ES2270527T3

ES2270527T3 - Acidos nucleicos dendriticos que muestran un autoensamblaje maximo.

Info

Publication number: ES2270527T3
Application number: ES98937269T
Authority: ES
Inventors: Thor W. Nilsen
Original assignee: Polyprobe Inc
Current assignee: Polyprobe Inc
Priority date: 1997-07-29
Filing date: 1998-07-29
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2018-07-29
Also published as: US6274723B1; ATE327344T1; AU8601898A; JP4221145B2; EP1005573A1; EP1005573B1; WO1999006595A1; DE69834645T2; DE69834645D1; EP1005573A4; JP2001512034A

Abstract

Un polinucleótido dendrítico que tiene una pluralidad de brazos de hibridación monocatenarios; comprendiendo dicho polinucleótido una pluralidad de monómeros polinucleótidos unidos entre sí por hibridación; teniendo cada monómero polinucleótido una región intermedia que comprende una región de cintura, bicatenaria, lineal, que tiene un primer extremo y un segundo extremo, terminando dicho primer extremo en dos regiones de hibridación monocatenarias, cada una de una cadena de la región de cintura, y terminando dicho segundo extremo en una o dos regiones de hibridación monocatenarias, cada una de una cadena de la región de cintura; y en dicho polinucleótido dendrítico, cada monómero polinucleotídico está unido por hibridación a al menos un monómero polinucleotídico diferente en al menos una de dichas regiones de hibridación; y en el que cada una de dichas regiones de hibridación y dichas regiones de cintura de dicha pluralidad de monómeros consta de secuencias obtenidas de una secuencia maestra que no contiene repeticiones de subsecuencias que tienen X nucleótidos, donde X representa un número entero de al menos 2.

Description

Ácidos nucleicos dendríticos que muestran un autoensamblaje máximo.

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para la detección de ácidos nucleicos y, más particularmente, a vehículos marcados para sondas que hibridan con el ácido nucleico de interés.

Técnica antecedente

Las moléculas dendríticas son estructuras arborescentes altamente ramificadas y han encontrado aplicaciones como reactivos químicos, lubricantes, medios de contraste para resonancia magnética y otros. Véase, por ejemplo, Barth et al., Bioconjugate Chemistry 5:58-66 (1994); Gitsov & Frechet, Macromolecules 26:6536-6546 (1993); Hawker & Frechet, J. Amer. Chem. Soc. 112:7638-7647 (1990a); Hawker & Frechet, Macromolecules 23:4726-4729 (1990b); Hawker et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:1287-1297 (1993); Lochmann et al. J. Amer. Chem. Soc. 115:7043-7044 (1993); Miller et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:1018-1025 (1992); Mousy et al., Macromolecules 25:2401-2406 (1992); Naylor et al., J. Amer. Chem. Soc. 111:2339-2341 (1989); Spindler & Frechet, Macromolecules Macromolecules 26:4809-4813 (1993); Turner et al., Macromolecules 26:4617-4623 (1993); Wiener et al., Magnetic Resonance Med. 31(1):1-8 (1994); Service, 267:458-459 (1995); Tomalia, Sci. Amer. 62-66 (1995); y Patentes de Estados Unidos Nº 4.558.120; 4.507.466; 4.568.737; 4.587.329; 4.857.599; 5.527.524; y 5.338.532 de Tomalia. Las moléculas dendríticas ofrecen varias ventajas sobre otras arquitecturas moleculares. Primero, los dendrímeros contactan con el volumen o área máxima con un mínimo de elementos estructurales. Segundo, el crecimiento de moléculas dendríticas puede controlarse muy bien para producir moléculas de tamaño y peso molecular ideales. Finalmente, la gran cantidad de "extremos" definidos puede derivatizarse para producir moléculas altamente marcadas con espacios definidos entre los marcadores.

Los dendrímeros de ácido nucleico se han construido siguiendo la tecnología que Tomalia aplicó a polímeros orgánicos convencionales. Véase Hudson et al., "Nucleic Acid Dendrimers: Novel Biopolymer Structures," Am. Chem. Soc. 115:2119-2124 (1993); y Patente de Estados Unidos 5.561.043 de Cantor. El documento US 5.288.609 describe métodos para la detección de material genético que utilizan dos segmentos polinucleotídicos monocatenarios marcados que son complementarios a la misma o a cadenas opuestas del material genético diana. Los métodos descritos conducen a la formación de estructuras multihíbridas que pueden detectarse de diversos modos. El documento 5.288.609 no describe métodos en los que se minimice el autoensamblaje de segmentos polinucleotídicos monocatenarios.

La detección de ADN típicamente se consigue con una medida de absorción en la que la cantidad de ADN es directamente proporcional a la absorbancia de la solución. Aunque esta técnica es moderadamente sensible, no proporciona información acerca de la secuencia específica del ADN, sólo cuánto ADN está presente. El ADN también puede marcarse con moléculas fluorescentes, radiactivas o quimioluminiscentes. El marcaje ofrece las ventajas de una mayor sensibilidad de detección y especificidad. La especificidad proviene del marcaje de sólo los trozos deseados de ADN. El mayor uso de este marcaje para la detección de ADN es marcando una sonda complementaria al ADN diana. Si la sonda marcada hibrida con su diana y puede detectarse, se puede deducir que la diana está presente. El uso más habitual de esta técnica se llama transferencia de Southern, donde se detectan dianas ADN-ADN después de la hibridación con una sonda marcada. Los ácidos nucleicos dendríticos son útiles para el desarrollo de agentes de diagnóstico de ácidos nucleicos como herramientas de amplificación de señales. Debido al tamaño relativamente grande de moléculas de ácido nucleico, los dendrímeros de ácido nucleico se marcan fácilmente con numerosos compuestos fluorescentes y/o restos proteicos con un impedimento estérico y/o inactivación limitados. También muestran potencial como vehículos de suministro de fármacos (antisentido).

Quizá, el método de detección más habitualmente usado para el ADN depende de la amplificación del ADN en lugar de la adición de un marcador. Esta técnica para la amplificación se denomina reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En esta técnica, la cadena diana se amplifica in situ por la adición de desoxinucleótido trifosfatos de las cuatro bases, una polimerasa térmicamente estable y un cebador de ADN que es una cadena corta complementaria a la diana. El cebador (o cebadores) marcan el punto de duplicación (y el punto de terminación). Si se usa un único cebador, la cadena complementaria se acoplará a la terminación, pero más habitualmente se usan dos cebadores para indicar el inicio y el final de la secuencia amplificada. La detección del ADN amplificado se puede conseguir por cualquiera de varias técnicas. Quizá, el método más habitual consiste en separar el ADN amplificado por electroforesis (típicamente en agarosa o poliacrilamida, aunque también se usa electroforesis capilar) y detectarlo por tinción con un reactivo intercalante fluorescente (habitualmente bromuro de etidio). La técnica de PCR por lo tanto permite una mayor selectividad y especificidad.

En las Patente de Estados Unidos Nº 5.517.270; 5.484.904; y 5.487.973 de Nilsen et al., y asignadas a Polyprobe Inc., se muestran matrices de ácidos nucleicos ensambladas sustancialmente después de la hibridación de los ácidos nucleicos y que se caracterizan por arquitectura tipo dendrítica, pero estructuralmente distintas de los dendrímeros orgánicos y de ácido nucleico mencionados anteriormente. El diseño molecular único de las matrices de Polyprobe acomoda grandes cantidades de marcadores, provocando una amplificación de más de 100 veces de la señal en comparación con diversos métodos de la técnica anterior - los ácidos nucleicos diana se pueden detectar incluso cuando están presentes en la muestra en cantidades extremadamente pequeñas (por ejemplo, femptogramo (10^{-15})). Por lo tanto, la tecnología de Polyprobe representa una mejora significativa sobre los métodos de detección de ácidos nucleicos del estado de la técnica, más notablemente PCR.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una mejora de los dendrímeros de ácido nucleico descritos en las patentes de Nilsen mencionadas anteriormente, y que muestran un autoensamblaje máximo. Un aspecto de la presente invención proporciona un polinucleótido dendrítico que tiene una pluralidad de brazos de hibridación monocatenarios; comprendiendo dicho polinucleótido una pluralidad de monómeros polinucleotídicos unidos entre sí por hibridación; teniendo cada monómero polinucleotídico una región intermedia que comprende una región de cintura bicatenaria lineal que tiene un primer extremo y un segundo extremo, terminando dicho primer extremo con dos regiones de hibridación monocatenarias, cada una de una cadena de la región de cintura, y terminando dicho segundo extremo en una o dos regiones de hibridación monocatenarias, cada una de una cadena de la región de cintura; y en dicho polinucleótido dendrítico, cada monómero polinucleotídico está unido por hibridación a al menos un monómero polinucleotídico diferente en al menos una de dichas regiones de hibridación; y donde cada una de dichas regiones de hibridación y dichas regiones de cintura de dicha pluralidad de monómeros comprende secuencias que no contienen repeticiones de subsecuencias que tienen X nucleótidos, donde X es un número entero de al menos 2. En realizaciones preferidas, X es un número entero de 2 a aproximadamente 7; en realizaciones más preferidas, X es 3, 4 ó 5.

La naturaleza y constitución de los ADN que comprenden los monómeros permiten un ensamblaje extremadamente preciso y controlado, por ejemplo, un autoensamblaje máximo, de las matrices dendríticas de ácido nucleico de la invención. Es decir, las regiones de hibridación de un monómero dado hibridan sustancialmente sólo con una región de hibridación sustancialmente complementaria de otro monómero. Por lo tanto, se reduce la autohibridación, preferiblemente hasta un grado que sea insignificante. Las ventajas son que se reduce la interferencia con el ensayo, conduciendo a una exactitud y sensibilidad superiores.

También se describen composiciones, kits y métodos para preparar y usar los polinucleótidos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1A es un diagrama esquemático de una realización preferida de la presente invención, concretamente siete oligómeros de ácido nucleico monocatenarios únicos usados para ensamblar los presentes monómeros de ácido nucleico. Las líneas continuas representan secuencias de cadena "+" y las líneas interrumpidas representan secuencias de cadena "-". La Fig. 1B representa los heterodímeros (monómeros de dendrímeros) que se usan como componentes básicos para el ensamblaje de dendrímeros de ácido nucleico. El heterodímero A es un monómero central ya que los brazos de heterodímeros B' y B'' pueden hibridar con A. A su vez, los brazos de C' y C'' pueden hibridar con los tres brazos de B' y B''.

La Fig. 2A ilustra esquemáticamente un dendrímero de un ácido nucleico de una capa, en el que un monómero iniciador hibrida con 4 monómeros de tipo B; la Fig. 2B ilustra esquemáticamente un dendrímero de ácido nucleico de dos capas; La Fig. 2C ilustra esquemáticamente un dendrímero de ácido nucleico de 3 capas; y la Fig. 2D ilustra esquemáticamente un dendrímero de ácido nucleico de 4 capas. Nota: el volumen adicional de los dendrímeros de 3 y 4 capas necesita que se representen proporcionalmente más pequeños que los dendrímeros de 1 y 2 capas.

Las Fig. 3 y 4 son gráficos de barras que muestran el contenido de GC para subsecuencias oligoméricas que tienen longitudes de 29 y 49 bases, respectivamente, obtenidas a partir de una secuencia de ADN maestra preferida anterior.

La Fig. 5 es un diagrama esquemático de una estructura monomérica "globo-cintura".

La Fig. 6 ilustra configuraciones dendríticas de ácido nucleico bicatenario.

La Fig. 7 ilustra configuraciones dendríticas de ácido nucleico de 4 cadenas.

La Fig. 8 es una ilustración de los impedimentos estéricos creados cuando se utilizan 5 cadenas para el ensamblaje de dendrímeros utilizando monómeros de dendrímero de 4 brazos. Las estructuras son "árboles de ácido nucleico" o dendrímeros compuestos de capas de ácido nucleico, estando cada capa compuesta de heterodúplex parcialmente monocatenarios, denominados en este documento monómeros de dendrímero. La capa más exterior de un dendrímero de ácido nucleico dado tendría múltiples brazos monocatenarios capaces de hibridar con una secuencia de ácido nucleico complementaria. Los monómeros de dendrímero tienen la propiedad de que la adición secuencial de monómeros produciría una estructura tridimensional compuesta de ácido nucleico.

La Fig. 9 es un gráfico que ilustra el crecimiento dendrítico de ácido nucleico, donde (*) representa la proporción del volumen de la cubierta al volumen de la esfera, (\blacklozenge) representa la proporción de volumen total del dendrímero a través de la capa k-1 al volumen añadido por la capa k, (X) representa la proporción de volumen total de ADN dendrítico a través de la capa k a volumen de la esfera k, y (\bullet) representa la proporción de volumen de ADN dendrítico añadido en la capa k al volumen de cubierta de la capa k.

Descripción detallada de la invención

Idealmente, una estructura de ácido nucleico dendrítico estará altamente ramificada a un peso molecular relativamente bajo, tendrá múltiples especificidades de secuencia, estará compuesta de sólo unas pocas cadenas únicas, tendrá crecimiento controlado predecible y minimizará el impedimento estérico para la adición de monómeros. Los dendrímeros de ácido nucleico pueden ensamblarse mediante hibridación usado tan solo dos moléculas monocatenarias. Sin embargo, se prefiere el uso de 7 moléculas monocatenarias porque produce una estructura con muchas características deseables. Diversas configuraciones de moléculas de ácido nucleico pueden dar lugar a grandes estructuras dendríticas. Las estructuras particulares descritas en este documento representan un equilibrio entre complejidad de reactivos, su facilidad de síntesis y la velocidad de crecimiento geométrico del dendrímero con cada capa adicional por hibridación.

En las estructuras descritas, un monómero de dendrímero de iniciación que es un heterodímero de dos moléculas de ácido nucleico parcialmente monocatenarias con dos regiones monocatenarias a(+) y dos regiones monocatenarias c(+), proporciona cuatro brazos con los que hibrida la primera capa de cuatro monómeros de dendrímero (véanse las Figuras 1 y 2). Como el iniciador, los monómeros de dendrímero de la primera capa también tienen cuatro regiones monocatenarias, una secuencia única (-), a(-) o c(-), y tres secuencias (+), d(+) o e(+). Los monómeros de la segunda capa son similares al iniciador y a los monómeros de la primera capa, excepto en que la secuencia (-) es d(-) o e(-) y las secuencias (+) son a(+) o c(+). Por lo tanto, a partir del iniciador que tiene secuencias a(+) y c(+), la primera capa se añade generando el dendrímero de la primera capa con secuencias d(+) y e(+). La adición de la segunda capa regenera las secuencias a(+) y c(+), permitiendo de este modo el ensamblaje geométrico de la estructura dendrítica por hibridación alterna de monómeros de dendrímero. Por la cuarta capa, el ensamblaje producirá moléculas con 324 regiones monocatenarias (ss), 2.916 regiones ss por la sexta capa y 26.244 regiones ss por la octava capa.

La Figura 1a representa los siete oligómeros de ácido nucleico monocatenarios usados para el ensamblaje de monómeros dendríticos o de matriz preferidos. Estas siete moléculas en total, están compuestas de seis secuencias oligoméricas - cuatro secuencias de brazo y dos secuencias de cintura. Cada segmento denominado por una letra (a, b, c, d, e) indica una de las secuencias únicas en los diferentes oligómeros. Para cada oligómero representado, la línea continua representa cadenas "+" (positivas) y las líneas discontinuas representan secuencias de cadena "-" (negativa) o complementaria. Cada una de las secuencias (a, b, c, d, e) está diseñada para que tengan una similitud de secuencia mínima entre sí.

Como se muestra en la figura 1b, los monómeros A, B', B'' C' y C'' son las unidades de repetición de la estructura y se llaman monómeros de dendrímero. Los monómeros se ensamblan a partir de los siete reactivos monocatenarios ilustrados en la Figura 1A. El iniciador o monómero "A" es ss1(+) hibridado con ss2(+). El monómero A tiene cuatro brazos monocatenarios, siendo cada uno complementario a uno de los brazos monocatenarios de los monómeros B' y B''. El número de cadena 4 es la cadena de cintura (-) para los dos monómeros de tipo B. La cadena 4 hibrida con las cadenas número 3 (para B') o cadena número 5 (para B''). El monómero B' puede hibridar con dos de los brazos del monómero A, el iniciador, mientras que B'' puede hibridar con los otros dos brazos del monómero iniciador A. La hibridación por saturación de sitio con los brazos ss de un monómero A con 4 monómeros de tipo B forma la estructura dendrítica de una capa ilustrada en la Fig. 2A. No es posible otra hibridación cuando se sigue la secuencia de etapas propuesta. Juntos, los monómeros B' y B'' saturan todos los sitios de hibridación disponibles del monómero A iniciador.

De un modo similar, las cadenas con los números 6 y 7, hibridan con la cadena número 2, para formar monómeros C' y C''. Estos monómeros tipo C tienen la capacidad de saturar por hibridación todos los sitios monocatenarios de los monómeros B' y B'', completando de este modo el ensamblaje del reactivo dendrítico a través del número de capa 2, como se ilustra en la Fig. 2B. Adiciones alternantes de B' y B'' seguido de C' y C'' conduce al crecimiento del dendrímero como se representa en las Fig. 2C y 2D.

Cada monómero tiene cuatro brazos monocatenarios con un brazo (-) para la unión, de modo que cada adición triplica la cantidad de brazos monocatenarios disponibles para la hibridación posterior. La primera capa tiene 12 brazos, la segunda 36, la tercera 108, la cuarta 324, etc. Además de triplicar la cantidad de brazos monocatenarios, la adición de cada capa dobla aproximadamente la masa total de la estructura en crecimiento. Los dendrímeros de 2 capas tienen 17 monómeros (monómero de iniciación, 4 monómeros en la primera capa y 12 monómeros en la segunda capa) y 36 extremos, y por consiguiente, la tercera capa tiene 36 monómeros. Por lo tanto, en cada fase de crecimiento del dendrímero, dos terceras partes de toda la masa están en la capa superficial.

Los oligómeros pueden tener una amplia diversidad de composición de bases y longitud. En realizaciones preferidas, la composición de bases se selecciona de modo que los oligómeros tengan una homología no específica mínima y longitudes que permitan la hibridación específica, pero que sean suficientemente cortos para una producción eficaz. La minimización de la homología no específica es significativa en dos aspectos. Primero, los reactivos están extremadamente limitados en su capacidad de autohibridar. Segundo, están limitados en términos de las porciones complementarias de otros reactivos con los que hibridan y, por lo tanto, dirigen el ensamblaje de las matrices de ADN de un modo preciso y controlado. En general, las longitudes de los oligómeros varían de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 bases.

En realizaciones más preferidas, las matrices de ácido nucleico de la presente invención se preparan usando secuencias tipo "Euler". Estas matrices muestran no sólo una ausencia de autohibridación, sino que las secuencias Euler hibridan sólo con su complemento Euler. En estas realizaciones preferidas, se preparan oligómeros no auto-hibridantes diseñando una denominada secuencia maestra caracterizada por la ausencia de subsecuencias repetidas de una longitud particular. Para calcular la longitud y composición de dicha secuencia maestra, la longitud mínima "X" de la subsecuencia no repetida se selecciona de modo que sea lo más pequeña posible. La longitud (L) de la secuencia maestra se calcula después usando la siguiente fórmula:

L = ((4^{x} - P) + 2) + (x - 1)

en la que x = la longitud de la subsecuencia no repetida; y P = cantidad de subsecuencias palindrómicas que tienen una longitud x. Los palíndromos existen sólo para subsecuencias que tienen un mínimo de dos bases y un número constante de bases. Por ejemplo, cuando x = 3 ó 5, P = 0.

La aplicación de la fórmula a una realización en la que x = 2 (de modo que la secuencia maestra no contenga repeticiones de subsecuencias que tienen dos o más nucleótidos) funciona del siguiente modo. Primero, la cantidad de "oligómeros de dos unidades" se calcula como 4^{2} = 16. Los 16 oligómeros de 2 unidades son los siguientes: AA, AC, AG, AT, CA, CC, CG, CT, GA, GC, GG, GT, TA, TC, TG y TT. Hay 4 palíndromos, concretamente: TA, AT, GC y CG. El diseño de la secuencia maestra comienza eligiendo uno de los 12 oligómeros de 2 unidades restantes, que necesita la elección de un segundo oligómero de 2 unidades complementario al primer oligómero de 2 unidades. La selección arbitraria de los oligómeros de 2 unidades AA produce lo siguiente:

100

En este caso, la selección del oligómero de 2 unidades AA necesita la selección del oligómero de 2 unidades TT para la cadena complementaria. La selección de la tercera base para la cadena de arriba (es decir, la cadena positiva o de Watson) debe después ser C o G, porque la selección de A violaría la regla de que no debe tener repeticiones de oligómeros de 2 unidades, y AT es una subsecuencia palindrómica. Por tanto, la elección de C provoca el crecimiento de la secuencia maestra bicatenaria

5' A A C 3'

3' T T G 5'

Los oligómeros de 2 unidades AC y GT se eliminan de su uso adicional. La siguiente selección para la cadena de arriba puede ser A (es decir, CA), C (es decir, CC), o T (es decir, CT). La elección de "A" limita la cuarta base a G (siendo AG el último oligómero de 2 unidades), mientras que la elección de C o T permite una mayor flexibilidad (es decir, A o T si se elige C, y C o G si se elige T). En el diseño de la secuencia maestra, los nucleótidos deben elegirse para maximizar las elecciones de al menos el siguiente nucleótido. Eligiendo "C" se produce la secuencia bicatenaria

5' A A C C 3'

3' T T G G 5'

de modo que los oligómeros de 2 unidades CC y GG se eliminan como futuras elecciones.

La quinta base para la cadena de arriba puede ser A o T. La elección de A impondrá que la sexta base sea G (ya que AG es ahora el último oligómero de 2 unidades restante que comienza con "A"). Eligiendo T, por otro lado, permite que C o G sea la sexta base. Por lo tanto, T es la elección para la quinta base en la cadena de arriba.

5' A A C C T 3'

3' T T G G A 5'

Ahora, se han eliminado CT y AG. Independientemente de si se añade C o G como sexta base, A debe ser la séptima base (porque CA y GA son los últimos oligómeros de 2 unidades restantes de los que elegir). La secuencia maestra entonces se completa del siguiente modo:

5' A A C C T C A 3'

3' T T G G A G T 5'

y se han utilizado los 12 oligómeros de 2 unidades.

Es evidente que pueden diseñarse muchas diferentes secuencias maestras que cumplen los mismos criterios. Sencillamente, el diseño de secuencias maestras que no tienen repeticiones de subsecuencias que tienen longitudes de 3, 4, o incluso 5 bases es más complicado que el de una secuencia maestra que no tiene repeticiones de subsecuencias que tienen longitudes de dos bases. Sin embargo, el seguimiento de las reglas anteriores conduce fácilmente a una secuencia maestra. La presente invención no requiere que la totalidad de la secuencia maestra se caracterice por no tener repeticiones de subsecuencias que tienen una longitud única predeterminada. Porciones de la secuencia maestra pueden no contener repeticiones de subsecuencias que tienen una longitud predeterminada y otras porciones que no tienen repeticiones de subsecuencias de una segunda longitud diferente. A continuación se exponen ejemplos de dichas secuencias, indicadas como las SEC ID Nº: 1 y 2. Estas dos secuencias contienen ambas 261 pares de bases, donde las primeras 86 pares de bases no tienen repeticiones de subsecuencias que tienen una longitud de más de 3 bases, y la secuencia completa, es decir, bases 1-261, no tiene repeticiones de subsecuencias que tienen longitudes superiores a 4 bases.

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1

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2

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Dependiendo del resultado deseado, pueden elegirse diferentes porciones de estas secuencias maestras como oligómeros que finalmente constituyen las secuencias de cintura o brazo de los monómeros. Por ejemplo, la selección de una secuencia de una longitud dada con un contenido relativamente alto de GC producirá un oligómero que tiene una temperatura de fusión relativamente alta. Esto es ventajoso en el diseño de estructuras que se fundirán parcialmente, es decir, se desnaturalizarán de un modo controlado y predecible. Las Fig. 3 y 4 son gráficos de barras que muestran el contenido de GC para subsecuencias que tienen longitudes de 29 y 49 bases, respectivamente, para las secuencias maestras anteriores. La secuencia parcial definida por las primeras 86 bases en la secuencia analizada en la Fig. 8 no tiene repeticiones superiores a 3 bases, y la secuencia definida por las bases 1-261 no tiene repeticiones superiores a 4 bases. Lo mismo es cierto para las secuencias parciales respectivas analizadas en la Fig. 9. Este tipo de análisis posibilitaría que un especialista en la técnica seleccione una porción de la secuencia maestra que tiene un punto de fusión predeterminado. Las secuencias maestras también pueden elegirse de modo que maximicen la flexibilidad en la selección de las diversas secuencias de cintura y brazo. Por ejemplo, se eligen más fácilmente 4 oligómeros de brazo de 30 bases y 2 oligómeros de cintura de 50 bases, teniendo cada uno diferentes puntos de fusión, etc., a partir de una secuencia maestra que contiene más de 220 (es decir, (4 x 20) + (2 x 50)) bases de longitud en oposición a una secuencia maestra que tiene una longitud de exactamente 220 bases.

En una realización más preferida, la secuencia maestra no contiene repeticiones de subsecuencias que contienen 4 o más nucleótidos. En estas realizaciones, las secuencias maestras tendrán una longitud (L) de ((4^{4} - 16) \textdiv 2) + (4 - 1) = 123 bases, bicatenaria. Las dieciséis secuencias palindrómicas (es decir, P = 16) son las siguientes: AATT, TTAA, CCGG, GGCC, TATA, ATAT, GCGC, CGCG, ACGT, TCGA, AGCT, TGCA, CATG, CTAG, GATC y GTAC. Dividiendo las 123 bases uniformemente entre los monómeros a, b, c, d, y e se producen 24 bases para cada monómero (es decir, oligómeros de 24 unidades). Los oligómeros de 24 unidades tienen una temperatura de fusión relativamente baja (55-70ºC), de modo que en realizaciones preferidas, la secuencia maestra usada en el ensamblaje de matriz no contiene repeticiones superiores a 4 bases para secuencias a, b, c, d, y e de >30 bases. En estas realizaciones, pueden ensamblarse secuencias bicatenarias maestras de 516 bases de longitud (es decir, (4^{5} \textdiv 2) + (5 - 1) = 516). Los oligonucleótidos que varían en tamaño de 30 a 100 bases sin repeticiones superiores a 4 bases, se construyen en base a una secuencia maestra que tiene 512 bases.

El uso de las secuencias Euler provoca oligómeros que permiten el ensamblaje extremadamente preciso y controlado de las matrices de ácido nucleico de la invención. Los oligómeros y los monómeros que se ensamblan a partir de los mismos no tienen capacidad o una capacidad insignificante de autohibridación. Es decir, hibridan sólo con el oligómero o monómero que tiene una secuencia Euler complementaria, y por tanto reduce la interferencia con el ensayo. El resultado es de mayor exactitud y sensibilidad. Por ejemplo, dos oligómeros monocatenarios que contienen múltiples oligómeros de 3 unidades no repetidos obtenidos de la misma o diferentes secuencias maestras que no contienen repeticiones de subsecuencias que tienen tres o más bases, tendrán una falta de coincidencia del 33% mínima en el apareamiento de bases. De manera similar, cualquier par de oligómeros monocatenarios que tengan múltiples oligómeros de 4 unidades no repetidos diseñados de la misma o diferentes secuencias maestras que no tienen repeticiones de subsecuencias que tienen cuatro o más bases, tendrán una falta de coincidencia del 25% mínima. En el caso de oligómeros que tiene múltiples oligómeros de 5 unidades no repetidos, la falta de coincidencia mínima será del 20%. Este grado de disimilitud de secuencia entre las secuencias oligoméricas de cintura y de brazo asegura además que cada cintura y brazo se unirá sólo a su complemento Euler. Estas realizaciones son igualmente aplicables al diseño de matrices que contienen ácido nucleico isoC, ácido nucleico isoT y ácido nucleico que contiene inosina, porque están todos gobernados por las reglas de hibridación para el ADN.

Los monómeros para la preparación de los dendrímeros de la presente invención tienen una región intermedia que contiene una cintura bicatenaria y dos brazos monocatenarios en cada extremo. En otras realizaciones, se emplean monómeros en los que un extremo del monómero tiene sólo un brazo monocatenario. En otras realizaciones más, se emplean ambos tipos de monómeros. En algunos casos pueden preferirse reactivos monoméricos con tres regiones monocatenarias, porque proporcionan menos impedimento estérico y mayores volúmenes de líquido en el interior del dendrímero. Además, como se ilustra en la Fig. 5, la porción de región intermedia del monómero no tiene que ser completamente bicatenaria a lo largo de su longitud completa, sino que puede incluir porciones monocatenarias entremedias de los extremos del monómero. Dichas estructuras monoméricas tienen un número mayor de sitios de hibridación, si se deseara.

El ensamblaje dendrítico mediante hibridación puede comenzar con una molécula de ácido nucleico iniciadora que tiene tres o más regiones monocatenarias. En estos casos, la hibridación de las moléculas de ácido nucleico a los extremos monocatenarios libres del iniciador genera el producto de la primera capa. En el caso de hibridación de un iniciador con tres brazos con monómeros de dendrímero de tres brazos, se produce una primera capa que tiene seis brazos. La estructura dendrítica de siete cadenas más preferida utiliza monómeros con cuatro brazos; por consiguiente, la primera capa tiene doce brazos. Las posteriores capas de hibridación conducen a una expansión geométrica de los extremos monocatenarios y una organización dendrítica tridimensional de ácidos
nucleicos.

El ensamblaje del dendrímero procede desde moléculas de ácido nucleico monocatenarias purificadas hasta la hibridación con los monómeros del dendrímero, seguido por el ensamblaje de una estructura de ácido nucleico ordenada en solución o en un soporte sólido. Como se usa en este contexto, los "dendrímeros de ácido nucleico" son complejos de ácido nucleico que comprenden subunidades de moléculas de ácido nucleico parcialmente
bicatenarias.

Como se ilustra en la Fig. 6, puede ensamblarse un dendrímero de ácido nucleico en la presente invención a partir de tan sólo dos ácidos nucleicos monocatenarios en los que la cadena 1 = [sec1(+)]_{n}[sec2(-)], cadena 2 = [sec2(+)]_{n}[sec1(-)], y sec1 y sec2 son secuencias de ácido nucleico y (+) y (-) indican secuencias complementarias (véase Fig. 6). La hibridación secuencial de la cadena 2 en exceso con la cadena 1, seguida por un exceso de la cadena 1 y la cadena 2 alternante produce una estructura dendrítica, dado que n es dos o más. Se esperaría que la estructura producida por dos cadenas únicas sea no homogénea, ya que cualquier estequiometría de la cadena 1 con la cadena 2 podría polimerizarse de forma semi-aleatoria por hibridación.

La adición de una tercera cadena que contiene sólo elementos de secuencia (+) puede usarse como iniciador, reduciendo de este modo la no homogeneidad de las estructuras en crecimiento. En efecto, se necesitan tres tipos de monómeros dendríticos (ácidos nucleicos monocatenarios) para la polimerización controlada por hibridación, un monómero "A" que es el iniciador y que lleva sólo secuencias (+), un monómero "B" que forma la primera capa que contiene una secuencia (-) única complementaria a una secuencia en el monómero "A" y secuencias (+)múltiples que difieren de las secuencias (+) encontradas en el monómero "A", y un monómero "C" que contiene una única secuencia (-) complementaria a la secuencia (+) del monómero "B" y múltiples secuencias (+) idénticas a las secuencias (+) del monómero "A".

Una modificación adicional del ensamblaje del dendrímero, ilustrado en la Figura 7, utiliza cuatro cadenas, donde la cadena 1 = [sec1(+)]_{n}, cadena 2 = [sec1(-)] [sec2(+)]_{n}, cadena 3 = [sec2(-)] [sec3(+)]_{n}, y cadena 4 = [sec3(-)] [sec1(+)]_{n}. Estos dendrímeros están compuestos de monómero "A" iniciador, monómeros "B" de la primera capa, monómeros de tipo "C" de la segunda capa, y monómeros de tipo "D" de la tercera capa, seguido por la adición secuencial de monómeros de tipo B, C, y D. Las estructuras dendríticas pueden prepararse incluso más complejas aumentando los tipos de monómeros. Sin embargo, se prefiere minimizar el número de reactivos.

Tres cadenas únicas podrían servir como tres monómeros. Sin embargo, la estructura tipo peine resultante probablemente estaría estéricamente impedida en unos pocos ciclos de hibridación. Monómeros parcialmente bicatenarios que constan de dos cadenas únicas de ácido nucleico pueden superar el impedimento estérico de la estructura tipo peine. En esta configuración, cada molécula monocatenaria tiene tres regiones, 5'\rightarrow3' = [secbrazo1] [seccintura] [secbrazo2]. En esta configuración, cada monómero del dendrímero consta de dos moléculas de ácido nucleico monocatenarias, que producen moléculas con cuatro brazos monocatenarios y una región de cintura bicatenaria. El ensamblaje de los monómeros A-iniciador, B-primera capa y C-segunda capa puede conseguirse con tan sólo cinco moléculas de ácido nucleico monocatenarias. Como se muestra en la Figura 8, sin embargo, la estructura resultante tendría un impedimento estérico aumentado como resultado de la restricción necesaria de tener dos de las cinturas de los monómeros en el mismo extremo de dos de las secuencias de brazo de cada monómero.

El espaciado máximo de los monómeros del dendrímero puede conseguirse con tan sólo siete ácidos nucleicos monocatenarios. Otro perfeccionamiento es la incorporación de dos diferentes secuencias de cintura, que sirven para minimizar el intercambio de cadenas entre monómeros de dendrímero y limita adicionalmente los acontecimientos de hibridación no deseables. Además, los dendrímeros resultantes presentan dos tipos de brazos monocatenarios en cantidades iguales en cada capa, permitiendo de este modo que un tipo de brazo se use para la hibridación con una secuencia diana particular y el otro brazo se use para la unión de moléculas señal.

Para reforzar y ayudar a mantener la integridad estructural del dendrímero de ácido nucleico ensamblado, una pluralidad, y preferiblemente todas las uniones inter-monómero (es decir, los brazos complementarios que están unidos por hibridación) se entrecruzan. En realizaciones más preferidas, la región de cintura bicatenaria de una pluralidad de, o incluso más preferiblemente todos los monómeros, está también entrecruzada. El solicitante ha descubierto que entrecruzando la matriz en estas localizaciones se produce una estructura sustancialmente más estable. El entrecruzamiento puede realizarse con una diversidad de agentes, de acuerdo con los procedimientos convencionales. Los agentes de entrecruzamiento adecuados incluyen mitomicina C (por ejemplo, Tomasz, et al., Science 235:1204-1208 (1987); Basu et al., Biochemistry 32:4708-4718 (1993); Borowy-Borowski et al., Biochemistry 29:2999-3006 (1990); y Norman et al., Biochemistry 29:2861-2895 (1990)), daunomicina y otros agentes anti-cáncer que ejercen un efecto anti-cáncer por entrecruzamiento del ADN, diazida de etidio, cisplatino, compuestos tipo EDC y
psoralenos.

Los especialistas en la técnica reconocerán que los requisitos de secuencia y las condiciones de funcionamiento varían dependiendo del agente de entrecruzamiento específico. Véase, por ejemplo, además de las publicaciones mencionadas anteriormente, Summerton et al., J. Mol. Biol. 122:145-162 (1978). Por ejemplo, mitomicina C prefiere 5' CpG. Para condiciones de reacción en general, se realizan reacciones de entrecruzamiento a T_{m} de aproximadamente -20ºC, y pH neutro. Se proporciona una guía abundante en al bibliografía para posibilitar que un especialista en la técnica entrecruce los dendrímeros de ácido nucleico de la presente invención. Véase, por ejemplo, The Pierce Catalog, y Patente de Estados Unidos Nº 5.543.507, titulada "Covalently Cross-linked Oligonucleotides", y la bibliografía revisada en la misma, específicamente Grineva et al., FEBS., 351-355 (1973); Summerton et al., J. Mol. Biol. 122:145-162 (1978); Summerton et al., J. Theor. Biol. 78:61-75 (1979); Patente de Estados Unidos Nº 4.123.610; Meyer et al., J. Amer. Chem. Soc., 111:8517-19 (1989); Matteucci et al., Nucleic Acids Res., 14:7661-7674 (1986); Matteucci et al., Tetrahedron Letters, 28:2469-2472 (1987); Ferentz, et al., J. Am.Chem. Soc., 113:4000-4002 (1991); Lee, et al., Biochemistry, 27:3197-3203 (1988); Manoharan, et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7217-7219 (1987); Manoharan, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:2690-2691 (1988); Vasseur, et al., Nucleosides & Nuclotides 8:863-866 (1989); Bertrand, et al., Nucleic Acids Research, 17:10307-10319 (1989); Philippe, et al., Tetrahedron Letters, 31:6347-6350 (1990); P. Iyer, et al., Nucleic Acids Research, 18:2855-2859 (1990); Groehke, et al., Helvetica Chimica Acta, 73:608-617 (1990); y Peoc'h et al., Tetrahedron Letters, 32:207-210 (1991).

Se prefiere el tratamiento con psoraleno. A causa de su estructura plana, los psoralenos pueden intercalarse entre los pares de bases en una estructura molecular de doble hélice de los ácidos nucleicos. Después de radiación con luz de longitud de onda UVA apropiada, por ejemplo, de aproximadamente 315 nm a aproximadamente 350 nm, los psoralenos pueden formar enlaces covalentes con nucleótidos de pirimidina que suceden como entidades integrales de las cadenas de ácido nucleico. Además del psoraleno, los derivados de psoraleno para el entrecruzamiento incluyen 8-metoxipsoraleno, 4,5',8-trimetilpsoraleno, y aductos 4' de trioxaleno (por ejemplo, 4'-hidroximetil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-metoximetil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'N-ftalimidometil-4,5',8-trimetilpsoraleno, y clorhidrato de 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno). Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
4.196.281.

En general, el entrecruzamiento por psoraleno se realiza de acuerdo con procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Cimino et al., Annu. Rev. Biochem. 54:1151-1193 (1985); Shi et al., Biochemistry 25:5895-5902 (1986); y Cimino et al., Biochemistry 25:3013-3020 (1986). Véase también la Patente de Estados Unidos Nº 4.196.281 titulada "PSORALENS", que se refiere a los aductos 4' de trioxaleno como agentes de entrecruzamiento de ácido nucleico. La Patente '281 proporciona adicionalmente una guía sobre la determinación de diversos parámetros de reacción tales como la solubilidad del psoraleno en solución acuosa, y la constante de disociación para la unión no covalente del psoraleno con ácido nucleico. Por tanto, cuanto mayor es la solubilidad, mayor es la cantidad de moléculas en el medio líquido que rodea disponible para los sitios de unión. De forma similar, cuanto menor es la constante de disociación, mayor es la cantidad de psoralenos que ocupan un sitio de unión potencial en cualquier momento en el tiempo. En realizaciones preferidas, la Tm es aproximadamente -20ºC, la concentración de ácido nucleico es menor de aproximadamente 100 ng/\mul y el psoraleno se recristaliza inmediatamente antes de su
uso.

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La naturaleza polianiónica de los ácidos nucleicos asegura que las construcciones de ácido nucleico sean casi esféricas, líquidas en, y tengan diferentes concentraciones de ácido nucleico en diferentes capas. Con cada adición sucesiva, el volumen de la esfera teórica capaz de contener una capa particular aumenta por el volumen adicional presente en la última capa de hibridación, es decir, la capa de cubierta. Además, el ácido nucleico añadido con cada capa aumenta muy rápidamente y se aproxima dos veces a la suma de todos los ácidos nucleicos presentes antes de la adición. Por lo tanto, según se acumulan las capas adicionales, el volumen parcial de la esfera en la que contribuye la cubierta, disminuye mientras que el volumen parcial del ácido nucleico presente en el dendrímero del ácido nucleico se duplica. Obviamente, el volumen del ácido nucleico presente en la cubierta o en la última capa de adición no puede ser mayor al volumen de la cubierta - una saturación de la cubierta sucede en algún número de capa. La capa en la que sucede la saturación de ácido nucleico en la cubierta define el inicio de una membrana de ácido nucleico semipermeable, y se indica experimentalmente por una progresión casi lineal del ácido nucleico total que comprende el dendrímero, en oposición a la progresión geométrica del ácido nucleico total observada antes de la saturación. La saturación del ácido nucleico en la cubierta podría deberse al impedimento estérico (volumen/volumen), o la alta concentración de carga negativa en la cubierta. En cualquier caso, el ácido nucleico adicional se excluye parcialmente de todos los posibles híbridos en formación incluso en la capa de cubierta, y se excluye completamente del interior del dendrímero.

Los dendrímeros construidos de monómeros de la misma configuración o similar pueden describirse en términos de los siguientes parámetros: la cantidad total de monómeros, la cantidad de monómeros añadidos en una capa adicional dada, el radio de la esfera, el volumen de la esfera, el volumen de la cubierta, el volumen total del ácido nucleico (NA) y el volumen del ácido nucleico añadido en un ciclo de adición dado. Para dendrímeros construidos con geometrías y tamaños variables del monómero, deben hacerse ajustes en la descripción del monómero en cada número de adición. Sin embargo, pueden usarse incluso monómeros de estructuras, valores de peso medio para bases totales, longitud en bases, volumen, masa, sitios de hibridación y longitud del sitio de hibridación diversos en una descripción para aproximarse a dendrímeros de ácido nucleico no uniformes. A continuación se proporciona un modelo de dendrímeros de ácido nucleico uniformes.

Un dendrímero de ácido nucleico (NA) se define como un conjunto de al menos tres moléculas de ácido nucleico monocatenarias mantenidas en cercana asociación mediante apareamiento de bases intermoleculares, opcionalmente reforzada por entrecruzamientos covalentes intermoleculares. Un monómero de dendrímero se define como una única o un grupo de cadenas NA usadas en el ensamblaje de un dendrímero NA. Este modelo usa cuatro variables de monómero de dendrímero:

: m = bases totales del monómero

: n = longitud del monómero en bases

: j = sitios de hibridación del monómero y

: p = longitud del sitio de hibridación en bases.

Estas variables son suficientes para crear un modelo de crecimiento dendrítico NA.

La longitud del monómero de dendrímero se obtiene de n y se define como la dimensión media más larga proyectada radialmente desde el monómero de dendrímero de iniciación medido en solución. La longitud del monómero de dendrímero se aproxima por el número de bases en la cadena única más larga de un monómero por la distancia por bases.

: Longitud del monómero de dendrímero en nm = n bases x 0,34 nm/base = q nm

Otra longitud importante usada en el modelo es la longitud del sitio de hibridación,

: Longitud del sitio de hibridación del monómero en nm = p bases x 0,34 nm/base = r nm

El volumen de un monómero de dendrímero se define como el disolvente total desplazado por un único monómero. El volumen del monómero de dendrímero se aproxima tratando el monómero como un cilindro como un diámetro de 1,0 (nm) y la longitud como se ha definido anteriormente.

: Volumen de monómero de dendrímero en nm^{-3} = p x (1 nm)^{-2} x q nm = s nm^{-3}

El modelo matemático del ensamblaje dendrítico del ácido nucleico hace varias suposiciones. La primera suposición es que los monómeros de dendrímero contribuyen a la longitud completa menos la longitud de sitio de hibridación para el radio teórico de la esfera. Segundo, el modelo supone que para cada adición, los monómeros añadidos se localizan en la capa de cubierta. Finalmente, los efectos del pH, temperatura y concentración salina se supone que son insignificantes.

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Capa Cero (de Iniciación) de un Dendrímero de Ácido Nucleico

Un único monómero se define como capa número cero.

k = 0

Volumen de la Esfera (0) = (4/3) x p x (radio)^{-3}

El radio (0) para la capa cero es la mitad de la longitud del monómero.

Es decir, Volumen de la Esfera (0) = (4/3) x p x (q nm/2)^{-3}

El Volumen de la Cubierta (0) para el número de capa cero es igual al volumen de la esfera para la capa cero.

El Volumen Total NA (0) para el número de capa cero es igual al volumen de un monómero.

Es decir, Volumen Total NA (0) = s nm^{-3}

El Volumen NA Añadido (0) para el número de capa cero es igual al Volumen Total NA (0).

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Primera Capa de un Dendrímero de Ácido Nucleico

k = 1

En general, los monómeros añadidos en el número de capa uno son iguales al número de sitios de hibridación disponibles por monómero de iniciación.

Radio (1) = q/2 + q - r

Volumen de la Esfera (1) = (4/3) x p x (q/2 + q - r)^{-3}

: Volumen de la Cubierta (1) = Volumen de la Esfera (1) - s

: Volumen NA (1) = j x s

: Volumen Total NA (1) = (1 + j) x s

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Capa k-ésima para un dendrímero generalizado (k>0)

Monómeros Totales (k) = 1 + \frac{j \ x \ (1 - (j -1)^{-k})}{2 - j}

Monómeros Añadidos (k) = j x (j -1)^{-(k} ^{-1)}

Radio de la Esfera (k) = q/2 + k x (q - r)

Volumen de la Esfera (k) = (4/3) x p x (q/2 + k x (q - r))^{-3}

Volumen de la Cubierta (k) = (Volumen de la Esfera (k)) - (Volumen de la Esfera (k - 1))

Volumen Total NA (k) = (Monómeros Totales (k)) x s

Volumen NA Añadido (k) = (Monómeros Añadidos (k)) x s

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Sucesivas adiciones de ácido nucleico producirían una saturación final de la superficie esférica, conduciendo de este modo al "carácter de membrana" de los reactivos; el volumen potencial del ácido nucleico añadido sería superior al aumento en el volumen de la esfera disponible. Después de la capa 11, el ácido nucleico ocuparía el 90% de todo el volumen superficial disponible, representando una densidad aproximada de 899 mg/ml. La concentración de ácido nucleico en la superficie del dendrímero sería extremadamente alta, y la mayoría de todas las moléculas de ácido nucleico estarían libres cerca de la superficie para la hibridación con secuencias complementarias. Además, la alta concentración de ácido nucleico en una esfera de más de 10 ciclos (aunque de menos ciclos pueden tener las propiedades semipermeables deseadas) puede evitar la absorción no específica de ácido nucleico en la estructura dendrítica esférica.

Los parámetros previstos de un ácido nucleico dendrítico producido durante hasta 20 adicciones de monómeros sucesivas se muestran en la Tabla 1, que es un tratamiento matemático de la presente construcción de monómeros formada en dendrímeros de ácido nucleico. A cantidades superiores de capas, el modelo está claramente por debajo de la saturación de ácido nucleico en la cubierta o capas superficiales. La Fig. 3 es una representación gráfica de las relaciones volumétricas como función del número de adiciones.

El ensamblaje de los monómeros de dendrímero de ácido nucleico en los dendrímeros de ácido nucleico podrían realizarse en un soporte sólido, es decir, un sustrato insoluble en agua tal como bolas fluorescentes de poliestireno, membranas de nylon, nitrocelulosa y similares. El monómero "A" del dendrímero central se reemplazaría por una capa de inicio de ácido nucleico monocatenario fijado a la superficie sólida. La capa de inicio de ácido nucleico seleccionada podría ser complementaria a cualquiera de los brazos monocatenarios de los monómeros B', B'', C', C'' descritos anteriormente. La hibridación secuencial con un exceso (B' + B'') seguido por una etapa de lavado (aclarado de un soporte de membrana o centrifugación de bolas de poliestireno) seguido por hibridación con un exceso de (C' + C''), etc., conduciría a una superficie de ácido nucleico semipermeable fijada a un soporte sólido.

Cinética de Hibridación Prevista de Dendrímeros de Ácido Nucleico

Otra vez, sin pretender limitarse por una teoría particular de funcionamiento, puede calcularse la cantidad de ADN necesaria en los dendrímeros para conseguir una velocidad de reacción razonable para la hibridación. La velocidad de renaturalización del ADN completamente desnaturalizado es cinéticamente una reacción de segundo orden, y las constantes de velocidad de renaturalización para los ADN vienen dadas aproximadamente por:

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k_{2} = \frac{3e+5 \ x \ L^{-0,5}}{N}

\hskip1cm

Litros \ mol^{-1} \ segundo^{-1}

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donde L = longitud de la cadena única más corta, y N = complejidad del ADN, o la cantidad de pares de bases no repetitivos (Wetmur & Davidson, J. Mol. Biol. 31:349-370 (1968). La velocidad prevista de hibridación de los ácidos nucleicos debe aplicarse a las moléculas dendríticas ya que se ha demostrado que los valores experimentales de k_{2} son aplicables a ADN de bacteriófagos rotos y no rotos T4 y T7, y de E. coli, que tienen un peso molecular comparable con la masa prevista de los dendrímeros de ácido nucleico.

Como ejemplo, un dendrímero de seis capas construido de 110 monómeros básicos estaría compuesto por 1.457 monómeros, que corresponde a un total de 160.270 pares de bases. Este tamaño contrasta con las 39.936 pares de bases del ADN del bacteriófago T7; es decir, los dendrímeros de seis capas son aproximadamente cuatro veces mayores que el ADN de T7. Estos dendrímeros tienen 2.916 secuencias de brazo monocatenario, 1.458 brazos de dos tipos, disponibles para la hibridación con un ADN único con una secuencia de 50 nucleótidos (nt) de longitud a detectar.

Como cada reacción conduce a los mismos 50 pares de bases, N = 50. L es la longitud de la región monocatenaria más corta que participa en la reacción, en este caso, L = 50. Por tanto, la constante de velocidad es:

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k_{2} = \frac{3e5 \ x \ 50^{-0,5}}{50} = 4,24e+4

\hskip1cm

L \ mol^{-1} \ segundo^{-1}

\vskip1.000000\baselineskip

Se supone que la reacción está dirigida por la concentración de matriz de ADN (para condiciones de detección igual de sensibles). Se puede ignorar la concentración del ADN diana en la muestra, y por tanto determinar la concentración del ADN del dendrímero necesaria para los parámetros de hibridación necesarios. Si la concentración de dendrímero es 1 mg/ml, es decir, 3e-6 M, y como el 50% de los nucleótidos está disponible para la reacción, es decir, la mitad de los brazos ss:

C_{0} \ de \ brazos \ monocatenarios = 3e-6/2 = 1,5e-6 \ molar.

Por tanto, la mitad del tiempo de reacción, t_{1/2} = ln2/[4,24e4 x 1,5e-6] = 11segundos o t_{3/4} <0,5 min. Este cálculo se ha verificado para predecir de forma exacta los resultados de hibridación de oligonucleótidos con secuencias complementarias unidas covalentemente a la superficie de perlas. Este cálculo supone que todos los oligonucleótidos del dendrímero están disponibles para la reacción (o la proporción está disminuida proporcionalmente) y que la mezcla es completa (o la reacción consta de una reacción homogénea rápida seguida por una reacción controlada por difusión más lenta). Para el ejemplo dado, es decir, concentración de dendrímero igual a 1 mg/ml, más del 75% de todos los puentes posibles se formarán en treinta segundos. Obsérvese, que 1 mg/ml es igual a 1 ng/ml, de modo que 50 ml de reacción necesitarían sólo 50 ng de dendrímero de ADN para una captura del 75% de una molécula de ácido nucleico de 50 unidades, independientemente de la concentración del oligómero de 50 unidades.

TABLA 1

Total de Bases del Monómero de la Matriz	200
Longitud en Bases del Monómero de la Matriz	110
Longitud del Monómero de la Matriz (nm)	37,4
Volumen del Monómero de la Matriz (nm)^{-}3	2,94e+01
Masa del Monómero de la Matriz (mg)	1,21e-16
Sitios de Hibridación del Monómero	4
Longitud del Sitio de Hibridación (PB)	30
Longitud del Sitio de Hibridación (nm)	10,2

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3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  *  \begin{minipage}[t]{150mm} Para estos números de capa, la
concentración de ácido nucleico se prevé que sea o esté por encima
de la de una solución saturada, es decir, el modelo se ha derrumbado
y el número de brazos monocatenarios, la masa y la concentración
prevista del ADN debe de tener todo valores
inferiores.\end{minipage} \cr}

Abreviaturas

PB = pares de bases

C_{0} = concentración a tiempo cero

ADN = ácido desoxirribonucleico

ds = bicatenario

l = litros

ln = logaritmo natural

M = Molar

-mer = oligómero

mg = miligramo

ml = mililitro

NA = ácido nucleico

nm = nanómetros

nt = nucleótido

ARN = ácido ribonucleico

ss = monocatenario

t = tiempo

mg = microgramo

ml = microlitro

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Símbolos

x = multiplicación

p = pi \sim 3,1415926

^{-} = elevado a la potencia

e = exponente en base 10

[ ] = concentración

Los polinucleótidos dendrímeros de la presente invención pueden usarse para preparar composiciones como las reivindicadas en el documento U.S. 5.175.270 y en ensayos como se describe y reivindica en el documento U.S. 5.487.973.

Aplicabilidad industrial

La presente invención es útil en ensayos para la detección de una diversidad de analitos de interés, incluyendo ácidos nucleicos y antígenos.

Todas las patentes y publicaciones que no son patentes citadas en esta memoria descriptiva indican el nivel de especialidad de los especialistas en la técnica a la que esta invención pertenece.

Aunque la invención en este documento se ha descrito con referencia a realizaciones particulares, debe entenderse que estas realizaciones son simplemente ilustrativas de los principios y aplicaciones de la presente invención. Por lo tanto, tiene que entenderse que pueden hacerse numerosas modificaciones a las realizaciones ilustrativas.

<110> Nilsen, Thor

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<120> ÁCIDOS NUCLEICOS DENDRÍTICOS QUE MUESTRAN UN AUTOENSAMBLAJE MÁXIMO

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<130> POLYPROBE 304-010 BUROPAT

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<140> 98 937 269.3

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<141> 27-01-2000

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 261

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<212> ADN

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<213> Organismo Desconocido

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<220>

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<223> Descripción de Organismo Desconocido: secuencia ilustrativa de ADN

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<400> 1

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4

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<210> 2

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<211> 261

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<212> ADN

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<213> Organismo Desconocido

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<220>

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<223> Descripción de Organismo Desconocido: secuencia ilustrativa de ADN

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<400> 2

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5

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Claims

1. Un polinucleótido dendrítico que tiene una pluralidad de brazos de hibridación monocatenarios; comprendiendo dicho polinucleótido una pluralidad de monómeros polinucleótidos unidos entre sí por hibridación; teniendo cada monómero polinucleótido una región intermedia que comprende una región de cintura, bicatenaria, lineal, que tiene un primer extremo y un segundo extremo, terminando dicho primer extremo en dos regiones de hibridación monocatenarias, cada una de una cadena de la región de cintura, y terminando dicho segundo extremo en una o dos regiones de hibridación monocatenarias, cada una de una cadena de la región de cintura; y en dicho polinucleótido dendrítico, cada monómero polinucleotídico está unido por hibridación a al menos un monómero polinucleotídico diferente en al menos una de dichas regiones de hibridación;

y en el que cada una de dichas regiones de hibridación y dichas regiones de cintura de dicha pluralidad de monómeros consta de secuencias obtenidas de una secuencia maestra que no contiene repeticiones de subsecuencias que tienen X nucleótidos, donde X representa un número entero de al menos 2.

2. El polinucleótido dendrítico de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de monómeros polinucleotídicos de matriz presentes no exceden la saturación del polinucleótido dendrítico.

3. El polinucleótido dendrítico de la reivindicación 1, en el que las regiones de hibridación que están unidas entre sí están entrecruzadas.

4. El polinucleótido dendrítico de la reivindicación 1, en el que las regiones de cintura de dichos monómeros están entrecruzadas.

5. El polinucleótido dendrítico de la reivindicación 1, en el que las regiones de cintura e hibridación están entrecruzadas.

6. El polinucleótido dendrítico de la reivindicación 1, en el que X es 3.

7. El polinucleótido dendrítico de la reivindicación 1, en el que X es 4.

8. El polinucleótido dendrítico de la reivindicación 1, en el que X es 5.

9. Una composición para su uso como reactivo de hibridación para la detección de una secuencia de ácido nucleico, que comprende un polinucleótido dendrítico que tiene una pluralidad de brazos de hibridación monocatenarios; comprendiendo dicho polinucleótido una pluralidad de monómeros polinucleotídicos unidos entre sí por hibridación; teniendo cada monómero polinucleotídico una región intermedia que comprende una región de cintura bicatenaria, lineal, que tiene un primer extremo y un segundo extremo, terminando dicho primer extremo en dos regiones de hibridación monocatenarias, cada una de una cadena de la región de cintura, y terminando dicho segundo extremo en una o dos regiones de hibridación monocatenarias, cada una de una cadena de la región de cintura; y en dicho polinucleótido dendrítico cada monómero polinucleotídico está unido por hibridación a al menos un monómero polinucleotídico diferente en al menos una de dichas regiones de hibridación;