兩個、三個或更多個受體信號傳導域、胞內信號傳導組分(例如細胞質信號傳導序列)、協同刺激域或其組合。示例性效應子域包括選自以下之信號傳導及刺激域：4-1BB (CD137)、CARD11、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD27、CD28、CD79A、CD79B、DAP10、FcRα、FcRβ (FcεR1b)、FcRγ、Fyn、HVEM (LIGHTR)、ICOS、LAG3、LAT、Lck、LRP、NKG2D、NOTCH1、pTα、PTCH2、OX40、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、TCRα、TCRβ、TRIM、Wnt、Zap70或其任何組合。在特定實施例中，示例性效應子域包括選自以下之信號傳導及協同刺激域：CD86、FcγRIIa、DAP12、CD30、CD40、PD-1、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配位體、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (觸覺)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、GADS、PAG/Cbp、NKp44、NKp30或NKp46。
以刺激方式起作用之細胞內信號傳導組分序列可包括iTAM。包括初級細胞質信號傳導序列之iTAM之實例包括來源於CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD66d、CD79a、CD79b及常見FcRγ (FCER1G)、FcγRlla、FcRβ (Fcε Rib)、DAP10及DAP12之iTAM。在特定實施例中，CD3ζ之變異體保留至少一個、兩個、三個或所有ITAM區。
在特定實施例中，效應子域包括與細胞質信號傳導蛋白締合之細胞質部分，其中細胞質信號傳導蛋白為淋巴球受體或其信號傳導域、包括複數個ITAM之蛋白質、協同刺激域或其任何組合。
細胞內信號傳導組分之額外實例包括CD3ζ鏈之細胞質序列及/或協同作用以在結合域嚙合之後起始信號轉導之共受體。
協同刺激域為活化可能為對細胞標記物結合之有效淋巴球反應所需的域。一些分子可互換為細胞內信號傳導組分或協同刺激域。協同刺激域之實例包括CD27、CD28、4-1BB (CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配位體。舉例而言，CD27協同刺激已證明可增強活體外人類CART細胞之擴增、效應功能及存活且增強活體內人類T細胞之持久性及抗癌活性(Song等人 Blood. 2012; 119(3):696-706)。此類協同刺激域分子之進一步實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDlla、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDllc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (觸覺)、NKG2D、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp及CD19a。
在特定實施例中，細胞內信號傳導組分之胺基酸序列包括CD3ζ之變異體及4-1BB細胞內信號傳導組分之一部分。
在特定實施例中，細胞內信號傳導組分包括(i) CD3ζ之信號傳導域所有或一部分，(ii)4-1BB之信號傳導域所有或一部分，或(iii)CD3ζ及4-1BB之信號傳導結構域所有或一部分。
細胞內組分亦可包括以下之蛋白質中之一或多者：Wnt信號傳導路徑(例如LRP、Ryk或ROR2)、NOTCH信號傳導路徑(例如NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3或NOTCH4)、刺蝟信號傳導路徑(例如PTCH或SMO)、受體酪胺酸激酶(RTK)(例如表皮生長因子(EGF)受體家族、纖維母細胞生長因子(FGF)受體家族、肝細胞生長因子(HGF)受體家族、胰島素受體(IR)家族、血小板衍生生長因子(PDGF)受體家族、血管內皮生長因子(VEGF)受體家族、原肌球蛋白受體激酶(Trk)受體家族、蝶素(Eph)受體家族、AXL受體家族、白血球酪胺酸激酶(LTK)受體家族、具有免疫球蛋白樣及EGF樣域1 (TIE)之酪胺酸激酶之受體家族、受體酪胺酸激酶樣孤兒(ROR)受體家族、盤狀域(DDR)受體家族、轉染期間重排(RET)受體家族、酪胺酸蛋白激酶樣(PTK7)受體家族、與受體酪胺酸激酶(RYK)受體家族相關或肌肉特異性激酶(MuSK)受體家族)；G蛋白偶合受體GPCR (捲曲或平滑)；絲胺酸/蘇胺酸激酶受體(BMPR或TGFR)；或細胞介素受體(IL1R、IL2R、IL7R或IL15R)。
連接子 . 如本文所用，連接子可為用以連接分子之兩種其它子組分之CAR分子的任何部分。一些連接子除連接其他組分以外無目的，而許多連接子提供額外目的。上文描述連接scFv之抗體衍生結合域之VL及VH的情形下的連接子。連接子亦可包括間隔子區及接合胺基酸。
間隔子區係用於與其他連接組分建立適當距離及/或可撓性的一種類型連接子區。在特定實施例中，間隔子區之長度可針對不合需要之細胞上之個別細胞標記物定製以優化不合需要之細胞之識別及破壞。間隔子之長度可使得細胞在抗原結合後之反應性與間隔子不存在之情況相比增加。在特定實施例中，間隔子區長度可基於以下來選擇：細胞標記物抗原決定基之位置、結合域對抗原決定基之親和力及/或對細胞標記物識別起反應，表現分子之經修飾細胞在活體外及/或活體內增殖的能力。間隔子區亦可允許經修飾之細胞中之高表現量。
在特定實施例中，間隔子區包括II型C-凝集素域間(莖)區或分化簇(CD)分子莖區之鉸鏈區。如本文所用，「野生型免疫球蛋白鉸鏈區」係指在抗體重鏈中發現的插入於CH1與CH2域之間且進行連接(對於IgG、IgA及IgD)或插入於CH1與CH3域之間且進行連接(對於IgE及IgM)的天然存在之上部及中間鉸鏈胺基酸序列。
II型C-凝集素或CD分子之「莖區」係指位於C型凝集素樣域(CTLD；例如類似於自然殺手細胞受體之CTLD)與疏水性部分(跨膜域)之間的II型C-凝集素或CD分子之細胞外域之部分。例如，人類CD94之細胞外域(GenBank寄存編號AAC50291.1)對應於胺基酸殘基34-179，但CTLD對應於胺基酸殘基61-176，因此人類CD94分子之莖區包括胺基酸殘基34-60，位於疏水性部分(跨膜域)與CTLD之間(參見Boyington等人,Immunity 10:15, 1999；關於其他莖區之描述，亦參見Beavil等人,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:153, 1992；及Figdor等人,Nat. Rev. Immunol . 2:11, 2002)。此等II型C-凝集素或CD分子亦可在莖區與跨膜區或CTLD之間具有接合胺基酸(下述)。在另一實例中，233個胺基酸之人類NKG2A蛋白(GenBank寄存編號P26715.1)具有範圍介於胺基酸71-93之疏水性部分(跨膜域)及範圍介於胺基酸94-233之細胞外域。CTLD包括胺基酸119-231且莖區包括胺基酸99-116，可由額外接合胺基酸側接。其他II型C-凝集素或CD分子以及其細胞外配位體結合域、莖區及CTLD係此項技術中已知的(關於人類CD23、CD69、CD72、NKG2A及NKG2D之序列及其描述，分別參見例如GenBank寄存編號NP 001993.2；AAH07037.1；NP 001773.1；AAL65234.1；CAA04925.1)。
如關於間隔子區進一步描述，融合蛋白之細胞外組分視情況包括細胞外之非信號傳導間隔子或連接子區，其例如可使結合域遠離宿主細胞(例如T細胞)表面以使得能夠進行適當細胞/細胞接觸、抗原結合及活化(Patel等人,Gene Therapy 6: 412-419, 1999)。如所指示，融合結合蛋白之細胞外間隔子區通常位於疏水性部分或跨膜域與細胞外結合域之間，且間隔子區長度可基於所選目標分子、所選結合抗原決定基或抗原結合域尺寸及親和力變化以最大化抗原識別(例如腫瘤識別)(參見例如Guest等人,J. Immunother . 28:203-11, 2005；PCT公開案第WO 2014/031687號)。在某些實施例中，間隔子區包括免疫球蛋白鉸鏈區。免疫球蛋白鉸鏈區可為野生型免疫球蛋白鉸鏈區或經改變之野生型免疫球蛋白鉸鏈區。在某些實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類免疫球蛋白鉸鏈區。免疫球蛋白鉸鏈區可為IgG、IgA、IgD、IgE或IgM鉸鏈區。IgG鉸鏈區可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4鉸鏈區。本文所述之融合結合蛋白中所用的鉸鏈區之其他實例包括諸如CD8α、CD4、CD28及CD7之可為野生型或其變異體之1型膜蛋白的細胞外區域中存在的鉸鏈區。
在某些實施例中，細胞外間隔子區包括選自以下之Fc域之全部或一部分：CH1域、CH2域、CH3域、CH4域或其任何組合。Fc域或其部分可為改變之野生型(例如減少抗體效應功能)。在某些實施例中，細胞外組分包括安置於結合域與疏水性部分之間的免疫球蛋白鉸鏈區、CH2域、CH3域或其任何組合。
接合胺基酸可為當不需要及/或想要由間隔子提供之距離時，可用於連接CAR域之序列的連接子。接合胺基酸為可以用於連接協同刺激細胞內信號傳導組分之短胺基酸序列。在特定實施例中，接合胺基酸為9個胺基酸或更少。
接合胺基酸可為短寡或蛋白質連接子，較佳長度介於2個胺基酸與9個胺基酸之間(例如2、3、4、5、6、7、8或9個胺基酸)，以形成連接子。在特定實施例中，甘胺酸-絲胺酸二聯體可用作適合接合胺基酸連接子。在特定實施例中，單一胺基酸，例如丙胺酸、甘胺酸可用作適合接合胺基酸。
跨膜域 . 如所指示，CAR分子內之跨膜域通常用於經由細胞膜連接細胞外組分及細胞內組分。跨膜域可將所表現之分子錨定於經修飾之細胞膜中。
跨膜域可來源於天然來源及/或合成來源。在來源為天然來源時，跨膜域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。跨膜域可至少包括T細胞受體、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154之α、β或ζ鏈的跨膜區。在特定實施例中，跨膜域可至少包括例如以下之跨膜區：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD 11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (觸覺)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D或NKG2C。
在特定實施例中，跨膜域具有三維結構，該三維結構在細胞膜中熱力學上穩定，且長度通常在15至30個胺基酸範圍內。跨膜域之結構可包括α螺旋、β桶狀、β片狀、β螺旋或其任何組合。
跨膜域可包括一或多個鄰近跨膜區之額外胺基酸，例如CAR之細胞外區域內之一或多個胺基酸(例如，細胞外區域之至多15個胺基酸)及/或CAR之細胞內區域內之一或多個額外胺基酸(例如，細胞內組分之至多15個胺基酸)。在一個態樣中，跨膜域可來自信號傳導域、協同刺激域或鉸鏈域所源自相同之蛋白質。在另一態樣中，跨膜域不來源於與CAR之任何其他域所源自相同之蛋白質。在一些情況下，可藉由胺基酸取代來選擇或修飾跨膜域，以避免此類結構域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域，從而使與受體複合物中之其他不期望成員的相互作用降至最低。在一個態樣中，跨膜域能夠與表現CAR之細胞之細胞表面上的另一CAR均二聚。在不同態樣中，跨膜域之胺基酸序列可經修飾或經取代以使與相同表現CAR之細胞中存在之天然結合搭配物之結合域的相互作用降至最低。在特定實施例中，跨膜域包括CD28跨膜域之胺基酸序列。
轉導標記物可選自以下中之至少一者：截短之CD19 (tCD19；參見Budde等人,Blood 122: 1660, 2013)；截短之人類EGFR (tEGFR；參見Wang等人,Blood 118: 1255, 2011)；人類CD34之細胞外域；及/或RQR8，其組合來自CD34(參見Fehse等人,Mol. Therapy 1(5 Pt 1):448–456, 2000)及CD20抗原(參見Philip等人,Blood 124: 1277-1278, 2014)之目標抗原決定基。
在特定實施例中，編碼i凋亡蛋白酶9構築體(iCasp9)之聚核苷酸可作為自殺開關插入至CAR核苷酸構築體中。
控制特徵可存在於CAR中之多個複本中或可使用跳躍元件表現為不同分子。在特定實施例中，轉導標記物包括tEGFR。示例性轉導標記物及同源對描述於美國專利第8,802,374號中。
CAR中包括至少一個控制特徵之一個優點為投與至個體之表現CAR之細胞可使用針對控制特徵之同源結合分子或藉由使用表現CAR且對控制特徵具有特異性之第二經修飾之細胞來耗乏。經修飾細胞之消除可使用對控制特徵具有特異性之耗乏劑來實現。
在某些實施例中，表現嵌合分子之經修飾細胞可藉由使用以特異性結合於控制特徵之抗體或藉由其他特異性結合控制特徵之同源結合分子在活體內偵測或追蹤，控制特徵之結合搭配物結合於螢光燃染料、放射性示蹤劑、氧化鐵奈米粒子或此項技術中已知用於藉由X射線、CT-掃描、MRI-掃描、PET-掃描、超音波、流動式細胞量測術、近紅外線成像系統或其他成像模態來偵測的其他成像劑(參見例如Yu等人,Theranostics 2:3, 2012)。
因此，與無標籤卡匣之經修飾細胞相比，在CAR下表現至少一個控制特徵之經修飾細胞可例如更容易地鑑別、分離、分選、誘導進行增殖、追蹤及/或消除。
T細胞受體(TCR)為在T細胞表面上發現之分子，其負責與主要組織相容性複合體(MHC)結合之肽的T細胞識別。
TCR係指天然存在之T細胞受體。HSC可在活體內修飾以表現所選擇之TCR。CAR/TCR雜交體係指具有TCR之元件及CAR之元件的蛋白質。舉例而言，CAR/TCR雜交體可具有天然存在之TCR結合域與TCR結合域不天然相關聯之效應子域。CAR/TCR雜交體可具有突變之TCR結合域及ITAM信號傳導域。CAR/TCR雜交體可具有天然存在之TCR，該TCR具有插入之非天然存在之間隔子區或跨膜域。
特定CAR/TCR雜交體包括TRuC® (T細胞受體融合構築體)雜交體；TCR2 Therapeutics, Cambridge, MA。舉例而言，TCR融合蛋白之產生描述於國際專利公開案WO 2018/026953及WO 2018/067993及申請公開案US 2017/0166622中。
在特定實施例中，CAR/TCR雜交體包括「T細胞受體(TCR)融合蛋白」或「TFP」。TFP包括來源於各種多肽之包括TCR之重組多肽，該TCR一般能夠i)與目標細胞上之表面抗原結合，及ii)通常當共位於T細胞之表面中或其表面上時，與完整TCR複合物之其他多肽組分相互作用。
(IV-d) CRISPR
CRISPR (成簇規律間隔短回文重複序列)/Cas (CRISPR相關蛋白)核酸酶系統為一種經工程改造之核酸酶系統，其用於基於細菌系統進行基因體工程改造。其部分地基於許多細菌及古細菌之適應性免疫反應。當病毒或質體侵入細菌時，侵入者之DNA區段藉由細菌『免疫』反應轉化成CRISPR RNA (crRNA)。該crRNA接著經由部分互補區與稱為tracrRNA之另一類型RNA締合，以引導Cas核酸酶至與目標DNA中之crRNA同源的稱為「原型間隔子」之區域。Cas核酸酶在由crRNA轉錄物內含有之20個核苷酸的互補股序列指定的位點處裂解DNA，以在雙股斷裂處產生鈍端。在一些情況下，Cas核酸酶需要crRNA及tracrRNA兩者用於位點特異性DNA識別及裂解。
嚮導RNA (gRNA)為靶向元件之一個實例。在其最簡單形式中，gRNA提供基於互補性(例如crRNA)靶向基因體內之位點的序列。然而，如下文所解釋，gRNA亦可包括其他組分。舉例而言，在特定實施例中，gRNA可包括靶向序列(例如crRNA)及將該靶向序列連接至切割元件之組分。此連接組分可為tracrRNA。在特定實施例中，如下文所述，包括crRNA及tracrRNA之gRNA可表現為稱為單gRNA (sgRNA)之單一分子。gRNA亦可經由其他機制，諸如經由奈米粒子或經由雙重或多用途分子之表現或構築連接至切割元件。
在特定實施例中，靶向元件(例如gRNA)可包括一或多個修飾(例如鹼基修飾、主鏈修飾)以提供具有新或增強特徵(例如改良穩定性)之核酸。經修飾主鏈可包括主鏈將保留磷原子之彼等主鏈及主鏈中不具有磷原子之彼等主鏈。含有磷原子之合適之經修飾主鏈可包括例如硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯及諸如3'-伸烷基膦酸酯、5'-伸烷基膦酸酯之其他烷基膦酸酯、對掌性膦酸酯、亞膦酸酯、包括3'-胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯之胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯及具有正常3'-5'鍵、2'-5'鍵類似物之硼烷磷酸酯，及具有反極性之其中一或多個核苷酸間鍵為3'至3'、5'至5'或2'至2'鍵的彼等磷酸酯。具有反極性之合適靶向元件可在3'-最大程度核苷酸間鍵處包括單個3'至3'鍵(亦即核鹼基缺失或具有羥基代替其之單個反核苷殘基)。亦可包括各種鹽(例如氯化鉀或氯化鈉)、混合鹽及游離酸形式。
靶向元件可包括一或多個硫代磷酸酯及/或雜原子核苷間鍵，尤其-CH2 -NH-O-CH2 -、-CH2 -N(CH3 )-O-CH2 - (亦即，亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主鏈)、-CH2 -O-N(CH3 )-CH2 -、-CH2 -N(CH3 )-N(CH3 )-CH2 -及-O-N(CH3 )-CH2 -CH2 - (其中天然磷酸二酯核苷酸間鍵表示為-O-P(=O)(OH)-O-CH2 -)。
在特定實施例中，靶向元件可包括N-嗎啉基主鏈結構。舉例而言，靶向元件可包括6員N-嗎啉基環，而不是核糖環。在此等實施例中之一些中，二胺基磷酸酯或其他非磷酸二酯核苷間鍵代替磷酸二酯鍵。
在特定實施例中，靶向元件可包括一或多個經取代之糖部分。合適聚核苷酸可包括選自以下之糖取代基：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。O((CH2 )n O) mCH3 、O(CH2)n OCH3 、O(CH2 )n NH2 、O(CH2 )n CH3 、O(CH2 )n ONH2 及O(CH2 )n ON((CH2 )n CH3 )2 尤其適合，其中n及m獨立地為1至10。
切割元件之實例包括核酸酶。CRISPR-Cas基因座具有超過50個基因家族且嚴格意義上無通用基因，此表明基因座結構快速進化及極端多樣性。示例性Cas核酸酶包括Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (亦稱為Csnl及Csxl2)、CaslO、Cpfl、C2c3、C2c2及C2clCsyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpfl、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3及Csf4。
存在三種主要類型之Cas核酸酶(I型、II型及III型)，及10種亞型，包括5種I型、3種II型及2種III型蛋白質(參見例如Hochstrasser及Doudna,Trends Biochem Sci , 40(l):58-66, 2015)。II型Cas核酸酶包括Casl、Cas2、Csn2及Cas9。此等Cas核酸酶為熟習此項技術者已知。舉例而言，化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)野生型Cas9多肽之胺基酸序列闡述於例如NBCI Ref. Seq. No. NP 269215中，且嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)野生型Cas9多肽之胺基酸序列闡述於例如NBCI Ref. Seq. No. WP_011681470中。
在特定實施例中，Cas9係指RNase引導之雙股DNA結合核酸酶蛋白或切口酶蛋白。野生型Cas9核酸酶具有切割不同DNA股之兩個功能域，例如RuvC及HNH。當兩個功能域均具有活性時，Cas9可誘導基因體DNA (目標DNA)中之雙股斷裂。在一些實施例中，Cas9酶包括來源於諸如以下之細菌的Cas9蛋白之一或多個催化域：棒狀桿菌屬(Corynebacter)、薩特菌屬(Sutterella)、軍團菌屬(Legionella)、螺旋體屬(Treponema)、產絲菌屬(Filif actor)、真桿菌屬(Eubacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、黴漿菌屬(Mycoplasma)、擬桿菌屬(Bacteroides)、黃沃拉菌屬(Flaviivola)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、螺旋體屬(Sphaerochaeta)、固氮螺旋菌屬(Azospirillum)、葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、羅氏菌屬(Roseburia)、細小棒狀菌屬(Parvibaculum)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、硝化菌屬(Nitratifractor)及曲狀桿菌屬(Campylobacter)。在一些實施例中，Cas9為融合蛋白，例如兩個催化域來源於不同細菌物種。
如先前所指示，CRISPR/Cas系統已經工程改造以使得在某些情況下crRNA及tracrRNA可組合成一個稱為單一gRNA (sgRNA)之分子。在此經工程改造之方法中，sgRNA引導Cas靶向任何所需序列。(參見例如Jinek等人,Science 337:816-821, 2012；Jinek等人,eLife 2:e00471, 2013；Segal,eLife 2:e00563, 2013)。因此，CRISPR/Cas系統可經工程改造以在細胞基因體中之所需目標處形成雙股斷裂，且利用細胞之內源性機制來修復由HDR或NHEJ引起之斷裂。本文所述之特定實施例利用同源臂促進經界定之併合位點處的HDR。
Cas9核酸酶之適用變異體包括單一非活性催化域，諸如RuvC或HNH酶或切口酶。Cas9切口酶僅具有一個活性功能域，且在一些實施例中，僅切割目標DNA之一股，藉此形成單股斷裂或切口。在一些實施例中，具有至少D10A突變之突變Cas9核酸酶為Cas9切口酶。在其他實施例中，具有至少H840A突變之突變Cas9核酸酶為Cas9切口酶。Cas9切口酶中存在之突變之其他實例包括N854A及N863A。若使用靶向相對DNA股之至少兩個靶向DNA之RNA，則使用Cas9切口酶引入雙股斷裂。雙重切口誘發之雙股斷裂由HDR或NHEJ修復。此基因編輯策略一般有利於HDR且降低脫靶DNA位點處之插入缺失突變的頻率。在一些實施例中，Cas9核酸酶或切口酶針對目標細胞或目標生物體進行密碼子優化。
特定實施例可利用金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ) Cas9 (SaCas9)。特定實施例可利用具有以下位置中之一或多者處之突變的SaCas9：E782、N968及/或R1015。特定實施例可利用具有以下位置中之一或多者處之突變的SaCas9：E735、E782、K929、N968、A1021、K1044及/或R1015。在一些實施例中，變異SaCas9蛋白包括以下突變中之一或多者：R1015Q、R1015H、E782K、N968K、E735K、K929R、A1021T及/或K1044N。在一些實施例中，變異SaCas9蛋白包括D10A、D556A、H557A、N580A、例如D10A/H557A及/或D10A/D556A/H557A/N580A處之突變。在一些實施例中，變異SaCas9蛋白包括選自E735、E782、K929、N968、R1015、A1021及/或K1044之一或多個突變。在一些實施例中，SaCas9變異體可包括以下突變集合中之一者：E782K/N968K/R1015H (KKH變異體)；E782K/K929R/R1015H (KRH變異體)；或E782K/K929R/N968K/R1015H (KRKH變異體)。
藉由Cpf1例示之II類V型CRISPR-Cas類別已由Zetsche等人,Cell 163(3): 759-771, 2015鑑別。具體言之，Cpf1核酸酶可藉助於短的三鹼基對識別序列(TTN) (稱為原型間隔子相鄰模體或PAM)增添目標位點選擇之靈活性。Cpf1之切割位點與PAM序列相距至少18 bp。此外，具有黏性末端之交錯式DSB准許取向特異性供體模板插入，此在非分裂細胞中為有利的。
特定實施例可利用經工程改造之Cpf1。舉例而言，US 2018/0030425描述具有改變且改善之標靶特異性的來自毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium ) ND2006及胺基酸球菌屬(Acidaminococcus sp.) BV3L6之經工程改造之Cpf1核酸酶。特定變異體包括毛螺科菌ND2006，例如至少包括在以下位置中之一或多者處具有突變(亦即天然胺基酸經不同胺基酸，例如丙胺酸、甘胺酸或絲胺酸置換)之胺基酸19-1246：S202、N274、N278、K290、K367、K532、K609、K915、Q962、K963、K966、K1002及/或S1003。特定Cpf1變異體亦可包括胺基酸球菌屬BV3L6 Cpf1 (AsCpf1)，例如在以下位置中之一或多者處具有突變(亦即天然胺基酸經不同胺基酸，例如丙胺酸、甘胺酸或絲胺酸置換(天然胺基酸為絲胺酸除外))：N178、S186、N278、N282、R301、T315、S376、N515、K523、K524、K603、K965、Q1013、Q1014及/或K1054。
其他Cpf1變異體包括Zetsche等人(Cell 163: 759-771, 2015)中所揭示之Cpf1同源物及Cpf1多肽之異種同源物以及美國專利公開案第2016/0208243號中所揭示之Cpf1多肽。其他經工程改造之Cpf1變異體為一般熟習此項技術者已知且包括於本發明之範疇內(參見例如WO/2017/184768)。
如先前所指示，實施例利用同源臂以便於使用同源定向修復進行基因構築體之靶向插入。同源臂可為與裂解位點處之基因體序列具有足夠同源性之任何長度，例如與側接裂解位點，例如在裂解位點之50個鹼基或更少鹼基內，例如在30個鹼基內、在15個鹼基內、在10個鹼基內、在5個鹼基內或緊接裂解位點之核苷酸序列具有70%、80%、85%、90%、95%或100%同源性，以支持其與同源之基因體序列之間的HDR。同源臂一般與基因體序列，例如發生雙股斷裂(DSB)之基因體區域一致。然而，如所指示，不需要絕對一致。
特定實施例可利用具有25、50、100或200個或超過200個在同源定向修復模板與靶向基因體序列之間具有序列同源性之核苷酸(或10與200個核苷酸之間的任何整數值，或更多)的同源臂。在特定實施例中，同源臂之長度為40個核苷酸(nt)-1000 nt。在特定實施例中，同源臂500-2500個鹼基對、700-2000個鹼基對或800 -1800個鹼基對。在特定實施例中，同源臂包括至少800個鹼基對或至少850個鹼基對。同源臂之長度亦可為對稱或不對稱的。關於同源臂之其他資訊，參見Richardson等人,Nat Biotechnol ., 34(3):339-44, 2016。
關於CRISPR-Cas系統及其組分之額外資訊描述於US8697359、US8771945、US8795965、‎US8865406、US8871445、US8889356、US8889418、US8895308、US8906616、‎US8932814、US8945839、US8993233及US8999641；及與其相關之申請案；及WO2014/018423、WO2014/093595、WO2014/093622、‎WO2014/093635、WO2014/093655、WO2014/093661、WO2014/093694、‎WO2014/093701、WO2014/093709、WO2014/093712、WO2014/093718、‎WO2014/145599、WO2014/204723、WO2014/204724、WO2014/204725,‎ WO2014/204726、WO2014/204727、WO2014/204728、WO2014/204729、‎WO2015/065964、WO2015/089351、WO2015/089354、WO2015/089364、‎WO2015/089419、WO2015/089427、WO2015/089462、WO2015/089465、‎WO2015/089473及WO2015/089486、WO2016/205711、WO2017/106657、WO2017/127807；及與其相關之申請案。
(IV-e) 鹼基編輯系統
鹼基編輯係指藉由將基因體DNA或細胞RNA內之鹼基或鹼基對轉化為不同鹼基或鹼基對來選擇性修飾核酸序列(Rees及Liu,Nature Reviews Genetics , 19:770-788, 2018)。存在兩種一般類別之DNA鹼基編輯器：(i)將鳥嘌呤-胞嘧啶鹼基對轉化為胸腺嘧啶-腺嘌呤鹼基對之胞嘧啶鹼基編輯器(CBC)，及(ii)將腺嘌呤-胸腺嘧啶鹼基對轉化為鳥嘌呤胞嘧啶鹼基對之腺嘌呤鹼基編輯器(ABE)。
DNA鹼基編輯器可在未產生雙股斷裂之情況下在非分裂細胞中插入此類點突變。由於缺乏雙股斷裂，鹼基編輯器不會導致過量的不合需要之編輯副產物，諸如插入及缺失(插入缺失)。舉例而言，相比於依賴於雙股斷裂之技術，鹼基編輯器可產生少於10%、9%、8%、7%、6%、5.5%、5%、4.5%、4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%、1%、0.5%或0.1%的插入缺失。
大部分鹼基編輯系統之組分包括(1)靶向DNA結合蛋白、(2)核鹼基去胺酶及(3) DNA醣苷酶抑制劑。
CRISPR系統之任何核酸酶可失能且用於鹼基編輯系統內。示例性Cas核酸酶包括Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (亦稱為Csnl及Csxl2)、CaslO、Cpfl、C2c3、C2c2及C2clCsyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpfl、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4及其突變。
亦可使用來自其他基因編輯系統之核酸酶。舉例而言，鹼基編輯系統可利用鋅指核酸酶(ZFN) (Urnov等人,Nat Rev Genet. , 11(9):636-46, 2010)及轉錄活化因子樣效應物核酸酶(TALENs) (Joung等人,Nat Rev Mol Cell Biol . 14(1):49-55, 2013)。關於DNA結合核酸酶之額外資訊參見US2018/0312825A1。
在特定實施例中，核鹼基去胺酶包括胞苷去胺酶域或腺嘌呤去胺酶域。
在特定實施例中，利用胞苷去胺酶域之CBE藉由使胞嘧啶之外環胺脫胺以產生尿嘧啶而將胍-胞嘧啶鹼基對轉化成胸腺嘧啶-腺嘌呤鹼基對。胞嘧啶去胺酶之實例包括APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3G、CDA1及AID。APOBEC1特別接受單股(ss) DNA作為受質，但不能作用於雙股(ds) DNA。
大部分鹼基編輯系統亦包括DNA醣苷酶抑制劑，其用以超越可以其他方式修復預期鹼基編輯之天然DNA修復機制。在特定實施例中，DNA醣苷酶抑制劑包括尿嘧啶醣苷酶抑制劑，諸如Wang等人(Gene 99, 31-37, 1991)中所述之尿嘧啶DNA醣苷酶抑制劑蛋白(UGI)。
鹼基編輯器之組分可直接融合(例如藉由直接共價鍵)或經由連接子融合。舉例而言，催化失能之核酸酶可經由連接子融合至去胺酶及/或醣苷酶抑制劑。多種醣苷酶抑制劑亦可經由連接子融合。如一般技術者所瞭解，可使用連接子連接任何肽或其部分。
示例性連接子包括聚合物連接子(例如聚乙烯、聚乙二醇、聚醯胺、聚酯)；胺基酸連接子；碳-氮鍵醯胺連接子；環狀或非環狀、經取代或未經取代、分支或未分支之脂族或雜脂族連接子；單體、二聚或聚合物胺基烷酸連接子；胺基烷酸(例如甘胺酸、乙酸、丙胺酸、β-丙胺酸、3-胺基丙酸、4-胺基丁酸、5-戊酸)連接子；單體、二聚或聚合物胺基己酸(Ahx)連接子；碳環部分(例如環戊烷、環己烷)連接子；芳基或雜芳基部分連接子；及苯環連接子。
連接子亦可包括官能化部分以促進親核試劑(例如硫醇、胺基)自肽附接至連接子。任何親電試劑均可用作連接子之一部分。示例性親電試劑包括活化酯、活化醯胺、邁克爾受體(Michael acceptor)、烷基鹵化物、芳基鹵化物、醯基鹵化物及異硫氰酸酯。
在特定實施例中，連接子之長度在4-100個胺基酸範圍內。在特定實施例中，連接子係4個胺基酸、9個胺基酸、14個胺基酸、16個胺基酸、32個胺基酸或100個胺基酸。
已描述許多藉由將靶向DNA結合蛋白與胞苷去胺酶及DNA醣苷酶抑制劑(例如UGI)連接而形成之鹼基編輯(BE)系統。此等複合物包括例如BE1 ([APOBEC1-16胺基酸(aa)連接子-Sp dCas9 (D10A, H840A)] Komer等人,Nature , 533, 420-424, 2016)、BE2 ([APOBEC1-16aa連接子-Sp dCas9 (D10A, H840A)-4aa連接子-UGI] Komer等人, 2016上述 )、BE3 ([APOBEC1-16aa連接子-Sp nCas9 (D10A)-4aa連接子-UGI] Komer等人,上述 )、HF-BE3 ([APOBEC1-16aa連接子-HF nCas9 (D10A)-4aa連接子-UGI] Rees等人,Nat. Commun. 8, 15790, 2017)、BE4、BE4max ([APOBEC1-32aa連接子-Sp nCas9 (D10A)-9aa連接子-UGI-9aa連接子-UGI] Koblan等人,Nat. Biotechnol 10.1038/nbt.4172, 2018；Komer等人,Sci. Adv ., 3, eaao4774, 2017)、BE4-GAM ([Gam-16aa連接子-APOBEC1-32aa連接子-Sp nCas9 (D10A)-9aa連接子-UGI-9aa連接子-UGI] Komer等人, 2017上述 )、YE1-BE3 ([APOBEC1 (W90Y, R126E)-16aa連接子-Sp nCas9 (D10A)-4aa連接子-UGI] Kim等人,Nat. Biotechnol . 35, 475–480, 2017)、EE-BE3 ([APOBEC1 (R126E, R132E)-16aa連接子-Sp nCas9 (D10A)-4aa連接子-UGI] Kim等人, 2017上述 )、YE2-BE3 ([APOBEC1 (W90Y, R132E)-16aa連接子-Sp nCas9 (D10A)-4aa連接子-UGI]Kim等人, 2017上述 )、YEE-BE3 ([APOBEC1 (W90Y, R126E, R132E)-16aa連接子-Sp nCas9 (D10A)-4aa連接子-UGI] Kim等人, 2017上述 )、VQR-BE3 ([APOBEC1-16aa連接子-Sp VQR nCas9 (D10A)-4aa連接子-UGI] Kim等人, 2017上述 )、VRER-BE3 ([APOBEC1-16aa連接子-Sp VRER nCas9 (D10A)-4aa連接子-UGI] Kim等人,Nat. Biotechnol . 35, 475–480, 2017)、Sa-BE3 ([APOBEC1-16aa連接子-Sa nCas9 (D10A)-4aa連接子-UGI] Kim等人, 2017上述 )、SA-BE4 ([APOBEC1-32aa連接子-Sa nCas9 (D10A)-9aa連接子-UGI-9aa連接子-UGI] Komer等人, 2017上述 )、SaBE4-Gam ([Gam-16aa連接子-APOBEC1-32aa連接子-Sa nCas9 (D10A)-9aa連接子-UGI-9aa連接子-UGI] Komer等人, 2017上述 )、SaKKH-BE3 ([APOBEC1-16aa連接子-Sa KKH nCas9 (D10A)-4aa連接子-UGI] Kim等人, 2017上述 )、Cas12a-BE ([APOBEC1-16aa連接子-dCas12a-14aa連接子-UGI] Li等人,Nat. Biotechnol . 36, 324–327, 2018)、目標-AID ([Sp nCas9 (D10A)-100aa連接子-CDA1-9aa連接子-UGI] Nishida等人,Science, 353, 10.1126/science.aaf8729, 2016)、目標-AID-NG ([Sp nCas9 (D10A)-NG-100aa連接子-CDA1-9aa連接子-UGI] Nishimasu等人,Science , 361(6408): 1259-1262, 2018)、xBE3 ([APOBEC1-16aa連接子-xCas9(D10A)-4aa連接子-UGI] Hu等人,Nature , 556, 57–63, 2018)、eA3A-BE3 ([APOBEC3A (N37G)-16aa連接子-Sp nCas9(D10A)-4aa連接子-UGI] Gerkhe等人,Nat. Biotechnol ., 10.1038/nbt.4199, 2018)、A3A-BE3 ([hAPOBEC3A-16aa連接子-Sp nCas9(D10A)-4aa連接子-UGI] Wang等人,Nat. Biotechnol . 10.1038/nbt.4198, 2018)及BE-PLUS ([10X GCN4-Sp nCas9(D10A) / ScFv-rAPOBEC1-UGI] Jiang等人,Cell. Res , 10.1038/s41422-018-0052-4, 2018)。對於BE複合物之其他實例，包括腺嘌呤去胺酶鹼基編輯器，參見Rees及LiuNat. Rev Genet . 2018年12月; 19(12): 770-788。
關於鹼基編輯器之其他資訊，參見US2018/0312825A1；WO2018/165629A；Urnov等人,Nat Rev Genet. 2010 ; 11(9):636-46；Joung等人,Nat Rev Mol Cell Biol . 2013; 14(1):49-55；Charpentier等人,Nature .; 495(7439):50-1, 2013；及Rees及Liu,Nature Reviews Genetics , 19:770–788, 2018。
(IV-f) 小 RNA
小RNA為在調控基因表現中起一定作用的短的非編碼RNA分子。在特定實施例中，小RNA長度小於200個核苷酸。在特定實施例中，小RNA之長度小於100個核苷酸。在特定實施例中，小RNA之長度小於50個核苷酸。在特定實施例中，小RNA之長度小於20個核苷酸。小RNA包括但微RNA (miRNA、Piwi相互作用RNA (piRNA)、小干擾RNA (siRNA)、小核仁RNA (snoRNA)、tRNA衍生之小RNA (tsRNA)、小rDNA衍生之RNA(srRNA)及小核RNA。繼續有待發現額外類別之小RNA。
在特定實施例中，與目標mRNA同源之干擾RNA分子可引起其降解，一種稱為RNA干擾(RNAi)之過程(Carthew,Curr. Opin. Cell. Biol . 13: 244-248, 2001)。RNAi天然出現在細胞中以移除外來RNA (例如病毒RNA)。天然RNAi經由自游離雙股RNA (dsRNA)裂解之片段進行，其將降解機制引導至其他類似RNA序列。或者，RNAi可經製造以例如使目標基因之表現沉默。示例性RNAi分子包括小髮夾RNA (shRNA，亦稱為短髮夾RNA)及小干擾RNA (siRNA)。
不限制本發明，且不受理論束縛，RNA干擾通常為兩步過程。在起始步驟第一步驟中，輸入dsRNA可能在切丁酶(dsRNA特異性核糖核酸酶之核糖核酸酶(RNA酶) III家族之一員)之作用下消化成21-23個核苷酸(nt) siRNA，此以ATP依賴性方式加工(裂解) dsRNA (直接或經由轉殖基因或病毒引入)。連續裂解事件使RNA降解成19-21個鹼基對(bp)雙螺旋體(siRNA)，各具有2個核苷酸之3'懸垂物(Hutvagner及Zamore,Curr. Opin. Genet. Dev . 12: 225-232, 2002；Bernstein,Nature 409:363-366, 2001)。
在效應子步驟中，siRNA雙螺旋體結合於核酸酶複合物以形成RNA誘導之沉默複合物(RISC)。siRNA雙螺旋體之ATP依賴性解開為RISC活化所需的。活性RISC隨後藉由鹼基配對相互作用靶向同源轉錄物，且通常將mRNA自siRNA之3'端裂解成12個核苷酸之片段(Hutvagner及Zamore,Curr. Opin. Genet. Dev . 12: 225-232, 2002；Hammond等人,Nat. Rev. Gen . 2:110-119, 2001；Sharp, Genes. Dev. 15:485-490, 2001)。研究指示各RISC含有單一siRNA及RNA酶(Hutvagner及Zamore,Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-232, 2002)。
由於RNAi之效力顯著，所以已提出RNAi路徑內之擴增步驟。擴增可藉由複製將產生更多siRNA之輸入dsRNA或藉由複製所形成之siRNA來進行。或者或另外，擴增可由RISC之多個轉換事件實現(Hutvagner及Zamore,Curr. Opin. Genet. Dev . 12: 225-232, 2002；Hammond等人,Nat. Rev. Gen . 2:110-119, 2001；Sharp,Genes. Dev. 15:485-490, 2001)。RNAi亦描述於Tuschl (Chem. Biochem . 2: 239-245, 2001)；Cullen (Nat. Immunol . 3:597-599, 2002)；及Brantl (Biochem. Biophys. Act . 1575:15-25, 2002)。
適用於本發明之RNAi分子之合成可如下進行。首先，可在靶向轉殖基因之起始密碼子下游掃描mRNA序列。各AA及3'相鄰19個核苷酸之出現記錄為潛在siRNA標靶位點。在特定實施例中，siRNA目標位點可選自開放閱讀框架，因為未轉譯區(UTR)在調控蛋白結合位點較豐富。UTR結合蛋白及/或轉譯起始複合物可能干擾siRNA核酸內切酶複合物之結合(Tuschl,Chem. Biochem . 2: 239-245, 2001)。然而，應瞭解，引導在未轉譯區處之siRNA亦可為有效的，如針對甘油醛3-磷酸酯去氫酶(GAPDH)所展現，其中引導在5' UTR之siRNA介導細胞GAPDH mRNA降低90%且完全消除蛋白質含量。其次，可使用任何序列比對軟體，諸如可獲自國家生物技術資訊中心(the National Center for Biotechnology Information，NCBI)伺服器之鹼基局部比對檢索工具(BLAST)軟體，將潛在目標位點與適當基因體資料庫相比較。可濾出展現與其他編碼序列明顯同源性之假定目標位點。
可選擇鑑定之目標序列作為siRNA合成之模板。所選序列可包括具有低G/C含量之序列，因為已顯示此等序列相比於具有高於55%之G/C含量的彼等序列在介導基因沉默方面更有效。可沿著目標基因之長度選擇若干目標位點以便評估。為更好地評估所選siRNA，可使用陰性對照。陰性對照siRNA可包括與siRNA相同但與基因體缺乏顯著同源性的核苷酸組成。因此，可使用siRNA之加擾核苷酸序列，限制條件為其不顯示與其他基因之任何顯著同源性。
基於所選部分之序列設計有義股。反義股通常與有義股長度相同且包括互補核苷酸。在特定實施例中，當對準或黏接時，股完全互補且形成鈍端。在其他實施例中，股對準或黏接以使得產生1個核苷酸、2個核苷酸或3個核苷酸之懸垂物，亦即有義股之3'末端比反義股之5'末端延伸遠1、2或3個核苷酸，及/或反義股之3'末端比有義股之5'末端延伸遠1、2或3個核苷酸。懸垂物可包括對應於目標基因序列(或其互補序列)之核苷酸。或者，懸垂物可包括去氧核糖核苷酸，例如去氧胸腺嘧啶(dT)或核苷酸類似物或其他適合之非核苷酸物質。
為促進反義股進入RISC (且因此提高或改良目標裂解及沉默之效率)，有義股之5'末端與反義股之3'末端之間的鹼基對強度可改變，例如減輕或減少。在特定實施例中，鹼基對強度因第一或反義股之5'末端與第二或有義股之3'末端之間的G:C鹼基對比第一或反義股之3'末端與第二或有義股之5'末端之間的G:C鹼基對少而較小。在特定實施例中，鹼基對強度因第一或反義股之5'末端與第二或有義股之3'末端之間的至少一個錯配鹼基對而較小。較佳地，錯配鹼基對係選自包括G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:C及U:U之群。在另一實施例中，鹼基對強度因第一或反義股之5'末端與第二或有義股之3'末端之間的至少一個擺動鹼基對(例如G:U)而較小。在另一實施例中，鹼基對強度因至少一個包括例如肌苷(I)之罕見核苷酸的鹼基對而較小。在特定實施例中，鹼基對係選自包括I:A、I:U及I:C之群。在另一實施例中，鹼基對強度因至少一個包括經修飾之核苷酸的鹼基對而較小。在特定實施例中，經修飾之核苷酸係選自例如2-胺基-G、2-胺基-A、2,6-二胺基-G及2,6-二胺基-A。
shRNA為具有髮夾環結構之單股聚核苷酸。該單股聚核苷酸具有連接雙股區域中之一股之3'末端及雙股區域中之另一股之5'末端的環區段。雙股區域由可與目標序列雜交之第一序列(諸如編碼轉殖基因之聚核苷酸)及與第一序列互補之第二序列形成，因此第一序列及第二序列形成連接序列連接末端以形成髮夾環結構之雙股區域。第一序列可與編碼轉殖基因之聚核苷酸的任何部分雜交。shRNA之雙股莖域可包括限制性核酸內切酶位點。
shRNA之轉錄在聚合酶III (Pol III)啟動子處起始，且認為在4-5-胸腺嘧啶轉錄終止位點之位置2處終止。在表現時，認為shRNA摺疊成具有3' UU-懸垂物之莖環結構；隨後，加工此等shRNA之末端，將shRNA轉化為21-23個核苷酸之siRNA樣分子(Brummelkamp等人,Science . 296(5567):550-553, 2002；Lee等人,Nature Biotechnol . 20(5):500-505, 2002；Miyagishi及Taira,Nature Biotechnol . 20(5):497-500, 2002；Paddison等人,Genes & Dev . 16(8): 948-958, 2002；Paul等人,Nature Biotechnol . 20(5):505-508, 2002；Sui,Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 99(6):5515-5520, 2002；Yu等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(9):6047-6052, 2002)。
shRNA之莖環結構可具有視情況選用之核苷酸懸垂物，諸如2-bp懸垂物，例如3' UU懸垂物。雖然可能存在變化，但莖通常在15至49、15至35、19至35、21至31 bp或21至29 bp範圍內，且環可在4至30 bp，例如4至23 bp範圍內。在特定實施例中，shRNA序列包括45-65 bp；50-60 bp；或51、52、53、54、55、56、57、58或59 bp。在特定實施例中，shRNA序列包括52或55 bp。在特定實施例中，siRNA具有15-25 bp。在特定實施例中，siRNA具有16、17、18、19、20、21、22、23或24 bp。在特定實施例中，siRNA具有19 bp。然而，熟習此項技術者應瞭解，長度小於16個核苷酸或大於24個核苷酸之siRNA亦可用於介導RNAi。已證實較長RNAi劑在某些哺乳動物細胞中引起可能不合需要之干擾素或蛋白激酶R (PKR)反應。RNAi劑較佳不引起PKR反應(亦即具有足夠短之長度)。然而，較長RNAi劑可適用於例如PKR反應已藉由替代方式下調或減弱之情況。
小RNA亦可用於活化基因表現。
(IV-g) 特定編碼序列與特定 LCR 之配對
本發明包括以下認識：LCR，諸如長LCR可控制可操作地連接之編碼核酸序列之表現(例如表現之量或細胞類型特異性)。表1中提供與本發明之特定LCR相關的示例性表現模式(例如細胞類型及/或組織類型)。因此，在各種實施例中，轉位子負載可包括與編碼用於在已知LCR驅動表現之一或多種細胞或組織類型中表現之產物的編碼核酸序列可操作地連接的LCR，諸如長LCR。僅舉幾個實例，本發明表現之轉位子負載可包括：(i) β-球蛋白LCR，其與編碼用於在紅血球(例如造血幹細胞)中表現之蛋白質之編碼序列可操作地連接；(2)免疫球蛋白重鏈LCR，其與編碼用於在B細胞中表現之蛋白質之編碼序列可操作地連接；或(3) T細胞受體α/δ LCR或CD2 LCR，其與編碼用於在T細胞中表現之蛋白質之編碼序列可操作地連接。舉例而言，用於在造血幹細胞中表現之蛋白質可為用於治療選自地中海貧血症、鐮狀細胞貧血症或血友病之病症的蛋白質；用於在B細胞中表現之蛋白質可為抗體，諸如治療性抗體；且用於在T細胞中表現之蛋白質可為T細胞受體(TCR)，諸如經工程改造之TCR或嵌合抗原受體(CAR)。因此，本發明尤其包括：(i)β-球蛋白LCR，其與編碼能夠部分或完全功能上替換γ-球蛋白、β-球蛋白或第八因子之蛋白質的編碼序列或用於校正引起鐮狀細胞貧血症之突變的基因編輯CRISPR-Cas可操作地連接；(2)免疫球蛋白重鏈LCR，其與編碼抗體之編碼序列可操作地連接；或(3)T細胞受體α/δ LCR或CD2 LCR，其與編碼TCR或CAR之編碼序列可操作地連接。
(V) 轉位酶
轉位酶係指作為能夠轉位且介導轉位之功能性核酸-蛋白質複合物之組分的酶。轉位酶亦指來自逆轉錄轉位子或逆轉錄病毒來源之併合酶。轉位反應包括轉位酶及轉位酶或整合酶。在特定實施例中，併合效率、可併合之DNA序列之尺寸及可併合至基因體中之DNA序列之複本數目可藉由使用此類可轉位元件改良。轉位子包括在DNA之較大區段上游及下游具有末端重複序列的短核酸序列。轉位酶結合末端重複序列且催化轉位子移動至基因體之另一部分-。
(V-a) 睡美人轉位酶 SB100x 之使用
睡美人(SB)係源自鮭魚之基因體的轉位酶。SB描述於Ivics等人,Cell 91, 501-510, 1997；Izsvak等人,J. Mol. Biol ., 93-102, 302(1), 2000；Geurts等人,Molecular Therapy , 8(1):108-117, 2003；Mates等人,Nature Genetics 41, 753-761, 2009；及美國專利第6,489,458號；第7,148,203號；及第7,160,682號；美國公開案第2011/117072號；第2004/077572號；及第2006/252140號。
已進行系統突變誘發研究以增加SB轉位酶之活性。舉例而言，Yant等人進行SB轉位酶之N端95 AA與丙胺酸之系統交換(Mol. Cell Biol . 24: 9239-9247, 2004)。此等取代中之十個相比於作為參考之SB10引起200%-400%之間的過度活性。Baus等人, Mol. Therapy 12: 1148-1156, 2005)中所述之SB16據報導與SB10相比活性增加16倍。額外活性過高SB變異體描述於Zayed等人 (Mol Therapy , 9(2):292-304, 2004)及美國專利第9,840,696號中。在篩選SB轉位酶之若干變異體之後，發現SB100X比第一代轉位酶有效100倍。
SB轉位子進行轉位需要環化(Yant等人,Nature Biotechnology , 20: 999-1005, 2002)。此外，對於1.9 kb與7.2 kb之間的轉位子，在轉位子之長度與轉位頻率之間存在反線性關係。換言之，SB轉位酶介導較大轉位子之遞送的效率低於較小轉位子(Geurts等人,Mol Ther ., 8(1):108-17, 2003)。
(V-a-i) 反向重複序列及位置
在特定實施例中，編碼睡美人之IR (反向重複序列)/DR (正向重複序列)及染色體序列之序列包括SEQ ID NO: 66。在特定實施例中，編碼睡美人之IR/DR及染色體序列之序列包括SEQ ID NO: 67。在特定實施例中，睡美人之IR/DR編碼序列包括SEQ ID NO: 68。在特定實施例中，編碼睡美人之IR/DR及染色體序列之序列包括SEQ ID NO: 69。在特定實施例中，編碼睡美人之IR/DR及染色體序列之序列包括SEQ ID NO: 70。在特定實施例中，編碼睡美人之IR/DR之序列包括SEQ ID NO: 71。在特定實施例中，編碼睡美人之IR/DR及染色體序列之序列包括SEQ ID NO: 72。在特定實施例中，編碼睡美人之IR/DR之序列包括SEQ ID NO: 73。
(V-a-ii) 轉位酶序列
在某些實施例中，睡美人轉位酶具有序列SEQ ID NO: 74。
在某些實施例中，過度活性睡美人為SB100X。在特定實施例中，SB100X具有序列SEQ ID NO: 75。
(V-b) 其他轉位酶
除SB以外，此項技術中已描述多種轉位酶，其促進核酸插入脊椎動物(包括人類)之基因體中。此類轉位酶之實例包括piggyBac™ (例如來源於鱗翅目(lepidopteran)細胞及/或小棕蝠(Myotis lucifugus))；mariner (例如來源於果蠅(Drosophila))；frog prince (例如來源於北美豹蛙(Rana pipiens))；Tol1；Tol2 (例如來源於青鱂魚(medaka fish))；TcBuster™ (例如來源於紅粉甲蟲赤擬穀盜(Tribolium castaneum))、Helraiser、Himar1、Passport、Minos、Ac/Ds、PIF、Harbinger、Harbinger3-DR、HSmar1及spinON。
(V-b-i) 組分及序列
piggyBac™ (PB)轉位酶為例如以下中描述之緊湊型功能性轉位酶蛋白：Fraser等人,Insect Mol. Biol ., 5:141-51, 1996；Mitra等人,EMBO J. 27:1097-1109, 2008；Ding等人,Cell , 122:473-83, 2005；及美國專利第6,218,185號、第6,551,825號、第6,962,810號、第7,105,343號及第7,932,088號。過度活性piggyBac™轉位酶描述於美國專利第10,131,885號中。
在特定實施例中，PB轉位酶具有如SEQ ID NO: 76 (GenBank ABS12111.1)中所闡述之序列。
在特定實施例中，Frog Prince轉位酶具有如SEQ ID NO；77 (GenBank: AAP49009.1)中所闡述之序列。亦參見US2005/0241007。
在特定實施例中，TcBuster轉位酶具有如SEQ ID NO: 78 (GenBank: ABF20545.1)中所述之序列。
在特定實施例中，Tol2轉位酶具有如SEQ ID NO: 79 (GenBank: BAA87039.1)中所述之序列。
關於DNA轉位子之額外資訊可見於例如Muñoz-López及García Pérez,Curr Genomics , 11(2):115-128, 2010中。
(VI) 調控組件
術語「調控組件」包括啟動子、強化子、轉錄終止信號、聚腺苷酸化序列及其他表現控制序列。本發明中所提及之調控組件包括控制核酸序列宿主細胞之表現的彼等調控組件。
(VI-a) 啟動子
啟動子為非編碼基因體DNA序列，通常在相關編碼序列上游(5')，RNA聚合酶在起始轉錄之前結合其。此結合將RNA聚合酶對準以使得轉錄將在特定轉錄起始位點起始。啟動子之核苷酸序列決定酶及其他附接至其之相關蛋白質因子之性質及RNA合成速率。RNA經加工以產生信使RNA (mRNA)，其充當用於將RNA序列轉譯為所編碼多肽之胺基酸序列的模板。5'未轉譯之前導序列為可在mRNA起始及轉譯中起一定作用之在編碼區上游的mRNA區域。3'轉錄終止/聚腺苷酸化信號係在植物細胞中起作用以引起RNA合成終止及聚腺苷酸化核苷酸添加至3'末端之在編碼區下游的未轉譯區。
啟動子可包括通用啟動子、組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子及/或對細胞質具有特異性之啟動子。啟動子可包括強啟動子、弱啟動子、組成性表現啟動子及/或誘導性(條件性)啟動子。誘導性啟動子響應於某些條件、信號或細胞事件控制表現。舉例而言，啟動子可為誘導性啟動子，其需要特定配位體、小分子、轉錄因子或激素蛋白以實現自啟動子轉錄。啟動子之特定實例包括AFP (α-胎蛋白)啟動子、澱粉酶1C啟動子、水孔蛋白-5 (AP5)啟動子、αl-抗胰蛋白酶啟動子、β-act啟動子、β-球蛋白啟動子、β-Kin啟動子、B29啟動子、CCKAR啟動子、CD14啟動子、CD43啟動子、CD45啟動子、CD68啟動子、CEA啟動子、c-erbB2啟動子、CMV (細胞巨大病毒)啟動子、minCMV啟動子、COX-2啟動子、CXCR4啟動子、肌間線蛋白啟動子、E2F-1啟動子、EF1α (延伸因子lα)啟動子、EGR1啟動子、eIF4A1啟動子、彈性蛋白酶-1啟動子、內皮因子啟動子、FerH啟動子、FerL啟動子、纖維結合蛋白啟動子、Flt-1啟動子、GAPDH啟動子、GFAP啟動子、GPIIb啟動子、GRP78啟動子、GRP94啟動子、HE4啟動子、hGR1/1啟動子、hNIS啟動子、Hsp68啟動子、Hsp68最小啟動子、HSP70啟動子、HSV-1病毒TK基因啟動子、hTERT啟動子、ICAM-2啟動子、胰舒血管素啟動子、LP啟動子、主要晚期啟動子(MLP)、Mb啟動子、ρ啟動子、MT (金屬硫蛋白)啟動子、MUC1啟動子、NphsI啟動子、OG-2啟動子、PGK (磷酸化甘油酸酯激酶)啟動子、PGK-1啟動子、聚合酶III (Pol III)啟動子、PSA啟動子、ROSA啟動子、勞氏肉瘤病毒(RSV)長末端重複(LTR)啟動子、SP-B啟動子、存活素啟動子、SV40 (猿猴病毒40)啟動子、SYN1啟動子、SYT8基因啟動子、TRP1啟動子、Tyr啟動子、泛素B啟動子及WASP啟動子。
(VI-a-i) 啟動子來源
啟動子可呈天然啟動子或複合啟動子形式獲得。天然啟動子或最小啟動子係指包括來自給定基因之5'區域之核苷酸序列的啟動子。天然啟動子包括核心啟動子及其天然5' UTR。在特定實施例中，5' UTR包括內含子。複合啟動子係指藉由組合不同來源之啟動子元件或藉由組合遠端強化子與相同或不同來源之最小啟動子而得到的啟動子。
(VI-a-ii) 示例性啟動子之序列及序列之變體 在特定實施例中，SV40啟動子包括SEQ ID NO: 80中所示之序列。在特定實施例中，dESV40啟動子(缺失強化子區域之SV40啟動子)包括SEQ ID NO: 81中所示之序列。在特定實施例中，人類端粒酶催化次單元(hTERT)啟動子包括SEQ ID NO: 82中所示之序列。在特定實施例中，來源於施密特-魯賓A株(Schmidt-Ruppin A strain)之RSV啟動子包括SEQ ID NO: 83中所示之序列。在特定實施例中，hNIS啟動子包括SEQ ID NO: 84中所示之序列。在特定實施例中，人類糖皮質激素受體1A (hGR 1/Ap/e)啟動子包括SEQ ID NO: 85中所示之序列。
在特定實施例中，啟動子包括野生型啟動子序列及相對於野生型啟動子在某些位置具有視情況存在之變化(包括插入、點突變或缺失)的序列。在特定實施例中，啟動子與天然存在之啟動子的不同之處在於每20個核苷酸延伸段具有1個變化、每20個核苷酸延伸段具有2個變化、每20個核苷酸延伸段具有3個變化、每20個核苷酸延伸段具有4個變化或每20個核苷酸延伸段具有5個變化。在特定實施例中，天然序列將在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鹼基中改變。啟動子之長度可變化，包括LTR序列之約50個核苷酸至LTR序列之100、200、250或350個核苷酸，具有或不具有其他病毒序列。
(VI-a-iii) 啟動子之表現模式
一些啟動子對組織或細胞具有特異性且一些啟動子對組織或細胞不具特異性。哺乳動物細胞中之各基因具有其自身啟動子且一些啟動子僅可在某些細胞類型中活化。非特異性啟動子或普遍存在之啟動子有助於起始在廣泛範圍之細胞、組織及細胞週期中與啟動子序列可操作地連接之基因或核苷酸序列的轉錄。在特定實施例中，啟動子為非特異性啟動子。在特定實施例中，非特異性啟動子包括CMV啟動子、RSV啟動子、SV40啟動子、哺乳動物延伸因子1α (EF1α)啟動子、β-act啟動子、EGR1啟動子、eIF4A1啟動子、FerH啟動子、FerL啟動子、GAPDH啟動子、GRP78啟動子、GRP94啟動子、HSP70啟動子、β-Kin啟動子、PGK-1啟動子、ROSA啟動子及/或泛素B啟動子。
特異性啟動子有助於與啟動子序列可操作地連接的核苷酸序列之細胞特異性表現。在特定實施例中，特異性啟動子在B細胞、單核球性細胞、白血球、巨噬細胞、胰臟腺泡細胞、內皮細胞、星形膠質細胞及/或任何其他細胞類型或細胞週期中具活性。在特定實施例中，啟動子為特異性啟動子。在特定實施例中，SYT8基因啟動子調控人類胰島中之基因表現(Xu等人, Nat Struct Mol Biol., 2011, 18: 372-378)。在特定實施例中，胰舒血管素啟動子調控導管細胞特異性唾液腺中之基因表現。在特定實施例中，澱粉酶1C啟動子調控腺泡細胞中之基因表現。在特定實施例中，水孔蛋白-5 (AP5)啟動子調控腺泡細胞中之基因表現(Zheng及Baum,Methods Mol Biol ., 434: 205-219, 2008)。在特定實施例中，B29啟動子調控B細胞中之基因表現。在特定實施例中，CD14啟動子調控單核球性細胞中之基因表現。在特定實施例中，CD43啟動子調控白血球及血小板中之基因表現。在特定實施例中，CD45啟動子調控造血細胞中之基因表現。在特定實施例中，CD68啟動子調控巨噬細胞中之基因表現。在特定實施例中，肌間線蛋白啟動子調控肌肉細胞中之基因表現。在特定實施例中，彈性蛋白酶-1啟動子調控胰臟腺泡細胞中之基因表現。在特定實施例中，內皮因子啟動子調控內皮細胞中之基因表現。在特定實施例中，纖維結合蛋白啟動子調控分化細胞或癒合組織中之基因表現。在特定實施例中，Flt-1啟動子調控內皮細胞中之基因表現。在特定實施例中，GFAP啟動子調控星形膠質細胞中之基因表現。在特定實施例中，GPIIb啟動子調控巨核細胞中之基因表現。在特定實施例中，ICAM-2啟動子調控內皮細胞中之基因表現。在特定實施例中，Mb啟動子調控肌肉中之基因表現。在特定實施例中，NphsI啟動子調控足細胞中之基因表現。在特定實施例中，OG-2啟動子調控成骨細胞、生齒細胞中之基因表現。在特定實施例中，SP-B啟動子調控肺細胞中之基因表現。在特定實施例中，SYN1啟動子調控神經元中之基因表現。在特定實施例中，WASP啟動子調控造血細胞中之基因表現。
在特定實施例中，啟動子為腫瘤特異性啟動子。在特定實施例中，AFP啟動子調控肝細胞癌中之基因表現。在特定實施例中，CCKAR啟動子調控胰臟癌中之基因表現。在特定實施例中，CEA啟動子調控上皮細胞癌中之基因表現。在特定實施例中，c-erbB2啟動子調控乳癌及胰臟癌中之基因表現。在特定實施例中，COX-2啟動子調控腫瘤中之基因表現。在特定實施例中，CXCR4啟動子調控腫瘤中之基因表現。在特定實施例中，E2F-1啟動子調控腫瘤中之基因表現。在特定實施例中，HE4啟動子調控腫瘤中之基因表現。在特定實施例中，LP啟動子調控腫瘤中之基因表現。在特定實施例中，MUC1啟動子調控癌細胞中之基因表現。在特定實施例中，PSA啟動子調控前列腺及前列腺癌中之基因表現。在特定實施例中，存活素啟動子調控腫瘤中之基因表現。在特定實施例中，TRP1啟動子調控黑色素細胞及黑色素瘤中之基因表現。在特定實施例中，Tyr啟動子調控黑色素細胞及黑色素瘤中之基因表現。
(VI-b) 微 RNA 位點
在各種實施例中，微RNA控制系統可指其中基因表現由微RNA位點(例如微RNA可進行相互作用之核酸序列)之存在調控的方法或組合物。在特定實施例中，微RNA控制系統調控基因表現以使得基因僅在目標細胞(諸如HSPC，例如腫瘤浸潤性HSPC)中表現。在一些實施例中，編碼所關注蛋白質或核酸(例如抗癌劑，諸如CAR、TCR、抗體及/或檢查點抑制劑，例如作為檢查點抑制劑之αPD-L1抗體(例如αPD-L1γ1抗體))之核酸(例如治療性基因)包括微RNA位點、複數個相同微RNA位點或複數個不同微RNA位點，與之相關聯，或可操作地與之連接。儘管熟習此項技術者將熟悉使微RNA位點與具有編碼所關注基因之序列的核酸或其部分相關聯的手段及技術，但本文提供某些非限制性實例。舉例而言，所關注基因(例如編碼αPD-L1γ1抗體之序列)可存在於核酸中，使得所關注基因之表現由一或多個抑制在非腫瘤浸潤白血球之細胞中表現但不抑制在腫瘤浸潤性白血球中表現之微RNA位點的存在調控。在某些特定實例中，所關注基因(例如編碼αPD-L1γ1抗體之序列)可存在於核酸中，使得所關注基因之表現由一或多個抑制在非腫瘤浸潤白血球之細胞中表現但不抑制在腫瘤浸潤性白血球中表現之miR423-5p微RNA位點的存在調控。在各種實施例中，微RNA控制系統可包括包含一或多個微RNA位點，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個微RNA位點或其中所關注蛋白質或核酸之表現由該一或多個微RNA位點調控的核酸。在各種實施例中，微RNA控制系統可包括包含一或多個miR423-5p微RNA位點，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個miR423-5p微RNA位點或其中所關注蛋白質或核酸之表現由該一或多個miR423-5p微RNA位點調控的核酸。在一些特定實施例中，微RNA控制系統可包括編碼αPD-L1γ1抗體且包括一或多個miR423-5p微RNA位點，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個miR423-5p微RNA位點，例如miR423-5p微RNA位點或其中αPD-L1γ1抗體之表現由該一或多個miR423-5p微RNA位點調控的核酸。
(VI-c) 特定調控組件、特定編碼序列及 / 或特定長 LCR 之配對
本發明之轉位子負載可包括與編碼核酸序列(例如編碼蛋白質之核酸序列)可操作地連接的LCR，諸如長LCR，其中該編碼核酸序列亦與啟動子可操作地連接。在各種實施例中，轉位子負載包括與(i) LCR及(ii)在人類基因體中通常與LCR可操作地連接之啟動子兩者可操作地連接的編碼核酸序列。換言之，轉位子負載可包括LCR以及其天然配對之啟動子，其中兩者一起驅動編碼核酸序列之表現。在各種實施例中，與LCR天然配對之啟動子為表2中所示之啟動子。在各種實施例中，啟動子為緊鄰在人類基因體中與LCR天然配對之編碼序列之起始密碼子上游的核酸序列，例如包括例如在參考基因體中緊鄰起始密碼子上游之100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、1,000bp、1,500bp、2,000bp、3,000bp、4,000bp、5,000bp或更多個核苷酸的核酸序列。在各種實施例中，啟動子為一種核酸序列，其包括包含緊鄰在人類基因體中與LCR天然配對之編碼序列之起始密碼子上游的例如100bp-5,000bp、100bp-4,000bp、100bp-3,000bp、100bp-2,000bp、100bp-1,000bp、1,000bp-5,000bp、1,000bp-4,000bp、1,000bp-3,000bp或1,000bp-2,000bp的核酸序列。在各種實施例中，在人類基因體中與LCR天然配對之編碼序列為表1或表2中所示之編碼序列。
在各種實施例中，轉位子負載包括與(i) LCR及(ii)在人類基因體中通常不與LCR可操作地連接之啟動子兩者可操作地連接的編碼核酸序列。本發明涵蓋以下認識：LCR可能已在特定情形下進化，但可用於控制其在人類基因體中通常不會可操作地連接之編碼核酸序列的表現及/或驅動表現亦由在人類基因體中LCR通常不相關聯之啟動子驅動的編碼核酸序列之表現。因此，LCR可與其天然可操作地連接之啟動子及/或基因配對(例如在包括與編碼β-球蛋白或γ-球蛋白之編碼核酸序列可操作地連接之β-球蛋白LCR以及β-球蛋白啟動子的轉位子負載中)，或可與其天然不可操作地連接之啟動子及/或基因配對(例如，與編碼第八因子替代、諸如ET3之編碼核酸序列可操作地連接之β-球蛋白LCR)。
表 2
LCR 示例性組織 示例性啟動子 示例性編碼序列 ( 轉殖基因 / 治療性基因 )
β-球蛋白LCR 紅血球 β-啟動子 下游β-球蛋白基因(ε、G-γ、A-γ、δ及β，或HBE1、HBG2、HBG1、HBD及HBB)
腺苷去胺酶LCR 富集於血液、腸及淋巴組織中 ADA啟動子 腺苷去胺酶   
載脂蛋白E/C-1 LCR 腎上腺、肝臟 APOE啟動子、APOC-I啟動子、APOC-II啟動子 APOE、APOC-I、APOC-II
T細胞受體α/δ LCR T細胞    TCR基因及Dad1 抗細胞凋亡基因
CD2 LCR T細胞    CD2
S100β LCR 腦星形膠質細胞 S100β啟動子 S100β
生長激素LCR 腦垂腺 人類生長激素(hGH)啟動子 GH1 (生長激素1)、CSHL1 (絨毛膜生長催乳素激素樣1)、CSH1 (絨毛膜生長催乳素激素1 (胎盤催乳激素))、GH2 (生長激素2)或CSH2 (絨毛膜生長催乳素激素2)
載脂蛋白B LCR 腸、肝臟    APOB   
β肌凝蛋白重鏈LCR 心肌、骨骼肌    β肌凝蛋白重鏈
MHC I類HLA-B7 LCR 所有細胞      
免疫球蛋白重鏈LCR B細胞      
免疫球蛋白Cα 1/2 LCR B細胞      
角蛋白18 LCR 上皮細胞 KRT18啟動子 角蛋白18 (KRT18)
MHC I類HLA G LCR 所有細胞 HLA-G啟動子 HLA-G
補體組分C4A/B LCR 肝臟    C4A
紅綠視覺色素LCR (視蛋白LCR) 視錐細胞    長波敏感視蛋白1；OPN1LW；中波敏感視蛋白1；OPN1MW、OPN1MW2及OPN1MW3
CD4 LCR CD4+ T細胞    CD4
α-乳白蛋白LCR 乳腺    α-乳白蛋白
肌間線蛋白LCR 心肌、骨骼肌、平滑肌    肌間線蛋白
CYP19/芳香酶LCR 多種組織    CYP19A1
C-fes原癌基因LCR 骨髓細胞，包括巨噬細胞及嗜中性球    FES
α-球蛋白基因座控制區域 紅血球    α-球蛋白基因簇內之HBZ (血紅素，ζ)、HBA2 (血紅素，α2)、HBA1 (血紅素，α1)及HBQ1 (血紅素，θ1)基因
核因子紅血球系2樣1 (NFE2L1) LCR 紅血球    NFE2L1
(VII) 載體
(VII-a) 可經最佳化以改良大負載併合之載體特徵
腺病毒基因體為長度在26 kb至45 kb範圍內之線性非分段雙股DNA，視血清型而定。腺病毒DNA在兩端由反向末端重複序列(ITR)側接，該等反向末端重複序列充當自引子以促進非引發酶依賴性DNA合成且促進併合至宿主基因體中。腺病毒基因體亦含有包裝信號，其促進適當病毒轉錄物包裝且位於基因體之左臂上。病毒轉錄物編碼若干蛋白質，包括早期轉錄單元E1、E2、E3及E4，及編碼Ad病毒體之結構性組分之晚期轉錄單元(Lee等人,Genes Dis ., 4(2):43-63, 2017)。
腺病毒為大的二十面體非包膜病毒。病毒衣殼包括三種類型之蛋白質，包括基於纖維、五鄰體及六鄰體之蛋白質。六鄰體構成病毒衣殼之大部分，形成20個三角形面。五鄰體底部位於衣殼之12個頂點處且纖維(亦稱為鼓起纖維)自各五鄰體底部突出。此等蛋白質、五鄰體及纖維在受體結合及內化方面尤為重要，因為其促進衣殼附接至宿主細胞(Lee等人,Genes Dis ., 4(2):43-63, 2017)。
腺病毒由於其穩定且安全之基因體而尤其適合於基因療法。相比於單股DNA或RNA病毒，Ad載體之雙股特徵增加載體穩定性且減少遺傳漂變(genetic shift)或偏移。為減少DNA複製期間之誤差，Ad載體使用校對DNA聚合酶。此外，Ad載體不將其DNA與宿主之基因體併合，而是將游離型DNA轉移至宿主細胞之細胞核。
Ad載體亦容易進行基因修飾且已對修飾進行研究以進一步改良其在基因療法中之用途。
(VII-b) 血清型及假型
人類腺病毒(Ad)分為含有超過50種血清型之六個子組。該等組標記為A至F。組B Ad包括Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad 35及Ad50。Ad5分至C組。因為存在超過50種人類Ad血清型，Ad載體可經修飾以靶向所關注之不同宿主細胞。不同Ad血清型結合於不同細胞受體且使用不同進入機制。
不同Ad血清型之感染性限於許多人類細胞株。感染性研究顯示，Ad5及Ad3尤其適用於感染及靶向內皮細胞或淋巴細胞，而Ad9、Ad11及Ad35高效地感染人類骨髓細胞。因此，Ad9、Ad11及Ad35之纖維蛋白質之旋鈕域為將Ad5載體再靶向至人類骨髓細胞之極佳候選物。其他可能之血清型包括Ad7。
在特定實施例中，Ad載體為重組載體。在特定實施例中，Ad5/35為表現包括Ad5之纖維尾域及Ad35之纖維軸及旋鈕域的經修飾之纖維蛋白的重組Ad5載體。在特定實施例中，Ad載體係選自Ad5、Ad35、Ad5/35、Ad5/35++或Ad35++。
在特定實施例中，Ad載體包括編碼CD46結合腺病毒纖維多肽之核酸。纖維多肽係指包括以下之多肽：(a) N端尾域或其同等物，其與衣殼之五鄰體底部蛋白相互作用且含有蛋白質轉運至細胞核所需之信號；(b)一或多個軸域或其同等物；及(c) C端旋鈕域或其同等物，其含有用於受體結合之決定子。能夠形成結合於CD46之同源三聚體的纖維多肽C端域稱為纖維旋鈕。纖維蛋白之C端部分可二聚且形成結合於CD46之纖維結構。CD46靶向僅需要纖維旋鈕。因此，第二核酸模組編碼包括一或多個結合於CD46之人類腺病毒旋鈕域或其同等物的腺病毒纖維。當編碼多個旋鈕域時，旋鈕域可相同或不同，只要其各自結合於CD46即可。如本文所用，旋鈕域「功能同等物」為具有一或多個胺基酸缺失、取代或添加的保持結合於CD34+細胞表面上之CD46之旋鈕域。
腺病毒纖維多肽亦包括軸域。軸域對於CD46結合而言並非關鍵。在特定實施例中，軸域可包括一或多個來自不同人類Ad血清型之軸域。在特定實施例中，軸域可包括允許纖維旋鈕三聚的軸域之任何部分或其突變體。在特定實施例中，軸域係選自Ad5軸域、Ad35軸域及其功能同等物。如本文所用，軸域之功能同等物為允許纖維旋鈕三聚的軸域之任何部分或其突變體。在存在超過1個軸域或同等物時，各軸域或同等物可為一致的，或軸域之一或多個複本或同等物在單一重組多肽中可不同。
腺病毒纖維多肽亦包括尾域。腺病毒尾域或其突變體與衣殼之基於五鄰體之蛋白質(在輔助Ad病毒上)相互作用且含有將蛋白質轉運至細胞核所需之信號。所用尾域為將與用於產生HD-Ad之輔助Ad病毒衣殼之基於五鄰體之蛋白質相互作用的尾部域。因此，若使用Ad5輔助病毒，則尾域將來源於Ad5；若使用Ad35輔助病毒，則尾域將來自Ad 35等。
在特定實施例中，Ad載體包括Ad5/35載體。在特定實施例中，Ad5/35載體為具有Ad35纖維旋鈕及Ad5軸之嵌合Ad載體。
在特定實施例中，Ad載體包括Ad5/35++載體。在特定實施例中，Ad5/35++載體為具有突變Ad35纖維旋鈕之嵌合Ad5/35載體。使載體突變以使對CD46之親和力增加25倍且使細胞轉導效率在較低感染倍率(MOI)下增加(Li及Lieber,FEBS Letters , 593(24): 3623-3648, 2019)。
在特定實施例中，Ad載體包括Ad35載體。在特定實施例中，Ad35載體為具有Ad35纖維旋鈕及軸之B類Ad載體。
在特定實施例中，Ad載體包括Ad35++載體。在特定實施例中，Ad35++載體為具有增強之Ad35纖維旋鈕及Ad35軸之Ad35載體。
在特定實施例中，Ad載體包括Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34或Ad50。
(VII-c) 組件
在特定實施例中，載體包括含有負載、調控組件、併合元件、選擇卡匣及填充序列之組件。
(VII-c-i) 負載
在特定實施例中，載體包括負載(例如，轉位子負載)。在特定實施例中，負載編碼所關注基因。在特定實施例中，負載可包括用於表現之其他元件，諸如內含子序列、信號序列、核定位序列、轉錄終止序列或用於起始IRES類型轉譯之位點。負載之額外描述可見於本文中。
(VII-c-ii) 調控組件
在特定實施例中，載體包括調控組件。在章節VI中更詳細地描述調控組件。調控組件可包括強化子、啟動子及調控基因表現之其他序列。
在特定實施例中，調控組件促進將編碼負載之序列轉錄成RNA及/或將mRNA轉譯成蛋白質。合適啟動子包括例如真核或病毒來源之啟動子。合適啟動子可為組成型或可調控型(例如誘導型)。合適啟動子之實例包括例如AFP (α-胎蛋白)啟動子、澱粉酶1C啟動子、水孔蛋白-5 (AP5)啟動子、αl-抗胰蛋白酶啟動子、β-act啟動子、β-球蛋白啟動子、β-Kin啟動子、B29啟動子、CCKAR啟動子、CD14啟動子、CD43啟動子、CD45啟動子、CD68啟動子、CEA啟動子、c-erbB2啟動子、CMV (細胞巨大病毒)啟動子、COX-2啟動子、CXCR4啟動子、肌間線蛋白啟動子、E2F-1啟動子、EF1α (延伸因子lα)啟動子、EGR1啟動子、eIF4A1啟動子、彈性蛋白酶-1啟動子、內皮因子啟動子、FerH啟動子、FerL啟動子、纖維結合蛋白啟動子、Flt-1啟動子、GAPDH啟動子、GFAP啟動子、GPIIb啟動子、GRP78啟動子、GRP94啟動子、HE4啟動子、hGR1/1啟動子、hNIS啟動子、Hsp68啟動子、HSP70啟動子、HSV-1病毒TK基因啟動子、hTERT啟動子、ICAM-2啟動子、胰舒血管素啟動子、LP啟動子、主要晚期啟動子(MLP)、Mb啟動子、ρ啟動子、MT (金屬硫蛋白)啟動子、MUC1啟動子、NphsI啟動子、OG-2啟動子、PGK (磷酸化甘油酸酯激酶)啟動子、PGK-1啟動子、聚合酶III (Pol III)啟動子、PSA啟動子、ROSA啟動子、勞氏肉瘤病毒(RSV)長末端重複(LTR)啟動子、SP-B啟動子、存活素啟動子、SV40 (猿猴病毒40)啟動子、SYN1啟動子、SYT8基因啟動子、TRP1啟動子、Tyr啟動子、泛素B啟動子及WASP啟動子。
(VII-c-iii) 併合元件
多種SB轉位酶係此項技術中已知的。此項技術中已知之SB轉位酶之實例包括(但不限於) SB、SB11、SB12、HSB1、HSB2、HSB3、HSB4、HSB5、HSB13、HSB14、HSB15、HSB16、HSB17、SB100x及SB150x。在特定實施例中，本發明利用SB100x轉位酶。在一些實施例中，可使用SB100x或SB150x轉位酶。在一些實施例中，可使用任何SB轉位酶。
SB轉位酶將位於SB反向末端重複序列(ITR)之間的核酸轉位子負載轉位。多種SB ITR係此項技術中已知的。在一些實施例中，SB ITR為230 bp序列，包括長度為32 bp的用作轉位酶之識別信號的不完全正向重複序列。經工程改造之SB ITR係此項技術中已知的，包括稱為pT、pT2、pT3、pT2B及pT4之SB ITR。在一些實施例中，使用pT4 ITR例如側接本發明之轉位子負載，例如用於由SB100x轉位酶轉位。
(VII-c-iv) 選擇元件
在特定實施例中，載體包括選擇元件，其包括選擇卡匣。在特定實施例中，選擇卡匣包括啟動子、添加對選擇劑之抗性的cDNA及能夠阻止此獨立轉錄元件之轉錄的多聚A序列。
選擇卡匣可編碼如下蛋白質：(a)賦予對抗生素或其他毒素之抗性，(b)補體營養缺陷性不足，或(c)供應無法自複雜培養基中獲得之關鍵營養物，例如編碼桿菌之D-丙胺酸消旋酶的基因。許多選擇系統可用於回收經轉型之細胞株。在特定實施例中，陽性選擇卡匣包括針對新黴素(neomycin)、潮黴素(hygromycin)、安比西林(ampicillin)、嘌呤黴素(puromycin)、博萊黴素(phleomycin)、佐黴素(zeomycin)、殺稻瘟菌素(blasticidin)、紫黴素(viomycin)之抗性基因。在特定實施例中，陽性選擇卡匣包括提供對甲胺喋呤之抗性之DHFR (二氫葉酸還原酶)基因、負責對O6 BG/BCNU之抗性之MGMT P140K基因、負責HAT選擇培養基中存在之特定鹼基(胺基喋呤、次黃嘌呤、胸苷)之轉型的HPRT (次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶)基因及關於一些藥物之解毒的其他基因。在特定實施例中，選擇劑包括新黴素、潮黴素、嘌呤黴素、博萊黴素、佐黴素、殺稻瘟菌素、紫黴素、安比西林、O6 BG/BCNU、甲胺喋呤、四環素、胺基喋呤、次黃嘌呤、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA。
在特定實施例中，陰性選擇卡匣包括用於將培養基中存在之受質轉型為對表現基因之細胞有毒之物質的基因。此等分子包括白喉毒素(DTA)之解毒基因(Yagi等人, Anal Biochem . 214(1):77-86, 1993；Yanagawa等人,Transgenic Res. 8(3):215-221, 1999)、對更昔洛韋(ganciclovir)或FIAU之存在敏感的疱疹病毒之激酶胸苷基因(HSV TK)。藉由添加6-硫代鳥嘌呤(6TG)至培養基中，HPRT基因亦可用作陰性選擇，且對於所有陽性及陰性選擇，來自不同來源之多聚A轉錄終止序列，最經典來源於SV40多聚A或真核基因多聚A (牛生長激素、兔β-球蛋白等)。
在特定實施例中，選擇卡匣包括如Olszko等人(Gene Therapy 22: 591-595, 2015)中所述之MGMT P140K。在特定元件中，選擇劑包括O6 BG/BCNU。
編碼人類烷基鳥嘌呤轉移酶(hAGT)之耐藥性基因MGMT為賦予對烷基化劑(諸如亞硝基脲(nitrosourea)及替莫唑胺(temozolomide，TMZ))之細胞毒性作用抗性之DNA修復蛋白。6-苄基鳥嘌呤(6-BG)為增強亞硝基脲毒性之AGT抑制劑，且與TMZ共投與以增強此藥劑之細胞毒性作用。編碼AGT之變異體的MGMT之若干突變形式對藉由6-BG之失活具有高度抗性，但保留其修復DNA損傷之能力(Maze等人,J. Pharmacol. Exp. Ther. 290: 1467-1474, 1999)。已展示基於P140KMGMT 之抗藥性基因療法賦予小鼠、犬科動物、恆河猴及人類細胞，尤其造血細胞化學保護(Zielske等人,J. Clin. Invest. 112: 1561-1570, 2003；Pollok等人,Hum. Gene Ther. 14: 1703-1714, 2003；Gerull等人,Hum. Gene Ther . 18: 451-456, 2007；Neff等人,Blood 105: 997-1002, 2005；Larochelle等人,J. Clin. Invest . 119: 1952-1963, 2009；Sawai等人,Mol. Ther . 3: 78-87, 2001)。
在特定實施例中，與活體內選擇卡匣組合將為在無基因校正之細胞之選擇性優勢下針對疾病之關鍵組分。舉例而言，在SCID及一些其他免疫缺乏症及FA中，經校正細胞具有優勢且僅將治療性基因轉導至「少數」HSPC中足以用於治療功效。對於細胞未展現競爭優勢之其他疾病，如血紅素病(亦即鐮狀細胞疾病及地中海貧血症)，活體內選擇基因校正之細胞，諸如與活體內選擇卡匣(諸如MGMT P140K)組合，將選擇少數經轉導之HSPC，使得能夠增加基因校正之細胞且以便達成治療功效。此方法亦可藉由在活體內使得HSPC對HIV具有抗性而非離體基因修飾來應用於HIV。
(VII-c-v) 填充序列
在特定實施例中，載體包括填充序列。在特定實施例中，可添加填充序列以使得載體基因體之尺寸接近野生型長度。填充為此項技術中一般公認之術語，其意欲定義意欲延伸長度之功能惰性序列。
填充序列用於實現載體之有效包裝及穩定性。在特定實施例中，填充序列用於使得載體基因體尺寸在野生型病毒尺寸的70%與110%之間。
填充序列可為任何DNA，較佳為哺乳動物來源。在本發明之一較佳實施例中，填充序列為哺乳動物來源之非編碼序列，例如內含子片段。
當用於將載體之尺寸保持為預定尺寸時，填充序列可為允許載體基因體在分裂或非分裂細胞中保持穩定之任何非編碼之編碼序列。此等序列可來源於其他病毒基因體(例如艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein bar virus))或生物體(例如酵母)。舉例而言，此等序列可為著絲點及/或端粒之功能部分。
(VII-d) 輔助病毒依賴型腺病毒載體
輔助病毒依賴型腺病毒載體(HDAd)經工程改造以缺乏所有病毒編碼序列，有效轉導各種細胞類型，且可介導長期轉殖基因表現且慢性毒性可忽略。病毒編碼序列之缺失且僅留下載體基因體複製(ITR)及衣殼化(ψ)所需之順式作用元件，減少針對Ad載體之細胞免疫反應。HDAd載體具有高達37 kb之大選殖容量，允許遞送大負載。此等負載可包括大治療性基因或甚至多種轉殖基因及大調控組件以增強、延長及調控轉殖基因表現。與其他腺病毒載體相同，HDAd基因體保持游離且不與宿主基因體併合(Rosewell等人,J Genet Syndr Gene Ther. 增刊 5:001, 2011)。
在一些HDAd載體系統中，一種病毒基因體(輔助)編碼複製所需之所有蛋白質但在包裝序列中具有條件性缺陷，使得其不大可能包裝成病毒體。第二病毒基因體僅包括病毒反向末端重複序列(ITR)、治療性負載及正常包裝序列，此允許此第二病毒基因體選擇性地包裝至HDAd病毒載體中且自生產細胞分離。HDAd病毒載體可藉由物理手段自輔助載體進一步純化。一般而言，HDAd病毒載體及HDAd病毒載體調配物中輔助載體及/或輔助基因體之一些污染可能發生且可容許。
在一些HDAd載體系統中，輔助基因體利用Cre/loxP系統。在某些此類HDAd載體系統中，HDAd供體載體基因體包括500 bp非編碼腺病毒DNA，其包括載體基因體複製所需之腺病毒ITR，及作為載體基因體衣殼化至衣殼中所需之包裝序列的ψ。亦已觀測到，當HDAd供體載體基因體之總長度為約27.7 kb至約37 kb時，其可最有效地包裝，該長度可由例如治療性負載及或「填充」序列構成。HDAd供體載體基因體可遞送至細胞，諸如表現Cre重組酶之293細胞，視情況其中該HDAd供體載體基因體以非病毒載體形式，諸如細菌質體形式遞送至細胞(例如其中HDAd供體載體基因體構築為細菌質體(pHDAd)且藉由限制酶消化釋放)。相同細胞可經輔助基因體轉導，該輔助基因體可包括帶有側接loxP位點之包裝序列的E1缺失之Ad載體，使得在表現Cre重組酶之293細胞感染之後，藉由loxP位點之間的Cre介導之位點特異性重組自輔助基因體切除包裝序列。因此，HDAd供體載體基因體可轉染至293細胞中，該等細胞表現Cre且經帶有側接loxP位點之包裝信號(ψ)的輔助基因體轉導，使得Cre介導之ψ切除致使輔助病毒基因體無法包裝，但仍能夠提供用於HDAd傳播必需之所有反式作用因子。在切除包裝序列之後，輔助基因體無法包裝，但仍能夠進行DNA複製且因此反式補充HDAd供體載體基因體之複製及衣殼化。在一些實施例中，為防止因293細胞中存在之輔助與HDAd供體載體基因體之間的同源重組而產生複製勝任型Ad (RCA；E1+ )，可將「填充」序列插入至E3區中以使得任何E1+ 重組體太大而不能包裝。已使用FLP (例如FLPe)/frt位點特異性重組開發類似HDAd產生系統，其中側接輔助基因體之包裝信號的frt位點之間的FLP介導之重組針對表現FLP之293細胞中輔助基因體之衣殼化進行選擇。已開發出針對輔助載體選擇之替代性策略。
HDAd5/35載體為具有Ad35纖維旋鈕及Ad5軸之輔助病毒依賴型嵌合Ad5/35載體。HDAd5/35++載體為具有突變Ad35纖維旋鈕之輔助病毒依賴型嵌合Ad5/35載體。使載體突變以使對CD46之親和力增加25倍且使細胞轉導效率在較低感染倍率(MOI)下增加(Li及Lieber,FEBS Letters , 593(24): 3623-3648, 2019)。HDAd35載體為輔助病毒依賴型Ad35載體。HDAd35++載體係具有增強其與CD46之親和力且增加細胞轉導效率之突變Ad35纖維旋鈕的輔助病毒依賴型Ad35載體。
(VII-e) 載體靶向細胞類型 ( 及載體分子目標 )
(VII-e-i) HSC
在特定實施例中，載體靶向細胞類型包括造血幹細胞(HSC)。HSC藉由結合CD46而靶向以進行活體內基因修飾。載體可包括增加CD46結合之特異性及/或強度之突變。HSC亦可藉由以下標記物概況鑑別：CD34+、Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ (HSC1)及CD34+CD38-CD45RA-CD90- CD49f+ (HSC2)。人類HSC1可藉由以下概況鑑別：CD34+/CD38-/CD45RA-/CD90+或CD34+/CD45RA-/CD90+且小鼠LT-HSC可藉由Lin-Sca1+ckit+CD150+CD48-Flt3-CD34-鑑別(其中Lin表示缺乏包括CD3、Cd4、CD8、CD11b、CD11c、NK1.1、Gr1及TER119之成熟細胞之任何標記物的表現)。在特定實施例中，HSC由CD164+概況鑑別。在特定實施例中，HSC藉由CD34+/CD164+概況鑑別。關於HSC標記物概況之額外資訊，參見WO2017/218948。
(VII-e-ii) T 細胞
已發現數個不同子集之T細胞，其各自具有獨特功能。舉例而言，大多數T細胞具有呈若干蛋白質之複合體存在的T細胞受體(TCR)。實際T細胞受體由兩個分開的肽鏈構成，該等肽鏈由獨立之T細胞受體α及β (TCRα及TCRβ)基因產生且稱為α-及β-TCR鏈。
γδ T細胞代表在表面上具有獨特T細胞受體(TCR)之T細胞之較小子集。在γδ T細胞中，TCR由一條γ-鏈及一條δ-鏈組成。此組T細胞不如αβ T細胞常見(佔總T細胞2%)。
CD3在所有成熟T細胞上表現。活化T細胞表現4-1BB (CD137)、CD69及CD25。CD5及運鐵蛋白受體亦在T細胞上表現。
T細胞可進一步分為輔助細胞(CD4+ T細胞)及細胞毒性T細胞(CTL、CD8+ T細胞)，包括細胞溶解T細胞。T輔助細胞在免疫過程中幫助其他白血球，尤其包括B細胞成熟為漿細胞及細胞毒性T細胞及巨噬細胞之活化。由於此等細胞在其表面上表現CD4蛋白，因此其亦稱為CD4+ T細胞。當輔助T細胞藉由在抗原呈遞細胞(APC)之表面上表現的MHC II類分子呈現肽抗原時，其變得活化。在活化後，其快速分裂且分泌調控或幫助活性免疫反應之稱為細胞介素的小型蛋白質。
細胞毒性T細胞破壞病毒感染細胞及腫瘤細胞，且亦與移植排斥反應有關。由於此等細胞在其表面上表現CD8糖蛋白，因此其亦稱為CD8+ T細胞。此等細胞藉由結合於在身體幾乎每個細胞之表面上存在的與MHC I類相關之抗原來識別其目標。
在特定實施例中，CAR經遺傳修飾以在細胞毒性T細胞中表現。
如本文所用之「中心記憶」T細胞(或「TCM」)係指在其表面上表現CD62L或CCR7及CD45RO且與原始細胞相比不表現或具有降低之CD45RA表現的經歷抗原之CTL。在特定實施例中，中心記憶細胞對CD62L、CCR7、CD25、CD127、CD45RO及CD95之表現呈陽性，且與原始細胞相比具有降低之CD45RA之表現。
如本文所用之「效應記憶」T細胞(或「TEM」)係指與中心記憶細胞相比在其表面上不表現或具有降低之CD62L表現且與原始細胞相比不表現或具有降低之CD45RA表現的經歷抗原之T細胞。在特定實施例中，與原始細胞或中心記憶細胞相比，效應記憶細胞對於CD62L及CCR7之表現為陰性的，且具有CD28及CD45RA之可變表現。與記憶或原始T細胞相比，效應T細胞對於顆粒酶B及穿孔蛋白呈陽性。
如本文所用之「原始」T細胞係指與中央或效應記憶細胞相比，表現CD62L及CD45RA且不表現CD45RO之未經歷抗原之T細胞。在特定實施例中，原始CD8+ T淋巴球之特徵在於原始T細胞之表型標記物之表現，包括CD62L、CCR7、CD28、CD127及CD45RA。
細胞或細胞群體對於或表現特定標記物呈「陽性」之表述係指特定標記物可偵測地存在於細胞上或細胞內。在提及表面標記物時，該術語可指如藉由流動式細胞量測術，例如藉由用與標記物特異性結合之抗體染色及偵測該抗體偵測到存在表面表現，其中該染色可藉由流動式細胞量測術在以下程度上偵測到：實質上超過使用同型匹配對照在其他方面相同的條件下執行相同程序所偵測到的染色的程度，及/或實質上類似於已知對標記物呈陽性之細胞的染色的程度，及/或實質上高於已知對標記物呈陰性之細胞的染色的程度。
細胞或細胞群體對於特定標記物呈「陰性」或缺乏標記物之表現的表述係指特定標記物在細胞上或細胞內之存在實質上不可偵測。在提及表面標記物時，該術語可指如藉由流動式細胞量測術，例如藉由用與標記物特異性結合之抗體染色及偵測該抗體偵測到缺乏表面表現，其中該染色可藉由流動式細胞量測術在以下程度上未偵測到：實質上超過使用同型匹配對照在其他方面相同的條件下執行相同程序所偵測到的染色的程度，及/或實質上低於已知對標記物呈陽性之細胞的染色的程度，及/或與已知對標記物呈陰性之細胞的染色相比實質上類似的程度。
(VII-e-iii) B 細胞
B細胞為體液反應之介體，且負責產生及釋放對抗原具有特異性之抗體。存在若干類型之B細胞，其可藉由關鍵標記物表徵。一般而言，不成熟B細胞表現CD19、CD20、CD34、CD38及CD45R，且當其成熟時，關鍵表現標記物為CD19及IgM。
(VII-e-iv) 腫瘤
在特定實施例中，載體可靶向腫瘤。在特定實施例中，腫瘤係藉由存在於腫瘤細胞上且不存在於健康細胞上之靶向受體靶向。腫瘤可藉由結合αv整聯蛋白而靶向以進行活體內基因修飾。αv整聯蛋白在血管生成中起重要作用。αvβ3及αvβ5整聯蛋白在正常內皮細胞中不存在或表現量低，但在腫瘤之血管生成脈管中誘發(Brooks等人,Cell , 79: 1157-1164, 1994；Hammes等人,Nature Med, 2: 529-533, 1996)。最近已鑑別胺基肽酶N/CD13為NGR模體之血管生成受體(Burg等人,Cancer Res , 59:2869-74, 1999)。胺基肽酶N/CD13在癌症之血管生成血管及其他血管生成組織中強烈表現。
在特定實施例中，載體可藉由靶向癌細胞抗原之抗原決定基而靶向腫瘤。癌細胞抗原由癌細胞或腫瘤表現。
在特定實施例中，癌細胞抗原之抗原決定基優先由癌細胞表現。「優先表現」意謂發現與其他細胞類型相比，癌細胞上癌細胞抗原之含量較高。在一些情況下，癌症抗原之抗原決定基僅由靶向之癌細胞類型表現。在其他情況下，靶向之癌細胞類型上之癌症抗原表現量比非靶向細胞多至少25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
在特定實施例中，癌細胞抗原在癌性及健康組織上顯著表現。在特定實施例中，顯著表現意謂基於癌外在靶毒性，在研發期間停止使用雙特異性抗體。在特定實施例中，顯著表現意謂基於癌外在靶毒性，雙特異性抗體之使用需要關於潛在不良副作用之警告。作為一個實例，西妥昔單抗(cetuximab)為與被認為歸因於皮膚中之EGFR表現的重度皮疹有關之抗EGFR抗體。另一實例為Herceptin (曲妥珠單抗)，其為抗HER2 (ERBB2)抗體。由於心臟中之目標表現，所以Herceptin引起心臟毒性。此外，由於肺中之癌外在靶表現，所以使用CAR-T細胞靶向Her2引起患者死亡。
表3提供更可能在特定癌症類型中共表現之癌症抗原的實例。
表 3 ：
可能共表現之癌症抗原 癌症類型
CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33、CD56、CLL-1、WT-1、CD123、PD-L1、EFGR 白血病/淋巴瘤
B細胞成熟抗原(BCMA)、PD-L1、EFGR 多發性骨髓瘤
PSMA、WT1、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、SV40 T、PD-L1、EFGR 前列腺癌
HER2、ERBB2、ROR1、PD-L1、EFGR、MUC16、葉酸受體(FOLR)、CEA 乳癌
CD133、PD-L1、EFGR 幹細胞癌症
L1-CAM、MUC16、FOLR、Lewis Y、ROR1、間皮素、WT-1、PD-L1、EFGR、CD56 卵巢癌
間皮素、PD-L1、EFGR 間皮瘤
羧基脫水酶-IX (CAIX)；PD-L1、EFGR 腎細胞癌
GD2、PD-L1、EFGR 黑色素瘤
間皮素、CEA、CD24、ROR1、PD-L1、EFGR、MUC16 胰臟癌
ROR1、PD-L1、EFGR、間皮素、MUC16、FOLR、CEA、CD56 肺癌
間皮素、PD-L1、EFGR 膽管癌
MUC16、PD-L1、EFGR， 膀胱癌
ROR1、磷脂肌醇蛋白聚醣-2、CD56、雙唾液酸神經節苷脂、PD-L1、EFGR， 神經母細胞瘤
CEA、PD-L1、EFGR， 大腸直腸癌
CD56、PD-L1、EFGR， 梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)
在更特定實例中，癌細胞抗原包括：間皮素、MUC16、FOLR、PD-L1、ROR1、磷脂肌醇蛋白聚醣-2 (GPC2)、雙唾液酸神經節苷脂(GD2)、HER2、EGFR、EGFRvIII、CEA、CD56、CLL-1、CD19、CD20、CD123、CD30、CD33 (全長)、CD33 (δE2變異體)、CD33 (C端截短)、BCMA、IGFR、MUC1、VEGFR、PSMA、PSCA、IL13Ra2、FAP、EpCAM、CD44、CD133、Tro-2、CD200、FLT3、GCC及WT1。如一般技術者所瞭解，靶向抗原可缺乏信號肽。
CD56，亦稱為神經細胞黏附分子1 (NCAM1)，係涉及細胞-細胞及細胞-基質黏附之I型膜醣蛋白。其細胞外域在N端處具有五個IgG樣域且在膜近區中具有兩個纖維結合蛋白III型域。
雙唾液酸神經節苷脂GalAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1Cer (GD2)在各種腫瘤上表現，包括神經母細胞瘤。雙唾液酸神經節苷脂抗原GD2包括由唾液酸及脂質殘基側接之寡醣主鏈。參見例如Cheresh (Surv. Synth. Pathol. Res . 4:97, 1987)及美國專利第5,653,977號。
EGFR變異體III (EGFRvIII)(EGFR之一種腫瘤特異性突變體)係常與野生型EGFR基因擴增相關之基因體重排產物。EGFRvIII藉由外顯子2-7之同框缺失形成，導致267個胺基酸缺失及接合處之甘胺酸取代。截短之受體失去其結合配位體之能力，但獲得組成性激酶活性。有趣的是，EGFRvIII在相同腫瘤細胞中常與全長野生型EGFR共表現。此外，EGFRvIII表現細胞展現增加之增殖、侵入、血管生成及對細胞凋亡之抗性。
最常在多形性膠質母細胞瘤(GBM)中發現EGFRvIII。據估計，25-35%之GBM攜帶此截短受體。此外，其表現通常反映更具侵襲性之表型及不良預後。除GBM以外，亦在其他實體腫瘤，諸如非小細胞肺癌、頭頸癌、乳癌、卵巢癌及前列腺癌中報導EGFRvIII之表現。相比之下，EGFRvIII未在健康組織中表現。
在特定實施例中，靶向之癌症抗原之抗原決定基可藉由靶向之癌細胞或腫瘤高表現或藉由靶向之癌細胞或腫瘤低表現。在特定實施例中，高表現及低表現可使用流動式細胞量測術或螢光活化細胞分選術(FAC)來測定。如流動式細胞量測術之一般技術者所理解，「hi」、「lo」、「+」及「-」係指相對於陰性或其他群體之信號強度。在特定實施例中，陽性表現(+)意謂在細胞上使用流動式細胞量測術可偵測到標記物。在特定實施例中，陰性表現(-)意謂在細胞上使用流動式細胞量測術無法偵測到標記物。在特定實施例中，「hi」意謂如藉由螢光(使用例如FACS)所量測，所關注標記物之陽性表現比表現亦呈陽性之其他細胞更明亮。在此等實施例中，一般技術者認識到，亮度係基於偵測閾值。一般而言，熟習此項技術者將首先分析陰性對照管，且藉由FSC及SSC設定所關注群體周圍之閘控(點陣圖)且調節所需發射波長下的光電倍增管電壓及螢光增益，使得在陰性對照下97%細胞對於螢光標記物呈現未染色。一旦建立此等參數，分析染色細胞，且記錄相對於未染色螢光細胞群體之螢光。在特定實施例中，且代表典型FACS圖，hi意指最右側(x線)或最高頂部線(右上方或左側)，而lo意指在左下部象限內或在右側象限與左側象限之間的中間(但相對於陰性群體移位)。在特定實施例中，「hi」係指相對於+細胞，可偵測螢光增加超過+之20倍，超過+之30倍、超過+之40倍、超過+之50倍、超過+之60倍、超過+之70倍、超過+之80倍、超過+之90倍、超過+之100倍或更多。相反地，「lo」可指定義為「hi」者之互逆群體。
(VII-e-v) 其他目標
除HSC、T細胞、B細胞及腫瘤(或癌細胞)以外，載體可靶向細菌及真菌之其他抗原。
靶向細菌之抗原可來源於例如以下各者：炭疽、革蘭氏陰性桿菌、披衣菌、白喉、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、百日咳毒素、肺炎球菌、立克次體(rickettsiae)、葡萄球菌、鏈球菌及破傷風。
作為細菌抗原標記物之特定實例，炭疽抗原包括炭疽保護性抗原；革蘭氏陰性桿菌抗原包括脂多醣；白喉抗原包括白喉毒素；結核分支桿菌抗原包括分枝菌酸、熱休克蛋白65 (HSP65)、30 kDa主要分泌蛋白及抗原85A；百日咳毒素抗原包括紅血球凝集素、百日咳桿菌黏附素、FIM2、FIM3及腺苷酸環化酶；肺炎球菌抗原包括肺炎鏈球菌溶血素及肺炎球菌莢膜多醣；立克次體抗原包括rompA；鏈球菌抗原包括M蛋白質；且破傷風抗原包括破傷風毒素。
靶向真菌之抗原可來源於例如念珠菌、球孢子菌、隱球菌、組織漿菌、利什曼原蟲、瘧原蟲、原生動物、寄生蟲、血吸蟲、皮黴菌、弓蟲及克氏錐蟲。
作為真菌抗原之特定實例，球孢子菌抗原包括球粒抗原；隱球菌抗原包括莢膜多醣；組織漿菌抗原包括熱休克蛋白60 (HSP60)；利什曼原蟲抗原包括gp63及脂磷酸聚糖；惡性瘧原蟲抗原包括裂體性孢子表面抗原、子孢子表面抗原、環子孢子抗原、配子母細胞/配子表面抗原、原蟲及其他寄生蟲抗原，包括血液階段抗原pf 155/RESA；血吸蟲抗原，包括麩胱甘肽-S-轉移酶及副肌球蛋白(paramyosin)；皮黴菌真菌抗原包括發癬菌素；弓蟲抗原包括SAG-1及p30；且克氏錐蟲抗原包括75-77 kDa抗原及56 kDa抗原。
(VII-f) 示例載體
在特定實施例中，載體包括具有負載、LCR、調控組件、併合元件、選擇卡匣及填充序列之HDAd5/35++載體。在特定實施例中，負載包括人類γ-球蛋白基因。在特定實施例中，LCR包括β-球蛋白LCR。在特定實施例中，調控組件包括β-球蛋白啟動子。在特定實施例中，併合元件包括睡美人100X轉位酶。在特定實施例中，選擇卡匣包括MGMT (P140K)。在特定實施例中，載體進一步包括EF1α啟動子。
在各種實施例中，包括本發明之LCR (諸如長LCR)的載體使可操作地連接之編碼核酸序列例如在目標細胞類型或組織(諸如其中LCR控制表現之細胞類型或組織，如表1中所示)中的表現增加。在各種實施例中，與不包括LCR之參考載體相比，包括本發明之LCR的載體使可操作地連接之編碼核酸序列在例如目標細胞類型或組織中的表現增加。在各種實施例中，與不包括長LCR之參考載體，例如包括較短LCR、諸如微型LCR之參考載體相比，包括本發明之LCR的載體使可操作地連接之編碼核酸序列在例如目標細胞類型或組織中的表現增加。在各種實施例中，增加可為增加參考表現量之至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，包括本發明之LCR (諸如長LCR)的載體引起可操作地連接之編碼核酸序列的表現為參考內源性編碼核酸序列在健康個體中，例如在目標細胞類型或組織中之參考表現量的至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
在一些實施例中，包括本發明之LCR (諸如長LCR)的載體使可操作地連接之編碼核酸序列在一或多種非目標細胞類型或組織(諸如並非表1中示為其中LCR控制表現之細胞類型或組織的細胞類型或組織的細胞類型或組織)中的表現減少。在各種實施例中，與不包括LCR之參考載體相比，包括本發明之LCR (諸如長LCR)的載體使可操作地連接之編碼核酸序列在一或多種非目標細胞類型或組織中的表現減少。在各種實施例中，與不包括長LCR之參考載體，例如包括較短LCR、諸如微型LCR之參考載體相比，包括本發明之LCR (諸如長LCR)的載體使可操作地連接之編碼核酸序列在一或多種非目標細胞類型或組織中的表現減少。在各種實施例中，減少可為減少參考表現量之至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。例如，在特定實施例中，與不包括β-球蛋白長LCR之參考載體，例如包括較短LCR、諸如β-球蛋白微型LCR之參考載體相比，β-球蛋白長LCR之使用使可操作地連接之編碼核酸序列(諸如編碼γ-球蛋白或β-球蛋白之編碼序列)在非紅血球系細胞中的表現減少。
如熟習此項技術者應瞭解，在目標細胞及/或組織中之表現增加(例如，由使用本發明之長LCR，諸如長LCR引起)降低載體在基因療法中之最小治療有效劑量且因此降低最小治療有效劑量之免疫毒性及/或免疫毒性風險。熟習此項技術者將進一步瞭解，在非目標細胞及/或組織中之表現減少(例如，由使用本發明之長LCR，諸如長LCR產生)降低免疫毒性及/或免疫毒性風險，在某些特定實例中，使用β-球蛋白長LCR增加可操作地連接之編碼核酸序列在造血幹細胞中之表現及/或減少可操作地連接之編碼核酸序列在非紅血球系細胞中之表現，藉此降低基因療法免疫毒性及/或其風險。在各種實施例中，在目標細胞中增加的自病毒載體轉位子負載之表現及/或由於免疫毒性降低而遞送較大劑量之病毒載體的能力提高可在接受基因療法之個體之目標細胞或組織中達成的由轉位子負載編碼之藥劑的總表現。因此，與諸如不包括LCR或不包括長LCR之參考載體的參考載體相比，包括本發明之LCR (諸如長LCR)的載體可提供增加之治療功效。
(VIII) 調配物
本文所述之腺病毒供體載體、大負載腺病毒載體、腺病毒基因體及腺病毒系統可調配用於投與個體。調配物包括與治療性基因(「活性成分」)相關之重組大負載腺病毒載體、腺病毒基因體及/或腺病毒系統及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
在特定實施例中，調配物包括以下量之活性成分：至少調配物之0.1% w/v或w/w；至少調配物之1% w/v或w/w；至少調配物之10% w/v或w/w；至少調配物之20% w/v或w/w；至少調配物之30% w/v或w/w；至少調配物之40% w/v或w/w；至少調配物之50% w/v或w/w；至少調配物之60% w/v或w/w；至少調配物之70% w/v或w/w；至少調配物之80% w/v或w/w；至少調配物之90% w/v或w/w；至少調配物之95% w/v或w/w；或至少調配物之99% w/v或w/w。
示例性的常用醫藥學上可接受之載劑包括任何及所有吸收延遲劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝劑、增積劑或填充劑、螯合劑、包衣、崩解劑、分散介質、凝膠、等張劑、潤滑劑、防腐劑、鹽、溶劑或共溶劑、穩定劑、界面活性劑及/或遞送媒劑。
示例性抗氧化劑包括抗壞血酸、甲硫胺酸及維生素E。
示例性緩衝劑包括檸檬酸鹽緩衝液、丁二酸鹽緩衝液、酒石酸鹽緩衝液、反丁烯二酸鹽緩衝液、葡糖酸鹽緩衝液、草酸鹽緩衝液、乳酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、組胺酸緩衝液及/或三甲胺鹽。
一種示例性螯合劑為EDTA。
其他等張劑包括多羥基糖醇，包括三元醇或高級糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
示例性防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苯甲銨、鹵化苯甲烴銨、氯化六羥季銨、對羥基苯甲酸烷基酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇及3-戊醇。
穩定劑係指廣泛類別之賦形劑，其功能可在增積劑至使活性成分溶解或有助於防止變性或黏附於容器壁上之添加劑的範圍內。典型的穩定劑可包括多羥基糖醇；胺基酸，諸如精胺酸、離胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L-白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸及蘇胺酸；有機糖或糖醇，諸如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌肉肌醇、半乳糖醇、甘油及環醇，諸如肌醇；PEG；胺基酸聚合物；含硫還原劑，諸如脲、麩胱甘肽、硫辛酸、巰乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量多肽(亦即，＜10個殘基)；蛋白質，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；單醣，諸如木糖、甘露糖、果糖及葡萄糖；雙醣，諸如乳糖、麥芽糖及蔗糖；三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如聚葡萄糖。以治療劑重量計，穩定劑通常以0.1至10,000重量份範圍存在。
本文所揭示之調配物可經調配以用於藉由例如注射投與。對於注射，調配物可調配為水溶液，諸如在包括漢克氏溶液(Hanks'solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理食鹽水之緩衝液中；或在培養基中，諸如伊氏改良達爾伯克培養基(IMDM)。水溶液可包括調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，調配物可呈在使用之前用適合媒劑(例如無菌無熱原質水)復原之凍乾及/或粉末形式。
本文所揭示之任何調配物宜包括任何其他醫藥學上可接受之載劑，包括不產生顯著不良、過敏或超過投藥益處之其他不良反應的載劑。示例性醫藥學上可接受之載劑及調配物揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版. Mack Printing Company, 1990。此外，調配物可經製備以符合美國FDA生物學標準辦公室(US FDA Office of Biological Standards)及/或其他相關外國管控機構所需要的無菌性、發熱性、一般安全性及純度標準。
(IX) 應用
(IX-a) 活體內療法
本文所揭示之調配物可用於治療個體(人類、獸醫學動物(犬、貓、爬行動物、鳥類等)、家畜(馬、牛、山羊、豬、雞等)及研究用動物(猴、大鼠、小鼠、魚等)。治療個體包括遞送治療有效量。治療有效量包括提供有效量、防治性治療及/或治療性治療之量。
本文所述之調配物可與HSPC動員共同投與。在特定實施例中，投與腺病毒供體載體與一或多種動員因子同時發生。在特定實施例中，腺病毒供體載體之投與在投與一或多種動員因子之後。在特定實施例中，腺病毒供體載體之投與在第一次一或多種動員因子之投與之後且與第二次一或多種動員因子之投與同時發生。
向特定個體投與之腺病毒供體載體及在特定實施例中腺病毒供體載體及動員因子之實際劑量及量以及協同動員程序及時程可由醫師、獸醫或研究人員考慮諸如物理及生理因素之參數來確定，該等因素包括例如目標；體重；病狀類型；病狀嚴重程度；當已知時即將出現之相關事件；先前或同時治療干預；個體之特發病；及投與途徑。此外，活體外及活體內分析可視情況用於幫助鑑別最佳劑量範圍。
與治療性基因相關之腺病毒供體載體之治療有效量可包括在例如1×107 至50×108 個感染單位(IU)或5×107 至20×108 IU範圍內之劑量。在其他實例中，劑量可包括5×107 IU、6×107 IU、7×107 IU、8×107 IU、9×107 IU、1×108 IU、2×108 IU、3×108 IU、4×108 IU、5×108 IU、6×108 IU、7×108 IU、8×108 IU、9×108 IU、10×108 IU或更多。在特定實施例中，與治療性基因相關之腺病毒供體載體的治療有效量包括4×108 IU。在特定實施例中，治療有效量之與治療性基因相關之腺病毒供體載體可皮下或靜脈內投與。在特定實施例中，治療有效量之與治療性基因相關之腺病毒供體載體可在投與一或多種動員因子後投與。
在特定實施例中，G-CSF之治療有效量包括0.1 µg/kg至100 µg/kg。在特定實施例中，G-CSF之治療有效量包括0.5 µg/kg至50 µg/kg。在特定實施例中，G-CSF之治療有效量包括0.5 µg/kg、1 µg/kg、2 µg/kg、3 µg/kg、4 µg/kg、5 µg/kg、6 µg/kg、7 µg/kg、8 µg/kg、9 µg/kg、10 µg/kg、11 µg/kg、12 µg/kg、13 µg/kg、14 µg/kg、15 µg/kg、16 µg/kg、17 µg/kg、18 µg/kg、19 µg/kg、20 µg/kg或更多。在特定實施例中，G-CSF之治療有效量包括5 µg/kg。在特定實施例中，G-CSF可皮下或靜脈內投與。在特定實施例中，G-CSF可投與1天、連續2天、連續3天、連續4天、連續5天或更長時間。在特定實施例中，G-CSF可投與連續4天。在特定實施例中，G-CSF可投與連續5天。在特定實施例中，作為單一藥劑，G-CSF可以10 µg/kg之劑量每日皮下使用，在腺病毒供體載體遞送之前3、4、5、6、7或8天開始。在特定實施例中，G-CSF可作為單一藥劑投與，隨後同時投與另一動員因子。在特定實施例中，G-CSF可作為單一藥劑投與，隨後同時投與AMD3100。在特定實施例中，治療方案包括5天治療，其中可在第1天、第2天、第3天及第4天及第5天投與G-CSF，在腺病毒供體載體投與之前6至8小時投與G-CSF及AMD3100。
待投與之GM-CSF之治療有效量可包括在例如0.1至50 µg/kg或0.5至30 µg/kg範圍內之劑量。在特定實施例中，GM-CSF之投與劑量可包括0.5 µg/kg、1 µg/kg、2 µg/kg、3 µg/kg、4 µg/kg、5 µg/kg、6 µg/kg、7 µg/kg、8 µg/kg、9 µg/kg、10 µg/kg、11 µg/kg、12 µg/kg、13 µg/kg、14 µg/kg、15 µg/kg、16 µg/kg、17 µg/kg、18 µg/kg、19 µg/kg、20 µg/kg或更多。在特定實施例中，GM-CSF可投與1天、連續2天、連續3天、連續4天、連續5天或更長時間。在特定實施例中，GM-CSF可皮下或靜脈內投與。在特定實施例中，作為單一藥劑，GM-CSF可以10 µg/kg之劑量每日皮下使用，在腺病毒供體載體遞送之前3、4、5、6、7或8天開始。在特定實施例中，GM-CSF可作為單一藥劑投與，隨後同時投與另一動員因子。在特定實施例中，GM-CSF可作為單一藥劑投與，隨後同時投與AMD3100。在特定實施例中，治療方案包括5天治療，其中可在第1天、第2天、第3天及第4天及第5天投與GM-CSF，在腺病毒供體載體投與之前6至8小時投與GM-CSF及AMD3100。沙格司亭(GM-CSF)之給藥方案可包括200 µg/m2 、210 µg/m2 、220 µg/m2 、230 µg/m2 、240 µg/m2 、250 µg/m2 、260 µg/m2 、270 µg/m2 、280 µg/m2 、290 µg/m2 、300 µg/m2 或更多。在特定實施例中，沙格司亭可投與一天、連續兩天、連續三天、連續四天、連續五天或更長時間。在特定實施例中，沙格司亭可皮下或靜脈內投與。在特定實施例中，沙格司亭之給藥方案可包括靜脈內或皮下每天250 µg/m2 且可繼續投與，直至周邊血液中達到目標細胞量或可繼續5天。在特定實施例中，沙格司亭可作為單一藥劑投與，隨後同時投與另一動員因子。在特定實施例中，沙格司亭可作為單一藥劑投與，隨後同時投與AMD3100。在特定實施例中，治療方案包括5天治療，其中可在第1天、第2天、第3天及第4天及第5天投與沙格司亭，在腺病毒供體載體投與之前6至8小時投與沙格司亭及AMD3100。
在特定實施例中，AMD3100之治療有效量包括0.1 mg/kg至100 mg/kg。在特定實施例中，AMD3100之治療有效量包括0.5 mg/kg至50 mg/kg。在特定實施例中，AMD3100之治療有效量包括0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/kg、20 mg/kg或更多。在特定實施例中，AMD3100之治療有效量包括4 mg/kg。在特定實施例中，AMD3100之治療有效量包括5 mg/kg。在特定實施例中，AMD3100之治療有效量包括10 µg/kg至500 µg/kg或50 µg/kg至400 µg/kg。在特定實施例中，AMD3100之治療有效量包括100 µg/kg、150 µg/kg、200 µg/kg、250 µg/kg、300 µg/kg、350 µg/kg或更多。在特定實施例中，AMD3100可皮下或靜脈內投與。在特定實施例中，AMD3100可在腺病毒供體載體遞送之前6至11小時以160-240 µg/kg皮下投與。在特定實施例中，治療有效量之AMD3100可與另一動員因子之投與同時投與。在特定實施例中，可在投與另一動員因子後投與治療有效量之AMD3100。在特定實施例中，治療有效量之AMD3100可在投與G-CSF之後投與。在特定實施例中，治療方案包括5天治療，其中在第1天、第2天、第3天及第4天及第5天投與G-CSF，在腺病毒供體載體注射之前6至8小時投與G-CSF及AMD3100。
待投與之SCF之治療有效量可包括在例如每天0.1至100 µg/kg或每天0.5至50 µg/kg範圍內之劑量。在特定實施例中，SCF之投與劑量可包括每天0.5 µg/kg、每天1 µg/kg、每天2 µg/kg、每天3 µg/kg、每天4 µg/kg、每天5 µg/kg、每天6 µg/kg、每天7 µg/kg、每天8 µg/kg、每天9 µg/kg、每天10 µg/kg、每天11 µg/kg、每天12 µg/kg、每天13 µg/kg、每天14 µg/kg、每天15 µg/kg、每天16 µg/kg、每天17 µg/kg、每天18 µg/kg、每天19 µg/kg、每天20 µg/kg、每天21 µg/kg、每天22 µg/kg、每天23 µg/kg、每天24 µg/kg、每天25 µg/kg、每天26 µg/kg、每天27 µg/kg、每天28 µg/kg、每天29 µg/kg、每天30 µg/kg或更多。在特定實施例中，SCF可投與1天、連續2天、連續3天、連續4天、連續5天或更長時間。在特定實施例中，SCF可皮下或靜脈內投與。在特定實施例中，SCF可以每天20 µg/kg皮下注射。在特定實施例中，SCF可作為單一藥劑投與，隨後同時投與另一動員因子。在特定實施例中，SCF可作為單一藥劑投與，隨後同時投與AMD3100。在特定實施例中，治療方案包括5天治療，其中可在第1天、第2天、第3天及第4天及第5天投與SCF，在腺病毒供體載體投與之前6至8小時投與SCF及AMD3100。
在特定實施例中，可投與生長因子GM-CSF及G-CSF以將骨髓小生境中之HSPC動員至周邊循環血液，從而增加血液中循環之HSPC分數。在特定實施例中，動員可藉由投與G-CSF/非格司亭(Amgen)及/或AMD3100 (Sigma)實現。在特定實施例中，動員可藉由投與GM-CSF/沙格司亭(Amgen)及/或AMD3100 (Sigma)實現。在特定實施例中，動員可藉由投與SCF/安西司亭(Ancestim)(Amgen)及/或AMD3100 (Sigma)實現。在特定實施例中，G-CSF/非格司亭之投與在投與AMD3100之前。在特定實施例中，投與G-CSF/非格司亭與AMD3100之投與同時發生。在特定實施例中，G-CSF/非格司亭之投與在投與AMD3100之前，接著同時投與G-CSF/非格司亭及AMD3100。US 20140193376描述利用CXCR4拮抗劑與S1P受體1 (S1PR1)調節劑之動員方案。US 20110044997描述利用CXCR4拮抗劑與血管內皮生長因子受體(VEGFR)促效劑之動員方案。
治療性大負載腺病毒載體可在與投與類固醇、IL-1受體拮抗劑及/或IL-6受體拮抗劑同時或之後投與。此等方案可緩解潛在的治療副作用。
已知IL-1受體拮抗劑且包括ADC-1001 (Alligator Bioscience, Lund, Sweden)、FX-201 (Flexion Therapeutics, Burlington, MA)、可自Bioasis Technologies獲得之融合蛋白(Richmond, Canada)、GQ-303 (Genequine Biotherapeutics GmbH, Hamburg, Germany)、HL-2351 (Handok, Inc., Seoul, South Korea)、MBIL-1RA (ProteoThera, Inc., Newton, MA)、阿那白滯素(Anakinra) (Pivor Pharmaceuticals, Vancouver, Canada)、人類免疫球蛋白G或球蛋白S (GC Pharma, Gyeonggi-do, South Korea)。IL-6受體拮抗劑亦為此項技術中已知且包括托西利單抗(tocilizumab)、BCD-089 (Biocad, Russia)、HS-628 (Zhejiang Hisun Pharm, Taizhou City, China)及APX-007 (Apexigen, San Carlos, CA)。
在特定實施例中，可投與HSC富集劑，諸如CD19免疫毒素或5-FU以富集HSPC。CD19免疫毒素可用於耗乏所有CD19譜系細胞，佔骨髓細胞之30%。耗乏促進自骨髓離開。藉由迫使HSPC增殖(不論經由CD19免疫毒素還是5-FU)，此刺激其分化且自骨髓離開且增加周邊血細胞中之轉殖基因標記。
治療有效量可經由任何適當投與途徑投與，諸如藉由注射、輸注、灌注，且更具體而言藉由骨髓、靜脈內、皮內、動脈內、結節內、淋巴管內、腹膜內注射、輸注或灌注中之一或多者投與。
(IX-b) 離體療法及活體外用途
本文所提供之方法及組合物至少部分地揭示用於活體內基因療法。然而，為避免疑問，本發明明確地包括本文所提供之組合物及方法用於活體外工程改造細胞及/或組織之用途，以及包括工程改造細胞及/或組織以用於研究目的之活體外用途。
(IX-c) 治療特定血液病症 ( 例如血友病、地中海貧血症 )
在特定實施例中，本文所揭示之方法及調配物可用於治療血液病症。在特定實施例中，向個體投與調配物以治療血友病、重型β-地中海貧血症、戴-布二氏貧血症(Diamond Blackfan anemia，DBA)、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、純紅血球再生不良(PRCA)、難治性貧血、重度再生不良性貧血及/或血癌，諸如白血病、淋巴瘤及骨髓瘤。
在特定實施例中，治療有效之治療誘導或增加HbF表現，誘導或增加血紅素產生及/或誘導或增加β-球蛋白產生。在特定實施例中，治療有效之治療改善血球功能，及/或增加細胞氧合。
在特定實施例中，本發明之方法可在有需要之個體中恢復骨髓功能。在特定實施例中，恢復骨髓功能可包括比不投與本文所述之療法的有需要之個體相比，用基因校正細胞改善骨髓再生。用基因校正之細胞改善骨髓再生可包括增加經基因校正之細胞的百分比。在特定實施例中，細胞係選自白血球及骨髓衍生細胞。在特定實施例中，經基因校正之細胞之百分比可使用選自定量即時PCR及流動式細胞量測術之分析來量測。
在特定實施例中，本發明之方法可用於治療FA。在特定實施例中，治療功效可經由淋巴球復原、改良純系多樣性及胸腺產生、減少感染及/或改善患者結果來觀測。亦可經由以下中之一或多者觀測治療功效：體重增加及生長、改善胃腸道功能(例如減少腹瀉)、減少上呼吸道症狀、減少口腔真菌感染(鵝口瘡)、減少肺炎發生率及嚴重程度、減少腦膜炎及血流感染以及減少耳部感染。在特定實施例中，用本發明之方法治療FA包括增加骨髓衍生細胞對絲裂黴素C (mitomycin C，MMC)之抗性。在特定實施例中，可藉由甲基纖維素及MMC中之細胞存活分析量測骨髓衍生細胞對MMC之抗性。
(IX-c-i) 用於治療血液病症之 LCR 、啟動子、編碼序列及載體
在各種實施例中，本發明包括使用本發明之腺病毒供體載體治療血液病症，該腺病毒供體載體包括β-球蛋白長LCR、β-球蛋白啟動子及編碼用於治療血液病症之蛋白質或藥劑的編碼核酸序列。在各種實施例中，血液病症為地中海貧血症且蛋白質為β-球蛋白或γ-球蛋白蛋白質，或在其他方面部分或完全在功能上替代β-球蛋白或γ-球蛋白之蛋白質。在各種實施例中，血液病症為血友病，且蛋白質為ET3或在其他方面部分或完全在功能上替代第八因子之蛋白質。在各種實施例中，血液病症係點突變疾病，諸如鐮狀細胞貧血症，且藥劑係基因編輯蛋白質。
ET3可具有以下胺基酸序列：SEQ ID NO 99。在各種實施例中，第八因子替代蛋白可具有與SEQ ID NO: 99至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
β-球蛋白可具有以下胺基酸序列：SEQ ID NO 100。在各種實施例中，β-球蛋白替代蛋白可具有與SEQ ID NO: 100至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
γ-球蛋白可具有以下胺基酸序列：SEQ ID NO 101。在各種實施例中，γ-球蛋白替代蛋白可具有與SEQ ID NO: 101至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
(IX-c-ii) 劑量及調配物
載體可經調配以使得向細胞或動物，例如向人類投與其係醫藥學上可接受的。載體可在活體外、離體或活體內投與。在各種情況下，載體可經調配以包括醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。醫藥學上可接受之載劑之實例包括但不限於生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，及其類似物。本發明之組合物可包括醫藥學上可接受之鹽，例如酸加成鹽或鹼加成鹽。
在各種實施例中，包括如本文所述之載體(例如，注射用無菌調配物)的組合物可根據習知醫藥實踐使用注射用蒸餾水作為媒劑來調配。舉例而言，生理食鹽水或含有葡萄糖之等張溶液及其他補充劑(諸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇及氯化鈉)可用作注射水溶液，視情況與適合的增溶劑(例如醇，諸如乙醇及多元醇，諸如丙二醇或聚乙二醇)及非離子界面活性劑(諸如聚山梨醇酯80™、HCO-50及其類似物)組合。
如本文所揭示，載體可呈此項技術中已知之任何形式。此類形式包括例如液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如，可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質體及栓劑。
任何特定形式之選擇或用途可部分地視預期投與模式及治療應用而定。舉例而言，含有意欲全身性或局部遞送之組成的組合物可呈可注射或可輸注溶液形式。因此，載體可經調配以藉由非經腸模式(例如靜脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射)投與。如本文所用，非經腸投藥係指通常藉由注射之除腸及局部投藥之外的投藥模式，且包括(不限於)靜脈內、鼻內、眼內、經肺、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、肺內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、硬膜外、大腦內、顱內、頸動脈內及腦池內注射及輸注。非經腸投藥途徑可為例如藉由注射、經鼻投與、經肺投與或經皮投與來投與。投與可藉由靜脈內注射、肌肉內注射、腹膜內注射、皮下注射而為全身性或局部的。
在各種實施例中，本發明之載體可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適合於以高濃度穩定儲存之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由將所需量之本文所述組合物與上文所列舉之成分之一或組合一起併入適當溶劑中，隨後根據需要過濾滅菌來製備。一般而言，藉由將本文所述之組合物併入無菌媒劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有基礎分散介質及來自上文所列舉之成分之其他所需成分。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，利用其預先無菌過濾之溶液產生本文所述之組合物加任何其他所需成分之粉末(參見下文)。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持溶液之適當流動性。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。
載體可呈可注射調配物形式非經腸投與，該可注射調配物包括於水或另一醫藥學上可接受之液體中之無菌溶液或懸浮液。舉例而言，載體可藉由適當地組合治療性分子與醫藥學上可接受之媒劑或介質來調配，該等媒劑或介質諸如無菌水及生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、穩定劑、調味賦形劑、稀釋劑、媒劑、防腐劑、黏合劑，接著以一般接受之醫藥實踐所需的單位劑型混合。醫藥製劑中所包括之載體之量使得提供指定範圍內之適合劑量。油性液體之非限制性實例包括芝麻油及大豆油，且其可與苯甲酸苯甲酯或苯甲醇組合作為增溶劑。可包括之其他物品為緩衝劑，諸如磷酸鹽緩衝液或乙酸鈉緩衝液；舒緩劑，諸如普魯卡因鹽酸鹽(procaine hydrochloride)；穩定劑，諸如苄醇或苯酚；及抗氧化劑。經調配之注射液可包括於適合之安瓿中。
在各種實施例中，皮下投藥可藉助於如下裝置實現：注射器、預填充注射器、自動注射器(例如拋棄式或可再用)、筆式注射器、貼片注射器、可穿戴式注射器、具有皮下輸液組之可走動式注射器輸液泵或用於皮下注射之其他裝置。
在一些實施例中，本文所述之載體在治療時藉助於局部投藥而遞送至個體。如本文所用，「局部投藥」或「局部遞送」係指遞送不依賴於經由血管系統輸送載體至其預定目標組織或位點。舉例而言，載體可藉由注射或植入組合物或藥劑或藉由注射或植入含有組合物或藥劑之裝置來遞送。在某些實施例中，在目標組織或位點附近局部投與後，組合物或藥劑或其一或多種組分可擴散至並非投與部位之預定目標組織或位點。
在一些實施例中，本文所提供之組合物以單位劑型存在，該單位劑型可適合於自我投藥。此類單位劑型可提供於容器內，通常例如小瓶、藥筒、預填充注射器或拋棄式筆。諸如美國專利第6,302,855號中所描述之劑量儀裝置之劑量儀亦可(例如)與如本文所述之注射系統一起使用。
適合於注射之載體調配物之醫藥形式可包括無菌水溶液或分散液。調配物可為無菌的且必須為流體以允許適當流入及流出注射器。調配物在製造及儲存條件下亦可為穩定的。載劑可為含有例如水及生理食鹽水或緩衝水溶液之溶劑或分散介質。較佳地，等張劑，例如糖或氯化鈉可用於調配物中。
此外，熟習此項技術者亦可涵蓋額外遞送方法，可經由電穿孔、超音波電滲法、骨內注射方法或藉由使用基因槍。載體亦可植入微晶片、奈米晶片或奈米粒子中。
本文所述之載體之適合劑量可視多種因素而定，包括例如待治療之個體之年齡、性別及體重、待治療之病狀或疾病及所用特定載體。影響投與受試者之劑量的其他因素包括例如病狀或疾病之類型或嚴重程度。其他因素可包括例如同時或先前影響受試者之其他醫學病症、受試者之總體健康狀況、受試者之遺傳傾向、飲食、投藥時間、排泄速率、藥物組合及投與受試者之任何其他額外治療劑。可基於待治療之病狀或疾病及個體年齡及病狀選擇投與載體之適合方式。投與之劑量及方法可視患者之體重、年齡、病狀及其類似因素而變化，且可根據熟習此項技術者之需要而適當地選擇。任何特定個體之特定劑量及治療方案可基於行醫者之判斷而調整。
載體溶液可包括治療有效量之本文所述之組合物。此等有效量容易由一般技術者部分根據所投組合物之效應或組合物與一或多種其他活性劑之組合效應(若使用超過一種藥劑)來確定。治療有效量可為治療有益作用超過組合物之任何毒性或有害作用的量。
(IX-d) 治療癌症類型
在特定實施例中，本文所揭示之方法及調配物可用於治療癌症。在特定實施例中，向個體投與調配物以治療急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓單核球性白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、幼年型骨髓單核球性白血病、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及/或非霍奇金氏淋巴瘤。
可治療之額外示例性癌症包括星形細胞瘤、非典型畸胎樣/橫紋肌樣瘤、腦及中樞神經系統(CNS)癌症、乳癌、癌肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、脈絡叢癌、脈絡叢乳頭狀瘤、軟組織透明細胞肉瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、室管膜瘤、上皮樣肉瘤、性腺外生殖細胞瘤、腎外橫紋肌樣瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、胃腸基質瘤、膠質母細胞瘤、HBV誘發之肝細胞癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、惡性橫紋肌樣瘤、髓母細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、神經膠質瘤、非特指型(NOS)肉瘤、寡樹突星狀膠質細胞瘤、寡樹突星形細胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢透明細胞腺癌、卵巢子宮內膜樣腺癌、卵巢漿液性腺癌、胰臟癌、胰管腺癌、胰臟內分泌腫瘤、松果體母細胞瘤、前列腺癌、腎細胞癌、腎神經管癌、橫紋肌肉瘤、肉瘤、神經鞘瘤、皮膚鱗狀細胞癌及幹細胞癌。在各種特定實施例中，癌症為卵巢癌。在各種特定實施例中，癌症為乳癌。
(IX-d-i) 用於治療癌症類型之 LCR 、啟動子、編碼序列及載體
本文所述之腺病毒供體載體適用於治療癌症。在此類腺病毒供體載體以及腺病毒供體基因體、轉位系統及腺病毒產生系統之實施例中，所提供之長LCR可用於介導基因轉移至適用於治療癌症之目標細胞。一般技術者將認識到適用於治療特定類型之癌症的合適啟動子、編碼序列及載體結構。另外，本文中描述此等元件之實例。
在特定實施例中，腺病毒供體載體可包括表現癌症特異性或癌症靶向之治療性基因之序列。此類癌症靶向之治療性基因之實例包括結合癌症抗原(例如CD19、ROR1或其他，包括本文所述之癌症抗原)之抗體片段，其中抗體片段之序列與編碼TCR次單元或其部分之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中。此類TFP能夠與一或多個內源性(或者，一或多個外源性或內源性與外源性組合) TCR次單元締合，以便形成功能性TCR複合物。
在特定實施例中，治療性基因可編碼抗體或抗體之結合片段，諸如Fab或scFv。可表現之示例性抗體(包括scFv)包括WO2014164553A1、US20170283504、US7083785B2、US10189906B2、US10174095B2、WO2005102387A2、US20110206701A1、WO2014179759A1、US20180037651A1、US20180118822A1、WO2008047242A2、WO1996016990A1、WO2005103083A2及WO1999062526A2中提供之所述之抗體。亦可使用本文中關於結合域所描述之抗體，以及阿特珠單抗、布林莫單抗(blinatumomab)、本妥昔單抗(brentuximab)、西妥昔單抗、瑟吐珠單抗(cirmtuzumab)、伐吐珠單抗(farletuzumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、OKT3、奧戈伏單抗(oregovomab)、普偌米昔單抗(promiximab)、派姆單抗(pembrolizumab)及曲妥珠單抗(trastuzumab)。
亦可使用免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點抑制劑係指抑制免疫抑制檢查點蛋白之功能之化合物。抑制包括降低功能及完全阻斷。較佳免疫檢查點抑制劑為特異性識別免疫檢查點蛋白之抗體。在特定實施例中，免疫檢查點抑制劑增強個體之CD8+ T細胞之增殖、遷移、持久性及/或細胞毒性活性，且特定言之，增強個體之CD8+ T細胞之腫瘤浸潤。因此，本發明之示例性免疫檢查點抑制劑包括αPD-L1γ1抗體(或者稱為αPD-L1γ1 )。αPD-L1γ1進一步描述於Engeland等人 2014Mol Ther 22(11):1949-1959。
PD-1及PD-L1抗體之實例描述於US 7,488,802；US 7,943,743；US 8,008,449；US 8,168,757；US 8,217,149、WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400及WO2011161699。在一些實施例中，PD-1阻斷劑包括抗PD-L1抗體。在其他實施例中，PD-1阻斷劑包括抗PD-1抗體及類似結合蛋白，諸如納武單抗(MDX 1106、BMS 936558、ONO 4538)、藉由配位體PD-L1及PD-L2結合於且阻斷PD-1活化之完全人類IgG4抗體；拉立珠單抗(lambrolizumab)(MK-3475或SCH 900475)、針對PD-1之人類化單株IgG4抗體；CT-011，結合PD-1之人類化抗體；AMP-224，B7-DC之融合蛋白；抗體Fc部分；用於阻斷PD-L1 (B7-H1)之BMS-936559 (MDX-1105-01)。
其他免疫檢查點抑制劑包括淋巴球活化基因-3 (LAG-3)抑制劑，諸如IMP321 (一種可溶性Ig融合蛋白)(Brignone等人, 2007, J. Immunol. 179:4202-4211)。其他免疫檢查點抑制劑包括B7抑制劑，諸如B7-H3及B7-H4抑制劑。詳言之，抗B7-H3抗體MGA271 (Loo等人, 2012, Clin. Cancer Res. 7月15日 (18) 3834)。亦包括TIM3 (T細胞免疫球蛋白域及黏蛋白域3)抑制劑(Fourcade等人, 2010, J. Exp. Med. 207:2175-86及Sakuishi等人, 2010, J. Exp. Med. 207:2187-94)。如本文所用，術語「TIM-3」具有其在此項技術中之一般含義且係指T細胞免疫球蛋白及含黏蛋白域之分子3。TIM-3之天然配位體為半乳糖凝集素9 (Ga19)。因此，如本文所用之術語「TIM-3抑制劑」係指可抑制TIM-3之功能的化合物、物質或組合物。舉例而言，抑制劑可抑制TIM-3之表現或活性，調節或阻斷TIM-3信號傳導路徑及/或阻斷TIM-3與半乳糖凝集素-9之結合。對TIM-3具有特異性之抗體為此項技術中所熟知且通常為WO2011/155607、WO2013/006490及WO2010/117057中所述之抗體。
額外特定免疫檢查點抑制劑包括阿特珠單抗、BMS-936559、伊派利單抗(ipilimumab)、MEDI0680、MEDI4736、MSB0010718C、派姆單抗(pembrolizumab)、皮立珠單抗(pidilizumab)及曲美木單抗(tremelimumab)。亦參見WO 1998/42752；WO 2000/37504；WO 2001/014424；WO 2004/035607；US 2005/0201994；US 2002/0039581；US 2002/086014；US 5,811,097；US 5,855,887；US 5,977,318；US 6,051,227；US 6,984,720；US 6,682,736；US 6,207,156；US 6,682,736；US 7,109,003；US 7,132,281；EP1212422B1；Hurwitz等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17):10067-10071 (1998)；Camacho等人, J. Clin. Oncology, 22(145): Abstract No. 2505 (2004) (抗體CP-675206)；及Mokyr等人, Cancer Res, 58:5301-5304 (1998)。
(IX-d-ii) 劑量及調配物
在癌症之情形下，治療有效量可減少腫瘤細胞數目，減少癌轉移之數目，減小腫瘤體積，增加預期壽命，誘導癌細胞之細胞凋亡，誘導癌細胞死亡，誘導癌細胞中之化學或放射敏感性，抑制癌細胞附近之血管生成，抑制癌細胞增殖，抑制腫瘤生長，預防癌轉移，延長個體壽命，減少癌症相關疼痛，減少癌轉移之數目，及/或減少癌症在治療後復發或再發。
特定實施例，向個體投與調配物以預防或延遲癌症復發或預防或延遲高風險生殖系突變攜帶者中之癌症發作。在特定實施例中，向個體投與調配物以接受較高治療劑量之替莫唑胺(TMZ)及苯甲基鳥嘌呤或BCNU。由於強骨髓抑制脫靶作用，因此將有效劑量之TMZ及苯甲基鳥嘌呤遞送至腫瘤仍為一種挑戰。患者當前可接受TMZ及苯甲基鳥嘌呤以用於與以下相關之治療：急性骨髓性白血病(AML)、食道癌、頭頸癌、高級別神經膠質瘤、骨髓發育不良症候群、非小細胞肺癌、NSCLC；難治性AML、小細胞肺癌、多形性星形細胞瘤、腦腫瘤、乳癌(例如轉移性)、大腸直腸癌(例如轉移性)、彌漫性內源性腦幹神經膠質瘤、尤文氏肉瘤、多形性膠質母細胞瘤(GBM)、惡性神經膠質瘤、黑色素瘤、轉移性惡性黑色素瘤、復發性惡性黑色素瘤、鼻咽癌、轉移性乳癌及兒科癌症。
具有表現MGMT之腫瘤之患者將受益於活性成分(諸如CAR、TCR或抗體)與MGMT P140k活體內選擇卡匣組合之治療性大負載腺病毒載體的投與。離體方法已展示此方法之適用性。在特定實施例中，投與治療量之TMZ及苯甲基鳥嘌呤或BCNU以減小腫瘤負荷或體積。
(IX-e) 治療點突變病狀 ( 例如鐮狀細胞 ) 在特定實施例中，本文所揭示之方法及調配物可用於治療點突變病狀。在特定實施例中，向個體投與調配物以治療鐮狀細胞疾病、囊腫性纖維化、泰-薩克斯病及/或苯酮尿症。在各種實施例中，本發明之轉位子負載編碼用於核酸病變之校正性編輯的CRISPR-Cas。在各種實施例中，本發明之轉位子負載編碼用於核酸病變之校正性編輯的鹼基編輯器。
(IX-f) 治療特定酶缺乏症
在特定實施例中，本文所揭示之方法及調配物可用於治療特定酶缺乏症。在特定實施例中，向個體投與調配物以治療賀勒氏症候群(Hurler's syndrome)、選擇性IgA缺乏症、高IgM、IgG子類缺乏症、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、泰-薩克斯病、高歇氏病(Gaucher disease)、法布立病(Fabry disease)、克拉培病(Krabbe disease)、半乳糖血症、楓糖漿尿病、苯酮尿症、肝糖貯積病、弗里德賴希共濟失調(Friedreich ataxia)、澤爾韋格症候群(Zellweger syndrome)、腎上腺腦白質營養不良、補體病症及/或黏多醣貯積症。
在特定實施例中，本發明方法可使對有需要之個體之免疫接種的初級及二級抗體反應正常化。對免疫接種之初級及二級抗體反應正常化可包括恢復在類別轉換及對抗原之記憶反應中起作用之B細胞及/或T細胞細胞介素信號傳導程式。對免疫接種之初級及二級抗體反應正常化可藉由噬菌體免疫接種分析量測。在特定實施例中，可在用T細胞依賴性新抗原噬菌體ΨX174免疫接種之後分析B細胞及/或T細胞細胞介素信號傳導程式之恢復。在特定實施例中，對免疫接種之初級及二級抗體反應正常化可包括使有需要之個體中之IgA、IgM及/或IgG含量提高至與源自對照群體之參考含量相當的含量。在特定實施例中，對免疫接種之初級及二級抗體反應正常化可包括使有需要之個體中之IgA、IgM及/或IgG之含量增加至超過未投與本文所述之基因療法的有需要之個體之含量的含量。IgA、IgM及/或IgG之含量可藉由例如免疫球蛋白測試量測。在特定實施例中，免疫球蛋白測試包括結合IgG、IgA、IgM、κ輕鏈、λ輕鏈及/或重鏈之抗體。在特定實施例中，免疫球蛋白測試包括血清蛋白質電泳、免疫電泳、輻射狀免疫擴散法、濁度測定法及比濁法。市售免疫球蛋白測試套組包括MININEPH™ (Binding site, Birmingham, UK)及來自Dako (Denmark)及Dade Behring (Marburg, Germany)之免疫球蛋白測試系統。在特定實施例中，可用於量測免疫球蛋白含量之樣品包括血液樣品、血漿樣品、腦脊髓液樣品及尿液樣品。
在特定實施例中，本發明之方法可用於治療SCID-X1。在特定實施例中，本發明之方法可用於治療SCID (例如JAK 3激酶缺乏症SCID、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏症SCID、腺苷去胺酶(ADA)缺乏症SCID、MHC II類缺乏症或重組酶活化基因(RAG)缺乏症SCID)。在特定實施例中，治療功效可經由淋巴球復原、改良純系多樣性及胸腺產生、減少感染及/或改善患者結果來觀測。亦可經由以下中之一或多者觀測治療功效：體重增加及生長、改善胃腸道功能(例如減少腹瀉)、減少上呼吸道症狀、減少口腔真菌感染(鵝口瘡)、減少肺炎發生率及嚴重程度、減少腦膜炎及血流感染以及減少耳部感染。在特定實施例中，用本發明之方法治療SCIDX-1包括恢復對γC依賴性信號傳導路徑之功能性。γC依賴性信號傳導路徑之功能性可藉由在分別用IL-21及/或IL-2進行活體外刺激之後量測效應分子STAT3及/或STAT5之酪胺酸磷酸化來分析。STAT3及/或STAT5之酪胺酸磷酸化可藉由細胞內抗體染色量測。
(IX-i) 其他用途
(IX-i-i) HIV ( 代表性感染物 )
特定實施例包括治療繼發性或後天性免疫缺乏，諸如由創傷、病毒、化學療法、毒素及污染所導致之免疫缺乏。如前所指示，後天性免疫缺乏症候群(AIDS)為由病毒人類免疫缺乏病毒(HIV)引起之繼發性免疫缺乏病症的實例，其中T淋巴球耗乏使得身體無法對抗感染。因此，作為另一實例，可選擇提供針對感染性疾病之治療有效反應的基因。在特定實施例中，感染性疾病為人類免疫缺乏病毒(HIV)。治療性基因可為例如使免疫細胞對HIV感染具抗性或使免疫細胞能夠經由免疫重建有效中和病毒之基因；編碼由免疫細胞表現之蛋白質的基因之多形現象；有利於對抗在患者中未表現之感染的基因；編碼感染物、受體或共受體之基因；編碼受體或共受體之配位體的基因；病毒複製必需之病毒及細胞基因，包括；編碼核糖核酸酶、反義RNA、小干擾RNA (siRNA)或誘餌RNA以阻斷某些轉錄因子之作用的基因；編碼顯性陰性病毒蛋白、細胞內抗體、細胞內趨化因子之基因及自殺基因。示例性治療性基因及基因產物包括α2β1；αvβ3；αvβ5；αvβ63；BOB/GPR15；Bonzo/STRL-33/TYMSTR；CCR2；CCR3；CCR5；CCR8；CD4；CD46；CD55；CXCR4；胺基肽酶-N；HHV-7；ICAM；ICAM-1；PRR2/HveB；HveA；α-肌營養不良蛋白聚糖；LDLR/α2MR/LRP；PVR；PRR1/HveC；及層黏連蛋白受體。用於治療HIV之治療有效量例如可增加個體對HIV之免疫性，改善與AIDS或HIV相關之症狀，或誘導個體中針對HIV之先天性或適應性免疫反應。針對HIV之免疫反應可包括產生抗體且預防AIDS及/或改善受試者之AIDS或HIV感染之症狀，或降低或消除HIV感染性及/或毒性。
包括以下示例性實施例及實例以展示本發明之特定實施例。根據本發明，一般技術者應認識到，在不背離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定實施例作出許多改變且仍獲得相同或相似結果。
(X) 示例性實施例 . 1.   一種腺病毒供體載體，其包括：(a)腺病毒衣殼；及(b)線性雙股DNA基因體，其包括：(i)至少10 kb之轉位子負載；(ii)側接該轉位子負載之轉位子反向重複序列(IR)；及(iii)側接該等轉位子反向重複序列之重組酶正向重複序列(DR)。 2.   一種腺病毒供體基因體，其包括：(a)至少10 kb之轉位子負載；(b)側接該轉位子負載之轉位子反向重複序列(IR)；及(c)側接該等轉位子反向重複序列之重組酶正向重複序列(DR)。 3.   一種腺病毒轉位系統，其包括：(a)實施例1之腺病毒供體載體；及 (b)腺病毒支撐載體，其包括：(i)腺病毒衣殼；及(ii)腺病毒支撐基因體，其包括編碼轉位酶之核酸序列。 4.   一種腺病毒轉位系統，其包括：(a)實施例2之腺病毒供體基因體；及(b)腺病毒支撐基因體，其包括編碼轉位酶之核酸序列。 5.   一種腺病毒產生系統，其包括：(a)包括實施例2之腺病毒供體基因體之核酸；及(b)包括腺病毒輔助基因體之核酸，該腺病毒輔助基因體包括條件性包裝元件。 6.   實施例1至5中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載包括長LCR，視情況其中該長LCR為包括β-球蛋白LCR HS1至HS5之β-球蛋白長LCR。 7.   實施例6之載體、基因體或系統，其中該長LCR具有至少27 kb之長度。 8.   實施例1至6中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載包括表1中所闡述之LCR。 9.   實施例1至6中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載具有至少15 kb、至少16 kb、至少17 kb、至少18 kb、至少19 kb、至少20 kb、至少21 kb、至少22 kb、至少23 kb、至少24 kb、至少25 kb、至少30 kb、至少35 kb、至少38 kb或至少40 kb之長度。 10.  實施例1至6中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載具有10 kb-35 kb、10 kb-30 kb、15 kb-35 kb、15 kb-30 kb、20 kb-35 kb或20 kb-30 kb之長度。 11.  實施例1至6中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載具有10 kb-32.4 kb、15 kb-32.4 kb或20 kb-32.4 kb之長度。 12.  實施例1至11中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載包括編碼蛋白質之核酸序列，視情況其中該蛋白質為治療性蛋白質。 13.  實施例12之載體、基因體或系統，其中該蛋白質係選自包括β球蛋白替代蛋白及γ-球蛋白替代蛋白之群。 14.  實施例12之載體、基因體或系統，其中該蛋白質為第八因子替代蛋白。 15.  實施例12或13之載體、基因體或系統，其中編碼該蛋白質之該核酸序列與啟動子可操作地連接，視情況其中該啟動子為β球蛋白啟動子。 16.  實施例1至15中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子反向重複序列為睡美人(SB)反向重複序列，視情況其中該SB反向重複序列為pT4反向重複序列。 17.  實施例3至15中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位酶為睡美人(SB)轉位酶，視情況其中該轉位酶為睡美人100x (SB100x)。 18.  實施例1至17中任一項之載體、基因體或系統，其中該等重組酶正向重複序列為FRT位點。 19.  實施例3至18中任一項之載體、基因體或系統，其中該腺病毒支撐基因體包括編碼重組酶之核酸。 20.  實施例19之載體、基因體或系統，其中該重組酶為FLP重組酶。 21.  實施例1至20中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載包括β-球蛋白長LCR，該轉位子負載包括與β-球蛋白啟動子可操作地連接之編碼β-球蛋白之核酸序列，該等反向重複序列為SB反向重複序列，且該等重組酶正向重複序列為FRT位點。 22.  實施例1至21中任一項之載體、基因體或系統，其中在該轉位子負載中包括選擇卡匣，視情況其中該選擇卡匣包括編碼mgmtP140K 之核酸序列。 23.  實施例1至22中任一項之載體、基因體或系統，其中該腺病毒衣殼經修飾以增加對CD46之親和力，視情況其中該腺病毒衣殼為Ad35++衣殼。 24.  實施例5至23中任一項之腺病毒產生系統，其中該腺病毒輔助基因體之條件性包裝元件包括由重組酶正向重複序列側接之包裝序列。 25.  實施例24之腺病毒產生系統，其中側接該條件性包裝元件之該包裝序列的該等重組酶正向重複序列為LoxP位點。 26.  一種細胞，其包括實施例1至25中任一項之載體、基因體或系統。 27.  一種細胞，其在其基因體中包括實施例1至25中任一項之轉位子負載，其中在該細胞之該基因體中存在的該轉位子負載由該等轉位子反向重複序列側接。 28.  實施例26或27之細胞，其中該細胞為造血幹細胞。 29.  一種產生腺病毒之細胞，其包括實施例5至25中任一項之腺病毒產生系統，視情況其中該細胞為HEK293細胞。 30.  一種修飾細胞之方法，該方法包括使該細胞與實施例1至25中任一項之載體、基因體或系統接觸。 31.  一種修飾個體之細胞的方法，該方法包括向該個體投與實施例1至25中任一項之載體、基因體或系統。 32.  一種修飾個體之細胞之方法，其在不自該個體分離該細胞下進行，該方法包括向該個體投與實施例1至25中任一項之載體、基因體或系統。 33.  一種治療有需要個體之疾病或病狀之方法，該方法包括向該個體投與實施例1至25中任一項之載體、基因體或系統。 34.  實施例31至33中任一項之方法，其中該腺病毒供體載體係靜脈內投與至該個體。 35.  實施例31至34中任一項之方法，其中該方法包括向該個體投與動員劑，視情況其中該動員劑包括顆粒球-群落刺激因子(G-CSF)、CXCR4拮抗劑及CXCR2促效劑中之一或多者。 36.  實施例35之方法，其中該CXCR4拮抗劑為AMD3100。 37.  實施例35或36之方法，其中該CXCR2促效劑係GRO-β。 38.  實施例31至37中任一項之方法，其中該轉位子負載包括選擇卡匣且該方法包括向該個體投與選擇劑。 39.  實施例38之方法，其中該選擇卡匣編碼mgmtP140K 且該選擇劑為O6 BG/BCNU。 40.  實施例31至39中任一項之方法，其中該方法引起至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%表現CD46之細胞中併合及/或表現該轉位子負載之至少一個複本。 41.  實施例31至39中任一項之方法，其中該方法引起至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%造血幹細胞及/或紅血球系Ter119+ 細胞中併合及/或表現該轉位子負載之至少一個複本。 42.  實施例31至41中任一項之方法，其中該方法引起包括該轉位子負載之至少1個複本之細胞的基因體中併合該轉位子負載之平均至少2個複本。 43.  實施例31至42中任一項之方法，其中該方法引起包括該轉位子負載之至少1個複本之細胞的基因體中併合該轉位子負載之平均至少2.5個複本。 44.  實施例31至43中任一項之方法，其中該方法引起由該轉位子負載編碼之蛋白質以參考量之至少約20%的量表現，視情況其中該參考為內源性參考蛋白在該個體中或參考群體中之表現。 45.  實施例31至43中任一項之方法，其中該方法引起由該轉位子負載編碼之蛋白質以參考量之至少約25%的量表現，視情況其中該參考為內源性參考蛋白在該個體中或參考群體中之表現。 46.實施例31至45中任一項之方法，其中該個體為罹患中間型地中海貧血症之個體，其中該轉位酶負載包含包括β-球蛋白LCR HS1至HS5之β-球蛋白長LCR及與β球蛋白啟動子可操作地連接之編碼β球蛋白替代蛋白及/或γ-球蛋白替代蛋白之核酸序列。 47.實施例31至45中任一項之方法，其中該個體為罹患血友病之個體，其中該轉位酶負載包含包括β-球蛋白LCR HS1至HS5之β-球蛋白長LCR及與β球蛋白啟動子可操作地連接之編碼第八因子替代蛋白之核酸序列。 48.實施例47之方法，其中該個體中該蛋白質之表現減少中間型地中海貧血症之至少一種症狀及/或治療中間型地中海貧血症。
(XI) 實驗實例
實例 1. 大負載腺病毒載體基因療法 .
引言 . 為使血紅素病(諸如重型地中海貧血症及鐮狀細胞貧血症)之基因療法成功，轉移基因較佳在紅血球系細胞中表現量高，而無併合之位置效應及轉錄沉默。認為β-球蛋白基因座控制區域(LCR)有益於此類用途。對於基因療法應用，含有HS1至HS5之β-球蛋白LCR已展示賦予轉殖基因小鼠中順式連接之基因高表現量(Grosveld等人,Cell 51:975-985, 1987)。然而，此LCR型式太大而不能用於慢病毒載體(插入容量8 kb)中，且因此已開發出截短的「微型」或「微小」LCR型式。舉例而言，在地中海貧血症患者之持續臨床試驗中，使用含有2.7 kb微型LCR (覆蓋HS2-HS4)及266 bp β-球蛋白啟動子之慢病毒(Negre等人,Curr Gene Ther 15: 64-81, 2015)。先前採用含有HS1至HS4及β-球蛋白啟動子之5.9 kb β-球蛋白LCR型式，用於在CD46轉殖基因小鼠或CD46/Hbbth3 地中海型貧血症小鼠中表現γ-球蛋白(Wang等人,J Clin Invest 129:598-615, 2019)。使用活體內HSPC轉導/選擇方法，在接近100%周邊血液紅血球中實現γ-球蛋白標記，而γ-球蛋白表現量為成年小鼠α-球蛋白之10%至15%，平均併合載體複本數(VCN)為2至3個複本/細胞。
對於完全治癒β0 /β0 地中海貧血症或鐮狀細胞貧血症而言，通常認為紅血球系細胞中需要20%之治療性球蛋白(γ-或β-球蛋白)表現量(Fitzhugh等人,Blood 130:1946-1948, 2017)。達到此水準之一種方式係藉由提高HSPC轉導或增加載體劑量來增加VCN。然而，至少部分地歸因於所用載體系統之隨機併合模式，在歷史上已在其他情形中觀測到此等方法增加毒性風險。在此實例中，在CD46轉殖基因小鼠之活體內HSPC轉導之後，使用較強轉錄元件，亦即較長LCR型式增加每個RBC的γ-球蛋白表現。
吾人研發出不需要白血球清除術、骨髓清除及HSPC移植之新穎活體內HSPC轉導方法(Richter等人,Blood, 128: 2206-2217, 2016)。該方法涉及適用於活體內HSPC轉導，亦即輔助病毒依賴性的經衣殼改質之腺病毒載體(HDAd5/35++)之新載體平台。此等載體之特徵包括CD46親和力增強型纖維，其允許原始HSC之高效轉導，同時避免在靜脈內注射之後非造血組織之感染且插入容量高達30 b。由於可接近性有限，所以位於骨髓中之HSPC無法藉由靜脈內注射載體(包括HDAd5/35++載體)轉導，即使當載體靶向骨髓細胞上存在之受體時(Ni等人,Hum Gene Ther, 16: 664-677, 2005及Ni等人,Cancer Gene Ther , 13: 1072-1081, 2006)。顆粒球-群落刺激因子(G-CSF)與CXCR4拮抗劑AMD3100 (MozobilTM 、PlerixaTM )之組合已展示在動物模型及人類中有效地動員原始祖細胞(Fruehauf等人,Cytotherapy , 11: 992-1001, 2009及Yannaki等人,Hum Gene Ther , 24: 852-860, 2013)。使用G-CSF/AMD3100將HSPC自骨髓動員至周邊血液流中，隨後靜脈內注射HDAd5/35++載體。此先前於人類CD46轉殖基因小鼠(Richter等人,Blood, 128: 2206-2217, 2016；Li等人,Mol Ther Methods Clin Dev, 9: 390-401, 2018；Li等人,Blood , 131: 2915-2928. 2018；Wang等人,J Clin Invest , 129: 598-615. 2019；Wang等人,Blood Adv , 3: 2883-2894, 2019；及Wang等人,Mol Ther Methods Clin Dev , 8: 52-64, 2018)、人類化小鼠(Richter等人,Blood, 128: 2206-2217, 2016)及恆河猴(Harworth等人,ASCGT 21th Annual meeting , 2018, DOI: 10.1016/j.ymthe.2018.05.001)中展示。在周邊中轉導之HSPC回至骨髓，在骨髓中其長期保留。在無增生優勢之情況下，活體內轉導之HSPC不會有效離開骨髓且促進下游分化。用O6 BG/BCNU對動物進行之短期治療提供對經mgmtP140K 基因修飾之HSPC之增殖刺激且隨後在＞80%周邊血細胞中轉殖基因表現穩定(Wang等人,Mol Ther Methods Clin Dev , 8: 52-64, 2018)。
HD-Ad5/35++基因體不併合至宿主細胞基因體中且在細胞分裂時損失。出於基因療法目的且為長期追蹤活體內轉導之HSPC，HD-Ad5/35++載體經修飾以允許轉殖基因併合。此藉由併入過度活性睡美人 轉位酶系統(SB100)進行(Zhang等人,PLoS One, 8: e75344, 2013；Hausl等人,Mol Ther , 18: 1896-1906, 2010；及Yant等人,Nat Biotechnol , 20: 999-1005, 2002)。該轉位酶，自第二載體以反式共表現，識別側接轉殖基因卡匣之特異性DNA序列(反向重複序列，「IR」)且觸發併合至染色體DNA之TA二核苷酸中。不同於逆轉錄病毒併合，SB100x介導之併合不視靶向基因之轉錄狀態而定(Yant等人,Mol Cell Biol , 25: 2085-2094, 2005)。若干研究已證明SB100x介導之轉殖基因併合為隨機的且尚未與原癌基因之活化相關(Richter等人,Blood, 128: 2206-2217, 2016；Wang等人,Mol Ther Methods Clin Dev , 8: 52-64, 2018；Zhang等人,PLoS One, 8: e75344, 2013；Hausl等人,Mol Ther , 18: 1896-1906, 2010；及Yant等人,Nat Biotechnol , 20: 999-1005, 2002)。基於SB100x之併合系統之優勢在於其不視細胞之高效同源DNA修復機制而定。後者在顯示低DNA修復及重組酶活性之HSPC中至關重要(Beerman等人,Cell Stem Cell , 15: 37-50, 2014)。證明在CD46轉殖基因小鼠(Richter等人,Blood, 128: 2206-2217, 2016；Wang等人,J Clin Invest , 129: 598-615. 2019；Li等人,Mol Ther , 27: 2195-2212, 2019；Li等人,Mol Ther Methods Clin Dev , 9: 142-152, 2018；及Wang等人,J Virol , 79: 10999-11013, 2005)及人類CD34+細胞(Li等人,Mol Ther , 27: 2195-2212, 2019)中HDAd35++-轉位子載體及SB100x/Flpe表現載體之活體內HSC共感染引起2個轉殖基因複本/細胞之隨機轉殖基因併合，對基因無偏好。
人類基因體通常經由環形成而組織成調控區(亦即轉錄因子結合位點)之間具有長程相互作用的3D結構。大多數此等相互作用在拓樸相關域(TAD)之情形下發生。TAD被視為染色體組織之功能單元，其中強化子與其他調控區相互作用以控制轉錄。認為TAD/LCR邊界隔絕限制強化子及啟動子之搜尋空間且防止形成不合需要之調控接觸點。在此等域之兩側的邊界在不同哺乳動物細胞類型之間且甚至在整個物種中保守。
當前使用之慢病毒及rAAV基因轉移載體僅可容納小強化子/啟動子，通常導致次佳的轉殖基因表現量及組織特異性、轉殖基因沉默及與載體併合位點周圍之調控區非故意之相互作用。在最壞情況下，後者會引起原癌基因之活化。
為增加基因療法之安全性及功效，TAD應用於基因添加策略。TAD之中值尺寸為880 kb。隨著高通量染色體構形捕捉(3C)分析及其後續4C、5C及Hi-C方案以及fiber-Seq分析之進一步進展，調控基因體之詢問將快速進行，且出於基因療法目的，可遞送僅含有關鍵核心元件之TAD。
b-球蛋白基因座控制區域(LCR)屬於TAD之定義。人類β-球蛋白基因簇位於染色體11中且跨越100 kb。已提出β-球蛋白基因座形成由順式調控元件及活性β-球蛋白基因構成之紅血球特異性空間結構，稱為活性染色質中心(ACH)(Tolhuis等人,Mol Cell, 10: 1453-1465, 2002)。核心ACH為發育保守的，且包括上游5' DNA水解酶超敏區1至5，稱為球蛋白LCR，及下游3' HS1以及紅血球特異性反式作用因子(Kim等人,Mol Cell Biol , 27: 4551-65, 2007)。為使血紅素病(諸如重型地中海貧血症及鐮狀細胞貧血症)之基因療法成功，必須轉移基因在紅血球系細胞中表現量高，而無併合之位置效應及轉錄沉默。為達成此，認為需要β-球蛋白基因座控制區域(LCR)(Ellis等人,Clin Genet, 59: 17-24, 2001)。對於基因療法應用，值得注意的是，含有HS1至HS5之23 kb β-球蛋白LCR賦予轉殖基因小鼠中之順式連接之基因高水準的紅血球特異性非位置依賴性表現(Grosveld等人,Cell , 51: 975-985, 1987)。然而，此LCR型式太大而不能用於慢病毒載體(插入容量8 kb)中，且因此已開發出截短的「微型」或「微小」LCR型式。舉例而言，在地中海貧血症患者之持續臨床試驗中，使用含有2.7 kb微型LCR (覆蓋HS2-HS4)及266 bp β-球蛋白啟動子之慢病毒(Negre等人,Curr Gene Ther , 15: 64-81, 2015)。在先前活體內HSPC轉導研究中，採用含有HS1至HS4及β-球蛋白啟動子之5.9 kb β-球蛋白LCR型式，用於在CD46轉殖基因小鼠或CD46/Hbbth3 地中海型貧血症小鼠中表現γ-球蛋白(Wang等人,J Clin Invest , 129: 598-615. 2019)。使用此活體內HSPC轉導/選擇方法，在接近100%周邊血液紅血球中實現γ-球蛋白標記，然而，γ-球蛋白表現量僅為成年小鼠α-球蛋白之10%至15%，平均併合載體複本數(VCN)為2-3個複本/細胞。對於治癒β0 /β0 地中海貧血症或鐮狀細胞貧血症而言，通常認為紅血球系細胞中需要水準為20%之治療性球蛋白(γ-或β-球蛋白)(Fitzhugh等人,Blood , 130: 1946-1948, 2017)。達到此之一種方式係藉由提高HSPC轉導或增加載體劑量來增加VCN，然而，考慮到此載體系統之隨機併合模式，此方式具有增加基因毒性之風險。因此，聚焦於在CD46轉殖基因小鼠及地中海型貧血症小鼠之活體內HSPC轉導之後，利用29 kb LCR型式增加γ-球蛋白表現/RBC。
結果 . 作為靜脈內注射HDAd5/35++載體之活體內轉導研究之模型，使用含有完整人類CD46基因座且因此以與人類類似之模式及量表現hCD46的轉殖基因小鼠(hCD46tg小鼠)(Kemper等人, (2001)Clin Exp Immunol 124: 180-189)。
含有長 β - 球蛋白 LCR 之 HDAd5/35++ 載體 . 在Wang等人(J. Clin Invest. 129(2):598-615, 2019)中描述之研究中，使用HDAd5/35++載體，其在連接於1.6 kb β-球蛋白啟動子之4.3 kb微型LCR (涵蓋HS1至HS4之核心元件；Lisowski等人,Blood 110:4175-4178, 2007)控制下表現γ-球蛋白(Wang等人,J Clin Invest 129:598-615, 2019；Li等人,Mol Ther Methods Clin Dev 9: 142-152, 2018)。在本實例中，構築含有以下元件以使γ-球蛋白基因表現最大化之HDAd5/35++載體：i) 包括全長HS5至HS1區域之21.5 kb LCR，ii) 1.6 kb β-球蛋白啟動子，iii) β-球蛋白3'UTR以使γ-球蛋白mRNA穩定，及iv) 3' HS1區域。載體稱為HDAd-長-LCR (圖1A)。為介導併合，LCR-載體與表現SB100x/Flpe之HDAd載體組合使用(圖1A)。
在各種實施例中，3' HS1具有chr11位置5206867-5203839之以下核酸序列。在各種實施例中，3'HS1具有如SEQ ID NO: 102中所示之以下核酸序列或與SEQ ID NO: 102具有至少80%序列一致性之序列，例如與SEQ ID NO: 102具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列。
離體 HSPC 轉導 / 移植研究 . HDAd-長-LCR含有32.4 kb轉位子。雖然SB系統已顯示能夠遞送大貨物(Rostovskaya等人,Nucleic Acids Res 40: e150, 2012)，但其是否可介導32.4 kb轉位子之染色體併合係未知的。因此，在可控制轉導功效之環境中進行離體HSPC轉導。CD46tg小鼠骨髓譜系陰性(Lin- )細胞(HSPC富集之細胞部分)經HDAd-長-LCR+HDAd-SB離體轉導(圖1A、1B)。接著將經離體轉導之細胞移植於經致死輻射之C57Bl/6小鼠中。基於CD46陽性PBMC，第4週之植入率＞95%。載體中mgtmP140K 突變基因之存在允許用O6 BG/BCNU在活體內選擇經轉導之細胞(Wang等人,Mol Ther Methods Clin Dev 8: 52-64, 2018)。移植之後一個月，對小鼠進行四輪O6 BG/BCNU處理以選擇性擴增併合γ-球蛋白/mgmt轉殖基因之祖細胞(圖1A)。在每輪活體內選擇下，在第20週(研究結束時) β-球蛋白陽性周邊紅血球(RBC)之百分比增加，達至＞95% (圖1C)。在第20週，殺死動物且分析骨髓單核細胞(MNC)。藉由qPCR量測之平均VCN為2.8個複本/細胞。藉由流動式細胞量測術，在85.46(+/-5.9)%之紅血球系Ter119+ 細胞及14.54(+/-2.3)%非紅血球系(Ter119- )骨髓MNC中偵測到γ-球蛋白表現(圖1D)。
為證明源自SB100x併合之轉殖基因的γ-球蛋白表現，對來自移植後第20週收穫之骨髓單核細胞(MNC)之基因體DNA進行反向PCR (iPCR)分析。iPCR方案涉及用SacI消化基因體DNA、重新接合/環化步驟、巢式PCR及載體/染色體接合點之定序(圖2A)。(圖2B)展示三種代表性PCR產物及併合位點在染色體4、15及X上之定位。產物之定序顯示在載體IR/DR-染色體接合點處包括TA二核苷酸的SB100x介導之併合典型的載體/染色體接合點(圖2C)。總之，在離體HSPC轉導研究中，長球蛋白LCR賦予源自SB100x併合之轉位子的高γ-球蛋白表現量。
在含有短對比長 LCR 之 HDAd5/35++ 載體下 CD46b 轉殖基因小鼠中之活體內 HSPC 轉導 . 對HDAd-長-LCR及先前使用之含有微型LCR之載體(Wang等人,J Clin Invest 129: 598-615, 2019；Li等人,Mol Ther Methods Clin Dev 9: 142-152, 2018)(本文中稱為「HDAd-短-LCR」)進行並列比較(圖3A)。將CD46轉殖基因小鼠用G-CSF/AMD3100動員且靜脈內注射載體。在活體內轉導之後第5週開始四輪O6 BG/BCNU選擇，且追蹤小鼠20週(圖3B)。接著將第20週骨髓Lin- 細胞移植於經致死輻射之C57Bl/6小鼠中且再監測二次接受者16週。與離體HSPC轉導研究中一樣，在第20週，每輪活體內選擇達至兩種載體＞95%時，β-球蛋白陽性RBC之百分比增加(圖3C)。在第20週樣品之RBC溶解物上進行之HPLC顯示HDAd-長-LCR載體顯著更高之γ-球蛋白/成年小鼠α-球蛋白百分比(圖3D)。此差異亦反映在mRNA含量上(圖3E)。
在第20週藉由qPCR量測之骨髓MNC中的載體複本數為2.5-3個複本/細胞(圖4)且該等載體之間的差異不顯著。此表明，「短」11.8 kb轉位子之併合與「長」32.4 kb轉位子之併合一樣有效。不管絕大部分紅血球系細胞中之γ-球蛋白表現如何，用該等載體進行之活體內HSPC轉導不引起血液異常(第20週) (圖5A-5B)。細胞骨髓之組成(圖5C)及骨髓Lin- 細胞之群落形成潛力(圖5D)在各組之間不顯著。
在第20週收穫之骨髓Lin- 細胞亦用於使用線性擴增介導之PCR (LAM-PCR)進行全基因體併合分析，接著對併合接點進行定序(圖6)。在自五隻小鼠彙集之基因體DNA樣品中，鑑別總共76個獨特的SB100x介導之併合位點(圖7A)。IR/DR/染色體接合點含有TA二核苷酸(圖7B)。絕大部分併合在基因間及內含子區域內，頻率分別為82%及19% (圖7C)。未發現原癌基因內或附近之併合。在整個小鼠基因體之任何給定窗中，併合為隨機的，無優先併合(圖7D)。
對二次接受者之分析 . 為證明活體內轉導及SB100x介導之併合發生在長期再生HSPC中，將活體內HSPC轉導後第20週收穫之骨髓Lin- 細胞移植至經致死照射之C57Bl/6小鼠(無hCD46轉殖基因)中。經16週之時段評估移植之細胞驅動二次接受者中之多譜系復原之能力。基於PBMC中之hCD46表現之植入率為95%且保持穩定(圖8A)。藉由流動式細胞量測術量測之RBC之γ-球蛋白標記在90%至95%範圍內且穩定(圖8B)。在兩種載體之間γ-球蛋白+ RBC之百分比不存在顯著差異。在兩種載體之間平均併合載體複本數亦無顯著差異。為量測γ-球蛋白表現量，使用HPLC (圖8C)及qRT-PCR (圖8D、8E)。在兩種分析中，HDAd-長-LCR載體之γ-球蛋白與成年小鼠球蛋白鏈之百分比更大。此載體之γ-球蛋白含量在小鼠α-球蛋白之20%至25%範圍內，此意指其對血紅素病將有治癒性。除賦予較高γ-球蛋白表現量以外，長LCR亦提供更嚴格之紅血球特異性表現，如紅血球系(Ter119+ )部分對比非紅血球系部分(Ter119- )中顯著較高百分比之表現γ-球蛋白之骨髓細胞所示(圖9A、9B)。當活體內HSPC轉導後第16週收穫時，在HDAd-短-LCR與HADad-長LCR之間骨髓MNC中之每個細胞之載體複本數無統計顯著性(圖9C)。與「初次」活體內HSPC轉導之小鼠中一樣，在二次接受者中未觀測到高球蛋白表現量對骨髓之細胞組成或周邊血液中之血液參數的影響(圖10A-10D)。
兩種載體在人類 CD34+ 轉導、活體外選擇及紅血球系分化後之比較 . 由於在LCR內結合之轉錄因子缺乏保守，因此如小鼠紅血球系細胞之異源系統中人類β-球蛋白LCR之功能可能是次佳的。因此，在人類細胞中進行活體外研究(圖11A)。以每個細胞4000 vp之總MOI，亦即賦予大多數CD34+細胞轉導之MOI，用HDAd-長-LCR+HDAd-SB或HDAd-短-LCR+HDAd-SB轉導自GCSF動員之健康供體獲得之人類CD34+細胞(Li等人,Mol Ther Methods Clin Dev 9: 390-401, 2018)。隨後經轉導之細胞進行紅血球系分化(ED)且針對具有併合轉殖基因之細胞進行O6 BG/BCNU選擇。在經轉導之細胞擴增18天期間，大部分游離型載體損失。在ED結束時，藉由流動式細胞量測術發現HDAd-長-LCR+HDAd-SB環境下γ-球蛋白+無核細胞(亦即損失細胞核之網狀紅血球)之百分比顯著較高(圖11B)。HPLC分析亦證實HDAd-長-LCR+HDAd-SB轉導之細胞中γ-球蛋白鏈水準顯著較高(圖11C)。
示例性 HDAd- 長 -LCR 載體及 HDAd- 短 -LCR 載體之結構 . 在HDAd-長-LCR中，γ-球蛋白基因處於21.5 kb β-球蛋白LCR (chr11:5292319-5270789)、1.6 kb β-球蛋白啟動子(chr11:5228631-5227023)及亦來源於β-球蛋白基因座之3' HS1區域(chr11:5206867-5203839)的控制下。為使紅血球系細胞中之RNA穩定，將β-球蛋白基因UTR連接於g-球蛋白基因之3'末端。載體亦含有mgmtp140k 之表現卡匣，允許經轉導之HSPC及HSPC子代之活體內選擇。γ-球蛋白與mgmt表現卡匣由雞球蛋白HS4分離子分隔開。32.4 kb LCR-γ-球蛋白/mgtm轉位子由反向重複序列(IR)側接，該等反向重複序列由SB100x及frt位點識別，允許轉位子藉由Flpe重組酶環化。在HDAd-短-LCR中，代替HDAd-長-LCR中存在之21.5 kb HS1-HS5 LCR及3'HS1，此載體含有4.3 kb微型-LCR，包括DNA水解酶超敏位點(HS) 1至4之核心區。轉位子之長度為11.8 kb。(圖12A)將hCD46tg小鼠動員且IV注射HDAd-短-LCR + HDAd-SB或HDAd-長-LCR +HDAd-SB (兩種病毒之1:1混合物4×1010 vp)。五週後，開始O6 BG/BCNU處理。在各週期下，BCNU濃度自2.5 mg/kg增加至7.5 mg/kg及10 mg/kg。所有三種處理中O6 BG濃度均為30 mg/kg。追蹤小鼠，直至第20週，此時處死動物用於分析(圖12B)。
中間型地中海貧血症小鼠模型之研究 ： γ - 球蛋白含量 . 對於此等研究，將(CD46+/+)小鼠與針對小鼠Hbb-β1及Hbb-β2基因缺失為異型接合之Hbbth3 小鼠交配(Yang等人,Proc Natl Acad Sci U S A , 92: 11608-11612, 1995)。所得Hbbth3 /CD46+/+ 小鼠具有中間型地中海貧血症之典型表型(Wang等人,J Clin Invest , 129: 598-615. 2019)。動員Hbbth3 /CD46+/+ 小鼠且IV注射HDAd-長-LCR及HDAd-短LCR(圖18A)。四週後，開始4輪O6 BG/BCNU劑量遞增之活體內選擇。周邊紅血球中之γ-球蛋白標記在第二個活體內選擇週期中已平均為40%且在經HDAd-長-LCR轉導之小鼠的第三個活體內選擇週期之後在所有小鼠中達到100% (圖18B)。對於經HDAd-短-LCR轉導之小鼠，需要四個活體內選擇週期以使RBC中達到100% γ-球蛋白標記。在100%標記率下，人類γ-球蛋白鏈對比成年小鼠α-球蛋白之百分比(藉由HPLC量測)隨時間推移增加(最可能歸因於疾病背景)，至處理後第21週達到平均20% (圖18C及18D)。此等資料藉由以下證實HDAd-長-LCR之優越性：i) 需要不太密集之活體內選擇及ii) 達成理論上應在SCA及重型地中海貧血症之患者中具有治癒性的γ-球蛋白表現量。
中間型地中海貧血症小鼠模型中之研究 ： 校正血液參數 . 展示不同時間點之表型校正。在第14週，展示用吉姆沙染色劑及May-Grünwald染色劑染色之血球形態(圖21A)。在處理後第21週，處死小鼠。低色素性、高度斷裂及不均性紅細胞異形之基線RBC置換為接近正常色素性之形狀完好的RBC (圖21B，左圖)，表明經處理之CD46+/+ /Hbbth3 小鼠之周邊血液抹片中地中海型貧血症表型之逆轉。在第21週在來自用HDAd-長-LCR處理之地中海型貧血症及小鼠的血液抹片上計數網狀紅血球(圖21B，右圖)。在骨髓細胞離心塗片中，相比於CD46+/+ /Hbbth3 小鼠之骨髓中之紅血球系譜系成熟的阻斷(由前紅血球母細胞及嗜鹼性紅血球母細胞之發生率表示)，在來自對照及經處理之CD46+/+ /Hbbth3 小鼠之細胞離心塗片中，成熟紅血球母細胞占主導且由多色及正色紅血球母細胞表示(圖21C)。展示用長LCR、短LCR及對照CD46tg載體轉導之小鼠的正常化紅血球參數(圖22)。在第18週在血液塗片上計數之網狀紅血球百分比自地中海型貧血症小鼠中平均20%恢復至用HDAd-長-LCR處理之小鼠之正常值(5%) (圖23A)。活體內轉導後第18週的血液參數與其對照CD46tg對應物不可區分，此表明完全表型校正。此包括白血球及紅血球計數以及紅血球系細胞特徵(Hb、HCT、MHCH及RDW)之正常化(圖23B)。此外，在第18週時正常、基線、長LCR及短LCR載體之間MCV及MCH細胞之差異不顯著(圖23B)。
中間型地中海貧血症小鼠模型中之研究 ： 校正髓外血細胞生成及含鐵血黃素沈積 . 在用HDAd-長-LCR處理之動物中，脾尺寸(補償性血細胞生成之可量測特徵)減小至正常(圖24A)。相比於Hbbth3 /CD46小鼠，在脾及肝臟切片中未觀測到髓外紅血球生成之病灶(圖24B)。在未處理之CD46+/+ /Hbbth3 小鼠中密集的實質含鐵血黃素沈積突出，而在CD46 tg及經處理之CD46+/+ /Hbbth3 小鼠中僅可偵測到背景鐵累積(圖25)。
在Hbbth3 /CD46tg小鼠之活體內HSC轉導之後第21週收穫骨髓。(圖26A)骨髓MNC中每個細胞之載體複本數。兩組之間的差異不顯著，但若用較大樣品尺寸進行分析，則可能變得顯著。(圖26B、26C) γ-球蛋白表現之紅血球系特異性。(圖26B)表現γ-球蛋白之紅血球系(Ter119+ )及非紅血球系(Ter119- )細胞的百分比。*p＜0.05。使用雙向ANOVA進行統計分析。
投與腺病毒供體載體之前來自CD46tg及CD46+/+ /Hbbth-3 小鼠之肝臟及脾切片中藉由蘇木精/伊紅染色之髓外血細胞生成(圖27)。鐵沈積藉由普爾染色作為脾中之含鐵血黃素之細胞質藍顏料展示。
概言之，使用CD46轉殖基因小鼠之活體外及活體內HSPC轉導研究以及使用人類HSPC之活體外研究證實含有長LCR之載體的優越性。SB100x介導之併合頻率不因長轉位子而受損。除賦予較高γ-球蛋白表現量以外，長LCR亦提供更嚴格之紅血球特異性表現。重要的是，在用HDAd-長-LCR處理之後，為實現中間型地中海貧血症小鼠模型中完全治癒，需要不太密集之O6 BG/BCNU選擇。
材料與方法 .
組件位置：HS5àHS1 (21.5kb)：Chr11，5292319à5270789 (SEQ ID NO：6)；β-啟動子：chr11，5228631à5227018 (SEQ ID NO：7)；及3'HS1：Chr11，5206867à5203839 (SEQ ID NO：102)。
HDAd 載體： 先前已描述HDAd-SB及HDAd-短-LCR載體之產生(Richter等人,Blood 128: 2206-2217, 2016；Li等人,Mol Ther Methods Clin Dev 9: 142-152, 2018)。為產生HDAd-長-LCR載體，相應穿梭質體係基於黏質體載體pWE15 (Stratagene, La Jolla, CA)。pWE.Ad5-SB-mgmt含有Ad5 5'ITR (核苷酸1至436)及3'ITR (核苷酸35741至35938)、來源於pBS-µLCR-γ-球蛋白-mgmt之人類EF1α啟動子-mgmt(p140k)-SV40pA-cHS4卡匣(Wang等人, (2019)J Clin Invest 129: 598-615)、SB100x特異性IR/DR位點及FRT位點。pAd.LCR-β-GFP (含有21.5-kb人類β-球蛋白LCR (Wang等人, (2005)J Virol 79: 10999-11013)中之GFP-BGHpA片段經人類γ-球蛋白基因及其3'UTR區域(Chr 11:5,247,139 → 5,249,804) (pAd-長-LCR-β-γ-球蛋白)置換。質體pAd-長-LCR-β-γ-球蛋白含有21.5 kb人類β-球蛋白LCR及3.0 kb人類β-球蛋白3'HS1。將含有LCR-β-γ-球蛋白-3'HS1之28.9 kb片段插入至EF1α-mgmt-SV40pA-cHS4之卡匣下游，進入pWE.Ad5-SB-mgmt (pWE.Ad5-SB-長-LCR-γ-球蛋白/mgmt)。完整長-LCR-γ-球蛋白/mgmt卡匣由SB100x特異性IR/DR位點及FRT位點側接。使用Gigapack III Plus包裝提取物(Stratagene, La Jolla, CA)將所得質體包裝至噬菌體中且繁殖。為產生HD-Ad-長-LCR-γ-球蛋白/mgmt病毒，病毒基因體藉由I-CeuI消化自質體釋放以用於在116細胞中進行救援。人類群體中存在HBG1基因之兩種已知變異體，其具有單胺基酸變異(76-異白胺酸或76-蘇胺酸)。使用76-Ile HBG1變異體，頻率範圍為歐洲人中13%至東亞人中73%。
為產生HDAd病毒，病毒基因體藉由FseI消化自質體釋放以用於藉由Ad5/35++-Acr輔助病毒在116細胞(Palmer等人Mol Ther 8: 846-852, 2003)中進行救援。此輔助病毒為AdNG163-5/35++之衍生物，係含有由Ad5纖維尾、Ad35纖維軸及親和力增強之Ad35++纖維旋鈕構成之嵌合纖維的Ad5/35++輔助載體(Richter等人, (2016)Blood 128: 2206-2217)。合成人類密碼子最佳化之AcrIIA4-T2A-AcrIIA2序列，近來顯示其抑制SpCas9活性(Li等人,Mol Ther Methods Clin Dev 9: 390-401, 2018)且將其選殖至穿梭質體pBS-CMV-pA (pBS-CMV-Acr-pA)中。隨後，2.0 kb CMV-Acr-pA卡匣自pBS-CMV-Acr-pA擴增且藉由In-Fusion HD選殖套組(Takara)插入至pNG163-2-5/35++之SwaI位點中(Richter等人,Blood 128: 2206-2217 2016)。接著藉由PacI消化釋放病毒基因體且在293細胞中救援Ad5/35++-Acr輔助病毒且繁殖。Ad5/35++-Acr輔助病毒含有由Ad5纖維尾、Ad35纖維軸及親和力增強之Ad35++纖維旋鈕構成之嵌合纖維(Wang等人,J Virol 82: 10567-10579, 2008)。先前已描述HDAd-SB之產生(Richter等人,Blood 128: 2206-2217, 2016)。輔助病毒污染水準低於0.05%。所有製劑均不含細菌內毒素。
CD34+ 細胞培養：由冷凍儲備液回收來自G-CSF動員之成年供體的CD34+ 細胞且在補充有10%熱不活化FCS、1% BSA 0.1 mmol/l 2-巰基乙醇、4 mmol/l麩醯胺酸及青黴素/鏈黴素、Flt3配位體(Flt3L、25 ng/ml)、介白素3 (10 ng/ml)、血小板生成素(TPO) (2 ng/ml)及幹細胞因子(SCF) (25 ng/ml)之伊氏改良達爾伯克培養基(IMDM)中培育隔夜。流動式細胞測量術證實＞98%之細胞為CD34陽性。細胞介素及生長因子來自Peprotech (Rocky Hill, NJ)。在低附著12孔盤中CD34+ 細胞經病毒轉導。
紅血球系活體外分化 ： 基於以下中所述之方案，使人類HSPC分化成紅血球系細胞：Douay等人,Methods Mol Biol 482: 127-140, 2009。簡言之，在步驟1中，將密度為104 個細胞/毫升之細胞在補充有5%人類血漿、2 IU/ml肝素、10 μg/ml胰島素、330 μg/ml運鐵蛋白、1 μM氫皮質酮、100 ng/ml SCF、5 ng/ml IL-3、3 U/ml紅血球生成素(Epo)、麩醯胺酸及Pen-Strep之IMDM中培育7天。在步驟2中，將密度為1×105 個細胞/毫升之細胞在補充有5%人類血漿、2 IU/ml肝素、10 μg/ml胰島素、330 μg/ml轉鐵蛋白、100 ng/ml SCF、3 U/ml Epo、麩醯胺酸及Pen/Strep之IMDM中培育3天。在步驟3中，將密度為1×106 個細胞/毫升細胞之細胞在補充有5%人類血漿、2 IU/ml肝素、10 μg/ml胰島素、330 μg/ml運鐵蛋白、3 U/ml Epo、麩醯胺酸及Pen/Strep之IMDM中培育12天。
經轉導之 CD34+ 細胞之活體外選擇 ：在活體外分化方案之步驟1中，在第3天用O6 BG/BCNU選擇經轉導之CD34+細胞。簡言之，將CD34+細胞與50 µM O6 BG一起培育一小時，且隨後與35 µM BCNU一起再培育兩小時。接著洗滌細胞兩次且再懸浮於新鮮步驟1培養基中。
Lin- 細胞培養：使用來自Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Germany)之譜系細胞耗乏套組，藉由MACS自總小鼠骨髓細胞分離譜系陰性細胞。將Lin- 細胞在補充有10% FCS、10% BSA、Pen-Strep、麩醯胺酸、10 ng/ml人類TPO、20 ng/ml小鼠SCF及20 ng/ml人類Flt-3L之IMDM中培養。
球蛋白 HPLC ：在具有SPD-10AV二極體陣列偵測器及LC-10AT二元泵之Shimadzu Prominence儀器(Shimadzu, Kyoto, Japan)上定量個別球蛋白鏈含量。使用Vydac C4逆相管柱(Hichrom, UK)，以1 mL/min之速率施加0.1%三氟乙酸於水/乙腈中之40%-60%梯度混合物。
流動式細胞量測術 ：將細胞以1×106 個細胞/100微升再懸浮於補充有1% FCS之PBS中且與FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotech, Auburn CA)一起在冰上培育十分鐘。隨後，將染色抗體溶液添加於100 µL/106 個細胞中，且在冰上在黑暗中培育30分鐘。在培育之後，將細胞在FACS緩衝液(PBS、1% FBS)中洗滌一次。對於二次染色，用二次染色溶液重複染色步驟。在洗滌之後，將細胞再懸浮於FACS緩衝液中且使用LSRII流動式細胞量測儀(BD Biosciences, San Jose, CA)進行分析。使用正向散射區域及側向散射區域閘排除碎片。接著使用正向散射高度及正向散射寬度閘來閘控單細胞。接著使用FlowJo (10.0.8版本, FlowJo, LLC)分析流動式細胞量測術資料。對於LSK細胞之流動分析，將細胞用生物素結合之譜系偵測混合液(目錄號：130-092-613；Miltenyi Biotec, San Diego, CA)及針對c-Kit之抗體(目錄號：12-1171-83)及Sca-1 (目錄號：25-5981-82)以及APC結合之抗生蛋白鏈菌素染色。來自eBioscience (San Diego, CA)之其他抗體包括抗小鼠LY-6A/E (Sca-1)-PE-Cyanine7 (純系D7)、抗小鼠CD117 (c-Kit)-PE (純系2B8)、抗小鼠CD3-APC (純系17A2；目錄號：17-0032-82)、抗小鼠CD19-PE-Cyanine7 (純系eBio1D3；目錄號：25-0193-82)及抗小鼠Ly-66 (Gr-1)-PE (純系RB6-8C5；目錄號：12-5931-82)。抗小鼠Ter-119-APC (純系：Ter-119；目錄號：116211)來自Biolegend (San Diego, CA)。
關於偵測人類γ-球蛋白表現之細胞內流動式細胞量測術及即時逆轉錄PCR方法，參見Wang等人 (J. Clin Invest. 129(2):598-615, 2019)。
載體複本數之量測 ：使用Quick-DNA小型製備套組(Zymo Research)自骨髓細胞提取總DNA。將自HDAd-短LCR-γ-球蛋白/mgmt病毒提取之病毒DNA連續稀釋且用於標準曲線。在StepOnePlus即時PCR系統(Applied Biosystems)上使用power SYBR Green PCR主混合物一式三份地進行qPCR。10 µL反應使用9.6 ng DNA (9600 pg/6 pg/細胞 = 1600個細胞)。使用以下引子對：人類γ-球蛋白正向(SEQ ID NO: 86)及反向(SEQ ID NO: 87)。
併合位點分析 (LAM-PCR) 。關於資料之圖形描繪參見圖6。使用泊松回歸插入模型(Poisson Regression Insertion Model，PRIM)計算沿著小鼠參考基因體(mm9)中各染色體之長度非重疊之20千鹼基窗的預期插入率來創建用於圖7D之隨機化資料。PRIM演算法基於各窗內TA二核苷酸之數目、窗所位於之染色體及獨特插入之總數目生成統計模型。對於各窗口，計算預期插入數目且將其與所觀測到之插入數目進行比較以產生p值。接著應用龐費格尼校正(Bonferroni-correction)鑑別顯示用於偵測所插入轉位子之富集的窗。接著產生含有TA之參考基因體的隨機序列，使用Bowtie2定位且針對實際併合資料繪製。使用R中之ggplot2進行計算及製作曲線圖。使用HOMER及ChIPseeker繪圖。
併合位點分析 ( 反向 PCR) . 如其他地方所述，在進行修改下，藉由反向PCR分析總骨髓細胞中之接合點(Wang等人,J Virol 79: 10999-11013, 2005)。簡言之，根據製造商說明書，藉由Quick-DNA™小型製備套組(Zymo Research)自骨髓細胞分離基因體DNA。用SacI消化5-10 μg DNA且在促進分子內反應之條件下重新接合。用苯酚/氯仿萃取及乙醇沈澱純化接合混合物，且隨後使用KOD Hot Start DNA聚合酶用於巢式PCR (各30個循環)。使用以下引子：EF1α p1正向(SEQ ID NO: 88)及反向(SEQ ID NO: 89)；EF1α p2正向(SEQ ID NO: 90)及反向(SEQ ID NO: 91)；3' HS1 p1正向(SEQ ID NO: 92)及反向(SEQ ID NO: 93)；及3' HS1 p2正向(SEQ ID NO: 94)及反向(SEQ ID NO: 95)。
在上表中，帶下劃線之鹼基用於下游選殖。對PCR擴增子進行凝膠純化、選殖、定序及比對以鑑別併合位點。
動物： 所有涉及動物之實驗均根據控制機構準則且根據the Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) Public Health Assurance (PHS)政策、USDA Animal Welfare Act and Regulations、the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals及the controlling Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)政策進行。
使用含有完整人類CD46基因座之基於C57Bl/6之轉殖基因小鼠模型(hCD46tg)進行離體及活體內HSPC轉導研究。此等小鼠以與人類類似之模式及量表現hCD46 (Kemper等人,Clin Exp Immunol 124: 180-189, 2001)。
CD46+/+/Hbbth3 小鼠之培育及篩選 ： 在三輪回交之後，關於CD46之Hbbth3 小鼠純合性藉由PCR在gDNA [使用CD46F (SEQ ID NO: 96)及CD46R引子(SEQ ID NO: 97)以及藉由允許量測CD46 MFI之流動式細胞量測術證實。
骨髓 Lin- 細胞移植 ： 接受者為雌性C57BL/6小鼠，6-8週齡。在移植當天，接受小鼠用1000 Rad輻射。輻射之後四小時，經由尾靜脈經靜脈內注射1×106 個Lin- 細胞。此方案用於移植離體轉導Lin- 細胞及用於移植至二次接受者中。
HSPC 動員及活體內轉導 ：此程序如先前在Richter等人,Blood 128: 2206-2217, 2016中所述。在小鼠中，藉由皮下注射人類重組G-CSF (5 μg/小鼠/天，4天) (Amgen Thousand Oaks, CA)，隨後在第5天皮下注射AMD3100 (5 mg/kg) (Sigma-Aldrich)來動員HSPC。此外，在注射病毒之前16小時及2小時，動物腹膜內接受地塞米松(10 mg/kg)。在AMD3100之後三十分鐘及60分鐘，經由眶後叢，以每次注射各病毒4×1010 vp之劑量向動物靜脈內注射HDAd載體。四週後，開始O6 BG/BCNU之活體內選擇。
二次骨髓移植 ：接受者為雌性C57BL/6小鼠，6-8週齡，來自the Jackson Laboratory。在移植當天，接受小鼠用1000 Rad輻射。自活體內轉導之CD46tg小鼠無菌分離骨髓細胞且使用MACS分離譜系耗乏之細胞。輻射後四小時，以1×106 個細胞/小鼠靜脈內注射細胞。在第20週，處死二次接受者且藉由MACS自血液、骨髓及脾分離CD46+細胞或進行動員及活體內轉導，如上所述。所有二次接受者在第4週開始接受免疫抑制。
血液分析 ：將血液樣品收集至經EDTA塗佈之試管中，且在HemaVet 950FS (Drew Scientific)上進行分析。
組織分析 ：將2.5 μm厚度之脾及肝臟組織切片固定於4%甲醛中至少24小時，脫水且包埋於石蠟中。使用蘇木精-伊紅染色以對髓外血細胞生成進行組織學評估。藉由普爾普魯士藍染色在組織切片中偵測到含鐵血黃素。簡言之，用等體積(2%)之亞鐵氰化鉀及鹽酸於蒸餾水中之混合物處理組織切片，且隨後用中性紅對比染色。脾尺寸評定為脾重量(mg)/體重(g)之比率。
血液分析及骨髓細胞離心塗片：將血液樣品收集至塗有EDTA之試管中且在HemaVet 950FS (Drew Scientific, Waterbury, CT)或ProCyteDx™ (IDEXX, Westbrook, Maine)機上進行分析。製備周邊血液抹片且分別用May-Grünwald/吉姆沙染色5及15分鐘(Merck, Darmstadt, Germany)。使用細胞離心塗片裝置將骨髓細胞之懸浮液離心至載片上且用May-Grünwald/吉姆沙染色。對血液抹片上之網狀紅血球進行計數之研究人員對樣品組分配不知情。僅動物編號出現在載片上(每隻動物5個載片，5個隨機1 cm2 切片)。
統計分析 ：資料呈現為平均值±平均值之標準誤差(SEM)。對於多個組之比較，採用單向及雙向變異數分析(ANOVA)與用於多重比較之龐費格尼事後檢驗進行。一個分組變數之群間差異藉由未配對雙尾史都登氏t-檢驗(Student's t-test)測定。對於非參數分析，使用克-瓦檢驗(Kruskal-Wallis test)。使用GraphPad Prism 6.01版本(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)進行統計分析。*p≤0.05，** p≤0.0002，***p ≤0.00003。P值小於0.05視為顯著的。
討論 . 其中之一，人類β-球蛋白基因簇位於染色體11中且跨越100 kb。已提出β-球蛋白基因座形成由順式調控元件及活性β-球蛋白基因構成之紅血球特異性空間結構，稱為活性染色質中心(ACH)(Tolhius等人,Mol Cell, 10:1453-1465, 2002)。核心ACH為發育保守的，且包括上游5' DNA水解酶超敏區1至5，稱為球蛋白LCR，及下游3' HS1以及紅血球特異性反式作用因子(Kim等人,Mol Cell Biol., 27:4551-65, 2007)。對於基因療法應用，值得注意的是，含有HS1至HS5之23 kb β-球蛋白LCR加3 kb 3' HS1區域賦予轉殖基因小鼠中之順式連接之基因高水準的紅血球特異性非位置依賴性表現(Grosveld,Cell , 51:975-985, 1987)。在此LCR控制下遞送轉殖基因之工具可用於30+ kb HDAd載體。
許多遺傳疾病之校正需要高水準及組織限制性的治療性基因表現，此可藉由採用LCR實現(Li等人,Blood 100: 3077-3086, 2002)。對於治癒重型β-地中海貧血症或鐮狀細胞貧血症而言，認為需要HSPC中約20%基因標記及紅血球系細胞中20%治療性球蛋白鏈(β-或γ-球蛋白)產生(Fitzhugh等人,Blood 130: 1946-1948, 2017)。由於尺寸限制，僅β-球蛋白LCR之截短形式可用於慢病毒載體中，此使得難以滿足校正性基因表現量之要求(Uchida等人,Nat Commun 10: 4479, 2019)。在慢病毒介導之HSPC轉導後增加表現量之策略係增加載體劑量且因此增加併合轉殖基因複本之數目。然而，此方法增強基因毒性及致瘤性之風險。其他嘗試集中於進一步最佳化球蛋白表現卡匣(Uchida等人,Nat Commun 10: 4479, 2019)。具有30 kb之插入容量之HDAd載體為產生後一概念之理想工具。在此實例中，產生攜有29 kb γ-球蛋白表現卡匣之HDAd5/35++載體，且在CD46轉殖基因小鼠中之活體外及活體內HSPC轉導之後測試。
在HDAd載體系統中，γ-球蛋白卡匣之併合由SB100x轉位酶介導。使用SB/轉位子系統之非病毒性基因轉移在臨床上用於CD19 CAR T細胞療法(Kebriaei等人,J Clin Invest 126: 3363-3376, 2016)、年齡相關之黃斑變性(Hudecek等人,Crit Rev Biochem Mol Biol 52: 355-380, 2017；Thumann等人,Mol Ther Nucleic Acids 6: 302-314, 2017)及阿爾茨海默氏病(Eyjolfsdottir等人,Alzheimers Res Ther 8: 30, 2016)。HDAd介導之SB基因轉移由Kay及Ehrhardt小組開創。在其研究中，轉位子相對較小；4 kb-6 kb (Hausl等人,Mol Ther 18: 1896-1906, 2010；Yant等人,Nat Biotechnol 20: 999-1005, 2002)。當前實例第一次證明，基於可比VCN (2-3個複本/細胞)，SB100x能夠以與11.8 kb轉位子之功效相當的功效併合32.4 kb轉位子。此發現本身與以下觀測結果矛盾：SBE介導之併合之功效與SB轉位子之尺寸成反比(Karsi等人,Mar Biotechnol (NY) 3: 241-245, 2001)。該系統似乎打破尺寸限制。首先，為形成催化啟動之轉位子/轉位酶複合物，轉位子之兩個末端必須保持在一起以與轉位酶分子緊靠(Hudecek等人,Crit Rev Biochem Mol Biol 52: 355-380, 2017)。此限制已藉由將frt側併入HDAd載體中，由共表現之Flpe重組酶識別，引起轉位子之環化而解決(Yant等人,Nat Biotechnol 20: 999-1005, 2002)。限制大構築體轉位之第二機制為自殺轉位機制，稱為自體併合，亦即併合至轉位子內部之TA二核苷酸中(Wang等人,PLoS Genet 10 : e1004103, 2014)。未看到的HDAd-短-LCR與HDAd-長-LCR之間的VCN差異可能與富集具有一定mgtmP140K 表現量之HSPC及祖細胞，亦即富集已達到臨限VCN之細胞的活體內選擇相關。
由於O6 BG/BCNU活體內選擇系統強大，所以幾乎100%之周邊血液紅血球均含有γ-球蛋白。雖然此活體內選擇方法不影響骨髓中之細胞組成，但其引起白血球減少症。因此努力集中於不涉及細胞毒性藥物BCNU之替代方法上。值得注意的是，如由鼠類地中海貧血症模型中之研究支持(Wang等人,J Clin Invest 129: 598-615, 2019)，醫藥活體內選擇可能並非血紅素病之患者所必需的，因為經基因校正之HSPC將具有優於未經校正之細胞的增殖優勢(Perumbeti等人,Blood 114: 1174-1185, 2009)。
鑒於初次動物及二次接受者中HDAd-短-LCR及HDAd-長-LCR之可比VCN，RBC及骨髓紅血球系祖細胞中之γ-球蛋白含量(藉由HPLC及qRT-PCR量測)顯著高於含有長LCR之載體。有趣的是，兩種載體之間的差異在二次接受者中更明顯。此暗示源自經轉導之長期再生HSPC之RBC具有較高γ-球蛋白含量。此外，HDAd-長-LCR顯示更強之紅血球系特異性。此等效應可歸因於HDAd-長-LCR中因LCR染色體打開能力而更好地接近轉錄因子之額外LCR元件(Li等人,Blood 100: 3077-3086, 2002)，及/或促使γ-球蛋白基因轉錄增加之額外轉錄因子之結合。LCR之另一特徵值得注意，亦即其能夠充當自主調控單元，此意味著在隨機併合之後相鄰基因之反式活化較少。在此上下文中，使用更完整之LCR型式降低該方法之潛在基因毒性。
總之，當前實例尤其描述一種載體，其在小鼠中之活體內HSPC轉導之後賦予γ-球蛋白含量，該等γ-球蛋白含量符合被視為可治癒重型地中海貧血症及鐮狀細胞貧血的基因表現閾值。
實例 2 ： SB 轉位酶 ITR
本實例比較編碼GFP及MGMTP140K 可選標記物之轉位子負載對目標細胞之標記，其中該轉位子負載由三種不同SB ITR側接。本實例包括三種質體，其中mgmt/GFP轉位子負載由以下側接：(i) pT0 ITR；(ii) pT2 ITR；或(iii) pT4 ITR，該等質體其他方面均一致。在此實例中，將293細胞用包括mgmt./GFP轉位子負載之三種質體轉染，有或無編碼pSB100x之支撐質體。T2為Cooper lab研發之IR且目前在臨床上用於CAR T細胞療法(Srour等人,Blood 235(11):862-865, 2020; PMID 31961918)。T4為Izcvak lab研發之IR的另一型式(Kebriaei等人,Trends Genet . 33(11)852-870, 2017; PMID: 28964527)。本發明者不瞭解T0、T2及T4之任何先前並列比較。
在有或無選擇下培養細胞17天。對於未進行選擇之細胞，在第3、12及17天，且對於藉由在第3天單次添加50 µM O6 BG/BCNU進行選擇之細胞，在第17天，吸取培養物樣品(參見圖28)。在一個系列中，細胞在第3、6及12天1:10繼代以消除游離型質體。GFP表現(在第17天分析)表示自併合轉位子之表現。在另一系列中，包括O6 BG/BCNU選擇步驟以富集具有併合之mgmt的細胞。
藉由流動式細胞量測術分析細胞。在不存在SB100x之情況下，GFP表現來源於殘餘游離型質體，且正如所料，未觀測到差異。圖29展示對於T0、T2及T4質體中之每一者，在有或無SB100x質體下培養之細胞在培養第12及17天表現GFP之293細胞的百分比。在SB100x存在之情況下，發生併合。T0及T2之GFP+細胞百分比相當，但T4顯著較高(p＜0.01)。GFP MFI反映GFP表現量，亦即每個細胞之併合轉位子複本數目。同樣，T4之MFI顯著較高。T0與T2之間亦存在顯著差異。總之，雖然所有IR均適合用於本發明之方法及組合物中，包括基因療法，但T4 IR在介導SB100x併合中係優良的。圖30展示對於T0、T2及T4質體中之每一者，在有或無SB100x質體下培養之細胞在用O6 BG/BCNU對細胞進行選擇下在培養第17天表現GFP之293細胞的百分比。抗性細胞之相對數目。O6 BG/BCNU選擇殺死未進行轉位子(GFP/mgtm)併合之細胞。無SB下存活細胞之背景可能歸因於游離型載體。在SB存在下，T0與T2之間的差異以及T2與T4之間的差異為顯著的，再次強調T4之優越性。正如所料，在所有經歷O6 BG/BCNU選擇而存活之細胞中GFP表現應相當。
實例 3 ： 經工程改造以有效併合之轉位子
本實例提供可有效併合至目標細胞基因體中之示例性轉位子負載。例示性轉位子具有在2.8 kb至31.8 kb範圍內之長度，且將在根據本發明之轉位子長度之所提供範圍內觀測到高效併合。本實例之轉位子由睡美人轉位酶(包括但不限於SB100x)可靶向之睡美人IR側接。在本實例中提供之轉位子與本實例之較短轉位子(或其他參考轉位子)的比較將不證明長度依賴性，及/或基於併合之頻率及/或效率，將證明長度依賴性程度低於熟習此項技術者所預期。在各種實施例中，舉例而言，併合之頻率及/或效率可藉由每個目標基因體之轉位子併合事件數目及/或藉由包括至少一個(或至少兩個，或至少三個)轉位子併合事件之目標基因體數目來量測。
多種示例性轉位子負載提供於圖31-43中。圖中提供之某些表示包括呈環化質體格式之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。
本實例包括一種在本文中稱為PWEAd5-PT4LCR-球蛋白/mgmt或pWEAd5-PT4-LCR-球蛋白-mgmt之核酸，其包括長度為31.776 kb之轉位子(圖31)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與β啟動子、包括HS1-HS5之長LCR及3'HS1可操作地連接之γ-球蛋白編碼序列，及(ii) MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與Ef1a啟動子可操作地連接。
本實例包括一種在本文中稱為HDAd5-PT4-長LCR球蛋白-rhMGMT之核酸，其包括長度為31.772 kb之轉位子(圖32)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與β啟動子、包括HS1-HS5之長LCR及3'HS1可操作地連接之γ-球蛋白編碼序列，及(ii) MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與Ef1a啟動子可操作地連接。
本實例包括一種在本文中稱為HDAd-Ad5-PT4-LCR-hACE2/mgmt之核酸，其包括長度為13.173 kb之轉位子(圖33)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其pT4睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與β啟動子及包括HS1-HS4之LCR可操作地連接之重組人類ACE2編碼序列，及(ii) MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與Ef1a啟動子可操作地連接。
本實例包括一種在本文中稱為pWEHCB-微LCR-球蛋白/mgmt之核酸，其包括長度為12.169 kb之轉位子(圖34)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與β啟動子及包括HS1-HS4之微LCR可操作地連接之γ球蛋白編碼序列，及(ii) MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與Ef1a啟動子可操作地連接。
本實例包括一種在本文中稱為pWEHCA-Faconi-GFP之核酸，其包括長度為9.382 kb之轉位子(圖35)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與pgk啟動子可操作地連接之FancA編碼序列，及(ii)與Ef1a啟動子可操作地連接之GFP編碼序列。
本實例包括一種在本文中稱為pHCA-T4-rhMGMT-GFP之核酸，其包括長度為5.49 kb之轉位子(圖36)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其pT4睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與PGK啟動子可操作地連接之GFP編碼序列，及(ii) MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與EF1a啟動子可操作地連接。
本實例包括一種核酸，其包括長度為3.797 kb之轉位子(圖37)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i) GFP編碼序列，及(ii) MGMTP140K 編碼序列，其與EF1a啟動子可操作地連接。
本實例包括一種在本文中稱為pBHCA-PT0-EF1a-mgmt/GFP之核酸，其包括長度為3.709 kb之轉位子(圖38)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其pT0睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i) eGFP編碼序列，及(ii) MGMTP140K 編碼序列，其與EF1a啟動子可操作地連接。
本實例包括一種在本文中稱為pHCA(Ad35)-PT4-EF1a-mgmt/GFP之核酸，其包括長度為3.547 kb之轉位子(圖39)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其pT4睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i) GFP編碼序列，及(ii) MGMTP140K 編碼序列，其與EF1a啟動子可操作地連接。
本實例包括一種在本文中稱為pHCA-Ad5-PT4-Ef1a-mgmt/GFP之核酸，其包括長度為3.543 kb之轉位子(圖40)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其pT4睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i) GFP編碼序列，及(ii) MGMTP140K 編碼序列，其與EF1a啟動子可操作地連接。
本實例包括一種在本文中稱為pHCA(Ad35)-PT4-EF1a-mgmt之核酸，其包括長度為2.781 kb之轉位子(圖41)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其pT4睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與EF1a啟動子可操作地連接。
本實例包括一種在本文中稱為pHCA-T4-Ef1a-rhMGMT之核酸，其包括長度為2.777 kb之轉位子(圖42)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其pT4睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與EF1a啟動子可操作地連接。
本實例包括一種在本文中稱為之核酸，pHCA-Ad5-PT4-Ef1a-mgmt其包括長度為之轉位子2.751 kb(圖43)。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其pT4睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與EF1a啟動子可操作地連接。
(XII) 結尾段 .
如一般技術者將理解，本文所揭示之各實施例可包括其具體陳述之要素、步驟、成分或組分、基本上由其組成或由其組成。因此，術語「包括(include)」或「包括(including)」應解釋為引用：「包含、由……組成或基本上由……組成」。過渡術語「包括(comprise)」或「包括(comprises)」意謂「包括(但不限於)」且允許包括未指定要素、步驟、成分或組分，甚至是大量的。過渡片語「由……組成」排除未指定之任何要素、步驟、成分或組分。過渡片語「基本上由…組成」將實施例之範疇限制為指定之要素、步驟、成分或組分以及不實質上影響實施例之彼等要素、步驟、成分或組分。在此情形下，實質影響為降低腺病毒載體攜帶大轉位子負載及/或將大負載併合至目標基因體中之能力的組合物或方法之任何變化。
除非另外指出，否則說明書及申請專利範圍中所使用之表示成分之量，諸如分子量、反應條件等之特性的所有數字應理解為在所有情況下均由術語「約」修飾。因此，除非相反指示，否則本說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為近似值，其可視本發明設法獲得之所要特性而變化而定。至少，且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位之個數且藉由應用普通捨入技術來解釋。當進一步要求清晰時，在結合所陳述數值或範圍使用時，術語「約」具有由熟習此項技術者合理地歸屬至其之含義，亦即表示比所陳述值或範圍略多或略少，在所陳述值±20%之範圍內；所陳述值±19之範圍內；所陳述值±18%之範圍內、所陳述值±17%之範圍內；所陳述值±16%之範圍內；所陳述值±15%之範圍內；所陳述值±14%之範圍內；所陳述值±13%之範圍內；所陳述值±12%之範圍內；所陳述值±11%之範圍內；所陳述值±10%之範圍內；所陳述值±9%之範圍內；所陳述值±8%之範圍內；所陳述值±7%之範圍內；所陳述值±6%之範圍內；所陳述值±5%之範圍內；所陳述值±4%之範圍內；所陳述值±3%之範圍內；所陳述值±2%之範圍內或所陳述值±1%之範圍內。
儘管闡述本發明之廣泛範疇的數值範圍及參數為近似值，但特定實施例中所闡述之數值應儘可能精確地報導。然而，任何數值均固有地含有因其對應測試量測值中發現之標準差所必然引起的某些誤差。
本文中值的範圍之敍述僅僅意欲充當個別地提及處於該範圍內之每一單獨值的簡寫方法。除非本文中另外指示，否則將各個別值併入至本說明書中，如同其在本文中個別地敍述一般。除非本文另外指示或另外與上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法均可以任何適合之順序進行。除非另外主張，否則使用本文所提供之任何及所有實例或示例性語言(例如，「諸如」)僅意欲更好地闡明本發明而不對本發明之範疇造成限制。本說明書中沒有語言應解釋為指示實施本發明所必需之任何未主張要素。
本文中所揭示之本發明之替代性要素或實施例的分組不應理解為限制。可個別地或以與群組之其他成員或本文中所發現之其他要素的任何組合來提及及主張各群組成員。預期群組中之一或多個成員可出於便利性及/或專利性原因而包括於群組中或自群組刪除。當任何此類包括或刪除發生時，本說明書被認為含有如所修改之群組，因此滿足所附申請專利範圍中所使用之所有馬庫什群組(Markush group)的書面描述。
本文中描述本發明之某些實施例，包括本發明者已知之進行本發明的最佳模式。當然，此等所描述實施例之變化在一般技術者閱讀前述描述後將變得顯而易見。本發明者期望熟習此項技術者適當時採用此等變化，且本發明者意欲以不同於本文中特定描述之方式來實踐本發明。因此，若適用法律允許，則本發明包括隨附於本文之申請專利範圍中所述之主題的所有修改及同等物。此外，除非本文另外指出或另外與上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素在其所有可能變體中之任何組合。
此外，在整個本說明書(本文中所提及之材料)中，已大量提及專利、印刷之公開案、期刊文章及其他書面文字。所提及之材料中之每一者針對其所提及之教示內容以全文引用之方式個別併入本文中。
應瞭解，本文中所揭示的本發明之實施例說明本發明之原理。可使用之其他修改在本發明之範疇內。因此，作為實例而非限制，可根據本文中之教示利用本發明之替代性組態。因此，本發明不限於如所準確展示及描述之內容。
本文中所展示之細節僅作為實例且出於例示性論述本發明之較佳實施例的目的，且為了提供被認為係本發明之各種實施例的原理及概念態樣之最有用且易於理解之描述而呈現。就此而言，不會試圖比基本理解本發明所需要之內容更詳細地來展示本發明之結構性細節，結合圖式及/或實例之描述使熟習此項技術者顯而易見如何在實際中體現本發明之若干形式。
除非在實例中清晰且明確地修改，或當含義之應用致使任何構造無意義或基本上無意義時，本發明中所用之定義及解釋意謂且意欲在任何未來構造中為主。在術語之構造將顯致使其無意義或基本上無意義之狀況下，定義應取自Webster's Dictionary (第3版)或一般技術者已知之辭典，諸如the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (編輯Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)。 序列表概述
本文所述之核酸及/或胺基酸序列使用標準字母縮寫顯示，如37 C.F.R. §1.822中所定義。雖然僅展示各核酸序列之一個股，但互補股應理解為包括在其適合之實施例中。具有136 KB之檔案大小之於或約於2021年4月9日創建之題為「F053-0126PCT_SeqList.txt (Sequence Listing.txt)」的電腦可讀文字檔案含有本申請案之序列表且以全文引用之方式併入本文中。在隨附序列表中：
SEQ ID NO: 1為5'末端載體序列、睡美人IR/DR序列、併合接點(chr15，6805206)之核苷酸序列，圖2C中所示。
Figure 02_image001
SEQ ID NO: 2為5'末端載體序列、睡美人IR/DR序列、併合接點(chrX，16897322)之核苷酸序列，圖2C中所示。
Figure 02_image003
SEQ ID NO: 3為3'末端載體序列、睡美人IR/DR序列、併合接點(chr4，10207667)之核苷酸序列，圖2C中所示。
Figure 02_image005
SEQ ID NO: 4為睡美人IR/DR序列、併合接點(chr7，79796094)之核苷酸序列，圖7B中所示。
Figure 02_image007
SEQ ID NO: 5為睡美人IR/DR序列、併合接點(重複區域)之核苷酸序列，圖7B中所示。
Figure 02_image009
SEQ ID NO: 6為人類染色體11之位置5292319-5270789 (21,531 bp)之長β-球蛋白LCR之核苷酸序列：
Figure 02_image011
Figure 02_image013
Figure 02_image015
Figure 02_image017
Figure 02_image019
Figure 02_image021
Figure 02_image023
Figure 02_image025
SEQ ID NO: 7為包括人類染色體11之位置5228631-5227018 (1614 bp)之可轉位轉殖基因插入物的核苷酸序列：
Figure 02_image027
SEQ ID NO: 8為Her2特異性CDRL1之胺基酸序列：KASQDVSIGVA
SEQ ID NO: 9為Her2特異性CDRL2之胺基酸序列：ASYRYT
SEQ ID NO: 10為Her2特異性CDRL3之胺基酸序列：QQYYIYPYT
SEQ ID NO: 11為Her2特異性CDRH1之胺基酸序列：GFTFTDYTMD
SEQ ID NO: 12為Her2特異性CDRH2之胺基酸序列：DVNPNSGGSIYNQRFK
SEQ ID NO: 13為Her2特異性CDRH3之胺基酸序列：LGPSFYFDY
SEQ ID NO: 14為PD-L1特異性CDRL1之胺基酸序列：RASKGVSTSGYSYLH
SEQ ID NO: 15為PD-L1特異性CDRL2之胺基酸序列：LASYLES
SEQ ID NO: 16為PD-L1特異性CDRL3之胺基酸序列：QHSRDLPLT
SEQ ID NO: 17為PD-L1特異性CDRH1之胺基酸序列：NYYMY
SEQ ID NO: 18為PD-L1特異性CDRH2之胺基酸序列：GINPSNGGTNFNEKFKN
SEQ ID NO: 19為PD-L1特異性CDRH3之胺基酸序列：RDYRFDMGFDY
SEQ ID NO: 20為阿維魯單抗特異性可變重鏈之胺基酸序列：
Figure 02_image029
SEQ ID NO: 21為阿維魯單抗特異性可變輕鏈之胺基酸序列：
Figure 02_image031
SEQ ID NO: 22為阿維魯單抗特異性CDRH1之胺基酸序列：SGFTFSSYIMM
SEQ ID NO: 23為阿維魯單抗特異性CDRH2之胺基酸序列：SIYPSGGITFYADTVKG
SEQ ID NO: 24為阿維魯單抗特異性CDRH3之胺基酸序列：IKLGTVTTVDY
SEQ ID NO: 25為阿維魯單抗特異性CDRL1之胺基酸序列：TGTSSDVGGYNYVS
SEQ ID NO: 26為阿維魯單抗特異性CDRL2之胺基酸序列：DVSNRPS
SEQ ID NO: 27為阿維魯單抗特異性CDRL3之胺基酸序列：SSYTSSSTRV
SEQ ID NO: 28為之胺基酸序列阿特珠單抗特異性可變重鏈，包括
Figure 02_image033
SEQ ID NO: 29為阿特珠單抗特異性可變輕鏈之胺基酸序列：
Figure 02_image035
SEQ ID NO: 30為阿特珠單抗特異性CDRH1之胺基酸序列：SGFTFSDSWIH
SEQ ID NO: 31為阿特珠單抗特異性CDRH2之胺基酸序列：WISPYGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 32為阿特珠單抗特異性CDRH3之胺基酸序列：RHWPGGFDY
SEQ ID NO: 33為阿特珠單抗特異性CDRL1之胺基酸序列：RASQDVSTAVA
SEQ ID NO: 34為阿特珠單抗特異性CDRL2之胺基酸序列：SASFLYS
SEQ ID NO: 35為阿特珠單抗特異性CDRL3之胺基酸序列：QQYLYHPAT
SEQ ID NO: 36為PSMA特異性特異性CDRL1之胺基酸序列：KASQDVGTAVD
SEQ ID NO: 37為PSMA特異性CDRL2之胺基酸序列：WASTRHT
SEQ ID NO: 38為PSMA特異性CDRL3之胺基酸序列：QQYNSYPLT
SEQ ID NO: 39為PSMA特異性CDRH1之胺基酸序列：GYTFTEYTIH
SEQ ID NO: 40為PSMA特異性CDRH2之胺基酸序列：NINPNNGGTTYNQKFED
SEQ ID NO: 41為PSMA特異性CDRH3之胺基酸序列：GWNFDY
SEQ ID NO: 42為MUC16特異性CDRL1之胺基酸序列：SEDIYSG
SEQ ID NO: 43為MUC16特異性CDRL3之胺基酸序列：GYSYSSTL
SEQ ID NO: 44為MUC16特異性CDRH1之胺基酸序列：TLGMGVG
SEQ ID NO: 45為MUC16特異性CDRH2之胺基酸序列：HIWWDDDKYYNPALKS
SEQ ID NO: 46為MUC16特異性CDRH3之胺基酸序列：IGTAQATDALDY
SEQ ID NO: 47為FOLR特異性CDRL1之胺基酸序列：KASQSVSFAGTSLMH
SEQ ID NO: 48為FOLR特異性CDRL2之胺基酸序列：RASNLEA
SEQ ID NO: 49為FOLR特異性CDRL3之胺基酸序列：QQSREYPYT
SEQ ID NO: 50為FOLR特異性CDRH1之胺基酸序列：GYFMN
SEQ ID NO: 51為FOLR特異性CDRH2之胺基酸序列：RIHPYDGDTFYNQKFQG
SEQ ID NO: 52為FOLR特異性CDRH3之胺基酸序列：YDGSRAMDY
SEQ ID NO: 53為阿瑪西單抗特異性可變重鏈之胺基酸序列：
Figure 02_image037
Figure 02_image039
.
SEQ ID NO: 54為阿瑪西單抗特異性可變輕鏈之胺基酸序列：
Figure 02_image041
SEQ ID NO: 55為阿瑪西單抗特異性CDRH1之胺基酸序列：GYSFTGYTMN
SEQ ID NO: 56為阿瑪西單抗特異性CDRH2之胺基酸序列：LITPYNGASSYNQ
SEQ ID NO: 57為阿瑪西單抗特異性CDRH3之胺基酸序列：GGYDGRGFDY
SEQ ID NO: 58為阿瑪西單抗特異性CDRL1之胺基酸序列：SASSSVSYMH
SEQ ID NO: 59為阿瑪西單抗特異性CDRL2之胺基酸序列：DTSKLAS
SEQ ID NO: 60為阿瑪西單抗特異性CDRL3之胺基酸序列：QQWSKHPLT
SEQ ID NO: 61為Nef (66-97)之胺基酸序列：
Figure 02_image043
SEQ ID NO: 62為Nef (116-145)之胺基酸序列：
Figure 02_image045
SEQ ID NO: 63為Gag p17 (17-35)之胺基酸序列：
Figure 02_image047
SEQ ID NO: 64為Gag p17-p24 (253-284)之胺基酸序列：
Figure 02_image049
SEQ ID NO: 65為Pol 325-355 (RT 158-188)：
Figure 02_image051
SEQ ID NO: 66為編碼睡美人之IR/DR及染色體序列之序列的核苷酸序列：
Figure 02_image053
SEQ ID NO: 67為編碼睡美人之IR/DR及染色體序列之序列的核苷酸序列：
Figure 02_image055
SEQ ID NO: 68為睡美人之IR/DR編碼序列之核苷酸序列：ACTTAAGTGTATGTAAACTTCCGACTTCAACTG
SEQ ID NO: 69為編碼睡美人之IR/DR及染色體序列之序列的核苷酸序列：
Figure 02_image057
Figure 02_image059
SEQ ID NO: 70為編碼睡美人之IR/DR及染色體序列之序列的核苷酸序列：
Figure 02_image061
SEQ ID NO: 71為編碼睡美人之IR/DR之序列：
Figure 02_image063
SEQ ID NO: 72為編碼睡美人之IR/DR及染色體序列之序列的核苷酸序列：
Figure 02_image065
SEQ ID NO: 73為編碼睡美人之IR/DR之序列的核苷酸序列：
Figure 02_image067
SEQ ID NO: 74為睡美人轉位酶：
Figure 02_image069
SEQ ID NO: 75為過度活性睡美人SB100X之胺基酸序列：
Figure 02_image071
Figure 02_image073
.
SEQ ID NO: 76為piggyBac™ (PB)轉位酶之胺基酸序列：
Figure 02_image075
Figure 02_image077
SEQ ID NO: 77為Frog Prince轉位酶之胺基酸序列：
Figure 02_image079
Figure 02_image081
.
SEQ ID NO: 78為TcBuster轉位酶之胺基酸序列：
Figure 02_image083
SEQ ID NO: 79為Tol2轉位酶之胺基酸序列：
Figure 02_image085
SEQ ID NO: 80為SV40啟動子之核苷酸序列：
Figure 02_image087
Figure 02_image089
.
SEQ ID NO: 81為dESV40啟動子之核苷酸序列：
Figure 02_image091
Figure 02_image093
SEQ ID NO: 82為人類端粒酶催化次單元(hTERT)啟動子之核苷酸序列：
Figure 02_image095
SEQ ID NO: 83為來源於施密特-魯賓A株之RSV啟動子之核苷酸序列：
Figure 02_image097
SEQ ID NO: 84為hNIS啟動子之核苷酸序列：
Figure 02_image099
Figure 02_image101
SEQ ID NO: 85為人類糖皮質激素受體1A (hGR 1/Ap/e)啟動子之核苷酸序列：
Figure 02_image103
SEQ ID NO: 86為人類γ-球蛋白正向引子之核苷酸序列：
Figure 02_image105
SEQ ID NO: 87為人類γ-球蛋白反向引子之核苷酸序列：
Figure 02_image107
SEQ ID NO: 88為EF1α p1正向引子之核苷酸序列：
Figure 02_image109
SEQ ID NO: 89為EF1α p1反向引子之核苷酸序列：
Figure 02_image111
SEQ ID NO: 90為EF1α p2正向引子之核苷酸序列：
Figure 02_image113
SEQ ID NO: 91為EF1α p2反向引子之核苷酸序列：
Figure 02_image115
SEQ ID NO: 92為3'HS1 p1正向引子之核苷酸序列：
Figure 02_image117
SEQ ID NO: 93為3'HS1 p1反向引子之核苷酸序列：
Figure 02_image119
SEQ ID NO: 94為3'HS1 p2正向引子之核苷酸序列
Figure 02_image121
SEQ ID NO: 95為3'HS1 p2反向引子之核苷酸序列：
Figure 02_image123
SEQ ID NO: 96為CD46F引子之核苷酸序列：5'-AAAGGGCAAAT ACCTTAAGGGGTG-3'
SEQ ID NO: 97為CD46R引子之核苷酸序列：5'-AGCACTTCGACCTAAAAATAGAGAT-3'
SEQ ID NO: 98 – 具有插入之XhoI位點(位置10655-10661)之長β-球蛋白LCR：
Figure 02_image125
Figure 02_image127
Figure 02_image129
Figure 02_image131
Figure 02_image133
Figure 02_image135
Figure 02_image137
Figure 02_image139
SEQ ID NO: 99 (示例性ET3序列)
Figure 02_image141
SEQ ID NO: 100 (示例性β-球蛋白序列)
Figure 02_image143
SEQ ID NO: 101 (示例性γ-球蛋白序列)
Figure 02_image145
SEQ ID NO: 102 (示例性3'HS1核酸序列)
Figure 02_image147
Figure 02_image149
本文中所提交之圖中之一或多者呈色彩可更好地理解。申請人考慮圖式之彩色版本作為原始提交之部分且保留在稍後程序中呈現圖式之彩色影像的權利。
圖 1A-1D . 使用HDAd-長-LCR之離體HSPC轉導研究。(圖1A)載體結構。γ-球蛋白基因處於21.5 kb β-球蛋白LCR、1.6 kb β-球蛋白啟動子及亦來源於β-球蛋白基因座之3'HS1區的控制下。為使紅血球系細胞中之RNA穩定，將β-球蛋白基因UTR連接於γ-球蛋白基因之3'末端。載體亦含有mgmtP140K 之表現卡匣，允許經轉導之HSPC及HSPC子代之活體內選擇。γ-球蛋白與mgmt表現卡匣由雞球蛋白HS4分離子(insulator)分隔開。32.4 kb LCR-γ-球蛋白/mgtm轉位子由反向重複序列(IR)側接，該等反向重複序列由SB100x及ftr位點識別，允許轉位子藉由Flpe重組酶環化。(圖1B)實驗方案。來自CD46-轉殖基因小鼠之骨髓Lin- 細胞經HDAd-長-LCR及HDAd-SB以每個細胞500 vp之總MOI轉導。在培養一天之後，將1×106 個轉導細胞/小鼠移植至經致死輻射之C57Bl/6小鼠中。在第4週，開始O6 BG/BCNU處理，且每兩週重複四次。在各週期下，BCNU濃度自5 mg/kg增加至7.5 mg/kg、至10 mg/kg (兩次)。在第20週，處死小鼠。(圖1C)藉由流動式細胞量測術量測之人類γ-球蛋白陽性周邊紅血球(RBC)之百分比。各符號為個別動物。(圖1D)代表性流式細胞量測資料，其展示在移植後第20週紅血球系(Ter119+ )骨髓細胞中人類γ-球蛋白之表現(下圖)。上圖顯示移植有模擬轉導細胞之小鼠。
圖 2A-2C . 在移植後第20週，對來自動物之骨髓細胞中之載體/染色體接點之iPCR分析。(圖2A) iPCR分析之示意圖。用SacI消化五微克基因體DNA，重新接合，且用所指示引子對其進行巢式反向PCR (參見材料與方法)。(圖2B)含有併合接點之選殖質體之瓊脂糖凝膠電泳。切除所指示條帶並定序。染色體併合位點展示在凝膠下方。(圖2C)接合序列之實例：5'末端載體序列、睡美人IR/DR序列、併合接點(chr15，6805206) SEQ ID NO: 1；5'末端載體序列、睡美人IR/DR序列、併合接點(chrX，16897322) SEQ ID NO: 2；3'末端載體序列、睡美人IR/DR序列、併合接點(chr4，10207667) SEQ ID NO: 3。載體及IR/DR序列分別以純文字及下劃線指定。染色體序列以粗體字指定。將IR與染色體DNA之接點處由SB100x使用之TA二核苷酸加括號。
圖 3A-3E . 使用含有32.4 kb轉位子之HDAd-長-LCR及含有11.8 kb轉位子之HDAd-短-LCR短活體內HSPC轉導。(圖3A)代替21.5 kb HS1-HS5 LCR及3'HS1 (圖1A HDAd-短-LCR)，此載體含有4.3 kb微型-LCR，包括DNA水解酶超敏位點(HS) 1至4之核心區。(圖3B)治療方案。將hCD46tg小鼠動員且IV注射HDAd-短-LCR + HDAd-SB或HDAd-長-LCR +HDAd-SB (兩種病毒之1:1混合物各4×1010 vp 2次)。五週後，開始O6 BG/BCNU處理。在各週期下，BCNU濃度自2.5 mg/kg增加至7.5 mg/kg及10 mg/kg。所有三種處理中O6 BG濃度均為30 mg/kg。追蹤小鼠直至第20週，此時處死動物用於分析，且將Lin- 細胞移植至二次接受者。接著追蹤二次接受者16週。活體內HSPC轉導之動物接受免疫抑制(IS)藥物以防止針對人類γ-球蛋白及mgtm蛋白之免疫反應。(圖3C)藉由流動式細胞量測術量測之周邊紅血球(RBC)中人類γ-球蛋白陽性細胞之百分比。各符號為個別動物。在模擬轉導之小鼠中，小於0.1%之細胞為γ-球蛋白陽性的。(圖3D) 在活體內HSPC轉導之後第20週藉由HPLC量測RBC中γ-球蛋白鏈之含量。展示人類γ-球蛋白相對於小鼠α-球蛋白鏈之百分比。(圖3E) 在活體內HSPC轉導之後第20週藉由qRT-PCR量測總血液中γ球mRNA之含量。展示人類γ-球蛋白mRNA相對於小鼠α-球蛋白mRNA之百分比。
圖 4 . 在活體內HSPC轉導後第20週收穫之骨髓MNC中的每個細胞之載體複本數。兩組之間的差異不顯著。
圖 5A-5D . 在活體內HSPC轉導後第20週的血液參數。(圖5A)白血球(WBC)、嗜中性球(NE)、白細胞(LY)、單核球(MO)、嗜酸性球(EO)及嗜鹼性球(BA)。(圖5B)紅血球生成參數。RBC：紅血球，Hb：血紅素，MCV：平均紅血球體積，MCH：平均紅血球血紅素，MCHC：平均紅血球血紅素濃度，RDW：紅血球分佈寬度。三組之間的差異不顯著。(圖5C)細胞骨髓組成。(圖5D)骨髓Lin- 細胞之群落形成潛能。圖5A-5D中各組之間的差異不顯著。圖5各圖中之資料顯示，利用HDAd短-LCR及/或長-LCR載體之活體內HSPC轉導不影響骨髓中之血細胞生成及細胞分佈。
圖 6 . 指示NheI及KpnI位點在HDAd-球蛋白載體中相對於睡美人反向重複序列(IR)之定位。此等酶接近但在SB IR/DR外部切割，且用於降低未併合載體之背景。將來自骨髓Lin- 細胞之剩餘基因體DNA用NheI及KpnI消化，且在熱不活化之後進一步用NlaIII消化。NlaIII為4重切割劑且將建立小DNA片段。接著經消化之DNA用具有已知序列及相容性末端之雙股寡核苷酸接合至經消化之NlaIII片段。在熱不活化及清除之後，連接子接合之產物用於線性擴增，此產生自SB左臂引發之單股(ss) DNA群體。引子經生物素標記，因此ssDNA可用抗生蛋白鏈菌素珠粒收集。在徹底洗滌之後，將ssDNA自珠粒溶離且藉由兩輪巢式PCR進行進一步擴增。對PCR擴增子進行凝膠純化、選殖、定序及映射至小鼠基因體序列以標記併合位點。
圖 7A-7D . 對HSPC中之載體併合位點之分析。在用HDAd-長-LCR +HDAd-SB活體內轉導之後第20週收穫自骨髓Lin-細胞分離之基因體DNA。(圖7A)併合位點之染色體分佈。全基因體睡美人併合。併合位點藉由豎直線標記。(圖7B)接合序列之實例：睡美人IR/DR序列、併合接點(chr7，79796094) SEQ ID NO: 4；睡美人IR/DR序列、併合接點(重複區域) SEQ ID NO: 5。IR/DR序列藉由下劃線及粗體字指定。染色體序列以純文字指定。將IR與染色體DNA之接點處由SB100x使用之TA二核苷酸加粗。(圖7C)參考RefSeq註釋之全基因體睡美人併合。將併合位點映射至小鼠基因體且分析其相對於基因之位置。展示在轉錄起始位點上游1 kb、外顯子之3'UTR、蛋白質編碼序列、內含子、3'UTR、3'UTR下游1 kb及基因間發生之併合事件的百分比。(圖7D)與隨機對照相比之睡美人併合模式。小鼠基因體窗中之併合模式。比較與連續基因體窗及隨機小鼠基因體窗及尺寸重疊之併合數目。此展示，併合模式在連續及隨機窗中類似。任何給定窗中之最大併合數目不超過3；其中每個窗一個併合之發生率較高。值表示平均值±s.d.。圖7之圖中的資料展示接近隨機之併合模式，對基因無偏好。
圖 8A-8E . 對二次接受者之分析。將在第20週自活體內轉導之CD46tg小鼠收穫的骨髓Lin- 細胞移植至經致死輻射之C57Bl/6小鼠中。追蹤二次接受者16週。(圖8A)植入率基於CD46陽性PBMC之百分比。兩組之間的差異不顯著。(圖8B)藉由流動式細胞量測術量測之表現γ-球蛋白之周邊血液RBC的百分比。兩組之間的差異不顯著。(圖8C)藉由HPLC分析二次接受者之RBC中的人類γ-球蛋白鏈。展示在移植之後第4週、第8週、第12週及第16週人類γ-球蛋白相對於成年小鼠α球蛋白之百分比。* p＜0.0001。使用雙向ANOVA進行統計分析。(圖8D) 總血細胞中之γ-球蛋白mRNA含量。展示人類γ-球蛋白mRNA相對於小鼠α及β-主要球蛋白mRNA之百分比。(圖8E)在移植之後第16週骨髓MNC中之γ-球蛋白mRNA含量。展示人類γ-球蛋白m-RNA相對於小鼠α及β-主要球蛋白mRNA之百分比。圖8及9之圖個別或一起展示，「32.4」kb轉位子之併合發生在長期再生細胞中；與具有短LCR之載體相比，γ-球蛋白自具有長LCR之載體表現之量隨著時間推移增加，且具有長LCR之載體提供γ-球蛋白表現之更嚴格之紅血球系特異性。
圖 9A-9C . 二次接受者之骨髓中γ-球蛋白表現之紅血球系特異性(在移植之後第16週)(圖9A)所有骨髓MNC中表現γ-球蛋白之紅血球系(Ter119+ 細胞)之百分比。(圖9B)紅血球系特異性。紅血球系(Ter119+ )及非紅血球系(Ter119- )細胞中之γ-球蛋白+細胞之百分比。(圖9C)在活體內HSPC轉導後第20週收穫之骨髓MNC中的每個細胞之載體複本數(VCN)。兩組之間的差異不顯著。
圖 10A-10D . 在移植之後第16週二次接受者中之血液參數。(圖10A)白血球。(圖10B)紅血球生成參數。RBC：紅血球，Hb：血紅素，MCV：平均紅血球體積，MCH：平均紅血球血紅素，MCHC：平均紅血球血紅素濃度，RDW：紅血球分佈寬度。三組之間的差異不顯著。(圖10C)細胞骨髓組成。(圖10D)骨髓Lin- 細胞之群落形成潛能。
圖 11A-11C .利用人類CD34+細胞之活體外研究。(圖11A)實驗示意圖。將CD34+細胞經HDAd-長-LCR + HD-SB或HDAd-短-LCR + HDAd-SB轉導且進行紅血球系分化(ED)。在ED第5天開始用O6 BG-BCNU進行活體外選擇。在第18天，藉由流動式細胞量測術(圖11B)及HPLC (圖11C)。分析細胞。圖11之圖顯示在人類細胞系統中，HDAd長-LCR載體在經轉導之人類HSC/CD34+細胞進行紅血球系分化之後提供較高的γ-球蛋白表現。
圖 12A-12B . 小鼠中載體hCD46tg中之活體內HSC轉導：「長」對比「短」載體LCR。(圖12A) HDAd-長-LCR-γ-球蛋白/mgmt.載體及HDAd-短-LCR-γ-球蛋白/mgmt.載體。(圖12B)小鼠中載體Hbbth3 /CD46之活體內轉導。第1組展示7隻小鼠中HDAd-長-LCR-γ-球蛋白/mgmt + HDAd-SB/Flpe之活體內轉導。第2組展示3隻小鼠中HDAd-短-LCRγ-球蛋白/mgmt + HDAd-SB/Flpe之活體內轉導。O6 BG、BCNU僅需要三個選擇週期。
圖 1 3 . Thbb小鼠測試(W6)。該等圖形結果顯示，當對比短LCR載體經長LCR載體轉導時小鼠中無差異且幾乎無人類γ-球蛋白表現。
圖 14 . Thbb小鼠測試(W8)。該等圖形結果顯示，當對比短LCR載體經長LCR載體轉導時小鼠中無差異，然而，不清楚短LCR病毒在小鼠中是否已經死亡。
圖 15 . 展示小鼠中表現人類γ-球蛋白之RBC之百分比的圖示。該圖說明在僅僅三個活體內選擇週期之後100%標記。
圖 16 . 展示相對於小鼠HBA之人類γ-球蛋白(第10週)之HPLC之圖示。該圖展示與短LCR相比，長LCR之γ-球蛋白含量顯著較高。
圖 17 . 含有長LCR載體之小鼠#57之示例第10週血液HPLC的圖示。
圖 18A-18D . 用HDAd-短-LCR及HDAd-長-LCR對Hbbth3 /CD46小鼠進行活體內HSC基因療法之後的人類γ-球蛋白表現。(圖18A)治療方案。與圖3A-3E對比，圖18A-18D展示地中海型貧血症Hbbth3 /CD46小鼠內之結果。(圖18B)藉由流動式細胞量測術量測之周邊紅血球(RBC)中人類γ-球蛋白陽性細胞之百分比。各符號為個別動物。(圖18C) 在活體內HSPC轉導之後第18週藉由HPLC量測RBC中γ-球蛋白鏈之含量。展示人類γ-球蛋白相對於小鼠α-球蛋白鏈之百分比。(圖18D)未處理Hbbth3 /CD46小鼠(左圖)及在處理之後第21週之小鼠的代表性層析圖。指示小鼠α及β鏈以及所添加之人類γ-球蛋白。圖18之圖中的資料顯示，在長-LCR HDAd載體之情況下，100% GRP標記可在較不密集及/或較少回合及/或較低劑量之活體內選擇下達成。γ-球蛋白表現量在預期提供有效療法之範圍內(處於或高於20%)。
圖 19 . 展示在處理前及長LCR處理之後第10週C57BL6 (正常小鼠)及Townes SCA小鼠之正規化紅血球形態的顯微圖。
圖 20 . 展示在處理前Townes小鼠及處理(長LCR)之後第10週Townes小鼠之正常化紅血球生成(網狀紅血球計數)的顯微圖。
圖 21A-21C . 表型校正。(圖21A、21B)血球形態，其中左圖呈現用吉姆沙染色劑(Giemsa stain)染色之血液抹片，且右側圖呈現用May-Grünwald染色劑染色之血液抹片。網狀紅血球中細胞核及細胞質之殘餘物導致染成紫色。(圖21A)之前與第14週比較。(圖21B) CD46tg、之前的Hbbth3 /CD46小鼠、第18週利用HDAd-長-LCR之Hbbth3 /CD46小鼠及第21週利用HDAd-長-LCR之Hbbth3 /CD46小鼠的吉姆沙染色及網狀紅血球的比較。(圖21C)骨髓細胞離心塗片。看見紅血球生成中往回移，在經處理中原紅血球母細胞為主。比例尺為20 μm。圖21之圖中的資料展示在用HDAd長-LCR載體進行活體內HSC基因療法之後血球形態正常化。
圖 22 . 在Hbbth3 /CD46+ 小鼠之活體內HSC基因療法之前及之後的血液參數。Hbbth3 /CD46+ 小鼠呈現中間型地中海貧血症表型。用腺病毒供體載體處理小鼠，該等腺病毒供體載體包括可操作地連接於尤其長LCR或短LCR之γ-球蛋白核酸序列。在處理之後第1週及第10週，對小鼠取樣。圖22展示在第1週(上圖)及第10週(下圖)來自用長LCR載體處理之小鼠、用短LCR載體處理之小鼠及對照CD46tg之樣品的WBC、RBC、Hb、HCT、MCV、MCH、MCHC及RDW之正常化紅血球參數的圖示。
圖 23A 、 23B . 在Hbbth3 /CD46+ 小鼠之活體內HSC基因療法之前及之後的血液參數。Hbbth3 /CD46+ 小鼠呈現中間型地中海貧血症表型。用腺病毒供體載體處理小鼠，該等腺病毒供體載體包括可操作地連接於尤其長LCR或短LCR之γ-球蛋白核酸序列。在處理之後第18週，處死小鼠且取樣。對血液抹片上之網狀紅血球百分比計數(圖23A；網狀紅血球計數)。在活體內轉導之後第18週的血液參數與其對照CD46tg對應物不可區分，此表明完全表型校正，包括白血球及紅血球計數以及紅血球系細胞特徵(Hb、HCT、MHCH及RDW)之正常化(圖23B；血液參數)。
圖 24A 、 24B . 脾及肝臟中髓外血細胞生成之表型校正。(圖24A)處死時脾尺寸(第21週)上兩個圖展示代表性脾影像。下圖為概述彼等結果之點陣圖。各符號代表個別動物。資料呈現為平均值±平均值之標準誤差(SEM)。* p ≤ 0.05。使用單向ANOVA進行統計分析。(圖24B)。藉由肝臟及脾切片中蘇木精/伊紅染色之髓外血細胞生成。Hbbth3 /CD46小鼠之肝臟中之紅血球母細胞及脾中之巨核細胞之團簇由黑色箭頭指示。比例尺為20 μm。
圖 25 . 脾及肝臟中含鐵血黃素沈積之表型校正。鐵沈積藉由普爾染色(Perl's staining)作脾及肝臟切片中之含鐵血黃素之細胞質藍顏料展示。比例尺為20 μm。(Exp：2.24ms，增量：4.1x，飽和度：1.50，γ：0.60)。
圖 26A-26C . 處死時(第21週)之骨髓分析。在Hbbth3 /CD46tg小鼠之活體內HSC轉導之後第21週收穫骨髓。(圖26A)骨髓MNC中每個細胞之載體複本數。兩組之間的差異不顯著，但若用較大樣品尺寸進行分析，則可能變得顯著。(圖26B、26C) γ-球蛋白表現之紅血球系特異性。(圖26B)表現γ-球蛋白之紅血球系(Ter119+ )及非紅血球系(Ter119- )細胞的百分比。*p＜0.05。使用雙向ANOVA進行統計分析。
圖 27 . 投與腺病毒供體載體之前來自CD46tg及CD46+/+ /Hbbth-3 小鼠之肝臟及脾切片中藉由蘇木精/伊紅染色之髓外血細胞生成。鐵沈積藉由普爾染色作為脾中之含鐵血黃素之細胞質藍顏料展示。
圖 28 . 比較使用不同反向重複序列(IR)之併合SB100x轉位酶功效的實驗設計之示意圖。使用三種質體，其中mgmt./GFP轉位子負載由以下側接：(i) pT0 ITR；(ii) pT2 ITR；或(iii) pT4 ITR，該等質體其他方面一致。將293細胞用包括mgmt./GFP轉位子負載之三種質體轉染，有或無編碼pSB100x之支撐質體。在有或無選擇下培養細胞17天。對於未進行選擇之細胞，在第3、12及17天，且對於藉由在第3天單次添加50 µM O6 BG/BCNU進行選擇之細胞，在第17天，吸取培養物樣品。
圖 29 . 對於T0、T2及T4質體中之每一者，在有或無SB100x質體下培養之細胞在培養第12及17天表現GFP之293細胞的百分比。
圖 30 . 對於T0、T2及T4質體中之每一者，在有或無SB100x質體下培養之細胞在用O6 BG/BCNU對細胞進行選擇下在培養第17天表現GFP之293細胞的百分比。
圖 31. 包括31.776 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸(pWEAd5-PT4-LCR-球蛋白-mgmt)的示意圖。示意圖劃分成兩個重疊部分以便易於呈現，該等部分之關係對於熟習此項技術者將為顯而易見的。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子IR (尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與β啟動子、包括HS1-HS5之長LCR及3'HS1可操作地連接之γ-球蛋白編碼序列，及(ii) MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與Ef1a啟動子可操作地連接。
圖 32. 包括31.772 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸(HDAd5-PT4-長LCR球蛋白-rhMGMT)的示意圖。示意圖劃分成兩個重疊部分以便易於呈現，該等部分之關係對於熟習此項技術者將為顯而易見的。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子IR (尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列DR (尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與β啟動子、包括HS1-HS5之長LCR及3'HS1可操作地連接之γ-球蛋白編碼序列，及(ii) MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與Ef1a啟動子可操作地連接。
圖 33. 包括13.173 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸(HDAd-Ad5-PT4-LCR-hACE2/mgmt)的示意圖。示意圖劃分成兩個重疊部分以便易於呈現，該等部分之關係對於熟習此項技術者將為顯而易見的。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子IR (尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列DR (尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與β啟動子及包括HS1-HS4之長LCR可操作地連接之重組人類ACE2編碼序列，及(ii) MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與Ef1a啟動子可操作地連接。
圖 34. 包括12.169 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸(pWEHCB-微LCR-球蛋白/mgmt)的示意圖。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子IR (尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列DR (尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與β啟動子及包括HS1-HS4之長LCR可操作地連接之γ球蛋白編碼序列，及(ii) MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與Ef1a啟動子可操作地連接。
圖 35. 包括9.382 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸(pWEHCA-Faconi-GFP)的示意圖。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子IR (尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列DR (尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與pgk啟動子可操作地連接之FancA編碼序列，及(ii)與Ef1a啟動子可操作地連接之GFP編碼序列。
圖 36. 包括5.490 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸(pHCA-T4-rhMGMT-GFP)的示意圖。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i)與PGK啟動子可操作地連接之GFP編碼序列，及(ii) MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與EF1a啟動子可操作地連接。
圖 37. 包括3.797 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸的示意圖。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i) GFP編碼序列，及(ii) MGMTP140K 編碼序列，其與EF1a啟動子可操作地連接。
圖 38. 包括3.709 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸(pBHCA-PT0-EF1a-mgmt/GFP)的示意圖。示意圖劃分成兩個重疊部分以便易於呈現，該等部分之關係對於熟習此項技術者將為顯而易見的。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i) eGFP編碼序列，及(ii) MGMTP140K 編碼序列，其與EF1a啟動子可操作地連接。
圖 39. 包括3.547 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸(pHCA(Ad35)-PT4-EF1a-mgmt/GFP)的示意圖。示意圖劃分成兩個重疊部分以便易於呈現，該等部分之關係對於熟習此項技術者將為顯而易見的。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i) GFP編碼序列，及(ii) MGMTP140K 編碼序列，其與EF1a啟動子可操作地連接。
圖 40. 包括3.543 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸((pHCA-Ad5-PT4-Ef1a-mgmt/GFP))的示意圖。示意圖劃分成兩個重疊部分以便易於呈現，該等部分之關係對於熟習此項技術者將為顯而易見的。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：(i) GFP編碼序列，及(ii) MGMTP140K 編碼序列，其與EF1a啟動子可操作地連接。
圖 41. 包括2.781 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸(pHCA(Ad35)-PT4-EF1a-mgmt)的示意圖。示意圖劃分成兩個重疊部分以便易於呈現，該等部分之關係對於熟習此項技術者將為顯而易見的。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與EF1a啟動子可操作地連接。
圖 42. 包括2.777 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸(pHCA-T4-Ef1a-rhMGMT)的示意圖。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與EF1a啟動子可操作地連接。
圖 43. 包括2.751 kb轉位子負載(併合卡匣)之核酸(pHCA-Ad5-PT4-Ef1a-mgmt)的示意圖。示意圖劃分成兩個重疊部分以便易於呈現，該等部分之關係對於熟習此項技術者將為顯而易見的。示意圖提供環化質體情形下之轉位子負載。熟習此項技術者應瞭解，在其他情形下，例如在病毒載體基因體中，可使用分子生物學技術容易地利用轉位子負載。轉位子負載由轉位子反向重複序列(IR，尤其睡美人IR)側接，其又由重組酶正向重複序列(DR，尤其FRT DR)側接。轉位子包括：MGMTP140K 選擇卡匣，其中MGMTP140K 編碼序列與EF1a啟動子可操作地連接。
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Claims (48)

  1. 一種腺病毒供體載體，其包含： (a) 腺病毒衣殼；及 (b) 線性雙股DNA基因體，其包含： (i) 至少10 kb之轉位子負載； (ii) 側接該轉位子負載之轉位子反向重複序列(IR)；及 (iii) 側接該等轉位子反向重複序列之重組酶正向重複序列(DR)。
  2. 一種腺病毒供體基因體，其包含： (a) 至少10 kb之轉位子負載； (b) 側接該轉位子負載之轉位子反向重複序列(IR)；及 (c) 側接該等轉位子反向重複序列之重組酶正向重複序列(DR)。
  3. 一種腺病毒轉位系統，其包含： (a) 如請求項1之腺病毒供體載體；及 (b) 腺病毒支撐載體，其包含： (i) 腺病毒衣殼；及 (ii) 腺病毒支撐基因體，其包含編碼轉位酶之核酸序列。
  4. 一種腺病毒轉位系統，其包含： (a) 如請求項2之腺病毒供體基因體；及 (b) 腺病毒支撐基因體，其包含編碼轉位酶之核酸序列。
  5. 一種腺病毒產生系統，其包含： (a) 包含如請求項2之腺病毒供體基因體之核酸；及 (b) 包含腺病毒輔助基因體之核酸，該腺病毒輔助基因體包含條件性包裝元件。
  6. 如請求項1至5中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載包含長LCR，視情況其中該長LCR為包含β-球蛋白LCR HS1至HS5之β-球蛋白長LCR。
  7. 如請求項6之載體、基因體或系統，其中該長LCR具有至少27 kb之長度。
  8. 如請求項1至6中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載包含表1中所闡述之LCR。
  9. 如請求項1至6中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載具有至少15 kb、至少16 kb、至少17 kb、至少18 kb、至少19 kb、至少20 kb、至少21 kb、至少22 kb、至少23 kb、至少24 kb、至少25 kb、至少30 kb、至少35 kb、至少38 kb或至少40 kb之長度。
  10. 如請求項1至6中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載具有10 kb-35 kb、10 kb-30 kb、15 kb-35 kb、15 kb-30 kb、20 kb-35 kb或20 kb-30 kb之長度。
  11. 如請求項1至6中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載具有10 kb-32.4 kb、15 kb-32.4 kb或20 kb-32.4 kb之長度。
  12. 如請求項1至11中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載包含編碼蛋白質之核酸序列，視情況其中該蛋白質為治療性蛋白質。
  13. 如請求項12之載體、基因體或系統，其中該蛋白質係選自由β球蛋白替代蛋白及γ-球蛋白替代蛋白組成之群。
  14. 如請求項12之載體、基因體或系統，其中該蛋白質為第八因子(Factor VIII)替代蛋白。
  15. 如請求項12或13之載體、基因體或系統，其中編碼該蛋白質之該核酸序列與啟動子可操作地連接，視情況其中該啟動子為β球蛋白啟動子。
  16. 如請求項1至15中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子反向重複序列為睡美人(SB)反向重複序列，視情況其中該SB反向重複序列為pT4反向重複序列。
  17. 如請求項3至15中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位酶為睡美人(SB)轉位酶，視情況其中該轉位酶為睡美人100x (SB100x)。
  18. 如請求項1至17中任一項之載體、基因體或系統，其中該等重組酶正向重複序列為FRT位點。
  19. 如請求項3至18中任一項之載體、基因體或系統，其中該腺病毒支撐基因體包含編碼重組酶之核酸。
  20. 如請求項19之載體、基因體或系統，其中該重組酶為FLP重組酶。
  21. 如請求項1至20中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載包含β-球蛋白長LCR，該轉位子負載包含與β-球蛋白啟動子可操作地連接之編碼β-球蛋白之核酸序列，該等反向重複序列為SB反向重複序列，且該等重組酶正向重複序列為FRT位點。
  22. 如請求項1至21中任一項之載體、基因體或系統，其中該轉位子負載包含選擇卡匣，視情況其中該選擇卡匣包含編碼mgmtP140K 之核酸序列。
  23. 如請求項1至22中任一項之載體、基因體或系統，其中該腺病毒衣殼經修飾以增加對CD46之親和力，視情況其中該腺病毒衣殼為Ad35++衣殼。
  24. 如請求項5至23中任一項之腺病毒產生系統，其中該腺病毒輔助基因體之條件性包裝元件包含由重組酶正向重複序列側接之包裝序列。
  25. 如請求項24之腺病毒產生系統，其中側接該條件性包裝元件之該包裝序列的該等重組酶正向重複序列為LoxP位點。
  26. 一種細胞，其包含如請求項1至25中任一項之載體、基因體或系統。
  27. 一種細胞，其在其基因體中包含如請求項1至25中任一項之轉位子負載，其中在該細胞之該基因體中存在的該轉位子負載由該等轉位子反向重複序列側接。
  28. 如請求項26或27之細胞，其中該細胞為造血幹細胞。
  29. 一種產生腺病毒之細胞，其包含如請求項5至25中任一項之腺病毒產生系統，視情況其中該細胞為HEK293細胞。
  30. 一種修飾細胞之方法，該方法包含使該細胞與如請求項1至25中任一項之載體、基因體或系統接觸。
  31. 一種修飾個體之細胞的方法，該方法包含向該個體投與如請求項1至25中任一項之載體、基因體或系統。
  32. 一種修飾個體之細胞之方法，其在不自該個體分離該細胞下進行，該方法包含向該個體投與如請求項1至25中任一項之載體、基因體或系統。
  33. 一種治療有需要個體之疾病或病狀之方法，該方法包含向該個體投與如請求項1至25中任一項之載體、基因體或系統。
  34. 如請求項31至33中任一項之方法，其中該腺病毒供體載體係靜脈內投與至該個體。
  35. 如請求項31至34中任一項之方法，其中該方法包含向該個體投與動員劑，視情況其中該動員劑包含顆粒球-群落刺激因子(G-CSF)、CXCR4拮抗劑及CXCR2促效劑中之一或多者。
  36. 如請求項35之方法，其中該CXCR4拮抗劑為AMD3100。
  37. 如請求項35或36之方法，其中該CXCR2促效劑係GRO-β。
  38. 如請求項31至37中任一項之方法，其中該轉位子負載包含選擇卡匣且該方法包含向該個體投與選擇劑。
  39. 如請求項38之方法，其中該選擇卡匣編碼mgmtP140K 且該選擇劑為O6 BG/BCNU。
  40. 如請求項31至39中任一項之方法，其中該方法引起至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%表現CD46之細胞中併合及/或表現該轉位子負載之至少一個複本。
  41. 如請求項31至39中任一項之方法，其中該方法引起至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%造血幹細胞及/或紅血球系Ter119+ 細胞中併合及/或表現該轉位子負載之至少一個複本。
  42. 如請求項31至41中任一項之方法，其中該方法引起包含該轉位子負載之至少1個複本之細胞的基因體中併合該轉位子負載之平均至少2個複本。
  43. 如請求項31至42中任一項之方法，其中該方法引起包含該轉位子負載之至少1個複本之細胞的基因體中併合該轉位子負載之平均至少2.5個複本。
  44. 如請求項31至43中任一項之方法，其中該方法引起由該轉位子負載編碼之蛋白質以參考量之至少約20%的量表現，視情況其中該參考為內源性參考蛋白在該個體中或參考群體中之表現。
  45. 如請求項31至43中任一項之方法，其中該方法引起由該轉位子負載編碼之蛋白質以參考量之至少約25%的量表現，視情況其中該參考為內源性參考蛋白在該個體中或參考群體中之表現。
  46. 如請求項31至45中任一項之方法，其中該個體為罹患中間型地中海貧血症之個體，其中該轉位酶負載包括包含β-球蛋白LCR HS1至HS5之β-球蛋白長LCR，及與β球蛋白啟動子可操作地連接之編碼β球蛋白替代蛋白及/或γ-球蛋白替代蛋白之核酸序列。
  47. 如請求項31至45中任一項之方法，其中該個體為罹患血友病之個體，其中該轉位酶負載包括包含β-球蛋白LCR HS1至HS5之β-球蛋白長LCR，及與β球蛋白啟動子可操作地連接之編碼第八因子替代蛋白之核酸序列。
  48. 如請求項47之方法，其中該個體中該蛋白質之表現減少中間型地中海貧血症之至少一種症狀及/或治療中間型地中海貧血症。
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