JP2011142911A - Rnaを切断するオリゴリボヌクレオチドおよびリボヌクレアーゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】dsRNaseを活性化する、2’−ペントリボフラノシルヌクレオシドのサブ配列を有するオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドを含むオリゴマー性化合物。さらに、哺乳動物リボヌクレアーゼ、すなわちRNAを分解する酵素(dsRNase)、およびそのようなリボヌクレアーゼのための基質。上記化合物は、相補的核酸鎖に対する結合親和性、ならびにヌクレアーゼ耐性を増加させるための置換基を含むことができ、蛋白質の発現を調節するオリゴヌクレオチド療法や、その適合疾患の診断等のために有用である。
【選択図】なし
Description
本出願は、1996年6月6日出願の米国出願第08/659440号の一部継続である。
発明の分野
本発明は、標的RNA鎖の鎖切断に有用な、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドを含めたオリゴマー化合物の合成および使用に関する。本発明に包含されるのは、修飾された糖、塩基またはリン酸基主鎖を有するオリゴリボヌクレオチド、並びに非リン酸基主鎖によって互いに結合した標準的な糖および塩基または修飾された糖および塩基を有するオリゴリボヌクレオシドである。本発明に更に包含されるのは、リン酸基かまたは非リン酸基の混合主鎖を有するキメラのオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドである。本発明に更に包含されるのは、哺乳動物リボヌクレアーゼ、すなわち、RNAを分解する酵素である。このようなリボヌクレアーゼは、本明細書中においてdsRNアーゼと称され、この「ds」は、若干の二本鎖RNA基質に対するRNアーゼの特異性を示す。本発明のオリゴリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオシド、リボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ基質は、治療薬、診断薬におよび研究用試薬として有用である。
オリゴヌクレオチドは、一本鎖DNAまたはRNA分子に対してハイブリッド形成することが知られている。ハイブリッド形成は、標的DNAまたはRNAの核塩基(nucleobases)に対するオリゴヌクレオチドの核塩基の配列特異的塩基対水素結合である。このような核塩基対は、互いに相補的であるといわれている。 オリゴヌクレオチドの相補性は、多数の細胞性標的の阻害に用いられてきた。このような相補的オリゴヌクレオチドは、一般的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドであると記載されている。これらの研究の結果を記載している種々の論評が公表されており、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法の発達(Progress In Antisense Oligonucleotide Therapeutics),Crooke,S.T.および Bennett,C.F.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,1996,36,107-129 が含まれる。これらオリゴヌクレオチドは、極めて強力な研修手段および診断薬であることが判明した。更に、有効であることが判った若干のオリゴヌクレオチドは、現在、ヒト臨床試験中である。
本発明により、予め選択されたRNA標的に対して特異的にハイブリッド形成しうる、結合したリボヌクレオシドサブユニットのリンカー配列から形成されるオリゴマー化合物を提供する。それらオリゴマー化合物は、少なくとも第一セグメントおよび第二セグメントを有する。第一セグメントは、少なくとも一つのリボヌクレオシドサブユニットを包含し、これは、その薬物動態学的性質、すなわち、標的RNAに対するその結合特性の少なくとも一つを向上させるようにまたはその電荷を変更するように修飾されている。第二セグメントは、少なくとも4個の連続的リボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む。オリゴマー化合物のそれらサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対して安定化されているヌクレオシド間結合によって、直鎖状配列で互いに連結している。
理論に拘束されたくはないが、ここで、若干の化学修飾されたオリゴマー化合物の使用により、ヒト細胞を含めた真核生物細胞において、これら化合物と標的RNA鎖との予想外の相互作用に起因する若干の酵素活性を利用して、若干の酵素によって切断される二本鎖RNA様構造を形成することができると考えられる。従来、このような活性は、真核生物系において認識されても利用されてもいなかった。ここで、本発明のオリゴマー化合物は、それらが、標的とされたRNA部分を含む二本鎖構造を形成できる若干のRNAのような特徴を有し、そして引続き、この二本鎖構造は、細胞または試験溶液中において真核性dsRNアーゼ、すなわち、二本鎖RNアーゼ酵素によって分解されるということが見出された。T24ヒト膀胱癌細胞を代表的な真核生物細胞系として用いると、この活性は、核および細胞質両方の部分に同様のレベルで存在することが示された。
非経口投与用製剤には、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤も含有しうる滅菌水溶液が含まれうる。
オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシド合成用アミダイト
2’−O−メチルヌクレオシドアミダイトおよび2’−OH(2’−t−ブチルジメチルシリル誘導体として遮断された)ヌクレオシドアミダイトは、Glen Research,スターリング,VAから入手可能である。他の2’−O−アルキル置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5,506,351号、同第5,466,786号または同第5,514,786号で記載されているように製造される。シクロブチル糖代理化合物は、本明細書中に援用される米国特許第5,359,044号で記載されているように製造される。ピロリジン糖代理物は、本明細書中に援用される米国特許第5,519,134号で記載されているように製造される。モルホリノ糖代理物は、本明細書中に援用される米国特許第5,142,047号および同第5,235,033号、並びに他の関連特許開示で記載されているように製造される。N−2置換プリンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5,459,255号で記載されているように製造される。3−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5,457,191号で記載されているように製造される。5,6−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5,614,617号で記載されているように製造される。5−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5,484,908号で記載されているように製造される。
実施例2
2’−O−(メトキシエチル)ヌクレオシドアミダイト
2’−O−エチル−O−メチル置換ヌクレオシドアミダイトを、次の実施例2−a〜2−hのようにまたは代わりに、Martin,P.,Helvetica Chimica Acta,1995,78,486-504 の方法によって製造する。
実施例2−a
2,2’−アンヒドロ[1−(β−D−アラビノフラノシル)−5−メチルウリジン]
5−メチルウリジン(リボシルチミン,Yamasa,銚子,日本によって商業的に入手可能)(72.0g,0.279M)、ジフェニルカーボネート(90.0g,0.420M)および重炭酸ナトリウム(2.0g,0.024M)を、DMF(300mL)に対して加えた。その混合物を撹拌しながら加熱して還流させ、発生した二酸化炭素ガスを制御方式で放出させた。1時間後、その薄黒い溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップをジエチルエーテル(2.5L)中に撹拌しながら注いだ。その生成物はガムを形成した。エーテルを傾瀉し、そしてその残留物を最小量のメタノール(約400mL)中に溶解させた。その溶液を新たなエーテル(2.5L)中に注いで、堅いガムを生成した。エーテルを傾瀉し、そしてそのガムを真空オーブン(1mmHgで60℃、24時間)中で乾燥させて固体を与え、これを破砕して痰黄褐色粉末(57g,85%粗収率)にした。NMRスペクトルは、フェノールをそのナトリウム塩として混入した(約5%)構造と一致した。その材料をそのままで更に別の反応に用いた(またはそれを、カラムクロマトグラフィーによって、メタノールの酢酸エチル中の勾配(10〜25%)を用いて更に精製して、白色固体,mp222〜4℃を与えることができる)。
実施例2−b
2’−O−メトキシエチル−5−メチルウリジン
2,2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(195g,0.81M)、トリス(2−メトキシエチル)ボレート(231g,0.98M)および2−メトキシエタノール(1.2L)を、2Lステンレス鋼製圧力容器に対して加え、そして160℃で予熱された油浴中に入れた。155〜160℃で48時間加熱した後、その容器を開け、そして溶液を蒸発乾固させ、そしてMeOH(200mL)で研和した。その残留物を熱アセトン(1L)中に懸濁させた。不溶性塩を濾過し、アセトン(150mL)で洗浄し、そして濾液を蒸発させた。残留物(280g)をCH3CN(600mL)中に溶解させ、そして蒸発させた。シリカゲルカラム(3kg)を、0.5%Et3NHを含有するCH2Cl2/アセトン/MeOH(20:5:3)中で充填した。残留物をCH2Cl2(250mL)中に溶解させ、そしてカラム上に加える前にシリカ(150g)に吸収させた。その生成物を充填用溶媒で溶離して、160g(63%)の生成物を与えた。追加の材料は、不純画分を再生することによって得られた。
実施例2−c
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン
2’−O−メトキシエチル−5−メチルウリジン(160g,0.506M)を、ピリジン(250mL)と一緒に共蒸発させ、そして乾燥した残留物をピリジン(1.3L)中に溶解させた。塩化ジメトキシトリチルの第一アリコート(94.3g,0.278M)を加え、そしてその混合物を室温で1時間撹拌した。塩化ジメトキシトリチルの第二アリコート(94.3g,0.278M)を加え、そしてその反応を更に1時間撹拌した。次に、メタノール(170mL)を加えて、反応を停止させた。HPLCは、約70%生成物の存在を示した。その溶媒を蒸発させ、そしてCH3CN(200mL)で研和した。その残留物をCHCl3(1.5L)中に溶解させ、そして2×500mLの飽和NaHCO3および2×500mLの飽和NaClで抽出した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして蒸発させた。275gの残留物が得られた。その残留物を、0.5%Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン(5:5:1)で充填され且つ溶離されるシリカゲルカラム3.5kg上で精製した。純粋画分を蒸発させて、164gの生成物を与えた。追加の約20gを不純画分から得て、183g(57%)の全収量を与えた。
実施例2−d
3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン(106g,0.167M)、DMF/ピリジン(562mLのDMFおよび188mLのピリジンから製造された3:1混合物750mL)および無水酢酸(24.38mL,0.258M)を一緒にし且つ室温で24時間撹拌した。その反応をtlcによって、MeOHの添加でtlc試料を最初に急冷することによって監視した。tlcによって判断される反応の完了時に、MeOH(50mL)を加え、そしてその混合物を35℃で蒸発させた。その残留物をCHCl3(800mL)中に溶解させ、そして2×200mLの飽和重炭酸ナトリウムおよび2×200mLの飽和NaClで抽出した。水層を200mLのCHCl3で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ且つ蒸発させて、122gの残留物(約90%生成物)を与えた。その残留物をシリカゲルカラム3.5kg上で精製し且つEtOAc/ヘキサン(4:1)を用いて溶離した。純生成物画分を蒸発させて、96g(84%)を生成した。追加の1.5gは、後の画分から回収された。
実施例2−e
3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−4−トリアゾールウリジン
3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルウリジン(96g,0.144M)をCH3CN(700mL)中に溶解させることによって第一溶液を製造し、取っておいた。トリエチルアミン(189mL,1.44M)を、トリアゾール(90g,1.3M)のCH3CN(1L)中溶液に対して加え、−5℃まで冷却し、そしてオーバーヘッドスターラーを用いて0.5時間撹拌した。0〜10℃で維持されたその撹拌溶液に対して、POCl3を30分間にわたって滴加し、そして得られた混合物を更に2時間撹拌した。第一溶液を、その溶液に対して45分間にわたって滴加した。得られた反応混合物を冷室内で一晩貯蔵した。その反応混合物から塩を濾過し、そしてその溶液を蒸発させた。残留物をEtOAc(1L)中に溶解させ、そして不溶性固体を濾過によって除去した。その濾液を、1×300mLのNaHCO3および2×300mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ且つ蒸発させた。その残留物をEtOAcで研和して、標題化合物を与えた。
実施例2−f
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン
3’−O−アセチル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−4−トリアゾールウリジン(103g,0.141M)のジオキサン(500mL)およびNH4OH(30mL)中溶液を室温で2時間撹拌した。そのジオキサン溶液を蒸発させ、そして残留物をMeOH(2×200mL)と共沸させた。その残留物をMeOH(300mL)中に溶解させ、そして2リットルステンレス鋼製圧力容器に移した。NH3ガスで飽和したMeOH(400mL)を加え、そしてその容器を100℃まで2時間加熱した(tlcは完全な転化を示した)。容器内容物を蒸発乾固させ、そして残留物をEtOAc(500mL)中に溶解させ且つ飽和NaCl(200mL)で1回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そしてその溶媒を蒸発させて、標題化合物85g(95%)を与えた。
実施例2−g
N 4 −ベンゾイル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン
2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン(85g,0.134M)をDMF(800mL)中に溶解させ、そして無水安息香酸(37.2g,0.165M)を撹拌しながら加えた。3時間撹拌した後、tlcは、反応が約95%完了したことを示した。その溶媒を蒸発させ、そして残留物をMeOH(200mL)と共沸させた。その残留物をCHCl3(700mL)中に溶解させ、そして飽和NaHCO3(2×300mL)および飽和NaCl(2×300mL)で抽出し、MgSO4上で乾燥させ且つ蒸発させて、残留物(96g)を与えた。その残留物を、シリカカラム1.5kg上において0.5%Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン(1:1)を溶離溶媒として用いてクロマトグラフィーによって分離した。純生成物画分を蒸発させて、標題化合物90g(90%)を与えた。
実施例2−h
N 4 −ベンゾイル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン−3’−アミダイト
N4−ベンゾイル−2’−O−メトキシエチル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチルシチジン(74g,0.10M)をCH2Cl2(1L)中に溶解させた。テトラゾールジイソプロピルアミン(7.1g)および2−シアノエトキシ−テトラ(イソプロピル)ホスファイト(40.5mL,0.123M)を、窒素雰囲気下において撹拌しながら加えた。得られた混合物を室温で20時間撹拌した(tlcは、反応が95%完了したことを示した)。その反応混合物を、飽和NaHCO3(1×300mL)および飽和NaCl(3×300mL)で抽出した。水性洗浄物をCH2Cl2(300mL)で逆抽出し、そしてその抽出物を一緒にし、MgSO4上で乾燥させ且つ濃縮した。得られた残留物を、シリカカラム1.5kg上においてEtOAc\ヘキサン(3:1)を溶離溶媒として用いてクロマトグラフィーによって分離した。純生成物画分を一緒にして、標題化合物90.6g(87%)を与えた。
実施例3
長鎖、すなわち(C 20 )置換ヌクレオシドアミダイトの製造
長鎖、例えば、C20置換基を2’位に有するヌクレオシドアミダイトの合成を、実施例3−a〜3−cで示す。
実施例3−a
2,6−ジアミノ−9−(2−O−オクタデシル−β−D−リボフラノシル)プリンの合成
DMF(1L)中の2,6−ジアミノ−9−(β−D−リボフラノシル)プリン(50g,180ミリモル)および水素化ナトリウム(7g)を加熱して2時間沸騰させた。ヨードオクタデカン(100g)を150℃で加え、そしてその反応混合物をRTまで冷却させた。その反応混合物をRTで11日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、そして残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。その生成物を5%MeOH/CH2Cl2で溶離した。適当な画分を蒸発させて、生成物(11g)を生成した。
1H NMR(DMSO−d6)δ0.84(t,3,CH2);1.22(m,32,O−CH2−CH2−(CH2)16);1.86(m,2,O−CH2−CH2);3.25(m,2,O−CH2);3.93(d,1,4’H);4.25(m,1,3’H);4.38(t,1,2’H);5.08(d,1,3’−OH);5.48(t,1,5’−OH);5.75(s,2,6−NH2);5.84(d,1,1’−H);6.8(s,2,2−NH2);および7.95(s,1,8−H)。
実施例3−b
2’−O−オクタデシルグアノシンの合成
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(50mL,pH7.4)、0.1Mトリス緩衝液(1000mL,pH7.4)およびDMSO(1000mL)中の2,6−ジアミノ−9−(2−O−オクタデシル−β−D−リボフラノシル)プリン(10g)を、RTにおいてアデノシンデアミナーゼ(1.5g)で処理した。3日目、5日目および7日目に、アデノシンデアミナーゼの追加のアリコート(それぞれ、500mg,880mgおよび200mg)を加えた。その反応を合計9日間撹拌し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、生成物(2g)を生じた。分析用試料は、MeOHから再結晶された。
1H NMR(DMSO−d6)δ0.84(t,3,CH3),1.22[s,32,O−CH2−CH2−(CH2)16],5.07(m,2,3’−OHおよび5’−OH);5.78(d,1,1’−H);6.43(s,2,NH2),7.97(s,1,8−H)および10.64(s,1,NH2)。
C28H49N5O5の分析計算値:C,62.80;H,9.16;N,12.95。実測値:C,62.54;H,9.18;N,12.95。
実施例3−c
N 2 −イソブチリル−2’−O−オクタデシルグアノシンの合成
ピリジン(150mL)中の2’−O−オクタデシルグアノシン(1.9g)を氷浴中で冷却し、そして塩化トリメチルシリル(2g,5当量)および塩化イソブチリル(2g,5当量)で処理した。その反応混合物を4時間撹拌し、その時間中にそれを室温まで暖めた。その溶液を冷却し、水を加え(10mL)、そして更に30分間撹拌した。濃水酸化アンモニウム(10mL)を加え、そしてその溶液を真空中で濃縮した。その残留物をシリカゲルクロマトグラフィー(3%MeOH/EtOAcで溶離された)によって精製して、生成物1.2gを生じた。
1H NMR(DMSO−d6)δ0.85(t,3,CH3),1.15(m,38,O−CH2CH2(CH2)16,CH(CH3)2),2.77(m,1,CH(CH3)2),4.25(m,2,2’−H)および3’−H);5.08(t,1,5’−OH),5.12(d,1,3’−OH),5.87(d,1,1’−H),8.27(s,1,8−H),11.68(s,1,NH2)および12.08(s,1,NH2)。
C32H55N5O6の分析計算値:C,63.47;H,9.09;N,11.57。実測値:C,63.53;H,9.20;N,11.52。
この生成物をオリゴリボヌクレオチド中に包含させる前に、それを、1994年2月3日公開の国際公開第WO94/02501号で記載された手順にしたがって、N2−イソブチリル−5’−ジメトキシトリチル−2’−O−オクタデシルグアノシンに変換した後、ホスホルアミダイトに変換した。
実施例4
2’−フルオロヌクレオシドアミダイト
2’−フルオロ置換ヌクレオシドアミダイトを、次の実施例4−a〜4−dのようにまたは代わりに、Kawasaki ら,J.Med.Chem.,1993,36,831-841 の方法によって製造する。
実施例4−a
i. N 6 −ベンゾイル−9−β−D−アラビノフラノシルアデニン。
ii. N 6 −ベンゾイル−9−[3’,5’−ジ−O−テトラヒドロピラン−2−イル)−β−D−アラビノフラノシル]アデニン。
iii. N 6 −ベンゾイル−9−[2’−O−トリフルオロメチルスルホニル−3’,5’−ジ−O−テトラヒドロピラン−2−イル)−β−D−アラビノフラノシル]アデニン。
iv. N 6 −ベンゾイル−9−[2’−フルオロ−3’,5’−ジ−O−テトラヒドロピラン−2−イル)−β−D−アラビノフラノシル]アデニン。
v. N 6 −ベンゾイル−9−(2’−フルオロ−β−D−リボフラノシル)アデニン。
vi. N 6 −ベンゾイル−9−[2’−フルオロ−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−β−D−リボフラノシル]アデニン。
vii. N 6 −ベンゾイル−[2’−フルオロ−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)]−アデノシン−3’−O−N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホルアミダイト。
実施例4−b
2’−デオキシ−2’−フルオロ−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−ウリジン3’−O−(N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホルアミダイト)。
実施例4−c
2’−デオキシ−2’−フルオロ−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−シチジン−3’−O−(N,N−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホルアミダイト)。
実施例4−d
i. 9−(3’,5’−[1,1,3,3−テトライソプロピルジシロクス−1,3−ジイル]−β−D−アラビノフラノシル)グアニン。
ii. N 2 −イソブチリル−9−(2’−O−イソブチリル−3’,5’−[1,1,3,3−テトライソプロピルジシロクス−1,3−ジイル]−β−D−アラビノフラノシル)グアニン。
iii. N 2 −イソブチリル−9−(2’−O−イソブチリル−β−D−アラビノフラノシル)グアニン。
iv. N 2 −イソブチリル−9−(2’−O−イソブチリル−3’,5’−ジ−O−[テトラヒドロピラン−2−イル]−β−D−アラビノフラノシル)グアニン。
v. N 2 −イソブチリル−9−(3’,5’−ジ−O−[テトラヒドロピラン−2−イル]−β−D−アラビノフラノシル)グアニン。
vi. N 2 −イソブチリル−9−(3’,5’−ジ−O−[テトラヒドロピラン−2−イル]−2’−O−トリフルオロメチルスルホニル−β−D−アラビノフラノシル)グアニン。
vii. N 2 −イソブチリル−9−(2’−デオキシ−2’−フルオロ−3’,5’−ジ−O−[テトラヒドロピラン−2−イル]−2’−O−トリフルオロメチルスルホニル−β−D−リボフラノシル)グアニン。
viii. N 2 −イソブチリル−9−(2’−デオキシ−2’−フルオロ−β−D−リボフラノシル)グアニン。
ix. N 2 −イソブチリル−9−(2’−デオキシ−2’−フルオロ−5’−O−[4,4−ジメトキシトリチル]−β−D−リボフラノシル)グアニン。
x. N 2 −イソブチリル−9−(2’−デオキシ−2’−フルオロ−5’−O−[4,4−ジメトキシトリチル]−グアノシン−3’−O−N,N−ジイソプロピル−β−D−シアノエチルホスホルアミダイト。
実施例5
糖および塩基フラグメント上に置換を有するヌクレオシドアミダイトを、実施例5−a〜5−kで示す。
実施例5−a
他のヌクレオシドアミダイト
i. 1−(2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン
2,2’−アンヒドロ−[1−(β−D−アラビノフラノシル)−5−メチルウリジン](71g,0.32ミリモル)(実施例2−aより)およびジオキサン(700mL)を、2リットルステンレス鋼製ボンベ中に入れ、そしてHF/ピリジン(100g,70%)を加えた。その混合物を120〜125℃で16時間加熱した後、氷浴中で冷却した。そのボンベを開け、そして混合物を3リットルの氷上に注いだ。この混合物に対して、炭酸水素ナトリウム(300g)および飽和重炭酸ナトリウム溶液(400mL)を注意深く加えた。その混合物を濾過し、そしてその濾過ケーキを水(2×100mL)およびメタノール(2×500mL)で洗浄した。その水およびメタノール洗液を真空中で濃縮乾固させた。メタノール(200mL)および粗シリカゲル(80g)をその残留物に対して加え、そしてその混合物を真空中で濃縮乾固させた。得られた材料をシリカゲル上で濃縮し、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、酢酸エチルおよびメタノールの勾配(100:0〜85:15)を用いて精製した。生成物画分のプールおよび濃縮は、標題化合物36.9g(51%,2段階収率)を与えた。
ii. 1−(5−O−ジメトキシトリチル−2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン
1−(2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン(31.15g,0.12モル)をピリジン(150mL)中に懸濁させ、そして塩化ジメトキシトリチル(44.62g,0.12モル)を加えた。その混合物を密封フラスコ中で2時間撹拌した後、メタノール(30mL)を加えた。その混合物を真空中で濃縮し、そして得られた残留物を飽和重炭酸塩溶液(500mL)と酢酸エチル(3×500mL)とに分配した。酢酸エチル部分をプールし且つ硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮して粘稠な油状物にした。その油状物をジクロロメタン(100mL)中に溶解させ、シリカゲルカラムに対して加え、そして60/39/1〜75/24/1まで増加する酢酸エチル:ヘキサン:トリエチルアミンで溶離した。生成物画分をプールし且つ真空中で濃縮して、標題化合物59.9g(89%)を泡状物として与えた。
iii. 1−(5−O−ジメトキシトリチル−2−フルオロ−3−O−N,N−ジイソプロピルアミノ−2−シアノエチルホスファイト−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン
1−(5−O−ジメトキシトリチル−2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン(59.8g,0.106モル)を、ジクロロメタンおよび2−シアノエチル N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(46.9mL,0.148モル)中に溶解させ、そしてジイソプロピルアミンテトラゾリド(5.46g,0.3当量)を加えた。その混合物を16時間撹拌した。その混合物を飽和重炭酸ナトリウム(1L)で洗浄し、そしてその重炭酸塩溶液をジクロロメタン(500mL)で逆抽出した。合わせた有機層をブライン(1L)で洗浄し、そしてそのブラインをジクロロメタン(100mL)で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して約200mLの容量にした。得られた材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによってヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン60/40/1を用いて精製した。生成物画分を真空中で濃縮し、アセトニトリル(500ml)中に溶解させ、濾過し、真空中で濃縮し、そして乾燥させて泡状物にした。その泡状物を細断し且つ恒量まで24時間乾燥させて、標題化合物68.2g(84%)を与えた。
1H NMR:(CDCl3)δ0.9−1.4(m,14H,4xCH3,2xCH),2.3−2.4(t,1H,CH2CN),2.6−2.7(t,1H,CH2CN),3.3−3.8(m,13H,2xCH3OAr,5’CH2,CH2OP,C−5 CH3),4.2−4.3(m,1H,4’),4.35−5.0(m,1H,3’),4.9−5.2(m,1H,2’),6.0−6.1(dd,1H,1’),6.8−7.4(m,13H,DMT),7.5−7.6(d,1H,C−6),8.8(bs,1H,NH)。
31P NMR(CDCl3);151.468,151.609,151.790,151.904。
iv. 1−(3’,5’−ジ−O−アセチル−2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン
実施例5−a−iの手順によって製造された1−(2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン(22.4g,92ミリモル,85%純度)を、ピリジン(2×150mL)と一緒に共沸させ、そしてピリジン(250mL)中に溶解させた。無水酢酸(55mL,0.58モル)を加え、そしてその混合物を16時間撹拌した。メタノール(50mL)を加え、そして撹拌を30分間続けた。その混合物を蒸発させてシロップにした。そのシロップを最小量のメタノール中に溶解させ、そしてシリカゲルカラム上に加えた。ヘキサン/酢酸エチル1:1を用いて生成物画分を溶離した。精製は、標題化合物19.0g(74%)を与えた。
実施例5−b
i. 4−トリアジン−1−(3’,5’−ジ−O−アセチル−2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン
1,2,4−トリアゾール(106g,1.53モル)をアセトニトリル(150mL)中に溶解させた後、トリエチルアミン(257mL,1.84モル)を溶解させた。その混合物を、氷浴を用いて0〜10℃に冷却した。POCl3(34.5mL,0.375モル)を、添加用漏斗によって徐々に加え、そしてその混合物を更に45分間撹拌した。別のフラスコ中で、1−(3’,5’−ジ−O−アセチル−2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン(56.9g,0.144モル)をアセトニトリル(150mL)中に溶解させた。その1−(3’,5’−ジ−O−アセチル−2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン含有溶液を、トリアゾール溶液に対してカニューレによって徐々に加えた。氷浴を除去し、そしてその反応混合物を室温まで1時間暖めた。アセトニトリルを真空中で除去し、そして残留物を飽和重炭酸ナトリウム溶液(400mL)とジクロロメタン(4×400mL)とに分配した。有機層を一緒にし且つ真空中で濃縮した。得られた残留物を酢酸エチル(200mL)中に溶解させ且つ固体の沈澱を開始させた。ヘキサン(300mL)を加え、そして更に固体を沈澱させた。その固体を濾過によって集め且つヘキサン(2×200mL)で洗浄し、そして真空中で乾燥させて63.5gを与え、これを、更に精製することなくそのまま用いた。
ii. 5−メチル−1−(2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)シトシン
4−トリアジン−1−(3’,5’−ジ−O−アセチル−2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)−チミン(75.5g,0.198モル)を、ステンレス鋼製ボンベ中のアンモニア(400mL)中に溶解させ、そして一晩密封した。そのボンベを冷却し且つ開け、そしてアンモニアを蒸発させた。メタノールを加えてその材料をフラスコに移し、そして約10容量のエチルエーテルを加えた。その混合物を10分間撹拌した後、濾過した。固体をエチルエーテルで洗浄し且つ乾燥させて、標題化合物51.7g(86%)を与えた。
iii. 4−N−ベンゾイル−5−メチル−1−(2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)シトシン
5−メチル−1−(2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)シトシン(54.6g,0.21モル)をピリジン(700mL)中に懸濁させ、そして無水安息香酸(70g,0.309モル)を加えた。その混合物を室温で48時間撹拌した。ピリジンを蒸発によって除去し、そしてメタノール(800mL)を加え、そしてその混合物を撹拌した。沈澱が形成され、これを濾過し、メタノール(4×50mL)で洗浄し、エーテル(3×100mL)で洗浄し、そして真空オーブン中において45℃で乾燥させて、標題化合物40.5gを与えた。その濾液を真空中で濃縮し、そして飽和メタノール性アンモニアをボンベ中において室温で一晩用いて処理した。その混合物を真空中で濃縮し、そして得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。再循環された出発物質を上記のように再度処理して、標題化合物を更に4.9g与え、合計45.4g(61%)の標題化合物を与えた。
iv. 4−N−ベンゾイル−5−メチル−1−(2−フルオロ−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)シトシン
4−N−ベンゾイル−5−メチル−1−(2−フルオロ−β−D−エリトロペントフラノシル)−シトシン(45.3g,0.124モル)を乾燥ピリジン250ml中に溶解させ、そして塩化ジメトキシトリチル(46.4g,0.137モル)を加えた。その反応混合物を室温で90分間撹拌し、そしてメタノール(20mL)を加えた。その混合物を真空中で濃縮し、そして酢酸エチル(2×1L)と飽和重炭酸ナトリウム(1L)とに分配した。酢酸エチル層を一緒にし、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして真空中で蒸発させた。得られた油状物をジクロロメタン(200mL)中に溶解させ、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル/ヘキサン/トリエチルアミン50:50:1を用いて精製した。生成物画分をプールし、真空中で濃縮して乾燥させて、標題化合物63.6g(76.6%)を与えた。
v. 4−N−ベンゾイル−5−メチル−1−(2−フルオロ−3−O−N,N−ジイソプロピルアミノ−2−シアノエチルホスファイト−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)シトシン
4−N−ベンゾイル−5−メチル−1−(2−フルオロ−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−シトシン(61.8g,92.8ミリモル)を、ジクロロメン(300mL)、2−シアノエチル N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(40.9mL,0.130モル)およびジイソプロピルアミンテトラゾリド(4.76g,0.3当量)と一緒に室温で17時間撹拌した。その混合物を飽和重炭酸ナトリウム(1L)で洗浄し、そしてその重炭酸塩溶液をジクロロメタン(500mL)で逆抽出した。合わせた有機層をブライン(1L)で洗浄し、そしてそのブラインをジクロロメタン(100mL)で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して約200mLの容量にした。得られた材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによってヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン60/40/1を用いて精製した。生成物画分を真空中で濃縮し、アセトニトリル(500ml)中に溶解させ、濾過し、真空中で濃縮し、そして乾燥させて泡状物にした。その泡状物を細断し且つ恒量まで24時間乾燥させて、標題化合物72.4g(90%)を与えた。
1H NMR:(CDCl3)δ1.17−1.3(m,12H,4xCH3),1.5−1.6(m,2H,2xCH),2.3−2.4(t,1H,CH2CN),2.6−2.7(t,1H,CH2CN),3.3−3.9(m,13H,2xCH3OAr,5’CH2,CH2OP,C−5 CH3),4.2−4.3(m,1H,4’),4.3−4.7(m,1H,3’),5.0−5.2(m,1H,2’),6.0−6.2(dd,1H,1’),6.8−6.9(m,4H,DMT),7.2−7.6(m,13H,DMT,Bz),7.82−7.86(d,1H,C−6),8.2−8.3(d,2H,Bz)。
31P NMR(CDCl3);bs,151.706;bs,151.941。
実施例5−c
i. 1−(2,3−ジ−O−ブチルスズ−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン
5−メチルウリジン(7.8g,30.2ミリモル)および酸化ジブチルスズ(7.7g,30.9ミリモル)を、メタノール(150mL)中に懸濁させ且つ加熱して16時間還流させた。その反応混合物を室温まで冷却し、濾過し、そしてその固体をメタノール(2×150mL)で洗浄した。得られた固体を乾燥させて、標題化合物12.2g(80.3%)を与えた。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。NMRは構造と一致した。
ii. 1−(2−O−プロピル−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン
1−(2,3−ジ−O−ブチルスズ−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン(5.0g,10.2ミリモル)およびヨードプロパン(14.7g,72.3ミリモル)を、DMF中において100℃で2日間撹拌した。その反応混合物を室温まで冷却し、濾過し、そして濃縮した。残留するDMFをアセトニトリルと一緒に共蒸発させた。残留物を乾燥した後、2.40g(78%)の標題化合物および3’−O−プロピル異性体を粗製混合物として得た。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。
iii. 1−(2−O−プロピル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン
粗製混合物としての1−(2−O−プロピル−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジンおよび3’−O−プロピル異性体(2.4g,8.4ミリモル)を、ピリジン(2×40mL)と一緒に共蒸発させ、そしてピリジン(60mL)中に溶解させた。その溶液をアルゴン下の室温で15分間撹拌し、そして塩化ジメトキシトリチル(4.27g,12.6ミリモル)を加えた。その混合物をtlcによって定期的に検査し、そして3時間で完了した。メタノール(10mL)を加え、そしてその混合物を10分間撹拌した。その反応混合物を真空中で濃縮し、そして得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、初めから終わりまで用いられる1%トリエチルアミンを含むヘキサン/酢酸エチル60:40を用いて精製した。適当な画分のプールおよび濃縮は、標題化合物1.32g(26%)を与えた。
iv. 1−(2−O−プロピル−3−O−N,N−ジイソプロピルアミノ−2−シアノエチルホスファイト−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン
1−(2−O−プロピル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン(50.0g,86ミリモル)、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(38mL,120ミリモル)およびジイソプロピルアミンテトラゾリド(4.45g,25.8ミリモル)をジクロロメタン(500mL)中に溶解させ且つ室温で40時間撹拌した。その反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液(2×400mL)およびブライン(1×400mL)で洗浄した。その水性層をジクロロメタンで逆抽出した。ジクロロメタン層を一緒にし、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル/ヘキサン40:60および1%トリエチルアミンを用いて精製した。適当な画分をプールし、濃縮し、そして高真空下で乾燥させて43g(67%)を与えた。
v. 1−(2−O−プロピル−3−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン
1−(2−O−プロピル−5−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン(10.0g,16.6ミリモル)をピリジン(50mL)中に溶解させ、そして無水酢酸(4.7ml,52.7ミリモル)を加えた。その反応混合物を18時間撹拌し、そして過剰の無水酢酸をメタノール(10mL)で中和した。その混合物を真空中で濃縮し、そして得られた残留物を酢酸エチル(150mL)中に溶解させた。その酢酸エチルを飽和NaHCO3(150mL)で洗浄し、そしてその飽和NaHCO3洗液を酢酸エチル(50mL)で逆抽出した。酢酸エチル層を一緒にし、そして真空中で濃縮して、白色泡状物11.3gを生成した。粗収率は100%を越え、そしてNMRは標題化合物の予想構造と一致した。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。
実施例5−d
i. 1−(2−O−プロピル−3−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−4−トリアゾロ−5−メチルピリミジン
トリアゾール(10.5g,152ミリモル)をアセトニトリル(120ml)およびトリエチルアミン(23mL)中に無水条件下で撹拌しながら溶解させた。得られた溶液をドライアイスアセトン浴中で冷却し、そしてオキシ塩化リン(3.9mL,41ミリモル)を5分間にわたって徐々に加えた。その混合物は、更に10分間撹拌されて、生成物形成を示す希薄なスラリーになった。1−(2−O−プロピル−3−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジン(11.2g,165ミリモル)をアセトニトリル(150mL)中に溶解させ、そして上記スラリーに対して加え、ドライアイスアセトン浴温度を維持した。その反応混合物を30分間撹拌した後、室温まで暖め且つ更に2時間撹拌した。その混合物を冷蔵庫中に0℃で18時間置いた後、取出し、そして室温まで暖めた。その混合物の酢酸エチル/ヘキサン1:1中のtlcは、出発物質の完全な転化を示した。その反応混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチル(300mL)中に再溶解させ、飽和重炭酸ナトリウム溶液(2×400mL)およびブライン(400mL)で抽出した。水性層を酢酸エチル(200mL)で逆抽出した。酢酸エチル層を一緒にし、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして真空中で濃縮した。粗収量は11.3g(95%)であった。NMRは標題化合物の予想構造と一致した。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。
ii. 1−(2−O−プロピル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルシチジン
1−(2−O−プロピル−3−O−アセチル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−4−トリアゾロ−5−メチルピリミジン(11.2g,16.1ミリモル)を、ドライアイスアセトン温度の100mLボンベ中の液体アンモニア(50ml)中に溶解させた。そのボンベを室温まで18時間暖めた後、ドライアイスアセトン温度まで再冷却した。ボンベ内容物をビーカーに移し、そしてメタノール(50mL)を加えた。その混合物を蒸発させてほぼ乾固させた。酢酸エチル(300mL)を加え、そして若干の固体を濾去した後、飽和重炭酸ナトリウム溶液(2×250mL)で洗浄した。酢酸エチル層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、前に濾去された固体と一緒にし、そして真空中で濃縮して、10.1gの材料を与えた。粗収率は100%を越え、そしてNMRは標題化合物の予想構造と一致した。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。
iii. 1−(2−O−プロピル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−4−N−ベンゾイル−5−メチルシチジン
1−(2−O−プロピル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルシチジン(7.28g,10.1ミリモル)および無水安息香酸(4.5g,20ミリモル)を、DMF(60ml)中に溶解させ且つ室温で18時間撹拌した。その反応混合物を真空中で濃縮し、そして酢酸エチル(300mL)中に再溶解させた。その酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液(2×400mL)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル/ヘキサン1:2および1%トリエチルアミンを用いて精製した。適当な画分をプールし、濃縮し、そして高真空下で乾燥させて5.1g(1−(2−O−プロピルジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−5−メチルウリジンで開始する4段階で59%)を与えた。
iv. 1−(2−O−プロピル−3−O−N,N−ジイソプロピルアミノ−2−シアノエチルホスファイト−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−4−N−ベンゾイル−5−メチルシチジン
1−(2−O−プロピル−5−O−ジメトキシトリチル−β−D−エリトロペントフラノシル)−4−N−ベンゾイル−5−メチルシチジン(5.0g,7ミリモル)、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(3.6mL,11.3ミリモル)およびジイソプロピルアミノテトラゾリド(0.42g,2.4ミリモル)をジクロロメタン(80mL)中に溶解させ且つ室温で40時間撹拌した。その反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液(2×40mL)およびブライン(1×40mL)で洗浄した。その水性層をジクロロメタンで逆抽出した。ジクロロメタン層を一緒にし、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル/ヘキサン40:60および1%トリエチルアミンを用いて精製した。適当な画分をプールし、濃縮し、そして高真空下で乾燥させて7.3g(98%)を与えた。
実施例5−e
i. 2’−O−メチル−5−メチルウリジン
方法1:
粗製2,2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(10.0g,0.0416モル)(実施例2−a)を、ステンレス鋼製ボンベ(100mL容量)中のメタノール(80mL)中に溶解させた。ホウ酸トリメチル(5.6mL,0.049モル)を加えた(注記1)。そのボンベを密封し且つ150℃の油浴中に入れ、そこで約5atmの圧力を生じさせた。40時間後、そのボンベを氷中で冷却し、開け、そしてその内容物を減圧下で濃縮して、12gの黄褐色泡状物にした。その粗製物のNMRは、出発物質中の不純物を混入した生成物並びに微量のチミンおよび出発物質と一致した(注記2)。その粗生成物をそのまま次の工程で用いた。
方法2:
純2,2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(1.0g,4.16ミリモル)およびホウ酸トリメチル(0.56mL,4.9ミリモル)を、ステンレス鋼製ボンベ(100mL)中のメタノール(20mL)中に溶解させた。そのボンベを150℃の油浴中に入れた。80時間後、TLCは、反応が概ね完了したことを示した。その溶媒を除去して白色泡状物を生じた。NMRは、93:7の生成物対出発物質比率を示し、他の不純物は認められなかった。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル中のメタノール勾配(0〜10%)を用いて精製して、純粋な生成物850mg(75%)およびまだ不純な生成物250mgを生じた。分析的に純粋な試料をNMR用に調製した。
1H NMR(DMSO−d6):δ1.79(s,3H,5−CH3),3.35(s,3H,OCH3),3.5−3.7(m,2H,H−5’),3.7−3.9(m,2H,H−3’,4’),4.15(m,1H,H−2’),5.17(m,2H,3’,5’−OH),5.87(d,J=5Hz,1H,H−1’),7.80(s,1H,H−6),11.37(br s,1H,N−H)。
C11H16N2O6(272.26)の分析計算値:C,48.52;H,5.92;N,10.29。実測値:C,48.56;H,5.88;N,10.22。
方法3:
方法2に記載した方法と同じ、ただし、30mgの炭酸水素ナトリウムが反応に加えられ(粗アンヒドロのナトリウム含量を一致させるため)、そのため反応が完了するのに24時間かかった。塩化アンモニウム(50mg)が塩基を中和するために加えられ、溶液を乾固させた。粗生成物のNMRは3種の重要でないヌクレオシド不純物(総計で約6%)を示した。同様のカラムを行った後、残渣をメタノール/酢酸エチルから再結晶すると、最初に850mg、続いて120mgの物質が得られ、両方ともなお2−3%の未知のヌクレオシド不純物を含んでおり、85%の収率であった。
ii.5’−O−ジメトキシトリフェニルメチル−2’−O−メチル−5−メチルウリジン
粗2’−O−メチル−5−メチルウリジン(12g)をピリジン(2x50mL)と共蒸発させ、乾燥ピリジン(50mL)に溶解した。塩化ジメトキシトリフェニルメチル(18.1g,0.054モル)を加え、フラスコに栓をして室温で45分間放置した。反応を停止させるためにメタノール(10mL)を加え、減圧下で溶液を濃縮すると油状物となった。残渣は酢酸エチル(2x400mL)および飽和炭酸水素ナトリウム溶液(500mL)間に分配させた。有機層を併せて乾燥し(硫酸ナトリウム)、濾過して濃縮すると黄色あわ状物を得た。あわ状物は塩化メチレン(60mL)に溶解し、シリカゲルカラムにのせ、酢酸エチル−ヘキサン−トリエチルアミン(60:40:1)で溶出した。生成物を含有している分画を集めて濃縮し、乾燥アセトニトリルと共蒸発させた(2x50mL)。得られた残渣は1mmHgで24時間乾燥すると、パリパリした白色あわ状物となった(5−メチルウリジンからの3工程で60.4%)。
実施例5−f
i.2,3,5−トリ−O−ベンゾイル−2−チオ−5−メチルウリジン
250mlの3頚丸底フラスコ中、1−O−アセチル−2,3,5−トリ−O−ベンゾイル リボース(0.500g、1ミリモル)および5−メチル−2−チオウラシル(0.156g、1.1ミリモル)を真空下で一夜乾燥させた。これらの成分は10mLの乾燥アセトニトリルに溶解し、80℃へ加熱した。この温かい溶液にN−O−ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(0.509g、2.5ミリモル)を加え、反応液は80℃で1時間攪拌した。反応混合液を加熱装置から取り出して室温まで放置により冷却し、トリメチルシリルトリフレート(0.334g、1.5ミリモル)を滴加した。反応混合物は次に50℃に加熱し、4時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル/ヘキサン 1:1を使用するTLCにより検査すると、反応が完了していることが示された。溶液を室温まで冷却し、50mLのジクロロメタンおよび50mLの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に分配した。水相をジクロロメタンで2回以上抽出し、有機層を併せ、硫酸マグネシウムで乾燥して濃縮すると淡黄色あわ状物を得た。このあわ状物はさらに精製することなく使用された。
ii.2−チオ−5−メチルウリジン
粗2,3,5−トリ−O−ベンゾイル−2−チオ−5−メチルウリジン(20g、37ミリモル)を500mLのメタノールに溶解した。この溶液にナトリウムメトキシド(2.0g、37ミリモル)を加え、反応液を2時間攪拌した。反応液を酢酸エチル/ヘキサン 1:1および酢酸エチル/メタノール9:1を使用するTLCにより検査すると、反応が完了していることが示された。Dowex50 H+樹脂をpH試験紙で溶液が中性になるまで加え、樹脂を濾過した。樹脂は別のメタノール100mlで洗浄し、併せた濾液を濃縮すると、表題化合物8.5g(84%)が淡黄色あわ状物として得られた。
実施例5−g
2’−O−メチル−5−メチル−2−チオウリジン
攪拌した2−メチル−5−チオウリジン(0.500g、1.8ミリモル)のDMF(10ml)溶液に、酸化ジブチルスズ(0.500g、2.0ミリモル)ヨウ化テトラブチルアンモニウム(0.738g、2ミリモル)およびヨウ化メチル(1.022g、7.2ミリモル)を加える。反応フラスコを封じ、50℃で16時間加熱する。混合物を冷却し、追加のヨウ化メチル(1.022g、7.2ミリモル)を加え、反応液をさらに16時間加熱する。この時間の終了時に反応混合物を室温まで冷却して塩化メチレンで希釈し、塩化メチレン/メタノールの濃度勾配を用いてクロマトグラフィーを行った。適切な分画を集めて濃縮すると2’−O−メチル−5−メチル−2−チオウリジンが得られる。
実施例5−h
2’−O−プロピル−5−メチル−2−チオウリジン
表題化合物はヨウ化メチルの代わりにヨウ化プロピル(1.22g、7.2ミリモル)を用いる実施例5−gの方法により製造される。
実施例5−i
i.2’−O−フタルイミドプロピル−5−メチル−2−チオウリジン
表題化合物はヨウ化メチルの代わりにブロモ−プロピルフタルイミド(0.67g、2.5ミリモル)を用いる実施例5−gの方法により製造され、追加(0.300g)は2日目に加えられる。
ii.5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−プロピルアミン−5−メチル−2−チオウリジン
2’−O−フタルイミドプロピル−5−メチル−2−チオウリジン(2.6g、3.6ミリモル)を乾燥ピリジンに溶解し2度共蒸発させた。得られたあわ状物は25mLの乾燥ピリジンに溶解し、塩化ジメトキシトリチル(1.8g、5.5ミリモル)続いて4,4−ジメチルアミノピリジン(0.050g、0.4ミリモル)を加えた。反応液は室温で一夜攪拌した。反応混合物に1mLのメタノールを加えた。溶液は75mLの飽和炭酸水素ナトリウムおよび50mLのクロロホルム間に分配させた。水層を2回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮するとオレンジ色の油状物が得られ、シリカゲルを中和するために0.5%ピリジンを加えたメタノール/クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。
iii.5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−プロピルアミン−5−メチル−2S−トルオイル−2−チオウリジン
5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−プロピルアミン−5−メチル−2−チオウリジン(1g、1.6ミリモル)をDMFに溶解し、0℃に冷却した。この溶液に、トリエチルアミン(0.300g、3ミリモル)続いて塩化トルオイル(0.300g、1.92ミリモル)を5分以上かけて滴加した。反応液は放置して室温まで温めて一夜攪拌し、反応が完了したらメタノールで停止させて濃縮すると油状物が得られた。油状物は次に250mLの飽和炭酸水素ナトリウム/クロロホルム1:1溶液間に分配させた。水層を2回、75mLのクロロホルムで抽出し、有機層を乾燥して濃縮すると油状物が得られた。保護ヌクレオシドはヘキサン/酢酸エチル濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の生成物はN−3トルオイルおよびS−2トルオイル化合物の混合物として集められた。この混合物はそのままフォスファイト化操作に使用された。
iv.5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−プロピルアミン−3’−O−[(N,N−ジイソプロピルアミノ)−2−シアノエトキシホスファイト]−5−メチル−2−S−トルオイル−2−チオウリジン
5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−プロピルアミン−5−メチル−2S−トルオイル−2−チオウリジン(16.01g、22ミリモル)およびジイソプロピルエチルアミン(10ml)のTHF(200ml)溶液に、0℃でクロロ−β−シアノエトキシ−N,N−ジイソプロピルアミノホスフィン(5.6ml、25ミリモル)を加える。反応混合物は室温で20時間攪拌した。反応液は濃縮し、残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。1%トリエチルアミンを常に含む酢酸エチル/ヘキサン濃度勾配で溶出し、適切な分画を集めて濃縮すると表題化合物が得られる。
実施例5−j
i.2’−O−アミノプロピル−5−メチル−2−チオウリジン
500mlフラスコ中、2’−O−フタルイミドプロピル−5−メチル−2−チオウリジン(5.0g、15.8ミリモル)を100mlのメタノールに溶解する。ヒドラジン(2.02g、63.2ミリモル)を加え、混合物は攪拌しながら14時間加熱還流(60−65℃)する。真空下、溶媒を蒸発させ、残渣はジクロロメタン(150ml)に溶解して等容量のNH4OHで2回抽出する。有機層を蒸発させると粗生成物が得られる。NMRが生成物純度の検定に使用された。生成物はさらに精製することなく次の反応に使用された。
ii.2’−O−トリフルオロアセチルアミノプロピル−5−メチル−2−チオウリジン
2’−O−アミノプロピル−5−メチル−2−チオウリジンをMeOHに溶解し、5当量のトリエチルアミン続けて10当量のトリフルオロ酢酸エチルを加える。表題化合物が精製後に単離される。
iii.2’−O−トリフルオロアセチルアミノプロピル−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−2−チオウリジン
2’−O−トリフルオロアセチルアミノプロピル−5−メチル−2−チオウリジン(2.5g、3.6ミリモル)を乾燥ピリジンに溶解し、2度共蒸発させる。得られた黄色あわ状物は25mLの乾燥ピリジンに溶解し、塩化ジメトキシトリチル(1.8g、5.5ミリモル)続いて4,4−ジメチルアミノピリジン(0.050g、0.4ミリモル)を加えた。反応液は室温で一夜攪拌した。反応混合物に1mLのメタノールを加えた。溶液は75mLの飽和炭酸水素ナトリウムおよび50mLのクロロホルム間に分配させた。水層を2回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮すると油状物が得られ、シリカゲルを中和するために0.5%ピリジンを加えたメタノール/クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると表題化合物が得られた。
iv.2’−O−トリフルオロアセチルアミノプロピル−3’−O−[(N,N−ジイソプロピルアミノ)−2−シアノエトキシホスファイト]−5’−O−ジメトキシトリチル−5−メチル−2−チオウリジン
実施例5−j−iiiの表題化合物を用い、実施例5−i−ivの方法により表題化合物が製造される。
実施例5−k
i.5’−O−ジメトキシトリチル−2−チオ−5−メチルウリジン
2−チオ−5−メチルウリジン(1g、3.6ミリモル)を乾燥ピリジンに溶解し、2度共蒸発させる。得られた黄色あわ状物は25mLの乾燥ピリジンに溶解し、塩化ジメトキシトリチル(1.8g、5.5ミリモル)続いて4,4−ジメチルアミノピリジン(0.050g、0.4ミリモル)を加えた。反応液は室温で一夜攪拌した。反応混合物に1mLのメタノールを加えた。溶液は75mLの飽和炭酸水素ナトリウムおよび50mLのクロロホルム間に分配させた。水層を2回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮するとオレンジ色の油状物が得られ、シリカゲルを中和するために0.5%ピリジンを加えたメタノール/クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。
ii.5’−O−ジメトキシトリチル−3’−t−ブチルジメチルシリル−5−メチル−2−チオウリジン
5’−O−ジメトキシトリチル−2−チオ−5−メチルウリジン(1g、1.73ミリモル)を乾燥DMFと2度共蒸発させて乾燥DMFに溶解し、イミダゾール(0.141g、2.08ミリモル)続いてt−ブチルジメチルシリルクロリド(0.313g、2.08ミリモル)を加えた。反応混合物は一夜攪拌した。反応液は酢酸エチル/ヘキサン1:1を使用するTLCにより検査され、それは反応が完了していることを示した。次に反応混合物を5%炭酸水素ナトリウム内に注ぎ、クロロホルムで3回抽出した。併せた有機溶液は硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮すると油状物となった。得られた油状物はメタノール/クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると、2’および3’シリル保護ヌクレオシドが別々に単離された。
iii.5’−O−ジメトキシトリチル−3’−t−ブチルジメチルシリル−2’−メタンスルホニル−5−メチル−2−チオウリジン
5’−O−ジメトキシトリチル−3’−t−ブチルジメチルシリル−5−メチル−2−チオウリジン(1.0g、1.45ミリモル)をピリジンに溶解して0℃に冷却した。この溶液にメタンスルホニルクロリド(0.183g、1.6ミリモル)を滴加した。TLCにより反応が完了したと認められるまで反応液を攪拌した。反応混合物をメタノールで中和して濃縮すると油状物が得られた。表題化合物はそのまま続いての反応に使用される。
iv.5’−ジメトキシトリチル−3’−t−ブチルジメチルシリル−2,2’−チオアンヒドロ−5−メチル−2−チオウリジン
実施例5−k−iiiで得られたメシル化ヌクレオシドに5当量のナトリウムメトキシドを加え、チオアンヒドロ生成物の形成が完了するまで攪拌した。次に溶液をDowex50W(H+型)で中和し、樹脂を濾過して除き、得られた溶液を濃縮すると表題化合物が得られた。
v.2’−フルオロ−3’−t−ブチルジメチルシリル−5’−ジメトキシトリチル−5−メチル−2−チオウリジン
実施例5−k−ivで得られたチオアンヒドロヌクレオシドを無水ジオキサンに溶解した。この溶液に6当量のHF/ピリジン複合体を加え、TLCにより反応が完了したと認められるまで反応液を攪拌した。反応混合物は等容量の氷に注ぎ、中性になるまで炭酸カルシウムを加えた。固形物を濾過し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると表題化合物が得られた。
vi.2’−フルオロ−3’−O−[(N,N−ジイソプロピルアミノ)−2−シアノエトキシホスファイト]−5’−ジメトキシトリチル−5−メチル−2−チオウリジン
2’−フルオロ−3’−t−ブチルジメチルシリル−5’−ジメトキシトリチル−5−メチル−2−チオウリジンを実施例5−i−ivの方法により処理すると表題化合物が得られる。
実施例6
オリゴリボヌクレオチド合成
無置換および置換ホスホジエステルオリゴリボヌクレオチド(本明細書においてPO結合オリゴリボヌクレオチドとも称される)は、ヨウ素での酸化による標準ホスホロアミダイト化学を使用する自動化DNAシンセサイザー(Applied Biosystems モデル380B)により合成された。
実施例7−a
オリゴリボヌクレオシド合成
メチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド(本明細書においてMMI結合オリゴリボヌクレオシドとも記される)、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド(本明細書においてMDH結合オリゴリボヌクレオシドとも記される)、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド(本明細書においてamide−3結合オリゴリボヌクレオシドとも記される)およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド(本明細書においてamide−4結合オリゴリボヌクレオシドとも記される)ならびに例えば、MMIおよびPOまたはPS結合を交互に持つ混合主鎖化合物は本明細書において援用される米国特許第5,378,825、5,386,023、5,489,677号および公開されたPCT出願PCT/US92/04294およびPCT/US92/04305(各々WO92/20822およびWO92/20823として公開)に記載されているように製造される。
実施例7−b
PNA
ペプチド核酸(PNA)それ自体は既知であり、ペプチド核酸(PNA):合成、特性および可能性のある応用、Bioorganic & Medicinal Chemistry,1996,4,5−23、を参考とした任意の種々の方法に従って製造される。それらはまた、米国特許第5,539,083号(1994年2月23日に出願された一連番号08/200,742に対応し、本出願と同じ譲受人に譲渡されている)に従っても製造される。これらの参照文献は本明細書において援用される。
実施例8
キメラ ホスホロチオエート オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Me]/PS・[2’−OH]/PS・[−2’−O−Me]/PSオリゴリボヌクレオチド
2’−O−アルキルホスホロチオエートおよび2’−OHホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを持つキメラ オリゴリボヌクレオチドは上記のようなApplied Biosystems自動化DNAシンセサイザー モデル380Bを使用して合成された。オリゴリボヌクレオチドは自動化シンセサイザーおよびRNA部分のために5’−ジメトキシトリチル−2’−tert−ブチルジメチルシリル 3’−O−ホスホロアミダイトおよび5’および3’ウイングのために5’−ジメトキシトリチル−2’−O−メチル−3’−O−ホスホロアミダイトを使用して合成された。環外アミン上の保護基は、rAおよびrGのためにはフェノキシアセチル、rCおよび2’−O−メチルAおよび2’−O−メチルCのためにはベンゾイル、および2’−O−メチルGのためにはイソブチリルであった。標準合成サイクルは、テトラゾールおよび塩基の送り込み後の待ち工程を600秒に延長し、RNAのために4回および2’−メチルのために2回反復するように修正した。完全に保護されたオリゴリボヌクレオチドは支持体から切断され、アンモニア/エタノール3:1中、室温で一夜かけてホスフェート基を脱保護し、凍結乾燥した。次に、すべての塩基を脱保護するために室温で24時間メタノール性アンモニアで処理し、試料は再び凍結乾燥した。ペレットは2’位を脱保護するためにTBAFの1M THF溶液に室温で24時間再懸濁した。反応を1M TEAAで停止させ、ロートバックで試料を1/2の容量に減じた後、G25サイズ排除カラムで脱塩した。回収されたオリゴは収率が分光学的に、純度がキャピラリー電気泳動および質量分光計により分析された。
実施例9
キメラ ”ギャップマー”オリゴリボヌクレオチド
i.キメラのメチルホスフェート オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Me]/PMe・[2’−OH]/PMe・[−2’−O−Me]/PMeオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとメチルホスフェート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
ii.キメラ ホスホロアミデート オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Me]/PN・[2’−OH]/PN・[−2’−O−Me]/PNオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホロアミデート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
iii.キメラ ホスホロアミデート オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Me]/3’NPN・[2’−OH]/3’NPN・[−2’−O−Me]/3’NPNオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いると3’−デオキシ−3’−アミノホスホロアミデート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
iv.キメラ ホスフィネート オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Me]/PI・[2’−OH]/PI・[−2’−O−Me]/PIオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスフィネート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
v.キメラ アルキルホスホノチオエート オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Me]/MePS・[2’−OH]/MePS・[−2’−O−Me]/MePSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホノチオエート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
vi.キメラ ホスホロジチオエート オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Me]/P2S・[2’−OH]/P2S・[−2’−O−Me]/P2Sオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホロジチオエート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
vii.キメラ ホスホセレネート オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Me]/PSe・[2’−OH]/PSe・[−2’−O−Me]/PSeオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホセレネート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
viii.キメラ ボラノホスフェート オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Me]/BP・[2’−OH]/BP・[−2’−O−Me]/BPオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとボラノホスフェート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
ix.キメラ メチルホスホトリエステル オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Me]/POMe・[2’−OH]/POMe・[−2’−O−Me]/POMeオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとメチルホスホトリエステル主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
実施例10
キメラ オリゴリボヌクレオシド
i.キメラ メチレンメチルイミノ オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’−O−Me]/MMI・[2’−OH]/MMI・[−2’−O−Me]/MMIオリゴリボヌクレオシド
実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してメチレンメチルイミノ結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
ii.キメラ メチレンジメチルヒドラゾ オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’−O−Me]/MDH・[2’−OH]/MDH・[−2’−O−Me]/MDHオリゴリボヌクレオシド
実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してメチレンジメチルヒドラゾ結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
iii.キメラ ホルムアセタール オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’−O−Me]/FA・[2’−OH]/FA・[−2’−O−Me]/FAオリゴリボヌクレオシド
実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してホルムアセタール結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
iv.キメラ チオホルムアセタール オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’−O−Me]/TFA・[2’−OH]/TFA・[−2’−O−Me]/TFAオリゴリボヌクレオシド
実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してチオホルムアセタール結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
v.キメラ エチレンオキシド オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’−O−Me]/ETO・[2’−OH]/ETO・[−2’−O−Me]/ETOオリゴリボヌクレオシド
実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してエチレンオキシド結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
vi.キメラ メチレンカルボニルアミノ オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’−O−Me]/amide−3・[2’−OH]/amide−3・[−2’−O−Me]/amide−3オリゴリボヌクレオシド
実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してamide−3結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
実施例11
キメラ オリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド
i.メチレンメチルイミノ/ホスホロチオエート キメラ、例えば、[2’−O−Me]/PS・[2’−OH]/PS・[−2’−O−Me]/MMIオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド
実施例6および7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は一つの”ウイング”にメチレンメチルイミノ結合、および中心部”ギャップ”および他の”ウイング”にホスホロチオエート結合を持っている。
ii.キメラ メチルホスホネート/メチレンメチルイミノ/ホスホロチオエート オリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’−O−Me]/PMe・[2’−OH]/PS・[−2’−O−Me]/MMIオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド
実施例6および7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方の部分を持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は一つの”ウイング”にメチレンメチルイミノ結合、中心部”ギャップ”にホスホロチオエート結合、および他の”ウイング”にメチルホスホネート結合を持っている。
iii.キメラ メチレンカルボニルアミノ/ホスホロチオエート/メチレンカルボニルアミノ オリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’−O−Me]/amide−3・[2’−OH]/PS・[−2’−O−Me]/amide−3オリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド
実施例6および7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は両方の”ウイング”にメチレンカルボニルアミノ結合、および中心部”ギャップ”にホスホロチオエート結合を持っている。
iv.キメラ メチレンカルボニルアミノ/ホスホロチオエート/メチレンメチルイミノ オリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’−O−Me]/amide−3・[2’−OH]/PS・[−2’−O−Me]/MMIオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド
実施例6および7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は一つの”ウイング”セグメントにメチレンカルボニルアミノ結合、中心部”ギャップ”セグメントにホスホロチオエート結合、および他の”ウイング”セグメントにメチレンメチルイミノ結合を持っている。
v.メチレンメチルイミノ/ホスホジエステル/ホスホロチオエート キメラ、例えば、[2’−O−Me]/MMI−PO・[2’−OH]/PS・[−2’−O−Me]/MMI−POオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド
実施例6および7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物はその”ウイング”セグメントにメチレンメチルイミノおよびホスホジエステル結合を交互に、およびその中心部”ギャップ”セグメントにホスホロチオエート結合を持っている。
実施例12
キメラの”末端”ギャップ形成ホスホロチオエート オリゴリボヌクレオチド
i.”3’−末端”ギャップ形成ホスホロチオエート キメラ、例えば、[2’−O−Me]/PS・[2’−OH]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その3’末端に”オープンギャップ”セグメント、その5’末端に”ウイング”セグメントおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ii.”5’−末端”ギャップ形成ホスホロチオエート キメラ、例えば、[2’−OH]/PS・[2’−O−Me]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その5’末端に”オープンギャップ”セグメント、その3’末端に”ウイング”セグメントおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
iii.”3’−末端”ギャップ形成ホスホロチオエート キメラ、例えば、[2’−F]/PS・[2’−OH]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その3’末端に”オープンギャップ”、その5’”ウイング”セグメントに2’−フルオロヌクレオシド、そのオープン”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
実施例13
単一形主鎖結合および変異ヌクレオシドサブユニットを持つキメラ オリゴリボヌクレオチド
i.キメラ 2’−O−エチル オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Et]/PS・[2’−OH]/PS・[2’−O−Et]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに2’−O−エチルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ii.キメラ 2’−O−プロピル オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−Pr]/PS・[2’−OH]/PS・[2’−O−Pr]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに2’−O−プロピルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
iii.[2’−O−F]/PS・[2’−OH]/PS・[2’−O−F]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに2’−フルオロヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
iv.[2’−O−EtOMe]/PS・[2’−OH]/PS・[2’−O−EtOMe]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに2’−O−メトキシエチルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
v.[2’−O−EtOMe]/PS・[2’−OH]/PS・[2’−F]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その5’”ウイング”セグメントに2’−O−メトキシエチルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシド、その3’”ウイング”セグメントに2’−フルオロヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
vi.[2’−O−EtOMe]/PS・[2’−OH]/PS・[2’−O−Me]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その5’”ウイング”セグメントに2’−O−メトキシエチルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシド、その3’”ウイング”セグメントに2’−O−メチルヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
実施例14
変異主鎖結合および変異ヌクレオシドを持つキメラオリゴリボヌクレオチド
i.[2’−O−Me]/PMe・[2’−OH]/PS・[2’−F]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例6の化学を用いる実施例8の方法で、その5’”ウイング”セグメントに2’−O−メチルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシド、その3’”ウイング”セグメントに2’−O−フルオロヌクレオシド、”ギャップ”セグメントおよび3’”ウイング”セグメント中にホスホロチオエート結合および5’”ウイング”セグメント中にメチルホスホネート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ii.[2’−O−Me]/PMe・[2’−OH]/PS・[2’−Pr]/PIオリゴリボヌクレオチド
実施例6の化学を用いる実施例8の方法で、その5’”ウイング”セグメントに2’−O−メチルヌクレオシド、その”ギャップ”に2’−OHヌクレオシド、その3’”ウイング”セグメントに2’−O−プロピルヌクレオシド、”ギャップ”セグメント中にホスホロチオエート結合、5’”ウイング”セグメント中にメチルホスホネート結合および3’”ウイング”セグメント中にホスフィネート結合を持つキメラ化合物が製造される。
実施例15
代用物ヌクレオシドを含むキメラオリゴリボヌクレオチド
i.モルホリノヌクレオシド代用物含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[モルホリノヌクレオシド代用物]・[2’−OH]/PS・[モルホリノヌクレオシド代用物]オリゴリボヌクレオチド
実施例7および実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第5,506,337号の教えにより製造されたモルホリノヌクレオシド、およびその”ギャップ”セグメントにホスホロチオエート結合を通して連結された2’−OHヌクレオシドを持つキメラ化合物が製造される。
ii.シクロブチルヌクレオシド代用物含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[シクロブチルヌクレオシド代用物]/PS・[2’−OH]/PS・[シクロブチルヌクレオシド代用物]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例7および実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第5,359,044号の教えにより製造されたシクロブチル代用物ヌクレオシド、およびその”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
iii.ピロリジンヌクレオシド代用物含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[ピロリジンヌクレオシド代用物]/PS・[2’−OH]/PS・[ピロリジン糖]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例7および実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第5,519,135号の教えにより製造されたピロリジン代用物ヌクレオシド、およびその”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
iv.”3’−末端”ギャップ形成PNA・ホスホロチオエート キメラ、例えば、PNA・[2’−OH]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例7−bの化学を組み合わせた実施例8の方法により、ホスホロチオエート結合を持つ2’−OHヌクレオシドから形成されたその3’末端に”オープンギャップ”および5’”ウイング”セグメントにPNA代用物を持つキメラ化合物が製造される。
実施例16
修飾された塩基を持つヌクレオシドを含むキメラ オリゴリボヌクレオチド
i.N−2修飾プリン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[修飾プリン]/PS・[2’−OH]/PS・[修飾プリン]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第5,459,255号の教えにより製造された4,7,10,13−テトラアザヘキサデカ−1−イル グアノシン ヌクレオシド、その”ギャップ”に2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ii.C−5修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[修飾ピリミジン]/PS・[2’−OH]/PS・[修飾ピリミジン]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第5,484,908号の教えにより製造された5−プロピニルピリミジン ヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
iii.N−2、C−6修飾プリン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[修飾プリン]/PS・[2’−OH]/PS・[修飾プリン]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第5,459,255号の教えにより製造された6−ヒドロキシ−2−フルオロプリン ヌクレオシド、その”ギャップ”に2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
iv.2’−O−アルキル、C−5修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−プロピル修飾ピリミジン]/PS・[2’−OH]/PS・[2’−O−プロピル修飾ピリミジン]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに2’−O−プロピル−5−メチルシチジン ヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
v.2’−O−アルキル、N−2、C−5修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−プロピル修飾ピリミジン]/PS・[2’−OH]/PS・[2’−O−プロピル修飾ピリミジン]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに2’−O−プロピル−2−チオ−5−メチルウリジン ヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
vi.2’−O−アミノアルキル、N−2、C−5修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−アミノプロピル修飾ピリミジン]/PS・[2’−OH]/PS・[2’−O−アミノプロピル修飾ピリミジン]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに2’−O−アミノプロピル−2−チオ−5−メチルウリジン ヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
vii.2’−O−フルオロ、N−2、C−5修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’−O−フルオロ修飾ピリミジン]/PS・[2’−OH]/PS・[2’−O−フルオロ修飾ピリミジン]/PSオリゴリボヌクレオチド
実施例8の方法で、その”ウイング”セグメントに2’−O−フルオロ−2−チオ−5−メチル ウリジンヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに2’−OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
実施例17
細胞培養およびras標的のノーザンブロット分析
T24細胞は、10%ウシ胎児血清および100単位/mlペニシリンを補給したマッコイ培地(GIBCO−BRL,Gaithersburg,MD)中で単層として維持された。オリゴマー化合物で24時間処理された後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、標準プロトコール(Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,1988,Wiley and Sons,New York,NYを参照されたい)に従って全細胞RNAが単離された。Ha−ras mRNAの相対的存在量を定量するため、全RNA(10μg)がノーザンブロッティングによりBio−Rad Zetaプローブメンブレン(Bio−Rad,Hercules,CA)上へ移され、UV架橋された(StratalinkerTM,Stratagene,LaJolla,CA)。メンブレン結合RNAは32P標識0.9kb Ha−ras cDNAプローブ(Oncogene Science,Pasadena,CA)へハイブリダイズされ、XARフィルム(Kodak,Rochester,N.Y.)へ暴露された。Ha−ras信号の相対量は、同一のメンブレンをとり、ヒトグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH,Coltech,Palo Alto,CA)で探査した場合に得られた信号でHa−ras信号を規格化することにより決定された。ノーザンブロットからの信号はホスホイメージャーおよびimage quantソフトウェアー(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)を用いて定量された。
実施例18
細胞の化合物処理
単層で増殖している細胞は15μg/mlの最大濃度を持つオリゴの200nM当たり5μg/mlの濃度でリポフェクチン(GIBCO−BRL)を含んでいるOpti−MEM(GIBCO−BRL)培地を加えた。培地が完全血清培地で置き換えられた場合はオリゴマー化合物を加え、37℃で4時間インキュベートした。化合物の存在下で24時間後、細胞を採取してRNAを次の分析のために調製する。
実施例19
RNase H分析
RNase H分析は活性化された(コドン12突然変異)Ha−ras mRNAの塩基(+23から+47)に対応する17塩基オリゴリボヌクレオチドを用いて実施された。20mMトリス−Cl、pH7.5、100mM KCl、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトールおよび100μlの最終容量に対して4単位のRNase阻害剤(Pharmacia,Newark,NJ)を含む反応液中で、5’末端標識RNA(20nM)を100倍モル過剰の種々の試験オリゴリボヌクレオチドとインキュベートした。オリゴリボヌクレオチドは95℃に5分間加熱することにより融解させ、90℃、2リットルの水浴中で室温まで徐々に冷却した。未変性ポリアクリルアミドゲル上、一本鎖末端標識センスRNAおよびアニール化二重鎖間の移動度におけるシフトにより二重鎖形成が確認された。得られた二重鎖は大腸菌RNase H(USB,Cleveland,OH)による消化のための基質として試験された。RNase Hの1x10−9mg/ml溶液の1μlを二重鎖反応液10μlに加え、37℃で30分間インキュベートし、変性装填緩衝液の添加により反応を停止させ、反応生成物は7M尿素を含む12%ポリアクリルアミドゲルで分離し、XARフィルム(Kodak)に暴露した。
実施例20
無細胞インビトロヌクレアーゼアッセイ
無細胞T24抽出物実験で使用される二重鎖は上記のようにアニール化されたが、ただし、二重鎖形成後、反応物は1μlのRNase TおよびA混合物(Ambion RPAIIキット、Austin,TX)を加えて37℃で15分間インキュベートし、未変性12%ポリアクリルアミドゲルで精製した。T24細胞核および細胞質分画は以前に記載されているように単離された(Szyf,M.,Bozoic,V.and Tanigawa,G.,J.Biol.Chem.,1991,266,10027−10030)。アニール化二重鎖(10μl)は3μgのT24細胞質抽出物と37℃でインキュベートされた。反応はフェノール/クロロホルム抽出により停止し、担体として10μgのtRNAを添加してエタノール沈殿させた。ペレットは10μlの変性充填色素に再懸濁し、生成物を上記のように12%ポリアクリルアミドゲルで分離した。分子量ラダーを発生させるため、32P標識17−塩基RNAを50mM NaCO3存在下(pH=9.0)95℃に10分間加熱することにより加水分解した。
実施例21
5’および3’末端の決定
非標識二重鎖を上記のようにT24抽出物で処理し、この反応液の半分を子ウシ小腸ホスファターゼ(CIP,Stratagene)で処理し、半分は未処理のままで残した。ホスファターゼは95℃に加熱することにより不活性化し、反応液をフェノール/クロロホルムで抽出し、担体としてグリコーゲンを添加してエタノール沈殿させた。沈殿物は次にT4ポリヌクレオチド キナーゼ(Stratagene)および32P−γ−ATP(ICN,Irvine,CA)で処理した。試料は再びフェノール/クロロホルムで抽出してエタノール沈殿させ、生成物は12%アクリルアミドゲルで分離し、XARフィルムに暴露することにより可視化した。切断二重鎖の3’末端は、二重鎖消化生成物とT4 RNAリガーゼ(Stratagene)および32P−pCp(ICN)との反応により評価された。
実施例22
T24細胞中の標的RNAのキメラ2’−メトキシ オリゴリボヌクレオチド媒介消化
種々の2’−糖修飾を含んでいる、Ha−ras癌遺伝子のコドン12に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの構造活性分析はMonia et al.,J.Biol.Chem.,1992,267,19954−19962およびMonia et al.,J.Biol.Chem.,1993,268,14514−14522に報告されている。これらの報告において、2’−修飾オリゴヌクレオチドは非修飾2’−デオキシ オリゴよりも高い親和性でRNAへハイブリダイズするけれども、それらはHa−ras遺伝子発現の阻害においては全く有効ではなかった。これらの2’−修飾オリゴで観察された活性の欠如は、まさにRNase Hによる分解の基質として働くことができる二重鎖を作ることができないことによっている。同様のプロトコールに従って、Ha−ras mRNAを標的とする17塩基2’−メトキシ オリゴリボヌクレオチドの中心に連続したリボヌクレオチドが導入されて2’−メトキシ−2’−ヒドロキシ−2’−メトキシホスホロチオエート オリゴリボヌクレオチド”ギャップ形成”キメラ化合物が形成され、それは中心ギャップセグメント中のリボヌクレオチド含量を変化させた(これらの化合物ならびにそれらの塩基配列の表示は図1を参照されたい)。それらの細胞標的にハイブリダイズした場合、生じた二重鎖は核酸分解の標的ではない二つの部分(2’−メトキシ”ウイング”)およびRNA:RNA二重鎖を認識する新規リボヌクレアーゼ活性の標的であることが見いだされている一つの2’−ヒドロキシオリゴリボヌクレオチド部分から成っている。Ha−ras遺伝子のコドン12位に活性化G−Tトランスバージョン突然変異を含むT24膀胱癌細胞が使用された。この突然変異に特異的な”ギャップ形成”キメラ化合物は培養で増殖しているT24細胞内へトランスフェクトされた。化合物と24時間インキュベーション後、細胞を採取し、全細胞質RNAが単離され、Ha−ras mRNAレベルについてのノーザンブロット分析が実施された。完全に修飾された2’−メトキシオリゴヌクレオチドは標的mRNAの核酸分解性切断を支援せず、従って試験された最も高い濃度でもHa−ras mRNAの定常状態レベルの減少を導かなかった(図2AおよびB)。ギャップにただ3つのみのリボヌクレオチドを持つRNAギャップマーオリゴヌクレオチドもまた標的RNAの核酸分解性切断を誘導できなかった(図2Cおよび2D)。しかしながら、ギャップに5、7および9のリボヌクレオチドを含むRNAギャップマーオリゴヌクレオチド、ならびに完全ホスホロチオエート オリゴリボヌクレオチド分子でT24細胞を処理した場合はすべてHa−ras mRNAの定常状態レベルの用量依存性減少を示した(図3B−3D)。4つの不適正塩基を配列に含んでいる対照9RNAギャップマーオリゴヌクレオチドでT24細胞を処理すると、Ha−ras mRNAの用量依存性減少は示さず、標的RNAへのハイブリダイゼーションが活性に必須であることを示唆している(図3E)。RNAギャップマー化合物はHa−ras mRNAの定常状態レベルの用量依存性阻害を示した。RNAギャップマー化合物の能力はRNAギャップの大きさ、従ってインビボで形成されるRNA:RNA二重鎖の大きさに依存していた。3塩基RNAギャップマー化合物での細胞処理は標的の切断を起こさなかったが、一方、5、7および9塩基RNAギャップマー化合物ではHa−ras mRNAの減少が生じた(図4)。ギャップ中に3つのリボヌクレオチドを含むRNAギャップマーオリゴヌクレオチドは標的mRNAの減少を誘導できないという事実は、標的への結合および切断のために少なくとも4つのリボヌクレオチドの最小RNA:RNA二重鎖領域が活性には必要とされることを示唆している。興味あることに、リボヌクレオチドの代わりにギャップ中にデオキシヌクレオチドを含んでいるキメラDNAギャップマーオリゴヌクレオチドは、標的mRNAのRNase H媒介分解の基質を形成するために同じ最小ギャップサイズ要求性を示しており(Crooke et al.,Annu.Rev.Pharmacol.,1996,36,107)、RNaseおよびここに説明した二本鎖RNase活性は、それらの基質は明らかに異なっているけれどもいくつかの特性を共有しているであろうことを示唆している。
実施例23
T24細胞抽出物中に存在する活性はインビトロで内部RNA:RNA部分内のギャップマーオリゴリボヌクレオチド:RNA二重鎖の切断を誘導する
T24細胞における二本鎖RNA切断活性をさらに特徴付けるため、T24細胞抽出物が調製され、インビトロにおいて9ギャップ オリゴリボヌクレオチド:RNA二重鎖を切断する能力が試験された。9ギャップ化合物:32P末端標識RNA二重鎖が3μgの細胞質抽出物と37℃にて図4に示した種々の時間インキュベートされ、続いてフェノール クロロホルム抽出、エタノール沈殿および変性ゲルでの生成物の分離を行った。この二重鎖がT24抽出物に存在する活性による消化の基質であったことは、完全長末端標識RNAの消失および図4で矢印により示されているより小さい分子量の消化生成物の出現により示される。さらに、二重鎖の切断に対応する活性は、それが産生する切断生成物のサイズにより示されるように二重鎖のRNA:RNA部分に対する特異性を持っている(32P末端標識RNAの物理地図を参照されたい、図4の最も右)。9デオキシヌクレオチド ギャップ オリゴヌクレオチド:RNA二重鎖のRNase H切断および9リボヌクレオチド ギャップ オリゴリボヌクレオチド:RNA二重鎖のT24細胞抽出物による切断は類似の消化生成物を生じるようである。このことは図4および5のゲルを比較することにより見ることができる。両方の活性はそれらの各々の二重鎖中の標的RNAの3’末端近くの好ましい切断部位を示し、そのことはそれらが結合ならびに機構的特性を共有しているであろうことを示唆している。ヒト臍帯静脈上皮細胞(HUVEC)、ヒト肺癌腫(A549)およびヒーラー細胞株から調製された細胞抽出物はすべてインビトロにおいて9RNAギャップマー:RNA標的二重鎖の切断を誘導できる活性を含んでいた。
実施例24
細胞生成物の細胞質および核分画の両方における標的RNAの切断
ここで説明された二本鎖RNase活性の細胞分布がさらに評価された。核抽出物がT24細胞から調製され、9RNAギャップマーオリゴヌクレオチド:RNA二重鎖を消化する能力が試験された。T24細胞から調製された核抽出物は標的二重鎖を分解でき、その活性は細胞質分画の活性と同レベルで核分画に存在することが観察された。
実施例25
RNAギャップマーオリゴヌクレオチド:RNA二重鎖はRNase Hの基質ではなかった
実施例23に示した切断がRNase Hによるものではないかという可能性を排除するため、9ギャップマーオリゴリボヌクレオチドおよびその相補的5’32P標識RNAの17塩基対二重鎖を切断する大腸菌RNase Hの能力がインビトロで試験された。図5は二重鎖が形成され、一本鎖32P末端標識RNAの隣で非変性ゲルにより分析された場合、電気泳動移動度に予期されるシフトを示している。図5の最も右のパネルに観察されるように、9ギャップマーオリゴヌクレオチド:RNA二重鎖は、RNaseで処理された場合により低い分子量バンドは現れなかったのでRNase H切断の基質ではなかった。しかしながら、予期されたように完全デオキシオリゴヌクレオチド:RNA二重鎖は同一条件下でRNase Hにより切断され、それはこの酵素で処理されたレーンにより小さな分子種が出現したことから明らかであった(図5、左パネル)。9ギャップマーDNAオリゴヌクレオチドおよびその相補的RNAから成る二重鎖はRNase H切断の基質であった。この特別な二重鎖中のRNase H切断部位が二重鎖のDNA:RNA部分に局在化しているという事実は、RNAギャップマーオリゴリボヌクレオチド:RNA二重鎖はRNase H消化の基質ではないことをさらに示している。
特定の理論に結び付けられるのを望んでいるわけではないが、すぐ前に記載した結果は、RNase Hおよび本発明のdsRNaseは結合ならびに機構的特性を共有しているらしいことを示唆している。しかしながら、c−Raf mRNA上の4つの部位を標的とするDNAおよびRNAギャップマーオリゴヌクレオチドの分析は、RNase Hおよび本明細書に記載したdsRNase活性は明らかに異なった基質特異性を持っている。c−Raf mRNAを標的とした”RNA様”ギャップマーオリゴヌクレオチドはmRNAの減少を誘導することはできなかったが、一方、同一の部位を標的としたRNase H活性オリゴデオキシヌクレオチドは標的mRNAレベルを減少させることができた。T24細胞中の4つのc−Raf”RNAギャップマー”により誘導されない切断が考えられる配列特異性または切断によるものであったかどうかを決定するため、4つのc−Raf”RNA様ギャップマー”、ras”RNA様ギャップマー”および対応する”DNA様ギャップマー”が32P標識標的オリゴリボヌクレオチドと前もってハイブリダイズされ、T24ホモジネートとインキュベートされた。ras”RNA様ギャップマー”は”DNAギャップマー”とほとんど同じくらい効率的にras標的化RNAの切断を支援した。しかしながら、c−Rafセグメントを標的とした”RNA様ギャップマー”のただ1つのみが切断を支援し、”RNA様ギャップマー”の切断速度は一致する”DNA様ギャップマー”よりもかなり遅かった。従って、RNaseと対照的に、dsRNaseは無視できない配列特異性を示した。
実施例26
ヌクレアーゼ活性は5’−リン酸および3’−ヒドロキル末端を発生させる
インビトロにおいて二重鎖のヌクレアーゼ切断により残される5’末端の性質を決定するため、非標識二重鎖が前記のようにT24細胞抽出物とインキュベートされ、次に子ウシ小腸ホスファターゼで前処理して、またはしないでT4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[32P−γ−ATP]と反応させた。二重鎖生成物のホスファターゼ処理はポリヌクレオチドキナーゼとの反応間中の32P標識取り込みに必須であることが観察され、5’末端のリン酸基の存在を示している。二重鎖消化生成物とT4 RNAリガーゼおよび32P−pCpとの反応により3’末端が評価された。T4 RNAリガーゼは32P−pCpの結合に遊離3’−ヒドロキシル末端を必要とする。T4 RNAリガーゼにより32P−pCpを取り込む二重鎖消化生成物の能力は3’−ヒドロキシル基の存在を示している。
実施例27
哺乳類組織からの二本鎖リボヌクレアーゼの精製および特徴付け
哺乳類細胞(培養細胞株以外の)が二本鎖RNase活性を含んでいるかどうかを決定するため、およびそのようなリボヌクレアーゼが精製できるであろう供給源を提供するために、ラット肝臓ホモジネートからdsRNaseを同定および精製する努力をした。
実施例27−a
dsRNase用の基質およびアッセイ
予備的実験において、二本鎖RNase活性がラット肝臓ホモジネートに観察されたが、ホモジネートはまた高レベルの一本鎖RNaseも示し、そのことはdsRNaseによる切断後にオリゴリボヌクレオチドの切断が重なることになるためにdsRNase活性の分析を複雑化させる。この問題を解決するため、2つの追加の基質および非変性ゲルアッセイが使用された。”センス”鎖は8塩基ギャップ中にホスホジエステル結合を持ち、(a)ホスホロチオエート結合の残基かまたは(b)ホスホロチオエート結合の2’−メトキシヌクレオシドのフランクを持つオリゴリボヌクレオチドであった。両方の基質の”アンチセンス”鎖はホスホジエステルかまたはホスホロチオエート結合を持つ8塩基リボヌクレオチドギャップのどちら側にも2’−メトキシ ホスホロチオエートウイングを含んでいた(表1)。そのようなdsRNase基質はオリゴリボヌクレオチドよりもエキソヌクレアーゼ消化に対してより安定であり、ホスホロチオエート結合および2’−メトキシヌクレオシド両方を持つ基質は特に安定であった。ラット肝臓においては二本鎖RNase活性に比較して一本鎖RNaseが豊富であるので、これらの特色は重要であり、非変性アッセイの使用により支援されている。
ラット肝臓細胞質および核抽出物の両方が二重鎖基質の切断を誘導した。両方の抽出物が非変性ゲル電気泳動分析でより急速に移動するバンドを生じた。細胞質抽出物は核抽出物よりも活性であるようである。二本鎖RNase、RNase V1(Pharmacia,Piscataway,NJ)は基質を切断した;T24抽出物もまた基質を切断した。RNase A(非常に高い濃度である程度の切断が起こった)を除いて、細菌または一本鎖RNaseは基質を切断しなかった。RNase Aによる切断は二本鎖RNaseの混入によるものか、または、ある条件下でRNase Aが二本鎖基質を切断できるのかどうかは不明である。
実施例27−b
ラット肝臓細胞質および核抽出物からのdsRNaseの精製
本明細書で同定された哺乳類dsRNaseを精製するため、0.5kgのラット肝臓を緩衝液X[10mMヘペス(pH7.5)、25mM KCl、0.15mMスペルミン、0.5mMスペルミジン、1mM EDTA、2Mスクロース、10%グリセロール;すべてSigma Chemical Co.,St.Louis,MOからの試薬]中でホモジナイズし、Beckman J2−21M遠心機(Beckman,Fullerton,CA)を用い、10,000rpmで1.5時間遠心した。上清は40%硫酸アンモニウム(Sigma)で沈殿させた。すべてのdsRNase活性が40%硫酸アンモニウム沈殿に回収された。ペレットは緩衝液A[20mMヘペス(pH 6.5)、5mM EDTA、1mM DTT、0.25mMフェニルメチルスルホニウムフルオリド(PMSF)、0.1M KCl、5%グリセロール、0.1%NP40、0.1%トリトンX−100;すべての試薬はSigmaから]に再懸濁し、透析して硫酸アンモニウムを除いた。約40gの細胞質抽出物が0.5kgの肝臓から得られた。
肝臓核および細胞質からのdsRNase活性の精製は、異なった性質を持つ少なくとも2つのdsRNaseが二本鎖RNAを切断できることを示唆している。核dsRNaseはイオン交換カラムから細胞質dsRNaseよりも高いNaCl濃度で溶出された。しかしながら、両方ともMg++を必要とし、オリゴリボヌクレオチドギャップ内のいくつかの部位を切断する。両方とも二重鎖基質を必要とし、二重鎖がホスホロチオエートまたはホスホロチオエート−2’−メトキシヌクレオシド ウイングを持っている場合、オリゴリボヌクレオチドの”センス”および2’−メトキシホスホロチオエート キメラの”アンチセンス”鎖から作り上げられている二重鎖中のオリゴリボヌクレオチドを切断できる。
実施例27−c
精製された哺乳類dsRNaseの特徴付け
dsRNase活性に対するいろいろな条件の影響が、イオン交換クロマトグラフィー後の活性分画を用いて評価された。dsRNase活性は約pH7から約pH10のトリスまたはリン酸緩衝液で示すことができた。dsRNase活性はアセトニトリルまたはメタノール溶液中では不安定であった。さらに、活性はNaClにより阻害された;10mM NaClで30%、100mM NaClで>60%、および300mM NaClで100%。60℃、80℃および100℃で5分間の加熱はdsRNaseを不活性化した。最適活性は約37℃から約42℃の温度範囲で観察された。25℃で、dsRNase活性は37℃で観察された活性の約50%であった。dsRNase活性は10、20および50mM EDTAで阻害されたが,5mMでは阻害されなかったのはMg++の要求性と一致しており、多数回の凍結/融解に安定であった。
実施例28
精製されたラットdsRNaseを用いたdsRNase切断部位のさらなる特徴付け
精製されたdsRNaseを用いて切断部位をより詳しく特徴付けた。エンドヌクレアーゼ切断後および操作中(特に二重鎖の変性後)に起こる一本鎖切断を最小にする必要があった。従って、最も安定な二重鎖基質、すなわち、二重鎖の両方の鎖が2’−メトキシヌクレオシドおよびホスホロチオエート結合から成る隣接領域を含む基質が使用された。
実施例28−a
オリゴヌクレオチドの 32 P標識
センスオリゴヌクレオチドは[g32P]ATP、T4ポリヌクレオチド キナーゼ、および標準法(Ausubel et.al.,1989)を用いて5’末端が32Pで標識された。標識オリゴヌクレオチドは12%変性PAGEでの電気泳動により精製された(Sambrook et.al.,1989)。標識オリゴヌクレオチドの比活性は約5000cpm/fmolであった。
実施例28−b
二本鎖RNA消化アッセイ
オリゴヌクレオチド二重鎖は、10nMアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび105cpm32P標識センスオリゴヌクレオチドを含む30μLの反応緩衝液[20mMトリス−HCl(pH7.5)、20mM KCl、10mM MgCl2、0.1mM DTT]中で調製された。反応液は90℃に5分間加熱され、37℃で2時間インキュベートされた。オリゴヌクレオチド二重鎖は総タンパク質濃度で75μgの未精製細胞質抽出物、60μgの未精製核抽出物、5μgのイオン交換精製細胞質分画、5μgのイオン交換精製核分画、または0.5μgのイオン交換およびゲル濾過精製核分画の未精製および半精製細胞抽出物とインキュベートした。消化反応液は37℃で0−240分インキュベートした。インキュベーション後、各々の反応液の10μLをとり、変性ゲル充填緩衝液[5μL 8M尿素、0.25%キシレン シアノールFF、0.25%ブロモフェノールブルー]の添加により反応を停止した。反応液は95℃に5分間加熱し、12%変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。残りの反応液は2μLの非変性ゲル充填緩衝液[グリセロール、0.25%キシレン シアノールFF]で停止した。反応液は10℃にて、44mMトリス−ホウ酸および1mM MgCl2を含む12%非変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。ゲルはMolecular Dynamics Phosphorimagerを用いて分析した。
実施例29
RNAアフィニティーカラムおよびリボヌクレアーゼを精製する方法
核酸アフィニティーカラムを準備する技術は本分野では既知である(例えば、Kadonaga,Methods in Enzymology,1991,208,10を参照されたい)。そのようなアフィニティーカラムは、非特異的かまたは特異的様式で基質を結合する所望の化合物のための核酸基質を含むマトリックスから成っている。DNA結合タンパク質の精製において最初に利用されたRNAアフィニティーカラムがRNA結合タンパク質およびリボヌクレアーゼを精製するためにも使用された(例えば、Prokipcak et al.,J.Biol.Chem.,1994,269,9261;Dake et al.,J.Biol.Chem.,1988,263,7691を参照されたい)。本発明の一つまたはそれ以上のdsRNase基質を含むマトリックスは、多くの組織および細胞で優勢である一本鎖リボヌクレアーゼの作用に抵抗するdsRNA基質を提供するという利点を持っている。そのようなマトリックスはまた、適した保持体および保持体とdsRNase基質間の架橋を提供するリンカーも含んでいる。
Claims (93)
- あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズすることができる合成のオリゴマー性化合物であって、
あらかじめ選択されたRNA標的に対する前記化合物の結合親和性を、RNA標的に対する修飾されていないオリゴリボヌクレオチドの結合親和性と比較して改良するよう修飾された少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第1のセグメント;および
2’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;
を含み、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されているヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とする、
合成のオリゴマー性化合物。 - あらかじめ選択されたRNA標的に対する前記化合物の結合親和性を、RNA標的に対する修飾されていないオリゴリボヌクレオチドの結合親和性と比較して改良するように修飾されている少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第3のセグメントをさらに含む、請求項1記載のオリゴマー性化合物。
- 前記RNA標的にハイブリダイズしたときに、二本鎖RNAse酵素を活性化して前記RNA標的を切断することができる、請求項1記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが前記第1のセグメントと前記第3のセグメントとの間に位置する、請求項2記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを含む、請求項2記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが4−12個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項2記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが5−9個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項6記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが少なくとも5個のサブユニットを有し、前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを有する、請求項2記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが少なくとも7個のヌクレオシドサブユニットを有する、請求項8記載のオリゴマー性化合物。
- あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズすることができる合成のオリゴマー性化合物であって、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されている少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;および
2’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;
を含み、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されているヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とする、合成のオリゴマー性化合物。 - 修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されている少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第3のセグメントをさらに含む、請求項10記載のオリゴマー性化合物。
- 前記RNA標的にハイブリダイズしたときに、二本鎖RNAse酵素を活性化して前記RNA標的を切断しうる、請求項10記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが前記第1のセグメントと前記第3のセグメントとの間に位置する、請求項11記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを含む、請求項11記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが4−12個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項11記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが5−9個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項15記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが少なくとも5個のサブユニットを有し、かつ前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを有する、請求項11記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが少なくとも7個のヌクレオシドサブユニットを有する、請求項17記載のオリゴマー性化合物。
- あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、
少なくとも1つの2’−O−C1−20アルキル、2’−O−置換C1−20アルキルまたは2’−フルオロ修飾リボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有し、前記アルキル上の置換が、アミノ、ヒドロキシまたはC1−10アルキルエーテル修飾である第1のセグメント;および
2’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;
を含み、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対して安定なヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とするオリゴマー性化合物。 - 少なくとも1つの2’−O−C1−20アルキル、2’−O−置換C1−20アルキルまたは2’−フルオロ修飾リボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第3のセグメントをさらに含み、ここで、前記アルキル上の置換がアミノ、ヒドロキシまたはC1−10アルキルエーテルである、請求項19記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが前記第1のセグメントと前記第3のセグメントとの間に位置する、請求項20記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを含む、請求項20記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが4−12個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項20記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが5−9個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項20記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが少なくとも5個のサブユニットを有し、および前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを有する、請求項20記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントが少なくとも7個のヌクレオシドサブユニットを有する、請求項20記載のオリゴマー性化合物。
- 前記RNA標的とハイブリダイズしたときに、二本鎖RNAse酵素を活性化して前記RNA標的を切断しうる、請求項19記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第1のセグメントおよび前記第3のセグメントの前記リボフラノシルヌクレオシドサブユニットがそれぞれ、2’−O−C1−20アルキル、2’−O−置換C1−20アルキルまたは2’−フルオロを有するように修飾されており、かつ前記アルキル上の置換がアミノ、ヒドロキシまたはC1−10アルキルエーテルである、請求項22記載のオリゴマー性化合物。
- 前記ヌクレオシドサブユニットの少なくとも2つが、ホスホロチオエート、3’−デオキシ−3’−チオ−ホスホロチオエート、5’−デオキシ−5’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’−デオキシホスフィネート、5’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、3’−デオキシ−3’−アミノホスホルアミデート、5’−デオキシ−5’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項19記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第1のセグメントのヌクレオシドサブユニットの各々が、ホスホロチオエート、3’−デオキシ−3’−チオ−ホスホロチオエート、5’−デオキシ−5’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’−デオキシホスフィネート、5’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、3’−デオキシ−3’−アミノホスホルアミデート、5’−デオキシ−5’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項19記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第1のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項19記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項19記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第3のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々が、ホスホロチオエート、3’−デオキシ−3’−チオ−ホスホロチオエート、5’−デオキシ−5’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’−デオキシホスフィネート、5’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、3’−デオキシ−3’−アミノホスホルアミデート、5’−デオキシ−5’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項20記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第3のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項20記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第1のサブユニット、前記第2のサブユニットおよび前記第3のサブユニットの前記ヌクレオシドサブユニットがそれぞれ、ホスホロチオエート結合により連結されている、請求項20記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第1のセグメントのヌクレオシドサブユニットの各々が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノ結合により連結されている、請求項19記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第3のセグメントのヌクレオシドサブユニットの各々が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノ結合により連結されている、請求項20記載のオリゴマー性化合物。
- 配列中に少なくとも12個のリボフラノシルヌクレオシドを含み、あらかじめ選択されたRNAに特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって;
前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定なヌクレオチド間結合により連結されており;
前記化合物はギャップ部分が間に入った2つのウイング部分を有し;
ウイング部分はそれぞれ少なくとも1つの修飾ヌクレオシドサブユニットを含み、前記修飾ヌクレオシドサブユニットは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されており、
前記ギャップ部分は、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドサブユニットを有する、
ことを特徴とする化合物。 - 前記ギャップ部分が少なくとも5個の連続するリボヌクレオシドサブユニットを有する、請求項38記載のオリゴマー性化合物。
- 複数の2’−O−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;
少なくとも4個の連続する2’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有する第2のセグメント;および
複数の2’−O−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第3のセグメント;
を順に含み、オリゴマーのヌクレオシドサブユニットはホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、合成のオリゴマー性化合物。 - 前記第2のセグメントが少なくとも5個の連続する2’−ヒドロキシルリボヌクレオチドサブユニットを有する、請求項40記載のオリゴマー性化合物。
- 前記オリゴマーがあらかじめ選択されたRNAに特異的にハイブリダイズしうる、請求項40記載のオリゴマー性化合物。
- あらかじめ選択されたRNAを特異的に切断する方法であって、
前記RNAを、少なくとも12個のリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを前記あらかじめ選択されたRNAと特異的にハイブリダイズしうる配列で含むオリゴマー性化合物と接触させることを含み、
前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定なヌクレオチド間結合により連結されており;
前記化合物は、少なくとも1つの修飾ヌクレオシドサブユニットを含む少なくとも1つのセグメントを有し、前記修飾ヌクレオシドサブユニットは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されており;
前記化合物は、少なくとも4個の連続する2’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有するさらなるセグメントを有する、
ことを特徴とする方法。 - 前記さらなるセグメントが少なくとも5個の連続するリボヌクレオシドサブユニットを有する、請求項43記載の方法。
- 蛋白質の望ましくない産生により特徴づけられる疾患を有する生物を治療する方法であって、
生物を、リボ核酸の相補鎖と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を有する本発明のオリゴマー性化合物と接触させることを含み、
ヌクレオシドサブユニットの少なくとも1つは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記標的RNAに対する前記化合物の親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されており、
複数のヌクレオシドサブユニットは連続する配列中に位置しており、かつ2’−ヒドロキシル−ペントフラノシル糖成分を有する、
ことを特徴とする方法。 - 薬学的に有効な量のオリゴマー性化合物を薬学的に許容しうる希釈剤または担体中に含む組成物であって、前記オリゴマー性化合物は、RNAの相補鎖と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を含み、オリゴマー性化合物の複数のヌクレオシドサブユニットは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記標的RNAに対する前記化合物の親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されており;
さらなる複数のヌクレオシドサブユニットが2’−ヒドロキシル−ペントフラノシル糖成分を有する、
ことを特徴とする組成物。 - 配列特異的標的RNAのインビトロ修飾の方法であって、dsRNase酵素および前記標的RNAを含む試験溶液を、前記標的RNAに特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を有するオリゴマー性化合物と接触させることを含み、
ここでヌクレオシドサブユニットの少なくとも1つは、前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性を改良するように修飾されており;および
複数のヌクレオシドサブユニットは2’−ヒドロキシル−ペントフラノシル糖成分を有する、
ことを特徴とする方法。 - 生物においてハイブリダイゼーションおよびdsRNase酵素活性化を同時に促進する方法であって、生物を、標的RNAの相補鎖と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を有するオリゴマー性化合物と接触させることを含み、
ここで、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも1つは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変;の少なくとも1つを改良するように修飾されており、
複数のヌクレオシドサブユニットは2’−ヒドロキシ−ペントフラノシル糖成分を有することを特徴とする方法。 - あらかじめ選択されたRNA標的と特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって;
少なくとも1つの代用物ヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;
連続する配列中に位置する少なくとも4個のリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含み、かつ2’−ヒドロキシル成分をそこに有する第2のセグメント;を含み、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対して安定なヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とする化合物。 - 前記ヌクレオシドサブユニット代用物がペプチド核酸サブユニットである、請求項49記載のオリゴマー性化合物。
- 前記ヌクレオシドサブユニット代用物がモルホリノヌクレオシドサブユニットである、請求項49記載のオリゴマー性化合物。
- 前記ヌクレオシド代用物がシクロブチルヌクレオシドである、請求項49記載のオリゴマー性化合物。
- 前記ヌクレオシド代用物がピロリジンヌクレオシドである、請求項49記載のオリゴマー性化合物。
- あらかじめ選択されたRNA標的と特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、
少なくとも2つのヌクレオシドサブユニットを含む第1のセグメント;前記第1のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、非リンヌクレオチド間結合により連結されており;および
2’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対して安定であるヌクレオチド間結合により連結されている、
を含む化合物。 - 前記非リン結合が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレン−ヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項54記載のオリゴマー性化合物。
- 前記非リンヌクレオチド間結合が、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、メチレンメチルイミノ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項54記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットがホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項54記載のオリゴマー性化合物。
- あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、
少なくとも3個のヌクレオシドサブユニットを含む第1のセグメント;前記第1のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、交互のリンおよび非リンヌクレオチド間結合により連結されており;および
2’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定なヌクレオチド間結合により連結されている、
を含む化合物。 - 前記非リン結合が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項58記載のオリゴマー性化合物。
- 前記非リンヌクレオチド間結合が、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、メチレンメチルイミノ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項58記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項58記載のオリゴマー性化合物。
- あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって;
少なくとも2つのヌクレオシドサブユニットを含む第1のセグメント;前記第1のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、3’−デオキシ−3’−チオ−ホスホロチオエート、5’−デオキシ−5’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’−デオキシホスフィネート、5’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、3’−デオキシ−3’−アミノホスホルアミデート、5’−デオキシ−5’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステルホスフェート結合により連結されており;および
2’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定であるヌクレオチド間結合により連結されている、
を含む化合物。 - 少なくとも2つのヌクレオシドサブユニットの第3のセグメントを含み、前記第3のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットが、3’−デオキシ−3’−チオ−ホスホロチオエート、5’−デオキシ−5’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’−デオキシホスフィネート、5’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、3’−デオキシ−3’−アミノホスホルアミデート、5’−デオキシ−5’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステルホスフェート結合により連結されている、請求項62記載のオリゴマー性化合物。
- 前記第1のセグメントおよび第3のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットが、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’−デオキシホスフィネート、3’−デオキシ−3’−アミノホスホルアミデート、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステルホスフェート結合により連結されている、請求項62記載のオリゴマー性化合物。
- あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、
DNAまたはRNA主要構築ブロックヌクレオシドではない少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;
2’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;
を含み、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されたヌクレオチド間結合により連結されている、ことを特徴とする化合物。 - 前記第1のセグメントヌクレオシドサブユニットが、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−アルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−アルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの7−アルキル誘導体、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)、4−チオウラシル、2−チオウラシルおよびシトシン、8−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルアデニンおよびグアニン、および5−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシンをその複素環塩基として有するヌクレオシドから選択される、請求項65記載の化合物。
- あらかじめ選択されたRNA標的と特異的にハイブリダイズすることができ、
アデノシン、2’−デオキシアデノシン、グアノシン、2’−デオキシグアノシン、シチジン、2’−デオキシシチジン、ウリジンおよび2’−デオキシチミジンからなるヌクレオシド群を除く少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;
2’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;
を含む合成のオリゴマー性化合物であって、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されているヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とするオリゴマー性化合物。 - 二本鎖基質の分解を触媒する活性を有する哺乳動物リボヌクレアーゼであって、前記基質の前記鎖の一方はmRNAであり、および前記基質の前記鎖の他方は、複数の2’修飾ヌクレオシドサブユニットを含む第1のセグメントおよび2’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメントを順に有する化合物を含むことを特徴とするリボヌクレアーゼ。
- 前記化合物の前記サブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている、請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
- 前記化合物の前記第1のセグメントの前記サブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
- 前記化合物の前記第2のセグメントの前記サブユニットが、ホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている、請求項70記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
- 前記化合物の前記第2のセグメントの前記サブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項70記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
- 前記化合物の前記第1のセグメントの前記サブユニットが、2’−O−アルキルヌクレオシドサブユニットである、請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
- (A) 前記活性はNaClにより阻害され;
(B) 前記活性はMg++を必要とし;および
(D) 前記哺乳動物リボヌクレアーゼは、SDS−PAGEにより決定して約50から約80キロダルトンの見かけの分子量を有する、
請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。 - 前記リボヌクレアーゼが核から単離される、請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
- 前記リボヌクレアーゼが細胞質から単離される、請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
- 前記リボヌクレアーゼがヒト細胞または組織から単離しうる、請求項68記載の哺乳動物蛋白質。
- 第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドのデュープレックスを含む二本鎖RNA基質であって、
(A) 前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドはそれぞれホスホジエステル結合を有する少なくとも4個の連続するリボフラノシル残基を有する中心部分を有し、
ここで前記中心部分は、前記デュープレックス中で互いに塩基対を形成しており;
(B) 前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、一本鎖ヌクレアーゼに対してそれらを耐性にする化学修飾を有する、前記中心部分に隣接する部分を有する
ことを特徴とする基質。 - 第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドのデュープレックスを含む二本鎖RNA基質であって、
(A) 前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドはそれぞれホスホジエステル結合を有する少なくとも4個の連続するリボフラノシル残基を有する中心部分を有し、ここで前記中心部分は前記デュープレックス中において互いに塩基対を形成しており;
(B) 前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、一本鎖ヌクレアーゼに対してそれらを耐性にし、かつデュープレックスの他方のオリゴヌクレオチドに対するそれらの親和性を増加させる化学修飾を有する、前記中心部分に隣接する部分を有する
ことを特徴とする基質。 - 前記化学修飾がホスホロチオエート結合または2’−メトキシ修飾である、請求項78記載の二本鎖RNA基質。
- 請求項78記載のdsRNA基質を含む親和性マトリックス。
- リボヌクレアーゼまたは非分解性RNA結合蛋白質を精製する方法であって、前記リボヌクレアーゼまたは非分解性RNA結合蛋白質を含む試料を請求項81記載の親和性マトリックスと接触させることを含む方法。
- ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の2’−O−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;および
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている少なくとも4個の連続する2’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有する第2のセグメント
を順に含む、合成のオリゴマー性化合物。 - ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の2’−O−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第3のセグメントをさらに含み、前記第2のセグメントは、前記オリゴマー性化合物中で前記第1のセグメントと前記第3のセグメントとの間に位置している、請求項83記載の化合物。
- 前記第2のセグメントがホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する、請求項83記載の化合物。
- 前記第2のセグメントがホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項83記載の化合物。
- ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の2’−O−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている少なくとも4個の連続する2’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有する第2のセグメント;および
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の2’−O−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第3のセグメント
を順に含む、合成のオリゴマー性化合物。 - 前記第2のセグメントがホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項87記載の化合物。
- 前記mRMAによりコードされる蛋白質の望ましくない産生により特徴づけられる疾患を有する生物を治療するための、請求項68記載の前記リボヌクレアーゼの使用。
- 前記mRNAまたは前記mRNAによりコードされる蛋白質の1つを同定するための、請求項68記載の前記リボヌクレアーゼの使用。
- 生物において、前記mRNAによりコードされる蛋白質に関連する異常な状態を診断するための、請求項68記載の前記リボヌクレアーゼの使用。
- 二本鎖基質の分解を触媒する活性を有する哺乳動物リボヌクレアーゼであって、前記基質の前記鎖の一方がmRNAであり、かつ前記鎖の他方が請求項1記載の化合物を含むことを特徴とするリボヌクレアーゼ。
- 前記オリゴヌクレオチドの1つが配列番号8のヌクレオチド配列を有する、請求項78記載の二本鎖RNA基質。
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