CN109021116A - 抗bcma抗原的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用。所述嵌合抗原受体包含抗原识别区，铰链区，跨膜区和胞内信号域；所述胞外识别区氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明提供的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，可有效清除表达BCMA的肿瘤靶细胞，并且对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。

Description

抗BCMA抗原的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用，还涉及包含靶向BCMA的嵌合抗原受体的病毒载体和应用。

背景技术

多发性骨髓瘤又称multiple myeloma，简写为MM，据统计MM的高发年龄段在65-74岁，并发症包括高钙血症，肾脏 机能不全、贫血和感染。虽然初次治疗MM对多种细胞毒性药物均较为敏感，但是由于高度异质性和耐药性MM复发概率高，目前不能治愈。2016年美国有30330名新生MM患者，有12650名患者死于MM，虽然中国国内没有系统的统计MM的发生率和病人生存情况，但是借鉴美国的数据可见目前已有的药物远不能解决MM患者的生存危机。而靶向CD19的CAR-T治疗在血液系统肿瘤中起到了较传统药物更优的疗效，利用CAR-T疗法治疗MM可能是一种可行并且有效的治疗方式。

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是模拟TCR功能的人工受体，包括一个肿瘤相关抗原结合区、一个胞外间隔区、一个跨膜区和一个胞内信号区。胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种共刺激分子相连，如4-1BB (CD137)，CD28，ICOS(CD278)。虽然靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞治疗在血液系统肿瘤治疗中取得了优异的成绩，但由于不同疾病所表达表面分子不同，MM细胞并不表达CD19，加之针对不同抗原不同抗体所激活的信号强度不同，因而筛选出针对MM的CAR组合仍然是CAR-T疗法治疗MM的关键点和难点。

BCMA全称为tumor necrosis factor receptor superfamily member 17，又称为B-cell maturation antigen （BCMA）或CD269或TNFRSF13A，主要表达于成熟B淋巴细胞和浆细胞表面，在MM组织和细胞中高表达，是治疗多发性骨髓瘤（MM）的合适的靶点。

常用的抗原识别区为单链抗体（scFV），然而并非所有抗BCMA的抗体来源的scFV均可作为CAR结构中抗原识别区，不同scFV的特异性、亲和力、稳定性以及与不同铰链区的连接均有可能导致构建的CAR转导的CAR-T细胞不能有效的靶向肿瘤细胞甚至发生脱靶。因此需要进行大量的筛选和研究寻找更稳定有效的识别BCMA的scFV和最佳的CAR组合方案。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，本发明靶向BCMA的嵌合抗原受体能够更稳定的表达于T淋巴细胞，能更好的清除表达BCMA抗原的肿瘤靶细胞。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

抗BCMA的嵌合抗原受体，由识别BCMA的单链抗体（scFV），铰链区，跨膜区和胞内信号组成；发明人选择8种抗BCMA抗体，通过筛选最优的VL和VH组合方式，筛选合适的Linker连接方式获得8种抗BCMA的scFV，进一步筛选和验证最佳的CAR组合方式，获得有效、稳定的抗BCMA的嵌合抗原受体。

进一步，抗BCMA抗原的嵌合抗原受体，其特征在于，包含识别BCMA的抗原识别序列，铰链区，跨膜区和胞内信号域；所述识别BCMA的抗原识别序列氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

进一步，编码所述识别BCMA的抗原识别序列核苷酸序列如SEQ ID NO.10或SEQ IDNO.11或SEQ ID NO.12所示。

在某些实施方案中，抗原识别区可以是任何可以与BCMA抗原结合的多肽，例如可与BCMA特异结合的配体、双特异抗体、scFV、任选的交联的Fab、F(ab)2、单域抗体以及连接有His-标签或HA-标签的scFV。

在某些实施例中特异性识别BCMA的scFV氨基酸序列如下所示：

EVQLQQSGPVLVKPGASVKMSCEASGYTFTDYYMNWVKQSHGKTLEWIGVINPYNGGTDYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARSVYDYPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSETDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSIEDPRTFGGGTKLEIK

在某些实施例中特异性识别BCMA的scFV氨基酸序列如下所示：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFGDYALSWFRQAPGKGLEWVGVSRSKAYGGTTDYAASVKGRFTISRDDSKSTAYLQMNSLKTEDTAVYYCASSGYSSGWTPFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIFNYHQRPSGVPDRFSGSKSGSSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGWVFGGGTKLTVLG

所述的嵌合抗原受体需要逾越两个技术障碍，一是寻找更稳定有效的识别BCMA抗原的scFV，二是寻找最佳的CAR的组合方案。

本发明的目的之一在于筛选出有效稳定的抗BCMA的scFV。

单链抗体（Single-chain variable fragment (scFv)）是由抗体的可变区（VH和VL区）通过15-20个氨基酸的短肽（Linker）连接而成，scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点，scFv的稳定性与Linker的选择密切相关。目前主要的连接方式为VH-Linker-VL，其Linker主要是由氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）连接形成的一个或多个GGGGS单位组成。发明人通过大量研究发现采用氨基酸序列为RGSTSGSGKPGSGEGSTKG的Linker连接的scFV组合的CAR能够获得优异的稳定性和有效性，并且选用RGSTSGSGKPGSGEGSTKG为Linker时仅有以VL-Linker-VH连接方式构建的单链抗体组合的CAR结构才能发挥scFV的活性和稳定性，促进CAR-T细胞的有效性。发明人通过反复筛选和验证最终优选出氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的3种有效的scFV和6种CAR组合方式，分别命名为：BCMA(3)CAR01、BCMA(4)CAR01、BCMA(10)CAR01、BCMA(3)CAR02、BCMA(4)CAR02、BCMA(10)CAR02，氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示；核苷酸序列如SEQ IDNO.22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示。表1为发明人前期筛选时选取的8种scFV抗体。

表1 识别BCMA的不同的scFV

进一步，编码铰链区核苷酸序列如SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示。

进一步，编码所述跨膜区核苷酸序列如SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO:18所示。

进一步，所述胞内信号域为CD28和/或CD137和/或CD3；编码所述CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO:19，编码所述CD137的核苷酸序列如SEQ ID NO:20，编码所述CD3的核苷酸序列如SEQ ID NO:21。

作为一种优选，所述胞内信号结构为CD28和CD3顺序串联。

作为一种优选，所述胞内信号结构为CD137和CD3顺序串联。

在某些实施方案中，包含本文所述多肽的嵌合抗原受体跨膜区可以来源CD4跨膜序列。

在某些实施方案中，包含本文所述多肽的嵌合抗原受体的铰链区可以来源CD7、CD8、IgG或IgD的跨膜序列。

在某些实施方案中，包含本文所述多肽的嵌合抗原受体的共刺激信号域选自OX40，CD2，CD27，CD28，CD40，4-1BB(CD137)，ICOS(CD278)，KIRDS2，KIRDS3，ITAM，NKG2D，NKG2C，在实施方案中，编码的共刺激结构域包含4-1BB，CD27，CD28或ICOS。

本发明的目的之二在于筛选出能够稳定表达，有效性高的CAR组合。

嵌合抗原受体细胞较单纯的抗体更具有治疗优势：（1）放大效应：CAR-T细胞在体内被激活后除了通过scFV区产生类似抗体的作用外，还会通过胞内信号将刺激作用层层放大进而达到更有效的清除肿瘤的作用；（2）耐受性好：因为更接近于体内天然的对抗肿瘤的方式，被转染的T细胞来源于病人自身，产生的耐药性远低于抗体治疗。

筛选最佳的嵌合抗原受体组合的方法，是保持抗原识别序列不变，对铰链区，跨膜区以及包内信号域进行随机组合；或者是保持铰链区，跨膜区以及包内信号域不变，筛选不同的抗原识别序列（scFV）。方法的结果存在随机性，只有在配置得当的情况下，其才能发挥识别目标肿瘤抗原并激活T细胞的作用。

进一步，编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示。

进一步，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示。

本部分保护的CAR的组合方式，经过测试之后，可以起到稳定表达于病人来源的T淋巴细胞，并且具有更好的清除肿瘤细胞的能力。

本发明的目的目的之三在于提供一种载体，所述载体选自慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、游离型载体或质粒。

进一步，所述的载体，其特征在于，包含用于质粒复制的原核复制子pUCOri序列；用于目的菌株大量扩增的含卡纳霉素或者氨苄青霉素抗性基因序列；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40Ori序列；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；用于嵌合抗原受体基因的真核转录的启动子；以及用于组成集靶点识别、信号传递、信号启动于一体的CAR编码基因。

在某些实施方案中，载体包含左(5')逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒导出元件、可操作地连接到编码本文所涵盖的CAR的多核苷酸的启动子和右(3')逆转录病毒LTR。

在某些实施方案中，CAR载体包含乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)或土拔鼠转录后调节元件(WPRE)；5'LTR的启动子经异源启动子置换，所述异源启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒 (Rous Sarcoma Virus，RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。

本发明的目的还在于提供一种所述的载体制备的病毒。

进一步，所述的病毒为慢病毒，所述的慢病毒转导细胞目的蛋白阳性表达率高，在病人细胞培养过程中很稳定。

在某些实施方案中，慢病毒载体3'LTR包含一个或多个修饰，在一些实施方案中，所述3'LTR包含一个或多个缺失，在一些实施方案中，所述3'LTR是自我失活(SIN)LTR。

在某些实施方案中，连接并启动本发明所述的CAR的多核苷酸启动子选自以下组群：巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、延伸因子1α启动子 (EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1启动子(PGK)、泛素-C启动子(UBQ-C)、巨细胞病毒增强子/鸡β- 肌动蛋白启动子(CAG)、多瘤病毒增强子/单纯疱疹胸苷激酶启动子(MC1)、β肌动蛋白启动子(β-ACT)、猿猴病毒40启动子(SV40)和骨髓增生肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失的、 dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子。

进一步，所述的载体能够作为靶向BCMA的药物或抗肿瘤药物组合物的成分。

本发明的目的还在于提供一种所述的病毒感染的细胞，所述细胞为免疫细胞或干细胞。

进一步，所述的细胞为T细胞，所述的T细胞是自体T细胞或异体T细胞。

在某些实施方案中，所述转导CAR基因的细胞可以是γδT细胞、CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞，或者CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞以特定的比例混合的细胞；在某些实施方案中，包含编码CAR基因的病毒转导NK细胞、单核细胞或巨噬细胞。

在某些实施方案中，CAR表达细胞还可以表达另外的活性剂或与活性剂联合应用，这些活性剂可以是免疫检查点抑制剂，如PD1/PDL1、TIM3、CTLA4、LAG3以及TGFRβ抑制剂等；在其他实施方案中，这些活性剂可以是多肽或融合蛋白，如PD-1-CD137-CD3分子形成的融合蛋白；在其他实施方案中，这些活性剂可以是抗体药物，如单抗药物、双特异性抗体药物等；在其他实施方案中，这些活性剂可以是激酶抑制剂，如酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼。

本发明的目的还在于提供一种所述的T细胞在靶向BCMA的药物或抗肿瘤药物中的应用。

在某些实施方案中，所述细胞在PI3K通路抑制剂存在下经活化和刺激。

在某些实施方案中，通过包含所述细胞的组合物进行应用，施用所述组合物的途径包括：口服、静脉注射、 腹膜输注、皮下注射以及肿瘤或器官局部给药。优选地，施用所述组合物的方法为：通过静脉内、腹膜内或皮下注射。

另外，回到发明的起源端，本发明的目的还在于提供一种所述识别BCMA抗原的scFv的氨基酸序列在用于制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。所述识别BCMA抗原scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

总的来说，本发明所述的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，不仅能维持靶向BCMA分子，通过结合细胞表面的BCMA分子达到杀灭多发性骨髓瘤的效果，并且能够加强CAR-T的增殖和杀伤肿瘤的能力，并且对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。

本发明的有益效果在于：

1）本发明提供的抗BCMA抗原的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，可以有效的清除表达BCMA抗原的肿瘤靶细胞，能维持靶向BCMA分子通过结合细胞表面的BCMA分子达到杀灭多发性骨髓瘤的效果，并且能够加强CAR-T的增殖和杀伤肿瘤的能力，对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。

2）本发明提供的通过改造的scFV组合的嵌合抗原受体，可以有效地降低CAR的免疫原性，增强CAR-T在体内的持续和安全性，降低肿瘤的复发几率。

附图说明

图1为不同BCMA-CAR结构图。

图2为不同CAR构建酶切结果。

图3为不同肿瘤细胞BCMA表达图

图4为不同CAR-T细胞杀伤能力检测。

图5为不同CAR-T细胞杀伤时因子分泌。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本部分实验通过对“现有技术”中的八种不同的单克隆抗体进行单链抗体的改造，将改造的单链抗体用于制备嵌合抗原受体，并对嵌合抗原受体进行功能验证试验。通过本部分的实验得出结论：虽然理论上“单链抗体”可以用于制备嵌合抗原受体，但实际并不是每一单链抗体都可以用于制备嵌合抗原受体。这需要发明人付出创造性的劳动，才能在众多的改造的单链抗体中找到具有预料不到的效果的产品。

实施例1含有BCMA scFV的嵌合抗原受体病毒的构建

为了构建更有效的针对BCMA的嵌合抗原受体我们利用8株抗体构建其scFV设计了BCMA(1)，BCMA(2)，BCMA(3)，BCMA(4)，BCMA(5)，BCMA(6)，BCMA(7)，BCMA(8)，BCMA(9)以及BCMA(10)共十组CAR，包含3种结构如图1所示。

1合成含有不同scFV的靶向BCMA的嵌合抗原受体的基因序列

合成依次含抗人BCMA抗原的不同的单链抗体ScFv， IgG4或人CD8铰链区（又称hinge区）、CD28跨膜区(简称为TM)，CD28和/或CD137和CD3共刺激信号组合而成的嵌合抗原受体，其结构如图1所示，由左至右分别为marker、原质粒和酶切质粒。

2构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体

设计如下引物，并将其由南京金斯瑞生物科技公司合成，具体引物如下：

引物1：5’-atcgctagcatggccctgccagtgaccgcc-3’，下划线为NheI限制性内切酶位点；

引物2：5’-ccaggtcgacttagcgagggggcagggcctg-3’，下划 线为SalI限制性内切酶位点。

然后以上述所示序列为引物，上述合成的各嵌合抗原受体序列为模板进行PCR扩增，反应体系按KOD FX NEO DNA聚合酶(购自TOYOBO公司)说明书加样，将扩增产物回收获得嵌合抗原受体DNA片段，将DNA回收片段送南京金斯瑞生物科技公司测序。

双酶切获得的编码嵌合抗原受体的基因序列和慢病毒表达载体pCDH-CAG(购至addgene Plasmid)，酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收后将目的片段和载体片段通过T4连接酶(购自Promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体。大肠杆菌表达后用质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。质粒酶切鉴定结果如图2所示，所有载体构建均正确。

3慢病毒的包装

本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤见分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)。

4慢病毒的纯化

将病毒上清收集后，离心过滤并移至新的50ml离心管；根据病毒上清量，分别加入PEG6000和4M NaCl进行纯化，纯化后的病毒分装，-80℃保存备用。制得病毒分别命名为：

BCMA(1)，BCMA(2)，BCMA(3)，BCMA(4)，BCMA(5)，BCMA(6)，BCMA(7)，BCMA(8)，BCMA(9)以及BCMA(10)

5慢病毒滴度测定

1）病毒感染293T细胞：感染前将293T细胞铺24孔板，向每孔细胞中加入1μl聚凝胺(Polybrene)溶液，然后将稀释后的病毒液分别加到293T细胞中，24h后用新鲜培养基换液，感染72h后于1000r/min条件下离心5min以收集细胞，抽提基因组。

2）抽提基因组：基因组抽提试剂盒为QIAamp DNA Blood Mini Kit购于Qiagen公司( 货号 511004)，按试剂盒说明书操作。

3）qRT-PCR测定病毒滴度：反应体系如下： Premix Ex TaqTM II(2× )10μl，上游引物1μl，下 游引物1μl，抽提的基因组1μl，RNase-Free dH2O 7μl。然后按如下程序进行扩增：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸 30s，反应结束后，用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度。计算结果显示，BCMA(5)，BCMA(6)和BCMA(9)病毒滴度低于1*10⁷不能正常转导T细胞，进行舍弃。

实施例2不同肿瘤细胞BCMA表达

培养至10天的肿瘤细胞Raji，NCI-H929分别收集到10ml离心管，利用 APC-BCMA抗体(BD公司)进行BCMA表达流式检测。

结果如图3所示，NCI-H929为高表达BCMA细胞，Raji为BCMA阴性细胞。

实施例3 CAR转染T细胞能力以及CAR-T细胞杀伤能力检测

一、BCMA-CAR转染T淋巴细胞能力检测

1 人外周血单核细胞的分离

利用梯度离心法分离人外周血单核细胞，获得PBMC细胞，加入含有10％FBS的RPMI1640完全培养基培养。

2 慢病毒载体感染T淋巴细胞

步骤1获得的单个核细胞PBMC，第1天加入抗CD3单克隆抗体活化；前3天进行慢病毒感染；加入5MOI对应的慢病毒载体，未感染的 T淋巴细胞作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500IU/ml重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基，继续培养10-20天。

在培养过程中对培养至10天的已感染病毒的T细胞，300g/min，离心5min，弃尽上清以收集细胞；用含有体积分数1％胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1×106个/ml；将收集的细胞分装最终标记Protein-L，4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测BCMA-CAR在T淋巴细胞表达阳性率。

BCMA（1）、BCMA（8）转染T淋巴细胞阳性率低，其他BCMA-CAR均可以较好的表达于T细胞表面。实验结果如表2统计：

表2：BCMA-CAR转染T细胞能力统计

实施例4 病毒感染CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤能力的影响

96孔板铺板，标记有萤火虫荧光素酶表达BCMA的肿瘤细胞（NCI-H929）1*10⁴每孔铺板，以效靶比8:1、 4:1铺效应细胞（CAR-T细胞），37度细胞培养箱分别共培养6小时后检测BCMA-CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力。结果如图4A和图4B所示，效靶比8:1和4：1能较好的区分不同CAR-T杀伤能力，除BCMA（7）外均具有较好杀伤效果，但是仅有BCMA（3）、BCMA（4）和BCMA（10）具有较好的特异性，表3为杀伤结果的统计数据。

表3：BCMA-CAR-T细胞不同效靶比杀伤阳性细胞能力统计

实施例5 CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤时因子分泌能力检测

细胞因子IFN-γ检测采用Elisa的方法，使用BD公司试剂盒进行。检测试剂盒货号：555142，生产批号6266958，具体步骤见试剂盒说明书。

测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。

结果如图5所示，显示效靶比为8:1CAR-T细胞杀伤靶细胞6小时后IFN-γ的分泌，BCMA（2）、BCMA（3）、BCMA（4）和BCMA（10）有较高的因子分泌能力。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 重庆精准生物技术有限公司

重庆精准生物产业技术研究院有限公司

<120> 抗BCMA抗原的嵌合抗原受体及其应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 247

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser

100 105 110

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val

115 120 125

Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val

130 135 140

Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met

145 150 155 160

His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala

165 170 175

Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly

180 185 190

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 2

<211> 248

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Ile

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro

130 135 140

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

145 150 155 160

Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Thr Leu Glu

165 170 175

Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln

180 185 190

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr

195 200 205

Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

210 215 220

Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Asp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 3

<211> 253

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 3

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Phe Asn Tyr His Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Arg

100 105 110

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro

130 135 140

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly

145 150 155 160

Asp Tyr Ala Leu Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

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Trp Val Gly Val Ser Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr

180 185 190

Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys

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<400> 15

aaaccgacca ccaccccggc gccgcgcccg ccgaccccgg cgccgaccat tgcgagccag 60

ccgctgagcc tgcgcccgga agcgcgcccg gcggcgggcg gcgcggtgca tacccgcggc 120

ctggattttg cgtgcgat 138

<210> 16

<211> 108

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 16

gcgccgccgc gcgcgagcgc gctgccggcg ccgccgaccg gcagcgcgct gccggatccg 60

cagaccgcga gcgcgctgcc ggatccgccg gcggcgagcg cgctgccg 108

<210> 17

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 17

atttatattt gggcgccgct ggcgggcacc tgcggcgtgc tgctgctgag cctggtgatt 60

accctgtatt gc 72

<210> 18

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 18

ttttgggtgc tggtggtggt gggcggcgtg ctggcgtgct atagcctgct ggtgaccgtg 60

gcgtttatta ttttttgggt g 81

<210> 19

<211> 123

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 19

cgcagcaaac gcagccgcct gctgcatagc gattatatga acatgacccc gcgccgcccg 60

ggcccgaccc gcaaacatta tcagccgtat gcgccgccgc gcgattttgc ggcgtatcgc 120

agc 123

<210> 20

<211> 132

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 20

gtgaaacgcg gccgcaaaaa actgctgtat atttttaaac agccgtttat gcgcccggtg 60

cagaccaccc aggaagaaga tggctgcagc tgccgctttc cggaagaaga agaaggcggc 120

tgcgaactgc gc 132

<210> 21

<211> 333

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 21

gtgaaattta gccgcagcgc ggatgcgccg gcgtatcagc agggccagaa ccagctgtat 60

aacgaactga acctgggccg ccgcgaagaa tatgatgtgc tggataaacg ccgcggccgc 120

gatccggaaa tgggcggcaa accgcgccgc aaaaacccgc aggaaggcct gtataacgaa 180

ctgcagaaag ataaaatggc ggaagcgtat agcgaaattg gcatgaaagg cgaacgccgc 240

cgcggcaaag gccatgatgg cctgtatcag ggcctgagca ccgcgaccaa agatacctat 300

gatgcgctgc atatgcaggc gctgccgccg cgc 333

<210> 22

<211> 1419

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 22

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgca gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120

ggcaaagcgc cgaaactgct gatttattat accagcaacc tgcatagcgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cgacctatta ttgccagcag tatcgcaaac tgccgtggac ctttggccag 300

ggcaccaaac tggaaattaa acgcggcagc accagcggca gcggcaaacc gggcagcggc 360

gaaggcagca ccaaaggcca ggtgcagctg gtgcagagcg gcgcggaagt gaaaaaaccg 420

ggcagcagcg tgaaagtgag ctgcaaagcg agcggcggca cctttagcaa ctattggatg 480

cattgggtgc gccaggcgcc gggccagggc ctggaatgga tgggcgcgac ctatcgcggc 540

catagcgata cctattataa ccagaaattt aaaggccgcg tgaccattac cgcggataaa 600

agcaccagca ccgcgtatat ggaactgagc agcctgcgca gcgaagatac cgcggtgtat 660

tattgcgcgc gcggcgcgat ttatgatggc tatgatgtgc tggataactg gggccagggc 720

accctggtga ccgtgagcag caaaccgacc accaccccgg cgccgcgccc gccgaccccg 780

gcgccgacca ttgcgagcca gccgctgagc ctgcgcccgg aagcgtgccg cccggcggcg 840

ggcggcgcgg tgcatacccg cggcctggat tttgcgtgcg atttttgggt gctggtggtg 900

gtgggcggcg tgctggcgtg ctatagcctg ctggtgaccg tggcgtttat tattttttgg 960

gtgcgcagca aacgcagccg cctgctgcat agcgattata tgaacatgac cccgcgccgc 1020

ccgggcccga cccgcaaaca ttatcagccg tatgcgccgc cgcgcgattt tgcggcgtat 1080

cgcagcgtga aatttagccg cagcgcggat gcgccggcgt atcagcaggg ccagaaccag 1140

ctgtataacg aactgaacct gggccgccgc gaagaatatg atgtgctgga taaacgccgc 1200

ggccgcgatc cggaaatggg cggcaaaccg cgccgcaaaa acccgcagga aggcctgtat 1260

aacgaactgc agaaagataa aatggcggaa gcgtatagcg aaattggcat gaaaggcgaa 1320

cgccgccgcg gcaaaggcca tgatggcctg tatcagggcc tgagcaccgc gaccaaagat 1380

acctatgatg cgctgcatat gcaggcgctg ccgccgcgc 1419

<210> 23

<211> 1422

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 23

gatattgtgc tgacccagag cccggcgagc ctggcggtga gcctgggcca gcgcgcgacc 60

attagctgcc gcgcgagcga aagcgtgagc attcatggca cccatctgat gcattggtat 120

cagcagaaac cgggccagcc gccgaaactg ctgatttatg cggcgagcaa cctggaaagc 180

ggcgtgccgg cgcgctttag cggcagcggc agcgaaaccg attttaccct gaacattcat 240

ccggtggaag aagaagatgc ggcgacctat ttttgccagc agagcattga agatccgcgc 300

acctttggcg gcggcaccaa actggaaatt aaacgcggca gcaccagcgg cagcggcaaa 360

ccgggcagcg gcgaaggcag caccaaaggc gaagtgcagc tgcagcagag cggcccggtg 420

ctggtgaaac cgggcgcgag cgtgaaaatg agctgcgaag cgagcggcta tacctttacc 480

gattattata tgaactgggt gaaacagagc catggcaaaa ccctggaatg gattggcgtg 540

attaacccgt ataacggcgg caccgattat aaccagaaat ttaaaggcaa agcgaccctg 600

accgtggata aaagcagcag caccgcgtat atggaactga acagcctgac cagcgaagat 660

agcgcggtgt attattgcgc gcgcagcgtg tatgattatc cgtttgatta ttggggccag 720

ggcaccctgg tgaccgtgag cagcaaaccg accaccaccc cggcgccgcg cccgccgacc 780

ccggcgccga ccattgcgag ccagccgctg agcctgcgcc cggaagcgtg ccgcccggcg 840

gcgggcggcg cggtgcatac ccgcggcctg gattttgcgt gcgatttttg ggtgctggtg 900

gtggtgggcg gcgtgctggc gtgctatagc ctgctggtga ccgtggcgtt tattattttt 960

tgggtgcgca gcaaacgcag ccgcctgctg catagcgatt atatgaacat gaccccgcgc 1020

cgcccgggcc cgacccgcaa acattatcag ccgtatgcgc cgccgcgcga ttttgcggcg 1080

tatcgcagcg tgaaatttag ccgcagcgcg gatgcgccgg cgtatcagca gggccagaac 1140

cagctgtata acgaactgaa cctgggccgc cgcgaagaat atgatgtgct ggataaacgc 1200

cgcggccgcg atccggaaat gggcggcaaa ccgcgccgca aaaacccgca ggaaggcctg 1260

tataacgaac tgcagaaaga taaaatggcg gaagcgtata gcgaaattgg catgaaaggc 1320

gaacgccgcc gcggcaaagg ccatgatggc ctgtatcagg gcctgagcac cgcgaccaaa 1380

gatacctatg atgcgctgca tatgcaggcg ctgccgccgc gc 1422

<210> 24

<211> 1437

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 24

cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcggcaccc cgggccagcg cgtgaccatt 60

agctgcagcg gcagcagcag caacattggc agcaacaccg tgaactggta tcagcagctg 120

ccgggcaccg cgccgaaact gctgattttt aactatcatc agcgcccgag cggcgtgccg 180

gatcgcttta gcggcagcaa aagcggcagc agcgcgagcc tggcgattag cggcctgcag 240

agcgaagatg aagcggatta ttattgcgcg gcgtgggatg atagcctgaa cggctgggtg 300

tttggcggcg gcaccaaact gaccgtgctg ggccgcggca gcaccagcgg cagcggcaaa 360

ccgggcagcg gcgaaggcag caccaaaggc gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc 420

ctggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg agctgcgcgg cgagcggctt tacctttggc 480

gattatgcgc tgagctggtt tcgccaggcg ccgggcaaag gcctggaatg ggtgggcgtg 540

agccgcagca aagcgtatgg cggcaccacc gattatgcgg cgagcgtgaa aggccgcttt 600

accattagcc gcgatgatag caaaagcacc gcgtatctgc agatgaacag cctgaaaacc 660

gaagataccg cggtgtatta ttgcgcgagc agcggctata gcagcggctg gaccccgttt 720

gattattggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagca aaccgaccac caccccggcg 780

ccgcgcccgc cgaccccggc gccgaccatt gcgagccagc cgctgagcct gcgcccggaa 840

gcgtgccgcc cggcggcggg cggcgcggtg catacccgcg gcctggattt tgcgtgcgat 900

ttttgggtgc tggtggtggt gggcggcgtg ctggcgtgct atagcctgct ggtgaccgtg 960

gcgtttatta ttttttgggt gcgcagcaaa cgcagccgcc tgctgcatag cgattatatg 1020

aacatgaccc cgcgccgccc gggcccgacc cgcaaacatt atcagccgta tgcgccgccg 1080

cgcgattttg cggcgtatcg cagcgtgaaa tttagccgca gcgcggatgc gccggcgtat 1140

cagcagggcc agaaccagct gtataacgaa ctgaacctgg gccgccgcga agaatatgat 1200

gtgctggata aacgccgcgg ccgcgatccg gaaatgggcg gcaaaccgcg ccgcaaaaac 1260

ccgcaggaag gcctgtataa cgaactgcag aaagataaaa tggcggaagc gtatagcgaa 1320

attggcatga aaggcgaacg ccgccgcggc aaaggccatg atggcctgta tcagggcctg 1380

agcaccgcga ccaaagatac ctatgatgcg ctgcatatgc aggcgctgcc gccgcgc 1437

<210> 25

<211> 1419

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 25

gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgca gcgcgagcca ggatattagc aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120

ggcaaagcgc cgaaactgct gatttattat accagcaacc tgcatagcgg cgtgccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaagattttg cgacctatta ttgccagcag tatcgcaaac tgccgtggac ctttggccag 300

ggcaccaaac tggaaattaa acgcggcagc accagcggca gcggcaaacc gggcagcggc 360

gaaggcagca ccaaaggcca ggtgcagctg gtgcagagcg gcgcggaagt gaaaaaaccg 420

ggcagcagcg tgaaagtgag ctgcaaagcg agcggcggca cctttagcaa ctattggatg 480

cattgggtgc gccaggcgcc gggccagggc ctggaatgga tgggcgcgac ctatcgcggc 540

catagcgata cctattataa ccagaaattt aaaggccgcg tgaccattac cgcggataaa 600

agcaccagca ccgcgtatat ggaactgagc agcctgcgca gcgaagatac cgcggtgtat 660

tattgcgcgc gcggcgcgat ttatgatggc tatgatgtgc tggataactg gggccagggc 720

accctggtga ccgtgagcag caaaccgacc accaccccgg cgccgcgccc gccgaccccg 780

gcgccgacca ttgcgagcca gccgctgagc ctgcgcccgg aagcgtgccg cccggcggcg 840

ggcggcgcgg tgcatacccg cggcctggat tttgcgtgcg atatttatat ttgggcgccg 900

ctggcgggca cctgcggcgt gctgctgctg agcctggtga ttaccctgta ttgcgtgaaa 960

cgcggccgca aaaaactgct gtatattttt aaacagccgt ttatgcgccc ggtgcagacc 1020

acccaggaag aagatggctg cagctgccgc tttccggaag aagaagaagg cggctgcgaa 1080

ctgcgcgtga aatttagccg cagcgcggat gcgccggcgt atcagcaggg ccagaaccag 1140

ctgtataacg aactgaacct gggccgccgc gaagaatatg atgtgctgga taaacgccgc 1200

ggccgcgatc cggaaatggg cggcaaaccg cgccgcaaaa acccgcagga aggcctgtat 1260

aacgaactgc agaaagataa aatggcggaa gcgtatagcg aaattggcat gaaaggcgaa 1320

cgccgccgcg gcaaaggcca tgatggcctg tatcagggcc tgagcaccgc gaccaaagat 1380

acctatgatg cgctgcatat gcaggcgctg ccgccgcgc 1419

<210> 26

<211> 1422

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 26

gatattgtgc tgacccagag cccggcgagc ctggcggtga gcctgggcca gcgcgcgacc 60

attagctgcc gcgcgagcga aagcgtgagc attcatggca cccatctgat gcattggtat 120

cagcagaaac cgggccagcc gccgaaactg ctgatttatg cggcgagcaa cctggaaagc 180

ggcgtgccgg cgcgctttag cggcagcggc agcgaaaccg attttaccct gaacattcat 240

ccggtggaag aagaagatgc ggcgacctat ttttgccagc agagcattga agatccgcgc 300

acctttggcg gcggcaccaa actggaaatt aaacgcggca gcaccagcgg cagcggcaaa 360

ccgggcagcg gcgaaggcag caccaaaggc gaagtgcagc tgcagcagag cggcccggtg 420

ctggtgaaac cgggcgcgag cgtgaaaatg agctgcgaag cgagcggcta tacctttacc 480

gattattata tgaactgggt gaaacagagc catggcaaaa ccctggaatg gattggcgtg 540

attaacccgt ataacggcgg caccgattat aaccagaaat ttaaaggcaa agcgaccctg 600

accgtggata aaagcagcag caccgcgtat atggaactga acagcctgac cagcgaagat 660

agcgcggtgt attattgcgc gcgcagcgtg tatgattatc cgtttgatta ttggggccag 720

ggcaccctgg tgaccgtgag cagcaaaccg accaccaccc cggcgccgcg cccgccgacc 780

ccggcgccga ccattgcgag ccagccgctg agcctgcgcc cggaagcgtg ccgcccggcg 840

gcgggcggcg cggtgcatac ccgcggcctg gattttgcgt gcgatattta tatttgggcg 900

ccgctggcgg gcacctgcgg cgtgctgctg ctgagcctgg tgattaccct gtattgcgtg 960

aaacgcggcc gcaaaaaact gctgtatatt tttaaacagc cgtttatgcg cccggtgcag 1020

accacccagg aagaagatgg ctgcagctgc cgctttccgg aagaagaaga aggcggctgc 1080

gaactgcgcg tgaaatttag ccgcagcgcg gatgcgccgg cgtatcagca gggccagaac 1140

cagctgtata acgaactgaa cctgggccgc cgcgaagaat atgatgtgct ggataaacgc 1200

cgcggccgcg atccggaaat gggcggcaaa ccgcgccgca aaaacccgca ggaaggcctg 1260

tataacgaac tgcagaaaga taaaatggcg gaagcgtata gcgaaattgg catgaaaggc 1320

gaacgccgcc gcggcaaagg ccatgatggc ctgtatcagg gcctgagcac cgcgaccaaa 1380

gatacctatg atgcgctgca tatgcaggcg ctgccgccgc gc 1422

<210> 27

<211> 1437

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 27

cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgcg agcggcaccc cgggccagcg cgtgaccatt 60

agctgcagcg gcagcagcag caacattggc agcaacaccg tgaactggta tcagcagctg 120

ccgggcaccg cgccgaaact gctgattttt aactatcatc agcgcccgag cggcgtgccg 180

gatcgcttta gcggcagcaa aagcggcagc agcgcgagcc tggcgattag cggcctgcag 240

agcgaagatg aagcggatta ttattgcgcg gcgtgggatg atagcctgaa cggctgggtg 300

tttggcggcg gcaccaaact gaccgtgctg ggccgcggca gcaccagcgg cagcggcaaa 360

ccgggcagcg gcgaaggcag caccaaaggc gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc 420

ctggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg agctgcgcgg cgagcggctt tacctttggc 480

gattatgcgc tgagctggtt tcgccaggcg ccgggcaaag gcctggaatg ggtgggcgtg 540

agccgcagca aagcgtatgg cggcaccacc gattatgcgg cgagcgtgaa aggccgcttt 600

accattagcc gcgatgatag caaaagcacc gcgtatctgc agatgaacag cctgaaaacc 660

gaagataccg cggtgtatta ttgcgcgagc agcggctata gcagcggctg gaccccgttt 720

gattattggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagca aaccgaccac caccccggcg 780

ccgcgcccgc cgaccccggc gccgaccatt gcgagccagc cgctgagcct gcgcccggaa 840

gcgtgccgcc cggcggcggg cggcgcggtg catacccgcg gcctggattt tgcgtgcgat 900

atttatattt gggcgccgct ggcgggcacc tgcggcgtgc tgctgctgag cctggtgatt 960

accctgtatt gcgtgaaacg cggccgcaaa aaactgctgt atatttttaa acagccgttt 1020

atgcgcccgg tgcagaccac ccaggaagaa gatggctgca gctgccgctt tccggaagaa 1080

gaagaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa tttagccgca gcgcggatgc gccggcgtat 1140

cagcagggcc agaaccagct gtataacgaa ctgaacctgg gccgccgcga agaatatgat 1200

gtgctggata aacgccgcgg ccgcgatccg gaaatgggcg gcaaaccgcg ccgcaaaaac 1260

ccgcaggaag gcctgtataa cgaactgcag aaagataaaa tggcggaagc gtatagcgaa 1320

attggcatga aaggcgaacg ccgccgcggc aaaggccatg atggcctgta tcagggcctg 1380

agcaccgcga ccaaagatac ctatgatgcg ctgcatatgc aggcgctgcc gccgcgc 1437

Claims (11)

1.抗BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，包含识别BCMA的抗原识别区，铰链区，跨膜区和胞内信号域；所述识别BCMA的抗原识别区氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，所述识别BCMA的抗原识别区为抗BCMA的单链抗体，编码所述单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO:18所示。

5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域为CD28和/或CD137和/或CD3；编码所述CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO:19；编码所述CD137的核苷酸序列如SEQ ID NO:20；编码所述CD3的核苷酸序列如SEQ ID NO:21。

6.根据权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示。

7.根据权利要求1-5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示。

8.载体，包含编码权利要求1-5任一项所述序列的核苷酸序列的载体，其中所述载体选自慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体或质粒。

9.权利要求8所述的载体转导的细胞，所述细胞可选自：干细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞或巨噬细胞。

10.权利要求8所述的细胞在制备靶向BCMA的药物或抗肿瘤药物中的应用。

11.如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列在制备CAR-T骨架中的抗原识别域的应用。