CN110540997A - 靶向bcma嵌合抗原受体、核酸序列、载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及靶向BCMA嵌合抗原受体、核酸序列、载体及应用，以及使用CAR细胞治疗癌症的组合物和方法。包括编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外结构域结合B细胞成熟抗原(BCMA)，并且分离的核酸序列包含SEQ ID NO：1，2或9的核酸序列。其中所述胞内结构域包含共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含选自CD27，CD28，4‑1BB，OX40，CD30，CD40，PD‑1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原‑1(LFA‑1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7‑H3及其任何组合的分子。

Description

靶向BCMA嵌合抗原受体、核酸序列、载体及应用

技术领域

本公开涉及修饰的细胞和用途，具体涉及使用靶向BCMA嵌合抗原受体(CAR)细胞治疗癌症的组合物和方法。

背景技术

B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA)，或CD269，是B细胞表面分子。BCMA由184个氨基酸组成，其胞内区含有80个氨基酸，胞外区序列很短，只有一个糖类识别结构域。在正常组织中，BCMA表达于成熟B细胞和浆细胞表面，在维持浆细胞的存活中起了重要的作用。

嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR T)技术是一种革命性的治疗肿瘤的方法。2011年8月10日，美国科学家在全球科学家二十多年的研究基础上，利用患者改造后的自身T细胞治愈了两位晚期慢性淋巴细胞白血病患者，开创了肿瘤生物治疗的新纪元。这种革命性的免疫细胞疗法就是嵌合抗原受体修饰的T细胞疗法，即CAR T疗法。

嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体，即CAR。患者的T细胞被“重编码”后，能够生成大量肿瘤特异性的CAR T细胞。

多发性骨髓瘤(MM)是浆细胞恶性肿瘤的恶性血液病，主要是通过骨髓和溶骨性病变的损害。骨痛，病理性骨折，贫血，出血，反复感染和免疫球蛋白异常的临床特征以肾功能受损为特征。基因靶向某些恶性肿瘤的T细胞已显示出巨大的临床结果。BCMA作为一种极为重要的B细胞生物标志物，是因为它的RNA总是在多发性骨髓瘤细胞中发现，并且该蛋白也被发现存在于多发性骨髓瘤患者恶行浆细胞表面。为了设计CAR T技术来治愈MM改善的患者，科学家需要开发有效靶向MM细胞表达的抗原。

本发明以BCMA作为CAR T细胞的靶点，在体外实验中显示了对靶细胞较强的杀伤作用，为接下来的临床实验和临床治疗奠定了良好的基础。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有骨髓瘤药剂不能导致持久缓解的问题，本发明提供一种靶向BCMA嵌合抗原受体，该靶向BCMA嵌合抗原受体具有特异性杀死来自骨髓瘤患者的浆细胞瘤的骨髓瘤细胞的功能，从而解决骨髓瘤患者不能持久缓解的问题。

2.技术方案

这里的实施方式涉及使用CAR细胞治疗癌症的组合物和方法。

一些实施方案涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞外结构域结合B细胞成熟抗原(BCMA)；所述分离的核酸序列包含SEQ ID NO：1，2或9的核酸序列。

一些实施方案涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外结构域结合B细胞成熟抗原(BCMA)且包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，涉及由前述的分离的核酸序列编码的嵌合抗原受体(CAR)。

在一些实施方案中，涉及一种CAR T细胞，所述的CAR T细胞是由前述的抗BCMA嵌合抗原受体修饰的T细胞。

一些实施方案涉及一种通过诱导T细胞应答治疗受试者的骨髓瘤药物，所述药物包括前述的CAR T细胞。

一些实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中诱导T细胞应答或治疗受试者的实体瘤或骨髓瘤的方法，所述方法包括：将包含SEQ ID NO：1，2或9核酸序列的核酸序列引入T细胞；并向受试者施用有效量的T细胞。

一些实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中诱导T细胞应答或治疗受试者的实体瘤或骨髓瘤的方法，所述方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞(即CAR T细胞)，所述CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述胞外结构域与B细胞成熟抗原(BCMA)结合并包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述细胞内结构域包含共刺激信号传导区域，所述共刺激信号传导区域包含选自CD27，CD28，4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能-相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其任何组合的分子。例如SEQIDNO：11，12，13，14的序列。

在一些实施方案中，细胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域。

一些实施方案涉及包含如上所述的分离的核酸序列的载体。

一些实施方案涉及包含如上所述的分离的核酸序列的分离的细胞。

一些实施方案涉及包含如所描述的包含CAR的T细胞群体的组合物。

在一些实施方案中，涉及如前所述的CAR T细胞在制备多发性骨髓瘤治疗药物中的应用。

本发明内容并非旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也并非旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的基于BCMA的嵌合抗原受体，通过嵌合了BCMA的scFv片段，以及共刺激分子，能够增强CAR T细胞扩增能力以及T细胞与抗原的结合能力；

(2)本发明所述的含有基于BCMA的嵌合抗原受体的T细胞在体外表现出很好的靶向性，对阳性表达的细胞有极强的杀伤能力；CAR T细胞在体内实验中，同样显示出很好的肿瘤靶向性和极好的治疗效果。

附图说明

参照附图描述具体实施方式。在不同附图中使用相同的参考数字表示类似或相同的项目。

图1是示出CAR结构的示例的示意图。

图2显示基于抗BCMA CAR T细胞和BCMA-K562细胞的共培养的杀伤测定结果。

图3是显示抗BCMA CAR T细胞抑制K562-BCMA细胞生长的直方图。

图4显示了根据本公开内容的实施方案的表现CAR T细胞的体内抗肿瘤活性的存活系。

详细说明

定义

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有如本公开所属的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本公开的实践或测试中可以使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。对于本公开的目的，下列术语定义如下。

本文使用冠词“一(a)”和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件”表示一个元件或多于一个元件。

“约”是指与参考量、水平、值、数量、频率、百分比、量纲、大小、用量、重量或长度相比，量、水平、值、数量、频率、百分比、量纲、大小、用量、重量或长度的变化高达30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。

如本文所使用的，术语“活化”指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”尤其指的是正经历细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性或功能即可。本公开中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)₂，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人，1999年，载于：《使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:A Laboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社，纽约；Harlow等人，1989年，载于：《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，冷泉港，纽约；Houston等人，1988年，《美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci)》85:5879-5883；Bird等人，1988年，《科学(Science)》242:423-426)。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常包含抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由一个重链和一个轻链可变区结构域通过紧密的、非共价结合的二聚体组成。通过这两个结构域的折叠来提供用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗原抗体特异性结合的六个高变环(3个环各自来自H和L链)。但是，甚至单个可变结构域(或者仅仅包括抗原特异的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力比完整结合位点低。如本文所使用的，“抗体重链”指的是以它们天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两类多肽链中较大的一类。如本文所使用的，“抗体轻链”指的是以它们天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两类多肽链中较小的一类。κ和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。

如本文所使用的，术语“合成抗体”是指利用重组DNA技术产生的抗体，例如，如本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指通过编码抗体的DNA分子的合成而产生的抗体，并且所述DNA分子表达抗体蛋白质，或表示抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列是利用本领域可用且公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得的。

如本文所使用的术语“抗原”被定义为引起免疫应答的分子，其可以涉及抗体产生或特定的免疫活性细胞的活化或两者。抗原可以包括任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，或来源于重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。此外，可以从包括组织样本，肿瘤样本，细胞或生物流体的生物样本产生，合成或衍生抗原。

如本文所使用的，术语“抗肿瘤作用”指的是与肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数量的减少、转移数量的减少、具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命的增加，或者与癌性病症相关的各种生理症状的改善相关的生物学效应。“抗肿瘤作用”也可由本公开的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤首次出现的能力表示。

术语“自体抗原”指的是由免疫系统错误识别为外源的抗原。自体抗原包括细胞蛋白质、磷蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

术语“自体的”用于描述源自相同个体的物质，所述物质随后被再次引入到个体中。

“同种异体的”用于描述源自相同物种的不同动物的移植物。

“异种异体的”用于描述源自不同物种的动物的移植物。

如本文所使用的，术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其它部位。各种癌症的实例包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。

在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含”和“包括”将被理解为指包括所陈述的步骤或元素或者步骤或元素的集合，但是不排除任何其它步骤或元素或者步骤或元素的集合。

“由……组成”是指包括并且限于短语“由……组成”之后所描述的内容。因此，短语“由……组成”表示所列元素是必要的或强制性的，并且其它元素可以不存在。

“基本上由……组成”是指包括该短语后面列出的任何元素，并且限于对本公开中针对所列元素说明的活性或作用不干扰或无贡献的其它元素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列元素是必要的或强制性的，但是其它元素是任选的，并且根据它们是否影响所列元素的活性或作用可以存在或不存在。

术语“互补的”和“互补”指的是通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即核苷酸的序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”是互补的。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对原则进行匹配。或者，核酸之间可存在“完全”或“总体”的互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。

“对应于”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补的核酸序列或编码与肽或蛋白质中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸；或者(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸的序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的同源共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，APC，树突细胞，B细胞等)上的分子，由此提供信号除了通过例如TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子的结合提供的主要信号之外，还介导包括增殖，活化，分化等中的至少一种的T细胞应答。共刺激配体可以包括B7-1(CD80)，B7-2(CD86)，PD-L1，PD-L2,4-1BBL，OX40L，诱导型共刺激配体(ICOS-L)，细胞间粘附分子ICAM)，CD30L，CD40，CD70，CD83，HLA-G，MICA，MICB，HVEM，淋巴毒素β受体，3/TR6，ILT3，ILT4，HVEM，CD7的配体，结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体尤其还包括与存在于T细胞上的共刺激分子如CD27，CD28,4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1特异性结合的激动剂或抗体，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3和与CD83特异性结合的配体。

“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，例如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子，BTLA和Toll样受体。

“共刺激信号”指的是与初级信号(诸如TCR/CD3接合)结合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。

如本文所使用的，术语“疾病”和“病症”可以互换使用，或者可以是不同的，因为特殊的疾病或病症可以不具有已知的致病因子(因此不能用病因学解决)，因此其不被公认为疾病而是为不合适的病症或症状，其中临床医师已经鉴定出或多或少的特异系列症状。如本文所使用的，“疾病”是受试者的一种健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果不改善该疾病，则受试者的健康继续恶化。与之相比，受试者中的“紊乱”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但是其中动物的健康状态与它没有处于该紊乱相比不太有利。保持不治疗，紊乱不一定引起动物健康状态的进一步降低。

如本文所使用的，术语“有效的”是指足以实现所期望的、预期的或意图的结果。例如，“有效量”可以是足以产生治疗性或预防性益处的化合物的量。

“编码”指的是多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中核苷酸的特异性序列在生物学过程中用作合成其它聚合物和大分子的模板的固有性质，所述聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由其产生的生物学性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其它产物。

关于多核苷酸，术语“外源”是指在野生型细胞或生物体中不天然存在但通常通过分子生物学技术被引入细胞中的多核苷酸序列。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体，质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸，术语“内源的”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸序列。而且，从第一生物体分离并通过分子生物学技术转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是关于第二生物体的“外源”多核苷酸。在具体的实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，例如产生另外天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外的拷贝，从而有助于过表达编码的多肽。

如本文所使用的，术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

“同源的”指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比为两个序列共有的匹配或同源位置数除以被比较的位置数再乘以l00所得的函数。例如,如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％的同源性。通常，当两个序列进行比对给出最大同源性时才进行比较。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”指的是起到抗体作用的一类蛋白质。包括在该类蛋白质中的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物(诸如唾液、泪液、母乳)、胃肠分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在多数受试者的初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是在凝集、补体结合和其它抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗体功能但可用作抗原受体的免疫球蛋白。IgE是在暴露于过敏原后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。

“分离的”是指基本上或实质上不含通常在其天然状态下附带着的成分的物质。例如，如本文所使用的，“分离的多核苷酸”指的是在天然存在的状态下被来自其两侧的序列所纯化的多核苷酸，例如从正常毗邻于所述片段的序列所移除的DNA片段。可选地，如本文所使用的，“分离的肽”或“分离的多肽”等指的是肽或多肽分子从其天然细胞环境中的体外分离和/或纯化，以及与细胞的其它成分关联。

在本公开的上下文中，使用下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，以及“U”指的是尿苷。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并版本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，在一定程度上编码蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含(一个或多个)内含子。

如本文所使用的，“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属。在逆转录病毒中，慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可以将显著量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，所以它们是基因传递载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV是慢病毒的所有实例。源自慢病毒的载体提供了实现显著水平的基因体内转移的工具。

如本文所使用的，术语“调节”是指与缺少治疗或化合物的受试者中的应答水平相比，和/或与在另外相同但未治疗的受试者中的应答水平相比，介导受试者中的应答水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导受试者、优选人中的有益的治疗性应答。

当使一核酸与另一核酸序列处于功能性关系时，所述核酸即是“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA被表达为参与多肽的分泌的前蛋白，则其可操作地连接至所述多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位成便于翻译，则其可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读相。然而，增强子不一定是连续的。连接是通过在方便的限制性位点进行接合而实现的。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或连接子。

术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意在表示相对于在来自组织或器官的正常细胞中的表达水平，肿瘤抗原在来自患者的特异性组织或器官内的疾病区域(如实体肿瘤)的细胞中的异常表达水平。患有特征在于肿瘤抗原的过表达的实体肿瘤或恶性血液疾病的患者可以通过本领域中已知的标准测定法来确定。

免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括，例如，皮下注射(s.c.)、静脉内注射(i.v.)、肌内注射(i.m.)、或胸骨内注射、或输液技术。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等等在本文中可互换使用，并且指的是不论是在体外或原位服从本文所描述的方法的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施例中，患者、受试者或个体是人。在一些实施例中，术语“受试者”意在包括可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。

如本文所使用的，叙述“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通常指的是长度为至少10个碱基的聚合体形式的核苷酸，所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的经修饰形式。该术语包括DNA和RNA的单链和双链形式。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示出实质序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过添加，缺失或取代至少一个核苷酸而与参考多核苷酸区分的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸置换的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知，可以对参照多核苷酸进行包括突变，添加，缺失和取代在内的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物学功能或活性或具有与参考多核苷酸的关系(即优化的)。多核苷酸变体包括例如与参考多核苷酸序列具有至少50％(以及至少51％至至少99％和全部整数百分比之间，例如90％，95％或98％)序列同一性的多核苷酸在此描述。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括编码这些酶的天然存在的等位基因变体和直向同源物。

“多肽”，“多肽片段”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化(即增加各种化学反应的速率)的酶促多肽或“酶”。

术语多肽“变体”指的是通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代而区别于参考多肽序列的多肽。在某些实施例中，多肽变体通过一个或多个取代基而区别于参考多肽，所述取代基可以是保守的或非保守的。在某些实施例中，所述多肽变体包含保守性取代基，并且在这方面，本领域中很好理解的是，一些氨基酸可以被改变为具有广泛相似性质的其它氨基酸，而不改变多肽的活性性质。多肽变体还包括其中一个或多个氨基酸被添加或缺失，或用不同的氨基酸残基置换的多肽。

如本文所使用的，术语“启动子”被定义为通过细胞的合成机制，或引入的合成机制识别的DNA序列，它是启动多核苷酸序列的特异性转录所必需的。表达“控制序列”指的是在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如适于原核生物的控制序列包括启动子，任选地包括操纵子序列和核糖体结合位点。真核细胞已知利用启动子、多腺苷酸化信号，以及增强子。

术语“结合”，“结合”或“与......相互作用”是指一个分子识别并粘附于样品或生物体中的特定第二分子，但基本上不识别或粘附于样品中其他结构不相关的分子。如本文关于抗体所使用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但实质上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不改变抗体的特异性分类。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位形式。然而，这种交叉反应性本身并不改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性结合”可用于指抗体，蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，意指相互作用取决于存在在化学物质上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)；例如，抗体通常识别并结合特定的蛋白质结构而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中含有表位A(或游离的，未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。

“统计学上显著的”是指结果不太可能是偶然发生的。统计显著性可通过本领域已知的任何方法来确定。通常使用的显著性测量值包括P值，它是在无效假设是真的情况下所观察到的事件将发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则无效假设被拒绝。在简单的情况下，显著性水平被限定在0.05或更小的p值。“下降的”或“减少的”或“更少的”量通常是“统计学上显著的”或生理学上显著的量，并且可以包括是本文中描述的量或水平的约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括在之间和在1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的下降。

术语“刺激”是指通过将刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合而诱导的初级应答，由此介导信号转导事件，诸如经TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织等等。

“刺激分子”是指特异性结合存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体的T细胞上的分子。例如，源自刺激分子的功能性信号传导结构域是与T细胞受体复合物相关的ζ链。

“刺激配体”指的是当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B-细胞等等)上时，可与T细胞上的同源结合配偶体(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合的配体，由此介导T细胞的初级应答，包括活化、免疫应答的开始、增殖等等。刺激配体在本领域中是公知的，并且尤其包括负载有肽的MHC I类分子、抗-CD3抗体、超激动剂抗-CD28抗体，以及超激动剂抗-CD2抗体。

如本文所使用的，“基本上纯化的”细胞为基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与在其天然存在状态下与其正常相关联的其它细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其它情况下，该术语仅仅指的是已经与在其天然状态下与其自然相关联的细胞分离的细胞。在一些实施例中，细胞在体外培养。在其它实施例中，细胞不在体外培养。

如本文所使用的，术语“治疗的”表示治疗和/或预防。治疗作用通过疾病状态的抑制、缓和或根除而获得。

术语“治疗有效量”是指将引起研究人员，兽医，医生或另一临床医生正在寻求的组织，系统或受试者的生物或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种症状或症状的发展或在一定程度上减轻所述病症或疾病的一种或多种症状或症状的量的化合物。治疗有效量将取决于待治疗的受试者的化合物，疾病及其严重程度和年龄，体重等而变化。

如本文所使用的术语，“治疗”疾病是指降低受试者经历的疾病或紊乱的至少一种迹象或症状的频率或严重性。

如本文所使用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是外源核酸被转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经由外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其子代。

如本文所使用的，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”是指启动子在相对于多核苷酸的正确位置和朝向上，以控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。

“载体”是包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。本领域已知许多载体，包括线性多核苷酸，与离子或两亲化合物相关的多核苷酸，质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应该解释为包括促进核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，例如多聚赖氨酸化合物，脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体，腺伴随病毒载体，逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag，pol和env之外还含有其他具有调控或结构功能的基因。慢病毒载体在本领域中是公知的。慢病毒的一些例子包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1，HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。已经通过多重减毒HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如，缺失基因env，vif，vpr，vpu和nef使得载体生物安全。

范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本公开的范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围的描述诸如从1至6应被认为具有具体公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点都是适用的。

本公开涉及分离的核酸序列、包括分离的核酸序列的载体、包括分离的核酸序列的细胞和使用这些细胞治疗癌症的方法。

组合物和治疗应用

本公开的实施方案涉及使用嵌合抗原受体(CAR)细胞治疗癌症。一些实施方案涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外结构域结合B细胞成熟抗原(BCMA)和分离的核酸序列包含SEQID NO：1，2或9的核酸序列。

一些实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中诱导T细胞应答或治疗受试者的实体瘤的方法，所述方法包括：将包含SEQ ID NO：1，2或9的核酸序列的核酸序列引入T细胞；并向受试者施用有效量的T细胞。

一些实施方案涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外结构域结合B细胞成熟抗原(BCMA)和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

一些实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中诱导T细胞应答或治疗受试者的实体瘤的方法，所述方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞，所述CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述胞外结构域与B细胞成熟抗原(BCMA)结合并包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列。

受试者中的t细胞应答是指与辅助细胞，杀伤细胞，调节细胞和其他类型T细胞相关的细胞介导的免疫。例如，T细胞应答可能包括一些活动，例如协助免疫过程中的其他白细胞以及识别和破坏病毒感染细胞和肿瘤细胞。受试者中的T细胞应答可以通过各种指标测量，例如T细胞杀死的病毒感染细胞和/或肿瘤细胞的数量，T细胞在与病毒感染细胞共培养时释放的细胞因子和/或肿瘤细胞的数量，受试者中T细胞的增殖水平，T细胞的表型变化(例如对记忆T细胞的变化)以及受试者中T细胞的水平寿命或寿命。

在一些实施方案中，体外杀伤测定可以通过将CAR T细胞与抗原阳性细胞共培养来测量CAR T细胞的杀伤效力来进行。通过显示与CAR T细胞共培养的相应抗原阳性细胞的数量减少以及IFNγ，TNFα等的释放增加，与不表达相应抗原的对照细胞相比，可以认为CART细胞对相应的抗原阳性细胞具有杀伤作用。此外，可以测试CAR T细胞的体内抗肿瘤活性。例如，可以使用本文描述的抗原在免疫缺陷小鼠中建立异种移植物模型。在过去的二十年中，人类癌细胞或肿瘤活组织检查异种移植到免疫缺陷啮齿类动物(异种移植模型)中已成为开发新型癌症治疗剂的主要临床前筛选(Song等人，Cancer Res.PMC2014Aug 21，Morton等，Nature Protocols，2，247-250(2007))。为了评估体内CAT T细胞的抗肿瘤活性，携带肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠评估CAR T的抗肿瘤活性(例如小鼠肿瘤和小鼠血液IFNγ，TNFα等的减少和/或CAR T在小鼠骨髓/外周血/脾中保留的时间)。

术语“嵌合抗原受体”或者“CAR”是指包含至少一个细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，细胞质结构域)的重组多肽构建体。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域处于相同的多肽链(例如，包含嵌合融合蛋白)或彼此不连续(例如，在不同的多肽链中)。

在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包括来源于如上所述的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括源自主信号传导结构域(例如CD3-Zeta的主要信号传导结构域)的功能性信号传导结构域。在其他实施方案中，细胞内信号传导结构域诸如FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CDS，CD22，CD79a，CD79b，CD278，FccRI，CD66d，DAP10和DAP12。例如，CD3ζ和FcRγ均显示为CAR分子的功能性主信号传导结构域(Eshhar等人，通过嵌合由抗体结合结构域和免疫球蛋白和T细胞受体的γ或ζ亚基组成的单链特异性激活和靶向细胞毒性淋巴细胞，PNAS，1993年1月15日；90(2)：720-4)。此外，多年来已开发了另外的基于非CD3ζ的CAR构建体(Wang等人，“基于杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的嵌合抗原受体(CAR)触发实体肿瘤中的可靠细胞毒性活性”Molecular Therapy，第22卷，No.Suppl.1，2014年5月)。

在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域还包括来自至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。共刺激信号传导区是指CAR的一部分，包括共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原有效应答所需的。

在CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间，可以掺入间隔区。如本文所用，术语“间隔结构域”通常意指用于将跨膜结构域连接至多肽链中的细胞外结构域或胞质结构域的任何寡肽或多肽。间隔区可包含多达300个氨基酸，优选10-100个氨基酸，最优选25-50个氨基酸。

CAR的细胞外结构域可以包括靶向特定肿瘤标志物(例如，肿瘤抗原)的抗原结合结构域(例如，scFv，单结构域抗体或TCR(例如，TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域)肿瘤抗原)。肿瘤抗原是由引起免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质，特别是T细胞介导的免疫应答。肿瘤抗原是本领域众所周知的，包括例如神经胶质瘤相关抗原，癌胚抗原(CEA)，β-人绒毛膜促性腺激素，甲胎蛋白(AFP)，凝集素反应性AFP，甲状腺球蛋白，RAGE-1，MN-CA IX，人端粒酶逆转录酶RU1，RU2(AS)，肠羧基酯酶，mut hsp70-2，M-CSF，前列腺，前列腺特异性抗原(PSA)，PAP，NY-ESO-1，LAGE-p53，prostein，PSMA，Her2/neu，生存素和端粒酶，前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)，MAGE，ELF2M，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，肝配蛋白B2，CD22，胰岛素生长因子(IGF)，IGF-I受体和间皮素。例如，肿瘤抗原是CD19，其CAR可以称为CD19CAR。

在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含scFv，其包含通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区。单链可变区片段通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备(Bird等人，Science242：423-426,1988)。连接肽的实例是具有氨基酸序列(GGGGS)₃(SEQ ID：15)的GS接头，其在一个可变区的羧基末端与另一个可变区的氨基末端之间桥接大约3.5nm。其他序列的接头已被设计和使用(Bird等，1988，同上)。通常，接头可以是短而灵活的多肽，并且优选包含约20个或更少的氨基酸残基。接头可以进行修改以实现附加功能，例如药物附着或附着到固体支持物上。单链变体可以重组或合成产生。对于scFv的合成生产，可以使用自动合成器。为了重组生产scFv，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒导入合适的宿主细胞，真核细胞例如酵母，植物，昆虫或哺乳动物细胞，或原核细胞例如大肠杆菌。编码目标scFv的多核苷酸可以通过常规操作例如连接多核苷酸来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离得到scFv。

在一些实施方案中，肿瘤抗原包括HER2，CD19，CD20，CD22，Kappa或轻链，CD30，CD33，CD123，CD38，ROR1，ErbB3/4，EGFR，EGFRvIII，EphA2，FAP，癌胚抗原，EGP2，间皮素，TAG72，PSMA，NKG2D配体，B7-H6，IL-13受体α2，IL-11受体α，MUC1，MUC16，CA9，GD2，GD3，HMW-MAA，CD171，Lewis Y，G250/CAIX，HLA-AI MAGE A1，HLA-A2NY-ESO-1，PSC1，叶酸受体-α，CD44v7/8,8H9，NCAM，VEGF受体，5T4，胎儿AchR，NKG2D配体，CD44v6，TEM1，TEM8或病毒相关由肿瘤表达的抗原。在一些实施方案中，CAR的结合元件可以包括任何抗原结合部分，所述抗原结合部分当与其同源抗原结合时影响肿瘤细胞，使得肿瘤细胞不能生长或促进死亡或消失。

在一些实施方案中，所述细胞内结构域包含共刺激信号传导区域，所述共刺激信号传导区域包含选自CD27，CD28,4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能-相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其任何组合。

在一些实施方案中，细胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施方案中，分离的核酸序列包含SEQ ID NO：1或3的核酸序列。

一方面，一些实施方案涉及包含如上所述的分离的核酸序列的载体。

在一个方面，一些实施方案涉及包含如上所述的分离的核酸序列的分离的细胞。

一方面，一些实施方案涉及包含如上所述的包含CAR的T细胞群体的组合物。

在一个方面，一些实施方案涉及由如上所述的分离的核酸序列编码的CAR。

在一些实施方案中，核酸序列编码另一分子(例如，集群PD-1)和CAR，被表达为分离多肽的基因产物。例如，可以实施通过脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点序列生成编码CD19CAR和树干PD-1的慢病毒载体以获得分离的多肽(参见含有CD137信号转导结构域的嵌合受体介导增强的T细胞存活和增加的抗白血病Efficacy In Vivo Molecular Therapy，第17卷，第8期，1453-1464，2009年8月，在此引入作为参考)。

编码所需分子的核酸序列可以使用本领域中已知的重组方法获得，例如使用标准技术通过从表达基因的细胞筛选文库、通过从已知包括基因的载体衍生该基因，或者通过直接从含有基因的细胞或组织中分离该基因而获得。可选地，也可以合成而非克隆生产目标的基因。

本公开的实施方式还涉及其中插入本公开内容的DNA的载体。源自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定整合并在子细胞中增殖。慢病毒载体相对于来源于诸如鼠白血病病毒等的逆转录病毒载体的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。

编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与一个或多个启动子可操作地连接并将该构建体整合到表达载体中来实现。载体可以适合于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子，起始序列和可用于调节所需核酸序列表达的启动子。

关于编码CAR的基因转移到哺乳动物细胞中的表达合成核酸的其它信息在美国专利US8,906,682号通过引用整体并入本文。

实施方式还涉及用于治疗患者的疾病的方法，包括向患者施用有效量的本公开的工程细胞。根据本发明的方法可以治疗各种疾病，包括癌症，如卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，多形性成胶质细胞瘤，前列腺癌和白血病。在一些实施方案中，所述方法包括向人类患者施用包含抗肿瘤有效量的人类T细胞群体的药物组合物，其中所述群体的人类T细胞包括人类T细胞，所述人类T细胞包含如目前披露。

术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种手段表现的生物学效应，包括但不限于例如肿瘤体积减小，肿瘤细胞数量减少，数量减少预期寿命的增加，肿瘤细胞增殖的减少，肿瘤细胞存活的减少或与癌症相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤效应”也可以通过本发明的肽，多核苷酸，细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来表现。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤(诸如血液性肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体肿瘤。利用本公开的CAR治疗的癌症的类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、以及恶性肿瘤,例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症。

血液性癌症为血液或骨髓的癌症。血液性(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(不活跃形式和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体肿瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体肿瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体肿瘤(诸如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴类恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合性神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。

例如，肾细胞癌是常见的恶性肿瘤之一。早期肾细胞癌患者的治疗可以通过手术切除达到90％的5年生存率。然而，具有晚期扩散和转移的晚期患者的五年存活率仅为约10％，参考文献(National Cancer Institute：SEER Stat Fact Sheets：Kidney andRenal Pelvis Cancer.Bethesda，MD：National Cancer Institute；在线提供，上次访问时间为2017年11月2日)。胰腺癌是消化道恶性肿瘤，非常恶性，难以诊断和治疗。虽然医疗技术在过去的二十年里有了很大的提高，但在胰腺癌的诊断和治疗中仍然存在很多问题。由于初始诊断较低，胰腺癌在发现时往往有转移。因此，低于20％的手术切除患者和平均5年生存率低于10％的患者。(美国癌症协会：癌症事实和数据2018年，乔治亚州亚特兰大：美国癌症协会，2018年。在线提供，最后访问时间为2018年1月5日)。尿路上皮癌是从泌尿系统的尿路上皮细胞发展而来的癌症，是一种相对罕见的恶性肿瘤。尽管早期诊断率高，早期治疗有效，但尿路上皮癌仍是一种复发率高，易于发展，预后差的恶性肿瘤。子宫内膜癌是指一组起源于子宫内膜的上皮恶性肿瘤。子宫内膜癌是女性生殖道三大恶性肿瘤之一。早期患者的5年生存率为但晚期患者的疗效较差。乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，女性频繁发病率高，由于医疗手段的不断提高，乳腺癌的生存机会得到明显改善，五年生存率可以达到90％以上。但对于三重阴性的乳腺癌治疗仍然非常棘手，肿瘤细胞侵袭力强，预后差。前列腺癌是男性生殖系统最常见的癌症，多为男性老年患者，是美国第二大致命癌症，据统计，早期前列腺癌的5年生存率可达90％，但晚期前列腺癌患者5年生存率仅为30％。食管癌是由食管引起的癌症，近几十年来食管癌的发病率有所上升。预后不良的主要原因是大多数患者在诊断时往往已经局部晚期或有远处转移。大多数卵巢癌患者(60％)被诊断为远期疾病，其5年生存率为29％。卵巢癌的总体5年相对生存率很低(47％)。结肠直肠癌是一种常见的恶性肿瘤。除遗传因素外，结直肠癌与高脂肪，高蛋白质和低纤维饮食习惯密切相关。美国等国家大肠癌的发病率较高，5年相对生存率约为60％。总结这些癌症的现状，似乎对癌症的治疗仍有很长的路要走，并且仍然迫切需要开发治疗这些癌症的新方法。

通常，如本文所述的活化和扩增的细胞可以用于治疗和预防免疫受损的个体出现的疾病。特别地，本公开的工程化细胞用于治疗癌症。在某些实施例中，本公开的细胞用于治疗处于发展成癌症的风险中的患者。因此，本公开提供用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包含向需要其的受试者施用治疗有效量的本公开的工程化T细胞。

本公开的工程化T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其它成分(诸如IL-2或其它细胞因子或细胞群)结合施用。简单地说，本公开的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括：缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。本公开的组合物优选配制成用于静脉内施用。

本公开的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的量和频率将由以下因素确定，诸如患者的病症、以及患者疾病的类型和严重度，尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本公开的组合物的精确量可由医师通过考虑个体的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度，以及患者(受试者)的状态的差异而确定。可以概括地说：包含本文所描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量施用,包括那些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。所述细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输液技术施用(参见例如Rosenberg等人，新英格兰医学杂志319:1676，1988年)。对于特殊患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域技术人员通过监测患者的疾病迹象并相应地调节治疗容易地确定。

在某些实施方案中，可能期望将活化的T细胞给予受试者，然后根据本公开内容重新绘制血液(或进行单采血液成分术)，从其活化T细胞，并用这些活化和扩增的T细胞再灌注患者。这个过程可以每隔几个星期进行多次。在某些实施方案中，T细胞可以从10cc至400cc的抽血活化。在某些实施方案中，从20cc，30cc，40cc，50cc，60cc，70cc，80cc，90cc或100cc的抽血活化T细胞。不受理论束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案，可以选择某些T细胞群体。

受试者组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过雾化吸入、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可经皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施例中，本公开的T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用给患者。在另一个实施例中，本公开的T细胞组合物优选地通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。

在本公开的某些实施方案中，使用本文所述的方法或本领域已知的其中T细胞扩展至治疗水平的方法将活化和扩增的细胞与(例如，之前，同时或之后)任何数量的相关治疗方式，包括但不限于用诸如抗病毒疗法，西多福韦和白细胞介素-2，阿糖胞苷(也称为ARA-C)或那他珠单抗治疗MS药物或依法珠单抗治疗银屑病患者或其他药物治疗进行性多灶性白质脑病(PML)患者。在其他实施方案中，本公开的T细胞可以与化学疗法，放射疗法，免疫抑制剂例如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸酯和FK506，抗体或其他免疫消融剂例如CAM PATH，CD3抗体或其他抗体疗法，细胞毒素，氟达拉宾，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，麦考酚酸，类固醇，FR901228，细胞因子和辐射联合施用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)可能抑制对生长因子诱导的信号传导(雷帕霉素)重要的p70S6激酶。(Liu等，Cell 66：807-815,1991；Henderson等，Immun 73：316-321,1991；Bierer等，Curr.Opin.Immun 5：763-773,1993)。在另一个实施方案中，将本公开的细胞组合物与骨髓移植联合(例如，之前，同时或之后)施用于患者，使用化疗剂例如氟达拉滨，外束辐射的T细胞消融疗法治疗(XRT)，环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH。在另一个实施方案中，本公开的细胞组合物在B细胞消融疗法之后施用，例如与CD20反应的试剂，例如Rituxan。例如，在一个实施方案中，受试者可以接受高剂量化疗然后进行外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本公开的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施方案中，扩张细胞在手术之前或之后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。例如，阿伦单抗(CAMPATH)的剂量对于成人患者通常将在1至约100mg的范围中，通常每天施用，持续1至30天。尽管在一些情况下可以使用高达40mg/天的较大剂量，但优选的日剂量为1至10mg/天(在美国专利号6,120,766中描述，所述专利全文引入作为参考)。

在美国专利号US8,906,682中提供了关于使用工程化T细胞治疗癌症的方法的其它信息，所述专利全文引入作为参考。

一些实施方案涉及用于体外制备修饰细胞的方法。该方法可以包括从受试者获得细胞样品。例如，样品可以包括T细胞或T细胞祖细胞。该方法可以进一步包括用于编码CAR的DNA转染细胞，在培养基中离体培养CAR细胞群，该培养基选择性地增强表达CAR的T细胞增殖。

在一些实施方案中，样品是冷冻保存的样品。

在一些实施方案中，细胞样品来自脐带血。

在一些实施方案中，细胞样品是来自受试者的外周血样品。

在一些实施方案中，通过单采取获得细胞样品。

在一些实施方案中，通过静脉穿刺获得细胞样品。

在一些实施方案中，细胞样品是T细胞的亚群。

实施例

通过参考以下实施例进一步描述本公开。提供这些实施例仅用于说明的目的，并非意在限制，除非另有说明。因此，本公开绝不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包含由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

抗原表达的K562细胞系的构建

用包含编码BCMA的核酸序列的慢病毒转导K562细胞以建立靶肿瘤细胞系。慢病毒包括IRES-mCherry(红色)构建体，其编码红色荧光以确认抗原表达。从这些细胞系观察到红色荧光信号，表明目标实体肿瘤细胞系成功建立(图2)。构建细胞系的技术可以在“含有CD137信号转导域的嵌合受体介导T细胞增强存活和增加抗白血病的效力，Vivo MolecularTherapy,2009，Aug，Vol.17no.8，1453-1464”，在此引入作为参考。K562细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

CAR T细胞的构建

将原代T细胞用包括不同CAR的慢病毒转导以建立靶向图1中列出的BCMA的CAR T细胞系。这些细胞来自健康的人类供体。慢病毒分别包含编码CAR分子的核酸序列，以确保CAR的表达。测量CAR的表达以确认CAR T细胞系结合特异性抗原分子。与细胞培养、慢病毒载体的构建以及流式细胞术有关的技术可以在“用mRNA工程化的T细胞处理小鼠中的进展性白血病，人类基因治疗22：1575-1586(2011年12月)”中找到，其并入本文引用。

CAT T细胞杀伤测定

进行CAR T细胞杀伤测定以测量CAR T细胞的有效性。原代T细胞获自健康人类供体的血液样品。这些T细胞用编码能结合BCMA的核酸序列转导，并且使用流式细胞术技术测量T细胞上的CAR表达。

用编码BCMA的核酸序列转导K562细胞，并且使用流式细胞术技术测量抗原表达。用编码荧光蛋白(RFP)的核酸序列转导进一步的抗原表达K562细胞，用于杀伤测定分析。将不同的CAR T细胞与相应的K562细胞以各种E:T(感染细胞：肿瘤细胞)比例(30:1，10:1，3:1)孵育24小时，并观察到来自共培养细胞的红色荧光信号。

例如，将表达抗BCMA CAR(由SEQ ID NO：1编码)的CAR T细胞与表达人BCMA(由SEQID NO：10编码)的K562细胞共培养至少五天。抗BCMA CAR的结合结构域为SEQ ID NO：3。与正常T细胞相比，CAR T细胞显著减少了抗原表达K562细胞的数量。在这些实例中，在共培养CAR T细胞和相应的抗原表达K562细胞后的第5天观察到共培养细胞的红色荧光信号。结果显示在图2和3中。该实施例证明抗BCMA CAR T细胞抑制表达K562的人BCMA的生长。

体内抗肿瘤活性

在过去的二十年中，将人类癌细胞或肿瘤活检组织异种移植到免疫缺陷啮齿类动物(异种移植模型)中已经成为开发新型癌症治疗剂的主要临床前筛选(Song等，CancerRes.PMC 2014Aug 21，Morton等，Nature Protocols，2，247-250(2007))。为了评估体内CART细胞的抗肿瘤活性，携带肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠评估CAR T的抗肿瘤活性。

使用K562-BCMA细胞建立携带BCMA肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠。第一天，将K562-BCMA细胞注射到免疫缺陷小鼠的尾静脉中。在第2或3天，以2Gy分数对免疫缺陷小鼠进行照射。在第三天，观察免疫缺陷小鼠中肿瘤细胞的形成。

通过本公开中描述的方案制备抗BCMA CAR T细胞。在第三天，将抗BCMA人类CAR T细胞(即抗BCMA CAR T)输注至免疫缺陷小鼠，并且在免疫缺陷小鼠中观察到抗肿瘤活性。在四周或六周后，使用免疫缺陷小鼠的外周血通过流式细胞术评估K562-BCMA细胞的存在。在对照中，将缓冲液输注至免疫缺陷小鼠，免疫缺陷小鼠在10至12周内死亡。对于采用普通T细胞处理的免疫缺陷小鼠，在16至17周内死亡。而对于用抗BCMA CAR T输注的免疫缺陷小鼠，没有观察到K562-BCMA细胞，免疫缺陷小鼠表现正常，在24周内存活率提高至80％(图4)。在免疫缺陷小鼠中进一步观察到人类CD3细胞。这些实例表明CAR T细胞抑制体内BCMA肿瘤的生长并改善荷瘤小鼠的存活。有关该实验的其他信息在下面的表1中提供。

表1

肿瘤细胞	K562-BCMA RFP细胞
		肿瘤细胞移植	5×10<sup>5</sup>个细胞/小鼠
放射	2Gy
		CAR T细胞注入	1×10<sup>7</sup>个细胞/小鼠

序列表

<110> 上海斯丹赛生物技术有限公司

<120> 靶向BCMA嵌合抗原受体、核酸序列、载体及应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1689

<212> DNA

<213> BCMA CAR载体(人工序列)

<400> 1

cggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 60

gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 120

tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 180

agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggatccgcc 240

accatggcct taccagtgac cgccttgctc ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc 300

aggccggaca tccagctcac ccagtccccg agctcgctgt ccgcctccgt gggagatcgg 360

gtcaccatca cgtgccgcgc cagccagtcg atttcctcct acctgaactg gtaccaacag 420

aagcccggaa aagccccgaa gcttctcatc tacgccgcct cgagcctgca gtcaggagtg 480

ccctcacggt tctccggctc cggttccggt actgatttca ccctgaccat ttcctccctg 540

caaccggagg acttcgctac ttactactgc cagcagtcgt actccacccc ctacactttc 600

ggacaaggca ccaaggtcga aatcaagggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt 660

ggcggcggat ctgaagtgca attggtggaa tcagggggag gacttgtgca gcctggagga 720

tcgctgagac tgtcatgtgc cgtgtccggc tttgccctgt ccaaccacgg gatgtcctgg 780

gtccgccgcg cgcctggaaa gggcctcgaa tgggtgtcgg gtattgtgta cagcggtagc 840

acctactatg ccgcatccgt gaaggggaga ttcaccatca gccgggacaa ctccaggaac 900

actctgtacc tccaaatgaa ttcgctgagg ccagaggaca ctgccatcta ctactgctcc 960

gcgcatggcg gagagtccga cgtctgggga caggggacca ccgtgaccgt gtctagcacc 1020

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 1080

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 1140

ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 1200

tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 1260

caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 1320

ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1380

cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1440

gagtacgatg ttttggacaa gaggcgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1500

aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1560

tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1620

cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1680

cctcgctaa 1689

<210> 2

<211> 1689

<212> DNA

<213> BCMA CAR载体(人工序列)

<400> 2

cggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 60

gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 120

tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 180

agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggatccgcc 240

accatggcct taccagtgac cgccttgctc ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc 300

aggccggaca tccagctcac ccagtccccg agctcgctgt ccgcctccgt gggagatcgg 360

gtcaccatca cgtgccgcgc cagccagtcg atttcctcct acctgaactg gtaccaacag 420

aagcccggaa aagccccgaa gcttctcatc tacgccgcct cgagcctgca gtcaggagtg 480

ccctcacggt tctccggctc cggttccggt actgatttca ccctgaccat ttcctccctg 540

caaccggagg acttcgctac ttactactgc cagcagtcgt actccacccc ctacactttc 600

ggacaaggca ccaaggtcga aatcaagggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt 660

ggcggcggat ctgaagtgca attggtggaa tcagggggag gacttgtgca gcctggagga 720

tcgctgagac tgtcatgtgc cgtgtccggc tttgccctgt ccaaccacgg gatgtcctgg 780

gtccgccgcg cgcctggaaa gggcctcgaa tgggtgtcgg gtattgtgta cagcggtagc 840

acctactatg ccgcatccgt gaaggggaga ttcaccatca gccgggacaa ctccaggaac 900

actctgtacc tccaaatgaa ttcgctgagg ccagaggaca ctgccatcta ctactgctcc 960

gcgcatggcg gagagtccga cgtctgggga caggggacca ccgtgaccgt gtctagcacc 1020

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 1080

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 1140

ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 1200

tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 1260

caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 1320

ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1380

cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1440

gagtacgatg ttttggacaa gaggcgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1500

aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1560

tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1620

cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1680

cctcgctaa 1689

<210> 3

<211> 237

<212> PRT

<213> 结合结构域(人工序列)

<400> 3

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Val Ser Gly Phe Ala Leu Ser Asn His Gly Met Ser Trp Val Arg

145 150 155 160

Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Val Tyr Ser

165 170 175

Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser Ala His Gly Gly Glu Ser

210 215 220

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 4

<211> 135

<212> DNA

<213> 铰链域(人工序列)

<400> 4

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 跨膜结构域(人工序列)

<400> 5

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 6

<211> 126

<212> DNA

<213> 4-1BB(NATURE)

<400> 6

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> CD3 zeta(NATURE)

<400> 7

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gaggcgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 8

<211> 339

<212> DNA

<213> WTCD3zeta(NATURE)

<400> 8

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gaggcgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 9

<211> 1689

<212> DNA

<213> WTCD3zeta-BCMACAR全序列(人工序列)

<400> 9

cggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 60

gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 120

tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 180

agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggatccgcc 240

accatggcct taccagtgac cgccttgctc ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc 300

aggccggaca tccagctcac ccagtccccg agctcgctgt ccgcctccgt gggagatcgg 360

gtcaccatca cgtgccgcgc cagccagtcg atttcctcct acctgaactg gtaccaacag 420

aagcccggaa aagccccgaa gcttctcatc tacgccgcct cgagcctgca gtcaggagtg 480

ccctcacggt tctccggctc cggttccggt actgatttca ccctgaccat ttcctccctg 540

caaccggagg acttcgctac ttactactgc cagcagtcgt actccacccc ctacactttc 600

ggacaaggca ccaaggtcga aatcaagggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt 660

ggcggcggat ctgaagtgca attggtggaa tcagggggag gacttgtgca gcctggagga 720

tcgctgagac tgtcatgtgc cgtgtccggc tttgccctgt ccaaccacgg gatgtcctgg 780

gtccgccgcg cgcctggaaa gggcctcgaa tgggtgtcgg gtattgtgta cagcggtagc 840

acctactatg ccgcatccgt gaaggggaga ttcaccatca gccgggacaa ctccaggaac 900

actctgtacc tccaaatgaa ttcgctgagg ccagaggaca ctgccatcta ctactgctcc 960

gcgcatggcg gagagtccga cgtctgggga caggggacca ccgtgaccgt gtctagcacc 1020

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 1080

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 1140

ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 1200

tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 1260

caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 1320

ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1380

cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1440

gagtacgatg ttttggacaa gaggcgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1500

aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1560

tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1620

cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1680

cctcgctaa 1689

<210> 10

<211> 184

<212> PRT

<213> BCMA 抗原(人工序列)

<400> 10

Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser

1 5 10 15

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr

20 25 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser

35 40 45

Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu

50 55 60

Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile

65 70 75 80

Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu

85 90 95

Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu

100 105 110

Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys

115 120 125

Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe

130 135 140

Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys

145 150 155 160

Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu

165 170 175

Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg

180

<210> 11

<211> 97

<212> PRT

<213> 修饰的PD-1细胞内结构域(人工序列)

<400> 11

Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln

1 5 10 15

Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Ala

20 25 30

Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val

35 40 45

Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Ala Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser

50 55 60

Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro

65 70 75 80

Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro

85 90 95

Leu

<210> 12

<211> 48

<212> PRT

<213> CD27 细胞内结构域(人工序列)

<400> 12

Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro

1 5 10 15

Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr

20 25 30

Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

35 40 45

<210> 13

<211> 41

<212> PRT

<213> CD28 细胞内结构域(人工序列)

<400> 13

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 14

<211> 188

<212> PRT

<213> CD30细胞内结构域(人工序列)

<400> 14

His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys

1 5 10 15

Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg

20 25 30

Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu

35 40 45

Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr

50 55 60

Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp

65 70 75 80

Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro

85 90 95

Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile

100 105 110

Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro

115 120 125

Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu

130 135 140

Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro

145 150 155 160

Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly

165 170 175

Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys

180 185

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 连接肽(NATURE)

<400> 15

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims (11)

1.一种编码CAR的分离的核酸序列，其特征在于，其中CAR包含细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞外结构域结合BCMA；所述分离的核酸序列包含SEQ ID NO：1，2或9的核酸序列。

2.根据权利要求1所述分离的核酸序列，其特征在于，所述细胞外结构域还包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列。

3.由权利要求1或2所述的分离的核酸序列编码的CAR。

4.一种CAR T细胞，其特征在于，所述的CAR T细胞是由权利要求3所述的CAR修饰的T细胞。

5.一种通过诱导T细胞应答治疗受试者的骨髓瘤药物，其特征在于，所述药物包括权利要求4所述的CAR T细胞。

6.根据权利要求3所述的CAR，或权利要求4所述的CAR T细胞，或权利要求5所述的通过诱导T细胞应答治疗受试者的骨髓瘤药物，其特征在于，其中所述细胞内结构域包含共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包含选自CD27，CD28，4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其任何组合的分子。

7.根据权利要求3所述的CAR，或权利要求4所述的CAR T细胞，或权利要求5所述的通过诱导T细胞应答治疗受试者的骨髓瘤药物，其特征在于，所述细胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域。

8.一种载体，其特征在于，包含权利要求1或2所述的分离的核酸序列。

9.一种分离的细胞，其特征在于，包含权利要求1或2所述的分离的核酸序列。

10.一种组合物，其特征在于，包含含有权利要求4所述的CAR T细胞的细胞群。

11.根据权利要求4所述的CAR T细胞在制备多发性骨髓瘤治疗药物中的应用。