CN117545511A - 与不饱和磷(v)化合物的硫醇偶联 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种新的偶联物及其制备方法。制备偶联物的方法之一包括以下步骤：使式(I)的化合物与式(II)的含硫醇分子，其中代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、聚合物、小分子、任选取代的C1‑C8‑烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5或6元杂环体系；产生式(III)的化合物。

Description

与不饱和磷(V)化合物的硫醇偶联
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月23日递交的欧洲专利申请号21170097.6的优先权的权益，其内容通过引用整体结合于此以用于所有目的。
技术领域
本发明涉及经由与不饱和磷(V)化合物的硫醇偶联制备抗体分子的化合物和偶联物的方法。本发明还涉及如本文所述的抗体分子的化合物和偶联物。
发明背景
用小的化学柄，如荧光团或生物活性化合物来位点选择性修饰生物分子，使得在生命科学和药理学中有大量应用(E.A.Hoyt,P.M.S.D.Cal,B.L.Oliveira,G.J.L.Bernardes,Nat.Rev.Chem.2019,3,147-171；D.Schumacher,C.P.R.Hackenberger,Curr.Opin.Chem.Biol.2014,22,62-69)。最常见的是，使用靶向亲核氨基酸如赖氨酸或半胱氨酸(Cys)的亲电试剂(E.A.Hoyt,P.M.S.D.Cal,B.L.Oliveira,G.J.L.Bernardes,Nat.Rev.Chem.2019,3,147-171；S.B.Gunnoo,A.Madder,ChemBioChem 2016,17,529-553；P.Ochtrop,C.P.R.Hackenberger,Curr.Opin.Chem.Biol.2020,58,28-36)。除此之外，大多数其它的亲核氨基酸也可以选择性地被处理(addressed)，然而这些方法尚未被很好地建立(S.Jia,D.He,C.J.Chang,2019,DOI 10.1021/jacs.8b11912；J.C.Vantourout,S.RaoAdusumalli,K.W.Knouse,D.T.Flood,A.Ramirez,N.M.Padial,A.Istrate,K.Maziarz,J.N.deGruyter,R.R.Merchant,J.X.Qiao,M.A.Schmidt,M.J.Deery,M.D.Eastgate,P.E.Dawson,alo J.L Bernardes,P.S.Baran,J.Am.Chem.Soc 2020,142,46；S.Sato,M.Matsumura,T.Kadonosono,S.Abe,T.Ueno,H.Ueda,H.Nakamura,Bioconjug.Chem.2020,31,1417-1424；M.T.Taylor,J.E.Nelson,M.G.Suero,M.J.Gaunt,Nature 2018,562,563-568；D.Hwang,N.Nilchan,A.R.Nanna,X.Li,M.D.Cameron,W.R.Roush,H.J.Park,C.Rader,Cell Chem.Biol.2019,26,1229-1239.e9)。另外，掺入带有叠氮化物、反式环辛烯或四嗪的非天然氨基酸允许肽和蛋白质的双正交修饰(K.Lang,J.W.Chin,ACS Chem.Biol.2014,9,16-20；X.Chen,Y.W.Wu,Org.Biomol.Chem.2016,14,5417-5439)。
在蛋白原氨基酸中，Cys在涉及蛋白质修饰时提供了若干优点。首先，巯基的增强的亲核性简化了位点选择性修饰。此外，其在可接近蛋白质表面上的相对低的丰度通常允许蛋白质的选择性单官能化(S.B.Gunnoo,A.Madder,ChemBioChem 2016,17,529-553)。因此，已经开发了几种选择性标记蛋白质上的Cys的方法。其中，马来酰亚胺的硫-迈克尔加成仍是最广泛使用的方法。尽管该反应在接近中性pH时提供了快速的动力学，但是产生的硫代琥珀酰亚胺键在外部硫醇的存在下固有地是不稳定的，这是由逆迈克尔加成引起的(B.Q.Shen,K.Xu,L.Liu,H.Raab,S.Bhakta,M.Kenrick,K.L.Parsons-Reponte,J.Tien,S.F.Yu,E.Mai,D.Li,J.Tibbitts,J.Baudys,O.M.Saad,S.J.Scales,P.J.McDonald,P.E.Hass,C.Eigenbrot,T.Nguyen,W.A.Solis,R.N.Fuji,K.M.Flagella,D.Patel,S.D.Spencer,L.A.Khawli,A.Ebens,W.L.Wong,R.Vandlen,S.Kaur,M.X.Sliwkowski,R.H.Scheller,P.Polakis,J.R.Junutula,Nat.Biotechnol.2012,30,184-189)。
除了用特异性有效载荷修饰单个Cys残基外，文献中还描述了使用双反应性Cys特异性试剂的肽或蛋白质修饰(M.E.B.Smith,F.F.Schumacher,C.P.Ryan,L.M.Tedaldi,D.Papaioannou,G.Waksman,S.Caddick,J.R.Baker,J.Am.Chem.Soc.2010,132,1960-1965；A.L.Baumann,S.Schwagerus,K.Broi,K.Kemnitz-Hassanin,C.E.Stieger,N.Trieloff,P.Schmieder,C.P.R.Hackenberger,J.Am.Chem.Soc.2020,142,9544-9552；Y.Zhang,C.Zang,G.An,M.Shang,Z.Cui,G.Chen,Z.Xi,C.Zhou,Nat.Commun.2020,11,1-10；C.Canovas,M.Moreau,C.Bernhard,A.Oudot,M.Guillemin,F.Denat,V.Goncalves,Angew.Chemie Int.Ed.2018,57,10646-10650；T.Wang,A.Riegger,M.Lamla,S.Wiese,P.Oeckl,M.Otto,Y.Wu,S.Fischer,H.Barth,S.L.Kuan,T.Weil,Chem.Sci.2016,7,3234-3239；D.L.Paterson,J.U.Flanagan,P.R.Shepherd,P.W.R.Harris,M.A.Brimble,Chem.–AEur.J.2020,26,10826-10833)。然而，与正常的马来酰亚胺类似，用这种试剂产生的连接通常对还原条件或过量的小硫醇是不稳定的(M.E.B.Smith,F.F.Schumacher,C.P.Ryan,L.M.Tedaldi,D.Papaioannou,G.Waksman,S.Caddick,J.R.Baker,J.Am.Chem.Soc.2010,132,1960-1965；Y.Zhang,C.Zang,G.An,M.Shang,Z.Cui,G.Chen,Z.Xi,C.Zhou,Nat.Commun.2020,11,1-10)。这些双功能试剂可以用于两个含Cys的蛋白质的分子间交联(Y.Zhang,C.Zang,G.An,M.Shang,Z.Cui,G.Chen,Z.Xi,C.Zhou,Nat.Commun.2020,11,1-10；S.J.Walsh,S.Omarjee,W.R.J.D.Galloway,T.T.-L.Kwan,H.F.Sore,J.S.Parker,M.J.S.Carroll,D.R.Spring,Chem.Sci.2019,10,694-700；M.E.B.Smith,F.F.Schumacher,C.P.Ryan,L.M.Tedaldi,D.Papaioannou,G.Waksman,S.Caddick,J.R.Baker,J.Am.Chem.Soc.2010,132,1960-1965)。或者，在通常称为二硫化物再桥接的过程中，半胱氨酸可以在还原和随后与双-亲电体反应后转化，这是一种对抗体官能化特别有用的方法。除了具有确定化学计量的位点选择性修饰之外，抗体链之间的共价非还原性连接已经显示增加其热稳定性(S.Sun,P.Akkapeddi,M.C.Marques,N.Martínez-Sáez,V.M.Torres,C.Cordeiro,O.Boutureira,G.J.L.Bernardes,Org.Biomol.Chem.2019,17,2005-2012；C.Bahou,E.A.Love,S.Leonard,R.J.Spears,A.Maruani,K.Armour,J.R.Baker,V.Chudasama,Bioconjug.Chem.2019,30,1048-1054)。最近，基于官能化的二溴马来酰亚胺(J.P.M.Nunes,M.Morais,V.Vassileva,E.Robinson,V.S.Rajkumar,M.E.B.Smith,R.B.Pedley,S.Caddick,J.R.Baker,V.Chudasama,Chem.Commun.2015,51,10624-10627),divinylpyrimidines(S.J.Walsh,S.Omarjee,W.R.J.D.Galloway,T.T.-L.Kwan,H.F.Sore,J.S.Parker,M./>J.S.Carroll,D.R.Spring,Chem.Sci.2019,10,694-700)二乙烯基嘧啶(S.J.Walsh,S.Omarjee,W.R.J.D.Galloway,T.T.-L.Kwan,H.F.Sore,J.S.Parker,M./>J.S.Carroll,D.R.Spring,Chem.Sci.2019,10,694-700)和乙烯砜(G.Badescu,P.Bryant,M.Bird,K.Henseleit,J.Swierkosz,V.Parekh,R.Tommasi,E.Pawlisz,K.Jurlewicz,M.Farys,N.Camper,X.Sheng,M.Fisher,R.Grygorash,A.Kyle,A.Abhilash,M.Frigerio,J.Edwards,A.Godwin,Bioconjug.Chem.2014,25,1124-1136)已被用于产生抗体-药物-偶联物(ADC)，其精确的药物-抗体比率为4。
以前，不饱和的膦酰胺酸酯和硫代膦酸酯已经被引入作为亲电子试剂用于化学选择性Cys修饰，产生高度稳定的偶联物(A.L.Baumann,S.Schwagerus,K.Broi,K.Kemnitz-Hassanin,C.E.Stieger,N.Trieloff,P.Schmieder,C.P.R.Hackenberger,J.Am.Chem.Soc.2020,142,9544-9552；M.Kasper,M.Glanz,A.Stengl,M.Penkert,S.Klenk,T.Sauer,D.Schumacher,J.Helma,E.Krause,M.C.Cardoso,H.Leonhardt,C.P.R.Hackenberger,Angew.Chemie Int.Ed.2019,58,11625-11630；M.A.Kasper,M.Glanz,A.Oder,P.Schmieder,J.P.Von Kries,C.P.R.Hackenberger,Chem.Sci.2019,10,6322-6329；WO 2018/041985；WO 2019/170710)。这些化合物可分别由乙烯基-或炔基-亚膦酸酯和叠氮化物或亲电子二硫化物产生。此外，亲电性P(V)-试剂已经用于肽钉合(M.A.Kasper,M.Glanz,A.Oder,P.Schmieder,J.P.Von Kries,C.P.R.Hackenberger,Chem.Sci.2019,10,6322-6329)，蛋白质-蛋白质偶联(A.L.Baumann,S.Schwagerus,K.Broi,K.Kemnitz-Hassanin,C.E.Stieger,N.Trieloff,P.Schmieder,C.P.R.Hackenberger,J.Am.Chem.Soc.2020,142,9544-9552；M.Kasper,M.Glanz,A.Stengl,M.Penkert,S.Klenk,T.Sauer,D.Schumacher,J.Helma,E.Krause,M.C.Cardoso,H.Leonhardt,C.P.R.Hackenberger,Angew.Chemie Int.Ed.2019,58,11625-11630)和生产有效的ADC中(M.Kasper,A.Stengl,P.Ochtrop,M.Gerlach,T.Stoschek,D.Schumacher,J.Helma,M.Penkert,E.Krause,H.Leonhardt,C.P.R.Hackenberger,Angew.ChemieInt.Ed.2019,58,11631-11636；M.Kasper,M.Gerlach,A.F.L.Schneider,C.Groneberg,P.Ochtrop,S.Boldt,D.Schumacher,J.Helma,H.Leonhardt,M.Christmann,C.P.R.Hackenberger,ChemBioChem2020,21,113-119)。
本发明的目的是提供制备偶联物的进一步的方法，并提供进一步的偶联物。
发明简述
一方面，本发明涉及一种制备式(III)化合物的方法，其包括以下步骤：
使式(I)化合物
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X表示R3-C；或
当是双键时，X表示/>
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；以及
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并且包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
与式(II)的含硫醇的分子
其中代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；
得到式(III)化合物
其中
当式(I)化合物中的代表三键时，/>代表双键；或
当式(I)化合物中的代表双键时，/>代表键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>以及
R1、R3、R4、Y和Z如对式(I)和式(II)化合物所定义。
本发明还涉及一种方法，其中使用式(L)的化合物
其中和/>在由连接Z和/>的弧所示的相同分子中，反应得到式(IIIa)的化合物：
其中如果式(L)化合物中的代表双键，则/>代表键，并且X代表/>或
如果式(L)化合物中的代表三键，则/>代表双键，且X代表R3–C；以及
R1、R3、R4、V和Y如本文所定义。
本发明还涉及一种制备抗体分子的偶联物的方法，所述方法包括：
-在还原剂的存在下还原抗体分子的至少一个二硫桥；以及
-使所述抗体分子与式(IV*)的化合物反应
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；
R5表示H或C1-C8-烷基；以及
Z代表通过碳原子与磷连接的残基，并包含基团●，其中●代表任选取代的脂族或任选取代的芳族残基
产生包含至少一个式(V)部分的抗体分子的偶联物
其中SA和SB各自为抗体分子链的硫原子；
当式(IV*)的化合物中的表示三键时，/>表示双键；或
当式(IV*)的化合物中的表示双键时，/>表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；以及
其中R1、R3、R4、R5、Y和Z如对式(IV*)化合物所定义。
本发明还涉及式(I)化合物
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X表示/>
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；以及
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
本发明还涉及式(III)的化合物
其中
表示双键；或
表示化学键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并且包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；以及
代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系。
本发明还涉及式(IIIa)的化合物
其中
表示双键；或
表示化学键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>以及
R1、R3、R4、V、X、Y、Z和如本文上下文所定义，特别是如关于式(III)化合物所定义。
本发明还涉及式(IV)的化合物
其中R1、R5、、V、X和Y如本文关于任一种方法、化合物和/或偶联物所定义。
本发明还涉及式(IV*)的化合物
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；
当是双键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；
R5表示H或C1-C8-烷基；以及
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包含基团其中/>表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
本发明还涉及包含至少一个式(V)部分的抗体分子的偶联物
其中SA和SB各自为抗体分子链的硫原子；
表示双键；或
表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；
当是键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；
R5表示H或C1-C8-烷基；以及
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
附图说明
图1显示取代的二乙炔基次膦酸酯作为试剂用于天然二硫化物的选择性硫醇-硫醇生物偶联和再桥接的开发，例如在治疗性抗体中。
图2显示与二乙炔基次膦酸酯的硫醇加成的E/Z选择性。分离的化合物的NMR分析允许基于烯烃-质子的特征偶联常数和它们与以前表征的硫醇加合物的比较来识别不同的异构体(Kasper,M.；Glanz,M.；Stengl,A.；Penkert,M.；Klenk,S.；Sauer,T.；Schumacher,D.；Helma,J.；Krause,E.；Cardoso,M.C.；Leonhardt,H.；Hackenberger,C.P.R.Cysteine-Selective Phosphonamidate Electrophiles for Modular ProteinBioconjugations.Angew.Chemie Int.Ed.2019,58(34),11625-11630.https://doi.org/10.1002/anie.201814715；Mikolajczyk,M.；Costisella,B.；Grzejszczak,S.Organosulphur Compounds-XXIX.Synthesis and Pummerer Rearrangement ofβ-Phosphoryl Sulphoxides.Tetrahedron 1983,39(7),1189-1193.https://doi.org/10.1016/S0040-4020(01)91883-6)。
图3显示所形成的硫醇加合物从Z/Z到E/E的异构化。将分离的Z/Z-产物(1-EtSH)放入NMR-管中，并溶解在CDCl3。在四天的时间内记录1H-和31P NMR，以监测异构化为E/E-形式。图3A显示异构化方法的示意图。图3b显示说明逐步异构化的1H-NMR扫描。图3c显示对应于不同异构体的31P-NMR信号随时间的积分。
图4显示淬灭的FRET对F1-F3的合成。产生淬灭的荧光团对的合成方法：从肽2和过量(10当量(eq.))在PBS(pH 7.4)中的次膦酸酯1合成淬灭的FRET-Pair 1。中间体纯化后，与1.2当量在PBS中的EDANS-硫醇反应。F1通过半制备HPLC纯化(1.67mg，86％)。淬灭的FRET-Pair 2以类似于F1合成，仅次膦酸酯2用作连接子。F2通过半制备HPLC纯化(1.94mg，91％)。从2当量肽2和在PBS中的次膦酸酯2(1当量)合成淬灭的FRET-Pair 3。随后，使用CuBr(10mol％)作为催化剂，EDANS-叠氮化物偶联至次膦酸酯侧链。F3通过半制备HPLC纯化(2.13mg，78％)。
图5a显示研究巯基偶联物稳定性的FRET淬灭分析。图5b和图5c显示在PBS、补充有谷胱甘肽的PBS、人血清和0.1M水溶液中观察到的构建体F1和F2的EDANS荧光。NaOH超过72小时。图5d显示使用二乙炔基-次膦酸酯和成功标记的蛋白质的解卷积的完整蛋白质-MS谱进行位点选择性蛋白质修饰的一般方案。图5e显示穿过R10肽的细胞与mCherry-5的偶联允许mCherry递送至活细胞中，并具有核仁定位和mCherry与NBD的共定位。
图6显示使用基于荧光团-淬灭剂的分析对二乙炔基-次膦酸酯偶联物进行稳定性测试，以研究次膦酸酯-硫醇加合物的稳定性。图6a和图6b显示次膦酸酯连接的染料-淬灭剂偶联物的结构和基于荧光-淬灭剂的读出的原理。图6c显示偶联物F1-F3的荧光测量。Dabcyl-EDANS加合物的稳定性研究在96孔板(Corning 3615，黑色，透明，平底)中进行，至少一式三份。向每个孔中加入5μl的200μM的Dabcyl-EDANS偶联物的储备溶液和95μl各自的测试溶液。人血清购自Sigma Aldrich。将谷胱甘肽以10mM的浓度溶解于PBS中，并将pH调节至7.4。在200μM下进行0.1mM NaOH研究，中和至pH 7并稀释至10μM，然后进行荧光测量。在Tecan Safire平板读数器上测量荧光。激发：360nm，发射：508nm，带宽：5nm，20℃。
图7显示用次膦酸酯1标记的eGFP和用二乙炔基次膦酸酯标记蛋白质对二级结构的影响的测定。图7a显示用10当量在PBS中(30分钟，r.t.)的1标记eGFP(C70M S147C)，然后通过具有7K MWCO的0.5mL ZebaTM旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific，USA)纯化到磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.5)中。通过完整蛋白质MS验证完全标记。图7b显示在将蛋白质稀释至5μM浓度后记录的CD和荧光光谱。与从未修饰的eGFP获得的光谱比较，没有显示显著差异。这表明，标记后蛋白质的二级结构不受影响。图7c显示凝胶内胰蛋白酶消化的、标记的eGFP的串联质谱分析，证实仅半胱氨酸被标记。
图8显示对二乙炔基次膦酸酯与蛋白质的反应动力学的估计。确定eGFP(C70MS147C)和次膦酸酯2之间的反应的二级速率常数的测。图8a显示反应条件。反应一式三份进行。将90μl eGFP(0.1mM)与10μl在DMSO中0.9mM次膦酸酯2的溶液混合。60、90、150、210和300分钟后取样，并通过完整蛋白质-MS分析。图8b显示在两种反应物浓度相等的情况下确定二阶速率常数的数学考虑。图8c显示eGFP浓度随时间的变化。通过解卷积的质量相对于内标eGFP(C70M)的强度计算。图8d示出1/c随时间的变化。该斜率对应于二阶速率常数。显示三次独立测量的平均值和误差。
图9显示作为用于将穿过肽的细胞连接至蛋白质的连接子-分子的二乙炔基次膦酸酯。图9a显示eGFP-R10-偶联物产生的示意图。图9b显示按照Schneider等人的方法(Schneider,Anselm F.L.；Kithil,Marina；Cardoso,M.Cristina；Lehmann,Martin；Hackenberger,Christian P.R.；Cellular uptake of Large Biomolecules Enabled byCell-surface-reactive Cell-penetrating Peptide Additives,Nat.Chem.(2021)accepted Manuscript.https://doi.org/10.1038/s41557-021-00661-x.)，单独用eGFP和eGFP-R10孵育后HeLa细胞的荧光成像。HeLa Kyoto细胞在潮湿环境中、在37℃下、在含有5％CO2的DMEM、含有10％胎牛血清(FBS)的4.5g/L葡萄糖中生长。将15,000HeLa Kyoto细胞接种到8孔ibidiμ-载玻片的每个孔中。细胞在37℃和5％ CO2中粘附和生长24小时。用不含FBS的Fluorobrite DMEM洗涤细胞两次，并在不含FBS的Fluorobrite DMEM中与10μM eGFP-1-R10和添加剂(10μM TNB-R10)一起孵育。细胞在37℃和5％ CO2下孵育1小时。用含有20mM谷氨酰胺和10％ FBS的Fluorobrite DMEM洗涤细胞三次。然后用含有20mM谷氨酰胺和10％FBS的含Hoechst染色剂(Hoechst 33342)的Fluorobrite DMEM覆盖细胞。eGFP摄取实验的活细胞显微图像在具有CSU-X1(Andor)和活细胞孵育腔室(OKOlab)的Nikon-CSU旋转盘显微镜上获得。所有活细胞图像都是使用Planapo60×NA 1.4oil objector(Nikon)和EMCCD(AU888，Andor)获得的。明视野图像与荧光图像一起获得。标准激光器、四重Dicrioc(400-410、486-491、560-570、633-647、AHF)和发射滤光器用于共焦荧光图像的获得(BFP(Hoechst 33342)，激发：405nm发射：450/50、GFP(GFP)，激发：488发射：525/50。图像以灰色显示明视野，绿色显示eGFP通道，和蓝色显示Hoechst 33342。比例条表示20μm。图9c显示产生mCherry-NBD-R10-偶联物的示意图。图9d显示在与mCherry双偶联物一起孵育后CCL2-细胞的荧光成像。产生mCherry-NBD-R10-偶联物，并如图9a和图9b所述进行荧光成像。
图10显示曲妥珠单抗(Trastuzumab)与二乙炔基-次膦酸酯1的反应和随后的分析。图10a显示使用化合物1的抗体再标记的一般程序。图10b显示通过SDS-PAGE分析反应前后的曲妥珠单抗。图10c显示通过PNGaseF去糖基化后，再桥接的半抗体(2x用1修饰)的解卷积的完整蛋白-MS。
图11显示通过交联质谱法鉴定抗体的两个交联半胱氨酸残基。对于MS/MS分析，使用PNGase F将再桥接的曲妥珠单抗去糖基化，然后进行胰蛋白酶的凝胶内消化。为了鉴定再桥接的半胱氨酸残基，使用专用的交联搜索引擎(pLink 2,Chen,Z.L.；Meng,J.M.；Cao,Y.；Yin,J.L.；Fang,R.Q.；Fan,S.B.；Liu,C.；Zeng,W.F.；Ding,Y.H.；Tan,D.；Wu,L.；Zhou,W.J.；Chi,H.；Sun,R.X.；Dong,M.Q.；He,S.M.A High-Speed Search Engine PLink 2withSystematic Evaluation for Proteome-Scale Identification of Cross-LinkedPeptides.Nat.Commun.2019,10(1).
https://doi.org/10.1038/s41467-019-11337-z)。图11a显示唯一可以鉴定的交联是曲妥珠单抗轻链和重链半胱氨酸之间的交联。很可能，因为所得到的肽相对大且疏水，所以无法检测到再桥接的铰链区。此外，图11b显示，鉴定了重链的两个铰链区半胱氨酸之间的链内交联。
图12显示使用膦酰亚胺II的抗体再桥接。根据一般的抗体再桥接方案，使用递增浓度的II(参见“使用次膦酸盐再桥连抗体的一般方法”)再桥接曲妥珠单抗。通过SDS-PAGE分析抗体重链和轻链的交联。
图13显示曲妥珠单抗的功能修饰及其生物学评价。图13a显示用次膦酸酯2对抗体进行两步修饰，然后对抗体CuAAC形成荧光素偶联物(半抗体和全抗体)。图13b显示通过SDS-PAGE使用考马斯染色和凝胶内荧光分析偶联物。图13c显示荧光素偶联抗体的UV-Vis光谱。图13d显示HeR2-阳性细胞的细胞膜标记，没有观察到HeR2-阴性细胞的任何染色(比例尺20μm)。
图14显示使用基于硫代乙烯基和三唑的乙炔基-次膦酸酯的抗体标记。图14a显示反应方案。使曲妥单抗(5mg/ml，在反应缓冲液中)与8eq TCEP和8eq化合物CS265和CS266反应。图14b示出CS265和CS266的结构。图14c显示通过SDS PAGE对偶联物的分析。图14d显示通过完整蛋白MS对偶联物的分析。确定CS265的荧光团与抗体的比率(FAR)为2.9，CS266的荧光团与抗体的比率(FAR)为7.4。图14e显示曲妥珠单抗与1当量或8当量次膦酸酯CS265反应的其他运行的示例性解卷积的完整蛋白质-MS谱。图14f显示曲妥珠单抗与1当量或8当量次膦酸酯CS266反应的其他运行的示例性解卷积的完整蛋白-MS谱。图14g显示未还原的曲妥珠单抗与100eq CS266的反应。使用完整蛋白MS检测不到CS266对未还原的曲妥珠单抗的标记。图14h显示用硫代乙烯基-乙炔基次膦酸酯CS265、三唑基-乙炔基次膦酸酯CS266和乙炔基-膦酰胺S1标记曲妥珠单抗。图14i显示随着次膦酸酯CS265和CS266的量增加的曲妥珠单抗的滴定。图14j显示时程实验，其中还原的曲妥珠单抗与10eq三唑基-乙炔基次膦酸酯CS266和乙炔基膦酰胺S1一起孵育。
图15显示谷胱甘肽和EDANS-次膦酸酯CS265之间反应的二级速率常数的测定。图15a显示反应条件。反应在0.1ml的体积中进行。在加入谷胱甘肽之前抽取第一样品(t＝0)。在30、60、120、240和1440分钟后取样(CS265)。吸取10μl体积的样品，并立即稀释到200μl、pH 3.5的50mM NaOAc缓冲液中，以终止反应。对这些样品进行荧光HPLC分析，每个样品注射50μl。图15b显示在两种反应物浓度相等的情况下确定二级速率常数的数学考虑。图15c显示起始材料随时间的浓度。通过相对于内标(EDANS)的峰积分来计算。显示三次独立测量的平均值和误差。(n＝3)图15d示出曲线图：1/c随时间的变化和线性曲线。斜率是二级速率常数。显示三次独立测量的平均值和误差。
图16显示谷胱甘肽和EDANS-次膦酸酯CS266之间反应的二级速率常数的测定。图16a显示反应条件。反应在0.1ml的体积中进行。在加入谷胱甘肽之前抽取第一样品(t＝0)。在1、2、5、12、22和35分钟后取样(CS266)。吸取10μl体积的样品，并立即稀释到200μl、pH3.5的50mM NaOAc缓冲液中，以终止反应。对这些样品进行荧光HPLC分析，每个样品注射50μl。图16b显示在两种反应物浓度相等的情况下确定二级速率常数的数学考虑。图16c显示起始材料随时间的浓度。通过相对于内标(EDANS)的峰积分来计算。显示三次独立测量的平均值和误差。(n＝3)图16d示出了曲线图：1/c随时间的变化和线性曲线。斜率是二级速率常数。显示三次独立测量的平均值和误差。
图17显示基于荧光团-淬灭剂的测定，以研究三唑-次膦酸酯硫醇-加合物(FRET-Pair 4(F4))的稳定性，以及抗体荧光素偶联物曲妥珠单抗-CS375在人血清中的稳定性。图17a显示次膦酸酯连接的染料-淬灭剂偶联物的结构和基于荧光-淬灭剂的读出的原理。图17b显示共轭物F4荧光测量的结果。图17c显示在不同孵育时间后，将抗体荧光素偶联物曲妥珠单抗-CS375与人血清孵育后获得的样品的分析。
图18显示化合物CS298的制备和使用该化合物的抗体再桥接(rebridging)。图18a显示由荧光素-叠氮化物(FAM-N3)和三-乙炔基-氧化膦制备化合物CS298。图18b显示使用CS298的抗体再桥接。SDS-PAGE分析显示高度的(＞85％)再桥接的抗体。
图19显示用三唑乙烯基次膦酸酯CS321对eGFP的蛋白质标记。图19a显示反应方案。图19b显示化合物CS321的结构。图19c显示标记的eGFP的质谱。
图20显示蛋白eGFPC70M S147C的质谱。
图21显示修饰的蛋白eGFPC70M S124C-1的质谱。
图22显示组蛋白H 3-3-1的质谱。
图23显示重组BSA-1的质谱。
图24显示偶联物eGFP-1-谷胱甘肽的质谱。
图25显示偶联物eGFP-1-R10的质谱。
图26显示再桥接抗体曲妥珠单抗-1的质谱。
图27显示再桥接抗体曲妥珠单抗-2的质谱。
图28显示曲妥珠单抗-2与FAM-N3的点击反应，通过SDS-PAGE使用考马斯染色和凝胶内荧光分析偶联物，以及荧光素偶联抗体的UV-Vis光谱。
图29显示乙基二乙炔基次膦酸酯(1)的NMR光谱。图29a显示乙基二乙炔基次膦酸酯(1)的1H NMR(600MHz，DMSO-d6)光谱。图29b显示乙基二乙炔基次膦酸酯(1)的31P-NMR(122MHz，CDCl3)光谱。图29c显示乙基二乙炔基次膦酸酯(1)的13C NMR(75MHz，CDCl3)光谱。
图30显示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的Z/Z-异构体的NMR光谱。图30a表示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的Z/Z-异构体的1HNMR(600MHz，CDCl3)光谱。图30b表示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的Z/Z-异构体的31P-NMR(243MHz，CDCl3)光谱。图30c表示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的Z/Z-异构体的13C NMR(151MHz，CDCl3)光谱。
图31表示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的E/Z异构体的NMR光谱。图31a表示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的E/Z-异构体的1HNMR(600MHz，CDCl3)光谱。图31b表示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的E/Z-异构体的31P-NMR(243MHz，CDCl3)光谱。图31c表示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的E/Z-异构体的13C NMR(151MHz，CDCl3)光谱。
图32表示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的E/E异构体的NMR光谱。图32a表示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的E/E-异构体的1HNMR(600MHz，CDCl3)光谱。图32b表示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的E/Z-异构体的31P-NMR(243MHz，CDCl3)光谱。图32c表示双(2-(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)的E/Z-异构体的13C NMR(151MHz，CDCl3)光谱。
图33显示丁-3-炔-1-基-二乙炔基次膦酸酯(2)的NMR光谱。图33a显示丁-3-炔-1-基二炔基次膦酸酯(2)的1H NMR(300MHz，CDCl3)光谱。图33b表示丁-3-炔-1-基二炔基次膦酸乙酯(2)的31P-NMR(122MHz，CDCl3)光谱。图33c显示了丁-3-炔-1-基二炔基次膦酸酯(2)的13C NMR(75MHz，CDCl3)光谱。
图34显示mPEG4二乙炔基次膦酸酯(3)的NMR光谱。图34a显示mPEG4二乙炔基次膦酸酯(3)的1H NMR(300MHz，CDCl3)光谱。图34b显示mPEG4二乙炔基次膦酸酯(3)的31P-NMR(122MHz，CDCl3)光谱。图34c显示mPEG4二乙炔基次膦酸酯(3)的13C NMR(75MHz，CDCl3)光谱。
图35表示NBD二乙炔基次膦酸酯(4)的NMR光谱。图35a表示NBD二乙炔基次膦酸酯(4)的1H NMR(600MHz，DMSO-d6)光谱。图35b表示NBD二乙炔基次膦酸酯(4)的31P-NMR(243MHz，DMSO-d6)光谱。图35c表示NBD二乙炔基次膦酸酯(4)的13C NMR(151MHz，DMSO-d6)光谱。
图36表示二乙基二乙炔基膦酰胺(II)的NMR光谱。图36a表示二乙基二乙炔基膦酰胺(II)的1H NMR(600MHz，CDCl3)光谱。图36b表示二乙基二乙炔基膦酰胺(II)的31P-NMR(243MHz，CDCl3)光谱。图36c表示二乙基二乙炔基膦酰胺(II)的13C NMR(151MHz，CDCl3)光谱。
图37显示化合物EDANS-N3的NMR光谱。图37a显示EDANS-N3的1H NMR(600MHz，DMSO-d6)谱。图37b显示EDANS-N3的13C NMR(151MHz，DMSO-d6)光谱。
图38显示肽1的HPLC色谱图。
图39显示FRET-Pair 1(F1)的HPLC色谱图。
图40显示FRET-Pair 2(F2)的HPLC色谱图。
图41显示FRET-Pair 3(F3)的HPLC色谱图。
图42显示化合物EDANS-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS266)的NMR光谱。图42a显示EDANS-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS266)的1H NMR(600MHz，DMSO-d6)光谱。图42b显示EDANS-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS266)的13C NMR(151MHz，DMSO-d6)光谱。图42c显示EDANS-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS266)的31P NMR(243MHz，DMSO-d6)光谱。
图43显示化合物生物素-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS292)的NMR光谱。图43a显示1H NMR(600MHz，DMSO-d6)光谱。图43b显示13C NMR(151MHz，DMSO-d6)光谱。图43c显示31P NMR(243MHz，DMSO-d6)光谱。
图44表示化合物二乙炔基(苯基)氧化膦(CS267)的NMR光谱。图44a显示1H NMR(600MHz，DMSO-d6)光谱。图44b显示31P NMR(243MHz，DMSO-d6)光谱。图44c显示13C NMR(151MHz，DMSO-d6)光谱。
图45显示化合物二乙炔基(乙基)氧化膦(CS297-副产物)的NMR光谱。图45a表示1HNMR(600MHz，氯仿-d)光谱。图45b表示13C NMR(151MHz，氯仿-d)光谱。图45c表示31P NMR(243MHz，氯仿-d)光谱。
图46显示CS298的31P NMR光谱。
图47显示CS298的HPLC色谱图。
图48显示CS314的HPLC色谱图。
图49显示NLS-mCherry-5的质谱。
图50显示偶联物NLS-mCherry-5-R10的质谱。
图51显示ADC曲妥珠单抗-CSDrug1的合成和生物学评价。图51a显示用于产生基于曲妥珠单抗的ADC的功能化毒性有效载荷CSDrug1的合成途径。I)0.2eq.MMAE-VC-PEG4-N3，10mol％CuBr，PBS/DMSO(2:8，v/v)，4h r.t.，59％产率。II)0.2eq.曲妥珠单抗(5mg/ml)，8eq.TCEP(相对于曲妥珠单抗)、Tris缓冲液(50mM，pH 8.3)、1mM EDTA、100mM NaCl。图51b显示纯化的ADC(曲妥珠单抗-CSDrug1；DAR 4.3)的亲水相互作用色谱。图51c显示HeR2+(SKBR3，绿色)和HeR2-(MDA-MB-468，黑色)细胞系中浓度依赖性细胞毒性。图51d显示在HeR2+(SKBR3，左)和HeR2-(MDA-MB-468，右)中，非功能化的曲妥珠单抗作为对照的浓度依赖性细胞毒性，其获自在增殖测定中测试ADC曲妥珠单抗-CSDrug1。按照下面实施例17中关于基于细胞的抗增殖测定所述的方法，用SKBR3和MDA-MB-468处理细胞。曲妥珠单抗-CSDrug1对HeR2+细胞系SKBR3表现出剂量依赖性毒性，IC50为72pm。相反，HeR2-细胞(MDA-MB-468)不受ADC的影响。非功能化的曲妥珠单抗对照在测试浓度下没有显示任何细胞毒性。图51e显示曲妥珠单抗-CSDrug1粗反应混合物的完整蛋白MS。
图52显示根据实施例14的蛋白质-蛋白质偶联。图52a显示从位点选择性安装的K→Aha突变体获得亲电子泛素的合成策略。图52b显示ETP-官能化的泛素13的完整蛋白-MS。当用于本文时，缩写“ETP”是指“乙炔基-三唑基-次膦酸酯”，即其中三唑基部分和乙炔基部分与磷结合的次膦酸酯。图52c显示人工Ub-二聚体15的完整蛋白MS。图52d显示通过SDS-PAGE监测的12与UbG76C偶联的时间过程。图52e显示鉴定15的连接位点的MS/MS谱图。52f显示用USP2孵育的Ub-二聚体14和15的SDS-PAGE分析。
图53显示UbG76C-UbK63PT二聚体(13)形成的时间过程。如实施例17所述，在UbK48Aha和UbK63Aha的ETP-官能化下，UbK63PT(200μM)与2.5当量新还原的UbG76C反应。0、2、4和6小时后，取样并通过完整蛋白MS分析。使用Graphpad Prism 5软件，将解卷积的质谱归一化为UbG76C峰，绘图并堆叠。
图54显示人工泛素二聚体的MS/MS分析。图54a显示UbK48-ETP-UbG76C的MS/MS分析。图54b显示UbK63-ETP-UbG76C的MS/MS分析。对于MS/MS分析，UbK48-ETP-UbG76C(a)和UbK63-ETP-UbG76C(b)二聚体如实施例17中所述在UbK48Aha和UbK63Aha的ETP功能化下制备，并如实施例16中所述在蛋白质组学数据分析-泛素二聚体下使用Proteome Discoverer(v.2.5.0.400)和MS Amanda 2.0分析。示例性的谱图显示识别正确的连接位点的最佳得分肽-谱-匹配(PSM)。
图55显示ETP-亲电试剂的全蛋白质组-半胱氨酸反应性的研究。图55a显示使用荧光次膦酸酯CS375标记全细胞裂解物和随后分析的工作流程。图55b显示用增加的亲电试剂浓度处理的细胞裂解物的SDS-PAGE分析。图55c显示通过基于MS的蛋白质组学对亲电试剂选择性进行无偏分析所用的工作流程的示意图。图55d显示在MS-Fragger开放搜索中三次重复检测到的修饰的直方图。次膦酸酯CS418的Δm以绿色突出显示。ox＝氧化(+15.99Da)，f＝甲酰化(+27.99Da)，CAM＝脲基甲基化(+57.02Da)。图55e显示当使用Δmexp作为偏移-质量时鉴定的修饰位点的丰度。PSM的#表示三次重复的总和。
图56显示应用ΔScore＞1的全蛋白质组氨基酸的选择性。如实施例16所述在蛋白质组数据分析下和实施例17所述在用于全蛋白质组半胱氨酸分布图(附加的ΔScore过滤器＞1)的样品制备下测定全蛋白质组氨基酸选择性。
图57显示全蛋白质组-半胱氨酸-分布图。使用次膦酸酯CS418比较半胱氨酸蛋白质组学的蛋白质输入。使用Proteome Discoverer(v.2.5.0.400)和MS Amanda 2.0分析数据。所示的值是三次重复的总和。
图58显示通过完整蛋白MS获得的偶联物曲妥珠单抗-CS375的质谱。图58a示出非解卷积的MS-光谱。图58b示出解卷积的MS-光谱。
图59显示UBK48-ETP和UbK63-ETP的完整蛋白质谱。图59a显示UBK48-EPT的完整蛋白MS。质量为8739.1Da的峰对应于UbK48M，是营养缺陷型表达的杂质。图59b显示UbK63-ETP的完整蛋白MS。
图60显示UbK48ETP-UbG76C二聚体12和UbK63ETP-UbG76C二聚体13的完整蛋白MS。图60a显示UbK48ETP-UbG76C二聚体12的完整蛋白MS。图60b显示UbK63ETP-UbG76C二聚体13的完整蛋白MS。
图61显示与USP2-CD一起孵育的二聚体12的SDS-PAGE分析。
图62显示化合物乙基降冰片烯-PEG7-三唑-乙炔基-次膦酸酯(CS390)的NMR光谱。图62a显示1H NMR(600MHz，乙腈-d3)光谱。图62b显示13CNMR(151MHz，乙腈-d3)光谱。图62c显示31P NMR(234MHz，乙腈-d3)光谱。
图63显示化合物5/6-羧基荧光素-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS375)的HPLC色谱图。
图64显示化合物脱硫生物素-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS418)的NMR光谱。图64a显示1H NMR(600MHz，DMSO-d6)光谱。图64b显示13C NMR(151MHz，DMSO-d6)光谱。图64c显示31P NMR(234MHz，DMSO-d6)光谱。
图65显示化合物Cy5-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS450)的HPLC色谱图。
图66显示化合物3-(4-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)苯基)-6-甲基-1，2，4，5-四嗪(CS414)的NMR光谱。图66a显示1H NMR(600MHz，乙腈-d3)光谱。图66b显示13C NMR(151MHz，乙腈-d3)光谱。
图67显示化合物四嗪-PEG3-三唑基-氧化膦(CS415)的NMR光谱。图67a显示1H NMR(600MHz，DMSO-d6)光谱。图67b显示13C NMR(151MHz，DMSO-d6)光谱。图67c显示31P NMR(234MHz，DMSO-d6)光谱。
发明详述
尽管下面详细描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是要限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
下面，将描述本发明的要素。这些要素与具体实施例一起列出，然而，应当理解，它们可以任何方式和任何数量组合以创建附加实施例。在整个说明书中描述的各种描述的示例和优选实施例不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施例。本说明书应当被理解为支持和包含将明确描述的实施例与任何数量的所公开的和/或优选的要素组合的实施例。此外，本文所述的所有要素的任何排列和组合应被认为是由本申请的描述所公开的，除非上下文另有说明。
在本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包含”和其变体如“包括”和“含有”应理解为暗示包括所述成员、整体或步骤或成员、整体或步骤的组，但不排除任何其它成员、整体或步骤或成员、整体或步骤的组，尽管在一些实施方案中，可以排除这样的其它成员、整体或步骤或成员、整体或步骤的组，即主题包括所述成员、整体或步骤或成员、整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”代替，或者有时当在本文中使用时用术语“具有”代替。当在本文中使用时，“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤或成分。
在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一”和“一个”和“该”以及类似的参考被解释为覆盖单数和复数，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。本领域技术人员知道，本申请中使用的术语“一”或“一个”可以根据情况表示“一(1)”、“一个(1)或多个”或“至少一个(1)”。在此列举的数值范围仅仅是为了用作单独地涉及落入该范围内的每个单独数值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值都并入说明书中，如同其在本文中单独列举一样。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的语言不应被解释为表示对本发明的实践必要的任何未要求保护的元素。
除非另有说明，在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元素。术语“至少一个”是指一个或多个，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个和更多。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这些等同物也包括在本发明中。
本文所使用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的全部或任何其它组合”的含义。
当在本文中使用时，“由……组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”不排除实质上不影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
术语“包括”是指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
术语“约”是指正或负20％，优选正或负10％，更优选正或负5％，最优选正或负1％。
在本说明书的整个描述和权利要求中，单数包括复数，除非上下文另有要求。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应被理解为既考虑复数又考虑单数。
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，因此可以变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是要限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
在本说明书的全文中引用了若干文献。本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明书等)，无论在上文或下文中，均全文引入本文作为参考。本文中没有任何内容被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这些公开。在通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何这样的材料。
在此引用的所有文献和专利文献的内容通过引用整体并入。
定义
除非另有定义，卤素：第7主族元素，优选氟、氯、溴和碘，更优选氟、氯和溴，与Mg结合甚至更优选溴。
除非另有定义，烷基：优选具有(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-碳原子的饱和直链或支链烃基。实例：甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基等。
除非另有定义，烯基：具有双键的不饱和直链或支链烃基。链烯基优选是(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯基。实例：乙烯基、1-丙烯基、3-丁烯基等。
除非另有定义，炔基(alkynyl)：具有三键的不饱和直链或支链烃基。炔基优选为(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-炔基。实例：乙炔基、1-丙炔基等。
除非另有定义，烷氧基(烷基-O-)：通过氧原子(-O-)与基本结构连接的烷基。烷氧基优选为(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-烷氧基。实例：甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基等。
类似地，除非另有定义，否则烯氧基和炔氧基分别为经由-O-连接至基本结构上的烯基和炔基。烯氧基优选为(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯氧基。炔氧基优选为(C3-C10)-、(C3-C6)-或(C3-C4)-炔氧基。
除非另有定义，烷基羰基(烷基-C(＝O)-)：烷基羰基优选是(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-烷基羰基。在此，碳原子数是指烷基羰基中的烷基。
类似地，除非另有定义，烯基羰基和炔基羰基是：通过-C(＝O)-连接到基本结构上的烯基和炔基。烯基羰基优选为(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯基羰基。炔基羰基优选为(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-炔基羰基。
除非另有定义，烷氧基羰基(烷基-O-C(＝O)-)：烷氧基羰基优选是(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-烷氧基羰基。这里，碳原子数是指烷氧基羰基中的烷基。
类似地，除非另有定义，烯氧基羰基和炔氧基羰基是：分别通过OC(＝O)-连接到基本结构上的烯基和炔基。烯氧基羰基优选为(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-链烯氧基羰基。炔氧基羰基优选为(C3-C8)-、(C3-C6)-或(C3-C4)-炔氧基羰基。
除非另有定义，烷基羰氧基(烷基-C(＝O)-O-)：通过羰氧基(-C(＝O)-O-)由氧连接到基本结构上的烷基。烷基羰氧基优选为(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-烷基羰氧基。
类似地，除非另有定义，否则烯基羰氧基和炔基羰氧基为：分别经由(-C(＝O)-O-)连接至基本结构的烯基和炔基。烯基羰氧基优选为(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯基羰氧基。炔基羰氧基优选为(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-炔基羰氧基。
除非另有定义，烷硫基：通过-S-连接至基本结构的烷基。烷硫基优选为(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-烷硫基。
类似地，除非另有定义，否则烯基硫基和炔基硫基为：分别通过-S-连接至基本结构的烯基和炔基。烯基硫基优选为(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯基硫基。炔基硫基优选为(C3-C8)-、(C3-C6)-或(C3-C4)-炔基硫基。
除非另有定义，否则所用术语“取代的”或“任选取代的”等是指非常宽的取代模式。从本发明的公开内容可以看出，尤其是位置R1、Z、●和/>允许用许多有机(大)分子取代。认为这些分子的结构与本发明公开的方法和所得偶联物不相关。因此，将这种新的和创新的概念的原理限制在仅仅一些分子上将是一种不适当的限制。然而，该术语分别表示有机取代基或其盐，其可以再次分别被另外的有机取代基或其盐取代数次。产生并在本申请中提供了这种复杂取代基的实例(参见，例如，方案1b和1c；图4、5、6、9、13、14、15、16、17、18和28；以及合成实施例)。优选地，术语取代的是指被一个或多个选自以下的取代基取代的基团：硝基、氰基、Cl、F、Cl、Br、-NH-R、NR2、COOH、-COOR、-OC(O)R-NH2、-OH、-CONH2CONHR、CON(R)2、-S-R、-SH、-C(O)H、-C(O)R、(C1-C20)-烷基、(C1-C20)-烷氧基、(C1-C20)-烯丙基、(杂)3-8个环成员的环(其中，如果存在的话，杂原子或原子独立地选自N、O和S)、具有5-12个环原子的(杂)芳族体系(例如苯基、吡啶基、萘基等)，其中R也可以代表这些取代基中的任何一个，并且取代可以重复数次，例如，取代可以重复1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；参见例如以下R1取代基：/>其中#表示本文所用化合物中Y的位置，如果R1已经是例如式(I)或(III)化合物的一部分的话。然而，技术人员将同意，例如用40个单元的多糖取代的烷基链，或蛋白质或抗体不能简单地通过一般取代模式来描述。
如本文所用，术语“肽”是指包含通过肽键(酰胺键)共价连接的两个或更多个氨基酸的有机化合物。肽可以根据组成氨基酸的数目来称呼，即二肽含有两个氨基酸残基，三肽含有三个，等等。含有十个或更少氨基酸的肽可以称为寡肽，而具有多于十个氨基酸残基，例如具有至多约30个氨基酸残基是多肽。氨基酸可以形成至少一个环或支链或非支链或其混合物。蛋白质和抗体是肽，因此被该术语所涵盖，但由于它们的重要性，可以单独命名。
本文所用的术语“氨基酸”是指具有-CH(NH3)-COOH基团的有机化合物。在一个实施方案中，术语“氨基酸”指天然存在的氨基酸。作为说明性的例子，天然存在的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甘氨酸。然而，该术语在其更广泛的含义中也包括非天然存在的氨基酸。
根据本发明的氨基酸和肽也可在官能团处被修饰。非限制性实例是糖，例如N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，或保护基，例如芴基甲氧基羰基(Fmoc)-修饰或酯。
术语“蛋白质”是指包含一个或多个氨基酸残基长链的肽，例如具有超过约30个氨基酸残基。蛋白质在体内和体外执行大量的功能，包括催化代谢反应、DNA复制、响应刺激和转运分子、催化反应。蛋白质折叠成特定的三维结构。蛋白质中的残基通常被化学修饰，例如通过翻译后修饰，这改变了蛋白质的物理和化学性质、折叠、稳定性、活性，并最终改变了蛋白质的功能。有时蛋白质具有连接的非肽基团，其可以被称为辅基或辅因子。蛋白质，包括酶和辅酶，也可以一起工作以实现特定的功能，并且它们通常缔合形成稳定的蛋白质复合物。所有这些形式都包括在术语“蛋白质”中。
如本文所用的术语“蛋白质标签”是指可经由根据本发明的连接子连接至蛋白质或其它含硫醇化合物以用于各种目的肽序列。蛋白质标签的非限制性实例是亲和标签、溶解标签、色谱标签、表位标签和报告酶。
亲和标签通过根据本发明的连接子被附加到蛋白质和其它含硫醇化合物，使得它们可以例如使用亲和技术纯化。这些包括例如壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或聚(His)标签。
溶解标签可用于帮助蛋白质的合适折叠并防止它们沉淀。这些包括硫氧还蛋白(TRX)和聚(NANP)。一些亲和标签具有作为增溶剂的双重作用，例如MBP和GST。
色谱标签用于改变蛋白质的色谱性质，以在特定分离技术中提供不同分辨率。通常，这些由聚阴离子氨基酸，例如FLAG-标签组成。
表位标签是短肽序列，选择它们是因为高亲和性抗体可以在许多不同物种中可靠地产生。这些通常来源于病毒基因。表位标签包括V5标签、Myc标签、HA标签和NE标签。这些标签特别适用于蛋白质印迹、免疫荧光和免疫沉淀实验以及抗体纯化。
本文所用的术语“报告酶”是指任何已知的酶，其允许在生物化学检测中增加信号。非限制性实例是，着色剂形成酶，例如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或葡萄糖氧化酶(GOX)；荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、氧化还原敏感GFP(RoGFP)、Azurite或Emerald；萤光素酶，即产生生物发光的一类氧化酶(例如萤火虫萤光素酶(EC1.13.12.7))；氯霉素乙酰转移酶(CAT)；β-半乳糖苷酶；或β-葡糖醛酸糖苷酶。
蛋白质标签的非限制性实例是：AviTag，其是一种允许通过酶BirA生物素化的肽，因此该蛋白质可以被链霉亲和素分离(GLNDIFEAQKIEWHE)；钙调蛋白标签，其是一种被蛋白质钙调蛋白(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)结合的肽；聚谷氨酸标签，其是一种有效地结合至阴离子交换树脂的肽如Mono-Q(EEEEEE)；E-标签，其是一种被抗体识别的肽(GAPVPYPDPLEPR)；FLAG-标签，其是一种被抗体识别的肽(DYKDDDDK)；HA-标签，其是一种来自被抗体识别的血凝素的肽(YPYDVPDYA)；His-标签，其是一种被镍或钴螯合物结合的5-10个组氨酸(HHHHHH)；Myc-标签，其是一种来自被抗体识别的c-myc的肽(EQKLISEEDL)；NE-标签，其是一种被单克隆lgG1抗体识别的新的18-氨基酸合成肽(TKENPRSNQEESYDDNES)，其可用于广谱应用，包括蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术、免疫细胞沉淀、和重组蛋白的亲和纯化；S-标签，其是一种衍生自核糖核酸酶A的肽(KETAAAKFERQHMDS)；SBP标签，其是一种与链霉亲和素结合的肽(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)；Softag 1，用于哺乳动物表达(SLAELLNAGLGGS)；Softag 3，用于原核表达(TQDPSRVG)；Strep-tag，其是一种与链霉亲和素或被称为链球菌素的经修饰的链霉亲和素结合的肽(Strep-tag II:WSHPQFEK)；TC tag，其由FlAsH和ReAsH双砷化合物识别的四半胱氨酸标签(CCPGCC)；V5标签，其由抗体识别的肽(GKPIPNPLLGLDST)；VSV-标签，其由抗体识别的肽(YTDIEMNRLGK)；Xpress标签(DLYDDDDK)；Isopeptag，一种共价结合至毛蛋白-C蛋白的肽(TDKDMTITFTNKKDAE)；SpyTag，一种共价结合至SpyCatcher蛋白的肽(AHIVMVDAYKPTK)；Snooptag，一种共价结合至SnootoCatcher蛋白(KLGDIEFIKVNK)的肽；BCCP(生物素羧基载体蛋白)，一种能够被链霉亲和素识别的由BirA生物素化的蛋白结构域；谷胱甘肽-S-转移酶-标签，一种结合固定的谷胱甘肽的蛋白；绿色荧光蛋白-标签，一种自发荧光并且可以被纳米抗体结合的蛋白；Halo-标签，一种共价结合至HaloLinkTM树脂(Promega)的突变水解酶；麦芽糖结合蛋白-标签，一种结合直链淀粉琼脂糖的蛋白；Nus-tag；硫氧还蛋白标签；Fc-标签，衍生自免疫球蛋白Fc结构域，允许二聚化和溶解。能用于蛋白-A琼脂糖凝胶上纯化，设计的内在无序标签含有促进紊乱的氨基酸(P、E、S、T、A、Q、G…)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOX)、绿色荧光蛋白(GFP)、氧化还原敏感GFP(RoGFP)、Azurite、Emerald、萤火虫荧光素酶(EC 1.13.12.7))、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、微管蛋白-酪氨酸连接酶(TTL)。
本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，优选由四条多肽链组成，两条重链(H)和两条轻链(L)，它们通常通过二硫键相互连接。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区可包含例如三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其中散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL通常由从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和多达四个FR组成，例如按以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。如本文所用，术语“抗体”或“抗体分子”包括完整的全长抗体和抗体的抗原结合片段。
本文所用的术语“互补决定区”(CDR；例如CDR1、CDR2和CDR3)指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的，每个可变结构域通常具有三个CDR区，分别为CDR1、CDR2和CDR3，每个互补决定区可包含Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中约24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位残基和重链可变结构域中约31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位残基，和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变结构域中约26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)位残基和重链可变结构域中约26-32(H1)、53-55(H2)和96-103(H3)。在一些情况下，互补决定区可以包括来自根据Kabat定义的CDR区和高变环的氨基酸。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以被分配到不同的“类别”。有五种主要类型的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。用于本发明的优选免疫球蛋白类型是IgG。
对应于不同种类抗体的重链恒定结构域分别被称为[α]([alpha])、[δ]([delta])、[ε]([epsilon])、[γ]([gamma])和[μ]([mu])。不同类型免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。如本文所用，抗体是常规已知的抗体及其功能片段。
抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”，或“抗体的抗原结合片段”或“抗体片段”在此定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个超变区中，例如CDR1、-2和/或-3区；然而，可变“框架”区也可在抗原结合中起重要作用，例如通过为CDR提供支架。优选地，“抗原结合区”至少包含可变轻链(VL)的4至103位氨基酸残基和可变重链(VH)的5至109位氨基酸残基，更优选VL的3至107位氨基酸残基和VH的4至111位氨基酸残基，特别优选完整的VL和VH链(VL的1至109位氨基酸和VH的1至113位氨基酸；编号根据WO 97/08320进行)。在许多情况下，本公开内容涉及“抗体分子”。如本文所用，术语“抗体分子”还包括“功能片段”、“抗原结合抗体片段”、“抗体的抗原结合片段”、“抗体片段”或“抗体片段”等。
本发明的“功能片段”、“抗原结合抗体片段”、“抗体的抗原结合片段”、或“抗体片段”或“抗体的片段”包括但不限于含有至少一个可与本文所述的还原剂反应的二硫键的那些片段。合适片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2，本文所用的由一条抗体重链和一条抗体轻链组成的“半抗体分子”，Fv片段；双抗体；单结构域抗体(DAb)，线性抗体；单链抗体分子(scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体，例如双特异性和三特异性抗体。“多特异性”或“多功能”抗体以外的抗体应理解为其每个结合位点相同。F(ab')2或Fab可经工程改造以最小化或完全去除CH1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用。
本文中的术语“Fc区”用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引。
本发明考虑的抗体或抗原结合抗体片段的变体是其中保持抗体或抗原结合抗体片段的结合活性的分子。
本发明中所考虑的“结合蛋白”是例如抗体模拟物，例如Afffibodies、Adnectin、Anticalin、DARPins、Avimers、Nanobodies。
“人”抗体或其抗原结合片段在本文中定义为非嵌合的(例如非“人源化的”)并且不来自(全部或部分)非人物种的抗体或其抗原结合片段。人抗体或其抗原结合片段可以源自人或可以是合成的人抗体。“合成人抗体”在本文中定义为具有完全或部分地在计算机上衍生自基于已知人抗体序列分析的合成序列的抗体。人抗体序列或其片段的计算机设计可以例如通过分析人抗体或抗体片段序列的数据库并利用由此获得的数据设计多肽序列来实现。人抗体或其抗原结合片段的另一个实例是由分离自人源抗体序列文库(例如，基于取自人天然来源的抗体的文库)的核酸编码的抗体或其抗原结合片段。
“人源化抗体”或其人源化抗原结合片段在本文中定义为：(i)衍生自非人来源(例如，携带异源免疫系统的转基因小鼠)的抗体，该抗体基于人种系序列；(ii)其中，非人抗体构架区的氨基酸通过基因工程部分交换为人氨基酸序列或(iii)CDR移植的，其中可变结构域的CDR来自非人来源，而可变结构域的一个或多个构架是人来源的，恒定结构域(如果有的话)是人源的。
“嵌合抗体”或其抗原结合片段在本文中定义为一种这样的抗体或其抗原结合片段，其中可变结构域衍生自非人来源，并且一些或所有恒定结构域衍生自人来源。
如本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即构成该群体的各个抗体除了可能以微量存在的可能的突变，例如天然存在的突变之外是相同的。因此，术语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体制剂的优点还在于它们通常不被其它免疫球蛋白污染。术语“单克隆”不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体，术语单克隆抗体具体包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
“分离的”抗体是已经鉴定并从表达它的细胞组分分离的抗体。细胞的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。
如本文所用，“特异性结合”、“特异性针对/用于”或“特异性识别”感兴趣的抗原，例如肿瘤相关多肽抗原靶标的抗体，是一种以足够的亲和力结合抗原，使得该抗体可用作靶向表达抗原的细胞或组织的治疗剂，并且与上述抗原靶标的其它蛋白质不显著交叉反应或与除直向同源物和变体(例如突变体形式、剪接变体或蛋白水解截短形式)之外的蛋白质不显著交叉反应。本文所用的术语“特异性识别”或“特异性结合”或“特异性针对/用于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位可表现为例如抗体或其抗原结合片段对抗原的单价KD小于约10-4M，或者小于约10-5M，或者小于约10-6M，或者小于约10-7M，或者小于约10-8M，或者小于约10-9M，或者小于约10-10M，或者小于约10-11M，或者小于约10-12M，或更小。如果抗体能够区分抗原和一种或多种参考抗原，则该抗体“特异性结合”抗原，“特异性针对/针对”抗原或“特异性识别”抗原。在其最一般的形式中，“特异性结合”、“特异性结合到”、“特异性针对/用于”或“特异性识别”是指抗体区分目标抗原和无关抗原的能力，例如根据以下方法之一确定。这些方法包括但不限于表面等离子体共振(SPR)、蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-检验和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。评分可以通过标准显色(例如，第二抗体与辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺与过氧化氢)进行。某些孔中的反应通过光密度进行评分，例如在450nm处。典型的背景(＝阴性反应)可以是0.1OD；典型的阳性反应可以是1OD。这意味着阳性/阴性差异大于5倍、10倍、50倍，优选大于100倍。通常，结合特异性的测定不是通过使用单一的参照抗原，而是通过使用一组约三至五个不相关的抗原，如奶粉、BSA、转铁蛋白等进行的。
“结合亲和力”或“亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合配偶体之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用的“结合亲和力”是指反映1：1结合对成员(例如抗体和抗原)之间的相互作用的固有结合亲和力。解离常数“KD”通常用于描述分子(例如抗体)与其结合配偶体(例如抗原)之间的亲和力，即配体与特定蛋白质结合的紧密程度。配体-蛋白质亲和力受两个分子之间的非共价分子间相互作用的影响。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。在一个实施方案中，本发明的“KD”或“KD值”是通过使用表面等离子体共振法使用合适的装置来测量，所述装置包括但不限于Biacore仪器，如Biacore T100、Biacore T200、Biacore 2000、Biacore 4000、Biacore3000(GE Healthcare Biacore,Inc.)或ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad Laboratories,Inc.)。
本文所用的术语“核苷”和“核苷部分”是指包括糖基和杂环碱基的核酸亚单位，以及这些亚单位的类似物，例如修饰的或天然存在的脱氧核糖核苷或其任何化学修饰。其它基团(例如保护基团)可以连接到核苷的任何组分上。核苷的修饰包括但不限于2'-、3'-和5'-位糖修饰、5-和6-位嘧啶修饰、2-、6-和8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、5-溴-尿嘧啶的取代等。核苷可适当地被保护和衍生，以便能通过本领域已知的方法合成寡核苷酸，例如使用核苷亚磷酰胺单体的固相自动化合成、H-膦酸酯偶联或磷酸三酯偶联。
“核苷酸”或“核苷酸部分”是指核酸的亚单位，其包括磷酸基团、糖基和杂环碱基，以及这些亚单位的类似物。其它基团(例如保护基团)可以连接到核苷酸的任何组分上。术语“核苷酸”可以指经修饰的或天然存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。在一些情况下，核苷酸包括嘌呤和嘧啶，其包括胸苷、胞苷、鸟苷、腺嘌呤和尿苷。术语“核苷酸”包括不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)，而且含有其它已被修饰的杂环碱基的部分。这样的修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其它杂环。这些修饰包括例如二氨基嘌呤及其衍生物、肌苷及其衍生物、烷基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、硫醇化嘌呤或嘧啶等，或加入保护基如乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、9-芴基甲氧基羰基、苯氧基乙酰基、二甲基甲脒、二丁基甲脒、二甲基乙脒、N，N-二苯基氨基甲酸酯等。嘌呤或嘧啶碱基也可以是前述的类似物；合适的类似物是本领域技术人员已知的，并描述于相关的教科书和文献中。常见的类似物包括但不限于1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊基腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)尿嘧啶、5-(羧甲基氨基甲基)-尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、奎宁、肌苷、1-甲基肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫代嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。
如本文所用的术语“寡核苷酸”是指由多个如上定义的连接的核苷酸单元形成的多核苷酸。核苷酸单元各自包括通过磷酸酯连接子团连接在一起的核苷单元或其类似物。术语寡核苷酸还指通过除磷酸酯键以外的键如硫代磷酸酯键或方酰胺键连接在一起的多个核苷酸。寡核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。在一些情况下，寡核苷酸可以包括核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)和/或脱氧核糖核苷酸单体。作为说明性实例，寡核苷酸可以包含2至50个核苷酸单位，例如2至40个核苷酸单位，例如5至35个核苷酸单位，例如10至35个核苷酸单位，例如15至30个核苷酸单位。
本文所用的术语“单糖”是指通式Cm(H2O)n的开链或环状化合物，其中m是3、4、5、6、7或8，n是2、3、4、5、6、7或8，然而，该术语还包括这些碱性化合物的衍生物，其中OH基团被NH2基团取代(例如葡糖胺)，脱氧糖，其中至少一个OH基团被H取代(例如脱氧核糖)。单糖的优选实例是D-(+)-甘油醛；D-(-)-赤藓糖；D-(-)-苏糖；D-(-)-核糖；D-(-)-阿拉伯糖；D-(+)-木糖；D-(-)-来苏糖(D-(-)-Lyxose)；D-(+)-阿洛糖；D-(+)-阿卓糖；D-(+)-葡萄糖；D-(+)-甘露糖；D-(-)-古洛糖；D-(-)-艾杜糖(D-(-)-Idose)；D-(+)-半乳糖；D-(+)-塔罗糖；二羟基丙酮；D-赤藓酮糖；D-核酮糖；D-木酮糖；D-阿洛酮糖；D-果糖；D-山梨糖；D-塔格糖。术语单糖还包括其中一个、两个、三个或四个羟基被取代的单糖。
术语“多糖”是指包含至少2(两个)、优选至少5(五个)、更优选至少10(十个)通过糖苷键连接的单糖的分子。
本文所用的碳水化合物包括单糖和多糖及其衍生物。
本文所用的聚合物是指由许多重复的有机亚单元组成的大分子，然而，其不是多糖、寡核苷酸或肽。聚合物的实例是聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯(PEO)或聚甘油(例如聚甘油-聚蓖麻醇酸酯(PGPR)。
术语“荧光团”是技术人员熟知的，并且是指在光激发时重新发射光的化合物。非限制性实例是CY5、EDANS、呫吨衍生物(例如荧光素、若丹明、俄勒冈绿、曙红、德克萨斯红)、花青衍生物(例如吲哚羰花青、氧杂羰花青、部花青)、方酸衍生物(例如Seta、Se Tau、Square染料)、萘衍生物(例如丹酰或prodan衍生物)、香豆素衍生物、噁二唑衍生物、蒽烯衍生物(例如蒽醌如DRAQ5、DRAQ7、CyTRAK橙)、芘衍生物(例如级联蓝)、噁嗪衍生物(例如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫)、吖啶衍生物(例如原黄素、吖啶橙、吖啶黄)、芳基甲烷衍生物(例如金胺、结晶紫、孔雀绿)或四吡咯衍生物(例如酪啡肽、酞菁、胆红素)。
本文所用的术语“脂族或芳族残基”是指脂族取代基，例如烷基残基，其可任选地被其它脂族和/或芳族取代基取代，例如脂族残基可以是核酸、肽、蛋白质、酶、辅酶、抗体、核苷酸、寡核苷酸、单糖、多糖、聚合物、荧光团、任选取代的苯等，只要该分子与核心结构(在R1的情况下，例如与例如式(I)、(III)、(IIIa)、(IV)或(IV*)的化合物或本文所述抗体分子的偶联物的相应的Y，例如氧)直接连接的为脂族的。芳族残基是取代基，其中与核心结构的直接连接是芳族体系的一部分，例如任选取代的苯基或三唑基或吡啶基或肽，例如，如果肽与核心结构的直接连接是例如经由苯基残基。如本文所用，术语“芳族残基”还包括杂芳族残基。
术语“抗体药物偶联物”或缩写的ADC是本领域技术人员公知的，并且如本文所用，是指抗体或其抗原结合片段与药物的连接，所述药物例如化疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针等。如本文所用的“连接子”是将抗体或其抗原结合片段共价连接至药物的任何化学部分。连接子可以是本领域技术人员已知的任何连接子。如本文所用的术语“连接子药物偶联物”是指包含如上文定义的连接子和药物或由其组成的分子或化学基团。在这方面，术语“连接子药物偶联物”通常是指抗体药物偶联物中的不是抗体或其抗原结合片段的部分。通常，在连接子药物偶联物中，连接子与药物共价连接。
术语“抗体荧光团偶联物”或缩写AFC也是本领域技术人员公知的，并且是指抗体或其抗原结合片段与荧光团例如Cy5的连接。荧光团可以通过连接子与抗体或其抗原结合片段连接。连接子可以是本领域技术人员已知的任何连接子。抗体荧光团偶联物可以包含“连接子荧光团偶联物”。如本文所用的术语“连接子荧光团偶联物”是指包含如上文定义的连接子或由其组成的分子或化学基团，以及荧光团。在这方面，术语“连接子荧光团偶联物”通常指抗体荧光团偶联物的不是抗体或其抗原结合片段的部分。通常，在连接荧光团偶联物中，连接子共价连接到荧光团。
本文所用的术语“小分子”表示包含至少两个碳原子，但优选不多于7、12、15或20个可旋转碳键，更优选不多于7、12或15个可旋转碳键，甚至更优选不多于7或12个可旋转碳键，具有100-2000道尔顿，优选100-1000道尔顿的分子量，并任选包含一个或两个金属原子的有机分子。作为小分子生物素和荧光团EDANS和Cy5的仅仅说明性的实例。
方法
制备式(III)化合物的方法
一方面，本发明涉及一种制备式(III)化合物的方法，其包括以下步骤：使式(I)化合物
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X表示/>
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；以及
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并且包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
与式(II)的含硫醇分子
其中代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；
得到式(III)的化合物
其中
当式(I)化合物中的代表三键时，/>代表双键；或
当式(I)化合物中的代表双键时，/>代表键；/>
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>以及
R1、R3、R4、Y和Z如对式(I)和式(II)化合物所定义。
所述V、X、Y、R1、R2、R3、R4、Z、●、/>和/>可以如本文对任一种方法、化合物和/或偶联物所定义。本文对于任一种方法、化合物和/或偶联物所定义的任何/>V、X、Y、R1、R2、R3、R4、Z、●、/>和/>可以彼此组合。
本发明提供使含硫醇化合物与不饱和磷(V)化合物反应的方法。本文所述的方法允许在R1、Z、●和位组合大量不同的有机残基。仅作为说明性的例子，当/>是氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸时，根据本发明的方法适于形成偶联物。一个优点是，存在于此种氨基酸、肽、蛋白质或抗体中的巯基，例如半胱氨酸残基的巯基，或存在于核苷酸或寡核苷酸中的巯基，与不饱和磷(V)化合物的三键或双键发生化学选择性反应，从而提供化学选择性修饰方法。由于这种化学选择性，含硫醇化合物，作为说明性实例，氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸可以是未保护的，这意味着保护基不是必需的。此外，根据本发明的方法允许两个复杂分子(例如荧光团和蛋白质或抗体)的偶联。所获得的偶联物是高度稳定的，特别是在生理相关条件下，例如在人血清中，在小硫醇的存在下，和在活细胞内的条件下。偶联在多种反应条件下进行，例如在生理相关条件下，例如生理pH。
在这种情况下，应注意，属于式(I)定义的化合物，即二炔基次膦酸酯，即在相同磷原子上具有两个乙炔基的分子，先前已经在产生P立体杂环的产生中报道(J.S.Harvey,G.T.Giuffredi,V.Gouverneur,Org.Lett.2010,12,1236-1239)，作为合成磷杂-蝎酸酯复合物的中间体(S.G.A.Van Assema,C.G.J.Tazelaar,G.De Bas Jong,J.H.VanMaarseveen,M.Schakel,M.Lutz,A.L.Spek,J.Chris Slootweg,K.Lammertsma,Organometallics 2008,27,3210-3215)和作为大环的结构单元(S.G.A.van Assema,G.B.de Jong,A.W.Ehlers,F.J.J.de Kanter,M.Schakel,A.L.Spek,M.Lutz,K.Lammertsma,European J.Org.Chem.2007,2007,2405-2412)。在本发明中已经发现，这些试剂可以用于制备如本文所述的式(III)化合物和抗体分子的偶联物。
现在更详细地描述本发明，优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，表示三键；V不存在；X代表R3-C，R3代表H或C1-C8-烷基；和/>代表双键。优选地，R3表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选R3为H。
在一些实施方案中，在制备式(III)化合物的任一种方法中，可表示双键；V可以是H或C1-C8-烷基；X可以表示/>；R3和R4可以独立地表示H或C1-C8-烷基；和/>可以代表键。优选地，R3和R4独立地表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。优选地，R3和R4是相同的；甚至更优选R3、R4和V相同。更优选R3和R4都是H，优选V是H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2--烷基。甚至更优选地，V是H，在优选的实施方案中，R3、R4和V各自是H。
关于本文所用的表示应注意，如本领域技术人员通常所知，每个碳原子是四价的。因此，结构/>其中X和V如本文所定义，星号(*)表示与磷的连接，包括结构/>其中R3、R4和V如本文所定义。结构其中/>X和V如本文所定义，且星号(“)表示与磷的连接，包括结构/>和/>其中/>R3、R4和V如本文所定义，且H为氢。波浪键表示双键的构型可以是E或Z，化合物也可以以E和Z异构体的混合物存在。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，Z是其中/>表示与磷的连接点，且●如本文所定义；和Q是包含至少三个主链碳原子和一个碳碳双键的部分，其中至少一个主链原子是选自S、O或N的杂原子，优选S，任选地，在每种情况下，连接子可以排列在●和Q之间，更优选Z是/>其中Q是/>R5为H或C1-C8-烷基；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基；和●如本文所定义；任选地，连接子可以排列在●和Q之间。优选R5为H或C1-C6-烷基，更优选R5为H或C1-C4-烷基，还更优选R5为H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，R5为H，优选地，在任一种方法中，当/>为三键且X为R3-C时，R3和R5相同；更优选地，当/>是三键且X是R3-C时，R3和R5都是H。优选地，在任一种方法中，当/>是双键且X是/>时，R3、R4和R5是相同的；更优选R3、R4、R5和V相同。更优选地，当/>是双键且X是时，R3、R4和R5各自是H；甚至更优选地，R3、R4、R5和V是H。优选地，R10，当存在时，是H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。还更优选R10为H。G可以是NR10。G可以是O。优选地，G是S。因此，优选地，Z是/>其中Q是/>并且R5和●如本文所定义；制备式(III)化合物的方法可进一步包括制备式(I)化合物，所述制备包括：
使式(IV)的化合物
其中R1、R5、V、X和Y如本文所定义，
与●-GH反应以形成式(I)的化合物，其中G和●如本文所定义；H是氢；优选G为S。任选地，在每种情况下，可在●和G之间设置连接子，其中G为通过与式(IV)化合物反应而转化为Q的部分。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，Z是其中/>表示与磷的连接点，且●如本文所定义；和Q是含有1、2或3个独立选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分。任选地，在每种情况下，在●和Q之间设置连接子。更优选地，Z选自 其中R5是H或C1-C8-烷基；R6为C1-C8-烷基，和●如本文所定义。因此，Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>优选Z为/>其中Q为/>更优选Z为/>其中Q为任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间，优选R5为H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，R5为H。优选地，在任一种方法中，当/>为三键且X为R3-C时，R3 的；甚至更优选R3、R4、R5和V相同。更优选地，当/>是双键且X是/>时，R3、R4和R5各自是H；更优选地，R3、R4和R5和V是H。R6，当存在时，可以是C1-C8-烷基，优选C1-C6-烷基，更优选C1-C4-烷基，还更优选C1-C2-烷基。制备式(III)化合物的方法可进一步包括制备式(I)化合物，所述制备包括：
使式(IV)的化合物
其中R1、R5、V、X和Y如本文所定义，
与●-N3、反应，以形成式(I)的化合物，其中●如本文所定义；和R6是C1-C8-烷基，优选C1-C6-烷基，更优选C1-C4-烷基，还更优选C1-C2-烷基。因此，式(IV)化合物可以与/>反应。优选地，式(IV)化合物可以与反应。式(IV)化合物可以与/>反应。式(IV)化合物可以与●-N3反应。优选地，反应在催化剂例如铜催化剂或钌催化剂的存在下进行。当与●-N3进行反应时，特别优选使用催化剂，例如铜催化剂或钌催化剂。任选地，连接子可以排列在●和通过与式(IV)化合物反应将转化为Q的部分之间。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，Z是其中/>表示与磷的连接点，且●如本文所定义；以及
Q是包含与式(I)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与该碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分；或
Q是包含与式(I)中的磷结合的碳-碳三键和与该碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分。任选地，在每种情况下，连接子排列在●和Q之间，更优选地，Z是其中Q是/>任选地，连接子可以排列在●和Q之间。更优选地，Z是/>其中Q是/>任选地，连接子可以排列在●和Q之间。制备式(III)化合物的方法可进一步包括制备式(I)化合物，所述制备包括：使式(IV)的化合物
/>
其中R1、V、X和Y如本文所定义，R5是H，
与反应，其中L为卤素(I、Br、Cl，优选I或Br，更优选I)或O-三氟甲磺酸酯，以形成式(I)化合物。优选地，反应在钯催化剂、铜催化剂和碱的存在下进行。例如，反应可以以Sonogashira偶联进行。任选地，连接子可以排列在●和通过与式(IV)化合物反应将转化为Q的部分之间。
在整个说明书中，无论在此关于任何方法、化合物或偶联物指出的任何地方，任选地在●和Q之间排列连接子等，连接子实际上可以是本领域技术人员已知的任何连接子，例如肽连接子或直链或支链的烃基部分。连接子也可以包含环状部分。肽连接子可以包含例如1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、1至3、或2、或1个氨基酸。如果连接子是烃基部分，则连接子的主链可以仅包括碳原子，但也可以含有杂原子如氧(O)、氮(N)或硫(S)原子，和/或可以含有羰基(C＝O)。连接子可以是例如C1-C20碳原子链或聚醚基链如具有-(O-CH2-CH2)-重复单元的聚乙二醇基链。在基于烃的连接子的典型实施方案中，连接部分包含1至约150、1至约100、1至约75、1至约50、或1至约40、或1至约30、或1至约20个之间，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19个主链原子。其中连接子排列在●和Q之间的示例性化合物如下所示：
其中所述连接子是其中所述连接子是/>其中所述连接子是其中所述连接子是/>例如，当本说明书涉及“连接子”本身时，或涉及“连接子-药物偶联物”，例如在抗体药物偶联物的上下文中，或涉及“连接子-荧光团偶联物”，例如在抗体荧光团偶联物的上下文中，也可以使用上述示例性连接子。本领域技术人员知道选择合适的连接子。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，Y代表O、NR2，其中R2代表H或C1-C8-烷基、S或键。优选地，在每种情况下，R1通过碳原子结合到Y上。
因此，Y可以是O(氧)。
Y可以是NR2。R2为H或C1-C8-烷基。优选地，R2是C1-C8-烷基。更优选R2为甲基、乙基、丙基或丁基。还更优选R2为甲基或乙基。
Y可以是S(硫)。
Y可以是键。特别地，Y可以是连接R1与磷的单键。
R1，无论何时在本说明书中提及，可以是任何脂族或芳族残基，其可以任选被取代，并且其不干扰制备如本文所述的式(III)化合物的方法。因此，R1包括宽范围的脂族或芳族残基，例如调节水溶性的基团(例如乙二醇低聚物)，可用于进一步官能化的基团(例如包含碳-碳三键的基团，其可进一步官能化，例如所谓的“点击手柄”，其可通过1，3-偶极环加成进一步官能化)，或荧光团(参见例如以下实施例2和7)。本领域技术人员知道选择与本文所述方法相容的合适残基R1。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1ma表示小分子；任选被至少一个如下取代基取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30或30；C2-C8-烯基；C2-C8-炔基；优选在这些实施方案的任何一个中，Y是O。因此，R1可以是小分子。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被至少一个如下取代基取代的C1-C8-烷基：F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基和/或-S-S-(C1-C8-烷基)中的至少一种取代。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被C2-C8-烯基取代的C1-C8-烷基。R1可以是任选被C2-C8-炔基取代的C1-C8-烷基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可表示任选独立地被至少一个以下取代基取代的苯基：C1-C8-烷基；(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；F；Cl；I；Br；-NO2；-N(C1-C8-烷基)H；-NH2；-N(C1-C8-烷基)2或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；优选地，在每种情况下Y是键。因此，R1可以是任选被C1-C8-烷基取代的苯基。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被以下中的至少一个取代的苯基：F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2和/或-N(C1-C8-烷基)2。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是键。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可代表5-或6-元杂芳族体系，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可代表小分子；C1-C8-烷基；被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基；被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；或任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或以-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基。因此，R1可以表示小分子，优选Y可以是O。R1可以代表C1-C8-烷基，优选Y可以是O。R1可以代表被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基，优选Y可以是O。R1可代表被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，且优选Y可为O。R1可以代表被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，并且优选Y可以是O。R1可代表C2-C8-烯基，优选Y可为O。R1代表任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基，优选Y为O。R1可代表C2-C8-炔基，优选Y可为O。R1可代表苯基，优选Y可为键。R1可表示被-NO2取代的苯基，优选Y可为键。R1可代表被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基，且优选Y可为键。R1可表示被荧光团取代的三唑基，且优选Y可为键。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可代表C1-C8-烷基。优选地，R1代表甲基、乙基、丙基或丁基。更优选R1代表甲基或乙基。更优选R1代表乙基。优选地，在这些实施方式的任一个中，R1为O。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。因此，R1可以是小分子。R1可以是荧光团。R1可以是任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基。R1可以是任选取代的C2-C8-烯基。R1可以是任选取代的C2-C8-炔基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为更优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。因此，R1可以是乙基。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。优选R1为M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选3、4或5，还更优选4。R1可以是荧光团。R1可以是任选被荧光团取代的C1-C8-烷基。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，优选R1为其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4。R1可以是C2-C8-炔基。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。/>
优选R1为其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选1、2或3，更优选2。优选R1为其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3。更优选R1为其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、21、13、20、21、22、24、20、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，并且n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。优选地，在这些实施方案的任何一个中，Y是O。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为或仍更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中K为H或C1-C8-烷基，优选K为H；优选其中在每种情况下Y是键。因此，R1可以是任选取代的芳基。优选地，R1是任选取代的苯基。更优选R1为未取代的苯基。R1可以是任选取代的杂芳基。优选地，R1为任选取代的三唑基。更优选地，R1为被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基。R1可以是荧光团。更优选R1为被荧光团取代的三唑基。更优选R1为/>还更优选地，R1是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1。优选R1是/>其中K是H或C1-C8-烷基，优选H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，更优选H或C1-C2-烷基；甚至更优选K为H。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可以是C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基；更优选甲基或乙基；还更优选乙基；和Z可以是其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，R1可以是被荧光团取代的C1-C8-烷基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以设置在●和Q之间。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可以是C2-C8-炔基，优选其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；和Z可以是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义；优选Z为/>其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可以是其中m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3；优选R1可以是/>其中m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；和Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义。优选Z为/>其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和Z可以是其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义。优选Z为/>其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和Z可以是其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义。优选Z为/>其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；和Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义；优选Z为/>其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O.任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可以是C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基；更优选甲基或乙基；还更优选乙基；和Z可以选自 其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●/> R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，R1可以是被荧光团取代的C1-C8-烷基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可以是C2-C8-炔基，优选其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选1、2或3，更优选1；和Z可以选自
/>其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O.任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可以是其中m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3；优选R1可以是/>其中m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；和Z可以选自
其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是/>义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文
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在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和Z可以选自
其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。任选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O.任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和Z可以选自
其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。任选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；和Z可以选自
其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。任选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O.任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，R1可选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为
或仍更优选R1为其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中K如本文所定义，优选K为H；和Z是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义。优选Z为/>其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。R1可以是任选取代的芳基。优选地，R1是任选取代的苯基。更优选R1为未取代的苯基。R1可以是任选取代的杂芳基。优选地，R1为任选取代的三唑基。更优选地，R1为被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基。R1可以是荧光团。更优选R1为被荧光团取代的三唑基。更优选R1为/>还更优选地，R1是其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1，优选R1是/>其中K是H或C1-C8-烷基，优选H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基；甚至更优选K为H，优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，●可以代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、可检测标签、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子位于●和Q之间，优选地，●表示氨基酸。任选地，●代表肽。任选地，●表示蛋白质。任选地，●表示抗体。任选地，●代表核苷酸。任选地，●表示寡核苷酸。在一些实施方案中，●表示糖。在一些实施方案中，●表示多糖。在一些实施方案中，●表示放射性或非放射性核素。在一些实施方案中，●代表报告酶。在一些实施方案中，●代表蛋白标签。任选地，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。任选地，●代表生物素。任选地，●表示连接子。优选地，●表示药物。任选地，●表示连接子-药物偶联物。任选地，●代表连接子-荧光团偶联物。在一些实施方案中，●代表聚合物。在一些实施方案中，●代表小分子。在一些实施方案中，●代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，●表示任选取代的苯基。优选地，●代表任选取代的芳族5或6元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，●可以代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子位于●和Q之间，优选地，●表示氨基酸。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。优选地，●代表核苷酸。优选地，●表示寡核苷酸。在一些实施方案中，●表示糖。在一些实施方案中，●表示多糖。在一些实施方案中，●表示放射性或非放射性核素。在一些实施方案中，●代表报告酶。在一些实施方案中，●代表聚合物。在一些实施方案中，●代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，●表示任选取代的苯基。优选地，●代表任选取代的芳族5或6元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备通式(III)化合物的任一种方法中，●表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，连接子位于●和Q之间。更优选地，●代表肽、蛋白质、抗体或寡核苷酸；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，●表示氨基酸。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。优选地，●代表核苷酸。优选地，●表示寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备式(III)化合物的任一方法中，●代表药物、蛋白质标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，连接子被设置在●和Q之间。优选地，●表示药物。优选地，●代表蛋白质标签。优选地，●表示连接子-药物偶联物。优选地，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，●代表生物素。优选地，●表示蛋白质。优选地，●代表肽。优选地，●表示抗体。优选地，●表示寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备通式(III)化合物的任一种方法中，●表示连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。优选地，●表示连接子。优选地，●代表荧光团。优选地，●代表连接子-荧光团偶联物。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，●代表小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，连接子被设置在●和Q之间。优选地，●表示小分子。优选地，●代表荧光团。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备通式(III)化合物的任一种方法中，●代表可检测的标签。任选地，在该实施方案中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备通式(III)化合物的任一种方法中，●表示连接子、药物或连接子-药物偶联物。优选地，●表示连接子。优选地，●表示药物。优选地，●表示连接子-药物偶联物。
当●代表连接子或连接子-药物偶联物时，连接子可以是能够将药物部分连接至Q的任何化学部分，其中Q如本文所定义。连接子可以是本领域技术人员已知的任何连接子。如本文所用，术语“连接子-药物偶联物”是指包含如本文定义的连接子和药物部分或由其组成的分子或化学基团。通常，在连接子药物偶联物中，连接子与药物共价连接。作为一个说明性的例子，用于本发明的连接子可以包含自切割肽，其可以被酶切割，例如组织蛋白酶B。特别地，酶可以切割连接子以释放药物。作为说明性实例，酶，如组织蛋白酶B，可以在摄取到细胞中之后切割连接子，使得药物在靶位置释放。特别地，用于本发明的包含自切割肽的连接子可以包含缬氨酸-瓜氨酸-对-氨基苄氧羰基(VC-PAB)部分、缬氨酸-丙氨酸-对-氨基苄氧羰基(VA-PAB)部分、赖氨酸-苯丙氨酸-对-氨基苄氧羰基(KF-PAB)部分或缬氨酸-赖氨酸-对-氨基苄氧羰基(VK-PAB)部分。具有自切割肽的连接子公开于例如美国专利申请公开US2006/0074008，G.M.Dubowchik等人，Bioconjugate Chem.2002,13,855-869或S.O.Doronina等人,Nature Biotechnology,vol.21,778-784(2003)，这些文献的全部公开内容通过引用结合于此。
当●代表连接子-药物偶联物时，连接子-药物偶联物可具有以下通式LD：
其中：/>
L是连接子；
D是药物；以及
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义。
优选地，当●代表连接子或连接子-药物偶联物时，连接子L是L1：
其中：
LS是任选的间隔基；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
*指示药剂的位置。
因此，L1具有缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(VC-PAB)部分。
连接子L可以是L2：
其中：
LS是任选的间隔基；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
*指示药剂的位置。
因此，L2具有缬氨酸-丙氨酸-对-氨基苄氧羰基(VA-PAB)部分。
连接子L可以是L3：
其中：
LS是任选的间隔基；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
*指示药剂的位置。
因此，L3具有赖氨酸-苯丙氨酸-对氨基苄氧羰基(KF-PAB)部分。
连接子L可以是L4：
其中：
LS是任选的间隔基；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
*指示药剂的位置。
因此，L4具有缬氨酸-赖氨酸-对氨基苄氧羰基(VK-PAB)部分。
如本文所述，LS是任选的间隔基。因此，LS可以存在或不存在。优选存在LS。本文所用术语“间隔基”可指能将氨基酸(式(L1)至(L4)中缬氨酸或赖氨酸)共价连接至Q的任何化学部分。为此目的，间隔基可以具有能够与氨基酸的氨基形成键的官能团。这种官能团可以是例如羰基，其可以被描述为例如-C(O)-。实际上可以使用任何间隔基部分(间隔基)。间隔基可以是例如直链或支链烃基部分。间隔基也可以包含环状部分。如果间隔基是烃基部分，则间隔基的主链可以仅包括碳原子，但也可以含有杂原子如氧(O)、氮(N)或硫(S)原子。间隔基可以例如包括C1-C20碳原子链或聚醚基链如具有-(O-CH2-CH2)-重复单元的聚乙二醇基链。在烃基间隔基的典型实施方案中，间隔基可包含1至约100、1至约75、1至约50、或1至约40、或1至约30、或1至约20个，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19个主链原子。在一些实施方案中，LS选自#-(C1-C10)亚烷基-C(O)-**、#-(C3-C8)碳环-C(O)-**、#-亚芳基-C(O)-**、#-(C1-C10)亚烷基-亚芳基-C(O)-**、#-亚芳基-(C1-C10)亚烷基-C(O)-**、#-(C1-C10)亚烷基-(C3-C8)碳环-C(O)-**、#-(C3-C8)碳环-(C1-C10)亚烷基-C(O)-**、#-(C3-C8)杂环-C(O)-**、-(C1-C10)亚烷基-(C3-C8)杂环-C(O)-**、#-(C3-C8)杂环-(C1-C10)亚烷基-C(O)-**、#-(CH2CH2CH2)r-C(O)-**、#-(CH2CH2CH2)r-(CH2)s-C(O)-**、#-(CH2CH2NH)r-C(O)-**、#-(CH2CH2NH)r-(CH2)s-C(O)-**、#-(CH2CH2O)r-C(O)-**和#-(CH2CH2O)r-(CH2)s-C(O)-**，其中r在每种情况下是1-20，优选1-10，更优选2-8，还更优选3-6的整数，甚至更优选r是4；和s在每种情况下是1-10，优选1-6，更优选1-4，还更优选1-3的整数，甚至更优选s是2；#表示Q的位置，**表示氨基酸(式(L1)-(L4)中的缬氨酸或赖氨酸)的位置。
优选地，当●表示连接子或连接子-药物结合物时，连接子L为L1*：
其中：
o是1至20，优选1至10，更优选2至8，还更优选3至6的整数，甚至更优选o是4；
p是0至9，优选0至5，更优选0至3，还更优选0至2的整数，甚至更优选p是1；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
*指示药物的位置。
连接子L可以是L2*：
其中：
o是1至20，优选1至10，更优选2至8，还更优选3至6的整数，甚至更优选o是4；
p是0至9，优选0至5，更优选0至3，还更优选0至2的整数，甚至更优选p是1；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
*指示药物的位置。
连接子L可以是L3*：
其中：
o是1至20，优选1至10，更优选2至8，还更优选3至6的整数，甚至更优选o是4；
p是0至9，优选0至5，更优选0至3，还更优选0至2的整数，甚至更优选p是1；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
*指示药物的位置。
连接子L可以是L4*：
其中：
o是1至20，优选1至10，更优选2至8，还更优选3至6的整数，甚至更优选o是4；
p是0至9，优选0至5，更优选0至3，还更优选0至2的整数，甚至更优选p是1；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
*指示药物的位置。
在一些实施方式中，当●代表连接子-药物偶联物时，连接子-药物偶联物LD可以是LD1：
其中：
LS是任选的间隔基；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
D为药物。
连接子-药物偶联物LD可以是LD2：
其中：
LS是任选的间隔基；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
D为药物。
连接子-药物偶联物LD可以是LD3：
其中：
LS是任选的间隔基；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
D为药物。
连接子-药物偶联物LD可以是LD4：
其中：
LS是任选的间隔基；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
D为药物。
优选地，当●表示连接子或连接子-药物偶联物时，所述连接子-药物偶联物LD为LD1*：
其中：
o是1至20，优选1至10，更优选2至8，还更优选3至6的整数，甚至更优选o是4；
p是0至9，优选0至5，更优选0至3，还更优选0至2的整数，甚至更优选p是1；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
D为药物。
连接子-药物偶联物LD可以是LD2*：
其中：
o是1至20，优选1至10，更优选2至8，还更优选3至6的整数，甚至更优选o是4；
p是0至9，优选0至5，更优选0至3，还更优选0至2的整数，甚至更优选p是1；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
D为药物。
连接子-药物偶联物LD可以是LD3*：
其中：
o是1至20，优选1至10，更优选2至8，还更优选3至6的整数，甚至更优选o是4；
p是0至9，优选0至5，更优选0至3，还更优选0至2的整数，甚至更优选p是1；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
D为药物。
连接子-药物偶联物LD可以是LD4*：
其中：
o是1至20，优选1至10，更优选2至8，还更优选3至6的整数，甚至更优选o是4；
p是0至9，优选0至5，更优选0至3，还更优选0至2的整数，甚至更优选p是1；
#表示Q的位置，其中Q如本文所定义；以及
D为药物。
本发明中使用的术语“药物”(其也可以表示为“药物D”或“药物部分D”)可以是本领域技术人员已知的任何药物。作为说明性实例，药物可以是细胞生长抑制药物或细胞毒性药物。作为说明性的例子，本发明所用的药物可以是澳瑞他汀(auristatin)，优选单甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E)(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(monomethylauristatin F)(MMAF)。
因此，在一些实施方案中，药物D是单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。MMAF由以下结构式表示：
单甲基澳瑞他汀F(MMAF)可通过用星号(*号)标记的氮原子与连接子结合。
在一些实施方案中，药物D是单甲基澳瑞他汀E(也称为MMAE)。MMAE由以下结构式表示：
单甲基澳瑞他汀E(MMAE)可以通过用星号(*)标记的氮原子与连接子结合。
当●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物时，Z可以是如本文定义的任何Z，其中●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物。因此，Z可以是如本文定义的任何其中●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物；Q可以是如本文所定义的任何Q。在一些实施方案中，当●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物时，Q可以是包含1、2或3个独立选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分，在一些实施方案中，Z可以是其中R5如本文定义，优选R5为H，因此，Z可为/>其中Q为/>且R5如本文定义，优选R5为H。在优选的实施方案中，当●表示连接子、药物或连接子-药物偶联物时，Z为/>其中Q为/>和R5如本文所定义，优选R5是H。
在一些实施方案中，当●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物时，R1可为任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。特别是当●表示连接子、药物或连接子-药物偶联物时，R1可以为M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；其中波浪线表示与Y的连接点。在这些实施方式中，Y可以是本文定义的任何Y。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O(氧)。
在其它实施方案中，当●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物时，R1可为任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基。在这些实施方案中，Y可以是如本文所定义的任何Y。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O(氧)。
在一些实施方式中，当●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物时，可以代表抗体。
在制备式(III)化合物的任一种方法中，可以代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系。优选地，/>表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸或小分子。更优选地，/>代表肽、蛋白质、抗体、寡核苷酸或小分子。优选地，/>表示氨基酸。优选地，/>代表肽。优选地，/>表示蛋白质。优选地，/>表示抗体。优选地，/>代表核苷酸。优选地，/>表示寡核苷酸。在一些实施方案中，/>代表糖。在一些实施方案中，/>代表多糖。在一些实施方案中，/>代表聚合物。优选地，/>表示小分子。在一些实施方案中，/>代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C6-烷基，更优选任选取代的C1-C4-烷基，还更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，/>代表任选取代的C3-C8-烷基，优选任选取代的C3-C6-烷基，更优选任选取代的C3-C4-烷基。在一些实施方案中，/>代表任选取代的C5-C8-烷基，优选任选取代的C6-C7-烷基。在一些实施方案中，/>代表任选取代的苯基。在一些实施方案中，/>代表任选取代的芳族5-或6-元杂环体系。/>
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，代表抗体，优选IgG抗体，例如西妥昔单抗或曲妥单抗或布来昔单抗；蛋白质，优选GFP蛋白或eGFP-蛋白、mCherry蛋白或白蛋白；小分子；肽，优选式(VIII)的肽/>
或式(IX)的化合物。
其中，#表示S的位置。优选表示抗体，例如西妥昔单抗或曲妥单抗或布来昔单抗。优选地，/>代表蛋白，例如GFP蛋白或eGFP-蛋白。在一些实施方案中，/>代表mCherry蛋白。在一些实施方案中，/>代表白蛋白。优选地，/>表示小分子。优选地，代表肽。更优选地，/>代表式(VIII)的肽/>更优选地，/>代表式(IX)的肽/>
在本发明任一方法的优选实施方案中，代表抗体(例如西妥昔单抗、曲妥单抗或布罗妥昔单抗)，并且●代表蛋白标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白、寡核苷酸或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表抗体，●代表蛋白标签。优选地，/>代表抗体，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，代表抗体，●代表生物素。优选地，/>表示抗体，●表示肽。优选地，/>代表抗体，●代表蛋白质。优选地，/>代表抗体，●代表寡核苷酸。优选地，/>代表抗体，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，代表蛋白质(例如GFP蛋白或eGFP蛋白或mCherry蛋白)，●代表蛋白质标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、抗体、蛋白质、寡核苷酸或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表蛋白质，●代表蛋白质标签。优选地，/>代表蛋白质，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，/>表示蛋白质，●表示生物素。优选地，/>表示蛋白质，●表示肽。优选地，/>表示蛋白质，表示抗体。优选地，/>代表蛋白质，●代表蛋白质。优选地，/>表示蛋白质，●表示寡核苷酸。优选地，/>代表蛋白质，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任何一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，代表肽，●代表蛋白质标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白质、寡核苷酸或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表肽，●代表蛋白标签。优选地，/>代表肽，●代表荧光团，例如CY5或EDANS。优选地，/>代表肽，●代表生物素。优选地，/>表示肽，●表示肽。优选地，/>表示肽，●表示蛋白质。优选地，/>代表肽，●代表寡核苷酸。优选地，/>代表肽，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，代表氨基酸，●代表蛋白质标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白质、寡核苷酸或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表氨基酸，●代表蛋白标签。优选地，/>代表氨基酸，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，/>代表氨基酸，●代表生物素。优选地，/>表示氨基酸，●表示肽。优选地，/>表示氨基酸，●表示蛋白质。优选地，表示氨基酸，●表示寡核苷酸。优选地，/>代表氨基酸，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，代表抗体(例如西妥昔单抗、曲妥单抗或布罗妥昔单抗)，●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物。优选地，/>表示抗体，●表示连接子。优选地，/>代表抗体，●代表药物。优选地，/>代表抗体，●代表连接子-药物偶联物。连接子、药物或连接子-药物偶联物可以是如本文所述的任何连接子、药物或连接子-药物偶联物。特别地，连接子、药物或连接子-药物偶联物可以是如本文关于●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物的实施方案所述的任何连接子、药物或连接子-药物偶联物。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，代表抗体(例如西妥昔单抗、曲妥单抗或布罗妥昔单抗)，●代表连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。优选地，表示抗体，●表示连接子。优选地，/>代表抗体，●代表荧光团。优选地，/>代表抗体，●代表连接子-荧光团偶联物。
优选地，在制备式(III)化合物的任一方法中，代表核苷酸，●代表肽、蛋白质标签、抗体、寡核苷酸、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表核苷酸，●代表肽。优选/>表示核苷酸，●表示蛋白质。优选地，/>代表核苷酸，●代表蛋白质标签。优选地，/>代表核苷酸，●代表抗体。优选地，/>代表核苷酸，●代表寡核苷酸。优选地，/>代表核苷酸，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，/>代表核苷酸，●代表生物素。优选地，/>代表核苷酸，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备通式(III)化合物的任一种方法中，代表核苷酸，●代表连接子。
优选地，在制备式(III)化合物的任一种方法中，代表寡核苷酸，●代表肽、蛋白质标签、抗体、寡核苷酸、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表寡核苷酸，●代表肽。优选地，/>表示寡核苷酸，●表示蛋白质。优选地，/>代表寡核苷酸，●代表蛋白质标签。优选地，/>表示寡核苷酸，●表示抗体。优选地，/>表示寡核苷酸，●表示寡核苷酸。优选地，/>代表寡核苷酸，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，/>代表寡核苷酸，●代表生物素。优选地，/>代表寡核苷酸，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备通式(III)化合物的任一方法中，代表寡核苷酸，●代表连接子。
在制备式(III)化合物的方法的一些实施方案中，●代表氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合。在一些实施方案中，●代表与固体支持物结合的氨基酸或肽。在一些实施方案中，●代表与固体支持物结合的核苷酸或寡核苷酸。优选地，●代表与固体支持物结合的肽。本发明的式(III)化合物在通常用于从固体支持物上切割肽的酸性条件下是稳定的，例如90％三氟乙酸(TFA)。固体支持物可以是本领域技术人员已知的任何适合于固相肽合成的固体支持物，或任何适合于固相寡核苷酸合成的固体支持物。这种固体支持物也称为树脂。适用于固相肽合成的固体支持物的说明性实例包括有机和无机支持物，例如Merrifield聚苯乙烯树脂(苯乙烯和1-2％二乙烯基苯的共聚物)、聚丙烯酰胺树脂、TentaGel(将聚乙二醇接枝到聚苯乙烯上的接枝聚合物)、Wang树脂(通常基于交联聚苯乙烯，例如在Merrifield树脂中)或具有限定孔径的多孔玻璃，作为无机固体支持物的实例。用于固相肽合成的市售固体支持物的说明性实例是由Merck Millipore提供的Rink酰胺树脂或TGR树脂。适用于固相寡核苷酸合成的固体支持物的说明性实例包括具有确定孔径的玻璃(可控孔度玻璃，CPG)和聚苯乙烯，如大孔聚苯乙烯(MPPS)。任选地，在氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合的上述实施方案中，连接子可以排列在●和Q之间。因此，●、Q、连接子和固体支持物可以如下排列：Q-连接子-氨基酸-固体支持物、Q-连接子-肽-固体支持物、Q-连接子-核苷酸-固体支持物或Q-连接子-寡核苷酸-固体支持物。“连接子”实际上可以是任何连接子，并且连接子排列在●和Q之间。连接子可以是本领域技术人员已知的任何连接子，例如肽连接子或直链或支链的基于烃的部分。连接子也可以包含环状部分。肽连接子可以包含例如1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、1至3、或2、或1个氨基酸。如果连接子是烃基部分，则连接子的主链可以仅包括碳原子，但也可以含有杂原子如氧(O)、氮(N)或硫(S)原子，和/或含有羰基(C＝O)。连接子可以是例如C1-C20碳原子链或聚醚基链如具有-(O-CH2-CH2)-重复单元的聚乙二醇基链。在基于烃的连接子的典型实施方案中，连接部分包含1至约150、1至约100、1至约75、1至约50、或1至约40、或1至约30、或1至约20个之间，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19个主链原子。本领域技术人员知道选择合适的连接子。
在制备式(III)化合物的方法的一些实施方案中，代表氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合。在一些实施方案中，代表与固体支持物结合的氨基酸或肽。在一些实施方案中，/>代表与固体支持物结合的核苷酸或寡核苷酸。优选地，/>代表与固体支持物结合的肽。
在制备式(III)化合物的方法的一些实施方案中，
在同一分子中。因此，本发明还涉及一种方法，其中使用式(L)化合物
其中在由连接Z和/>的弧所示的相同分子中，反应得到式(IIIa)的化合物：
其中如果式(L)化合物中的代表双键，则/>代表键，并且X代表/>或
如果式(L)化合物中的代表三键，则/>代表双键，且X代表R3-C；以及
R1、R3、R4、V、Y和Z如本文所定义。在一些实施方案中，在同一分子中具有的化合物(L)是肽，例如BCL9肽。因此，通过该方法获得的式(IIIa)化合物可以是环肽，例如衍生自BCL9肽的环肽。本文所述的所有用于式(I)、(II)和(III)化合物的方法可以类似于式(L)和(IIIa)化合物的方法进行。
制备抗体分子的偶联物的方法
本发明还涉及一种制备抗体分子的偶联物的方法，所述方法包括：
-在还原剂的存在下还原抗体分子的至少一个二硫桥；以及
-使所述抗体分子与式(IV*)的化合物反应
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；
R5表示H或C1-C8-烷基；以及
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基
产生包含至少一个式(V)部分的抗体分子的偶联物
其中SA和SB各自为抗体分子链的硫原子；
当式(IV*)化合物中的表示三键时，/>表示双键；或
当式(IV*)的化合物中的表示双键时，/>表示键；
当是双键时，V不存在；或/>
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；以及
其中R1、R3、R4、R5、Y和Z如对式(IV*)化合物所定义。
所述V、X、Y、R1、R2、R3、R4、R5、Z、●和/>可以如本文对任一种方法、化合物和/或偶联物所定义。如本文中关于任一种方法、化合物和/或偶联物所定义的任何/>V、X、Y、R1、R2、R3、R4、R5、Z、●和/>可以彼此组合。
本发明提供一种通过与不饱和磷(V)化合物反应制备抗体分子偶联物的方法，该方法包括用还原剂还原抗体分子的二硫桥，得到两个相应的巯基，然后通过与式(IV)化合物反应再桥接巯基，得到抗体分子偶联物。本文所述的方法允许将大量的不同有机残基在位置处组合，并因此将R1、Z和●与抗体分子组合。例如，根据本发明的方法允许抗体与复杂分子例如荧光团偶联。所获得的偶联物是高度稳定的，特别是在生理相关条件下，例如在人血清中，在小硫醇的存在下，和在活细胞内的条件下。偶联在多种反应条件下进行，例如在生理相关条件下，例如生理pH。如以下实施例所示，在本文所述的抗体分子的偶联物中，抗体可保持对靶标的特异性，即其可保持其靶标选择性(参见例如以下实施例7)。
在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，抗体分子可以选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体和分离的抗体。因此，抗体分子可以是IgA。抗体分子可以是IgD。抗体分子可以是IgE。抗体分子可以是IgM。抗体分子可以是人抗体。抗体分子可以是人源化抗体。抗体分子可以是嵌合抗体。抗体分子可以是单克隆抗体。抗体分子可以是分离的抗体。优选地，抗体分子是IgG，例如曲妥珠单抗、西妥昔单抗或布罗妥昔。式(IV*)的化合物提供了修饰IgG的所有四个链间二硫化物的可能性，这允许提供四个的精确抗体-货物比。特别地，本发明的方法至少允许通过式(V)的部分在重链和轻链之间形成链间交联。重链与轻链的这种交联可以在例如人IgG中C226和C229位的半胱氨酸之间形成。通过应用本文所述的方法，也可以形成由一条抗体重链和一条抗体轻链组成的半抗体分子(参见例如下面的实施例7和11)。
在制备抗体分子的任一种方法中，还原剂可以选自三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、连二亚硫酸钠、硫代硫酸钠和亚硫酸钠。因此，还原剂可以是二硫苏糖醇(DTT)。还原剂可以是连二亚硫酸钠。还原剂可以是亚硫酸钠。优选地，还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，表示三键；V不存在；X代表R3-C，R3代表H或C1-C8-烷基；R5代表H或C1-C8-烷基；和/>代表双键。优选地，R3表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，R3为H，优选地，R5表示H或C1-C6-烷基，更优选地，R5表示H或C1-C4-烷基，还更优选地，R5表示H或C1-C2-烷基。更优选地，R5为H.优选地，在制备抗体分子偶联物的任一种方法中，当/>为三键且X为R3-C时，R3和R5相同；更优选地，当/>是三键且X是R3-C时，R3和R5都是H。
在一些实施方案中，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，可表示双键；V可以是H或C1-C8-烷基；X可以表示/>；R3和R4可以独立地表示H或C1-C8-烷基；R5代表H或C1-C8-烷基；和/>可以代表键。优选地，R3和R4独立地表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。优选R3和R4相同。更优选R3和R4都是H，优选V是H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，V是H，在优选实施方案中，R3、R4和V是相同的；更优选地，R3、R4和V各自为H。优选地，在制备抗体分子偶联物的任一种方甚至更优选地，R3、R4、R5和V各自为H。
关于本文所用的表示和/>，应注意，如本领域技术人员通常所知，每个碳原子是四价的。因此，结构/>其中X和V如本文所定义，星号(*)表示与磷的连接，包括结构/>其中R3、R4和V如本文所定义。结构/>其中SA、X和V如本文所定义，星号(*)表示与磷的连接，包括结构其中R3、R4、SA和V如本文所定义，H为氢。
在任一种制备抗体分子偶联物的方法中，可以代表/>其中/>表示与磷的连接点；Y表示O、NR2、S或键；R1代表任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；和R2代表H或C1-C8-烷基。优选地，在每种情况下，R1通过碳原子结合到Y。
因此，Y可以是氧(O)。
Y可以是NR2。R2为H或C1-C8-烷基。优选地，R2是C1-C8-烷基。更优选R2为甲基、乙基、丙基或丁基。还更优选R2为甲基或乙基。
Y可以是S(硫)。
Y可以是键。特别是；Y可以是连接R1与磷的单键。
R1，无论何时在本说明书中提及，可以是任何脂族或芳族残基，其可以任选被取代，并且其不干扰制备如本文所述的抗体分子的偶联物的方法。因此，R1包括宽范围的脂族或芳族残基，例如调节水溶性的基团(例如乙二醇低聚物)，可用于进一步官能化的基团(例如包含碳-碳三键的基团，其可进一步官能化，例如所谓的“点击手柄”，其可通过1，3-偶极环加成进一步官能化)，或荧光团(参见例如以下实施例2和7)。本领域技术人员知道选择与本文所述方法相容的合适残基R1。
在任一种制备抗体分子偶联物的方法中，R1可代表小分子；C1-C8-烷基，其任选被以下的至少一个取代：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30或30；C2-C8-链烯基；C2-C8-炔基；优选在每种情况下Y为O。因此，R1可以是小分子。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是C1-C8-烷基，其任选被F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基和/或-S-S-(C1-C8-烷基)中的至少一个取代。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被C2-C8-烯基取代的C1-C8-烷基。R1可以是任选被C2-C8-炔基取代的C1-C8-烷基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。
在任一制备抗体分子偶联物的方法中，R1可代表任选独立地被以下中至少一个取代的苯基：C1-C8-烷基，(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。因此，R1可以是任选被C1-C8-烷基取代的苯基。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2和/或-N(C1-C8-烷基)2中的至少一个取代的苯基。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是键。
在任一种制备抗体分子偶联物的方法中，R1可代表5-或6-元杂芳族体系，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。
在任一制备抗体分子偶联物的方法中，R1可代表小分子；C1-C8-烷基；被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基；被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；或任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基。因此，R1可以表示小分子，优选Y可以是O。R1可以代表C1-C8-烷基，优选Y可以是O。R1可以代表被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基，优选Y可以是O。R1可代表被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，且优选Y可为O。R1可以代表被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，并且优选Y可以是O。R1可代表C2-C8-烯基，优选Y可为O。R1代表任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基，优选Y为O。R1可代表C2-C8-炔基，优选Y可为O。R1可代表苯基，优选Y可为键。R1可表示被-NO2取代的苯基，优选Y可为键。R1可代表被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基，且优选Y可为键。R1可表示被荧光团取代的三唑基，且优选Y可为键。
优选地，在制备抗体分子偶联物的任一方法中，R1可代表C1-C8-烷基。优选地，R1代表甲基、乙基、丙基或丁基。更优选R1代表甲基或乙基。更优选R1代表乙基。优选地，在这些实施方式的任一个中，R1为O。
在任一种制备抗体分子偶联物的方法中，R1可选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。因此，R1可以是小分子。R1可以是荧光团。R1可以是任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基。R1可以是任选取代的C2-C8-烯基。R1可以是任选取代的C2-C8-炔基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。
优选地，在制备抗体分子偶联物的任一方法中，R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选地，R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为更优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。因此，R1可以是乙基。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。优选R1为M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选3、4或5，还更优选4。R1可以是荧光团。R1可以是任选被荧光团取代的C1-C8-烷基。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4。R1可以是C2-C8-炔基。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选1、2或3，更优选2。优选地，R1为其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3。更优选地，R1为/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、21、13、20、21、22、24、20、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，并且n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。优选地，在这些实施方案的任何一个中，Y是O。
优选地，在制备抗体分子偶联物的任一种方法中，R1可选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为或仍更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>，其中K为H或C1-C8-烷基，优选K为H；优选其中在每种情况下Y是键。因此，R1可以是任选取代的芳基。优选地，R1是任选取代的苯基。更优选R1为未取代的苯基。R1可以是任选取代的杂芳基。优选地，R1为任选取代的三唑基。更优选地，R1为被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基。R1可以是荧光团。更优选R1为被荧光团取代的三唑基。更优选R1为/>还更优选地，R1是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1。优选R1是/>，其中K是H或C1-C8-烷基，优选H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，更优选H或C1-C2-烷基；甚至更优选K为H，优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。
在任一制备抗体分子偶联物的方法中，R1可代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、可检测标签、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环系统；其中任选地，R1和Y之间有连接子。优选地，R1代表氨基酸。优选地，R1代表肽。优选地，R1代表蛋白质。优选地，R1代表抗体。优选地，R1代表核苷酸。优选地，R1代表寡核苷酸。在一些实施方案中，R1表示糖。在一些实施方案中，R1表示多糖。在一些实施方式中，R1表示放射性核素或非放射性核素。在一些实施方案中，R1代表报告酶。在一些实施方案中，R1代表蛋白质标签。优选地，R1代表荧光团如CY5、荧光素或EDANS。优选地，R1代表生物素。优选地，R1表示连接子。优选地，R1代表药物。优选地，R1表示连接子-药物偶联物。优选地，R1表示连接子-荧光团偶联物。在一些实施方式中，R1表示聚合物。在一些实施方案中，R1表示小分子。在一些实施方案中，R1代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，R1表示任选取代的苯基。优选地，R1表示任选取代的芳族5-或6-元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在R1和Y之间。
在任一种制备抗体分子偶联物的方法中，R1可代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，R1和Y之间有连接子。优选地，R1代表氨基酸。优选地，R1代表肽。优选地，R1代表蛋白质。优选地，R1代表抗体。优选地，R1代表核苷酸。优选地，R1代表寡核苷酸。在一些实施方案中，R1表示糖。在一些实施方案中，R1表示多糖。在一些实施方式中，R1表示放射性核素或非放射性核素。在一些实施方案中，R1代表报告酶。在一些实施方式中，R1表示聚合物。在一些实施方案中，R1代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，R1表示任选取代的苯基。优选地，R1表示任选取代的芳族5-或6-元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在R1和Y之间。
优选地，在制备抗体分子偶联物的任一方法中，R1代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，R1和Y之间有连接子。更优选地，R1代表肽、蛋白质、抗体或寡核苷酸；其中任选地，R1和Y之间有连接子。优选地，R1代表氨基酸。优选地，R1代表肽。优选地，R1代表蛋白质。优选地，R1代表抗体。优选地，R1代表核苷酸。优选地，R1代表寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在R1和Y之间。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，R1代表药物、蛋白质标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，R1和Y之间有连接子。优选地，R1代表药物。优选地，R1代表蛋白质标签。优选地，R1表示连接子-药物偶联物。优选地，R1代表荧光团如CY5、荧光素或EDANS。优选地，R1代表生物素。优选地，R1代表蛋白质。优选地，R1代表肽。优选地，R1代表抗体。优选地，R1代表寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在R1和Y之间。
优选地，在制备抗体分子偶联物的任一方法中，R1代表连接子、药物或连接子-药物偶联物。优选地，R1表示连接子。优选地，R1代表药物。优选地，R1表示连接子-药物偶联物。
优选地，在制备抗体分子偶联物的任一种方法中，R1代表可检测标签。任选地，在该实施方案中，连接子可以排列在R1和Y之间。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，R1代表连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。优选地，R1表示连接子。优选地，R1表示荧光团。优选地，R1表示连接子-荧光团偶联物。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，R1代表小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，R1和Y之间设置有连接子。优选地，R1表示小分子。优选地，R1表示荧光团。优选地，R1代表肽。优选地，R1代表蛋白质。优选地，R1代表抗体。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在R1和Y之间。
在整个说明书中，无论本文关于任何方法、化合物或结合物指出的是，任选地连接子位于R1和Y之间等，连接子实际上可以是本领域技术人员已知的任何连接子，例如在此公开的用于位于●和Q之间的那些连接子，例如肽连接子或直链或支链烃基部分。连接子也可以包含环状部分。肽连接子可以包含例如1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、1至3、或2、或1个氨基酸。如果连接子是基于烃基的部分，则连接子的主链可以仅包括碳原子，但也可以含有杂原子如氧(O)、氮(N)或硫(S)原子，和/或可以含有羰基(C＝O)。连接子可以是例如C1-C20碳原子链或聚醚基链如具有-(O-CH2-CH2)-重复单元的聚乙二醇基链。在基于烃的连接子的典型实施方案中，连接部分包含1至约150、1至约100、1至约75、1至约50、或1至约40、或1至约30、或1至约20个之间，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19个主链原子。其中连接子位于R1和Y之间(Y是荧光团)的说明性示例化合物如下所示：
其中所述连接子是/>例如，当本说明书涉及“连接子”本身时，或涉及“连接子-药物偶联物”，例如在抗体药物偶联物的上下文中，或涉及“连接子-荧光团偶联物”，例如在抗体荧光团偶联物的上下文中，也可以使用上述示例性连接子。本领域技术人员知道选择合适的连接子。
在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，可以表示Z；Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包括基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
优选地，在制备抗体偶联物的任一种方法中，Z是其中/>表示与磷的连接点，且●如本文所定义；和Q是包含至少三个主链碳原子和碳碳双键的部分，其中至少一个主链原子是选自S、O或N的杂原子，优选S。任选地，在每种情况下，连接子可以排列在●和Q之间。更优选Z是/>其中Q是/>Rx是H或C1-C8-烷基；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基；和●如本文所定义；任选地，连接子可以排列在●和Q之间。优选地，Rx是H或C1-C6-烷基。更优选Rx是H或C1-C4-烷基，还更优选Rx是H或C1-C2-烷基。更优选Rx为H。优选地，在任一种方法中，当/>为三键且X为R3-C时，R3和Rx相同；更优选地，R3、Rx和R5是相同的。更优选地，当/>是三键和X是R3-C时，R3和Rx都是H；甚至更优选地，R3、Rx和R5各自为H。优选地，在任一种方法中，当/>为双键且X为/>时，R3、R4和Rx相同；甚至更优选地，R3、R4、Rx和R5是相同的；更优选地，R3、R4、Rx、R5和V是相同的。更优选地，当/>是双键且X是/>时，R3、R4和Rx各自是H；甚至更优选地，R3、R4、Rx和R5各自为H；更优选地，R3、R4、Rx、R5和V各自为H。R10，当存在时，可以是H或C1-C6-烷基，优选H或C1-C4-烷基，更优选H或C1-C2-烷基。还更优选R10为H。G可以是NR10。G可以是O。优选地，G是S。因此，更优选地，Z是其中Q是/>Rx和●如本文所定义；任选地，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备抗体偶联物的任一种方法中，Z是其中/>表示与磷的连接点，且●如本文所定义；和Q是含有1、2或3个独立选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分。任选地，在每种情况下，在●和Q之间设置连接子。更优选地，Z选自 其中Rx是H或C1-C8-烷基；R6为C1-C8-烷基，和●如本文所定义。因此，Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>优选Z为/>其中Q为/>更优选Z为/>其中Q为/>任选地，在这些实施方案的任何一个中，连接子可以排列在●和Q之间，优选地，Rx是H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。更优选Rx为H。优选在任一种方法中，当/>为三键且X为R3-C时，R3和Rx相同；更优选R3、Rx和R5是相同的。更优选地，当/>是三键和X是R3-C时，R3和Rx都是H；甚至更优选地，R3、Rx和R5各自为H。优选地，在任一种方法中，当/>为双键且X为/>时，R3、R4和Rx相同；甚至更优选地，R3、R4、Rx和R5是相同的；更优选地，R3、R4、Rx、R5和V是相同的。更优选地，当/>是双键且X是时，R3、R4和Rx各自是H；甚至更优选地，R3、R4、Rx和R5各自为H；更优选地，R3、R4、Rx、R5和V各自为H。R6，当存在时，可以是C1-C8-烷基，优选C1-C6-烷基，更优选C1-C4-烷基，还更优选C1-C2-烷基。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，Z是其中/>表示与磷的连接点，且●如本文所定义；和Q是包含与式(I)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与该碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分；或Q是包含与式(IV*)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与该碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分。任选地，在每种情况下，连接子排列在●和Q之间。更优选地，Z是/>其中Q是/>任选地，连接子可以排列在●和Q之间，更优选地，Z是/>其中Q是任选地，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●可以表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，●表示氨基酸。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。优选地，●代表核苷酸。优选地，●表示寡核苷酸。在一些实施方案中，●表示糖。在一些实施方案中，●表示多糖。在一些实施方案中，●表示放射性或非放射性核素。在一些实施方案中，●代表报告酶。在一些实施方案中，●代表蛋白标签。优选地，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，●代表生物素。优选地，●表示连接子。优选地，●表示药物。优选地，●表示连接子-药物偶联物。优选地，●代表连接子-荧光团偶联物。在一些实施方案中，●代表聚合物。在一些实施方案中，●代表小分子。在一些实施方案中，●代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，●表示任选取代的苯基。优选地，●代表任选取代的芳族5或6元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在任一种制备抗体分子的偶联物的方法中，●可以代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、可检测标签、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，●表示氨基酸。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。优选地，●代表核苷酸。优选地，●表示寡核苷酸。在一些实施方案中，●表示糖。在一些实施方案中，●表示多糖。在一些实施方案中，●表示放射性或非放射性核素。在一些实施方案中，●代表报告酶。在一些实施方案中，●代表聚合物。在一些实施方案中，●代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，●表示任选取代的苯基。优选地，●代表任选取代的芳族5或6元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，连接子位于●和Q之间。更优选地，●代表肽、蛋白质、抗体或寡核苷酸；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，●表示氨基酸。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。优选地，●代表核苷酸。优选地，●表示寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一方法中，●代表药物、蛋白质标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，连接子被设置在●和Q之间。优选地，●表示药物。优选地，●代表蛋白质标签。优选地，●表示连接子-药物偶联物。优选地，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，●代表生物素。优选地，●表示蛋白质。优选地，●代表肽。优选地，●表示抗体。优选地，●表示寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●表示连接子、药物或连接子-药物偶联物。优选地，●表示连接子。优选地，●表示药物。优选地，●表示连接子-药物偶联物。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●代表可检测标签。任选地，在该实施方案中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●表示连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。优选地，●表示连接子。优选地，●代表荧光团。优选地，●代表连接子-荧光团偶联物。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●表示小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，连接子被设置在●和Q之间。优选地，●表示小分子。优选地，●代表荧光团。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●可以代表小分子；任选被以下的至少一个取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30或30取代；C2-C8-烯基；C2-C8-炔基；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。●因此可以是小分子。●可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以是C1-C8-烷基，其任选被F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基和/或-S-S-(C1-C8-烷基)中的至少一个取代。●可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以是任选被C2-C8-烯基取代的C1-C8-烷基。●可以是任选被C2-C8-炔基取代的C1-C8-烷基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●可以代表任选独立地被以下中的至少一个取代的苯基：C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；其中任选地，连接子位于●和Q之间。因此，●可以是任选地被C1-C8-烷基取代的苯基。●可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以是任选被F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2和/或-N(C1-C8-烷基)2中的至少一个取代的苯基。●可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。任选地，在这些实施方案的任何一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在任一种制备抗体分子偶联物的方法中，R1可代表5-或6-元杂芳族系统，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●可以代表小分子，C1-C8-烷基，被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基，被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；或任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基；其中任选地，在●和Q之间排列连接子。●因此可以代表小分子。●可以代表C1-C8-烷基。●可以代表被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基。●可以代表被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以代表被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以表示C2-C8-烯基。●可以代表被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基。●可以代表苯基。●可以表示被-NO2取代的苯基。●可以表示被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基。●可以表示被荧光团取代的三唑基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●可以表示C1-C8-烷基；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。优选地，●代表甲基、乙基、丙基或丁基。更优选地，●表示甲基或乙基。更优选地，●表示乙基。优选地，在这些实施方式的任一个中，R1是O。任选地，在这些实施方式的任一个中，连接子可排列在●和Q之间。
在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●可选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；其中任选地，在●和Q之间排列连接子。●因此可以是小分子。●可以是荧光团。●可以是任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基。●可以是任选取代的C2-C8-烯基。●可以是任选取代的C2-C8-炔基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选●为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选3、4或5，还更优选4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选●为其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选●为更优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。因此，●可以是乙基。●可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。优选●是M是氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选氢或甲基，并且其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选3、4或5，还更优选4。●可以是荧光团。●可以是任选地被荧光团取代的C1-C8-烷基。优选地，●是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5。优选地，●是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4。R1可以是C2-C8-炔基。优选地，●为/>其中n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。优选地，●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选1、2或3，更优选2。优选地，●为其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3。更优选●为其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选3，4，22.23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，并且n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在制备抗体分子的偶联物的任一种方法中，●可选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，仍然更优选●为或仍然更优选●是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选●是/>其中K是H或C1-C8-烷基，优选K是H；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。因此，●可以是任选取代的芳基。优选地，●是任选取代的苯基。更优选地，●是未取代的苯基。●可以是任选取代的杂芳基。优选地，●是任选取代的三唑基。更优选地，●是被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基。●可以是荧光团。更优选地，●是被荧光团取代的三唑基。仍然更优选地，●是仍然更优选地，●是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1。优选地，●是/>，其中K是H或C1-C8-烷基，优选H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，更优选H或C1-C2-烷基；甚至更优选K为H。任选地，在这些实施方案的任何一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在整个说明书中，无论本文关于任何方法、化合物或偶联物指出的何处，任选地，连接子排列在●和Q之间等，连接子实际上可以是本领域技术人员已知的任何连接子，例如肽连接子或直链或支链的烃基部分，例如在此描述的那些连接子中的任何一种。连接子也可以包含环状部分。肽连接子可以包含例如1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、1至3、或2、或1个氨基酸。如果连接子是烃基部分，则连接子的主链可以仅包括碳原子，但也可以含有杂原子如氧(O)、氮(N)或硫(S)原子，和/或可以含有羰基(C＝O)。连接子可以是例如C1-C20碳原子链或聚醚基链如具有-(O-CH2-CH2)-重复单元的聚乙二醇基链。在基于烃的连接子的典型实施方案中，连接部分包含1至约150、1至约100、1至约75、1至约50、或1至约40、或1至约30、或1至约20个之间，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19个主链原子。其中连接子位于●和Q之间的进一步说明性实施例化合物如下所示：
其中所述连接子是例如，当本说明书涉及“连接子”本身时，或涉及“连接子-药物偶联物”，例如在抗体药物偶联物的上下文中，或涉及“连接子-荧光团偶联物”，例如在抗体荧光团偶联物的上下文中，也可以使用上述示例性连接子。本领域技术人员知道选择合适的连接子。
化合物
式(I)、(IV)、(III)、(L)和(IIIa)的化合物
本发明还涉及式(I)化合物
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X表示/>
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；以及
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
在任一种式(I)化合物中，V、X、Y、R1、R2、R3、R4、Z和●可如本文中对任一种方法、化合物和/或偶联物所定义。如本文中任一方法、化合物和/或偶联物所定义的任何V、X、Y、R1、R2、R3、R4、Z和●可彼此组合。
优选地，在任一式(I)化合物中，表示三键；V不存在；X表示R3-C，R3表示H或C1-C8-烷基。优选地，R3表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选R3为H。
在一些实施方案中，在式(I)化合物的任一种中，可以表示双键；V可以是H或C1-C8-烷基；X可以表示/>和R3和R4可以独立地表示H或C1-C8-烷基。优选地，R3和R4独立地表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。优选地，R3和R4是相同的；甚至更优选R3、R4和V相同。更优选R3和R4都是H，优选V是H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，V是H，在优选的实施方案中，R3、R4和V各自是H。
本发明还涉及式(III)的化合物
其中
表示双键；或
表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并且包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；以及
代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系。
在式(III)化合物的任一种中，V、X、Y、R1、R2、R3、R4、Z、●和/>可以如本文针对方法、化合物和/或偶联物的任一种所定义。如本文对于任一种方法、化合物和/或偶联物所定义的任何/>V、X、Y、R1、R2、R3、R4、Z、●和/>可彼此组合。
优选地，在式(III)化合物的任一种中，表示双键；V不存在；X表示R3-C，R3表示H或C1-C8-烷基。优选地，R3表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选R3为H。
在一些实施方案中，在式(III)化合物的任一种中，可以表示键；V可以是H或C1-C8-烷基；X可以表示/>和R3和R4可以独立地表示H或C1-C8-烷基。优选地，R3和R4独立地表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。优选地，R3和R4是相同的；甚至更优选R3、R4和V相同。更优选R3和R4都是H，优选V是H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，V是H，在优选的实施方案中，R3、R4和V各自是H。
优选地，在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，Z是其中/>表示与磷的连接点，且●如本文所定义；和Q是包含至少三个主链碳原子和一个碳碳双键的部分，其中至少一个主链原子是选自S、O或N的杂原子，优选S。任选地，在每种情况下，连接子可以排列在●和Q之间，更优选Z是/>其中Q是/>R5为H或C1-C8-烷基；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基；和●如本文所定义；任选地，连接子可以排列在●和Q之间，优选R5为H或C1-C6-烷基，更优选R5为H或C1-C4-烷基，还更优选R5为H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，R5为H，优选地，在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，当X为R3-C时，R3和R5相同；更优选地，当X为R3-C时，R3和R5均为H，优选地，在式(I)或(III)化合物的任一种中，当X为/>时，R3、R4和R5相同；甚至更优选R3、R4、R5和V相同。更优选地，当X为/>时，R3、R4和R5各自为H；更优选地，R3、R4、R5和V各自为H。R10，当存在时，可以是H或C1-C6-烷基，优选H或C1-C4-烷基，更优选H或C1-C2-烷基。还更优选R10为H。G可以是NR10。G可以是O，优选地，G是S。因此，优选地，Z是/>其中Q是/>并且R5和●如本文所定义；任选地，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，Z是其中/>表示与磷的连接点，且●如本文所定义；和Q是含有1、2或3个独立选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分。任选地，在每种情况下，在●和Q之间设置连接子，更优选地，Z选自/>其中R5是H或C1-C8-烷基；R6为C1-C8-烷基，和●如本文所定义。因此，Z可以是/>其中Q是/>Z可以是其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>Z可以是其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>Z可以是其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>优选Z为/>其中Q为/>更优选Z为/>其中Q为/>任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。优选地，R5为H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，R5为H，优选地，在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，当X为R3-C时，R3和R5相同；更优选地，当X为R3-C时，R3和R5均为H，优选地，在式(I)或(III)化合物的任一种中，当X为/>时，R3、R4和R5相同；甚至更优选R3、R4、R5和V相同。更优选地，当X为/>时，R3、R4和R5各自为H；甚至更优选地，R3、R4、R5和V是H。R6，当存在时，可以是C1-C8-烷基，优选C1-C6-烷基，更优选C1-C4-烷基，还更优选C1-C2-烷基。
优选地，在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，Z是其中/>表示与磷的连接点，且●如本文所定义；以及
Q是包含与式(I)或式(III)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与该碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分；或
Q是包含与式(I)或式(II)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与该碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分。任选地，在每种情况下，连接子排列在●和Q之间。更优选地，Z是，其中Q是/>任选地，连接子可以排列在●和Q之间，更优选地，Z是/>其中Q是/>任选地，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或(III)的化合物中的任何一个中，Y表示O、NR2，其中R2表示H或C1-C8-烷基、S或键。优选地，在每种情况下，R1通过碳原子结合到Y。
因此，Y可以是O(氧)。
Y可以是NR2。R2为H或C1-C8-烷基。优选地，R2是C1-C8-烷基。更优选R2为甲基、乙基、丙基或丁基。还更优选R2为甲基或乙基。
Y可以是S(硫)。
Y可以是键。特别地，Y可以是连接R1与磷的单键。
在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，R1可表示小分子；任选被以下中的至少一个取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30或30；C2-C8-烯基；C2-C8-炔基；优选在这些实施方案的任何一个中，Y是O。因此，R1可以是小分子。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是C1-C8-烷基，其任选被F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基和/或-S-S-(C1-C8-烷基)中的至少一个取代。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被C2-C8-烯基取代的C1-C8-烷基。R1可以是任选被C2-C8-炔基取代的C1-C8-烷基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。
在式(I)或(III)的化合物的任何一个中，R1可表示任选独立地被以下中的至少一个取代的苯基：C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；优选地，在每种情况下Y是键。因此，R1可以是任选被C1-C8-烷基取代的苯基。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2和/或-N(C1-C8-烷基)2中的至少一个取代的苯基。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是键。
在式(I)或(III)的化合物中的任何一种中，R1可以代表5-或6-元杂芳族体系，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。
在式(I)或(III)的化合物中的任何一种中，R1可表示小分子、C1-C8-烷基、被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基、被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；或任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或被-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基。因此，R1可以表示小分子，优选Y可以是O。R1可以代表C1-C8-烷基，优选Y可以是O。R1可以代表被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基，优选Y可以是O。R1可代表被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，且优选Y可为O。R1可以代表被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，并且优选Y可以是O。R1可代表C2-C8-烯基，优选Y可为O。R1代表任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基，优选Y为O。R1可代表C2-C8-炔基，优选Y可为O。R1可代表苯基，优选Y可为键。R1可表示被-NO2取代的苯基，优选Y可为键。R1可代表被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基，且优选Y可为键。R1可表示被荧光团取代的三唑基，且优选Y可为键。
优选地，在式(I)或(III)的化合物中的任何一种中，R1可以代表C1-C8-烷基。优选地，R1代表甲基、乙基、丙基或丁基。更优选R1代表甲基或乙基。更优选R1代表乙基。优选地，在这些实施方式的任一个中，R1为O。
在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，R1可选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。因此，R1可以是小分子。R1可以是荧光团。R1可以是任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基。R1可以是任选取代的C2-C8-烯基。R1可以是任选取代的C2-C8-炔基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。
优选地，在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C1-C8-烷基，其任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为更优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。因此，R1可以是乙基。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。优选R1为M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选3、4或5，还更优选4。R1可以是荧光团。R1可以是任选被荧光团取代的C1-C8-烷基。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4。R1可以是C2-C8-炔基。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选1、2或3，更优选2。优选R1为其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3。更优选地，R1为/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、21、13、20、21、22、24、20、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，并且n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。优选地，在这些实施方案的任何一个中，Y是O。
在式(I)或(III)的化合物中的任何一种中，R1可以选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为或仍然更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中K为H或C1-C8-烷基，优选K为H；优选其中在每种情况下Y是键。因此，R1可以是任选取代的芳基。优选地，R1是任选取代的苯基。更优选R1为未取代的苯基。R1可以是任选取代的杂芳基。优选地，R1为任选取代的三唑基。更优选地，R1为被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基。R1可以是荧光团。更优选R1为被荧光团取代的三唑基。更优选R1为/>还更优选地，R1是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1。优选R1是/>，其中K是H或C1-C8-烷基，优选H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，更优选H或C1-C2-烷基；甚至更优选K为H，优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。
在式(I)或(III)的化合物中的任何一种中，R1可以是C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基；更优选甲基或乙基；还更优选乙基；和Z可以是其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，R1可以是被荧光团取代的C1-C8-烷基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或(III)的化合物中的任何一种中，R1可以是C2-C8-炔基，优选其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；和Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义；优选Z为/>其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。/>
在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，R1可以是其中m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3；优选R1可以是/>其中m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；和Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义。优选Z为其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或(III)的化合物的任何一种中，R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和Z可以是其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义。优选Z为/>其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或(III)的化合物的任何一种中，R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和Z可以是其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义。优选Z为/>其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。/>
优选地，在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；和Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义；优选Z为/>其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或(III)的化合物中的任何一种中，R1可以是C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基；更优选甲基或乙基；还更优选乙基；和Z可以选自 其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，R1可以是被荧光团取代的C1-C8-烷基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或(III)的化合物中的任何一种中，R1可以是C2-C8-炔基，优选其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选1、2或3，更优选1；和Z可以选自
其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>，其中Q是/>，R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，R1可以是其中m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3；优选R1可以是/>其中m是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；和Z可以选自
/>其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>，其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或(III)的化合物的任何一种中，R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和Z可以选自
其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。任选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或(III)的化合物的任何一种中，R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和Z可以选自
其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。任选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(I)或(III)的化合物中的任一种中，R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优/>
其中R5如本文所定义，优选R5为H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。更优选地，Z是/>其中Q是R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。优选地，Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；R6如本文所定义；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。Z可以是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；和●如本文所定义。任选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或(III)的化合物中的任何一种中，R1可以选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为或仍更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中K如本文所定义，优选K为H；和Z是/>其中Q是/>R5如本文所定义，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10如本文所定义，优选R10是H；和●如本文所定义。优选Z为/>其中Q为/>R5如本文所定义，优选R5为H，且●如本文所定义。R1可以是任选取代的芳基。优选地，R1是任选取代的苯基。更优选R1为未取代的苯基。R1可以是任选取代的杂芳基。优选地，R1为任选取代的三唑基。更优选地，R1为被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基。R1可以是荧光团。更优选R1为被荧光团取代的三唑基。更优选R1为还更优选地，R1是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1，优选R1是/>，其中K是H或C1-C8-烷基，优选H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基；甚至更优选K为H，优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或式(III)的化合物的任何一种中，●可以代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、可检测标签、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，●表示氨基酸。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。优选地，●代表核苷酸。优选地，●表示寡核苷酸。在一些实施方案中，●表示糖。在一些实施方案中，●表示多糖。在一些实施方案中，●表示放射性或非放射性核素。在一些实施方案中，●代表报告酶。在一些实施方案中，●代表蛋白标签。优选地，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，●代表生物素。优选地，●表示连接子。优选地，●表示药物。优选地，●表示连接子-药物偶联物。优选地，●代表连接子-荧光团偶联物。在一些实施方案中，●代表聚合物。在一些实施方案中，●代表小分子。在一些实施方案中，●代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，●表示任选取代的苯基。优选地，●代表任选取代的芳族5或6元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(I)或式(III)的化合物的任何一种中，●可以代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，●表示氨基酸。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。优选地，●代表核苷酸。优选地，●表示寡核苷酸。在一些实施方案中，●表示糖。在一些实施方案中，●表示多糖。在一些实施方案中，●表示放射性或非放射性核素。在一些实施方案中，●代表报告酶。在一些实施方案中，●代表聚合物。在一些实施方案中，●代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，●表示任选取代的苯基。优选地，●代表任选取代的芳族5或6元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(I)或式(III)的化合物的任一种中，●表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，连接子位于●和Q之间。更优选地，●代表肽、蛋白质、抗体或寡核苷酸；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，●表示氨基酸。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。优选地，●代表核苷酸。优选地，●表示寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(I)或式(III)的化合物的任何一种中，●代表药物、蛋白质标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，连接子被设置在●和Q之间。优选地，●表示药物。优选地，●代表蛋白质标签。优选地，●表示连接子-药物偶联物。优选地，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，●代表生物素。优选地，●表示蛋白质。优选地，●代表肽。优选地，●表示抗体。优选地，●表示寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(I)或式(III)的化合物的任一种中，●表示连接子、药物或连接子-药物偶联物。优选地，●表示连接子。优选地，●表示药物。优选地，●表示连接子-药物偶联物。连接子、药物或连接子-药物偶联物可以是如本文所述的任何连接子、药物或连接子-药物偶联物。特别地，连接子、药物或连接子-药物偶联物可以是如本文关于●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物的实施方案所述的任何连接子、药物或连接子-药物偶联物。
在一些实施方式中，当●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物时，可以代表抗体。
优选地，在式(I)或式(III)的化合物的任何一种中，●代表可检测的标签。任选地，在该实施方案中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(I)或式(III)的化合物的任一种中，●表示连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。优选地，●表示连接子。优选地，●代表荧光团。优选地，●代表连接子-荧光团偶联物。
优选地，在式(I)或式(III)的化合物的任一种中，●表示小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，连接子被设置在●和Q之间。优选地，●表示小分子。优选地，●代表荧光团。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(III)的化合物的任一种中，可以表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系。优选地，/>表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸或小分子。更优选地，/>代表肽、蛋白质、抗体、寡核苷酸或小分子。优选地，/>表示氨基酸。优选地，/>代表肽。优选地，/>表示蛋白质。优选地，/>表示抗体。优选地，/>代表核苷酸。优选地，/>表示寡核苷酸。在一些实施方案中，/>代表糖。在一些实施方案中，代表多糖。在一些实施方案中，/>代表聚合物。优选地，/>表示小分子。在一些实施方案中，/>代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C6-烷基，更优选任选取代的C1-C4-烷基，还更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，/>代表任选取代的C3-C8-烷基，优选任选取代的C3-C6-烷基，更优选任选取代的C3-C4-烷基。在一些实施方案中，/>代表任选取代的C5-C8-烷基，优选任选取代的C6-C7-烷基。在一些实施方案中，代表任选取代的苯基。在一些实施方案中，/>代表任选取代的芳族5-或6-元杂环体系。
优选地，在式(III)化合物的任一种中，代表抗体，优选IgG抗体，例如西妥昔单抗或曲妥珠单抗或布伦妥昔单抗；蛋白质，优选GFP蛋白或eGFP-蛋白、mCherry蛋白或白蛋白；小分子；肽，优选式(VIII)的肽/>
或式(IX)的化合物。
其中，#表示S的位置，优选表示抗体，例如西妥昔单抗或曲妥珠单抗或布伦妥昔单抗。优选地，/>代表蛋白，例如GFP蛋白或eGFP-蛋白。在一些实施方案中，/>代表mCherry蛋白。在一些实施方案中，/>代表白蛋白。优选地，/>表示小分子。优选地，代表肽。更优选地，/>代表式(VIII)的肽/>更优选地，/>代表式(IX)的肽/>
优选地，在式(III)的化合物的任一种中，代表抗体(例如西妥昔单抗、曲妥单抗或布罗妥昔单抗)，并且●代表蛋白标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白、寡核苷酸或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表抗体，●代表蛋白标签。优选地，/>代表抗体，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，代表抗体，●代表生物素。优选地，/>表示抗体，●表示肽。优选地，/>代表抗体，●代表蛋白质。优选地，/>代表抗体，●代表寡核苷酸。优选地，/>代表抗体，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(III)的化合物的任一种中，代表蛋白质(例如GFP蛋白或eGFP蛋白或mCherry蛋白)，●代表蛋白质标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、抗体、蛋白质、寡核苷酸或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表蛋白质，●代表蛋白质标签。优选地，/>代表蛋白质，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，/>表示蛋白质，●表示生物素。优选地，/>表示蛋白质，●表示肽。优选地，表示蛋白质，●表示抗体。优选地，/>代表蛋白质，●代表蛋白质。优选地，/>表示蛋白质，●表示寡核苷酸。优选地，/>代表蛋白质，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任何一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在任一式(III)化合物中，代表肽，●代表蛋白质标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白质、寡核苷酸或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表肽，●代表蛋白标签。优选地，/>代表肽，●代表荧光团，例如CY5或EDANS。优选地，/>代表肽，●代表生物素。优选地，/>表示肽，●表示肽。优选地，表示肽，●表示蛋白质。优选地，/>代表肽，●代表寡核苷酸。优选地，/>代表肽，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在任一式(III)化合物中，代表氨基酸，●代表蛋白质标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白质、寡核苷酸或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表氨基酸，●代表蛋白标签。优选地，/>代表氨基酸，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，/>代表氨基酸，●代表生物素。优选地，/>表示氨基酸，●表示肽。优选地，/>表示氨基酸，●表示蛋白质。优选地，/>表示氨基酸，●表示寡核苷酸。优选地，/>代表氨基酸，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(III)的化合物的任一种中，代表抗体(例如西妥昔单抗、曲妥单抗或布鲁妥昔单抗)，●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物。优选地，/>表示抗体，●表示连接子。优选地，/>代表抗体，●代表药物。优选地，/>代表抗体，●代表连接子-药物偶联物。连接子、药物或连接子-药物偶联物可以是如本文所述的任何连接子、药物或连接子-药物偶联物。特别地，连接子、药物或连接子-药物偶联物可以是如本文关于●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物的实施方案所述的任何连接子、药物或连接子-药物偶联物。
优选地，在式(III)的化合物的任一种中，代表抗体(例如西妥昔单抗、曲妥单抗或布鲁妥昔单抗)，●代表连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。优选地，/>表示抗体，●表示连接子。优选地，/>代表抗体，●代表荧光团。优选地，/>代表抗体，●代表连接子-荧光团偶联物。
优选地，在任一式(III)化合物中，代表核苷酸，●代表肽、蛋白质标签、抗体、寡核苷酸、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表核苷酸，●代表肽。优选地/>表示核苷酸，●表示蛋白质。优选地，/>代表核苷酸，●代表蛋白质标签。优选地，/>代表核苷酸，●代表抗体。优选地，代表核苷酸，●代表寡核苷酸。优选地，/>代表核苷酸，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，/>代表核苷酸，●代表生物素。优选地，/>代表核苷酸，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在任一式(III)化合物中，代表核苷酸，●代表连接子。
优选地，在任一式(III)化合物中，代表寡核苷酸，●代表肽、蛋白质标签、抗体、寡核苷酸、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素或小分子；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，/>代表寡核苷酸，●代表肽。优选地，/>表示寡核苷酸，●表示蛋白质。优选地，/>代表寡核苷酸，●代表蛋白质标签。优选地，/>表示寡核苷酸，●表示抗体。优选地，/>表示寡核苷酸，●表示寡核苷酸。优选地，/>代表寡核苷酸，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，/>代表寡核苷酸，●代表生物素。优选地，/>代表寡核苷酸，●代表小分子。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在任一式(III)化合物中，代表寡核苷酸，●代表连接子。
在式(I)或式(III)化合物任一种的一些实施方案中，●代表氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合。在一些实施方案中，●代表与固体支持物结合的氨基酸或肽。在一些实施方案中，●代表与固体支持物结合的核苷酸或寡核苷酸。优选地，●表示与固体支持物结合的肽。本发明的式(III)化合物在通常用于从固体支持物上切割肽的酸性条件下是稳定的，例如90％三氟乙酸(TFA)。固体支持物可以是本领域技术人员已知的任何适合于固相肽合成的固体支持物，或任何适合于固相寡核苷酸合成的固体支持物。这种固体支持物也称为树脂。适用于固相肽合成的固体支持物的说明性实例包括有机和无机支持物，例如Merrifield聚苯乙烯树脂(苯乙烯和1-2％二乙烯基苯的共聚物)、聚丙烯酰胺树脂、TentaGel(将聚乙二醇接枝到聚苯乙烯上的接枝聚合物)、Wang树脂(通常基于交联聚苯乙烯，例如在Merrifield树脂中)或具有限定孔径的多孔玻璃，作为无机固体支持物的实例。用于固相肽合成的市售固体支持物的说明性实例是由Merck Millipore提供的Rink酰胺树脂或TGR树脂。适用于固相寡核苷酸合成的固体支持物的说明性实例包括具有确定孔径的玻璃(可控孔度玻璃，CPG)和聚苯乙烯，如大孔聚苯乙烯(MPPS)。任选地，在氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合的上述实施方案中，连接子可以排列在●和Q之间。因此，●、Q连接子和固体支持物可以如下排列：Q-连接子-氨基酸-固体支持物、Q-连接子-肽-固体支持物、Q-连接子-核苷酸-固体支持物或Q-连接子-寡核苷酸-固体支持物。“连接子”实际上可以是任何连接子，并且连接子排列在●和Q之间。连接子可以是本领域技术人员已知的任何连接子，例如肽连接子或直链或支链的基于烃的部分。连接子也可以包含环状部分。肽连接子可以包含例如1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、1至3、或2、或1个氨基酸。如果连接子是烃基部分，则连接子的主链可以仅包括碳原子，但也可以含有杂原子如氧(O)、氮(N)或硫(S)原子，和/或含有羰基(C＝O)。连接子可以是例如C1-C20碳原子链或聚醚基链如具有-(O-CH2-CH2)-重复单元的聚乙二醇基链。在基于烃的连接子的典型实施方案中，连接部分包含1至约150、1至约100、1至约75、1至约50、或1至约40、或1至约30、或1至约20个之间，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19个主链原子。本领域技术人员知道选择合适的连接子。
在式(III)化合物任一种的一些实施方案中，代表氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合。在一些实施方案中，/>代表与固体支持物结合的氨基酸或肽。在一些实施方案中，/>代表与固体支持物结合的核苷酸或寡核苷酸。优选地，/>表示与固体支持物结合的肽。
本发明还涉及式(IIIa)的化合物
其中
表示双键；或
表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>以及
R1、R3、R4、V、X、Y、Z和如本文上下文所定义，特别是如关于式(III)化合物所定义。优选地，化合物(IIIa)是环肽，例如衍生自BCL9肽的环肽。
本发明还涉及式(IV)的化合物
其中R1、R5、V、X和Y如本文中对任一种方法和化合物所定义。因此，在式(IV)化合物的任一种中，/>V，X，Y，R1和R5可如本文关于方法、化合物和/或偶联物的任一种所定义。如本文定义的用于任一种方法、化合物和/或偶联物的任何/>V、X、Y、R1和R5可彼此组合。
式(IV*)化合物和抗体分子的偶联物
本发明还涉及式(IV*)的化合物
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；
当是双键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；
R5表示H或C1-C8-烷基；以及
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
在式(IV*)的化合物中的任一种中，V、X、Y、R1、R2、R3、R4、R5、Z、/>和●可以如本文针对方法、化合物和/或偶联物中的任一种所定义。如本文对于任一种方法、化合物和/或偶联物所定义的任何/>V、X、Y、R1、R2、R3、R4、R5、Z、/>和●可彼此组合。
优选地，在式(IV*)的化合物中的任一种中，表示三键；V不存在；X代表R3-C，R3代表H或C1-C8-烷基；和R5代表H或C1-C8-烷基。优选地，R3表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，R3为H，优选地，R5表示H或C1-C6-烷基，更优选地，R5表示H或C1-C4-烷基，还更优选地，R5表示H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，R5为H，优选地，在式(IV*)的化合物中的任一种中，当/>为三键且X为R3-C时，R3和R5相同；更优选地，当/>是三键且X是R3-C时，R3和R5都是H。
在一些实施方案中，在式(IV*)的化合物中的任一种中，可表示双键；V可以是H或C1-C8-烷基；X可以表示/>R3和R4可以独立地表示H或C1-C8-烷基；和R5代表H或C1-C8-烷基。优选地，R3和R4独立地表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。优选R3和R4相同。更优选R3和R4都是H，优选V是H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，V为H，在优选的实施方案中，R3、R4和V各自为H，优选地，在式(IV*)的化合物中的任一种中，当/>为双键且X为/>时，R3、R4和R5相同；甚至更优选R3、R4、R5和V相同。更优选地，当/>是双键且X是/>时，R3、R4和R5各自是H；更优选地，R3、R4、R5和V各自为H。
本发明还涉及包含至少一个式(V)部分的抗体分子的偶联物
其中SA和SB各自为抗体分子链的硫原子；
表示双键；或
表示化学键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；
R5表示H或C1-C8-烷基；以及
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
在抗体分子的任一偶联物中，、V、X、Y、R1、R2、R3、R4、R5、Z、/>和●可以如本文针对任一方法、化合物和/或偶联物所定义。如本文对于任一种方法、化合物和/或偶联物所定义的任何/>、V、X、Y、R1、R2、R3、R4、R5、Z、/>和●可彼此组合。
在抗体分子的任一偶联物中，抗体分子可以选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体和分离的抗体。因此，抗体分子可以是IgA。抗体分子可以是IgD。抗体分子可以是IgE。抗体分子可以是IgM。抗体分子可以是人抗体。抗体分子可以是人源化抗体。抗体分子可以是嵌合抗体。抗体分子可以是单克隆抗体。抗体分子可以是分离的抗体。优选地，抗体分子是IgG，例如曲妥珠单抗、西妥昔单抗或或布伦妥昔单抗。
优选地，在抗体分子的任一偶联物中，代表双键；V不存在；X代表R3-C，R3代表H或C1-C8-烷基；和R5代表H或C1-C8-烷基。优选地，R3表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，R3为H，优选地，R5表示H或C1-C6-烷基，更优选地，R5表示H或C1-C4-烷基，还更优选地，R5表示H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，R5为H。优选地，在抗体分子的任一偶联物中，当/>为双键且X为R3-C时，R3和R5相同；更优选地，当/>是双键且X是R3-C时，R3和R5都是H。
在一些实施方案中，在抗体分子的任一偶联物中，可表示键；V可以是H或C1-C8-烷基；X可以表示/>R3和R4可以独立地表示H或C1-C8-烷基；和R5代表H或C1-C8-烷基。优选地，R3和R4独立地表示H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。优选R3和R4相同。更优选R3和R4都是H，优选V是H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。甚至更优选地，V是H，在优选实施方案中，R3、R4和V是相同的；更优选地，R3、R4和V各自为H，优选地，在抗体分子的任一偶联物中，当/>为键且X为/>时，R3、R4和R5为相同的；甚至更优选R3、R4、R5和V相同。更优选地，当/>是键且X是/>时，R3、R4和R5各自为H；甚至更优选地，R3、R4、R5和V各自为H。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，可以表示/>其中/>表示与磷的连接点；Y表示O、NR2、S或键；R1代表任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；和R2代表H或C1-C8-烷基。优选地，在每种情况下，R1通过碳原子结合到Y。
因此，Y可以是氧(O)。
Y可以是NR2。R2为H或C1-C8-烷基。优选地，R2是C1-C8-烷基。更优选R2为甲基、乙基、丙基或丁基。还更优选R2为甲基或乙基。
Y可以是S(硫)。
Y可以是键。特别地，Y可以是连接R1与磷的单键。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物的任一种中，R1可以表示小分子；任选被以下的至少一个取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30或30；C2-C8-烯基；C2-C8-炔基；优选在每种情况下Y为O。因此，R1可以是小分子。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被以下中的至少一个取代的C1-C8-烷基：F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基和/或-S-S-(C1-C8-烷基)。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被C2-C8-烯基取代的C1-C8-烷基。R1可以是任选被C2-C8-炔基取代的C1-C8-烷基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1可以表示任选独立地被以下的至少一种取代的苯基：C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、29、28或30；优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。因此，R1可以是任选被C1-C8-烷基取代的苯基。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2和/或-N(C1-C8-烷基)2中的至少一个取代的苯基。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是键。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1可以表示5元或6元杂芳族体系，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1可表示小分子、C1-C8-烷基、被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基、被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；或任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基。因此，R1可以表示小分子，优选Y可以是O。R1可以代表C1-C8-烷基，优选Y可以是O。R1可以代表被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基，优选Y可以是O。R1可代表被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，且优选Y可为O。R1可以代表被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，并且优选Y可以是O。R1可代表C2-C8-烯基，优选Y可为O。R1代表任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基，优选Y为O。R1可代表C2-C8-炔基，优选Y可为O。R1可代表苯基，优选Y可为键。R1可表示被-NO2取代的苯基，优选Y可为键。R1可代表被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基，且优选Y可为键。R1可表示被荧光团取代的三唑基，且优选Y可为键。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1可表示C1-C8-烷基。优选地，R1代表甲基、乙基、丙基或丁基。更优选R1代表甲基或乙基。更优选R1代表乙基。优选地，在这些实施方式的任一个中，R1为O。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1可以选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。因此，R1可以是小分子。R1可以是荧光团。R1可以是任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基。R1可以是任选取代的C2-C8-烯基。R1可以是任选取代的C2-C8-炔基。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O。
优选地，在式(IV*)化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为更优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。因此，R1可以是乙基。R1可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。R1可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。优选地，R1为M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选3、4或5，还更优选4。R1可以是荧光团。R1可以是任选被荧光团取代的C1-C8-烷基。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，优选R1为其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4。R1可以是C2-C8-炔基。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。优选地，R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选1、2或3，更优选2。优选地，R1为其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3。更优选地，R1为/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、21、13、20、21、22、24、20、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，并且n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。优选地，在这些实施方案的任何一个中，Y是O。
优选地，在式(IV*)化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1可以选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为或仍更优选R1为其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中K为H或C1-C8-烷基，优选K为H；优选其中在每种情况下Y是键。因此，R1可以是任选取代的芳基。优选地，R1是任选取代的苯基。更优选R1为未取代的苯基。R1可以是任选取代的杂芳基。优选地，R1为任选取代的三唑基。更优选地，R1为被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基。R1可以是荧光团。更优选R1为被荧光团取代的三唑基。更优选R1为还更优选地，R1是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1，优选R1是/>其中K是H或C1-C8-烷基，优选H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，更优选H或C1-C2-烷基；甚至更优选K为H。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y为键。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1可以表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、可检测标签、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，R1和Y之间有连接子。优选地，R1代表氨基酸。优选地，R1代表肽。优选地，R1代表蛋白质。优选地，R1代表抗体。优选地，R1代表核苷酸。优选地，R1代表寡核苷酸。在一些实施方案中，R1表示糖。在一些实施方案中，R1表示多糖。在一些实施方式中，R1表示放射性核素或非放射性核素。在一些实施方案中，R1代表报告酶。在一些实施方案中，R1代表蛋白质标签。优选地，R1代表荧光团如CY5、荧光素或EDANS。优选地，R1代表生物素。优选地，R1表示连接子。优选地，R1代表药物。优选地，R1表示连接子-药物偶联物。优选地，R1表示连接子-荧光团偶联物。在一些实施方式中，R1表示聚合物。在一些实施方案中，R1表示小分子。在一些实施方案中，R1代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，R1表示任选取代的苯基。优选地，R1表示任选取代的芳族5-或6-元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在R1和Y之间。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1可以表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，R1和Y之间有连接子。优选地，R1代表氨基酸。优选地，R1代表肽。优选地，R1代表蛋白质。优选地，R1代表抗体。优选地，R1代表核苷酸。优选地，R1代表寡核苷酸。在一些实施方案中，R1表示糖。在一些实施方案中，R1表示多糖。在一些实施方式中，R1表示放射性核素或非放射性核素。在一些实施方案中，R1代表报告酶。在一些实施方式中，R1表示聚合物。在一些实施方案中，R1代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，R1表示任选取代的苯基。优选地，R1表示任选取代的芳族5-或6-元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在R1和Y之间。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，R1和Y之间有连接子。更优选地，R1代表肽、蛋白质、抗体或寡核苷酸；其中任选地，R1和Y之间有连接子。优选地，R1代表氨基酸。优选地，R1代表肽。优选地，R1代表蛋白质。优选地，R1代表抗体。优选地，R1代表核苷酸。优选地，R1代表寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在R1和Y之间。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1表示药物、蛋白质标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，R1和Y之间有连接子。优选地，R1代表药物。优选地，R1代表蛋白质标签。优选地，R1表示连接子-药物偶联物。优选地，R1代表荧光团如CY5、荧光素或EDANS。优选地，R1代表生物素。优选地，R1代表蛋白质。优选地，R1代表肽。优选地，R1代表抗体。优选地，R1代表寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在R1和Y之间。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1表示连接子、药物或连接子-药物偶联物。优选地，R1表示连接子。优选地，R1代表药物。优选地，R1表示连接子-药物偶联物。
优选地，在式(IV*)化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1表示可检测标签。任选地，在该实施方案中，连接子可以排列在R1和Y之间。
优选地，在式(IV*)化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1表示连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。优选地，R1表示连接子。优选地，R1表示荧光团。优选地，R1表示连接子-荧光团偶联物。
优选地，在式(IV*)化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1表示小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，R1和Y之间设置有连接子。优选地，R1表示小分子。优选地，R1表示荧光团。优选地，R1代表肽。优选地，R1代表蛋白质。优选地，R1代表抗体。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在R1和Y之间。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，可以表示Z；Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包括基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，Z是其指示与磷的连接点，并且●如本文所定义；和Q是包含至少三个主链碳原子和一个碳碳双键的部分，其中至少一个主链原子是选自S、O或N的杂原子，优选S。任选地，在每种情况下，连接子可以排列在●和Q之间。更优选Z是/>其中Q是/>RX是H或C1-C8-烷基；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基；和●如本文所定义；任选地，连接子可以排列在●和Q之间。优选地，RX是H或C1-C6-烷基，更优选地，RX是H或C1-C4-烷基，仍更优选地，RX是H或C1-C2-烷基。更优选地，RX为H。优选地，在式(IV*)化合物或抗体分子的偶联物的任一种中，当X为R3-C时，R3和RX相同；更优选地，R3、RX和R5是相同的。更优选地，当X是R3-C时，R3和RX都是H；更优选地，R3、RX和R5各自为H。优选地，在式(IV*)化合物或抗体分子的偶联物的任一种中，当X为R4和RX各自是H；甚至更优选地，R3、R4、RX和R5各自为H；更优选地，R3、R4、RX、R5和V各自为H。R10，当存在时，可以是H或C1-C6-烷基，优选H或C1-C4-烷基，更优选H或C1-C2-烷基。还更优选R10为H。G可以是NR10。G可以是O，优选地，G是S，因此，更优选地，Z是/>其中Q是RX和●如本文所定义；任选地，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，Z是其中/>指示与磷的连接点，并且●如本文所定义；和Q是含有1、2或3个独立选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分。任选地，在每种情况下，在●和Q之间设置连接子，更优选地，Z选自/>/>其中RX是H或C1-C8-烷基；R6为C1-C8-烷基，和●如本文所定义。因此，Z可以是/>其中Q是Z可以是/>其中Q是 其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>Z可以是/>其中Q是/>优选Z为/>其中Q为/>更优选Z为/>其中Q为/>任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。优选RX是H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，还更优选H或C1-C2-烷基。更优选地，RX为H，优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，当X为R3-C时，R3和RX相同；更优选地，R3、RX和R5是相同的。更优选地，当X是R3-C时，R3和RX都是H；更优选地，R3、RX和R5各自为H，优选地，在式(IV*)化合物或抗体分子的偶联物的任一种中，当X为/>R3、R4和RX相同时；更优选地，R3、R4、RX和R5是相同的；甚至更优选地，R3、R4、RX、R5和V是相同的。更优选地，当X是/>时，R3、R4和RX各自是H；甚至更优选地，R3、R4、RX和R5各自为H；更优选地，R3、R4、RX、R5和V各自为H。R6，当存在时，可以是C1-C8-烷基，优选C1-C6-烷基，更优选C1-C4-烷基，还更优选C1-C2-烷基。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，Z是其中/>指示与磷的连接点，并且●如本文所定义；以及
Q是含有与式(IV*)化合物或式(V)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与该碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分，或
Q是包含与式(IV*)中的磷或式(V)的部分键合的碳-碳三键和与该碳-碳三键键合的任选取代的碳-碳双键的部分。任选地，在每种情况下，连接子排列在●和Q之间。更优选地，Z是其中Q是/>任选地，连接子可以排列在●和Q之间。更优选地，Z是/>其中Q是/>任选地，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●可以表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，●表示氨基酸。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。优选地，●代表核苷酸。优选地，●表示寡核苷酸。在一些实施方案中，●表示糖。在一些实施方案中，●表示多糖。在一些实施方案中，●表示放射性或非放射性核素。在一些实施方案中，●代表报告酶。在一些实施方案中，●代表蛋白标签。优选地，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，●代表生物素。优选地，●表示连接子。优选地，●表示药物。优选地，●表示连接子-药物偶联物。优选地，●代表连接子-荧光团偶联物。在一些实施方案中，●代表聚合物。在一些实施方案中，●代表小分子。在一些实施方案中，●代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，●表示任选取代的苯基。优选地，●代表任选取代的芳族5或6元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●可以表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，●表示氨基酸。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。优选地，●代表核苷酸。优选地，●表示寡核苷酸。在一些实施方案中，●表示糖。在一些实施方案中，●表示多糖。在一些实施方案中，●表示放射性或非放射性核素。在一些实施方案中，●代表报告酶。在一些实施方案中，●代表聚合物。在一些实施方案中，●代表任选取代的C1-C8-烷基，优选任选取代的C1-C4-烷基，更优选任选取代的C1-C2-烷基。在一些实施方案中，●表示任选取代的苯基。优选地，●代表任选取代的芳族5或6元杂环体系。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，连接子位于●和Q之间。更优选地，●代表肽、蛋白质、抗体或寡核苷酸；其中任选地，连接子位于●和Q之间。优选地，●表示氨基酸。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。优选地，●代表核苷酸。优选地，●表示寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(IV*)化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●表示药物、蛋白质标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，连接子被设置在●和Q之间。优选地，●表示药物。优选地，●代表蛋白质标签。优选地，●表示连接子-药物偶联物。优选地，●代表荧光团，例如CY5、荧光素或EDANS。优选地，●代表生物素。优选地，●表示蛋白质。优选地，●代表肽。优选地，●表示抗体。优选地，●表示寡核苷酸。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●表示连接子、药物或连接子-药物偶联物。优选地，●表示连接子。优选地，●表示药物。优选地，●表示连接子-药物偶联物。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●表示可检测标签。任选地，在该实施方案中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●表示连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。优选地，●表示连接子。优选地，●代表荧光团。优选地，●代表连接子-荧光团偶联物。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●表示小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，连接子被设置在●和Q之间。优选地，●表示小分子。优选地，●代表荧光团。优选地，●代表肽。优选地，●表示蛋白质。优选地，●表示抗体。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●可以表示小分子；任选被以下中的至少一个取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30或30；C2-C8-烯基；C2-C8-炔基；其中任选地，在●和Q之间排列连接子。因此，●可以是小分子。●可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以是C1-C8-烷基，其任选被F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基和/或-S-S-(C1-C8-烷基)中的至少一个取代。●可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以是任选被C2-C8-烯基取代的C1-C8-烷基。●可以是任选被C2-C8-炔基取代的C1-C8-烷基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●可以表示任选独立地被以下的至少一个取代的苯基：C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、29、28或28；其中任选地，连接子位于●和Q之间。因此，●可以是任选地被C1-C8-烷基取代的苯基。●可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以是任选被F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2和/或-N(C1-C8-烷基)2中的至少一个取代的苯基。●可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的苯基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。任选地，在这些实施方案的任何一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，R1可以表示5元或6元杂芳族体系，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●可以表示小分子、C1-C8-烷基、被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基、被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；或任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基；其中任选地，在●和Q之间排列连接子。因此，●可以代表小分子。●可以代表C1-C8-烷基。●可以代表被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基。●可以代表被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以代表被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以表示C2-C8-烯基。●可以代表被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基。●可以代表苯基。●可以表示被-NO2取代的苯基。●可以表示被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基。●可以表示被荧光团取代的三唑基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●可以表示C1-C8-烷基；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。优选地，●代表甲基、乙基、丙基或丁基。更优选地，●表示甲基或乙基。更优选地，●表示乙基。优选地，在这些实施方式的任一个中，R1是O。任选地，在这些实施方式的任一个中，连接子可排列在●和Q之间。
在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●可以选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；其中任选地，在●和Q之间排列连接子。因此，●可以是小分子。●可以是荧光团。●可以是任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基。●可以是任选取代的C2-C8-烯基。●可以是任选取代的C2-C8-炔基。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选●为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选3、4或5，还更优选4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选●为更优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。因此，●可以是乙基。●可以是任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。●可以是任选被羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。优选●是M是氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选氢或甲基，并且其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选3、4或5，还更优选4。●可以是荧光团。●可以是任选地被荧光团取代的C1-C8-烷基。优选地，●是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5。优选地，●是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4。R1可以是C2-C8-炔基。优选地，●为/>其中n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。优选地，●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选1、2或3，更优选2。优选地，●为其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3。更优选地●为/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，并且n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
优选地，在式(IV*)的化合物或抗体分子的偶联物中的任一种中，●可选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，仍更优选●为或仍更优选●是其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选●是/>，其中K是H或C1-C8-烷基，优选K是H；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。因此，●可以是任选取代的芳基。优选地，●是任选取代的苯基。更优选地，●是未取代的苯基。●可以是任选取代的杂芳基。优选地，●是任选取代的三唑基。更优选，●是被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基。●可以是荧光团。更优选地，●是被荧光团取代的三唑基。更优选地，●是/>更优选，●是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1。优选地，●是/>其中K是H或C1-C8-烷基，优选H或C1-C6-烷基，更优选H或C1-C4-烷基，更优选H或C1-C2-烷基；甚至更优选K为H。任选地，在这些实施方案的任何一个中，连接子可以排列在●和Q之间。
此外，还优选本文提供的作为式(I)、(III)、(IIIa)、(IV*)化合物和抗体分子偶联物的实施例部分中实例的抗体分子的化合物和偶联物。
本领域技术人员理解，根据本发明的实施例可以彼此组合，条件是排除了违反任何自然法则的组合。
本文参照任何方法描述的任何实施方案、特征、定义等也适用于已作必要修正的抗体分子的任何化合物和/或偶联物。以相同的方式，本文所述的关于抗体分子的任何化合物和/或偶联物的任何实施方案、特征、定义等适用于本文所述的已作必要修正的任何方法。
用于样品的巯基-/半胱氨酸-特异性全蛋白质组分布的方法，和从样品中分离巯 基-/半胱氨酸-特异性蛋白质的方法
本发明的化合物还可以用于样品的巯基-/半胱氨酸-特异性全蛋白质组分布的分析。在这种方法中，将样品与本发明的式(I)化合物一起孵育，其中●是可检测标签。所述化合物与可检测标签偶联或包含可检测标签。因此，样品中含巯基的蛋白质，特别是含半胱氨酸的蛋白质与可检测标签偶联(通过式(I)的化合物，其中●是可检测标签)。之后，样品中包含的蛋白质(标记的和未标记的)可以通过沉淀，例如通过使用冰冷的丙酮来富集。在任选的沉淀步骤之后，可基于可检测标签富集样品的含巯基蛋白质，特别是含半胱氨酸的蛋白质。最后，可以对富集和分离的偶联蛋白进行酶消化，例如通过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Lys-C、Lys-N、Asp-N、Glu-C和/或Arg-C进行酶消化。为了分析蛋白质组，可以通过质谱法，例如LC-MS/MS，分析偶联的蛋白质或消化的蛋白质。
因此，本发明还涉及一种用于样品的巯基特异性，特别是半胱氨酸特异性，全蛋白质组分析(proteome-wide profiling)的方法，所述方法包括：
(a)将样品与式(I)化合物一起孵育，其中●代表可检测标签，从而将包含巯基的蛋白质，特别是半胱氨酸，特异性地偶联至标签上；
(b)任选地通过沉淀富集样品中包含的蛋白质；
(c)任选地富集与可检测标签偶联的蛋白质，优选通过使它们与固相如可逆地结合可检测标签的珠接触；
(d)分析偶联的蛋白质。
可检测标签可以是例如脱硫生物素。
分析偶联的蛋白质可以例如通过质谱法进行。质谱可以是例如LC-MS/MS。分析偶联的蛋白质还可以包括消化，例如胰蛋白酶消化，特别是在质谱分析之前。因此，可以进行偶联蛋白的分析，例如通过(胰蛋白酶)消化，然后进行LC-MS/MS。
在一个实施方式中，步骤(c)包括：
(1)使步骤(a)或(b)中获得的样品与固相接触，所述固相包含与所述可检测标签可逆结合的配体，从而将已与所述标签偶联的蛋白质可逆地固定在所述固相上；
(2)将所述固相与所述样品的剩余部分分离；
(3)破坏固相配体和偶联蛋白的标签之间的可逆键，例如通过用竞争物如生物素置换标记。
可逆地结合可检测标签的配体可以是例如链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白。
破坏固相配体和偶联蛋白的标记之间的可逆键可以例如通过用竞争剂如生物素置换标签来进行。
本发明还适用于从样品中巯基-/半胱氨酸-特异性分离蛋白质。因此，所有含巯基的蛋白质，特别是含半胱氨酸的蛋白质，可以从样品中分离。因此，本发明还涉及从样品中分离含巯基的蛋白质，特别是含半胱氨酸的蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)将样品与式(I)化合物一起孵育，其中●代表可检测标签，从而将包含巯基/半胱氨酸的蛋白质特异性地偶联至标签上；以及
(b)富集与可检测标签偶联的蛋白质。
可检测标签可以是例如脱硫生物素。
优选地，与可检测标签偶联的蛋白质的富集可以通过使它们与可逆地结合可检测标签的珠接触来进行。
在一个实施方案中，步骤(b)包括
(1)使步骤(a)中获得的样品与固相接触，所述固相包含与所述可检测标签可逆结合的配体，从而将已与所述标签偶联的蛋白质可逆地固定在所述固相上；
(2)将所述固相与所述样品的剩余部分分离；
(3)破坏固相配体和偶联蛋白标签之间的可逆键。
可逆地结合可检测标签的配体可以是例如链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白。
破坏固相配体和偶联蛋白的标签之间的可逆键可以例如通过用竞争剂如生物素置换标记来进行。
式(I)化合物，其中●代表可检测标签，具有以下结构：
其中Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包含基团●，其中●表示可检测标签；以及
R1，V，X和Y如本文关于式(I)化合物所定义。
在一些实施方案中，可检测标签是脱硫生物素。
Z可以是如本文定义的任何其中●代表可检测标签；Q可以是如本文所定义的任何Q。任选地，连接子可以排列在●和Q之间。在一些实施方案中，当●代表可检测标签时，Q可以是包含1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分，在一些实施方案中，Z可以是/>其中R5如本文所定义，优选R5为H。因此，Z可为/>其中Q为/>并且R5如本文所定义，优选R5为H。在优选的实施方案中，当●代表可检测标签时，Z为/>其中Q为/>R5如本文定义，优选R5为H。任选地，在这些实施方案的任一个中，连接子可排列在●和Q之间。
当●代表可检测标签时，R1可以是任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基。在这些实施方案中，Y可以是如本文所定义的任何Y。优选地，在这些实施方案的任一个中，Y是O(氧)。
在一个实施方案中，其中●代表可检测标签的式(I)化合物是：
沉淀方法是本领域技术人员已知的，包括盐析，例如使用硫酸铵，等电沉淀，用可混溶的溶剂如乙醇或甲醇，非离子亲水聚合物如葡聚糖或聚乙二醇沉淀，通过聚电解质如藻酸盐、羧甲基纤维素、聚丙烯酸、鞣酸和多磷酸盐絮凝，或用多价金属离子如Ca2+、Mg2+、Mn2 +或Fe2+沉淀。
本文所用的“分析”涉及产生关于蛋白质组信息的任何方法，所述蛋白质组包含巯基或半胱氨酸基团。这些信息可以涉及质量、结构、特定蛋白质或其巯基/半胱氨酸基团的存在与否等。合适的方法包括但不限于质谱法，任选地在液相(反相)色谱(“在线”-MS)之后，免疫测定，Edman降解，多维的等。
当在本文中使用时，术语“样品”涉及材料或材料的混合物，通常但不一定是液体形式，其含有一种或多种包含半胱氨酸或巯基的蛋白质。样品可以是细胞裂解物。本发明的样品可以是生物样品。如本文所用，术语“生物样品”是指从受试者获得的样品，其中样品可以是任何生物组织或流体样品。通常，样品将是“临床样品”，其是源自患者的样品。本发明的生物样品可以是血清样品、血浆样品、尿样品、粪便样品、唾液样品、泪液样品或组织提取物样品。设想的其它样品是痰、脑脊液、细针活检样品、腹膜液和胸膜液，但本发明不限于此。在本发明的上下文中，样品可以是唾液样品、血清样品、组织样品、血液样品、尿样品、淋巴液样品、鼻咽洗液样品、痰样品、口拭子样品、喉拭子样品、鼻拭子样品、支气管肺泡灌洗样品或支气管分泌物样品。生物样品还可以包括组织切片，例如用于组织学目的冷冻切片。这样的样品包括例如全血、血清等。优选地，样品是包括细胞外物质或液体的样品。生物样品可以直接分析，或者它们可以在用于本发明的方法或试剂盒之前进行一些制备。这种制备可以包括但不限于将样品悬浮/稀释在水或合适的缓冲液中，或在分析前例如通过离心、沉淀或选择样品的特定级分除去细胞碎片。
本文所用的“富集”描述了增加混合物中的珠/复合物/物质的量的过程。通常，样品与固相如可逆地结合可检测标签的珠接触。然后可以将固相与剩余的样品或上清液分离。可以洗涤固相。最后，与可检测标签偶联的蛋白质可以从固相洗脱，例如通过添加如本文所述的竞争剂。
固相可以用于分批法或色谱法。因此，本文所述的方法或样品的巯基/半胱氨酸特异性全蛋白质组分析或用于从样品分离包含巯基/半胱氨酸的蛋白质可以是分批方法。本文所述的方法或样品的巯基/半胱氨酸特异性全蛋白质组分析或用于从样品分离包含巯基/半胱氨酸的蛋白质的方法也可以是层析方法。固相可以包含一种或多种可逆地结合可检测标签的配体。
如已经提到的，本文描述的方法或样品的巯基/半胱氨酸特异性全蛋白质组分析或用于从样品分离包含巯基/半胱氨酸的蛋白质可以作为流体层析，通常是液相层析的一部分实施。在本发明的上下文中，任何材料都可以用作层析基质，只要该材料适合于层析分离所选的生物实体，例如蛋白质。在该方法或样品的巯基/半胱氨酸特异性全蛋白质组分析或用于从本文所述的样品分离含巯基/半胱氨酸的蛋白质的情况下，层析基质对应于固相。如在该方法中使用的层析基质或本文所述的样品的巯基/半胱氨酸特异性全蛋白质组分析或用于从样品分离包含巯基/半胱氨酸的蛋白质的层析基质通常保持在预定位置，通常在预定位置，而待分离的样品和其中包含的组分的位置被改变，即层析基质也可以看作固定相。作为一个说明性的例子，如果使用填充床色谱柱，则固相通常被限制在柱的底部和流动适配器之间。当色谱作为膨胀床吸附进行时，树脂在使用中变成流化的，并且所用的珠粒以浓度梯度的形式排列，单个珠粒采取它们的沉降速度与向上的液体流动速度匹配的位置。因此，色谱基质是“固定相”(对应于本发明上下文中所使用的“固相”)，这与本领域技术人员的共同理解一致，因为固定相是色谱系统的一部分，流动相流动通过该色谱系统，并且液相中包括的组分在该色谱系统中散布在两相之间。
如果使用珠，在柱色谱中，珠通常在尺寸上相当均匀，而在膨胀床中，吸附珠在尺寸上是可变的，通常在约50至约400mm的范围内。在这点上，注意到，在一个实施方案中，加入液体样品中、与样品混合、然后例如通过丢弃上清液(液体)同时将珠暂时保持在适当位置(例如，通过外部磁力或通过离心)而从样品中除去的颗粒(例如，可自由移动的磁珠)不是如本文所用的固相。然而，本文所述的方法或样品的巯基/半胱氨酸特异性全蛋白质组分析或用于从样品分离包含巯基/半胱氨酸的蛋白质的方法也可以分批模式实施。在这种方法中，可以将(磁性)珠加入到含有含半胱氨酸/巯基的蛋白质的样品中，用于将蛋白质固定在这些珠上，然后例如通过将珠暂时保持在适当位置，同时弃去上清液，将珠与样品分离。这种分批方法也是根据本发明的方法。
通常，相应的色谱基质具有固相或半固相的形式，而样品是液相。用于实现分离的流动相同样是流体相。色谱基质可以是颗粒材料(具有任何合适的尺寸和形状)或整体色谱材料，包括纸基材或膜。因此，色谱法可以是例如柱色谱法。在一些实施方案中，色谱可以是平面色谱。在一些实施方案中，色谱可以是膨胀床色谱。如果在柱色谱法中使用微粒基质材料，则微粒基质材料可以具有例如约5μm至约200μm，或约5μm至约400μm，或约5μm至约600μm的平均粒度。如以下详细解释的，层析基质可以是，例如，或包括聚合物树脂或金属氧化物或准金属氧化物。如果使用平面色谱法，则基质材料可以是任何适于平面色谱法的材料，例如常规的基于纤维素或基于有机聚合物的膜(例如，纸膜、硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)或二氧化硅涂覆的玻璃板。在一个实施方案中，层析基质/固相是非磁性材料或不可磁化材料。
本领域使用的非磁性或不可磁化层析固相，也适用于样品的巯基/半胱氨酸特异性全蛋白质组分析的方法或本文所述的用于从样品分离含巯基/半胱氨酸的蛋白质的方法，包括衍生化的二氧化硅或交联凝胶。交联凝胶(其通常以珠粒形式制造)可以基于天然聚合物，即基于自然界中存在的聚合物类别。例如，色谱固相所基于的天然聚合物是多糖。通常使相应的多糖交联。多糖基质的实例是琼脂糖凝胶(例如SuperflowTM琼脂糖或材料如SuperflowTM/>其可以以不同的珠和孔径商购获得)或交联葡聚糖的凝胶。另一个说明性实例是葡聚糖共价键合到其上的颗粒交联的琼脂糖基质，其可作为均以SuperflowTM或/>得自GE Healthcare(以各种珠粒尺寸和具有各种孔尺寸)。这种层析材料的另一个说明性实例是/>其也可以不同的珠和孔径从GE Healthcare获得。
交联凝胶也可基于合成聚合物，即基于自然界中不存在的聚合物类别。通常，用于细胞分离的色谱固相所基于的这种合成聚合物是具有极性单体单元的聚合物，因此其本身是极性的。这种极性聚合物是亲水的。亲水(“喜水”)分子，也称为疏脂(“厌脂”)分子，含有可以与水分子形成偶极-偶极相互作用的部分。疏水(“厌水”)分子，也称为亲脂分子，具有与水分离的趋势。
合适的合成聚合物的说明性实例是聚丙烯酰胺、苯乙烯-二乙烯基苯凝胶和丙烯酸酯与二醇或丙烯酰胺与二醇的共聚物。说明性的例子是聚甲基丙烯酸酯凝胶，可以作为商购获得。另一个例子是乙二醇和甲基丙烯酸酯的共聚物，可作为/>商购获得。在一些实施方案中，层析固相还可以包括天然和合成的聚合物组分，例如复合基质或多糖和琼脂糖的复合物或共聚物，例如聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物，或多糖和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺的复合物或共聚物。葡聚糖和N，N'-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物的说明性实例是上述/>系列材料。衍生的二氧化硅可包括与合成聚合物或天然聚合物偶联的二氧化硅颗粒。这些实施方案的实例包括但不限于多糖接枝的二氧化硅、聚乙烯基吡咯烷酮接枝的二氧化硅、聚环氧乙烷接枝的二氧化硅、聚(2-羟乙基天冬酰胺)二氧化硅和聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝的二氧化硅。
固相如在该方法中使用的层析基质或样品的巯基/半胱氨酸特异性全蛋白质组分析或用于从本文所述的样品分离含巯基/半胱氨酸的蛋白质的层析基质也可以包括可磁性吸引的颗粒。而且，这种相应的可磁性吸引的颗粒可以包括可逆地结合到包含在固相中的可检测标签的配体。可磁性吸引的颗粒可以包含抗磁性、铁磁性、顺磁性或超顺磁性材料。超顺磁性材料响应于具有感应磁场的磁场，而没有产生永久磁化。基于氧化铁的磁性颗粒例如可以作为Dynal Biotech的Miltenyi Biotec的磁性MicroBeads、CPG公司的磁性多孔玻璃珠以及各种其它来源，例如Roche Applied Science、BIOCLON、BioSource International公司、Micromod、AMBION、Merck、Bangs Laboratories、Polysciences或Novagen公司，仅举几个例子。例如由Hütten，A.等人(J.Biotech.(2004),112,47-63)已经描述了基于超顺磁性Co和FeCo以及铁磁性Co纳米晶体的磁性纳米颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法中使用的层析基质不含任何磁吸性物质。
本文所用的“蛋白质组”涉及在某一时间由基因组、细胞、组织或生物体表达或可以由基因组、细胞、组织或生物体表达的整组蛋白质。
在(偶联蛋白的)可检测标签和固相的配体(可逆地结合至可检测标签)之间形成的非共价键可以具有任何期望的强度和亲和力，只要其在实施本发明的方法的条件下是可断裂的或可逆的即可。(偶联蛋白的)可检测标签和固相配体之间结合的解离常数(KD)可以具有约10-2M至约10-13M的值，因此，该可逆键可以具有例如约10-2M至约10-13M，或约10-3M至约10-12M或约10-4M至约10-11M，或约10-5M至约10-10M的KD，该键的KD以及(偶联蛋白的)可检测标签和固相配体之间形成的键(可逆地结合至可检测标签)的KD、koff和kon速率可以通过任何合适的方式测定，例如，通过荧光滴定、平衡或表面等离子体共振。偶联蛋白可以包括至少一个，包括两个、三个或更多个可检测标签，并且固相可以包括至少一个、至少两个，例如三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个可逆地结合至可检测标签的配体。
如本文已经描述的，(偶联蛋白的)可检测标签和固相配体的结合(可逆地结合至可检测标签)是可逆的。破坏(置换)可检测标签(偶联蛋白)和固相配体(与可检测标签可逆结合)的可逆结合可以通过将样品与组合物接触来实现，所述组合物包含能够逆转可检测标签(偶联蛋白)和固相配体(与可检测标签可逆结合)之间的结合的物质(如本文所用的“竞争物”)。例如，竞争物是游离结合配偶体和/或是竞争剂(例如生物素、生物素类似物、其生物活性片段)。在一些实施方案中，本发明的方法包括在应用竞争剂以破坏(置换)固相的可检测标签(偶联蛋白)和配体之间的键(可逆地结合至可检测标签)之后，从而从固相回收所选择的偶联蛋白，或换句话说，从固相洗脱一部分偶联蛋白。竞争剂的选择取决于(偶联蛋白的)特定可检测标签和固相的配体(可逆地结合可检测标签)。在一些实施方案中，固相的配体(可逆地结合至可检测标签)是链霉亲和素突变蛋白(例如Strep-)，用于识别包含在可检测标签中的链霉亲和素结合肽(例如Strep-/>或Twin-Strep-/>)，并且竞争剂是生物素或生物素类似物。
术语“竞争物/竞争剂”或“竞争试剂”——这两个术语可互换使用-如本文所用指能够减少、干扰或消除一对结合剂或部分，如(偶联蛋白的)可检测标签和固相配体(可逆地结合可检测标签)之间复合物形成的任何试剂或条件。术语“竞争”是指对结合的任何干扰，而不管这种干扰的性质。在一些实施方案中，这种干扰也可以是与某一结合位点的非竞争性结合。这种竞争机制的一个实例是当通过络合的金属离子如Ca2+、Ni2+、Co2+或Zn2+介导可逆键时，通过螯合试剂如EDTA或EGTA的金属螯合。这种机制适用于结合对，例如钙调蛋白和在Ca2+存在下结合的钙调蛋白结合肽，或适用于在固定化金属螯合物亲和层析(IMAC)中使用的结合对。在一些实施方案中，竞争试剂可以具有能够特异性结合配偶体之一上包括的结合位点，所述结合配偶体之一例如(偶联蛋白的)可检测标签和固相的配体(可逆地结合可检测标签)。也有可能整个竞争试剂能够特异性结合到包括在这些结合配偶体之一上的结合位点。在一些实施方案中，竞争通过缓冲液的pH或盐强度的变化提供，然后竞争试剂是增加或降低的pH或盐强度。pH的改变可以例如用于置换/破坏链霉抗生物素蛋白与链霉抗生物素蛋白结合肽的结合，或用于置换/破坏蛋白A或蛋白G与抗体Fc结构域之间的结合。优选地，竞争剂是生物素或其衍生物，更优选生物素。竞争剂可以是还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)、LiAlH4、NaBH4、连二硫酸盐、硫代硫酸盐、碘化物、抗坏血酸等，优选DTT。
在一个实施方案中，与可检测标签可逆结合的配体是抗体或其片段。在这样的实施方案中，可以通过改变pH来进行可逆键的破坏。
如本文所述，本文所述的式(I)化合物可包含可检测标签。标签和可检测标签在本文中可互换使用。优选的标签包括但不限于酶、放射性同位素、荧光蛋白、荧光染料、生物发光标签或标签(例如生物素或脱硫生物素)。可检测标签可以是目前在体外诊断学领域中使用的各种类型中的任何一种，包括颗粒标签，包括金属如胶体金、同位素、发色团，包括荧光标签、生物素、发光标记、磷光标记等，以及将给定底物转化为可检测标签的酶标记，和在扩增后(例如通过聚合酶链反应)显示的多核苷酸标记。合适的酶标签包括辣根过氧化物酶、polyHRP、碱性磷酸酶等，优选辣根过氧化物酶。例如，标签可以是碱性磷酸酶，通过在1，2-二氧杂环丁烷底物如金刚烷基甲氧基磷酰氧基苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1，2-二氧杂环丁烷-3，2'-(5'-氯)三环{3.3.1.13,7}癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠(CSPD)以及CDP和CDP-星或本领域技术人员公知的其它发光底物，例如合适镧系元素的螯合物如铽(III)和铕(III)的转化后测量化学发光的存在或形成来检测，通过选择的标签来确定检测手段，在标签是微粒并且以适当水平累积的情况下，或者使用仪器如分光光度计、发光计、荧光计等，所有都根据标准实践。因此，可以基于光学、荧光、发光、电化学发光和/或多个分析物分析(xMAP)读数或手段来检测标签。标签可以通过光学手段检测，例如在特定波长下的吸收或肉眼检查。可以通过荧光手段检测标签，例如在不同的、通常更短的波长激发后，确定特定波长的荧光团的发射。标签可以通过电化学发光方法检测，例如使用Roche公司的市售ELECSYS系统。可以通过多分析物分析(xMAP)来检测标记，例如，如WO 2007/075891中所述。
本文所用的“标签”可包括但不限于附着于蛋白质的亲和标签，使得它们可使用亲和技术从其粗制生物来源纯化，所述亲和技术例如壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、链霉亲和标签和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，或者聚(His)标签是广泛使用的蛋白质标签，其结合金属基质；用于改变蛋白质的色谱性质以提供跨越特定分离技术的不同分辨率的色谱标签，例如FLAG-tag；表位标签，其是短肽序列，选择所述短肽序列是因为高亲和性抗体可以在许多不同物种中可靠地产生，例如ALFA-tag,V5-tag,Myc-tag,HA-tag,Spot-tag,T7-tag和NE-tag；用于在蛋白如GFP及其变体上给出可视读数的荧光标记；可以允许特异性酶促修饰(例如通过生物素连接酶生物素化)或化学修饰(例如与FlAsH-EDT2反应用于荧光成像)的蛋白质标签。
化合物和抗体分子偶联物的合成
以下部分提供了式I、III、IIIa、IV*的化合物和抗体分子偶联物的合成的一些一般特征。通常，本领域技术人员知道选择用于进行这种合成的合适的起始材料和反应条件。进一步的细节在以下实施例部分中给出。如果没有另外说明，任何变量，例如R1、R2、R3、R4、R5、V、X、Y、Z、●、/>和任何其它变量如本说明书中所定义。
式(IV)或(IV*)化合物的合成
式(IV)的化合物，其中Y是O或S，或式(IV*)的化合物，或其中是-Y-R1且Y是O或S，可例如由二烷基-亚磷酰胺二卤化物，例如可商购的二乙基-亚磷酰胺二氯化物制备，如以下方案所示：
因此，二烷基-亚磷酰胺二卤化物，例如二乙基-亚磷酰胺二氯化物，可以与包含X基团的格氏化合物(Grignard compound)A和包含R5基团的格氏化合物B反应，形成中间体-I。本领域技术人员将选择格氏化合物A和B以获得所需的取代模式。在一些实施方案中，格氏化合物A和B相同(换句话说，仅使用一种格氏化合物)，例如，在A中，是三键，V不存在，X是R3C，R3和R5相同，优选R3和R5是氢。然后，当A和B相同时，二烷基-亚磷酰胺基二卤化物，例如二乙基-亚磷酰胺基二氯化物，可以与2至3，例如2.5当量的格氏化合物反应，得到包含两个相同的乙炔基取代基的中间体-I。或者，当格氏化合物A和B不同时，二烷基-亚磷酰胺二卤化物，例如二乙基-亚磷酰胺二氯化物可以按顺序与约1当量格氏化合物A反应，然后与约1当量格氏化合物B反应，以获得具有由格氏化合物引入的不同取代基的相应中间体-1。格氏化合物A和B可以以任何顺序反应，即首先与A反应，然后与B翻译，或首先与B反应，然后与A反应。本领域技术人员将容易地选择合适的顺序。二烷基-亚磷酰胺基二卤化物，例如二乙基-亚磷酰胺基二氯化物与格氏化合物反应得到中间体I可以应用格氏反应的典型已知条件进行，例如使用二乙醚的四氢呋喃(THF)作为溶剂，在低于-50℃的低温下，然后加热反应；例如，温度范围可以在-100℃和+50℃之间；更具体地说，反应可以在约-78℃下进行，然后升温至室温。本领域技术人员知道选择合适的反应条件。优选地，与格氏化合物的反应在惰性气体如氩气下进行。在许多情况下，不必分离中间体I；相反，中间体I可不经分离用于随后的反应，例如与R1-YH的反应。因此，为了与R1-YH反应，可再次冷却包含中间体-I的混合物，并可将R1-YH加入到合适的溶剂如乙腈中，其中Y为O(即醇)或Y为S(即硫醇)。与R1-YH的反应可在低温，例如低于-50℃，优选-78℃下进行，然后升温至例如室温，或甚至升温至+50℃。优选地，与R1-YH的反应在四唑存在下进行。优选地，与R1-YH的反应可在惰性气体如氩气下进行。任选地，在与R1-YH反应后，可以使用本领域技术人员公知的方法处理混合物，例如包括萃取，并且在蒸发溶剂后可以获得粗产物。任选地，如果需要，可以例如使用硅胶色谱法进一步纯化粗产物。为了得到式(IV)或(IV*)的化合物，使用合适的氧化剂将化合物进一步氧化。可以使用各种合适的氧化剂，例如叔丁基过氧化氢(tBuOOH)、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、过氧化氢(H2O2)、碘(I2)、过一硫酸钾或氧(O2)，例如来自空气的氧。技术人员将容易地确定合适的氧化剂。优选地，H2O2用作氧化剂。例如，氧化可以使用水/乙腈中的H2O2作为溶剂进行。氧化可以在合适的温度下进行，例如在0℃和50℃之间，例如在室温下。在氧化后，式(IV)/式(IV*)化合物可以使用本领域技术人员已知的后处理程序和/或纯化方法分离。例如，在氧化后，可将混合物冻干以提供式(IV)化合物/式(IV*)的化合物。
式(IV)的化合物，其中Y是NR2、O或S，尤其是其中Y是NR2，或式(IV*)化合物其中是-Y-R1和Y是NR2、O或S，尤其是其中Y是NR2，也可以经由中间体-I制备，如以下方案所示：
因此，中间体-I(其在格氏反应后也不需要分离，而是可以不经分离而用于随后的反应中)与约两当量的酸，例如氢卤酸如HCl、HBr或HI，优选HCl反应，以获得中间体-II(see,e.g.,Van Assema et al.(2007),J.Organomet.Chem.，其通过引用整体并入本文)。与氢卤酸的反应可以在合适的溶剂中进行，例如该反应可以使用盐酸在乙醚中进行。合适的反应温度容易由本领域技术人员选择，并且可以是例如-20℃至+20℃；特别地，该反应可以在0℃下进行，中间体-II通常不被分离，并且与R1-YH反应，其中Y是NR2，即胺。也可以将中间体-II与R1-YH反应，其中Y是O或S。因此，对于与R1-YH反应，可以将包含中间体-II的混合物再次冷却，并且可以将其中Y是NR2(或O或S)的R1-YH加入到合适的溶剂中，例如乙醚、四氢呋喃或乙腈。与R1-YH的反应可在低温，例如低于-50℃，优选-78℃下进行，然后升温至例如室温，或甚至升温至+50℃，优选与R1-YH的反应在吡啶存在下进行。优选地，与R1-YH的反应可在惰性气体如氩气下进行。任选地，在与R1-YH反应后，可以使用本领域技术人员公知的方法处理混合物，例如包括萃取，并且在蒸发溶剂后可以获得粗产物。任选地，如果需要，可以例如使用硅胶色谱法进一步纯化粗产物。为了获得式(IV)或(IV*)的化合物，如本文所述，使用合适的氧化剂将化合物进一步氧化。可以使用各种合适的氧化剂，例如叔丁基过氧化氢(tBuOOH)、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、过氧化氢(H2O2)、碘(I2)、过一硫酸钾或氧(O2)，例如来自空气的氧。技术人员将容易地确定合适的氧化剂。优选地，H2O2用作氧化剂。例如，氧化可以使用水/乙腈中的H2O2作为溶剂进行。氧化可以在合适的温度下进行，例如在0℃和50℃之间，例如在室温下。在氧化后，可以使用本领域技术人员已知的后处理程序和/或纯化方法分离式(IV)化合物/式(IV*)化合物。例如，在氧化后，可将混合物冻干以提供式(IV)化合物/式(IV*)的化合物。
式(IV)的化合物，其中Y是键，或式(IV*)的化合物，其中是-Y-R1且Y是键，或式(IV*)的化合物，其中/>是Z且Z表示经由碳原子与磷结合且包含基团●的残基，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基，也可经由中间体-II制备，如以下方案中所示：
中间体-II可以与例如格氏化合物反应，以形成式IV或式IV*的化合物，其中Y是键。中间体-II与R1-MgX*或Z-MgX*的反应可以在低于-50℃和+50℃的低温下，使用格氏反应的典型条件，例如上述使用四氢呋喃或乙醚作为溶剂的条件来进行；更具体地说，反应可以在约-78℃下进行，然后升温至室温。本领域技术人员知道选择合适的反应条件。与格氏试剂反应的反应优选在氩气等惰性气体下进行。任选地，在与R1-MgX*或Z-MgX*反应后，可以使用本领域技术人员公知的方法对混合物进行后处理，例如包括萃取，并且可以在蒸发溶剂后获得粗产物。任选地，如果需要，可以例如使用硅胶色谱法进一步纯化粗产物。为了获得式(IV)或(IV*)的化合物，如本文所述，使用合适的氧化剂将化合物进一步氧化。可以使用各种合适的氧化剂，例如叔丁基过氧化氢(tBu-OOH)、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、过氧化氢(H2O2)、碘(I2)、过一硫酸钾或氧(O2)，例如来自空气的氧。技术人员将容易地确定合适的氧化剂。优选地，H2O2用作氧化剂。例如，氧化可以使用水/乙腈中的H2O2作为溶剂进行。氧化可以在合适的温度下进行，例如在0℃和50℃之间，例如在室温下。在氧化后，式(IV)/式(IV*)化合物可以使用本领域技术人员已知的后处理程序和/或纯化方法分离。例如，在氧化后，可将混合物冻干以提供式(IV)或式(IV*)的化合物。
式IV的化合物，其中Y为O、S或NR2，或式IV*的化合物，其中为-Y-R1且Y为O、S或NR2，也可例如根据以下方案制备：
例如，三卤化磷，优选PCl3，可以与R1-YH，其中Y是O、S或NR2，在合适的溶剂，例如二乙醚或四氢呋喃中，在低于-10℃的低温下反应，然后将反应混合物加热；例如，温度范围可以在-50℃和+50℃之间；更具体地说，反应可以在约-40℃或-30℃下进行，然后升温至室温。优选地，三卤化磷与醇的反应在弱碱例如胺碱如三乙胺的存在下进行。优选地，反应在惰性气体如氩气下进行。中间体-IV通常可以不经分离用于随后的格氏反应。任选地，可以例如通过硅藻土过滤纯化混合物。然后，中间体-IV可以与包含X基团的格氏化合物A和包含R5基团的格氏化合物B反应以形成中间体-V。本领域技术人员将选择格氏化合物A和B以获得所需的取代模式。在一些实施方案中，格氏化合物A和B相同(换句话说，仅使用一种格氏化合物)，例如，在A中，是三键，V不存在，X是R3C，R3和R5相同，优选R3和R5是氢。然后，当A和B相同时，二烷基-亚磷酰胺基二卤化物，例如二乙基-亚磷酰胺基二氯化物，可以与2至3，例如2.5当量的格氏化合物反应，得到包含两个相同乙炔基取代基的中间体-V。或者，当格氏化合物A和B不同时，二烷基-亚磷酰胺二卤化物，例如二乙基-亚磷酰胺二氯化物可以按顺序与约1当量格氏化合物A反应，然后与约1当量的格氏化合物B反应，以获得具有由格氏化合物引入的不同取代基的相应中间体-V。格氏化合物A和B可以以任何顺序反应，即首先与A反应，然后与B反应，或首先与B反应，然后与A反应。本领域技术人员将容易地选择合适的顺序。中间体-IV与格氏化合物反应得到中间体-V可以使用格氏反应的典型已知条件，例如上述使用四氢呋喃(THF)或乙醚作为溶剂的条件，在低于-50℃的低温下进行，然后将反应加热；例如，温度范围可以在-100℃和+50℃之间；更具体地说，反应可以在约-78℃下进行，然后升温至室温。本领域技术人员知道选择合适的反应条件。优选地，与格氏化合物的反应在惰性气体如氩气下进行。在许多情况下，不必分离中间体-V；相反，中间体-V可以不经分离而用于下面的氧化。因此，为了得到式(IV)或(IV*)的化合物，使用适当的氧化剂将中间体-V进一步氧化。可以使用各种合适的氧化剂，例如叔丁基过氧化氢(tBu-OOH)、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、过氧化氢(H2O2)、碘(I2)、过一硫酸钾或氧(O2)，例如来自空气的氧。技术人员将容易地确定合适的氧化剂。优选地，H2O2用作氧化剂。例如，氧化可以使用水/乙腈中的H2O2作为溶剂进行。氧化可以在合适的温度下进行，例如在0℃和50℃之间，例如在室温下。在氧化后，式(IV)/式(IV*)化合物可以使用本领域技术人员已知的后处理程序和/或纯化方法分离。例如，在氧化后，可将混合物冻干以提供式(IV)化合物/式(IV*)化合物。
提供式(IV)或式(IV*)化合物的其它合成方法通常是本领域技术人员已知的，其中脂族或芳族残基经由碳原子与磷原子结合。因此，式(IV)化合物，其中Y是键，或式(IV*)化合物，其中是-Y-R1且Y是键，或优选式(IV*)化合物，其中/>是Z且Z表示经由碳原子与磷结合且包含基团●的残基，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基，也可由任选取代的氧化膦制备，如以下方案所示；特别是当Z为/>时，其中/>表示与磷的连接点，Q为包含至少三个主链原子和碳-碳双键的部分，其中至少一个主链原子为选自S、O或N的杂原子：
在这些实施方案中，式(IV)或(IV*)的化合物通过将●-GH，其中G为S、O或NH，加成至三键上以形成式(IV*)的化合物而形成；优选地，G是S。在一些实施方案中，是三键，V不存在，X是R3C，优选R3，R5和Rx是相同的，更优选R3，R5和Rx各自是氢。反应在合适的溶剂中进行，这是本领域技术人员容易确定的。溶剂体系可以选自宽范围的溶剂。溶剂可以是极性非质子溶剂体系，例如四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(MeCN)、丙酮、二甲亚砜(DMSO)、乙酸乙酯(EtOAc)、N-乙基吡咯烷酮或其混合物，优选THF、DMF、DMSO；非极性溶剂如己烷、甲苯、苯、1，4-二恶烷、氯仿、乙醚或二氯甲烷(DCM)，优选DCM；极性质子溶剂，例如水、乙醇、异丙醇、甲醇、正丁醇，优选乙醇；或其混合物。例如，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。特别地，当生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸反应时，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。溶剂也可以是水性介质，例如水或水性缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)、碳酸氢盐、EDTA/NH4HCO3缓冲液、EDTA/NH4HCO3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液或含硼酸盐的磷酸盐缓冲盐水。在反应中使用生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸的情况下，优选在缓冲液中进行反应。反应也可以在任何一种上述含水缓冲液和DMF或DMSO的混合物中进行。本领域技术人员将容易地选择合适的溶剂和缓冲剂。优选地，反应在碱性条件下进行，特别是在微碱性条件下，例如在7.2-9的pH下，例如在8或8.5的pH下。这种基本条件可以通过使用合适的缓冲系统，例如通过使用上述任何一种缓冲液来建立。另外或可选地，反应的碱性条件可以通过使用弱碱来建立。合适的碱是例如碳酸盐，如(NH4)2CO3、Na2CO3、Rb2CO3、K2CO3或Cs2CO3或其相关碳酸氢盐(例如NaHCO3等)；和弱含氮碱如三甲胺Et3N(25℃时pKa为10,76)。优选使用pKa值在7.5-11.5范围内的碱。本领域技术人员将容易地选择合适的碱。反应温度没有特别限制。例如，反应可以在0℃至60℃、0℃至50℃、0℃至40℃、0℃至30℃范围内的温度下进行，例如在室温，即约25℃，例如约5℃，或例如在生理学相关条件下在约37℃下进行，本领域技术人员将容易选择合适的反应条件，包括温度和反应时间。
式(IV)化合物，其中Y为键，或式(IV*)化合物，其中为-Y-R1且Y为键，或优选式(IV*)化合物，其中/>为Z且Z表示经由碳原子与磷结合的残基并包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基，也可由如下结构所示的任选取代的氧化膦制备(在一些实施方案中，/>为三键，V不存在，X为R3C，优选R3、R5和Rx相同，更优选R3、R5和Rx各自为氢)：
例如，这种任选取代的氧化膦可用于制备其中Z为的化合物，其中/>表示与磷的连接点，Q为含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分。如本领域技术人员所知，这种杂环部分可以例如使用环加成反应来形成。例如，六元杂环部分可通过使氧化膦与合适的杂二烯在杂Diels-Alder反应中反应而获得。五元杂环部分可通过使氧化膦与合适的1，3-偶极化合物在1，3-偶极环加成中反应(1，3-偶极环加成也称为点击反应)而形成。合适的杂二烯和1，3-偶极化合物是本领域技术人员已知的并且容易选择。1，3-偶极化合物包括含有四个电子的三原子π电子系统，所述电子在三个原子上离域；1，3-偶极化合物，即包含1，3-偶极官能团的化合物，是本领域公知的。此外，本领域技术人员知道选择用于进行环加成反应，例如杂-Diels-Alder反应或1，3-偶极环加成的合适反应条件。例如，环加成反应可以在合适的溶剂中进行合适的反应时间，所述溶剂例如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃(THF)、Me-THF、乙酸乙酯、乙醚、DMF、DMA、DMSO、甲苯、苯、二甲苯、丙酮或己烷；环加成反应也可以在水中进行，或在水和水混溶性溶剂(例如乙腈或THF)的混合物中进行，当与生物分子进行反应时，也可以使用合适的缓冲体系。例如，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。特别地，当生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸反应时，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。溶剂也可以是水性介质，例如水或水性缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)、碳酸氢盐、EDTA/NH4HCO3缓冲液、EDTA/NH4HCO3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液或含硼酸盐的磷酸盐缓冲盐水。在反应中使用生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸的情况下，优选在缓冲液中进行反应。反应也可以在任何一种上述含水缓冲液和DMF或DMSO的混合物中进行。本领域技术人员将容易地选择合适的溶剂和缓冲剂。或者，反应可以在没有任何溶剂(纯的)的情况下进行。任选地，环加成可以在合适的催化剂存在下进行。在优选的实施方案中，环加成是1，3-偶极环加成。合适的1，3-偶极化合物和反应条件描述于例如US2017/0008858中，其全部内容通过引用并入本文。特别地，叠氮化物(例如●-N3)、硝酮(例如/>其中R6如本文所定义)、腈氧化物(例如/>)或重氮化合物(例如/>)可以用作1，3-偶极化合物。优选地，1，3-偶极化合物是叠氮化物。具有叠氮化物作为示例性试剂的产物示于以下方案中；如本领域技术人员容易理解的，原则上可以形成两种区域异构体(在一些实施方案中，/>是三键，V不存在，X是R3C，优选R3，R5和Rx是相同的，更优选R3，R5和Rx各自是氢)：
优选地，在与叠氮化物的1，3-偶极环加成中的区域选择性可以通过使用合适的催化剂来实现。例如，如本领域技术人员已知的，使用铜催化剂，优选铜(I)催化剂的铜催化的叠氮化物/炔烃点击反应，产生在上面方案中左边显示的产物；优选地，溴化铜(I)用作催化剂。另一方面，当使用钌催化剂，优选钌(II)催化剂，更优选Cp*RuCl(PPh3)2、Cp*RuCl(COD)或Cp*RuCl(NBD)(e.g.,B.C.Boren et al.,Ruthenium-Catalyzed Azide-AlkyneCycloaddition:Scope and Mechanism,J.Am.Chem.Soc.2008,130,28,8923-8930,https://doi.org/10.1021/ja0749993)时，形成上述方案中右所示的产物。本领域技术人员知道容易选择合适的催化剂和合适的反应条件。通过1，3-环加成获得的其它示例性5元杂环部分是和/>(从硝酮获得，R6如本文所定义)、/>和(从腈氧化物获得)、/>和/>(从重氮化合物获得)以及和/>(从重氮化合物获得的重排产物)。/>
式(IV)化合物，其中Y是键，或式(IV*)化合物，其中是-Y-R1且Y是键，或优选式(IV*)化合物，其中/>是Z且Z表示经由碳原子与磷结合且包含基团●的残基，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基，也可由任选取代的氧化膦制备，如以下方案所示；特别是当Z为/>时，其中/>表示与磷的连接点，Q为包含与磷结合的碳-碳三键以及与碳-碳三键结合的任选取代的苯基或与碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分(Rx为H；在一些实施方案中，/>为三键，V不存在，X为R3C，优选R3和R5相同，更优选R3和R5各自为氢，使得R3、R5和Rx各自为氢；OTf＝三氟甲磺酸酯)：
因此，如以上流程图中所述的偶联反应和合适的条件是本领域技术人员已知的，例如Cacchi偶联、Castro-Stevens偶联和Sonogashira偶联。作为非限制性实例，偶联反应可以使用钯催化剂和铜催化剂在碱存在下以Sonogashira偶联进行。通常，两种催化剂用于Sonogashira偶联：零价钯复合物和卤化铜(I)盐。钯催化剂的普通例子包括那些含有膦配体的催化剂，例如[Pd(PPh3)4]。另一种常用的钯源是[Pd(PPh3)2Cl2]，但也可使用含有二齿膦配体的络合物，例如[Pd(dppe)Cl2]、[Pd(dppp)Cl2]和[Pd(dppf)Cl2]。铜(I)盐，例如CuI，与末端炔反应并产生乙炔铜(I)，其作为偶联反应的活化物质。Cu(I)是反应中的助催化剂，用于提高反应速率。本领域技术人员知道选择合适的条件进行Sonogashira偶联。例如，Sonogashira偶联在室温下用碱进行，所述碱通常为胺，例如二乙胺，其也可以用作溶剂，但DMF、DMSO或醚也可以用作溶剂。可以使用其它碱，例如碳酸钾或碳酸铯。例如，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。特别地，当生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸反应时，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。溶剂也可以是水性介质，例如水或水性缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)、碳酸氢盐、EDTA/NH4HCO3缓冲液、EDTA/NH4HCO3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液或含硼酸盐的磷酸盐缓冲盐水。在反应中使用生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸的情况下，优选在缓冲液中进行反应。反应也可以在任何一种上述含水缓冲液和DMF或DMSO的混合物中进行。本领域技术人员将容易地选择合适的溶剂和缓冲剂。优选地，Sonogashira反应在惰性气体例如氩气下进行。
更进一步，式(IV)化合物，其中Y是键，或式(IV*)化合物，其中是-Y-R1且Y是键，可由芳基取代的二卤代氧化膦(即R1可以是芳基或杂芳基，其可任选被取代；优选R1可以是苯基，其可任选被取代)制备，例如由市售二氯-苯基氧化膦通过格氏反应制备，如以下方案所示：
格氏反应可以在本文所述的各种条件下进行，例如在-78℃至室温，和在合适的溶剂例如四氢呋喃或乙醚中；A和B可以相同或不同，并且如果合适，可以按顺序加入；优选地，A和B相同，在A中，是三键，V不存在，X是R3C，R3和R5相同；更优选R3和R5是氢。此外，可以如本文所述进行后处理和任选的纯化。
式(IV)或(IV*)的化合物，其中是双键且X是R3R4C，优选R3、R4和V各自是氢，可以如下制备，作为说明性实例：
因此，例如，活化可以使用草酰氯实现以形成氯化中间体。氯化可以在例如0℃至60℃的温度下进行，例如在约30℃下进行，本领域技术人员知道选择合适的溶剂；例如，可以使用二氯甲烷。氯化中间体可以例如通过蒸发溶剂来分离，或者在没有预先分离的情况下用于随后的反应步骤。优选地，当使用二氯甲烷作为氯化反应的溶剂时，在进行格氏反应之前除去溶剂。格氏反应可以如本文中许多实例中所述进行，例如使用乙醚或四氢呋喃作为溶剂，例如在-78℃至室温的温度下。反应混合物可以使用本领域技术人员已知的方法进行后处理，并且如果需要，可以任选地使用例如色谱法进行纯化。
如本文通过描述许多合成方法所提供的，本领域技术人员能够合成式(IV)或式(IV*)的化合物，如本说明书和所附权利要求书中所描述的，并且将容易地选择合适的起始材料、试剂和反应条件。
式(I)化合物的合成
提供式(I)化合物，其中脂族或芳族残基Z通过碳原子与磷原子连接，的合成方法通常是本领域技术人员已知的，并且一些一般特征以示例性方式描述于下文中。例如，如本领域技术人员容易理解的，格氏反应适合于形成碳-磷键。可以使用许多其它方法，例如如下所述的那些。通常，本领域技术人员知道选择合适的原料和反应条件来进行这种合成。如果没有另外说明，任何变量，例如R1、R2、R3、R4、R5、V、X、Y、Z、●、/>和任何其它变量如本说明书中所定义。
作为说明性实例，式(I)化合物可例如根据以下方案由式(IV)化合物制备，特别是当Z为时，其中/>表示与磷的连接点，Q为包含至少三个主链原子和碳-碳双键的部分，其中至少一个主链原子为选自S、O或N的杂原子：
在这些实施方案中，式(I)化合物通过将●-GH，其中G为S、O或NH，加入式(IV)化合物的三键上形成式(I)化合物而形成；优选地，G是S。在一些实施方案中，是三键，V不存在，X是R3C，优选R3，R5和Rx是相同的，更优选R3，R5和Rx各自是氢。该反应可以例如按照以上关于式(IV)或(IV*)化合物合成所述的方法进行。因此，反应在合适的溶剂中进行，这是本领域技术人员容易确定的。溶剂体系可以选自宽范围的溶剂。溶剂可以是极性非质子溶剂体系，例如四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(MeCN)、丙酮、二甲亚砜(DMSO)、乙酸乙酯(EtOAc)、N-乙基吡咯烷酮或其混合物，优选THF、DMF、DMSO；非极性溶剂如己烷、甲苯、苯、1，4-二恶烷、氯仿、乙醚或二氯甲烷(DCM)，优选DCM；极性质子溶剂，例如水、乙醇、异丙醇、甲醇、正丁醇，优选乙醇；或其混合物。例如，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。特别地，当生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸反应时，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。溶剂也可以是水性介质，例如水或水性缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)、碳酸氢盐、EDTA/NH4HCO3缓冲液、EDTA/NH4HCO3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液或含硼酸盐的磷酸盐缓冲盐水。在反应中使用生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸的情况下，优选在缓冲液中进行反应。反应也可以在任何一种上述含水缓冲液和DMF或DMSO的混合物中进行。本领域技术人员将容易地选择合适的溶剂和缓冲剂。优选地，反应在碱性条件下进行，特别是在微碱性条件下，例如在7.2-9的pH下，例如在8或8.5的pH下。这种基本条件可以通过使用合适的缓冲系统，例如通过使用上述任何一种缓冲液来建立。另外或可选地，反应的碱性条件可以通过使用弱碱来建立。合适的碱是例如碳酸盐，如(NH4)2CO3、Na2CO3、Rb2CO3、K2CO3或Cs2CO3或其相关碳酸氢盐(例如NaHCO3等)；和弱含氮碱如三甲胺Et3N(25℃时pKa为10，76)。优选使用pKa值在7.5-11.5范围内的碱。本领域技术人员将容易地选择合适的碱。反应温度没有特别限制。例如，反应可以在0℃至60℃、0℃至50℃、0℃至40℃、0℃至30℃范围内的温度下进行，例如在室温，即约25℃，例如约5℃，或例如在生理学相关条件下在约37℃下进行，本领域技术人员将容易选择合适的反应条件，包括温度和反应时间。
式(I)化合物也可以由式(IV)化合物制备
使用例如环加成反应，特别是当Z为时，其中/>表示与磷的连接点，Q为包含1、2或3个独立选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分。如本领域技术人员所知，这种杂环部分可以例如使用环加成反应来形成。例如，六元杂环部分可通过使式(IV)化合物与合适的杂二烯在杂Diels-Alder反应中反应而获得。五元杂环部分可通过使式(IV)化合物与合适的1，3-偶极化合物在1，3-偶极环加成中反应(1，3-偶极环加成也称为点击反应)而形成。合适的杂二烯和1，3-偶极化合物是本领域技术人员已知的并且容易选择。1，3-偶极化合物包括含有四个电子的三原子π电子系统，所述电子在三个原子上离域；1，3-偶极化合物，即包含1，3-偶极官能团的化合物，是本领域公知的。此外，本领域技术人员知道选择用于进行环加成反应，例如杂-Diels-Alder反应或1，3-偶极环加成的合适反应条件。例如，环加成反应可以在合适的溶剂中进行合适的反应时间，所述溶剂例如二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃(THF)、Me-THF、乙酸乙酯、乙醚、DMF、DMA、DMSO、甲苯、苯、二甲苯、丙酮或己烷；环加成反应也可以在水中进行，或在水和水混溶性溶剂(例如乙腈或THF)的混合物中进行，当与生物分子进行反应时，也可以使用合适的缓冲体系。例如，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。特别地，当生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸反应时，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。溶剂也可以是水性介质，例如水或水性缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)、碳酸氢盐、EDTA/NH4HCO3缓冲液、EDTA/NH4HCO3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液或含硼酸盐的磷酸盐缓冲盐水。在反应中使用生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸的情况下，优选在缓冲液中进行反应。反应也可以在任何一种上述含水缓冲液和DMF或DMSO的混合物中进行。本领域技术人员将容易地选择合适的溶剂和缓冲剂。或者，反应可以在没有任何溶剂(纯的)的情况下进行。任选地，环加成可以在合适的催化剂存在下进行。在优选的实施方案中，环加成是1，3-偶极环加成。合适的1，3-偶极化合物和反应条件描述于例如US 2017/0008858中，其全部内容通过引用并入本文。特别地，叠氮化物(例如●N3)、硝酮(例如其中R6如本文所定义)、腈氧化物(例如/>)或重氮化合物(例如)可用作1，3-偶极化合物。优选地，1，3-偶极化合物是叠氮化物。具有叠氮化物作为示例性试剂的产物示于以下方案中；如本领域技术人员容易理解的，原则上可以形成两种区域异构体(在一些实施方案中，/>是三键，V不存在，X是R3C，优选R3和R5相同，更优选R3和R5各自是氢；在一些实施方案中，/>是双键，X是R3R4C，优选V，R3，R4和R5各自是H)：
优选地，在与叠氮化物的1，3-偶极环加成中的区域选择性可以通过使用合适的催化剂来实现。例如，如本领域技术人员已知的，使用铜催化剂，优选铜(I)催化剂的铜催化的叠氮化物/炔烃点击反应，产生在上面方案中左边显示的产物；优选地，溴化铜(I)用作催化剂。另一方面，当使用钌催化剂，优选钌(II)催化剂，更优选Cp*RuCl(PPh3)2、Cp*RuCl(COD)或Cp*RuCl(NBD)(e.g.,B.C.Boren et al.,Ruthenium-Catalyzed Azide-AlkyneCycloaddition:Scope and Mechanism,J.Am.Chem.Soc.2008,130,28,8923-8930,https://doi.org/10.1021/ja0749993)时，形成上述方案中右部所示的产物。本领域技术人员知道容易选择合适的催化剂和合适的反应条件。通过1，3-环加成获得的其它示例性5元杂环部分是和/>(从硝酮获得，R6如本文所定义)、/>(从腈氧化物获得)、
(从重氮化合物获得)以及(从重氮化合物获得的重排产物)。
式(I)化合物也可例如如下方案所示，使用C-C偶联反应制备，特别是当Z为时，其中/>表示与磷的连接点，Q为包含与磷结合的碳-碳三键和与碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分，或为与碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键(R5为H；在一些实施例中，/>为三键，V不存在，X为R3C，优选R3和R5相同，更优选R3和R5各自为氢；OTf＝三氟甲磺酸酯)：
因此，如以上流程图中所述的偶联反应和合适的条件是本领域技术人员已知的，例如Cacchi偶联、Castro-Stevens偶联和Sonogashira偶联。作为非限制性实例，偶联反应可以使用钯催化剂和铜催化剂在碱存在下以Sonogashira偶联进行。通常，两种催化剂用于Sonogashira偶联：零价钯配合物和卤化铜(I)盐。钯催化剂的普通例子包括那些含有膦配体的催化剂，例如[Pd(PPh3)4]。另一种常用的钯源是[Pd(PPh3)2Cl2]，但也可使用含有二齿膦配体的络合物，例如[Pd(dppe)Cl2]、[Pd(dppp)Cl2]和[Pd(dppf)Cl2]。铜(I)盐，例如CuI，与末端炔反应并产生乙炔铜(I)，其作为偶联反应的活化物质。Cu(I)是反应中的助催化剂，用于提高反应速率。本领域技术人员知道选择合适的条件进行Sonogashira偶联。例如，Sonogashira偶联在室温下用碱进行，所述碱通常为胺，例如二乙胺，其也可以用作溶剂，但DMF、DMSO或醚也可以用作溶剂。可以使用其它碱，例如碳酸钾或碳酸铯。例如，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。特别地，当生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸反应时，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。溶剂也可以是水性介质，例如水或水性缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)、碳酸氢盐、EDTA/NH4HCO3缓冲液、EDTA/NH4HCO3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液或含硼酸盐的磷酸盐缓冲盐水。在反应中使用生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸的情况下，优选在缓冲液中进行反应。反应也可以在任何一种上述含水缓冲液和DMF或DMSO的混合物中进行。本领域技术人员将容易地选择合适的溶剂和缓冲剂。优选地，Sonogashira反应在惰性气体例如氩气下进行。
式(III)化合物的合成
式(I)化合物可以与式(II)的硫醇进行如以下方案所示的氢硫基化反应：
如果没有另外说明，任何变量，例如R1、V、X、Y、Z、●、/>和任何其它变量如本说明书中所定义。反应可以在合适的溶剂中进行。溶剂体系可以选自宽范围的溶剂。溶剂可以是极性非质子溶剂体系，例如四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(MeCN)、丙酮、二甲亚砜(DMSO)、乙酸乙酯(EtOAc)、N-乙基吡咯烷酮或其混合物，优选THF、DMF、DMSO；非极性溶剂如己烷、甲苯、苯、1，4-二恶烷、氯仿、乙醚或二氯甲烷(DCM)，优选DCM；极性质子溶剂，例如水、乙醇、异丙醇、甲醇、正丁醇，优选乙醇；或其混合物。例如，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。特别地，当生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸反应时，反应可以在DMF、DMSO、DMF/水混合物或DMSO/水混合物中进行。溶剂也可以是水性介质，例如水或水性缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)、碳酸氢盐、EDTA/NH4HCO3缓冲液、EDTA/NH4HCO3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液或含硼酸盐的磷酸盐缓冲盐水。在反应中使用生物分子如蛋白质、抗体、肽、核苷酸或寡核苷酸的情况下，优选在缓冲液中进行反应。反应也可以在任何一种上述含水缓冲液和DMF或DMSO的混合物中进行。本领域技术人员将容易地选择合适的溶剂和缓冲剂。优选地，硫代膦酸酯或膦酸酯的硫代氢化反应在碱性条件下进行，特别是在微碱性条件下，例如在7.2-9的pH下，例如在8或8.5的pH下。这种基本条件可以通过使用合适的缓冲系统，例如通过使用上述任何一种缓冲液来建立。另外或可选地，可以通过使用弱碱建立用于氢硫基化反应的碱性条件。合适的碱是例如碳酸盐，如(NH4)2CO3、Na2CO3、Rb2CO3、K2CO3或Cs2CO3或其相关碳酸氢盐(例如NaHCO3等)；和弱含氮碱如三甲胺Et3N(25℃时pKa为10,76)。优选使用pKa值在7.5-11.5范围内的碱。本领域技术人员将容易地选择合适的碱。对所述氢化反应的反应温度没有特别的限制。例如，所述的水硫酸化可以在0℃至60℃、0℃至50℃、0℃至40℃、0℃至30℃的温度范围内进行，例如在室温，即约25℃，例如约5℃，或者例如在生理学相关的条件下在约37℃，反应时间取决于温度、反应体积和物质的量。作为指导，反应可以例如在1分钟至24小时的时间范围内进行，例如在1分钟至20小时的时间范围内、1分钟至10小时的时间范围内、1分钟至3小时的时间范围内、或甚至在1分钟至1小时的时间范围内进行。本领域技术人员将容易地确定合适的反应温度和反应时间。类似地，本领域技术人员容易确定用于反应混合物的后处理和纯化，例如包括色谱法的合适条件。
抗体分子偶联物的合成
抗体分子的偶联物的制备特别包括还原抗体分子的二硫桥并使所述抗体分子与式(IV*)化合物反应，如以下方案中示例性所示：
还原剂
因此，获得了抗体分子的偶联物，其包含式(V)的部分：
如果没有另外说明，任何变量，例如R5、V、X、SA、SB和任何其它变量如本说明书中所定义。用于还原二硫桥的合适还原剂是本领域技术人员已知的，并且可以容易地选择。例如，其中，可以使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、连二亚硫酸钠、硫代硫酸钠或亚硫酸钠；例如，还原剂可以是三(2-羧乙基)膦(TCEP)。合适的反应条件，包括浓度、温度和时间，是本领域技术人员容易选择的。此外，本领域技术人员容易确定巯基与式(IV*)化合物反应的合适条件，并且可以包括本文已经描述的从式(I)化合物与式(II)化合物合成式(III)化合物的条件。例如，与式(IV*)化合物的还原和反应可以在0℃至50℃、0℃至40℃、0℃至30℃下进行，例如在室温下，即约25℃，例如约5℃，或例如在生理学相关条件下在约37℃；反应可以在1分钟至24小时的时间范围内进行，例如过夜。作为一个说明性实例，使用10当量TCEP在37℃和pH 8.4下可在30分钟内实现二硫键的还原，然后可以加入5当量的式(IV)化合物，反应过夜。溶剂可以是通常用于生物分子，特别是抗体反应的任何溶剂或缓冲体系，合适的溶剂和缓冲体系可包括用于式(I)化合物与式(II)化合物反应生成式(III)化合物的那些，如本文所述。特别地，反应可以在水性介质中进行，例如水或水性缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、碳酸氢盐、EDTA/NH4HCO3缓冲液、EDTA/NH4HCO3的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、含硼酸盐的磷酸盐缓冲盐水或TRIS/NaCl/EDTA。反应也可以在任何一种上述含水缓冲液和DMF或DMSO的混合物中进行。本领域技术人员将容易地选择合适的溶剂和缓冲剂。优选地，与式(IV*)化合物的反应在碱性条件下进行，特别是在微碱性条件下，例如在例如7.2和9之间的pH下，例如在8或8.5的pH下。这种基本条件可以通过使用合适的缓冲系统，例如通过使用上述任何一种缓冲液来建立。另外或作为选择，碱性条件可以通过使用弱碱建立。合适的碱是例如碳酸盐，如(NH4)2CO3、Na2CO3、Rb2CO3、K2CO3或Cs2CO3或其相关碳酸氢盐(例如NaHCO3等)；和弱含氮碱如三甲胺Et3N(25℃时pKa为10,76)。优选使用pKa值在7.5-11.5范围内的碱。本领域技术人员将容易地选择合适的碱。作为说明性实例，反应可在TRIS/NaCl/EDTA中在pH 8.4下进行，例如在50mM TRIS、1mM EDTA和300mM NaCl中在pH 8.4下进行。此外，本领域技术人员容易确定用于反应混合物的后处理和/或纯化的合适条件，例如包括使用旋转脱盐柱的缓冲液交换。
本发明的项目
本发明还涉及以下项目：
1.一种制备式(III)化合物的方法，该方法包括以下步骤：
使式(I)化合物
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X表示/>
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；以及
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并且包含基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
与式(II)的含硫醇分子进行反应
其中代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；
得到式(III)化合物
其中
当式(I)化合物中的代表三键时，/>代表双键；或
当式(I)化合物中的代表双键时，/>代表键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>以及
R1、R3、R4、Y和Z如上所定义。
2.根据项目1所述的方法，其中代表三键；V不存在；X表示R3-C；R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3为H，和/>代表双键。
3.根据项目1所述的方法，其中代表双键；V代表H或C1-C8-烷基，优选V是H；X代表/>，R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3为H；R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4是H；和/>代表键。
4.根据前述项目中任一项所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，●如前述项目中任一项所定义；以及
Q是包含至少三个主链原子和碳-碳双键的部分，其中至少一个主链原子选自S、O或N；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
5.根据项目4所述的方法，其中Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
6.根据项目5所述的方法，其中Z为R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H，且●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
7.根据项目4至6中任一项所述的方法，其进一步包括式(I)化合物的制备，所述制备包括：
使式(IV)的化合物
其中R1、R5、V、X和Y如前述项目中任一项所定义，
与●-GH反应以形成式(I)的化合物，其中G和●如前述项目中任一项所定义；优选地，G是S；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
8.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，并且●如前述项目中任一项所定义；以及
Q是含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
9.根据项目8所述的方法，其中Z选自
烷基，优选R5是H；R6为C1-C8-烷基，和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
10.根据项目9所述的方法，其中Z是优选Z为
R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H；和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
11.根据项目8至10中任一项所述的方法，其进一步包括式(I)化合物的制备，所述制备包括：
使式(IV)的化合物
其中R1、R5、V、X和Y如前述项目中任一项所定义，与●-N3、优选与●-N3反应，以形成式(I)的化合物，其中●如前述项目中任一项所定义；R6为C1-C8-烷基；优选地，所述反应在催化剂例如铜催化剂或钌催化剂的存在下进行；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
12.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，●如前述项目中任一项所定义；以及
Q是包含与式(I)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分；或
Q是包含与式(I)中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分；
其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
13.根据项目12所述的方法，其中Z是或其中Z是/>
其中●如前述项目中任一项所定义；
其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
14.根据项目12或13所述的方法，其进一步包括式(I)化合物的制备，所述制备包括：
使式(IV)的化合物
其中R1、V、X和Y如前述项目中任一项所定义，R5是H，
与或/>反应，其中L为卤素(I、Br、Cl，优选I或Br，更优选I)或O-三氟甲磺酸酯(O-triflate)，以形成式(I)化合物；优选地，所述反应在钯催化剂、铜催化剂和碱的存在下进行；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
15.根据前述项目中任一项所述的方法，其中Y为O。
16.根据项目1至14中任一项所述的方法，其中Y为NR2；优选地，其中R2是C1-C8-烷基，更优选地，其中R2是甲基、乙基、丙基或丁基，还更优选地，其中R2是甲基或乙基。
17.根据项目1至14中任一项所述的方法，其中Y为S。
18.根据项目1至14中任一项所述的方法，其中Y为键。
19.根据前述项目中任一项所述的方法，其中R1表示小分子；任选被以下中至少一个取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n、n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F，Cl，Br，I，-NO2，-N(C1-C8-烷基)H，-NH2，-N3，-N(C1-C8-烷基)2，＝O，C3-C8-环烷基，-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-链烯基；C2-C8-炔基；优选地，在每种情况下Y是O；或
R1表示任选独立地被以下基团中的至少一个取代的苯基：C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；优选地，在每种情况下，Y是键；或
R1表示5-或6-元杂芳族体系，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基；优选地，在每种情况下Y是键。
20.根据项目19所述的方法，其中R1代表小分子、C1-C8-烷基、被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基、被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基。
21.根据项目19或20所述的方法，其中R1代表C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基。
22.根据前述项目1至18中任一项所述的方法，其中R1选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。
23.根据项目22所述的方法，其中R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为/>更优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。
24.根据项目1至18中任一项所述的方法，其中R1选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为或仍更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>，其中K为H或C1-C8-烷基，优选K为H；优选其中在每种情况下Y是键。
25.根据项目1至23中任一项所述的方法，其中R1为C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基；更优选甲基或乙基；还更优选乙基；以及Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项所定义；
优选地，Z为R5为H或C1-C8烷基，优选R5为H，并且●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，C1-C8-烷基被荧光团取代；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
26.根据项目1至23中任一项所述的方法，其中R1为C2-C8-炔基，优选其中n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或其中R1为/>优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；以及/>
Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项中所定义；
优选地，Z为R5为H或C1-C8烷基，优选R5为H，并且●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
27.根据项目1至23中任一项所述的方法，其中R1为任选被至少一个以下取代基取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；以及
Z是，R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项中所定义；
优选地，Z为R5为H或C1-C8烷基，优选R5为H，并且●如前述项目中任一项所定义；
优选R1为M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
28.根据项目1至23中任一项所述的方法，其中R1为C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基；更优选甲基或乙基；还更优选乙基；以及
/>其中R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；R6为C1-C8-烷基；和●如前述项目中任一项中所定义；
优选Z为或/>更优选Z为/>R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H；和●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，C1-C8-烷基被荧光团取代；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
29.根据项目1至23中任一项所述的方法，其中R1为C2-C8-炔基，优选其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选1、2或3，更优选1；或其中R1为优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；以及
其中R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；R6为C1-C8-烷基；和●如前述项目中任一项所定义；
优选Z为或/>更优选Z为/>R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H；和●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
30.根据项目1至23中任一项所述的方法，其中R1为任选被以下中至少一个取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；以及
Z选自
其中R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；R6为C1-C8-烷基；和●如前述项目中任一项所定义；
优选地，R1为M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；
优选Z为更优选Z为/>R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H；和●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
31.根据项目1至18和24中任一项所述的方法，其中R1选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为或仍更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>，其中K为H或C1-C8-烷基，优选K为H；以及
Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项所定义；
优选地，Z为R5为H或C1-C8烷基，优选R5为H，并且●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下，Y是键；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
32.根据前述项目中任一项所述的方法，其中
●代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物(linker-drug conjugate)、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
33.根据项目32所述的方法，其中
●代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
34.根据项目32或33所述的方法，其中●代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
35.根据项目32所述的方法，其中●代表药物、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
36.根据项目18所述的方法，其中●表示连接子、药物或连接子-药物偶联物。
37.根据项目32所述的方法，其中●表示连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。
38.根据项目32所述的方法，其中●代表小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
39.根据前述项目中任一项所述的方法，其中代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸或小分子。/>
40.根据前述项目中任一项所述的方法，其中表示抗体，优选IgG抗体，更优选西妥昔单抗或曲妥单抗或布罗妥昔单抗；蛋白质，优选GFP蛋白、eGFP蛋白、mCherry蛋白或白蛋白；小分子；肽，优选式(VIII)的肽
或式(IX)的肽
其中，#表示S的位置。
41.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中
代表抗体和
●代表蛋白标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白、寡核苷酸或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
42.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中
代表蛋白质，和
●代表蛋白标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、抗体、蛋白、寡核苷酸或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
43.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中
代表肽和
●代表蛋白标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白、寡核苷酸或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
44.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中
代表氨基酸和
●代表蛋白标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白、寡核苷酸或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
45.根据项目1至18中任一项所述的方法，其中
代表抗体和
●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物。
46.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中
代表抗体和
●代表连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。
47.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中
代表核苷酸和
●代表肽、蛋白质、蛋白质标签、抗体、寡核苷酸、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
48.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中
代表核苷酸和
●代表连接子。
49.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中
代表寡核苷酸和
●代表肽、蛋白质、蛋白质标签、抗体、寡核苷酸、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
50.根据项目1至32中任一项所述的方法，其中
代表寡核苷酸和
●代表连接子。
51.根据项目1至34中任一项所述的方法，其中●代表氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物(solid support)结合；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
52.根据项目1至39中任一项所述的方法，其中，表示氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中，所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合。
53.根据项目1至50中任一项所述的方法，其中所述和所述在相同的分子中。
54.一种制备抗体分子的偶联物的方法，所述方法包括：
-在还原剂的存在下还原抗体分子的至少一个二硫桥；以及
-使所述抗体分子与式(IV*)的化合物反应
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；或/>
当是双键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；以及
R1、R3、R4、R5、Y和Z如前述项目中任一项所定义，
形成包含至少一个式(V)部分的抗体分子的偶联物
其中SA和SB各自为抗体分子链的硫原子；
当式(IV*)化合物中的表示三键时，/>表示双键；或
当式(IV*)的化合物中的表示双键时，/>表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
是键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；以及
其中R1、R3、R4、R5、Y和Z如前述项目中任一项所定义。
55.根据项目54所述的方法，其中所述抗体分子选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体和分离的抗体。
56.根据项目55所述的方法，其中抗体分子是IgG，例如曲妥珠单抗、西妥昔单抗或布伦妥昔单抗。
57.根据项目54至56中任一项所述的方法，其中所述还原剂选自三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、连二亚硫酸钠、硫代硫酸钠和亚硫酸钠；优选地，所述还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
58.根据项目54至57中任一项所述的方法，其中表示三键；V不存在；X表示R3-C；R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；R5代表H或C1-C8-烷基，优选R5是H；和/>代表双键。/>
59.根据项目54至57中任一项所述的方法，其中表示双键；V代表H或C1-C8-烷基，优选V是H；X表示/>R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4是H；R5代表H或C1-C8-烷基，优选R5是H；和/>代表键。
60.根据项目54至59中任一项所述的方法，其中表示/>其中/>表示与磷的连接点；Y表示O、NR2、S或键；R1代表任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；和R2代表H或C1-C8-烷基。
61.根据项目60所述的方法，其中Y是O。
62.根据项目60所述的方法，其中Y是NR2；优选地，其中R2是C1-C8-烷基，更优选地，其中R2是甲基、乙基、丙基或丁基，还更优选地，其中R2是甲基或乙基。
63.根据项目60所述的方法，其中Y是S。
64.根据项目60所述的方法，其中Y是键。
65.根据项目60至64中任一项所述的方法，其中R1表示小分子；任选被以下中的至少一个取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30、29或30，F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n取代，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、28、30或29；C2-C8-烯基；C2-C8-炔基；优选地，在每种情况下Y是O；或
R1表示任选独立地被至少一个以下基团取代的苯基：C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；优选地，在每种情况下，Y是键；或
R1表示5-或6-元杂芳族体系，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基；优选地，在每种情况下Y是键。
66.根据项目65所述的方法，其中R1代表小分子、C1-C8-烷基、被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基、被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基。
67.根据项目65或66所述的方法，其中R1表示C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基；更优选乙基。
68.根据项目60至64中任一项所述的方法，其中R1选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。
69.根据项目68所述的方法，其中R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为/>更优选其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。
70.根据项目60至64中任一项所述的方法，其中R1选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为或仍更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>，其中K为H或C1-C8-烷基，优选K为H；优选其中在每种情况下Y是键。
71.根据项目60至64中任一项所述的方法，其中R1表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
72.根据项目71所述的方法，其中R1代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体现；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
73.根据项目71或72所述的方法，其中R1代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
74.根据项目71所述的方法，其中R1代表药物、蛋白质标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
75.根据项目71所述的方法，其中R1表示连接子、荧光团、或连接子-荧光团偶联物。
76.根据项目71所述的方法，其中R1表示连接子、荧光团、或连接子-荧光团偶联物。
77.根据项目71所述的方法，其中R1表示小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
78.根据项目54至59中任一项所述的方法，其中表示Z；Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包括基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
79.根据项目78所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，●如前述项目中任一项所定义；以及
Q是包含至少三个主链原子和碳-碳双键的部分，其中所述主链原子中至少一个选自S、O或N；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
80.根据项目79所述的方法，其中Z是RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。/>
81.根据项目80所述的方法，其中Z为RX为H或C1-C8-烷基，优选RX为H，和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
82.根据项目78所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，●如前述项目中任一项所定义；以及
Q是含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
83.根据项目40所述的方法，其中Z选自
其中RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H；R6为C1-C8-烷基，和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
84.根据项目83所述的方法，其中Z是优选Z为
RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H，和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
85.根据项目78所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，●如前述项目中任一项所定义；以及
Q是包含与式(IV*)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分；或
Q为包含与式(IV*)中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分；
其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
86.根据项目85所述的方法，其中Z是或其中Z是
其中●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
87.根据项目78至86中任一项所述的方法，其中●表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
88.根据项目87所述的方法，其中●代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
89.根据项目87或88所述的方法，其中●代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
90.根据项目87所述的方法，其中●代表药物、蛋白质标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
91.根据项目87所述的方法，其中●表示连接子、药物或连接子-药物偶联物。
92.根据项目87所述的方法，其中●表示连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。
93.根据项目87所述的方法，其中●表示小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
94.根据项目78至86中任一项所述的方法，其中●表示小分子；任选被以下的至少一个取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30或30；C2-C8-烯基；C2-C8-炔基；其中任选地，连接子设置在●和Q之间；或
●代表任选独立地被至少一个以下基团取代的苯基：C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2，或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；其中任选地，连接子设置在●和Q之间；或
●代表5-或6-元杂芳族体系，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
95.根据项目94所述的方法，其中●代表小分子、C1-C8-烷基、被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基、被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
96.根据项目94或95所述的方法，其中●代表C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基；还更优选乙基；其中任选地，在和Q之间设置连接子。
97.根据项目78至86中任一项所述的方法，其中●选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
98.根据项目97所述的方法，其中●选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选●为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选3、4或5，还更优选4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选●为/>更优选其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
99.根据项目78至86中任一项所述的方法，其中●选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，仍更优选●为或仍更优选●是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选●是/>其中K是H或C1-C8-烷基，优选K是H；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
100.式(I)化合物
其中R1、V、X、Y和Z如前述项目中任一项所定义，特别是如项目1至53中任一项所定义。
101.根据项目100所述的化合物，其中代表三键；V不存在；X表示R3-C；和R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H。
102.根据项目100所述的化合物，其中代表双键；V是H或C1-C8-烷基，优选V是H；X表示/>R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；和R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4是H。
103.式(III)的化合物
其中
表示双键；或
表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>以及
R1、R3、R4、Y、Z和如前述项目中任一项所定义，特别是如项目1至53中任一项所定义。
104.根据项目103所述的化合物，其中代表双键；V不存在；X表示R3-C；和R3是H或C1-C8-烷基，优选R3是H。
105.根据项目103所述的化合物，其中代表键；V代表H或C1-C8-烷基，优选V是H；X表示/>R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4为H。
106.根据项目48至53中任一项所述的化合物，其中Z是其中/>表示与磷的连接点，●如前述项目中任何一项所定义；以及
Q是包含至少三个主链原子和碳-碳双键的部分，其中所述主链原子中至少一个选自S、O或N；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
107.根据项目106所述的化合物，其中Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
108.根据项目107所述的化合物，其中Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H，和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
109.根据项目100至105中任一项所述的化合物，其中Z是其中/>表示与磷的连接点，●如前述项目中任一项所定义；以及
Q是含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
110.根据项目109所述的化合物，其中Z选自
其中R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H；R6为C1-C8-烷基，和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
111.根据项目110所述的化合物，其中Z是优选Z为
R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H，且●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
112.根据项目48至53中任一项所述的化合物，其中Z是其中/>表示与磷的连接点，●如前述项目中任一项所定义；以及
Q是包含与式(I)或式(III)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分；或
Q是包含与式(I)或式(III)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分；
其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
113.根据项目112所述的化合物，其中Z是或其中Z是/>
其中●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
114.根据项目100至113中任一项所述的化合物，其中Y为O。
115.根据项目100至113中任一项所述的化合物，其中Y是NR2；优选地，其中R2是C1-C8-烷基，更优选地，其中R2是甲基、乙基、丙基或丁基，还更优选地，其中R2是甲基或乙基。
116.根据项目100至113中任一项所述的化合物，其中Y为S。
117.根据项目100至113中任一项所述的化合物，其中Y为键。
118.根据项目100至117中任一项所述的化合物，其中R1表示小分子；任选被至少一个以下的取代基取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30或30；C2-C8-烯基；C2-C8-炔基；优选地，在每种情况下Y是O；或
R1表示任选独立地被至少一个以下基团取代的苯基：C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2，或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；优选地，在每种情况下，Y是键；或
R1表示5-或6-元杂芳族体系，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基；优选地，在每种情况下Y是键。
119.根据项目118所述的化合物，其中R1代表小分子、C1-C8-烷基、被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基、被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基。
120.根据项目118或119所述的化合物，其中R1代表C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基。
121.根据项目48至61中任一项所述的化合物，其中R1选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。
122.根据项目63所述的化合物，其中R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为/>更优选其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。
123.根据项目100至117中任一项所述的化合物，其中R1选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为或仍更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中K为H或C1-C8-烷基，优选K为H；优选其中在每种情况下Y是键。/>
124.根据项目100至122中任一项所述的化合物，其中R1为C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基；更优选甲基或乙基；还更优选乙基；以及Z是
R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项所定义；
优选地，Z为R5为H或C1-C8烷基，优选R5为H，并且●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，C1-C8-烷基被荧光团取代
任选地，在●和Q之间设置连接子。
125.根据项目100至122中任一项所述的化合物，其中R1为C2-C8-炔基，优选其中n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或其中R1为优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；以及
Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项中所定义；
优选地，Z为R5为H或C1-C8烷基，优选R5为H，并且●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
126.根据项目100至122中任一项所述的化合物，其中R1为任选被至少一个以下基团取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；以及
Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项所定义；/>
优选地，Z为R5为H或C1-C8烷基，优选R5为H，并且●如前述项目中任一项所定义；
优选R1为M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
127.根据项目100至122中任一项所述的化合物，其中R1为C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基；更优选甲基或乙基；还更优选乙基；以及Z选自
其中R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；R6为C1-C8-烷基；和●如前述项目中任一项所定义；
优选Z为更优选Z为/>R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H；和●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，C1-C8-烷基被荧光团取代；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
128.根据项目100至122中任一项所述的化合物，其中R1为C2-C8-炔基，优选其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选1、2或3，更优选1；或其中R1为优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；以及
其中R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；R6为C1-C8-烷基；和●如前述项目中任一项所定义；
优选Z为更优选Z为/>R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H；和●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
129.根据项目100至122中任一项所述的化合物，其中R1为任选被至少一个选自以下的基团取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和Z选自
其中R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；R6为C1-C8-烷基；和●如前述项目中任一项所定义；
优选R1为M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；
优选Z为更优选Z为/>R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H；和●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下Y是O；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
130.根据项目100至117和123中任一项所述的化合物，其中R1选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为或仍更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选地其中R1为/>其中K为H或C1-C8-烷基，优选K为H；以及
Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项所定义；
优选地，Z为R5为H或C1-C8烷基，优选R5为H，并且●如前述项目中任一项所定义；
优选地，在每种情况下，Y是键；
任选地，在●和Q之间设置连接子。
131.根据项目100至130中任一项所述的方法，其中●表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
132.根据项目131所述的化合物，其中●代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
133.根据项目131或132所述的化合物，其中●代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
134.根据项目131所述的化合物，其中●代表药物、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
135.根据项目131所述的方法，其中●表示连接子、药物或连接子-药物偶联物。
136.根据项目131所述的化合物，其中●表示连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。
137.根据项目131所述的化合物，其中●表示小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
138.根据项目51至66中任一项所述的方法，其中，表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸或小分子。
139.根据项目103至138中任一项所述的化合物，其中表示抗体，优选IgG抗体，更优选西妥昔单抗或曲妥单抗或布罗妥昔单抗；蛋白质，优选GFP蛋白、eGFP蛋白、mCherry蛋白或白蛋白；小分子；肽，优选式(VIII)的肽
或式(IX)的肽
其中，#表示S的位置。
140.根据项目103至131中任一项所述的化合物，其中
代表抗体和
●代表蛋白标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白、寡核苷酸或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
141.根据项目103至131中任一项所述的化合物，其中
代表蛋白质，和
●代表蛋白标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、抗体、蛋白、寡核苷酸或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
142.根据项目103至131中任一项所述的化合物，其中
代表肽和
●代表蛋白标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白、寡核苷酸或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
143.根据项目103至131中任一项所述的化合物，其中
代表氨基酸和
●代表蛋白标签，或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、肽、蛋白、寡核苷酸或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
144.根据项目103至131中任一项所述的方法，其中，
代表抗体和
●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物。
145.根据项目103至131中任一项所述的化合物，其中
代表抗体和
●代表连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。
146.根据项目103至131中任一项所述的化合物，其中
代表核苷酸和
●代表肽、蛋白质、蛋白质标签、抗体、寡核苷酸、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
147.根据项目103至131中任一项所述的化合物，其中
代表核苷酸和
●代表连接子。
148.根据项目103至131中任一项所述的化合物，其中
代表寡核苷酸和
●代表肽、蛋白质、蛋白质标签、抗体、寡核苷酸、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素或小分子；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
149.根据项目103至131中任一项所述的化合物，其中
代表寡核苷酸和
●代表连接子。
150.根据项目100至133中任一项所述的方法，其中●表示氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合，其中任选地连接子设置在●和Q之间。
151.根据项目103至138中任一项所述的方法，其中表示氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合。
152.式(IIIa)的化合物
/>
其中
表示双键；或
表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>以及
R1、R3、R4、Y、Z和如前述项目中任一项所定义，特别是如项目1至53或100至151中任一项所定义。
153.式(IV)的化合物
其中R1、R5、V、X和Y如前述项目中任一项所定义，特别是如项目1至52中任一项所定义；和/或特别地如项目100至152中的任一项所定义。
154.式(IV*)的化合物
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；
当是双键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与所述磷的连接点；或/>
表示Z；以及
R1、R3、R4、R5、Y和Z如前述项目中任一项所定义，特别是如项目54至99中任一项所定义。
155.根据项目154所述的方法，其中代表三键；V不存在；X表示R3-C；R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；和R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H。
156.根据项目154所述的方法，其中代表双键；V代表H或C1-C8-烷基，优选V是H；X表示/>R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4是H；和R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H。
157.一种抗体分子的偶联物，其包含至少一个式(V)部分的
其中SA和SB各自为所述抗体分子链的硫原子；
表示双键；或
表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；以及
R1、R3、R4、R5、Y和Z如前述项目中任一项所定义，特别是如项目54至99中任一项所定义。
158.根据项目157所述的抗体分子的偶联物，其中所述抗体分子选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体和分离的抗体。
159.根据项目158所述的抗体分子的偶联物，其中所述抗体分子是IgG，优选曲妥珠单抗(Trastuzumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)或布伦妥昔单抗(Brentuximab)；或其片段。
160.根据项目157至159中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中代表双键；V不存在；X表示R3-C；R3为H或C1-C8-烷基，优选R3为H；和R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H。
161.根据项目157至160中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中代表键；V代表H或C1-C8-烷基，优选V是H；X表示/>R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4是H；和R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H。
162.根据项目154至156中任一项所述的化合物，或根据项目157至161中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中表示/>其中/>表示与磷的连接点；Y表示O、NR2、S或键；R1代表任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；和R2代表H或C1-C8-烷基。
163.根据项目162所述的化合物，或根据项目162所述的抗体分子的偶联物，其中Y是O。
164.根据项目162所述的化合物，或根据项目162所述的抗体分子的偶联物，其中Y是NR2；优选地，其中R2是C1-C8-烷基，更优选地，其中R2是甲基、乙基、丙基或丁基，还更优选地，其中R2是甲基或乙基。
165.根据项目162所述的化合物，或项根据目162所述的抗体分子的偶联物，其中Y是S。
166.根据项目162所述的化合物，或根据项目162所述的抗体分子的偶联物，其中Y是键。
167.根据项目162至166中任一项所述的化合物，或根据项目162至166中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中R1表示小分子；任选被以下基团中的至少一个取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30、29或30，F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30、29或30；C2-C8-烯基；C2-C8-炔基；优选地，在每种情况下Y是O；或
R1表示任选独立地被至少一个以下基团取代的苯基：C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；优选地，在每种情况下，Y是键；或
R1表示5-或6-元杂芳族体系，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基；优选地，在每种情况下Y是键。
168.根据项目167所述的化合物，或根据项目167所述的抗体分子的偶联物，其中R1表示小分子，C1-C8-烷基，被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基，被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基。
169.根据项目167或168所述的化合物，或根据项目167或168所述的抗体分子的偶联物，其中R1代表C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基；更优选乙基。
170.根据项目162或166所述的化合物，或根据项目162或166所述的抗体分子的偶联物，其中R1选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。
171.根据项目170所述的化合物，或根据项目170所述的抗体分子的偶联物，其中R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选R1为M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为
其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为/>更优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。
172.根据项目162至166中任一项所述的化合物，或根据项目162至166中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中R1选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，R1更优选为或仍更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中K为H或C1-C8-烷基，优选K为H；优选其中在每种情况下Y是键。
173.根据项目162至166中任一项所述的化合物，或根据项目162至166中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中R1表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5元或6元杂环体系；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
174.根据项目173所述的化合物，或根据项目173所述的抗体分子的偶联物，其中R1表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
175.根据项目173或项目174所述的化合物，或根据项目173或项目174的抗体分子的偶联物，其中R1代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
176.根据项目173所述的化合物，或项目173所述的抗体分子的偶联物，其中R1代表药物、蛋白质标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
177.根据项目173所述的化合物，或根据项目173所述的抗体的偶联物，其中R1代表连接子、药物或连接子-药物偶联物。
178.根据项目173所述的化合物，或根据项目173所述的抗体分子的偶联物，其中R1表示连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。
179.根据项目173所述的化合物，或根据项目173所述的抗体分子的偶联物，其中R1表示小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
180.根据项目154至156中任一项所述的化合物，或根据项目154至156中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中表示Z；Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包括基团●，其中●表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
181.根据项目180所述的化合物，或根据项目180所述的抗体分子的偶联物，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，●如前述项目中任一项所定义；以及Q是包含至少三个主链原子和碳-碳双键的部分，其中所述主链原子的至少一个选自S、O或N；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
182.根据项目181所述的化合物，或根据项目181所述的抗体分子的偶联物，其中Z是RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
183.根据项目182所述的化合物，或根据项目185所述的抗体分子的偶联物，其中Z是RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H，且●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
184.根据项目180所述的化合物，或根据项目180所述的抗体分子的偶联物，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，●如前述项目中任一项所定义；以及Q是含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
185.根据项目184所述的化合物，或根据项目184所述的抗体分子的偶联物，其中Z选自
其中RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H；R6为C1-C8-烷基，和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。/>
186.根据项目185所述的化合物，或根据项目185所述的抗体分子的偶联物，其中Z是优选Z是/>
RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H，和●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
187.根据项目180所述的化合物，或根据项目180所述的抗体分子的偶联物，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，●如前述项目中任一项所定义；以及Q是含有与式(IV*)化合物或式(V)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分，或Q是包含与式(IV*)中的磷或式(V)的部分结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
188.根据项目187所述的化合物，或根据项目190所述的抗体分子的偶联物，其中Z是或其中Z是/>
其中●如前述项目中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
189.根据项目180至188中任一项所述的化合物，或根据项目180至188中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中，其中●代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
190.根据项目189所述的化合物或项目189所述的抗体分子的偶联物，其中●表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
191.根据项目189或项目190所述的化合物，或根据项目189或项目190所述的抗体分子的偶联物，其中●表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
192.根据项目189所述的化合物或项目189所述的抗体分子的偶联物，其中●代表药物、蛋白质标签或荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地，在Q之间设置连接子。
193.根据项目189所述的化合物，或者根据项目189所述的抗体分子的偶联物，其中●表示连接子、药物或连接子-药物偶联物。
194.根据项目189所述的化合物，或根据项目189所述的抗体分子的偶联物，其中●表示连接子、荧光团、或连接子-荧光团偶联物。
195.根据项目189所述的化合物或项目189所述的抗体分子的偶联物，其中●表示小分子、荧光团、肽、蛋白质或抗体；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
196.根据项目180至188中任一项所述的化合物，或根据项目180至188中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中●表示小分子；任选被至少一个以下基团取代的C1-C8-烷基：(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、27、30或30；C2-C8-烯基；C2-C8-炔基；其中任选地，连接子设置在●和Q之间；或
●代表任选独立地被至少一个以下基团取代的苯基：C1-C8-烷基、(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N(C1-C8-烷基)2，或羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；其中任选地，连接子设置在●和Q之间；或
●代表5-或6-元杂芳族体系，例如任选取代的三唑基或任选取代的吡啶基；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
197.根据项目196所述的化合物或项目196所述的抗体分子的偶联物，其中●代表小分子、C1-C8-烷基、被-S-S-(C1-C8-烷基)取代C1-C8-烷基、被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；C2-C8-烯基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或C2-C8-炔基；或苯基；或-NO2取代的苯基；或被任选取代的C1-C8-烷基取代的三唑基；或被荧光团取代的三唑基；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
198.根据项目196或项目197所述的化合物，或项目196或项目197所述的抗体分子的偶联物，其中●代表C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基；还更优选乙基；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
199.根据项目180至188中任一项所述的化合物，或根据项目180至188中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中●选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；其中任选地，连接子设置在●和Q之间。
200.根据项目199所述的化合物或根据项目199所述的抗体分子的偶联物，其中●选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选●为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选3、4或5，还更优选4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选●为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选●为更优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。
201.根据项目180至188中任一项所述的化合物，或根据项目180至188中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中●选自任选取代的芳基，优选任选取代的苯基，更优选未取代的苯基；和任选取代的杂芳基，优选任选取代的三唑基，更优选被任选取代的C1-C8烷基取代的三唑基；更优选被荧光团取代的三唑基，仍更优选●为或仍更优选●是/>其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选1、2或3，更优选1；或优选●是/>其中K是H或C1-C8-烷基，优选K是H；其中任选地，在●和Q之间设置连接子。/>
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。然而，本文所述的实施例和具体实施方案不应被解释为将本发明限制于这些具体实施方案。
其中，本发明人已经表明，使用基于小分子的FRET体系，用二炔基次膦酸酯(diethynyl-phosphinates)产生的硫醇偶联物在人血清中和在小硫醇的存在下是高度稳定的。此外，使用二炔基亚膦酸酯来位点选择性修饰蛋白质以用于生物学应用。此外，在产生官能化的、重新桥接的抗体中使用了二炔基次膦酸酯，这些抗体显示出对它们的抗原保持选择性。
图1显示根据本发明开发取代的二炔基亚膦酸酯作为试剂用于天然二硫化物，例如在治疗性抗体中的选择性硫醇-硫醇生物偶联和再桥接。
实施例1：二乙炔基-次膦酸酯的合成和对硫醇的反应性
从市售二氯亚磷酸乙酯和乙炔基溴化镁开始，本发明人获得了乙基二乙炔基次膦酸酯(I)，方案1a。次膦酸酯I成功地用过氧化氢乙基二乙炔基次膦酸酯(1)氧化，产率72％。为了测试其对硫醇的反应性，将化合物1与过量乙硫醇(3eq.)在DMF中混合。实际上，在室温下反应5分钟后，观察到起始材料完全转化为双硫醇加合物(室温，方案1a)。
方案1a：合成二乙炔基次膦酸酯。次膦酸酯1的产生和其硫醇加合物的形成。
有趣的是，形成了三种不同异构体的混合物(通过UPLC测定)，其可以通过半制备HPLC分离(70％合并的分离产率)。用核磁共振(NMR)光谱表征所获得的化合物，揭示观察到的45:50:5的比例分别对应于Z/Z-、E/Z-和E/E-异构体。(图2)。然而，观察到Z/Z-和E/Z异构体缓慢异构化形成E/E-产物。(图3)。
图2显示用二乙炔基次膦酸酯进行硫醇加成的E/Z选择性。基于烯烃-质子的特征偶联常数和它们与以前表征的硫醇加成物的比较，分离的化合物的NMR分析允许鉴定不同的异构体(Kasper,M.；Glanz,M.；Stengl,A.；Penkert,M.；Klenk,S.；Sauer,T.；Schumacher,D.；Helma,J.；Krause,E.；Cardoso,M.C.；Leonhardt,H.；Hackenberger,C.P.R.Cysteine-Selective Phosphonamidate Electrophiles for Modular ProteinBioconjugations.Angew.Chemie Int.Ed.2019,58(34),11625-11630.https://doi.org/10.1002/anie.201814715；Mikolajczyk,M.；Costisella,B.；Grzejszczak,S.Organosulphur Compounds-XXIX.Synthesis and Pummerer Rearrangement ofβ-Phosphoryl Sulphoxides.Tetrahedron 1983,39(7),1189-1193.https://doi.org/10.1016/S0040-4020(01)91883-6)。
图3显示所形成的硫醇加合物从Z/Z到E/E的异构化。将分离的Z/Z-产物(1-EtSH)放入NMR-管中并溶解在CDCl3。在四天的时间内记录1H-和31PNMR，以监测异构化为E/E-形式。图3a显示异构化过程的示意图。图3b显示说明逐步异构化的1H-NMR扫描。图3c显示对应于不同异构体的31P-NMR信号随时间的积分。
实验步骤在以下实施例18中给出。
实施例2：具有官能O-取代基的二乙炔基次膦酸酯的合成
为了得到具有功能性O-取代基的化合物，开发了从二乙基-二氯化磷酰胺开始的一锅两步反应。(方案1b)。因此，在初始步骤中，二乙基-二氯化磷酰胺被乙炔基溴化镁取代两次。使用该路线，合成了带有炔作为点击-手柄的二炔基次膦酸酯(2)，以及四乙二醇(3)和荧光团NBD(4)(方案1b)。在该合成过程中，发现二乙炔基次膦酸酯氧化后在二氧化硅上是热敏性的且是适度稳定的。为此，本发明人纯化了P(III)-衍生物形式的化合物，并将其氧化作为最终步骤。此外，通过将乙炔基溴化镁加成到二乙基二氯化磷酰胺上获得的中间体可以用过氧化氢氧化得到II。
方案1b：官能性二炔基次膦酸酯2-4的合成路线。
实验步骤在以下实施例18中给出。
实施例3：蛋白质-偶联物的稳定性
蛋白质-偶联物在生理和生物相关条件下(例如在其它硫醇存在下)的稳定性对于它们的成功应用是极其重要的。尤其是，已经报道了马来酰亚胺-和缺电子炔-基硫醇加合物易于与其它硫醇交换，因为它们存在于细胞内或血清中(S.B.Gunnoo,A.Madder,ChemBioChem 2016,17,529-553；H.-Y.Shiu,T.-C.Chan,C.-M.Ho,Y.Liu,M.-K.Wong,C.-M.Che,Chem.-A Eur.J.2009,15,3839-3850)。为了研究基于磷酰胺化合物和硫代膦酸酯的硫醇加合物的稳定性，以前已经使用了荧光猝灭分析(A.L.Baumann,S.Schwagerus,K.Broi,K.Kemnitz-Hassanin,C.E.Stieger,N.Trieloff,P.Schmieder,C.P.R.Hackenberger,J.Am.Chem.Soc.2020,142,9544-9552；M.Kasper,M.Glanz,A.Stengl,M.Penkert,S.Klenk,T.Sauer,D.Schumacher,J.Helma,E.Krause,M.C.Cardoso,H.Leonhardt,C.P.R.Hackenberger,Angew.Chemie Int.Ed.2019,58,11625-11630)。使用该分析方法，研究了由二乙炔基次膦酸酯1产生的硫醇偶联物的稳定性，以及硫醇偶联后P-O键的稳定性。淬灭的产物F1-F3是由肽P3、EDANS-SH或EDANS-N3合成的，相应的次膦酸酯1或3用作双反应性的乙炔类次膦酸酯。(方案1c和图4)对于所有构建体，在生理缓冲液、人血清和过量游离硫醇存在下观察到几天的优异稳定性。(图5a-c和图6)。只有在强碱性条件下，偶联物才通过在连接的Cys残基处的β-消除而降解。
方案1c：对二炔基次膦酸酯的连续硫醇加成允许产生猝灭的FRET对F1和F2。
图4显示淬灭的FRET对F1-F3的合成。产生淬灭荧光团对的合成方法：从肽2和过量(10当量)次膦酸酯1在PBS(pH 7.4)中合成猝灭的FRET-Pair 1(FRET对1)。中间体纯化后，与1.2当量EDANS-硫醇在PBS中反应。F1通过半制备HPLC纯化(1.67mg，86％)。猝灭的FRET-Pair 2(FRET对2)类似于F1合成，仅次膦酸酯2用作连接子。F2通过半制备HPLC纯化(1.94mg，91％)。从2当量肽2和次膦酸酯2(1当量)在PBS中合成淬灭的FRET-Pair3(FRET-对3)。随后，使用CuBr(10mol％)作为催化剂，将EDANS-叠氮化物偶联至次膦酸酯侧链。F3通过半制备HPLC纯化(2.13mg，78％)。
图5a显示研究硫醇偶联物稳定性的FRET淬灭分析。图5b和图5c显示在PBS、补充有谷胱甘肽的PBS、人血清和0.1M NaOH水溶液中观察到72小时以上的构建体F1和F2的EDANS荧光。
图6显示使用基于荧光团-猝灭剂的测定方法对二乙炔基-次膦酸酯偶联物的稳定性测试，以研究次膦酸酯-硫醇加合物的稳定性。图6a和图6b显示次膦酸酯连接的染料-淬灭剂偶联物的结构和基于荧光-淬灭剂的读出原理。图6c显示偶联物F1-F3的荧光测量。Dabcyl-EDANS加合物的稳定性研究在96孔板(Corning3615，黑色，透明，平底)中进行至少三次。向每个孔中加入5μl 200μM Dabcyl-EDANS偶联物的储备溶液和95μl各自的测试溶液。人血清购自Sigma Aldrich。将谷胱甘肽以10mM的浓度溶解于PBS中，并将pH调节至7.4。在200μM进行0.1mM NaOH研究，中和至pH 7并稀释至10μM，然后进行荧光测量。在TecanSafire平板读数器上测量荧光。激发：360nm，发射：508nm，带宽：5nm，20℃。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例4：蛋白质修饰
已经证明这种化合物类别是高度硫醇反应性的，并且所得偶联物在各种生物学相关条件下是稳定的，测试了它们用于蛋白质修饰的适用性。首先，次膦酸酯-1与含有单个可寻址Cys的eGFP突变体(eGFPC70M S147C)反应。使用10当量含有10％ DMSO作为共溶剂的PBS pH 7.4中的次膦酸酯，30分钟后反应完成(图5d)。通过CD-和荧光-光谱分析蛋白偶联物，结果表明，eGFP的二级结构在修饰后没有改变(图7)。胰蛋白酶消化的蛋白质的串联-质谱(MS/MS)分析证实，除了Cys之外没有氨基酸被次膦酸酯修饰(图7)。
为了证明使用二乙炔基次膦酸酯的Cys特异性蛋白质标记的普遍适用性，标记了具有一个单一可寻址Cys残基的不同大小和性质的各种蛋白质(泛蛋白G76C、组蛋白H4、重组人白蛋白和NLS-mCherry)。以10当量次膦酸酯孵育蛋白质(10-50μM，在PBS pH 7.4中)，在反应10-60分钟后产生单修饰的蛋白质。(图5d)相反，1与不含可寻址Cys的eGFP变体(eGFPC70M)的反应没有导致任何蛋白质标记，进一步支持了优异的Cys选择性。
图5d显示使用二乙炔基次膦酸酯进行位点选择性蛋白质修饰和成功标记的蛋白质的解卷积的完整蛋白质-MS谱的一般方案。
图7显示通过测定用二乙炔基次膦酸酯标记蛋白质对二级结构的影响，用次膦酸酯1进行eGFP标记。图7a显示用10eq PBS中的1标记eGFP(C70M S147C)(30分钟，r.t.)，然后通过具有7K MWCO的0.5mL ZebaTM旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific，USA)纯化到磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.5)中。通过完整蛋白MS验证完全标记。图7b显示在将蛋白质稀释至5μM浓度后记录的CD和荧光光谱。与从未修饰的eGFP获得的光谱比较没有显示显着差异。这表明，标记不影响蛋白质的二级结构。图7c显示凝胶内胰蛋白酶消化的、标记的eGFP的串联质谱分析，证实了仅半胱氨酸被标记。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例5：硫醇加成的反应动力学
随后，将这种新的化合物种类与其它Cys-反应性亲电子试剂在反应动力学方面进行比较。由于第二次硫醇加入干扰分析，因此对于双反应性试剂，反应动力学的估计尤其具有挑战性。然而，人们观察到在蛋白质水平上，第二次硫醇加成(即蛋白质-蛋白质交联)显著更慢，可能是因为扩散成为限制因素。结果，2与浓度为90μM的Tris缓冲液(pH 8.3)中的一当量GFP在室温下反应。用eGFPC70M作为内标，通过完整的蛋白-MS监测反应进程，显示二级速率常数约为0.47M-1sec-1，这与以前报道的P(V)-亲电子试剂相当(A.L.Baumann,S.Schwagerus,K.Broi,K.Kemnitz-Hassanin,C.E.Stieger,N.Trieloff,P.Schmieder,C.P.R.Hackenberger,J.Am.Chem.Soc.2020,142,9544-9552；M.Kasper,M.Glanz,A.Stengl,M.Penkert,S.Klenk,T.Sauer,D.Schumacher,J.Helma,E.Krause,M.C.Cardoso,H.Leonhardt,C.P.R.Hackenberger,Angew.Chemie Int.Ed.2019,58,11625-11630)(图8)。
图8显示对二乙炔基次膦酸酯与蛋白质的反应动力学的估计。确定eGFP(C70MS147C)和次膦酸酯2之间的反应的二级速率常数。图8a显示反应条件。反应一式三份进行。将90μl eGFP(0.1mM)与10μl 0.9mM次膦酸酯2的DMSO溶液混合。60、90、150、210和300分钟后取样，并通过完整蛋白质-MS分析。图8b显示在两种反应物浓度相等的情况下确定二阶速率常数的数学考虑。图8c显示eGFP随时间的浓度。通过去卷积(解卷积)的质量相对于内标eGFP(C70M)的强度计算。图8d示出1/C随时间的变化。该斜率对应于二阶速率常数。显示了三次独立测量的平均值和误差。
实施例6：蛋白质偶联物的制备
接下来，使用两步标记方法产生功能性蛋白质-偶联物。最近，已经描述了使用线性多精氨酸肽(R10)将蛋白质的非内体细胞递送至活细胞中，并具有即时生物利用度(C.P.R.Schneider,Anselm F.L.；Kithil,Marina；Cardoso,M.Cristina；Lehmann,Martin；Hackenberger,2021，投稿)。在两步标记方法之后，含有R10的Cys通过次膦酸酯1与eGFP偶联。(图9a)手头有eGFP-R10结合物，按照先前开发的方案(C.P.R.Schneider,Anselm F.L.；Kithil,Marina；Cardoso,M.Cristina；Lehmann,Martin；Hackenberger,2021，投稿)探测细胞摄取进入活HeLa-Kyoto细胞。活细胞成像显示蛋白质的胞质定位。此外，观察到在核仁中的定位，这表明次膦酸酯-键在活细胞内部是稳定的(图5e和图9b)。此外，含Cys的R10通过NBD次膦酸酯5与NLS-mCherry-5偶联(图5d和图9c)。
图5e显示穿过R10-肽的细胞与mCherry-5的偶联允许mCherry递送至活细胞中，其核仁定位和mCherry与NBD的共定位。这也表明次膦酸酯键在活细胞内是稳定的(图5e和图9d)。
图9显示作为用于将细胞穿透肽附着于蛋白质的连接分子的二乙炔基次膦酸酯。图9a显示eGFP-R10-偶联物产生的示意图。图9b显示按照Schneider等的方法(Schneider,Anselm F.L.；Kithil,Marina；Cardoso,M.Cristina；Lehmann,Martin；Hackenberger,Christian P.R.；Cellular uptake of Large Biomolecules Enabled by Cell-surface-reactive Cell-penetrating Peptide Additives,Nat.Chem.(2021)接收稿件.https://doi.org/10.1038/s41557-021-00661-x.)单独用eGFP和eGFP-R10孵育后HeLa细胞的荧光成像。HeLa Kyoto细胞在含5％ CO2的DMEM 4.5g/L葡萄糖和10％胎牛血清(FBS)的潮湿空气中于37℃生长。将15,000个HeLa Kyoto细胞接种到8孔ibidiμ-载玻片的每孔中。细胞在37℃和5％ CO2中粘附和生长24小时。用不含FBS的Fluorobrite DMEM洗涤细胞两次，并在不含FBS的Fluorobrite DMEM中与10μM eGFP-1-R10和添加剂(10μM TNB-R10)一起孵育。细胞在37℃和5％ CO2培养1小时。用含有20mM谷氨酰胺和10％ FBS的Fluorobrite DMEM洗涤细胞三次。然后用含有20mM谷氨酰胺和10％ FBS的含Hoechst染色剂(Hoechst 33342)的Fluorobrite DMEM覆盖细胞。eGFP摄取实验的活细胞显微图像在具有CSU-X1(Andor)和活细胞孵育腔室(OKOlab)的Nikon-CSU旋转盘显微镜上获得。所有活细胞图像都是使用Planapo60×NA 1.4油物镜(oil objector)(Nikon)和EMCCD(AU888，Andor)获得的。明视野图像与荧光图像一起获得。标准激光器、四重Dicrioc(400-410、486-491、560-570、633-647、AHF)和发射滤光器用于共焦荧光图像的获取(BFP(Hoechst 33342)，激发：405nm发射：450/50、GFP(GFP)，激发：488发射：525/50。图像显示灰色的明视野，绿色的eGFP通道和蓝色标尺的Hoechst 33342。比例尺代表20μm。
作为连接分子用于产生细胞穿透蛋白双偶联物的二乙炔基次膦酸酯：为了进一步验证整个次膦酸酯-键合的完整性，本发明人使用在O-取代基上具有NBD的次膦酸酯5以产生mCherry-NBD-R10双偶联物。该偶联物也被递送到活细胞中，并且观察到mCherry与NBD的共定位。这进一步指向货物-偶联物中的全部次膦酸酯-键的细胞内稳定性。
图9c显示mCherry-NBD-R10-偶联物产生的示意图。图9d显示按照Schneider等公开的方法(Schneider,Anselm F.L.；Kithil,Marina；Cardoso,M.Cristina；Lehmann,Martin；Hackenberger,Christian P.R.；Cellular uptake of Large BiomoleculesEnabled by Cell-surface-reactive Cell-penetrating Peptide Additives,Nat.Chem.(2021)接收稿https://doi.org/10.1038/s41557-021-00661-x.)，用mCherry双偶联物孵育后，CCL2-细胞的荧光成像。
图像以灰色显示明视野，以绿色显示eGFP通道(NBD)，以红色显示mCherry，以蓝色显示Hoechst 33342。比例尺为20μm。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例7：抗体中二硫键的再桥接
受这些结果的启发，本发明人致力于IgG抗体中二硫键的再桥接。二乙炔基次膦酸酯提供了修饰所有四个链间二硫化物的潜力，导致精确的抗体-货物比为四。使用靶向Her2的单克隆IgG抗体曲妥珠单抗，研究了二乙炔基次膦酸酯用于抗体再桥接的能力(图10)。
因此，稍微采用了先前描述的抗体修饰方案(S.J.Walsh,S.Omarjee,W.R.J.D.Galloway,T.T.-L.Kwan,H.F.Sore,J.S.Parker,M.J.S.Carroll,D.R.Spring,Chem.Sci.2019,10,694-700)。首先，使用10eq(2.2当量/二硫化物)TCEP在37℃下还原曲妥珠单抗(5mg/ml)半小时。随后，将5eq次膦酸酯1加入到溶液中，并使反应在室温下进行过夜。SDS-PAGE和完整蛋白质-MS分析显示＞95％的抗体再桥接。反应产生了再桥接的完整全抗体和半抗体(共价连接的重链和轻链，图10b和图10c)的混合物，其中半抗体是主要产物。相反，当未还原的曲妥珠单抗与1反应时，没有观察到再桥接或修饰。使用专用的交联质谱搜索引擎(Z.L.Chen,J.M.Meng,Y.Cao,J.L.Yin,R.Q.Fang,S.B.Fan,C.Liu,W.F.Zeng,Y.H.Ding,D.Tan,L.Wu,W.J.Zhou,H.Chi,R.X.Sun,M.Q.Dong,S.M.He,Nat.Commun.2019,10,DOI 10.1038/s41467-019-11337-z)，本发明人甚至能够验证曲妥珠单抗的重链和轻链之间形成的链间交联(图11)。此外，试验膦酰胺II(phosphinamidateII)用于抗体再桥接。SDS-凝胶分析显示II能够将抗体轻链和重链交联至约33％(图12)。
图10显示曲妥珠单抗与二乙炔基-次膦酸酯1的反应和随后的分析。图10a显示使用化合物1的抗体再桥接的一般程序，图10b显示通过SDS-PAGE分析反应前后的曲妥珠单抗。图10c显示通过PNGaseF去糖基化后的再桥接的半抗体(用1修饰的2x)的去卷积的完整蛋白-MS。
图11显示通过交联质谱法鉴定抗体的两个交联半胱氨酸残基。对于MS/MS分析，使用PNGase F将再桥接的曲妥珠单抗去糖基化，然后进行胰蛋白酶的凝胶内消化。为了鉴定再桥接的半胱氨酸残基，使用专用的交联搜索引擎(pLink 2,Chen,Z.L.；Meng,J.M.；Cao,Y.；Yin,J.L.；Fang,R.Q.；Fan,S.B.；Liu,C.；Zeng,W.F.；Ding,Y.H.；Tan,D.；Wu,L.；Zhou,W.J.；Chi,H.；Sun,R.X.；Dong,M.Q.；He,S.M.A High-Speed Search Engine PLink 2withSystematic Evaluation for Proteome-Scale Identification of Cross-LinkedPeptides.Nat.Commun.2019,10(1).https://doi.org/10.1038/s41467-019-11337-z)。图11a显示唯一可以鉴定的交联是曲妥珠单抗轻链和重链半胱氨酸之间的交联。很可能，因为所得到的肽相对大且疏水，所以无法检测到再桥接的铰链区。此外，图11b显示，鉴定了重链的两个铰链区半胱氨酸之间的链内交联。
图12显示使用膦酰胺II的抗体再桥接。根据一般的抗体再桥连方案，使用递增浓度的II(参见“General procedure for antibody rebridging using phosphinates”)再桥接曲妥珠单抗。通过SDS-PAGE分析抗体重链和轻链的交联。
由于双乙炔基次膦酸酯的优异的再桥接效率和位点选择性，曲妥珠单抗与次膦酸酯2反应以允许抗体-偶联物的进一步官能化。(图13)按照与1所述相同的程序，在过夜反应后观察到完全再桥接。形成半抗体作为主要产物。(图13b)在下一步中，通过铜辅助的叠氮化物炔环加成(CuAAC)将抗体偶联至荧光素-叠氮化物(FAM-N3)以产生抗体-荧光团偶联物(AFC)。凝胶内荧光成像和UV-vis光谱证实了抗体的成功修饰。(图13b和图13c)计算出荧光团与抗体的比率为4.03，表明定量转化。(下面的实验程序的“用荧光素-N3对曲妥珠单抗-2进行Cu-点击修饰”一节)。功能化的曲妥珠单抗清楚地染色BT474细胞上的外膜结合的Her2，而Her2细胞系未观察到荧光信号。(图13d)这表明再桥接和标记策略不会妨碍抗体的性能。
图13显示曲妥珠单抗的功能修饰及其生物学评价。图13a显示用次膦酸酯2对抗体的两步修饰，随后对抗体CuAAC形成荧光素偶联物。图13b显示通过SDS-PAGE使用考马斯染色和凝胶内荧光分析偶联物。图13c显示荧光素偶联抗体的UV-Vis光谱。图13d显示没有观察到Her2阴性细胞染色的Her2阳性细胞的细胞膜标记(比例尺20μm)。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例8：使用基于硫代乙烯基和三唑的乙炔基-次膦酸酯的抗体标记
选择Her2靶向治疗性抗体曲妥珠单抗来测试用基于硫代乙烯基和三唑的乙炔基次膦酸酯的标记。首先，测试硫代乙烯基-次膦酸酯CS265和三唑基-次膦酸酯CS266。简言之，曲妥珠单抗(5mg/ml，在Tris缓冲液pH 8.3中)用10eq TCEP(37℃，30分钟)还原。随后，加入8eq相应的次膦酸酯，并使反应在室温下进行过夜。化合物CS265达到每个抗体4.2个荧光团的平均标记(在用CS265的另一次运行中，确定每个抗体2.9个荧光团的平均标记)。化合物CS266达到几乎化学计量的标记，对应于7.4的荧光团与抗体比率(FAR)(图14d)。在对照实验中，其中抗体在与两种次膦酸酯反应之前未被还原，通过SDS-PAGE和完整蛋白MS未观察到修饰(图14g)。这已经表明良好的硫醇选择性。在不存在还原剂的情况下，更大过量的试剂(50-100当量)也不导致任何抗体标记。
当使用8当量CS266时，观察到几乎化学计量的标记之后，探究这是否是一般现象。因此，用增加量的次膦酸酯CS265和CS266滴定曲妥珠单抗(图14i)。对于次膦酸酯CS266，观察到高达5eq的完全抗体标记和接近6&8eq的化学计量标记。同样，对于所有等价物，化合物CS265在相同时间后达到约50％标记(图14i)。
发明人还在抗体标记中比较了乙炔基-三唑基-次膦酸酯与乙炔基-磷酰酰胺的种类。因此，进行了一个时间过长实验，其中还原的曲妥珠单抗与10eq相应的P(V)-亲电子试剂CS266和S1一起孵育，并且使用完整蛋白MS在16小时内监测反应。在过夜反应后，乙炔基膦酰胺和乙炔基-三唑基-次膦酸酯试剂在更短的反应时间后都达到接近完全转化(分别为FAR 7.5和7.9)，次膦酸酯CS266的更快的反应动力学导致更高的官能化程度(图14j)。
抗体标记的方法：使抗体曲妥珠单抗(5mg/ml，在包含50mM Tris-HCl、150mM NaCl和1mM EDTA，pH 8.3的反应缓冲液中)与8eq TCEP和8eq P(V)化合物CS265或CS266(二者都携带荧光团(EDANS))反应16小时。通过SDS-PAGE和完整蛋白MS分析标记效率。已经表明，标记抗体可以通过CS265和CS266两者实现。CS265的荧光团与抗体的比率(FAR)已测定为4.2或2.9。此外，已测定CS266的荧光团与抗体之比(FAR)为7.4。
未还原的曲妥珠单抗与100当量CS266的反应：曲妥珠单抗(1mg/ml，在50mM Tris、100mM NaCl、1mM EDTA中，pH 8.3)与100当量次膦酸酯3反应16小时，不加入还原剂。在使用具有7K MWCO的0.5mL ZebaTM旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific，USA)除去过量标记试剂后，用5mM DTT(37℃，30分钟)还原抗体并通过完整蛋白MS分析。没有检测到抗体的标记，表明标记试剂具有极好的半胱氨酸选择性(图14g)。
图14示出反应方案、CS265和CS266的结构、SDS-PAGE分析和完整蛋白MS，其显示使用基于硫代乙烯基和三唑的乙炔基-次膦酸酯进行抗体标记。图14a显示反应方案。曲妥珠单抗(5mg/ml，在反应缓冲液中)与8eq TCEP和8eq化合物CS265和CS266反应。图14b示出CS265和CS266的结构。图14c显示通过SDS PAGE对偶联物的分析。图14d显示了过完整蛋白MS对偶联物的分析。测定CS265的荧光团与抗体的比率(FAR)为2.9，CS266的荧光团与抗体的比率(FAR)为7.4。图14e显示曲妥珠单抗与1当量或8当量次膦酸酯CS265的其他运行的示例性去卷积的完整蛋白质-MS谱。图14f显示曲妥珠单抗与1当量或8当量次膦酸酯CS266反应的其他运行的示例性解卷积的完整蛋白-MS谱。图14g显示未还原的曲妥珠单抗与100eqCS266的反应。使用完整蛋白MS检测不到CS266对未还原的曲妥珠单抗的标记。图14h显示用硫代乙烯基-乙炔基次膦酸酯CS265、三唑基-乙炔基次膦酸酯CS266和乙炔基-膦酰胺S1标记曲妥珠单抗。图14i显示曲妥珠单抗随着次膦酸酯CS265和CS266的量增加的滴定。图14j显示了一个时间过长实验，其中还原的曲妥珠单抗与10eq三唑基-乙炔基次膦酸酯CS266和乙炔基膦酰胺S1一起孵育。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例9：谷胱甘肽和EDANS-次膦酸酯之间的偶联物形成动力学CS265和CS266
使含少量硫醇的荧光团(EDANS-SH)与过量的乙基二乙炔基-次膦酸酯(1)反应，以良好的产率得到了潜在的标记试剂CS265(Z-异构体，76％)(图15)。为了评估这种试剂用于蛋白质标记的潜力，我们测定了其在与还原型谷胱甘肽在水性缓冲液中的反应中的二级速率常数，如前所述(Kasper,M.A.et al.Vinylphosphonites for Staudinger-inducedchemoselective peptide cyclization and functionalization.Chem.Sci.10,6322-6329(2019)；Baumann,A.L.et al.Chemically Induced VinylphosphonothiolateElectrophiles for Thiol-Thiol Bioconjugations.J.Am.Chem.Soc.142,9544-9552(2020))。观察到平稳转化为谷胱甘肽加合物的E-和Z-异构体的混合物。
本发明人进一步研究了从EDANS-N3和乙基二炔基-次膦酸酯(1)开始通过Cu(I)介导的叠氮化物-炔环加成反应合成三唑基乙炔基-次膦酸酯。使用5当量次膦酸酯允许以良好的收率获得化合物CS266(图16)。使用谷胱甘肽作为硫醇模型进行动力学分析。次膦酸酯CS266显示了加速的反应动力学；与CS266的反应比与CS265的反应快大约十倍(图16)。
谷胱甘肽和EDANS-次膦酸酯CS265和CS266之间反应的二级速率常数根据以下步骤测定：在pH 8.5的50mM ABC缓冲液(碳酸氢铵缓冲液)和1mM EDTA的存在下，将EDANS-次膦酸酯与1当量谷胱甘肽(0.5mM)反应。反应在0.1毫升的体积中进行。在加入谷胱甘肽之前抽取第一样品(t＝0)。在1、2、5、12、22和35分钟(CS266)或30、60、120、240和1440分钟(CS265)后取样。以10μl的体积吸取样品，并立即稀释到200μl的50mM pH 3.5的NaOAc缓冲液中，以终止反应。对这些样品进行荧光HPLC分析，每种注射50μl。
图15显示谷胱甘肽和EDANS-次膦酸酯CS265之间反应的二级速率常数的测定。图15a显示了反应条件。反应在0.1ml的体积中进行。在加入谷胱甘肽之前抽取第一样品(t＝0)。在30、60、120、240和1440分钟(CS265)后取样。以10μl的体积抽取样品，并立即稀释到200μl的50mM pH 3.5的NaOAc缓冲液中，以终止反应。对这些样品进行荧光HPLC分析，每种注射50μl。图15b显示了在两种反应物浓度相等的情况下确定二阶速率常数的数学考虑。图15c显示了起始材料随时间的浓度。通过相对于内标(EDANS)对峰积分来计算。显示了三次独立测量的平均值和误差。(n＝3)图15d示出了曲线图：1/c随时间的变化和线性曲线。斜率是二阶速率常数。显示了三次独立测量的平均值和误差。
图16显示谷胱甘肽和EDANS-次膦酸酯CS266之间反应的二级速率常数的测定。图16a显示了反应条件。反应在0.1ml的体积中进行。在加入谷胱甘肽之前抽取第一样品(t＝0)。在1、2、5、12、22和35分钟后取样(CS266)。以10μl的体积抽取样品，并立即稀释到200μl的50mM pH 3.5的NaOAc缓冲液中，以终止反应。对这些样品进行荧光HPLC分析，每种注射50μl。图16b显示了在两种反应物浓度相等的情况下确定二阶速率常数的数学考虑。图16c显示了起始材料随时间的浓度。通过相对于内标(EDANS)对峰积分来计算。显示了三次独立测量的平均值和误差。(n＝3)图16d示出了曲线图：1/c随时间的变化和线性曲线。斜率是二阶速率常数。显示了三次独立测量的平均值和误差。
结果显示，在谷胱甘肽与CS265和CS266之间实现了有效的偶联物形成。
发明人进一步合成了各种官能化的三唑基乙炔基-次膦酸酯(方案2)。
方案2：官能化的三唑基乙炔基-次膦酸酯的合成。以百分比计的收率在括号中表示。
使用所述方法，以中等至良好的产率制备带有荧光团(CS266、CS375和CS435)、亲和标记(CS418和CS292)或点击柄(CS390和CS380)的三唑基乙炔基-次膦酸酯试剂。此外，该策略允许将三唑基乙炔基-次膦酸酯掺入含叠氮化物的肽(10)中。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例10：三唑-次膦酸酯硫醇-加合物的稳定性
该连接的血清稳定性对于在抗体-药物-偶联物中成功应用以防止危险的脱靶效应是重要的。为了测试这一点，与上述实施例3类似，进行基于荧光团-猝灭剂的测定，以确定包含DABCYL和EDANS的三唑-次膦酸酯硫醇加合物(FRET-Pair 4(F4))的稳定性。测试了在1000当量谷胱甘肽和1M NaOH存在下在PBS，血清中的稳定性。在过量的小硫醇存在下和在人血清中在生理缓冲液中孵育F4没有显示荧光信号的任何增加，表明优异的稳定性。图17a和17b示出了结构和结果。淬灭的FRET对F4由次膦酸酯CS266和包含DABCYL的肽1合成。
图17a和17b显示基于荧光团-猝灭剂的分析，以研究三唑-次膦酸酯硫醇-加合物(FRET-对4(F4))的稳定性。图17a显示了次膦酸酯连接的染料-淬灭剂偶联物的结构和基于荧光-淬灭剂的读出原理。图17b显示了共轭物F4荧光测量的结果。
观察到三唑-次膦酸酯硫醇-加合物在生理缓冲液、人血清和过量游离硫醇存在下随时间的优异稳定性。(图17b)。
此外，合成了使用曲妥珠单抗和次膦酸酯CS375的抗体-荧光素偶联物(曲妥珠单抗-CS375)，并在37℃在人血清中孵育14天，没有观察到向其它血清蛋白上的显著转移，因此证实了连接的稳定性(图17c)。
图17c显示在不同孵育时间后，将抗体荧光素偶联物曲妥珠单抗-CS375与人血清孵育后获得的样品的分析。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例11：使用三唑基取代的氧化膦再桥接抗体中的二硫化物
使用TCEP还原抗体曲妥珠单抗，然后使用携带荧光素部分的三唑基取代的氧化膦CS298再桥接。CS298是通过三乙炔基氧化膦和荧光素-叠氮化物(FAM-N3)的Cu点击反应合成的。16小时后再桥接反应的SDS-PAGE分析显示＞85％的高度再桥连抗体。
图18显示化合物CS298的制备和结构，以及使用该化合物的抗体再桥接。图18a显示由荧光素-叠氮化物(FAM-N3)和三-乙炔基-氧化膦制备化合物CS298。图18b显示使用CS298的抗体再桥接。SDS-PAGE分析显示高度的(＞85％)再桥接的抗体。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例12：使用三唑-乙烯基-次膦酸酯的蛋白质标记
将eGFP(50μM)在含有50mM Tris和1mM EDTA的反应缓冲液中与25eq三唑乙烯基化合物CS321反应得到相应的标记eGFP。反应方案、CS321的结构和质谱示于图19a、b和c中，反应三天后记录质谱。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例13：抗体药物偶联物
在本实施例中，三唑基乙炔基次膦酸酯被用于合成抗体药物偶联物(ADC)。单甲基阿里他汀E(MMAE)是一种有效的抗有丝分裂药物，也用于FDA批准的ADC Vedotin，被选择作为ADC的有效负载。此外，连接子中包括组织蛋白酶B可切割Val-Cit二肽以确保游离MMAE在内体摄取后从抗体释放。为了制备ADC，使用mPEG4-二乙炔基次膦酸酯3。HPLC纯化后，得到功能化药物CSDrug1，产率为59％(图51a)。进行最初的曲妥珠单抗标记实验以确定用MMAE标记的效率。由于使用CSDrug1的实验显示在4小时后大部分试剂已经反应，反应在该时间后终止并检查。完整蛋白质谱分析显示，在相对较短的反应时间后，5eq的CSDrug1已经足以达到大约4的平均药物抗体比(DAR)(图51b，图51e)。因此，使用1mg曲妥珠单抗进行反应的放大以允许进一步的生物学测试。通过尺寸排阻层析(SEC)纯化后，得到功能化抗体曲妥珠单抗-CSDrug1，产率80％(0.8mg)。通过亲水相互作用层析(HIC)分析显示，大多数抗体分子用3-6种药物分子官能化，导致平均DAR为4.3。(图51b)随后用Her2-MDA-MB-468和Her2+SKBR3细胞系评价该Her-2指导的ADC的细胞毒性。尽管表达抗原的细胞系的增殖可以被低至0.5nM浓度的曲妥珠单抗-CSDrug1完全抑制，但抗原阴性细胞仅在非常高浓度的ADC(＞100nM，图51d)时受到影响。这些有希望的纤维素内结果突出了三唑基-乙炔基-次膦酸酯作为模块结构单元用于产生有效的生物治疗剂的潜力。
图51显示ADC曲妥珠单抗-CSDrug1的合成和生物学评价。图51a显示用于产生基于曲妥珠单抗的ADC的功能化毒性有效载荷CSDrug1的合成途径。I)0.2当量MMAE-VC-PEG4-N3，10mol％CuBr，PBS/DMSO(2:8，v/v)，4小时r.t.，59％产率。II)0.2当量曲妥珠单抗(5mg/ml)，10eq TCEP(对于曲妥珠单抗)、Tris缓冲液(50mM，pH 8.3)、1mM EDTA、100mM NaCl。图51b显示纯化的ADC(曲妥珠单抗-CSDrug1；DAR 4.3)的亲水作用层析。图51c显示Her2+(SKBR3，绿色)和Her2-(MDA-MB-468，黑色)细胞系中浓度依赖性细胞毒性。图51d显示以Her2+(SKBR3，左)和Her2-(MDA-MB-468，右)和非功能化的曲妥珠单抗作为对照的浓度依赖性细胞毒性，其获自在增殖测定中测试ADC曲妥珠单抗-CSDrug1。按照下面实施例17中关于基于细胞的抗增殖测定所述的方法，用SKBR3和MDA-MB-468处理细胞。曲妥珠单抗-CSDrug1对Her2+细胞系SKBR3表现出剂量依赖性毒性，IC50为72pm。相反，Her2-细胞(MDA-MB-468)不受ADC的影响。非功能化的曲妥珠单抗对照在测试浓度下没有显示任何细胞毒性。图51e显示曲妥珠单抗-CSDrug1粗反应混合物的完整蛋白MS。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例14：蛋白质-蛋白质偶联
本发明人进一步扩展了偶联策略，使用三唑基乙炔基次膦酸酯来官能化含叠氮化物的蛋白质并将它们应用于蛋白质-蛋白质偶联。以前已经报道了将亲电性乙烯基硫代磷酸酯掺入泛蛋白中和随后在人工蛋白质-泛素化中的应用(Baumann,A.L.etal.Chemically Induced Vinylphosphonothiolate Electrophiles for Thiol-Thiol Bioconjugations.J.Am.Chem.Soc.142,9544-9552(2020))。然而，这种方法的缺点是必须使用补充有TFA的无水DMSO作为溶剂，随后需要HPLC纯化。相反，三唑基乙炔基次膦酸酯的引入可以在仅具有少量有机共溶剂的生理缓冲液中实现。此外，与膦酰基硫醇酯相比，三唑基乙炔基次膦酸酯增强的反应性导致优异的蛋白质-蛋白质偶联。为了获得含叠氮化物的蛋白质，本发明人利用Schneider等开发的方法，其允许经由选择性压力掺入将叠氮高丙氨酸(aha)掺入泛素(Ub)中(Schneider,T.et al.Dissecting Ubiquitin Signaling withLinkage-Defined and Protease Resistant Ubiquitin Chains.Angew.ChemieInt.Ed.53,12925-12929(2014))。按照该方法，表达两个Ub突变体UbK48Aha和UbK63Aha，随后用乙基二乙炔基次膦酸酯(1)修饰(实施例17，表达UbK48Aha和UbK63Aha)。与小分子实验相比，该合成方法稍作修改(实施例17中UbK48Aha和UbK63Aha的EETP-官能化)。将Ub-突变体再缓冲到浓度为1mg/ml(115μM)的PBS(pH 6.9)中，随后加入乙基二乙炔基-次膦酸酯(1)(20当量，2.3mM终浓度)。将CuBr和THPTA以50mM的浓度溶解在乙腈中，随后将预先形成的Cu(I)-偶联物加入到Ub-次膦酸酯混合物中至最终乙腈含量为5％。5小时反应时间后，通过完整蛋白MS观察到Aha突变体的完全转化。通过用补充了5mM EDTA的PBS透析16小时，然后通过尺寸排阻色谱(SEC)除去过量的铜、配体和次膦酸酯，以分别以74％和62％的产率获得三唑基-次膦酸酯修饰的UbK48ETP和UbK63ETP(图52a)。
接下来，本发明人将这些蛋白质-亲电子试剂用于蛋白质-蛋白质偶联。因此，UbK48ETP和UbK63ETP都与UbG76C突变体进行生物偶联。反应在pH 8的Tris缓冲液中进行，并通过完整蛋白-MS和SDS-PAGE监测(图52d&53)。6小时反应时间后起始原料完全消耗，相应的Ub-二聚体(12&113)通过SEC纯化。
为了验证连接和半胱氨酸选择性，使用胰蛋白酶消化纯化的二聚体，并通过自下而上的蛋白质组学分析。使用常规和专用的蛋白质组学软件，允许验证正确的键合位点，没有可检测的副反应(图52e&54)(Dorfer,V.et al.MS Amanda,a universalidentification algorithm optimized for high accuracy tandem massspectra.J.Proteome Res.13,3679-3684(2014)；M.et al.StavroX-A softwarefor analyzing crosslinked products in protein interactionstudies.J.Am.Soc.Mass Spectrom.23,76-87(2012))。此外，研究了键特异性合成的泛素二聚体对去泛素化酶(DUB)的蛋白酶抗性。虽然DUB USP2能够完全切割K48-连接的野生型二泛素，但没有观察到我们的合成类似物的降解。(图52f和61)。
图52显示根据实施例14的蛋白质-蛋白质偶联，图52a显示从位点选择性安装的K→Aha突变体获得亲电子泛素的合成策略。图52b显示UbK63ETP的完整蛋白质-MS。图52c显示人造Ub-二聚体13的完整蛋白MS。图52d显示通过SDS-PAGE监测的UbK63ETP与UbG76C偶联的时间过程。图52e显示鉴定13的连接位点的MS/MS谱。图52f显示12和与USP2孵育的wtUbiquitin的SDS-PAGE分析。
图53显示UbG76C-UbK63ETP二聚体形成的时间过程。UbK63ETP(200M)与2.5当量新鲜还原的UbG76C如实施例14所述在UbK48Aha和UbK63Aha的ETP官能化下反应。0、2、4和6小时后，取样并通过完整蛋白MS分析。使用Graphpad Prism 5软件将去卷积的质谱标准化为UbG76C峰，绘图并堆叠。
图54显示人工泛素二聚体的MS/MS分析。图54a显示UbK48-ETP-UbG76C的MS/MS分析。图54b显示UbK63-ETP-UbG76C的MS/MS分析。对于MS/MS分析，UbK48-ETP-UbG76C(a)和UbK63-ETP-UbG76C(b)二聚体按照实施例17中所述在UbK48Aha和UbK63Aha的ETP-官能化下制备，并按照实施例16中所述在蛋白质组学数据分析-泛素二聚体下使用蛋白质组发现仪(v.2.5.0.400)和MS Amana 2.0进行分析。示例性的谱图显示识别正确的连接位点的最佳得分肽-谱-匹配(PSM)。
图61显示与USP2-CD孵育的二聚体12的SDS-PAGE分析。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例15：全蛋白质组半胱氨酸标记(Proteomwide Cysteine Labelling)
已经证明ETP试剂用于半胱氨酸选择性蛋白质修饰的效用，本发明人测试了该化合物类别是否可以应用于全细胞裂解物中的全蛋白质组半胱氨酸标记和分析。为了测试这一点，在通过SDS-PAGE和凝胶内荧光分析之前，将HEK-293细胞裂解物(在PBS pH 7.4中1mg/ml)在室温下用增加量的次膦酸酯CS375处理45分钟(图55a)。考马斯染色用于控制相同的上样量。我们观察到裂解物的浓度依赖性标记，其中已经在30μM 5处观察到合适的荧光信号。
为了鉴定标记位点，本发明人利用脱硫生物素-PT CS418，并采用了Zanon等人最近开发的工作流程，允许在蛋白质组规模上对亲电体选择性进行无偏分析(Zanon,P.R.A.et al.Profiling the proteome-wide selectivity of diverseelectrophiles.https://fragpipe.nesvilab.org(2021)doi:10.26434/CHEMRXIV.14186561.V1)。简言之，将HEK293细胞裂解物(1mg/ml，PBS pH 7.4)用200μM次膦酸酯CS418在室温下处理45分钟。然后，使用冰冷的丙酮沉淀蛋白质，并使用链霉亲和素-珠富集。在胰蛋白酶消化和洗脱标记的肽后，通过高分辨率液相色谱-偶联串联质谱法(LC-MS/MS)分析样品。为了鉴定修饰的质量，本发明人使用先前优化的设置在MS-Fragger中进行了开放搜索(Zanon,P.R.A.et al.Profiling the proteome-wide selectivity ofdiverse electrophiles.https://fragpipe.nesvilab.org(2021)doi:10.26434/CHEMRXIV.14186561.V1)。令人愉快的是，在所有三个重复中最显著的修饰对应于用次膦酸盐6进行烷基化的预期质量(Δmexp，27137PSMs)。此外，还检测了修饰质量加氧化(ΔmOx，1747PSMs)、甲酰化(Δmf，2005PSMs)和脲基甲基化(ΔmCAM，4546PSMs)(图55d)。
在鉴定修饰质量后，下一步是分析氨基酸选择性。因此，发明人使用Δmexp作为修正质量来执行偏移质量搜索。在该研究中，每个氨基酸被认为是潜在的修饰位点，允许无偏见的研究。
将获得的结果过滤，以仅包含PSM，该PSM包含在1％的肽水平错误发现率(FDR)内，以确保良好的数据质量。此外，在分析中仅考虑MS-Fragenger能够分配单一修饰位点的谱。在与上述标准匹配的22102个光谱中，20429(92％)位于半胱氨酸残基处(图55e)。其余的光谱分布在所有其它19种蛋白氨基酸中，其中没有一个达到超过150个光谱匹配(＜0.7％)。仔细观察结果发现，在1673个不局限于半胱氨酸的光谱中，817个氨基酸残基归属于与半胱氨酸相邻的氨基酸残基。当MS/MS谱不包含足够的片段峰时，明确的位点定位通常是困难的。为了说明这种不确定性，应用δ分数＞1(分数-最佳和次佳修饰位点之间的差异)。从其余的光谱(19595PSM)中发现95％的半胱氨酸被修饰(图56)。这些发现进一步强调了ETP亲电子试剂的极好的半胱氨酸选择性。
最后，本发明人使用MS Amanda(Dorfer,V.et al.MS Amanda,a universalidentification algorithm optimized for high accuracy tandem massspectra.J.Proteome Res.13,3679-3684(2014))进行了常规搜索，应用所获得的脱硫生物素-PT CS418的参数(修饰质量：438.2136；修饰位点：Cys)作为可变修饰(详情参见实施例16的蛋白质组学数据分析)。总共，从三个独立的重复中可以鉴定到源自3978个蛋白的8661个独特的标记半胱氨酸位点。有趣的是，我们发现，即使在较低的细胞裂解物浓度以及较低的总蛋白组输入(0.1mg/ml，总共50μg)下，仍可检测到7023个独特的半胱氨酸位点(图57)。
图55显示ETP-亲电子试剂的全蛋白质组-半胱氨酸反应性的研究。图55a显示使用荧光次膦酸酯CS375标记全细胞裂解物和随后分析的工作流程。图55b显示用增加的亲电子试剂浓度处理的细胞裂解物的SDS-PAGE分析。图55c显示通过基于MS的蛋白质组学对亲电子试剂选择性进行无偏分析所用的工作流程的示意图。图55d显示在三个重复的MS碎片开放搜索中检测到的修饰的直方图。次膦酸酯CS418的Δm以绿色突出显示。ox＝氧化(+15.99Da)，f＝甲酰化(+27.99Da)，CAM＝脲基甲基化(+57.02Da)。图55e显示当使用Δmexp作为偏移-质量时鉴定的修饰位点的丰度。PSMs的#表示三次重复的总和。
图56显示了应用ΔScore＞1的全蛋白质组的氨基酸选择性。如在蛋白质组数据分析下的实施例16和在用于全蛋白质组的半胱氨酸分析的样品制备下的实施例17中所述，用＞1的另外的ΔScore过滤器测定全蛋白质组的氨基酸选择性。
图57显示全蛋白质组-半胱氨酸-分布。使用次膦酸酯CS418比较半胱氨酸蛋白质组学的蛋白质输入。使用蛋白质组发现仪(v.2.5.0.400)和MS Amanda 2.0分析数据。所示的值是三次重复的总和。
实验程序在以下实施例17和18中给出。
实施例16：通用信息
化学品和溶剂
化学品和溶剂购自Merck(Merck group,Germany)、TCI(Tokyo chemicalindustry CO.,LTD.,Japan)和Acros Organics(Thermo Fisher scientific,USA)，并且不经进一步纯化而使用。干燥溶剂购自Acros Organics(Thermo Fisher Scientific，USA)。用于SPPS的氨基酸和树脂购自Novabiochem(Merck，USA)或Iris Biotech GmbH(Germany)。
快速和薄层色谱法
使用NORMASIL 硅胶40-63μm(VWR international,USA)进行快速柱色谱。涂覆有荧光指示剂F254s的玻璃TLC板，硅胶60W购自Merck(Merck Group，Germany)。通过用254nm灯荧光消耗或锰染色(在200ml H2O中10g K2CO3、1.5g KMnO4、0.1g NaOH)观察斑点，然后加热。
半制备型HPLC
使用VP250/21Macherey-Nagel Nucleodur C18HTec Spum柱(Macherey-NagelGmbH&Co.Kg,Germany)，在具有CBM20A通讯总线模块、FRC-10A级分收集器、2个泵LC-20AP和SPD-20A UV/VIS检测器的Shimadzu prominence HPLC系统(Shimadzu Corp.,Japan)上进行半制备型HPLC。使用以下梯度：(A＝H2O+0.1％ TFA,B＝MeCN++0.1％ TFA)，流速10ml/min，5％ B 0-5min，5-99％ B 5-65min，99％ B 65-75min。
NMR
用Bruker Ultrashield 300MHz光谱仪和Bruker Avance III 600MHz光谱仪(Bruker Corp.,USA)在环境温度下记录NMR光谱。化学位移δ以相对于残留溶剂峰的ppm报告(对于1H-谱，CDCl3:7.26[ppm]；DMSO-d6:2.50[ppm]；丙酮-d6:2.05[ppm]；CD3CN 1.94[ppm]；4.79D2O[ppm]；对于13C-谱，CDCl3:77.16[ppm]；DMSO-d6:39.52[ppm]；acetone-d6:29.84[ppm]；CD3CN 1.32[ppm]；耦合常数J以Hz为单位。信号多重性缩写如下：s：单峰；d：双峰；t：三峰；q：四峰；m:多峰。
UPLC-UV/MS
在装配有四元溶剂管理器、Waters自动进样器、Waters TUV检测器和WatersAcquity QDa检测器的Waters H-class仪器上记录UPLC-UV/MS迹线，所述仪器带有AcquityUPLC BEH C181.7μm，2.1×50mm RP柱，流速为0.6mL/min(Waters公司，美国)。使用以下梯度：A：0.1％ TFA的H2O溶液；B：0.1％ TFA的MeCN溶液。5％ B 0-0.5min，5-95％ B 0.5-3min，95％ B 3-3.9min，5％ B 3.9-5min。此外，使用以下梯度：梯度A：0.1％ TFA的H2O溶液；B：0.1％ TFA的MeCN溶液。5％ B 0-1.5min，5-95％ B 1.5-13min，95％B 13-13.9min，5％ B 13.9-15min。梯度B：0.1％ TFA的H2O溶液；B：0.1％TFA的MeCN溶液。5％ B 0-0.5min，5-95％ B 0.5-3min，95％ B 3-3.9min，5％B 3.9-5min。
SPPS
SPPS通过手工进行或在Tribute-UV肽合成仪(Protein Technologies，USA)上通过基于标准Fmoc的方案进行。
HR-MS
高分辨率ESI-MS谱在配备有四元溶剂管理器、Waters样品管理器-FTN、WatersPDA检测器和具有Acquity UPLC蛋白BEH C18柱(1.7μm，2.1mm×50mm)的Waters柱管理器的Waters H-class仪器上记录。样品以0.3mL/min的流速洗脱。使用以下梯度：A：0.01％ FA的H2O溶液；B：0.01％ FA的MeCN溶液。5％ B:0-1min；5to 95％ B:1-7min；95％ B:7to8.5min。质量分析用Waters XEVO G2-XS QT分析仪进行。
完整蛋白MS
使用配备有四元溶剂管理器、Waters样品管理器-FTN、Waters PDA检测器和具有Acquity UPLC蛋白BEH C4柱(1.7μm,2.1mm x 50mm)的Waters柱管理器的WatersH-class仪器分析完整的蛋白。以0.3mL/min的流速洗脱蛋白质。使用以下梯度：A：0.01％FA的H2O溶液；B：0.01％ FA的MeCN溶液。5-95％ B 0-6min。质量分析用Waters XEVO G2-XSQT分析仪进行。原始数据用MaxEnt 1分析。
蛋白质浓度测定
使用NanoDrop ND-1000上的蛋白质的消光系数和分子量，通过在280nm处的吸收光谱测量来确定蛋白质浓度。另外或作为替代方案，根据制造商的方案通过BCA测定法(Thermo Fisher Scientific，USA)测定浓度。
蛋白质纯化
如下所述，用FPLC或BioRad NGC系统完成蛋白质纯化。
CD光谱
在Jasco J-720分光旋光仪上在25℃下测量CD-光谱，参数设定为：测量波长范围190-260nm；数据间距为0.1nm；连续扫描模式；100nm/min的扫描速度；1秒响应；1.0nm带宽；0.1cm单元长度；10次累积。
蛋白质MS/MS
胰蛋白酶消化后的肽混合物通过连接到Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo FisherScientific,Germany)的反相毛细管液相色谱系统(Dionex Ultimate 3000NCS-3500RSNano,Thermo Scientific)进行分析。对于样品加载，使用0.075mm ID×50mm长度，3μm粒度，孔径的PepMap C-18捕获柱(Thermo Fischer Scientific)。上样流动相A含有1％乙腈和0.1％ TFA酸的水溶液，流动相B含有0.1％ TFA酸的乙腈溶液。LC分离用200cmμPACTM柱(Pharma-Fluidics，Ghent，Belgium)以750nL/min的洗脱液流速进行，使用4-50％ B的梯度在59分钟内进行。分离的流动相A含有0.1％甲酸的水溶液，流动相B含有0.1％甲酸的乙腈溶液。在350至1500m/z的范围内获得FT调查扫描，分辨率为120000(FWHM)，AGC目标值为4e5。用具有10秒动态排阻的质量选择四极(隔离窗1.2m/z)分离具有2-5电荷态的前体离子。使用阶梯式高能碰撞解离(HCD)来分裂前体离子。用27-30-33％的归一化碰撞能量(NCE)获得分步HCD MS/MS谱。最大注射时间设定为54ms以收集2e4前体离子。在Orbitrap中以15000(FWHM)的分辨率获得碎片离子谱。
分析型亲水作用色谱法(HIC)
使用TSKgel Butyl-NPR，在具有DAD检测器的Shimadzu LC20AT上进行ADC的分析HIC；4.6mm ID×10cm，2.5微米(TOSOH)，流速为0.5mL/min。在30分钟梯度溶剂A：25mM Na-P-Puffer pH 7＝1,5M(NH4)2SO4；溶剂B：25mM Na-P-Puffer pH 7+20％异丙醇中实现了不同ADC/mAb群的分离。(0-20min 0-100％ B，20-25min 100％ B，25-30min 100-0％ B)。将10μg ADC加载到柱上用于HIC分析。在220和280nm处记录UV色谱图。在220nm处的峰面积积分之后实现不同物种的定量。
LC-MS/MS
使用在线偶联到Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo Fisher Scientific)的UltiMate 3000RSLC Nano LC系统进行LC-MS分析。对于样品上样，使用0.075mm ID×50mm长度、3μm粒度和孔径的PepMap C-18捕获柱(Thermo Fischer Scientific)。上样流动相A含有1％乙腈和0.05％ TFA酸的水溶液，流动相B含有0.05％ TFA酸的乙腈溶液。使用50cm分析柱(内部装有Poroshell 120EC-C18，2.7μm，Agilent Technologies)进行反相分离，流动相A含有0.1％甲酸水溶液，流动相B含0.1％甲酸乙腈溶液，使用45分钟梯度(4％B0-5分钟；5-40％B in 5-30分钟；40％B 30-35分钟；40-50％B 35-38分钟；50％B 38-40.5分钟；50-80％B 40.5-41分钟；80％B 41-44分钟；80-4％B 44-45分钟)或93分钟梯度(4-5％B 0-8分钟；5-25％B in 8-74分钟；25-28％B 74-80分钟；28-31％B 80-86分钟；31-36％B 86-92分钟；36-40％B 92-95分钟；40-50％B 95-96分钟；50-80％B 96-101分钟；80％B 101-104分钟；80-4％B 104-104.1分钟)进行反相分离。
使用375到1500m/z范围内的测量扫描来获取数据，分辨率为120000，AGC目标值为4e5。用质量选择四极杆(隔离窗1.6m/z)以10秒动态排阻(对于93分钟梯度为40秒)分离具有电荷状态2-5的前体离子。前体离子使用较高能量的碰撞解离(HCD)分裂，施加30的归一化碰撞能量(NCE)。最大注入时间设定为54ms，以收集2e6前体离子。碎片离子谱在Orbitrap中以30000(FWHM)的分辨率获得。
蛋白质组学数据分析
泛素二聚体：FASTA-file被修饰为含有wtUb和UbK63A或UbK48A突变体。使用MSAmanda2.0(Dorfer,V.et al.MS Amanda,a universal identification algorithmoptimized for high accuracy tandem mass spectra.J.Proteome Res.13,3679-3684(2014))作为搜索引擎，在Proteome Discoverer(v.2.5.0.400)中进行分析，使用以下设置：MS1精度：6ppm；MS2精度：20ppm；所用的酶：胰蛋白酶；最大遗漏切缝(max.missedcleavages)：3；最大动态修改：4；肽质量：350-5000Da；动态修改：ETP+Ub-Cterm(A,+375.077Da)。
脱硫生物素-ETP CS418的全蛋白质组-反应性：为了确定修饰质量和氨基酸选择性，如Zanon等人Zanon，P.R.A.等人描述的分析数据，分析了不同亲电子试剂的全蛋白质组的选择性。https://fragpipe.nesvilab.org(2021)doi:10.26434/CHEMRXIV.14186561.V1使用MS Amanda2.0(Dorfer,V.et al.MS Amanda,a universal identificationalgorithm optimized for high accuracy tandem mass spectra.J.Proteome Res.13,3679-3684(2014))作为搜索引擎，在Proteome Discoverer(v.2.5.0.400)中进行封闭搜索，使用下列设置：MS1精度：8ppm；MS2精度：20ppm；所用的酶：胰蛋白酶；最大遗漏切缝(max.missed cleavages)：3；最大动态修改：4；肽质量：350-5000Da；动态修改：脲基甲基化(半胱氨酸，+57.021Da)，氧化(甲硫氨酸，+15.995Da)，甲酰化(N-末端，+27.995Da)，DTB-ETP(半胱氨酸，+438.214Da)。对于FDR计算，使用具有1％的目标FDR的Percolator。
实施例17：实验步骤
Dabcyl-EDANS加合物的稳定性研究(按照实施例3和10)
稳定性研究在96孔板(Corning 3615，黑色，透明，平底)中进行至少三次。向每个孔中加入5μl的200μM Dabcyl-EDANS偶联物的储备溶液和95μl各自的测试溶液。人血清购自Sigma Aldrich。将谷胱甘肽以10mM的浓度溶解于PBS中，并将pH调节至7.4。在200μM进行0.1mM NaOH研究，中和至pH 7并稀释至10μM，然后进行荧光测量。在Tecan Safire平板读数器上测量荧光。激发：360nm，发射：508nm，带宽：5nm，20℃。
eGFP C70M S147C的产生(根据实施例4)
eGFP突变体C70MS147C如文献(Kasper,M.；Glanz,M.；Stengl,A.；Penkert,M.；Klenk,S.；Sauer,T.；Schumacher,D.；Helma,J.；Krause,E.；Cardoso,M.C.；Leonhardt,H.；Hackenberger,C.P.R.Cysteine-Selective Phosphonamidate Electrophiles forModular Protein Bioconjugations.Angew.Chemie Int.Ed.2019,58(34),11625-11630.https://doi.org/10.1002/anie.201814715)中所述进行表达和纯化。将等分试样休克冷冻并储存在-80℃下直至进一步使用。eGFPC70M S147C的质谱示于图20中。
蛋白质序列：His标签以斜体突出显示；用下标突出显示的蛋白酶切割位点；以正常字母键入eGFP；以粗体和下标突出显示C70M和S147C：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGSIQMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQMFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNCHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
用二炔基次膦酸酯(根据实施例4)进行蛋白质修饰
将溶于PBS(pH 7.4)的感兴趣的蛋白质与10当量的次膦酸酯在室温下孵育10-60分钟。使用具有7K MWCO的0.5mL ZebaTM旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific，USA)除去过量的试剂。通过完整蛋白MS证实完全标记，并将修饰的蛋白保存在-20℃直至进一步使用。
eGFP C70M S124C-1(根据实施例4)
根据以上“用双乙炔基次膦酸酯进行蛋白质修饰”部分，使用双乙炔基次膦酸酯1并且以100μM的蛋白质浓度制备eGFP-1。eGFPC70M S124C-1的质谱示于图21。
组蛋白H3-3-1(根据实施例4)
根据以上“用双-乙炔基-次膦酸酯进行蛋白质修饰”部分，使用蛋白质浓度为20μM的乙基双-乙炔基次膦酸酯1制备Histone H3-3-1。组蛋白H3-3-1的质谱如图22所示。
重组BSA-1(根据实施例4)
根据“用双-乙炔基-次膦酸酯修饰蛋白质”部分，使用蛋白质浓度为10μM的乙基双-乙炔基次膦酸酯1制备rBSA-1。rBSA-1的质谱示于图23中。
NLS-mCherry-5(根据实施例4)
根据“用双-乙炔基-次膦酸酯修饰蛋白质”部分，使用蛋白质浓度为120μM的NBD-双-乙炔基次膦酸酯5制备NLS-mCherry-5。NLS-mCherry-5的质谱如图49所示。
次膦酸酯修饰的eGFP的硫醇加成(根据实施例6)
100μl次膦酸酯修饰的eGFP(60μM的PBS溶液)与20eq硫醇在室温下反应16小时。硫醇加入完成后，用Amicon-Ultra离心过滤器(10000MWCO，Merck Millipore)通过反复渗滤到PBS中除去过量的试剂，将修饰的蛋白保存在-20℃直至进一步使用。
eGFP-1-谷胱甘肽(根据实施例6)
根据“对次膦酸酯修饰的eGFP的硫醇加成”部分，由eGFP-1和作为硫醇的谷胱甘肽制备eGFP-1-谷胱甘肽。图24显示了偶联eGFP-1-谷胱甘肽的质谱。
eGFP-1-R10(根据实施例6)
根据“对次膦酸盐修饰的eGFP的硫醇加成”部分，由eGFP-1和含Cys的作为硫醇的十精氨酸制备eGFP-1-R10。图25显示了结合eGFP-1-R10的质谱。
NLS-mCherry-Cys-5-R10(根据实施例6)
NLS-mCherry-Cys-5-R10以类似于“次膦酸酯修饰的eGFP的硫醇加成”部分的方式，由NLS-mCherry-Cys-5和含Cys的十精氨酸作为硫醇制备。偶联物NLS-mCherry-Cys-5-R10的质谱示于图50中。
细胞摄取实验和活细胞显微术(根据实施例6)
细胞(HeLa Kyoto或CCL2)在37℃下在含有5％ CO2的潮湿气氛中在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM 4.5g/L葡萄糖中生长。将15'000个细胞(CCL2为30'000)接种到8孔ibidiμ-载玻片的每孔中。细胞在37℃和5％ CO2中粘附和生长24小时。用不含FBS的FluorobriteDMEM洗涤细胞三次，并在不含FBS的Fluorobrite DMEM中与10μM蛋白质-R10和添加剂(10μMTNB-R10)一起孵育。细胞在37℃和5％ CO2下孵育1小时。用含有20mM谷氨酰胺和10％ FBS的Fluorobrite DMEM洗涤细胞三次。然后用含有20mM谷氨酰胺和10％ FBS的含Hoechst染色剂(Hoechst 33342)的Fluorobrite DMEM覆盖细胞。
eGFP&mCherry摄取实验的活细胞显微图像在具有CSU-X1(Andor)和活细胞孵育腔室(OKOlab)的Nikon-CSU旋转盘显微镜上获得。所有活细胞图像都是使用Planapo60×NA1.4Oil Objector(Nikon)和EMCCD(AU888，Andor)获得的。明视野图像与荧光图像一起获得。标准激光器、四色Dicroic(400-410,486-491,560-570,633-647,AHF)和发射滤光器用于采集共焦荧光图像(BFP(Hoechst 33342)激发:405nm发射:450/50,GFP(GFP,NBD),激发:488发射:525/50,RFP(mCherry)激发:561nm发射:600/50)。
使用次膦酸酯进行抗体再桥接的一般方法(根据实施例7和11)
使用10eq TCEP(37℃，30分钟)将单克隆抗体的链间二硫化物(5mg/ml；50mMTris，1mM EDTA，300mM NaCl，pH 8.4)还原。随后，加入5eq次膦酸酯，并使反应进行过夜。使用具有7K MWCO的0.5mL ZebaTM旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific，USA)，将缓冲液更换为PBS终止反应。用PNGaseF(参见3.6)去糖基化并还原SDS-PAGE后，通过完整蛋白质谱评价再桥接效率。对于使用膦酰胺II的再桥接实验，使用相同的方案，然而使用不同量的II(5，10，20，40，100当量)。
再桥接的曲妥珠单抗的去糖基化、还原和MS分析(根据实施例7)
用PBS将5μl粗制抗体修饰混合物(5mg/ml)稀释至终蛋白浓度为1mg/ml。加入1μlPNGase-F溶液(Pomega,Germany,Recombinant,cloned from Elizabethkingia miricola10u/μl)和2μl TCEP溶液(50mM，在H2O中)，并将溶液在37℃下孵育＞2小时，进行完整蛋白MS。
曲妥珠单抗-1(根据实施例7)
按照“使用次膦酸酯再桥接抗体的一般方法”部分，使用曲妥珠单抗作为抗体，使用乙基双-乙炔基次膦酸酯1制备曲妥珠单抗-1。再桥接抗体曲妥珠单抗-1的质谱根据“再桥接的曲妥珠单抗的去糖基化、还原和MS-分析”部分获得，见图26。
曲妥珠单抗-2(根据实施例7)
按照“使用次膦酸酯再桥接抗体的一般方法”部分，使用曲妥珠单抗作为抗体，并使用丁-3-炔-1-基二炔基次膦酸酯2制备曲妥珠单抗-2。再桥接抗体曲妥珠单抗-2的质谱根据“再桥接的曲妥珠单抗的去糖基化、还原和MS分析”部分获得，见图27。
曲妥珠单抗-2用荧光素-N3的Cu点击修饰(根据实施例7)
向曲妥珠单抗-2(100μL，2mg/mL)的PBS溶液中加入FAM-N3(5mM，在DMSO中，至200μM)、CuSO4·5H2O(至300μM)、THPTA(至0.5mM)和抗坏血酸钠(至1.5mM)。将混合物涡旋并在室温下孵育2小时，使用Amicon-Ultra离心过滤器(10000MWCO，Merck Millipore)通过重复渗滤到PBS中除去过量的试剂。UV-vis分析显示转化为AFC，平均DAR为4.03。图28显示曲妥珠单抗-2与FAM-N3的点击反应，通过SDS-PAGE使用考马斯染色和凝胶内荧光分析偶联物，以及荧光素偶联抗体的UV-Vis光谱。荧光团与抗体的比率(FAR)根据下式计算：
UV-vis FAR计算：
PBS用作分析的基线。
使用下式计算FAR：
对于曲妥珠单抗，Abs495＝3.498；Abs280＝2.941；ε280＝215,380M-1cm-1；对于荧光素，ε495＝8030M-1cm-1，对于280nm处的荧光素吸收，校正因子为0.178。
用标记的曲妥珠单抗对SK-BR-3和MDA-MB-468细胞进行免疫荧光分析(根据实施 例7)
SKBR3细胞和MDA-MB-469细胞在含有10％ FBS和1％ P/S的DMEM/Ham'S F-12中于37℃在含有5％ CO2的潮湿气氛中生长，将30’000个SKBR3或15'000个MDA-MB-468细胞分别接种到8孔ibidiμ-载玻片的每孔中。使细胞粘附并生长过夜。用PBS洗涤细胞三次，用PBS中的4％多聚甲醛固定10分钟。然后用PBS中的0.1％ Triton X-100(PBS-T)洗涤细胞。将抗体与5μg/mL的PBS溶液一起加入，并在室温下在黑暗中孵育1小时。用PBS-T洗涤细胞一次，并用Hoechst 33342复染。然后在共焦激光扫描显微镜下使细胞成像。
用装备有ACS APO 63x/1.3NA物镜的Leica SP5II获得图像。明视野图像与荧光图像一起获得。使用氩激光器(GFP，488nm)和激发二极管CW(Hoechst 33342,405nm)和标准发射滤光片。
使用EDANS亲电试剂和曲妥珠单抗的等效筛选和时程实验(时间过程实验)(根据 实施例8)
曲妥珠单抗(5mg/ml，Tris缓冲液pH 8.5，100mM NaCl，1mM EDTA)用8eq TCEP(30分钟，37℃)还原。随后，加入X eq亲电子试剂(X＝1、2、5、6、8、10)，并使反应在室温下进行过夜。用PNGase-F(37℃，1mM TCEP，1h)去糖基化后，通过完整蛋白-MS测定标记程度。对于时间过程实验，在0.5、1、2、4、6和16小时后取等分试样，并通过完整蛋白MS分析。
使用次膦酸酯CS375标记曲妥珠单抗(根据实施例10)
曲妥珠单抗(5mg/ml，Tris缓冲液pH 8.5，100mM NaCl，1mM EDTA)用8eq TCEP(30分钟，37℃)还原。随后，加入5eq次膦酸酯CS375。在室温下4小时后，完整蛋白质-MS显示平均FAR为4.5。通过旋转过滤(配有7K MWCO的0.5mL ZebaTM旋转脱盐柱，Thermo FisherScientific，USA)除去过量的试剂，并将蛋白质稀释至1mg/mL。曲妥珠单抗-CS375储存在4℃下直至进一步使用。
为了分析目的，使用PNGaseF(37℃，1mM DTT，1小时)将少量去糖基化，并通过完整蛋白MS分析。图58显示通过完整蛋白MS获得的偶联物曲妥珠单抗-CS375的质谱。图58a示出未去卷积的MS-光谱。图58b示出去卷积的MS-光谱。
用ETP修饰的细胞毒性有效载荷标记曲妥珠单抗(根据实施例13)
曲妥珠单抗(5mg/ml，Tris缓冲液pH 8.5，100mM NaCl，1mM EDTA)用8eq TCEP(30分钟，37℃)还原。随后，加入5eq MMAE-次膦酸酯CSDrug1。4小时后，通过尺寸排阻层析用25ml SuperoseTM6Increase 10/300GL(GE Healthcare，美国)和0.75ml/min的流速用无菌PBS(Merck，德国)洗脱纯化反应混合物。合并含有抗体的级分并测定最终浓度(参见实施例13的蛋白质浓度测定)。对于DAR分析，使用疏水相互作用层析分析10μl该样品。曲妥珠单抗-CSDrug1在4℃储存备用。
图51b显示曲妥珠单抗-CSDrug1的HIC色谱图。
图51e显示曲妥珠单抗-CSDrug1粗反应混合物的完整蛋白MS。
基于细胞的抗增殖测定(根据实施例13)
将SKBR3和MDA-MB-468细胞系培养在补充了10％ FCS和0.5％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中。将细胞以5*103细胞/孔(SKBR3)或2*103细胞/孔(MDA-MB-468)的密度接种(100μL)在96孔细胞培养微孔板中。平板在37℃，5％ CO2孵育24小时。随后，吸出细胞，并将微孔板上的各个孔直接进行ADC/抗体在培养基(5％ PBS；100μL)中的1:4系列稀释，起始终浓度为62.5nM。平板在37℃，5％ CO2孵育96小时。随后，吸出细胞，加入刃天青(100μM培养基；100μL)，随后在37℃，5％ CO2下孵育4小时。在Tecan Infinite 200Pro微量板读数器上，通过试卤灵的荧光信号(λEX＝560nm，λEM＝590nm，激发带宽＝9nm，发射带宽＝20nm，增益(手动)＝50，闪光次数＝25，积分时间＝20μs，滞后时间＝0μs，稳定时间＝0ms，Z-位置(手动)＝20000μm)定量刃天青至试卤灵的代谢转化。用Graphpad Prism 5软件进行数据分析。原始数据标准化为0％存活率(用10μM含有5％ PBS的培养基的MMAE中处理的细胞；100μL)和100％存活率(用含有5％ PBS的培养基处理的细胞；100μL)。从三个生物学重复计算平均值和平均值的标准误差(SEM)，其全部包含三份数据集(N＝3，n＝3)，并相对于ADC/抗体浓度绘图。IC50值使用非线性回归(抑制剂对响应的对数)计算。
UbK48 Aha和UbK63Aha的表达(根据实施例14)
使用了pET28a载体中的泛素突变体DNA序列，其含有N-末端His6-标签和凝血酶切割位点。将该质粒与含有pTARA载体的T7聚合酶一起转化到营养缺陷型大肠杆菌细胞系B834中。从含有30μg/mL卡那霉素(FaRoth#T832.3)和34μg/mL氯霉素(FaRoth#388.2)的LB-琼脂平板挑取一个菌落用于过夜培养。从OD600为0.05开始，将5-10mL的过夜培养物加入到500mL含有45μM甲硫氨酸作为限制性氨基酸、0.75％阿拉伯糖、30μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素的NMM培养基中。细胞在28℃和180rpm生长过夜直至达到稳定期。然后加入叠氮高丙氨酸(100mg/L)，细胞在37℃孵育30分钟。随后，通过加入1mM IPTG(Fa ThermoScientific，#R0392)诱导表达，并在28℃以180rpm振荡16-18小时。通过在4℃下4000RCF离心15分钟收获细胞，用1xPBS pH 7.4洗涤，再次离心并重悬于30mL裂解缓冲液(PBS pH7.4，10mM咪唑)中。通过微流化器进行裂解。将裂解物在4℃以50000RCF离心15分钟，上清液用HisTrap(Cytiva，17-5255-01)纯化，裂解缓冲液作为结合缓冲液。用含有500mM咪唑的pH7.4的1xPBS洗脱蛋白质。用HiPrep 26/10脱盐柱(GE，#17-5087-01)在20mM Tris pH 8、150mM NaCl、2.5mM CaCl2中脱盐后，用凝血酶(1U/mL)(牛凝血酶，Fa Merck Millipore#605157)在室温下切割His6-标签过夜。切割的蛋白质通过HisTrap在1xPBS pH 7.4中纯化，10mM咪唑作为结合缓冲液以除去剩余的His6标记的蛋白质。收集流过级分并测定蛋白质浓度。表达的蛋白质以2-10mg产量分离1L表达。
UbK48 Aha和UbK63Aha的ETP官能化(根据实施例14)
UbK48/63Aha突变体在pH 6.9的PBS中稀释至1mg/ml(0.115mM)。通过加入次膦酸酯1至终浓度为2.3mM(20当量)以及CuBr(50mM)、THPTA(50mM)的预混合溶液至2.5mM的终浓度(最终MeCN浓度5％)开始反应。5小时反应时间后，加入5mM EDTA终止反应。随后，将反应混合物用1000倍体积的PBS(pH 6.9，5mM EDTA)透析过夜。在配备有Superdex7510/300GL柱(GE Healthcare，USA)的FPLC系统上，以及0.75ml/min流速的无菌PBS洗脱(Merck，德国)，通过SEC进一步精制次膦酸酯修饰的泛素。将含有蛋白质的级分合并，浓缩至200μM的浓度，并在4℃下储存直至进一步使用。
图59显示UBK48-ETP和UbK63-ETP的完整蛋白质质谱。图59a显示UBK48-EPT的完整蛋白MS。8739.1Da质量的峰对应于营养缺陷型表达的杂质UbK48M。图59b显示UbK63-ETP的完整蛋白MS。
使用ETP-官能化泛素的蛋白质-蛋白质交联(按照实施例14)
向0.2ml的UbG76C(0.5mM)的Tris-EDTA缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，5mMEDTA，pH 8.3)溶液中加入TCEP(1.05当量)，将混合物在37℃下振荡30分钟。初始还原后，加入0.2当量UbK63/48-ETP，允许反应进行6小时。然后，在配备有Superdex7510/300GL柱(GEHealthcare，USA)的FPLC系统上通过SEC纯化粗产物，用0.75ml/min流速的无菌PBS(Merck，德国)洗脱。合并含有产物的级分并在-20℃下储存直至进一步使用。
图60显示UbK48ETP-UbG76C二聚体12和UbK63ETP-UbG76C二聚体13的完整蛋白MS。图60a显示UbK48ETP-UbG76C二聚体12的完整蛋白MS。图60b显示UbK63ETP-UbG76C二聚体13的完整蛋白MS。
12对USP2-CD的水解稳定性(根据实施例14)
向50mM含有150mM NaCl、0.1mM EDTA和1mM DTT的HEPES pH 8.0中的去泛素化酶(DUB)USP2-CD(1.6μg,40pmol)(BostonBiochem)中加入在PBS pH 7.4中的12(1μg)或wtDiUb(K48)(1μg)(Enzo Life Sciences)，并将混合物在37℃孵育2小时。
图61显示以USP2-CD孵育的二聚体12的SDS-PAGE分析。
人工Diubiquitins的胰蛋白酶消化产物(按照实施例14)
用1.5％(wt/vol)脱氧胆酸钠(SDC)补充泛素二聚体(1mg/ml，50mM HEPES pH7.4)，并加热至60℃30分钟。将溶液稀释至1％(重量/体积)SDC，加入1:20(重量/重量)胰蛋白酶。在37℃消化蛋白质4小时，加入1％ TFA终止反应。离心除去沉淀的SDC，并将上清液保存在-20℃直至分析。
使用亚膦酸酯CS375在HEK293-细胞裂解物中进行全蛋白质组-半胱氨酸标记(根 据实施例15)
HEK293细胞在75cm2细胞培养瓶中生长至总面积的约80％。用PBS洗涤细胞，并通过离心在含有150mM NaCl、5mM EDTA、1mM PMSF和0.5％ Triton x-100的50mM Tris pH7.5中裂解。通过BCA试验检测蛋白质的总量，并用PBS调节至1mg/ml。细胞裂解物与浓度递增的次膦酸酯CS375(0、30、75、150、300μM)在室温下反应45分钟。随后通过SDS-PAGE使用凝胶内荧光和考马斯染色分析标记的裂解物。
用于全蛋白质组-半胱氨酸分析的样品制备(根据实施例15)
对于使用DTB-次膦酸酯CS418的全蛋白质组的半胱氨酸分析，调整了Zanon等描述的工作流程(Zanon,P.R.A.et al.Profiling the proteome-wide selectivity ofdiverse electrophiles.https://fragpipe.nesvilab.org(2021)doi:10.26434/CHEMRXIV.14186561.V1)。
HEK293细胞在75cm2细胞培养瓶中生长至总面积的约80％。用PBS洗涤细胞，并通过离心在含有150mM NaCl、5mM EDTA、1mM PMSF和0.5％ Triton x-100的50mM Tris pH7.5中裂解。通过BCA试验检测蛋白质的总量，并用PBS调节至1mg/ml。细胞裂解物与200μMCS418在室温下反应45分钟。随后，在-20℃下，在2ml冰冷的丙酮中沉淀蛋白过夜，将沉淀物在25℃下以3,500rpm离心10分钟，并重新悬浮于0.5ml冷MeOH中。将悬浮液以10,000xg离心5分钟，并除去上清液。再重复该过程两次。将蛋白质重悬于100mM三乙基碳酸氢铵(TEAB，Sigma Aldrich)中的150μL 8M尿素中，随后用100mM TEAB缓冲液稀释至2M尿素。将该溶液加入到预洗涤的高容量链霉亲和素珠(25μL初始浆液)中，并在室温和温和搅拌下孵育1小时。
为了除去未结合的蛋白质，将珠子离心并弃去上清液。另外，用补充有0.1％ NP-40的300μl PBS将珠洗涤3次，用300μl PBS和300μl milliQ-水洗涤3次。将珠子重悬(8M尿素，100mM TEAB)，用15μl二硫苏糖醇(DTT；31mg/mL水溶液)在37℃处理45分钟。在黑暗中用15μl碘乙酰胺(74mg/mL的水溶液)将还原的半胱氨酸烷基化45分钟。离心并除去上清液后，将珠子重悬于0.5ml TEAB缓冲液(100mM，2M尿素)中，加入1μg胰蛋白酶(Promega，V5113)。在37℃过夜消化蛋白质。
弃去含有未标记肽的上清液，用补充有0.1％ NP-40的300μl PBS洗涤珠子3次，用300μl PBS和300μl milliQ-水洗涤珠子3次。用100μl 50:0.1水/MeCN/FA洗脱脱硫-生物素化的肽两次。通过冷冻干燥除去溶剂，将样品再溶解在30μl 5:95:0.1水/MeCN/FA中并储存在-20℃直至测量。
实施例18：有机和肽合成
乙基二炔基次膦酸酯(1)
在氩气下，在50ml Schlenk烧瓶中加入115μl溶于2ml无水THF中的二氯次磷酸乙酯(1mmol，1当量)。冷却至-78℃后，滴加2.2当量乙炔基-溴化镁(0.5M，在THF中，22ml)。在使反应升温至室温后，将混合物倾倒在含有20mmol H2O2的40ml冰冷的H2O上。用40ml DCM萃取溶液3次，用50ml H2O洗涤合并的有机层两次，并通过MgSO4干燥。在溶剂蒸发后，获得红色液体1。(100mg，70％收率)。1的NMR光谱如图29(a)1H；b)31P；c)13C)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ4.91(d,J＝12.8Hz,2H),4.21(dq,J＝9.9,7.0Hz,2H),1.38(t,J＝7.0Hz,3H).
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ90.36(2C),89.72(2C),63.80(d,J＝4.1Hz),16.09(d,J＝7.9Hz).
31P-NMR(122MHz,CDCl3)δ-22.57.
HRMS for C6H8O2P+[M+H]+calc.(计算值):143.0256；found(观察值):143.0257
双(2--(乙硫基)乙烯基)次膦酸乙酯(5)
向10ml烧瓶中加入72mg溶解在1ml DMF中的1(0.5mmol，1当量)。滴加150μl乙硫醇(2当量，溶解于1ml DMF)，并将反应物在室温下搅拌10分钟。用2ml 1％ TFA的H2O溶液猝灭反应，通过半制备HPLC分离不同的E/Z异构体。
得到29mg淡黄色液体的Z/Z-异构体。Z/Z-异构体的NMR光谱如图30(a)1H；b)31P；c)13C)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.25(dd,J＝42.2,12.4Hz,2H),5.81(dd,J＝16.4,12.4Hz,2H),4.32-3.97(m,2H),2.84(q,J＝7.4Hz,4H),1.41(dt,J＝20.4,7.3Hz,9H).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ153.08(2C),116.06(d,J＝139.9Hz,2C),63.54(d,J＝5.2Hz),32.27(d,J＝9.4Hz,2C),19.19(d,J＝6.9Hz),18.10(2C).
31P-NMR(243MHz,CDCl3)δ25.86.
HRMS for C10H20O2PS2+[M+H]+calc.:267.0637；found:267.0645
得到32mg橙色液体的E/Z-异构体。E/Z异构体的NMR光谱示于图31(a)1H；b)31P；c)13C)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.59(dd,J＝20.4,16.6Hz,1H),7.25(dd,J＝42.8,12.5Hz,1H),6.02-5.61(m,2H),4.45-3.81(m,2H),2.88(dq,J＝27.0,7.4Hz,4H),1.67-1.04(m,9H).
13C NMR(151MHz CDCl3)δ153.32-152.04(m),115.90(d,J＝142.1Hz),113.23(d,J＝143.0Hz),63.79,32.28,28.76,19.14(d,J＝6.8Hz),18.13,16.54.
31P-NMR(243MHz,CDCl3)δ26.35.
HRMS for C10H20O2PS2+[M+H]+calc.:267.0637；found:267.0645.
得到4mg暗橙色液体的E/E-异构体。E/E异构体的NMR光谱示于图32(a)1H；b)31P；c)13C)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.50(dd,J＝20.0,16.7Hz,2H),5.68(dd,J＝19.2,16.7Hz,2H),4.11(dd,J＝7.9,7.0Hz,2H),2.90(q,J＝7.4Hz,4H),1.41(dt,J＝14.2,7.2Hz,9H).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ152.22(d,J＝8.3Hz),113.82(d,J＝144.2Hz),63.82(d,J＝5.9Hz),28.78,19.17(d,J＝6.7Hz),16.50.
31P-NMR(243MHz,CDCl3)δ25.78.
HRMS for C10H20O2PS2+[M+H]+calc.:267.0637；found:267.0645.
一般程序A
在氩气下，在50ml Schlenk烧瓶中加入150μl二乙基二磷酰胺二氯化物(1mmol，1当量)。加入2ml无水THF，将混合物冷却至-78℃，滴加4.4ml乙炔基溴化镁(0.5M，在THF中，1.1当量)，使反应物升温至室温。然后将混合物再次冷却至-78℃，并滴加溶于2.5ml四唑溶液(0.45M的乙腈溶液，1.1当量)的1当量的醇和2.5ml乙腈。使反应混合物升温至室温。随后从H2O/DCM萃取混合物。干燥合并的有机层并减压蒸发。粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(100％ Et2O)，得到所需产物，为次膦酸酯。将产物级分合并，并与含有0.1％ TFA的乙腈/H2O(80:20)混合。在减压下除去Et2O，向该溶液中加入H2O2(0.5ml30％水溶液/mmol原料)。随后将反应混合物冻干，得到所需化合物。该合成还描述于以下方案中，其进一步显示了相应的硫代膦酸酯和膦酰胺的合成：
为了产生相应的硫代膦酸酯，可以使用与次膦酸酯相同的步骤。如合成二炔基次膦酸酯中所述，由二乙基次磷酰胺二氯化合物和乙炔基溴化镁生成中间体I。简言之，将混合物再次冷却至-78℃和滴加溶解在1:1混合物四唑-溶液(0.45M乙腈溶液，1.1当量)中的1当量硫醇和乙腈。使反应混合物升温至室温。随后从H2O/DCM萃取混合物。干燥合并的有机层并减压蒸发。粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(100％ Et2O)，得到所需产物，为次膦酸酯。将产物级分合并，并与含有0.1％ TFA的乙腈/H2O(80:20)混合。在减压下除去Et2O，向该溶液中加入H2O2(0.5ml30％水溶液/mmol原料)。随后将反应混合物冻干，得到所需化合物。
为了产生相应的膦酰胺中间体I，用2eq在Et2O中的HCl在0℃下处理，以形成中间体II，如Van Assema等人所述(S.G.A.van Assema,P.B.Kraikivskii,S.N.Zelinskii,V.V.Saraev,G.B.de Jong,F.J.J.de Kanter,M.Schakel,J.Chris Slootweg,K.Lammertsma,Building blocks for phospha[n]pericyclynes,J.Organomet.Chem.692(2007)2314-2323.https://doi.org/10.1016/j.jorganchem.2007.02.017)。冷却至-78℃后，将仲胺溶解在Et2O或THF或MeCN中，逐滴加入1.2当量吡啶至充分搅拌的反应混合物中。将反应物温热至室温并继续搅拌30分钟。反应混合物用DCM萃取并在二氧化硅上纯化。最后，将纯化的化合物溶解在水和MeCN的混合物中，用过氧化氢氧化，并冻干得到所需产物。
或者，中间体II可以与格氏化合物反应。相应地，在冷却到-78℃之后，将溶于THF或Et2O中的格氏化合物R-MgBr滴加到剧烈搅拌的反应混合物中。将反应物温热至室温并继续搅拌30分钟。反应混合物用DCM萃取并在二氧化硅上纯化。最后，将纯化的化合物溶解在水和MeCN的混合物中，用过氧化氢氧化，并冻干得到所需产物。
丁-3-炔-1-基二炔基次膦酸酯(2)
该化合物按照一般程序A合成，得到澄清无色液体。(102mg，61％收率)。2的NMR光谱示于图33(a)1H；b)31P；c)13C)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ4.27(dt,J＝9.4,7.1Hz,2H),3.18(d,J＝12.8Hz,2H),2.69(td,J＝7.1,2.7Hz,2H),2.07(t,J＝2.7Hz,1H).
13C-NMR(75MHz,CDCl3)δ90.34(d,J＝48.6Hz),78.63,76.41(d,J＝260.9Hz),70.88,64.60(d,J＝5.5Hz),20.56(d,J＝8.6Hz).
31P-NMR(122MHz,CDCl3)δ-22.29.
HRMS for C8H8O2P+[M+H]+calc.:167.0256；found:167.0258.
mPEG4二炔基次磷酸酯(3)
按照一般程序A合成该化合物，得到浅棕色液体。(84mg，24％收率)。NMR光谱示于图34(a)1H；b)31P；c)13C)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ4.79(d,J＝1.5Hz,2H),4.07-3.99(m,2H),3.69-3.64(m,2H),3.63-3.54(m,10H),3.52-3.46(m,2H),3.31(s,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ104.91(2C),83.49(d,J＝30.3Hz,2C),74.48(2C),73.17-72.57(m,6C),61.24.
31P-NMR(122MHz,CDCl3)δ-25.89.
HRMS for C13H21O6P+[M+H]+calc.:305.1149；found:305.1148.
NBD-甲基氨基-己醇(A1)
A1是按照Concilio等人报道的两步方法(Concilio,S.；Ferrentino,I.；Sessa,L.；Massa,A.；Iannelli,P.；Diana,R.；Panunzi,B.；Rella,A.；Piotto,S.A NovelFluorescent Solvatochromic Probe for Lipid Bilayers.Supramol.Chem.2017,29(11),887-895.https://doi.org/10.1080/10610278.2017.1372583)合成的，以37％的产率得到暗红色固体。光谱表征与文献非常一致。
A0:1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ8.57(d,J＝8.6Hz,1H),7.74(d,J＝7.8Hz,1H),6.25(d,J＝8.6Hz,1H),3.78(t,J＝6.3Hz,2H),3.65-3.49(m,2H),1.93(m,2H),1.77-1.53(m,6H).
13C NMR(151MHz,氯仿-d)δ146.63,139.19,133.15,131.23,126.73,101.21,65.43,46.61,34.90,31.04,29.35,28.18.
A1:1H NMR(600MHz,甲醇-d4)δ8.46(d,J＝9.1Hz,1H),6.32(d,J＝9.2Hz,1H),4.11(宽-s,2H),3.58(t,J＝6.5Hz,2H),3.01(s,3H),1.93-1.75(m,2H),1.68-1.52(m,2H),1.53-1.42(m,4H).
13C NMR(151MHz,甲醇-d4)δ163.44,145.94,144.85,135.67,120.74,101.39,61.38,55.42,35.55,32.06,30.26,26.12,25.26.
HRMS for C13H18N4O4[M+H]+calc.:295.1401；found:295.1402
NBD二炔基次膦酸酯(4)
按照一般程序A(0.1mmol-规模)合成该化合物，获得红色固体。(18mg，46％收率)。4的NMR光谱如图35(a)(a)1H；b)31P；c)13C)所示。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.48(d,J＝9.2Hz,1H),6.42(d,J＝9.1Hz,1H),4.85(d,J＝12.7Hz,2H),4.10(dt,J＝9.3,6.3Hz,2H),2.51(s,3H),1.88-1.59(m,4H),1.53-1.19(m,5H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ158.21,146.33,145.32,136.69,120.32,102.69,94.86(d,J＝45.3Hz),77.27(d,J＝251.5Hz),67.48(d,J＝6.2Hz),55.66,40.54,29.78,29.73,25.92,25.13.
31P NMR(243MHz,DMSO-d6)δ-23.24.
HRMS for C17H20N4O5P+[M+H]+calc.:391.1166；found:391.1198.
二乙基二乙炔基次膦酰胺(Ⅱ)
在氩气下，向50ml Schlenk烧瓶中加入溶解在4ml干燥THF中的300μl二乙基磷酰胺(2mmol，1当量)。冷却至-78℃后，滴加2.5当量乙炔基-溴化镁(0.5M，在THF中，10ml)。在使反应升温至室温后，将混合物倾倒在含有10mmol H2O2的150ml冰冷的H2O上。用30ml DCM萃取溶液3次，用50ml H2O洗涤合并的有机层两次，并通过MgSO4干燥。蒸发溶剂后，得到棕色固体II。(205mg，61％收率)。II的NMR光谱如图36(a)1H；b)31P；c)13C)所示。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ＝3.23(dq,J＝14.1,7.1Hz,4H),3.07(d,J＝11.6Hz,2H),1.18(t,J＝7.1Hz,6H).
13C-NMR(151MHz,CDCl3)δ＝89.47(d,J＝42.0Hz),79.29(d,J＝229.2Hz),39.09(d,J＝6.3Hz),14.15(d,J＝3.0Hz).
31P-NMR(243MHz,CDCl3)δ＝-24.16.
由于分析过程中P-N键水解，没有记录到HRMS。
EDANS-叠氮丙酸酰胺(EDANS-N 3)
将100mg叠氮基-丙酸NHS-酯和115mg EDANS钠盐溶解在10ml DCM/DMF(8:2)中，加入200μl DIPEA。反应完成后，蒸发溶剂，粗产物经半制备HPLC纯化。(灰色固体，76mg，50％)。EDANS-N3的NMR光谱示于图37(a)1H；b)13C)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.42-8.26(m,2H),8.14(d,J＝8.5Hz,1H),8.02(d,J＝7.1Hz,1H),7.45(td,J＝7.8,2.7Hz,1H),7.42-7.36(m,1H),6.84(dt,J＝11.2,7.1Hz,1H),3.60(t,J＝6.4Hz,2H),3.49(q,J＝6.3Hz,2H),3.38(t,J＝6.4Hz,2H),2.49(t,J＝6.4Hz,2H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ173.49,147.34,133.30,129.20,127.78,127.21,126.30,125.86,121.55,109.41,50.13,47.69,40.55,37.81.
肽合成的一般程序
在Rink酰胺树脂上以0.05mmol的规模合成肽，加载量为0.78mmol/g。该合成在PTI合成仪上进行，每种氨基酸(5eq.氨基酸，5eq.HCTU，5eq.Oxyma，10eq.DIPEA，40min)在DMF中进行单一偶联。最后一个氨基酸与Boc保护的N-末端偶联。最后，通过用2ml TFA/TIS/H2O(95:2.5)混合物处理1小时，将肽从树脂上切下，并在冷Et2O中沉淀。通过半制备型HPLC纯化粗肽。
肽1
根据肽合成的一般程序合成肽1。作为最后一步，使用以下条件偶联DABCYLCOOH：3eq.酸、3eq.HATU、10eq.DIPEA，60分钟，于DMF中。通过半制备型HPLC纯化肽，得到暗红色粉末。(39.1mg，18μmol，36％)。肽1的HPLC色谱图示于图38中。
ESI-MS for C48H66N12O14S:[M+2H]2+calc.:533.23；found:533.34
FRET-Pair 1(F1)
猝灭的FRET-Pair 1从肽2和过量(10当量)次膦酸酯1在PBS(pH7.4)中合成。中间体纯化后，与1.2当量在PBS中的EDANS-硫醇反应。F1通过半制备HPLC纯化(1.67mg，86％)。F1的HPLC色谱图示于图39。
HRMS for C69H89N14O20PS3:[M+3H]3+calc.:521.1832；found:521.1806
[M+2H]2+calc.:781.2711；found:781.2713
FRET-Pair 2(F2)
猝灭的FRET-Pair 2以类似于F1合成，仅次膦酸酯2用作连接子。F2通过半制备HPLC纯化(1.94mg，91％)。F2的HPLC色谱图见图40。
HRMS for C71H89N14O20PS3:[M+3H]3+calc.:529.1832；found:521.1826
[M+2H]2+calc.:793.2711；found:793.2737
FRET-Pair 3(F3)
淬灭的FRET-Pair 3从2当量肽2和次膦酸酯2(1当量)在PBS中合成。随后，使用CuBr(10mol％)作为催化剂，EDANS-N3被偶联到次膦酸酯侧链。F3通过半制备HPLC纯化(2.13mg，78％)。F3的HPLC色谱图见图41。
HRMS for C119H152N29O34PS3:[M+3H]3+calc.:887.0058；found:887.0068
[M+4H]4+calc.:665.5062；found:665.5032
FRET-Pair 4(F4)
猝灭的FRET-Pair 4从肽2和过量(10当量)次膦酸酯1在PBS(pH7.4)中合成。中间体纯化后，与1.2当量在PBS(pH 7.4)中EDANS-N3和20mol％CuBr反应。F4通过半制备HPLC纯化(2.73mg，89％)。
HRMS for C69H88N17O20PS2:[M+3H]3+calc.:524.1930；found:524.1885
[M+2H]2+calc.:785.7858；found:785.7858
EDANS-SH
将50mg三苯甲硫基丙酸、60mg HATU和200μlDIPEA溶于5ml DMF并搅拌5分钟。加入40mg EDANS钠盐，使反应进行过夜。减压除去溶剂，将残余物溶解在TFA/DCM(1:1)中。30分钟后，在氩气流下除去溶剂，并将粗产物通过半制备型HPLC纯化。(白色粉末，21.3mg，45％)
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.29(d,J＝8.6Hz,1H),8.17(t,J＝5.8Hz,1H),8.07(dt,J＝8.4,1.1Hz,1H),7.96(dd,J＝7.1,1.1Hz,1H),7.39(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.33(dd,J＝8.6,7.5Hz,1H),6.77(d,J＝7.5Hz,1H),3.43(q,J＝6.3Hz,2H),3.32(t,J＝6.5Hz,2H),2.69(q,J＝7.1Hz,2H),2.43(t,J＝7.0Hz,2H),2.31(t,J＝8.0Hz,1H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ171.51,144.71,130.60,126.46,125.02,124.45,123.55,123.09,118.79,45.10,40.53,37.79,20.37.
HRMS for C15H19N2O4S2 +[M+H]+calc.:355.0781found:355.0789.
EDANS-乙基-硫代乙烯基-乙炔基次膦酸酯(CS265)
CS265由乙基-二炔基-次膦酸酯(1，5当量)和EDANS-SH(6.5mg 1当量)在室温下溶解于400μl DMSO/PBS(1:1)中合成。将反应搅拌90分钟，并通过加入3ml 0.1％ TFA水溶液停止反应。CS265通过半制备HPLC纯化。(6.9mg，76％收率)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.30-8.23(m,2H),8.13(d,J＝8.5Hz,1H),8.00(dd,J＝7.1,1.1Hz,1H),7.65(dd,J＝46.6,12.5Hz,1H),7.42(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.35(dd,J＝8.6,7.6Hz,1H),6.71(d,J＝7.6Hz,1H),5.73(dd,J＝19.3,12.5Hz,1H),4.52(d,J＝10.8Hz,1H),4.07(dq,J＝9.0,7.0Hz,2H),3.47(q,J＝6.3Hz,2H),3.35(t,J＝6.6Hz,2H),3.11(t,J＝7.1Hz,2H),1.32(t,J＝7.0Hz,3H).
13C NMR(189MHz,DMSO-d6)δ170.97,154.21,144.67,143.14,140.39,130.61,126.54,124.88,124.21,123.15,117.35,112.44(d,J＝163.3Hz),104.57,92.98(d,J＝36.1Hz),78.50(d,J＝201.7Hz),61.78(d,J＝5.9Hz),44.28,38.09,36.80,31.03,16.57(d,J＝6.8Hz).
31P NMR(243MHz,DMSO-d6)δ0.46.
EDANS-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS266)
CS266由乙基-二炔基-次膦酸酯(1，5当量)和EDANS-N3(8.3mg 1当量)在室温下溶解于400μl DMSO/PBS(1:1)合成。通过加入5mgCuBr开始反应。30分钟后，通过加入3ml 0.1％TFA水溶液停止反应。CS266经半制备型HPLC纯化。(9.8mg，85％收率)。CS266的NMR光谱示于图42(a)1H；b)13C；c)31P)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.68(s,1H),8.38(d,J＝8.7Hz,1H),8.27(d,J＝5.7Hz,1H),8.08(d,J＝8.5Hz,1H),7.99(d,J＝7.1Hz,1H),7.44(t,J＝7.9Hz,1H),7.37(t,J＝8.1Hz,1H),6.88(d,J＝7.5Hz,1H),4.81-4.57(m,3H),4.20-4.10(m,2H),3.40(t,J＝6.2Hz,2H),3.31(t,J＝6.6Hz,2H),2.83(t,J＝6.8Hz,2H),1.28(t,J＝7.0Hz,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ169.99,144.67,140.51(d,J＝257.5Hz),138.24,132.29(d,J＝34.1Hz),130.59,126.44,125.08,124.56,123.68,123.16,119.17,107.13,95.00(d,J＝39.6Hz),77.71(d,J＝220.3Hz),63.08(d,J＝5.8Hz),46.63,44.94,37.69,35.61,16.50(d,J＝6.7Hz).
31P NMR(243MHz,DMSO-d6)δ-4.84.
HRMS C21H25N5O6PS2 +[M+H+]calc.:506.1258；found:
生物素-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS292)
CS292以类似于CS266的方法由16mg生物素-N3合成。(18.4mg，74％收率)。CS292的NMR光谱示于图43(a)(a)1H；b)13C；c)31P)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.77(s,1H),4.71(d,J＝11.6Hz,1H),4.45(t,J＝7.1Hz,2H),4.31(dd,J＝7.7,5.0Hz,1H),4.22-4.08(m,3H),3.16-3.00(m,1H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.59(d,J＝12.4Hz,1H),1.96-1.80(m,2H),1.60(ddd,J＝11.8,8.0,4.3Hz,1H),1.51-1.08(m,8H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ163.17,139.11(d,J＝213.4Hz),131.94(d,J＝34.0Hz),94.96(d,J＝39.3Hz),77.76(d,J＝220.2Hz),63.07(d,J＝5.9Hz),61.47,59.68,55.85,50.12,29.75,28.55,28.33,26.28,16.52(d,J＝6.8Hz).
31P NMR(243MHz,DMSO-d6)δ-4.74.
HRMS for C16H24N5O3SP[M+H]+calc.:398.1410；found:398.1409
二乙炔基(苯基)氧化膦(CS267)
CS267是根据乙基二乙炔基次膦酸酯，由市售的二氯苯基膦开始合成的。CS67的NMR光谱示于图44(a)1H；b)31P；c)13C)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.98-7.83(m,2H),7.80-7.70(m,1H),7.66(td,J＝7.6,3.7Hz,2H),5.00(d,J＝11.1Hz,2H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ133.98(d,J＝3.2Hz),131.77(d,J＝140.6Hz),130.29(d,J＝12.7Hz),129.77(d,J＝14.8Hz),97.72(d,J＝34.0Hz),78.85(d,J＝189.8Hz).
31P NMR(243MHz,DMSO-d6)δ-22.79.
HRMS for C10H8OP+[M+H]+calc.:175.0307；found:175.0316
三乙炔基次膦酸酯(CS297)
该化合物S.G.A.Van Assema,C.G.J.Tazelaar,G.De Bas Jong,J.H.Van Maarseveen,M.Schakel,M.Lutz,A.L.Spek,J.Chris Slootweg,K.Lammertsma,Phospha-scorpionate complexes by click chemistry using phenyl azide andethynylphosphine oxides,Organometallics.27(2008)3210-3215.https://doi.org/10.1021/om800127h制备。光谱表征与文献一致。(152mg，40％收率)
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ5.13(d,J＝12.5Hz,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ97.07(d,J＝42.8Hz),78.09(d,J＝227.6Hz).
31P-NMR(243MHz,DMSO-d6)δ-56.9.
HRMS for C6H4OP+[M+H+]calc.:122.9994；found:123.0009
二乙炔基(乙基)氧化膦(CS297-副产物)
作为合成CS297的副产物分离。(5mg，1.3％产率)。CS197的NMR光谱如图45(a)1H；b)13C；c)31P)。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ3.17(d,J＝10.5Hz,2H),2.11(dq,J＝15.3,7.6Hz,2H),1.33(dt,J＝23.7,7.6Hz,3H).
13C NMR(151MHz,Chloroform-d)δ91.56(d,J＝32.8Hz),77.12(d,J＝31.9Hz),27.70(d,J＝97.6Hz),5.63(d,J＝4.8Hz).
31P NMR(243MHz,Chloroform-d)δ-7.04.
HRMS for C6H8OP+[M+H+]calc.:127.0307；found:127.0310
化合物CS298
CS298是由4mg FAM-N3(5/6异构体的混合物)和10eq乙基-二炔基-次膦酸酯(1)溶解于1ml DMSO/PBS(1:1)中合成的。通过加入3mgCuBr开始反应。30分钟后，通过加入4ml 0.1％TFA水溶液停止反应，并通过半制备型HPLC纯化。(3.2mg，62％收率)。CS298的31P NMR谱见图46，CS298的HPLC色谱图见图47。
31P NMR(243MHz,DMSO-d6)δ-37.45.
HRMS for C32H26N4O7P+[M+H+]calc.:609.1534；found:609.1494
R10-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS314)：
CS314以类似于CS266由9mg相应的叠氮化物取代的肽合成。CS314的HPLC色谱图见图48。
HRMS for C84H166N47O19P4+[M+4H+]calc.:542.0796；found:542.0784
化合物CS321
CS321是由乙基-乙烯基-乙炔基-次膦酸酯(1.2当量)和TAMRA-N3(5mg 1当量，5/6-异构体的混合物)在室温下溶解于400μl DMSO/PBS(1:1)中合成的。通过加入5mg CuBr开始反应。30分钟后，通过加入3ml 0.1％TFA水溶液停止反应，CS321经半制备型HPLC纯化。(5.4mg，86％收率)
1H NMR(600MHz,乙腈-d3)δ8.64(d,J＝10.8Hz,1H),8.26-8.17(m,2H),7.59(t,J＝6.3Hz,1H),7.43(dd,J＝7.0,4.8Hz,1H),7.12(t,J＝10.2Hz,2H),6.94(dt,J＝13.0,6.4Hz,2H),6.84(dd,J＝10.3,2.9Hz,2H),6.55-6.07(m,3H),4.47(q,J＝6.1,4.9Hz,2H),4.18-3.88(m,2H),3.44(p,J＝6.1Hz,2H),3.26(d,J＝10.9Hz,12H),2.02(dd,J＝14.8,7.2Hz,4H),1.69(p,J＝6.5,5.6Hz,2H),1.43(q,J＝7.6Hz,2H),1.28(td,J＝7.0,4.6Hz,3H).
13C NMR(189MHz,乙腈-d3)δ165.91,165.40,157.31(d,J＝7.1Hz),139.28(d,J＝176.2Hz),136.74,136.57,135.16(d,J＝1.8Hz),131.72,131.11,130.84,130.72,130.57,129.99,129.74(d,J＝144.9Hz),129.25,114.17,96.24,61.33(d,J＝6.0Hz),50.05,39.35,29.43,28.43,23.56,15.78(d,J＝6.4Hz).
31P NMR(243MHz,乙腈-d3)δ20.02
HRMS for C36H42N6O6P+[M+H]+calc.:685.2898；found:685.2901
化合物CS327
CS321是根据CS321从15mg EDANS-N3合成的。(14.3mg，68％收率)
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.57(s,1H),8.41(d,J＝8.7Hz,1H),8.27(t,J＝5.7Hz,1H),8.08(d,J＝8.5Hz,1H),7.99(dd,J＝7.2,1.1Hz,1H),7.46-7.42(m,1H),7.38(t,J＝8.1Hz,1H),7.23-7.01(m,0H),6.96-6.85(m,1H),6.46(ddd,J＝24.4,18.6,12.7Hz,1H),6.32-6.08(m,2H),4.68(t,J＝6.8Hz,2H),4.07-3.85(m,2H),3.40(q,J＝6.4Hz,2H),3.31(t,J＝6.6Hz,2H),2.82(t,J＝6.8Hz,2H),1.21(t,J＝7.0Hz,3H).
13C NMR(189MHz,DMSO-d6)δ170.04,144.62,141.10,139.14(d,J＝174.8Hz),135.88,131.99(d,J＝28.6Hz),130.64(d,J＝25.6Hz),129.97,126.42,125.11,124.20(d,J＝154.0Hz),123.17,119.44,107.61,61.28(d,J＝5.8Hz),46.49,45.10,37.60,35.73,16.73(d,J＝6.1Hz).
31P NMR(243MHz,DMSO-d6)δ19.60.
HRMS calculated for C21H26N5O6PS+[M+H]calc.:508.1414；found:508.1416
化合物CS145
在氩气下将1mmol乙烯基膦酸二乙酯(153μl，1当量)溶解在4ml无水DCM中。一次性加入350μl草酰氯，并将反应物在30℃下搅拌过夜，随后回流30分钟。在高真空下除去挥发物，将残余物(乙烯基膦酸氯化乙酯，31P-NMR：26.95ppm)溶解在无水THF中，形成1M溶液。冷却至0℃后，加入2.2ml乙炔基-MgBr(0.5M的THF溶液，1.1当量)，使反应物升温至室温。使反应在DCM和水之间分配，水层再用DCM萃取两次。干燥(MgSO4)合并的有机级分，过滤并蒸发。残余物不经进一步纯化直接使用。(71mg，50％)
1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ6.44(ddd,J＝27.2,16.0,4.1Hz,1H),6.37-6.14(m,2H),4.35-4.15(m,2H),3.04(d,J＝10.7Hz,1H),1.41(t,J＝7.1Hz,3H).
13C NMR(151MHz,氯仿-d)δ136.01(d,J＝2.6Hz),128.78(d,J＝160.0Hz),89.72(d,J＝36.8Hz),76.95(d,J＝202.8Hz),62.40(d,J＝6.6Hz),16.22(d,J＝7.0Hz).
31P NMR(243MHz,氯仿-d)δ6.54.
2-(6-苯基-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙-1-醇(CS333)
根据Mao等人(W.Mao,W.Shi,J.Li,D.Su,X.Wang,L.Zhang,L.Pan,X.Wu,H.Wu,Organocatalytic and Scalable Syntheses of Unsymmetrical 1,2,4,5-Tetrazines by Thiol-Containing Promotors,Angew.Chemie Int.Ed.58(2019)1106-1109.https://doi.org/10.1002/anie.)由苄腈和羟基丙腈合成。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.48(dd,J＝7.5,2.6Hz,2H),7.68(ddt,J＝17.1,8.8,4.6Hz,3H),4.84(td,J＝5.6,2.7Hz,1H),4.04(qd,J＝6.1,2.7Hz,2H),3.46(td,J＝6.4,2.8Hz,2H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ168.68,164.01,132.95,132.31,130.04,129.90,127.90,59.79,38.62.
HRMS for C10H11N4O+[M+H]+calc.:203.0927；found:203.0937
3-(2-叠氮乙基)-6-苯基-1，2，4，5-四嗪(CS347)
将50mg CS333(0.25mmol，1当量)溶解在2ml无水DCM中并冷却至0℃。加入1.2当量三乙胺，然后滴加1.2当量甲磺酰氯(溶解在2ml无水DCM中)。在室温下1小时后，用H2O萃取反应物三次，用MgSO4干燥，过滤并蒸发至干。将残余物溶于3ml DMSO，加入5当量NaN3，并将反应物在室温下搅拌过夜。用Et2O(30ml)沉淀盐并经硅藻土过滤。将滤液蒸发至干，CS347无需进一步纯化即可使用。(粉红色粉末；51mg，91％)
1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ8.70-8.55(m,1H),7.74-7.55(m,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,1H),3.66(t,J＝6.7Hz,1H).
13C NMR(151MHz,氯仿-d)δ167.15,164.63,132.86,131.55,129.31,128.13,48.76,34.46.
HRMS for C10H10N7+[M+H]+calc.:228.0992；found:228.0999
乙基乙炔基(1-(2-(6-苯基-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)次 膦酸酯(CS380)
CS380以类似于CS266方法由10mg CS347合成。(8.4mg，52％收率)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.87(s,1H),8.59-8.43(m,2H),7.84-7.60(m,3H),5.12(t,J＝6.9Hz,2H),4.72(d,J＝11.6Hz,1H),4.15(dqd,J＝9.6,7.0,2.8Hz,2H),4.01(t,J＝6.9Hz,2H),1.29(t,J＝7.0Hz,3H).
31P NMR(243MHz,乙腈-d3)δ-5.21.
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ167.22,164.12,139.10(d,J＝212.9Hz),133.20,132.60(d,J＝34.2Hz),132.09,129.99,128.03,95.06(d,J＝39.6Hz),77.66(d,J＝221.1Hz),63.11(d,J＝5.9Hz),47.79,34.87,16.49(d,J＝6.9Hz).
HRMS for C16H16N7O2P+[2M+Na]+calc.:761.2096；found:761.2093.
3-(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄腈(CS337)
将10mmol 3-氰基苯酚溶解在10ml丙酮中。加入2eq K2CO3，随后加入1当量甲苯磺酸四乙酯。将反应回流5小时，直到没有起始原料剩余。将混合物用水(100ml)稀释，用EtOAc(3×50ml)萃取。干燥(MgSO4)合并的有机层，过滤并蒸发。将残余物在二氧化硅(EtOAc/MeOH；10:1)上纯化，得到无色油状的所需产物。(1.8g，61％)
1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ7.36(t,J＝7.9Hz,1H),7.24(dt,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.19-7.13(m,2H),4.17-4.13(m,2H),3.89-3.83(m,2H),3.75-3.63(m,11H),3.63-3.57(m,2H).
13C NMR(151MHz,氯仿-d)δ158.90,130.32,124.65,119.93,118.68,117.67,113.12,72.47,70.84,70.64,70.55,70.30,69.48,67.86,61.68.
HRMS for C15H22NO5 +[M+H]+calc.:296.1492；found:296.1497
2-(2-(2-(2-(3-(6-苯基-1，2，4，5-四嗪-3-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基) 乙-1-醇(CS338)
根据Mao等人(W.Mao,W.Shi,J.Li,D.Su,X.Wang,L.Zhang,L.Pan,X.Wu,H.Wu,Organocatalytic and Scalable Syntheses ofUnsymmetrical 1,2,4,5-Tetrazines by Thiol-Containing Promotors,Angew.ChemieInt.Ed.58(2019)1106-1109.https://doi.org/10.1002/anie.)由CS337和苄腈合成。
1H NMR(600MHz,乙腈-d3)δ8.70-8.56(m,2H),8.24(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),8.18(dd,J＝2.8,1.4Hz,1H),7.79-7.65(m,3H),7.61(td,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.29(dd,J＝8.3,2.6Hz,1H),4.38-4.25(m,2H),3.88(td,J＝4.3,1.2Hz,2H),3.77-3.68(m,2H),3.66-3.58(m,8H),3.52(td,J＝4.8,1.3Hz,2H).
13C NMR(151MHz,乙腈-d3)δ165.45,165.24,161.07,135.00,134.07,133.61,132.10,130.84,129.14,121.73,120.72,114.32,73.67,71.77,71.58,71.54,71.39,70.65,69.26,62.33.
HRMS for C22H27N4O5 +[M+H]+calc.:427.1976；found:427.1981
化合物CS344A
根据一般程序A由20mg CS338合成。(16mg，67％)
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.64-8.49(m,2H),8.26-8.11(m,1H),8.07(d,J＝2.0Hz,1H),7.72(qd,J＝8.8,7.8,3.8Hz,4H),7.62(t,J＝8.0Hz,1H),7.32(dd,J＝8.3,2.6Hz,1H),4.86(d,J＝12.7Hz,2H),4.27(dd,J＝5.7,3.5Hz,2H),4.23-4.12(m,2H),3.83(dd,J＝5.5,3.6Hz,2H),3.68(t,J＝4.5Hz,3H),3.65(dd,J＝5.9,3.6Hz,2H),3.61-3.56(m,7H).
31P NMR(243MHz,DMSO-d6)δ-22.95.
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ165.26,165.04,161.06,135.05,134.56,133.71,132.67,131.39,129.47,121.92,121.04,114.63,96.52(d,J＝45.7Hz),78.53(d,J＝252.9Hz),71.83,71.72,71.67,71.61,70.81,70.75,69.39,68.00(d,J＝6.1Hz).
HRMS for C26H28N4O6P+[M+H]+calc.:523.1741；found:523.1744
二乙炔基(1-(2-(6-苯基-1，2，4，5-四嗪-3-基)乙基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)氧化 膦(CS350)
CS350是根据CS298由15mg CS347合成的。(7mg，30％)。
1H NMR(600MHz,氯仿-d)δ8.70-8.53(m,2H),8.31(s,1H),7.79-7.56(m,4H),5.25(t,J＝6.8Hz,2H),4.13(t,J＝6.8Hz,2H),3.33(d,J＝11.7Hz,2H).
31P NMR(243MHz,氯仿-d)δ-35.18.
13C NMR(151MHz,乙腈-d3)δ168.19,165.86,141.57(d,J＝191.3Hz),134.12,133.46,132.90(d,J＝35.7Hz),130.82,129.20,95.64(d,J＝39.1Hz),78.85(d,J＝205.2Hz),49.07,35.91.
HRMS for C16H13N7OP+[M+H]+calc.:350.0914；found:350.0918
外型-5-降冰片烯羧酸NHS-酯
根据P.Werther,J.S./>R.Wombacher,Chem.Eur.J.2017,23,18216合成。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ6.25(dd,J＝5.6,3.0Hz,1H),6.20(dd,J＝5.7,3.1Hz,1H),3.20-3.11(m,1H),3.00(dq,J＝3.6,1.8Hz,1H),2.83(s,4H),2.55(ddd,J＝9.1,4.4,1.3Hz,1H),1.90(dt,J＝11.8,3.9Hz,1H),1.51(ddd,J＝11.7,9.0,2.4Hz,1H),1.38(qt,J＝8.8,1.9Hz,2H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ172.05,170.74,138.69,135.67,47.02,46.42,41.68,30.97,25.93(一个信号与溶剂峰重叠)。
乙基降冰片烯-PEG 7 -三唑-乙炔基-次膦酸酯(CS390)
将H2N-PEG7-N3(11mg，0.02mmol)溶于100μl DMSO和200μl PBS(pH 7.4)。加入1.2当量外型-5-降冰片烯羧酸NHS-酯，并使其在室温下反应1小时。在胺完全消耗后(UPLC-MS)加入5eq次膦酸酯1和20mol％CuBr。30分钟后，通过加入3ml 0.1％TFA水溶液停止反应，7经半制备型HPLC纯化。(11.1mg，59％收率)。CS390的NMR光谱示于图62(a)1H；b)13C；c)31P)。
1H NMR(600MHz,乙腈-d3)δ8.37(s,1H),6.15(qd,J＝5.6,2.8Hz,2H),4.62(t,J＝5.1Hz,2H),4.26(dqd,J＝9.0,7.0,2.1Hz,2H),3.94-3.87(m,2H),3.65(d,J＝11.5Hz,1H),3.63-3.52(m,24H),3.50(t,J＝5.6Hz,2H),3.33(qd,J＝5.6,2.3Hz,2H),2.88(d,J＝3.1Hz,1H),2.86(dt,J＝2.8,1.3Hz,1H),2.09-2.03(m,1H),1.85(dt,J＝11.4,4.0Hz,1H),1.67(dt,J＝8.0,1.5Hz,1H),1.39(t,J＝7.1Hz,3H).
13C NMR(151MHz,乙腈-d3)δ175.31,139.17(d,J＝214.8Hz),137.85,136.17,131.64(d,J＝33.8Hz),91.72(d,J＝40.6Hz),76.95(d,J＝221.0Hz),70.14(d,J＝7.4Hz),69.98,69.94,69.43,68.53,63.05(d,J＝6.1Hz),50.21,47.20,45.76,43.79,41.44,38.99,29.92,15.59(d,J＝7.1Hz).
31P NMR(243MHz,乙腈-d3)δ-4.89.
HRMS for C28H46N4O9P+[M+H+]calc.:613.2997；found:613.3019.
5/6羧基荧光素-叠氮化物
HRMS for C26H23N4O6P[M+H]+calc.:487.1612；found:687.1613.
5/6-羧基荧光素-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS375)
CS375以类似于CS298由3mg 5/6-羧基荧光素-N3和次膦酸酯1合成。(2.7mg，70％)。CS375的HPLC色谱图见图63。
HRMS for C32H30N4O8P[M+H]+calc.:629.1796；found:629.1769
脱硫生物素NHS-酯
将脱硫生物素(214mg，1mmol)溶解在2ml无水DMF中。加入EDC-HCl(1.1当量)和NHS(1.1当量)，并将反应物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用50ml 2M HCl稀释，用EtOAc(3×30ml)萃取。干燥(MgSO4)合并的有机层，过滤并蒸发以获得脱硫生物素，为白色固体(280mg，90％)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ3.66-3.59(m,1H),3.50(td,J＝7.9,4.7Hz,1H),2.82(d,J＝6.2Hz,5H),2.67(t,J＝7.3Hz,2H),1.63(p,J＝7.2Hz,2H),1.36(dddd,J＝20.5,18.3,9.7,4.7Hz,5H),1.22(qd,J＝9.3,7.6,5.0Hz,1H),0.97(d,J＝6.4Hz,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ170.72,169.44,163.30,55.37,50.69,30.57,29.84,28.48,25.90,25.76,24.66,15.94.
20mg 3-叠氮基丙胺溶解在1ml无水DMF和40μl二异丙胺中。加入60mg(0.95当量)脱硫生物素-NHS-酯，反应物于室温搅拌2小时。产物通过制备性HPLC分离。(62mg，84％)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.82(t,J＝5.6Hz,1H),3.61(dd,J＝7.6,6.3Hz,1H),3.48(td,J＝8.0,4.7Hz,1H),3.34(t,J＝6.8Hz,2H),3.09(q,J＝6.5Hz,2H),2.05(t,J＝7.4Hz,2H),1.64(p,J＝6.8Hz,2H),1.49(p,J＝7.4Hz,2H),1.41-1.12(m,6H),0.96(d,J＝6.4Hz,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ172.62,163.27,55.45,50.70,48.91,36.21,35.79,29.97,29.18,28.93,26.01,25.63,15.93.
HRMS C13H25N6O2 +[M+H+]calc.:297.2034；found:297.2036.
脱硫生物素-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS418)
CS418类似于CS298由10mg CS374和次膦酸酯1合成。(9.27mg，63％)。CS418的NMR光谱示于图64(a)1H；b)13C；c)31P)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.76(s,1H),7.87(t,J＝5.7Hz,1H),4.71(d,J＝11.6Hz,1H),4.45(t,J＝7.0Hz,2H),4.17(dqd,J＝9.4,7.0,2.5Hz,2H),3.66-3.57(m,1H),3.48(td,J＝7.9,4.6Hz,1H),3.04(q,J＝6.5Hz,2H),2.06(t,J＝7.5Hz,2H),1.99(p,J＝6.9Hz,2H),1.49(q,J＝7.5Hz,2H),1.44-1.12(m,9H),0.96(d,J＝6.4Hz,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ172.77,163.26,139.07(d,J＝213.1Hz),132.14(d,J＝34.3Hz),94.99(d,J＝39.6Hz),77.73(d,J＝219.3Hz),63.10(d,J＝5.7Hz),55.45,50.70,48.09,36.00,35.80,30.19,29.97,29.20,26.03,25.59,16.51(d,J＝6.6Hz),15.94.
31P NMR(243MHz,DMSO-d6)δ-4.79.
HRMS C19H32N6O4P+[M+H+]calc.:439.2217；found:439.2231
Cy5-1，2，3-三唑-乙基-乙炔基次膦酸酯(CS450)
CS450类似于CS298由5mg Cy5-叠氮化物和次膦酸酯1合成。(4.8mg，78％产率)。CS450的HPLC色谱图见图65。
HRMS for C34H39N5O2P+[M+H]+calc.:580.2836；found:580.2866.
4-(6-甲基-1，2，4，5-四嗪-3-基)苯酚(CS342)
CS342按照Yang等人(Yang,J.,Karver,M.R.,Li,W.,Sahu,S.and Devaraj,N.K.(2012),Metal-Catalyzed One-Pot Synthesis of TetrazinesDirectly from Aliphatic Nitriles and Hydrazine.Angew.Chem.Int.Ed.,51:5222-5225.)来合成。
1H NMR(600MHz,乙腈-d3)δ8.51-8.30(m,2H),7.67(s,1H),7.18-6.88(m,2H),2.99(s,3H).
13C NMR(151MHz,乙腈-d3)δ166.77,163.66,160.90,129.55(2C),123.89,116.12(2C),20.27.
3-(4-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)-6-甲基-1，2，4，5-四嗪 (CS414)
0.7mmol CS342溶解在15ml DMF/MeCN(5:1)中。加入2eq K2CO3和1.2eq甲苯磺酰基-PEG3-N3，并将反应在60℃搅拌2小时。将混合物用1M HCl(100ml)和EtOAc(3×50ml)萃取，将合并的有机萃取物用MgSO4干燥，过滤并蒸发。将得到的粗品用二氧化硅(己烷/乙酸乙酯2:1)纯化，得到183mg粉红色固体的CS414。(76％产率)。CS414的NMR光谱示于图66(a)1H；b)13C)。
1H NMR(600MHz,乙腈-d3)δ8.48(dt,J＝8.9,2.0Hz,2H),7.19-7.13(m,2H),4.28-4.22(m,2H),3.89-3.84(m,2H),3.71-3.68(m,2H),3.68-3.64(m,4H),3.39(q,J＝4.4,3.9Hz,2H),3.00(s,3H).
13C NMR(151MHz,乙腈-d3)δ166.88,163.58,162.42,129.37,124.68,115.33(d,J＝19.0Hz),70.39(d,J＝4.2Hz),70.19,69.57,69.19,67.82,50.53,20.29.
四嗪-PEG3-三唑基-膦酰氧化物(CS415)
CS415根据CS298由17mg CS414合成。(13.07mg，56％收率)。CS415的NMR光谱示于图67(a)1H；b)13C)；c)31P)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.81(s,1H),8.45-8.38(m,2H),7.23-7.15(m,2H),5.02(d,J＝11.6Hz,2H),4.67(t,J＝5.2Hz,2H),4.23-4.19(m,2H),3.90(t,J＝5.2Hz,2H),3.80-3.72(m,2H),3.59(q,J＝1.5Hz,4H),2.97(s,3H).
13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ166.97,163.42,162.42,140.15(d,J＝190.3Hz),132.17(d,J＝36.0Hz),129.66,124.54,115.86,97.54(d,J＝37.5Hz),78.38(d,J＝203.2Hz),70.22,70.00,69.22,68.70,67.95,50.27,21.18.
31P NMR(243MHz,DMSO-d6)δ-37.38.
HRMS for C21H23N7O4P+[M+H]+calc.:468.1544Da；found:468.1564Da
N 3 -PEG 4 -Val-Cit-PAB-MMAE
在5ml烧瓶中加入37.9mg在0.3ml DMSO中的Val-Cit-PAB-MMAE(根据Matos等人.(M.J.Matos,C.D.Navo,T.Hakala,X.Ferhati,A.Guerreiro,D.Hartmann,B.Bernardim,K.L.Saar,I.F.Corzana,T.P.J.Knowles,G.Jiménez-Osés,G.J.L.Bernardes,Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,6640.)合成的)。加入1.2eq N3-PEG4-NHS-酯(JenaBioscience)和2eq DIPEA。使反应在50℃下进行4小时，并通过半制备HPLC纯化产物(37.6mg，71％产率)。
HRMS for C69H115N13O17 2+[M+2H]2+calc:698.9261Da；found:698.9261Da
(PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE)-三唑基-mPEG4-乙炔基次膦酸酯(CSDrug1)
/>
CSDrug1根据CS298由2.55μmol N3-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE和12.75μmol次膦酸酯3合成。(2.57mg，59％收率)
HRMS for C82H136N13O23P2+[M+2H]2+calc:850.9799Da；found:850.9773Da
(PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE)-三唑基二乙炔基-氧化膦
该化合物根据CS298由2.55μmol N3-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE和6.2mg膦氧化CS297合成。产物通过半制备HPLC纯化。(0.62mg，16％收率)。
HRMS for C75H118N13O18P+[M+2H]2+calc:759.9222Da；found:759.9233Da.
结论
总之，本发明提供一种基于双反应性不饱和磷(V)化合物的用于偶联包含硫醇基的化合物和再偶联二硫基的新技术。双反应性不饱和磷(V)化合物对巯基显示出优异的反应性和选择性，例如在含水体系中，这允许容易且模块化地生成具有复杂分子的偶联物。此外，获得的偶联物表现出出色的稳定性，例如在过量的小硫醇存在下、在人血清存在下和在活细胞内的条件下。用磷(V)化合物再桥接的抗体可以进一步用功能性分子例如荧光团修饰，并保持它们的靶选择性。这种用于修饰包含巯基和抗体的化合物的简单且直接的策略将有助于开发用于生物学和生物药学应用的新工具。
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[20]M.E.B.Smith,F.F.Schumacher,C.P.Ryan,L.M.Tedaldi,D.Papaioannou,G.Waksman,S.Caddick,J.R.Baker,J.Am.Chem.Soc.2010,132,1960-1965.
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序列表
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<120> 与不饱和磷(V)化合物的硫醇偶联
<130> LC23310028P
<150> EP 21170097.6
<151> 2021-04-23
<160> 23
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Avi标签
<400> 1
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 钙调蛋白标签
<400> 2
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1 5 10 15
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20 25
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 聚谷氨酸标签
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> E-标签
<400> 4
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FLAG-标签
<400> 5
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> HA-标签
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> His-标签
<400> 7
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Myc-标签
<400> 8
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> NE-标签
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Thr Lys Glu Asn Pro Arg Ser Asn Gln Glu Glu Ser Tyr Asp Asp Asn
1 5 10 15
Glu Ser
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> S-标签
<400> 10
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> SBP-标签
<400> 11
Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Arg Glu Pro
35
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Softag 1
<400> 12
Ser Leu Ala Glu Leu Leu Asn Ala Gly Leu Gly Gly Ser
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Softag 3
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Thr Gln Asp Pro Ser Arg Val Gly
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Strep-标签 II
<400> 14
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TC 标签
<400> 15
Cys Cys Pro Gly Cys Cys
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> V5 标签
<400> 16
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VSV-标签
<400> 17
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Xpress 标签
<400> 18
Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Isopeptag
<400> 19
Thr Asp Lys Asp Met Thr Ile Thr Phe Thr Asn Lys Lys Asp Ala Glu
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Spy标签
<400> 20
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Snoop标签
<400> 21
Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys
1 5 10
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<211> 264
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> eGFP C70M S147C
<400> 22
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gly Ser Ile Gln Met Val Ser Lys Gly Glu Glu
20 25 30
Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val
35 40 45
Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
50 55 60
Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro
65 70 75 80
Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Met
85 90 95
Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser
100 105 110
Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp
115 120 125
Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr
130 135 140
Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly
145 150 155 160
Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Cys His Asn Val
165 170 175
Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys
180 185 190
Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr
195 200 205
Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn
210 215 220
His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys
225 230 235 240
Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr
245 250 255
Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
260
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 凝胶内胰蛋白酶消化和标记的eGFP的串联质谱分析
<400> 23
Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Cys Pro Val His Asn Val Tyr Ile Met Ala
1 5 10 15
Asp Lys

Claims (98)

1.一种制备式(III)化合物的方法，该方法包括以下步骤：
使式(I)化合物
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X表示/>
Y代表O、NR2、S或键；
R1表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
R2表示H或C1-C8-烷基；
R3表示H或C1-C8-烷基；
R4表示H或C1-C8-烷基；以及
Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并且包含基团其中/>表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；
与式(II)的含硫醇分子进行反应
其中代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；
得到式(III)化合物
其中
当式(I)化合物中的代表三键时，/>代表双键；或
当式(I)化合物中的代表双键时，/>代表键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>以及
R1、R3、R4、Y和Z如上所定义。
2.根据权利要求1所述的方法，其中代表三键；V不存在；X表示R3-C；R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3为H，和/>代表双键。
3.根据权利要求1所述的方法，其中代表双键；V代表H或C1-C8-烷基，优选V是H；X代表/>R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3为H；R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4是H；和/>代表键。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，/>如前述权利要求中任一项所定义；以及
Q是包含至少三个主链原子和碳-碳双键的部分，其中至少一个主链原子选自S、O或N；其中任选地，连接子设置在和Q之间。
5.根据权利要求4所述的方法，其中Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和/>如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
6.根据权利要求5所述的方法，其中Z为R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H，且/>如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其进一步包括式(I)化合物的制备，所述制备包括：
使式(IV)的化合物
其中R1、R5、V、X和Y如前述权利要求中任一项所定义，
与反应以形成式(I)的化合物，其中G和/>如前述权利要求中任一项所定义；优选地，G是S；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，并且/>如前述权利要求中任一项所定义；以及
Q是含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分；其中任选地，连接子设置在和Q之间。
9.根据权利要求8所述的方法，其中Z选自
烷基，优选R5是H；R6为C1-C8-烷基，和如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
10.根据权利要求9所述的方法，其中Z是优选Z为
R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H；和如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其进一步包括式(I)化合物的制备，所述制备包括：
使式(IV)的化合物
其中R1、R5、V、X和Y如前述权利要求中任一项所定义，与优选与/>反应，以形成式(I)的化合物，其中/>如前述权利要求中任一项所定义；R6为C1-C8-烷基；优选地，所述反应在催化剂例如铜催化剂或钌催化剂的存在下进行；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，/>如前述权利要求中任一项所定义；以及
Q是包含与式(I)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分；或
Q是包含与式(I)中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分；
其中任选地，连接子设置在和Q之间。
13.根据权利要求12所述的方法，其中Z是或其中Z是/>
其中如前述权利要求中任一项所定义；
其中任选地，连接子设置在和Q之间。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其进一步包括式(I)化合物的制备，所述制备包括：
使式(IV)的化合物
其中R1、V、X和Y如前述权利要求中任一项所定义，R5是H，
与反应，其中L为卤素(I、Br、Cl，优选I或Br，更优选I)或O-三氟甲磺酸酯(O-triflate)，以形成式(I)化合物；优选地，所述反应在钯催化剂、铜催化剂和碱的存在下进行；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中Y为O。
16.根据前述权利要求1至18中任一项所述的方法，其中R1选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。
17.根据权利要求16所述的方法，其中R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为/>更优选其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中
代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物(linker-drugconjugate)、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
19.根据权利要求18所述的方法，其中表示连接子、药物或连接子-药物偶联物。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸或小分子。
21.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中
代表抗体和
代表连接子、药物或连接子-药物偶联物。
22.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中代表氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物(solid support)结合；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
23.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，表示氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中，所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合。
24.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述和所述在相同的分子中。
25.一种制备抗体分子的偶联物的方法，所述方法包括：
-在还原剂的存在下还原抗体分子的至少一个二硫桥；以及
-使所述抗体分子与式(IV*)的化合物反应
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；或
当是双键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；以及
R1、R3、R4、R5、Y和Z如前述权利要求中任一项所定义，
形成包含至少一个式(V)部分的抗体分子的偶联物
其中SA和SB各自为抗体分子链的硫原子；
当式(IV*)化合物中的表示三键时，/>表示双键；或
当式(IV*)的化合物中的表示双键时，/>表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；以及
其中R1、R3、R4、R5、Y和Z如前述权利要求中任一项所定义。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体分子选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体和分离的抗体。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述还原剂选自三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、连二亚硫酸钠、硫代硫酸钠和亚硫酸钠；优选地，所述还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中表示三键；V不存在；X表示R3-C；R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；R5代表H或C1-C8-烷基，优选R5是H；和/>代表双键。
29.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中表示双键；V代表H或C1-C8-烷基，优选V是H；X表示/>R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4是H；R5代表H或C1-C8-烷基，优选R5是H；和/>代表键。
30.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中表示/>其中/>表示与磷的连接点；Y表示O、NR2、S或键；R1代表任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；和R2代表H或C1-C8-烷基。
31.根据权利要求30所述的方法，其中Y是O。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中R1选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。
33.根据权利要求32所述的方法，其中R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为/>更优选其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。
34.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中R1表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
35.根据权利要求34所述的方法，其中R1表示连接子、荧光团、或连接子-荧光团偶联物。
36.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中表示Z；Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包括基团/>其中/>表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
37.根据权利要求36所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，/>如前述权利要求中任一项所定义；以及
Q是包含至少三个主链原子和碳-碳双键的部分，其中所述主链原子中至少一个选自S、O或N；其中任选地，连接子设置在和Q之间。
38.根据权利要求37所述的方法，其中Z是RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和/>如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
39.根据权利要求38所述的方法，其中Z为RX为H或C1-C8-烷基，优选RX为H，和/>如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
40.根据权利要求36所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，/>如前述权利要求中任一项所定义；以及
Q是含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分；其中任选地，连接子设置在和Q之间。
41.根据权利要求40所述的方法，其中Z选自
其中RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H；R6为C1-C8-烷基，和如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
42.根据权利要求41所述的方法，其中Z是优选Z为
RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H，和如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
43.根据权利要求36所述的方法，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，/>如前述权利要求中任一项所定义；以及
Q是包含与式(IV*)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分；或
Q为包含与式(IV*)中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分；
其中任选地，连接子设置在和Q之间。
44.根据权利要求43所述的方法，其中Z是或其中Z是/>
其中如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
45.根据权利要求36至44中任一项所述的方法，其中表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
46.根据权利要求45所述的方法，其中表示连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。
47.根据权利要求36至44中任一项所述的方法，其中选自由小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
48.式(I)化合物
其中R1、V、X、Y和Z如前述权利要求中任一项所定义，特别是如权利要求1至24中任一项所定义。
49.根据权利要求48所述的方法，其中代表三键；V不存在；X表示v；和R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H。
50.根据权利要求48所述的方法，其中代表双键；V是H或C1-C8-烷基，优选V是H；X表示/>R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；和R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4是H。
51.式(III)的化合物
其中
表示双键；或
表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；/>
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>以及
R1、R3、R4、Y、Z和如前述权利要求中任一项所定义，特别是如权利要求1至24中任一项所定义。
52.根据权利要求51所述的方法，其中代表双键；V不存在；X表示R3-C；和R3是H或C1-C8-烷基，优选R3是H。
53.根据权利要求51所述的方法，其中代表键；V代表H或C1-C8-烷基，优选V是H；X表示/>R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4为H。
54.根据权利要求48至53中任一项所述的方法，其中Z是其中/>表示与磷的连接点，/>如前述项目中任何一项所定义；以及
Q是包含至少三个主链原子和碳-碳双键的部分，其中所述主链原子中至少一个选自S、O或N；其中任选地，连接子设置在和Q之间。
55.根据权利要求54所述的方法，其中Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和/>如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
56.根据权利要求55所述的方法，其中Z是R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H，和/>如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
57.根据权利要求48至53中任一项所述的方法，其中Z是其中/>表示与磷的连接点，/>如前述权利要求中任一项所定义；以及
Q是含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分；其中任选地，连接子设置在和Q之间。
58.根据权利要求57所述的方法，其中Z选自
其中R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H；R6为C1-C8-烷基，和如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
59.根据权利要求58所述的方法，其中Z是优选Z为
R5为H或C1-C8-烷基，优选R5为H，且如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
60.根据权利要求48至53中任一项所述的方法，其中Z是其中/>表示与磷的连接点，/>如前述权利要求中任一项所定义；以及
Q是包含与式(I)或式(III)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分；或
Q是包含与式(I)或式(III)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分；
其中任选地，连接子设置在和Q之间。
61.根据权利要求60所述的方法，其中Z是或其中Z是
其中如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。/>
62.根据权利要求48至61中任一项所述的方法，其中Y为O。
63.根据权利要求48至61中任一项所述的方法，其中R1选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。
64.根据权利要求63所述的方法，其中R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选R1为其中M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为/>更优选其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。/>
65.根据权利要求48至64中任一项所述的方法，其中表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
66.根据权利要求65所述的方法，其中表示连接子、药物或连接子-药物偶联物。
67.根据权利要求51至66中任一项所述的方法，其中，表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸或小分子。
68.根据权利要求51至65中任一项所述的方法，其中，
代表抗体和
代表连接子、药物或连接子-药物偶联物。
69.根据权利要求48至67中任一项所述的方法，其中表示氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合，其中任选地连接子设置在/>和Q之间。
70.根据权利要求51至67中任一项所述的方法，其中表示氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合。
71.式(IIIa)的化合物
其中
表示双键；或
表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>以及
R1、R3、R4、Y、Z和如前述权利要求中任一项所定义，特别是如权利要求1至24或48至70中任一项所定义。
72.式(IV)的化合物
其中R1、R5、V、X和Y如前述权利要求中任一项所定义，特别是如权利要求1至23中任一项所定义；和/或特别地如权利要求48至71中的任一项所定义。
73.式(IV*)的化合物
其中
表示三键或双键；
当是三键时，V不存在；或
当是双键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是三键时，X代表R3-C；
当是双键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与所述磷的连接点；或
表示Z；以及
R1、R3、R4、R5、Y和Z如前述权利要求中任一项所定义，特别是如权利要求25至47中任一项所定义。
74.根据权利要求73所述的方法，其中代表三键；V不存在；X表示R3-C；R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；和R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H。
75.根据权利要求73所述的方法，其中代表双键；V代表H或C1-C8-烷基，优选V是H；X表示/>R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4是H；和R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H。
76.一种抗体分子的偶联物，其包含至少一个式(V)部分的
其中SA和SB各自为所述抗体分子链的硫原子；
表示双键；或
表示键；
当是双键时，V不存在；或
当是键时，V表示H或C1-C8-烷基；
当是双键时，X表示R3-C；或
当是键时，X表示/>
代表/>其中/>表示与磷的连接点；或
表示Z；以及
R1、R3、R4、R5、Y和Z如前述权利要求中任一项所定义，特别是如权利要求25至47中任一项所定义。
77.根据权利要求76所述的抗体分子的偶联物，其中所述抗体分子选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体和分离的抗体。
78.根据权利要求77所述的抗体分子的偶联物，其中所述抗体分子是IgG，优选曲妥珠单抗(Trastuzumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)或布伦妥昔单抗(Brentuximab)；或其片段。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中代表双键；V不存在；X表示R3-C；R3为H或C1-C8-烷基，优选R3为H；和R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中代表键；V代表H或C1-C8-烷基，优选V是H；X表示/>R3代表H或C1-C8-烷基，优选R3是H；R4代表H或C1-C8-烷基，优选R4是H；和R5是H或C1-C8-烷基，优选R5是H。
81.根据权利要求73至75中任一项所述的化合物，或根据权利要求76至80中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中表示/>其中/>表示与磷的连接点；Y表示O、NR2、S或键；R1代表任选取代的脂族或任选取代的芳族残基；和R2代表H或C1-C8-烷基。
82.根据权利要求81所述的化合物，或根据权利要求81所述的抗体分子的偶联物，其中Y是O。
83.根据权利要求81或82所述的化合物，或根据权利要求81或82所述的抗体分子的偶联物，其中R1选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；优选其中在每种情况下Y是O。
84.根据权利要求83所述的化合物，或根据权利要求170所述的抗体分子的偶联物，其中R1选自乙基；任选被(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；羟基-(C1-C8-烷氧基)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；更优选R1为M为氢、甲基、乙基、丙基或丁基，更优选为氢或甲基，并且其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选为3、4或5，还更优选为4；任选被荧光团取代的C1-C8-烷基，更优选R1为/>其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选4、5或6，还更优选5，或更优选R1为
其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选3、4或5，还更优选4；C2-C8-炔基，优选/>其中n是1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；或优选R1为其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28，优选为1、2或3，更优选为2；或优选R1为更优选/>其中m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，更优选2、3或4，还更优选3，n为1、2、3、4或5，优选1、2或3，更优选1；优选其中在每种情况下Y是O。
85.根据权利要求81或82所述的化合物，或根据权利要求81或82所述的抗体分子的偶联物，其中R1表示氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5元或6元杂环体系；其中任选地，连接子设置在R1和Y之间。
86.根据权利要求85所述的化合物，或根据权利要求85所述的抗体分子的偶联物，其中R1表示连接子、荧光团或连接子-荧光团偶联物。
87.根据权利要求73至75中任一项所述的化合物，或根据权利要求73至75中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中表示Z；Z表示通过碳原子与磷结合的残基，并包括基团/>其中/>表示任选取代的脂族或任选取代的芳族残基。
88.根据权利要求87所述的化合物，或根据权利要求180所述的抗体分子的偶联物，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，/>如前述权利要求中任一项所定义；以及Q是包含至少三个主链原子和碳-碳双键的部分，其中所述主链原子的至少一个选自S、O或N；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
89.根据权利要求88所述的化合物，或根据权利要求181所述的抗体分子的偶联物，其中Z是RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H；G是S、O或NR10，其中R10是H或C1-C8-烷基，优选R10是H；和/>如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
90.根据权利要求89所述的化合物，或根据权利要求185所述的抗体分子的偶联物，其中Z是RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H，且/>如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
91.根据权利要求87所述的化合物，或根据权利要求180所述的抗体分子的偶联物，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，/>如前述权利要求中任一项所定义；以及Q是含有1、2或3个独立地选自N、O或S的杂原子的五元或六元杂环部分；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
92.根据权利要求91所述的化合物，或根据权利要求184所述的抗体分子的偶联物，其中Z选自
/>
其中RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H；R6为C1-C8-烷基，和/>如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
93.根据权利要求92所述的化合物，或根据权利要求185所述的抗体分子的偶联物，其中Z是优选Z是/>
RX是H或C1-C8-烷基，优选RX是H，和如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
94.根据权利要求87所述的化合物，或根据权利要求87所述的抗体分子的偶联物，其中Z为其中/>表示与磷的连接点，/>如前述权利要求中任一项所定义；以及Q是含有与式(IV*)化合物或式(V)化合物中的磷结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的苯基的部分，或Q是包含与式(IV*)中的磷或式(V)的部分结合的碳-碳三键和与所述碳-碳三键结合的任选取代的碳-碳双键的部分；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
95.根据权利要求94所述的化合物，或根据权利要求94所述的抗体分子的偶联物，其中Z是或其中Z是/>
其中如前述权利要求中任一项所定义；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
96.根据权利要求87至95中任一项所述的化合物，或根据权利要求87至95中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中，其中代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、蛋白质标签、荧光团如CY5、荧光素或EDANS、生物素、连接子、药物、连接子-药物偶联物、连接子-荧光团偶联物、聚合物、小分子、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环体系；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。
97.根据权利要求96所述的化合物，或根据权利要求96所述的抗体分子的偶联物，其中表示连接子、荧光团、或连接子-荧光团偶联物。
98.根据权利要求87至95中任一项所述的化合物，或根据权利要求87至95中任一项所述的抗体分子的偶联物，其中选自小分子；任选取代的C1-C8-烷基，优选甲基、乙基、丙基或丁基，更优选甲基或乙基，还更优选乙基；任选取代的C2-C8-烯基；和任选取代的C2-C8-炔基；其中任选地，连接子设置在/>和Q之间。/>
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