CN101124248A - 结合域融合蛋白 - Google Patents

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CN101124248A CNA2005800345222A CN200580034522A CN101124248A CN 101124248 A CN101124248 A CN 101124248A CN A2005800345222 A CNA2005800345222 A CN A2005800345222A CN 200580034522 A CN200580034522 A CN 200580034522A CN 101124248 A CN101124248 A CN 101124248A
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Abstract

本发明涉及治疗疾病、病症和状况的构建体和方法，所述疾病、病症和状况包括相关于或涉及自身免疫病、炎症、细菌、真菌和病毒感染那些，以及由细胞的不受控制或异常增殖，包括癌症导致或与其相关的疾病。

Description

结合域融合蛋白
发明领域
该领域包括蛋白和肽、所述肽和蛋白的制备和用途及编码其的核酸，以及预防和治疗状况、疾病和病症的方法，所述状况、疾病和病症可以通过施用例如本发明的多肽和/或核酸构建体而改善、减轻或缓解，包括例如炎症、感染和癌症以及不受控制的细胞增殖的其它状况、疾病和病症。
发明背景
以下包括可以用于理解本发明的信息。并不是承认此处提供的任何信息都是目前描述或要求保护的发明的现有技术或与所述发明相关，或具体并特意引用的任何公开文献或文件都是现有技术。
很多疾病、病症和状况都涉及炎症。炎症是一种复杂的多因素过程。不受控制的炎症对组织是破坏性的，并且加重疾病症状。导致炎症的疾病、病症和状况包括，例如，细菌感染、真菌感染和病毒感染。涉及不利的或不受控制的细胞增殖的疾病、病症和状况通常也具有炎症成分。这些包括，例如，涉及新血管形成和血管形成的疾病、病症和状况，包括癌症和其它增殖性疾病。
细胞因子形成了负责起始、调节和终止炎症反应的一类主要的化学介质。它们的合成、开和关机制以及它们的作用模式在细胞因子网络中受到紧密调节。早期细胞因子，如白介素-I(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF)在炎症开始后1小时内非常迅速地合成，或反应于诸如细菌脂多糖(LPS)的刺激而合成。细胞因子驱动诸如中性粒细胞和单核细胞的炎症细胞的迁移，所述炎症细胞的功能是去除造成损伤的物质并且恢复体内稳态。
认为炎症细胞采用多种蛋白酶，包括中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞金属蛋白酶和弹性蛋白酶，以便从血管间隙迁移出来，通过间质进入炎症位点。Sallenave J.R.，2000’Resp.Res.，1：87-92。对关节炎和肿瘤进展的研究报道了蛋白酶，特别是金属蛋白酶(MMPs)，在细胞外基质更新中起关键作用。Hayashi，T.et al.，1997 Hum.Pathol. 28，1071-1078。尽管这些蛋白酶在炎症和许多其它生物过程中起关键作用，但会存在不良的蛋白酶相关作用和与蛋白酶相关的病症。例如，当在炎症部位分泌或异常释放丝氨酸蛋白酶弹性蛋白酶时，会导致严重的组织破坏，并且会破坏广泛的结缔组织成分，如弹性蛋白酶、蛋白聚糖和胶原。Wolters，P.J.，and Chapman，H.A.，2000 Respir.Res.1，170-177。
蛋白酶也与很多疾病和病症相关。例如，已经报道了半胱氨酸蛋白酶参与类风湿性关节炎。Duffy，J.M. et al.，1994 Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.32，429-434。通过在组织重塑和癌细胞侵入中起作用，蛋白酶与诸如癌症的增殖性疾病相关。作为具体实例，已经描述了半胱氨酸蛋白酶在生理和病理过程中起作用，并且参与癌症侵入和转移。Mignatti，P.，and Rifkin，D.B.，1993 Phsyiol.Rev.73：161-195。已经报道了半胱氨酸蛋白酶参与肺气肿(Chapman，H.A.，et al.，1994 Am.J.Respir.Crit.Care Maed.150：155-159)、肌萎缩(Takeda，A.，et al.，1992Biochem.J.288：643-648和阿尔茨海默病(Marks，N.，et at.，1995 Int.J.Peptide Protein Res.46：306，313)。从细胞释放的溶酶体半胱氨酸蛋白酶降解细胞外胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白，导致对基质的有害作用，如Wolters，P.J.，and Chapman，H.A.，2000 Respir.Res.1：170-177中的综述。蛋白酶-3是人类多形核白细胞中的一种天然丝氨酸蛋白酶，并且以高水平存在于Wegnener肉芽肿中，所述Wegnener肉芽肿是诸如肾、鼻和肺的器官一种严重的血管炎。蛋白酶-3上调会导致肺损伤，并且，控制所述蛋白酶的活性，能够提供针对涉及抗中性粒细胞细胞质自身抗体的疾病的治疗。Brockman，H.Et al.，2002 Arthritis Res.4：L220-225。
也已经鉴定了蛋白酶的蛋白抑制剂，其调节蛋白酶并且消除它们的潜在有害作用。这些蛋白酶抑制剂称作“抗蛋白酶”，并且分成不同的家族。基于它们的调节和生物作用，将抗蛋白酶分类为“警戒”抑制剂和“系统”抑制剂。Sallenave J.R.，2000 Resp.Res.，1：87-92。
已经报道了警戒型蛋白酶组包括抗白细胞蛋白酶(ALP)家族的两种低分子量蛋白酶抑制剂，包括(i)ALP，有时也称作分泌型白细胞蛋白酶抑制剂或SLPI(Stolk，J.And I liemstra，P.，1998 Molecular Biologyof the Lung，vol.I::In Emphysema and Infection.Edited by Stockley RA.Basel：Birkhauser，55-68)，和(ii)弹性蛋白酶抑制剂(ESI，有时也称作抑弹性蛋白酶蛋白或SKALP；Schalkwijk J，et al.，1999 BiochemJ340：569-577)。
最近，已经提出了用名称“捕获蛋白(trappin)”基因家族来统一表示这组蛋白。″捕获蛋白″是转谷氨酰胺酶底物和含有wAP结构域的蛋白的缩写，表示这种蛋白捕获在组织内，并且作为锚定的蛋白的能力。Schalkwijk，J.et at.，supra。已经通过含有甘氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-脯氨酸-缬氨酸-赖氨酸(GQDPVK)共有序列的六肽重复的N-末端转谷氨酰胺酶底物结构域和折叠成4个二硫化键核心的C-末端抑制剂(WAP)结构域定义了捕获蛋白家族成员。ALP/SLPI称作捕获蛋白-1，而SKALP/抑弹性蛋白酶蛋白称作捕获蛋白-2，因为它是鉴定为捕获蛋白家族的第二种蛋白。Schalkwijk，J.et al.，supra。
报道作为捕获蛋白的活性蛋白酶抑制结构域的C-末端WAP结构域的特征在于具有形成4个二硫键的8个半胱氨酸残基，所述二硫键的功能是稳定结构域。Schalkwijk，J.et al.，supra。已经通过X线晶体学解析了捕获蛋白-1和捕获蛋白-2的三维结构，并且发现这些蛋白的WAP结构域共有相同的二硫键分布和抑制活性中心中的共同甲硫氨酸残基。Grutter，M.G.et al.，.1988 EMBO J.7：345-351；Tsunemi，M.，et al.，1996 Biochemistry 35：11570-11576。报道了每个WAP结构域中的多肽链以伸长的螺旋形式排列，所述排列是通过结构域的两个内部链形成的规则β-发夹环，所述内部链伴随了通过蛋白酶结合片段连接的两个外部链，每个结构域包括4个二硫键。认为第二个结构域包括具有弹性蛋白酶和糜蛋白酶结合特性的反应环，其在Leu72和Met73之间存在易断裂键。报道这些肽片段似乎具有与其它丝氨酸蛋白酶抑制剂在一定程度上相似的构象。Grutter，M.G.et al.，supra。
已经报道了N-末端转谷氨酰胺酶底物结构域具有富含谷氨酰胺和赖氨酸残基的重复序列。认为这些残基在异肽键形成中分别作为酰基供体和受体位点。该结构域的总长度在各个物种间不同，报道了人捕获蛋白具有该结构域序列的5个重复。
认为捕获蛋白-1与SLPI相同。Thompson，R.C.，and Ohlsson，K.，1986 Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82：6692-6696；Saheki T.，et al.，1992Biochem.Res.Commun.185：240-245。捕获蛋白-1/SLPI被描述为11.7kDa的蛋白，包含107个氨基酸残基，其中包括16个半胱氨酸残基，形成8个二硫键。SLPI被描述为具有飞镖的形状。根据Grutter et al.，supra的描述，SLPI的两个部分的结构域边界是天冬氨酸52，其中残基1-51(Val)形成第一个结构域，残基53(Thr)-107(Ala)形成第二个结构域，两个结构域之间只有很少的非共价接触。核心包含少量疏水性氨基酸残基，并且包含一些极性残基，其中的一些在核心内以静电相互作用形成氢键。Grutter et al.，supra。以前也将可能与捕获蛋白-1相同或相似的分子称作钠/钾ATP酶抑制剂-1或SPAI-2(Araki，K.，et al.，1989 Biochem.Biophys.Res.49076.000017 Commun.164：496-502)、抗白细胞蛋白酶或ALP(Klasen，E.E.，and Kramps，J.A.，1986 Biochen.Biophys.Res.Commun.128：285-289)、人精液抑制剂或HUSI-1(Schiessler，H.，et al.，1976 Hoppe-Seyler′s Z Physiol.Chem.357：1251-1260；Seemuller，U.，et al.，1986 FEBS Lett.199：43-48)、乳清酸性蛋白家族成员(Drenth，J.，et al.，1980 J.Biol.Chem.255：2652-2655)、ALP/HUSI-I(Wingens，M.，et al.，1998 J.Invest.Dermatol.111：996-1002BSI-ATE(Hochstrasser.K，et al.，1981 Hoppe-Seyer′s Z. Physiol.Chem.362：1369-1375)、支气管粘液抑制剂(BMI)、粘液蛋白酶抑制剂(MPI)，以及捕获蛋白-4和捕获蛋白-5(Zeeuwen et al.，1997 Biol Chem.272(33)：20471-8)。
Kuroki et al.，1995 J.10 Biol.Chem.270：22428-22433报道了猪SPAI-2的一级结构。将其描述为具有187个氨基酸的蛋白，包括具有21个氨基酸的疏水性前序列，其后是具有166个氨基酸的序列，其中前105个氨基酸(末端是天冬氨酸126)称作前序列，除去该前序列，得到含有61个氨基酸的SPAT-2(以脯氨酸127开始)。将该蛋白描述为具有16个六肽重复，所述重复与抑弹性蛋白酶蛋白TGase结构域中的重复序列高度同源，因此作者概括，其作为锚，将抑弹性蛋白酶蛋白共价定位于细胞外基质蛋白上的特定位点。Kuroki et al.，1995，supra。
已经报道了通过hSLPI中的保守Leu72残基的突变而产生的具有改变的蛋白酶抑制(PI)活性的SLPI突变蛋白，减少了对弹性蛋白酶、糜蛋白酶和/或胰蛋白酶的PI活性。参见Eisenberg，et al.，1990 JBC 265(14)：7976-7981。已经报道了具有减小的PI活性的SLPI突变蛋白不具有促转移或致肿瘤可能，这与母体分子相反(Devoogt，et al.，2003 Proc NatlAcad Sci.100(10)：5778-82)，这可能与保护progranulin免受蛋白水解消化的能力缺陷相关(He，Z.and Bateman，A.，2003 J Mol Med.81(10)：600-12)，或保护前上皮蛋白免于转化为上皮蛋白的类似能力的缺陷相关(Zhu，et al.2002 Cell.111(6)：867-78)。此外，PI缺陷的SLPI变体失去了由肺细胞(Mulligan，M.，et al.，2000.Am J Pathol.156(3)：1033-9)或LPS诱导的单核细胞(Taggart，C.，et al.，2002.J Biol Chem.277(37)：33648-53)产生NFκB的能力。但是，SLPI突变蛋白保留了其它特性，包括单核细胞前列腺素H合酶-2的抑制，导致LPS或ConA刺激的巨噬细胞的PGE2和MMP产量较低(Zhang，et al.，1997 JCI 5：894-900)，并且抑制单核细胞的病毒感染(McNeely，T.，et al.，1997 Blood90：1141-1149)。因此，SLPI具有多种功能，其中的一些依赖于其PI活性，另一些则不是。
由两个不同的小组独立发现了捕获蛋白-2或皮肤来源的抗白细胞蛋白酶。Wiedow，O.，et al.，1990 J.Biol.Chem.265：14791-14795，Schalkwijk，J.，et al.，1990 Br.J.Dermatol.122：631-641。在用蛋白进行研究的小组中，一个小组将其命名为“抑弹性蛋白酶蛋白”，因为它能够抑制弹性蛋白酶，另一小组将其命名为皮肤来源的抗白细胞蛋白酶(或″SKALP″)，因为它在结构上与乳清酸性蛋白，或″WAP″的抗白细胞蛋白酶相似，WAP是一个蛋白家族，其具有四个二硫化物核心蛋白。SKALP中的一个差异是与WAP家族当时已知的成员不具有相似性的N末端结构域。该结构域被认为是转谷氨酰胺酶底物，并且称作“cementoin”。抑弹性蛋白酶蛋白中的TGase序列与豚鼠中形成阴道栓的一部分的精囊腺蛋白同源。Nara，K.，et al.，J.Biochem.(Tokyo)115：441-448，1994。成熟的捕获蛋白-1(SLPI)不具有氨基末端TGase底物结构域。
捕获蛋白-2含有高变区，其被认为是与弹性蛋白酶相互作用的区域。这三个包含高变区的残基是Ala-24，Met-25和Leu-26。捕获蛋白家族其它成员中的该区域也可以作为蛋白酶的特异性决定因子。已经报道了抑弹性蛋白酶蛋白的10个残基参与其与弹性蛋白酶的相互作用，包括三个已经鉴定为抑弹性蛋白酶蛋白的高变区的残基。最初将捕获蛋白-2鉴定为非SLPI、低分子量、抗弹性蛋白酶。Hochstrasser K，et al.，1981 Hoppe-Seyler′s Z Physiol Chem 362：1369-1375；Kramps JA，和Klasen EC，1985 Exp Lung Res 9：151-165；综述于Sallenave J-M，et al.，supra。捕获蛋白-2报道为与抑弹性蛋白酶蛋白相同。Wiedow，O.，et al.，1990 supra。可能与捕获蛋白-2相同或相似的分子有时也称作皮肤来源的抗白细胞蛋白酶或SKALP(Schalkwijk，J.，et al.，1991 supra、抑弹性蛋白酶蛋白/SKALP和弹性蛋白酶特异性抑制剂(ESE)(Sallenave，J.-M.，et al.，1992 Biol.Chem.Hoppe Seyler 373：27-33)。
抑弹性蛋白酶蛋白分子显示出与SLPI的C-末端部分约38％的同源性，报道了两种抑制剂的活性位点是相似的。Francart，et al.，1997 J.Mol.Biol.268：666-677。类似于SLPI，抑弹性蛋白酶蛋白具有高含量的半胱氨酸残基，它们以C末端蛋白酶抑制区中的四个二硫键排列。重组抑弹性蛋白酶蛋白(r-抑弹性蛋白酶蛋白)的NMR色谱研究表明，蛋白具有扁平的核心和柔性氨基末端，据报道，中心的卷曲发夹的侧翼是两个外部单位。Francart，et al.，1997 supra。根据Francart et al.，据报道残基14-57具有盘状片段，认为其导致二维结构，其假定r-抑弹性蛋白酶蛋白具有双链，由主链氢键稳定卷曲的β折叠形成。认为核心β折叠通过半胱氨酸23-半胱氨酸49二硫键连接于外部结合环。认为溶液中该环中的灵活性和移动性与在其它蛋白酶抑制剂，如牛胰蛋白酶抑制剂中观察到的相似。Kraumsoe，J.A.，et al.，1996 Biochem.35：9090-9096。据报道，残基47-50形成β转角，据报道，两个二硫键(半胱氨酸14-半胱氨酸21和半胱氨酸28-半胱氨酸31)将r-抑弹性蛋白酶蛋白的中心β-发夹连接于两个外部片段，并且产生螺旋基序，其中每个外部链与其在中心β-折叠中的相应链平行。认为两个外部片段通过包含与例如弹性蛋白酶相互作用的位点的环(残基22-27)连接。根据Francart等人的文献，易断裂的肽键预测在A1a24和Met25之间，并且这一点得到了报道的证实，这是通过与猪胰腺弹性蛋白酶复合的抑弹性蛋白酶蛋白的晶体学结构证实的。Tsunemi，et al.，1996 Biochem.35：11570-11576。
抑弹性蛋白酶蛋白，即弹性蛋白酶的一种低分子量抑制剂，具有WAP基序和TGase的氨基酸序列底物，并且，纯化的SKALP/抑弹性蛋白酶蛋白是用于转谷氨酰胺酶交联的底物，Molhuizen，H.O.F.，et al.，1992 J.Biol.Chem.268：12028-12032，其辅助使蛋白酶抑制剂固定于表皮蛋白和角质化包膜。抑弹性蛋白酶蛋白是作为一种大前体蛋白分子合成的，其具有独特的生物学特征，包括共价结合于表皮蛋白的能力。抑弹性蛋白酶蛋白存在于一些炎性皮肤病的表皮中，但不存在于正常人表皮中。SKALP/抑弹性蛋白酶蛋白存在于牛皮癣表皮上基底层的分化的角质形成细胞中。Schwalkjik，J.，et al.，1993 J.Invest.Dermatol.100：390-293。
捕获蛋白由含有三个外显子的2千碱基单拷贝基因编码。第一个外显子编码5’非翻译区、信号肽和蛋白的第一对氨基酸残基。第二个外显子含有编码大部分蛋白的序列，第三个外显子编码3’非翻译区。在捕获蛋白家族的成员中存在内含子序列的高度保守性。人捕获蛋白-2基因(SKALP)位于染色体20上。捕获蛋白家族中这些基因的两个结构域结构被认为是通过外显子改组而进化的，因为很多蛋白与这些捕获蛋白基因具有相同的基序。研究者认为SLPI基因和称作REST基因的一组基因的外显子改组和基因复制产生了捕获蛋白基因。
在基因水平，在人染色体20q12-13.1上鉴定了含有14个编码与WAP结构域具有同源性的蛋白的基因。Clauss，A.，et al.，2002 Biochem.J.368：233-242。在这14个基因中包括了抑弹性蛋白酶蛋白、SLPI、人附睾基因产物4、eppin和huWAP2。也已经将具有4个二硫化物核心蛋白的huWAP2(编号AY037803)描述为推定的蛋白酶抑制剂。Lundwall，A.，and Clauss，A.，2002 Biochem.Biophys.Res.Commun.290：452-456。已经鉴定了抑弹性蛋白酶蛋白超家族的至少3个密切相关的成员，并且已经提出了通过加速进化激发了它们的基因。Tamechika et al.，1996 J.Biol Chem.271：7012-7018。抑弹性蛋白酶蛋白和SLPI的羧基末端结构域之间的一级序列同一性据报道是大约38％。Tamechika et al.，supra。已经发现了来自不同物种的一些与SLPI和抑弹性蛋白酶蛋白同源的基因。Schalkwijk，J.，et al.，1999 Biochem.J.340：569-577；Zeeuwen，P.L.J.M.，et al.，1997J.Biol.Chem.272，20471-20478；Furutani，Y.，et al.，1998 J.Biochem(Tokyo)124：491-502。
已经至少部分表征了捕获蛋白家族蛋白抑制的蛋白酶。已经报道了SLPI抑制糜蛋白酶和胰蛋白酶(Smith，C.E.，and Johnson，D.A.，1985Biochem.J.225：463-472)、人肥大细胞类糜蛋白酶(Walter，M.，et al.，1996 Arch.Biochem.Biophys.327：81-88)、角质层糜蛋白酶(Franzke，C.W.，et al.，1996J.Biol.Chem.271，21886-21890)、人白细胞弹性蛋白酶(Ying，Q.L，et al.，1994 Biochemistry 33：5445-5450)；人组织蛋白酶G(Smith，C.E.，et al.，1985 Biochem.J 225：463-472)、牛糜蛋白酶(Wiedow，O.，et al.，1993 Adv.Exp.Med.Biol.336：61-64)、猪糜蛋白酶(Smith，C.E.，et al.，1985)和类胰蛋白酶(Beppu，Y.，et al.，J.Biochem.121：309-216，1997)。已经描述了捕获蛋白-2抑制人白细胞弹性蛋白酶(Ying，Q.L. and Simon，S.R.，1993 Biochemistry 32：1866-1874)、猪胰腺弹性蛋白酶(Wiedow，O.，et al.，1993 Adv.Exp.Med.Biol.336：61-64)，和角质层糜蛋白酶(Franzke，C.W.，et al.，1997 in Proteolysis in CellFunctions，pp.438-446，IOS Press，Amsterdam)。
最初在牛皮癣患者皮肤中发现的捕获蛋白-2/抑弹性蛋白酶蛋白的表达，似乎在正常皮肤中很低，但可以由创伤或刺激而诱导。抑弹性蛋白酶蛋白中信号序列的存在表明，蛋白是分泌的。在伤口愈合过程中，认为抑弹性蛋白酶蛋白的表达增加，因为角质形成细胞是通过激活的中性粒细胞增加的环境而迁移的，所述激活的中性粒细胞分泌蛋白酶，如弹性蛋白酶和蛋白酶。参见Alkemade，Hans，A.C，et al.，(1994)″Demonstration of Skin-Derived Antileukoproteinase(SKALP)and ItsTarget  Enzyme  Human  Leukocyte  Elastase  in  Squamous  CellCarcinoma，″Journal of Pathology 174：121-129；Alkemade，J.A.C.，et al.，(1994)″Skalp/elafin is an inducible proteinase inhibitor in humanepidermal keratinocytes，″Journal of  Cell Science.107：2335-42.；Boelsma，Esther，et al.(1998)″Expression of Skin-DerivedAntileukoproteinase(SKALP)in Reconstructed Human Epidermis andIts Value as a Marker for Skin Irritation，″Acta Derm.Venereol.78：107-113；Goselink，Henriette M.，et al.，(1996)″Colony Growth of HumanHematopoietic progenitor Cells in the Absence of Serum Is Supported bya Proteinase Inhibitor Identified as Antileukoproteinase，″The Journalof Experimental Medicine.184：1305-12；Kuijpers，Astrid，L.，(1996)″SKALP is decreased in pustualr forms of psoriasis.A clue to thepathogenesis of pustule formation？″Archives of DermatologicalResearch 288：641-7；Molhuizen，Henri O.F.，(1995)；″Structural，Biochemical，and Cell Biological Aspects of the Serine ProteinaseInhibitor SKALP/Elafin/ESI，″Biological Chemistry Hoppe-Seyler376：(1)1-7；Schalkwijk，Joost，et al.，(1999)″The trappin gene family：proteins defined by an N-terminal transglutaminase substrate domainand C-terminal four-disulphide core，″Biochem.J.340：569-577。
警戒型蛋白酶抑制剂SLPI和抑弹性蛋白酶蛋白可能是局部的、可诱导的抗蛋白酶防御网络的第一个波的一部分，所述网络即强效的、局部产生的弹性蛋白酶抑制剂，其具有使它们首先存在于炎症起病部位的特征。已经将所述蛋白酶描述为反应于诸如IL-1和TNF的主要细胞因子而在损伤部位局部合成和分泌。Sallenave J.M.，1994 et al.，Am JRespir Cell Mol Biol，11：733-741。报道了诸如细菌LPS、IL-1、TNF、中性粒细胞弹性蛋白酶和防御蛋白的警戒信号能够启动蛋白酶抑制剂的产生。Schalkwijk J.et al.1994，supra；Van Wetering S，et al.，2000 AmJPhysiol Lung Cell Mol Physiol 278：L51-L58；Jin FY，et al.，1998 InfectImmun 66：2447-245。相反，抗炎和重塑细胞因子，如转化生长因子-β可能使所述产生停止(对于SLPI，参见例如Jaumann F，et al.，2000Eur Respir J 15：1052-1057)。
据报道，包括α1-蛋白酶抑制剂(A1-Pi)和抗糜蛋白酶的系统型蛋白酶抑制剂主要通过细胞因子，如IL-6家族的细胞因子(如IL-6和制癌蛋白M)的后一个波而上调。Sallenave J.M.，2000 Resp.Res，1：87-92。描述了干扰素-γ抑制巨噬细胞中LPS诱导的SLPI上调，可能表明在天然和获得性免疫之间的界面上SLPI的调节。Jin F.Y.，et al.，1997 Cell88：417-426。
也认为抗蛋白酶参与调节免疫系统功能。例如，已经描述了SLPI可能在单核细胞的信号传导途径中起作用。也已经报道了SLPI抑制单核细胞前列腺素H合酶-2(PGHS-2)和基质金属蛋白酶的产生(Zhang，Y.，et al.J.，Clin.Invest.99：894-900，1997)。SLPI的抑制作用不一定依赖于其抑制蛋白酶活性的能力，因为也描述了具有显著更低的抗蛋白酶活性的SLPI的突变蛋白抑制PGHS-2和基质金属蛋白酶的诱导。作者也概括了通过干扰导致单核细胞产生基质金属蛋白酶的信号传递途径，SLPI可作为强效的抗炎剂。Zhang，Y.，supra。已经描述了将重组SLPI加入人单核细胞或用SLPI或抑弹性蛋白酶蛋白转染巨噬细胞，可以下调LPS刺激时诸如TNF和基质金属蛋白酶的炎症介质。参见Zhang Y，etal.，1997 J Clin Invest 99：894-900。它也可以直接(通过结合LPS)或通过例如下调核因子-κB功能而间接(以反馈模式干扰LPS)干扰。Lentsch AB，et al.，1999 Am J Pathol 154：239-247。
已经推测抗蛋白酶在调节免疫系统功能中的一种可能的作用模式是通过蛋白酶3。蛋白酶3以高浓度存在于人中性粒细胞中(Campbell，E.J.，1999 et al.，J.Immunol.165：3366-3374，1999)；已经报道了抑弹性蛋白酶蛋白抑制蛋白酶3活性。Sallenave，J.-M.，et al.，Biol Chem HoppeSevler.373：27-33.，1992。也已经提出了SLPI除了作为蛋白酶抑制剂的作用外，具有额外的作用模式，包括上调肺组织中的再生基因。也已经报道了SLPI对人肺成纤维细胞中的肝细胞生长因子产生的上调。Kikuchi et al.，2000 Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.23：364-370。
在肺中，报道了SLPI通过气管、支气管、细支气管和II型肺泡细胞体外产生，并且由单核细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞产生。参见Sallenave J.M.，et al.，1997 J Leukoc Biol 61：695-702。也已经描述了SLPI由气管浆液腺和细支气管Clara细胞体内产生，并且与肺泡间质中的弹性蛋白纤维缔合。Stolk and Hiemstra，supra。在肺外，报道了其在多个粘膜部位分泌(导致其另一个名称，即粘膜蛋白酶抑制剂)。Stolk and Hiemstra，supra。也已经报道了SLPI在支气管和子宫颈粘膜(Ohlsson，K.，et al.，1977 Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem 357(5)：583-589)、精浆(Schiessler，H.，et al.，1976 Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.357：1252-1260)和腮腺和颌下唾液腺(Ohlsson，M.，et al.，1983 Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.364：1323-1328；Thompson，R.C.，和Ohlsson，K.，1986 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：6692-6696)分泌。
如上文指出的，蛋白酶和蛋白酶在疾病中起作用。丝氨酸蛋白酶参与呼吸和免疫病症，包括哮喘的病理生理。哮喘患者气道中的白细胞丝氨酸蛋白酶和肥大细胞增加。Wenzel et al.1988，Am Rev Respir Dis137：1002-1008，Fahy et al.，1995 J Allery，Clin Immunol 95：843-852。据报道，SLPI在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者(Sallenave，J.-M.，et al.，1999 Eur.Respir.J.14：1029-1036)、肺炎患者(Asano，S.，et al.，1995 Am.J.Respir.Crit.Care Med.151：1576-1581)和发热患者(Duits，L.A.，et al.，2003 Clin.Microbiol.Infect.9：605-613)中增加；这与SLPI在炎症反应中作为警戒抑制剂的功能一致。也报道了在ARDS中，与对照受试者相比，抑弹性蛋白酶的表达在支气管肺泡灌洗液中显著增加。SallenaveJ.M，et al.，Eur Respir J 1999，supra。
也已经描述了抑弹性蛋白酶蛋白在很多其它组织的粘膜部位的存在。已经报道了捕获蛋白-2存在于支气管分泌液(Sallenave JM，andRyle AP，1991 Biol Chem Hoppe-Seyler 372：13-21)和皮肤(Wiedow et al.(1990)，supra；Molhuizen et al.，1993 J Bial Chem 268：12028-12032)中。抑弹性蛋白酶蛋白在肺细胞系中表达，并且认为其在外周肺组织的炎症中起作用。报道了抑弹性蛋白酶蛋白的一种抑弹性蛋白酶蛋白免疫反应性物质(12-14kD)由A549肺癌细胞分泌，并且报道了两种抑弹性蛋白酶蛋白免疫反应性物质(12-14kD和6kD)由NCI-H322肺癌细胞分泌。Sallenave，J.M，etal.，1993 Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.8：126-133。这些细胞系分别具有II型肺泡细胞和Clara细胞的特征，因此可能在外周肺对中性粒细胞弹性蛋白酶的防御中的炎症过程中起II型肺泡细胞的作用。
已经报道了蛋白酶抑制剂在体内减少抗原诱导的应答，Clark etal.，1995 Am J Respir Crit Care Med 152：2076-2083，Fujimoto et al.，1995 Respir Physiol 100：91-100，并且认为SPLI在一些呼吸疾病，如急性呼吸窘迫综合征、哮喘、囊性纤维化、肺炎(Reid，P.T.，and Sallenave，J.M.，2001 Curr.Opin.Invest.Drugs 2，59-67)和肺气肿(Knight，K.R.，etal.，Respirol.2，91-95，1997)中起作用。描述了SLPI的施用在哮喘的动物模型中是有益的，这是通过以下方法确定的：(i)在慢性过敏原暴露后抑制白细胞流入气道，(ii)防止抗原诱导的气管粘液流速降低，和(iii)抑制晚期支气管收缩和高反应性的发展。Wright，CD.，et al.，1999-.1.Pharmacol.Exp.Ther.289：1007-1014。
已经报道了rSLPI是抗炎症刺激的保护剂。Lucey，E.C.，et al.，J.Lab.Clin.Med 115：224-232；Vogelmeier，C.，et al.，J.Clin.Invest.87：482-488，1991。通过用人白细胞弹性蛋白酶进行气管内处理，可以诱导炎症刺激。在这些研究中，描述了在施用0.25mg人中性粒细胞弹性蛋白酶前8小时气管内滴注3mg重组SLPI，导致了抗诱导肺气肿和分泌细胞化生的保护作用。也报道了分别在施用后1和4小时，通过肺灌洗可以回收59％的rSLPI和44％的rSLPI，表明半衰期是大约2小时。Lucey，E.supra；Vogelmeier et al.，supra。已经描述了SLPI缺陷小鼠(SLPI-/-)比亲代株(SLPI+/+)对LPS诱导的内毒素休克具有更高的易感性，Nakamura，A.，2003 et al.，J.Exp.Med.5：669-674，这与SLPI可以减弱过多的免疫应答和辅助天然免疫平衡的概念一致。
炎症是很多疾病、病症和状况中的主要因素。炎症在例如囊性纤维化肺疾病的致病过程中起主要作用。已经提示了囊性纤维化的基本原因是抗蛋白酶多于蛋白酶，恢复这两类酶的平衡可以提供有益效果。Birrer P.，1995 Respiration 62(Suppl.l)：25-8。不幸的是，给CF患者施用SLPI受到了短半衰期和重组产品不容易到达囊性纤维化患者的病变区域的阻碍(综述于Stolk and Hiemstra，supra)。作者评论了囊性纤维化的其它新的抗炎治疗是有益的。Oermann，C.M.，Curr.Opin.Invest.Drugs 2，900-996，2001；Reid，P.T.，和Sallenave，J.-M.，Curr.Opin.Invest.Drugs 2，59-67，2001。
已经报道了细菌LPS能够上调巨噬细胞的体外SLPI产量(Jin FY，et al.，1998 Infect Immun 66：2447-2452)，并且报道了SLPI和抑弹性蛋白酶蛋白具有体外抗微生物特性。Schalkwijk J (1999)，et al.，supra；Simpson AJ，et al.，1999 FEBS Lett 452：309-313。据报道，SLPI和抑弹性蛋白酶蛋白有效抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。综述参见Schalkwijk，J.，Wiedow，O.，and Hirose，S.，1999 Biochem.J.340：569-577；Sallenave，J.-M.，2000 Respir.Res.1：87-92；Sallemave.J.-M.，2002 Biochem. Soc.Trans.30：111-115；Hiemstra，P.S.，Biochem.Soc.Trans.30：116-120，2002；Tomee，J.F.，C.，et al.，1998 Thorax 53：114-116；和Rogers，D.F.，andLaurent，G.J.，1998 Thorax 53：200-203。
报道了从小鼠克隆了两种新的抗菌WAP基序蛋白SWAM1和SWAM2。Hagiwara et al.，2003 J.Immunol.170：1973-1979。描述了这两种蛋白都具有与SLPI和抑弹性蛋白酶蛋白同源的单个WAP结构域。在10μM的浓度，报道了SWAM1和SWAM2都将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制了90％。Hagiwara et al.，supra。也已经报道了rSLPI能够抑制致病真菌(以微摩尔范围的浓度)，例如烟曲霉和白色假丝酵母。报道了静息的烟曲霉抗rSLPI，但当诱导细胞成为代谢活性时，变得对rSLPI敏感。报道了SLPI的氨基末端结构域具有抗真菌活性。Tomee，J.F.C.et al.，1997 J Infect Dis 176：740-747。
口腔分泌液中的SLPI也能够抗病毒感染，例如，抗HIV-1感染。Shine，N.，et al.，J.Dent.Res.76：634-640，1997；Wahl et al.，Oral.Dis.3(Suppl1)：S64-S69，1997；Shugars，D.E.，J.Infect.Dis.179(Suppl.3)：S431-S435，1999；Shugars，D.C.，et al.，Arch.Oral Biol.44：445-453，1999。参见Shine et al.，Bioorg.Chem.30：249-263，2002。存在一些报道，即rSLPI能够抑制巨噬细胞和原代T细胞的HIV-1感染。Wahl，S.M.，et al.(1997)，supra；Shugars，D.E.，J.Infect.Dis.179(Suppl.3)：S431-S435，1999；Shugars，D.C.，et al.(1999)，supra；McNeely，T.B.，et al.，J.Clin.Invest.96：456-464，1995；McNeely，T.B.，et al.，Blood 90：1141-1149，1997；Shugars，D.C.，et al.，Oral.Dis.3(Suppl.1)：70-S72，1997。已经报道了SLPI不防止人T细胞系、外周血淋巴细胞和原代巨噬细胞上的HIV-1感染(Turpin，J.A.，et al.，1996 Antivral Res.29，2269-277)，并且也报道了巨噬细胞的各种保护(Konopka，K.，tal.，J.Dent.Res.78：1773-1776，1999)。除了HIV-1，SLPI能够抑制仙台病毒和甲型流感病毒。Shugars，D.E.，1999 J.Infect.Dis.179(Suppl.3)：S431-S435。
已经提出了SLPI可能在病毒结合于细胞表面后但在逆转录前的某个感染步骤抑制HIV-1感染。McNeely，T.B.，et at.，J.Clin.Invest.96：456-464，1995；McNeely，T.B.，et al.，Blood 90：1141-1149，1997。SLPI可能影响细胞表面上参与病毒进入的分子。已经报道了rSLPI可能与除CD4(HIV-1的主要受体)以外的另一种细胞表面分子相互作用(Wahl，S.M.，et al.，Oral.Dis.3(Suppl1)：S64-S69，1997；McNeely，T.B.，et al.，J.Clin.Invest.96：456-464，1995；McNeely，T.B.，et al.(1997)，supra；Shugars，D.C.，et al.，1997 Oral.Dis.3(Suppl.1)：S70-S72)，这与缺乏rSLPI结合于表达CD4，CD26和CCR5的人T细胞的关联一致(Konopka，K.，et al.，1999 J.Dent.Res,78：341)。除了CD4，HIV-1进入的主要受体、其它分子和辅因子也可能在病毒和细胞膜之间的融合中起重要作用。J.P.Moore，et al.，1999 Curr.Opinion Immunol.17：551-562，1997；Berger，E.A.，et al.，Annu.Rev.Immunol.17：657-700。来自大肠杆菌的重组、复性的SLPI通过HIV-1Ba-L减少分化的THP-1细胞的感染，并且它具有用商业制备的重组SLPI没有观察到的抗病毒活性。报道了sSLPI(从合成基因制备的SLPI)和rSLPI(商购的rSLPI)都具有相似的抗蛋白酶活性。Kohno，T.，et al.，1990 Met.Enzymol.185：187-195。
金属蛋白酶(TIMPs)的组织抑制剂是密切相关的蛋白家族，其最初描述为金属蛋白酶的抑制剂。Stetler-Stevenson，W.G.，et al.，1999 AnnRev Cell Biol.9：541-573；Stetler-Stevenson，W.G.，et al.，1990 J.Biol.Chem.265：13933-13938。TIMP基因家族包括TIMP1，TIMP2，T1MP3和TIMP4。每种都具有TIMP基序，并且具有TIMP结构域。金属蛋白酶2(TIMP2)的组织抑制剂是一种组成型的24,000分子量蛋白，其含有12个半胱氨酸，形成6个二硫键。已经鉴定了TIMP基序的9种异构体。TIMP结合于并且不可逆地灭活细胞外基质金属蛋白酶(MMP)，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MMP-10，MMP-13，MMP-14，MMP-15，MMP-16和MMP-19，以及胶原酶。例如，TIMP-2抑制MMP-2，所述MMP-2消化细胞外基质，使癌细胞能够生长并侵入组织。Musso，O.，et al.，1997 J Hepatol.26：593-605。TIMP-4似乎在组织重塑和细胞外基质稳态中起作用。Gomez，D.E.，et al.，1997 Eur.J.Cell Biol.74：111-122。
除了阻断MMP活性，也报道了TIMPs具有不依赖于它们的MMP抑制功能的生长因子活性。  Montgomery A.M.，et al.1994 Cancer Res.54：5467-5473；Hayakawa T.，et al.1992 FEBS Lett.298(1)：29-32；Stetler-Stevenson，W.G.，et al.，1992 FEBS Lett.296：231-234。也报道了TIMP-1和TIMP-2抑制肿瘤生长、肿瘤细胞侵入和肿瘤的转移性播散，并且抑制血管发生。Valente，P.，et al.，1998 Int.J.Cancer 75：246-253。也报道了TIPM-1通过上调CD40和CD23以及下调CD77，影响生发中心B细胞分化。Guedez et al.1998 Blood 92：1342-1349。也报道了TIMP-1表达调节B细胞中的IL-10水平。Guedez，et al.，2001 Blood 97：1796-1802。其它抗微生物肽包括防卫素、cathelicidins和histatins。哺乳动物抗微生物肽是粘膜表面的宿主防御系统的重要成分。在肺中，由气道表面液体(asl)覆盖了气道表面，所述液体是覆盖气道腔面的一薄层液体。存在于覆盖气道的表面液体中的多种成分和因子提供了抗病毒和细菌的一线防御。除SLPI外，在该液体中还存在的一些抗微生物因子是溶菌酶、乳铁蛋白、防卫素和cathelicidins。Niyonsaba，F.，et al.，2003Curr.Drug Targets Inflamm.Allergy 2：224-23.1；Oppenheim，J.J.，et al.，2003 Ann.Rheum.Dis.62(suppl.2)ii：17-21。
已经将哺乳动物防卫素表征为分子量为大约3.5-4.5kDa的阳离子、非糖基化的、富含精氨酸的肽。Bals R.，200020 Respir Res.1(3)：141-50。它们含有6个半胱氨酸残基，形成3个细胞内二硫键。LeherR.，1991 Cell 64：229-230。可以将防卫素分为三类：α-防卫素、β-防卫素和θ-防卫素。Bals R.，supra。α-防卫素的长度是大约29-35个氨基酸残基，含有3个二硫键，并且具有三链β折叠结构，所述结构具有含有阳离子氨基酸的β发夹结构。β-防卫素的长度是大约36-42个氨基酸残基。θ-防卫素具有由两个截短的α-防卫素的翻译后连接产生的环形结构。Bals R.，supra。α-防卫素人中性粒细胞肽1-4(HNP-1-HNP-4)位于中性粒细胞的嗜天青颗粒中，并且导致吞噬的微生物的氧依赖性杀灭。Ganz T.，et al.，1985 J Clin Invest 76：1427-1435，Selsted M.E.，et al.1985 JClin Invest 76：1436-1439。
除了作为抗微生物剂的作用，这些抗微生物肽在炎症、伤口修复和免疫系统调节中起作用。Bals R.10 supra。已经报道了人中性粒细胞防卫素对多种细胞类型具有细胞毒性(Van Wetering S.，et al.，1997Leukoc Biol 62：217-226)，因为诱导气道上皮细胞(Van Wetering S.，etal.1997 Am J Phvsiol Lung Cell Mol Phvsiol 272：L888-L896)、单核细胞(Territo M.C.et al.，1989.J Clin Invest 84：2017-2020)和T淋巴细胞(Chertov O.et al.，1996 J Biol Chem 271：2935-2940)中的细胞因子合成，并且增加SLPI从呼吸道上皮细胞的释放(Van Wetering S.，et al.，2000 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 278：L51-L58)。同样，报道了α-防卫素参与单核细胞和T细胞的趋化作用(Yang D.，et al.，2000 JLeukoc Biol.68：9-14)、细胞增殖和抗体应答的调节，和补体激活的抑制、纤维蛋白溶解的抑制、和丝氨酸蛋白酶抑制蛋白家族成员活性的抑制(综述于Van Wetering S.，et al.，1999 J Allergy Clin Immunol104：1131-1138)。已经将人β-防卫素鉴定为趋化因子受体CCR6的可能配体，提供了天然和获得性免疫之间的关联。Yang D.，et al.，1999Science 286：525-528。已经报道了与抗原结合的防卫素刺激并增强了Th1依赖性细胞和Th2依赖性体液细胞因子产生和免疫应答。Oppenheim，J.J.，et al.，2003 Ann.Rheum.Dis.62(Suppl2)ii：17-21。
cathelicidin家族的抗微生物肽具有高度保守的信号序列和前肽区，但在含有C-末端结构域的成熟肽中具有显著趋异性，所述成熟肽的大小可以是约12-80个或更多个氨基酸。Zanetti M.，et al.，1995FEBS Lett 374：1-5。人cathelicidin LL-37/hCAP-18作为颗粒存在于髓样细胞中，但也存在于发炎的皮肤组织中，据报道，其在所述组织受到炎症刺激的调节。Frohm M.，et al.，1997 J Biol Chem 272：15258-15263。CAP18除存在于中性粒细胞的过氧化物酶阴性颗粒中，也以更小的含量存在于淋巴细胞和单核细胞的亚群中，存在于口腔、舌、食道、子宫颈、阴道和肺上皮中，存在于炎性皮肤病的角质形成细胞中，并且存在于附睾中。Oppenheim，J.J.，et al.，(200-3)supra。
包括木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶的可逆性抑制半胱氨酸蛋白酶的小蛋白，即半胱氨酸蛋白酶抑制剂，广泛分布于组织和体液中。Abhrahamson，M.，1994 Methods Enzymol.244：685-700。正常情况下，除了在例如内毒素诱导的脓毒症、转移癌、类风湿关节炎、支气管扩张和牙周炎的致病状况外，不能够在体液中测量到半胱氨酸蛋白酶活性，这表明了半胱氨酸蛋白酶抑制剂进行的紧密酶调节是正常状态下必要的。Ni，J.，etal.，1998 J.Biol.Chem.273：24797-24804。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的蛋白是结构和功能上相似的，并且可能构成单个进化蛋白超家族。存在半胱氨酸蛋白酶抑制剂的至少3个不同的亚类或家族。家族I(半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族)中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂不具有二硫键，并且含有大约100个氨基酸残基。家族II(stefin家族)具有两个二硫键，并且含有大约120个氨基酸残基。家族成员的实例包括但不限于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、D、S、SN和SA，这些都是分泌型蛋白。家族III(激肽原家族)含有三个半胱氨酸蛋白酶抑制剂样结构域，其中的每一个都含有两个二硫键，并且可能是糖基化的。家族III中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂样结构域的结构与家族II半胱氨酸蛋白酶抑制剂同源。综述参见Abrahamson M.et al.，2003Biochem Soc Symp.70：179-99。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员起调节蛋白酶活性的保护作用，否则所述蛋白酶可能会导致不受控制的蛋白水解和组织破坏。这些肽酶在如细胞内蛋白降解的生理过程中起关键作用(组织蛋白酶B、H和L)，在骨骼重组中是关键的(组织蛋白酶K)，并且可能在控制抗原呈递中是重要的(组织蛋白酶S，哺乳动物legumain)。此外，所述肽酶的活性在诸如癌症转移和炎症的病理生理状况中是增加的。此外，这些肽酶对于一些致病寄生虫和细菌是关键的。因此，半胱氨酸蛋白酶抑制剂不仅具有调节正常身体过程的能力，并且可能在下调时导致疾病，而且可能参与抗微生物感染的防御。Abrahamson M.etal.，supra。
组织蛋白酶D是乳腺癌的一种预后指示剂，组织蛋白酶B是乳腺癌从恶性前到恶性转变的诊断标志物。MMP-9可以预测膀胱癌的病理分期和膀胱癌的分级。MT1-MMP和MMP-2可以预测前列腺癌的病理分期和前列腺癌的分级。半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的突变也与疾病相关。例如，家族II的一个成员，即半胱氨酸蛋白酶抑制剂C中的突变，与心血管淀粉样变相关。胱氨酸蛋白酶抑制剂B与一种形式的进展性肌阵挛癫痫相关。Pennacchio，L.A.，et al.，1996 Science 271：731-1734。也存在关于半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制病毒复制的能力的数据。例如，人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抑制疱疹病毒的复制(Bjoreck，L.，et al.，1990 J.Virol.64：941-943)，人半胱氨酸蛋白酶抑制剂D抑制冠状病毒的复制(Collins，A.R.，and Grubb，A.，1998 Oral.Microbiol. Immunol.13：59-61)，人半胱氨酸蛋白酶抑制剂A抑制杆状病毒诱导的细胞凋亡(Bjorklund，H.V.，et al.，1997 J.Virol.71：5658-5662)。半胱氨酸蛋白酶抑制剂D可能起到抗口腔中存在的蛋白酶的保护作用。Freije，J.P.，et al.，1993 J.Biol.Chem.268：15737-15744。
目前仍然需要认识蛋白酶抑制剂用于治疗的潜能。一种蛋白酶抑制剂，即ZemairaTM，其是一种α-蛋白酶抑制剂(AI-PI)，在2003年被FDA批准，但其适应症是非常特异的。ZemairaTM是具有AI-PI缺陷和肺气肿的临床表现的个体的静脉内治疗。参见，例如Schakwijk，J.，et al.，1999 Biochem.J.340：569-577；Reid，P.T.，and Sallenave，J.M.，2001Curr.Opin.Invest.Drugs 2：59-67；Oermann，C.M.，2001 Curr.Opin.Invest.Drugs 2：900-996；Ward，P.A.，and Lentsch，A.B.，2002 Mol.Cell.Biochem.234/235：225-228；Somerville，R.P.T.，et al.，2003 Genome Biol.4：216，2003。
存在大量疾病和病症，缺乏用于它们的治疗剂，或它们的治疗方法不存在、有限或不足。这些疾病和病症包括免疫系统的疾病和病症(如炎症)、感染和传染病、增殖性疾病(如癌症)、呼吸系统病症(如ARDS)、血管病和此处描述的其它病症。改进这些疾病的治疗的机会是大量的，投资非常高。
例如，自身免疫病是普遍存在的和花费巨大的一种类型的免疫系统功能障碍。当免疫系统变得不受调节并且攻击健康组织时，会导致至少80种不同的自身免疫病中的任意一种。自身免疫病在不断增加，并且据报道，在美国影响了超过5千万人。在很多自身免疫病中，由于大量炎症途径的不受控制的激活，导致了细胞、组织、关节和器官受损。炎性疾病，包括类风湿关节炎、狼疮、牛皮癣、多发性硬化和哮喘，仍然是世界范围的死亡率和发病率的主要原因。类风湿关节炎(RA)是这样的一种慢性炎性疾病，其特征在于关节的炎症，导致肿胀、疼痛和功能丧失。RA在美国影响了至少大约250万人。RA是由包括最初的感染或损伤、异常免疫应答和遗传因素的事件组合导致的。尽管RA中存在自身反应性T细胞和B细胞，但RA的诊断中使用在关节中收集的高水平抗体，称作类风湿因子的检测。
RA目前的治疗包括很多用于控制疼痛和缓解疾病进展的药物。没有发现能够治愈该疾病的治疗。药物包括非甾体类抗炎药(NSAIDS)和缓解病情的抗风湿药物(DMARDS)。NSAIDS在良性疾病中有用，但不能防止严重RA进展到关节破坏和残疾。此外，NSAIDS和DMARDS都与严重的不良副作用相关。过去10年中批准了一种新的DMARD，即来氟米特。来氟米特阻断自身抗体的产生，减轻炎症，并且延缓RA的进展，但是，这种药物也导致严重的副作用，包括恶心、腹泻、脱发、皮疹和肝损伤。
其它没有足够治疗的重要疾病包括眼部疾病和病症。年龄相关的黄斑变性(AMD)是失明的主要原因，其影响视网膜的中心部分(黄斑)。湿AMD是涉及新血管膜形成的两种形式的状况中的一种。其通过这些血管的渗漏和出血导致视觉丧失，这通常是不可逆的。湿AMD可以进一步细分为经典型和隐藏型，经典型对视力的威胁更大。估计60-64岁，湿AMD的流行程度是每1000人中有3人，而在90岁和90岁以上，是1000人中有117人。Meads C.，et al.，2003 Health Technol Assess.7(9)：v-vi，1-93。除AMD外，其它眼部疾病，包括色素性视网膜炎、青光眼、视网膜脱落、糖尿病视网膜病和病理性近视，导致了视网膜细胞的凋亡。已经推测了抑制参与视网膜细胞凋亡的过程，可以减少死亡细胞的数目，并且防止与诸如青光眼的一些病理相关的不可逆的视觉丧失。Garcia M，and Vecino E.，2003 Arch Soc Esp Oftalmol.78(7)：351-64。
目前仍然明确需要用于治疗癌症的新药剂。癌症包括广泛的疾病，在世界范围内影响着大约四分之一的个体。恶性细胞的迅速和不受调节的增殖是很多癌症类型的标志，包括造血系统恶性肿瘤。很多癌症的发病可能与免疫系统问题相关。人类中随着年龄增长，很多类型癌症(肿瘤)的发病率的增加可能与免疫系统的峰值效力降低相关，所述峰值出现在大约25岁。尽管过去二十年中，患有造血系统恶性状况的患者从癌症治疗的进展获益，Multani et al.，1998 j.Clin.Oncology16：3691-3710，并且好转期延长，但大多数患者仍然复发并且死于他们的疾病。用细胞毒性药物治愈癌症的障碍包括，例如，肿瘤细胞抗性和化疗的高毒性，这阻止了很多患者中的最优剂量。
明确需要用于治疗上诉疾病和病症的新的和有效的分子。也需要用于治疗这些疾病和病症的、副作用减少并且效力更高的治疗分子。此处描述和要求保护的本发明的组合物和方法提供了这样的改进的组合物和方法，以及其它优点。
发明概述
此处描述和要求保护的发明具有很多特性和实施方式，包括，但不限于在此概述部分阐述或描述或提到的那些。此处描述和要求保护的发明不限于概述部分鉴定的特征和实施方案，这些只是用于说明目的，而不是限制。
一方面，本发明涉及能够治疗、预防或阻抑与蛋白酶的活性或激活相关的疾病、病症和状况的治疗剂和组合物。
另一方面，本发明涉及能够治疗、预防或阻抑能够通过抗蛋白酶作用获益或改善的疾病、病症和状况的治疗剂和组合物。
另一方面，本发明涉及能够治疗、预防或阻抑免疫系统的疾病和病症的治疗剂和组合物。
另一方面，本发明涉及能够治疗、预防或阻抑感染的治疗剂和组合物。
本发明进一步涉及能够治疗、预防或阻抑增殖性疾病(如肿瘤和癌症)的治疗剂和组合物。
本发明也涉及能够治疗、预防或阻抑呼吸系统疾病、病症和状况，包括ARDS的治疗剂和组合物。
本发明也涉及能够治疗、预防或阻抑血管疾病、病症和状况的治疗剂和组合物。
本发明也涉及能够治疗、预防或阻抑炎症以及炎性疾病、病症和状况的治疗剂和组合物。
本发明提供了结合域融合蛋白，包含结合域融合蛋白、基本由结合域融合蛋白组成、或由结合域融合蛋白组成的组合物，以及使用结合域融合蛋白的方法，包括治疗需要其的患者的治疗方法。
一方面，结合域融合蛋白包括具有需要的抗蛋白酶的生物活性的多肽或其它试剂。结合域融合蛋白还包含能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽，所述蛋白酶相关分子也就是结合域融合蛋白能够结合并且施加抗靶蛋白酶的活性的非蛋白酶分子。需要的生物活性可以是例如与靶蛋白酶的调节相关的任何生物活性。蛋白酶相关分子包括但不限于酶；参与信号传导的配体和受体；参与炎症的分子；参与免疫系统功能的蛋白；包括蛋白激酶和磷酸酶的调节蛋白；结构蛋白；等，以及与一种或多种此处提到的疾病、病症和/或状况相关的靶，或参与一种或多种此处提到的疾病、病症和/或状况的靶。靶相关分子通常是与蛋白酶活性足够接近或将足够接近，或与蛋白酶活性物理相关或将物理相关的分子，使得结合域融合蛋白能够抑制或调节蛋白酶活性，所述蛋白酶活性如局部蛋白酶活性。
蛋白酶相关分子通常是用于将结合域融合蛋白送递到蛋白酶活性或表达位点的蛋白酶相关靶，需要的生物活性是调节要调节的蛋白酶的一种或多种活性、表达或其它特性。
在某些实施方案中，蛋白酶是一种或多种此处描述的蛋白酶，或本领域目前已知或以后将发现的蛋白酶。因此，一个方面是提供结合域融合蛋白，其包含具有能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽的多肽和具有蛋白酶抑制活性的多肽、基本由具有能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽的多肽和具有蛋白酶抑制活性的多肽组成、或由具有能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽的多肽和具有蛋白酶抑制活性的多肽组成。具有蛋白酶抑制活性的多肽包括，例如，具有抗蛋白酶活性的抗蛋白酶和蛋白酶抑制剂结构域。
蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂结构域，包括但不限于此处描述的那些，可以包括在结合域融合蛋白中，或用于制备结合域融合蛋白。也可以采用目前已知或以后发现的其它蛋白酶和其它蛋白酶抑制剂。
蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂结构域可以包含多肽、基本由多肽组成、或由多肽组成。也考虑非多肽蛋白酶抑制剂分子。
在一些实施方案中，本发明提供包含与一种或多种免疫球蛋白结构域连接的蛋白酶抑制剂分子的化合物。免疫球蛋白结构域可以选自，例如CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL(轻链恒定区)。在某些实施方案中，免疫球蛋白结构域是灵长动物免疫球蛋白结构域。在其它实施方案中，免疫球蛋白结构域是人免疫球蛋白结构域。在其它实施方案中，免疫球蛋白结构域是(全部或部分)人源化的免疫球蛋白结构域。在其它实施方案中，蛋白酶抑制剂是蛋白。
在某些实施方案中，结合域融合蛋白包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：i)具有或构成能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽，和ii)包含或构成能够抑制所述蛋白酶的多肽(包括蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂结构域)的第二多肽。
在另一实施方案中，结合域融合蛋白任选包含第三多肽、基本由第三多肽组成、或由第三多肽组成，所述第三多肽包含连接所述第一和第二多肽的连接区。连接区优选是多肽，但不必一定是多肽。
在某些实施方案中，结合域多肽包含免疫球蛋白或其部分或变体。例如，结合域多肽可以是单克隆抗体或其结合部分，包括但不限于Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段、单链结合蛋白、单链Fv(scFv)、包含免疫球蛋白轻链可变区多肽和免疫球蛋白重链可变区多肽、基本由免疫球蛋白轻链可变区多肽和免疫球蛋白重链可变区多肽组成、或由免疫球蛋白轻链可变区多肽和免疫球蛋白重链可变区多肽组成的多肽。所述免疫球蛋白或免疫球蛋白部分或变体不仅仅包括天然分子，也包括嵌合或(全部或部分)人源化的分子，或为了人类或其它用途而减少了免疫原性的分子。
另一方面，结合域多肽使得此处描述的结合域融合蛋白能够结合于选定的蛋白酶相关分子。例如，结合域多肽可以结合选自CD45、CD45RA、CD45 RO、VEGF的分子。结合域多肽可以结合一种或多种特定细胞类型上的分子，所述细胞如白细胞、T淋巴细胞(如CD2，CD3，CD4，CDS，CD6，CD7，CD8，CD25，CD28，CD69，CD154，CD152(CTLA-4)和ICOS抗原)、辅助T细胞、单核细胞、树突细胞、免疫效应细胞、B细胞(如II类MHC，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD37和CD40抗原)。其它结合域靶包括正常或恶性细胞的细胞表面标记物；细胞因子(包括生长因子和信号传导的介质)；血液或组织中的蛋白；传染性靶，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫靶；和细胞内靶，包括细胞内蛋白靶。其它由本发明的构建体结合的蛋白酶相关分子包括肿瘤抗原。可以由本发明的构建体靶定的肿瘤抗原的实例包括鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1；蛋白T4-A)；磷脂细胞癌抗原2(SCCA-2)；卵巢癌抗原CA125(1A1-3B；KIAA0049)；黏蛋白1(肿瘤相关黏蛋白；癌相关黏蛋白；多形性上皮细胞黏蛋白；Pem；Pemt；Episialin；肿瘤相关上皮膜抗原；Ema；H23AG；花生反应性尿黏蛋白；Pum；乳腺癌相关抗原DF3)；1组CTCL肿瘤抗原；CTCL肿瘤抗原se14-3.；CTCL肿瘤抗原se20-4；CTCL肿瘤抗原se20-9.；CTCL肿瘤抗原se33-1；CTCL肿瘤抗原se37-2；CTCL肿瘤抗原se57-1；CTCL肿瘤抗原se39-1；前列腺特异性膜抗原；5T4癌胚滋养层糖蛋白；Orf73卡波西肉瘤相关疱疹病毒；MAGE-CI(癌/睾丸抗原CT7)；MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原；DAM10)；MAGE-B2抗原(DAM6)；MAGE-2抗原；MAGE-4a抗原；MAGE-4b抗原；结肠癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12变体A；癌相关表面抗原；腺癌抗原ART1；副肿瘤相关脑-睾丸-癌抗原(癌神经元抗原MA2；副肿瘤神经元抗原)；神经-肿瘤腹侧抗原2(NOVA2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原MAGE-X2；滑液癌，X断裂点2；T细胞识别的鳞状细胞癌；血清学确定的结肠癌抗原；血清学确定的乳腺癌抗原NY-BR-15；血清学确定的乳腺癌抗原NY-BR-16；嗜铬粒蛋白A；甲状旁腺分泌蛋白1；DUPAN-2；CA19-9；CA72-4；CA195；和L6。
连接区，如连接区多肽，是例如使得分子的两端能够行使它们的所需功能的分子，例如，使靶定或结合域能够与其靶相互作用，并且使抑制结构域能够行使其所需功能的那些。
连接区多肽包括例如IgG、IgA、IgE、IgM和IgD的免疫球蛋白铰链区。它们也包括这些序列的变体，包括含有正常情况下存在于这些免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基的取代或缺失的变体。
结合域融合蛋白的蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂结构域包括但不限于例如捕获蛋白多肽或其具有蛋白酶抑制剂活性的部分。蛋白酶抑制剂包括捕获蛋白多肽的具有蛋白酶抑制剂活性的天然和非天然类似物。
蛋白酶抑制剂也包括但不限于例如SLPI多肽、SLPI多肽的具有蛋白酶抑制剂活性的天然和非天然类似物、抑弹性蛋白酶蛋白多肽，和抑弹性蛋白酶蛋白多肽的具有蛋白酶抑制剂活性的天然和非天然类似物。
此外，例如，蛋白酶抑制剂也包括但不限于具有蛋白酶抑制剂活性的WAP基序多肽，和所述WAP基序多肽的具有具有蛋白酶抑制剂活性的天然和非天然类似物。
蛋白酶抑制剂也包括但不限于例如具有蛋白酶抑制剂活性的TIMP多肽，和TIMP多肽的具有具有蛋白酶抑制剂活性的天然和非天然类似物。
蛋白酶抑制剂也包括但不限于例如具有蛋白酶抑制剂活性的防卫素多肽，和防卫素多肽的具有具有蛋白酶抑制剂活性的天然和非天然类似物。
通过本发明的结合域融合蛋白进行抑制的蛋白酶包括任何需要的蛋白酶。所述蛋白酶包括但不限于例如细胞内蛋白酶，包括胱天蛋白酶；参与补体激活的调节的蛋白酶；参与凝血调节的蛋白酶；参与信号传递调节的蛋白酶；和参与前列腺素(如PGHS-2)的表达或活性的蛋白酶。其它蛋白酶包括但不限于基质金属蛋白酶、弹性蛋白酶、α1蛋白酶、蛋白酶3、糜蛋白酶、胰蛋白酶、人肥大细胞类糜蛋白酶、角质层糜蛋白酶、人组织蛋白酶G、牛糜蛋白酶、猪糜蛋白酶、类胰蛋白酶、人白细胞弹性蛋白酶、猪胰腺弹性蛋白酶、角质层糜蛋白酶。蛋白酶靶也包括，但不限于具有诸如弹性蛋白、蛋白聚糖和胶原作为底物的蛋白酶。
另一方面，结合域融合蛋白可以包含蛋白酶抑制剂多肽或结构域、基本由蛋白酶抑制剂多肽或结构域组成、或由蛋白酶抑制剂多肽或结构域组成。因此，另一方面是提供结合域融合蛋白，它包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：i)具有能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽；ii)包含与所述第一多肽连接的连接区的第二多肽；和iii)包含能够抑制所述蛋白酶的蛋白酶抑制剂的类似物的第三多肽。在某些其它实施方案中，蛋白酶抑制剂类似物具有降低的蛋白酶抑制活性。所述蛋白酶抑制剂类似物例如可以具有与此处描述或提到的，或其它现在已知或以后发现的蛋白酶抑制剂多肽相比的选择性氨基酸缺失、插入或取代。
结合域融合蛋白的某些实施方案具有一个或一个以上TGase基序，例如大约3-大约15个TGase基序(如Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys)、大约4-大约10个TGase基序，或1个、2个、3个、4个、5个、1个或两个、1-5个或5个以上TGase基序。示例的TGase基序例如包含氨基酸序列Gly-G1n-Asp-Pro-Val-Lys、基本由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成。因此，另一方面是提供结合域融合蛋白，它包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：i)具有能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽，和ii)包含蛋白酶抑制剂结构域、基本由蛋白酶抑制剂结构域组成、或由蛋白酶抑制剂结构域组成的第二多肽；和iii)包含TGase基序、基本由TGase基序组成、或由TGase基序组成的第三多肽。任选地，结合域融合蛋白可以包含一种或多种额外的分子，所述分子包括连接一种或多种上述多肽的连接区、基本由所述连接区组成、或由所述连接区组成，所述连接如连接第一多肽和第二多肽、连接第二和第三多肽，和/或连接第一和第三多肽。这些多肽可以是处于任何保持结合域融合蛋白和/或其任意成分的需要的功能活性的顺序。连接区包括此处描述的那些。
另一方面，TGase基序作为转谷氨酸酰胺酶的底物，通过促进转谷氨酸酰胺酶交联，作为用于结合域融合蛋白的锚定基序。
结合域融合蛋白的某些实施方案也可以包含一个或多个二聚结构域，例如，1个、2个、3个、1-5个或5个或5个以上二聚结构域。这些融合蛋白包括使两个或更多结合域融合蛋白能够共价或非共价缔合的任何序列或分子。
在示例的实施方案中，二聚结构域包含免疫球蛋白铰链结构域或变体或类似物，包括，例如，此处描述的那些。在其它实施方案中，二聚结构域包含免疫球蛋白CH2CH3结构域或免疫球蛋白CH3结构域或类似物，包括此处描述的那些。所述区域包括IgG CH2CH3结构域或CH3结构域或其类似物。其它免疫球蛋白，包括但不限于IgA免疫球蛋白，可以用于构建CH2CH3结构域或CH3结构域或其类似物。在优选实施方案中，二聚结构域是灵长动物二聚结构域。在其它实施方案中，其中灵长动物二聚结构域不是野生型或天然分子，二聚化聚合物是从灵长动物二聚结构域制备或衍生的。在更优选的实施方案中，二聚结构域是人(或全部或部分人源化的)二聚结构域。在其它实施方案中，其中人二聚结构域不是野生型或天然分子，二聚化聚合物是从人二聚结构域制备或衍生的。
例如，结合域融合蛋白的某些实施方案包含连接区多肽。人多肽和从人多肽衍生或制备的多肽优选作为连接区多肽。连接区多肽可以包括，例如包含肽或多肽间隔基、基本由肽或多肽间隔基组成、或由肽或多肽间隔基组成的多肽，所述间隔基的长度是大约15-大约115个氨基酸；大约10-大约50个氨基酸；大约15-大约35个氨基酸；大约18-大约32个氨基酸；大约5-大约15个氨基酸；或需要的任何其它数目的氨基酸。在另外的某些实施方案中，连接区包含二聚结构域、基本由二聚结构域组成、或由二聚结构域组成。在某些实施方案中，连接区包含天然存在的或改变的免疫球蛋白铰链区或具有铰链区作用的多肽。例如，免疫球蛋白铰链区多肽可以包括任何天然存在的铰链区或具有铰链区作用的肽或多肽组成，或基本由所述肽或多肽组成、或由所述肽或多肽组成，所述肽或多肽可以例如是选自下组的天然存在的铰链区：人铰链区或其部分；人IgG铰链区或其部分；人IgA铰链区或其部分；人IgE铰链区或其部分；骆驼类(camelid)铰链区或其部分；IgG1、IgG2或IgG3美洲驼铰链区或其部分；护士鲨(nurse shark)铰链区或其部分；以及斑点银鲛(spotted ratfish)铰链区或其部分。在另外的某些实施方案中，连接区包含例如但不限于以下铰链区、基本由以下铰链区组成、或由以下铰链区组成：比天然存在的铰链区，如正常情况下具有3个半胱氨酸残基的铰链区具有更少半胱氨酸残基的、经过改变而具有0、1或2个半胱氨酸残基的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区；具有0、1或2个半胱氨酸残基的人IgG铰链区；野生型人IgG1免疫球蛋白铰链区；包括含有糖基化位点的免疫球蛋白铰链区的铰链区；包括不具有能够形成二硫键的半胱氨酸残基的免疫球蛋白铰链区的铰链区；包括含有一个半胱氨酸残基的免疫球蛋白铰链区的铰链区；包括突变或其它改变的野生型免疫球蛋白铰链区多肽的铰链区，其包含不超过一个半胱氨酸残基；包括经过改变使得蛋白二聚化能力降低的免疫球蛋白铰链区的铰链区；包括具有三个半胱氨酸残基和一个脯氨酸残基的免疫球蛋白铰链区的铰链区，其中所述一个或多个所述半胱氨酸残基缺失，并且所述脯氨酸残基被取代或缺失；包含突变或其它改变的野生型免疫球蛋白铰链区多肽的铰链区，所述多肽包含第一、第二和第三半胱氨酸残基，其中第一半胱氨酸残基在第二半胱氨酸的N末端，第二半胱氨酸在第三半胱氨酸的N末端，第一半胱氨酸被取代或缺失。这些不是穷举。
结合域融合蛋白的某些实施方案包含天然存在的或改变的免疫球蛋白恒定区结构域。因此，另一方面是提供包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成的结合域融合蛋白：i)包含能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽、基本由所述多肽组成、或由所述多肽组成的第一多肽；ii)包含与所述第一多肽连接的连接区的第二多肽；iii)包含蛋白酶抑制剂结构域、基本由蛋白酶抑制剂结构域组成、或由蛋白酶抑制剂结构域组成的第三多肽；和iv)包含免疫球蛋白恒定区或其部分、基本由免疫球蛋白恒定区或其部分组成、或由免疫球蛋白恒定区或其部分组成的第四多肽。在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定区实施方案包括免疫球蛋白CH3区、基本由免疫球蛋白CH3区组成、或由免疫球蛋白CH3区组成，所述CH3区包括CH3类似物。在其它实施方案中，结合域融合蛋白包含其它免疫球蛋白恒定区或类似物，包括此处描述的那些。另一方面，结合域融合蛋白的免疫球蛋白恒定区结构域能够介导免疫效应物功能，包括，例如以下一种或多种活性：补体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞毒性、FcR结合、蛋白A结合，和靶细胞数目的减少。
在某些其它进一步的实施方案中，提供了包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成的结合域融合蛋白：i)具有能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽；ii)包含与所述第一多肽连接的连接区的第二多肽；iii)包含蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域、基本由蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域组成、或由蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域组成的第三多肽；和iv)一个或多个二聚结构域，其中所述第一多肽位于所述第二多肽的N末端，所述第二多肽位于所述蛋白酶抑制剂结构域的N末端，其中所述蛋白酶抑制剂结构域包括一个或多个WAP结构域，并且其中所述一个或多个WAP结构域位于所述一个或多个二聚结构域的N末端。
在某些其它进一步的实施方案中，提供了包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成的结合域融合蛋白：i)具有能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽；ii)包含与所述第一多肽连接的连接区的第二多肽；iii)包含蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域、基本由蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域组成、或由蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域组成的第三多肽；和iv)一个或多个二聚结构域，其中所述第一多肽位于所述第二多肽的N末端，所述第二多肽位于所述一个或多个二聚结构域的N末端，并且其中所述一个或多个二聚结构域位于所述蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域的N末端，并且其中所述蛋白酶抑制剂结构域包括一个或多个WAP结构域。
在某些其它进一步的实施方案中，提供了包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成的结合域融合蛋白：i)具有能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽；ii)包含与所述第一多肽连接的连接区的第二多肽；iii)包含蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域、基本由蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域组成、或由蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域组成的第三多肽；iv)一个或多个二聚结构域；和v)一个或多个TGase结构域，其中所述第一多肽位于所述第二多肽的N末端，所述第二多肽位于所述蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域的N末端，其中所述蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域包括一个或多个WAP结构域，并且其中所述一个或多个WAP结构域位于所述一个或多个二聚结构域的N末端，并且其中所述一个或多个二聚结构域位于所述一个或多个TGase结构域的N末端。
在某些其它进一步的实施方案中，提供了包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成的结合域融合蛋白：i)具有能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽；ii)包含与所述第一多肽连接的连接区的第二多肽；iii包含蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域的第三多肽；iv)一个或多个二聚结构域；和v)一个或多个TGase结构域，其中所述第一多肽位于所述第二多肽的N末端，所述第二多肽位于所述蛋白酶抑制剂结构域的N末端，其中所述蛋白酶抑制剂结构域包括一个或多个WAP结构域，并且其中所述一个或多个WAP结构域位于所述一个或多个TGase结构域的N末端，并且其中所述TGase结构域位于所述一个或多个二聚结构域的N末端。
另一方面，提供了某些构建体，其优选不具有结合域(如免疫球蛋白可变区)。例如，这些实施方案可以包含两个结构域、基本由两个结构域组成、或由两个结构域组成，这两个结构域如蛋白酶抑制剂结构域和免疫球蛋白恒定区结构域。这种类型的构建体的一个实例是SLPI-CH2CH3或SLPI类似物-CH2CH3。在某些进一步的实施方案中，可以将捕获蛋白家族的其它成员融合或以其它方式连接于免疫球蛋白恒定区结构域。这些构建体可以用于此处描述的多种治疗方法中。
也提供了结合域融合蛋白及其具有抗菌活性的组合物。也提供了治疗具有细菌感染的患者的方法，包括施用有效抗菌量的结合域融合蛋白。
也提供了结合域融合蛋白及其具有抗炎活性的组合物。提供了治疗具有炎性病症的患者的方法，包括施用有效抗炎量的结合域融合蛋白
也提供了结合域融合蛋白及其具有抗病毒活性的组合物，包括例如可以有效治疗患者中的HIV感染的结合域融合蛋白。提供了治疗具有病毒感染，例如HIV感染的患者的方法，包括施用有效抗病毒或抗HIV量的结合域融合蛋白。
也提供了可以有效治疗患者中的肺部病症的结合域融合蛋白及其组合物。也提供了治疗患者中的肺部病症的方法，包括施用有效量的结合域融合蛋白。进一步提供了可以有效治疗患者中的肺炎的结合域融合蛋白及其组合物。也提供了治疗患者中的肺炎的方法，包括施用有效量的结合域融合蛋白。
也提供了可以有效治疗患者中的血管病症的结合域融合蛋白及其组合物。也提供了治疗患者中的血管病症的方法，包括施用有效量的结合域融合蛋白。
也提供了可以有效治疗患者中的眼部疾病或病症的结合域融合蛋白及其组合物。也提供了治疗患者中的眼部疾病或病症的方法，包括施用有效量的结合域融合蛋白。另一方面，提供了可以有效治疗患者中的年龄相关的黄斑退化性疾病的结合域融合蛋白及其组合物。也提供了治疗患者中的年龄相关的黄斑退化性疾病的方法，包括施用有效量的结合域融合蛋白。
从说明书和权利要求可以明确了解此处描述和要求保护的本发明的这些和其它方面以及实施方案，所有这些都应该认为是说明书的一部分。
附图简述
图1.猪SPAI-2，外显子1。将SPAI-2的猪cDNA，即外显子1(ACCESSION D17754)翻译为氨基酸。向上的箭头表明天冬氨酸和脯氨酸之间的前序列切割位点。在蛋白的氨基末端区用下划线标出了6个氨基酸的可变区段。这些同源重复单位是TGase交联的底物。
图2.人SLPI的氨基和羧基末端结构域的同源性。对人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂的氨基酸序列(ATCC保藏号AAH20703)进行了比对，显示氨基和羧基末端结构域的定位和保守的半胱氨酸残基的位置。
图3.图3提供了一种类型的结合域融合蛋白的图解，显示编码一个结合域和一个蛋白酶抑制结构域的功能单位的合成基因的组构。间隔基(黑色柱所示)是可能不具有除分隔功能单位之外的功能的单位，它们使得能够实现功能单位的全部生物活性。每个间隔基是结合域融合蛋白的任选特征。
图4.图4提供了多种类型的结合域融合蛋白中的另一种的图示，表明了结合域融合蛋白的组构，所述结合域融合蛋白具有一个结合域、一个蛋白酶抑制结构域、和一个二聚结构域的组合。
图5.图5提供了多种类型的结合域融合蛋白中的另一种的图示，表明了结合域融合蛋白的组构，所述结合域融合蛋白包含WAP、TIMP或半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，和一个二聚结构域。
图6.图6表明了人WAP结构域之间的同源性。用于提取WAP结构域的蛋白的ATCC保藏号提供在图左侧。图顶部的连接的箭头表明二硫键模式。
图7.图7表明了人TIMP结构域之间的同源性。对来自TIM1_HUMAN(ATCC保藏号P01033)、TIM2_HUMAN(ATCC保藏号P16035)、TIM3_HUMAN(ATCC保藏号P35625)和TIM4_HUMAN(ATCC保藏号PQ9937)的TIMP结构域进行了比对，以说明总体同源性和半胱氨酸同源性。
图8.图8表明人半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域之间的同源性。用于提取半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域的蛋白的ATCC保藏号报道在图左侧。
图9.图9提供了多种类型的结合域融合蛋白中的另一种的图示，表明编码结合域融合蛋白的合成基因的功能单位的组构，所述结合域融合蛋白包含两个方向的可变H和L链的结构域、乳清酸性蛋白和CH3型二聚结构域。
图10.图10提供了多种类型的结合域融合蛋白中的另一种的图示，表明三类结合域融合蛋白，所述结合域融合蛋白包含结合域中的两个方向的可变H和L链、免疫球蛋白铰链区二聚结构域、来自SLPI蛋白酶抑制结构域的WAP基序、和CH3二聚结构域。在图示的实施方案中包括了链霉素标志。
图11.图11图示了抗CD28(2E12)构建体CD28 scFv-SCC-SLPI的核酸和蛋白序列。从N末端到C末端添加SLPI基因、SCC铰链区和链霉素标志，通过PCR制备SCC铰链区SLPI链霉素标志。采用Bcil限制位点，将具有15个氨基酸组成的接头的2E12 scFv与SCC铰链区SPLI标志一起组装，得到2E12 scFv-SCC-SPLI。通过DNA测序证实序列。
图12.图12图示了抗CD28(2E12)构建体CD28 scFv-(5aa接头)-SSS-SLPI的核酸和蛋白序列。从N末端到C末端添加SLPI基因、SSS铰链区和链霉素标志，通过PCR制备SSS铰链区SLPI链霉素标志。将具有5个氨基酸组成的接头的2E12 scFv与SSS铰链区SPLI标志一起组装，得到2E12 scFv-(5aa接头)-SSS-SLPI。通过DNA测序证实序列。
图13.图13图示了抗CD28(2E12)构建体CD28 scFv-SSS-SLPI-CH3的核酸和蛋白序列。通过PCR建立SSS铰链区SPLI和CH3链霉素标志片段，并且通过两个片段的重叠延伸将其融合，制备SSS铰链区SLPICH3链霉素标志。将具有15个氨基酸组成的接头的2E12 scFv与SCCSLPICH3一起组装，得到2E12 CD28 scFv-SSS-SLPI-CH3。通过DNA测序证实序列。
图14.图14图示了2E12-SLPI缀合物的结合活性。将携带不同缀合基因的哺乳动物载体(scFv-SCC-SLPI、scFv(5aa接头)-SSS-SLPI和scFv-SSS-SLPI-CH3)转染到COS细胞中，收集上清液。然后将上清液与CD28-CHO细胞一起温育，洗涤，然后用山羊抗SLPI探测，然后用兔抗山羊FITC探测。FACS分析显示，我们制备了抗CD28 scFv-SLPI缀合物，其具有能够结合CD28-CHO细胞的结合域，和能够被抗SLPI抗体检测的C末端结构域。
图15.图15说明了SLPI Ig和2E12 scFv-SLPI缀合物对弹性蛋白酶的蛋白酶活性的作用。2E12-SLPI缀合物(scFv-SLPI和scFv-SLPI-CH3)和SLPIIg都以剂量依赖性方式抑制了弹性蛋白酶的蛋白酶活性。
图16.图16说明了2E12 SMIP对CD3未成熟PBMC增殖的作用。
发明详述
本发明的实施可以采用多种常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物、细胞生物、生物化学、核酸化学和免疫学技术，其在本领域的技术之内。所述技术在文献中有完整解释，所述文献包括但不限于，例如MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版(Sambrook et al.，1989)和MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第三版(Sambrook and Russel，2001)，在此共同和分别称作″Sambrook″；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(M.J.Gait，ed.，1984)；ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney，ed.，1987)；HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY(D.M.Weir & C.C.Blackwell，eds.)；GENE TRANSFER VECTORS FORMAMMALIAN CELLS (J.M.Miller & M.P.Calos，eds.，1987)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubelet al.，eds.，1987，包括到2001年的增刊)；PCR：THE POLYMERASECHAIN REACTION，(Mullis et al.，eds.，1994)；CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)；THE IMMUNOASSAY HANDBOOK(D.Wild，ed.，Stockton Press NY，1994)；BIOCONJUGATE TECHNIQUES(Greg T.Hermanson，ed.，Academic Press.，1996)；METHODS OF IMMUNOLOGICALANALYSIS(R.Masseyeff，W.H.Albert，and N.A.Staines，eds.，Weinheim：VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)，Harlow and Lane(1988)ANTIBODIES.，A LABORATORY MANUAL，Cold SpringHarbor Publications，New York，和Harlow and Lane(1999)USINGANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(在此共同和分别称作Harlow and Lane)，Beaucage et al.eds.，CURRENT PROTOCOLS INNUCLEIC ACID CHEMISTRY John Wiley & Sons，Inc.，New York，2000)；和Agrawal，ed.，PROTOCOLS FOR OLIGONUCLEOTIDESAND ANALOGS，SYNTHESIS AND PROPERTIES Humana Press Inc.，New Jersey，1993)。
定义
在进一步概括和根据多种非限定性特定实施方案描述本发明前，阐述某些用于描述本发明的术语。除非另外指出，以下术语在此处使用和在所附权利要求中具有以下含义。在下文或说明书其它地方没有定义的术语，应该具有它们的本领域公知的含义。
此处用到的术语“等位基因”或“等位基因序列”是指编码多肽的基因(即编码结合域融合蛋白的多核苷酸)的天然存在的可变形式。等位基因也从突变(即核酸序列的改变)得到，有时产生改变的和/或不同调节的mRNAs或多肽，它们的结构和/或功能可能改变或不变。产生等位基因的常见突变通常是由于核苷酸的天然缺失、添加或取代，其可能影响或不影响编码的氨基酸。这些类型的改变中的每一种都可能是单独存在、与其它改变组合，或在特定基因、染色体或其它细胞多核苷酸中出现一次或多次。任何给定的基因都可能不具有等位基因形式、具有一种等位基因形式，或很多等位基因形式。此处用到的术语“等位基因”是指从基因转录的基因或mRNA，或这两者。
“氨基酸”是具有以下结构的分子，其中中间的碳原子(“alpha(α)-碳原子”)与氢原子、羧酸基团(其碳原子称作“羧基碳原子”)、氨基(其氮原子称作“氨基氮原子”)和侧链基团R连接。在掺入蛋白的过程中，氨基在连接一个氨基酸与另一个氨基酸的脱水反应中失去了其氨基酸羧基的一个或多个原子。因此，当掺入蛋白时，氨基酸通常称作“氨基酸残基”。氨基酸在掺入蛋白之前或之后可以被衍生或修饰(例如，通过糖基化、通过氧化两个非相邻半胱氨酸残基的硫醇侧链而形成胱氨酸，得到通常在稳定蛋白的折叠构象中起重要作用的二硫共价键)。氨基酸可以在蛋白中天然存在，或者它可以是非天然存在的(即，由合成方法如固相合成和其它自动化合成方法制备)。非天然存在的氨基酸的实例包括α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、L-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌苷酸、citralline、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基赖氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸，包括β和γ氨基酸、设计氨基酸(例如，β-甲基氨基酸、α-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸)和总体上的氨基酸类似物。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即具有例如与氢结合的α-碳、羧基、氨基和R基团，但具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，而保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指与氨基酸的通常化学结构具有不同的结构，但通常以与天然存在的氨基酸相同的方式起作用的化合物。
除了其取代基外，还存在每种氨基酸的两种不同的对映异构体形式，称作D和L。在哺乳动物中，在天然存在的蛋白中仅仅掺入L-氨基酸，但本发明涉及掺入了一个或多个D-氨基酸和L-氨基酸的蛋白，和仅仅包含D-氨基酸或仅仅包含L-氨基酸残基的蛋白。
本文中可以将以下缩写用于以下氨基酸(及其残基)：丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；和缬氨酸(Val，V)。
术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白序列、上述任意物质的片段，并且是指天然存在的或合成分子，以及适于与例如计算机结合的前述物质的电子形式或其它表示形式。
术语“抗体”是以最广泛的含义使用的，具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)、抗体片段(如Fab、F(ab′)2和Fv)，和抗体衍生物(如重组或合成的)，只要它们表现出需要的生物活性。抗体(Abs)和免疫球蛋白(Igs)是具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体表现出与特异性抗原的结合特异性，免疫球蛋白包括抗体和其它缺乏抗原特异性的抗体样分子。后一种类型的多肽例如是由淋巴系统以低水平产生的，并且由骨髓瘤以高水平产生。
天然抗体和免疫球蛋白通常是大约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，其包含两条轻(L)链和两条相同的重(H)链。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变区(VH)，其后是一些恒定区。每条轻链在一端具有可变区(VL)，在另一端具有恒定区。轻链的恒定区与重链的第一个恒定区连接在一起，而轻链可变区与重链可变区连接在一起。认为特定氨基酸残基形成了轻链和重链可变区之间的界面(Clothia et al.，J.Mol.Biol.186，651-66，1985)；Novotny and Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，4592-4596(1985))。根据重链组成定义了五类人免疫球蛋白，命名为IgG，IgM，IgA，IgE和IgD。IgG类和IgA类抗体进一步分为亚类，即，IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2。IgG、IgA和IgD抗体中的重链具有三个恒定区结构域，其称作CH1，CH2和CH3，IgM和IgE抗体中的重链具有四个恒定区结构域，即CH1，CH2，CH3和CH4。因此，重链具有一个可变区和三个或四个恒定区。免疫球蛋白结构和功能综述于例如Harlow et al.，Eds.，Antibodies：A Laboratory Manual，Chapter 14，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(1988)。
免疫球蛋白的重链也可以分为三个功能区：Fd区(包含VH和CH1，即重链的两个N-末端结构域的片段)、铰链区和Fc区(“片段可结晶区”，来自恒定区，在胃蛋白酶消化后形成)。Fd区与轻链组合形成Fab(″片段抗原结合″)。由于抗原将与每个Fab的氨基末端的抗原结合区进行立体化学反应，IgG分子是二价的，即，它能够结合两个抗原分子。Fc区含有与细胞上的免疫球蛋白受体相互作用，并且与补体级联的起始元件相互作用的结构域。因此，通常认为Fc片段负责免疫球蛋白的效应物功能，如补体固定和与Fc受体结合。胃蛋白酶有时也在重链的第三个恒定区(CH3)前进行切割，得到大片段F(abc)和小片段pFcb。这些术语也用于其它免疫球蛋白的类似区域。IgG、IgA和IgD类抗体中存在的铰链区作为使Fab部分能够在空间中自由移动的柔性间隔基。与恒定区相反，铰链区是结构上多样的，在各类和亚类免疫球蛋白之间的序列和长度都不同。
例如，IgG亚类之间的铰链区长度和柔性都不同。据报道，IgG1的铰链区包括216-231个氨基酸，由于其是自由柔性的，Fab片段可以围绕它们的对称轴旋转，并且在以两个重链间二硫键的第一个二硫键为中心的球体内移动。IgG2具有比IgG1短的铰链区，据报道是12个氨基酸残基和4个二硫键。IgG2的铰链区缺乏甘氨酸残基，其相对短，并且含有刚性的聚脯氨酸双螺旋，所述双螺旋由额外的重链间二硫键稳定。这些特性限制了IgG2分子的柔性。IgG3与其它亚类的区别在于其独特的伸长的铰链区(约是IgG1铰链区的4倍)，据报道其含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成非柔性的聚脯氨酸双螺旋。在IgG3中，Fab片段离Fc片段相对远，使分子具有更大的柔性。IgG3中伸长的铰链区也负责其与其它亚类相比更高的分子量。IgG4的铰链区比IgG1的铰链区短，其柔性介于IgG1和IgG2之间。据报道，铰链区的柔性以IgG3＞IgGl＞IgG4＞IgG2的顺序递减。4个IgG亚类彼此之间的差异也在于它们的效应物功能。这种差异与结构差异相关，包括可变区、Fab片段和恒定区Fc片段之间的相互作用方面的差异。
根据晶体学研究，免疫球蛋白铰链区可以进一步从功能上细分为三个区域：上铰链区、核心区和下铰链区。Shin et al.，1992Immunological Reviews 130：87。上铰链区包含CH1的羧基端的氨基酸至限制运动的铰链区的第一个残基，一般是第一个半胱氨酸残基，它在两条重链之间形成链间二硫键。上铰链区的长度与抗体的片段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫键，下铰链区连接CH2结构域的氨基末端并且包含CH2中的残基。Id.人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，当通过形成而二硫键进行二聚时，该序列形成一个环状八肽，人们认为该八肽作为一个轴，由此赋予柔性。铰链区也可以含有一个或多个糖基化位点，其包括一些结构上不同类型的碳水化合物附着位点。例如，IgA1通常在铰链区的一个17氨基酸的片段中含有5个糖基化位点，它们赋予了铰链区对肠蛋白酶的抗性，这被认为是分泌型免疫球蛋白的有利特征。
免疫球蛋白铰链区多肽的结构和柔性所允许的构象改变也可以影响抗体的Fc部分的效应物功能。与Fc区相关的效应物功能的三个大类包括(1)激活经典的补体级联，(2)与效应细胞相互作用和(3)免疫球蛋白的区室化。不同的人IgG亚类在其固定补体、或激活和扩增补体级联的步骤的相对效力方面有所不同。参见，例如Kirschfink，2001Immunol.Rev.180：177；Chakraborti et al.，2000 Cell Signal 12：607；Kohl et al.，1999 Mol.Immunol.36：893；Marsh et al.，1999 Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.8：557；Speth et al.，1999 Wien Klin.Wochenschr.111：378。
补体依赖性细胞毒性(CDC)被认为是用于清除诸如肿瘤细胞的特定靶细胞的重要机理。CDC是一系列事件，由一系列以级联方式彼此激活的酶组成。补体在清除抗原方面具有重要作用，伴随其四种主要功能：(1)局部血管扩张；(2)吸引免疫细胞，特别是巨噬细胞(趋化作用)；(3)标记外来生物，以便进行吞噬(调理)；和(4)通过膜攻击复合体破坏侵入的生物(MAC攻击)。中心的分子是C3蛋白。它是一种被经典途径或替代途径的成分分割成两个片段的酶。抗体，特别是IgG和IgM，诱导经典途径，而替代途径是由诸如脂多糖(LPS)的细菌产物非特异性刺激的。简言之，C3分割的产物包括对吞噬性免疫细胞具有趋化作用的小肽C3a，并且通过导致从C5释放C5a片段而导致局部血管扩张。C3的另一部分，即C3b，包被外来生物表面的抗原，并且调理生物，以进行破坏。C3b也与补体系统的其它成分反应，以形成由C5b，C6，C7，C8和C9组成的MAC。
一般说来，IgG1和IgG3最有效固定补体，IgG2效力较低，而IgG4不激活补体。补体激活是由C1q与抗原抗体复合物的结合起始的，C1q是级联中的第一个成分C1的一个亚基。尽管C1q的结合位点位于抗体的CH2结构域，铰链区影响抗体激活级联的能力。例如，缺乏铰链区的重组免疫球蛋白不能激活补体。Shin et at，1992。如果没有铰链区所赋予的柔性，与抗原结合的抗体的Fab部分可能不能采用允许C1q与CH2结合所需的构象。见上述参考文献。据报道，铰链区长度和片段柔性与补体激活相关；然而，该相关不是绝对的。例如，具有与IgG4相同的刚性的改变的铰链区的人IgG3分子仍然能够有效激活该级联。
这些抗体、其结合部分或片段、其铰链区部分或片段、其效应物区或部分，都可以用于本发明的构建体。
抗体可变区内容中的术语“可变”是指可变区的某些部分在抗体之间的序列中广泛不同，并且用于特定抗原的每种特定抗体的结合和特异性。但是，可变性在抗体的可变区中不是平均分布的。其在轻链和重链可变区中的三个称作互补决定区(CDRs)的片段中浓集，所述互补决定区也称作高变区。存在至少两种确定CDRs的技术：(1)基于跨物种序列可变性的方法(即Kabat et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institute of Health，Bethesda，Md.1987)；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Chothia，C.etal.(1989)，Nature 342：877)。至于申请人的抗IgE抗体，通过结合Kabat等人和Chothia等人的方法，确定了某些CDRs。可变区的更高度保守的部分称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区均包含4个FR区，大部分采用通过三个CDRs连接的β折叠构型，所述CDRs形成连接β折叠的环，在某些情况下形成β折叠的一部分。由FR区导致每条链中的CDRs紧密相邻，并且通过另一条链的CDRs，导致抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应物功能，如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。
术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，包括抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称作Fab片段，每个所述片段都具有单个抗原结合位点和残留的″Fc″片段，该名称是因为其容易结晶的能力。木瓜蛋白酶处理产生具有两个能够交联抗原的抗原结合片段的F(ab′)2片段和残留的其它片段(称作pFc′)。其它片段可以包括双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。此处针对抗体用到的“结合片段”是指Fv，F(ab)和F(ab′)2片段及其功能突变体和类似物。
Fab片段也称作F(ab)′，其也包含轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段的区别在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在此表示这样的Fab′，其中恒定区的半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab′)片段是通过在F(ab′)2胃蛋白酶消化产物的铰链区半胱氨酸裂解二硫键而制备的。抗体片段的其它化学偶联是本领域技术人员公知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的轻链可以归于两种明确不同的类型之一，基于它们恒定区的氨基酸，称作kappa(κ)和lambda(λ)。
此处用到的术语“单克隆抗体”是指获自基本均质的抗体群的抗体，即构成该群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在可能的天然突变。可以通过例如首先由Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)首先描述的杂交瘤法制备，或可以通过例如美国专利No.4,816,567中描述的重组方法制备。可以用Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)描述的技术和Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。
此处具体描述的单克隆抗体包括单克隆抗体或重组抗体或其片段，它们通过任何方法进行了改变，以便在人类中免疫原性较低。
因此，例如，此处具体描述的单克隆抗体/片段包括“嵌合”抗体和“人源化”抗体。通常，在嵌合抗体中，重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体或所述抗体的片段的相应序列相同或同源，只要它们表现出需要的生物活性(美国专利No.4,816,567)；Morrison et al.Proc.Natl Acad.Sci.81：6851-6855(1984)。
非人(如鼠)抗体或片段的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗体的其它抗原结合亚序列)，其含有很少的来源于非人免疫球蛋白的序列。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，受体的互补决定区的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有需要的特异性、亲和力和能力的CDR的残基取代。在某些情况下，相应的非人残基取代了人免疫球蛋白的Fv构架区残基。此外，人源化抗体可以包含既不存在于受体抗体，也不存在输入的CDR或构架区序列中的残基。进行了这些修饰，以便进一步改进和优化抗体性能。概言之，人源化抗体包含至少一个，一般是两个可变区的基本全部，其中全部或基本全部CDR区相应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且，全部或基本全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。进一步的细节参见例如：Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature 332：323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段可以包含存在于单个多肽链中的抗体的VH和VL结构域。scFv多肽可以进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，它使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。
术语“双抗体”包括具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在相同多肽链(VH-VL)中与轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)。例如，通过不采用接头，或采用过短，以至于不能使相同链上的两个结构域之间配对的接头，所述结构域被强制与另一条链的互补决定区配对，产生两个抗原结合位点。双抗体更完整描述于例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA90：6444-6448(1993)。
如此处用到的，这里出现的免疫球蛋白氨基酸残基的所有编号都是根据Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health，Bethesda，Md.1987)中的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行的。
概言之，术语“生物活性”是指具有天然分子的功能，例如结构、调节或生化功能的蛋白。功能活性可能小于、大于或大约等于天然分子。在本发明的治疗应用中，术语“生物活性”表明分子具有以正指向影响患疾病或病症的动物和/或以负指向影响病原体或寄生虫的活性。因此，例如，生物活性分子可能导致或促进动物中对病原体或寄生虫的生长和/或维持有害、或对具有异常生长或生化特征的细胞、组织或器官如癌细胞或炎症有害的生物或生化活性。
在本发明的预防应用方面，术语“生物活性”表明分子可以用于诱导或刺激免疫反应性或其它需要的反应，如抗蛋白酶反应。在某些优选的实施方案中，免疫反应性或其它反应被设计为预防性的。在其它优选的实施方案中，免疫反应性或其它反应被设计为导致动物的免疫或其它系统如蛋白酶系统与动物细胞的有害物如具有异常生长或生化特征的癌细胞反应。
此处用到的术语“结合构建体”和“结合域融合蛋白构建体”可以指例如工程化的构建体，其包括能够结合诸如抗原的靶的多肽、重组多肽、合成、半合成或其它融合蛋白。也可以包括一种或多种非肽序列，例如连接区。
“细胞”表示用于本发明目的，包括但不限于结合域融合蛋白的制备的任何存活的合适细胞。细胞包括真核和原核细胞。优选的真核细胞包括脊椎动物细胞，如哺乳动物细胞(例如人、鼠、羊、猪、马、犬和猫细胞)、鸟类细胞、鱼细胞，和无脊椎动物细胞，如昆虫细胞和酵母细胞。优选的原核细胞是细菌细胞。
此处用到的术语“组合物”意欲包括含有一种或多种以指定量或其它量存在的指定成分的产品，以及任何从所述指定量或其它量的指定成分的组合直接或间接得到的产品。
“化合物”是一种分子，并且包括例如小分子、蛋白、碳水化合物和脂质。
“已知与蛋白相互作用的化合物”表示鉴定为与蛋白或其它靶相互作用的化合物。
当描述多肽时，术语“保守取代”是指基本不改变多肽活性的多肽的氨基酸组成的改变，即用具有相似特性的其它氨基酸取代氨基酸。保守取代表提供了本领域公知的功能上相似的氨基酸。以下六组均含有通常理解为代表彼此保守取代的氨基酸：(1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；(2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和(6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)(也参见，Creighton，1984，Proteins，W.H.Freeman and Company)。
除了上文定义的保守取代，氨基酸残基的其它修饰也可以导致“保守修饰的变体”。例如，可以考虑所有带电氨基酸作为彼此的取代物，而不论它们是带正电还是带负电。此外，也可以通过改变、添加或缺失编码的序列中单个氨基酸或小百分比的氨基酸，例如，通常少于5％的氨基酸的取代、缺失或添加而得到保守修饰的变体。此外，通过将天然或野生型基因采用的氨基酸的密码子取代为相同氨基酸的不同密码子，可以从重组多肽制备保守修饰的变体。
术语“控制元件”或“调节序列”包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5’和3’非翻译区，多肽或其它生物分子与它们相互作用，以进行转录和翻译。对于真核细胞，控制序列通常包括启动子，优选包括增强子，例如，来源于免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒和聚腺苷酸化序列，并且可能包括剪接供体和受体序列。根据载体系统和利用的宿主，可以使用任何数目的合适转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。当提到结合域融合蛋白时，除天然与结合域融合蛋白编码序列相关的启动子外的启动子可以称作“异源”启动子。
“缺失”是指由于缺乏一个或多个氨基酸残基或核苷酸而导致的氨基酸或核苷酸序列的改变。术语“插入”或“添加”是指与参照序列，如天然分子中存在的序列相比，导致分别给分子或其表现物添加一个或多个氨基酸残基或核苷酸的氨基酸或核苷酸序列的改变。“取代”是指分别用不同的氨基酸或核苷酸取代一个或多个氨基酸或核苷酸。
此处用到术语“衍生物”包括多肽、多核苷酸或其它分子的化学修饰。在本发明的上下文中，“衍生物多肽”，例如，通过糖基化、聚乙二醇化、或任何相似过程修饰的衍生物多肽，保留了结合域融合蛋白活性。例如，术语结合域融合蛋白的“衍生物”包括例如通过添加一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸和/或其它所述分子而进行了化学修饰的结合域融合蛋白、变体或片段，其中所述分子不是天然与野生型结合域融合蛋白连接的。多肽的“衍生物”进一步包括通过例如相对于参照多肽进行了氨基酸取代、缺失或插入而“衍生”自参照多肽的那些多肽。因此，多肽可以“衍生”自野生型多肽或任何其它多肽。此处用到的化合物，包括多肽，也可以“衍生”自特定来源，例如，衍生自特定生物、组织类型，或特定多肽、核酸或特定生物或特定组织类型中存在的其它化合物。
此处用到的“可检测标记”具有本领域的常规含义，表示可以用于检测(例如，由于物理、化学或光学性质)、表明分子的存在、或使得能够结合另一种分子的原子(例如放射性核素)、分子(例如荧光素)或复合物，所述另一种分子与其共价结合或以其它方式缔合。术语“标记”也指对底物起作用，以产生可检测的原子、分子或复合物的共价结合的或以其它方式缔合的分子(例如生物分子，如酶)。适用于本发明的可检测标记包括例如通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电子、光学、化学或其它方法可检测的任何组分。
“病症”是任何可以从此处描述的分子或组合物的治疗获益的状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患考虑的病症的病理状况。
术语“表位”具有其通常的含义，即抗原或抗原性分子上的由抗体或其结合部分或其它结合分子如scFv识别的位点。表位可以是氨基酸分子或氨基酸片段，包括代表完整蛋白或多肽的一小部分的片段。表位可以是构象性的(即，不连续的)。也就是说，它们可以由一级序列的非连续部分编码的氨基酸形成，它们通过蛋白折叠而并列。
术语“融合蛋白”是指复合多肽，即，由单个氨基酸序列中融合或以其它方式直接或间接连接在一起的两个(或多个)不同的多肽组成的单个连续氨基酸序列。通常，该分子是直接连接的。但是，该分子可以间接连接，例如，通过另一序列或分子连接，前提是融合体的总体功能和/或活性不受到不利影响。因此，例如，融合蛋白可以包括含有两个完全不同的氨基酸序列或两个相似或相同的多肽序列的单个氨基酸序列，所述两个序列正常情况下不以相同构型一起存在于自然界存在的单个氨基酸序列中。融合蛋白可以用重组核酸方法制备，即作为重组基因融合产物的转录和翻译的结果，所述融合体包含编码本发明的多肽的片段和编码异源多肽的片段，或通过本领域公知的化学合成方法制备。
此处描述的结合域多肽的“高亲和力”是指至少约106M-1，优选至少约108M-1，更优选至少约109M-1或更高，更优选至少约1010M-1或更高，例如，最高达1012M-1或更高的缔合常数(Ka)。但是，“高亲和力”结合可以由于其它结合域多肽而改变。
“杂交”是指任何以下过程，即，通过该过程使单链核酸分子、其部分、或原本双链的核酸分子的单链区通过碱基配对与互补的单链核酸分子、其部分、或原本双链的核酸分子的单链区结合。杂交可以当两个核酸分子都在溶液中时进行，或者在溶液中的一个核酸分子和固定在固体支持物(例如纸、膜、滤膜、芯片、钉、载玻片、或核酸可以固定的任何其它合适的基质)上的另一个核酸分子之间进行。
术语“免疫原”和“免疫原性”具有它们在本领域中的常规含义，即免疫原是一种能够在导入个体或动物后立即诱导获得性免疫应答的分子，如多肽或其它抗原。
“分离的”分子(例如多肽或多核苷酸)是指存在于最初的环境之外或从最初的环境(例如，如果是天然存在的，则是天然环境)取出的分子。例如，活动物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但与天然系统(例如，蛋白、脂质、碳水化合物、核酸)中共存的一些或全部材料分开的该同一多核苷酸或多肽则是分离的。所述多核苷酸可以是载体的一部分，和/或所述多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分而在所述载体中仍然是分离的，因为所述载体或组合物不是其天然环境的一部分。
意欲进行治疗的“哺乳动物”是指任何分类为哺乳动物的动物，包括人、家养和饲养动物、非人灵长动物和动物园动物、运动动物或宠物，如狗、马、猫、牛等。
术语“调节”是指生物化学活性的改变。例如，调节可能涉及增加或减少催化速度、底物结合特征、和增加或减少表达等。调节可以通过例如与蛋白的共价或非共价相互作用而发生，并且可以涉及增加或减少生物化学活性。“调节剂”包括导致蛋白活性改变，即增加或减少的化合物，例如，典型地是配体，其是肽、多肽或小分子(例如激动剂或拮抗剂)。调节剂可能直接作用，例如，通过与蛋白相互作用，以导致活性的增加或减少。调节剂也可能间接作用，例如，通过干扰，即拮抗或阻断另一种导致蛋白活性增加或减少的分子的作用。此处以多种形式用到的感兴趣分子的“调节剂”和“调节”意欲包括与感兴趣的蛋白酶相关的活性的拮抗、激动、部分拮抗和/或部分激动。在多种实施方案中，“调节剂”可能抑制或刺激蛋白酶表达或活性。所述调节剂包括蛋白酶分子的小分子激动剂和拮抗剂、反义分子、核酶、三螺旋分子和RNAi多核苷酸，以及其它分子。
术语“核酸”、“核酸分子”等是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段。这些术语也表示细胞或合成来源的单链或双链DNA和/或RNA。在此上下文中，“片段”是指当翻译时产生保留天然存在的多肽的一些功能特征如抗原性或保留天然存在的多肽的结构域的多肽。除非特别限制，多核苷酸序列的公开也意欲表示互补序列。此处用到的术语“多核苷酸”包括寡核苷酸。
术语“可操作性相关的”和“可操作性连接的”是指功能相关的核酸分子。例如，如果启动子辅助控制合适的宿主细胞或其它表达系统中编码的多肽的转录和/或翻译，则启动子与编码序列可操作性相关或可操作性连接。尽管可操作性相关或可操作性连接的核酸分子可以是相邻的并且处于同一读码框中，某些遗传元件不需要相邻地连接于编码要表达的多肽的核酸。例如，增强子不需要与编码序列紧密相邻，其中所述增强子增强所述编码序列的表达。
术语“同一性百分比(％)”表示比较两个或多个氨基酸序列时发现的序列相似性百分比。可以用任何合适的软件电子确定同一性百分比。同样，通过比较一个多肽的氨基酸序列与第二个多肽的氨基酸序列，确定两个多肽(或所述多肽中的一个或全部两个多肽的一个或多个部分)之间的“相似性”。可以对任何可用于所述比较的合适算法进行修改，用于本发明的内容中。
“可药用”表示例如与制剂中的其它成分相容，并且通常对于给接受者施用是安全的载体、稀释剂或赋形剂。
术语“多肽”在此可以与术语“蛋白”互换使用，并且表示包含通过酰胺键连接的氨基酸残基的聚合物，包括其合成的、天然存在的和非天然存在的类似物(氨基酸和键)。肽是多肽的实例。
“多核苷酸”表示多个核苷酸。因此，术语“核苷酸序列”或“核酸”或“多核苷酸”或“寡核苷酸”可以互换使用，并且是指核苷酸的杂聚物，或这些核苷酸的序列。这些术语也表示基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的，并且可以代表有义链或反义链，该术语也表示肽核酸(PNA)或任何DNA样或RNA样物质。考虑当多核苷酸是RNA时，此处提供的序列中的T(胸腺嘧啶)被U(尿嘧啶)取代。编码多肽、多肽片段或多肽变体的多核苷酸是指编码以下物质的多核苷酸：自然界中存在的多肽的成熟形式；自然界中存在的多肽的成熟形式及额外的编码序列，例如前导序列或信号序列或前蛋白序列；前述任意序列和非编码序列(例如内含子或自然界中存在的多肽的成熟形式的编码序列5’和/或3’的非编码序列)；自然界中存在的多肽的成熟形式的片段；和自然界中存在的多肽的成熟形式的变体。因此，术语“编码结合域融合蛋白的多核苷酸”等包括了仅仅包含需要的结合域融合蛋白、片段或变体的编码序列的多核苷酸，以及包括了额外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
概言之，术语“蛋白”是指通过肽键连接的两个或多个氨基酸(不论是否是天然存在的)，当与一个氨基酸(或氨基酸残基)的α-碳键合的羧酸基团的羧基碳原子共价结合于与邻接的氨基酸的α-碳键合的氨基的氨基氮原子时发生所述肽键合。这些肽键，以及构成它们的原子(即α-碳原子、羧基碳原子(及其取代氧原子)和氨基氮原子(及其取代氢原子))形成了蛋白的“多肽主链”。此外，此处用到的术语“蛋白”理解为包括术语“多肽”和“肽”(其有时可以互换使用)。类似地，蛋白片段、类似物、衍生物和变体在此也可以称作“蛋白”，并且除非指出其它意思，应该认为是“蛋白”。术语蛋白的“片段”是指包含的氨基酸残基少于蛋白的所有氨基酸残基的多肽。应该理解，蛋白的“片段”可以是在氨基末端、羧基末端和/或内部截短(如通过天然剪接)的蛋白，并且也可以是变体和/或衍生物。蛋白的“结构域”也是一种片段，并且包括赋予相应于天然存在的蛋白的生物化学活性所需的蛋白的氨基酸残基。
“变体”或“类似物”是指相对于参照蛋白(例如蛋白的天然存在形式)改变了一个或多个氨基酸的蛋白，所述改变例如是通过一个或多个氨基酸序列取代、缺失和/或插入。变体或类似物可以具有“保守”改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性(例如用异亮氨酸取代亮氨酸)。或者，变体或类似物可以具有一个或多个“非保守”改变(例如，用色氨酸代替甘氨酸)。其它变异包括氨基酸缺失或插入，或这两者。所述变体和类似物可以从相应的核酸分子变体制备，所述变体具有从例如结合域融合蛋白构建体的核苷酸序列进行相应改变的核苷酸序列。
此处用到的术语“类似物”通常是指一种化合物，它通常与另一化合物(所述一种化合物是所述另一化合物的类似物)或“母体”化合物结构相似。通常，类似物将保留母体化合物的某些特征，如生物学或药理学活性。类似物可能缺乏其它较不理想的特征，如抗原性、蛋白水解不稳定性、毒性等。类似物包括以下化合物，其中减少了母体的特定生物活性，而母体的一种或多种独特的生物活性在“类似物”中不受影响。在应用于多肽时，术语“类似物”可能与母体化合物具有各种范围的氨基酸序列同一性，例如，与母体中给定氨基酸序列或母体的选定部分或结构域中的氨基酸具有至少约70％，更优选至少约80％-85％或约86％-89％，更优选至少约90％，约92％，约94％，约96％，约98％或约99％的同一性。在应用于多肽时，术语“类似物”通常是指包括至少3个氨基酸的片段、与结合域融合蛋白的至少一部分具有显著同一性的多肽。类似物的长度典型是至少5个氨基酸，至少20个氨基酸或更长，至少50个氨基酸或更长，至少100个氨基酸或更长，至少150个氨基酸或更长，至少200个氨基酸或更长，更典型是至少250个氨基酸或更长。一些类似物缺乏主要生物活性，但仍然可以用于多种用途，如产生针对预定表位的抗体、作为免疫试剂通过亲和层析检测和/或纯化反应性抗体，或作为结合域融合蛋白功能的竞争性或非竞争性激动剂、拮抗剂或部分激动剂。
除非指出其它意思，蛋白的氨基酸序列(即其“一级结构”或“一级序列”)将按照氨基末端到羧基末端的方向书写。在非生物系统(例如采用固相合成的那些)中，蛋白的一级结构(其也包括二硫(半胱氨酸)键定位)可以由用户确定。
术语“蛋白酶(proteinase)”和“蛋白酶(protease)”可以互换使用。“蛋白酶”能够降解靶蛋白序列，如通过断裂多肽的一个或多个酰胺键，或通过从靶蛋白除去一个或多个氨基酸的任何其它方式。
术语“蛋白酶(proteinase)抑制剂”和“蛋白酶(protease)抑制剂”在此可以互换使用，包括任何影响或调节蛋白酶活性的试剂，包括蛋白试剂或非蛋白试剂。
术语“重组”是指合成或以其它方式体外操作的多核苷酸(如“重组多核苷酸”)、用重组多核苷酸在细胞或其它生物系统中制备基因产物的方法、或由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。因此“重组”多核苷酸是由其制备方法或其结构定义的。在提到其制备方法时，该过程是指采用重组核酸技术，例如，涉及核苷酸序列的人类干预，通常是选择或生产。或者，它可以是通过建立包含两个或多个在天然情况下不彼此邻接的片段的融合体的序列而制备的多核苷酸。因此，例如，包括了通过用任何非天然存在的载体转化细胞而制备的产物，如包含用任何合成寡核苷酸方法衍生的序列的多核苷酸。类似地，“重组”多肽是从重组多核苷酸表达的多肽。
“重组宿主细胞”是包含载体的细胞，所述载体例如是克隆载体或表达载体，或者是通过重组技术进行了其它操作以表达感兴趣的蛋白的细胞。
“小分子”包括分子量通常小于约5,000道尔顿的有机分子。小分子可以是天然存在的或合成的。小分子包括例如有机蛋白酶抑制剂。
当提到抗体或其它结合分子和蛋白或多肽或表位之间的相互作用时，术语“特异性免疫反应性”或“特异性结合”是指识别并且以高亲和力可检测性结合感兴趣的靶的抗体或其它结合分子。优选地，在指定或需要的条件下，指定的抗体或结合分子结合于特定多肽、蛋白或表位，并且不以显著量或不理想的量结合样品中存在的其它分子，即它们不与非靶抗原和/或表位进行不理想的交叉反应。多种免疫测定形式可以用于选择与特定多肽免疫反应并且具有需要的特异性的抗体或其它结合分子。例如，常规用固相ELISA免疫测定选择具有需要的免疫反应性和特异性的单克隆抗体。对于免疫测定形式和用于确定或评估免疫反应性和特异性的条件的描述，参见Harlow，1988，ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring HarborPublications，New York(下文称作″Harlow″)。因此，例如，术语“特异性结合”、“特异性地结合”、“特异性”等是指蛋白和调节剂(例如激动剂或拮抗剂)、抗体等之间的不是随机的相互作用。“选择性结合”、“选择性”等是指化合物与一种分子的相互作用相对于与另一种分子的相互作用的优先性。优选地，化合物特别是调节剂与蛋白之间的相互作用是特异性和选择性的。
术语“稳定转化的”是指插入宿主细胞并且存在于宿主细胞中的核酸分子，它是作为宿主细胞基因组DNA的一部分，或作为独立的分子(例如，染色体外)，并且在亲代宿主细胞中保持并复制，使得它通过宿主细胞的连续世代进行传递。
术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间杂交的调节。可以由盐浓度、有机溶剂(例如甲酰胺)的浓度、温度和本领域公知的其它条件定义严格条件。具体地，可以通过减少盐浓度、增加有机溶剂(例如甲酰胺)的浓度、或升高杂交温度而增加严格性。例如，严格盐浓度通常是小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，最优选小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。可以在缺乏有机溶剂如甲酰胺的条件下获得低严格性杂交，而可以在存在有机溶剂(例如至少约35％甲酰胺，最优选至少约50％甲酰胺)的条件下获得高严格性杂交。严格温度条件通常包括温度为至少约30℃，更优选至少约37℃，最优选至少约42℃。改变其它参数，例如杂交时间、去污剂如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及引入或排除载体DNA，是本领域技术人员公知的。通过按照需要组合这些各种条件可以实现各种严格性水平，并且这是本领域技术人员公知的。严格杂交条件也可以通过以下条件定义，即比靶序列和与靶精确或几乎精确互补的探针之间的解链温度(Tm)低约5℃-约20℃或25℃的温度。此处用到的解链温度是双链核酸分子的群体一半解离为单链的温度。计算核酸的Tm的方法是本领域公知的(参见例如Bergerand Kimmel，1987，METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.152：Guide ToMolecular Cloning Techniques，San Diego：Academic Press，Inc.，和Sambrook et al.(1989)MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，2nd Ed.，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory)。如标准参考文献指出的，当核酸在1M NaCl的水溶液中时，可以通过公式Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算Tm值的简单估计值(参见例如Andersonand Young，″Quantitative Filter Hybridization″in NUCLEIC ACIDHYBRIDIZATION(1985))。其它参考文献包括了更精确的计算，其中在Tm的计算中考虑了结构和序列特征。杂交体的解链温度(因此，严格杂交的条件)受到多种因素影响，所述因素如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定，等)、盐浓度和其它成分(例如是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)。这些因素的效果是公知的，并且讨论于本领域的标准参考文献中，参见例如上文引用的Sambrook的文献和Ausubel的文献。典型地，严格杂交条件是盐浓度小于约1.0M钠离子、典型约0.01-1.0M钠离子，pH7.0-8.3，温度对于短探针(例如10-50个核苷酸)是至少约30℃，对于长探针(例如多于50个核苷酸)是至少约60℃。如指出的，通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂也可以实现严格条件，在此情况下可以采用较低的温度。
术语“基本纯化的”或“分离的”是指从天然环境取出，因此是分离或分开的核酸或多肽，因此至少约50％，优选60％，更优选至少约75％，最优选至少约90％或更高比例不含其它与其天然相关的成分。因此，当蛋白占含有蛋白的组合物的总蛋白含量的约50％以上，典型地，占总蛋白含量的约60％以上时，认为蛋白或多肽是基本纯的。更典型地，基本纯的或分离的蛋白或多肽占总蛋白的至少75％，更优选至少90％。优选地，蛋白将占组合物中总蛋白的约90％以上，更优选约95％以上。当提到多核苷酸时，“基本纯的”或“分离的”通常是指从通常相关的污染物如脂质、蛋白和其它多核苷酸分开的多核苷酸。本发明的基本纯的或分离的构建体，包括多核苷酸，将大于约50％纯。典型地，这些构建体将是大于约60％纯，更典型，约75％-约90％纯，优选约95％-约98％纯。
“取代”变体是天然序列中的至少一个氨基酸残基被除去，在相同位置插入了不同氨基酸的变体。取代可以是单个，其中仅仅取代了分子中的一个氨基酸，或可以是多个，其中在相同的分子中取代了两个或更多氨基酸。“插入”变体是在天然序列中的特定位置的氨基酸紧密相邻的位置插入一个或多个氨基酸的变体。紧密相邻于氨基酸表示连接于氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团。“缺失”变体是除去了天然氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的变体。通常，缺失变体在分子的特定区域中缺失了一个或两个氨基酸。
“合成”的分子(例如核酸、蛋白或小分子)是全部或部分通过化学合成方法制备的分子。
“靶蛋白酶”包括通过此处描述的结合域融合蛋白直接或间接调节的蛋白酶。“蛋白酶相关分子”包括与特定靶蛋白酶邻近，或以其它方式与特定靶蛋白酶相关的分子，使得结合域融合蛋白的结合能够抑制或调节靶蛋白酶。多种非限定性实例包括在表达特定靶蛋白酶的特定细胞类型中或表面上表达的蛋白酶相关分子。蛋白酶相关分子也包括但不限于已知表达特定靶蛋白酶的细胞类型上的细胞表面抗原。
术语“治疗有效量”表示受试化合物的量将诱导例如研究者、兽医、医生或其它临床人员研究的组织、系统、动物或人的需要的反应，例如生物或医学反应。
“治疗”是指治疗性处理和预防或防止措施。需要治疗的受试者包括已经患有病症的那些和要预防病症或停止或延缓病症进展的那些。
“转化”描述了外源核酸分子进入受体细胞的过程。转化可以根据本领域公知的多种方法在天然或人工条件下进行，并且可以依赖于已知方法将外源核酸分子插入原核或真核宿主细胞。基于转化的宿主细胞类型选择转化方法，可以包括病毒感染、磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂转染和粒子轰击。“转化的”细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能够作为自主复制的质粒或作为宿主染色体的一部分而复制，也包括瞬时转化的细胞，其中插入的核酸分子可能不复制或分离。
术语“载体”是指用于将核酸送递到细胞的质粒、噬菌体、病毒或其它系统(天然存在或合成的)形式的核酸分子扩增、复制和/或表达运载体，其中质粒、噬菌体或病毒在细菌、酵母、无脊椎动物和/或哺乳动物宿主细胞中可以是有功能的。载体可能保持独立于宿主细胞基因组DNA，或可能全部或部分整合到基因组DNA中。载体通常但不一定含有使其在相容的宿主细胞中有功能的所有元件。“表达载体”是能够在合适的条件下指导外源多核苷酸如编码结合域融合蛋白的多核苷酸表达的载体。
本发明的构建体
此处提供了用作治疗剂，以及用于其它目的，包括诊断和研究目的的新分子和组合物。这些化合物可以具有结合功能和一种或多种靶蛋白酶调节活性。
本发明提供了包含构建体和结合域融合蛋白的组合物，以及获得所述构建体和结合域融合蛋白的方法，所述构建体和结合域融合蛋白用于例如控制或预防炎症、炎症反应和细菌、真菌和病毒感染、涉及异常细胞增殖的疾病，包括癌症，以及抑制参与一种或多种状况、反应或疾病过程，或与一种或多种状况、反应或疾病过程相关的蛋白酶。
此处提供的构建体和结合域融合蛋白可以具有例如2-7个多肽结构域，一些实施方案包括2-5个多肽结构域。每个多肽结构域通常具有需要的功能或结构特征，并且是组件式的，因为每个结构域可以是任何保留结合域融合蛋白和/或其任何成分的所需功能活性的顺序。
在一些实施方案中，构建体优选不具有结合域，如包含免疫球蛋白可变区的那些。这些构建体可以用于此处描述的多种治疗方法中。这些实施方案可以例如包含两个结构域、基本由两个结构域组成、或由两个结构域组成，所述结构域如蛋白酶抑制剂结构域和免疫球蛋白恒定区结构域。这些类型的构建体的实例包括SLPI-CH2CH3或SLPI类似物-Ig。免疫球蛋白恒定区可以包括此处提到的任意那些，例如IgE的CH1，CH2，CH3和CH4结构域中的一个或多个。所述构建体可以例如包含捕获蛋白家族成员蛋白结构域或其类似物和免疫球蛋白恒定区结构域，基本由捕获蛋白家族成员蛋白结构域或其类似物和免疫球蛋白恒定区结构域组成、或由捕获蛋白家族成员蛋白结构域或其类似物和免疫球蛋白恒定区结构域组成。这些类型的构建体的非限定性实例包括SLPI-CH2CH3和SLPI-CH1CH2CH3。在某些实施方案中，可以将氨基酸取代导入一个或多个恒定区结构域。例如，在某些进一步的实施方案中，通过在CH2结构域添加半胱氨酸残基，导入二硫键。在另一方面，提供了不具有结合域的融合蛋白。其它实施方案包含3个结构域、基本由3个结构域组成、或由3个结构域组成，所述结构域如蛋白酶抑制剂结构域、连接区结构域和免疫球蛋白恒定区结构域。这些实施方案的非限定性实例包括SLPI-CH1-铰链区-CH2CH3和SLPI-铰链区-CH2CH3。在某些进一步的实施方案中，例如，包含SLPI-CH1-铰链区-CH2CH3的构建体与结合域-轻链恒定区共表达，以提供双特异性样分子。已经描述过与捕获蛋白相关的某些蛋白和蛋白结构域，如描述于Schummer等的名称为″Diagnosis of Carcinomas″的USSN10/233,150中的HE4a融合蛋白，所述文件公开为US 2003/0108965A1，在此全文引入这两篇文献作为参考，其可以包括在本发明的某些实施方案中，或排除于本发明的某些实施方案之外。
结合域融合蛋白的一些实施方案具有两个多肽结构域，包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：i)抗蛋白酶相关的靶结合域和ii)蛋白酶抑制剂。在某些实施方案中，结合域融合蛋白包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：具有能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽和能够已知所述蛋白酶的第二多肽结构域(包括蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂结构域)。这种类型的分子的一个实例是抗-CD28scFv-HSLPI(SEQ ID NO：)。参见图5。
在某些实施方案中，结合域融合蛋白具有三个多肽结构域，包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：i)具有能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽；ii)包含蛋白酶抑制剂结构域、基本由蛋白酶抑制剂结构域组成、或由蛋白酶抑制剂结构域组成的第二多肽；和iii)包含一个或多个TGase基序、基本由一个或多个TGase基序组成、或由一个或多个TGase基序组成的第三多肽。
在其它实施方案中，结合域融合蛋白具有四个多肽结构域，例如包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：i)具有能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽；ii)包含蛋白酶抑制剂结构域的第二多肽；iii)包含一个或多个TGase基序、基本由一个或多个TGase基序组成、或由一个或多个TGase基序组成的第三多肽，和任选的iv)连接这些多肽中的一个或多个多肽的连接区(如连接第一多肽和第二多肽、连接第二和第三多肽、和/或连接第一和第三多肽)。
其它结合域融合蛋白可以包括一个或多个二聚结构域，并且具有四个或五个多肽结构域。例如，在某些实施方案中，结合域融合蛋白具有四个多肽结构域，包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：i)具有能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽；ii)包含蛋白酶抑制剂结构域的第二多肽；iii)包含一个或多个TGase基序的第三多肽，和iv)一个或多个二聚结构域(如1-5个或更多)。这些实施方案的合适二聚结构域包括免疫球蛋白铰链区或变体或类似物，例如，二聚结构域可以是免疫球蛋白CH2CH3结构域或免疫球蛋白CH3结构域或类似物(如IgG CH2CH3或CH3，IgACH2CH3或CH3)。
其它结合域融合蛋白具有五个多肽结构域。示例的实施方案包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：i)具有能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽；ii)包含蛋白酶抑制剂结构域、基本由蛋白酶抑制剂结构域组成、或由蛋白酶抑制剂结构域组成的第二多肽；iii)包含一个或多个TGase基序、基本由一个或多个TGase基序组成、或由一个或多个TGase基序组成的第三多肽；iv)连接这些多肽中的一个或多个多肽的连接区；和v)一个或多个二聚结构域(如1-5个或更多)。
具有四个多肽结构域的结合域融合蛋白的其它实施方案包括，例如，包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成的结合域融合蛋白：i)包含能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽、基本由能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽组成、或由能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽组成的第一多肽；ii)包含连接于所述第一多肽的连接区、基本由连接于所述第一多肽的连接区组成、或由连接于所述第一多肽的连接区组成的第二多肽；iii)包含蛋白酶抑制剂结构域、基本由蛋白酶抑制剂结构域组成、或由蛋白酶抑制剂结构域的第三多肽；和iv)包含恒定区或其部分、基本由恒定区或其部分组成、或由恒定区或其部分组成第四多肽。在某些实施方案中，免疫球蛋白恒定区实施方案包括免疫球蛋白CH3区、基本由免疫球蛋白CH3区组成、或由免疫球蛋白CH3区组成，所述CH3区包括CH3类似物。在其它实施方案中，结合域融合蛋白包括其它免疫球蛋白恒定区或类似物、基本由其它免疫球蛋白恒定区或类似物组成、或由其它免疫球蛋白恒定区或类似物组成，所述免疫球蛋白恒定区或类似物包括此处描述的那些。
具有四个结构域的结合域融合蛋白的其它实施方案包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：i)能够结合靶或靶相关分子的多肽结合域多肽，ii)连接区，iii)包含一个或多个WAP结构域、基本由一个或多个WAP结构域组成、或由一个或多个WAP结构域组成的多肽蛋白酶抑制剂结构域，iv)一个或多个二聚结构域，所述WAP结构域位于二聚结构域N末端。某些其它实施方案包含i)具有能够结合蛋白酶或蛋白酶相关分子的结合域多肽的第一多肽；ii)包含与所述第一多肽连接的连接区的第二多肽；iii)包含蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域、基本由蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域组成、或由蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂结构域组成的第三多肽；和iv)一个或多个二聚结构域，其中所述第一多肽位于所述第二多肽的N末端，所述第二多肽位于所述蛋白酶抑制剂结构域的N末端，其中所述蛋白酶抑制剂结构域包括一个或多个WAP结构域，并且其中所述一个或多个WAP结构域位于所述一个或多个二聚结构域的N末端。
具有四个结构域的结合域融合蛋白的其它实施方案包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：i)能够结合靶或靶相关分子的多肽结合域多肽，ii)连接区，iii)一个或多个二聚结构域，iv)包含一个或多个WAP结构域的多肽蛋白酶抑制剂结构域，所述二聚结构域位于多肽蛋白酶抑制剂结构域N末端。
具有五个结构域的结合域融合蛋白的某些其它实施方案也可以包含以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：i)能够结合靶或靶相关分子的多肽结合域多肽，ii)连接区，iii)包含一个或多个WAP结构域、基本由一个或多个WAP结构域组成、或由一个或多个WAP结构域组成的多肽蛋白酶抑制剂结构域，iv)一个或多个TGase结构域，v)一个或多个二聚结构域，所述多肽蛋白酶抑制剂结构域位于TGase结构域N末端，所述TGase结构域位于二聚结构域N末端。
结合域融合蛋白的其它示例实施方案包括但不限于NH3 +-{VL-VH或VH-VL}间隔基{WAPx}间隔基IgG1CH3}y-COO-，NH3 +-{VL-VH或VH-VL}间隔基{TIMP-2x}间隔基{IgG1CH3}y-COO-，NH3+-{VL-VH或VH-VL}间隔基{半胱氨酸蛋白酶抑制剂x}间隔基{IgG1CH3}y-COO-，其中x是0-5，最优选是1或2，y是0-5，优选1或2。本发明的第二种优选实施方案是但不限于NH3 +-{VL-VH或VH-VL}间隔基{WAPx}间隔基{IgGACH3}y-COO-，NH3 +-{VL-VH或VH-VL}间隔基{TIMP-2x}间隔基{IgGACH3}y -COO-和NH3 +-{VL-VL或VH-VL}间隔基{半胱氨酸蛋白酶抑制剂x}间隔基{IgGACH3}y-COO-。在本发明的范围内，包括了结合域融合蛋白中蛋白抑制结构域的所有组合，包括但不限于NH3 +-{VL-VH或VH-VL}间隔基{WAPa-TIMP-2b-半胱氨酸蛋白酶抑制剂c}间隔基{IgG1CH3}y-COO-，其中a+b+c等于1-5，a、b和C是0-5，各个蛋白抑制结构域是任意顺序，有或没有分隔它们的间隔基。
这些实施方案是多肽结构域的特定组合的非限制性实例，通过下文更详细描述的任意组件式多肽结构域的所需定位，可以获得许多其它的结合域融合蛋白。
蛋白酶抑制剂结构域
结合域融合蛋白的合适的蛋白酶抑制结构域包括包含WAP基序、基本由WAP基序组成、或由WAP基序组成的分子，包括例如具有WAP基序的捕获蛋白。可以使用一个或多个WAP基序或其部分，包括但不限于具有与WAP基序相关的蛋白序列的结构域和包含具有蛋白酶抑制活性的WAP基序的片段和变体、基本由所述片段和变体组成、或由所述片段和变体组成的结构域。WAP结构域可以来源于哺乳动物，包括，例如人、非人灵长动物、骆驼类s、沙袋鼠，或来源于其它动物，包括，例如爬行动物、鸟类(如鸡)。
概言之，结合域融合蛋白的蛋白酶抑制剂结构域可以例如包含以下任何成分、基本由以下任何成分组成、或由以下任何成分组成：具有蛋白酶抑制剂活性的捕获蛋白多肽、具有蛋白酶抑制剂活性的捕获蛋白多肽的天然和非天然存在的类似物、SLPI多肽、具有蛋白酶抑制剂活性的SLPI多肽的天然和非天然存在的类似物、抑弹性蛋白酶蛋白多肽、具有蛋白酶抑制剂活性的抑弹性蛋白酶蛋白多肽的天然和非天然存在的类似物、具有蛋白酶抑制剂活性的WAP基序多肽、具有蛋白酶抑制剂活性的所述WAP基序多肽的天然和非天然存在的类似物、具有蛋白酶抑制剂活性的TIMP多肽、具有蛋白酶抑制剂活性的TIMP多肽的天然和非天然存在的类似物、具有蛋白酶抑制剂活性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂多肽、具有蛋白酶抑制剂活性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂多肽的天然和非天然存在的类似物、具有蛋白酶抑制剂活性的防卫素多肽和具有蛋白酶抑制剂活性的防卫素多肽的天然和非天然存在的类似物。
可以用于结合域融合蛋白中的WAP结构域或含有WAP结构域的蛋白的特定实例包括但不限于人抗白细胞蛋白酶1前体(ALP)(蛋白酶抑制剂WAP4，Swiss-Prot ALK1_HUMAN P03973)；抑弹性蛋白酶蛋白前体(弹性蛋白酶特异性抑制剂，人皮肤来源的抗白细胞蛋白酶(SKALP)，蛋白酶抑制剂WAP3，Swiss-Prot ELAF_HUMAN P19957)；猪抑弹性蛋白酶蛋白前体(WAP-1蛋白，Swiss-Prot ELAF_PIG Q29125)；人eppin前体(附睾蛋白酶抑制剂)(具有Kunitz和WAP结构域1的丝氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白(蛋白酶抑制剂WAP7，Swiss-Prot EPPI_HUMANO95925，TrEMBL Q86TP9，Entrez protein NP_852479，AAH44829，NP_065131)；猕猴eppin前体(附睾蛋白酶抑制剂)(具有Kunitz和WAP结构域1的丝氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白，Swiss-Prot EPPI_MACMUQ9BDL1)；小鼠eppin前体(附睾蛋白酶抑制剂，具有Kunitz和WAP结构域1的丝氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白，Swiss-Prot EPPI_MOUSEQ9DA01，Entrez protein AAH48637)；黑颈眼镜蛇nawaprin(类似于抑弹性蛋白酶蛋白)(Swiss-Prot NWAP_NAJNG P60589)；猪钠/钾ATP酶抑制剂SPAI-2前体(WAP-2蛋白，Swiss-Prot SPAI_PIG P16225)；小鼠单WAP基序蛋白1前体(抑弹性蛋白酶蛋白样蛋白I，Swiss-ProtSWM1_MOUSEQ9JHY4，Entrez protein NP_067020)；小鼠单WAP基序蛋白2前体(抑弹性蛋白酶蛋白样蛋白II，Swiss-Prot SWM2_MOUSEQ9JHY3)；猪WAP-3蛋白前体(Swiss-Prot WAP3_PIG Q29126)；人WAP四-二硫化物核心结构域蛋白10A前体(推定的蛋白酶抑制剂WAP 10A，Swiss-Prot WFAA_HUMAN Q9H1FO，Entrez protein：NP_542791，XP215918)；大鼠WAP 10A前体(Entrez proteinXP_215918)；小鼠WAP 10A前体(Entrez protein XP_130649)；人蛋白WFDC10B前体(Swiss-Prot WFAB_HUMAN Q8IUB3)；鸡WAP四-二硫化物核心结构域蛋白1前体(ps20蛋白，Swiss-Prot WFD1_CHICKQ8JG33，Entrez protein NP_542181)；人WAP四-二硫化物核心结构域蛋白1前体(前列腺基质蛋白ps20)(ps20生长抑制剂，Swiss-Prot WFD1_HUMAN Q9HC57)；小鼠WAP四-二硫化物核心结构域蛋白1前体(前列腺基质蛋白ps20，ps20生长抑制剂Swiss-Prot WFD 1_MOUSEQ9ESH5)；大鼠WAP四-二硫化物核心结构域蛋白1前体(前列腺基质蛋白ps20)(ps20生长抑制剂Swiss-Prot WFD1_RAT070280)；狗WAP四-二硫化物核心结构域蛋白2前体(主要的附睾特异性蛋白E4(CE4)，附睾分泌蛋白E4，Swiss-Prot WFD2_CANFA Q28894)；人WAP四-二硫化物核心结构域蛋白2前体(主要的附睾特异性蛋白E4，附睾分泌蛋白E4，推定的蛋白酶抑制剂WAP5 Swiss-Prot WFD2_HUMAN Q14508，Entrez protein NP_542771，NP_542772，NP_542773，NP_542774，NP006094，NP_003055)；小鼠WAP四-二硫化物核心结构域蛋白2前体(WAP结构域蛋白HE4，Swiss-Prot WFD2_MOUSE Q9DAU7)；猪WAP四-二硫化物核心结构域蛋白2前体(附睾分泌蛋白E4，Swiss-ProtWFD2_PIG Q8MI69)；兔WAP四-二硫化物核心结构域蛋白2前体(主要的附睾特异性蛋白E4，附睾蛋白BE-20，Swiss-Prot WFD2_RABITQ28631)；大鼠WAP四-二硫化物核心结构域蛋白2前体(附睾分泌蛋白4(RE4)，Swiss-Prot WFD2_RAT Q8CHN3)；人WAP四-二硫化物核心结构域蛋白3前体(推定的蛋白酶抑制剂WAP14，Swiss-ProtWFD3_HUMAN Q8IUB2，Entrez  protein：NP_852666，NP_852782，NP_852663)；人WAP四-二硫化物核心结构域蛋白5前体(推定的蛋白酶抑制剂WAP1，Swiss-Prot WFD5_HUMAN Q8TCV5，Entrez protein：N_663627，AAH39173，AAK72468)；人WAP四-二硫化物核心结构域蛋白6前体(推定的蛋白酶抑制剂WAP6，Swiss-Prot WFD6_HUMANQ9BQY6，Entrez 15 protein NP_543017)；人WAP四-二硫化物核心结构域蛋白8前体(推定的蛋白酶抑制剂WAP8，Swiss-ProtWFD8_HUMAN Q8IUA0，Entrez protein：NP_570966，NP_852611)；推定的小鼠WAP8(Entrez protein XP_204940)；人蛋白WFDC9前体(Swiss-Prot WFD9_HUMAN Q8NEX5)；人蛋白WFDC11前体(SwissProt WFDB_HUMAN Q8NEX6，Entrez protein NP_671730)；WAP四-二硫化物核心结构域蛋白12前体(推定的蛋白酶抑制剂WAP12，Swiss-Prot WFDC_HUMAN Q8 WWY7，Entrez protein：NP_742143，NP_543145，NP_742003)；蛋白WFDC13前体(Swiss-ProtWFDD_HUMAN Q8IUB5)；具有kunitz/牛胰蛋白酶抑制剂结构域和WAP型(乳清酸性蛋白)四-二硫化物核心结构域的人蛋白，TrEMBLQ9H3Y3)；人ps20 WAP型四-二硫化物核心结构域蛋白(Entreznucleotide AAG15263.1)，阿拉伯骆驼乳清酸性蛋白(WAP，Swiss-ProtWAP_CAMDR P09837)，沙袋鼠乳清酸性蛋白(WAP，Swiss-ProtWAP_MACEU Q9N0L8，Entrez protein CAB90357)；小鼠乳清酸性蛋白(WAP，Swiss-Prot  WAP_MOUSE P01173，Entrez proteinAAH26780)；猪乳清酸性蛋白(WAP，Swiss-Prot WAP_PIG O46655)；兔乳清酸性蛋白(WAP，Swiss-Prot WAP_RABIT P09412)；大鼠乳清酸性蛋白(WAP，Swiss-Prot WAP_RAT P01174，Entrez proteinNP_446203)；小鼠乳清酸性蛋白前体(TrEMBL Q7M748)；类似于乳清酸性蛋白的小鼠蛋白(TrEMBL Q8R0J0)；乳清酸性蛋白(WAP，Swiss-Prot)；刷尾负鼠(TrEMBL Q95JH3，Entrez protein AAK69407)；具有WAP型四-二硫化物核心结构域的大鼠蛋白(Entrez proteinXP_215938)；人多价蛋白酶抑制剂蛋白(Swiss-Prot Q8TEU8，Entrezprotein AAL77058)；小鼠serpina 3g蛋白(Entrez protein AAH57144)；小鼠分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(Entrez protein AAH28509，NP_035544)；人多价蛋白酶抑制剂(Entrez protein NP_783165)；大鼠分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(Entrez protein NP_445824，XP_215940)；小鼠eppin(Entrez protein NP_083601)；大鼠蛋白，类似于eppin(Entrez proteinXP_345469)；人蛋白，类似于来自小鼠的抑弹性蛋白酶蛋白样蛋白和WAP型蛋白酶抑制剂(Entrez protein CAC36291)；人推定的蛋白酶抑制剂WAP2前体(Entrez protein AAK68848)；人推定的多价蛋白酶抑制剂(Entrez protein AAL18839)。本发明的范围内涉及的其它WAP结构域可以容易地从多种数据库中鉴定，所述数据库如Medline(NationalLibrary of Medicine)，EPASy(Expert Protein Analysis System，其包括Swiss-Prot/TrEMBL Swiss Institute of  Bioinformatics，和Protein DataBase(Brookhaven，PDB))。其它蛋白酶抑制剂结构域包括例如eppin，huWAP2，SWAM1，SWAM2，和由LOC149709在人类中指定的蛋白。
图6中示出了一些人WAP结构域的比对(图左侧示出了编号)。图顶部的连接的箭头示出了作为WAP基序的中心特征的二硫键配对。对WAP结构域进行了比对，以示出氨基酸残基，特别是半胱氨酸残基的同源性，以及它们通过多肽序列的间隔。
可以用于结合域融合蛋白中的合适的捕获蛋白家族成员包括例如：B捕获蛋白-2蛋白(牛，TrEMBL O46625)；B捕获蛋白-4蛋白前体(牛，TrEMBL O46626)，B捕获蛋白-5蛋白前体(牛，TrEMBL O46627)；捕获蛋白-6(牛，TrEMBL O62652，Entrez protein JE0252，BAA28148)；S捕获蛋白-2蛋白前体(猕猴，TrEMBL O46643)；捕获蛋白(豚鼠，TrEMBL Q8VID9)；抑弹性蛋白酶蛋白(捕获蛋白-2)(Warthog，TrEMBL Q9XS42，Entrez protein JE0251，BAA77825)；SPAI(捕获蛋白-1)(Warthog，TrEMBL # Q9XS43，Entrez protein # JE0250，BAA77826)；捕获蛋白(环颈西  ，TrEMBL # Q9XS44，BAA77827)；捕获蛋白-11(海马，TrEMBL # Q9XS45，Entrez protein # JE0257)；类似于捕获蛋白(挪威大鼠，Entrez protein # XP_345873)；抑弹性蛋白酶蛋白(绵羊，Entrez protein # AAQ21594)；捕获蛋白-7(猪TrEMBL #P79389，Entrez protein # JE0253)；捕获蛋白-8(猪，Entrez protein#JE0254)；捕获蛋白-9(猪，TrEMBL # Q9XS46，Entrez protein #JE0255)；捕获蛋白-10(环颈西  Entrez protein # JE0256)；捕获蛋白(家养豚鼠，Entrez protein # BAB79626)；抑弹性蛋白酶蛋白家族成员蛋白(猪，Entrez protein # BAA08858，BAA08857)；抑弹性蛋白酶蛋白同源物(猪，Entrez protein # BAA12038，BAA77829)；捕获蛋白(海马Entrez protein # BAA77828).{检索的数据库：Swiss-Prot，TrEMBL，Entrez protein，PI/Georgetown}。其它捕获蛋白成员，包括此处描述的那些和现在已知或以后发现的那些，都是本发明的范围包括的。
在其它实施方案中，结合域融合蛋白具有蛋白酶抑制结构域，其包括TIMP结构域，如来自TIMP1，TIMP2，TIMP3，TIMP4或任何其它TIMP家族成员的TIMP结构域的TIMP结构域或任何TIMP基序的异构体。所述TIMP结构域包括例如抑制MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MMP-10，MMP-13，MMP-14，MMP-15，MMP-16和MMP-19以及胶原酶的任何多肽或其部分或变体。例如参见Bode W.，Maskos K.，2003，Biol Chem.384(6)：863-72，Beaudeux J.L.，et a1.，2004Clin.Chem.Lab Med.42(2)：121-131，Nagase H.，Brew K.，2003 Biochem.Soc.Symp.，70：201-12，Visse R.，Nagase H.，2003，Circ.Res.，92(8)：827-39，Baker A.H.et al.，2002 J.Cell Sci.，115(19)：3719-27，Skiles J.W.et al.，2001 Curr.Med.Chem.8(4)：425-74，和Nagase H.，Brew K.，2002Arthritis Res.4(Supp.3)S51-61，在此引入上述文献的内容作为参考。图7示出了人TIMP结构域的比对，其中观察了12个半胱氨酸残基的比对和间隔。在另一种实施方案中，结合域融合蛋白包含TIMP结构域的变体，包括取代变体、插入变体和缺失变体。优选地，TIMP结构域的变体具有蛋白酶抑制剂活性。
在其它实施方案中，结合域融合蛋白具有包含半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域、基本由半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域组成、或由半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域组成的蛋白酶抑制结构域。示例的半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域包括例如来自家族I(半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族)的半胱氨酸蛋白酶抑制剂、家族II(stefin家族，如半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，D，S，SN和SA)的半胱氨酸蛋白酶抑制剂、家族III(激肽原家族)半胱氨酸蛋白酶抑制剂的结构域。所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂包括例如抑制组织蛋白酶(如组织蛋白酶B，H，K，L和S)的任何多肽或其部分或变体。在其它实施方案中，结合域融合蛋白包含半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域的变体、基本由半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域的变体组成、或由半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域的变体组成，所述变体包括取代变体、插入变体和缺失变体。优选地，半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域的变体具有蛋白酶抑制剂活性。图8示出了一些人半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域的另一个所述比对。
在其它实施方案中，结合域融合蛋白具有蛋白酶抑制结构域，其是Kunitz型抑制剂，包含活性“Kunitz结构域”、基本由“Kunitz结构域”组成、或由“Kunitz结构域”组成。结合域融合蛋白的蛋白酶抑制剂结构域可以包含例如一个或多个Kunitz结构域、基本由一个或多个Kunitz结构域组成、或由一个或多个Kunitz结构域组成。每个Kunitz结构域典型地包含约50-60个氨基酸，并且包含6个半胱氨酸残基，其形成三个二硫键，得到双环结构。可以用于结合域融合蛋白的蛋白酶抑制剂结构域中的代表性Kuntz抑制剂包括牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI，也称作抑蛋白酶肽)(Trapnell，J.E.，et al，1974 Brit.J.Surg.61：177-182；Sher，G，1977 Am.J.Obstet.Gynecol.129：164-170；Auer，L.M.，et al.，1979 Acta Neurochir.49：207-217；McMichan，J.，et al.，1982 CirculatoryShock9：107-116；Kobayashi，H.，et al.，2004 J Biol Chem 279：6371-9)，Bikunin(Kobayashi，1995 Br J Cancer，72：1131-1137；Kobayashi et al.，2001 J.Biol.Chem.，276：2015-2022)、Penthalaris(Francischetti IM，etal.，2004 Thromb.Haemost.91：886-98)、大肠杆菌素(Dennis，MS et al.，1995 J Biol Chem.，270：.25411-17)、淀粉样前体蛋白(APP)(Preece，P.，etal.，2004 Brain Res Mol Brain Res.122：1-9)，WFIKKN(Hill，JJ，et al.，2003 Mol.Endocrinol.17：1144-54)、组织因子途径抑制剂(TFPI)(Hiraishi S.，et al.，2002 Biochem Biophys Res Commun.298：468-73)、尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)(Suzuki M.，et al.，2001 Biochim Biophys Acta.1547：26-36)、2型肝细胞生长因子激活物抑制剂(HAI-2)(Itoh H.，et al.，1999 Biochem Biophys Res Commun.255：740-8)。在某些其它实施方案中，结合域融合蛋白包含一个以上蛋白酶抑制结构域、基本由一个以上蛋白酶抑制结构域组成、或由一个以上蛋白酶抑制结构域组成，其中至少一个蛋白酶抑制剂结构域包含Kunitz型抑制剂，并且一个或多个其它的蛋白酶抑制剂结构域包含例如WAP基序。
另一方面，考虑包含保守二硫化物核心的蛋白酶抑制剂多肽结构域，例如如下蛋白酶抑制剂结构域，其中半胱氨酸残基的数目不同于天然存在的WAP基序。例如，考虑包含与WAP基序中报道的8个半胱氨酸(形成四个二硫键)数目不同的半胱氨酸的蛋白酶抑制剂结构域。例如，包含4、6、10、12、14、16、20或更多半胱氨酸残基的蛋白酶抑制剂结构域属于本发明的范围内。优选地，半胱氨酸残基的数目是偶数，两个或多个半胱氨酸残基能够形成稳定蛋白酶抑制剂结构域的二硫键。
在某些其它实施方案中，蛋白酶抑制剂类似物具有减少或基本灭活的蛋白酶抑制活性。所述蛋白酶抑制剂类似物例如可以具有与此处描述或提到的或现在已知或以后发现的蛋白酶抑制剂多肽相比的选择性氨基酸缺失、插入或取代。因此，另一方面是提供结合域融合蛋白的类似物蛋白酶抑制剂结构域，其包含蛋白酶抑制剂活性减少或无活性的捕获蛋白多肽的天然和非天然存在的类似物、或基本由所述类似物组成、或由所述类似物组成、或包含蛋白酶抑制剂活性减少或无活性的SLPI多肽的天然和非天然存在的类似物、或基本由所述类似物组成、或由所述类似物组成、或包含蛋白酶抑制剂活性减少或无活性的抑弹性蛋白酶蛋白多肽的天然和非天然存在的类似物、或基本由所述类似物组成、或由所述类似物组成、或包含蛋白酶抑制剂活性减少或无活性的WAP基序多肽的天然和非天然存在的类似物、或基本由所述类似物组成、或由所述类似物组成、或包含蛋白酶抑制剂活性减少或无活性的TIMP多肽的天然和非天然存在的类似物、或基本由所述类似物组成、或由所述类似物组成、或包含蛋白酶抑制剂活性减少或无活性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂多肽的天然和非天然存在的类似物、或基本由所述类似物组成、或由所述类似物组成。
本发明的另一方面是提供对蛋白酶降解的易感性降低的蛋白酶抑制剂类似物。在一种实施方案中，结合域融合蛋白包含对蛋白酶降解的易感性降低的SLPI类似物，或例如抗一种或多种特定蛋白酶降解的SLPI类似物。在某些实施方案中，结合域融合蛋白包含SLP类似物、由SLP类似物组成、或基本由SLP类似物组成，所述SLPI类似物包含在氨基酸Thr(77)和Tyr(68)之一或这两个位置上的氨基酸取代或缺失。在其它实施方案中，SLPI类似物包含在氨基酸Leu(72)，Met(73)和Leu(74)的一个或多个位置上的氨基酸取代或缺失。在一种特定实施方案中，SLPI的72位的Leu被例如甘氨酸取代。在一种优选实施方案中，SLPI类似物包含使结合域融合蛋白的SLPI结构域至少部分抗蛋白酶(如组织蛋白酶)降解的氨基酸取代或缺失。SLPI的多种类似物和突变蛋白描述于例如Niven等人的US2002/0010318，Bandyopadhyay等人的US6,291,662，Sugiyama等人的US 5,851,983，Muller等人的US 5,633,227，和Eisenberg，S.P.et al.，1990 J.Biol.Chem.，265(14)：7976-7981，在此全文引入上述文献的内容作为参考，并且其可以包含在本发明的某些实施方案中或排除在本发明的某些实施方案之外。
另一方面，可以改变(如优化)蛋白酶抑制剂结构域对蛋白酶进行抑制的特异性和效能。仅仅出于说明的目的，对结合域融合蛋白的WAP结构域(如SLPI或抑弹性蛋白酶蛋白的WAP结构域)进行修饰，以增加结合域融合蛋白的生物活性。报道了用基因III或基因VIII上的WAP结构域噬菌体展示选择抑制或结合蛋白酶的能力改进的WAP结构域(参见Nixon，A.E.，2002 Curr.Pharm.Biotechnol.3：1-12)。因此，在某些其它实施方案中，对蛋白酶抑制剂进行一种或多种修饰(如氨基酸插入、取代或缺失)，以改变一种或多种预选的特性，包括例如多肽的绝对或相对分子量、完整或部分序列(氨基酸或核苷酸)、和核酸、酶活性、配体结合活性、蛋白酶抗性、血清稳定性、pI、抗原性、配制成各种药物组合物的能力、容易生产、生产中的产率、生产成本、相关副作用、特异性等。
另一方面，任何需要的天然存在的和化学合成的蛋白酶抑制剂都可以用于结合域融合蛋白。这些包括有机分子，其可以例如单独使用，或作为与生物分子的缀合物。例如，小分子蛋白酶抑制剂可以连接、缀合或以其它方式与此处提供的构建体和结合域融合蛋白缔合。参见例如Curci J.A.，et al.，2000 J Vasc Surg.，31(2)：325-42)，其中描述了多西环素；Moore G.et al.，1999 J Vasc Surg.29(3)：522-32，其中描述了氧肟酸盐；Supuran et al.，2003 Med.Res.Rev.23(5)：535-58，其中描述了磺胺型蛋白酶抑制剂；Tamamura H.，Fujii N.，2004  Curr.DrugTargets Infect Disord.，4(2)：103-10，其中描述了CXCR4拮抗剂；Schirmeister T.，Kaeppler U.，2003 Mini Rev.Med.Chem.，3(4)：361-73，其中描述了非肽半胱氨酸蛋白酶抑制剂；Hernandez A.A.，RoushW.R.，2003 Curr.Opin.Chem.Biol.8，(4)：459-65，其中描述了合成的半胱氨酸蛋白酶抑制剂；Donkor I.O.，2000 Curr.Med.Chem.，7(12)：1171-88，其中描述了钙激活中性蛋白酶抑制剂；和Schimmoller F.，et al.，2002 Curr.Pharm.Des.8(28)：2521-31，其中描述了淀粉样蛋白形成蛋白酶；在此全文引入上述文献的内容作为参考，并且其可以包含在本发明的某些内容中或排除在本发明的某些内容之外。
目前已知或以后发现的其它蛋白酶和其它蛋白酶抑制剂结构域都考虑在本发明的范围内。
另一方面，结合域融合蛋白包含不同来源的蛋白酶抑制结构域、基本由所述结构域组成、或由所述结构域组成，所述结构域在天然不存在的组合中连接在一起。SLPI的氨基末端和羧基末端WAP结构域的晶体坐标旋转和平移使得两个结构域能够叠加。这表明结构域中蛋白酶的结合环是几何定位的，使两个分子的蛋白酶能够同时结合单分子的SLPI。在结构域之间插入了间隔基，以带来额外的柔性，促进一个以上的蛋白酶同时结合蛋白酶抑制剂结构域的组合，所述结构域包括但不限于WAP结构域、TIMP-2结构域和半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域。
结合域融合蛋白的蛋白酶抑制剂结构域抑制任何需要的靶蛋白酶的蛋白酶活性，包括已知或此处描述、或以后发现的蛋白酶。示例的靶蛋白酶包括细胞内蛋白酶，包括胱天蛋白酶(包括但不限于胱天蛋白酶1-14)、参与补体激活的调节的蛋白酶、参与凝血调节的蛋白酶、参与信号传导的调节的蛋白酶、参与VEGF的各种前体的加工的蛋白酶、参与前列腺素(如PGHS-2)的表达或活性的蛋白酶、基质金属蛋白酶(如金属蛋白酶-2)、弹性蛋白酶、α1-蛋白酶、蛋白酶3、糜蛋白酶、胰蛋白酶、人肥大细胞类糜蛋白酶、角质层糜蛋白酶、类胰蛋白酶、人白细胞弹性蛋白酶、角质层糜蛋白酶、和具有诸如弹性蛋白、蛋白聚糖和胶原作为底物的蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶；其它弹性蛋白酶；多型核粒细胞；蛋白酶3；枯草蛋白酶；无色细菌蛋白酶；α-裂解蛋白酶；蛋白酶；谷氨酸特异性蛋白酶；蛋白酶B；表皮溶解性(脱落性)毒素A；脱落性毒素B；蛋白酶Do(DegP，HtrA)；线粒体丝氨酸蛋白酶HtrA2；前列腺特异性抗原；凝血酶；neuropsin；热激蛋白31；胰蛋白酶样蛋白酶家族成员，包括但不限于原核、真核和病毒蛋白酶(病毒壳体蛋白、TEV蛋白酶、NS3蛋白酶、NSP4蛋白酶)；半胱氨酸蛋白酶超家族成员，包括但不限于木瓜蛋白酶样蛋白酶(组织蛋白酶外肽酶、组织蛋白酶内肽酶、前组织蛋白酶B、组织蛋白酶B、C、F、G、H、K、J、L、L2.M、O、Q、R、S、W、Z、V和X、组织蛋白酶，包括但不限于组织蛋白酶-1、组织蛋白酶-2、组织蛋白酶-3和组织蛋白酶-6、克鲁氏锥虫cuzain、人博莱霉素水解酶、staphopain和酿脓链球菌外毒素B)、FMDV前导蛋白酶(口蹄疫病毒)、钙激活中性蛋白酶，包括但不限于μ-钙激活中性蛋白酶、m-钙激活中性蛋白酶、钙激活中性蛋白酶1-14、钙蛋白酶抑制蛋白、钙激活中性蛋白酶大亚基、催化域(结构域II)、转谷氨酰胺酶催化域、paracaspase、芳基胺-N-乙酰转移酶、遍在蛋白羧基末端水解酶7、腺病毒蛋白酶样、微生物转谷氨酰胺酶、otubain家族、弗林蛋白酶和弗林蛋白酶基序-变体、PC5、PC7。对于蛋白酶和抑制剂的一般描述，参见例如Barrett，A.J.，1994，″Classification of peptidases″，Methods Enzymol.，244，1-15；Otto，H.-H. & Schirmeister，T.1997″Cysteine Proteases and theirinhibitors″，Chem.Rev.97，133-171，在此全文引入其内容作为参考。
结合域
结合域融合蛋白包括能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽。本发明的结合域融合蛋白，包括结合域多肽，包括了任何具有特异性识别和结合相关生物分子或一种以上分子的复合物或这种分子的稳定或瞬时组装物或聚集物的能力的多肽。所述分子包括例如蛋白、多肽、肽、氨基酸或其衍生物；脂质、脂肪酸等或其衍生物；碳水化合物、糖等或其衍生物等；核酸、核苷酸、核苷、嘌呤、嘧啶或相关分子或其衍生物；或其任意组合，例如，糖蛋白、糖肽、糖脂、脂蛋白、蛋白脂；或任何其它生物分子。
结合区，包括结合域多肽，例如可以是任何天然存在、合成、半合成和/或重组产生的、生物分子或其它分子的结合配偶体，该生物分子或其它分子是感兴趣的蛋白酶相关结构或分子，此处有时称作“抗原”或“表位”，但根据本发明的公开，意欲包括任何需要使本发明的融合蛋白与其结合或特异性与其结合的生物分子或其它分子。如果本发明的构建体以需要的水平，例如以大于或等于约106M-1，更优选大于或等于约107M-1，更优选大于或等于约108M-1的Ka结合需要的靶分子，如此处提供的抗原，则该构建体定义为“特异性”、“免疫特异性”或能够结合至需要的程度，包括特异性结合。甚至大于约108M-1的亲和力是更优选的，如等于或大于约109M-1、约1010M-1、约1011M-1和约1012M-1。本发明的结合域融合蛋白的亲和力可以使用常规技术，例如描述于Scatchard et al.，1949 Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660中的技术容易测定。也可以使用任何已知用于鉴定和获得特异性与其它蛋白或多肽相互作用的蛋白的方法，例如美国专利5,283,173和美国专利5,468,614，或其同族专利等描述的酵母双杂交筛选系统进行融合蛋白结合的测定。
在某些优选实施方案中，结合域融合蛋白包含来源于抗体和免疫球蛋白的结合域、基本由所述结合域组成、或由所述结合域组成。因此，结合域可以包含例如单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)、双抗体、三抗体、修饰的抗体(如人源化的)、单链Fvs(scFvs)，和任何表现出需要的结合活性的抗体片段。用于本发明的免疫球蛋白分子包括5类免疫球蛋白的蛋白，即IgG，IgM，IgA，IgE，和IgD。其中包括IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。
用于本发明的抗体片段包括例如轻链可变区(VL和VH)、Fv区、Fd区(包含VH和CH1的片段，即重链的两个N末端结构域)、铰链区(包括部分铰链区、上铰链区、核心区和/或下铰链区，其具有或不具有糖基化位点)、Fc区(“片段可结晶”区，其来源于恒定区，在胃蛋白酶消化后形成)、和Fab(“片段抗原结合”)区。包括在本发明的构建体内的上述任何或所有片段可以是天然存在的。包括在本发明的构建体内的上述任何或所有片段可以是非天然存在的，例如通过氨基酸缺失、取代或插入进行了突变或其它改变。可以通过本领域技术人员公知的技术合成制备抗体片段，例如免疫球蛋白轻链可变区多肽和/或重链可变区多肽，例如通过在聚合酶链反应中使用不同组的寡核苷酸引物。这些合成制备的抗体片段可以包含与已知或天然存在的免疫球蛋白序列相同的氨基酸序列，或所述免疫球蛋白序列的变体。
在本发明的一方面，结合域包含以下成分、基本由以下成分组组成、或由以下成分组成：抗体、任意方向的H和L链的可变区、细胞表面受体的胞外域、H链的可变区、L链的可变区、互补决定区(CDR)，如H和L链的CDR3、人源化的骆驼类H链、选择噬菌体文库的多肽、和与细胞表面展示的受体特异性反应的细胞因子。
本发明的构建体可能包括或不包括，或可能利用或不利用非常规免疫球蛋白，如骆驼类s(骆驼、单峰骆驼和美洲驼；Hamers-Castermanet al.，1993 Nature 363：446；Nguyen et al.，1998 J.Mol.Biol 275：413)、护士鲨(Roux et al.，1998 Proc.Nat.Acad.Sci. LISA 95：11804)和斑点银鲛(Nguyen，et al.，″Heavy-chain antibodies in骆驼类ae；a case ofevolutionary innovation，2002 Immunogenetics 54(1)：39-47)中发现的那些。这些抗体可以仅仅用重链可变区形成抗原结合区，即，这些功能性抗体仅仅是重链的同二聚体(称作“重链抗体”或″HCAbs″)。
本发明的构建体可以包括或不包括免疫球蛋白可变区序列或序列片段中的突变或改变。
本发明的构建体可以包括或不包括免疫球蛋白恒定区序列或序列片段中的突变或改变。
在本发明的一种实施方案中，结合域融合蛋白包含结合域，其可包括至少一个天然或工程化的免疫球蛋白可变区多肽，如天然或工程化的重链和/或天然或工程化的轻链V区的全部或部分或片段，前提是它能够以需要的结合水平和选择性结合或特异性结合抗原或其它需要的靶结构。
在其它优选实施方案中，结合区或结合域包含单链免疫球蛋白来源的Fv产物、基本由所述Fv产物组成、或由所述Fv产物组成，所述Fv产物例如是scFv，其可以包括至少一个天然或工程化的免疫球蛋白轻链V区的全部或部分，和至少一个天然或工程化的免疫球蛋白重链V区的全部或部分，和融合或以其它方式连接于V区的接头。ScFVs包括天然存在的可变区以及经过突变或其它改变的可变区。其它制备和测试方法是本领域公知的。Fv区的单个多肽链结合分子，即单链Fv分子的制备是本领域公知的。参见例如美国专利No.4,946,778。在本发明中，可以通过编码重链或轻链的第一可变区，然后分别通过相应轻链或重链的可变区的一个或多个接头的连接，合成可以包括在本发明的构建体中的单链Fv样分子。
两个可变区之间的适当接头的选择描述于美国专利4,946,778(也参见例如Huston et al.，1993 Int.Rev.Immunol.10：195)。此处描述的示例性的接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3，但也可以是任何需要的长度。接头用于将天然聚集但化学上分离的重链和轻链转化为单个多肽链的氨基末端抗原结合部分，其中该抗原结合部分将折叠成类似于由两条多肽链形成的原始结构的结构，或原本具有结合靶，如靶抗原的能力的结构。一方面，结合域包含组装为结合域融合蛋白的H和L链可变区，以便识别和结合靶分子。在本发明的一方面，H和L可变区或L和H可变区之间的接头是短的，包含少于10个氨基酸，优选3-10个氨基酸，更优选2-7个氨基酸，最优选4-6个氨基酸，以防止一个多肽链上的H和L可变区(任何方向)形成识别靶的组合位点，并且要求两条肽链上的H和L区形成组合位点。在本发明的另一方面，H和L可变区或L和H可变区之间的接头是长的，包含12个以上氨基酸，优选12-30个氨基酸，更优选12-20个氨基酸，最优选14-16个氨基酸，使得一个多肽链上的H和L区(任何方向)能够形成识别靶的组合位点。另一方面，本发明包括这样的构建体，其中结合区与免疫效应细胞上的抗原结合。下文描述了在特定实施方案中用作结合域的特定scFv的部分列表。
根据本发明的某些实施方案，结合域多肽包括以下成分、基本由以下成分组成、或由以下成分组成：(a)至少一个天然或工程化的免疫球蛋白轻链可变区多肽；(b)至少一个天然或工程化的免疫球蛋白重链可变区多肽；和(c)至少一个与(a)的多肽并与(b)的多肽融合或以其它方式连接的接头多肽。在某些进一步的实施方案中，天然或工程化的免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区多肽是从人免疫球蛋白构建的，在某些其它实施方案中，接头多肽包含至少一个包含或具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：_)的多肽。在其它实施方案中，接头多肽包含具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：_)的多肽的至少两个或三个重复。在其它实施方案中，接头包含糖基化位点，其在某些进一步的实施方案中是天冬酰胺连接的糖基化位点、O-连接的糖基化位点、C-半乳糖基化位点、糖基磷脂酰肌醇化位点或磷酸糖基化位点。
可以将例如特定免疫球蛋白参照序列的部分和任意一个或多个额外的感兴趣的免疫球蛋白序列的部分与参照序列进行比较。可以根据Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(5th ed.Bethesda，MD：Public Health Service，National Institutes of Health(1991))，基于免疫球蛋白氨基酸位置的编号常规，鉴定“相应的”序列、区域、片段等。如此处的描述和本领域的公知常识，免疫球蛋白包含一种基因家族的产物，所述家族的成员表现出高度序列保守性。可以对两个或多个免疫球蛋白或免疫球蛋白结构域或其区域或部分(如VH结构域、VL结构域、铰链区、CH2恒定区、CH3恒定区)的氨基酸序列进行比对和分析。可以通过例如序列同源性鉴定彼此相应的序列的部分。可以用任何序列比对和分析工具确定序列同源性，所述工具包括本领域普通技术人员公知的计算机算法，如Align或BLAST算法(Altschul，1991 J.Mol.Biol.219：555-565；Henikoff and Henikoff,1992 Proc.Natl.Acad.Set.USA 89：10915-10919)，其可以从NCBI网站(http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)获得。可以使用默认参数。在某些优选实施方案中，感兴趣的免疫球蛋白序列或其区域、部分、衍生物或片段与相应参照序列的同一性大于约95％，在某些优选实施方案中，所述感兴趣的序列与相应参比序列可能在约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸位置不同。
例如，在本发明的某些实施方案中，涉及在相关部分包含人或其它物种免疫球蛋白重链可变区多肽的构建体，所述重链可变区多肽包含位于相应于例如来源于鼠VH的序列中的氨基酸位置9、10、11、12、108、110、111和112中的一个或多个的位置的突变、改变或缺失。在某些实施方案中，例如，本发明也涉及在相关部分包含人免疫球蛋白轻链可变区多肽或另一物种的免疫球蛋白轻链可变区多肽的构建体，所述轻链可变区多肽包含位于相应于氨基酸位置12、80、81、82、83、105、106、107和108中的一个或多个的位置的突变、改变或缺失。在本发明的其它实施方案中，例如，本发明涉及在相关部分包含以下成分的构建体：(1)人免疫球蛋白重链可变区多肽，或来自另一物种的免疫球蛋白重链可变区重链多肽，所述重链序列在相应于氨基酸位置9、10、11、12、108、110、111和112中的一个或多个的位置具有突变、改变或缺失，和(2)人免疫球蛋白轻链可变区多肽，或来自另一物种的免疫球蛋白重链可变区轻链多肽，所述轻链序列在相应于氨基酸位置12、80、81、82、83、105、106、107和108中的一个或多个的位置具有突变、改变或缺失。
作为另一个实例，例如，通过参照如上文引用的免疫球蛋白序列概略和数据库，可以容易地以允许鉴定来源的动物物种、特定免疫球蛋白或免疫球蛋白区多肽序列的类和亚类(如同种型)的方式建立两个或更多免疫球蛋白序列的相关性，而无须过多实验。任何免疫球蛋白可变区多肽序列，包括天然或工程化的VH和/或VL和/或单链可变区(sFv)序列或其它天然或工程化的V区来源的序列等，可以用作结合区或结合域。工程化的序列包括来自任何物种，优选例如人或小鼠的免疫球蛋白序列，例如，其在相应于重链可变区序列或scFv的氨基酸位置9、10、11、12、108、110、111和112中的一个或多个的位置包括突变、改变或缺失，和/或在相应于轻链可变区序列或scFv的位置12、80、81、82、83、105、106、107和108中的一个或多个的位置包括突变、改变或缺失。
多种实施方案包括例如天然或工程化的免疫球蛋白V区多肽，其来源于例如包括单克隆抗体的抗体，如鼠或其它啮齿动物抗体，或来源于其它来源，如羊、兔、马、牛、骆驼类或其它物种，包括转基因动物的抗体或单克隆抗体，并且包括人或人源化抗体或单克隆抗体。非限定性实例包括来源于单克隆抗体的可变区多肽序列，如此处提到的和/或更详细描述于以下文献的那些：Ledbetter等的未决的申请U.S.A.N.10/627,556，2003年7月26日提交，题目为″BINDING CONSTRUCTSAND METHODS OF USE THEREOF″，和Ledbetter等2003年12月24日提交的PCT/US03/41600，题目为″BINDING CONSTRUCTS ANDMETHODS OF USE THEREOF″。
其它结合区，包括结合域多肽，可以包括保留了特异性结合于此处提供的抗原的能力的任何蛋白或其部分，包括非免疫球蛋白。因此本发明考虑了包含来源于以下物质的结合区或结合域多肽的融合蛋白：多肽配体如激素、细胞因子、趋化因子等；这种多肽配体的细胞表面或可溶受体；凝集素；细胞间粘附受体如特异性白细胞整联蛋白、选择蛋白、免疫球蛋白基因超家族成员、细胞间粘附分子(ICAM-1，-2，-3)等；组织相容性抗原等。
本发明的分子内的其它结合区可以包括含有用于糖基化的位点的结构域，所述糖基化例如碳水化合物部分如单糖或寡糖的共价结合。
本发明的分子内的其它结合区包括多肽，其可以包括保留了特异性结合其它分子，包括抗原的能力的蛋白或其部分。因此，结合区可包含或来源于激素、细胞因子、趋化因子等；所述多肽配体的细胞表面或可溶受体；凝集素；细胞内粘附受体如特异性白细胞整联蛋白、选择蛋白、免疫球蛋白基因超家族成员、细胞内粘附分子(ICAM-1，-2，-3)等；组织相容性抗原等。来源于所述分子的结合区通常包括结合靶所必须或需要的分子的这些部分。
通常，靶相关分子，特别是蛋白酶相关靶，包括任何蛋白、碳水化合物、核酸或其它有机分子。靶相关分子可以在细胞表面或特定细胞类型、特定组织或动物或受试者的特定位置表达。例如，靶相关分子可以在白细胞、T淋巴细胞(如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD25、CD28、CD69、CD 154、CD 152(CTLA-4)和ICOS抗原)、辅助T细胞、单核细胞、树突细胞、免疫效应细胞、B细胞(如II类MHC、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD37和CD40抗原)上表达。细胞表面标志物是另一类靶相关分子，包括来自正常或恶性细胞的细胞表面标志物。其它结合域靶包括来自正常或恶性细胞的细胞表面标志物；细胞因子(包括生长因子和信号传导的介质)；血液或组织中的蛋白；包括病毒、细菌、真菌和寄生虫靶的感染性靶；和细胞内靶，包括细胞内蛋白靶。
可以作为结合域多肽的蛋白酶相关靶或作为结合区或结合域多肽或其部分的合适来源的细胞表面抗原/受体包括以下受体等：CD2(例如GenBank编号Y00023，SEG_HUMCD2，M16336，M16445，SEG_MUSCD2，M14362)，4-1BB(CDw137，Kwon et al.，1989 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：1963)，4-1BB(Goodwin et al.，1993 Eur.J.Immunol.23：2361；Melero et al.，1998 Eur.J.Immunol. 3：116)，CD5(例如GenBank编号X78985，X89405)，CD10(例如GenBank编号M81591，X76732)，CD27(例如GenBank编号M63928，L24495，L08096)，CD28(June et al.，1990 Immunol.Today 11：211；也见，例如GenBank编号SEGHUMCD28，M34563)，CD152/CTLA-4(例如GenBank编号L15006，X05719，SEG_HUMIGCTL)，CD40(例如GenBank编号M83312，SEGMUSC040A0，Y10507，X67878，X96710，U15637，L07414)，γ干扰素(IFN-γ，见例如Farrar et al.1993 Ann.Rev.Immunol.11：571及其中引用的参考文献，Gray et al.1982 Nature 295：503，Rinderknecht et al.1984 J Biol. Chem.259：6790，DeGrado et al.1982 Nature 300：379)，白介素-4(IL-4，见例如53rd Forum in Immunology，1993 Research inImmunol.144：553-643；Banchereau et al.，1994 in The CytokineHandbook，2nd ed.，A.Thomson，ed.，Academic Press，NY，p.99；Keeganet al.，1994 J Leukocyt.Biol..55：272，及其中引用的参考文献)，白介素-17(IL-17)(例如，GenBank编号U32659，U43088)和白介素-17受体(IL-17R)(例如，GenBank编号U31993，U58917)。
可以作为结合域多肽的蛋白酶相关靶或作为结合区或结合域多肽或其部分的合适来源的其它细胞表面抗原/受体包括以下受体等：CD59(例如，GenBank编号SEG_HUMCD590，M95708，M34671)，CD48(例如，GenBank编号M59904)，CD58/LFA-3(例如，GenBank编号A25933，Y00636，E12817，也见JP 1997075090-A)，CD72(例如，GenBank编号AA311036，S40777，L35772)，CD70(例如，GenBank编号Y13636，S69339)，CD80/B7.1(Freeman et al.，1989 J.Immunol.43：2714；Freeman et al.，1991 J.Exp.Med.174：625，也见，例如GenBank编号U33208，I683379)，CD86/B7.2(Freeman et al.，1993 J.Exp.Med.178：2185，Boriello et al.，1995 J Immunol.155：5490；也见，例如GenBank编号AF099105，SEG_MMB72G，U39466，U04343，SEGHSB725，L25606，L25259)，B7-H1/B7-DC(例如Genbank编号NM_014143，AF177937，AF317088；Dong et al.，2002 Nat.Med.Jun 24(epub ahead of print)，PMID 12091876；Tseng et al.，2001 J.Exp.Med.193：839；Tamura et al.，2001 Blood 97：1809；Dong et al.，1999 Nat.Med.5：1365)，CD40配体(例如，GenBank编号SEG_HUMCD40L，X67878，X65453，L07414)，IL-17(例如，GenBank编号U32659，U43088)，CD43(例如，GenBank编号X52075，J04536)，ICOS(例如Genbank编号AH011568)，CD3(例如Genbank编号NM_000073(γ亚基)，NM 000733(ε亚基)，X73617(δ亚基))，CD4(例如Genbank编号NM_000616)，CD25(例如Genbank编号NM_000417)，CD8(例如Genbank编号M12828)，CD8α(T细胞表面糖蛋白CD8α链，也称作T淋巴细胞分化抗原，T8/Leu-2，和Lyt-2)；CD11b(例如Genbank编号J03925)，CD14(例如Genbank编号XM0_039364)，CD56(例如Genbank编号U63041)，CD69(例如Genbank编号NM_001781)和VLA-4(α4β7)(例如，GenBank编号L12002，X16983，L20788，U97031，L24913，M68892，M95632)。以下细胞表面受体一般与B细胞相关：CD19(例如，GenBank编号SEG_HUMCD19W0，M84371，SEG_MUSCD19W，M62542)，CD20(例如，GenBank编号SEG_HUMCD20，M62541)，CD22(例如，GenBank编号I680629，Y10210，X59350，U62631，X52782，L16928)，CD30(例如Genbank编号M83554，D86042)，CD153(CD30配体，例如Genbank编号L09753，M83554)，CD37(例如Genbank编号SEG_MMCD37X，X14046，X53517)，CD50(ICAM-3，例如Genbank编号NM_002162)，CD106(VCAM-1)(例如Genbank编号X53051，X67783，SEG_MMVCAM1C，也参见美国专利No.5,596,090)，CD54(ICAM-1)(例如Genbank编号X84737，S82847，X06990，J03132，SEG_MUSICAM0)，白介素-12(也参见例如Reiteretal.1993 Crit.Rev.Immunol.13：1，及其中引用的参考文献)，CD134(OX40，例如Genbank编号AJ277151)，CD137(41BB，例如Genbank编号L12964，NM_001561)，CD83(例如Genbank编号AF001036，AL021918)，DEC-205(例如Genbank编号AF011333，U19271)，CD6，CD7(Entrez protein AAH24376 [小鼠]，Entrez nucleotide AY407406[人])，CD21(Entrez protein CAA66910[人]，Entrez nucleotideAF298224，X98257[人]，Entrez nucleotide AF168683[小鼠])，CD23(Entrez protein AAL84004，CAA51981，Entrez nucleotide AF381978，X73579[大鼠]，Entrez protein AAB28793，AAB28792，AAB28791，Entrez nucleotide A1449163[小鼠]，Entrez nucleotide E04250[人]，CD45(Entrez protein AAS46962，AAS46954，AAS46946，AAS46938，AAS46930，AAS46922，Entrez nucleotide AY539659，AY539707，AY539699，AY539691，AY539683，AY539675，AY539667，AJ006102[人]，Entrez protein AAB34268，AAB34274，AAB34272，AAB34270，AAB34268[小鼠]，CD45 RA，CD45 RO，CD154 Entrez nucleotideAY333790[家犬]，II类MHC[Entrez protein CAD62436，CAD62435，AAB08109[人]，Entrez protein 156028[小鼠])，VEGF Entrez proteinNP_003368，AAD03710，AAC63143，CAA44447[Homo sapiens]，Entreznucleotide NM_003376，AY047581[人])。
其它蛋白酶相关分子包括肿瘤抗原。可以由本发明的构建体靶定的肿瘤抗原的实例包括鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)(蛋白T4-A)；鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)；卵巢癌抗原CA125(IA1-3B)(KIAA0049)；粘蛋白1(肿瘤相关粘蛋白)(癌相关粘蛋白)(多形核上皮粘蛋白)(Pem)(Pemt)(上皮唾液蛋白)(肿瘤相关上皮膜抗原)(Ema)(H23AG)(花生反应性尿粘蛋白)(Pum)(乳腺癌相关抗原DF3)；CTCL肿瘤抗原se1-1；CTCL肿瘤抗原se14-3；CTCL肿瘤抗原se20-4；CTCL肿瘤抗原se20-9；CTCL肿瘤抗原se33-1；CTCL肿瘤抗原se37-2；CTCL肿瘤抗原se57-1；CTCL肿瘤抗原se89-1；前列腺特异性膜抗原；5T4癌胚滋养层糖蛋白；Orf73卡波西肉瘤相关疱疹病毒；MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)；MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原)(DAM10)；MAGE-B2抗原(DAM6)；MAGE-2抗原；MAGE-4a抗原；MAGE-4b抗原；结肠癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12变体A；癌症相关表面抗原；腺癌抗原ART1；副肿瘤相关脑-睾丸-癌抗原(癌神经元抗原MA2；副肿瘤神经元抗原)；神经-肿瘤腹侧抗原2(NOVA2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原MACE-X2；滑膜肉瘤，X断裂点2；T细胞识别的鳞状细胞癌抗原；血清学确定的结肠癌抗原1；血清学确定的乳腺癌抗原NYBR-15；血清学确定的乳腺癌抗原NY-BR-16；嗜铬粒蛋白A；甲状旁腺分泌蛋白1；DUPAN-2；CA 19-9；CA 72-4；CA 195；和L6(肿瘤相关抗原L6，也称作跨膜4超家族成员1、膜成分表面标志物1，或M3S1)。
可以作为结合域多肽的蛋白酶相关靶或作为结合区或结合域多肽或其部分的合适来源的其它细胞表面抗原/受体包括以下受体等：HER1(如GenBank编号U48722，SEG_HEGFREXS，K03193)，HER2(Yoshinoet al.，1994 J.Immunol.152：2393；Disis et al.，1994 Canc.Res.54：16；也见，例如GenBank编号X03363，M17730，SEG_HUMHER20)，HER3(例如GenBank编号U29339，M34309)，HER4(Plowman et al.，1993Nature 366：473；也见，例如GenBank编号L07868，T64105)，表皮生长因子(EGFR)(例如GenBank编号U48722，SEG_HEGFREXS，KO3193)，血管内皮细胞生长因子(例如GenBank编号M32977)，血管内皮生长因子受体(例如GenBank编号AF022375，1680143，U48801，X62568)，胰岛素样生长因子-I(例如GenBank编号X00173，X56774，X56773，X06043，也见欧洲专利GB 2241703)，胰岛素样生长因子-II(例如GenBank编号X03562，X00910，SEG_HUMGFIA，SEG_HUMGFI2，M17863，M17862)，转铁蛋白受体(Trowbridge and Omary，1981 Proc.Nat.Acad.USA 78：3039；也参见，  例如GenBank编号X01060，M11507)，雌激素受体(如GenBank编号M38651，X03635，X99101，U47678，M12674)，孕激素受体(如GenBank编号X51730，X69068，M15716)，滤泡刺激素受体(FSH-R)(如GenBank编号Z34260，M65085)，视黄酸受体(如GenBank编号L12060，M60909，X77664，X57280，X07282，X06538)，MUC-1(Barnes et al.，1989 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：7159；也见，例如GenBank编号SEG_MUSMUCIO，M65132，M64928)，NY-ESO-1(如GenBank编号AJ003149，U87459)，NA 17-A(如欧洲专利WO 96/40039)，Melan-A/MART-1(Kawakami et al.，1994 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3515；也见，例如GenBank编号U06654，U06452)，酪氨酸酶(Topalian et al.，1994 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：9461；也见，例如GenBank编号M26729，SEG_HUMTYRO，也见，例如Weber et al.，J；Clin.Invest(1998)102：1258)，Gp-100(Kawakami et al.，1994 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3515；也见，例如GenBank编号S73003，也见欧洲专利EP 668350；Adema et al.，1994 J.Biol.Chem.269：20126)，MAGE(van den Bruggen et al.，1991 Science254：1643；例如GenBank编号U93163，AF064589，U66083，D32077，D32076，D32075，U10694，U10693，U10691，U10690，U10689，U10688，U10687，U10686，U10685，L18877，U10340，U10339，L18920，U03735，M77481)，BAGE(例如GenBank编号U19180，也见美国专利5,683,886和5,571,711)，GAGE(例如GenBank编号AF055475，AF055474，AF055473，U19147，U19146，U19145，U19144，U19143，U19142)，任意CTA类的受体，具体包括由SSX2基因编码的HOM-MEL-40抗原(例如GenBank编号X86175，U90842，U90841，X86174)，癌胚抗原(CEA，Gold andFreedman，1985 J Exp.Med 121：439；也见，例如GenBank编号SEGHUMCEA，M59710，M59255，M29540)，以及PyLT(例如GenBank编号J02289，J02038)。
本发明的分子内的结合区可以包括例如需要的蛋白酶相关分子，包括抗原结合靶的结合域。结合域可以优选包含单链Fvs和scFv结构域。在某些实施方案中，本发明的分子可以包含结合区，其具有至少一个免疫球蛋白可变区多肽，所述多肽可以是轻链或重链可变区多肽。在某些实施方案中，本发明的分子可以包含至少一个所述轻链V区和一个所述重链V区，和至少一个连接V区的接头肽。用于本发明中的ScFv也包括具有嵌合的结合域或序列或其它结构域或序列的那些。用于本发明的其它ScFv也包括具有人源化的(全部或部分)结合域或序列或其它结构域或序列的那些。在某些实施方案中，来源于非人来源的免疫球蛋白结合序列或其它序列的全部或一部分可以根据制备人源化抗体的公知程序进行全部或部分“人源化”，即，引入了人Ig序列以减少人免疫系统将该蛋白识别为外源蛋白的程度的免疫球蛋白序列。
在某些实施方案中，结合域融合蛋白的结合域包含能够结合特定的蛋白酶相关分子的scFv。用于本发明的scFv，其作为鼠或其它scFVs(包括人scFvs)、嵌合scFvs或完整或部分人源化的scFV引入，其实例包括但不限于抗人CD28 scFvs(例如″2E12″scFvs)，VEGF scFvs(例如″LL4″scFvs(Peregrine Pharmaceuticals，Inc)，抗人VEGF scFvs(参见Thorpe等的US 6,703,020和ATCC PTA1595)，和抗人VEGF″JH1″scFvs。
在某些优选实施方案中，合成制备具有序列同源性或序列同一性免疫球蛋白可变区序列的多核苷酸，包括公知和/或公众可获得的那些，例如通过寡核苷酸合成、PCR和本领域公知的其它技术。
在本发明的另一方面，优选的受抑制的蛋白酶是基质金属蛋白酶，包括但不限于从前体释放血管内皮生长因子(VEGF)的片段的基质金属蛋白酶。VEGF的多种异构体的表达的其它蛋白酶和调节剂是此处描述的结合域融合蛋白和构建体的某些实施方案的靶，包括例如前蛋白转化酶如弗林蛋白酶、含有弗林蛋白酶基序的蛋白、弗林蛋白酶基序变体、PC5和PC7。参见，例如Siegfried et al.，2003 J.Clin.Invest.，111(11)：1723-1732，Joukov V.，et al.，1997 EMBOJ 16：3898-3911；KhatibA.M.，et al.，2002 Am.J.Pathol.160：1921-1935；Zhong，M.et al.，1999 J.Biol.Chem.274：33913-33920；Nakayama，K.，1997 Biochem.J.327：625-635；Salven P.，et al.1998 Am.J.Pathol.153：103-108和Seidah，N：G.etal.，1999 Brain Res.848：45-62；在此引入所有这些文献的内容作为参考，其可以包括在本发明的某些实施方案中，或排除于本发明的某些实施方案之外。另一方面，结合域融合蛋白抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达或减少VEGF的量。在示例的实施方案中，结合域融合蛋白抑制三种主要异构体(VEGF 121，VEGF 165和VEGF 189)中一种或多种异构体的表达或减少其量。在某些实施方案中，在预定的所需位点减少CEGF的一种或多种异构体(VEGF 121，VEGF 165和VEGF189)的表达或量。
某些构建体可能包含结合于VEGF的结合域，包括，例如抗人VEGFscFVs(例如来自Peregrine Pharmaceuticals，Inc的″LL4″)、嵌合的抗VEGF抗体(例如Ran Y et al.，″Construction of anti-human VEGF165chimeric antibodies and expression in eukaryotic cells″Zhonghua ZhongLiu Za Zhi.1999 Nov；21(6)：412-5中描述的″vmD 11″)、抗人VEGF scFvs(例如Thorpe等的US 6,703,020中的描述和ATCC PTA 1595)以及抗人VEGF scFvs(例如Kulawiec M.et al.，″Characterization of a novelbispecific fusion protein incorporating anti-VEGF single chain antibodyfragment JHI and anti-HER2/neu peptide AHNP″Abstracts submittedto the 2003 Annual Meeting of the Regional Cancer Center Consortiumfor the Biological Therapy of Cancer；第17页描述的″JH1″scFv)。
在本发明中有用的scFvs也包括scFvs，其包括具有一个或多个氨基酸取代的嵌合和人源化的scFvs。优选的氨基酸取代是重链可变区(VH)中第11位氨基酸的取代。所述取代在此可以称作″XxxVH11Zxx″。因此，例如，当VH11位的正常情况下存在的氨基酸是亮氨酸，并且将其取代为丝氨酸残基时，该取代被指定为″LVH11S″或″Leu VH11Ser″。本发明的其它优选实施方案包括含有scFvs的分子，其中缺失了正常情况下存在于VH11位的氨基酸残基。本发明的其它优选实施方案包括含有scFvs的分子，其中正常情况下存在于VH10和/或VH11和/或VH12位的氨基酸残基被取代或缺失。
在其它实施方案中，结合域融合蛋白包含一个或多个转谷氨酰胺酶结构域(TGase结构域或TGase底物结构域)。示例的TGase基序例如包含氨基酸序列Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys、基本由氨基酸序列Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys组成、或由氨基酸序列Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys组成。但是，任何包含另一氨基酸序列的肽或多肽都可以在此用作TGase基序，只要它是转谷氨酰胺酶的具有功能活性的底物。结合域融合蛋白的某些实施方案具有一个或一个以上TGase基序，例如一个、两个、三个、四个、五个、一个或两个、一个至五个、或五个以上TGase基序(如Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys)。某些其它示例的实施方案具有大约3-大约15个TGase基序(如Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys)，某些其它实施方案具有大约4-大约10个TGase基序(如Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys)。在某些实施方案中，结合域融合蛋白或此处描述的其它构建体的TGase结构域使得结合域融合蛋白能够锚定在特定位点，例如，提供额外的生物活性并且改进疗效的位点。转谷氨酰胺酶描述于名称为″Transglustaminase cross-linkable polypeptides and methodsrelating thereto″的US 5,428,014和名称为″Human Transglutaminases″的US 5,952,011中，在此全文引入这两篇文献作为参考，其可以包括在本发明的某些实施方案中，或排除于本发明的某些实施方案之外。
此处描述并且要求保护的多种分子包括连接分子的一个结构域与另一个结构域的连接区。在某些其它实施方案中，结合域多肽融合蛋白不具有连接区或间隔区。
连接区可以包含例如免疫球蛋白铰链区多肽，包括天然存在的任何铰链区肽或多肽。连接区也可以包括例如用于连接尾区和结合区的任何人工肽或其它分子(包括例如非肽分子、部分肽分子和肽模拟物等)。这些可以包括例如位于免疫球蛋白重链多肽中负责形成CH1和CH2区中的链内免疫球蛋白-结构域二硫键的氨基酸残基之间的分子的改变。天然存在的铰链区包含位于免疫球蛋白的恒定区，即CH1和CH2之间的那些。有用的免疫球蛋白铰链区多肽包括例如人免疫球蛋白铰链区多肽和美洲驼或其它骆驼类免疫球蛋白铰链区多肽。其它有用的免疫球蛋白铰链区多肽包括例如护士鲨和斑点银鲛免疫球蛋白铰链区多肽。人免疫球蛋白铰链区多肽包括例如野生型IgG铰链区，包括野生型人IgG1铰链区、人IgG来源的免疫球蛋白铰链区多肽、人IgG铰链区或IgG来源的免疫球蛋白铰链区的一部分、野生型人IgA铰链区多肽、人IgA来源的免疫球蛋白铰链区多肽、人IgA铰链区多肽或IgA来源的免疫球蛋白铰链区多肽的一部分、野生型人IgD铰链区多肽、人IgD来源的免疫球蛋白铰链区多肽、人IgD铰链区多肽或IgD来源的免疫球蛋白铰链区的一部分、起野生型人IgE铰链区作用的区域，即IgE CH2区多肽(其通常具有5个半胱氨酸残基)、人IgE来源的免疫球蛋白铰链区多肽、起人IgE铰链区作用的区域，即IgE CH2区多肽或IgE来源的免疫球蛋白铰链区多肽的一部分，等等。“来源于”免疫球蛋白多肽链区或作为免疫球蛋白多肽链区的“一部分或片段”的被认为具有铰链区功能的多肽具有肽键中一个或多个氨基酸的铰链区功能，例如，15-115个氨基酸，优选95-110、5-15、80-94、60-80或5-65个氨基酸，优选10-50个，更优选15-35个，更优选18-32个，更优选20-30个，更优选21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸。美洲驼免疫球蛋白铰链区多肽包括例如IgG1美洲驼铰链区。
所述连接区也包括，例如突变的或以其它方式改变或工程化的免疫球蛋白铰链区多肽。突变的或以其它方式改变或工程化的免疫球蛋白铰链区多肽可以包含来源于与任何包括的天然或工程化的CH2和CH3结构域相同或不同的免疫球蛋白同种型或类中的种，或免疫球蛋白亚类的免疫球蛋白的铰链区、基本由所述铰链区形成、或由所述铰链区形成。突变的或以其它方式改变或工程化的免疫球蛋白铰链区多肽包括来源于或构建自例如含有一个或多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区，如天然包含三个半胱氨酸的野生型人IgG或IgA铰链区的那些。在所述多肽中，半胱氨酸残基的数目可以例如通过氨基酸取代或缺失或截短而减少。这些多肽包括例如含有0、1或2个半胱氨酸残基的突变的人或其它IgG1或IgG3铰链区多肽，和含有0、1或2个半胱氨酸残基的突变的人或其它IgA1或IgA2铰链区多肽。突变的或以其它方式改变或工程化的免疫球蛋白铰链区多肽包括来源于或构建自例如含有三个或更多半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区，例如野生型人IgG2铰链区(其具有4个半胱氨酸)或IgG3铰链区(其具有11个半胱氨酸)的那些。突变的或以其它方式改变或工程化的免疫球蛋白铰链区多肽包括来源于或构建自例如通常含有5个半胱氨酸残基的IgE CH2野生型免疫球蛋白区的那些。在所述多肽中，半胱氨酸残基的数目可以通过例如氨基酸取代或缺失或截短而减少一个或多个半胱氨酸残基。也包括了改变的铰链区多肽，其中铰链区中的半胱氨酸残基被极性较低、疏水性较低、亲水性较高和/或中性的一个或多个其它氨基酸取代。所述突变的免疫球蛋白铰链区多肽包括例如含有一个半胱氨酸残基并且来源于具有两个或更多半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽的突变的铰链区多肽，如含有一个半胱氨酸残基并且来源于野生型人IgG或IgA区多肽的突变的人IgG或IgA铰链区多肽。连接区多肽包括形成链间、同二聚二硫键的能力受损的免疫球蛋白铰链区多肽。
突变的免疫球蛋白铰链区多肽也包括相对于野生型人免疫球蛋白G铰链区多肽表现出二聚能力降低的突变的铰链区多肽，和使得能够表达单体分子和二聚分子的混合物的突变的铰链区多肽。突变的免疫球蛋白铰链区多肽也包括经过工程化而含有糖基化位点的铰链区多肽。糖基化位点包括例如天冬酰胺连接的糖基化位点、O-连接的糖基化位点、C-半乳糖基化位点、糖基磷脂酰肌醇化位点和磷酸糖基化位点。
在此处描述和要求保护的本发明的分子中有用的特定连接区包括例如以下的由18个氨基酸组成的序列，DQEPKSCDKTHTCPPCPA、DQEPKSSDKTHTSPPSPA和DLEPKSCDKTHTCPPCPA。
例如，免疫球蛋白铰链区多肽可以包含任意以下成分、基本由任意以下成分组成、或由任意以下成分组成：(1)天然存在的任何铰链区或起铰链区作用的肽或多肽，例如，人免疫球蛋白铰链区多肽，其包括例如野生型人IgG铰链区或其部分、野生型人IgA铰链区或其部分、野生型人IgD铰链区或其部分、或起野生型人IgE铰链区作用的区域，即IgE CH2或其部分、野生型骆驼类铰链区或其部分(包括IgG1美洲驼铰链区或其部分、IgG2美洲驼铰链区或其部分、和IgG3美洲驼铰链区或其部分)、护士鲨铰链区或其部分、和/或斑点银鲛铰链区或其部分；(2)不含半胱氨酸残基并且来源于或构建自具有一个或多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽的突变的或以其它方式改变或工程化的铰链区多肽；(3)含有一个半胱氨酸残基并且来源于具有一个或多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽的突变的或以其它方式改变或工程化的铰链区多肽；(4)经过突变或以其它方式改变或工程化而含有或添加了一个或多个糖基化位点，如天冬酰胺连接的糖基化位点、O-连接的糖基化位点、C-半乳糖基化位点、糖基磷脂酰肌醇化位点或磷酸糖基化位点的铰链区多肽；(5)突变或以其它方式改变或工程化的铰链区多肽，其中半胱氨酸的数目由于氨基酸取代或缺失而减少，例如，含有例如0、1或2个半胱氨酸残基的突变的或以其它方式改变或工程化的IgG1铰链区、含有例如0、1、2或3个半胱氨酸残基的突变的或以其它方式改变或工程化的IgG2铰链区、含有例如0、1、2、3或4-10个半胱氨酸残基的突变的或以其它方式改变或工程化的IgG3铰链区、含有例如0或1个半胱氨酸残基的突变的或以其它方式改变或工程化的IgG4铰链区、或含有0或仅仅1或2个半胱氨酸残基的突变的或以其它方式改变或工程化的IgA1或IgA2铰链区(如″SCC″铰链区)、不含半胱氨酸残基的突变或以其它方式改变或工程化的IgD铰链区、或含有0或仅仅1、2、3或4个半胱氨酸残基的突变的或以其它方式改变或工程化的起人IgE铰链区作用的区域，即IgE CH2区多肽；或(6)此处描述或提到的任何其它连接区分子或用于连接相邻免疫球蛋白结构域如CH1结构域和CH2结构域的其它已知或以后发现的连接区分子。例如，铰链区多肽可以选自(i)例如野生型人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽，(ii)来源于或构建自具有3个或更多半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽的突变的或以其它方式改变或工程化的人IgG1或其它免疫球蛋白铰链区多肽，其中所述突变的人IgG1或其它免疫球蛋白铰链区多肽含有两个半胱氨酸残基，并且其中野生型铰链区的第一个半胱氨酸没有突变，(iii)来源于具有3个或更多半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽的突变的或以其它方式改变或工程化的人IgG1或其它免疫球蛋白铰链区多肽，其中所述突变的人IgG1或其它免疫球蛋白铰链区多肽含有不超过1个半胱氨酸残基，和(iv)来源于具有3个或更多半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区多肽的突变的或以其它方式改变或工程化的人IgG1或其它免疫球蛋白铰链区多肽，其中所述突变或以其它方式改变的人IgG1或其它免疫球蛋白铰链区多肽不含半胱氨酸残基。在某些实施方案中，例如，免疫球蛋白铰链区多肽是突变的或以其它方式改变或工程化的铰链区多肽，并且相对于野生型人免疫球蛋白G或其它野生型铰链区或起铰链区作用的多肽表现出二聚化能力降低。
免疫球蛋白铰链区多肽包括任何天然存在的、作为人工肽或作为基因工程结果和位于负责在CH1和CH2区中形成链内免疫球蛋白-结构域二硫键的氨基酸残基之间的免疫球蛋白重链多肽内的铰链区肽或多肽。用于本发明的铰链区多肽也可以包括突变的或以其它方式改变的铰链区多肽。因此，例如，免疫球蛋白铰链区多肽可以来源于上述经典地认为具有铰链区功能的免疫球蛋白链区域(包括此处描述的那些)，或是其部分或片段(即以肽键连接的一个或多个氨基酸，典型地约15-115个氨基酸，优选约95-110个，约80-94个，约60-80个，或约5-65个氨基酸，优选约10-50个，更优选约15-35个，更优选约18-32个，更优选约20-30个，更优选约21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸)。但用于本发明的铰链区多肽并不限于此，并且在IgG、IgA和IgD的情况下可以包括一个或多个位于邻接的免疫球蛋白结构域，如CH1结构域和/或CH2结构域中的氨基酸(根据用于分配特定残基至特定结构域的结构标准可能不同，如本领域公知)(或在IgE的情况下，是诸如CH1结构域和/或CH3结构域的邻接的免疫球蛋白结构域)，或者在某些人工工程化的免疫球蛋白构建体的情况下，可以包括免疫球蛋白可变区结构域。
野生型免疫球蛋白铰链区多肽包括任何位于免疫球蛋白，例如人免疫球蛋白的恒定区结构域CH1和CH2之间(或某些类型的免疫球蛋白，如IgE的CH1和CH3区之间)的公知的或以后发现的天然存在的铰链区。对于用于构建一种类型的连接区，野生型免疫球蛋白铰链区多肽优选是人免疫球蛋白铰链区多肽，优选包含来自人IgG、IgA或IgD免疫球蛋白(或IgE免疫球蛋白的CH2区)的铰链区，更优选包含例如来自此处描述的野生型或突变的人IgG1同种型的铰链区多肽。
如本领域所公知，尽管免疫球蛋白氨基酸序列具有极大的总体多样性，免疫球蛋白一级结构在免疫球蛋白多肽链的特定部分表现出高度序列保守性，特别是存在半胱氨酸残基，它们通过其巯基提供了与其它存在的巯基形成二硫键的潜能。因此，在本发明的内容中，用作连接区的野生型免疫球蛋白铰链区多肽包括特征在于一个或多个高度保守的(如以统计学显著的方式普遍存在于人群中)半胱氨酸残基的那些，在某些优选实施方案中，连接区可以包含突变的铰链区多肽、或基本由突变的铰链区多肽组成、或由突变的铰链区多肽组成，所述突变的铰链区多肽可以选自含有的半胱氨酸数目少于天然存在的半胱氨酸数目的那些，例如，在IgG1铰链区的情况下是0或1或2个半胱氨酸残基，在IgG4的情况下是0或1个半胱氨酸残基，以及来源于或构建自(或使用)所述野生型铰链区序列的那些。
在某些优选的实施方案中，其中连接区是铰链区多肽，并且铰链区多肽是来源于或构建自(或使用)野生型铰链区序列的突变的、工程化的或以其它方式改变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽，应该注意野生型人IgG1铰链区多肽序列沿着铰链区序列从多肽N末端到C末端包含3个非相邻的半胱氨酸残基，分别称作野生型铰链区的第一半胱氨酸、野生型铰链区的第二半胱氨酸，和野生型铰链区的第三半胱氨酸。这在此可以称作″CCC″铰链区(或″WTH″，即野生型铰链区)。突变的或工程化的铰链区的实例包括不含半胱氨酸的那些，其在此可以称作″XXX″铰链区(或例如称作″MH-XXX，″表示具有3个氨基酸或其它分子代替天然存在的半胱氨酸的突变的或工程化的铰链区，例如，″MH-SSS″，表示具有三个丝氨酸残基代替天然在的半胱氨酸的突变的铰链区)。可以理解，术语“突变的”仅仅表示在天然存在的残基的位置存在不同的分子，或不存在分子，不表示进行了所述取代、改变或缺失的任何特定方法。因此，在本发明的某些实施方案中，连接区可以是铰链区多肽，并且铰链区多肽是突变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽，其含有2个半胱氨酸残基，并且例如其中野生型铰链区的第一个半胱氨酸没有改变或缺失。这可以称作″MH-CXX″铰链区，例如″MH-CSC″铰链区，在此情况下半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代。在本发明的某些其它实施方案中，突变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽含有不超过1个半胱氨酸残基，并且包括例如″MH-CSS″铰链区或″MH-SSC″铰链区或″MH-SCS″铰链区，并且在某些其它实施方案中，突变的人IgG1免疫球蛋白铰链区多肽不含半胱氨酸，例如″MH-SSS″铰链区。
连接区可以包含突变的或以其它方式改变的免疫球蛋白铰链区多肽，其自身可以包含来源于不同于尾区的免疫球蛋白同种型或类中的种或免疫球蛋白亚类的免疫球蛋白的铰链区，所述尾区例如包含CH2和CH3结构域(或IgE CH3和CH4结构域)、基本由CH2和CH3结构域(或IgE CH3和CH4结构域)组成、或由CH2和CH3结构域(或IgE CH3和CH4结构域)组成的尾区。例如，在本发明的某些实施方案中，构建体，例如结合域免疫球蛋白融合蛋白，可以包含结合区，如融合或以其它方式连接于免疫球蛋白铰链区多肽的结合域多肽，所述铰链区包含以下铰链区、或基本由以下铰链区组成、或由以下铰链区组成：此处描述的野生型人IgA铰链区多肽或包含0或仅仅1个或更多半胱氨酸残基(但少于野生型的半胱氨酸数目)的突变的或以其它方式改变的人IgA铰链区多肽、或野生型人IgG铰链区，如IgG1铰链区多肽，或起野生型人IgE铰链区作用的区域，即IgE CH2区多肽、或经过突变或以其它方式改变以含有0、1或2个半胱氨酸残基的突变的或以其它方式改变的人IgG铰链区，如IgG1铰链区多肽，其中野生型铰链区的第一个半胱氨酸没有突变或改变或缺失，其也在此描述。所述铰链区多肽可以融合或以其它方式连接于例如尾区，所述尾区包含来自不同Ig同种型或类的免疫球蛋白重链CH2区多肽、基本由所述CH2区多肽组成、或由所述CH2区多肽组成，所述不同Ig同种型或类例如IgA或IgD或IgG亚类(或来自IgE亚类的CH3区)，其在某些优选实施方案中是IgG1或IgA或IgE亚类，在某些其它优选实施方案中可以是IgG2、IgG3或IgG4亚类中的任何一个。
例如，如下面更详细的描述，在本发明的某些实施方案中，可以选择连接区，使其是免疫球蛋白铰链区多肽，其是或来源于天然包括三个半胱氨酸的野生型人IgA铰链区，其中所选择的铰链区多肽相对于完整的和/或天然存在的铰链区被截短或以其它方式改变或取代，使得只剩下1个或2个半胱氨酸残基(如SEQ ID NOS：35-36)。
类似地，在本发明的某些其它实施方案中，构建体可以是结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含融合或以其它方式连接于免疫球蛋白铰链区多肽的结合域多肽，所述免疫球蛋白铰链区多肽包含突变或以其它方式改变的铰链区多肽，其中由于氨基酸取代或缺失而减少了半胱氨酸残基的数目，例如，此处描述的含有0、1或2个半胱氨酸残基的突变的或以其它方式改变的IgG1铰链区，或含有0个半胱氨酸残基的IgD铰链区。
因此，突变的或以其它方式改变的铰链区多肽可以来源于或构建自(或使用)含有1个或更多半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区。在某些实施方案中，突变的或以其它方式改变的铰链区多肽可以含有0或仅仅1个半胱氨酸残基，其中突变的或以其它方式改变的铰链区多肽来源于分别含有1个或多个或2个或更多半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链区。在突变的或以其它方式改变的铰链区多肽中，野生型免疫球蛋白铰链区的半胱氨酸残基优选缺失或被不能形成二硫键的氨基酸取代。在本发明的一种实施方案中，突变的或以其它方式改变的铰链区多肽来源于人IgG野生型铰链区多肽，其可以包括四种人类IgG同种型亚类即IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任意一种。在某些优选实施方案中，突变的或以其它方式改变的铰链区多肽来源于(或使用)人IgA或IgD野生型铰链区多肽。例如，来源于人IgG1或IgA野生型铰链区多肽的突变的或以其它方式改变的铰链区多肽可以包含野生型免疫球蛋白铰链区中三个半胱氨酸残基中两个半胱氨酸残基的突变、改变或缺失，或所有三个半胱氨酸残基的突变、改变或缺失。
存在于野生型免疫球蛋白铰链区并且根据本发明的某些实施方案而进行的诱变或任何其它技术所除去或改变的半胱氨酸残基包括形成、或能够形成链间二硫键的半胱氨酸残基。
在结合域融合蛋白的某些实施方案中，可以制备具有一种或多种需要的效应物功能的蛋白。不希望受到特定理论或作用机制的限制，本发明考虑了这些铰链区半胱氨酸残基的突变、缺失或其它改变，这些半胱氨酸残基被认为参与链间二硫桥形成，减少本发明的结合域免疫球蛋白融合蛋白通过二硫键形成而二聚化(或形成更高级的寡聚物)的能力，同时出乎意料地不减少或不利地破坏融合蛋白或其它构建体促进ADCC和/或CDC和/或固定补体的能力。具体地，介导ADCC的Fc受体(如FcRIII，CD16)具有对免疫球蛋白Fc结构域的低亲和力，支持Fc与FcR的功能性结合需要Fc-FcR复合物的亲和稳定这一观点，这是由于常规抗体中重链的二聚结构，和/或通过常规抗体Fc结构的FcR聚集和交联而导致的。Sonderman et al.，2000 Nature 406：267；Radaev et al.，2001 J Biol Chem.276：16469；Radaev et al.，2001 J：Biol.Chem.276：16478；Koolwijk et al.，1989 J；Immunol.143：1656；Kato etal.，2000 Immunol.Today 21：310。因此，本发明的构建体，包括例如结合域免疫球蛋白融合蛋白提供了与单链构建体，包括单链免疫球蛋白融合蛋白相关的优点，同时也出乎意料地保留了免疫学活性。同样，固定补体的能力一般与包含Fc的重链恒定区为二聚化的免疫球蛋白相关，而本发明的各种构建体，包括结合域免疫球蛋白融合蛋白，可能由于铰链区半胱氨酸残基的取代或缺失或由于此处描述的其它结构修饰，例如具有受损或减少的形成链间二硫键的能力，表现出出乎意料的固定补体的能力。此外，根据本发明的某些实施方案，其中构建体，包括例如结合域免疫球蛋白融合蛋白，可以包含连接区和尾区，所述尾区包含以下成分、或基本由以下成分组成、或由以下成分组成：起人IgE铰链区作用的区域，即IgE CH2区多肽、人IgE CH3恒定区多肽和人IgE CH4恒定区多肽中的一个或多个，本发明的构建体，包括融合蛋白出乎意料地保留了介导ADCC和/或诱导过敏反应机制的免疫学活性。
作为本发明构建体，如结构域免疫球蛋白融合蛋白的某些实施方案的连接区的免疫球蛋白铰链区多肽的选择可能涉及使用“替代的铰链区”多肽序列，其包括不是必须来源于任何免疫球蛋白铰链区序列本身的多肽序列。实际上，替代的铰链区是指这样的铰链区多肽，其包含未决的U.S.A.N.10/627,556或PCT/US03/41600中描述的序列中存在的至少约10个连续氨基酸或分子的氨基酸序列或其它分子，在某些实施方案中，包含U.S.A.N.10/627,556或PCT/US03/41600中描述的序列中存在的至少约11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21-25，26-30，31-50，51-60，71-80，81-90或91-110个氨基酸或分子的氨基酸序列或分子，或例如，来源于位于免疫球蛋白基因超家族成员的链内二硫键产生的免疫球蛋白样环结构域之间的区域的多肽序列，所述基因超家族成员例如CD2(例如Genbank编码NM_001767)，CD4(例如Genbank编号NM_00616)，CD5(例如Genbank编号  BC027901)，CD6(例如Genbank编号NM_006725)，CD7(例如Genbank编号XM_046782，BC009293，NM_006137)或CD8(例如Genbank编号M12828)，或其它Ig超家族成员。通过非限定性的举例，用作连接区的替代的铰链区，例如可以提供此处提供的糖基化位点，或者可提供来源于人类基因的多肽序列，目的在于增强融合蛋白的“人源化”程度，或可以包含消除或降低本发明的构建体如融合蛋白的能力，如形成多聚物或寡聚物或聚集物等的能力的氨基酸序列、或基本由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成。某些替代的铰链区多肽序列，包括此处描述的那些，可以来源于或构建自(或使用)实际上本身不是免疫球蛋白的免疫球蛋白基因超家族成员的多肽序列。例如，根据非限制性的理论，某些位于免疫球蛋白基因超家族成员蛋白的链内二硫键产生的免疫球蛋白环结构域之间的多肽序列可以全部或部分用作此处提供的替代的铰链区多肽，或为了所述用途进一步修饰。在某些实施方案中，连接区自身可以作为二聚结构域。但是，在某些其它包含二聚结构域的实施方案中，二聚结构域是分开的，并且不同于连接区。
在本发明的另一方面，结合域融合蛋白可以进一步包含一个区域，该区域包含二聚结构域、基本由二聚结构域组成、或由二聚结构域组成。
合适的二聚结构域包括促进蛋白或蛋白的结构域之间共价和非共价键形成的那些。二聚结构域可以例如促进此处提供的构建体和结合域融合蛋白的同二聚体或异二聚体的形成。在某些实施方案中，二聚结构域促进包含二聚结构域的群体的所有分子或基本所有分子的向二聚状态的绝对转变。在替代的实施方案中，二聚结构域将不会促进向二聚状态的绝对转变，而是将影响特定构建体的单体/二聚体平衡状态。这种作用可能是诸如pH、盐浓度、蛋白浓度等的生理条件的函数。特定的二聚结构域可以对特定构建体和结合域蛋白的单体与二聚体平衡赋予不同的作用，这些作用可以例如依赖于蛋白内放置的位点。
合适的二聚结构域包括此处描述的任何连接区。连接区通常通过促进二硫键的形成起二聚结构域的作用。任选可以存在不作为连接区的一个或多个二聚结构域，其中连接区可能自身起或不起二聚结构域的作用。另一种合适的二聚结构域可以包含连接区的亚部分或连接区的保守的序列基序，如免疫球蛋白铰链区中的保守序列。可以用作二聚基序的示例的保守序列包括四个氨基酸组成的基序CPPC和CPXC，其中x选自氨基酸赖氨酸和谷氨酰胺。合适的五个氨基酸组成的二聚基序包括CPPCP和CPXCP，其中x选自氨基酸赖氨酸和谷氨酰胺。尽管不希望受到任何理论的限制，认为包含半胱氨酸残基的二聚基序促进二硫键的形成，包括有效促进二聚的链内二硫键。二聚结构域是可以放置在此处描述的构建体和结合域中任何需要的位置上的构建体的另一种组件成分。
二聚结构域可以包含促进离子相互作用、疏水相互作用、氢键形成或促进二聚体形成的非共价相互作用。例如，结合域免疫球蛋白可变区相互作用可以作为二聚结构域。
合适的二聚结构域进一步包含免疫球蛋白恒定区，如免疫球蛋白CH2CH3结构域或免疫球蛋白CH3结构域或类似物(如IgG CH2CH3或CH3，IgA CH2CH3或CH3)。结合域融合蛋白的二聚结构域中的免疫球蛋白结构域的序列可以来源于动物，例如哺乳动物，并且优选来源于人。但是，二聚结构域可以包含任何免疫球蛋白恒定区多肽序列。除了作为二聚结构域外，抗体恒定区可以用于结合域融合蛋白中，例如用于与恒定区结构域相关的效应物功能。
免疫球蛋白恒定区可以掺入构建体中，以便例如促进构建体的纯化、增加半衰期或赋予效应物功能。用于本发明中的抗体恒定区包括IgG、IgA和IgD抗体中的重链，其称作CH1、CH2和CH3，以及IgM和IgE抗体中的重链，即CH1、CH2、CH3和CH4，和免疫球蛋白轻链CL(轻链的恒定区)中的恒定区。优选的是IgG、IgA和IgD CH2和/或CH3区。优选的是IgM和IgE CH2、CH3和/或CH4。本发明的构建体可能具有或介导，或不具有或介导抗体依赖性介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。本发明的构建体可能结合或不结合Fc受体，包括但不限于例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcαRl(CD89)和FcγRIII(CD16)受体。
在本发明的另一方面，结合域融合蛋白可以进一步包含来自免疫球蛋白重链的除CH1外的天然或工程化的恒定区、基本由所述恒定区组成、或由所述恒定区组成，所述恒定区如IgG的CH2和CH3区、IgA的CH2和CH3区、或IgE的CH3和CH4区。
在本发明的另一方面，结合域多肽调节剂融合蛋白可进一步包括一个区域，所述区域包含天然或工程化的免疫球蛋白重链CH2型区、基本由所述免疫球蛋白重链CH2型区组成、或由所述免疫球蛋白重链CH2型区组成，所述免疫球蛋白重链CH2型区例如IgG的CH2区、IgA的CH2区、或IgE的CH3区。
在本发明的另一方面，结合域多肽融合蛋白可以进一步包括一个区域，所述区域包含天然或工程化的来自免疫球蛋白重链的C末端恒定区、基本由所述恒定区组成、或由所述恒定区组成，所述恒定区如IgG的CH3区、IgA的CH3区、或IgE的CH4区。本发明的范围内还包含来自IgA的CH3结构域，其包括能够通过J链交联多肽的J链尾。
尽管不希望受到任何特定理论或机理的限制，认为缺乏二聚结构域时，结合域融合蛋白将以单体状态存在，除非结合域的一些特定特征使得结合域融合蛋白能够形成二聚体或多聚体。
在某些实施方案中，本发明提供了多核苷酸或载体(包括克隆载体和表达载体)或转化或转染的细胞，包括分离或纯化的或纯的多核苷酸、载体和分离的转化或转染的细胞，其编码或含有任何上述或此处描述的多肽或例如包括结合域融合蛋白的本发明的蛋白构建体。因此，在多种实施方案中，本发明提供了包含与启动子可操作性连接的任何所述多核苷酸的重组克隆或表达构建体。
将编码本发明的所需构建体，如结合域-免疫球蛋白融合蛋白的DNA构建体导入用于在适当宿主中表达的载体，如质粒。在优选实施方案中，宿主是哺乳动物宿主，如哺乳动物细胞系。编码配体或核酸结合域的序列优选进行了密码子优化，用于在特定宿主中表达。因此，例如，如果构建体例如是人结合域-免疫球蛋白融合蛋白，并且在细菌中表达，可以对密码子进行优化用于细菌使用。对于小的编码区，可以将基因合成为单个寡核苷酸。对于较大的蛋白，可以使用多个核苷酸的剪接、诱变或其它本领域公知的技术。质粒或其它载体中的作为调节区的核苷酸序列，例如启动子和操纵子，进行了彼此的可操作性结合，用于转录。编码结合域-免疫球蛋白融合蛋白的核苷酸序列也可以包括编码分泌信号的DNA，由此得到的肽是前体蛋白。得到的加工的蛋白可以从周质间隙或发酵培养基中回收。
在优选实施方案中，DNA质粒也可包含转录终止子序列。此处用到的“转录终止子区”是传递转录终止信号的序列。完整的转录终止子可以从蛋白编码基因获得，该基因可以与插入的结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码基因或启动子来源相同或不同。转录终止子任选是此处的表达系统的任选成分，但在优选实施方案中使用。
此处使用的质粒或其它载体包含与编码目的蛋白或多肽的DNA操作性连接的启动子，并且设计用于在上文所述的合适宿主(例如细菌、鼠或人)中表达蛋白，这取决于质粒的所需用途(例如，给予含有结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码序列的疫苗)。用于表达此处的蛋白和多肽的合适启动子可以从多种途径获得，并且是本领域公知的。优选连接于调节区的诱导型或组成型启动子。例如，这些启动子包括，但不限于T7噬菌体启动子和其它T7样噬菌体启动子，例如T3、T5和SP6启动子，trp、lpp和lac启动子，如大肠杆菌的lacUV5启动子；杆状病毒/昆虫细胞表达系统的P10或多角体蛋白基因启动子(见，例如美国专利5,243,041，5,242,687，5,266,317，4,745,051和5,169,784)以及来自于其它真核表达系统的诱导型启动子。对于表达蛋白，将这些启动子插入质粒，与控制区如lac操纵子处于操作性连接。
优选的启动子区例如是在哺乳动物细胞中可诱导并且具有功能的那些。用于细菌表达的合适的诱导型启动子和启动子区的例子包括，但不限于，反应于异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG；见Nakamuraet al.，Cell 18：1109-1117，1979)的大肠杆菌lac操纵子；反应于重金属(如锌)诱导的金属硫蛋白启动子金属调节元件(见例如Evans等的美国专利4,870,009)；反应于IPTG的噬菌体T7lac启动子(见例如美国专利4,952,496；和Studier et al.，Meth.Enzymol.185：60-89，1990)以及TAC启动子。根据要采用的表达宿主系统，质粒可以任选包含在宿主中具有功能的选择标记基因。选择标记基因包括任何赋予细菌能够使被转化细菌细胞从大量未转化细胞中鉴定出来并选择性生长的表型的基因。用于细菌宿主的适当选择标记，例如包括氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)和卡那霉素抗性基因(Kanr)。目前卡那霉素抗性基因对于细菌表达是优选的。
在多种表达系统中，质粒或其它载体也可以包含编码用于可操作性连接的蛋白的分泌信号的DNA。适用的分泌信号可以从多种途径获得并且是本领域公知的。可以采用在大肠杆菌中有功能的原核和真核分泌信号。根据表达系统，此处优选的分泌信号可以包括，但不限于，由以下大肠杆菌基因编码的信号：ompA，ompT，ompF，ompC，β-内酰胺酶和碱性磷酸酶等(von Heijne，J MoL BioL 184：99-105，1985)。此外，可以使用细菌pelB基因分泌信号(Lei et al.，J.Bacteriol.169：4379，1987)，phoA分泌细胞和在昆虫细胞中有功能的cek2。用于某些表达系统的最优选的分泌信号是大肠杆菌ompA分泌信号。也可以使用本领域公知的其它原核和真核分泌信号(见，例如von Heijne，J MoL Biol.184：99-105，1985)。采用此处描述的方法，本领域技术人员可以替换在酵母、昆虫或哺乳动物细胞中有功能的分泌信号，以便从这些细胞分泌蛋白。
用于转化大肠杆菌细胞的优选质粒包括pET表达载体(如pET-11a，pET-12a-c，pET-15b；见美国专利4,952,496；可以从Novagen，Madison，WI.获得)。其它优选的质粒包括pKK质粒，特别是pKK 223-3，它含有tac启动子(Brosius et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6929，1984；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology；美国专利5,122,463，5,173,403，5,187,153，5,204,254，5,212,058，5,212,286，5,215,907，5,220,013，5,223,483和5,229,279)。已经通过用卡那霉素基因替代氨苄青霉素抗性基因而修饰质粒pKK(可以从Pharmacia获得；得自pUC4K，见例如Vieira et al(1982 Gene 19：259-268，1982；和美国专利4,719,179.)。杆状病毒载体，例如pBlueBac(也称作pJVETL及其衍生物)，特别是pBlueBac III(见例如美国专利5,278,050，5,244,805，5,243,041，  5,242,687，  5,266,317，4,745,051和5,169,784；可以从Invitrogen，San Diego得到)也可以用于在昆虫细胞中表达多肽。其它质粒包括pIN-IIIompA质粒(见美国专利4,575,013；也见Duffaud et al.，Meth.Enz.153：492-507，1987)，例如pIN-IIIompA2。
优选地，如果一个或多个DNA分子在细菌细胞中复制，优选的宿主是大肠杆菌。优选的DNA分子也包括细菌的复制起点，以保证DNA分子在细菌的各代中保留。以此方式，可以通过在细菌中的复制产生大量DNA分子。在所述表达系统中，优选的细菌复制起点包括，但不限于fl-ori和col E1复制起点。所述系统的优选的宿主细胞含有可操作性连接于诱导型启动子，如lacUV启动子的编码T7 RNA聚合酶的DNA(见美国专利4,952,496)。所述宿主包括，但不限于溶原体大肠杆菌株HMS174(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysS，HMS174(DE3)和BL21(DE3)。菌株BL21(DE3)是优选的。PLys菌株提供了低水平的T7溶菌酶，即T7 RNA聚合酶的一种天然抑制剂。
提供的DNA分子也可以含有编码阻遏蛋白的基因。阻遏蛋白能够抑制含有结合于阻遏蛋白的核苷酸序列的启动子的转录。可以通过改变细胞的生理条件而解除启动子的阻遏。例如，该改变可以通过在生长培养基中加入抑制与操纵子或调节蛋白或DNA的其它区域相互作用的能力的分子或通过改变生长培养基的温度而完成。优选的阻遏蛋白包括，但不限于反应于IPTG诱导的大肠杆菌lacI阻遏物，温度敏感性λcI857阻遏物等。大肠杆菌lacI阻遏物是优选的。
概言之，本发明的重组构建体也将含有转录和翻译的必要元件。具体地，这些元件是优选的，其中含有编码结合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸序列的重组表达构建体将用于在宿主细胞或生物中表达。在本发明的某些实施方案中，可以通过使基因处于启动子调节下而完成细胞结合域免疫球蛋白-融合蛋白编码基因的细胞类型优选性或细胞类型特异性表达。启动子的选择将取决于待转化细胞类型和所需控制的程度或类型。启动子可以是组成型的或有活性的，并且可以进一步是细胞类型特异性的，组织特异性的、各个细胞特异性的、事件特异性的、时间特异性的或诱导型的。细胞类型特异性启动子和事件类型特异性的启动子是优选的。组成型或非特异性启动子的例子包括SV40早期启动子(美国专利5,118,627)、SV40晚期启动子(美国专利5,118,627)、CMV早期基因启动子(美国专利5,168,062)，以及腺病毒启动子。除病毒启动子外，细胞启动子也用于本发明的内容。具体地，可以使用用于所谓的管家基因的细胞启动子。病毒启动子是优选的，因为它们一般是比细胞启动子更强的启动子。已经在许多真核生物，包括高等真核生物的基因中鉴定了启动子区，这样本领域技术人员可以容易选择用于特定宿主的适当启动子。
也可以使用诱导型启动子。这些启动子包括由地塞米松诱导的MMTV LTR(PCT WO 91/13160)、由重金属诱导的金属硫蛋白启动子；和由cAMP诱导的具有cAMP反应元件的启动子。通过使用诱导型启动子，编码结合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸序列可以由本发明的表达构建体递送至细胞，并且保持静止，直到加入诱导剂。这允许了对基因产物的产生时间的进一步控制。
事件类型特异性启动子仅仅在发生某种事件，如致肿瘤性或病毒感染时才有活性或被上调。HIV LTR是事件特异性启动子的公知例子。该启动子是无活性的，除非存在tat基因产物，这是在病毒感染时发生的。一些事件类型特异性启动子也是组织特异性的。
此外，可以使用由特定细胞基因协同调节的启动子。例如，当需要本发明的特定结合构建体，如结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码基因的表达与一个或多个额外内源性或外源性导入的基因协同时，可以使用协同表达的基因的启动子。当已知与在免疫系统的特定组织中导入免疫应答相关的基因表达模式时，这种类型的启动子特别有用，这样该组织内的特异性免疫感受态细胞可以被激活或以其它方式募集参与免疫应答。
除了启动子外，可以插入阻遏序列、负调节子、或组织特异性沉默子，以减少某些情况下结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码基因的非特异性表达，所述情况例如，作为治疗策略的一部分而瞬时免疫受到破坏的宿主。可以在启动子区插入多种阻遏元件。转录的阻遏不依赖于阻遏元件的方向或与启动子的距离。一种类型的阻遏序列是绝缘序列。这种序列抑制转录(Dunaway et al.，Mol Cell Biol 17：182-9，1997；Gdula et al.，Proc Natl Acad Sci USA 93：9378-83，1996，Chan et al.，JVirol 70：5312-28，1996；Scott and Geyer，EMBO J 14：6258-67，1995；Kalos and Fournier，Mol Cell Biol 15：198-207，1995；Chung et al.，Cell74：505-14，1993)并将沉默不需要的背景转录。
也在II型(软骨)胶原、碱性酰基转移酶、白蛋白(Hu et al.，J.CellGrowth Differ.3(9)：577-588，1992)、磷酸甘油激酶(PGK-2)(Misuno etal.，Gene 119(2)：293-297，1992)的启动子区和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶基因中鉴定了阻遏元件(Lemaigre et al.，Mol.Cell Biol.11(2)：1099-1106)。此外，在许多肝脏特异性基因中鉴定了负调节元件Tse-1，发现其阻断cAMP反应元件-(CRE)介导的肝细胞中基因激活的诱导(Boshart et al.，Cell 61(5)：905-916，1990)。
在优选实施方案中，将增加所需产物的表达的元件掺入构建体中。所述元件包括内部核糖体结合位点(IRES；Wang and Siddiqui，1995Curr.Top.Microbiol.Immunol 203：99；Ehrenfeld and Semler，1995Curr.Top.Microbiol.Immunol.203：65；Rees et al.，1996 Biotechniques20：102；Sugimoto et al.，1994 Biotechnology 12：694)。IRES增加翻译效率。同样，其它序列也可增加表达。对于一些基因，特别是在5’端的序列抑制转录和/或翻译。这些序列通常是可以形成发夹结构的回文序列。一般去除待递送核酸中的这种序列。对转录或翻译产物的表达水平进行了测定，以证实或确定哪些序列影响表达。可以用任何公知的方法测定转录物水平，包括RNA印迹杂交，RNA酶探针保护等。可以通过任意公知的方法测定蛋白水平，包括ELISA，蛋白印迹，免疫细胞化学或其它公知方法。
可以将其它元件掺入本发明的构建体中，例如掺入编码本发明的构建体的结合域-免疫球蛋白融合蛋白中。在优选实施方案中，该构建体包含转录终止子序列，包括聚腺苷酸化序列，剪接供体和受体位点，以及增强子。也可以掺入其它用于表达构建体和将其维持在哺乳动物细胞或其它真核细胞中的元件(如复制起点)。由于这些构建体可以方便地在细菌细胞中产生，掺入了对于在细菌中增殖是必要的，或者增强在细菌中增殖的元件。所示元件包括复制起点、可选择标记等。
如此处提供的，此处通过同时递送两种或更多的不同调节的核酸构建体，可以使编码本发明的构建体，如结合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸表达的额外控制水平可以送递到细胞中，例如用于基因治疗。使用这样的多核酸构建体方法可以允许免疫应答的协同调节，例如，依赖于细胞类型和/或另一所表达的被编码成分的空间时间协同。本领域技术人员可以理解，通过选择适当的调节序列可以用相似的方式完成多个水平的被调节基因表达，所述调节序列包括但不限于启动子、增强子和其它公知的基因调节元件。
本发明也涉及载体，以及通过包含本发明的核酸的公知载体制备的构建体，特别涉及“重组表达构建体”，包括多种公知构建体中的任何一种，所述构建体包括用于基因治疗的送递构建体，其包含任何编码例如本发明的结合域-免疫球蛋白融合蛋白和多肽的核酸；本发明也涉及通过用本发明的载体和/或其它构建体而基因工程化的宿主细胞，以及通过重组技术施用表达或包含例如本发明的所述结合域-免疫球蛋白融合多肽和融合蛋白，或其片段或变体的编码核酸的构建体方法。
本发明的多种构建体，包括例如结合域-免疫球蛋白融合蛋白基本可以在适当启动子的控制下在任何宿主细胞中(在用于基因治疗的情况下包括体内宿主细胞)表达，这取决于构建体的性质(如上文所述启动子的类型)，以及所需宿主细胞的性质(如有丝分裂后最终分化还是活跃分裂；如表达构建体在宿主细胞中是作为附加体存在还是整合到宿主基因组中)。
用于原核和真核宿主的适当克隆和表达载体描述于例如Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor，NY，(1989)，如上文所指出，在本发明的特别优选的实施方案中，在用本发明的重组表达构建体转染或转化的哺乳动物细胞中进行重组表达。也参见例如Machida，CA.，″Viral Vectors for GeneTherapy：Methods and Protocols″；Wolff，JA，″Gene Therapeutics：Methods and Applications of Direct Gene Transfer″(Birkhauser 1994)；Stein，U and Walther，W(eds.P，″Gene Therapy of Cancer：Methodsand Protocols″(Humana Press 2000)；Robbins，PD(ed.)，″GeneTherapy Protocols″(Humana Press 1997)；Morgan，JR(ed.)，″GeneTherapy Protocols″(Humana Press 2002)；Meager，A(ed.)，″GeneTherapy Technologies，Applications and Regulations：From Laboratoryto Clinic″(John Wiley & Sons Inc.1999)；MacHida，CA and Constant，JG，″Viral Vectors for Gene Therapy：Methods and Protocols″(Humana Press 2002)；″New Methods Of Gene Therapy For GeneticMetabolic Diseases NIH′Guide，″Volume 22，Number 35，October 1，1993。也参见涉及包括疫苗的基因治疗的美国专利，包括美国专利6,384,210(″Solvent for biopolymer synthesis，solvent microdroplets andmethods of use″)；6,384,203(″Family of immunoregulators designatedleukocyte immunoglobulin-like receptors(LIR)″)；6,384,202(″Cell-specific active compounds regulated by the cell cycle″)；6,384,018(″Polynucleotide tuberculosis vaccine″)；6,383,814(″Cationicamphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules″)；6,383,811(″Polyampholytes for delivering polyions to a cell″)；6,383,795(″Efficient purification of adenovirus″)；6,383,794(″Methods ofproducing high titer recombinant adeno-associated virus″)；6,383,785(″Self-enhancing，pharmacologically controllable expression systems″)；6,383,753(″Yeast mammalian regulators of cell proliferation″)；6,383,746(″Functional promoter for CCR5″)；6,383,743(″Method forserial analysis of gene expression″)；6,383,738(″Herpes simplex virusORF P is a repressor of viral protein synthesis″)；6,383,737(″Humanoxalyl-CoA Decarboxylase″)；6,383,733(″Methods of screening forpharmacologically active compounds for the treatment of tumourdiseases″)；6,383,522(″Toxicity reduced composition containing ananti-neoplastic agent and a shark cartilage extract″)；6,383,512(″Vesicular complexes and methods of making and using the same″)；6,383,481(″Method for transplantation of hemopoietic stem cells″)；6,383,478(″Polymeric encapsulation system promoting angiogenesis″)；6,383,138(″Method for transdermal sampling of analytes″)；6,380,382(″Gene encoding a protein having diagnostic，preventive，therapeutic，and other uses″)；6,380,371(″Endoglycan：a hovel protein havingselectin ligand and chemokine presentation activity″)；6,380,369(″Human DNA mismatch repair proteins″)；6,380,362(″Polynucleotides，polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for theiruse″)；6,380,170(″Nucleic acid construct for the cell cycle regulatedexpression of structural genes″)；6,380,169(″Metal complex containingoligonucleoside cleavage compounds and therapies″)；6,379,967(″Herpesvirus saimiri as viral vector″)；6,379；966(″Intravasculardelivery of nou-viral nucleic acid protease proteins，and uses thereof)。
一般地，例如，表达构建体来源于质粒载体。一种优选的构建体是修饰的pNASS载体(Clontech，Palo Alto，CA)，其具有编码氨苄青霉素抗性基因的核酸序列、聚腺苷酸化信号和T7启动子位点。其它适当的哺乳动物表达载体是公知的(见，例如，Ausubel et al.，1995；Sambrooket al.，supra；也见，例如catalogues from Invitrogen，San Diego，CA；Novagen，Madison，WI；Pharmacia，Piscataway，NJ，及其它)。目前可以制备的优选构建体包含适当调控下的二氢喋呤还原酶(DHFR)编码序列，用于增加结合域-免疫球蛋白融合蛋白的产生水平，该水平是通过在施用适当选择试剂(如氨甲喋呤)后进行基因扩增而达到的。
一般地，重组表达载体包括允许宿主细胞转化的复制起点和选择标记，以及来自于高表达的基因、用于指导下游结构序列转录的上文所述的启动子。异源结构序列与翻译起始和终止序列组装在适当噬菌体中。因此，例如，此处提供的结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码核酸可以包含在各种表达载体中的任意一个表达载体中，所述载体构建为重组表达构建体，用于在宿主细胞中表达结合域-免疫球蛋白融合多肽。在某些优选实施方案中，构建体包含在体内给药的制剂中。所述载体和构建体包括染色体的、非染色体的和合成DNA序列，如，SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒，来源于质粒和噬菌体DNA的联合的载体、病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒，以及假狂犬病病毒或复制缺陷逆转录病毒的DNA，如下文所述。然而，任何其它载体可以用于制备重组表达构建体，在优选实施方案中，所述载体是可复制的，并且可在宿主中存活。
例如可以通过各种程序将适当的DNA序列插入载体中。概言之，通过本领域公知的程序将DNA序列插入适当的限制性内切酶位点。用于克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术，用于酶促反应的标准技术，包括DNA连接酶，DNA聚合酶、限制性内切酶等，以及各种分离技术是本领域技术人员公知和通常使用的。许多标准技术描述于，例如Ausubel et al.(1993 Current Protocols in Molecular Biology，GreenePubl.Assoc.Inc. & John Wiley & Sons，Inc.，Boston，MA)；Sambrook etal.(1989 Molecular Cloning，Second Ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Plainview，NY)；Maniatis et al.(1982 Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)；Glover(Ed.)(1985DNA Cloning Vol.I and II，IRL Press，Oxford，UK)；Hames and Higgins(Eds.)，(1985 Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，UK)；及其它。
表达载体中的DNA序列与至少一种适当的表达控制序列(如组成型启动子或受调节的启动子)操作性连接，以指导mRNA合成。这种表达控制序列的代表性例子包括真核细胞启动子或上述真核细胞病毒。可以使用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它具有选择标记的载体从任何需要的基因选择启动子区。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR启动子和小鼠金属硫蛋白-I启动子。适当载体和启动子的选择处于本领域普通技术人员的水平之内，此处描述了某些特别优选的重组表达构建体的制备，其中包含与编码结合域-免疫球蛋白融合多肽的核酸可操作性连接的至少一种启动子或受调节启动子。
由高等真核动物进行的编码本发明的蛋白和多肽的DNA的转录可以通过将增强子序列插入载体而增强。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10-300bp，作用于启动子以增加其转录。增强子的例子包括位于复制起点晚期侧100-270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。
在其它实施方案中，本发明提供了编码任何本发明的构建体，例如本发明的蛋白或多肽构建体，包括结合域融合蛋白的分离的多核苷酸，在本相关实施方案中，本发明提供了包含所述多核苷酸的重组表达构建体，在某些进一步的实施方案中，本发明提供了用所述重组表达构建体转化或转染的宿主细胞，或以其它方式含有所述重组表达构建体的宿主细胞。在另一实施方案中，本发明提供了制备本发明的构建体的方法，所述构建体例如本发明的蛋白或多肽构建体，如结合域融合蛋白，该方法包括以下步骤：(a)在允许表达构建体，例如编码结合域融合蛋白的构建体的条件下培养用本发明的多核苷酸构建体转化或转染、或用其它方式导致含有所述多核苷酸构建体的宿主细胞；和(b)从宿主细胞培养物分离构建体，例如结合域融合蛋白。
本发明的构建体，包括多肽构建体，包括了例如具有结合区的结合域-免疫球蛋白融合多肽和融合蛋白，所述结合区诸如与本领域公知的序列相同或相似的结合域多肽氨基酸序列或其片段或部分。例如用于说明而不是限定性的，抗CD28 scFv-捕获蛋白构建体[SEQ IDNO：____]可考虑用于本发明，作为与报道的多肽和所述多肽的部分具有至少约70％相似性(优选大于70％同一性)，更优选约90％相似性(更优选大于90％同一性)，更优选约95％相似性(更优选大于95％同一性)的多肽，其中所述结合域-免疫球蛋白融合多肽的部分例如一般含有至少约30个氨基酸，更优选约50个氨基酸。胞外域包括例如细胞表面分子的部分，在特别优选的实施方案中，包括作为内部膜蛋白的细胞表面分子或包含跨细胞质膜的跨膜结构域的细胞表面分子，所述跨膜结构域构建为当分子在细胞表面表达时延伸超过细胞质膜磷脂双侧的外小叶，优选以将所述分子的胞外域部分暴露于细胞的外部环境(也称作细胞外环境)的方式。确定细胞表面分子的一部分是否包含胞外域的方法是本领域公知的，并且包括例如实验确定(如分子的直接或间接标记、评估分子是否能够被不能通透细胞质膜的试剂如蛋白水解或脂解酶进行结构改变的分子)或基于分子结构的拓扑学预测(如分析多肽的氨基酸序列)或其它方法。
在其它实施方案中，提供了用所述重组克隆或表达构建体转化或转染、或以其它方式含有所述重组克隆或表达构建体的宿主细胞。所述细胞包括进行离体细胞治疗，例如离体基因治疗的受试者的细胞。
另一方面，本发明涉及含有上述核酸构建体，例如重组结合域-免疫球蛋白融合表达构建体的宿主细胞。用本发明的载体和/或表达构建体对宿主进行基因工程化(转导、转化或转染)所述载体可以是，例如，克隆载体、穿梭载体或表达构建体。该载体或构建体可以是，例如，质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。工程化的宿主细胞可以在经改进的常规营养培养基中培养，该培养基适于激活启动子、选择转化体或扩增特定基因如编码结合域-免疫球蛋白融合多肽或结合域-免疫球蛋白融合蛋白的基因。选择用于表达的特定宿主细胞的培养条件，如温度、pH等对于本领域技术人员是容易理解的。
用于制备或表达本发明的构建体的宿主细胞例如可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。适当宿主细胞的代表性例子包括，但不需要限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO，COS或293细胞；腺病毒；植物细胞，或适于体外繁殖或从头建立的适当细胞。本领域技术人员根据此处的教导应该能够选择适当宿主细胞。
也可以使用多种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子包括由Gluzman，Cell 23：175(1981)描述的猴肾成纤维细胞的COS-7系，以及其它能够表达相容载体的细胞系，如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包含复制起点、适当的启动子和增强子，以及必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、和5’侧翼非转录序列，例如此处所提供的关于结合域-免疫球蛋白融合表达构建体的制备。来源于SV40剪接的DNA序列，以及聚腺苷酸化位点可以用于提供需要的非转录遗传元件。将构建体导入宿主细胞可以通过本领域技术人员熟悉的各种方法而实现，包括但不限于，例如，磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染或电穿孔(Davis et al.，1986 Basic Methods inMolecular Biology)。
在相关实施方案中，提供了制备本发明的多肽或蛋白或其它构建体，例如，包括结合域融合蛋白的方法，包括以下步骤：(a)在允许构建体，例如结合域融合蛋白表达的条件下培养此处描述或提供的宿主细胞；和(b)从宿主细胞或宿主细胞培养物分离构建体，例如，结合域融合蛋白。
结合域融合蛋白的实施方案包括链霉素标志，其可以用于纯化。链霉素标志是由8-9个氨基酸组成的序列，其可逆地结合链霉素，并且包括但不限于AWRHPQFGG，AQRHPQFGG，WSHPQFEK和SWSHPQFEK。
此处描述和要求保护的发明包括例如用作治疗剂和用于包括诊断和研究目的的其它目的的新分子。所述分子具有例如抗原结合或其它结合功能以及一种或多种效应物功能。本发明的DNA构建体可以用于例如基因治疗，包括体内和离体基因治疗。
基因治疗是用遗传物质治疗疾病。它包括替代细胞和/或组织中的缺陷基因或在细胞和/或组织中加入新基因，并且正在开发用于治疗癌症、纠正代谢障碍和免疫治疗领域。本发明的基因治疗包括用具有或不具有分开的载体或送递载体或构建体的本发明的多种构建体治疗此处指出的疾病、病症和/或状况。所述构建体也可以用作治疗或预防此处指出的疾病、病症和/或状况的疫苗。例如，DNA疫苗利用编码免疫原性蛋白的多核苷酸和核酸决定簇刺激抗病原体或肿瘤细胞的免疫系统。所述策略可以刺激获得性或天然免疫，或可以参与通过细胞因子表达进行的免疫功能修饰。体内基因治疗涉及将遗传物质直接注射到人类疾病的患者或动物模型。疫苗和免疫调节是系统性治疗。对于组织特异性体内治疗，如目标在于治疗癌症的那些治疗，优选采用定位基因送递和/或表达/靶定系统。设计了多种多样的基因治疗载体来靶定特定组织，并且开发了多种程序来物理靶定特定组织，例如，采用基于导管的技术，在此考虑所有这些技术。此处也考虑基因治疗的离体方法，包括患者自身细胞的取出、基因修饰、扩增和重新给予。其实例包括用于治疗癌症的骨髓移植或淋巴祖细胞的基因修饰。离体基因治疗优选适用于容易获取并且在基因转移过程中能够在培养物中存活的细胞(如血液和皮肤细胞)。
有用的基因治疗载体包括腺病毒载体、慢病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSv)载体和逆转录病毒载体。也可以用“裸DNA”、基于脂质体的送递、基于脂质的送递(包括连接于带正电的脂质的DNA)和电穿孔来进行基因治疗。
此处在某些实施方案，包括基因治疗实施方案中提供的载体可以是病毒载体如逆转录病毒载体。Miller et al.，1989 BioTechniques 7：980；Coffin and Varmus，1996 Retroviruses，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY。例如，可以得到逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括，但不限于莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。
逆转录病毒是一种通过DNA中间体能复制并整合到宿主细胞基因组中的RNA病毒。该DNA中间体，或前病毒，可以稳定整合到宿主细胞DNA。根据本发明的某些实施方案，表达构建体可以包含掺入了编码外源蛋白的外源基因而替代正常逆转录病毒RNA的逆转录病毒。当逆转录病毒RNA伴随感染进入宿主细胞时，外源基因也引入细胞中，然后可以作为逆转录病毒基因组的一部分而整合到宿主细胞DNA中。该外源基因的在宿主中的表达导致外源蛋白的表达。
开发用于基因治疗的大多数逆转录病毒系统都是基于鼠逆转录病毒。所述逆转录病毒以两种形式存在，即作为称作毒粒的游离病毒颗粒，或作为整合到宿主细胞DNA中的前病毒。毒粒形式的病毒含有逆转录病毒的结构蛋白和酶蛋白(包括逆转录酶)、病毒基因组的两个RNA拷贝、以及含有病毒包膜糖蛋白的来源细胞质膜的部分。逆转录病毒基因组组织为四个主要区域：含有转录起始和终止所必须的顺式作用元件并且位于编码基因的5’和3’的长末端重复(LTR)，以及三个编码基因gag，pol和env。这三个基因gag，pol和env分别编码内部病毒结构、酶蛋白(如整合酶)以及赋予病毒感染性和宿主范围特异性的被膜糖蛋白(称为gp70和pl5e)，以及未确定功能的“R”肽。
已经开发了单独的包装细胞系和载体产生细胞系，这是出于逆转录病毒使用的安全性考虑，包括它们在本发明提供的构建体表达中使用的安全性。简言之，该方法使用了两种成分，即逆转录病毒载体和包装细胞系(PCL)。逆转录病毒载体含有长末端重复(LTRs)、待转移的外源DNA和包装序列(y)。该逆转录病毒载体自身不会复制，因为编码结构蛋白和包膜蛋白的基因没有包含在载体基因组中。PCL含有编码gag，pol和env蛋白的基因，但不含包装信号″y″。这样，PCL自身只能形成空的毒粒。在此普通方法中，将逆转录病毒载体导入PCL中，从而建立载体产生细胞系(VCL)。该VCL制造仅含有逆转录病毒(外源)基因组的毒粒，因此被认为是用于质粒用途的安全的逆转录病毒载体。
“逆转录病毒载体”是指在本发明优选实施方案中能够指导目的序列或基因，如结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码核酸序列的表达的组装体。简言之，逆转录病毒构建体可以包含5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二条链DNA合成的起点和3′LTR。可以将多种异源序列包含在载体构建体中，包括例如，编码蛋白(如细胞毒性蛋白、疾病相关抗原、免疫辅助分子或替代基因)的序列，或自身作为分子的序列(如作为核酶或反义序列)。
可以容易从多种逆转录病毒构建本发明的逆转录病毒构建体，包括例如B、C和D型逆转录病毒以及泡沫病毒和慢病毒(见，例如RNATumor Viruses，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，1985)。所述逆转录病毒可以容易从存放处或保藏中心获得，例如从美国典型培养物保藏中心(″ATCC″；Rockville，Maryland)，或者使用常用技术从公知来源分离。根据此处提供的公开内容和标准重组技术，可以使用上述任意逆转录病毒以组装或构建本发明的逆转录病毒载体构建体、包装细胞或生产细胞(如Sambrook et al，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989；Kunkle，PNAS 82：488，1985)。
用于病毒载体中的适当启动子可以包括，但不限于描述于Miller，et al.，1989 Biotechniques 7：980-990中的逆转录病毒LTR；SV40启动子和人巨细胞病毒(CMV)启动子，或任意其它启动子(如细胞启动子，如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、pol III和β肌动蛋白启动子)。其它可以使用的病毒启动子包括，但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。根据此处包含的教导和上文描述的受调节启动子或启动子，本领域技术人员可以明白适当启动子的选择。
如此处所描述，使用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产细胞系。可以转染的包装细胞系包括，但不限于Miller，HumanGene Therapy，1：5-14(1990)中描述的PE501，PA317，ψ-II-2，ψ-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，ψCRE，ψCRIP，GP+E-86，GP+envAm12和DAN细胞系。载体可以通过本领域的任何方法转导包装细胞系。这些方法包括，但不限于，电穿孔，脂质体的使用和CaPO4沉淀。在另一选择中，逆转录病毒质粒载体可以包被在脂质体中，或偶联于脂质，然后给予宿主。
生产细胞系产生包含编码结合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的核酸序列的感染性逆转录病毒载体颗粒。然后用这些逆转录病毒载体颗粒体外或体内转导真核细胞。被转导的真核细胞将表达编码结合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的核酸序列。可以转导的真核细胞包括，但不限于，胚胎干细胞，以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、循环外周血单核细胞和多形核细胞，包括骨髓单核细胞、淋巴细胞、成肌细胞、组织巨噬细胞、树突细胞、肝巨噬细胞、淋巴结和脾的淋巴和网状内皮细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
作为本发明的用病毒载体制备例如重组结合域-免疫球蛋白融合表达构建体的实施方案的另一个例子，在一个优选实施方案中，用指导结合域免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白表达的重组病毒构建体转导的宿主细胞可以产生病毒颗粒，该病毒颗粒含有被表达的来源于病毒出芽时由病毒颗粒掺入的宿主细胞膜的部分的结合域-免疫球蛋白融合蛋白融合多肽或融合蛋白。
在另一实施方案中，提供了包含例如与生理可接受的载体组合的上文或此处描述的任意本发明的多肽或蛋白或其它构建体(包括例如结合域融合蛋白)的药物组合物。
在另一实施方案中，本发明提供了药物组合物，其中包含例如与生理可接受的载体组合，例如与基因送递运载体或载体组合或包含在其中的例如分离、纯化的、或纯的多核苷酸，其编码本发明的任意多肽或蛋白构建体。
可以将本发明的构建体，例如，结合域-免疫球蛋白融合蛋白，或包含此处描述的一种或多种编码所述构建体的多核苷酸的组合物(例如，用于在足以允许结合域融合蛋白在宿主细胞中体内或体外表达的条件和时间中给药，用于基因治疗，等)制剂化为药物组合物，用于根据公知方法给药。药物组合物一般包含一种或多种重组表达构建体，和/或所述构建体的表达产物，并组合了可药用载体、赋形剂或稀释剂。所述载体在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。对于基于核酸的制剂，或包含本发明的重组构建体的表达产物的制剂，将给予约0.01μg/kg-约100mg/kg体重，例如一般通过真皮内、皮下、肌内或静脉途径或其它途径。优选的剂量例如为约1μg/kg-约1mg/kg，约5μg/kg-约200μg/kg是特别优选的。本领域技术人员将明白，给药的次数和频率将取决于宿主的反应。用于治疗用途的“可药用载体”是制药领域公知的，描述于，例如Remingtons Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)。例如，可以使用生理pH的无菌盐水和磷酸缓冲盐水。可以通过药物组合物形式提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。例如，可以添加苯甲酸钠、山梨酸和β-羟基苯甲酸的酯作为防腐剂。Id.1449。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。Id。
“可药用盐”是指本发明的化合物的盐，它来自于所述化合物和有机或无机酸(酸加成盐)或有机或无机碱(碱加成盐)的组合。本发明的化合物可以以游离碱或盐形式使用，两种形式都考虑处于本发明的范围内。
含有一种或多种本发明的核酸构建体，例如编码结合域-免疫球蛋白融合蛋白的构建体(或它们的表达产物)的药物组合物可以是允许将该组合物给予患者的任何形式。例如，该组合物可以是固体、液体或气体(气溶胶)形式。典型的给药途径包括，但不限于口服、局部、肠胃外(如舌下或颊)、舌下、直肠、阴道和鼻内给药。此处使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内、海绵体内、鞘内、腔道内、尿道内注射或输注技术。对药物组合物进行制剂化，从而允许其中含有的活性成分在将组合物给予患者时是生物可利用的。将给予患者的组合物是一种或多种剂量单位的形式，例如，片剂可以是单剂量单位，本发明的气溶胶形式的一种或多种化合物的容器可以具有多个剂量单位。
对于口服给药，可以存在赋形剂和/或粘合剂。其例子包括蔗糖、高岭土、甘油、淀粉糊精、藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素。可以存在着色剂和/或调味剂。可以使用包衣。
组合物可以是液体，如酏剂、糖浆、溶液、乳状液或悬浮液形式。该液体可以用于作为两个例子的口服给药或通过注射递送。当用于口服给药时，除一种或多种结合域-免疫球蛋白融合构建体或表达产物外，优选的组合物还含有一种或多种增甜剂、防腐剂、染料/着色剂和味道增强剂。在用于注射给药的组合物中，可以含有一种或多种表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂。
不论是溶液、悬浮液或其它形式，此处用到的液体药物组合物可以包含一种或多种以下佐剂：无菌稀释剂如用于注射的水、盐溶液，优选生理盐水、林格氏液、等渗氯化钠，固定的油，如可以作为溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂如苯甲醇或甲基对羟基苯甲酸酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗透压的试剂如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以包含于玻璃或塑料制备的安瓿、一次性注射器或多剂量管形瓶中。生理盐水是优选的佐剂。可注射的药物组合物优选是无菌的。
制剂中也可能需要包含其它成分，如递送载体，包括但不限于铝盐、油包水乳状液、生物可降解油载体、水包油乳状液、生物可降解微胶囊和脂质体。用于所述载体中的免疫刺激物质(佐剂)包括N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺(MDP)、脂多糖(LPS)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ干扰素和IL-15。
尽管在本发明的药物组合物中可以使用任何适当的本领域技术人员公知的载体，载体的类型将根据给药方式和是否需要持续释放而不同。对于肠胃外给药，如皮下注射，载体优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服给药，可以使用任何上述载体或固体载体如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。也可以将生物可降解微球体(如polylacticgalactide)用作本发明的药物组合物的载体。适当的生物可降解微球体公开于，例如美国专利4,897,268和5,075,109。在这一点上，微球体优选大于约25微米。
药物组合物也可以包含稀释剂如缓冲液、抗氧化剂如抗坏血酸、低分子量(小于约10个残基)多肽、蛋白、氨基酸、糖，包括葡萄糖、蔗糖或糊精、螯合剂如EDTA、谷胱甘肽及其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是极为适合的稀释剂。优选地，用作为稀释剂的适当赋性溶液(如蔗糖)将该产物制剂化为冻干物。
如上文所述，本发明包括能够递送编码结合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸分子的组合物。所述组合物包括重组病毒载体(如逆转录病毒(见WO 90/07936，WO 91/02805，WO 93/25234，WO 93/25698和WO 94/03622)，腺病毒(见Berkner 1988 Biotechniques 6：616-627；Liet al.，1993 Hum.Gene Ther.4：403-409；Vincent et al.，Nat.Genet.5：130-134；和Kolls et al.，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219)，痘病毒(见美国专利4,769,330；美国专利5,017,487和WO 89/01973))，复合于聚阳离子分子的重组表达构建体核酸分子(见WO 93/03709)，和脂质体相关的核酸(见Wang et al.，1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851)。在某些实施方案中，DNA可以连接于杀死的或灭活的腺病毒(见Curiel et al.，1992 Hum.Gene Ther.3：147-154，1992；Cotton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6094)。其它适当的组合物包括DNA-配体(见Wu et al.，1989 J.Biol.Chem.264：16985-16987)和脂质-DNA组合(见Felgner et al.，1989 Proc.Natl.Acad Sci.USA 84：7413-7417)。
除了定位于体内程序，也可以使用体外程序，其中从宿主取出细胞，进行修饰，然后置于相同或另一宿主动物。明显的是，可以使用上述任意一种组合物，将本发明的构建体，如结合域-免疫球蛋白融合蛋白或结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码核酸分子导入离体的组织细胞。病毒、物理和化学摄取方法的程序是本领域公知的。
因此，本发明用于治疗B细胞病症或恶性状况的患者，或用于治疗来源于所述患者的细胞培养物。此处用到的“患者”是指任何温血动物，优选人。患者可以患有癌症或恶性状况，如B细胞淋巴瘤或可以是正常的(即没有可检测的疾病和感染)。“细胞培养物”包括任何可以进行离体处理的制备物，例如，含有免疫系统的免疫感受态细胞或分离细胞(包括但不限于T细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞和树突细胞)的制备物。所述细胞可以通过本领域公知的多种技术进行分离(如Ficoll-hypaque密度离心)。细胞可以(但不是必须)从B细胞病症或恶性状况的患者中分离，并且可以在治疗后重新引入患者。
用于肠胃外或口服给药的液体组合物应该含有一定量的本发明的构建体，如结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码构建体或表达产物，从而获得适当的剂量。一般地，该量为组合物中含有至少0.01wt％结合域-免疫球蛋白融合构建体或表达产物。当用于口服给药时，该量可以是组合物的0.1-约70wt％。优选口服组合物含有约4-约50wt％的结合域-免疫球蛋白融合构建体或表达产物。优选组合物和制剂制备物一个肠胃外剂量单位含有0.01-1wt％活性化合物。
药物组合物可以用于局部给药，在此情况下载体可以适当包括溶液、乳状液、油膏或凝胶基质。该基质，例如可以包含一种或多种以下成分：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水和醇，以及乳化剂和稳定剂。用于局部给药的药物组合物中可以存在增稠剂。如果用于经皮给药，该组合物可以包含经皮贴剂或离子电渗设备。局部制剂可以含有浓度为约0.1-10％w/v(每单位体积的重量)的本发明的构建体，如结合域-免疫球蛋白融合构建体或表达产物。
组合物可以用于以在直肠中溶解并释放药物的栓剂形式进行直肠给药。用于直肠给药的组合物可以含有油性基质，如适当的非刺激性赋形剂。所述基质包括，但不限于羊毛脂、可可油和聚乙二醇。
在本发明的方法中，可以通过插入物、珠、时间控制释放制剂、贴剂或快速释放制剂的形式给予本发明的构建体，如结合域-免疫球蛋白融合蛋白编码构建体或表达产物。
可以将本发明的构建体，例如，本发明的抗原-结合构建体给予动物或患者，或与其他化合物组合，同时地或大约同时地共同给药动物或患者。在一个方面，将一种或多种构建体，包括例如一种或多种抗原-结合构建体，与一种或多种化疗化合物，例如烷化剂、核苷类似物等组合给予给动物或患者。给予或共同给药一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体和一种或多种化疗剂，可以用于治疗动物或患者的肿瘤或癌症。示例性的癌症包括，但不限于，头和颈癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌(非-小细胞)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌；绒毛膜癌(肺癌)；毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(乳腺&膀胱)、急性髓细胞白血病、脑膜白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病。更常见地，治疗的癌症包括非何杰金淋巴瘤(骨源性肉瘤、成年人软组织肉瘤)、T-细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、缓慢生长的非-何杰金淋巴瘤、何杰金淋巴瘤和卵巢癌。
可以与一种或多种构建体，包括一种或多种本发明的抗原-结合构建体共同给药的烷化剂的实例包括氮芥、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、百消安、亚硝脲氮芥、环己亚硝脲、甲基苄肼、dacardazine、顺氯氨铂、卡波铂、丝裂霉素C、环磷酰胺、isosfamide、六甲蜜胺、噻替哌和氮烯唑胺，和其类似物。参见，例如描述苯丁酸氮芥的合成的美国专利号3,046,301，描述异环磷酰胺的合成的美国专利号3,732,340，描述环磷酰胺的合成的美国专利号3,018,302，描述苯丙氨酸氮芥的合成的美国专利号3,032,584，和Braunwald等，″Harrison′sPrinciples of Internal Medicine，″第15版，McGraw-Hill，New York，NY，第536-544页(2001)关于环磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺、甲基苄肼、六甲蜜胺、顺氯氨铂和卡波铂的临床方面。核苷类似物的实例，包括，但不限于，氟达拉滨喷托他丁、氨甲蝶呤、氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、CB3717、氮杂胞苷、阿糖胞苷，5-氟脱氧尿苷、巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、cladribine和其类似物。一个实例是构建体的组合，包括能结合CD20的抗原-结合构建体。该构建体能起化学敏化剂的作用，并能与其他化疗剂一起作用，从而减少实现抗-肿瘤或抗-癌作用所需的化疗剂。例如，描述喷托他丁的合成的美国专利号3,923,785，描述氨甲蝶呤的合成的美国专利号4,080,325，描述氟尿嘧啶的合成的美国专利号2,802,005，和Braunwald等，″Harrison′s Principles of InternalMedicine，″第15版，McGraw-Hill，New York，NY，第536-544页(2001)关于氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤和磷酸氟达拉滨的临床方面。
在另一个方面，可以给予一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体，或与能抑制拓扑异构酶II的化合物或另外能与细胞中的核酸相互作用的化合物共同给药。这样的化合物包括，例如，阿霉素、表柔比星、足叶乙甙、替尼泊甙、米托蒽醌和其类似物。在一个实例中，在治疗中使用该组合以及高-剂量的化疗和自体的干细胞支持(HDC-ASCT)，以减少外周血液祖细胞(PBSC)的肿瘤细胞污染。参见，Geroni等的美国专利6,586,428。
在另一个方面，可以给予一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体，或与治疗药物共同给药。例如，Virulizin(Lorus Therapeutics)，认为它能体外地刺激肿瘤细胞释放肿瘤坏死因子TNF-α，并刺激巨噬细胞的活化。这可以与一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体组合使用，以增加癌细胞的细胞凋亡和治疗各种类型的癌症，包括胰腺癌、恶性黑素瘤、卡波西肉瘤(KS)、肺癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和子宫颈癌。另一个实例是CpG7909(Coley Pharmaceutical Group)，认为它能活化NK细胞和单核细胞，并增强ADCC。该药物可以与癌症或肿瘤特异性的本发明的构建体，包括抗原-结合构建体，例如抗-CD20构建体组合使用，以治疗非-何杰金淋巴瘤和其他癌症。
也可以将一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体与血管发生抑制剂组合使用，以增强抗肿瘤作用。血管发生是新血管的生长。该过程允许肿瘤生长和转移。抑制血管发生，可以辅助预防转移，并阻止肿瘤细胞的传播。血管发生抑制剂包括，但不限于，血管抑素(angiostatin)、内皮抑制素(endostatin)、血小板反应蛋白、血小板因子4、软骨-衍生的抑制剂(CDI)、类视黄醇、白细胞介素-12、金属蛋白酶1、2和3的组织抑制剂(TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3)和能阻断血管发生信号传导级联的蛋白，例如抗-VEGF(血管内皮生长因子)和IFN-α。可以给予血管发生抑制剂，或与肿瘤特异性的本发明的构建体共同给药，所述构建体包括抗原-结合构建体，其能介导例如ADCC和/或补体固定或化疗-缀合的抗原-结合，以抗击各种类型的癌症，例如，实体肿瘤癌例如肺癌和乳腺癌。
在另一个方面，可以给予一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体，或与能缓解疾病的抗风湿性试剂(DMAR试剂)共同给药，用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、克隆氏病、强直性脊柱炎和各种炎性的疾病过程。在这样的治疗中，本发明的构建体(例如，抗原-结合构建体)一般与化合物结合给予，所述化合物例如硫唑嘌呤、环孢菌素、金、羟氯喹、氨甲蝶呤、penicallamine、柳氮磺胺吡啶等。
在另一个方面，可以给予一种或多种本发明的构建体包括一种或多种抗原-结合构建体，或与能抵消白细胞介素-1的生物学作用的试剂或化合物共同给药，包括例如白细胞介素-1抑制剂和白细胞介素-1受体拮抗剂。认为白细胞介素-1在类风湿性关节炎(RA)、炎症和关节的破坏的产生中起作用。IL-1抑制剂也可以与本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)组合使用，以治疗关节炎、炎性肠病、脓毒病和脓毒性休克、局部缺血性损伤、再灌注、局部缺血性脑损伤例如大脑性麻痹和多发性硬化。参见，Thompson等的美国专利号6,159,460。在另一个方面，例如，可以给动物或患者给予一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体)，或与一种或多种糖皮质激素结合共同给药，后者例如，methylprednisilone、地塞米松、氢化可的松等。糖皮质激素已经用于诱导细胞凋亡和抑制生长，其独立于ADCC和CDC。这些化合物可以与本发明的能诱导癌细胞的细胞凋亡的构建体(包括抗原-结合构建体)组合。在一个实例中，是抗-CD20和抗-CD40抗原-结合构建体，其可以用于诱导B-细胞的细胞凋亡，与糖皮质激素结合，以治疗B-细胞非何杰金淋巴瘤(NHL)。
在另一个方面，  可以给予一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体，或与p38抑制剂或拮抗剂共同给药。p38促分裂原-激活的蛋白激酶途径能参与许多有助于发展类风湿性关节炎的细胞过程。例如，白细胞的激活和浸润以及炎性细胞因子的生产是p38-依赖性的过程。
在另一个方面，  可以给予一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体，或与能促进B-细胞的分化和增殖的化合物共同给药。除了其他的生物活性以外，已经证实细胞因子例如白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-6(IL-6)能刺激激活的B淋巴细胞的抗体合成和分泌。在本发明的一个具体方面，将构建体(包括能识别和结合CD20的抗原-结合构建体)与白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-6(IL-6)中的一种或多种共同给药。
在另一个方面，可以给予一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体，或与白细胞介素-2(IL-2)共同给药。白细胞介素2(IL-2)是能增加效应细胞的生产的淋巴因子，例如CD4+T-辅助细胞、CD8细胞毒性细胞、能生产抗体的B细胞、自然杀伤细胞(NK)和单核细胞/巨噬细胞。IL-2能辅助生产T-细胞，后者又分泌更多的IL-2(“自分泌环”)。IL-2可以用于增强依赖抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)和与本发明的构建体有关的免疫治疗。在一个实例中，本发明的抗-CD20构建体和IL-2用于治疗患有复发的或难治疗的滤泡性非何杰金淋巴瘤的患者。在另一个实例中，给予IL-2，或与HIV免疫治疗共同给药，以辅助T细胞恢复。
在另一个方面，可以给予一种或多种本发明的构建体包括一种或多种抗原-结合构建体，或与白细胞介素-12(IL-12)共同给药。已知IL-12能增强细胞溶解的T-细胞反应，促进辅助T细胞的发育，增强自然杀伤(NK)细胞的活性，和诱导T和NK细胞中的IFN-γ的分泌。IL-12也能增加许多能介导细胞凋亡的辅助和效应细胞。在本发明的另一个方面，给予一种或多种构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体，或与IL-12共同给药，以治疗患有肿瘤或癌症的动物或患者。例如，将能结合CD20的本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)与IL-2组合，以用于治疗患有B-细胞非何杰金淋巴瘤(NHL)的患者。
也可以将一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体与免疫调制剂组合，以加强本发明的抗原-结合构建体的功效。免疫调制剂包括，但不限于，集落刺激因子(CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素(IFN)。
CSF可以包括粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)和巨噬细胞CSF(M-CSF)。认为GM-CSF能调节嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞的发育。已经显示G-CSF能诱导嗜中性粒细胞生产和M-CSF生产。已经显示M-CSF能刺激巨噬细胞和单核细胞。已经长期地建立了CSF在治疗癌症患者的嗜中性粒细胞减少症中的应用。在一个实例中，可以将本发明的构建体，包括抗原-结合构建体与GM-CSF、G-CSF或其组合相组合，以促进骨髓移植和化疗后的患者的嗜中性粒细胞减少症恢复。嗜中性粒细胞在抗击微生物(例如细菌、真菌和寄生物)中起主要作用。嗜中性粒细胞减少症的患者对细菌和广泛传播的真菌感染特别易感。在另一个实例中，可以将本发明的构建体，包括抗原-结合构建体与GM-CSF-治疗的嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞相组合，以增强抗细菌、真菌等(包括可怕的卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii))的活性。
IFN的一个实例是干扰素α(IFN-α)。当身体对癌症或病毒感染起反应时，一些类型的白细胞会自然地产生IFN-α，作为免疫反应的一部分。它有2种主要攻击模式，即干扰癌细胞的生长和增殖，和加强杀伤T细胞和能攻击癌细胞的其他细胞的生产。也认为干扰素能促进癌细胞输出化学信号，所述信号使它们成为免疫系统的更好的靶，且在近年来已经用于几种不同类型的癌症，尤其是肾癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤和一些类型的白血病。它也用于治疗病毒感染，例如肝炎。例如，干扰素-α2a能增强ADCC，且可以与一种或多种本发明的构建体，包括抗原-结合构建体相组合，以提高与构建体有关的ADCC活性的效率。在另一个实例中，可以给动物或患者给予一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体，或者与干扰素-γ(IFN-γ)共同给药，已经证实其能增加B细胞和骨髓浆细胞(BMPC)上的抗-CD20抗原的数目。这特别适用于治疗患有多发性骨髓瘤的患者，他们的B细胞和骨髓浆细胞(BMPC)具有减少的CD20表达。因此，构建体，包括本发明的抗原-结合构建体，尤其是能结合CD20的构建体，可以与IFN-γ组合共同给药，用于治疗多发性骨髓瘤患者。
TNF是一类具有抗癌性能的天然化学物质。TNF的一个实例是TNF-α。还已经显示TNF-α与IFN-γ和IL-12具有协同作用。在另一个实例中，可以给予TNF，或与一种或多种本发明的肿瘤特异性的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体共同给药，且其包括本发明的化疗-缀合的抗原-结合构建体，以及IFN-γ、IL-12或其各种组合。还已知TNF是炎症调节分子。TNF-α抗体或拮抗剂可以与本发明的抗-T细胞构建体(包括抗原-结合构建体)组合，以治疗具有类风湿性关节炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、克隆氏病、强直性脊柱炎和各种炎性疾病过程的患者。
在另一个方面，可以给予一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体，或者与另一种本发明的抗体或抗原-结合构建体共同给药。一个实例是构建体，例如，本发明的抗原-结合构建体，其能结合CD20，后者与能结合CD22、CD19或其组合的构建体组合。该组合可以有效地用于治疗无痛和攻击形式的B-细胞淋巴瘤，和急性和慢性形式的淋巴细胞性白血病。参见，Goldberg的美国专利6,306,393。在另一个实例中，将本发明的构建体，包括抗原-结合构建体与其他构建体共同给药，例如能辅助介导细胞凋亡的本发明的抗原-结合构建体。例如，能结合CD28、CD3、CD20或其组合的一种或多种构建体(包括一种或多种本发明的抗原-结合构建体)的组合。抗-CD28和CD3的组合，能提供延长增殖T-细胞的方法。参见，June等的美国专利号6,352,694。这种延长的T-细胞增殖，能增加免疫依赖性的细胞毒性效率，尤其是与抗-CD20有关的那些。
在另一个方面，可以给予本发明的构建体，包括抗原-结合构建体，或与一种或多种T-细胞调节分子共同给药。一个实例是与白细胞介素-12(IL-12)的组合。IL-12细胞因子能刺激细胞-介导的免疫，具有血管抑制(angiostatic)活性，且在许多肿瘤模型中具有显著的抗-肿瘤作用。还已经显示，IL-12能刺激干扰素-γ(IFN-γ)的生产。因此，预期当与IL-12组合共同给药时，用一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体，尤其是能结合CD20的那些)治疗多发性骨髓瘤患者，是更有效的。在另一个实例中，可以给予一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体)，或与能结合CTLA-4的本发明其他蛋白的结合-结构域构建体共同给药，以通过抑制T-细胞激活的下调来增强抗-肿瘤免疫反应。
在另一个方面，可以将一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体与基因治疗相组合。在一个实例中，给予化疗-缀合的本发明的构建体，或与Bcl-2反义寡核苷酸共同给药。Bcl-2与对抗-癌疗法的肿瘤抗性有关，且认为它能阻断化疗-诱导的细胞死亡。在另一个实例中，给予一种或多种本发明的构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体)，或与用于送递“自杀基因”的腺病毒共同给药。腺病毒能直接地将基因插入肿瘤细胞，这能使这些细胞对否则是无效的药物敏感。然后，药物治疗能破坏肿瘤细胞，同时使健康的细胞不受影响。但是，一旦完成了治疗，逃脱了治疗的杂散的癌细胞就可以重新建立和转移。将基因治疗和一种或多种构建体(包括一种或多种抗原-结合构建体)相组合，能辅助杀伤杂散的癌细胞，并使癌症复发最小化。
可以与治标的(非彻底的)手术使用类似的组合，以手术地去除肿瘤。在该实例中，可以在手术取出肿瘤之前和之后，给予一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体，以通过杀伤在手术过程中没有取出的所有癌细胞，来增加免疫反应和减少复发的可能性。
另一个方面是组合癌或抗原疫苗和T-细胞调节分子。例如，构建体的结合部分，例如，抗原-结合部分可以是对癌细胞或抗原、或来自癌细胞或抗原的蛋白片段特异性的。这可以辅助介导针对特定肿瘤或抗原的免疫反应。这样的构建体可以与T-细胞调节剂相组合，以提高免疫反应的效率。
在另一个实例中，可以给予一种或多种本发明的构建体，包括一种或多种抗原-结合构建体，或与类视黄醇共同给药。类视黄醇包括维生素A和它的衍生物，其具有终止细胞分裂并使它们分化的能力。将维生素A与本发明的抗-癌构建体(包括抗原-结合构建体)组合，以抗击各种形式的癌症。
如本文所使用的，术语“结合构建体”和“抗原-结合构建体”可以指，例如，工程化的多肽、重组多肽、合成的、半合成的或能结合靶(例如，抗原)的其他融合蛋白。本发明的抗原-结合构建体可以用于各种用途，包括抗体或有关的免疫球蛋白-类构建体可以应用的多种用途中的那些。可以在体内和体外实验中，使用本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)，以用于治疗、诊断、研究和其他目的。这样的应用包括，例如，下述的。
构建体(包括本发明的抗原-结合构建体)可以用于免疫组织化学用途。例如，它们可以用于特定抗原或抗原组在组织中的免疫定位。可以固定组织，并与目标抗原-结合构建体一起温育。然后，使用偶联到标记(例如，金颗粒或能产生化学反应的酶，如辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶)上的第二抗体或本发明的结合构建体，可以定位这些构建体。经常制备第二抗体或结合构建体，它对例如第一结合构建体的部分是反应性的。因而，例如，如果第一结合构建体具有人尾区部分，则第二抗体或结合构建体可以是，例如，已经被连接到β-半乳糖苷酶上的兔抗小鼠抗体或抗原-结合构建体。或者，可以纯化本发明的抗体或结合构建体，然后缀合到另一个分子上，以生产荧光抗体或结合构建体。
也可以使用本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)，使用例如免疫电子显微镜术，来检测细胞表面上的一种或多种抗原的定位，或检测细胞内的材料的定位。电子致密材料(例如铁蛋白或胶体金)可以缀合到抗原-结合构建体上。可以使用扫描电子显微镜术来检测抗原/结合构建体复合物的定位。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以用于定量一种或多种抗原的存在，其中使用许多免疫测定方式中的一种，例如，放射免疫测定(RIA)方式或酶联免疫吸附测定(ELISA)方式。这些方案存在许多变体，但是它们是基于类似的观点。例如，如果抗原可以结合固体支持体或表面，或在溶液中，则可以通过它与本发明的特异性的抗原-结合构建体的反应来检测。然后，可以利用它与例如本发明的第二抗体或第二种抗原-结合构建体的反应，通过将标记直接地整合进第一抗体，来检测或定量构建体的存在或量。或者，例如，本发明的抗原-结合多肽可以结合到固体表面上，并添加抗原。可以加入并检测能识别抗原上的不同表位的本发明的第二抗体或抗原-结合多肽。该技术通常称作“夹心测定法”，它常用于避免高背景或非-特异性的反应的问题，除了别的以外。
因为本发明的结合构建体可以具有对特定的一个或多个表位的高亲和力和/或选择性，所以它们也可以用作亲和试剂，例如，在蛋白或抗原纯化中。在这样的方法的一个实例中，将本发明的抗原-结合构建体固定化到合适的支持物上，例如，Sephadex树脂或滤纸。将固定化的构建体暴露于含有或怀疑含有靶蛋白或抗原的样品中。用能去除不希望的材料的合适的缓冲液，冲洗支持物。用能释放结合的蛋白或抗原的另一种缓冲液洗涤支持物。
因为本发明的具体的结合构建体可以高亲和力和选择性地结合蛋白或其他抗原，所以它们也可以用作特定酶或其他大分子在特定反应中的重要性的标准。如果本发明的抗原-结合构建体可以妨碍溶液中的反应，则这能表明该构建体可以特异性地结合蛋白或其他的参与该反应的抗原性的材料。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以用作受体阻断剂或抑制剂或拮抗剂。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以用于鉴别和研究蛋白的功能。如果本发明的抗原-结合构建体可以与特定蛋白反应，例如，该蛋白可以随后从例如溶液中沉淀出来。一般地，使用能将第一复合物连接到一起的本发明的第二抗体或抗原-结合构建体，进行沉淀。或者，通过使溶液与A蛋白，或者例如，取决于构建体，与抗-Fc抗体(例如，其已经附着到例如珠子上)反应，从而使其可以容易地从溶液中去除，可以去除复合物。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以与凝胶-移位实验结合使用，以鉴别特定的核酸-结合蛋白，例如DNA-结合蛋白。例如，通过它们以高亲和力结合特定寡核苷酸的能力，可以测定DNA-结合蛋白。与蛋白结合的寡核苷酸的迁移率明显不同于游离寡核苷酸的迁移率，并产生凝胶迁移模式和信号，这通常称作凝胶移位。向结合测定中添加构建体，可以具有2种作用中的任一种。如果构建体能结合不参与DNA结合的蛋白区域，则可以产生具有更慢的迁移率的复合物，并检测为更大的迁移率移位(超移位(supershift))。或者，如果构建体能结合参与识别DNA的蛋白区域，那么它可以破坏结合和消除移位。在任一种情况下，来自这些实验的数据可以用作鉴别例如DNA-结合蛋白的标准。
也可能通过例如SDS-PAGE分级分离后的蛋白印迹，使用本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)来检测蛋白。一旦将分级分离的蛋白转移到膜(例如硝酸纤维素片)上，它们就会暴露于本发明的特定抗原-结合构建体，后者能特异性地识别或以理想的选择性程度识别固定化到印迹上的蛋白。这允许鉴别特定的蛋白。如果蛋白的迁移率在实验过程中发生变化，则该方法是特别有用的。例如，磷酸酯或碳水化合物的整合，或蛋白的切割，会导致迁移率的变化，这可以通过蛋白印迹分析直接进行。利用适当的对照，该方法可以用于测量在对实验操作的反应中的蛋白丰度。
SDS凝胶和免疫沉淀的组合也是非常有效的。如果特定的蛋白可以在溶液中免疫沉淀，则可以在SDS凝胶上分离上清液和沉淀的级分，并使用本发明的抗原-结合构建体进行研究。
有时，针对一种蛋白的本发明的结合构建体也能沉淀能与第一种蛋白相互作用的第二种蛋白。然后，通过凝胶染色或通过放射自显影，可以观察第二种蛋白以及第一种。该关系经常是蛋白起复合物的一部分的功能的第一个迹象，且它也可以用于证实2种蛋白的物理相互作用，在其他证据的基础(例如，双杂交筛选或抑制基因突变)上，猜想所述蛋白能相互作用。该方法可以以几种非常有效的方式与蛋白印迹分析相组合。
因而，例如，在例如信号转导和蛋白加工的研究中，本发明的抗原-结合构建体可以与免疫沉淀和蛋白印迹分析相组合。例如，使用能结合蛋白的本发明的不同的抗体或抗原-结合构建体，通过蛋白印迹分析，可以随后研究免疫沉淀的蛋白。其中最有用的是，针对可能存在于蛋白中的特定结构决定簇的那些。因而，针对能经历蛋白水解加工的蛋白区域的本发明的抗体或抗原-结合构建体，可以有用地进行蛋白水解加工。另外，本发明的构建体或能识别磷酸化的肽的本发明的抗原-结合构建体(例如，抗PY(磷酸化的酪氨酸)的混合物，可以在沉淀后用于研究蛋白的磷酸化程度(使用蛋白印迹分析)，反之亦然。通过针对碳水化合物表位的本发明的抗原-结合构建体(或通过凝集素，即，能识别碳水化合物的蛋白)，也可以进行糖基化作用反应。同样地，可以制备一些本发明的抗原-结合构建体，其能特异性地识别磷酸化的表位，例如，其能识别磷酸化后的酪氨酸或丝氨酸残基，但是不能结合(或可检测到地结合)没有磷酸酯的表位。该方法可以用于测定特定蛋白的磷酸化状态。例如，通过能以依赖于丝氨酸133的磷酸化的方式特异性地识别表位的抗体，可以检测CREB(cAMP反应元件结合蛋白)的磷酸化。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以用于筛选表达文库，以分离能表达或存在特定表位、或具有特定亲和力或表达特征的候选多核苷酸。
能结合细胞表面的本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)也可以用作标记，以使用流式细胞计定量能表达该标记的细胞级分。如果使用例如，本发明的不同的抗原结合构建体/荧光染料组合，则可以测定能表达几种抗原的细胞级分。
其功能类似于抗-独特型抗体(即，针对另一种抗体的结合结构域的抗体)的本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)，可以用于许多方法中，其中需要或有用地模仿抗原的结构。这样的应用包括，例如，用作癌症疫苗(包括能整合分子佐剂的本发明的抗原-结合构建体)、作为受体的探针、作为受体激动剂、作为受体拮抗剂、作为受体阻断剂或抑制剂等。
在另一个方面，本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)可以是双特异性的，因而能结合2个不同的表位，后者可以存在于相同的或不同的细胞类型中。
本发明的构建体(包括抗原-结合构建体)的体内应用包括单独的或与一种或多种其他治疗相组合的治疗，用于各种疾病，包括癌症及B-细胞障碍包括自身免疫病。在一些情况下，将本发明的构建体给予给患者。在其他的情况下，通过本领域已知的技术，可以使构建体偶联另一种分子，例如，用于辅助靶成像的荧光分子，或治疗性药物和/或用于辅助杀伤靶的毒素。
例如，可以将标记分子或原子缀合或另外连接到本发明的抗原-结合构建体上，以辅助成像或用作诊断试剂。它们包括，但不限于，酶标记、放射性同位素或放射性的化合物或元素、荧光化合物或金属、化学发光的化合物和生物发光的化合物。因而，本发明的结合构建体或抗原-结合构建体可以缀合药物，其允许特异性的药物靶向和药物达到靶后的高效率。这能促进药物治疗，同时减少全身的毒性和副作用。这允许使用否则在全身给予时不可接受的药物。剂量依赖于药物的效力和载体构建体的效率。体内应用的其他实例包括使用本发明的结合构建体或抗原-结合构建体，其中将毒素化学地连接或缀合到本发明的多肽上，以形成例如可以称作“免疫缀合物”或“免疫毒素”的分子。一般，例如，这样的毒素可以包括一种或多种放射性同位素(例如，碘-131、钇-90、铼-186、铜-67和/或Bishmuth-212)、天然毒素、化疗剂、生物反应调节剂或能辅助破坏或杀伤靶细胞、抑制靶细胞复制、或能有效地破坏靶细胞中的需要的细胞功能的任何其他物质。
免疫毒素的毒素部分可以源自各种来源。毒素通常源自植物或细菌，但是也可以使用例如人源的毒素或合成的毒素。源自细菌或植物的毒素的实例包括，但不限于，相思豆毒蛋白、α-帚曲菌素、白喉毒素、篦麻毒蛋白、皂草素和假单胞菌外毒素。哺乳动物酶的实例包括，但不限于，核糖核酸酶(RNA酶)和脱氧核糖核酸酶。本领域已经描述了许多可以与一种或多种本发明的构建体一起使用的免疫毒素。参见，例如，Frankel等的美国专利号4,753,894；Pastan等的美国专利号6,099,842；Nevelle，等，1982 Immunol Rev.62：75-91；Pastan等，1992Ann Rev Biochem 61：331-354；Chaudary等，1989 Nature 339：394；和Batra等，1991 Mol.Cell.Biol.11：2200。本文所述的修饰的毒素和在各种出版物中描述的那些，也在本发明的范围内。
通常，以能治疗上有效地治疗或预防特定疾病、障碍或状况的浓度，给予本发明的免疫毒素和其他治疗剂，例如用于治疗肿瘤和恶性肿瘤，治疗自身免疫病，变态反应和炎症等。该有效剂量和给予模式取决于待治疗的动物或患者、待治疗的疾病或状况、免疫缀合物或免疫毒素的强度和缀合物的效率。为了实现该目的，可以使用许多本领域已知的可接受的制剂和赋形剂，来配制免疫毒素。一般地，例如，通过静脉内的或腹膜内的注射来给予免疫毒素。实现该给予的方法，是本领域的普通技术人员已知的。在另一方面，本发明包括局部地或经口地给予的组合物，例如气溶胶或乳膏或贴剂，其能穿透粘膜。
在给予给待治疗的患者之前，可以向本发明的免疫缀合物或免疫毒素加入制剂(Formulant)。液体制剂是最常见的，但是其他的制剂也在本发明的范围内。制剂可以包括例如油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲剂、清蛋白、表面活性剂或填充剂。碳水化合物可以包括糖或糖醇例如单、二或多糖，或水-可溶的葡聚糖。糖或葡聚糖可以包括例如果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、α和β环糊精、可溶的淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素或其混合物。“糖醇”可以定义为具有-OH基团的C4-C8烃，且包括，例如，半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和阿拉伯糖醇。可以单独地或组合地使用上面提到的这些糖或糖醇。对用量没有固定的限制，只要糖或糖醇可溶于水制剂中即可。在一个方面，糖或糖醇浓度是0.5w/v％至15w/v％，一般地1.0w/v％至7.0w/v％，更一般地2.0至6.0w/v％。
氨基酸的实例包括左旋(L)形式的camitine、精氨酸和甜菜碱；但是，也可以加入其他的氨基酸。常用的聚合物包括平均分子量为例如2,000至3,000的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或平均分子量为例如3,000至5,000的聚乙二醇(PEG)。可以在组合物中使用缓冲剂，以使冻干之前或重配之后的溶液中的pH变化最小化。可以使用任意的生理缓冲液，但是更常用柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐和谷氨酸盐缓冲液或其混合物。浓度可以是例如约0.01至0.3摩尔。可以使用更高或更低的浓度。
通过共价缀合聚合物，可以化学地修饰本发明的免疫毒素，以增加例如它们的循环半衰期。使它们附着肽的示例性的聚合物和方法，参见Katre等的美国专利号4,766,106；Davis等的4,179,337；Shimizu等的4,495,285；和Hiratani的4,609,546。
另一方面，提供了治疗、预防或抑制与蛋白酶的活性或激活相关的疾病、病症和状况的方法。所述病症和状况包括将通过抗蛋白酶作用获益或改善的那些。另一方面，本发明提供了治疗患有或怀疑患有恶性状况或免疫系统病症(如T细胞病症)的受试者的方法，包括给予患者治疗有效量的此处描述或要求保护的任意药物组合物。
可以通过利用此处提供的治疗剂和组合物的方法治疗或改善的疾病和病症的一些实例包括免疫系统的疾病和病症(如可以通过调节免疫系统功能而改善的那些)；感染(如细菌、病毒、真菌和其它寄生生物导致的感染)；增殖性疾病(如肿瘤和癌症)；呼吸系统疾病、病症和状况，包括ARDS；血管疾病、病症和状况；炎症；以及炎性疾病、病症和状况。
例如，可以通过调节免疫系统功能、通过促进肺细胞增殖、或通过促进肺细胞再生而治疗肺部病症或状况。代表性的肺细胞病症包括治疗哮喘(如通过抑制长期变应原暴露后白细胞流入气道、防止抗原诱导的气管粘膜流速降低、或抑制晚期支气管收缩和高反应性的发展而确定的)、治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、治疗囊性纤维化和治疗肺炎。
可以在本发明的实施方案中治疗许多其它疾病、病症和状况，包括但不限于格雷夫斯病、桥本氏病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、免疫性血小板减少性紫癜、多发性硬化、重症肌无力、硬皮病、牛皮癣、炎性肠病，包括克隆氏病和溃疡性结肠炎，炎性肠病，包括克隆氏病和溃疡性结肠炎是消化系统的自身免疫疾病。
一个实施方案涉及治疗患有癌症或另一种增殖性病症的患者的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL(轻链恒定区)。
另一实施方案涉及治疗患有炎性病症的患者的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL。
另一实施方案涉及治疗患有类风湿关节炎的患者的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL。
另一实施方案涉及治疗患者中的HIV感染的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL。
另一实施方案涉及治疗患者中的肺部病症的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL(轻链恒定区)。
另一实施方案涉及治疗患者中的肺部病症的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL(轻链恒定区)。
另一实施方案涉及治疗患者中的肺部炎症的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL。
另一实施方案涉及治疗患者中的哮喘的方法，包括给予有效抗炎量的i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)此处描述的化合物或组合物，例如包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL(轻链恒定区)。
另一实施方案涉及治疗患者中的哮喘的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL(轻链恒定区)。
另一实施方案涉及治疗患者中的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL(轻链恒定区)。
另一实施方案涉及治疗患者中的囊性纤维化的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL(轻链恒定区)。
另一实施方案涉及治疗患者中的肺炎的方法，包括给予有效抗炎量的i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)此处描述的化合物或组合物，例如包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL。
另一实施方案涉及治疗患者中的血管病症的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL。
另一实施方案涉及治疗患者中的眼部疾病或病症的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL。
另一实施方案涉及治疗患者中的年龄相关的黄斑变性疾病的方法，包括给予有效抗炎量的此处描述的化合物或组合物，例如i)能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽，和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽；或ii)包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子的化合物，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL。
在某些实施方案中，此处提供的方法利用了能够结合CD28的结合域。在某些优选实施方案中，结合域能够抑制T细胞激活或治疗一种或多种选自炎症、增殖性病症(如癌症)或感染(如细菌、真菌、病毒感染)的状况或病症。CD28是免疫球蛋白超基因家族的一个成员，并且是在人T细胞的一个主要亚群的表面上表达为44kD的二聚体的跨膜粘附受体。它是异二聚的I型跨膜糖蛋白，表达为具有27个氨基酸组成的氨基末端信号序列的220个氨基酸组成的前体。成熟蛋白在胞外域含有134个氨基酸，在跨膜区含有27个氨基酸，并且具有41个氨基酸组成的细胞质尾。CD28是异嗜性细胞粘附复合物的一个成员，并且是B细胞限制的B7/BB-1抗原的受体。CD28起信号传导途径的表面成分的作用，调节T细胞淋巴因子产生，并且增加对多种免疫抑制剂的T细胞应答的抗性。CD28在所有成熟CD3+胸腺细胞、浆细胞和大多数外周T淋巴细胞中以高水平表达。对于CD28结构和功能的综述，参见June，C.H.，et al.，lmmunol.Today 15：321，1994；June，C.H.，et al.，Immunol Today11：211，1990；和Linsley，P.S.，and Ledbetter，J.A.，1993 Annu..Rev.Immunol.11：191。已经报道了结合CD28的scFv免疫球蛋白区和蛋白酶抑制剂α1-抗胰蛋白酶的融合蛋白，其不是本发明的结合域融合蛋白。参见Vanhove B.，″Selective blockade of CD28 and not CTLA-4 with asingle-chain Fv-α1-antitrypsin fusion antibody″，2003 Blood 102(2)。
在某些实施方案中，此处提供的治疗方法利用了能够结合VEGF或VEGF前体以调节(如抑制)VEGF活性、表达等的结合域。在某些优选实施方案中，结合域能够抑制T细胞激活，或治疗一种或多种选自增殖性病症的状况或病症，包括涉及心血管形成和血管形成的癌症。
结合域融合蛋白的一种实施方案包括具有可变L链(氨基酸残基1-112)、接头(113-117)和识别CD28(2E12)的可变H链(118-238)、含有用丝氨酸取代三个半胱氨酸残基之一的IgG1铰链区的二聚结构域(249-265)、包含在SLPI中的WAP结构域(266-374)和WSHPQFE链霉素标志(残基375-382)的结合域(SEQ ID NO：1)。据报道，基因序列具有信号肽(核酸碱基7-75)。
结合域融合蛋白的一种实施方案包括含有可变H链(氨基酸残基1-120)、接头(残基121-137)和识别VEGF的可变L链(残基138-243)、含有用丝氨酸取代半胱氨酸残基之一的IgG1铰链区的二聚结构域(残基244-260)、包含在SLPI中的WAP结构域(残基261-360)和WSHPQFEK链霉素标志(残基370-377)的结合域(SEQ ID NO：4)。据报道，基因序列具有信号肽(核酸碱基19-75)。
结合域融合蛋白的一种实施方案包括含有可变L链(氨基酸残基1-106)、接头(107-122)和识别VEGF的可变H链(123-242)、含有用丝氨酸取代三个半胱氨酸残基之一的IgG1铰链区的二聚结构域(243-259)、包含在SLPI中的WAP结构域(260-368)和WSHPQFED链霉素标志(残基369-376)的结合域(SEQ ID NO：5)。据报道，基因序列具有信号肽(核酸碱基21-83)。
结合域融合蛋白的一种实施方案包括含有可变L链(氨基酸残基1-112)、接头(113-127)和识别CD28(2E12)的可变H链(128-248)、含有用丝氨酸取代三个半胱氨酸残基之一的IgG1铰链区的二聚结构域(239-255)、包含在SLPI中的WAP结构域(256-364)和WSHPQFEK链霉素标志(残基365-372)的结合域(SEQ ID NO：2)。据报道，基因序列具有信号肽(核酸碱基7-75)。
结合域融合蛋白的一种实施方案包括含有可变H链(氨基酸残基1-120)、接头(121-127)和识别VEGF的可变L链(128-233)、含有用丝氨酸取代所有三个半胱氨酸残基的IgG1铰链区的二聚结构域(234-250)、包含在SLPI中的WAP结构域(251-359)和WSHPQFED链霉素标志(残基360-367)的结合域(SEQ ID NO：6)。据报道，基因序列具有信号肽(核酸碱基19-75)。
结合域融合蛋白的一种实施方案包括含有可变L链(氨基酸残基1-106)、接头(107-112)和识别VEGF的可变H链(113-232)、含有用丝氨酸取代所有三个半胱氨酸残基的IgG1铰链区的二聚结构域(233-249)、包含在SLPI中的WAP结构域(250-358)和WSHPQFED链霉素标志(残基359-366)的结合域(SEQ ID NO：7)。据报道，基因序列具有信号肽(核酸碱基21-83)。
结合域融合蛋白的一种实施方案包括含有可变L链(氨基酸残基1-112)、接头(残基113-127)和识别CD28(2E12)的可变H链(残基128-248)、含有用丝氨酸取代所有三个半胱氨酸残基的IgG1铰链区的二聚结构域(残基249-265)、包含在SLPI中的WAP结构域(残基266-372)、间隔基(373-388)、CH3结构域(残基389-497)和WSHPQFEK链霉素标志(残基498-505)的结合域(SEQ ID NO：3)。据报道，基因序列具有信号肽(核酸碱基7-75)。
结合域融合蛋白的一种实施方案包括含有可变H链(氨基酸残基1-120)、接头(残基121-137)和识别VEGF的可变L链(残基138-243)、含有用丝氨酸取代所有三个半胱氨酸残基的IgG1铰链区的二聚结构域(残基244-260)、包含在SLPI中的WAP结构域(残基261-367)、间隔基(368-382)、CH3结构域(残基383-494)和WSHPQFEK链霉素标志(残基493-500)的结合域(SEQ ID NO：8)。据报道，基因序列具有信号肽(核酸碱基19-75)。
结合域融合蛋白的一种实施方案包括含有可变L链(氨基酸残基1-106)、接头(残基107-122)和识别VEGF的可变H链(残基123-242)、含有用丝氨酸取代所有三个半胱氨酸残基的IgG1铰链区的二聚结构域(残基243-259)、包含在SLPI中的WAP结构域(残基260-366)、间隔基(367-381)、CH3结构域(残基382-491)和WSHPQFEK链霉素标志(残基492-499)的结合域(SEQ ID NO：9)。据报道，基因序列具有信号肽(核酸碱基21-83)。
本发明范围内包括包含例如掺入以下示例的蛋白酶抑制结构域的蛋白抑制结构域的结合域融合蛋白。
P03973a  残基  31-76：
KAGVCPPKKSAQCLRYKKPECQSDWQCPGKKRCCPDTCGIKCLDPV(SEQ ID NO：10)
P03973b  残基  85-130：
KPGKCPVTYGQCLMLNPPNFCEMDGQCKRDLKCCMGMCGKSCVSPV(SEQ ID NO：11)
P19957  残基  72-117：
KPGSCPIILIRCAMLNPPNRCLKDTDCPGIKKCCEGSCGMACFVPQ(SEQID NO：12)
O95925  残基  29-73：
FPRRCPKIREECEFQERDVCTKDRQCQDNKKCCVFSCGKKCLDLK(SEQID NO：13)
Q9H1F0a  残基  22-79：
GYRDKKRMQKTQLSPEIKVCQQQPKLYLCKHLCESHRDCQANNICCSTYCGNVCMSIL(SEQ ID NO：14)
Q9H1F0b  残基  37-75：
EIKVCQQQPKLYLCKHLCESHRDCQANNICCSTYCGNV(SEQ ID NO：15)
Q8IUB3  残基  22-73：
GYRDKMRMQRIKVCEKRPSIDLCIHHCSYFQKCETNKICCSAFCGNICMSIL(SEQ ID NO：16)
Q9HC57  残基  62-108：
RADRCPPPPTLPPGACQAARCQADSECPRHRRCCYNGCAYACLEAV(SEQ ID NO：17)
＞Q14508a  残基  32-74：
KTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPN(SEQ IDNO：18)
Q14508b  残基  76-124：
SLPNDKEGSCPQVNINFPQLGLCRDQCQVDSQCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNF(SEQ ID NO：19)
Q8IUB2a  残基  29-69：
KEGECPPHKNPCKELCQGDELCPAEQKCCTTGCGRICRDIP(SEQ ID NO：20)
Q8IUB2b  残基  72-114：
RKRDCPRVIRKQSCLKTCITDETCPGVKKCCTLGCNKSCVVPIS(SEQ IDNO：21)
                                      49076.000017
Q8IUB2c  残基  122-162：
FGGECPADPLPCEELCDGDASCPQGHKCCSTGCGRTCLGDI(SEQ ID NO：22)
Q8IUB2d  残基  166-207
DIEGGRGGDCPKVLVGLCIVGCVMDENCQAGEKCCKSGCGRFCVPPV(SEQ ID NO：23)
Q8TCV5a  残基  30-74：
KSGGCPPDDGPCLLSVPDQCVEDSQCPLTRKCCYRACFRQCVPRV(SEQID NO：24)
Q8TCV5b  残基  77-121：
KLGSCPEDQLRCLSPMNHLCHKDSDCSGKKRCCHSACGRDCRDPA(SEQID NO：25)
Q9BQY9  残基  31-69：
KPCPKIKVECEVEEIDQCTKPRDCPENMKCCPFSRGKKC(SEQ ID NO：26)
Q8IUB0a  残基  47-90：
KPGLCPKERLTCTTELPDSCNTDFDCKEYQKCCFFACQKKCMDP(SEQ IDNO：27)
Q8IUB0b  残基  150-193：
CRTACMLIVKDGQCPLFPFTERKECPPSCHSDIDCPQTDKCCESRCGFVCARA(SEQ ID NO：28)
Q8IUB0c  残基  197-239：
KKGFCPRKPLLCTKIDKPKCLQDEECPLVEKCCSHCGLKCMDP(SEQ IDNO：29)
Q8NEX5  残基  24-89：
SFWNKDPFLDMIRETECWVQPPYKYCEKRCTKIMTCVRPNHTCCWTYCGNICLDNEEPLKSMLNP(SEQ ID NO：30)
Q8NEX6  残基  26-87：
EMRKKRYDRKELLLEECWGKPNVKECTNKCSKAFRCKDKNYTCCWTYCGNICWINVETSGDY(SEQ ID NO：31)
Q8WWY7  残基  30-74：
KAGVCPADNVRCFKSDPPQCHTDQDCLGERKCCYLHCGFKCVIPV(SEQID NO：32)
Q8IUB5  残基  23-93：
SPKQRVLKYILEPPPCISAPENCTHLCTMQEDCEKGFQCCSSFCGIVCSSETFQKRNRIKHKGSEVIMPAN(SEQ ID NO：33)
结合域融合蛋白的WAP结构域区包含捕获蛋白的任何结构域或部分。优选的WAP成分是：
(SEQ ID NO：34)
捕获蛋白-1(两个WAP结构域)
MKSSGLFPFLVLLALGTLAPWAVEGSGKSFKAGVCPPKKSAQCLRY
KKPECQSDWQCPGKKRCCPDTCGIKCLDPVDTPNPTRRKPGKCPVTYG
QCLMLNPPNFCEMDGQCKRDLKCCMGMCGKSCVSPVKA
VEGSGKSFKAGVCPPKKSAQCLRY
KKPECQSDWQCPGKKRCCPDTCGIKCLDPVDTPNPTRRKPGKCPVTYG
QCLMLNPPNFCEMDGQCKRDLKCCMGMCGKSCVSPVKA
SEQ ID NO：35
捕获蛋白-1的氨基末端结构域
MKSSGLFPFLVLLALGTLAPWAVEGSGKSFKAGVCPPKKSAQCLRY
KKPECQSDWQCPGKKRCCPDTCGIKCLDPV
MVEGSGKSFKAGVCPPKKSAQCLRYKKPECQSDWQCPGKKRCCPDTCGI
KCLDPV
SEQ ID NO：36
捕获蛋白-1的羧基末端结构域
DTPNPTRRKPGKCPVTYGQCLMLNPPNFCEMDGQCKRDLKCCMGMCGK
SCVSPVKA
SEQ ID NO：37
WAP结构域5
MRTQSLLLLGALLAVGSQLPAVFGRKKGEKSGGCPPDDGPCLLSVPDQC
VEDSQCPLTRKCCYRACFRQCVPRVSVKLGSCPEDQLRCLSPMNHLCHKDS
DCSGKKRCCHSACGRDCRDPARG
SEQ ID NO：38
SWAM1
MWPNSILVLMTLLISSTLVTGGGVKGEEKRVCPPDYVRCIRQDDPQCYSD
NDCGDQEICCFWQCGFKCVLPVKDNSEEQIPQSKVGGVKGEEKRVCPPDYVRCIRQDDP
QCYSDNDCGDQEICCFWQCGFKCVLPVKDNSEEQIPQSKV
SEQ ID NO：39
SWAM2
MKLLGLSLLAVTILLCCNMARPEIKKKNVFSKPGYCPEYRVPCPFVLIPK
CRRDKGCKDALKCCFFYCQMRCVDPWESPEARPEIKKKNVFSKPGYCPEYRVPCPFVLI
PKCRRDKGCKDALKCCFFYCQMRCVDPWESPE
提供以下实施例是为了说明，而不是起限制作用。
实施例1
制备结合域VL-VH区的合成构建体
本实施例描述了制备编码识别作为靶相关分子的CD28的结合域融合蛋白和识别作为靶相关分子的VEGF的结合域融合蛋白的多核苷酸构建体。
在构建体的制备中，可以从与需要的靶特异性反应的mAb克隆H和L链的可变区。克隆可变区的mAb可以是例如来源于鼠或人，并且优选来源于人。如果mAb来源于鼠，则典型地通过将互补决定区(CDRs)放置到人可变区的构架区(FR)中，对可变区进行人源化。肽接头可以放置在可变区之间。示例的接头含有富含甘氨酸和丝氨酸的氨基酸序列，例如(G4S)x接头，其中x是2-5或3-4的整数。可变区可以是任意方向：NH3 +-VL-VH-COO-或NH3 +VH-VL-COO-。
需要的结合域融合蛋白的氨基酸序列可以用与表达宿主细胞匹配的密码子优化翻译回到核酸序列。通过化学合成法合成感兴趣的基因的部分。在全部或部分结构域的末端插入限制位点，以促进将多种结构域取代为多种结构域融合蛋白。
2E12 VL-VH单链Fv(scFv)wt的合成构建。通过用聚合酶重叠延伸长度为约66-69个碱基的一组8个寡核苷酸，分别制备2E12 VL和2E12 VH的DNA片段。将这些寡核苷酸克隆到TA克隆载体(Invitrogen)中。将片段组装到scFV中，其中VL在VH前面，将15个氨基酸组成的接头([G4S]3)或5个氨基酸组成的接头(G4S)用于连接两个片段。通过DNA测序证实构建体的序列。
用涉及均针对scFv的VL和VH结构域的8个寡核苷酸的重叠PCR延伸法，然后通过使用两个短末端引物的基因扩增，构建多核苷酸。16个寡核苷酸的列表示于表1。对于每个VL和VH的构建，将一组8个寡核苷酸与两个短末端寡核苷酸混合，用TAQ聚合酶建立PCR反应，其中采用以下条件：最初94℃下解链1分钟，然后进行30个循环的以下步骤：94 ℃下1分钟，50 ℃下2分钟，和72 ℃下3分钟。
表1.用于构建VL的寡核苷酸
2E12 VLF 1A   aagcttatgg attttcaagt gcagattttc agcttcctgc taatcagtgc ttcagtcata atgtccaga (SEQ ID NO：)
2E12 VLF 1B   tctttggctg tgtctctagg tcagagagcc accatctcct gcagagccag tgaaagtgtt gaatattat (SEQ ID NO：)
2E12 VLF 1C   ccaggacagc cacccaaact cctcatctct gctgctagca acgtagaatc tggggtccct gccaggttt (SEQ ID NO：)
2E12 VLF 1D   aacatccatc ctgtggagga ggatgatatt gcaatgtatt tctgtcagca aagtaggaag gttccatgg (SEQ ID NO：)
2E12 VLR 1A   tagagacaca gccaaagaag ctggagattg ggtgagcaca atgtcgactc ctctggacat tatgactga (SEQ ID NO：)
2E12 VLR 1B   tttgggtggc tgtcctggtt tctgttggta ccactgcatt aaacttgtga cataatattc aacactttc (SEQ ID NO：)
2E12 VLR 1C   ctccacagga tggatgttga ggctgaagtc tgtcccagac ccactgccac taaacctggc agggacccc (SEQ ID NO：)
2e12 VLR 1D   ggatccaccg ccaccccgtt tgatttccag cttggtgcct ccaccgaacg tccatggaac cttcctact (SEQ ID NO：)
用于构建VH的寡核苷酸
2E12 VHF 1A  ggatccggcg gaggtgggtc gggtggcggc ggatctcagg tgcagctgaa ggagtcagga cctggc  (SEQ ID NO：)
2E12 VHF 1B  acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc ggctatggtg taaactgggt tcgccagcct ccagga  (SEQ ID NO：)
2E12 VHF 1C  ggtgatggaa gcacagacta taattcagct ctcaaatcca gactatcgat caccaaggac aactcc  (SEQ ID NO：)
2E12 VHF 1D  ctgcaaactg atgacacagc cagatactac tgtgctcgag atggttatag taactttcat tactatg (SEQ ID NO：)
2E12 VHR 1A  ccctgagacg gtgcatgtga tggacaggct ctgtgagggc gccaccaggc caggtcctga ctcctt  (SEQ ID NO：)
2E12 VHR 1B  gtctgtgctt ccatcacccc atatcattcc cagccactct agaccctttc ctggaggctg gcgaac  (SEQ ID NO：)
2E12 VHR 1C  tgtgtcatca gtttgcagac tgttcatttt taagaaaact tggctcttgg agttgtcctt ggtgat  (SEQ ID NO：)
2e12 VHR 1D  tgatcagaggagacggtgactgaggttccttgaccccagtagtccataacatagtaatgaaagttac (SEQ ID NO：)
基于大小对VL和VH片段进行凝胶分离，连接到TOPO克隆载体(Invitrogen)中，并且测序以证实它们的序列。然后用合适的限制酶消化VL和VH片段，通过连接到pUC19载体中进行组装，以产生VL-VH2E12 wt scFv。然后通过DNA测序证实序列。2E12 scFv wt的DNA和蛋白序列示于表2。然后将scFv片段连接到PD18载体中，该载体携带SSS或SCC铰链区，加上scFv基因3’末端的CH2/CH3结构域，以便在COS细胞中表达为2E12 SMIPs。
表2.2E12 VL-VH的DNA序列：
aagcttatgg attttcaagt gcagattttc agcttcctgc taatcagtgc ttcagtcata    60
atgtccagag gagtcgacat tgtgctcacc caatctccag cttctttggc tgtgtctcta   120
ggtcagagag ccaccatctc ctgcagagcc agtgaaagtg ttgaatatta tgtcacaagt   180
ttaatgcagt ggtaccaaca gaaaccagga cagccaccca aactcctcat ctctgctgct   240
agcaacgtag aatctggggt ccctgccagg tttagtggca gtgggtctgg gacagacttt   300
agcctcaaca tccatcctgt ggaggaggat gatattgcaa tgtatttctg tcagcaaagt   360
aggaaggttc catggacgtt cggtggaggc accaagctgg aaatcaaacg gggtggcggt   420
ggatccggcg gaggtgggtc gggtggcggc ggatctcagg tgcagctgaa ggagtcagga   480
cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg tccatcacat gcaccgtctc agggttctca   540
ttaaccggct atggtgtaaa ctgggttcgc cagcctccag gaaagggtct agagtggctg   600
ggaatgatat ggggtgatgg aagcacagac tataattcag ctctcaaatc cagactatcg   660
atcaccaagg acaactccaa gagccaagtt ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat   720
gacacagcca gatactactg tgctcgagat ggttatagta actttcatta ctatgttatg   780
gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctctg atca                    824
信号肽-7-75
VL：76-411
接头：412-456
VH：457-819
2E12 VL-VH的蛋白序列
2   divltqspas lavslgqrat iscrasesve yyvtslmgwy ggkpggppkl lisaasnves
61  gvparfsgsg sgtdfslnih pveeddiamy fcqqsrkvpw tfgggtklei krggggsggg
121 gsggggsqvq lkesgpglva psqslsitct vsgfsltgyg vnwvrqppgk glewlgmiwg
181 dgstdynsal ksrlsitkdn sksqvflkmn slgtddtary ycardgysnf hyyvmdywgq
241 gtsvtvss
VL：1-112
接头：113-127
VH：128-248
小鼠抗VEGF VL-VH单链Fv(scFv)wt的合成构建。用涉及均针对scFv的VL和VH结构域的8个寡核苷酸的重叠PCR延伸法，然后通过使用两个短末端引物的基因扩增，构建多核苷酸。16个寡核苷酸的列表示于表3。对于每个VL和VH的构建，将一组8个寡核苷酸与两个短末端寡核苷酸混合，用高保真TAQ聚合酶建立PCR反应，其中采用以下条件：最初94℃下解链1分钟，然后进行30个循环的以下步骤：94℃下1分钟，50℃下2分钟，和72℃下3分钟。8个长寡核苷酸的每一个的终浓度是10 uM，而短寡核苷酸是1 uM。图2显示来自8个寡核苷酸的全长基因的制备中涉及的步骤。
基于大小对VL和VH片段进行凝胶分离，连接到TOPO克隆载体(Invitrogen)中，并且测序以证实它们的序列。然后用合适的限制酶消化VL和VH片段，通过连接到pUC19载体中进行组装，以产生VL-VH抗-VEGF wt scFv。然后通过DNA测序证实序列。小鼠抗人VEGF scFvwt的DNA和蛋白序列示于表3。
表3.20个寡核苷酸的序列(16个长，4个短)。F表示正向引物，而R表示反向引物
a-mvegfhvlfr-F1   ATAGTCTAGG TCGACATTGT GCTGACACAG TTTCCTGCTA GCCTTAGCGT ATTTTTGGGG CA
(SEQ ID NO：)
a-mvegfhvlfr-F2
(SEQ ID NO：)     GCCAAAGTGT CAGTACATAT GGCTATAGTT ATATGCACTG GAACCAACAG AAACCAGGAC AG
a-mvegfnvlff-F3   ATCCAATCTA GAATTTGGGG TCCCTGCCAG GTTCAGTGGC AGTGGGTCTG GGACAGACTT CA
(SEQ ID NO：)
a-mvegfvlfr-F4    GAGGATGCTG CAACCTATTA TTGTCAGCAC ATTAGGGAGC TTCCTTACAC GTTCGGAGGG GG
(SEQ ID NO：)
a-mvegfvlfr-R1
(SEQ ID NO：)     ATGTACTGAC ACTTTGGCTG GCCCTGCATG AAATGGTGGC CCTCTGCCCC AAAAATACGC TA
a-mvegfvlfr- R2
(SEQ ID NO：)     CCAAATTCTA GATTGGATAC AAGATAAATG AGGAGTCTGG GTGGCTGTCC TGGTTTCTGT TG
a-mvegfvlfr-R3    ATAGGTTGCA GCATCCTCCT CCTCCACAGG ATGGATGTTG AGGGTGAAGT CTGTCCCAGA CC
(SEQ ID NO：)
a-mvegfvlfr-R4    ACCTCCGCCG GATCCACCGC CACCTTTGAT TTCCAGCTTG GTCCCCCCTC CGAACGTGTA A
(SEQ ID NO：)
a-mvegfVLFrtsht-F ATAGTCTAGG TCGACATTGT GCTG
(SEQ ID NO：)
a-mvegfVLFrtsht-R ACCTCCGCCG GATCCACCGC CAC
(SEQ ID NO：)
a-mvegfhvhbk-F1   GGTGGCGGTG GATCCGGCGG AGGTGGGTCG GGTGGCGGCGG ATCGGAGGTAC
(SEQ ID NO：)     AGCTTCTGGA GTCTGGG
a-mvegfhvhbkr-F2  TTGTCCTGCA CAGCTTCTGG CTTCAACATT AAAGACACCTA TATGCACTGG GTGAAGCAGA
(SEQ ID NO：)     GGCCTGAA
a-mvegfhvhbk-F3   GCGAATGGTA ATACTAAATA TGACCCGAAG TTCCAGGGCA AGGCCACTAT AACAGCAGAC
(SEQ ID NO：)     ACATCCTCC
a-mvegfvhbk-F4    TCTGAGGACA CCGCGGTCTA TTACTGTGCT AGGCCATCTA TTTACTACGG TAGTAACCAC
(SEQ ID NO：)     TGGTACTTC
a-mvegfvhbk-R1    AGAAGCTGTG CAGGACAACT TGACTGAGGC CCCTGGCTTCA CAAGCTCTGC CCCAGACTCC
(SEQ ID NO：)     AGAAGCTG
a-mvegfvhbk-R2    TTTAGTATTA CCATTCGCAG GATCGATCCT TCCGATCCAC TCCAGGCCCT GTTCAGGCCT
(SEQ ID NO：)     CTGCTTCAC
a-mvegfvhbk-R3    GACCGCGGTG TCCTCAGATG TCAGGCTGCT GAGCTGCAGG TAGGCTGTGT TGGAGGATGT
(SEQ ID NO：)     GTCTGCTGT
a-mvegfvhbkr-R4   TGATACTATC AGATCTGAGG AGACGGTGAC TGAGGTTCCT GCGCCCCAGA CATCGAAGTA
(SEQ ID NO：)     CCAGTGGTTA CT
a-mvegfVHbksht-F  GGTGGCGGTG GATCCGGCGG AGGT
(SEQ ID NO：)
a-mvegfVHbksht-R  TGATACTATC AGATCTGAGG AGA
(SEQ ID NO：)
表4.小鼠抗人VEGF VL-VH的核苷酸和蛋白序列。
小鼠抗人VEGF VL-VH的DNA序列：
aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca         60
gtcataattg ccagaggagt cgactctgag ctgactcagg accctgctgt gtctgtggcc        120
ttgggacaga cagtcaggat cacatgccaa ggagacagcc tcagaagcta ttatgcaagc        180
tggtaccagc agaagccagg acaggcccct gtacttgtca tctatggtaa aaacaaccgg        240
ccctcaggga taccagaccg attctctggc tccagctcag gaaacacagc ttccttgacc        300
atcactgggg ctcaggcgga agatgaggct gactattact gtaactcccg ggacagcagt        360
ggtaaccatg tggtattcgg cggagggacc aagctgaccg tcctaggtgg cggtggctcg        420
ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcgggagc tctcaggtgc agctggtgca gtctggggct        480
gagtcgaaga agcctggggc ctcagtgaag gtttcctgca aggcttctgg atacaccttc        540
actagctatg ctatgcattg ggtgcgccag gcccccggac aaaggcttga gtggatggga        600
tggatcaacg ctggcaatgg taacacaaaa tattcacaga agttccaggg cagagtcacc        660
attaccaggg acacatccgc gagcacagcc tacatggagc tgagcagcct gagatccgaa        720
gacacggccg tgtattactg tgcaaggttg acgcggaata agtttaagtc gcgtggtcat        780
tggggccaag gtaccctggt caccgtgtcg agagatctg                               824
信号肽-13-81
VL：82-405
接头：406-450
VH：451-819
小鼠抗人VEGF VL-VH的蛋白序列
DSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGK NNRPSGIPDR         60
FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSR DSSGNHVVFG GGTKLTVLGG GGSGGGGSGG        120
GGSSQVQLVQ SGAESKKPGA SVKVSCKASG YTFTSYAMHW VRQAPGQRLE WMGWINAGNG        180
NTKYSQKFQG RVTITRDTSA STAYMELSSL RSEDTAVYYC ARLTRNKFKS RGHWGQGTLV        240
TVSRDL                                                                   246
VL：1-108
接头：109-123
VH：124-246
人抗-VEGF VL-VH单链Fv(scFv)的合成构建
该方法涉及使用重叠寡核苷酸引物，和采用高保真DNA聚合酶(Invitrogen PCR HIFI mix)的PCR合成免疫球蛋白V区。从V区序列的中间开始，设计了45-70个碱基的引物，使得生长中的链以任意方向延伸了40-50个碱基，并且相邻引物最少重叠20个碱基。每个PCR步骤需要两个引物，一个作为反义链的引物(正向或有义引物)，一个作为有义链的引物(反向或反义引物)，以建立生长中的双链PCR产物，如下文实施例所示。在引物设计过程中，可以在终产物的核苷酸序列中进行改变，以建立限制酶位点、破坏存在的限制酶位点、加入柔性接头、改变、去除或插入改变氨基酸序列的碱基、优化总体DNA序列以增强引物合成，和维持用于表达合成基因的生物的密码子选择规则。
分别合成重链和轻链可变区，在两步过程中(PCR1和2)合成每个V区。在以下实施例中，合成VH，但过程与VL合成相同。按顺序对引物编号，然后是其方向标示(F＝正向，R＝反向)和PCR中每个引物的浓度(μM)。
步骤1-94℃，4m-3个循环的94℃，30s/65℃，30s/70℃，30s-一个72℃，6m延伸
5106F 10μM；5107R 10μM
步骤2-加入以下引物后27个循环
5102F 10uM；5103R 10uM；5104F 10uM；5105R 10uM
步骤3-从PCR1分离PCR产物(通过凝胶纯化)，以1∶20稀释PCR2步骤1-94℃，4m-30个循环的94C，1m/55C，1m/72C，1m-1个72C，6m延伸
1uL稀释的PCR1；5098F 10uM；5099R 10uM；5100F 10uM；5101R
10uM；5108F 10uM；5109R 10uM；5100F 10uM；和5101R 10uM
PCR产物纯化(通过凝胶纯化)除去过量的引物
TA TOPO克隆(Invitrogen PCR 2.1 topo载体)以进行测序
限制性消化并且三向连接到人抗VEGF vL和PD18载体中的css铰链区
表5：用于合成人抗VEGFscFv VH+VL的引物
轻链引物＝#5086-5097
重链引物＝#5098-5109
Seq#序列名称            序列5′→3′
5086F vlavegfvlvh5-1    ACGCGTAAGC TTGCCGCCCC ATGGCCTGGA CCCCTCTCTG GCTCACT
     (SEQ ID NO：)
5087R vlavegfvlvh3-1    AGAGCTCCCG CCGCCACCCG ACCCACCACC GCCCGAGCCA CCGCCA
     (SEQ ID NO：)
                        GGACCCCTCT CTGGCTCACT CTCCTCACTC TTTGCATAGG TTCCGTGGTT TCTTCTGAGC
5088F vlavegfvlvh5-2    TGACTCAGGA C
     (SEQ ID NO：)
                        CACCGCCCGA GCCACCGCCA CCTAGGACGG TCAGCTTGGT CCCTCCGCCG AATACCACAT
5089R vlavegfvlvh3-2    GGTTACCACT
     (SEQ ID NO：)
5090Fvlavegfvlvh5-3     TCTTCTGAGC TGACTCAGGA CCCTGCTGTG TCTGTGGCCT TGGGACAGAC AGTCAGGATC ACATG
     (SEQ ID NO：)
5091R vlavegfvlvh3-3    AATACCACAT GGTTACCACT GCTGTCCCGG GAGTTACAGT AATAGTCAGC CTCATCTTCC GCCTG
     (SEQ ID NO：)
5092F vlavegfvlvh5-4    CAGACAGTCA GGATCACATG CCAAGGAGAC AGCCTCAGAA GCTATTATGC AAGCTGGTAC CAGCAG
     (SEQ ID NO：)
5093R vlavegfvlvh3-4    TCAGCCTCAT CTTCCGCCTG AGCCCCAGTG ATGGTCAAGG AAGCTGTGTT TCCTGAGCTG GAGCC
     (SEQ ID NO：)
5094F vlavegfvlvh5-5    TATGCAAGCT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA CAGGCCCCTG TACTTGTCAT CTATGGTAAA AACAACCG
     (SEQ ID NO：)
5095R vlavagfvlvh3-5    GTGTTTCCTG AGCTGGAGCC AGAGAATCGG TCTGGTATCC CTGAGGGCCG GTTGTTTTTA CCATAGAT
     (SEQ ID NO：)
5096F vlavegfvhvl5-1a   GGGAGCTCTT CTGAGCTGAC TCAGGACCCT
     (SEQ ID NO：)
5097R vlavegfvhvl3-1a   CAGATCTAGG ACGGTCAGCT TGGTCCCTCC GCCGAATACC ACATGGTTAC CA
     (SEQ ID NO：)
5098F vhavegfvhvl5-1    ACGCGTAAGC TTGCCGCCAT GGACTGGACC TGGAGAATCC TCTTCTTGGT GGCAGCAGCC ACAGG
     (SEQ ID NO：)
5099R vhavegfvhvl3-1    AGAGCTCCCG CCGCCACCCG ACCCACCACC GCCCGAGCCA CCG
     (SEQ ID NO：)
                        TGGTGGCAGC AGCCACAGGA GCCCACTCCC AGGTGCAGCT GGTGCAGTCT GGGGCTGAGT
5100F vhavegfvhvl5-2    CGAAGAAGCC
     (SEQ ID NO：)
5101R vhavegfvhvl3-2    CACCACCGCC CGAGCCACCG CCACCTCTCG ACACGGTGAC CAGGGTAC
     (SEQ ID NO：)
5102F vhavegfvhvl5-3    GGCTGAGTCG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTTTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC CTTCACTA
     (SEQ ID NO：)
5103R vhavegfvhvl3-3    CTTGGCCCCA ATGACCACGC GACTTAAACT TATTCCGCGT CAACCTTGCA CAGTAATACA CGGCCGTGTC
     (SEQ ID NO：)
5104F vhavegfvhvl5-4    TTCTGGATAC ACCTTCACTA GCTATGCTAT GCATTGGGTG CGCCAGGCCC CCGGACAAAG GCTTGAGTGG
     (SEQ ID NO：)
5105R vhavegfvhvl3-4    ACAGTAATAC ACGGCCGTGT CTTCGGATCT CAGGCTGCTC AGCTCCATGT AGGCTGTGCT CGCGGATGTG
     (SEQ ID NO：)
5106F vhavegfvhvl5-5    CCGGACAAAG GCTTGAGTGG ATGGGATGGA TCAACGCTGG CAATGGTAAC ACAAAATATT CACAGAAG
     (SEQ ID NO：)
5107R vhavegfvhvl3-5    GGCTGTGCTC GCGGATGTGT CCCTGGTAAT GGTGACTCTG CCCTGGAACT TCTGTGAATA TTTTGTGT
     (SEQ ID NO：)
                        GGGAGCTCTC AGGTGCAGCT GGTGCAGTCT GGGGCTGAGT CGAAGAAGCC
5108F vhavegfvlvh5-1a
     (SEQ ID NO：)
5109R vhavegfvlvh3-1a   CAGATCTCTC GACACGGTGA CCAGGGTACC TTGGCCCCAA TGACCACGC
连接后的最终的人抗VEGF(VL+VH方向)核苷酸和氨基酸序列(SEQID NO：)
                           M  A  W  T   P  L  W   L  T  L
  1 ACGCGTAAGC TTGCCGCCCC ATGGCCTGGA CCCCTCTCTG GCTCACTCTC
     L  T  L  C   I  G  S   V  V  S   S  E  L  T   Q  D  P
 51 CTCACTCTTT GCATAGGTTC CGTGGTTTCT TCTGAGCTGA CTCAGGACCC
     A  V  S   V  A  L  G   Q  T  V   R  I  T   C  Q  G  D
101 TGCTGTGTCT GTGGCCTTGG GACAGACAGT CAGGATCACA TGCCAAGGAG
       S  L  R   S  Y  Y   A  S  W  Y   Q  Q  K   P  G  Q
151 ACAGCCTCAG AAGCTATTAT GCAAGCTGGT ACCAGCAGAA GCCAGGACAG
     A  P  V  L   V  I  Y   G  K  N   N  R  P  S   G  I  P
201 GCCCCTGTAC TTGTCATCTA TGGTAAAAAC AACCGGCCCT CAGGGATACC
      D  R  F   S  G  S  S   S  G  N   T  A  S   L  T  I  T
251 AGACCGATTC TCTGGCTCCA GCTCAGGAAA CACAGCTTCC TTGACCATCA
       G  A  Q   A  E  D   E  A  D   Y  Y  C  N   S  R  D
301 CTGGGGCTCA GGCGGAAGAT GAGGCTGACT ATTACTGTAA CTCCCGGGAC
     S  S  G  N   H  V  V   F  G  G   G  T  K  L   T  V  L
351 AGCAGTGGTA ACCATGTGGT ATTCGGCGGA GGGACCAAGC TGACCGTCCT
      G  G  G   G  S  G  G   G  G  S   G  G  G    G  S  S  Q
401 AGGTGGCGGT GGCTCGGGCG GTGGTGGGTC GGGTGGCGGC GGGAGCTCTC
       V  Q  L   V  Q  S   G  A  E  S   K  K  P   G  A  S
451 AGGTGCAGCT GGTGCAGTCT GGGGCTGAGT CGAAGAAGCC TGGGGCCTCA
     V  K  V  S   C  K  A   S  G  Y   T  F  T  S   Y  A  M
501 GTGAAGGTTT CCTGCAAGGC TTCTGGATAC ACCTTCACTA GCTATGCTAT
      H  W  V   R  Q  A  P   G  Q  R   L  E  W   M  G  W  I
551 GCATTGGGTG CGGCAGGCCC CCGGACAAAG GCTTGAGTGG ATGGGATGGA
       N  A  G   N  G  N   T  K  Y  S   Q  K  F   Q  G  R
601 TCAACGCTGG CAATGGTAAC ACAAAATATT CACAGAAGTT CCAGGGCAGA
     V  T  I  T   R  D  T   S  A  S   T  A  Y  M   E  L  S
651 GTCACCATTA CCAGGGACAC ATCCGCGAGC ACAGCCTACA TGGAGCTGAG
      S  L  R   S  E  D  T   A  V  Y   Y  C  A   R  L  T  R
701 CAGCCTGAGA TCCGAAGACA CGGCCGTGTA TTACTGTGCA AGGTTGACGC
       N  K  F   K  S  R   G  H  W  G   Q  G  T   L  V  T
751 GGAATAAGTT TAAGTCGCGT GGTCATTGGG GCCAAGGTAC CCTGGTCACC
     V  S  R  D   L
801 GTGTCGAGAG ATCTG
最终的人抗VEGF(vL+vH方向)氨基酸序列(SEQ ID NO：)
MAWTPLWLTLLTLCIGSVVSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKP
GQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVF
GGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSSQVQLVQSGAESKKPGASVKVSCKASGYTFTSYA
MHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSED
TAVYYCARLTRNKFKSRGHWGQGTLVTVSRD
连接后的最终的人抗VEGF(vL+vH方向)核苷酸序列(SEQ IDNO：)
  1  ACGCGTAAGCTTGCCGCCATGGACTGGACCTGGAGAATCCTCTTCTTGGT
 51  GGCAGCAGCCACAGGAGCCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGG
101  CTGAGTCGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCT
151  GGATACACCTTCACTAGCTATGCTATGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGG
201  ACAAAGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACGCTGGCAATGGTAACACAA
251  AATATTCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCC
301  GCGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCGAAGACACGGC
351  CGTGTATTACTGTGCAAGGTTGACGCGGAATAAGTTTAAGTCGCGTGGTC
401  ATTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTGTCGAGAGGTGGCGGTGGCTCG    451
     GGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGGAGCTCTTCTGAGCTGACTCAGGA
501  CCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAG
551  GAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGA
601  CAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGAT
651  ACCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCA
701  TCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGG
751  GACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGT
801  CCTAGATCTG
连接后的最终的人抗VEGF(vL+vH方向)氨基序列
MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAESKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWV
RQAPGQRLEWMGWTNAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYY
CARLTRNKFKSRGHWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQT
VRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGA
QAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVLDL
实施例2
2E12-SLPI缀合物的构建和表征
最初通过PCR从卵巢细胞系克隆SLPI DNA。制备了三个不同的片段。首先，用PCR将SCC铰链区添加到SLPI基因的N末端，并且将链霉素标志添加到SLPI基因的C末端，制备了SCC铰链区SLPI链霉素标志。其次，通过用PCR将SSS铰链区添加到SLPI基因的N末端，并且将链霉素标志添加到SLPI基因的C末端，制备了SSS铰链区SLPI链霉素标志。最后，通过PCR建立SSS铰链区SPLI和CH3链霉素标志片段，并且通过两个片段的重叠衍生将其融合，制备了SSS铰链区SLPI CH3链霉素标志。通过DNA测序证实了所有这些序列。
通过组合上文描述的不同片段制备了三个最终的分子。首先，采用Bcil限制位点将具有15个氨基酸组成的接头的2E12 scFv与SCC铰链区SPLI标志组装在一起，得到2E12 scFv-SCC-SPLI标志(图11)。其次，将具有5个氨基酸组成的接头的2E12 scFv与SSS铰链区SPLI标志组装在一起，得到2E12 scFv(5aa接头)-SSS-SLPI标志(图12)。最后，将具有15个氨基酸组成的接头的2E12 scFv与SSS铰链区SPLI CH3标志组装在一起，得到2E12 scFv-SSS-SPLI-CH3标志(图13)。
蛋白表达和纯化。根据制造商的方案，在每个孔含有0.5ml培养基的24孔板中用lipofectmine2000(Invitrogen)将所有构建体转染到COS7细胞系中。转染后1天，用无血清的培养基替换血清培养基。三天后，收集上清液，并且测试活性。对于更大规模的表达，采用150mm的培养皿，每三天收集上清液三次，合并，并且通过过滤器使其澄清。然后使上清液通过用100mM Tris pH8缓冲液预平衡的蛋白A固定的柱。用PBS彻底清洗柱子，用100mM柠檬酸，pH2.5洗脱蛋白。然后用PBS透析洗脱的蛋白并且浓缩。通过280nm处的吸光度确定每种蛋白的浓度，其中使用了从它们的氨基酸序列计算的消光系数和分子量。
按照上文所述将三种2E12-SLPI构建体转染到COS7细胞中，但在转染后用含有血清的培养基代替无血清的培养基。也按照上文收集上清液。对于纯化，使上清液通过用结合缓冲液(100mMTris-Cl pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA)平衡的trep-tactin柱。用结合缓冲液彻底清洗柱子后，用添加2.5 mM脱硫生物素的相同缓冲液洗脱蛋白。用PBS透析洗脱的蛋白，浓缩，按照上文用OD280进行定量。
2E12-SLPI缀合物的结合活性。将具有不同缀合基因的哺乳动物载体(scFv-SCC-SLPI、scFv(5aa接头)-SSS-SLPI和scFv-SSS-SLPI-CH3)转染到COS细胞中，收集上清液。然后将上清液与清洗过的CD28-CHO细胞一起温育，然后用山羊抗SLPI，并且随后用兔抗山羊Fitc进行探测。然后用FACS测定法分析细胞。数据示于图14。我们证明了我们可以经2E12 scFv-SSC-SLPI和2E12 scFv-SSS-SLPI-CH3制备功能性2E12-SLPI缀合物，因为这些分子能够结合CD28-CHO，并且可以在FACS测定中通过抗SLPI抗体进行检测。
2E12-SLPI缀合物和SLPI Ig的蛋白酶抑制活性。进一步检验SLPI Ig(问题-该构建体以前是否称作SLPI Ig？)、2E12 scFv-SCC-SLPI、scFv-SSS-SLPI-CH3的纯化样品抑制弹性蛋白酶的蛋白酶活性的能力。图15示出了数据。2E12-SLPI缀合物中的两个(即scFv-SLPI和scFv-SLPI-CH3)和SLPI Ig以剂量依赖性方式抑制弹性蛋白酶的蛋白水解活性。同样，这些分子通过阻断弹性蛋白酶活性展示蛋白酶抑制活性，表明缀合物的前端和后端都是有功能的。
2E12-SLPI缀合物和SLPI IG对PBMC增殖的作用。也检验了SLPI Ig和选定的2E12-SLPI缀合物对CD3和PHA胚PBMC的作用。参见图16。我们观察到了2E12-SLPI缀合物(scFv-SLPI-CH3和scFV-SLPI)对PMBC增殖具有温和的抑制作用。单独的SLPI Ig也对PMBC增殖具有抑制作用。
实施例3
结合域融合蛋白的纯化
在实施例中，纯化了包含结合域和WAP结构域型蛋白酶抑制剂的结合域融合蛋白，所述结合域识别CD28，所述WAP结构域型蛋白酶抑制剂包含人SLPI的58-107位的序列。采用Morris等描述的通用方法(Morris，A.E.，Jiang，Y.J.，McChesney，R.E.，Jackson，A.E.，Bancroft，C.，and Chasin，LA，Gene 94，289-294，1990)，用合成基因转染CHO DHFR-细胞。将中国仓鼠二氢叶酸还原酶编码基因(DHFR)用作有效的显性可选择报道物，以构建稳定转染的DHFR-CHO细胞，作为转染的基因的接受细胞。基于DHFR+表型选择转染的细胞。
将缺失了内源DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO DG44)用于表达结合域融合蛋白。DHFR-细胞在含有HT(次黄嘌呤、胸苷)的培养基中生长，使得所有存活的细胞必须保留质粒。在染色体外复制含有用于结合域融合蛋白表达的基因的质粒(PD18)，在氨甲喋呤中扩增。
用购自HyCult Biotechnology的试剂盒(HK316，人SLPIELISA)，通过ELISA测量SLPI或含SLPI的结合域融合蛋白的浓度。用也购自HyCult Biotechnology的测试试剂盒(HK318，人抑弹性蛋白酶蛋白/SKALP ELISA)，通过ELISA测量抑弹性蛋白酶蛋白或含抑弹性蛋白酶蛋白的结合域融合蛋白的浓度。
在具有重组体(ZN全长链)的无血清条件下，在补加了4mM谷氨酰胺、青霉素/链霉素、丙酮酸钠和MEM非必须氨基酸(均来自Invitrogen储液)的Excell 302(JRH Biosciences)培养基中生长含有质粒的CHO细胞，该质粒编码结合域融合蛋白，该蛋白包含识别CD28的结合域、具有人SLPI的58-107位的序列的WAP结构域和具有人CH3的序列的二聚结构域。使细胞在发酵罐中生长，监测细胞密度。用测量SLPI浓度的ELISA试剂盒监测结合域融合蛋白的浓度。在相应于结合域融合蛋白的峰值浓度的时间，停止发酵，通过过滤将细胞培养基从细胞和细胞碎片分离出来。使过滤后的培养基通过固定的蛋白A的柱子，用缓冲液洗涤柱子。检测280nm处的吸光度。通过对人SLPI特异的ELISA监测选定的级分中的结合域融合蛋白的浓度。当280nM处的吸光度达到低水平，即0.1-0.3个吸光度单位时，用pH3甘氨酸-柠檬酸缓冲液洗脱柱子，以除去结合域融合蛋白。立即用Tris缓冲液中和含有洗脱的蛋白的级分，并且透析到与结合域融合蛋白的稳定性相容的合适缓冲液(0.1MHepes，pH7.2，含150mM NaCl或0.1M磷酸钠，pH7.2，含150mMNaCl)中。无菌过滤结合域融合蛋白，在保护其生物活性的条件下储存。
实施例4
分析结合域融合蛋白的抗菌作用
将处于纯化的中间阶段的纯化的结合域融合蛋白或样品转移到与抗微生物测定相容的缓冲液中。尽管可以使用正常情况下用于可溶蛋白的很多常用缓冲液，合适的缓冲液是磷酸缓冲盐水(PBS)；50mM磷酸钾，pH7.2；50mM磷酸钠，pH7.0；50mM磷酸钾，pH7.2，含150mM NaCl；和50mM磷酸钠，pH7.0，含150mM NaCl。
发光定量测定：合适的细菌是含有发光质粒pCGLS1(Frackman，S.，et al.，1998 Proc.Natl.Acad.Sci.95，14961-1514966)的大肠杆菌DH5α。细菌在LB(Luria-Bertani)培养基中30℃-37℃生长，直到达到对数期，然后通过离心收集，重悬于10mM磷酸钾，pH7.2，其中含有1％生长培养基。在含有多种浓度的结合域融合蛋白的96孔培养皿中温育细菌(106)4小时。NaCl浓度也在0-200mM之间改变。温育4小时后，用光度计对发光进行定量。发光表示存在活细胞或含有发光质粒的细胞。用发光单位对加入的结合域融合蛋白的浓度进行的作图，表明抑制50％发光时的浓度。将每种结合域融合蛋白与高度纯化的捕获蛋白(SLPI，抑弹性蛋白酶蛋白等)的可信实例进行比较，以定量确定它们的相对抗菌作用。
菌落形成单位(CFU)测定：对细菌样品测定结合域融合蛋白，然后对所述样品进行活细胞计数。本领域技术人员可以认识到，很多不同的细菌都可以用于确定结合域融合蛋白的生物活性。合适的细菌是铜绿假单胞菌。37℃下在合适的培养基如胰胨豆胨大豆培养液中生长细菌，直到达到对数期。然后通过离心收集细胞，以2×105CFU/ml重悬于合适的缓冲液中。合适的缓冲液是10 mM磷酸钾，pH7.2。将细菌与多种浓度的结合域融合蛋白一起在37℃温育4-6小时。在温育期末，将细菌铺展在琼脂板表面，在37℃生长24小时。确定菌落数目，用可信的捕获蛋白纯化样品与CFU结果进行比较。
其它合适的细菌包括大肠杆菌ML或金黄色葡萄球菌，例如，在胰胨豆胨大豆培养液中生长并且用于中对数期。通过离心收集细菌，并用10mM磷酸钠，pH7.4洗涤，重悬于含有1％胰胨豆胨大豆培养液的10mM磷酸钠，pH7.4中。通过分光光度计估计细菌浓度(0.2A620＝5×107细菌/ml)。在含有5×104细菌/ml的450∶1的细菌细胞培养物中加入50∶1的各种浓度的融合蛋白。在37℃温育培养物。在加入结合域融合蛋白时，取出100∶1的样品，连续稀释以确定菌落形成单位。温育2小时后，取出另外100∶1，用于确定CFU。在0和2小时确定对照的CFU。通过100-(100XCFU样品/CFU对照)确定抑制百分比，对照的百分比是100×CFU样品/CFU对照。用结合域融合蛋白处理后部分或完全抑制细菌生长显示杀菌活性。
通过在加入细菌和与细菌一起温育之前在结合域融合蛋白中加入与多种捕获蛋白特异性反应的抗体，测试抑制的特异性。在结合域融合蛋白中加入各种浓度的抗体，以实现抗菌活性的最大抑制。用抗SLPI的抗体(HP9024兔多克隆抗人SLPI；抗人SLPI的HM2037小鼠Mab，HyCult Biotechnology)、抑弹性蛋白酶蛋白(HP9026兔多克隆抗人抑弹性蛋白酶蛋白/SKALP，抗人抑弹性蛋白酶蛋白的H2062小鼠mab/SKALP，SLPI HyCult Biotechnology)阻断结合域融合蛋白的抗菌活性。
实施例5
通过结合域融合蛋白抑制弹性蛋白酶活性
在本实施例中，评估了包含蛋白酶抑制剂的结合域融合蛋白的蛋白酶抑制活性。可以用一些蛋白酶确定结合域融合蛋白对蛋白酶的抑制和抑制特异性。比较了结合域融合蛋白、SLPI、抑弹性蛋白酶蛋白和包含在结合域融合蛋白中的母体蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制活性。在一个测定中，在存在或缺乏多种浓度的结合域融合蛋白、SLPI、抑弹性蛋白酶蛋白或包含在结合域融合蛋白中的母体蛋白酶抑制剂的条件下用结合域融合蛋白、SLPI、抑弹性蛋白酶蛋白或其它蛋白酶抑制剂来抑制一个浓度的弹性蛋白酶、糜蛋白酶和组织蛋白酶G。测定缓冲液与蛋白酶活性相容。合适的缓冲液是含有100mMNaCl的50mM Hepes，pH7.4。蛋白酶浓度是1-100nM，更优选是10-60nM，并且依赖于使用的特定蛋白酶。在10mM氯化钙存在下测定糜蛋白酶。用于比较的结合域融合蛋白和其它蛋白酶抑制剂的浓度是0.01-100nM，并且依赖于抑制剂的生物活性。在25℃将结合域融合蛋白和其它蛋白酶抑制剂以及蛋白酶靶温育30分钟，然后确定蛋白酶活性。糜蛋白酶和组织蛋白酶G的合适底物是N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺。弹性蛋白酶的合适底物是N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-对硝基苯胺。将这两种对硝基苯胺底物溶解于二甲亚砜。当将底物溶解于缓冲液中时，二甲亚砜的浓度保持尽可能低，优选低于10％，更优选低于5％。将结合域融合蛋白和蛋白酶的混合物加入底物中，以96孔形式随时间记录405nm处的吸光度。存在与不存在抑制剂的条件下反应速度之比等于1-([Eo]+[Io]+Ki app)-{([Eo]+{Io]+Ki app)2-4[Eo][Io]}112/(2[Eo])，其中[Eo]和[Io]分别是指蛋白酶和结合域融合蛋白的总浓度，并且Kiapp是表观抑制常数。用Ki app＝Ki(1+[So]/Km)，通过对底物浓度的作用校正Kiapp值而计算Ki′，其中[So]是底物浓度，Km是Michaelis-Menten常数。
在另一个测定中，将弹性蛋白酶(人中性粒细胞弹性蛋白酶，Calbiochem)在缓冲液中与多种浓度的抑制剂(即结合域融合蛋白、抑弹性蛋白酶蛋白、SLPI等)一起温育，该缓冲液与这些蛋白相容。由于弹性蛋白酶在某种程度上是不稳定的，并且随时间失去活性，优选使用新鲜的弹性蛋白酶溶液。合适的缓冲液是0.1M Tris HCl，pH7.8，其中含有0.2M NaCl和0.05％Triton X-100。弹性蛋白酶的浓度是5-10nM，优选8nM。25℃下将弹性蛋白酶与多种浓度的结合域融合蛋白一起温育10-20分钟，优选15分钟。将温育的混合物的样品(10-25μl)加入96孔培养皿中的150μl的0.33mM甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-对硝基苯胺(Sigma Aldrich M4765)，用96孔板读数器读出作为时间的函数的405nm处的吸光度，从而确定弹性蛋白酶活性。类似地，用N-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基苯胺(SigmaAldrich，B4875)测试结合域融合蛋白抑制胰蛋白酶的能力。从时程确定动力学常数(Bieth，J.G.，Biochem.Med.32，387-397，1984)。
在另一个测定中，将N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-7-酰氨基-4-甲基香豆素(Sigma Aldrich)，即弹性蛋白酶的一种产荧光的底物溶解于含有0.5 M NaCl和1-10％二甲亚砜的0.1M Hepes，pH7.5中。在390μl底物中加入10μl弹性蛋白酶或与结合域融合蛋白预先混合的弹性蛋白酶。用荧光计测量445 nm处的荧光发射，其中采用383 nm的激发波长。在25℃，记录作为时间的函数的测量值10-20分钟。制出荧光强度随时间的变化图，计算初始速度并记录。也用96孔培养皿进行测定，并且用平板读数器记录随时间变化的荧光。基于加入的蛋白酶和抑制剂(即结合域融合蛋白)的摩尔浓度计算比活性。将人白细胞弹性蛋白酶的标准品用于比较。用标准量的结合域融合蛋白的抑制百分比和弹性蛋白酶的标准量用于比较不同结合域融合蛋白的相对抑制能力。
实施例6
结合域融合蛋白和气道中存在的抑制性蛋白的协同作用
用棋盘测定形式(Krogstad，D.，and Moellering，R.C.，inAntibiotics in Laboratory Medicine，2nd ed.，edited by Lorian V.Baltimore，Williams & Wilkins，1986，p.557-578)测试协同作用。制备结合域融合蛋白和气道表面液体的成分(如溶菌酶、乳铁蛋白等)的系列溶液，使得每行和每列含有固定量的结合域融合蛋白和逐渐增加量的溶菌酶、乳铁蛋白等。在本发明的范围内，包括利用和测试不特别认为在ASL中的分子。在2倍系列稀释液中调节每个成分的浓度，使得它们包括高于每种试剂的EC50 2-4倍到低于EC50100-200倍的范围。测试了要进行协同作用测定的结合域融合蛋白和气道试剂的抗菌活性。在每个孔中加入含有发光质粒pCGLS1(5×106CFU)的大肠杆菌DH5α，并且与蛋白和蛋白混合物一起温育4小时。用光度计对发光进行定量。矩阵的每行或每列代表组合实验，从每个组合计算每种试剂的分数抑制浓度(FIC)。与另一种试剂组合使用时的杀灭浓度除以单独使用时具有相同效果的浓度，得到FIC(Hall，M.J.，Middleton，R.F.，and Westmacott，D.，J.Antimicrobiol.Chemother.11，427-433，1983)。为了获得FIC指数，加入两种蛋白的组合的FIC值。以加和方式起作用的组合的FIC指数大约等于1。协同起作用的组合的FIC指数小于1。拮抗起作用的组合的FIC指数大于1。显著偏离1的协同或拮抗组合比接近于1的组合更有效。用这些数据制出等效应图(isobologram)以便于解释。凹形等效应图表示测定中两种成分具有协同作用。将含有捕获蛋白的结合域融合蛋白与捕获蛋白比较，所述捕获蛋白与溶菌酶、乳铁蛋白等一起温育。
重组人溶菌酶、人乳铁蛋白、cathelicidin LL-37、妥布拉霉素、人防御蛋白、人β-防御蛋白-1(HBD-1)、人β-防御蛋白-2(HBD-2)、HNP-1防御蛋白或分泌型IgA(气道试剂)是气道液体中的成分的实例。将这些和其它可能的协同分子与结合域融合蛋白以多种组合和比例混合。抑弹性蛋白酶蛋白/SKALP(HC4011)、抑弹性蛋白酶蛋白/SKALP ELISA(HK318)、人SLPI ELISA(HC316)、人弹性蛋白酶ELISA(HK319)、人乳铁蛋白(HP9034)、人LLC肽(HC4013)、人溶菌酶(H8035)、人中性粒细胞防御蛋白1-3(HK317)获自荷兰的Hycult Biotechnology。
实施例6
通过时间-杀灭方法分析结合域融合蛋白
用结合域融合蛋白和ASL的成分如溶菌酶、乳铁蛋白等测试亚抑制浓度的一种试剂随时间改善另一种试剂的杀灭活性的能力(Krogstad，D.，and Moellering，R.C.，in Antibiotics in LaboratoryMedicine，2nd ed.，edited by Lorian V.Baltimore，Williams & Wilkins，1986，p.557-578)。将含有发光质粒pCGLS1(5×106CFU)的大肠杆菌DH5α与以下物质一起温育：(i)以等于EC50的浓度存在的ASL成分(如溶菌酶)，(ii)不导致发光减少的一半浓度的结合域融合蛋白，(iii)ASL成分和结合域融合蛋白的组合，和(iv)单独的缓冲液。确定发光的时程，以一小时的间隔采用从30分子到6.5小时的各种温育时间。对于含有蛋白的三个反应(i，ii和iii)中的每一个反应制出发光单位随时间的变化图，并且与缓冲液(iv)进行比较。如果亚抑制浓度的结合域融合蛋白的存在能够有效增强ASL成分的杀灭，这将在图中观察到。本发明的范围内包括了利用和测试不特别已知存在于ASL中的分子。
实施例7
通过结合域融合蛋白增加肝细胞生长因子的产生
在存在和不存在多种浓度的结合域融合蛋白的条件下测定成纤维细胞培养物产生肝细胞生长因子(HGF)的能力。尽管可以使用一些类型的成纤维细胞培养物，合适的成纤维细胞是人肺成纤维细胞CCD-11Lu、CCD-25Lu、CCD-32Lu和CCD-33Lu，这些细胞都购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。37℃下在5％二氧化碳中使细胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基(DMEM)中生长。将细胞以5×104个细胞/cm2铺板在6孔或12孔培养皿上24小时，然后用PBS(不含钙和镁)清洗三次，然后在无血清的DMEM存在下与多种浓度的结合域融合蛋白一起温育。与结合域融合蛋白一起温育16-24小时后，收集细胞培养基，通过离心澄清。用ELISA(酶联免疫吸附测定)对HGF进行定量。将ELISA试剂盒用于该目的，该试剂盒获自商业来源，如DHGOO HumanHGF Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)。用具有宽浓度范围的HGF的标准曲线确定细胞培养基中的HGF浓度。用结合域融合蛋白的浓度范围确定对HGF产生的最大作用。将母体捕获蛋白用于比较。
实施例8
分析结合域融合蛋白的体内抗炎作用
给小鼠气管内滴注铜绿假单胞菌508和直径小于200μm的琼脂微珠的复合物(Gosselin，D.，DeSanctis，J.，Boule，M.，Skamene，E.，Matouck，C.，and Radzioch，D.，Infect.Immun.63，3272-3278，1995)。用Jin等人的方法(Jin，F.Y.，Nathan，C.，Radzioch，D.，and Ding，A.，Cell 88，417-426，1997)确定结合域融合蛋白对细菌攻击肺系统的炎症反应的作用。使铜绿假单胞菌生长，直到达到对数期，然后在冰上在胰胨豆胨大豆琼脂和重油中剧烈搅拌细菌样品。通过对珠子进行匀浆并且将系列稀释液铺板在胰胨豆胨大豆琼脂培养基上，确定微珠的活细菌滴度。为了滴注微珠，在麻醉的小鼠的气管的腹侧中线上切开一个小切口，将50μl体积的含有5×104个活细菌的微珠注射到气管中。通过延伸到气管中的22号IV导管导入额外的50μl空气。用手术钳关闭切口。通过滴注用缓冲液代替细菌而制备的微珠建立假处理对照。从细菌样品滴注后多个时间(0、3、6和24小时，以及3、5、7和14天)取出的肺制备总RNA。采用含有50mM醋酸钠、1mM EDTA和2％甲醛的20mM3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，pH7.0的缓冲液，在1％琼脂糖凝胶上对25μg RNA/道进行电泳，从而产生Northern印迹。将RNA转移到尼龙膜(NENResearch Products，Bostob，MA)上之后，将Prime-a-Gene试剂盒(Promega，Madison，WI)用于在42℃探针标记(106cpm/ml)杂交样品18小时。将SLPI的cDNA和使Northern印迹归一化的β-肌动蛋白的cDNA进行杂交。杂交缓冲液是5×SSC，5×Denhardt溶液，50％甲酰胺和1％SDS，其中每ml含有100μg鲑鱼精子DNA。对Northern印迹进行放射性自显影，确定SLPI和β-肌动蛋白条带的图像密度。用β-肌动蛋白条带的图像密度对作为时间的函数的SLPI图像密度进行加样差异校正。通过尾静脉注射在第0、1、2、3、4和7天给予小鼠结合域融合蛋白。结合域融合蛋白的剂量最初是1mg/kg，并且根据结果，在额外的实验中调整。用产生很少作用或无作用的剂量到产生最大作用的剂量获得剂量反应。采用0时间道作为分母，对作为时间的函数的SLPI cDNA含量的增加倍数作图。Jin等人证明了SLPI cDNA反应于铜绿假单胞菌的滴注而增加。当与假处理的对照样品进行比较时，抗铜绿假单胞菌导致的炎症的阳性作用是处理的小鼠中SLPI mRNA的产生减少。
实施例9
分析结合域融合蛋白对LPS的体外作用的抑制
反应于LPS的刺激，B细胞分泌SLPI，并且同时开始增殖并产生免疫球蛋白。优选的方法利用多种浓度的结合域融合蛋白和其它蛋白酶抑制剂的组合抑制LPS存在下LPS在小鼠脾细胞培养物中的作用。将SLPI缺陷的小鼠脾细胞和巨噬细胞(Nakamura，A.，Mori，Y.，Hagiwara，K.，Suzuki，T.，Sakakibara，T.，Kikuchi，T.，Igarashi，T.，Ebina，M.，Abe，T.，Miyazaki，J.，Takai，T.，and Nukivva，T.，J.Exp.Med.5，669-674，2003)与野生型小鼠的小鼠脾细胞和巨噬细胞进行比较。从2ml4％的硫代乙醇酸盐培养基(Sigma)处理的SLPI-/-和SLP+/+小鼠腹膜腔收集巨噬细胞。用冰冷的PBS洗涤细胞，然后培养1小时，使贴壁的细胞附着于培养皿。通过清洗除去未贴壁的细胞。在存在和缺乏多种浓度的结合域融合蛋白和其它蛋白酶抑制剂的条件下在含有10％胎牛血清的DMEM中将贴壁的腹膜巨噬细胞与100ngLPS/ml或LPS和100Uγ干扰素(IFNγ)一起温育。通过ELISA确定培养物上清液中IL-6、IL-1ε和TNF-α的浓度。通过硝酸盐/亚硝酸盐比色试剂盒(Cayman Chemical)确定NO2 -。比较SLPI缺陷型和野生型巨噬细胞的细胞因子和NO2 -浓度，作为结合域融合蛋白浓度的函数。
已知SLPI-/-对LPS诱导的内毒素休克敏感。给SLPI-/-和野生型小鼠注射腹膜内LPS攻击(1mg/小鼠)，然后观察存活情况。在LPS攻击时，给予小鼠多种剂量的结合域融合蛋白和蛋白酶抑制剂(SLPI，抑弹性蛋白酶蛋白等)以进行比较。结合域融合蛋白和蛋白酶抑制剂都注射到尾静脉中。对结合域融合蛋白和蛋白酶抑制剂进行每天的存活小鼠数目作图，以确定结合域融合蛋白是否抗LPS攻击。与缓冲液对照相比，给予结合域融合蛋白的小鼠死亡延迟，表明结合域融合蛋白抗LPS攻击。
实施例10
分析结合域融合蛋白的体外抗炎作用
用Jin等人的程序(Jin，F.Y.，Nathan，C.，Radzioch，D.，and Ding，A.，Cell 88，417-426，1997)确定结合域融合蛋白在体外对巨噬细胞的影响。通过将2ml 4％的Brewer′s硫代乙醇酸盐培养液(Difco，Detroit，MI)腹膜内注射到一组5只小鼠中，制备活化的原代小鼠巨噬细胞。4天后，洗涤腹膜腔，收集原代巨噬细胞。优选的巨噬细胞系是获自ATCC，Manassas，VA的RAW 264.7巨噬细胞系。使RAW 264.7在含有10％热灭活的胎牛血清的RPMI 1640培养基上生长。测定培养基中的LPS污染，如果LPS浓度高于25pg/ml，则不使用。其它巨噬细胞系也适用于该测定。
在24孔或96孔培养皿中制备细胞单层。对于96孔培养皿，在150μl培养基中使用105个细胞/孔。将细胞与LPS、IFNγ或这两者一起温育48小时。收集培养基(100μl)，放置在96孔培养皿中。加入100微升Griess试剂(1％磺胺、0.1％二盐酸萘基乙二胺和2.5％磷酸)，确定550nm处的吸光度。从所有测定中扣除缓冲液中亚硝酸盐的浓度。用亚硝酸钠浓度对550nm处的吸光度所作的标准曲线确定培养的样品中的亚硝酸盐浓度。确定了与多种浓度的结合域融合蛋白一起温育的细胞的亚硝酸盐浓度。结合域融合蛋白的阳性作用是与缺乏结合域融合蛋白相比，亚硝酸盐产生相对减少。
实施例11
结合域融合蛋白与弹性蛋白酶的结合的BIACORE分析
通过将可溶性结合域融合蛋白共价固定在BIAcore芯片上并且使蛋白酶溶液通过芯片表面，进行可以用于计算热动力学结合常数的结合动力学分析。也将蛋白酶固定在BIAcore芯片上，使结合域融合蛋白的溶液通过芯片。仪器检测出了随时间的表面等离子共振改变。表面等离子共振对吸附在金包被的芯片表面上的薄亲水膜上的材料的质量敏感。随着SMIP的质量在芯片表面积累，表面等离子共振增加，数据连续捕获在计算机上，用于进一步的分析。用自动化的软件计算显微动力学常数。从各种浓度SMIP的共振单位的改变速度，计算显微缔合速度。当单一溶质(蛋白酶或结合域融合蛋白)浓度下共振信号达到平台时，溶质溶液的流动是不连续的，并且用缓冲液洗去结合的溶质。从共振单位减少(芯片上的质量随结合的蛋白的解离损失)的速度，可以计算结合域融合蛋白：蛋白酶复合物的解离速度。曲线形状通常可以判断溶质溶液中聚集物的存在。显微缔合和解离速度常数的比值等于热动力学结合常数(Ka)。Ka的倒数是热动力学解离常数(Kd)。结合域融合蛋白将与母体捕获蛋白进行比较。
为了测试结合域融合蛋白对弹性蛋白酶的结合特异性，用N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲酮(Sigma Aldrich M4814)处理弹性蛋白酶，以灭活活性位点。使加合物通过固定在BIAcore芯片上的结合域融合蛋白。如果弹性蛋白酶被灭活，加合物不能结合于结合域融合蛋白。通过缺乏抗N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-对硝基苯胺底物的活性(不能释放对硝基苯胺)，证明弹性蛋白酶的灭活。
为了证明结合的特异性，通过与抗结合域融合蛋白的捕获蛋白部分的抗体反应，阻断固定的结合域融合蛋白。结合域融合蛋白固定在BIAcore芯片表面后，使抗体溶液通过芯片，从而进一步阻断芯片，所述抗体如兔多克隆抗人SLPI或兔抗人抑弹性蛋白酶蛋白/SKALP(Hycult Biotechnology)。从芯片洗去抗体后，使弹性蛋白酶或用N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲酮灭活的弹性蛋白酶通过BIAcore芯片，记录共振单位。含有结合域融合蛋白：抗体复合物的芯片结合弹性蛋白酶的能力降低。
实施例12
分析结合域融合蛋白对糜蛋白酶、胰蛋白酶和其它蛋白酶的抑制
将结合域融合蛋白、SLPI、抑弹性蛋白酶蛋白和包含在结合域融合蛋白中的母体蛋白酶抑制剂的能力进行比较，以比较它们对多种蛋白酶的抑制作用(生物活性的一种特征)。在多种浓度的结合域融合蛋白、SLPI、抑弹性蛋白酶蛋白或包含在结合域融合蛋白中的母体蛋白酶抑制剂存在或不存在的条件下，将结合域融合蛋白、SLPI、抑弹性蛋白酶蛋白或蛋白酶抑制剂用于抑制一个浓度的弹性蛋白酶、糜蛋白酶或组织蛋白酶G。测定缓冲液与蛋白酶活性相容。优选的缓冲液是含有100mM NaCl的50mM Hepes，pH7.4。蛋白酶浓度是1-100nM，更优选是10-60nM。蛋白酶的浓度将依赖于使用的特定蛋白酶。在10mM氯化钙存在下测定糜蛋白酶。用于比较的结合域融合蛋白和其它蛋白酶抑制剂的浓度是0.01-100nM，并且依赖于抑制剂的生物活性。在25℃将结合域融合蛋白和其它蛋白酶抑制剂以及蛋白酶靶温育30分钟，然后确定蛋白酶活性。
实施例13
分析结合域融合蛋白对HIV-1的抑制
本领域技术人员已知一些方法可以用于对HIV复制的抑制进行定量，并且测定细胞的HIV感染，所述感染是急性、慢性和潜伏感染HIV-1。在优选方法中(Shine，N.R.，Wang，S.C.，Konopka，K.，Burks，E.A.，Duzgunes，N.，and Whitman，C.P.，Bioorg.Chem.30，249-263，2002)，测定结合域融合蛋白抑制PMA处理的THP-1单核细胞(美国典型培养物保藏中心TIB-202)中的HIV-1复制的能力。使细胞在37℃下在补加了10％热灭活的胎牛血清的RMPI 1640培养基中生长。用12-豆蔻酸13-乙酸佛波醇(PMA)处理THP-1细胞的单细胞悬浮液，以刺激分化。使HIV的亲单核细胞株HIV-1Ba-L(AdvancedBiotechnologies，Columbia，MO)在巨噬细胞中繁殖(Pretzer，E.，Flasher，D.，and Duzgunes，1997 Antiviral.Res.34：1-15)。PMA处理的细胞贴壁于培养皿，并且进行形态改变，成为扁平、似阿米巴的形状。使细胞生长大约7天。将细胞与多种浓度的结合域融合蛋白、SLPI或抑弹性蛋白酶蛋白在37℃一起预温育2小时。然后用HIV-1Ba-L感染细胞。37℃下2小时后，洗涤细胞3次，然后在RPMI培养基中培养。用对p24特异的ELISA确定培养物上清液中存在的病毒p24的负荷，从而对HIV感染的量进行定量(AIDS VaccineProgram，National Cancer Institute，Frederick，MD)。也将结合域融合蛋白与HIV预温育2小时，然后将HIV加入细胞。如果与对照相比，结合域融合蛋白减少培养物上清液中观察到的p24的量，则结合域融合蛋白是具有生物活性的。
认为一些蛋白酶抑制剂影响病毒复制的整合后阶段中的非常晚期的事件(转录后和翻译)。在第二种优选方法中(Turpin，J.A.，Buckheit，R.W.，Jr.，Derse，D.，Hollingshead，M.，Williamson，K.，Palamone，C.，Osterline，M.C.，Hill，S.A.，Graham，L.，Schaeffer，C.A.，Bu，M.，Huang，M.，Cholody，W.M.，Michejda，C.J.，and Rice，W.G.，Antimicrobiol.Agents Chemother.42，487-494)，在存在和不存在不同浓度的结合域融合蛋白或捕获蛋白的条件下将慢性感染的H9/HIV-IIIB NIH 1983细胞(5×104个细胞/ml)培养5天。5天后，用培养物的上清液确定毒粒相关的逆转录酶活性。在还原测定中通过XTT确定细胞存活力。如果结合域融合蛋白与使用缓冲液的对照相比使毒粒相关的逆转录酶活性降低和/或增加细胞培养物上清液中的细胞存活力，则它是具有生物活性的。
从上文中可以理解，尽管处于说明的目的描述了本发明的许多特定实施方案，可以在不偏离本发明的精神和范围的前提下进行多种修饰。因此，本发明并不受其限制，而是由所附权利要求进行限定。
在本文中引用的或提及的所有专利、专利申请、出版物、科学文章、网站和其他的文件和材料，都指明本发明所属领域的技术人员的技术水平，且每篇这样的引用的文件和材料在这里引作参考，其程度与各自整体引作参考或在本文中整体阐述相同。另外，在该申请中的所有权利要求和所有优先权申请，包括但不限于原始的权利要求，在这里整体引入本发明的书面描述，并形成它的一部分。申请人保留将来自任何这样的专利、申请、出版物、科学文章、网站、可电子地获得的信息和其他的引用的材料或文件的任何和所有材料和信息物理地整合进本说明书的权利。申请人保留物理地整合进本文件的任何部分(包括书面说明书的任何部分)、上面提及的权利要求(包括但不限于任何原始的权利要求)的权利。
本文所述的特定的方法和组合物是优选的实施方案的代表，且是示例性的，并无意限制本发明的范围。本领域的技术人员考虑本说明书，能够明白其他的目的、方面和实施方案，且其包含在如权利要求书的范围限定的本发明的精神内。本领域的技术人员能够容易地明白，可以对本文公开的发明进行各种替代和修改，而不脱离本发明的范围和精神。在缺少本文中没有特别公开为必需的任何因素或限制的情况下，可以适当地实现在本文中解释性地描述的本发明。因而，例如，在本文的每种情况下，在本发明的实施方案或实施例中，说明书中的术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一个，都可以用其他的2个术语中的任一个替代。同样，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当广义地理解，且没有限制。可以以不同的步骤次序，适当地实现本文解释性地描述的方法和过程，且它们不必限于本文或权利要求中指出的步骤次序。如本文和所附的权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”也包括复数形式，除非上下文清楚地另有说明。因而，例如，提及“一个宿主细胞”包括许多这样的宿主细胞(例如，培养物或群体)，依此类推。在任何情况下，都不能将本专利理解为限于本文特别公开的特定实施例或实施方案或方法。在任何情况下，都不能将本专利理解为限于专利和商标局的任何审查员或任何其他官员或雇员作出的任何陈述，除非这样的陈述被申请人在答复意见书中具体地且无条件地或无保留地明确采纳。
已经采用的术语和表达用作描述而不是限制性的术语，这样的术语和表达的应用，无意排除所示且所述的特征的任何等同方案或其部分，但是应当认识到，各种改进在要求保护的本发明的范围内是可能的。因而，应当理解，尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征具体地公开了本发明，但本领域的技术人员可以使用本文公开的概念的修饰和变化，且认为这样的修饰和变化是在所附的权利要求限定的本发明的范围内的。
本文已经广泛地和一般地描述了本发明。每个落入一般公开内容的更窄的种类和亚类组，也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述，其附带条件或负面限制是，从该种类去除任何主题，无论本文是否特别地引用了删去的材料。
其他的实施方案也在下面的权利要求书中。另外，其中根据马库什组，描述了本发明的特征或方面，本领域的技术人员能认识到，此外还根据马库什组的各成员或成员的亚组描述了本发明。

Claims (108)

1.一种化合物，包含能够结合蛋白酶相关分子的结合域多肽、包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽和任选的包含连接区的多肽，所述连接区连接结合域多肽和包含蛋白酶抑制剂结构域的多肽。
2.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽包含免疫球蛋白或其部分。
3.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽包含单克隆抗体或其结合部分。
4.权利要求2的化合物，其中所述结合域多肽选自Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。
5.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽包含单链蛋白。
6.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽包含免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区多肽。
7.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽包含两个免疫球蛋白重链可变区多肽。
8.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽包含单链Fv。
9.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽包含由合成多核苷酸编码的单链Fv。
10.权利要求9的化合物，其中所述合成多核苷酸是通过组合一个以上的寡核苷酸合成的。
11.权利要求9的化合物，其中所述合成多核苷酸是通过PCR程序组合一个以上寡核苷酸合成的。
12.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽包含由多核苷酸编码的单链Fv，所述多核苷酸是用噬菌体展示从文库分离的。
13.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽包含由分离自杂交瘤的多核苷酸编码的单链Fv。
14.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽结合白细胞上的抗原。
15.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽结合T淋巴细胞上的抗原。
16.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽是结合T淋巴细胞上的抗原的scFv。
17.权利要求16的化合物，其中所述T淋巴细胞抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD25、CD28、CD69、CD 154、CD 152(CTLA-4)和ICOS。
18.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽结合辅助T细胞上的抗原。
19.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽结合单核细胞上的抗原。
20.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽结合树突细胞上的抗原。
21.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽结合免疫效应细胞上的抗原。
22.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽结合B细胞上的抗原。
23.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽结合一种靶，所述靶是选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD28、CD37、CD40、CD45、CD45 RA、CD45 RO、CD69、CD154、CD 152(CTLA-4)、ICOS、II类MHC、VEGF的抗原。
24.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽结合VEGF。
25.权利要求1的化合物，其中所述结合域多肽结合CD28。
26.权利要求1的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂结构域包含具有蛋白酶抑制剂活性的捕获蛋白多肽。
27.权利要求26的化合物，其中所述捕获蛋白多肽包含天然存在的SLPI多肽。
28.权利要求26的化合物，其中所述捕获蛋白多肽包含天然存在的SLPI多肽的类似物。
29.权利要求26的化合物，其中所述捕获蛋白多肽是天然存在的捕获蛋白多肽的类似物。
30.权利要求1的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂结构域包含具有蛋白酶抑制剂活性的WAP结构域。
31.权利要求30的化合物，其中所述WAP结构域是天然存在的WAP基序多肽的类似物。
32.权利要求1的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂结构域包含具有蛋白酶抑制剂活性的TIMP。
33.权利要求32的化合物，其中所述TIMP多肽是天然存在的TIMP多肽的类似物。
34.权利要求1的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂结构域包含具有蛋白酶抑制剂活性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
35.权利要求34的化合物，其中所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂是天然存在的半胱氨酸蛋白酶抑制剂多肽的类似物。
36.权利要求1的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂结构域包含防卫素。
37.权利要求36的化合物，其中所述防卫素是天然存在的防卫素的非天然存在的类似物。
38.权利要求1的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂抑制选自下组的蛋白酶：弹性蛋白酶、α1蛋白酶、蛋白酶3、糜蛋白酶、胰蛋白酶、人肥大细胞类糜蛋白酶、角质层糜蛋白酶、人白细胞弹性蛋白酶、人组织蛋白酶G、牛糜蛋白酶、猪糜蛋白酶、类胰蛋白酶、人白细胞弹性蛋白酶、猪胰腺弹性蛋白酶、角质层糜蛋白酶。
39.权利要求1的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂结构域抑制具有选自弹性蛋白、蛋白聚糖、胶原、VEGF前体的底物的蛋白酶。
40.权利要求1的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂结构域经过突变，相对于未突变的蛋白酶抑制剂结构域具有增加或减少的蛋白酶抑制活性。
41.权利要求1的化合物，其经过修饰，以实现对抑制的靶蛋白酶的特异性。
42.权利要求1的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂具有至少一种选自下组的生物活性：i)调节内源性蛋白酶的活性，ii)调节内源性蛋白酶的表达，iii)调节信号传导，iv)调节信号传导分子的活性，和v)调节信号传导分子的表达。
43.权利要求1的化合物，包含具有至少一种选自下组的生物活性的蛋白酶抑制剂类似物：i)调节内源性蛋白酶的活性，ii)调节内源性蛋白酶的表达，iii)调节信号传导，iv)调节信号传导分子的活性，和v)调节信号传导分子的表达。
44.权利要求1的化合物，包含TGase基序。
45.权利要求1的化合物，包含两个或多个TGase基序。
46.权利要求44或45的化合物，其中所述TGase基序包含氨基酸序列Gly-Gln-Asp-Pro-Val-Lys。
47.权利要求1的化合物，进一步包含二聚结构域。
48.权利要求47的化合物，其中所述二聚结构域包含免疫球蛋白CH3结构域或其部分。
49.权利要求1的化合物，其中所述连接区包含二聚结构域。
50.权利要求1的化合物，其中所述连接区包含选自下组的天然存在的铰链区：人铰链区或其部分、人IgG铰链区或其部分、人IgA铰链区或其部分、人IgE铰链区或其部分、骆驼类铰链区或其部分、IgG1美洲驼铰链区或其部分、护士鲨铰链区或其部分和斑点银鲛铰链区或其部分。
51.权利要求1的化合物，其中所述连接区包含选自下组的天然存在的铰链区：人铰链区或其部分、人IgG铰链区或其部分、人IgA铰链区或其部分、人IgE铰链区或其部分、骆驼类铰链区或其部分、IgG1美洲驼铰链区或其部分、护士鲨铰链区或其部分和斑点银鲛铰链区或其部分。
52.权利要求1的化合物，其中所述连接区包含人IgE铰链区或其部分。
53.权利要求1的化合物，其中所述连接区包含具有0或1个半胱氨酸残基的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区。
54.权利要求1的化合物，其中所述连接区包含具有0-2个半胱氨酸残基的人IgG铰链区。
55.权利要求1的化合物，其中所述连接区包含野生型人IgG1免疫球蛋白铰链区。
56.权利要求1的化合物，其中所述连接区包含糖基化位点。
57.权利要求1的化合物，进一步包含与连接区缀合的合成蛋白酶抑制剂。
58.权利要求1的化合物，其中所述连接区不具有能够形成二硫键的半胱氨酸残基。
59.权利要求1的化合物，其中所述连接区具有1个半胱氨酸残基。
60.权利要求1的化合物，其中所述连接区包含突变的野生型免疫球蛋白铰链区多肽，所述多肽包含不超过1个半胱氨酸残基。
61.权利要求1的化合物，其中所述连接区是改变的，使得所述化合物二聚的能力降低。
62.权利要求1的化合物，其中所述连接区包含突变的野生型免疫球蛋白铰链区多肽或其部分，所述多肽或其部分包含第一、第二和第三半胱氨酸残基，其中所述第一半胱氨酸残基在所述第二半胱氨酸的N末端，所述第二半胱氨酸在所述第三半胱氨酸的N末端，其中所述第一半胱氨酸被取代或缺失。
63.权利要求1的化合物，其中所述连接区的长度是大约15-大约115个氨基酸。
64.权利要求1的化合物，其中所述连接区的长度是大约10-大约50个氨基酸。
65.权利要求1的化合物，其中所述连接区的长度是大约15-大约35个氨基酸。
66.权利要求1的化合物，其中所述连接区的长度是大约18-大约32个氨基酸。
67.权利要求1的化合物，其中所述连接区的长度是大约5-大约15个氨基酸。
68.权利要求1的化合物，进一步包含免疫球蛋白恒定区结构域。
69.权利要求68的化合物，包含免疫球蛋白CH3恒定区结构域。
70.权利要求68的化合物，包含免疫球蛋白CH2CH3恒定区结构域。
71.一种化合物，包含i)具有能够结合靶分子的结合域多肽的第一多肽；ii)包含与所述第一多肽连接的连接区的第二多肽，iii)包含蛋白酶抑制剂结构域或调节蛋白酶抑制剂的结构域的第三多肽；和iv)包含免疫球蛋白恒定区或其部分的第四多肽。
72.权利要求68的化合物，其中所述免疫球蛋白恒定区结构域能够介导选自下组的效应物功能：补体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞毒性、FcR结合、蛋白A结合和靶细胞数目的减少。
73.权利要求1的化合物，进一步包含一个或多个二聚结构域和一个或多个TGase结构域，其中所述蛋白酶抑制剂结构域包含一个或多个WAP结构域。
74.权利要求1的化合物，进一步包含一个或多个二聚结构域，其中所述第一多肽位于所述第二多肽的N末端，所述第二多肽位于所述蛋白酶抑制剂结构域的N末端，其中所述蛋白酶抑制剂结构域包含一个或多个WAP结构域，并且其中所述一个或多个WAP结构域位于所述一个或多个二聚结构域的N末端。
75.权利要求1的化合物，进一步包含一个或多个二聚结构域，其中所述第一多肽位于所述第二多肽的N末端，所述第二多肽位于所述一个或多个二聚结构域的N末端，其中所述二聚结构域位于所述蛋白酶抑制剂结构域的N末端，并且其中所述蛋白酶抑制剂结构域包含一个或多个WAP结构域。
76.权利要求1的化合物，进一步包含一个或多个二聚结构域和一个或多个TGase结构域，其中所述第一多肽位于所述第二多肽的N末端，所述第二多肽位于所述蛋白酶抑制剂结构域的N末端，所述蛋白酶抑制剂结构域包含一个或多个WAP结构域，所述一个或多个WAP结构域位于所述一个或多个二聚结构域的N末端，并且其中所述二聚结构域位于所述一个或多个TGase结构域的N末端。
77.权利要求1的化合物，进一步包含一个或多个二聚结构域和一个或多个TGase结构域，其中所述第一多肽位于所述第二多肽的N末端，所述第二多肽位于所述蛋白酶抑制剂结构域的N末端，其中所述蛋白酶抑制剂结构域包含一个或多个WAP结构域，所述一个或多个WAP结构域位于所述一个或多个TGase结构域的N末端，并且其中所述TGase结构域位于所述一个或多个二聚结构域的N末端。
78.权利要求73-77的任一项的化合物，其中所述一个或多个WAP结构域是天然存在的WAP基序的非天然存在的类似物。
79.权利要求73-78的任一项的化合物，包含2-5个WAP结构域。
80.权利要求73-78的任一项的化合物，包含1或2个WAP结构域。
81.权利要求1的化合物，具有抗菌活性。
82.治疗患有细菌感染的患者的方法，包括给予有效抗菌量的权利要求1的化合物。
83.权利要求1的化合物，具有抗炎活性。
84.一种化合物，包含连接于免疫球蛋白结构域的蛋白酶抑制剂分子，所述免疫球蛋白结构域选自CH2CH3、铰链区-CH2CH3、铰链区-CH3、CH1-铰链区-CH2CH3、CH1-铰链区-CH3和CL。
85.权利要求1的化合物，其中所述免疫球蛋白结构域是灵长动物免疫球蛋白结构域。
86.权利要求1的化合物，其中所述免疫球蛋白结构域是人免疫球蛋白结构域。
87.权利要求1的化合物，其中所述蛋白酶抑制剂是蛋白。
88.权利要求1的化合物，其中所述CH2或CH3结构域中的一个或多个结构域包含氨基酸取代或缺失。
89.权利要求5的化合物，包含一个以上氨基酸取代或缺失。
90.治疗患有炎性病症的患者的方法，包括给予有效抗炎量的权利要求1的化合物。
91.治疗患有类风湿关节炎的患者的方法，包括给予有效抗炎量的权利要求1的化合物。
92.权利要求1的化合物，其对于治疗患者中的HIV感染有效。
93.治疗患有HIV感染的患者的方法，包括给予有效量的权利要求1的化合物。
94.权利要求1的化合物，其对于治疗患者中的肺部病症有效。
95.治疗患者中的肺部病症的方法，包括给予患者有效量的权利要求1的化合物。
96.权利要求1的化合物，其对于治疗患者中的肺炎有效。
97.治疗患者中的肺炎的方法，包括给予患者有效抗炎量的权利要求1的化合物。
98.权利要求1的化合物，其对于治疗患者中的血管病症有效。
99.治疗患者中的血管病症的方法，包括给予患者有效量的权利要求1的化合物。
100.权利要求1的化合物，其对于治疗眼部疾病或病症有效。
101.治疗患者中的眼部疾病或病症的方法，包括给予患者有效量的权利要求1的化合物。
102.权利要求1的化合物，其对于治疗年龄相关的黄斑变性有效。
103.治疗患者中的年龄相关的黄斑变性方法，包括给予患者有效量的权利要求1的化合物。
104.编码权利要求1-81的任一项的化合物的多核苷酸。
105.权利要求104的多核苷酸，其可操作性连接于启动子或增强细胞中多核苷酸表达的其它序列。
106.含有权利要求104或105的多核苷酸的细胞。
107.能够表达权利要求1-81的任一项的蛋白的重组载体。
108.表达权利要求1-81的任一项的蛋白的方法，所述方法在使得蛋白表达的条件下进行。
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