CN107406860A - 逆转录病毒载体和慢病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：(i)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其包含促有丝分裂结构域和跨膜结构域；和/或(ii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域，其中所述促有丝分裂或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是病毒包膜糖蛋白的一部分。当通过此类病毒载体转导细胞例如T细胞或自然杀伤细胞时，它们被促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白同时活化。

Description

逆转录病毒载体和慢病毒载体
发明领域
本发明涉及逆转录病毒和慢病毒载体以及用于它们的产生的细胞。所述载体可以用于转导细胞，例如T细胞。特别地，本发明涉及能够转导并活化细胞例如T细胞的逆转录病毒或慢病毒载体。
发明背景
生成工程化的T细胞产物通常要求使用促细胞分裂剂(mitogen)刺激随后使用整合载体例如慢病毒载体或逆转录病毒载体转导。
广泛使用的方法是向细胞培养物添加可溶的促有丝分裂单克隆抗体(mAb)，例如抗TCR/CD3和抗CD28。替换方法是将抗TCR/CD3 mAb连同抗CD28 mAb一起附接于珠。相比于单独的可溶性抗体，所述珠的表面具有改进的T细胞活化特性。
另外，普遍将细胞因子(例如IL2、IL15或IL17)添加至细胞培养物。
这些促有丝分裂剂抗体和细胞因子是单次使用的消耗品，且通常代表了T细胞产生过程中最昂贵的部分。
Maurice等人描述了慢病毒包膜蛋白的直接工程化，使得CD3激动剂OKT3展示在病毒粒子表面(Maurice et al.；Blood；2002；99；2342-2350)。Verhoeyen等人描述了相似的方法，其中慢病毒包膜蛋白经工程化以整合IL7(Verhoeyen et al.；Blood；2003；101；2167-2174)。
这些工程化方法中的每一种要求对病毒包膜蛋白的复杂工程化。该复杂工程化必须对待展示在病毒粒子表面上的每种离散的肽执行。所述方法也已经显示降低病毒滴度。
因此，对于不与上述缺点相关的用于生成工程化的T细胞产物的新方法存在需要。
附图简述
图1-由脂质双层包围的retroSTIM载体的图，所述脂质双层散布有RD114包膜糖蛋白和各种促有丝分裂元件如scFv或膜结合的细胞因子。
图2-证明OKT3 scFv可以整合到慢病毒中。结果显示T细胞的活化(a)未刺激-使用来自294T细胞的慢病毒载体转导；(b)使用OKT3、CD28.2和IL-2刺激-使用来自293T细胞的慢病毒载体转导；(c)未刺激-使用来自293T.OKT3的上清液转导，所述293T.OKT3仅使用转移载体转染；(d)未刺激-使用来自293T.OKT3的慢病毒载体转导。顶部图显示了转导的散点图(x-轴)，和通过CD25表达的活化(y-轴)。底部图显示了T细胞培养物的显微照片。聚集(clumping)指示活化。
图3-证明T细胞的促有丝分裂刺激和转导依赖于gagpol。使用gagpol、RD-PROenv，所有三种质粒的转移载体连同rev转染稳定表达表面结合的OKT3的293T细胞。将随后的上清液应用于原代人T细胞。通过流式细胞术使用以下参数研究T细胞：CD25以测量T细胞活化；抗Fc以检测作为具有Fc间隔区的CAR的转基因；ki67以确定周期中的细胞。仅供给gagpol的条件导致显著的促有丝分裂刺激。仅供给所有质粒(连同rev)的条件导致T细胞的促有丝分裂刺激和转导。
图4-证明不同的慢病毒假型化(pseudotyping)支持促有丝分裂效果。使用慢病毒转移载体、慢病毒gagpol，rev和不同的env质粒转染稳定表达膜结合的OKT3的293T细胞：即VSV-G、RD-PRO、Ampho、GALV和麻疹(Measles)M/H。将随后的上清液应用于原代人T细胞。所述细胞随后使用ki67染色并通过流式细胞术分析。所有假型支持促有丝分裂效果，尽管使用麻疹假型化似乎降低效果。
图5-证明使用gamma-逆转录病毒载体实现了T细胞的促有丝分裂刺激和转导。使用编码CAR、gamma-逆转录病毒gagpol表达质粒和RD114表达质粒的gamma-逆转录病毒转移载体转染稳定表达膜结合的OKT3的293T细胞。将随后的上清液应用于原代人T细胞。所述T细胞随后使用抗Fc、抗CD25和ki67染色并通过流式细胞术研究。尽管没有应用促有丝分裂刺激物，T细胞被活化、循环，并表达转基因。
图6-证明可以将两种不同的促有丝分裂刺激物整合到病毒载体中，且与仅抗CD3/TCR相比，抗CD3/TCR刺激物连同抗CD28刺激物具有改进的效果。
图7-使用自在其细胞表面表达不同元件的293T细胞生成的不同慢病毒载体刺激的T细胞的低分辨率显微术。
图8-使用展示促有丝分裂和细胞因子肽的不同组合的lentiSTIM载体转导后CD4和CD8T细胞的活化。通过转导后120小时的CD25表达确定活化。
图9-使用展示促有丝分裂和细胞因子肽的不同组合的lentiSTIM载体转导后CD4和CD8T细胞的增殖。通过转导后120小时的Ki67表达确定增殖。
图10-使用展示促有丝分裂和细胞因子肽的不同组合的lentiSTIM载体转导后T细胞的扩增。通过转导后120小时的绝对细胞计数确定扩增。
图11-检查使用表达抗CD3和抗CD28抗体的lentiSTIM载体或使用抗CD3和抗CD28抗体包被的珠活化的PBMC的T细胞亚组表型。NM-LV＝未修饰的慢病毒；STIM-LV＝lentiSTIM载体；Tem＝效应记忆T细胞；Tcm＝中央记忆T细胞；Tscm＝干记忆T细胞；和Tn＝幼稚T细胞。
发明概述
本发明基于以下发现，即可以将促有丝分裂刺激物和/或细胞因子刺激物整合到逆转录病毒或慢病毒衣壳中，使得病毒既活化又转导T细胞。这去除了添加载体、促细胞分裂剂和细胞因子的需要。本发明涉及在生产或包装细胞中包括促有丝分裂跨膜蛋白和/或基于细胞因子的跨膜蛋白，其当从生产/包装细胞膜出芽时，整合到逆转录病毒中。所述促有丝分裂跨膜蛋白和/或基于细胞因子的跨膜蛋白在生产细胞(producer cell)上作为单独的细胞表面分子表达而不是病毒包膜糖蛋白的一部分。这意味着病毒包膜的读码框不受影响，因此保留了功能完整性和病毒滴度。
因此，在第一个方面本发明提供具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：
(i)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其包含促有丝分裂结构域和跨膜结构域；和/或
(ii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域
其中所述促有丝分裂或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是病毒包膜糖蛋白的一部分。
逆转录病毒或慢病毒载体可以包含单独的病毒包膜糖蛋白，其由env基因编码。
因此，提供的是具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：
(i)病毒包膜糖蛋白；和
(ii)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其具有以下结构：
M-S-TM
其中M是促有丝分裂结构域；S是任选的间隔区且TM是跨膜结构域；和/或
(iii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域。
所述促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是病毒包膜糖蛋白的一部分。它们作为病毒包膜中单独的蛋白存在，且由单独的基因编码。
促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白可以具有以下结构：
M-S-TM
其中M是促有丝分裂结构域；S是任选的间隔区且TM是跨膜结构域。
促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白可以结合活化T细胞表面抗原例如CD3、CD28、CD134或CD137。促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白可以包含用于此类活化T细胞表面抗原的激动剂。
促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白可以包含来自抗体例如OKT3、15E8、TGN1412的结合结构域；或共刺激分子例如OX40L或41BBL。
病毒载体可以在病毒包膜中包含两个或更多个促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白。例如，病毒载体可以包含结合CD3的第一促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和结合CD28的第二促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白。
基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白可以例如包含选自IL2、IL7和IL15的细胞因子。
特别地，提供了具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：
(ia)结合CD3的第一促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白；和
(ib)结合CD28的第二促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白。
还提供了具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：
(ia)结合CD3的第一促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白；
(ib)结合CD28的第二促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白；和
(ii)包含IL2的基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白。
还提供了具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：
(ia)结合CD3的第一促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白；
(ib)结合CD28的第二促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白；
(iia)包含IL2的基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白；
(iib)包含IL15的基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白。
所述病毒载体可以包含产生假性化病毒载体的异源病毒包膜糖蛋白。例如，所述病毒包膜糖蛋白可以来源于RD114或其变体之一、VSV-G，长臂猿白血病病毒(GALV)，或是双嗜性(Amphotropic)包膜、麻疹(Measles)包膜，或狒狒逆转录病毒包膜糖蛋白。
在本发明的第一个方面的第二个实施方案中，病毒载体的病毒包膜还可以包含：
(iv)标签化蛋白(tagging protein)，其包含：
结合捕获部分的结合结构域；
间隔区；和
跨膜结构域
通过所述标签化蛋白对所述捕获部分的结合，所述标签化蛋白促进所述病毒载体从细胞上清液的纯化。
标签化蛋白的结合结构域可以包含一个或多个链霉亲合素结合表位。所述链霉亲合素结合表位可以是生物素模拟物，例如以比生物素低的亲和力结合链霉亲合素的生物素模拟物，使得可以使用亲和素洗脱链霉亲合素捕获的由包装细胞产生的逆转录病毒载体。
适合的生物素模拟物的实例包括：StreptagII(SEQ ID NO:36)、Flankedccstretag(SEQ ID NO:37)和ccstreptag(SEQ ID NO:38)。
本发明的第一个方面的病毒载体可以包含编码T细胞受体或嵌合抗原受体的核酸序列。
所述病毒载体可以是病毒样颗粒(VLP)。
在第二个方面，本发明提供宿主细胞，其在细胞表面表达：
(i)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其包含促有丝分裂结构域和跨膜结构域；和/或
(ii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域
使得由所述宿主细胞产生的逆转录病毒或慢病毒载体如本发明的第一个方面中所定义的。
在本发明的第二个方面的第二个实施方案中，所述宿主细胞在细胞表面还表达
(iii)标签化蛋白，其包含：
结合捕获部分的结合结构域；和
跨膜结构域
通过所述标签化蛋白对所述捕获部分的结合，所述标签化蛋白促进所述病毒载体从细胞上清的纯化，
使得由包装蛋白产生的逆转录病毒或慢病毒载体如本发明的第一个方面的第二个实施方案中所定义的。
所述标签化蛋白可以在结合结构域和跨膜结构域之间包含间隔区。
术语宿主细胞可以是包装细胞或生产细胞。
包装细胞可以包含一种或多种以下基因：gag、pol、env和/或rev。
生产细胞包含gag、pol、env和任选的rev基因，且还包含逆转录病毒或慢病毒基因组。
在这方面，所述宿主细胞可以是稳定表达促有丝分裂和/或细胞因子跨膜蛋白的任何适合的细胞系。其可以使用转移载体gagpol，env(和在慢病毒的情况下rev)瞬时转染以产生无复制能力的逆转录病毒/慢病毒载体。
在第三个方面，提供了用于制造根据本发明的第二个方面的宿主细胞的方法，其包括使用编码促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白的核酸转导或转染细胞的步骤。
在第四个方面，提供了用于产生根据本发明的第一个方面的病毒载体的方法，其包括在根据本发明的第二个方面的细胞中表达逆转录病毒或慢病毒基因组的步骤。
在第五个方面，提供了用于制造活化的转基因T细胞或自然杀伤(NK)细胞的方法，其包括使用根据本发明的第一个方面的病毒载体转导T或NK细胞的步骤，使得所述T细胞或NK细胞被一种或多种促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或一种或多种基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白活化。
在第六个方面，提供了用于制造如本发明的第一个方面中定义的逆转录病毒或慢病毒载体的试剂盒，其包含：
(i)如本发明的第二个方面中定义的宿主细胞；
(ii)包含gag、pol、env和任选的rev的核酸；和
(iii)逆转录病毒基因组。
还提供了用于制造如本发明的第一个方面中定义的逆转录病毒或慢病毒载体的试剂盒，其包含：
(i)如本发明的第二个方面中定义的包装细胞；和
(ii)逆转录病毒基因组。
还提供了用于制造根据本发明的第二个方面的第二个实施方案中定义的包装细胞的试剂盒，其包含：
(i)编码促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白的一种或多种核酸；和
(ii)包含逆转录病毒gag、pol、和env基因的核酸。
还提供了用于制造根据本发明的第二个方面的生产细胞的试剂盒，其包含：
(i)编码促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白的一种或多种核酸；
(ii)包含逆转录病毒gag、pol、和env基因的核酸；和
(iii)逆转录病毒或慢病毒载体基因组。
因此，本发明提供了具有嵌入(built-in)促有丝分裂刺激物和/或细胞因子刺激物的病毒载体(参见图1)。所述载体具有既刺激T细胞又实现基因插入的能力。这具有许多优点：(1)其简化了T细胞工程化的过程，因为只需要添加一种组分；(2)其避免了珠的去除和相关的产率降低，因为病毒是不稳定的(labile)且不必要去除。(3)其降低了T细胞工程化的成本，因为仅需要制造一种组分；(4)其允许更大的设计灵活性：每个T细胞工程化过程将涉及制造基因转移载体，也可以使用促有丝分裂刺激物制造相同的产物以使得产物“相符(fit)”；(5)其允许缩短的产生过程：在可溶性抗原/基于珠的方法中，促细胞分裂剂和载体通常顺序给予，其由一天、两天或有时候三天分开，使用本发明的逆转录病毒载体可以避免这样，因为促有丝分裂刺激和病毒进入是同步和同时的；(6)更容易工程化，因为不需要测试多种不同的融合蛋白的表达和功能性；(7)可以同时添加多于一种信号；和(8)可以单独调节每种信号/蛋白的表达和/或表达水平。
由于在与病毒包膜糖蛋白分离的分子上提供促有丝分裂刺激物和/或细胞因子刺激物，维持了病毒包膜糖蛋白的完整性，且对病毒滴度没有负面影响。
发明详述
逆转录病毒
逆转录病毒是双链RNA包膜病毒，其主要特征在于将其基因组从RNA“逆转录”至DNA的能力。病毒粒子直径测量为100-120nm，且含有与核衣壳蛋白质复合的相同阳性RNA链的二聚体基因组。基因组被封装在还含有酶蛋白质的蛋白质衣壳中，即病毒感染所需的逆转录酶，整合酶和蛋白酶。基质蛋白在衣壳核心外部形成层，其与围绕病毒核心颗粒的衍生自宿主细胞膜的脂质双层的包膜相互作用。锚定在该双层上的是负责识别宿主细胞上的特异性受体并起始感染过程的病毒包膜糖蛋白。包膜蛋白由两个亚基形成，将蛋白质锚定到脂质膜中跨膜(TM)，和结合细胞受体的表面(SU)。
基于基因组结构，逆转录病毒分为简单逆转录病毒，如MLV和鼠白血病病毒；或复杂逆转录病毒，如HIV和EIAV。逆转录病毒编码四种基因：gag(组特异性抗原)，pro(蛋白酶)，pol(聚合酶)和env(包膜)。gag序列编码三种主要结构蛋白：基质蛋白，核衣壳蛋白和衣壳蛋白。pro序列编码在颗粒组装，发芽和成熟期间负责切割Gag和Gag-Pol的蛋白酶。pol序列编码酶逆转录酶和整合酶，前者在感染过程中催化病毒基因组从RNA到DNA的逆转录，后者负责将前病毒DNA整合入宿主细胞基因组。env序列编码包膜糖蛋白的SU和TM亚基。另外，逆转录病毒基因组呈现非编码顺式作用序列，例如：两个LTR(长末端重复序列)，其含有驱动基因表达，逆转录和整合入宿主细胞染色体所需的元件；将病毒RNA特异性包装到新形成的病毒体中所需的称为包装信号(ψ)的序列；和作为在逆转录过程中引发正链DNA合成的位点的多嘌呤序列(polypurine tract)(PPT)。除了gag，pro，pol和env之外，复杂逆转录病毒如慢病毒具有包括vif，vpr，vpu，nef，tat和rev的附属基因，其调节感染细胞中病毒基因表达，感染颗粒的组装和调控病毒复制。
在感染过程期间，逆转录病毒最初附着于特定的细胞表面受体。在进入易感宿主细胞时，然后通过亲本病毒内部携带的病毒编码的逆转录酶将逆转录病毒RNA基因组复制到DNA。该DNA转运至宿主细胞核，随后其整合到宿主基因组中。在这个阶段，其通常被称为前病毒。前病毒在细胞分裂期间在宿主染色体中是稳定的，并且像其他细胞蛋白质一样转录。前病毒编码产生更多病毒所需的蛋白和包装机器，可以通过称为“萌芽”的过程离开细胞。
当包膜病毒(例如逆转录病毒和慢病毒)从宿主细胞中出芽时，它们会采取宿主细胞脂质膜的一部分。以这种方式，宿主细胞衍生的膜蛋白成为逆转录病毒颗粒的一部分。本发明利用该过程以将感兴趣的蛋白质引入病毒颗粒的包膜中。
逆转录病毒载体
逆转录病毒和慢病毒可以用作将感兴趣的核苷酸(NOI)或多个NOI转移到靶细胞的载体或递送系统。转移可以在体外，离体或体内发生。当以这种方式使用时，病毒通常被称为病毒载体。
在本发明的病毒载体中，NOI可以编码T细胞受体或嵌合抗原受体和/或自杀基因。
通常称为逆转录病毒载体的γ-逆转录病毒载体是1990年用于基因治疗临床试验的第一种病毒载体，且仍然是最常用的病毒载体之一。最近，源自复杂逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒(HIV)的慢病毒载体的兴趣由于其转导非分裂细胞的能力而增长。逆转录病毒和慢病毒载体作为基因转移工具的最有吸引力的特征包括大的遗传有效载荷的容量(高达9kb)，最小的患者免疫应答，体内和体外的高转导效率，以及永久修饰靶细胞的遗传内容的能力，维持所递送基因的长期表达。
逆转录病毒载体可以基于能够将遗传信息传递给真核细胞的任何合适的逆转录病毒。例如，逆转录病毒载体可以是α逆转录病毒载体，γ逆转录病毒载体，慢病毒载体或spumaretroviral载体。这些载体已广泛用于基因疗法治疗和其他基因递送应用。
本发明的病毒载体可以是逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒载体。所述病毒载体可以基于人类免疫缺陷病毒。
本发明的病毒载体可以是慢病毒载体。所述载体可以基于非灵长类慢病毒如马传染性贫血病毒(EIAV)。
如图1所示，本发明的病毒载体包含病毒包膜中的促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白。
如上文所述，促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白来自宿主细胞膜。
病毒样颗粒(VLP)
对于逆转录病毒和慢病毒载体，Gag前体的表达足以介导病毒粒子组装和释放。已经证明了Gag蛋白，甚至Gag的片段能够在体外组装形成类似于病毒粒子核心的各种结构。这些没有病毒遗传物质，因此是非传染性的颗粒被称为病毒样颗粒(VLP)。与完整的病毒颗粒相似，它们含有由宿主细胞脂双层(膜)制成的外部病毒包膜，因此含有宿主细胞跨膜蛋白。
本发明的第一个方面的病毒载体可以是或包含病毒样颗粒。
感兴趣的核酸(NOI)
本发明的病毒载体能够将目的核苷酸(NOI)递送至靶细胞，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
NOI可编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)和/或自杀基因的全部或一部分。
CAR是将细胞外抗原识别结构域(结合剂(binder))连接到细胞内信号传导结构域(胞内域)的嵌合I型跨膜蛋白。结合剂通常是衍生自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但其可以基于包含抗体样抗原结合位点的其他形式。通常需要间隔区结构域来将结合剂与膜分开并允许其具有合适的取向。跨膜结构域将蛋白质锚定在细胞膜中。CAR可以包含细胞内T细胞信号传导结构域或胞内域，或与其相关。
可以使用本发明的逆转录病毒或慢病毒载体将编码CAR的核酸转移到细胞，例如T细胞。以这种方式，可以产生大量癌症特异性T细胞用于过继细胞转移。当CAR结合靶抗原时，这导致活化信号传输到其在上面表达的T细胞。因此，CAR将T细胞的特异性和细胞毒性引导至表达靶定抗原的肿瘤细胞。
自杀基因编码能够使表达此类多肽的细胞被删除的多肽，例如通过引发细胞凋亡。自杀基因的实例描述于WO2013/153391中。
宿主细胞
在第二个方面，本发明提供宿主细胞，其在细胞表面表达促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白。
宿主细胞可以用于生产根据本发明的第一个方面的病毒载体。
宿主细胞可以是包装细胞并且包含一个或多个以下基因：gag，pol，env和rev。
用于逆转录病毒载体的包装细胞可以包含gag，pol和env基因。
用于慢病毒载体的包装细胞可以包含gag，pol，env和rev基因。
宿主细胞可以是生产细胞并且包含gag，pol，env和任选的rev基因和逆转录病毒或慢病毒载体基因组。
在用于基因治疗的典型的重组逆转录病毒或慢病毒载体中，gag-pol和env蛋白编码区中一个或多个的至少一部分可以从病毒中除去并由包装细胞提供。这使得病毒载体是复制缺陷的，因为病毒能够将其基因组整合到宿主基因组中，但是由于缺乏结构蛋白，修饰的病毒基因组不能增殖(propagation)自身。
包装细胞用于传播和分离大量病毒载体，即制备对于转导靶细胞适合的滴度的逆转录病毒载体。
在某些情况下，增殖和分离可以需要分离逆转录病毒gagpol和env(和在慢病毒，rev)基因和它们分开引入宿主细胞以产生包装细胞系。包装细胞系产生用于包装逆转录病毒DNA所需的蛋白质，但是由于缺乏psi区域，其不能引起衣壳化。然而，当将携带psi区的重组载体引入包装细胞系中时，辅助蛋白可以包装psi阳性重组载体以产生重组病毒原种(stock)。
“Retroviruses”(1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds：JMCoffin，SM Hughes，HE Varmus pp 449)中呈现了可用的包装系的概述。
还开发了包装细胞，其中gag，pol和env(并且在慢病毒载体的情况下，rev)病毒编码区携带在独立转染到包装细胞系中的分开的表达质粒上，使得三个重组事件是野生型病毒产生所需的。
瞬时转染避免了产生稳定的载体产生细胞系所需的较长的时间，且如果载体或逆转录病毒包装组分对细胞有毒性则使用。通常用于生成逆转录病毒/慢病毒载体的组分包括编码Gag/Pol蛋白的质粒，编码Env蛋白的质粒(和在慢病毒载体的情况下rev蛋白)，和逆转录病毒/慢病毒载体基因组。载体产生涉及将这些组分中的一种或多种瞬时转染到含有其它所需组分的细胞中。
本发明的包装细胞可以是能够产生逆转录病毒/慢病毒载体颗粒的任何哺乳动物细胞类型。包装细胞可以是293T细胞或293T细胞的变体，其已经适应于悬浮生长和在没有血清的情况下生长。
可以通过使用以下项瞬时转染制成包装细胞
a)转移载体
b)gagpol表达载体
c)env表达载体。该env基因可以是异源的，导致假型化逆转录病毒载体。例如，env基因可以来自RD114或其变体之一，VSV-G，长臂猿白血病病毒(GALV)，双嗜性(Amphotropic)包膜或麻疹(Measles)包膜，或狒狒逆转录病毒包膜糖蛋白。
在慢病毒载体的情况下，也进行用rev载体的瞬时转染。
促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白
本发明的病毒载体可以在病毒包膜中包含促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白。促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白来源于逆转录载体产生期间的宿主细胞。促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白由包装细胞制备，并表达在细胞表面。当新生逆转录病毒从宿主细胞膜出芽时，促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白作为包装细胞来源的脂质双层的一部分整合到病毒包膜中。
术语“宿主细胞来源的”是指促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白来源于如上文所述的宿主细胞，而不从病毒基因之一(如gag，其编码主要结构蛋白；或env，其编码包膜蛋白)作为融合物或嵌合物产生。
包膜蛋白由两个亚基形成，将蛋白锚定到脂质膜中的跨膜(TM)和结合细胞受体的表面(SU)。本发明的包装细胞来源的促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白不包含表面包膜亚基(SU)。
促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白可以包含以下序列之一，或其变体。
SEQ ID No.1(OKT3-CD8STK-TM-A)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV
SEQ ID No.2(15E8-CD8STK-TM-A)
METDTLILWVLLLLVPGSTGQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARDKRAPGKLYYGYPDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVPSTFGGGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV
SEQ ID No.3(TGN1412-CD8STK-TM-A)
METDTLILWVLLLLVPGSTGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV
促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白可以包含如SEQ ID No.1、2或3所示的序列的变体，其具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性，条件是该变体序列是具有所需特性的促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，即当存在于逆转录病毒载体的包膜蛋白中时活化T细胞的能力。
序列比对的方法是本领域公知的，并且使用合适的比对程序来实现。％序列同一性是指当两个序列最佳对齐时，两个序列中相同的氨基酸或核苷酸残基的百分比。核苷酸和蛋白质序列同源性或同一性可以使用诸如BLAST程序(国立生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Informat ion)的基本局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool))的标准算法使用默认参数来确定，其可以在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov公开获得。用于确定序列同一性或同源性的其他算法包括：LALIGN(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/和http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/nucleotide.html)，A MAS(多重比对序列分析(Analysis of MultiplyAligned Sequences)，在ht tp://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/Amas/amas.html)，FASTA(http://w ww.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/)，Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/ms a/clustalo/)，SIM(http://web.expasy.org/sim/)和EMBOSS Needle(http://ww w.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)。
促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白可以具有以下结构：
M-S-TM
其中M是促有丝分裂结构域；S是任选的间隔结构域，且TM是跨膜结构域。
促有丝分裂结构域
促有丝分裂结构域是引起T细胞活化的促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白的一部分。它可以直接或间接地与T细胞结合或以其他方式相互作用，导致T细胞活化。特别地，促有丝分裂结构域可以结合T细胞表面抗原，如CD3，CD28，CD134和CD137。
CD3是T细胞共受体。其是由四个不同的链组成的蛋白质复合物。在哺乳动物中，该复合物含有CD3γ链，CD3δ链和两个CD3ε链。这些链与T细胞受体(TCR)和ζ链相关，以在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR，ζ链和CD3分子一起构成TCR复合物。
促有丝分裂结构域可以结合CD3ε链。
CD28是T细胞上表达的一种蛋白质，其提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号。除了T细胞受体(TCR)外，通过CD28的T细胞刺激可以为各种白细胞介素(特别是IL-6)的产生提供强力的信号。
CD134也称为OX40，是TNFR-受体超家族的成员，其与CD28不同，不是在静息的幼稚T细胞上组成型表达的。OX40是次级共刺激分子，活化后24至72小时表达；其配体OX40L也不在静息的抗原呈递细胞上表达，而是在其活化之后。OX40的表达依赖于T细胞的完全活化；没有CD28，OX40的表达被延迟并且降低了四倍。
CD137，也称为4-1BB，是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员。CD137可以由活化的T细胞表达，但在CD8上比在CD4T细胞上程度更大。此外，在树突状细胞，滤泡树突状细胞，自然杀伤细胞，粒细胞和炎症部位的血管壁细胞上发现CD137表达。CD137的最好表征的活性是其对活化的T细胞的共刺激活性。CD137的交联增强T细胞增殖，IL-2分泌存活和细胞溶解活性。
促有丝分裂结构域可以包含特异性结合T细胞表面抗原的抗体或其它分子的全部或一部分。抗体可以活化TCR或CD28。抗体可以结合TCR，CD3或CD28。这些抗体的实例包括：OKT3，15E8和TGN1412。其他合适的抗体包括：
抗CD28：CD28.2，10F3
抗CD3/TCR：UCHT1，YTH12.5，TR66
促有丝分裂结构域可以包含来自OKT3，15E8，TGN1412，CD28.2，10F3，UCHT1，YTH12.5或TR66的结合结构域。
促有丝分裂结构域可以包含共刺激分子例如OX40L和41BBL的全部或一部分。例如，促有丝分裂结构域可以包含来自OX40L或41BBL的结合结构域。
OKT3，也称为Muromonab-CD3是靶向CD3ε链的单克隆抗体。其在临床上用于减少器官移植患者中的急性排斥反应。这是第一个被批准用于人类临床应用的单克隆抗体。OKT3的CDR如下：
CDRH1:GYTFTRY(SEQ ID No.4)
CDRH2:NPSRGY(SEQ ID No.5)
CDRH3:YYDDHYCLDY(SEQ ID No.6)
CDRL1:SASSSVSYMN(SEQ ID No.7)
CDRL2:DTSKLAS(SEQ ID No.8)
CDRL3:QQWSSNPFT(SEQ ID No.9)
15E8是针对人CD28的小鼠单克隆抗体。其CDR如下：
CDRH1:GFSLTSY(SEQ ID No.10)
CDRH2:WAGGS(SEQ ID No.11)
CDRH3:DKRAPGKLYYGYPDY(SEQ ID No.12)
CDRL1:RASESVEYYVTSLMQ(SEQ ID No.13)
CDRL2:AASNVES(SEQ ID No.14)
CDRL3:QQTRKVPST(SEQ ID No.15)
TGN1412(也称为CD28-SuperMAB)是人源化单克隆抗体，其不仅结合CD28受体，也是其强激动剂。其CDR如下：
CDRH1:GYTFSY(SEQ ID No.16)
CDRH2:YPGNVN(SEQ ID No.17)
CDRH3:SHYGLDWNFDV(SEQ ID No.18)
CDRL1:HASQNIYVLN(SEQ ID No.19)
CDRL2:KASNLHT(SEQ ID No.20)
CDRL3:QQGQTYPYT(SEQ ID No.21)
OX40L是CD134的配体，并在DC2s(树突状细胞的亚型)等细胞上表达，使得能够放大(amplification)Th2细胞分化。OX40L也被命名为CD252(分化簇252)。
OX40L序列(SEQ ID No.22)
MERVQPLEENVGNAARPRFERNKLLLVASVIQGLGLLLCFTYICLHFSALQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL
41BBL是属于肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的细胞因子。这种跨膜细胞因子是双向信号转导子，其作为4-1BB的配体(其是T淋巴细胞中的一种共刺激受体分子)起作用。已经显示除了促进T淋巴细胞增殖外，41BBL使无能T淋巴细胞再活化。
41BBL序列(SEQ ID No.23)
MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
间隔区结构域
促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白可以包含间隔区序列以连接抗原结合结构域和跨膜结构域。柔性间隔区允许抗原结合结构域以不同的方向定向以促进结合。
间隔区序列可以例如包含IgG1Fc区、IgG1铰链或人CD8茎部或小鼠CD8茎部。或者，间隔区可以包含备选接头序列，其与IgG1Fc区、IgG1铰链或CD8茎部具有相似的长度和/或结构域间隔特性。可以改变人IgG1间隔区以去除Fc结合基序。
这些间隔区的氨基酸序列的实例如下给出：
SEQ ID No.24(人IgG1的铰链-CH2CH3)
AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD
SEQ ID No.25(人CD8茎部):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDISEQ ID No.26(人IgG1铰链):
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
SEQ ID No.27(CD2胞内域)
KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD
SEQ ID no.28(CD34胞内域)
SLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKT
间隔区序列可以衍生自人蛋白质。间隔区序列可以不衍生自于病毒蛋白质。特别地，间隔区序列可以不是，不衍生自，或不包含逆转录病毒env蛋白的表面包膜亚基(SU)的部分。
跨膜结构域
跨膜结构域是促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白的跨越膜的序列。跨膜结构域可以包含疏水性α螺旋。跨膜结构域可以衍生自CD28，其产生良好的受体稳定性。
跨膜结构域可以衍生自人蛋白质。跨膜结构域可以不衍生自病毒蛋白。特别地，跨膜结构域可以不是，不衍生自，或不包含逆转录病毒env蛋白的跨膜包膜亚基(TM)的部分。
跨膜结构域的备选选项是膜靶向结构域，例如GPI锚。
GPI锚定是发生在内质网中的翻译后修饰。预组装的GPI锚前体转移到携带C末端GPI信号序列的蛋白质。在处理期间，GPI锚取代了GPI信号序列，并通过酰胺键与靶蛋白连接。GPI锚将成熟蛋白质靶向至膜。
标签化蛋白可以包含GPI信号序列。
基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白
本发明的病毒载体可以包含病毒包膜中的基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白。在病毒载体产生期间，基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白衍生自宿主细胞。基于细胞因子的T细胞激活跨膜蛋白由宿主细胞生成并在细胞表面表达。当新生病毒载体从宿主细胞膜出芽时，基于细胞因子的T细胞活化的跨膜蛋白作为包装细胞来源的脂质双层的一部分整合到病毒包膜中。
基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是从病毒基因之一(例如编码主要结构蛋白的gag，或编码包膜蛋白的env)产生的
基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白可以包含细胞因子结构域和跨膜结构域。其可以具有结构C-S-TM，其中C是细胞因子结构域，S是任选的间隔区，TM是跨膜结构域。间隔区和跨膜结构域如上文定义。
细胞因子结构域
细胞因子结构域可以包含T细胞活化细胞因子的一部分或全部，例如来自IL2，IL7和IL15。细胞因子结构域可以包含细胞因子的一部分，只要其保持结合其特定受体并活化T细胞的能力。
IL2由T细胞分泌的因子之一，以调节T细胞和某些B细胞的生长和分化。IL2是诱导反应性T细胞增殖的淋巴因子。其作为单个糖基化多肽分泌，并且其活性需要信号序列的切割。溶液NMR表明IL2的结构包含4个螺旋的束(称为A-D)，其侧翼有2个较短的螺旋和若干较差定义的环。螺旋A中，和螺旋A和B之间的环区域中的残基对于受体结合是重要的。IL2的序列显示为SEQ ID No.29。
SEQ ID No.29
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
IL7是充当B和T细胞谱系两者的早期淋巴样细胞的生长因子的细胞因子。IL7的序列显示为SEQ ID No.30。
SEQ ID No.30
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
IL-15是具有与IL-2结构相似性的细胞因子。和IL-2相似，IL-15结合由IL-2/IL-15受体β链和共有的γ链组成的复合物并通过由IL-2/IL-15受体β链和共有的γ链组成的复合物发出信号。IL-15由单核吞噬细胞和一些其他细胞在病毒感染后分泌。该细胞因子诱导自然杀伤细胞的细胞增殖；自然杀伤细胞是先天免疫系统的细胞，其主要作用是杀死病毒感染的细胞。IL-15的序列显示为SEQ ID No.31。
SEQ ID No.31
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白可以包含以下序列之一或其变体：
SEQ ID No.32(膜-IL7)
MAHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHSGGGSPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV
SEQ ID No.33(膜-IL15)
MGLVRRGARAGPRMPRGWTALCLLSLLPSGFMAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV
基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白可以包含SEQ ID No.32或33所示序列的变体，其具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性，条件是变体序列是具有所需特性的基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，即当存在于逆转录病毒或慢病毒载体的包膜蛋白中时活化T细胞的能力。
标签化蛋白
病毒载体的病毒包膜还可以包含标签化蛋白，其包含结合捕获基序的结合结构域和跨膜结构域。
标签化蛋白可以包含：
结合捕获基序的结合结构域；
间隔区；和
跨膜结构域。
通过标签化蛋白与捕获基序的结合，标签化蛋白促进病毒载体从细胞上清液的纯化。
“结合结构域”是指能够识别并特异性结合目标实体，例如捕获基序的实体，例如表位。
结合结构域可以包含一个或多个表位，其能够特异性结合捕获基序。例如，结合结构域可以包含至少两个、三个、四个或五个能够特异性结合捕获基序的表位。在结合结构域包含多于一个表位的情况下，每个表位可以通过接头序列分离，如本文所述。
结合结构域可以在添加与结合结构域相比对捕获部分具有更高的结合亲和力的实体时从捕获部分可释放。
链霉亲合素结合表位
结合结构域可以包含一个或多个链霉亲合素结合表位。例如，结合结构域可以包含至少一个，二个，三个，四个或五个链霉亲合素结合表位。
链霉抗生物素蛋白是从细菌阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)纯化的52.8kDa的蛋白质。链霉亲合素同四聚体具有对生物素(维生素B7或维生素H)非常高的亲和力，解离常数(Kd)是约10-15M。链霉亲合素是本领域熟知的，且由于链霉亲合素-生物素复合物对有机溶剂，变性剂，蛋白水解酶以及温度和pH的极值的耐受性而广泛用于分子生物学和生物纳米技术。强链霉亲合素-生物素键可用于将各种生物分子彼此连接或连接到固体支持物上。需要苛刻的条件来破坏链霉亲合素-生物素相互作用，然而，可以使纯化的蛋白质变性。
结合结构域可以是例如生物素模拟物。“生物素模拟物”可以指特异性结合链霉亲合素的短肽序列(例如6至20，6至18，8至18或8至15个氨基酸)。
如上文所述，生物素/链亲和素相互作用的亲和力非常高。因此，本发明的优点是结合结构域可以包含与生物素本身相比对链霉亲合素具有较低亲和力的生物素模拟物。
特别地，生物素模拟物可以以比生物素更低的结合亲和力结合链霉亲合素，使得生物素可用于洗脱链霉亲合素捕获的逆转录病毒载体。例如，生物素模拟物可以以1nM至100uM的Kd结合链霉亲合素。
生物素模拟物可以包含如表1中所示的序列。
表1.生物素模拟肽
生物素模拟物可以选自下组：StreptagII，Flankedccstreptag和ccstrepta。
结合结构域可以包含多于一个生物素模拟物。例如，结合结构域可以包含至少一个、两个、三个、四个或五个生物素模拟物。
在结合结构域包含多于一个生物素模拟物的情况下，每个模拟物可以是相同或不同的模拟物。例如，结合结构域可以包含由接头分开的两个StreptagII生物素模拟物(例如如SEQ ID NO:43所示)或由接头分开的两个Flankedccstreptag(例如如SEQ ID NO:44所示)。
SEQ ID NO:43(StreptagII-d8-x2)
WSHPQFEKSGGGGSPAPRPPTPAPTIASWSHPQFEK
SEQ ID NO:44(Flankedccstreptag-d8-x2)
ECHPQGPPCIEGRKSSGGGGSPAPRPPTPAPTIASECHPQGPPCIEGRKS
谷胱甘肽-S-转移酶
结合结构域可以包含谷胱甘肽S-转移酶(GST)结构域。
GST包括真核和原核II期代谢同功酶家族，其催化还原形式的谷胱甘肽(GSH)与异生物质底物的缀合以用于解毒。GST家族由三个超家族组成：细胞溶质，线粒体和微粒体(也称为MAPEG)蛋白(Udomsinpraser et al.Biochem.J.(2005)388(Pt 3):763–71)。
GST蛋白对GSH具有强的结合亲和力，这种相互作用通常用于分子生物学，以使得能够从蛋白质混合物中分离加GST标签的蛋白质。
GST的氨基酸序列如SEQ ID NO：45所示。
SEQ ID NO:45(GST)
MGTSLLCWMALCLLGADHADAMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLG
利妥昔单抗结合表位
此标签化蛋白可以包含结合结构域，其包含利妥昔单抗结合表位(R表位)和/或Qbend10表位(Q表位)。
利妥昔单抗结合表位是指特异性结合利妥昔单抗的表位。例如，利妥昔单抗结合表位可以基于CD20B细胞抗原。
来自CD20的利妥昔单抗结合表位序列是CEPANPSEKNSPSTQYC(SEQ ID No.46)
Perosa等人(2007，J.Immunol 179:7967-7974)描述了一系列半胱氨酸约束性的7聚体环肽，其具有由抗CD20mAb利妥昔单抗识别的抗原基序，但具有不同的围绕基序的氨基酸。共描述了11种肽，如下表所示：
肽 插入序列
R15-C acPYANPSLc(SEQ ID No.47)
R3-C acPYSNPSLc(SEQ ID No.48)
R7-C acPFANPSTc(SEQ ID No.49)
R8-,R12-,R18-C acNFSNPSLc(SEQ ID No.50)
R14-C acPFSNPSMc(SEQ ID No.51)
R16-C acSWANPSQc(SEQ ID No.52)
R17-C acMFSNPSLc(SEQ ID No.53)
R19-C acPFANPSMc(SEQ ID No.54)
R2-C acWASNPSLc(SEQ ID No.55)
R10-C acEHSNPSLc(SEQ ID No.56)
R13-C acWAANPSMc(SEQ ID No.57)
Li等人(2006 Cell Immunol 239:136-43)也描述了利妥昔单抗的模拟表位，包括以下序列：
QDKLTQWPKWLE(SEQ ID No.58)。
本发明的多肽包含具有选自SEQ ID No.46-58的氨基酸序列的利妥昔单抗结合表位或其保留了利妥昔单抗结合活性的变体。
QBend10
CliniMACS CD34选择系统利用QBEnd10单克隆抗体以实现细胞选择。本发明人先前已经从CD34抗原中定位了QBEnd10结合表位(参见WO 2013/153391)并确定了其具有如SEQ ID No.59所示的氨基酸序列。
ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID No.59)。
本发明的标签化蛋白的结合结构域可以包含具有如SEQ ID No.59所示的氨基酸序列的QBEnd10结合表位或其保留QBEnd10结合活性的变体。
RQR8
标签化蛋白可以包含包括如SEQ ID NO:60所示的136氨基酸序列或由其组成的结合结构域。
SEQ ID NO:60(RQR8)
CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV
核酸
本发明还涉及编码基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白的核酸或编码促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白的核酸。所述核酸可以是包含编码促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白的多个序列的构建体的形式。
如本文所用，术语“多核苷酸”，“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。
本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行核苷酸取代，其不影响由本文所述的多核苷酸编码的多肽序列，以反映多肽在其中表达的任何特定宿主生物的密码子选择。
核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链。它们也可以是在其中包括合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯骨架，在分子的3'和/或5'端加入吖啶或聚赖氨酸链。为了本文所述的用途的目的，应当理解可以通过本领域可用的任何方法修饰多核苷酸。可以进行这些修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。
关于核苷酸序列的术语“变体”，“同源物”或“衍生物”包括从序列或对序列中一个(或多个)核酸的任何取代，变异，修饰，替换，缺失或添加。
核酸可以产生包含多肽，其包含编码促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白的一个或多个序列和/或编码基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白的一个或多个序列。切割位点可以是自切割的，使得当多肽产生时，其立即被切割成受体组分和信号传导成分，而不需要任何外部切割活性。
多种自切割位点是已知的，包括口蹄疫病毒(FMDV)2a自切割肽和各种变体和2A样肽。所述肽可以具有SEQ ID No.34或35所示的序列。
SEQ ID No.34
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP.
SEQ ID No 35
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
共表达序列可以是内部核糖体进入序列(IRES)。共表达序列可以是内部启动子。
载体
本发明还提供载体或载体试剂盒，其包含编码促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白的一个或多个序列和/或编码基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白的一个或多个序列。可以使用此类载体将核酸序列引入宿主细胞中，例如生产或包装细胞。
载体可以是例如质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mRNA。
载体可以能够转染或转导宿主细胞。
方法
本发明还提供了制备活化的转基因T细胞或自然杀伤(NK)细胞的方法，其包括用根据本发明的逆转录病毒或慢病毒载体转导T细胞或NK细胞的步骤，使得T细胞或NK细胞被一种或多种促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和任选的一种或多种基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白活化。
用于转导和活化T细胞或NK细胞的方法可以需要48小时或更短，例如24小时至48小时。
现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明，而并不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-产生在病毒粒子表面上展示OKT3的病毒载体
进行了初步的概念验证实验，其中证明了包装细胞上的OKT3 scFv的表达导致产生病毒载体，其引起T细胞靶标的促有丝分裂活化。
OKT3 scFv 293T细胞产生引起靶T细胞活化和转导的慢病毒载体。这种促有丝分裂特性依赖于慢病毒辅助组分的存在，即该效果不是由于包装细胞上清液的非特异性特性(图2)。
还比较了通过CD8茎部或通过IgG1铰链附接到膜的OKT3 scFv整合到慢病毒中并引起促有丝分裂刺激物的能力，其中两种间隔区之间没有注意到差异。
用慢病毒gagpol，RD-PRO env，转移载体或全部三种质粒以及慢病毒rev表达质粒转染稳定表达表面结合的OKT3的293T细胞。将随后的上清液应用于原代人T细胞。随后通过流式细胞术研究T细胞，使用以下参数：CD25以测量T细胞活化；抗Fc以检测转基因(具有Fc间隔区的CAR)；ki67以确定周期中的细胞(图3)。只有提供gagpol的条件导致显著的促有丝分裂刺激。
只有提供所有质粒(连同rev)的条件导致T细胞的促有丝分裂刺激和转导。
还进行了进一步的实验以确定不同的慢病毒假型化是否支持促有丝分裂作用。用慢病毒转移载体，慢病毒gagpol，rev和不同的env质粒：即VSV-G，RD-PRO，Ampho，GALV和麻疹M/H转染稳定表达膜结合的OKT3的293T细胞。随后的上清液应用于原代人T细胞。细胞随后用ki67染色并通过流式细胞术研究。所有的假型支持促有丝分裂效果，尽管使用麻疹假型化，效果似乎减少(图4)。
实施例2-可以将两种单独的促有丝分裂刺激物整合到病毒载体中
生成包含来自抗体15E8的抗CD28活化scFv的另外的构建体。OKT3 scFv盒(上文所述)表达eGFP，而15E8 scFv盒表达蓝色荧光蛋白eBFP2。
生成了共表达高水平的eGFP和eBFP2的293T细胞，证明了在293T细胞表面上OKT3和15E8两者的成功表达。
从野生型293T细胞，仅表达OKT3 scFv的293T细胞和表达OKT3和15E8两者的293T细胞生成了慢病毒上清液。使用两种刺激的活化水平和转导效率更高(图6)。
实施例3-证明γ逆转录病毒载体中的功能性
用编码CAR的γ-逆转录病毒转移载体，γ-逆转录病毒gagpol表达质粒和RD114表达质粒转染稳定表达膜结合的OKT3的293T细胞。将随后的上清液应用于原代人T细胞。T细胞使用抗-Fc，抗CD25和ki67染色，并通过流式细胞术研究。虽然没有应用促有丝分裂刺激物，T细胞被活化，循环(cycling)并表达转基因(图5)。
实施例4-整合到慢病毒载体中的肽的组合
将元件的不同组合整合到包装细胞系中。这包括TGN1412 scFv，其是超激动性抗CD28 mAb。细胞因子IL7和IL15以及OX40L和41BBL也以不同的组合整合，如下：
1.(无)
2.OKT3
3.OKT3+15E8
4.OKT3+TGN1412
5.OKT3+15E8+OX40L+41BBL
6.OKT3+15E8+OX40L+41BBL+mIL15
7.OKT3+15E8+OX40L+41BBL+mIL7
使用从这些不同的293T细胞产生的慢病毒载体刺激/转导T细胞。
使用非工程化的293T细胞生成的载体连同促有丝分裂可溶性抗体OKT3和CD28.2+/-IL2作为对照。测量在第5天的活化(CD25)，增殖分数(Ki67)和绝对计数(图7-10)。
再次注意到整合两个信号而不是一个的明显的优势。还注意到，使用在病毒粒子表面上展示的促有丝分裂肽的活化明显优于通过向T细胞添加可溶性抗体而实现的活化。
还实现了与使用细胞因子的mAb活化的增殖水平相似的增殖水平。
方法
将促有丝分裂抗体的VH和VL作为scFv克隆并连接到间隔区结构域，TM结构域和极性锚(上文SEQ ID No 1-3)
将细胞因子以符合框架的方式连接到间隔区，TM结构域和极性锚(上文SEQ ID No32和33)。
对于天然共刺激分子如41BBL和OX40L，这些以其天然形式克隆。
然后，可以在293T细胞上以高水平稳定地表达每种上述类型的膜结合蛋白质。
使用标准瞬时转染从这些293T细胞制备病毒载体。对于慢病毒载体，共转染转移载体，rev表达载体，lenti gagpol表达载体和RD-PRO表达载体。对于γ逆转录病毒载体，使用转移载体，MoMLV gagpol和RD114表达质粒共转染293T细胞。通过离心澄清上清液并用0.45uM滤器过滤。将该病毒应用于纤维连接蛋白(retronectin)平板上的的原代人T细胞。在一些条件下添加IL2，或在其他条件下不添加细胞因子。
实施例5-比较来自使用慢病毒载体刺激的细胞相对于使用抗CD3/抗CD28抗体包被的珠刺激的细胞的T细胞亚组表型
使用标准技术从外周血中分离单核细胞。然后用以下之任一处理外周血单核细胞(PBMC)：
(i)在非修饰的慢病毒载体和IL15/IL7的存在下，以3:1比例的抗CD3/抗CD28抗体包被的珠( HUMAN T-Activator CD3/CD28)；或者
(ii)在IL15和IL7的存在下，在纤维连接蛋白包被的板上的表达OKT3和15E8B的慢病毒载体(如实施例4中所述的组合物3)。
48小时后，收获细胞并用一组T细胞表型分型抗体染色，如下：
■aCD4-BV650
■aCD8-PE.Cy7
■aCD45RO-BV605
■aCD45RA-FITC
■aCD95-PB
■aCD197-BV685
通过FACS分析T细胞亚组，并且结果总结在图11中。对于CD4+和CD8+T细胞亚组两者，使用病毒刺激的细胞比用抗体包被的珠刺激的细胞显示更大比例的幼稚T细胞(Tn和Tscm)。
上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应过度限于这些具体实施方案。实际上，对于分子生物学，细胞免疫学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改意图在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> UCL商务股份有限公司
<120> 载体
<130> P105663PCT
<150> GB 1503500.9
<151> 2015-03-02
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白
(OKT3-CD8STK-TM-A)
<400> 1
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala
20 25 30
Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
35 40 45
Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met
165 170 175
Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu
195 200 205
Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser
210 215 220
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
245 250 255
Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ser Asp Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
325 330 335
Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
340 345 350
<210> 2
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白
(15E8-CD8STK-TM-A)
<400> 2
Met Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Leu Leu Leu Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
20 25 30
Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser
35 40 45
Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser
85 90 95
Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Lys Arg Ala Pro Gly Lys Leu Tyr Tyr Gly
115 120 125
Tyr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
145 150 155 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg
165 170 175
Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr
180 185 190
Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
195 200 205
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Val
225 230 235 240
Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Arg Lys Val
245 250 255
Pro Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp
260 265 270
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
290 295 300
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
305 310 315 320
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
325 330 335
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys
340 345 350
Cys Pro Arg Pro Val Val
355
<210> 3
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白
(TGN1412-CD8STK-TM-A)
<400> 3
Met Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Leu Leu Leu Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
35 40 45
Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Glu Lys Phe Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
165 170 175
Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn Trp Tyr Gln
180 185 190
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn
195 200 205
Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
210 215 220
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
325 330 335
His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
340 345 350
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 CDRH1
<400> 4
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 CDRH2
<400> 5
Asn Pro Ser Arg Gly Tyr
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 6
Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
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<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 CDRL1
<400> 7
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 CDRL2
<400> 8
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1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OKT3 CDRL3
<400> 9
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 10
Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15E8 CDRH2
<400> 11
Trp Ala Gly Gly Ser
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15E8 CDRH3
<400> 12
Asp Lys Arg Ala Pro Gly Lys Leu Tyr Tyr Gly Tyr Pro Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15E8 CDRL1
<400> 13
Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln
1 5 10 15
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15E8 CDRL2
<400> 14
Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 15E8 CDRL3
<400> 15
Gln Gln Thr Arg Lys Val Pro Ser Thr
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGN1412 CDRH1
<400> 16
Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr
1 5
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGN1412 CDRH2
<400> 17
Tyr Pro Gly Asn Val Asn
1 5
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGN1412 CDRH3
<400> 18
Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGN1412 CDRL1
<400> 19
His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Leu Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGN1412 CDRL2
<400> 20
Lys Ala Ser Asn Leu His Thr
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TGN1412 CDRL3
<400> 21
Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 22
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40L序列
<400> 22
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Tyr Leu Ile Ser Leu Lys
85 90 95
Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp
100 105 110
Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu
115 120 125
Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr
130 135 140
Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu
145 150 155 160
Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
165 170
<210> 23
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 41BBL序列
<400> 23
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 24
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区序列, 人IgG1的铰链-CH2CH3
<400> 24
Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp
225 230
<210> 25
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区序列, 人CD8茎部
<400> 25
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
35 40 45
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区序列, 人IgG1铰链
<400> 26
Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys
20
<210> 27
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区序列, CD2胞外域
<400> 27
Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp
1 5 10 15
Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp
20 25 30
Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg
35 40 45
Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys
50 55 60
Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys
85 90 95
Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser
100 105 110
Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr
115 120 125
Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser
130 135 140
Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe
145 150 155 160
Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro
165 170 175
Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu Asp
180 185
<210> 28
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区序列, CD34胞外域
<400> 28
Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro Thr Gln Gly
1 5 10 15
Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu Thr Thr Thr
20 25 30
Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser Gln His Gly
35 40 45
Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys Phe Thr Ser
50 55 60
Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln
65 70 75 80
Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro Ala Asn Val
85 90 95
Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro Gly Asn Val
100 105 110
Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser Pro Thr Lys
115 120 125
Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys Ala Glu Ile
130 135 140
Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly Ile Cys Leu
145 150 155 160
Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys Asp Arg Gly
165 170 175
Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala Asp Ala Asp
180 185 190
Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser Glu Val Arg
195 200 205
Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu Ile Ser Ser
210 215 220
Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly
225 230 235 240
Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln Ser Tyr Ser
245 250 255
Gln Lys Thr
<210> 29
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL2序列
<400> 29
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 30
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL7序列
<400> 30
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His
<210> 31
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15序列
<400> 31
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 32
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白序列
<400> 32
Met Ala His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His Ser Gly Gly Gly Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
180 185 190
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
195 200 205
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
210 215 220
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
225 230 235 240
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
245 250 255
His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
260 265 270
<210> 33
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白序列
<400> 33
Met Gly Leu Val Arg Arg Gly Ala Arg Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg
1 5 10 15
Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Gly Phe Met
20 25 30
Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro
35 40 45
Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile
50 55 60
Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu
65 70 75 80
Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu
85 90 95
Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His
100 105 110
Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser
115 120 125
Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu
130 135 140
Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln
145 150 155 160
Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala
165 170 175
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
180 185 190
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
195 200 205
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
210 215 220
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
225 230 235 240
Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
245 250 255
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自切割位点
<400> 34
Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自切割位点
<400> 35
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物素模拟物, streptagII
<400> 36
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物素模拟物, flankedccstreptag
<400> 37
Ala Glu Cys His Pro Gln Gly Pro Pro Cys Ile Glu Gly Arg Lys
1 5 10 15
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物素模拟物, ccstreptag
<400> 38
Cys His Pro Gln Gly Pro Pro Cys
1 5
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物素模拟物, 长nanotag
<400> 39
Asp Val Glu Ala Trp Leu Asp Glu Arg Val Pro Leu Val Glu Thr
1 5 10 15
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物素模拟物, 短nanotag
<400> 40
Asp Val Glu Ala Trp Leu Gly Ala Arg
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物素模拟物, Streptag
<400> 41
Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 42
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 生物素模拟物, SBP-tag
<400> 42
Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Arg Glu Pro
35
<210> 43
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合结构域, StreptagII-d8-x2
<400> 43
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala
1 5 10 15
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Trp Ser His Pro
20 25 30
Gln Phe Glu Lys
35
<210> 44
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合结构域, Flankedccstreptag-d8-x2
<400> 44
Glu Cys His Pro Gln Gly Pro Pro Cys Ile Glu Gly Arg Lys Ser Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
20 25 30
Ile Ala Ser Glu Cys His Pro Gln Gly Pro Pro Cys Ile Glu Gly Arg
35 40 45
Lys Ser
50
<210> 45
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 谷胱甘肽S-转移酶(GST)结构域
<400> 45
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Ala Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys
20 25 30
Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys
35 40 45
Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn
50 55 60
Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile
65 70 75 80
Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile
85 90 95
Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu
100 105 110
Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser
115 120 125
Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu
130 135 140
Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His
145 150 155 160
Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu
165 170 175
Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp
180 185 190
Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro
195 200 205
Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu
210 215 220
Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser
225 230 235 240
Asp Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Leu Gly
245 250
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自CD20的利妥昔单抗结合表位序列
<400> 46
Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr
1 5 10 15
Cys
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸限制的7聚体环肽, R15-C
<400> 47
Ala Cys Pro Tyr Ala Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸限制的7聚体环肽, R3-C
<400> 48
Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸限制的7聚体环肽, R7-C
<400> 49
Ala Cys Pro Phe Ala Asn Pro Ser Thr Cys
1 5 10
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸限制的7聚体环肽, R8-, R12-, R18-C
<400> 50
Ala Cys Asn Phe Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸限制的7聚体环肽, R14-C
<400> 51
Ala Cys Pro Phe Ser Asn Pro Ser Met Cys
1 5 10
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸限制的7聚体环肽, R16-C
<400> 52
Ala Cys Ser Trp Ala Asn Pro Ser Gln Cys
1 5 10
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸限制的7聚体环肽, R17-C
<400> 53
Ala Cys Met Phe Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸限制的7聚体环肽, R19-C
<400> 54
Ala Cys Pro Phe Ala Asn Pro Ser Met Cys
1 5 10
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸限制的7聚体环肽, R2-C
<400> 55
Ala Cys Trp Ala Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸限制的7聚体环肽, R10-C
<400> 56
Ala Cys Glu His Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸限制的7聚体环肽, R13-C
<400> 57
Ala Cys Trp Ala Ala Asn Pro Ser Met Cys
1 5 10
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单抗的模拟表位
<400> 58
Gln Asp Lys Leu Thr Gln Trp Pro Lys Trp Leu Glu
1 5 10
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> QBEnd10-来自CD34抗原内的结合表位
<400> 59
Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser
1 5 10 15
<210> 60
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合结构域RQR8
<400> 60
Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro
20 25 30
Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
50 55 60
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
65 70 75 80
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
85 90 95
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
100 105 110
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val
115 120 125
Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
130 135

Claims (26)

1.具有病毒包膜的逆转录病毒或慢病毒载体，所述病毒包膜包含：
(i)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其包含促有丝分裂结构域和跨膜结构域；和/或
(ii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域
其中所述促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白不是病毒包膜糖蛋白的一部分。
2.根据权利要求1的病毒载体，其包含结合CD3、CD28、CD134或CD137的促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白。
3.根据权利要求2的病毒载体，其中所述促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白包含来自OKT3、15E8、TGN1412、OX40L或41BBL的结合结构域。
4.根据权利要求1的病毒载体，其在所述病毒包膜中包含两个或更多个促有丝分裂T细胞活化跨膜结构域。
5.根据权利要求4的病毒载体，其包含结合CD3的第一促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和结合CD28的第二促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白。
6.根据前述权利要求任一项的病毒载体，其包含基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，所述基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白包含选自IL2、IL7和IL15的细胞因子。
7.根据前述权利要求中任一项的病毒载体，其包含产生假性化病毒载体的异源病毒包膜糖蛋白。
8.根据权利要求7的病毒载体，其中所述包膜糖蛋白来自RD114或其变体之一，VSV-G，长臂猿白血病病毒(GALV)，或是双嗜性(Amphotropic)包膜糖蛋白、麻疹(Measles)包膜糖蛋白，或狒狒逆转录病毒包膜糖蛋白。
9.根据前述权利要求中任一项的病毒载体，其中所述病毒包膜还包含：
(iii)标签化蛋白，所述标签化蛋白包含：
结合捕获部分的结合结构域；和
跨膜结构域
通过所述标签化蛋白对所述捕获部分的结合，所述标签化蛋白促进所述病毒载体从细胞上清液的纯化。
10.根据权利要求9的病毒载体，其中所述标签化蛋白的所述结合结构域包含一个或多个链霉亲合素结合表位。
11.根据权利要求10的病毒载体，其中所述链霉亲合素结合表位是生物素模拟物。
12.根据权利要求11的病毒载体，其中所述生物素模拟物以比生物素低的亲和力结合链霉亲合素，使得生物素可以用于洗脱由包装细胞产生的链霉素捕获的逆转录病毒载体。
13.根据权利要求12的病毒载体，其中所述生物素模拟物选自下组：StreptagII(SEQID NO:36)、Flankedccstretag(SEQ ID NO:37)和ccstreptag(SEQ ID NO:38)。
14.根据前述权利要求中任一项的病毒载体，其包含编码T细胞受体或嵌合抗原受体的核酸序列。
15.根据前述权利要求中任一项的病毒载体，其是病毒样颗粒(VLP)。
16.宿主细胞，其在细胞表面表达：
(i)促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白，其包含促有丝分裂结构域和跨膜结构域；和/或
(ii)基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白，其包含细胞因子结构域和跨膜结构域
使得由所述宿主细胞产生的逆转录病毒或慢病毒载体如权利要求1至8任一项中所定义的。
17.根据权利要求16的宿主细胞，其在细胞表面还表达：
(iii)标签化蛋白，其包含：
结合捕获部分的结合结构域；和
跨膜结构域
通过所述标签化蛋白对所述捕获部分的结合，所述标签化蛋白促进所述病毒载体从细胞上清液的纯化，使得由包装蛋白产生的逆转录病毒或慢病毒载体是如权利要求9至14中任一项中所定义的。
18.包装细胞，其是如权利要求16或17中定义的宿主细胞，所述包装细胞还包含一种或多种以下基因：gag、pol、env和/或rev。
19.生产细胞，其是如权利要求16或17中定义的宿主细胞，其包含gag、pol、env和任选的rev基因，且还包含逆转录病毒或慢病毒基因组。
20.制造根据权利要求16或17的宿主细胞，根据权利要求18的包装细胞或根据权利要求19的生产细胞的方法，其包括使用编码促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白的核酸转导或转染细胞的步骤。
21.产生根据权利要求1至15中任一项的病毒载体的方法，其包括在根据权利要求17至19中任一项的细胞中表达逆转录病毒或慢病毒基因组的步骤。
22.制造活化的转基因T细胞或自然杀伤(NK)细胞的方法，其包括使用根据权利要求1至15中任一项的病毒载体转导T或NK细胞的步骤，使得所述T细胞或NK细胞被一种或多种促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或一种或多种基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白活化。
23.用于制造如权利要求1至15任一项中定义的逆转录病毒或慢病毒载体的试剂盒，其包含：
(i)如权利要求16或17中定义的宿主细胞；
(ii)包含gag、pol、env和任选的rev的核酸；和
(iii)逆转录病毒基因组。
24.用于制造如权利要求1至15任一项中定义的逆转录病毒或慢病毒载体的试剂盒，其包含：
(i)如权利要求18中定义的包装细胞；和
(ii)逆转录病毒或慢病毒载体基因组。
25.用于制造根据权利要求18的包装细胞的试剂盒，其包含：
(i)编码促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白的一种或多种核酸；和
(ii)包含逆转录病毒gag、pol、env和任选的rev基因的核酸。
26.用于制造根据权利要求19的生产细胞的试剂盒，其包含：
(i)编码促有丝分裂T细胞活化跨膜蛋白和/或基于细胞因子的T细胞活化跨膜蛋白的一种或多种核酸；
(ii)包含逆转录病毒gag、pol、和env以及任选的rev基因的核酸；和
(iii)逆转录病毒或慢病毒载体基因组。
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