JP2017505606A - 偽型レンチウイルスベクター - Google Patents
偽型レンチウイルスベクター Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017505606A JP2017505606A JP2016545901A JP2016545901A JP2017505606A JP 2017505606 A JP2017505606 A JP 2017505606A JP 2016545901 A JP2016545901 A JP 2016545901A JP 2016545901 A JP2016545901 A JP 2016545901A JP 2017505606 A JP2017505606 A JP 2017505606A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- cells
- vsv
- cell
- acid molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15042—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15045—Special targeting system for viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2740/15052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/16045—Special targeting system for viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
- C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
- C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
- C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
- C12N2810/859—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from immunoglobulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
この必要性は、請求項で特徴付けられる態様の提供によって対処される。
好ましい実施態様において、少なくともオプション(a)〜(d)に具体的に記載された核酸配列はDNAである。さらにより好ましい実施態様において、本発明のすべての核酸分子はDNAである。
付加的な異種の配列は、例えば、本発明のコード配列に作動的に連結された異種のプロモーター、及びさらに当技術分野で周知であり、本明細書により詳細に記載されている調節核酸配列を含んでもよい。
本発明の核酸分子によってコードされる融合タンパク質を製造するために、好ましくは天然に存在するERシグナル配列が用いられ、より好ましくはウイルス性ERシグナル配列又は細胞系に内在するERシグナル配列が用いられる。ウイルス性ERシグナル配列の場合は、ラブドウイルス科由来であることが好ましく、ベシクロウイルス属に由来することがより好ましい。最も好ましくは、ERシグナル配列は、オプション(d)で用いられるVSV−GのERへの移動を内因的に媒介するERシグナル配列である。
好ましくは、相互作用(すなわち結合)は、細胞膜の定められた部位(特定の細胞膜成分/エピトープを含む)で起こり、少なくとも1つの相互作用の形成、好ましくはいくつかの特定の相互作用のネットワークの形成を伴って進む。さらにより好ましくは、結合は標的細胞に特異的である。すなわち、結合は、標的細胞の細胞膜で起こり、非標的細胞の細胞膜では起こらず、又は有意には起こらない。
好ましくは、中間の配列は、第2、第3及び第4の配列セグメントの間に存在しない。すなわち、これらの配列セグメントは、第2、第3及び第4の配列セグメントに対応する融合タンパク質が第2〜第4の配列セグメントに属するヌクレオチドのみで構成されるように、お互い直接に続く。
免疫グロブリンドメインにおけるVLドメイン及びVHドメインの配置に関しては、VLドメインは、VHドメインのN末端又はC末端に配置することができる。従って、本発明の核酸分子において、VLドメインをコードする核酸は、VHドメインをコードする核酸の5’又は3’に配置することができる。当業者は、VHドメイン及びVLドメインのいかなる配置が特異的scFvにより適しているかを決定することができる。
このような変異体分子は、他の種に由来するスプライスフォーム又は相同の分子であってもよい。これらの変異体核酸分子は、それにもかかわらず、示された機能を有するアミノ酸配列をコードしなければならないことが理解されるであろう。すなわち、配列番号1の変異体によってコードされる配列はERシグナル配列でなければならず;配列番号3の変異体によってコードされる配列は、リンカーでなければならず;及び、配列番号5の変異体によってコードされる配列は、本明細書に上記したVSV−Gの機能を有する糖タンパク質をコードしていなければならない。
1つの実施態様においては、2つの配列が、一列に整列させた際、同一の長さ、すなわち3’末端又は5’末端で他の配列上に延びるいずれの配列も存在せずに、少なくとも60%の相同性を示す。あるいは、そのような延長が起こる場合は、他の配列のいずれかの末端上に30個以上のヌクレオチドが延長しないことが好ましく、より好ましくは15個以上のヌクレオチドが延長しない。
従って、所定の機能を有し、さらに上記のプログラム又は当業者に利用可能なプログラムのいずれか、好ましくはBLASTプログラムを用いて決定される少なくとも60%の配列相同性を有する全ての核酸分子は、本発明の範囲に含まれる。
本発明の核酸分子のさらにより好ましい実施態様において、核酸分子は、配列番号7又は配列番号9の全長の核酸配列を有する。
好ましくは、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、又は例えば、従来から遺伝子工学的に用いられている他のベクターである。本発明の核酸分子は、真核生物のタンパク質の発現に適したいくつかの市販のベクターに挿入してもよい。非限定的な例としては、原核生物のプラスミドベクターが含まれ、具体的にはpUCシリーズ,pBluescript(Stratagene社)、pETシリーズの発現ベクター(Novagen社)又はpCRTOPO(Invitrogen社)、並びにpREP(Invitrogen社)、pcDNA3(Invitrogen社)、pCEP4(Invitrogen社)、pMCIneo(Stratagene社)、pXT1(Stratagene社)、pSG5(Stratagene社)、EBO−pSV2neo、pBPV−1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2−dhfr、plZD35、pLXIN、pSIR(Clontech社)、pIRES−EGFP(Clontech社)、pEAK−10(Edge Biosystems社)、pTriEx−Hygro(Novagen社)及びpCINeo(Promega社)等の哺乳動物細胞における発現に適合するベクターが含まれる。
ベクター改変技術については、SambrookとRussell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)が参照される。一般に、ベクターは、1つ又はそれ以上の複製開始点(ori)及びクローニング又は発現のための遺伝システム、1つ又はそれ以上の宿主における選択のためのマーカー、例えば抗生物質耐性、並びに1つ又はそれ以上の発現カセットを含むことができる。適切な複製開始点(ori)は、例えばColE1、SV40ウイルス及びM13の複製開始点を含む。
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸分子及びコードされた融合タンパク質の複製及び発現を導くことができる。記載の調節エレメントを含む適切な発現ベクターは当技術分野で知られており、例えば、pGreenPuro(System Biosciences社,米国,カリフォルニア,マウンテンビュー)、pRc/CMV、pcDNAI、pcDNA3(Invitrogene社,特に添付の実施例で用いられる)、pSPORT1(GIBCO BRL社)又はpGEMHE(Promega社)、又はラムダgt11、pJOE、pBR1−MCSシリーズなどの原核生物発現ベクターが挙げられる。
本明細書で上記した本発明の核酸分子は、細胞内に、直接導入するように、又はリポソーム、ファージベクター若しくはウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス)を介して導入するように設計しても良い。さらに、本発明の核酸分子のための真核生物発現システムとして、バキュロウイルス系、又はワクシニアウイルス若しくはセムリキ森林ウイルスに基づくシステムを用いることができる。
適切な原核生物宿主は、例えば、大腸菌、ストレプトミセス、サルモネラ又はバチルス属の細菌などを含む。適切な真核生物宿主細胞は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、シゾサッカロミセス・ポンベ等の酵母、又はDT40細胞等のニワトリ細胞である。発現に適した昆虫細胞は、例えば、ショウジョウバエS2細胞、ショウジョウバエKc細胞、又はスポドプテラSf9細胞及びSf21細胞である。適当なゼブラフィッシュ細胞株は、ZFL、SJD又はZF4を含むが、これらに限定されない。
用いられ得る哺乳動物宿主細胞は、ヒトHela、HEK293、HEK293T、H9及びJurkat細胞、マウスNIH3T3及びC127細胞、COS1、COS7及びCV1、ウズラQC1−3細胞、マウスL細胞、マウス肉腫細胞、ボウズメラノーマ細胞、ヒトCAP又はCAP−T細胞及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含む。また、本発明の範囲には、初代哺乳動物細胞又は細胞株が含まれる。初代細胞は、生物から直接得られる細胞である。適切な初代細胞は、例えば、マウス胚線維芽細胞(MEF)、マウス初代肝細胞、心筋細胞、神経細胞、及びマウス筋肉幹細胞(サテライト細胞)、ヒト皮膚線維芽細胞及びヒト肺線維芽細胞、ヒト上皮細胞(鼻、気管、腎臓、胎盤、腸、気管支上皮細胞)、ヒト分泌細胞(唾液腺、皮脂腺、汗腺に由来)、ヒト内分泌細胞(甲状腺細胞)、ヒト脂肪細胞、ヒト平滑筋細胞、ヒト骨格筋細胞、及びこれらに由来する安定な不死化細胞株(例えば、hTERT又は癌遺伝子不死化細胞)である。
本実施態様における宿主細胞は、本明細書で後に詳述する通り、例えば、本発明のベクターの増幅のための方法、本発明の融合タンパク質の製造のための方法、又はレンチウイルス粒子の直接製造のための方法で用いることができる。
本発明のポリペプチドは、例えば配列番号8又は配列番号10で示される配列から選択されるアミノ酸配列の全体を有してもよい。
原核生物又は真核生物の宿主を培養するのに適した条件は、当業者によく知られている。例えば、細菌を培養するのに適した条件は、Luria Bertani(LB)培地中で通気下に培養することである。発現生成物の収率及び溶解度を高めるために、培地は、収率及び溶解度を向上させ又は促進させることが知られている適当な添加剤を用いて緩衝化させ又は補充することができる。大腸菌は4℃〜約37℃で培養することができ、その正確な温度又は連続の温度は過剰発現される分子に依存する。一般的に、当業者は、これらの条件が宿主の要求及び発現タンパク質の要件に適合しなければならないことがあることも認識している。誘導性プロモーターが宿主細胞中に存在するベクター中の本発明の核酸を制御する場合は、ポリペプチドの発現は、適切な誘導剤の添加によって誘導することができる。適切な発現プロトコール及び戦略は、当業者に知られている。
用語「製造された融合タンパク質の単離」は、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の単離をさすことが当業者には理解されるであろう。
言い換えれば、この好ましい実施態様に従って、本発明のVSV−G融合タンパク質とwt−VSV−Gとの比率は、約10%の本発明のVSV−G融合タンパク質対約90%のwt−VSV−Gと、約50%の本発明のVSV−G融合タンパク質対約50重量%のwt−VSV−Gとの間の範囲にある。好ましくは、その比率は、約33%の本発明のVSV−G融合タンパク質と約67重量%のwt−VSV−Gである。
本発明の細胞に形質導入する方法の好ましい実施態様において、前記方法は、前記細胞を、アジュバント、好ましくは12.8kDa〜約15kDaの分子量を有するポロキサマーと接触させることをさらに含む。
本明細書で用いられる用語「アジュバント」は、レンチウイルス形質導入の効率を高める化合物に関する。アジュバントの非限定的な例には、例えば12.8kDa〜約15kDaの分子量を有するポロキサマー、及びポリブレンが含まれる。
好ましくは、本発明の細胞に形質導入する方法は、前記細胞を12.8kDa〜約15kDaの分子量を有するポロキサマーと接触させることをさらに含む。
HO(C2H4O)x(C3H6O)z(C2H4O)yH
(式中、zは、(C3H6O)で表される疎水性基部が少なくとも2250Daの分子量を有するような整数である。x又はyは、約8から180又はそれ以上の整数である。)
ポロキサマーは、「プルロニック(登録商標)」又は「Synperonic(登録商標)」(BASF)の商標名でも知られている。ポリマーブロックの長さはカスタマイズすることができ、その結果、多くの異なるポロキサマーが存在する。本発明の方法に従って用いられるポロキサマーは、少なくとも12.8kDa〜約15kDaの分子量を有するポロキサマーである。上記の一般式から明らかなように、対応する分子量を有するポロキサマーは、ポロキサマーを構成する重合体ブロックの長さを変えて構成することができる。例えば、2つのポロキサマーが、ほぼ同じ分子量を有するが構造的に異なることがある。というのも、一方のポロキサマーがより多くの疎水性ブロックポリマーの繰り返しと、より少ない親水性ブロックポリマーの繰り返しとを有し、他のポロキサマーがより多い親水性ブロックポリマーの繰り返しと、より少ない疎水性ブロックポリマーの繰り返しを有することがあるからである。例えば、zは、少なくとも(各値として)43、44、45、46、47、48、49、50又は少なくとも52のように、42〜52の範囲にすることができ、そしてx+yは、少なくとも(各値として)230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340又は少なくとも350のように、220〜360の範囲にすることができる。好ましくは、zは44〜50の範囲であり、x+yは235〜266の範囲である。ブロックコポリマーの合成は精密ではないから、上記の値は正確には合成によって達成できないかもしれず、その平均値は(本明細書に記載のように)ある程度異なるであろう。好ましくは、ポロキサマーは、12.8〜約14.9kDaの分子量、約13.2〜約14.9kDaの分子量、約13.4〜約14.9kDaの分子量、より好ましくは約14.0〜約14.9kDaの分子量、約14.3〜約14.8kDaの分子量、約14.5〜約14.7kDaの分子量、及び最も好ましくは約14.6kDaの分子量を有する。当業者に理解されるように、本方法は、多数のポロキサマーを用いて行うことができる。従って、特に異なって明記しない場合は、本明細書で用いられる用語「ポロキサマー」は、用語「ポロキサマーズ」(いくつかのポロキサマーの集まりを表し、ポロキサマー混合物とも呼ばれる)と互換的に用いることができる。本明細書で概説したように、ポロキサマーの合成は精密ではなく、様々な分子量のポロキサマー混合物を生じる。従って、本明細書中で使用されるポロキサマー(ズ)の分子量に関連する用語「平均」は、全て同一の組成を有するポロキサマーを、従って同一の分子量を有するポロキサマーを製造する技術能力がない結果として用いられる。従って、当技術分野の方法に従って製造されるポロキサマーは、各々がその分子量に関して多様性を有するポロキサマーの混合物として存在し、しかしその混合物は全体として本明細書で特定された平均された分子量を有する。当業者は、本発明の方法で用いることができるポロキサマーを得る立場にいる。例えば、BASF社とシグマアルドリッチ社は、本明細書で記載されるように、ポロキサマーを提供している。分子量を測定する方法は、当技術分野でよく知られており、化学の標準的な教科書に記載されている。実験的に高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)をポロキサマーの分子量を測定するために用いることができる。
HO−[CH2CH2O]x−[CH2C2H4O]z−[CH2CH2O]y
(式中、x+y=265.45、及びz=50.34(平均値(Synperonic(登録商標)F108)))
を有するか、又はポロキサマーは、式:
HO−[CH2CH2O]x−[CH2C2H4O]z−[CH2CH2O]y
(式中、x+y=236.36、及びz=44.83(平均値(F98)))
を有する。
本発明の方法の好ましい実施態様において、前記ポロキサマーは、約50〜5000μg/mlの濃度で提供される。
本明細書で規定された用語「約」は、必要な変更を加えて実施態様に適用される。
本発明のこの方法に従って、ポロキサマーは、好ましくは、水、リン酸緩衝液、又は直接、細胞培養培地に溶解される。ポロキサマーは、例えば、水又はリン酸緩衝液中に溶解させて、所定の使用濃度に希釈することができる100mg/mlのストック溶液を得ることができる。200mg/ml以上の濃度のポロキサマー溶液はゲル状である。200mg/ml以下の濃度ではポロキサマー溶液は、液体状態である。好ましくは、濃度は、ポロキサマーが液体状態で提供される程度のものである。
本発明において、「ポリカチオン性ポリマー」は、繰り返し単位が正電荷を有し、前記繰り返し単位の正電荷がプロトン化された窒素部分に起因する荷電したポリマーをさす。例えば、ポリエチレンイミン(PEI)で正に帯電した基は、イミン基である。ポリカチオン性ポリマーの他の非限定的な例は、ポリブレン物質(1,5−ジメチル−1,5−ジアザウンデカメチレンポリメトブロミド、ヘキサジメトリンブロミド)である。
用語「ポリカチオン性ペプチド」は、正に荷電したペプチドをさす。例えば、ポリ−L−リジンは、(C6H12N2O)n(式中、本発明に従って、nは少なくとも2、例えば少なくとも20、好ましくは200と500の間、より好ましくは500と2500の間であってよいが、これらに限定されない。)の分子式を有するホモポリマーポリカチオン性ペプチドである。
本発明の細胞を形質導入する方法のさらにより好ましい実施態様において、前記方法は、標的細胞の前記ポロキサマーとの接触の前に、接触と同時に、又は接触の後に、偽型レンチウイルスベクター粒子を前記細胞とスピノキュレーションさせるさらなる工程を含む。
用語「スピノキュレーション」は、当技術分野でよく知られており、ウイルス粒子の細胞への取り込みのためにごく近く接触することを確実にするための、レンチウイルスベクター粒子との標的細胞の遠心力利用接種に関する。スピノキュレーションのプロトコールは当技術分野でよく知られており、例えば、Millingtonら, 2009[44]にレンチウイルスベクターについて記載されている。スピノキュレーション工程は、標的細胞の前記アジュバント、好ましくは前記ポロキサマーとの接触の前に、接触と同時に、又は接触の後に行われる。好ましくは、スピノキュレーション工程は、標的細胞をアジュバント、好ましくはポロキサマーと接触させた後に行われる。
スピノキュレーション工程は、実施例5に示されるように、本発明の方法で達成される形質導入率を、特にトランスフェクトが困難な細胞で、さらに増加させる。
本発明における用語「腫瘍細胞」は、当技術分野でよく知られており、良性、前悪性又は悪性の腫瘍の形成に関与する腫瘍細胞をさす。悪性である腫瘍細胞は、一般に癌細胞と呼ばれ、転移し、又は隣接組織に拡散する能力を有しうる。好ましい腫瘍細胞は、例えば、膵臓腫瘍細胞(例えば、AsPC−1及びPANC−1細胞等)、リンパ腫細胞株(例えば、KARPAS−299、SUDHL−1、SUP−M2及びSR−786細胞等)、及び乳癌細胞(例えば、MCF7、MDA−MB−361及びT47d細胞等)である。
用語「リンパ系細胞」は、リンパ球の生成に関与している細胞及びリンパ球自体をさす。用語「リンパ球」は、当技術分野でよく知られているように、小リンパ球(Bリンパ球、Tリンパ球、形質細胞)及びナチュラルキラー細胞をさす。リンパ球系細胞はさらに、例えば、リンパ球系樹状細胞、及びプロリンパ球、リンパ芽球、リンパ球系共通前駆細胞等のリンパ球前駆細胞を含む。
「神経細胞」は、当技術分野でよく知られており、電気的に興奮性であり、電気的及び化学的なシグナリングによって情報を送信する細胞である。例えば、感覚ニューロン、運動ニューロン等の様々な特殊化した神経細胞が存在する。例えば、バスケット細胞、ベッツ細胞、中型有棘神経細胞、プルキンエ細胞、錐体細胞、レンショウ細胞、顆粒細胞、又は前角細胞は、本発明に従って標的細胞として用いることができる。「神経腫瘍細胞」は、神経起源の腫瘍細胞であり、例えば神経膠腫、髄芽腫、星細胞腫、及び神経系統由来の他の癌がある。神経膠腫細胞株(例えば、U87及びLN18等)は、本発明の方法に用いることができる。
これらの細胞型の全ては、典型的にトランスフェクト又は形質導入することが困難と考えられているが、今や、本発明の方法に基づいて、より効率的に形質導入することができる。
付加的な、又は好ましい実施態様において、形質導入される細胞は、不均質な細胞集団、すなわち異なる種類の細胞を含む細胞集団(本明細書では「混合集団」とも呼ぶ)の一部である。添付の実施例に示されるように、特に実施例4及び6において、形質導入が、細胞膜結合ドメインが結合し得る標的分子を有する細胞で、明確に高められる。そのような標的分子を有する細胞と有さない細胞を含む混合細胞集団では、形質導入の平衡が前記標的分子を有する細胞に向けてシフトされる。従って、競合する非標的細胞の存在下ですら、それらの標的細胞に対する再標的化されたレンチウイルス粒子の相対的な特異性が得られることが、本明細書に示されている。
(a)(i)本発明の核酸分子;若しくは
(a)(ii)本発明の核酸分子、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる(ポリ)ペプチドに連結されていないVSV−Gをコードする核酸配列を含む若しくはからなる核酸分子;
並びに/又は
(b)(i)本発明のベクター;若しくは
(b)(ii)本発明のベクター、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる(ポリ)ペプチドに連結されていないVSV−Gをコードする核酸配列を含む若しくはからなる核酸分子を含むベクター;
並びに/又は
(c)(i)本発明の宿主細胞;若しくは
(c)(ii)本発明の宿主細胞、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる(ポリ)ペプチドに連結されていないVSV−Gをコードする核酸配列を含む若しくはからなる核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞;
並びに/又は
(d)(i)本発明のポリペプチド;若しくは
(d)(ii)本発明のポリペプチド、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる(ポリ)ペプチドに連結されていないVSV−G;
並びに/又は
(e)本発明の偽型レンチウイルスベクター粒子;
並びに、必要に応じて、使用説明書
を含むキットに関する。
本明細書中、特に請求項中で特徴付けられた実施態様に関しては、従属請求項に記述された各々の実施態様は、その従属クレームが従属している(独立又は従属している)各々の請求項の各々の実施態様と組み合わされることが意図されている。例えば、独立請求項1が3つの選択肢A、BとCを列挙し、従属請求項2が選択肢D、EとFを列挙し、請求項1及び請求項2に従属する請求項3が選択肢G、HとIを列挙している場合、特に異なって記述されていなければ、本明細書には、A,D,G;A,D,H;A,D,I;A,E,G;A,E,H;A,E,I;A,F,G;A,F,H;A,F,I;B,D,G;B,D,H;B,D,I;B,E,G;B,E,H;B,E,I;B,F,G;B,F,H;B,F,I;C,D,G;C,D,H;C,D,I;C,E,G;C,E,H;C,E,I;C,F,G;C,F,H;C,F,Iの組み合わせに対応する実施態様が開示されていると理解されるべきである。
上記の考慮すべき事項は、添付されているすべての請求項に準用される。
細胞株
ヒト胎児腎臓HEK293T細胞は、10%ウシ胎児血清(FCS,Pan Biotech,ドイツ,アイデンバッハ)及び2mMグルタミンを補充したDMEM培地中で培養した。未分化大細胞リンパ腫細胞株KARPAS−299、SUDHL−1及びSUP−M2、及び前骨髄球性白血病細胞株HL60は、10%FCS及び2mMグルタミンを補充したRPMI1640培地中で培養した。上皮乳房腫瘍細胞株ZR75及びT47Dは、10%FCS、2mMグルタミン及び0.2U/mlウシインシュリン(Cell Application Inc.,カリフォルニア,サンディエゴ)を含むRPMI培地中で培養した。
MfeI制限部位は、パッケージングベクターpMD2.G(例えば、Addgene.orgから入手可能)中で利用可能なVSV−G(インディアナ血清型)のSSにエラープローンPCRを介して加えた。N末端にHisタグを導入するために、scFv−αCD30及びscFv−αEGFRのcDNA(これらの配列は、例えばGeneArt(登録商標)等の供給業者から注文可能である)は、MfeI−Hisタグセンスプライマー(5'-GCGACCAATTGCCATCATCATCATCATCATGCCCAGGTCAAGCTGCAGGAGTGGACTGAACTGGCAAAG;配列番号11)、及びXhoI部位(5'-GTAATCTCGAGCCACCTCCTGAACCGCCTCCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCACACCGAACGTGGCG;配列番号12)を係留(harbouring)し、リンカー配列の半分(柔軟なリンカー:GGGSGGGSSGGGS)を含むアンチセンスプライマーを用いて増幅した。加えた際、リンカーの他の半分は、PCR(5'-GTTATCTCGAGCGGAGGCGGTTCAAAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACAAAAGAAACTG(配列番号13)及び5'-GTATTACCGGTTCCTGGGTTTTTAGGAGCAAGATAGCTGAGATCCACTG(配列番号14)VSV−G内のAgel制限部位を使用する)で、VSV−GのN末端に結合した。両生成物は、MfeI/XhoI又はXhoI/Agelのいずれかで二重に消化して、(MfeI/Agel消化で線状化された)pMD2.Gに再挿入した。FastDigest制限酵素は、Fermentas(リトアニア,ビリニュス)から購入した。オリゴヌクレオチドは、Eurofins MWG Operon(ドイツ,エベルスベルク)から入手した。
レンチウイルス形質導入ベクターpGreenPuro(System Biosciences,米国,カリフォルニア,マウンテンビュー)は、内部CMVプロモーターで制されるcopGFPの発現を可能にする。複製欠損レンチウイルス粒子は、8μgのpGreenPuro、16μg又は8μgのパッケージングプラスミドpMDLg/pRREとpRSV.Rev(例えばAddgene.orgから入手可能)、4μgの様々な比のpMD2.G、pMD2.G scFv−αCD30又はαEGFRを有する10cmのペトリ皿中でHEK293T細胞の一過性コトランスフェクションによって製造した。トランスフェクションには、リポフェクタミン2000(Life Technologies,米国,カリフォルニア,カールズバッド)を製造業者の指示書に従って使用した。ウイルス粒子は、トランスフェクションから48時間後に回収し、低速遠心分離で細胞破片を取り除き、0.45μmステリカップフィルターを用いて濾過した。レンチウイルス上清を、前述[24]の通り、アミコン−20カラム(Millipore,米国,マサチューセッツ,ビレリカ)を用いた限外濾過によって濃縮した。濃縮レンチウイルスのアリコートを−80℃で保存した。ウイルス力価(濃縮アリコート1ml当たりのウイルス粒子)は、連続的に希釈したレンチウイルスのアリコートを用いて、QuickTiter(商標)レンチウイルス定量p24ELISA(BioCat,ドイツ,ハイデルベルク)によって同社のプロトコールに従って、決定した。
ウイルスタンパク質の調製のために、2μlの濃縮レンチウイルス溶液を、尿素サンプル緩衝液(5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、8M尿素、200mMTris−HCl、0.1mMEDTA、0.03%ブロモフェノールブルー、2.5%ジチオスレイトール、pH8.0)中で95℃で10分間インキュベートすることで変性させた[25]。サンプルは、SDSポリアクリルアミドゲル(14%)で分画し、ニトロセルロース膜(GE Healthcare,英国,リトルチャルフォント)に移した。Hisタグ付きのscFv−αCD30−VSV−G又はscFv−αEGFR−VSV−Gは、マウス抗His抗体(クローン13/45/31,Dianova,ドイツ,ハンブルク)、及び続いて、抗マウス抗体が結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ(Santa Cruz Biotechnology,米国,カリフォルニア,サンタクルス)を用いて検出した。マウス抗体(BioCat,ドイツ,ハイデルベルク)で検出されるレンチウイルスコアタンパク質p24を、レンチウイルスタンパク質の内部標準として使用した。ブロットした膜は、供給業者が推奨するように、ECLアドバンスウエスタンブロット検出システム(GE Healthcare)で展開した。
HEK293T、ZR75及びT47D細胞(2×105細胞/ウェル)が、10μlのポロキサマーに基づく化学アジュバント(LentiBoost(商標),シリオンバイオテック社,ドイツ,マルティンス)[23]を有するか又は有さない1mlのレンチウィルス含有培地で、異なるMOI(レンチウイルス粒子/細胞)で覆われた。37℃で5%CO2で24時間培養した後、上清を新鮮な培地に交換し、さらに24時間培養した。
KARPAS−299、SUDHL−1又はSUP−M2懸濁細胞(106細胞/ウェル)は、1mlのレンチウイルス含有培地に再懸濁した。プレートを800gで90分間、遠心分離(スピノキュレーション)した。スピノキュレーション後、直接、SUDHL−1細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁させ、48時間培養した。遠心分離後、KARPAS−299、SUP−M2及びHL60細胞を、1mlのレンチウイルス含有培地中で一晩培養し、その後、洗浄し、新鮮な培地に再懸濁し、さらに24時間培養した。競合アッセイのために、5×105のKARPAS−299及び5×105のHL60細胞又は105のT47D及び105のZR75細胞の混合物を、ポロキサマーに基づくアジュバントLentiBoost(商標)を有する1mlのレンチウイルス含有培地に再懸濁した。懸濁細胞を800gで90分間、遠心分離し、一晩培養し、その後、洗浄し、再度24時間培養した。
レンチウイルスの形質導入後、細胞を洗浄し、PBSに再懸濁した。FACSDiva(BD Biosciences,ドイツ,ハイデルベルク)を用いて、前方及び側方散乱特性及び530nmの緑色蛍光発光について、3万イベントが分析された。平均蛍光強度(MFI)は形質導入された細胞の蛍光強度の変化を定量化する。
CD30又はEGFRの表面発現を検出するために、2%FCSを補充したPBSで、106細胞を2回洗浄し、100μlの抗体希釈液(PBS+2%FCS中1:20;FITC結合αCD30又はαEGFR抗体及びアイソタイプ対照,Dako,デンマーク;PE結合αCD30又はαEGFR抗体,BioLegend,米国,カリフォルニア,サンディエゴ)中で、氷上で1時間、培養した。サイトメトリー検出(FITC:530nm;PE:610nm)の前に、細胞を2回洗浄し、PBS+2%FCS中に再懸濁した。
全ての実験は、技術的には二重試験で、生物学的には三重試験で行った。平均±標準偏差(SD)の値は、特に明記しない限り、示された。得られた結果を、統計ソフトウェアSigmaPlot(Systat Software,カリフォルニア,サンノゼ)を用いて、t検定で統計的に評価した。統計的有意性は、*p<0.05レベルで考慮した。
VSV−G偽型レンチウイルス粒子の製造のために、HEK293T細胞を、copGFP発現レンチウイルス発現ベクターと3つのパッケージングプラスミド(それらの1つがVSV−G(pMD2.G)をコードする)とを含む4つのプラスミドの混合物で一過的にトランスフェクトした。それぞれCD30又はEGFRを認識する一本鎖抗体フラグメント(scFv−αCD30又はscFv−αEGFR)を組み込むために、シグナル配列(SS)及び全長VSV−GのN末端との間に挿入された、N末端Hisタグと、それに続いてscFv抗体フラグメント、柔軟なリンカー(GGGSGGGSSGGGS)を含む新規VSV−G融合タンパク質が設計された(図1)。最適なレンチウイルスベクターの構成を決定するために、野生型(wt)VSV−G又はscFv−αEGFR付加VSV−GのいずれかをコードするpMD2.Gプラスミドを異なる比率で有するGFPコードscFvで再標的化されたレンチウイルス粒子が生成された。10%、20%、33%及び67%のscFv−αEGFR−VSV−Gを有する抗体で再標的化された粒子が、同等の収率(レンチウイルスコアタンパク質p24を検出するELISAアッセイで定量化)で製造することができた(図2a)。製造混合物中のscFv−αEGFR−VSV−Gコードプラスミドの高い比率によって、wt−VSV−Gレンチウイルスの製造と比較して低い収率がもたらされた。レンチウイルス粒子へのscFv−αEGFR−VSV−Gの取り込みは、scFv−VSV−G偽型粒子のイムノブロットで示された。膜結合型VSV−Gの可能な蓄積が認められたが(白い雲)、HisタグscFv−αEGFR−VSV−Gの明確なバンドが検出された(図2b)。
GFPコード抗体で再標的化された粒子は、MOI1でサイトメトリー分析(図2c〜e)でEGFR+HEK293T細胞に感染する能力を試験した。wt−VSV−Gレンチウイルス粒子は、HEK293T細胞の24.1%に感染できるが、scFv−VSV−G追加レンチウイルス粒子は、感染率を大幅に2.5倍(33%scFv−αEGFR−VSV−Gを有する粒子で62.3%)に向上させることができた。67%のscFv−αEGFR−VSV−Gを担持する抗体で再標的化されたレンチウイルス粒子は、感染率がwt−VSV−Gレンチウイルス粒子の半分(13.4%)のみであり、ホモタイプ(100%)のscFv−αEGFR−VSV−Gレンチウイルス粒子は感染性ではなかった(図2d,e)。
scFv−αEGFR−VSV−Gを提示するレンチウイルス粒子は、EGFR+HEK293T細胞に感染することができた。向上された形質導入率の特異性を確認するために、抗原発現T47D乳癌細胞及び抗原陰性ZR75細胞の両方を、細胞モデルとして用いた(図3a)。T47D細胞では、33%scFv−αEGFR−VSV−Gレンチウイルス粒子は、wt−VSV−Gレンチウイルス粒子(33.7%)と比較して感染率が2倍(67.5%)に高まり、最高の性能を示した。上記の通り、より高いプラスミド量のscFv添加VSV−G(100%)を含有するウイルスの製造は、サイトメトリ−アッセイにおいてEGFR+細胞の感染に失敗した(図3b)。33%scFv−αEGFR−VSV−Gレンチウイルス粒子でのEGFR−ZR75細胞の形質導入では、形質導入率が増加せず(図3c)、このことから、scFv標的化されたレンチウイルス粒子の増強効果がタ−ゲット細胞表面上の抗原の存在と相関していることが証明された。
融合タンパク質のドメインの大きさ及び付着メカニズムの両方が、組換融合タンパク質の正しい折り畳み及び機能のために重要である。融合リンカ−(13アミノ酸:GGGSGGGSSGGGS)の役割を評価するために、我々は、scFv−αEGFR抗体フラグメントの可変軽鎖配列とVSV−G遺伝子配列を分離するリンカー配列が無いscFv−αEGFR−VSV−Gを設計した(参照:図1a)。融合リンカーが無い33%scFv−αEGFR−VSV−Gレンチウイルス粒子の製造は、33%scFv−αEGFR−VSV−Gレンチウイルス粒子の製造と比較して、ウイルス収率が強く減少した(2.5×108対9.1×108ウイルス粒子/ml)。融合リンカーの無い抗体で再標的化された粒子は、T47D細胞の形質導入率を増加させることができなかった(図3d)。我々は、抗体とVSV−Gとの間のリンカー配列は、scFv−VSV−Gで再標的化されたレンチウイルス粒子の改善された機能に影響するとの結論を下した。
低いレンチウイルス感染力価(MOI2以下)は、最も接着性の上皮細胞に形質導入するのに十分である。しかし、懸濁のリンパ腫細胞等の造血細胞では、高いレンチウイルス力価(MOI10)であっても、一部の細胞集団しか形質導入できない。従って、スピノキュレーション、ポロキサマーに基づく化学アジュバント、及びscFvで再標的化されたVSV−Gエンベロープを組み合わせることによって、最適化された感染プロトコールが開発された。KARPAS−299、SUP−M2及びSUDHL−1リンパ腫細胞は、CD30−HEK293T細胞と比較して、高いCD30表面発現レベルを示す(図4a)。MOI10でのリンパ腫細胞の標準的な形質導入によって、20〜40%の形質導入率がもたらされた(図4b〜d)。スピノキュレーション及び化学アジュバントを追加することで、レンチウイルス感染が増加した。さらに、レンチウイルスの表面の33%をscFv−αCD30−VSV−Gで改変したところ、MOI10での形質導入率が90%を超えるレベルに向上した(SUDHL−1細胞でwt−VSV−Gよりも4倍の改善)。レンチウイルス粒子の力価がMOI1に減少したとしても、本形質導入プロトコールを用いることで50%のリンパ腫細胞が形質導入できた。従って、本最適化されたシステムを用いることで、以前の当技術分野のプロトコールと比較すると10倍以上の形質導入効率の増加が得られた。対照的に、CD30−HEK293T細胞は、レンチウイルス表面の改変によって利益を得ることができず、特定の抗原の存在が必要であることがはっきりと示された。これらのデータは、scFv−αEGFR−VSV−G付加レンチウイルスが用いられたときのEGFR−ZR75細胞への効果(図3c)と相関する。すべての試験した細胞型で、33%のscFv−VSV−Gで偽型化されたレンチウイルスベクターの使用によって、最高の形質導入の結果が得られた。
単一細胞型の培養において、scFvで再標的化されたレンチウイルス粒子は、wt−VSV−G偽型ベクターよりもより効果的にリンパ腫と上皮腫瘍細胞を形質導入することができた。さらに、その特異性を2つの競合的な細胞形質導入実験で試験した。第1の実験では、接着性のEGFR+T47D細胞及びEGFR−ZR75細胞を共培養した(図5a)。第2の実験では、CD30+KARPAS−299細胞を、CD30−HL60前骨髄球性リンパ腫細胞と混合し、両細胞を懸濁液中で培養した(図5b,c)。両方の混合物を、100%wt−VSV−Gレンチウイルス粒子又は33%scFv−αCD30−VSV−Gレンチウイルス粒子で、MOI1で最適化条件(+スピノキュレーション、+ポロキサマー系アジュバント)下で感染させた。100%wt−VSV−G偽型レンチウイルス粒子を使用した細胞混合物の各々は、FACS分析によって類似した形質導入率を示した(第1の実験では、24.8%形質導入されたZR75細胞及び27.3%形質導入されたT47D細胞;第2の実験では、37.1%形質導入されたHL−60細胞及び36.3%形質導入されたKARPAS−299細胞)。接着性のT47D細胞及びZR75細胞の形質導入と比較して、リンパ腫細胞及びHL60細胞の懸濁液を用いた実験では、全体としてGFP発現のMFI(平均蛍光強度)値がより低かった。
どちらの場合も、scFvで再標的化されたレンチウイルス粒子を使用したときは、形質導入の平衡が、混合物中の抗原陽性細胞型にシフトした(61.9%のEGFR+T47D細胞、対17.1%の形質導入されたEGFR−ZR75細胞、及び72.2%のCD30+KARPAS−299細胞、対16.5%の形質導入されたCD30−HL60細胞)。これらの知見は、競合する非標的細胞の存在下であっても、抗体で再標的化されたレンチウイルス粒子がそれらの標的細胞に対する相対的特異性を有することを示している。
リンパ腫腫瘍抗原CD30又は広範な上皮腫瘍抗原EGFRに対するリンカー融合一本鎖抗体フラグメント(scFv)を提示するscFv再標的化VSV−G糖タンパク質を担持する、新たなタイプのレンチウイルス粒子が開発された。スピノキュレーション及びポロキサマーに基づくアジュバントと組み合わせると、抗原陽性細胞における高い形質導入率が低いMOIでも達成された。
様々な化学アジュバントを、レンチウイルス遺伝子導入を高めるために用いることができ、化学アジュバントには膜電荷を中和するカチオン性ポリマー又は脂質に基づく化学物質が含まれる[26〜28]。臨床応用のために、レンチウイルス形質導入プロトコールは、しばしばレトロウイルス形質導入増強剤のレトロネクチン、フィブロネクチン由来フラグメントの使用に基づく[29]。レトロネクチンは、GALV偽型ベクター及びRD114偽型ベクターの活性を促進するが、VSV−G偽型ベクターの形質導入は低いことが報告された[22,30,31]。さらに、懸濁細胞へのレトロネクチンの添加量は、その表面に基づく活性によるため難解である。
DrejaとPiechaczyk[14]は、遍在的に発現するヒトMHC−Iに対して指向されたscFv抗体フラグメントに融合された外来シグナル配列を、全長VSV−GのN末端(リンカーなし)に付加した。彼らは、抗体で再標的化されたレンチウイルス粒子の形成及び細胞との結合が示したが、低い力価と、ヒト細胞への低い感染性しか達成しなかった。
本研究では、wt−VSV−GとscFv添加VSV−Gの混合物を提示するレンチウイルス粒子を製造することによって、高い形質導入率で特異性を増加させることができた。全ての実験で、scFv添加VSV−Gの33%の比率で最良の結果が得られた。スピノキュレーションとポロキサマーに基づく化学アジュバントを組み合わせることで、抗原陽性リンパ腫細胞の4倍高い形質導入が、非標的HL60細胞の存在下であっても、得られた。
本明細書に記載された組換えscFv−VSV−G融合の戦略は、及び特に上記実施例中の好ましい戦略は、scFv抗体フラグメントの親和性を変えることで、異なる細胞性抗原に容易に適応できる。挑戦的な非接着性細胞モデルでスピノキュレーション及び化学アジュバントを組み合わせることによって、遺伝子送達速度の顕著な増加が達成された。これらは、工業及び医薬におけるレンチウイルスの適用に有益である。
[1]Bukrinsky MI, Haggerty S, Dempsey MP, Sharova N, Adzhubel A, Spitz L et al. A nuclear localization signal within HIV-1 matrix protein that governs infection of non-dividing cells. Nature 1993; 365: 666-669.
[2]Gaspar HB, Cooray S, Gilmour KC, Parsley KL, Zhang F, Adams S et al. Hematopoietic stem cell gene therapy for adenosine deaminase-deficient severe combined immunodeficiency leads to long-term immunological recovery and metabolic correction. Sci Transl Med 2011; 3: 97ra80.
[3]Gaspar HB, Cooray S, Gilmour KC, Parsley KL, Adams S, Howe SJ et al. Long-term persistence of a polyclonal T cell repertoire after gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. Sci Transl Med 2011; 3: 97ra79.
[4]Lamb LS, Bowersock J, Dasgupta A, Gillespie GY, Su Y, Johnson A et al. Engineered drug resistant γδ T cells kill glioblastoma cell lines during a chemotherapy challenge: a strategy for combining chemo- and immunotherapy. PLoS One 2013; 8(1):e51805.
[5]Chen F, Cai B, Gao Y, Yuan X, Cheng F, Wang T et al. Suicide gene-mediated ablation of tumor-initiating mouse pluripotent stem cells. Biomaterials 2013; 34(6): 1701-1711.
[7]Burns JC, Friedmann T, Driever W, Burrascano M, Yee JK. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1993; 90: 8033-8037.
[8]Li Y, Drone C, Sat E, Ghosh HP. Mutational analysis of the vesicular stomatitis virus glycoprotein G for membrane fusion domains. J Virol 1993; 67: 4070-4077.
[9]Strappe PM, Hampton DW, Cachon-Gonzalez B, Fawcett JW, Lever A. Delivery of a lentiviral vector in a Pluronic F127 gel to cells of the central nervous system. Eur J Pharm Biopharm 2005; 61: 126-133.
[10]Waehler R, Russell SJ, Curiel DT. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet 2007; 8: 573-587.
[12]Kameyama Y, Kawabe Y, Ito A, Kamihira M. Antibody-dependent gene transduction using gammaretroviral and lentiviral vectors pseudotyped with chimeric vesicular stomatitis virus glycoprotein. J Virol Methods 2008; 153(1): 49-54.
[13]Padmashali RM, Andreadis ST. Engineering fibrinogen-binding VSV-G envelope for spatially- and cell-controlled lentivirus delivery through fibrin hydrogels. Biomaterials 2011; 32(12): 3330-3339.
[14]Dreja H, Piechaczyk M. The effects of N-terminal insertion into VSV-G of an scFv peptide. Virol J 2006; 3: 69.
[15]Guinivan P, Ladda RL. Decrease in epidermal growth factor receptor levels and production of material enhancing epidermal growth factor binding accompany the temperature-dependent changes from normal to transformed phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979; 76(7): 3377-3381.
[17]Udayachander M, Meenakshi A, Ansamma J, Muthiah R. Lymphoma-associated antigen (LAA): isolation, characterization and clinical evaluation. Br J Cancer. 1983; 48(5): 717-725.
[18]Deutsch YE, Tadmor T, Podack ER, Rosenblatt JD. CD30: an important new target in hematologic malignancies. Leuk Lymphoma. 2011; 52(9): 1641-1654.
[19]Matthey B, Borchmann P, Schnell R, Tawadros S, Lange H, Huhn M et al. Metalloproteinase inhibition augments antitumor efficacy of the anti-CD30 immunotoxin Ki-3(scFv)-ETA' against human lymphomas in vivo. Int J Cancer 2004; 111: 568-574.
[20]Braschoss S, Hirsch B, Duebel S, Stein H, Duerkop H. New anti-CD30 human pancreatic ribonuclease-based immunotoxin reveals strong and specific cytotoxicity in vivo. Leuk Lymphoma 2007; 48: 1179-1186.
[22]Ingrao D, Majdoul S, Seye AK, Galy A, Fenard D. Concurrent Measures of Fusion and Transduction Efficiency of Primary CD34+ Cells with Human Immunodeficiency Virus 1-Based Lentiviral Vectors Reveal Different Effects of Transduction Enhancers. Hum Gene Ther Methods 2013; In print.
[23]Hofig I, Atkinson MJ, Mall S, Krackhardt AM, Thirion C, Anastasov N. Poloxamer synperonic F108 improves cellular transduction with lentiviral vectors. J Gene Med 2012; 14: 549-560.
[24]Anastasov N, Bonzheim I, Rudelius M, Klier M, Dau T, Angermeier D et al. C/EBPβ expression in ALK-positive anaplastic large cell lymphomas is required for cell proliferation and is induced by the STAT3 signaling pathway. Haematologica 2010; 95(5): 760-767.
[25]Funke S, Maisner A, Muehlebach MD, Koehl U, Grez M, Cattaneo R et al. Targeted cell entry of lentiviral vectors. Mol Ther 2008; 16: 1427-1436.
[27]Toyoshima K, Vogt PK. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology 1969; 38: 414-426.
[28]Davis HE, Rosinski M, Morgan JR, Yarmush ML. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J 2004; 86: 1234-1242.
[29]Hanenberg H, Xiao XL, Dilloo D, Hashino K, Kato I, Williams DA. Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells. Nat Med 1996; 2: 876-882.
[30]Sandrin V, Boson B, Salmon P, Gay W, Negre D, Le Grand R et al. Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates. Blood 2002; 100: 823-832.
[32]Fenard D, Ingrao D, Seye A, Buisset J, Genries S, Martin S et al. Vectofusin-1, a new viral entry enhancer, strongly promotes lentiviral transduction of human hematopoietic stem cells. Mol Ther Nucleic Acids 2013; 2: e90.
[33]Wu DT, Seita Y, Zhang X, Lu CW, Roth MJ. Antibody-directed lentiviral gene transduction for live-cell monitoring and selection of human iPS and hES cells. PLoS One 2012; 7: e34778.
[34]Zhang KX, Moussavi M, Kim C, Chow E, Chen IS, Fazli L et al. Lentiviruses with trastuzumab bound to their envelopes can target and kill prostate cancer cells. Cancer Gene Ther 2009; 16: 820-831.
[35]Morizono K, Xie Y, Ringpis GE, Johnson M, Nassanian H, Lee B et al. Lentiviral vector retargeting to P-glycoprotein on metastatic melanoma through intravenous injection. Nat Med 2005; 11: 346-352.
[37]Farley DC, Iqball S, Smith JC, Miskin JE, Kingsman SM, Mitrophanous KA. Factors that influence VSV-G pseudotyping and transduction efficiency of lentiviral vectors - in vitro and in vivo implications. J Gene Med 2007; 9: 345-356.
[38]Schlehuber LD, Rose JK. Prediction and identification of a permissive epitope insertion site in the vesicular stomatitis virus glycoprotein. J Virol 2004; 78(10): 5079-5087.
[39]Yu JH, Schaffer DV. Selection of novel vesicular stomatitis virus glycoprotein variants from a peptide insertion library for enhanced purification of retroviral and lentiviral vectors. J Virol 2006; 80: 3285-3292.
[40]Kaikkonen MU, Lesch HP, Pikkarainen J, Raety JK, Vuorio T, Huhtala T et al. (Strept)avidin-displaying lentiviruses as versatile tools for targeting and dual imaging of gene delivery. Gene Ther 2009; 16: 894-904.
[42]Roche S, Albertini AA, Lepault J, Bressanelli S, Gaudin Y. Structures of vesicular stomatitis virus glycoprotein: membrane fusion revisited. Cell Mol Life Sci 2008; 65: 1716-1728.
[43]Albertini AA, Merigoux C, Libersou S, Madiona K, Bressanelli S, Roche S et al. Characterization of monomeric intermediates during VSV−Glycoprotein structural transition. PLoS Pathog 2012; 8(2):e1002556.
[44]Millington M, Arndt A, Boyd M, Applegate T, Shen S, 2009 Towards a Clinically Relevant Lentiviral Transduction Protocol for Primary Human CD34+ Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. PLoS ONE 4(7): e6461. doi:10.1371/journal.pone.0006461.
[45]Lemberg and Martoglio. Requirements for signal peptide peptidase-catalyzed intramembrane proteolysis. Mol Cell. 2002; 10(4):735-44.
[47]Yeagle “The Membranes of Cells”, Academic Press, Amsterdam (1993).
[48]Luckey “Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations”, Cambridge University Press, Cambridge (2008).
[49]Yoneda J, Saiki I, Igarashi Y, Kobayashi H, Fujii H, Ishizaki Y, Kimizuka F, Kato I, Azuma I. Role of the heparin-binding domain of chimeric peptides derived from fibronectin in cell spreading and motility. Exp Cell Res. 1995 Mar; 217(1):169-79.
[50]Michalsky,E., Goede,A. and Preissner,R. (2003) Loops In Proteins (LIP) - a comprehensive loop database for homology modelling. Protein Eng. 16, 979-985.
[52]Lichty, Power, Stojdl and Bell. Vesicular stomatitis virus: re-inventing the bullet. Trends Mol Med. 2004; 10(5): 210-6.
[53]Regan and Whittaker. Entry of rhabdoviruses into animal cells. Adv Exp Med Biol. 2013; 790: 167-77.
[54]Martinez and Wertz. Biological differences between vesicular stomatitis virus Indiana and New Jersey serotype glycoproteins: identification of amino acid residues modulating pH-dependent infectivity. J Virol. 2005; 79(6):3578-85.
[55]Fredericksen and Whitt. Vesicular stomatitis virus glycoprotein mutations that affect membrane fusion activity and abolish virus infectivity. J. Virol. 1995; 69: 1435-43.
[57]Yee JK, Friedmann T, Burns JC. Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range. Methods Cell Biol. 1994; 43 Pt A: 99-112.
[58]Cronin J, Zhang XY, Reiser J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 2005 Aug; 5(4):387-98.
[59]Bartosch B, Cosset FL. Strategies for retargeted gene delivery using vectors derived from lentiviruses. Curr Gene Ther. 2004 Dec; 4(4):427-43.
[60]Froelich S, Tai A, Wang P. Lentiviral vectors for immune cells targeting. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2010 Jun; 32(2):208-18.
[62]Robison C.L. and Whitt, M.A.: The Membrane-Proximal Stem Region of Vesicular Stomatitis Virus G Protein Confers Efficient Virus Assembly. Journal of Virology, Mar. 2000, p. 2239-2246.
[63]Klimka et al. An anti-CD30 single-chain Fv selected by phage display and fused to Pseudomonas exotoxin A (Ki-4(scFv)-ETA') is a potent immunotoxin against a Hodgkin-derived cell line. Br J Cancer. 1999 Jun; 80(8):1214-22.
[64]Kettleborough CA, Ansell KH, Allen RW, Rosell-Vives E, Gussow DH, Bendig MM. Isolation of tumor cell-specific single-chain Fv from immunized mice using phage-antibody libraries and the re-construction of whole antibodies from these antibody fragments. Eur J Immunol. 1994 Apr; 24(4):952-8.
Claims (15)
- 細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる(ポリ)ペプチドに連結された水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質(VSV−G)をコードする核酸配列を含むか又はからなる核酸分子であって、
前記核酸配列は、5’から3’の方向に、
(a)小胞体(ER)シグナル配列をコードする第1の配列セグメント;
(b)細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる前記の(ポリ)ペプチドをコードする第2の配列セグメント;
(c)リンカーをコードする第3の配列セグメント;及び
(d)前記のVSV−Gをコードする第4の配列セグメント
を含む、核酸分子。 - 前記の第2の配列セグメントでコードされる細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる前記の(ポリ)ペプチドが、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、VHH抗体フラグメント、VNAR一本鎖抗体及びタンパク質足場からなる群から選択される、請求項1に記載の核酸分子。
- 細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる前記の(ポリ)ペプチドが、糖脂質、リン脂質、オリゴ糖、Gタンパク質共役細胞受容体(GPCR)、分化のクラスター(CD)細胞表面タンパク質、細胞表面受容体、細胞表面共受容体及びタンパク質からなる群から選択される1つ又はそれ以上の細胞膜成分に特異的に結合する、請求項1又は2に記載の核酸分子。
- (a)前記ERシグナル配列をコードする前記第1の配列セグメントが、配列番号1に示される核酸配列を含むか又はからなり;
(b)リンカーをコードする前記第3の配列セグメントが、配列番号3に示される核酸配列を含むか又はからなり;及び/又は
(c)前記VSV−Gをコードする前記第4の配列セグメントが、配列番号5に示される核酸配列を含むか又はからなる、
請求項1〜3のいずれかに記載の核酸分子。 - 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸分子、又は請求項5に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる細胞膜結合ドメインを含むか若しくはからなる(ポリ)ペプチド、又は請求項7に記載のポリペプチドに連結されたVSV−Gを製造する方法であって、
前記方法は、請求項6の宿主細胞を培養し、細胞膜結合ドメインを含むか若しくはからなる(ポリ)ペプチドに連結された製造されたVSV−G又は製造されたポリペプチドを単離することを含む方法。 - (a)請求項1〜4のいずれからに記載の核酸分子によってコードされる細胞膜結合ドメインを含む及び/又はからなる(ポリ)ペプチドに連結されたVSV−G;及び
(b)細胞膜結合ドメインを含む及び/又はからなる(ポリ)ペプチドに連結されていないVSV−G
で偽型化されたレンチウイルスベクター粒子。 - 請求項9に記載の偽型レンチウイルスベクター粒子を製造する方法であって、
前記方法は、宿主細胞に
(i)ウイルス粒子タンパク質をコードする1つ又はそれ以上のパッケージングプラスミド;
(ii)請求項1〜4のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター;及び
(iii)細胞膜結合ドメインを含むか又はからなる(ポリ)ペプチドに連結されていないVSV−Gをコードする核酸分子を含むベクター
をトランスフェクトすることを含む方法。 - 細胞に形質導入する方法であって、
前記方法は、形質導入に適した条件下、形質導入される細胞を請求項9に記載の偽型レンチウイルスベクター粒子と接触させて、前記細胞に形質導入する工程を含む方法。 - 前記細胞を、アジュバントと、好ましくは12.8kDa〜約15kDaの分子量を有するポロキサマーと接触させることをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 標的細胞の前記アジュバントとの接触の前に、接触と同時に、又は接触の後に、偽型レンチウイルスベクター粒子を前記細胞とスピノキュレーションさせる工程をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 形質導入される細胞が、腫瘍細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、神経細胞及び幹細胞からなる群から選択されるか、並びに/又は、好ましくは、形質導入される細胞が、異種細胞集団の一部である、請求項11〜13のいずれかに記載の方法。
- (a)(i)請求項1〜4のいずれかに記載の核酸分子;若しくは
(a)(ii)請求項1〜4のいずれかに記載の核酸分子、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる(ポリ)ペプチドに連結されていないVSV−Gをコードする核酸配列を含む若しくはからなる核酸分子;
並びに/又は
(b)(i)請求項5に記載のベクター;若しくは
(b)(ii)請求項5に記載のベクター、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる(ポリ)ペプチドに連結されていないVSV−Gをコードする核酸配列を含む若しくはからなる核酸分子を含むベクター;
並びに/又は
(c)(i)請求項6に記載の宿主細胞;若しくは
(c)(ii)請求項6に記載の宿主細胞、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる(ポリ)ペプチドに連結されていないVSV−Gをコードする核酸配列を含む若しくはからなる核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞;
並びに/又は
(d)(i)請求項7に記載のポリペプチド;若しくは
(d)(ii)請求項7に記載のポリペプチド、及び細胞膜結合ドメインを含む若しくはからなる(ポリ)ペプチドに連結されていないVSV−G;
並びに/又は
(e)請求項9に記載の偽型レンチウイルスベクター粒子;
並びに、必要に応じて、使用説明書
を含むキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14150846 | 2014-01-10 | ||
EP14150846.5 | 2014-01-10 | ||
PCT/EP2015/050337 WO2015104376A1 (en) | 2014-01-10 | 2015-01-09 | Pseudotyped lentiviral vectors |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017505606A true JP2017505606A (ja) | 2017-02-23 |
JP6412579B2 JP6412579B2 (ja) | 2018-10-24 |
Family
ID=49918583
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016545901A Active JP6412579B2 (ja) | 2014-01-10 | 2015-01-09 | 偽型レンチウイルスベクター |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10072273B2 (ja) |
EP (2) | EP3092306B1 (ja) |
JP (1) | JP6412579B2 (ja) |
CA (1) | CA2935929C (ja) |
ES (1) | ES2761638T3 (ja) |
WO (1) | WO2015104376A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021500909A (ja) * | 2017-10-30 | 2021-01-14 | ミルテニイ バイオテック ベー.ファオ. ウント コー.カーゲー | 標的細胞の選択的形質導入のためのアダプターベースのレトロウイルスベクター系 |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11326183B2 (en) | 2016-02-12 | 2022-05-10 | Bluebird Bio, Inc. | VCN enhancer compositions and methods of using the same |
US20190069528A1 (en) * | 2016-03-21 | 2019-03-07 | The George Washington University | Engineered human hookworms as a novel biodelivery system for vaccines and biologicals |
AU2017301881A1 (en) | 2016-07-29 | 2019-02-07 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for assessing the presence or absence of replication competent virus |
US11535903B2 (en) | 2018-01-31 | 2022-12-27 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods and reagents for assessing the presence or absence of replication competent virus |
CN113631703A (zh) * | 2018-12-04 | 2021-11-09 | 西瑞恩生物科技股份有限公司 | 使用泊洛沙胺的病毒传导 |
CN111910015A (zh) * | 2019-05-08 | 2020-11-10 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 一种检测复制型慢病毒的探针、引物对、荧光定量pcr试剂盒及方法 |
AU2020278470A1 (en) * | 2019-05-23 | 2021-12-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Ligand discovery and gene delivery via retroviral surface display |
WO2022013872A1 (en) * | 2020-07-14 | 2022-01-20 | Ichilov Tech Ltd. | Pseudotyped viruses configured to express car in t-cells |
JP2023543472A (ja) * | 2020-09-30 | 2023-10-16 | サンシャイン・レイク・ファーマ・カンパニー・リミテッド | ウイルスベクター及びその使用 |
WO2023143209A1 (zh) * | 2022-01-25 | 2023-08-03 | 广东东阳光药业股份有限公司 | 病毒载体及其应用 |
WO2024107983A1 (en) * | 2022-11-16 | 2024-05-23 | The General Hospital Corporation | Virus-like particles with programmable tropism and methods of use thereof for delivery to cells |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2615176A1 (en) * | 2012-01-11 | 2013-07-17 | Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe | Novel pseudotyped lentiviral particles and their use in the in vitro targeted transduction of undifferentiated pluripotent human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells |
WO2013127964A1 (en) * | 2012-02-29 | 2013-09-06 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Retroviral transduction using poloxamers |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US6080560A (en) | 1994-07-25 | 2000-06-27 | Monsanto Company | Method for producing antibodies in plant cells |
-
2015
- 2015-01-09 WO PCT/EP2015/050337 patent/WO2015104376A1/en active Application Filing
- 2015-01-09 CA CA2935929A patent/CA2935929C/en active Active
- 2015-01-09 EP EP15700128.0A patent/EP3092306B1/en active Active
- 2015-01-09 JP JP2016545901A patent/JP6412579B2/ja active Active
- 2015-01-09 ES ES15700128T patent/ES2761638T3/es active Active
- 2015-01-09 US US15/110,924 patent/US10072273B2/en active Active
- 2015-01-09 EP EP19202980.9A patent/EP3670651A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2615176A1 (en) * | 2012-01-11 | 2013-07-17 | Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe | Novel pseudotyped lentiviral particles and their use in the in vitro targeted transduction of undifferentiated pluripotent human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells |
WO2013127964A1 (en) * | 2012-02-29 | 2013-09-06 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Retroviral transduction using poloxamers |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
AMMAYAPPAN A; PENG K-W; RUSSELL S J: "CHARACTERISTICS OF ONCOLYTIC VESICULAR STOMATITIS VIRUS DISPLAYING TUMOR-TARGETING LIGANDS", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. VOL:87 NR:24, JPN5016013433, 2 October 2013 (2013-10-02), pages 13543 - 13555, ISSN: 0003714530 * |
BLOOD, vol. 114, JPN6017050818, 2009, ISSN: 0003870598 * |
NATURE METHODS, vol. 7 (11), JPN6017050814, 2010, pages 929 - 935, ISSN: 0003870597 * |
PNAS, vol. 103 (31), JPN6017050816, 2006, pages 11479 - 11484, ISSN: 0003870599 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021500909A (ja) * | 2017-10-30 | 2021-01-14 | ミルテニイ バイオテック ベー.ファオ. ウント コー.カーゲー | 標的細胞の選択的形質導入のためのアダプターベースのレトロウイルスベクター系 |
JP7237960B2 (ja) | 2017-10-30 | 2023-03-13 | ミルテニイ ビオテック ベー.ファー. ウント コー.カーゲー | 標的細胞の選択的形質導入のためのアダプターベースのレトロウイルスベクター系 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2761638T3 (es) | 2020-05-20 |
JP6412579B2 (ja) | 2018-10-24 |
US20160333374A1 (en) | 2016-11-17 |
EP3092306A1 (en) | 2016-11-16 |
CA2935929C (en) | 2022-02-22 |
CA2935929A1 (en) | 2015-07-16 |
EP3670651A1 (en) | 2020-06-24 |
EP3092306B1 (en) | 2019-10-16 |
WO2015104376A1 (en) | 2015-07-16 |
US10072273B2 (en) | 2018-09-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6412579B2 (ja) | 偽型レンチウイルスベクター | |
JP2021530985A (ja) | フソソームの組成物及びその使用 | |
JP2022002530A (ja) | ウイルスベクター効率を改善するための組成物及び方法 | |
WO2021202604A1 (en) | Targeted lipid particles and compositions and uses thereof | |
US20180320196A1 (en) | Transposon system, kit comprising the same, and uses thereof | |
JP2022527129A (ja) | クローディン18.2を標的とする抗体又はキメラ抗原受容体 | |
JP2024503027A (ja) | Cd8標的ウイルスベクターの使用方法 | |
WO2021046143A1 (en) | Cd24-associated particles and related methods and uses thereof | |
Höfig et al. | Systematic improvement of lentivirus transduction protocols by antibody fragments fused to VSV-G as envelope glycoprotein | |
CN116157116A (zh) | 用于产生病毒融合体的方法和组合物 | |
JP2024020452A (ja) | 遺伝子治療のためのポリマーカプセル化されたウイルスベクター | |
US6524572B1 (en) | Targeting recombinant virus with a bispecific fusion protein ligand in coupling with an antibody to cells for gene therapy | |
Kubo et al. | Characterization of R peptide of murine leukemia virus envelope glycoproteins in syncytium formation and entry | |
RU2790661C2 (ru) | Варианты trem2, устойчивые к действию шеддазы | |
WO2022084491A1 (en) | Coronavirus-specific t cell receptor fusion constructs, vectors encoding the same, t cells comprising the same and uses thereof | |
Hoop | Modulation of the transduction of pseudotyped lentiviral vectors and their application for the production of recombinant proteins | |
KR20230112691A (ko) | 바이러스 감염을 치료하기 위한 방법 및 조성물 | |
CN116789844A (zh) | 一种靶向cd7蛋白的嵌合抗原受体及其用途 | |
Truncations | Fusogenicity of Jaagsiekte Sheep |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170119 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170119 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180109 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180307 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180904 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180928 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6412579 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |