ES2877398T3

ES2877398T3 - Vectores retrovíricos y lentivíricos

Info

Publication number: ES2877398T3
Application number: ES16709502T
Authority: ES
Inventors: Martin Pule; Leila Mekkaoui
Original assignee: Autolus Ltd
Current assignee: Autolus Ltd
Priority date: 2015-03-02
Filing date: 2016-03-01
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2036-03-01
Also published as: US11814641B2; EP3265570A1; WO2016139463A1; AU2016227474A1; US10954530B2; RU2017133854A; RU2017133854A3; US20210348191A1; EP3265570B1; JP2023060000A; JP2020092722A; IL253820B; KR20180002602A; EP3904523A1; JP2018506983A; GB201503500D0; US20180066280A1; CN107406860A; SG11201706721PA; IL253820A0

Abstract

Un vector retrovírico o lentivírico que tiene una envuelta vírica que comprende: (i) una primera proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que comprende un dominio mitogénico que se une a CD3 y un dominio transmembrana; y (ii) una segunda proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que comprende un dominio mitogénico que se une a CD28 y un dominio transmembrana en donde las proteínas transmembrana activadoras de células T mitogénicas no forman parte de una glucoproteína de la envuelta vírica.

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores retrovíricos y lentivíricos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a vectores retrovíricos y lentivíricos y a células para su producción. Los vectores pueden usarse para transducir células, tales como células T. En particular, la invención se refiere a vectores retrovíricos o lentivíricos capaces tanto de transducir como de activar una célula, tal como una célula T.

Antecedentes de la invención

La generación de productos de células T modificadas generalmente requiere estimulación con un mitógeno seguido de transducción con un vector de integración, tal como un vector lentivírico o un vector retrovírico.

Un enfoque ampliamente usado es añadir anticuerpos monoclonales (mAb) mitogénicos solubles, tales como anti-TCR/CD3 y anti-CD28, al cultivo celular. Un enfoque alternativo es unir mAb anti-TCR/CD3 junto con mAb anti-CD28 a una perla. La superficie de la perla tiene propiedades de activación de células T mejoradas en comparación con los anticuerpos solubles solos.

Además, comúnmente se añaden citocinas (por ejemplo, IL2, IL15 o IL7) al cultivo celular.

Estos anticuerpos mitógenos y citocinas son consumibles de un solo uso y generalmente representan la parte más costosa del proceso de producción de células T.

Maurice et al. describen la modificación por ingeniería genética directa de una proteína de envuelta lentivírica de tal manera que el agonista de CD3 OKT3 se muestra en la superficie del virión (Maurice et al.; Blood; 2002; 99; 2342 2350). Verhoeyen et al. describen un enfoque similar en el cual la proteína de la envuelta lentivírica está modificada por ingeniería genética para incorporar IL7 (Verhoeyen et al.; Blood; 2003; 101; 2167-2174).

Cada uno de estos enfoques de ingeniería genética requiere una compleja ingeniería de la proteína de la envuelta vírica. Esta compleja ingeniería genética debe realizarse para que cada péptido discreto se muestre en la superficie del virión. También se ha demostrado que el enfoque reduce el título vírico.

Existe por lo tanto una necesidad de nuevos enfoques para generar productos de células T modificados por ingeniería genética que no estén asociados a las desventajas descritas anteriormente.

Descripción de las figuras

Figura 1 - Diagrama de un vector retroSTIM rodeado por una bicapa lipídica que está tachonada con la glucoproteína de la envuelta RD114 y diversos elementos mitogénicos tales como scFv o citocinas unidas a la membrana.

Figura 2 - Demostración de que puede incorporarse un scFv OKT3 en un lentivirus. Los resultados muestran la activación de células T (a) no estimuladas - transducidas con vector lentivírico de células 293T; (b) estimulado con OKT3, CD28.2 e IL2 - transducidos con vector lentivírico de células 293T; (c) no estimulado - transducido con sobrenadante de 293T.OKT3, transfectado solo con el vector de transferencia; (d) no estimulado - transducido con vector lentivírico de 293T.OKT3. El panel superior muestra diagramas de dispersión de transducción (eje x) y activación por expresión de CD25 (eje y). El panel inferior muestra fotomicrografías de cultivos de células T. El agrupamiento indicó activación.

Figura 3 - Demostración de que la estimulación mitogénica y la transducción de células T depende de gagpol. Las células 293T que expresan de forma estable OKT3 unido a la superficie se transfectaron con gagpol, RD-PRO env, el vector de transferencia o los tres plásmidos junto con rev. El sobrenadante posterior se aplicó a células T humanas primarias. Las células T se estudiaron mediante citometría de flujo con los siguientes parámetros: CD25 para medir la activación de células T; anti-Fc para detectar un transgén que era un CAR con un espaciador Fc; ki67 para determinar las células en ciclo. Solo las condiciones en donde se suministró gagpol dieron como resultado una estimulación mitogénica significativa. Solo la condición en donde se suministraron todos los plásmidos (junto con rev) dio como resultado la estimulación mitogénica de las células T y la transducción.

Figura 4 - Demostración de que diferentes pseudotipados lentivíricos apoyan el efecto mitogénico. Las células 293T que expresan de manera estable el OKT3 unido a la membrana se transfectaron con un vector de transferencia lentivírico, gagpol lentivírico, rev y diferentes plásmidos env: a saber, VSV-G, RD-PRO, Ampho, GALV y Sarampión M/H. El sobrenadante posterior se aplicó a células T humanas primarias. Las células se tiñeron con ki67 y se estudiaron mediante citometría de flujo. Todos los pseudotipos apoyaron el efecto mitogénico, aunque el efecto pareció reducirse con la pseudotipificación del Sarampión.

Figura 5 - Demostración de que la estimulación mitogénica y la transducción de células T se logra con un vector gamma-retrovírico. Las células 293T que expresan de forma estable OKT3 unido a la membrana se transfectaron con un vector de transferencia gamma-retrovírico que codifica un CAR, plásmido de expresión gamma-retrovírico gagpol y un plásmido de expresión RD114. El sobrenadante posterior se aplicó a células T humanas primarias. Posteriormente, las células T se tiñeron con anti-Fc, anti-CD25 y ki67 y se estudiaron por citometría de flujo. Aunque no se aplicó ningún estímulo mitogénico, se activaron las células T, estaban en ciclo y estaban expresando transgén.

Figura 6 - Demostración de que pueden incorporarse dos estímulos mitogénicos diferentes en el vector vírico y que un estímulo anti-CD3/TCR junto con un estímulo anti-CD28 tiene un efecto mejorado en comparación con anti-CD3/TCR solo.

Figura 7 - Microscopía de baja resolución de células T estimuladas con diferentes vectores lentivíricos generados a partir de células 293t que expresan diferentes elementos en su superficie celular.

Figura 8 - Activación de células T CD4 y CD8 después de la transducción con vectores lentiSTIM que muestran diferentes combinaciones de péptidos mitogénicos y de citocinas. La activación se determina mediante la expresión de CD25 120 horas después de la transducción.

Figura 9 - Proliferación de células T CD4 y CD8 después de la transducción con vectores lentiSTIM que muestran diferentes combinaciones de péptidos mitogénicos y de citocinas. La proliferación se determina mediante la expresión de Ki67 120 horas después de la transducción.

Figura 10 - Expansión de células T después de la transducción con vectores lentiSTIM que muestran diferentes combinaciones de péptidos mitogénicos y de citocinas. La expansión se determina mediante el recuento absoluto de células 120 horas después de la transducción.

Figura 11 - Examinación del fenotipo del subconjunto de células T de PBMC activadas con vectores lentiSTIM que expresan anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, o perlas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. NM-LV = lentivirus no modificado; STIM-LV = vector lentiSTIM; Tem = células T de memoria efectoras; Tcm = células T de memoria central; Tscm = células T de memoria madre; y Tn = células T vírgenes.

Sumario de aspectos de la invención

La presente divulgación se basa en el descubrimiento de que es posible incorporar un estímulo mitogénico y/o un estímulo de citocina, en una cápside retrovírica o lentivírica, de tal manera que el virus active y transduzca las células T. Esto elimina la necesidad de añadir vector, mitógeno y citocinas. La invención implica la inclusión de dos proteínas transmembrana mitogénicas y, opcionalmente, una proteína transmembrana basada en citocinas en la célula productora o empaquetadora, que se incorporan al retrovirus cuando brota de la membrana celular productora/empaquetadora. Las proteínas transmembrana mitogénicas y la proteína transmembrana basada en citocinas se expresan como moléculas de superficie celular separadas en la célula productora en lugar de formar parte de la glucoproteína de la envuelta vírica. Esto significa que el marco de lectura de la envuelta vírica no se ve afectado, el cual, por tanto, conserva la integridad funcional y el título vírico.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un vector retrovírico o lentivírico que tiene una envuelta vírica que comprende:

(i) una primera proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que comprende un dominio mitogénico que se une a CD3 y un dominio transmembrana; y

(i) una segunda proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que comprende un dominio mitogénico que se une a CD28 y un dominio transmembrana

en donde las proteínas transmembrana activadoras de células T mitogénicas no forman parte de una glucoproteína de la envuelta vírica.

El vector vírico de acuerdo con el primer aspecto de la invención puede comprender una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas que comprende una citocina seleccionada de IL2, IL7 e IL15.

El vector retrovírico o lentivírico puede comprender una glucoproteína de envuelta vírica separada, codificada por un gen env.

Por lo tanto se proporciona un vector retrovírico o lentivírico que tiene una envuelta vírica que comprende:

(i) una glucoproteína de la envuelta vírica: y

(ii) una primera y segunda proteínas transmembrana activadora de células T mitogénicas que tienen la estructura: M-S-TM

en la cual M es un dominio mitogénico; S es un espaciador opcional y TM es un dominio transmembrana; y opcionalmente

(iii) una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas que comprende un dominio de citocina y un dominio transmembrana.

La proteína transmembrana activadora de células T mitogénica y/o la proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas no forman parte de la glucoproteína de la envuelta vírica. Existen como proteínas separadas en la envuelta vírica y están codificadas por genes separados.

La proteína transmembrana activadora de células T mitogénica puede tener la estructura:

M-S-TM

en la cual M es un dominio mitogénico; S es un espaciador opcional y TM es un dominio transmembrana.

Las proteínas transmembrana activadoras de las células T mitogénicas se unen a los antígenos de superficie de las células T activadores CD3 y CD28. La proteína transmembrana activadora de células T mitogénica puede comprender un agonista para dicho antígeno de superficie activador de células T.

La proteína transmembrana activadora de células T mitogénica puede comprender el dominio de unión de un anticuerpo tal como OKT3, 15E8, TGN1412; o una molécula coestimuladora como OX40L o 41BBL.

La proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas puede, por ejemplo, comprender una citocina seleccionada de IL2, IL7 e IL15.

Se proporciona también un vector retrovírico o lentivírico que tiene una envuelta vírica que comprende:

(ia) una primera proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que se une a CD3;

(ib) una segunda proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que se une a CD28; y

(ii) una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas que comprende IL2.

(ib) una segunda proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que se une a CD28;

(iia) una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas que comprende IL7; y

(iib) una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas que comprende IL15.

El vector vírico puede comprender una glucoproteína de envuelta vírica heteróloga que da un vector vírico pseudotipado. Por ejemplo, la glucoproteína de la envuelta vírica puede derivar de RD114 o una de sus variantes, VSV-G, virus de la leucemia del mono gibón (GALV) o es la envuelta Anfotrópica, la envuelta del Sarampión o la glucoproteína de la envuelta retrovírica de babuino.

En una segunda realización del primer aspecto de la invención, la envuelta vírica del vector vírico también puede comprender:

(iv) una proteína de etiquetado que comprende:

un dominio de unión que se une a un resto de captura; y

un dominio transmembrana

cuya proteína de etiquetado facilita la purificación del vector vírico del sobrenadante celular a través de la unión de la proteína marcadora al resto de captura.

El dominio de unión de la proteína de etiquetado puede comprender uno o más epítopo o epítopos de unión a estreptavidina. El epítopo o epítopos de unión a estreptavidina pueden ser un mimético de biotina, tales como un mimético de biotina que se une a estreptavidina con una afinidad menor que la biotina, de tal manera que pueda usarse biotina para eluir vectores retrovíricos capturados por estreptavidina producidos por la célula de empaquetamiento. Algunos ejemplos de mímicos de biotina adecuados incluyen: Streptagll (SEQ ID NO: 36), Flankedccstretag (SEQ ID NO: 37) y ccstreptag (SEQ ID NO:38).

El vector vírico del primer aspecto de la invención puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de células T o un receptor de antígeno quimérico.

El vector vírico puede ser una partícula similar a un virus (VLP).

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedadora que expresa, en la superficie celular,

(ii) una primera proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que comprende un dominio mitogénico que se une a CD3 y un dominio transmembrana; y

(ii) una segunda proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que comprende un dominio mitogénico que se une a CD28 y un dominio transmembrana

de tal manera que un vector retrovírico o lentivírico producido por la célula hospedadora es como se define en el primer aspecto de la invención.

En una segunda realización del segundo aspecto de la invención, la célula hospedadora también puede expresar, en la superficie celular:

(iii) una proteína de etiquetado que comprende:

un dominio de unión que se une a un resto de captura; y

un dominio transmembrana

cuya proteína de etiquetado facilita la purificación del vector vírico del sobrenadante celular a través de la unión de la proteína marcadora al resto de captura,

de tal manera que un vector retrovírico o lentivírico producido por la célula de empaquetamiento es como se define en la segunda realización del primer aspecto de la invención.

La proteína de etiquetado también puede comprender un espaciador entre el dominio de unión y el dominio transmembrana.

La expresión célula hospedadora puede ser una célula de empaquetamiento o una célula productora.

Una célula de empaquetamiento puede comprender uno o más de los siguientes genes: gag, pol, env y/o rev.

Una célula productora comprende los genes gag, pol, env y opcionalmente rev y también comprende un genoma retrovírico o lentivírico.

En este sentido, la célula hospedadora puede ser cualquier línea celular adecuada que exprese de forma estable proteínas transmembrana mitogénicas. Puede transfectarse transitoriamente con vector de transferencia, gagpol, env (y rev en el caso de un lentivirus) para producir un vector retrovírico/lentivírico incompetente para la replicación. En un tercer aspecto se proporciona un método para fabricar una célula hospedadora de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, que comprende la etapa de transducción o transfección de una célula con un ácido nucleico que codifica una primera proteína transmembrana activadora de células T mitogénica y una segunda proteína transmembrana activadora de células T mitogénica.

En un cuarto aspecto se proporciona un método para producir un vector vírico de acuerdo con el primer aspecto de la invención que comprende la etapa de expresar un genoma retrovírico o lentivírico en una célula de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.

En un quinto aspecto, se proporciona un método para producir una célula T transgénica activada o una célula asesina natural (NK), que comprende la etapa de transducción de una célula T o NK con un vector vírico de acuerdo con el primer aspecto de la invención, de tal manera que la célula T o la célula NK sea activada por una o más proteínas transmembrana activadoras de células T mitogénicas.

En un sexto aspecto, se proporciona un kit para preparar un vector retrovírico o lentivírico como se define en el primer aspecto de la invención, que comprende:

(i) una célula hospedadora como se define en el segundo aspecto de la invención;

(ii) ácidos nucleicos que comprenden gag, pol, env y opcionalmente rev; y

(iii) un genoma retrovírico.

También se proporciona un kit para preparar un vector retrovírico o lentivírico como se define en el primer aspecto de la invención, que comprende:

(i) una célula de empaquetamiento como se define en el segundo aspecto de la invención; y

(ii) un genoma retrovírico o lentivírico.

También se proporciona un kit para fabricar una célula de empaquetamiento de acuerdo con la segunda realización del segundo aspecto de la invención que comprende:

(i) uno o más ácido o ácidos nucleicos que codifican una primera proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que se une a CD3 y una segunda proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que se une a CD28; y

(ii) ácidos nucleicos que comprenden genes retrovíricos gag, pol, env y opcionalmente rev.

También se proporciona un kit para fabricar una célula productora de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, que comprende:

(i) uno o más ácido o ácidos nucleicos que codifican una primera proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que se une a CD3 y una segunda proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que se une a CD28;

(ii) ácidos nucleicos que comprenden genes retrovíricos gag, pol, env y opcionalmente rev; y

(iii) un genoma de vector retrovírico o lentivírico

La invención por lo tanto proporciona un vector vírico con un estímulo mitogénico incorporado y, opcionalmente, un estímulo de citocina (véase la Figura 1). El vector tiene la capacidad tanto de estimular la célula T como de efectuar la inserción de genes. Esto tiene una serie de ventajas: (1) simplifica el proceso de modificación por ingeniería genética de células T, ya que solo es necesario añadir un componente; (2) evita la retirada de perlas y la reducción asociada del rendimiento, ya que el virus es lábil y no es necesario retirarlo. (3) reduce el coste de la modificación por ingeniería genética de células T ya que solo se necesita fabricar un componente; (4) permite una mayor flexibilidad de diseño: cada proceso de modificación por ingeniería genética de células T implicará la creación de un vector de transferencia de genes, el mismo producto también puede hacerse con un estímulo mitogénico para "adaptarse" al producto; (5) permite un proceso de producción más corto: en enfoques basados en antígenos solubles/perlas, el mitógeno y el vector generalmente se administran secuencialmente separados por uno, dos o a veces tres días, esto se puede evitar con el vector retrovírico de la presente invención ya que la estimulación mitogénica y la entrada vírica están sincronizadas y son simultáneas; (6) es más fácil de diseñar, ya que no hay necesidad de probar muchas proteínas de fusión diferentes para determinar su expresión y funcionalidad; (7) es posible añadir más de una señal al mismo tiempo; y (8) es posible regular la expresión y/o los niveles de expresión de cada señal/proteína por separado.

Dado que el estímulo mitogénico y el estímulo de citocina opcional se proporcionan en una molécula que está separada de la glucoproteína de la envuelta vírica, se mantiene la integridad de la glucoproteína de la envuelta vírica y no hay impacto negativo en el título vírico.

Descripción detallada

RETROVIRUS

Los retrovirus son virus con envuelta de ARN bicatenario que se caracterizan principalmente por la capacidad de "transcribir inversamente" su genoma de ARN a ADN. Los viriones miden 100-120 nm de diámetro y contienen un genoma dimérico de cadenas de ARN positivas idénticas complejadas con las proteínas de la nucleocápside. El genoma está encerrado en una cápside proteica que también contiene proteínas enzimáticas, a saber, la transcriptasa inversa, la integrasa y proteasas, requerido para la infección vírica. Las proteínas de la matriz forman una capa fuera del núcleo de la cápside que interactúa con la envuelta, una bicapa lipídica derivada de la membrana celular hospedadora, que rodea la partícula del núcleo vírico. Anclado en esta bicapa, son las glucoproteínas de la envuelta vírica responsables de reconocer receptores específicos en la célula hospedadora e iniciar el proceso de infección. Las proteínas de la envuelta están formadas por dos subunidades, la transmembrana (TM) que ancla la proteína en la membrana lipídica y la superficie (SU) que se une a los receptores celulares.

Basado en la estructura del genoma, los retrovirus se clasifican en retrovirus sencillos, tales como MLV y virus de la leucemia murina; o retrovirus complejos, tales como VIH y EIAV. Los retrovirus codifican cuatro genes: gag (antígeno específico de grupo), pro (proteasa), pol (polimerasa) y env (sobre). La secuencia gag codifica las tres proteínas estructurales principales: la proteína de la matriz, proteínas de la nucleocápside y proteína de la cápside. La secuencia pro codifica proteasas responsables de escindir Gag y Gag-Pol durante el ensamblaje de partículas, brotación y maduración. La secuencia pol codifica las enzimas transcriptasa inversa e integrasa, el primero cataliza la transcripción inversa del genoma vírico de ARN a ADN durante el proceso de infección y el segundo es responsable de integrar el ADN provírico en el genoma de la célula hospedadora. La secuencia env codifica las subunidades SU y TM de la glucoproteína de la envuelta. Adicionalmente, el genoma retrovírico presenta secuencias que actúan en cis no codificantes, tales como: dos LTR (repeticiones terminales largas), que contienen elementos necesarios para impulsar la expresión génica, transcripción inversa e integración en el cromosoma de la célula hospedadora; una secuencia denominada señal de empaquetamiento (y ) necesaria para el empaquetamiento específico del ARN vírico en viriones de nueva formación; y un tracto de polipurina (PPT) que funciona como el sitio para iniciar la síntesis de ADN de cadena positiva durante la transcripción inversa. Además de gag, pro, pol y env, los retrovirus complejos, tales como lentivirus, tienen genes accesorios que incluyen vif, vpr, vpu, nef, tat y rev que regulan la expresión de genes víricos, ensamblaje de partículas infecciosas y modular la replicación vírica en células infectadas.

Durante el proceso de infección, un retrovirus se une inicialmente a un receptor específico de la superficie celular. Al entrar en la célula hospedadora susceptible, el genoma del ARN retrovírico se copia después en ADN mediante la transcriptasa inversa codificada víricamente que se transporta dentro del virus original. Este ADN se transporta al núcleo de la célula hospedadora donde posteriormente se integra en el genoma del hospedador. En esta fase, se denomina típicamente el provirus. El provirus es estable en el cromosoma del hospedador durante la división celular y se transcribe como otras proteínas celulares. El provirus codifica las proteínas y la maquinaria de envasado necesarias para producir más virus, que puede salir de la célula mediante un proceso conocido como "brotación". Cuando los virus con envuelta, tales como retrovirus y lentivirus, brotan de las células hospedadoras, forman parte de la membrana lipídica de la célula hospedadora. De esta forma, las proteínas de la membrana derivadas de la célula hospedadora se vuelven parte de la partícula retrovírica. La presente invención utiliza este proceso para introducir proteínas de interés en la envuelta de la partícula vírica.

VECTORES RETROVÍRICOS

Los retrovirus y lentivirus pueden usarse como vector o sistema de administración para la transferencia de un nucleótido de interés (NOI), o una pluralidad de NOI, a una célula diana. La transferencia puede producirse in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando se usa de esta manera, los virus se denominan típicamente vectores víricos.

En los vectores víricos de la presente invención, el NOI puede codificar un receptor de células T o un receptor de antígeno quimérico y/o un gen suicida.

Los vectores gamma-retrovíricos, comúnmente designados vectores retrovíricos, fueron el primer vector vírico empleado en ensayos clínicos de terapia génica en 1990 y siguen siendo uno de los más usados. Más recientemente, el interés por los vectores lentivíricos, derivado de retrovirus complejos tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), ha crecido debido a su capacidad para transducir células que no se dividen. Las características más atractivas de los vectores retrovíricos y lentivíricos como herramientas de transferencia de genes incluyen la capacidad para una gran carga útil genética (hasta 9 kb), una respuesta inmunitaria mínima del paciente, alta eficiencia de transducción in vivo e in vitro, y la capacidad de modificar permanentemente el contenido genético de la célula diana, sosteniendo una expresión a largo plazo del gen administrado.

El vector retrovírico puede basarse en cualquier retrovirus adecuado que sea capaz de administrar información genética a células eucariotas. Por ejemplo, el vector retrovírico puede ser un vector alfaretrovírico, un vector gammaretrovírico, un vector lentivírico o un vector espumaretrovírico. Dichos vectores se han usado extensamente en tratamientos de terapia génica y otras aplicaciones de administración de genes.

El vector vírico de la presente invención puede ser un vector retrovírico, tal como un vector gamma-retrovírico. El vector vírico puede basarse en el virus de la inmunodeficiencia humana. El vector vírico de la presente invención puede ser un vector lentivírico. El vector puede basarse en un lentivirus que no sea de primates tal como el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV).

El vector vírico de la invención comprende una primera y una segunda proteínas transmembrana activadoras de células T mitogénicas que comprenden dominios mitogénicos que se unen a CD3 y CD28, respectiva y opcionalmente una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas en la envuelta vírica, como se ilustra en la Figura 1.

La proteína transmembrana activadora de células T mitogénica y/o la proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas derivan de la membrana de la célula hospedadora, como se ha explicado anteriormente. PARTÍCULAS SIMILARES A VIRUS (VLP)

Para vectores retrovíricos y lentivíricos, la expresión del precursor de Gag es suficiente para mediar el ensamblaje y la liberación del virión. Las proteínas Gag, e incluso fragmentos de Gag, han demostrado ser competentes para ensamblar in vitro para formar diversas estructuras que se asemejan a los núcleos de virión. Estas partículas que carecen de material genético vírico y, por lo tanto, no son infecciosas, se denominan partículas similares a virus (VLP). Al igual que las partículas virales completas, contienen una envuelta vírica externa hecha de la bicapa lipídica de la célula hospedadora (membrana) y, por lo tanto, contienen proteínas transmembrana de la célula hospedadora. El vector vírico del primer aspecto de la invención puede ser o comprender una partícula similar a un virus.

NUCLEÓTIDO DE INTERÉS (NOI)

El vector vírico de la presente invención es capaz de administrar un nucleótido de interés (NOI) a una célula diana, tal como una célula T o una célula citolítica natural (NK).

El NOI puede codificar todo o parte de un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR) y/o un gen suicida.

Los CAR, son proteínas transmembrana de tipo I quiméricas que conectan un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular (de unión) con un dominio de señalización intracelular (endodominio). El fragmento de unión es típicamente un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal (mAb), pero puede basarse en otros formatos que comprenden un sitio de unión a antígeno de tipo anticuerpo. Normalmente, es necesario un dominio espaciador para aislar el fragmento de unión de la membrana y permitir una orientación adecuada. Un dominio transmembrana ancla la proteína en la membrana celular. Un CAR puede comprender o asociarse con un dominio o endodominio de señalización de células T intracelular.

Los ácidos nucleicos que codifican CAR pueden transferirse a células, tales como células T, usando el vector retrovírico o lentivírico de la presente invención. De esta forma, puede generarse una gran cantidad de células T específicas de cáncer para transferencia celular adoptiva. Cuando el CAR se une al antígeno diana, esto da como resultado la transmisión de una señal de activación la célula T en la que se expresa. Por lo tanto el CAR dirige la especificidad y la citotoxicidad del linfocito T hacia las células tumorales que expresan el antígeno diana.

Un gen suicida codifica un polipéptido que permite eliminar las células que expresan dicho polipéptido, por ejemplo, desencadenando apoptosis. Un ejemplo de un gen suicida se describe en el documento WO2013/153391.

CÉLULA HOSPEDADORA

En un segundo aspecto, la invención proporciona una célula hospedadora que expresa una primera y una segunda proteínas transmembrana activadoras de células T mitogénicas que comprenden dominios mitogénicos que se unen a CD3 y CD28, respectivamente en la superficie celular.

La célula hospedadora puede ser para la producción de vectores víricos de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

La célula hospedadora puede ser una célula de empaquetamiento y comprende uno o más de los siguientes genes: gag, pol, env y rev.

Una célula de empaquetamiento para un vector retrovírico puede comprender los genes gag, pol y env.

Una célula de empaquetamiento para un vector lentivírico puede comprender los genes gag, pol, env y rev.

La célula hospedadora puede ser una célula productora y comprende los genes gag, pol, env y opcionalmente rev genes y un genoma de vector retrovírico o lentivírico.

En un vector retrovírico o lentivírico recombinante típico para uso en terapia génica, al menos parte de una o más de las regiones codificantes de la proteína gag-pol y env puede retirarse del virus y proporcionarse mediante la célula de empaquetamiento. Esto hace que el vector vírico sea defectuoso en la replicación, ya que el virus es capaz de integrar su genoma en el genoma del hospedador, pero el genoma vírico modificado no puede propagarse debido a la falta de proteínas estructurales.

Las células empaquetadoras se usan para propagar y aislar cantidades de vectores víricos, es decir, para preparar títulos adecuados del vector retrovírico para la transducción de una célula diana.

En algunos casos, la propagación y el aislamiento pueden implicar el aislamiento de los genes retrovíricos gagpol y env (y en el caso de los lentivirus, rev) y su introducción separada en una célula hospedadora para producir una línea celular de empaquetamiento. La línea celular de empaquetamiento produce las proteínas necesarias para empaquetar el ADN retrovírico pero no puede provocar la encapsidación debido a la falta de una región psi. Sin embargo, cuando se introduce un vector recombinante que lleva una región psi en la línea celular de empaquetamiento, las proteínas auxiliares pueden empaquetar el vector recombinante psi-positivo para producir el reservorio de virus recombinante. Un resumen de las líneas de envasado disponibles se presenta en "Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 449).

También se han desarrollado células de empaquetamiento en las cuales las regiones codificantes víricas gag, pol y env (y, en el caso de vectores lentivíricos, rev) se transportan en plásmidos de expresión separados que se transfectan independientemente en una línea celular de empaquetamiento, de tal manera que se requieren tres eventos recombinantes para la producción vírica de tipo silvestre.

La transfección transitoria evita el mayor tiempo necesario para generar líneas celulares productoras de vectores estables y se usa si el vector o los componentes de empaquetamiento retrovíricos son tóxicos para las células. Los componentes que se usan normalmente para generar vectores retrovíricos/lentivíricos incluyen un plásmido que codifica las proteínas Gag/Pol, un plásmido que codifica la proteína Env (y, en el caso de los vectores lentivíricos, la proteína rev) y el genoma del vector retrovírico/lentivírico. La producción de vectores implica la transfección transitoria de uno o más de estos componentes en células que contienen los otros componentes necesarios.

Las células de empaquetamiento de la presente invención pueden ser cualquier tipo de célula de mamífero capaz de producir partículas de vector retrovírico/lentivírico. Las células de empaquetamiento pueden ser células 293T o variantes de células 293T que se han adaptado para crecer en suspensión y crecer sin suero.

Las células de empaquetamiento pueden fabricarse mediante transfección transitoria con

a) el vector de transferencia

b) un vector de expresión gagpol

c) un vector de expresión env. El gen env puede ser heterólogo, dando como resultado un vector retrovírico pseudotipado. Por ejemplo, el gen env puede ser de RD114 o una de sus variantes, VSV-G, el virus de la leucemia del mono gibón (GALV), la envuelta Anfotrópica o la envuelta del Sarampión o la glucoproteína de la envuelta retrovírica de babuino.

En el caso del vector lentivírico, también se realiza la transfección transitoria con un vector rev.

PROTEÍNA TRANSMEMBRANA ACTIVADORA DE CÉLULAS T MITOGÉNICA

El vector vírico de la presente invención puede comprender una primera y una segunda proteínas transmembrana activadoras de células T mitogénicas que comprenden dominios mitogénicos que se unen a CD3 y CD28, respectivamente en la envuelta vírica. La proteína transmembrana activadora de células T mitogénica deriva de la célula hospedadora durante la producción del vector retrovírico. La proteína transmembrana activadora de células T mitogénica se produce por la célula empaquetadora y se expresa en la superficie celular. Cuando el vector retrovírico naciente brota de la membrana de la célula hospedadora, la proteína transmembrana activadora de células T mitogénica se incorpora en la envuelta vírica como parte de la bicapa lipídica derivada de la célula de empaquetamiento.

La expresión "derivada de la célula hospedadora" indica que la proteína transmembrana activadora de células T mitogénica deriva de la célula hospedadora como se describió anteriormente y no se produce como una fusión o quimera de uno de los genes víricos, tales como gag, que codifica las principales proteínas estructurales; o env, que codifica la proteína de la envuelta.

Las proteínas de la envuelta están formadas por dos subunidades, la transmembrana (TM) que ancla la proteína en la membrana lipídica y la superficie (SU) que se une a los receptores celulares. La proteína transmembrana activadora de células T mitogénica derivada de células de empaquetamiento de la presente invención no comprende la subunidad de envuelta superficial (SU).

La proteína transmembrana activadora de células T mitogénica puede comprender una de las siguientes secuencias, o una variante de las mismas.

SEQ ID NO. 1 (OKT3-CD8STK-TM-A)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMH WVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDS AVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAI MSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGS GSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRSDPTTTPAPRPPT PAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY CNHRNRRRVCKCPRPVV SEQ ID NO. 2 (15E8-CD8STK-TM-A)

METDTLILWVLLLLVPGSTGQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWV RQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAM YYCARDKRAPGKLYYGYPDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSP ASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPA RFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVPSTFGGGTKLEIKRSDPTTTPAP RPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAvGTCGVLLLSLV ITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV SEQ ID NO. 3 (TGN1412-CD8STK-TM-A) METDTLILWVLLLLVPGSTGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWV RQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVY FCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTI ASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR NRRRVCKCPRPVV

La proteína transmembrana activadora de células T mitogénica puede comprender una variante de la secuencia mostrada como SEQ ID NO. 1,2 o 3 teniendo al menos el 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad de secuencia, con la condición de que la secuencia variante sea una proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que tenga las propiedades requeridas, es decir, la capacidad de activar una célula T cuando esté presente en la proteína de la envuelta de un vector retrovírico.

Los métodos de alineación de secuencias son bien conocidos en la técnica y se logran usando programas de alineación adecuados. El % de identidad de secuencia se refiere al porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos en las dos secuencias cuando están alineadas de manera óptima. La homología o identidad de secuencia de nucleótidos y proteínas puede determinarse usando algoritmos convencionales tales como un programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool en el National Center for Biotechnology Information) usando parámetros predeterminados, que está disponible públicamente en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Otros algoritmos para determinar la identidad u homología de secuencia incluyen: LALIGN (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/ y http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/nucleotide.html), AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences, en http://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/Amas/amas.html), FASTA (http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/), Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), SIM (http://web.expasy.org/sim/) y EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html).

M-S-TM

en la cual M es un dominio mitogénico; S es un dominio espaciador opcional y TM es un dominio transmembrana.

DOMINIO MITOGÉNICO

El dominio mitogénico es la parte de la proteína transmembrana activadora de células T mitogénica que provoca la activación de las células T. Puede unirse o interactuar de otra manera, directa o indirectamente, con una célula T, dando lugar a la activación de las células T. En particular, el dominio mitogénico puede unirse a un antígeno de superficie de la célula T, tales como CD3, CD28, CD134 y CD137.

CD3 es un correceptor de células T. Es un complejo proteico compuesto por cuatro cadenas distintas. En mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3y, una cadena CD38 y dos cadenas CD3e. Estas cadenas se asocian al receptor de células T (TCR) y la cadena Z para generar una señal de activación en los linfocitos T. El TCR, la cadena Z y las moléculas CD3 comprenden juntos el complejo TCR.

El dominio mitogénico puede unirse a la cadena CD3 £.

CD28 es una de las proteínas expresadas en las células T que proporcionan señales coestimuladoras necesarias para la activación y supervivencia de las células T. La estimulación de células T a través de CD28 además del receptor de células T (TCR) puede proporcionar una señal potente para la producción de diversas interleucinas (IL-6 en particular).

CD134, también conocido como OX40, es un miembro de la superfamilia de receptores TNFR que no se expresa constitutivamente en células T vírgenes en reposo, a diferencia de CD28. OX40 es una molécula coestimuladora secundaria, expresada después de 24 a 72 horas después de la activación; su ligando, OX40L, tampoco se expresa en células presentadoras de antígeno en reposo, sino que es después de su activación. La expresión de OX40 depende de la activación completa de la célula T; sin CD28, la expresión de OX40 está retrasada y en niveles cuatro veces más bajos.

CD137, también conocido como 4-1BB, es un miembro de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF). CD137 puede expresarse por células T activadas, pero en mayor medida en las células T CD8 que en las CD4. Además, la expresión de CD137 se encuentra en células dendríticas, células dendríticas foliculares, células citolíticas naturales, granulocitos y células de las paredes de los vasos sanguíneos en los sitios de inflamación. La actividad mejor caracterizada de CD137 es su actividad coestimuladora para las células T activadas. La reticulación de CD137 mejora la proliferación de células T, la supervivencia de la secreción de IL-2 y actividad citolítica.

El dominio mitogénico puede comprender todo o parte de un anticuerpo u otra molécula que se une específicamente a un antígeno de superficie de células T. El anticuerpo puede activar el TCR o CD28. El anticuerpo puede unirse al TCR, CD3 o CD28. Algunos ejemplos de dichos anticuerpos incluyen: OKT3, 15E8 y TGN1412. Otros anticuerpos adecuados incluyen:

Anti-CD28: CD28.2, 10F3

Anti-CD3/TCR: UCHT1, YTH12.5, TR66

El dominio mitogénico puede comprender el dominio de unión de OKT3, 15E8, TGN1412, CD28.2, 10F3, UCHT1, YTH12.5 o TR66.

El dominio mitogénico puede comprender todo o parte de una molécula co-estimuladora tal como OX40L y 41BBL. Por ejemplo, el dominio mitogénico puede comprender el dominio de unión de OX40L o 41BBL.

OKT3, también conocido como Muromonab-CD3 es un anticuerpo monoclonal dirigido a la cadena CD3e. Se usa clínicamente para reducir el rechazo agudo en pacientes con trasplantes de órganos. Fue el primer anticuerpo monoclonal aprobado para uso clínico en seres humanos. Los CDR de OKT3 son como sigue:

CDRH1: GYTFTRY (SEQ ID NO. 4)

CDRH2: NPSRGY (SEQ ID NO. 5)

CDRH3: YYDDHYCLDY (SEQ ID NO. 6)

CDRL1: SASSSVSYMN (SEQ ID NO. 7)

CDRL2: DTSKLAS (SEQ ID NO. 8)

CDRL3: QQWSSNPFT (SEQ ID NO. 9)

15E8 es un anticuerpo monoclonal de ratón contra CD28 humano. Sus CDR son como sigue:

CDRH1: GFSLTSY (SEQ ID NO. 10)

CDRH2: WAGGS (SEQ ID NO. 11)

CDRH3: DKRAPGKLYYGYPDY (SEQ ID NO. 12)

CDRL1: RASESVEYYVTSLMQ (SEQ ID NO. 13)

CDRL2: AASNVES (SEQ ID NO. 14)

CDRL3: QQTRKVPST (SEQ ID NO. 15)

TGN1412 (también conocido como CD28-SuperMAB) es un anticuerpo monoclonal humanizado que no solo se une a, sino que es un fuerte agonista para, el receptor de CD28. Sus CDR son como sigue.

CDRH1: GYTFSY (SEQ ID NO. 16)

CDRH2: YPGNVN (SEQ ID NO. 17)

CDRH3: SHYGLDWNFDV (SEQ ID NO. 18)

CDRL1: HASQNIYVLN (SEQ ID NO. 19)

CDRL2: KASNLHT (SEQ ID NO. 20)

CDRL3: QQGQTYPYT (SEQ ID NO. 21)

OX40L es el ligando de CD134 y se expresa en tales células como DC2 (un subtipo de células dendríticas) que permite la amplificación de la diferenciación de células Th2. OX40L también se ha designado CD252 (grupo de diferenciación 252).

Secuencia OX40L (SEQ ID NO. 22)

MERVQPLEENVGNAARPRFERNKLLLVASVIQGLGLLLCFTYICLHFSAL

QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNYLISLKGYFS QEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSL DDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL

41BBL es una citocina que pertenece a la familia de ligandos del factor de necrosis tumoral (TNF). Esta citocina transmembrana es un transductor de señal bidireccional que actúa como ligando para 4-1BB, que es una molécula receptora coestimuladora en los linfocitos T. Se ha demostrado que 41BBL reactiva los linfocitos T anérgicos además de promover la proliferación de linfocitos T.

Secuencia 41BBL (SEQ ID NO. 23)

MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVS GARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSD PGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQ PLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARH AWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE

DOMINIO ESPACIADOR

La proteína transmembrana activadora de células T mitogénica y/o la proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas pueden comprender una secuencia espaciadora para conectar el dominio de unión al antígeno con el dominio transmembrana. Un espaciador flexible permite que el dominio de unión a antígeno se oriente en diferentes direcciones para facilitar la unión.

La secuencia espaciadora puede, por ejemplo, comprender una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un pedúnculo de CD8 humano o el pedúnculo de CD8 de ratón. El espaciador puede comprender alternativamente una secuencia enlazadora alternativa que tiene una longitud y/o propiedades espaciadoras de dominio similares como una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un pedúnculo de CD8. Un espaciador de IgG1 humana puede alterarse para retirar los motivos de unión a Fc.

Algunos ejemplos de secuencias de aminoácidos para estos espaciadores se dan a continuación:

SEQ ID NO. 24 (bisagra CH2CH3 de lgG1 humana)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA

L.PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKKD SEQ ID NO. 25 (tallo de CD8 humana):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI SEQ ID NO. 26 (bisagra de IgG1 humana):

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK SEQ ID NO. 27 (ectodominio de CD2)

KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKD TYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINT TLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSV EPVSCPEKGLD SEQ ID NO. 28 (ectodominio de CD34)

SLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITE TTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDL STTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKD RGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMK KHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKT

La secuencia espadadora puede derivar de una proteína humana. La secuencia espadadora puede no derivar de una proteína vírica. En particular, la secuencia espadadora puede no ser, derivar de, o comprender parte de la subunidad de la envuelta superficial (SU) de una proteína env retrovírica.

DOMINIO TRANSMEMBRANA

El dominio transmembrana es la secuencia de la proteína transmembrana activadora de células T mitogénica y/o la proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas que atraviesa la membrana. El dominio transmembrana puede comprender una hélice alfa hidrófoba. El dominio transmembrana puede derivar de CD28, que da una buena estabilidad de receptor.

El dominio transmembrana puede derivar de una proteína humana. El dominio transmembrana puede no derivar de una proteína vírica. En particular, el dominio transmembrana puede no ser, derivar de, o comprender parte de la subunidad de la envuelta transmembrana (TM) de una proteína env retrovírica.

Una opción alternativa a un dominio transmembrana es un dominio dirigido a la membrana tal como un anclaje GPI. El anclaje de GPI es una modificación postraduccional que se produce en el retículo endoplásmico. Los precursores de anclaje de GPI preensamblados se transfieren a proteínas que llevan una secuencia señal de GPI C-terminal. Durante el procesamiento, el anclaje de GPI reemplaza la secuencia señal de GPI y se une a la proteína diana a través de un enlace amida. El anclaje de GPI dirige la proteína madura a la membrana.

La presente proteína de etiquetado puede comprender una secuencia señal de GPI.

PROTEÍNA TRANSMEMBRANA ACTIVADORA DE CÉLULAS T BASADA EN CITOCINA

El vector vírico de la presente invención puede comprender una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas en la envuelta vírica. La proteína transmembrana activadora de células T basada en citocina deriva de la célula hospedadora durante la producción del vector vírico. La proteína transmembrana activadora de células T basada en citocina se produce por la célula hospedadora y se expresa en la superficie celular. Cuando el vector vírico naciente brota de la membrana de la célula hospedadora, la proteína transmembrana activadora de células T basada en citocina se incorpora en la envuelta vírica como parte de la bicapa lipídica derivada de la célula de empaquetamiento.

La proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas no se produce a partir de uno de los genes víricos, tales como gag, que codifica las principales proteínas estructurales, o env, que codifica la proteína de la envuelta.

La proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas puede comprender un dominio de citocina y un dominio transmembrana. Puede tener la estructura C-S-TM, donde C es el dominio de citocina, S es un dominio espaciador opcional y TM es el dominio transmembrana. El dominio espaciador y los dominios transmembrana son como se definieron anteriormente.

DOMINIO DE CITOCINA

El dominio de citocina puede comprender parte o la totalidad de una citocina activadora de células T, tal como de IL2, IL7 e IL15. El dominio de citocina puede comprender parte de la citocina, siempre que conserve la capacidad de unirse a su receptor particular y activar las células T.

La IL2 es uno de los factores secretados por las células T para regular el crecimiento y la diferenciación de las células T y de ciertas células B. IL2 es una linfocina que induce la proliferación de células T sensibles. Se secreta como un único polipéptido glucosilado y se requiere la escisión de una secuencia señal para su actividad. La RMN en solución sugiere que la estructura de IL2 comprende un paquete de 4 hélices (llamadas A-D), flanqueado por 2 hélices más cortas y varios bucles mal definidos. Los restos en la hélice A y en la región del bucle entre las hélices A y B, son importantes para la unión al receptor. La secuencia de IL2 se muestra como SEQ ID NO. 29.

SEQ ID No. 29

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTR MLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELK GSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT IL7 es una citocina que sirve como factor de crecimiento para las células linfoides tempranas de los linajes de células B y T. La secuencia de IL7 se muestra como SEQ ID NO. 30.

SEQ ID No. 30

MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSN CLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILL NCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILM GTKEH IL15 es una citocina con similitud estructural con IL-2. Al igual que IL-2, la IL-15 se une a y envía señales a través de un complejo compuesto por la cadena beta del receptor de IL-2/IL-15 y la cadena gamma común. La IL-15 se secreta por fagocitos mononucleares y algunas otras células, después de una infección por virus. Esta citocina induce la proliferación celular de células citolíticas naturales; células del sistema inmunitario innato cuya función principal es destruir las células infectadas por virus. La secuencia de IL-15 se muestra como SEQ ID NO. 31.

SEQ ID No. 31

MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKI EDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANN SLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

La proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas puede comprender una de las siguientes secuencias, o una variante de las mismas:

SEQ ID NO. 32 (membrana-IL7)

MAHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSN CLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILL NCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILM GTKEHSGGGSPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDF ACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV SEQ ID NO. 33 (membrana-IL15)

MGLVRRGARAGPRMPRGWTALCLLSLLPSGFMAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVN VISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVE NLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSPAKPTTTP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV

La proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas puede comprender una variante de la secuencia mostrada como SEQ ID NO. 32 o 33 teniendo al menos el 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad de secuencia, con la condición de que la secuencia variante sea una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas que tenga las propiedades requeridas, es decir, la capacidad de activar una célula T cuando esté presente en la proteína de la envuelta de un vector retrovírico o lentivírico.

ETIQUETADO DE PROTEÍNA

La envuelta vírica del vector vírico también puede comprender una proteína de etiquetado que comprende un dominio de unión que se une a un resto de captura y un dominio transmembrana.

La proteína de etiquetado puede comprender:

un dominio de unión que se une a un resto de captura

un espaciador; y

un dominio transmembrana.

La proteína de etiquetado facilita la purificación del vector vírico del sobrenadante celular a través de la unión de la proteína marcadora al resto de captura.

"Dominio de unión" se refiere a una entidad, por ejemplo un epítopo, que es capaz de reconocer y unirse específicamente a una entidad diana, por ejemplo, un resto de captura.

El dominio de unión puede comprender uno o más epítopos que son capaces de unirse específicamente a un resto de captura. Por ejemplo, los dominios de unión pueden comprender al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco epítopos capaces de unirse específicamente a un resto de captura. Cuando el dominio de unión comprende más de un epítopo, cada epítopo puede estar separado por una secuencia enlazadora, como se describe en el presente documento. El dominio de unión puede ser liberable del resto de captura tras la adición de una entidad que tiene una afinidad de unión más alta por el resto de captura en comparación con el dominio de unión.

Epítopo de unión a estreptavidina

El dominio de unión puede comprender uno o más epítopo o epítopos de unión a estreptavidina. Por ejemplo, el dominio de unión puede comprender al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco epítopos de unión a estreptavidina. La estreptavidina es una proteína de 52,8 kDa purificada a partir de la bacteria Streptomyces avidinii. Los homotetrámeros de estreptavidina tienen una afinidad muy alta por la biotina (vitamina B7 o vitamina H), con una constante de disociación (Kd) ~ 10-15 M. La estreptavidina es bien conocida en la técnica y se usa extensamente en biología molecular y bionanotecnología debido a la resistencia del complejo estreptavidina-biotina a los disolventes orgánicos, desnaturalizantes, enzimas proteolíticas y extremos de temperatura y pH. El fuerte enlace estreptavidinabiotina puede usarse para unir diversas biomoléculas entre sí o sobre un soporte sólido. Se necesitan condiciones rigurosas para romper la interacción estreptavidina-biotina, sin embargo, que pueden desnaturalizar una proteína de interés que se está purificando.

El dominio de unión puede ser, por ejemplo, un mímico de biotina. Un "mímico de biotina" puede referirse a una secuencia de péptidos corta (por ejemplo, 6 a 20, 6 a 18, 8 a 18 u 8 a 15 aminoácidos) que se une específicamente a la estreptavidina.

Como se ha descrito anteriormente, la afinidad de la interacción biotina/estreptavidina es muy alta. Es por lo tanto una ventaja de la presente invención que el dominio de unión pueda comprender un mimético de biotina que tenga una afinidad menor por la estreptavidina en comparación con la propia biotina.

En particular, el mimético de biotina puede unirse a la estreptavidina con una afinidad de unión menor que la biotina, de tal manera que la biotina pueda usarse para eluir vectores retrovíricos capturados por estreptavidina. Por ejemplo, el mimético de biotina puede unirse a estreptavidina con una Kd de 1 nM a 100 uM.

El mimético de biotina puede comprender una secuencia como se muestra en la Tabla 1.

T l 1. P i mim i i in .

El mímico de biotina puede seleccionarse del siguiente grupo: Streptagll, Flankedccstreptag y ccstreptag.

El dominio de unión puede comprender más de un mimético de biotina. Por ejemplo, el dominio de unión puede comprender al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco miméticos de biotina.

Cuando el dominio de unión comprende más de un mimético de biotina, cada mimético puede ser el mismo o un mimético diferente. Por ejemplo, el dominio de unión puede comprender dos mímicos de biotina Streptagll separados por un enlazador (por ejemplo, como se muestra en SEQ ID NO: 43) o dos Flankedccstreptag separados por un enlazador (por ejemplo, como se muestra en SEQ ID NO: 44).

SEQ ID NO: 43 (Streptagll-d8-x2)

WSHPQFEKSGGGGSPAPRPPTPAPTIASWSHPQFEK SEQ ID NO: 44 (Flankedccstreptag-d8-x2) ECHPQGPPCIEGRKSSGGGGSPAPRPPTPAPTIASECHPQGPPCIEGRKS

Glutatión S-transferasa

El dominio de unión puede comprender un dominio de glutatión S-transferasa (GST).

Las GST comprenden una familia de isoenzimas metabólicas de fase II eucariotas y procariotas que catalizan la conjugación de la forma reducida de glutatión (GSH) con sustratos xenobióticos con el fin de desintoxicar. La familia GST consiste en tres superfamilias: las proteínas citosólicas, mitocondriales y microsómicas (también conocidas como MAPEG) (Udomsinpraser et al. Biochem. J. (2005) 388 (Pt 3): 763-71).

La proteína GST tiene una fuerte afinidad de unión por GSH y esta interacción se usa comúnmente en biología molecular para permitir el aislamiento de una proteína marcada con GST de una mezcla de proteínas.

Una secuencia de aminoácidos para GST se muestra como SEQ ID NO: 45.

SEQ ID NO: 45 (GST) MGTSLLCWMALCLLGADHADAMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERD EGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEIS MLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTH PDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQ ATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLG

Epítopo de unión a rituximab

La presente proteína de etiquetado puede comprender un dominio de unión que comprende un epítopo de unión a rituximab (epítopo R) y/o un epítopo Qbend10 (epítopo Q).

Un epítopo de unión a rituximab se refiere a un epítopo que se une específicamente a rituximab. Por ejemplo, el epítopo de unión a rituximab puede basarse en el antígeno de células B CD20.

La secuencia del epítopo de unión a Rituximab de CD20 es CEPANPSEKNSPSTQYC (SEQ ID NO. 46) Perosa et al (2007, J. Immunol 179:7967-7974) describen una serie de péptidos cíclicos de 7-meros constreñidos por cisteína, que llevan el motivo antigénico reconocido por el mAb anti-CD20 Rituximab, pero tienen diferentes aminoácidos alrededor del motivo. En total se describieron once péptidos, como se muestra en la siguiente tabla:

Li et al (2006 Cell Immunol 239:136-43) también describen mimétopos de Rituximab, que incluyen la secuencia: QDKLTQWPKWLE (SEQ ID NO. 58).

El polipéptido de la presente divulgación comprende un epítopo de unión a rituximab que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46-58 o una variante de la misma que conserva la actividad de unión a Rituximab.

QBendIO

El sistema de selección de CD34 CliniMACS utiliza el anticuerpo monoclonal QBEnd10 para lograr la selección celular. Los presentes inventores han mapeado previamente el epítopo de unión a QBEnd10 desde el interior del antígeno CD34 (véase el documento WO 2013/153391) y han determinado que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 59.

ELPTQGTFSNVSTNVS (SEQ ID NO. 59).

El dominio de unión de la presente proteína de etiquetado de la presente invención puede comprender un epítopo de unión a QBEnd10 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 59 o una variante de la misma que conserva la actividad de unión a QBEnd10.

RQR8

La proteína de etiquetado puede comprender un dominio de unión que comprende o consiste en una secuencia de 136 aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 60.

SEQ ID NO: 60 (RQR8)

CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV ÁCIDO NUCLEICO

La divulgación también se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas o un ácido nucleico que codifica una proteína transmembrana activadora de células T mitogénica. El ácido nucleico puede estar en forma de una construcción que comprende una pluralidad de secuencias que codifican una proteína transmembrana activadora de células T mitogénica y/o una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas.

Como se usan en el presente documento, los términos "polinucleótido", "nucleótido" y "ácido nucleico" pretenden ser sinónimos entre sí.

Un experto en la materia entenderá que numerosos polinucleótidos y ácidos nucleicos diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que las personas expertas pueden, usando técnicas rutinarias, hacer sustituciones de nucleótidos que no afecten a la secuencia de polipéptido codificada por los polinucleótidos descritos aquí para reflejar el uso de codones de cualquier organismo hospedador particular en el cual han de expresarse los polipéptidos.

Los ácidos nucleicos pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Pueden ser también polinucleótidos que incluyan dentro de ellos nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se conocen varios tipos distintos de modificación de oligonucleótidos. Estas incluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines del uso como se describe en el presente documento, debe entenderse que los polinucleótidos pueden modificarse por cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo para potenciar la actividad o vida útil in vivo de polinucleótidos de interés.

Los términos "variante", "homólogo" o "derivado" con respecto a una secuencia de nucleótidos incluye cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de un (o más) ácido nucleico de o en la secuencia.

El ácido nucleico puede producir un polipéptido que comprende una o más secuencias que codifican una proteína transmembrana activadora de células T mitogénica y/o una o más secuencias que codifican una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas. El sitio de escisión puede ser autoescindible, de tal manera que cuando se produce el polipéptido, se escinde inmediatamente en el componente receptor y el componente de señalización sin necesidad de ninguna actividad de escisión externa.

Se conocen diversos sitios de autoescisión, incluyendo el péptido autodescindible 2a del virus de la fiebre aftosa (FMDV) y diversas variantes y péptidos similares a 2A. El péptido puede tener la secuencia que se muestra como SEQ ID NO. 34 o 35.

SEQ ID NO. 34

RAEGRGSLLTCGDVEENPGP.

SEQ ID NO. 35

QCTNYALLKLAGDVESNPGP

La secuencia de coexpresión puede ser una secuencia de entrada interna al ribosoma (IRES). La secuencia de coexpresión puede ser un promotor interno.

VECTOR

La presente divulgación también proporciona un vector, o un kit de vectores que comprende una o más secuencias que codifican una proteína transmembrana activadora de células T mitogénica y/o una o más secuencias que codifican una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas. Un vector tal puede usarse para introducir la secuencia o secuencias de ácido nucleico en una célula hospedadora, tal como una célula productora o de empaquetamiento.

El vector puede, por ejemplo, ser un plásmido o un vector vírico, tal como un vector retrovírico o un vector lentivírico, o un vector basado en transposón o ARNm sintético.

El vector puede ser capaz de transfectar o transducir una célula hospedadora.

MÉTODO

La invención también proporciona un método para producir una célula T transgénica activada o una célula asesina natural (NK), que comprende la etapa de transducción de una célula T o NK con un vector retrovírico o lentivírico de acuerdo con la invención, de tal manera que la célula T o la célula NK se active por una o más proteínas transmembrana activadoras de células T mitogénicas y opcionalmente una o más proteínas transmembrana activadoras de células T basadas en citocinas.

El método para transducir y activar células T o NK puede tardar 48 horas o menos, por ejemplo, entre 24 y 48 horas. La invención se describirá además a continuación por medio de Ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto en la materia a llevar a cabo la invención y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención. Ejemplos

Ejemplo 1: producción de vectores víricos que muestran OKT3 en la superficie del virión

Se realizó un experimento inicial de prueba de concepto donde se demostró que la expresión de un scFv de OKT3 en la célula de empaquetamiento da como resultado la producción de un vector vírico que provoca la activación mitogénica de las dianas de las células T.

Las células OKT3 scFv 293T produjeron un vector lentivírico que provocó la activación y transducción de las células T diana. Esta propiedad mitogénica dependía de la presencia de componentes auxiliares lentivíricos, es decir, el efecto no se debía a una propiedad no específica del sobrenadante de la célula de empaquetamiento (Figura 2).

También se realizó una comparación del OKT3 scFv unido a la membrana a través de un tallo CD8 o mediante la capacidad de una bisagra IgG1 para incorporarse al lentivirus y provocar un estímulo mitogénico, sin que se observe ninguna diferencia entre los dos espaciadores.

Las células 293T que expresan de forma estable OKT3 unido a la superficie se transfectaron con gagpol lentivírico, RD-PRO env, el vector de transferencia o los tres plásmidos junto con un plásmido lentivírico que expresa rev. El sobrenadante posterior se aplicó a células T humanas primarias. Las células T se estudiaron posteriormente mediante citometría de flujo con los siguientes parámetros: CD25 para medir la activación de células T; anti-Fc para detectar transgén (CAR con un espaciador Fc); ki67 para determinar las células en ciclo (Figura 3). Solo las condiciones en donde se suministró gagpol dieron como resultado una estimulación mitogénica significativa.

Solo la condición en donde se suministraron todos los plásmidos (junto con rev) dio como resultado la estimulación mitogénica de las células T y la transducción

También se llevaron a cabo experimentos adicionales para determinar si diferentes pseudotipados lentivíricos apoyan el efecto mitogénico. Las células 293T que expresan de manera estable el OKT3 unido a la membrana se transfectaron con un vector de transferencia lentivírico, gagpol lentivírico, rev y diferentes plásmidos env: a saber, VSV-G, RD-PRO, Ampho, GALV y Sarampión M/H. El sobrenadante posterior se aplicó a células T humanas primarias. Las células se tiñeron con ki67 y se estudiaron mediante citometría de flujo. Todos los pseudotipos apoyaron el efecto mitogénico, aunque el efecto pareció reducirse con la pseudotipificación del Sarampión (Figura 4).

Ejemplo 2 - Pueden incorporarse dos estímulos mitogénicos separados en el vector vírico

Se generó una construcción adicional que comprendía el scFv activador de anti-CD28 del anticuerpo 15E8. El casete de scFv de OKT3 (descrito anteriormente) expresó eGFP y el casete de scFv de 15E8 expresó la proteína fluorescente azul eBFP2.

Se generaron células 293T que coexpresaron altos niveles de eGFP y eBFP2, demostrando la expresión exitosa de OKT3 y 15E8 en la superficie de las células 293T.

El sobrenadante lentivírico se generó a partir de células 293T de tipo silvestre, células 293T que expresaron OKT3 scFv solo y células 293T que expresaron tanto OKT3 como 15E8. Los niveles de activación y la eficiencia de la transducción fueron mayores con las dos estimulaciones (Figura 6).

Ejemplo 3: demostración de funcionalidad en vectores gamma-retrovíricos

Las células 293T que expresan de forma estable OKT3 unido a la membrana se transfectaron con un vector de transferencia gamma-retrovírico que codifica un CAR, plásmido de expresión gamma-retrovírico gagpol y un plásmido de expresión RD114. El sobrenadante posterior se aplicó a células T humanas primarias. Las células T se tiñeron con anti-Fc, anti-CD25 y ki67 y se estudiaron por citometría de flujo. Aunque no se aplicó ningún estímulo mitogénico, se activaron las células T, estaban en ciclo y estaban expresando transgén (Figura 5)

Ejemplo 4 - combinaciones de péptidos incorporados en vectores lentivirus

Se incorporaron diferentes combinaciones de elementos en líneas celulares de empaquetamiento. Esto incluía TGN1412 scFv, que es un mAb anti-CD28 superagonista. Las citocinas IL7 e IL15, así como OX40L y 41BBL también se incorporaron en diferentes combinaciones como sigue:

1. (Nulo)

2. OKT3

3. OKT3+15E8

4. OKT3+TGN1412

5. OKT3+15E8+OX40L+41BBL

6. OKT3+15E8+OX40L+41BBL+mlL15

7. OKT3+15E8+OX40L+41BBL+mlL7

El vector lentivírico generado a partir de estas diferentes células 293T se usó para estimular/transducir las células T. El vector generado a partir de células 293T no modificadas por ingeniería genética junto con anticuerpos solubles mitogénicos OKT3 y CD28.2 /- IL2 se usó como un control. Se midieron la activación (CD25), la fracción proliferativa (Ki67) y los recuentos absolutos en el día 5 (Figuras 7-10).

Una vez más, se señaló que existía una marcada ventaja al incorporar dos señales en lugar de una. También se observó que la activación usando péptidos mitogénicos mostrados en la superficie del virión fue marcadamente superior a la activación lograda agregando anticuerpos solubles a las células T.

También se consiguieron niveles de proliferación similares a los de la activación de mAb con citocina.

Metodología

El VH y VL de los anticuerpos mitogénicos se clonaron como scFv y se conectaron a un dominio espaciador, un dominio TM y un ancla polar (SEQ ID NO 1-3 anteriormente)

Las citocinas se conectaron en marco a un espaciador, un dominio TM y un ancla polar (SEQ ID NO 32 y 33 anteriormente).

Para las moléculas co-estimuladoras nativas tales como 41BBL y OX40L, estas se clonan en sus formas nativas. Cada uno de los tipos anteriores de proteínas unidas a la membrana podría entonces expresarse de manera estable a niveles altos en una célula 293T.

Los vectores víricos se prepararon a partir de estas células 293T usando transfección transitoria convencional. Para el vector lentivírico, el vector de transferencia, vector de expresión rev, un vector de expresión lenti gagpol y el vector de expresión RD-PRO se co-transfectaron. Para los vectores retrovíricos gamma, las células 293T se co-transfectaron con el vector de transferencia, MoMLV gagpol y plásmido de expresión RD114. El sobrenadante se clarificó mediante centrifugación y filtración con un filtro de 0,45 uM. El virus se aplicó a células T humanas primarias en una placa de retronectina. Se añade IL2 en algunas condiciones, o no se añaden citocinas en otras condiciones.

Ejemplo 5 - Comparación de fenotipos de subconjuntos de células T de células estimuladas con vector lentivírico frente a células estimuladas con perlas recubiertas de anticuerpo antiCD3/antiCD28

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica usando técnicas convencionales. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se trataron después con cualquiera de:

(i) perlas recubiertas de anticuerpo antiCD3/antiCD28 (Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28) en una proporción de 3:1 en presencia de vector lentivírico no modificado e IL15/IL7; o

(ii) vector lentivírico que expresa OKT3 y 15E8B (combinación 3 como se describe en el Ejemplo 4) en una placa recubierta con retronectina en presencia de IL15 e IL7.

Después de 48 horas, las células se recolectaron y se tiñeron con un panel de anticuerpos de fenotipado de células T, como sigue:

aCD4-BV650

aCD8-PE.Cy7

aCD45RO-BV605

aCD45RA-FITC

aCD95-PB

aCD197-BV685

Los subconjuntos de células T se analizaron mediante FACS y los resultados se resumen en la Figura 11. Para ambos de los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+, las células estimuladas con virus mostraron una mayor proporción de células T vírgenes (Tn y Tscm) que las células estimuladas con perlas recubiertas de anticuerpos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector retrovírico o lentivírico que tiene una envuelta vírica que comprende:

2. El vector vírico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una proteína transmembrana activadora de células T basada en citocinas que comprende una citocina seleccionada de IL2, IL7 e IL15.

3. Un vector vírico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la envuelta vírica también comprende: (iii) una proteína de etiquetado que comprende:

un dominio de unión que se une a un resto de captura; y

un dominio transmembrana

4. Un vector vírico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de células T o un receptor de antígeno quimérico.

5. Una célula hospedadora que expresa, en la superficie celular,

en donde la célula hospedadora produce un vector retrovírico o lentivírico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

6. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 5, que también expresa, en la superficie celular:

(iii) una proteína de etiquetado que comprende:

un dominio de unión que se une a un resto de captura; y

un dominio transmembrana

de tal manera que un vector retrovírico o lentivírico producido por la célula de empaquetamiento sea como se define en la reivindicación 3.

7. Una célula de empaquetamiento que es una célula hospedadora como se define en la reivindicación 5 o 6 que también comprende uno o más de los siguientes genes: gag, pol, env y/o rev.

8. Una célula productora que es una célula hospedadora como se define en la reivindicación 5 o 6 que comprende los genes gag, pol, env y opcionalmente rev y también comprende un genoma retrovírico o lentivírico.

9. Un método para fabricar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, una célula de empaquetamiento de acuerdo con la reivindicación 7 o una célula productora de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende la etapa de transducción o transfección de una célula con un ácido nucleico que codifica una primera proteína transmembrana activadora de células T mitogénica y una segunda proteína transmembrana activadora de células T mitogénica.

10. Un método para producir un vector vírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende la etapa de expresar un genoma retrovírico o lentivírico en una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

11. Un método para producir una célula T transgénica activada o una célula citolítica natural (NK), que comprende la etapa de transducción de una célula T o NK con un vector vírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, de tal manera que la célula T o la célula NK sea activada por una o más proteínas transmembrana activadoras de células T mitogénicas.

12. Un kit para preparar un vector retrovírico o lentivírico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende cualquiera de:

A.

(i) una célula hospedadora como se define en la reivindicación 5 o 6;

(ii) ácidos nucleicos que comprenden gag, pol, env y opcionalmente rev; y

(iii) un genoma retrovírico; o

B.

(i) una célula de empaquetamiento como se define en la reivindicación 7; y

(ii) un genoma de vector retrovírico o lentivírico.

13. Un kit para fabricar una célula de empaquetamiento de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende:

(ii) ácidos nucleicos que comprenden genes retrovíricos gag, pol, env y opcionalmente rev.

14. Un kit para fabricar una célula productora de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende:

(ii) ácidos nucleicos que comprenden genes retrovíricos gag, pol y env y opcionalmente rev; y

(iii) un genoma de vector retrovírico o lentivírico.

15. Una partícula similar a un virus (VLP) que tiene una envuelta vírica que comprende:

en donde la proteína transmembrana activadora de células T mitogénica no es parte de una glucoproteína de la envuelta vírica.