ES2255047T3 - Tipificacion de adn y polimorfismos repetidos en tandem cortos e identificacion de repeticiones polimorficas en tandem corto. - Google Patents
Tipificacion de adn y polimorfismos repetidos en tandem cortos e identificacion de repeticiones polimorficas en tandem corto.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA PRUEBA DE DNA PARA DETECTAR POLIMORFISMOS. EL METODO INCLUYE LOS PASOS DE EXTRAER DNA A UNA MUESTRA A COMPROBAR, AMPLIFICAR EL DNA EXTRAIDO E IDENTIFICAR LOS PRODUCTOS DE EXTENSION AMPLIFICADOS PARA CADA SECUENCIA DIFERENTE. CADA SECUENCIA DIFERENTE SE ETIQUETA DE FORMA DIFERENTE. UNA SECUENCIA DE REPETICION DE TANDEM CORTO PUEDE CARACTERIZARSE POR LA FORMULA (AWGXTYCZ)N, EN DONDE A, G, T Y C REPRESENTAN LOS NUCLEOTIDOS, W, X, Y Y Z REPRESENTAN EL NUMERO DE NUCLEOTIDOS Y OSCILAN ENTRE 0 Y 7 Y LA SUMA DE W, X, Y Y Z OSCILA ENTRE 3 Y 7 Y N REPRESENTA EL NUMERO DE REPETICION Y OSCILA ENTRE 5 Y 50.
Description
Tipificación de ADN y polimorfismos repetidos en
tándem cortos e identificación de repeticiones polimórficas en
tándem corto.
La presente invención se relaciona en general con
un método de tipificación de ADN para detección de secuencia
repetida en tándem corto. Más particularmente, se relaciona con el
método de detección de secuencia repetida en tándem corto el cual
muestra polimorfismos en el número de repeticiones para la
detección o identificación de muestras médicas y forenses,
paternidad, origen de muestras y origen de tejidos. Adicionalmente,
se relaciona además con el método de identificación de repeticiones
en tándem corto polimórficas y genomas.
El volumen de crímenes cometidos en los Estados
Unidos ha aumentado con el incremento de población y expansión de
los centros de población. Una gran porción de crímenes violentos
involucra la creación de evidencia de fluidos corporales que tienen
el potencial de suministrar información significativa acerca del
perpetrador de una ofensa particular. Aunque la comunidad
científica forense ha hecho tremendos esfuerzos para usar estas
evidencias, los resultados han estado limitados históricamente y no
son útiles en muchas situaciones, cuando tienen que ver con restos
humanos y evidencias de la escena del crimen. La identificación por
marcadores genéticamente heredados ha sido vista por mucho tiempo
como una posibilidad que podría superar la mayoría de los problemas
que se encuentran cunado la identificación no se logra mediante
huellas digitales, odontología forense, registros médicos u otros
médicos. El establecimiento de un método heredado genéticamente que
podría ser utilizado para identificación tendría tremendo impacto
sobre la investigación de los crímenes violentos, de asalto sexual
y asesinato, identificación de restos humanos y personas
desaparecidas y disputas sobre paternidad.
Los métodos que permiten la comparación de
muestras de tejidos no identificados con individuos específicos
tendrían amplia aplicación en los sistemas de justicia criminal y
las ciencias forenses. Con la posible excepción de los gemelos
monozigóticos, cada individuo en la población humana tiene una
única composición genética la cual podría ser usada para
identificar específicamente cada individuo. Este fenómeno presenta
la posibilidad teórica de usar la variación de secuencia de ADN
para determinar si una muestra forense fue derivada de algún
individuo dado.
Los sistemas de marcador genético, que incluyen
grupos sanguíneos e isoenzimas han sido usados por forenses y
serologistas médicos para proporcionar estimaciones de rango de
individualidad de 1:1000 1:1,000,000 usando 10 a 15 marcadores. Los
números en este rango no están a menudo disponibles, puesto que un
gran porcentaje de la evidencia no produce resultados para 10
sistemas de marcadores genéticos. Los científicos forenses,
investigadores y el sistema judicial han estado usando inclusiones
tan bajas como 1:5 a 1:100 en una población para reforzar su caso
contra los acusados.
Los campos de la serología forense y médica,
pruebas de paternidad y origen de tejidos y muestras han sido
alterados por el uso de la variación de secuencia del ADN, por
ejemplo, secuencias satélite y número variables de repeticiones de
tándem (VNTRS) o AMP-FLPS, en el laboratorio
criminalístico, la corte, hospitales y laboratorios de
investigación y prueba. Las probabilidades de inclusión
establecidas por los laboratorios que llevan a cabo los análisis en
tales casos a menudo exceden 1:1,000,000. La primera implementación
de la tipificación de ADN en ciencia forense fue el uso de Jeffreys
de una sonda de ADN multilocus de "huella digital" que
identificó a un sospechoso en u caso de asesinato que ocurrió en
Inglaterra. En los Estados Unidos un perfil de ADN ha sido
establecido usando una batería de sondas VNTR de locus sencillo
altamente polimórfico no enlazadas. El uso de estas baterías de
sondas permite el desarrollo de un perfil de ADN compuesto para un
individuo. Estos perfiles pueden ser comparados con bases de datos
étnicos que usan los principios de Hardy-Weinberg
para determinar la probabilidad de correspondencia entre el
sospechoso y la muestra forense desconocida.
La aplicación de los VNTR a un mapeo del gen,
genética de población e identificación personal ha estado limitada
por la baja frecuencia en la distribución asimétrica de estas
repeticiones en el genoma y por la inhabilidad para determinar con
precisión los alelos con la hibridrización Southern basada en los
esquemas de detección. La inhabilidad para hacer determinaciones
precisas de alelos complica la aplicación del VNTR a la
identificación personal. SE han diseñado protocolos de organización
en los cuales todos los alelos 5 que se presentan dentro de una
región del gel son tratados como el mismo alelo para los cálculos
de genotipo. Puesto que la distribución de alelos aparece continua
debido al limitado poder de resolución del gel Southern, los
heterocigotos con alelos de tamaño similar podrían marcados como
homozigotos. Estos aspectos han llevado a reivindicar que los loci
VNTR no están en equilibrio de Hadad-Weinberg, y
por lo tanto el método para calcular al significado de una
correspondencia no está
acordado.
acordado.
Aunque estos métodos han mejorado marcadamente el
poder de los científicos médicos y forense para distinguir entre
individuos, sufren de un cierto número de deficiencia que incluyen
pérdida de sensibilidad, ausencia de control interno, costos,
intensidad de tiempo, tamaños de muestra relativamente grandes e
inhabilidad para ejecutar una identificación precisa de alelos y
problemas con la identificación de muestras de ADN degradadas.
Estudios médicos y forenses también han empleado
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para examinar
variaciones en el locus HLA. El PCR ha sido también usado para
amplificar VNTR o AMP-FLP cortos. El uso de PCR
apunta hacia algunos de los problemas de sensibilidad y degradación
de las muestras, sin embargo, el sistema de tipificación de HLA,
tiene todavía algunos problemas. Una técnica más simple, más
ponderosa, es necesaria la cual haga uso de los más recientes
avances en la tecnología del ADN.
La presente invención involucra una novedosa
aplicación de estos avances en la ciencia forense y médica. En la
presente invención han sido identificadas novedosas clases de
repeticiones (STR) de tándem corto o simple, primariamente
triméricas y tetraméricas altamente polimórficas. Estos STR tienen
características apropiadas para la inclusión de un ensayo de
perfilado de ADN. Este ensayo incorpora estándares internos o
externos, que suministran mayor sensibilidad, requieren tiempos de
análisis más cortos, costes más bajos y permite una identificación
precisa de alelos. Los STR se amplifican con gran fidelidad y los
patrones de alelos son interpretados fácilmente. La amplificación de
secuencias reiteradas en tándem altamente polimórficas puede ser la
de coste más efectivo y de método poderos disponibles para la
comunidad médica y forense.
El ensayo de perfilado de ADN de la presente
invención tiene aspectos que representan mejoras significativas
sobre la tecnología existente y trae una capacidad incrementada y
precisión para el perfilado del ADN para la justicia criminal,
pruebas de paternidad y otros usos médicos y forenses.
En WO9004040 se describen procesos para analizar
polimorfismos de longitud en dominios de ADN que usan iniciadores
para secuencias simples de ADN, PCR controlado por iniciador y
análisis de los productos de reacción. Aunque hay descripción de
que las secuencias simples y simples críticas de ADN son elementos
repetitivos que están presentes en genomas eucarióticos, no hay
sugerencias de que los tetranucleótidos puedan ser efectivos como
objetivos del método de tipificación de ADN basado en PCR.
En Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86,
9178-82, 89 (Chehab et al.) se enseña la
utilización de PCR multiplex en el cual cada par iniciador porta un
marcador diferente. Sin embargo, no hay guías hacia el uso de
tetranucleótidos.
En Genomics, 8, 403-406, 90
(Fries et al.) se describe un método para detección de
polimorfismos, pero sólo con respecto a repeticiones de
dicnucleótidos.
De acuerdo con ello, se provee en concordancia
con un aspecto de la presente invención:
Un objeto de la presente invención es un
perfilado del ADN usando polimorfismos repetidos de tándem
corto.
Un objeto adicional de la presente invención es
un método para identificar la fuente de ADN en una muestra médica
forense. Un objeto adicional de la presente invención es suministrar
un ensayo automatizado para el perfilado de ADN.
Un objeto adicional de la presente invención es
la provisión de un método para la identificación y detección de
polimorfismos repetidos de tándem corto para expandir el poder de
discriminación del ensayo de perfilado de ADN.
Un objeto adicional de la presente invención es
extender el poder de discriminación de un ensayo de perfilado de
ADN.
Un objeto adicional de la presente invención es
suministrar un kit para detectar polimorfismos repetidos de tándem
corto.
Así, para alcanzar los objetivos anteriores, se
provee de acuerdo con un aspecto de la presente invención un ensayo
de perfilado de ADN para detección de polimorfismos en secuencias
repetidas de tándem corto que tiene una secuencia flanqueadora,
comprendiendo las etapas de:
\bullet extracción del ADN de la muestra que se
va a probar;
\bullet amplificar una secuencia repetida de
tándem corto en el ADN extraído usando una pareja de iniciador (es)
de oligonucleótidos para producir productos de extensión
amplificados, en donde la secuencia repetida de tándem corto es de
la fórmula (AwGxTyCz)n, donde A, G, T y C representan los
nucleótidos; w, x, y y z representan el número de cada nucleótido y
varía de 0 a 7 y la suma de w+x+y+z varía de 4 a 7; y n representa
el número de repeticiones y varía de 5 a 50; y
\bullet detector dichos polimorfismos
identificando dichos productos de extensión amplificados para cada
secuencia repetida de tándem corto, donde cada producto de
extensión es distinguible de otros por un tamaño diferente y/o por
un marcador diferente enlazado y/o unión a un oligonucleótido
específicamente marcado y donde cada iniciador de cada par de
iniciadores seleccionado para ser sustancialmente complementario a
una cadena diferente en la secuencia flanqueadora de cada secuencia
repetida de tándem corto que va a ser amplificada.
Un objeto adicional de la presente invención es
extender el poder de discriminación del ensayo de perfilado del
ADN.
Un objeto adicional de la presente invención es
suministrar un kit para detectar polimorfismos repetidos de tándem
corto.
Así, para cumplir los objetivos anteriores se
provee de acuerdo con un aspecto de la presente invención un ensayo
de perfilado de ADN que comprende los pasos de: extraer del ADN de
una muestra que va a ser probada; llevar a cabo una reacción de
cadena de polimerasa multiplex sobre el ADN extraído; e identificar
los productos de extensión amplificados de la reacción en cadena de
polimerasa multiplex para cada secuencia diferente, donde cada
diferente secuencia es marcada diferencialmente.
EL ensayo de perfilado de ADN es aplicable a
cualquier muestra a partir de la cual puede extraerse el ADN
amplificable. En los usos médicos y forenses las muestras son
seleccionadas del grupo que consiste de sangre, semen, frotis
vaginal, tejido, cabello, saliva, orine y mezcla de fluidos
corporales.
Modalidades específicas de la invención incluyen
el uso de ; secuencias repetidas de tándem corto seleccionadas del
grupo de secuencias de nucleótidos no duplicativas que consiste
en:
(AAAC)n, (AAAG)n, (AAAT)n,
(AACC)n, (AACG)n, (AACT)n, (AAGC)n,
(AAGG)n, (AAGT)n, (AATC)n, (AATG)n,
(AATT)n, (ACAG)n, (ACAT)n, (AGAT)n,
(ACCC)n, (ACCG)n, (ACCT)n, (ACGC)n,
(ACGG)n, (ACGT)n, (ACTC)n, (ACTG)n,
(ACTT)n, (AGCC)n, (AGCG)n, (AGCT)n,
(AGGC)n, (AGGG)n, (ATCC)n,
(ATCG)n,
(ATGC)n, (CCCG)n, (CCGG)n y combinaciones de las mismas donde n es el número de repetición y varía de 5 a 40 aproximadamente.
(ATGC)n, (CCCG)n, (CCGG)n y combinaciones de las mismas donde n es el número de repetición y varía de 5 a 40 aproximadamente.
En otra modalidad de la presente invención el
marcado diferencial para cada secuencia específico es seleccionado
del grupo consistente de agentes de fluorescencia, radioisótopos,
agentes de quimiluminiscencia, enzimas, colorantes y anticuerpos.
Una modalidad específica usa los compuestos fluorescentes Texas
Red, tetrametilrodamina-5-(y-5)
isotiocianato, ácido aminoeanóico NBD y
fluoresesin-5-isotiocianato.
El ensayo puede ser automatizado usando un
analizador automatizado de ADN marcado con fluorescente capaz de
distinguir, simultáneamente, diferentes fluorescencias durante el
paso de identificación.
Otra modalidad de la presente invención incluye
un kit que contiene iniciadores oligonucleótidos de la secuencia
repetida de tándem corto.
Una modalidad adicional incluye un método para
determinar repeticiones de tándem corto polimórficas que comprende
los pasos de: determinación de secuencias de nucleótidos no
duplicativos de la fórmula (AwGxTyCz) donde A, G, T y C representan
los nucleótidos; y W, x, y, y z representan el número de cada
nucleótido en la secuencia y varía entre 0 y 7 con la suma de
w+x+y+z variando de 4 a 7; identificación y búsqueda de
(AwGxTyCz)n en bases de datos que contengan secuencias
genéticas conocidas, en donde n representa el número de repeticiones
en tándem de la secuencia y es al menos 5 aproximadamente; extraer
cada secuencia de nucleótido y su secuencia flanqueante encontrada
en el paso de búsqueda; identificar las secuencias extraídas, las
cuales tienen secuencias flanqueantes únicas; sintetizar pares
iniciadores de oligonucleótidos que corresponden a la secuencia de
flanqueo; llevar a cabo el PCR con los pares de iniciadores sobre
las muestras de ADN de una población de prueba, y examinar los
productos de extensión de PCR para detectar las repeticiones en
tándem corto polimórficas.
Objetivos, aspectos y ventajas diversos y
adicionales serán evidentes y la invención será más fácilmente
entendida a partir de una lectura de la siguiente especificación y
por referencia a los dibujos acompañantes, que forman una parte de
la misma, donde los ejemplos de las modalidades actualmente
preferidas de la invención se dan para propósito de revelación.
La figura 1 ilustra la estrategia usada para
determinar la secuencia que flanquea un STR.
La figura 2 muestra el desarrollo de un locus STR
polimórfico.
La figura 3 muestra ejemplos de los productos del
multiplex y ensayos de PCR sencillos usados en generar datos de 1
genotipo del multilocus.
La figura 3A muestra el multiplex PCR (mPCR) de
HUMHPRTB[AGAT]n (arriba) y
HUMFABP[AAT]n*. La figura 3B muestra el mPCR de
HUMRENA4[ACAG]n (arriba) y
HUMTH01[AATG]n. La figura 3C muestra el PCR sencillo
de HUMARA[AGC]n*.
Las figures 4A a 4A representan gráficamente las
distribuciones relativas de frecuencia de alelos. Los recuentos de
alelos fueron usados para calcular y representar gráficamente las
frecuencias relativas de alelos en: 4A
HUMRENA4[ACAG]n; 4B HUMTH01[AATG]n; 4C
HUMARA[AGC]n; 4D HUMHPRTB[AGAT]n; y 4E
HUMFABP[AAT]n.
La figura 5 muestra el resultado de un ensayo de
tipificación de ADN fluorescente. El programa de análisis mide las
intensidades de los perfiles fluorescentes con relación a la señal
más fuerte.
Los dibujos y figuras no están necesariamente en
escala y ciertos aspectos de la invención pueden ser exagerados en
escala o mostrados en forma esquemática en interés de la claridad y
la concisión.
Será fácilmente evidente para un experto en la
técnica que diversas sustituciones y modificaciones pueden ser
hechas a la invención revelada aquí sin apartarse del alcance del
espíritu de la invención.
Como se usa aquí, el término "repetición de
tándem corto" (STR) se refiere a todas las secuencias entre 2 y 7
nucleótidos de largo los cuales son reiterados *^{\text{no acuerdo
con la invención}} en tándem dentro del organismo humano. Los STR
pueden ser representados por la fórmula
(AwGx-TyCz)n donde A, G, T y C representan
los nucleótidos los cuales pueden estar en cualquier orden; w, x, y
y z representan el número de cada nucleótido en la secuencia y
varía entre 0 y 7 con la suma de w+x+y+z variando entre 4 y 7; y n
representa el número de veces que la secuencia es repetida en tándem
y está entre 5 y 10 aproximadamente. La mayoría de los perfiles
útiles usualmente ocurren cuando la suma de w+x+y+z varían entre 3
y 7 y n varía entre 5 y 40.
Como se usa aquí secuencia "no duplicativa"
significa la secuencia y su complemento. Esto está representado en
su forma alfabética más baja como se muestra en la Tabla 1. Por
ejemplo, (ACT) representa ACT, CTA, TAC, AGT, TAG y GTA. Cada
secuencia representativa puede representar un máximo de dos veces
el número de nucleótidos en la secuencia.
Como se usa aquí "secuencia de flanqueo" se
refiere a la secuencia de nucleótidos en uno u otro lado del STR.
"Secuencias de flanqueo únicas" son aquellas secuencias de
flanqueo las cuales solo se encuentran en una ubicación dentro del
genoma.
El término "iniciadores de oligonucleótidos"
se usa aquí para definir una molécula que comprende más de tres
desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Su longitud exacta
dependerá de muchos factores relacionados con la función última y
uso del iniciador del oligonucleótido, incluyendo temperatura,
fuente del iniciador y uso del método. El iniciador del
oligonucleótido puede presentarse de forma natural, como en un
digerido de restricción purificado, o ser producido sintéticamente.
El iniciador del oligonucleótido es capaz de actuar como un punto de
iniciación para síntesis cuando se coloca bajo condiciones que
inducen síntesis de un producto de extensión de iniciador
complementario a la cadena del ácido nucleico. Las condiciones
pueden incluir la presencia de nucleótido y un agente inductor tal
como una ADN polimerasa a una temperatura y pH apropiados. En una
modalidad preferida, el iniciador es un oligodesoxirribonucleótido
de cadena sencilla de longitud suficiente para iniciar la síntesis
de un producto de extensión a partir de una secuencia específica en
la presencia de un agente inductor. La sensibilidad y la
especificidad de los iniciadores del oligonucleótido son
determinadas por la longitud del iniciador y la unicidad de la
secuencia dentro de una muestra dada del ADN plantilla. En la
presente invención los iniciadores de oligonucleótidos son
usualmente aproximadamente mayor de 15 meros y en la modalidad
preferida tiene de 20 a 30 meros de longitud aproximadamente.
Cada par de iniciadores es seleccionado para
detectar un diferente STR. Cada iniciador de cada par aquí es
seleccionado para ser sustancialmente complementario a una cadena
diferente en la secuencia de flanqueo de cada secuencia específica
que va a ser ampliada. Así, un iniciador de cada par es
suficientemente complementario para hibridizarse con una parte de
la secuencia en el sentido de la cadena y el otro iniciador de cada
par es suficientemente complementario para hibridizarse con una
parte diferente de la misma secuencia en la cadena antisentido.
Aunque la secuencia de iniciador no necesita reflejar la secuencia
exacta de la plantilla, cuanto más cercanamente la terminación 3'
refleje la secuencia exacta, mejor es el enlace durante la etapa de
fijación.
Según se usa aquí el término "producto de
extensión" se refiere a la secuencia de nucleótido la cual es
sintetizada a partir de la terminación 3' del iniciador del
oligonucleótido y el cual es complementario a la cadena a la cual el
iniciador del oligonucleótido está enlazado.
Según se usa aquí, el término "marcado
diferencialmente" indica que cada producto de extensión puede
ser distinguido de todos los otros porque tiene un marcador
diferente unido y/o es de un tamaño diferente y/o se enlaza a un
oligonucleótido marcado específicamente. Un experto en la técnica
reconocería que una variedad de marcadores está disponible. Por
ejemplo, estos pueden incluir radioisótopos, agentes de
fluorescencia, agentes de quimiluminiscencia, colorantes, enzimas y
anticuerpos. Diversos factores afectan la escogencia del marcador.
Incluye el efecto del marcador sobre la velocidad de hibridización
y enlace del iniciador al ADN, la sensibilidad del marcador, la
facilidad de hacer el iniciador marcado, sondas o productos de
extensión, la habilidad para automatizar, la instrumentación
disponible, conveniencia y similares. Por ejemplo, la marcación de
radioisótopos diferenciales podría incluir ^{32}P, ^{3}H y
^{14}C; agentes de fluorescencia diferencial de marcación podrían
incluir fluorescein-5-isotiocianato,
tetrametilrodamina-5-(y-6)isotiocianato,Texas
Red y ácido minoeanóico NBD; o una mezcla de marcadores tales como
radioisótopos, agentes de fluorescencia y agentes de
quimiluminiscencia.
Cada secuencia especifica diferente de ADN, la
cual va a ser detectada aquí, es derivada del ADN genómico. La
fuente del ADN genómico que va ser probado puede ser cualquier
muestra médica o forense. Ejemplos de muestras médicas y forenses
incluyen sangre, semen, frotis vaginal, tejido, cabello, saliva,
orina y mezcla de fluidos corporales. Estas mezclas pueden ser
frescas, antiguas, secas y/o parcialmente degradadas. Las muestras
pueden ser colectadas de la evidencia en la escena de un
crimen.
El término "muestra forense" según se usa
aquí significa usar la tecnología para problemas legales que
incluyen pero no se limitan a muestras criminales, de pruebas de
paternidad y una mezcla. El término "muestra médica" según se
usa aquí significa el uso de la tecnología para problemas médicos
que incluyen pero no se limitan a la investigación, diagnóstico y
trasplantes de tejidos y órganos.
Según se usa aquí, el término "polimorfismo"
se refiere a la variación genética en las repeticiones en tándem o
secuencias de flanqueo. Un ejemplo de este polimorfismo es el
número de veces que la secuencia de nucleótidos 3 a 7 se
repite.
Según se usa aquí, el término "reacción en
cadena de polimerasa multiplex" (mPCR) se refiere a una
variación novedosa de PCR. Es un procedimiento para llevar a cabo
simultáneamente PCR sobre más de dos secuencias diferentes. La
reacción de mPCR comprende: tratar dicho ADN extraído para formar
cadenas complementarias en encadenamiento sencillo, adicionado una
pluralidad de iniciadores oligonucleótidos emparejados marcados, o
cada iniciador pareado específico para una diferente secuencia
repetida en tándem corto, un iniciador de cada par sustancialmente
complementario a una parte de la secuencia en el sentido de la
cadena y el otro iniciador de cada par sustancialmente
complementario a una parte diferente de la misma secuencia en la
cadena antisentido complementaria, fijando la pluralidad de los
iniciadores primarios a sus secuencias complementarias, extendiendo
simultáneamente dicha pluralidad de iniciadores fijados desde el
término 3' de cada iniciador para sintetizar un producto de
extensión complementario a las cadenas fijadas de cada iniciador, o
sirviendo dichos productos de extensión, después de la separación de
su complemento, como plantillas para la síntesis de un producto de
extensión para el otro iniciador de cada par, separando dichos
productos de extensión de dichas plantillas para producir moléculas
de encadenado sencillo, amplificando dichas moléculas de
encadenamiento sencillo repitiendo al menos un a vez dichos pasos de
separación, separación, extensión y fijación. En el proceso de mPCR
el método preferido para tres loci incluye: (1) iniciadores
compuestos composiciones y longitudes de base GC similares; (2)
tiempos de extensión más largos hasta 8 veces los tiempos
normalmente utilizados; y (3), minimización del número de ciclos de
PCR llevados a cabo para alcanzar la detección por ejemplo
aproximadamente 23 a 25 ciclos.
La reacción mPCR es optimizada para cada
reacción. En algunas reacciones mPCR la optimización incluye además
más enzima que la que normalmente se añade a una reacción de
PCR.
Según se usa aquí, el término "probabilidad de
correspondencia" se refiere a la oportunidad de que dos personas
no relacionadas tengan el mismo genotipo combinado en los loci
examinados.
Una modalidad de la presente invención es un
ensayo de perfil de ADN para la detección de polimorfismos en una
repetición de tándem corto que comprende los pasos de: extracción
de ADN de una muestra que se va a probar; amplificación del ADN
extraído; e identificación de dicho producto de extensión
amplificado para cada secuencia diferente, en donde cada secuencia
diferente tiene un marcador diferencial. Aunque se conoce una
variedad de procedimientos de amplificación conocidos, la modalidad
preferida emplea PCR o mPCR.
En una modalidad de la presente invención se usa
un estándar externo. En una modalidad preferida se usa un estándar
interno. El estándar está compuesto de alelos marcados de los loci
STR de interés. Un experto en la técnica reconocerá que la
escogencia del estándar y los intervalos escogidos dependerá del
marcador y la resolución deseada. Por ejemplo, en un ensayo de
perfilado de ADN, los alelos STR de una muestra de ADN pueden ser
localizados con más de un bp de resolución usando un estándar
interno de marca cada 3-5 bp.
En un ensayo preferido, se usan secuencias
repetidas en tándem corto de nucleótidos caracterizados por la
fórmula (AwGxTyCz)n donde A, G, T y C representan los
nucleótidos, w, x, y y z representan el número de cada nucleótido y
varían de 0 a 7 y la suma x+y+w+z varía de 4 a 7 y n representa el
número y de repetición y varía de repetición y varía de 5 a 40. En
otro ensayo preferido la suma de x+w+y+z es ó 4. En la modalidad
preferida del ensayo de perfilado, al menos dos STR son ensayados
simultáneamente.
En la modalidad más preferida el ensayo de
perfilado de ADN es automatizado. Esta automatización puede ser
lograda por una variedad de métodos. Un método es usar un
analizador automatizado de marcación de ADN capaz de distinguir
simultáneamente dirigentes agentes de fluorescencia, marcadores
radioactivos o agentes de quimiluminiscencia, durante el paso de
identificación. Un experto en la técnica reconocerá rápidamente que
una variedad de instrumentación satisface un requerimiento. Un
ejemplo de tal analizador usado en el ensayo preferido es el
dispositivo de secuencia de ADN Applied Biosystems 370A Fluorescent
("dispositivo 370A") el cual tiene la capacidad para
distinguir entre cuatro diferentes especies fluorescentes durante
la electroforesis.
Otro aspecto de la presente invención es un
método de detección de STR polimórficos para uso en el ensayo del
perfilado de ADN. El método para detección de STR polimórfico
comprende los pasos de: determinación de posibles secuencias de
nucleótidos no duplicativos de la fórmula (AwGxTyCz), donde A, G, T
y C representan cada uno el respectivo nucleótido y w, x, y y z
representan el número de cada nucleótido en la secuencia y varía
entre 0 y 7 con la suma de w+x+y+z variando entre 4 y 7;buscar e
identificar (AwGxTyCz)n en bases de datos que contengan
secuencias genéticas conocidas e identificar la secuencia
(AwGxTyCz)n de dicha secuencia genética y su secuencia
flanqueante, en donde representa el número de repeticiones en
tándem de la secuencia, y es al menos 5 aproximadamente; extracción
de cada secuencia identificada y su secuencia de flanqueo;
identificación de la secuencia extraída la cual tiene una única
secuencia de flaqueo; sintetizar los pares de iniciadores de
oligonucleótidos en las secuencias de flanqueo únicas; llevar a
cabo un PCR con los pares de iniciadores sobre las muestras de ADN
de una población de prueba; y examinar los productos de extensión
del PCR para detectar los STR polimórficos.
Un aspecto adicional de la presente invención es
la provisión de un kit para ensayos de perfilado de ADN. El kit
está compuesto de un contenedor que contiene un par de iniciadores
de oligonucleótidos para amplificación de un STR. En la modalidad
preferida, el número de pares de iniciadores de STR es seleccionado
tal como la frecuencia de genotipo (p) y es al menos 10^{6}. Esto
requiere usualmente 6-10 pares de iniciadores
STR.
Una adición más al kit puede ser un contenedor
que contenga estándares marcados. Una mejora adicional al kit es la
adición de reactivos para mPCR.
Los siguientes ejemplos son ofrecidos a manera de
ilustración y no pretenden limitar la intención de manera alguna.
En los ejemplos, todos los porcentajes corresponden a peso, sin son
sólidos, y a volumen si son líquidos, y todas las temperaturas
están en grados Celsius a menos que se especifique de otra manera.
Aquéllos indicados por un asterisco "*" están fuera de la
invención reivindicada.
Ejemplo
1
Los STR fueron identificados por búsqueda en
todas las secuencias humanas en el repositorio de secuencias de ADN
del GenBank ADN, de la presencia a de todas las posibles clases de
STR diméricos, triméricos y tetraméricos. Un experto en la técnica
reconocerá rápidamente que una búsqueda similar usando repeticiones
de nucleótidos 5 a 7 puede ser usada para identificar STR de 5 a 7
nucleótidos de longitud. Las posibles secuencias de nucleótidos no
duplicativos usada en esta búsqueda son dadas por su representación
alfabética más baja.
Como se muestra en la Tabla 2, la búsqueda por
ordenador identificó un número considerable de STR. La búsqueda de
diméricos fue fijada para identificar secuencias en las cuales el
STR estaba repetido al menos 10 veces y la búsqueda de triméricos y
tetraméricos fue fijada para identificar secuencias las cuales
estaban repetidas al menos 5 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
STR Humano en el ADN de GenBank | |||
Longitud del monómero | Dinucleótido | Trinucleótido | Tetranucleótido |
(10 ó mas) | (5 ó más) | (5 ó más) | |
Fracción observada | 5/6 | 10/10 | 16/34 |
Número total | 217 | 101 | 67 |
La fracción observada se refiere al número de
diferentes clases de STR observado del número total de clases de
STR posibles. Todas las clases de repeticiones de triméricos
estaban presentes y aproximadamente la mitad de las posibles
secuencias de tetraméricos estaba representada.
Aproximadamente el 50% de los STR estudiados eran
polimórficos. Los STR triméricos y tetraméricos tienen
características de marcadores polimórficos útiles para el mapeo
genético y físico del genoma humano e identificación de personas en
las ciencias forense y médica.
Ejemplo
2
Además del procedimiento para identificar los STR
en GenBank, están disponibles otros métodos para identificar loci
de STR adicionales. Por ejemplo, las sondas de oligonucleótidos par
alas posibles 50 únicas secuencias diméricas, triméricas y
tetraméricas pueden ser sintetizadas y usadas para visualizar las
bibliotecas de ADN humano totales. En un ejemplo el bacteriófago
recombinante lambda del cromosoma humano X fue analizado en placa a
una densidad de placa de 255 formando unidades por 15 placa. La
capa recolectada de las placas se hibridiza a nucleótidos marcados
en el extremo 5' ^{32}P de los motivos STR. Se usaron métodos
estándar de hibridización. Los oligonucleótidos fueron marcados de
acuerdo con los protocolos estándar.
Con secuencias de nucleótidos hasta por encima de
100 bp las condiciones para hibridización podrían ser estimadas
usando la siguiente fórmula:
T_{i} = T_{m}
-
15^{o}C
T_{m} =
16\text{.}6 \ log[M] + 0\text{.}41 [P_{gc}] + 81\text{.}5 -
P_{m} - B/L - 0\text{.}65
[Pf]
donde:
M es la concentración molar de Na^{+}, hasta un
máximo de 0.5 (1 X SSC contiene 0.165 M Na^{+});
P_{gc} es el porcentaje de bases G o C en los
nucleótidos y es 1-16 entre 30 y 70;
P_{m} es el porcentaje de bases no
correspondientes, si es conocido;
P_{f} es el porcentaje de formamida en el
regulador;
B es 675 para sondas sintéticas hasta de 100
bases;
L es la longitud de la sonda en bases.
LA fórmula fue usada para llegar a las
condiciones en la Tabla 3:
Oligo | (ml) 2X | P_{f} (%) | H_{2}O (ml) V (ml) | ||
Id secuencia | Mezcla Hib | Formamida (ml) | |||
1152 [AATC]_{7\text{.}5} | 12.5 | 10 | 2.5 | 10 | 25 |
1154 [AGAT]_{7\text{.}5} | 12.5 | 10 | 2.5 | 10 | 25 |
1525 [AAT]_{10} | 12.5 | 0 | 0 | 12.5 | 25 |
1526 [AATG]_{7\text{.}5} | 12.5 | 10 | 2.5 | 10 | 25 |
1528 [ACAG]_{7\text{.}5} | 12.5 | 30 | 7.5 | 5 | 25 |
La mezcla de hibridización 2X que contenía 37.5
ml de 20 X SSC, 15 ml de 50 X Denhardts, 7.5 ml de 20% SDS, y 15 ml
de H_{2}O. La hibridización fue llevada a acabo a 42ºC.
Estas condiciones fueron usadas para determinar
la frecuencia de cada STR mostrado en el cromosoma X usando lambda
recombinante de una biblioteca genómica de cromosomas X escogida a
una rejilla (Tabla 4).
La frecuencia de STR triméricos y tetraméricos | ||
STR | Bacteriófago positivo (%) | Frecuencia (kb/STR) |
[AAT] | 5 | 300 |
[AATC] | 5 | 300 |
[AATG] | 3 | 500 |
[ACAG] | 3 | 500 |
[AGAT] | 3 | 500 |
Un total de 1020 bacteriófagos recombinantes
fueron hibridizados a oligonucleótidos 30 bp radiomarcados (por
ejemplo, [AATC]_{7\text{.}5}. Los cálculos se basaron en
un tamaño de inserto promedio de 15 kb en la biblioteca. Estos
resultados de hibridización y los resultados de los estudios en el
GenBank sugieren la presencia de aproximadamente 400 millones de
STR en el genoma humano. Los resultados del cromosoma X han sido
extendidos al genoma humano completo mediante uso de la biblioteca
genómica completa del fago lambda. Así, es factible la
identificación de suficientes STR para extender el ensayo de
tipificación del ADN a muy altos niveles de individualización (por
ejemplo, uno en un billón).
Ejemplo
3
Los clones que contiene STR, como por ejemplo,
M13, lambda, cósmido y YAC pueden ser identificados por cualquier
procedimiento que lleve a la hibridización a uno de los
oligonucleótidos centrales. La mayoría de los métodos de
hibridización son usualmente laboriosos para determinar la
secuencia de segmentos de ADN únicos que flanqueen a ambos lados
del STR. En la presente invención se uso la estrategia llamada
STR-PCR. Esta estrategia está mostrada en forma
esquemática en (figura 1).
La estrategia STR-PCR estaba
basada en el método de Riley, et al, Nucleic Acids Res. 18:
2887 (1990). El método de Riley fue diseñado para amplificar las
terminaciones de las moléculas YAC de un ADN genómico total de
levadura. Este método fue adaptado para amplificar los segmentos de
ADN flanqueantes del STR, y acoplados al secuenciamiento directo
del ADN de los productos a través de una tecnología de
secuenciamiento de ADN en fase sólida. Este procedimiento involucra
los siguientes pasos: (1) Los extremos romos son generados para
flanquear ambos lados de un STR en un segmento de ADN clonado por
digestión con una enzima de restricción sencilla. Las enzimas
múltiples pueden ser usadas, separadamente para generar una longitud
de secuencia flanqueante en el intervalo de 100-150
bp. (2) Un enlazante que contiene una región de ADN no
complementaria está ligado a la población de moléculas de extremo
romo. (3) Las secuencias flanqueantes son amplificadas en reacciones
separadas. La terminación izquierda es amplificada con el iniciador
PCR anclado y un indicador de una cadena de STR. La terminación
derecha es amplificada con el mismo iniciador PCR anclado y un
iniciador de otra cadena del STR. El iniciador del STR puede ser
biotinilado (*). (4) El producto PCR biotinilado (*) final. (5) La
cadena biotinilada puede ser capturada con perlas recubiertas con
avidina. Y (6) la secuencia flanqueante puede ser obtenida por
extensión a partir del iniciador de secuenciamiento en la presencia
de didesoxinucleótidos.
Los resultados de usar la estrategia
STR-PCR se muestran en la Figura 2. La
amplificación de ala secuencia de ADN que flanquea ambos lados de
un (AGAT) STR de una bacteriófago recombinante se muestra en la
Figura 2A. Mientras la Figura 2B muestra secuenciamiento directo de
ADN de plantillas de cadena simple siguiendo la captura y
separación de cadenas de los productos de amplificación
biotinilados de lAE[AGAT]-2 con perlas
magnéticas recubiertas con avidita. La Figura 2C demuestra el uso
de oligonucleótidos complementarios a la secuencia de STR
flanqueantes para amplificar el locus de STR en una familia.
Fueron sintetizados los iniciadores de
oligonucleótidos los cuales generan un enlazante de extremo romo al
fijarse. Ejemplos de estos oligonucleótidos son SEQ ID Nos: 1, 2, 3
y 4. Oligonucleótidos (SEQ ID Nos: 1 y 2) del enlazante de doble
cadena, oligonucleótido (SEQ ID No: 3) es el iniciador de PCR para
el ancla y el oligonucleótido (SEQ ID No: 4) es el iniciador de
secuenciamiento del ADN.
El oligonucleótido (SEQ ID No: 1) fue fosforilado
y fijado al (SEQ ID No: 2) para formar el enlazante de cadena doble
por protocolo estándar. En este procedimiento 10 \mul de un
oligonucleótido enlazante (SEQ. ID No: 1) (100 mM; 1 nanomol) se
combina con aproximadamente 10 \mul de
^{32}P-gamma-ATP (10 mM);
aproximadamente 5 \muL de regulador PNK ; aproximadamente 3 \muL
de T4 PNKinasa (30 U); aproximadamente 22 \muL de H_{2}O para
un volumen final de 50 \mul aproximadamente (a 37ºC
aproximadamente, por 40 minutos aproximadamente; y a 65ºC
aproximadamente, por 5 minutos aproximadamente). Luego se adicionan
10 \mul aproximadamente de otro oligonucleótido enlazante (SEQ ID
No: 2). Esta mezcla es mantenida a 95ºC aproximadamente por 5
minutos aproximadamente.
Aunque el método Riley enseñaba que ambos
oligonucleótidos deberías ser fosforilados, la presente invención
ha descubierto que es suficiente y posiblemente mejor fosforilar
sólo el primer oligonucleótido.
El siguiente procedimiento era para ligar el
enlazante de doble cadena (Ancla de PCR) para el ADN del
bacteriófago lambda recombinante. Primero cada clon fue digerido
con enzimas de restricción de corte frecuente las cuales dan
terminaciones romas. Por ejemplo: AluI, HaeIII, y RsaI. Segundo, el
enlazante estaba ligado al extreme romo del ADN. Tercero, los
segmentos flanqueantes fueron amplificados. En este procedimiento
la muestra fue digerida con suficiente enzima para cortar el ADN
(0.5 ml de enzima aproximadamente) en 1.5 \mul aproximadamente de
un regulador de restricción One Phor All Plus Restriction Buffer
(Pharmacia) aproximadamente 250 ng del ADN del Fago Lambda (50 kb)
y suficiente H_{2}O para llevar el volumen final a 15 \mul
aproximadamente. La temperatura fue mantenida a 37ºC
aproximadamente hasta que el ADN fue cortado.
Después de la digestión, se añadió un cóctel para
ligar. Aunque se conoce una variedad de cócteles, la presente
invención usó: hasta 2.0 \mul aproximadamente de Annealed
Oligonucleotides con 0.05 \mul aproximadamente de DTT 1 M, 3.0
\mul aproximadamente de rATP 0,1 M, 0.25 \mul aproximadamente
de T4 ADN ligasa (Pharmacia), 1.5 \mul aproximadamente de One
Phor All Plus Restriction Buffer y 9.7 \mul de H_{2}O
aproximadamente. La mezcla fue mantenida a 15ºC aproximadamente por
al menos 2 horas aproximadamente. Tiempos más largos, por ejemplo,
durante la noche, podrían dar mejores resultados.
A continuación, los segmentos flanqueantes fueron
amplificados, La mezcla de amplificación incluyó 3 \mul
aproximadamente del STR-PCR Primer (10 X Cetus; 10
mM), aproximadamente 3 mL of Anchor-PCR Primer (lo
mismo que con el iniciador STR-PCR), 3 \mul
aproximadamente de mezcla de dNTP (10 X Cetus; 2 mM),
aproximadamente 3 \muL de PCR Buffer (10 X Cetus, sin Mg++),
aproximadamente 3.0 mL de 0.01 M, aproximadamente 1 mL de ADN,
aproximadamente 14.2 mL de H_{2}O, y aproximadamente 0.3 mL de
Amplitaq (Cetus).
La mezcla fue calentada por 2 minutos
aproximadamente a 95ºC aproximadamente, luego el ensayo de PCR
sobre la mezcla incluyó 25 a 30 ciclos de 45 segundos
aproximadamente a 95ºC aproximadamente, luego 30 segundos
aproximadamente a 60ºC aproximadamente, luego 1 minuto
aproximadamente a 72ºC aproximadamente. Finalmente, la mezcla fue
mantenida a 72ºC por 10 minutos aproximadamente, luego transferida
a 4ºC aproximadamente. En este procedimiento la
STR-PCR fue llevada a cabo separadamente para ambas
cadenas de STR. El control de la concentración de Mg++ parecía ser
importante.
Los producto amplificados fueron secuenciados. Si
los iniciadores de STR están biotinilados (por ejemplo, por la
metodología Aminolink 2 Applied Biosystems, Inc.) los productos
fueron capturados con perolas recubiertas con avidita (Dynal). Fue
removida la cadena de ADN no deseada. Las condiciones preferidas
para el aislamiento de los productos amplificados fue como sigue: 25
\mul aproximadamente de M280 Beads de Dynal se mezclaron con
aproximadamente 25 \mul de PCR Product. Esto fue mantenido por 30
minutos aproximadamente a 25ºC aproximadamente en una rueda
giratoria. El sobrenadante fue removido y se adicionaron 150 \mul
aproximadamente de NaOH 0.15 M. Esto fue mantenido por 5 minutos a
25ºC aproximadamente. El sobrenadante se removió entonces y el
material restante fue lavado al menos una vez con agua y
resuspendido en 7 \mul de agua aproximadamente para
secuenciamiento del ADN. Cualesquiera reacciones estándar de
secuenciamiento de ADN pueden ser usadas. En la presente invención
el secuenciamiento fue llevado a cabo como para cualquier plantilla
de cadena
sencilla.
sencilla.
Ejemplo
4
Diecisiete STR presentes bien dentro del locus
HPRT humano o bien en secuencias humanas en la base de datos del
Gen Bank fueron probados en cuanto a variación en la población
humana. Nueve fueron polimórficos.
Las amplificaciones fueron llevadas a cabo con un
termociclizador Cetus- PerkinElmer, enzima Amplitaq y condiciones
de regulador recomendadas en un volumen de 15 \mul
aproximadamente. Las condiciones de amplificación fueron 95ºC
aproximadamente por 45 segundos aproximadamente; luego 60ºC
aproximadamente por 30 segundos aproximadamente, luego 72ºC
aproximadamente por 30 segundos aproximadamente. Y fueron corridos
23 a 28 ciclos aproximadamente. Los productos amplificados fueron
radiomarcados por inclusión de 2 \muCi
^{32}P-dCTP (3000 Ci/mmol) en el PCR. El HUMHPRTB
[AGAT]n y HUMFABP [AAT]n loci, y el HUMRENA4
[ACAG]n y HUMTH01 [AATG]n loci, fueron estudiados
como un PCR multiplex PCR para dos loci. Aproximadamente 50 ng de
ADN genómico fueron usados en los PCR. Los productos PCR fueron
diluidos 2:5 en formamida, desnaturalizados a 95ºC aproximadamente
por 2 minutos aproximadamente, y cargados sobre un gel de
secuenciamiento de ADN (6% aproximadamente (39:1)
acrilamida:bisacrilamida, con urea 7 M aproximadamente, y 0.04%
TEMED aproximadamente). Reacciones de control sin ADN agregado
fueron incluidas en cada juego de amplificaciones. Los productos de
amplificación variaron en tamaño desde entre aproximadamente 100 a
350 bp. Esto permitió una precisa determinación de las longitudes de
los alelos.
Los datos del GenBank para el nombre del locus,
secuencia de repetición aproximada, Primer SEQ ID No:, número de
alelos observados, número de cromosomas estudiados y frecuencias de
heterocigotos predichas promedio se muestran en la Tabla 6.
\newpage
\newpage
En la Tabla 6 se muestran los rasgos de los loci
STR polimórficos 9, El rango de frecuencias de heterocigotos
representa el valor obtenido por al menos el grupo racial más
polimórfico. Los alelos del loci, mostrados con un rango de números
de reiteración(por ejemplo,
HUMFABP[AAT]*8-15) fueron secuenciados para
permitir asociación precisa del número de reiteraciones en tándem
con alelos específicos. El número de reiteración del clon del
GenBank está dado por loci en el cual el rango en el número de
repeticiones es desconocido. Se usa la representación alfabética más
baja de cada motivo de STR, con el complemento reverso (c:) indicado
cuando sea apropiado para loci STR compuestos. La variabilidad en
la población humana fue probada con un ensayo de PCR
radioactivo.
Ejemplo
5
Los datos de genotipo para cinco loci STR fueron
determinados en dos PCR multiplex y uno sencillo (Figura 3). Ambas
cadenas del ADN de los productos amplificados son radiomarcadas y
los alelos de diferentes loci tienen apariencia distinta basada en
la movilidad relativa de las dos cadenas de ADN. Los alelos
HUMHPRTB [AGAT]n y HUMTHO1 [AATG]n aparecen como
bandas doblete cercanamente espaciadas, mientras que los alelos
HUMRENA4 [ACAG]n y HUMFABP [AAT]*n aparecen usualmente como
singletes. Los alelos HUMARA [AGC]*n aparecen como dobletes
ampliamente espaciados, tales que alelos adyacentes se superponen.
La cadena más rápida de alelos j HUMHPRTB 15 [AGAT]n
usualmente aparece como un doblete, debido a la adición incompleta
de una base extra, no complementaria al extremo 3' del producto.
Las movilidades relativas de las cadenas están influenciadas por la
composición del gel de archilamida. Los datos para la >Figura 3
fueron seleccionados de exámenes de población como una
representación nítida de la claridad con la cual fue hecha la
designación de alelos. Los autorradiogramas fueron sobreexpuestos
para ilustrar las tenues bandas de artefactos que difieren en el
número de repeticiones la cuales se cree que surgen durante el
PCR.
Fueron secuenciados alelos representativos de
cada STR polimórfico. <los resultados muestran que la variación
en tamaño es una función de los números de repetición.
Ejemplo
6
Los STR triméricos y tetraméricos representan una
rica fuente de marcadores altamente polimórficos en el genoma
humano. Se llevó a cabo el análisis de un examen de genotipo
multilocus de 40 o más individuos en poblaciones Negra, Blanca,
Hispana y Asiática en EEUU, en cinco loci STR localizados en los
cromosomas 1, 4, 11 y X. Las frecuencias de heterocigotos de los
loci variaban desde 0.34 a 0.91 y el número de alelos de 6 a 17 para
las 20 combinaciones de raza y locus. Frecuencias de alelos
relativas exhiben diferencias entre razas y distribuciones
unimodales, bimodales y complejas. Los datos de genotipo a partir
de los loci fueron consistentes con el equilibrio de
Hardy-Weinberg por tres pruebas y la
sub-heterogeneidad de la población dentro de cada
grupo étnico no fue detectada por dos pruebas adicionales. No
fueron detectadas mutaciones en u total de 860 meiosis para dos a
cinco loci estudiados en diversos parentescos. Un estimativo
indirecto de las ratas de mutación dan valores desde 2.5 x
10^{-5} a 15 x 10^{-5} para los cinco loci. Ratas de mutación
más altas parecen estar asociadas con más repeticiones en tándem
del motivo central. El genotipo más frecuente de todos los cinco
loci combinados parece tener una frecuencia de 6.51 x 10^{-4}.
Juntos, estos resultados sugieren que los loci STR trimérico y
tetramérico son marcadores ideales para entender el mecanismo de
producción de nuevas mutaciones en regiones del ADN hipervariables
y son apropiados para identificación de personas en las ciencias
médicas y forenses.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
El ADN fue extraído de muestras de sangre
obtenidas en bancos de sangre locales de donantes voluntarios no
relacionados. El personal del banco de sangre designó visualmente a
los donantes como Negros, Blancos u otros. Los Hispanos y
Orientales fueron identificados con base en el apellido. Fueron
estudiados un total de 40 individuos en cada uno de estos cuatro
grupos étnicos. Los datos de genotipo en 40 familias (10 franceses,
27 mormones de UTA, 2 venezolanos y un Maíz) fueron determinados
con [HUMHPRTB (AGAT)n y HUMFABP (AAT)*n. Cinco loci STR
fueron estudiados en familias adicionales para un mínimo de 31
meiosis. Los loci STR son designados por su nombre de locus del
GenBank y la representación alfabética más baja de los 44 motivos
de repetición triméricos y tetraméricos posibles únicos. Por
ejemplo, HUMHPRTB (AGAT)n se refiere al (CTAT) STR
polimórfico localizado en el intrón 3 del gen (HPRT) hipoxantina
fosforibosiltransferasa humana. Los loci estudiados, sus números de
acceso al GenBank, asignaciones cromosomales, iniciadores de
amplificación y rango de los tamaños de producto (basados en la
secuencia del GenBank) se dan en la Tabla 7.
En la Tabla 8 los alelos son numerados de acuerdo
con el número de repeticiones en tándem presentes en los productos
de amplificación. El número de motives repetidos fue determinado
por secuenciamiento directo del ADN de los productos amplificados,
o por subclonación en M13 para el secuenciamiento. EL número de
repeticiones de los fragmentos subclonados fue verificado con
respecto a la fuente del ADN genómico original por amplificación del
segmento clonado. Cálculos y estadísticas
Una variedad de pruebas genéticas en población
estándar fueron empleadas para valorar las frecuencias de
heterozigotos, frecuencias de alelos y asociación aleatoria de
alelos en diferentes loci. Estas pruebas incluyen mediciones de
errores estándar, estadísticas G para la prueba de relación de
relaciones de probabilidad, distribuciones binomiales, equilibrio
Hardy-Weinberg y resumen estadístico (sk_{2}).
Las frecuencias de alelos y sus errores estándar
fueron calculados a partir de los genotipos de aproximadamente 40
individuos para las combinaciones de cinco loci STR y cuatro
poblaciones (Tabla 8).
Frecuencias de alelos y sus errores estándar en 5 loci STR en 4 poblaciones | |||||
Frecuencias de alelos (%) y errores estándar (%) en alelo (a) | |||||
Blancos | Negros | Hispanos | Asiáticos | Combinado (b) | |
LOCUS - HUMHPRTB[AGAT]_{n} | |||||
7 | 0.4 \pm 0.4 | - - - | - - - | - - - | 0.3 \pm 13 |
9 | 0.4 \pm 0.4 | 1.6 \pm 1.6 | - - - | - - - | 0.5 \pm 0.4 |
10 | 0.4 \pm 0.4 | 1.6 \pm 1.6 | - - - | - - - | 0.5 \pm 0.4 |
11 | 12.1 \pm 2.2 | 3.2 \pm 2.2 | 8.9 \pm 3.8 | 11.3 \pm 4.4 | 10.1 \pm 1.5 |
12 | 34.4 \pm 3.2 | 29.0 \pm 5.8 | 39.3 \pm 6.5 | 26.4 \pm 6.1 | 33.2 \pm 2.4 |
13 | 33.0 \pm 3.1 | 30.6 \pm 5.9 | 39.3 \pm 6.5 | 39.6 \pm 6.7 | 34.4 \pm 2.4 |
14 | 14.7 \pm 2.4 | 21.0 \pm 5.2 | 5.4 \pm 30 | 13.2 \pm 4.7 | 14.2 \pm 1.8 |
15 | 2.2 \pm 1.0 | 11.3 \pm 4.0 | 7.1 \pm 34 | 9.4 \pm 4.0 | 5.3 \pm 1.1 |
16 | 2.2 \pm 1.0 | 1.6 \pm 1.6 | - - - | - - - | 1.5 \pm 0.6 |
(n^{d}) | 224 | 62 | 56 | 53 | 395 |
LOCUS - HUMTHO1[AATG]_{n} | |||||
6 | 26.2 \pm 4.9 | 12.5 \pm 3.7 | 21.3 \pm 4.6 | 8.8 \pm 3.2 | 17.2 \pm 2.1 |
7 | 8.8 \pm 3.2 | 32.5 \pm 5.2 | 30.0 \pm 5.1 | 23.7 \pm 4.8 | 23.8 \pm 2.4 |
8 | 11.3 \pm 3.5 | 21.3 \pm 4.6 | 6.3 \pm 2.7 | 3.8 \pm 2.1 | 10.6 \pm 1.7 |
9 | 16.2 \pm 4.1 | 21.3 \pm 4.6 | 13.7 \pm 3.9 | 47.5 \pm 5.6 | 24.7 \pm 2.4 |
10 | 36.2 \pm 5.4 | 12.5 \pm 3.7 | 28.7 \pm 5.1 | 7.5 \pm 2.9 | 21.3 \pm 2.3 |
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} Designaciones alélicas que se refieren al número de repeticiones del motivo de secuencia central indicado en la columna de locus. \end{minipage} | |||||
^{b} Alelos de todos los cuatro grupos raciales fueron combinados para esta columna. | |||||
^{c} Un guión indica la ausencia de ese alelo en la muestra respectiva. | |||||
^{d} Se refiere al número de muestras de cromosomas. | |||||
* no de acuerdo con la invención |
Frecuencias de alelos y sus errores estándar en 5 loci STR en 4 poblaciones | |||||
Frecuencias de alelos (%) y errores estándar (%) en alelo (a) | |||||
LOCUS - HUMTHO1[AATG]_{n} | |||||
11 | 1.3 \pm 1.2 | - - - | - - - | 7.5 \pm 2.9 | 22 \pm 2.3 |
12 | - - - | - - - | - - - | 1.3 \pm 1.2 | 03 \pm 0.3 |
(n) | 80 | 80 | 80 | 80 | 320 |
LOCOS - HUMRENA4[ACAG]_{n} | |||||
7 | - - - | 2.5 \pm 1.7 | - - - | - - - | 0.6 \pm 0.5 |
8 | 80.3 \pm 4.6 | 71.2 \pm 5.1 | 76.2 \pm 4.8 | 69.7 \pm 5.3 | 74.4 \pm 2.5 |
9 | - - - | 3.8 \pm 2.1 | - - - | - - - | 1.0 \pm 0.6 |
10 | 7.9 \pm 3.1 | 11.3 \pm 3.5 | 6.3 \pm 2.7 | 19.7 \pm 4.6 | 11.2 \pm 1.8 |
11 | 11.8 \pm 3.7 | 10.0 \pm 3.4 | 12.5 \pm 3.7 | 3.9 \pm 2.2 | 9.6 \pm 1.7 |
12 | - - - | 1.3 \pm 1.2 | 5.0 \pm 2.4 | 6.6 \pm 2.8 | 3.2 \pm 1.0 |
(n) | 76 | 80 | 80 | 76 | 312 |
LOCOS - HUMFABP[AAT]*_{n} | |||||
8 | - - - | 2.5 \pm 1.7 | 1.3 \pm 12 | - - - | 0.6 \pm 0.3 |
9 | 0.3 \pm 0.3 | 27.5 \pm 5.0 | 1.3 \pm 12 | 5.1 \pm 2.5 | 5.2 \pm 1.0 |
10 | 49.7 \pm 2.9 | 32.5 \pm 5.2 | 55.0 \pm 5.6 | 66.7 \pm 5.3 | 50.4 \pm 2.2 |
11 | 17.4 \pm 2.2 | 2.5 \pm 1.7 | 8.8 \pm 3.2 | 6.4 \pm 2.8 | 12.3 \pm 1.4 |
12 | 3.4 \pm 1.0 | 5.0 \pm 2.4 | 2.5 \pm 1.7 | 2.6 \pm 1.8 | 3.4 \pm 0.8 |
13 | 24.8 \pm 2.5 | 12.5 \pm 3.7 | 25.0 \pm 4.8 | 19.2 \pm 4.4 | 22.2 \pm 1.8 |
14 | 4.4 \pm 1.2 | 16.3 \pm 4.1 | 6.2 \pm 2.7 | - - - | 5.8 \pm 1.0 |
15 | - - - | 1.3 \pm 1.2 | - - - | - - - | 0.2 \pm 0.2 |
(n) | 298 | 80 | 80 | 78 | 536 |
LOCUS - HUMARA[AGC]*_{n} | |||||
13 | - - - | 1.6 \pm 1.6 | - - - | - - - | 0.4 \pm 0.4 |
15 | - - - | - - - | - - - | 5.7 \pm 3.2 | 1.3 \pm 0.8 |
16 | - - - | 1.6 \pm 1.6 | - - - | - - - | 0.4 \pm 0.4 |
17 | 1.7 \pm 1.7 | 17.7 \pm 4.9 | - - - | 1.9 \pm 1.9 | 5.7 \pm 1.5 |
18 | 1.7 \pm 1.7 | 16.1 \pm 4.7 | 9.3 \pm 3.9 | 3.8 \pm 2.6 | 7.9 \pm 1.8 |
19 | 10.2 \pm 3.9 | 8.1 \pm 3.5 | 9.3 \pm 3.9 | 9.4 \pm 4.0 | 9.2 \pm 1.9 |
20 | 15.3 \pm 4.7 | 9.7 \pm 3.8 | 3.7 \pm 2.6 | 5.7 \pm 3.2 | 8.8 \pm 1.9 |
21 | 16.9 \pm 4.9 | 8.1 \pm 3.5 | 18.5 \pm 5.3 | 18.9 \pm 5.4 | 15.4 \pm 2.4 |
22 | 8.5 \pm 3.6 | 17.7 \pm 4.9 | 9.3 \pm 3.9 | 17.0 \pm 5.2 | 13.6 \pm 2.3 |
23 | 15.3 \pm 4.7 | 4.8 \pm 2.7 | 9.3 \pm 3.9 | 15.1 \pm 4.9 | 11.0 \pm 2.1 |
24 | 20.3 \pm 5.2 | 6.5 \pm 3.1 | 13.0 \pm 4.6 | 3.8 \pm 2.6 | 10.5 \pm 2.0 |
25 | 6.8 \pm 3.3 | 1.6 \pm 1.6 | 11.1 \pm 4.3 | 5.7 \pm 3.2 | 6.1 \pm 1.6 |
26 | 3.4 \pm 2.4 | - - - | 5.6 \pm 3.1 | 11.3 \pm 4.3 | 4.8 \pm 1.4 |
27 | - - - | 1.6 \pm 1.6 | 1.8 \pm 1.8 | 1.9 \pm 1.9 | 13 \pm 0.8 |
28 | - - - | 3.2 \pm 2.2 | 1.8 \pm 1.8 | - - - | 1.3 \pm 0.8 |
29 | - - - | 1.6 \pm 1.6 | 5.6 \pm 3.1 | - - - | 1.8 \pm 0.9 |
30 | - - - | - - - | 1.8 \pm 1.8 | - - - | 0.4 \pm 0.4 |
(n) | 59 | 62 | 54 | 53 | 228 |
\begin{minipage}[t]{155mm} designaciones alélicas que se refieren al número de repeticiones del motivo de secuencia central indicado en la columna locus. \end{minipage} | |||||
* no de acuerdo con la invención |
Las frecuencias de algunos alelos específicos
(por ejemplo, alelo 7 de HUMTH01 [AATG]n y alelo 17 de
HUMARA [AGC]*n) son claramente variables a través de los cuatro
grupos raciales. Las distribuciones de frecuencias de alelos por
raza se dan en la Figura 4. Con la excepción de HUMHPRTB
(AGAT)n, el cual es unimodal y simétrico, las distribuciones
de frecuencia de alelos parecen bimodales o más compleja. EL alelo
más común, sin embargo, parece ser el mismo para algunos loci (por
ejemplo, HUMRENA4 (ACAG)n), mientras que en otros loci los
alelos predominantes no coinciden entre razas (por ejemplo, HUMARA
(AGC)*n).
\newpage
\newpage
Las frecuencias de los genotipos más comunes de
sistemas de tipificación de ADN refleja la utilidad del ensayo en
la práctica. Los genotipos más frecuentes para los cinco loci STR
tienen frecuencias desde 0.048 a 0.645 en las 20 combinaciones de
los STR de las razas (Tabla 9). Los genotipos más comunes para
todos los cinco loci combinados (p) tienen frecuencias desde 1.40 x
10^{-4} hasta 6.54 x 10^{-4} en los cuatro grupos raciales.
La probabilidad de correspondencia P2) para el
genotipo más común de todos los cinco loci combinados fue 4.24 x
10^{-7}. Las frecuencias de los genotipos menos comunes para
todos los cinco loci combinados fueron del orden de 10^{-17}. Los
cálculos de probabilidad en la Tabla 15 son solo relevantes para
individuos femeninos puesto de dos de los loci están unidos por X.
El genotipo masculino más común para todos los cinco loci
combinados tiene frecuencias de 6.8 x 10^{-4} hasta 36.4 x
10^{-4} en los cuatro grupos raciales.
Los mejores marcadores para individualización en
medicina y ciencia forense pueden ser aquéllos con distribuciones
de frecuencias de alelos simétricas y similares. La escogencia de
la base de datos étnica apropiada parece menos crítica en tales
loci para las cuatro poblaciones éticas que hemos estudiado.
Las bandas de artefactos tenues las cuales se
cree que surgen durante el PCR, ayudan en la determinación del
genotipo con relación a estándares externos. Es posible encontrar
entre las líneas de alelo a alelo sobre radiogramas sobreexpuestos,
tales que aun los alelos ampliamente separados que difieren por
aproximadamente 6 unidades de repeticiones sean contados con
exactitud. EL uso de mPCR con marcadores fluorescentes y estándares
internos mejora con esta exactitud.
Los datos demuestran que los datos de genotipo de
repeticiones en tándem triméricas y tetraméricos fueron exacta y
eficientemente obtenidos vía PCR multiplex. La fidelidad con la
cual los STR triméricos y tetraméricos fueron amplificados
comparada con los STR diméricos hace que estas nuevas clases de
marcadores polimórficos sean bien apropiadas para aplicación en
tipificación de ADN en ciencia forense y medicina.
Ejemplo
7
La tipificación de ADN es una técnica poderosa
para determinar la relación, si la hay, entre dos muestras de ADN
genómicas. Las aplicaciones para la tipificación del ADN incluyen
identificación personal y pruebas de paternidad en ciencia forense,
y determinaciones de Fuentes de muestra en trasplantes, diagnóstico
prenatal y validación de pedigrí. Varios aspectos de los STR
polimórficos sugieren que podrían formar las bases de un ensayo de
tipificación de ADN poderoso y simple. El pequeño tamaño de las
unidades amplificadas permite que varios loci sean fácilmente
amplificados simultáneamente por mPCR y analizados con
identificación de alelos precisa sobre geles de secuenciamiento de
ADN. La precisión, sensibilidad y velocidad de detección de los
alelos con PCR ofrece oportunidades especiales para el estudio de
espécimenes forenses. Por ejemplo, STR triméricos y tetramérico
muestran excelente fidelidad de amplificación indicando que las
huellas de genotipificación pueden ser fácilmente interpretadas y
dóciles a la automatización. La detección de los fragmentos de ADN
fluorescentes puede ser usada para estándares internos de tamaño y
cuantificación precisa de alelos.
Para la tipificación genética, los alelos de tres
loci STR cromosómicamente no unidos fueron ampliados
simultáneamente en un mPCR (Figura 5). Un iniciador de cada uno de
los tres juegos de iniciadores de amplificación está marcado
diferencialmente con uno de los cuatro colorantes fluorescentes
usados con el dispositivo de secuenciamiento de ADN. En el sistema
ABI 370A, un colorante reservado para el estándar interno, mientras
que tres colorantes están disponibles para la amplificación de los
productos de los loci STR. Teóricamente, cualquier región dada del
gel de secenciamiento puede contener estándares internos así como
alelos de los tres loci STR no enlazados. Usado a su máximo
potencial la metodología tiene enorme poder de identificación
personal de alta
exactitud.
exactitud.
La amplificación incorpora un marcador
fluorescente dentro de una terminación y un sitio MluI en el otro
extreme de cada producto en el mpCR (Figura 5). Siguiendo la
amplificación de los loci STR de una muestra de ADN genómico, la
actividad residual de la T. aquaticus polimerasa es destruida y una
longitud de fragmento homogénea es alcanzada para cada alelo por
digestión con MluI. Los productos multiplex tratados son entonces
mezclados con los estándares internos y cargados sobre un gel de
secuenciamiento para análisis en un ABI 370A. Los estándares
internos fueron generados combinando productos de amplificación de
individuos de genotipo conocido tales que la relación molar de cada
alelo observado era aproximadamente igual. Los alelos combinados
fueron diluidos, reamplificados y tratados con MluI. Este esquema
para generar marcadores internos de tamaño estándar asegura un
suministro virtualmente ilimitado de estándares.
La combinación de un sistema de detección
cuantitativo y mPCR permitió niveles adicionales de control interno
y precisión. Usando productos de mPCR sintetizados bajo condiciones
de amplificación estandarizadas, la intensidad fluorescente de
alelos específicos en diferentes loci, estaba relacionada. Debido a
la relación entre alelos de diferentes loci, fue posible distinguir
entre homozigoticidad y hemizigoticidad en un locus dado (Figura
5). Mientras que una falla en la amplificación de alelos puede
ocurrir por polimorfismo en el sitio de enlace del iniciador, el
fracaso fue detectable por cuantificación. Esta capacidad
cuantitativa remueve 1 a duda que se ha forjado en el uso de VNTR
debido a la observación de exceso de homozigoticidad en estudios de
población. La naturaleza cuantitativa de la identificación de
alelos también facilita el análisis de muestras corporales mezcladas
lo cual ocurre en forénsica, diagnóstico prenatal, la detección
aneuploidia cromosomática y mosaicismo somático verdadero vistos en
pacientes con anormalidades cromosómicas y en el seguimiento de
trasplantes de médula ósea.
El potencial de individualización promedio (PI)
de los tres loci juntos fue uno en 500 individuos. Estas
frecuencias de genotipo combinadas (tres loci) de los individuos en
los paneles A y B fueron 0,00026 y 0,0085 asumiendo el equilibrio
Hardy-Weinberg. La adición de tres loci más dará un
PI de aproximadamente uno en 200,000 mientras que la adición de
seis loci más dará un PI de uno en 90 millones. Se han hecho PCR
multiplex de esta complejidad. Son conocidos ocho y nueve sitios
genéticos de mPCR para los genes de la hipoxantina
fosforibosiltransferasa y
distrofina.
distrofina.
Los oligonucleótidos fueron sintetizados en un
sintetizador de ADN Applied Biosystems (ABI) 380B. Los
oligonucleótidos no derivados no fueron purificados después de la
desprotección y liofilización. La química ABI Aminolink 2 fue usada
para derivar oligonucleótidos para marcaje con biotina y
fluorescente, después de lo cual fueron precipitados con etanol y
purificados por electroforesis en gel de poliacrilamida. Los
colorantes fluorescentes (Molecular Probes, Eugene, OR) usados en
el ensayo fueron (i) ácido aminoheanóico NBD, para todos los
marcadores de estándar interno, (ii) éster succimidilo de (ii)
5-(y-6)-carboxifluoresceína para los
loci HUMTH01 [AATG]n y HUMHPRTB [AGAT]n, y (iii)
Texas Red^{TM} cloruro de sulfonilo para el locus HUMFABP
[AAT]*n. Los juegos de iniciadores tenían el primer iniciador
derivado y el segundo iniciador que contenía un sitio de
restricción MluI. Los iniciadores usados:
HUMTH01(AATG)n, (SEQ. ID NOS: 13, 23);
HUMFABP(ATT)*n (SEQ ID NOS; 5, 24);
HUMHPRTB(AGAT)n (SEQ ID. NOS; 19, 25). La
amplificación simultánea con todos los seis iniciadores fue llevada
a cabo con 25 ciclos por desnaturalización a 95ºC aproximadamente
por 45 segundos aproximadamente, fijando a 60ºC aproximadamente por
30 segundos aproximadamente, y extendiendo a 72ºC por 30 segundos
aproximadamente, usando un termociclizador
Perkin-Elmer-Cetus, Amplitaq y
condiciones de regulador. La concentración del iniciador en el
multiplex fueron aproximadamente 0.06 \muM para HUMTH01
[AATG]n, aproximadamente 1.6 mM para HUMFABP [AAT]*n, y
aproximadamente 0.56 mM para HUMHPRTB [AGAT]n. Siguiendo la
amplificación, los productos fueron extraídos con fenol,
precipitados con etanol y digeridos con MluI. Los productos
multiplex digeridos fueron combinados entonces con los estándares
internos de tamaño y se sometieron a electroforesis través de un
gel de poliacrilamida al 6.5% y urea 8.3 M a
1300-1500 v, 24 mA y 32 W a una temperatura de
aproximadamente 46ºC. Los estándares de tamaño internos fueron
preparados por amplificación de alelos específicos a partir de
individuos de genotipo conocido. Los productos fueron
cuantificados, cuantificados para dar una equimolaridad cercana,
diluidos aproximadamente 5000 veces y reamplificados con
aproximadamente 12 ciclos.
En la figura 5A se muestran los perfiles
fluorescentes de de los cócteles del estándar interno cuando se
combinan y se someten a electroforesis en una línea sencilla de un
dispositivo secuenciador de ADN ABI 370. En la Figura 5B los
estándares internos fueron combinados con los productos de
amplificación de un PCR multiplex compuesto de (de izquierda a
derecha) los loci HUMTH01 (AATG)n, (I), HUMFABP (AAT)*n
(II), y HUMHPRTB (AGAT)n (III). El individuo mostrado es
heterozigótico para todos los tres marcadores. En la Figura 5C se
muestra la amplificación multiplex de un individuo homozigótico en
el locus HUMFABP (AAT)*n y hemizigótico en HUMHPRTB
(AGAT)n.
(AGAT)n.
Ejemplo
8
Puesto que algunos laboratorios forenses podrían
no tener acceso a dispositivos de detección fluorescente, los
marcadores STR pueden ser detectados con sistemas electroforéticos
no desnaturalizantes y desnaturalizantes, usando marcación
alternativa como estrategia de detección, por ejemplo, métodos de
detección radiactiva y tinción con plata, métodos de tinción con
bromuro de etidio, son todos aplicables. Los loci STR
6-15 están distribuidos en 4 a 5 reacciones mPCR
separadas, cada uno conteniendo 2-4 loci. Los tres
loci son seleccionados de tal forma que los productos de
amplificación corren en regiones no superpuestas del gel (esto es,
las longitudes del par de bases de los alelos de diferentes loci no
se superponen). Los alelos de muestras desconocidas son
identificados con referencia a estándares externos en líneas
adyacentes (Pueden ser empleados los mismos cócteles usados en el
esquema de detección fluorescente (Figura 5)).
Ejemplo
9
La especificidad de especies de amplificación de
todos los loci STR puede ser determinada. Los ADN de primates, por
ejemplo, humanos, babún, chimpancé, gorrilla y diversas cepas
bacterianas y de levaduras son comparados. Adicionalmente, son
también examinadas la Drosophila, animales de granja comunes,
mascotas caseras comunes y flora humana común. No hay dificultad en
obtener las muestras, ya que sólo 10 \mug de ADN se necesitan
para llevar a cabo más de 100 estudios. La alta similitud de
secuencia entre humanos y otros primates sugiere que algunos de los
loci amplifican genomas a partir de los primates no humanos. Es
importante documentar cuáles loci pueden ser amplificados a partir
de cuáles especies, para óptimos rendimientos del método en el
campo forense. La amplificación no se ve en no primates.
Ejemplo
10
EL kit incluye un contenedor que contiene un par
iniciador de oligonucleótido para amplificar repeticiones en tándem
corto. El kit puede también incluir estándares. Un kit incluye
estándares y tres pares de iniciadores de oligonucleótido. En una
modalidad preferida, el kit incluye suficientes pares de
iniciadores de oligonucleótidos necesarios para llevara a cabo mPCR
para al menos 6-10 loci. El kit puede además
incluir los reactivos y protocolos establecidos para el uso del
kit. Estos kits suministran eficiente y efectiva transferencia y
distribución del método a la comunidad forense. Los
oligonucleótidos y las mezclas de reacción en estos kits pueden ser
guardados a -70ºC por periodos extensos de tiempo. Esto facilita la
producción en masa y control de calidad de los reactivos necesarios
para suministrar para suministrar reactivos preciso a un costo
razonable.
Ejemplo
11
Una secuencia de repetición de tándem corto
novedosa (SEQ ID. NO. 26) fue identificada a partir de un clon
lambda que contenía la biblioteca del cromosoma X con un
oligonucleótido de 30 pares de bases de la secuencia AGAT repetida
en tándem. Este locus fue identificado como HUMSTRXI. La secuencia
que flanquea la repetición AGAT fue amplificada y secuenciada. Los
oligonucleótidos fueron diseñados para amplificar la repetición
AGAT SEQ ID. NOS. 21 y 22.
El número de repeticiones AGAT es variable. La
longitud exacta de la secuencia fue inferida por la longitud de las
secuencias repetidas de tándem corto polimórficas, con verificación
de las secuencias terminales. El STR está entre aproximadamente la
base 153 y 203 del SEQ ID. NO. 26. El iniciador de sentido está
entre las bases 61 y 84 que corresponde a SED ID Nº 22 y el
iniciador antisentido es el complemento reverse de la secuencia
entre las bases 346 y 369 y corresponde a SEQ ID. NO. 21.
Ejemplo
12
La metodología novedosa de la presente invención
suministra la más ponderosa técnica hasta la fecha para la
caracterización de sangre y otros fluidos corporales. El incremento
en la evidencia creíble que este ensayo produce podría traducirse
en un incremento en la tasa de convictos por crímenes violentos
tales como asalto sexual y asesinato. Más importante aun, muchos
sospechosos inocentes serina categóricamente librados de falsas
acusaciones. Aplicaciones adicionales podrían resultar en un poder
investigativo incrementado en la identificación de personas
desaparecidas, niños raptados, personal militar, y restos humanos
de desastres naturales y físicos. La sensibilidad de los métodos de
identificación de fluidos corporales podría también ser
incrementada bastante más allá de los límites actuales. Esto
proporcionaría obvios beneficios en el número de casos en los
cuales las evidencias útiles fueran disponibles.
Otra mejora significativa sobre la tecnología de
ADN actualmente usada es la disminución profunda en la cantidad de
tiempo requerida para suministrar resultados y la cantidad de
trabajo requerida para producir los resultados. EL tiempo de prueba
real para las nuevas metodologías es solo el 10% del tiempo
requerido par alas técnicas de perfilado de ADN existentes. Además,
la tecnología existente es de uso investigativo limitado en asaltos
sexuales y homicidios, debido a la longitud de tiempo requerido para
obtener resultados.
El ensayo de perfilado de STR ADN permite una
precisa determinación de alelos. El análisis de bases de datos para
la estabilidad del locus, hetereogenicidad de población, frecuencia
de alelos en población, la herencia mendeliana, son enormemente
simplificados. La recolección de datos a partir del ensayo de perfil
de STR fluorescente se presta por sí mismo para al automatización,
reduciendo por lo tanto la posibilidad de error del operador. Las
designaciones de alelos discretos definidas promueve la generación
de un banco de datos nacional.
Los loci desarrollados, los métodos de ensayo de
perfilado, y los estudios de población son de interés para la
comunidad científica en general. El perfilado del ADN tiene
aplicación directa en el diagnóstico médico y en los laboratorios
de investigación para la verificación de la identidad de un
espécimen.
Un experto en la técnica apreciará rápidamente
que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los
objetivos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como los
inherentes a los mismos. Los oligonucleótidos, métodos,
procedimientos y técnicas descritos aquí son actualmente
representativos de las modalidades preferidas, se pretende que sean
considerados como ejemplos y no se deben entender como limitaciones
del alcance. Cambios en los mismos y otros usos se les ocurrirán a
los expertos en la técnica, los cuales están comprendidos dentro
del espíritu de la invención o definidos por el alcance de las
reivindicaciones anexas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTES: Albert O. Edwards y Charles Thomas Caskey
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PERFILADO DE ADN CON POLIMORFISMOS REPETIDOS DE TÁNDEM CORTO E IDENTIFICACIÓN DE STR POLIMÓRFICOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 26
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRIGIRSE A: Fulbright & Jaworski Patent Department
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1301 McKinney, Suite 5100
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Houston
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Texas
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: U.S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 77010-3095
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco,3.5 pulgadas (1.44 MB)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC/AT
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: BASIC
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: THOMAS D. PAUL
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32,714
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: D-5217
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (713) 651-5325
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (713) 651-5246
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: WESTERN UNION 762829
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGAGAATC GCTGTCTCTG CAGT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAGTATCAG TTTCATAGGG TCACC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTTCGTTT CCATTGTCTG TCCG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCAGAATCT GTTCCAGAGC GTGC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGTGAAGG TTGCTGTTCC TCAT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTGAGTCCC AGTTGCCAGT CTAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTGGTCACC TTGGAAAGTG GCAT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(12) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAGGGCTGT ATGGAATACG TTCA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(13) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAAGCACCAA GCTGAGCAAA CAGA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(14) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGGCTGAA AAGCTCCCGAT TAT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTCAAAGGG TATCTGGGCT CTGG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(16) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGAGACAG GATGTCTGGC ACAT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(17) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATCTCTCT CCTTAGCTGT CATA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(18) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAGTACCTT CCCTCCTCTA CTCA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(19) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCTATGGAG CTGGTAGAAC CTGA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(20) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGCCACAGA TAATACACAT CCCC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(21) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCTCCAGAA TAGTTAGATG TAGG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(22) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCCTTGTGG CCTTCCTTAA ATGG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(23) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTCTCCAGC ACCCAAGGAA GTCA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(24) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTACGCGTAT TCAAAGGGTA TCTGGGCTCT GG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(25) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTACGCGTCT CGGACAGTAT TCAGTTCGTT TC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(26) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTACGCGTTC TCCAGAATAG TTAGATGTAG GTAT
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(27) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 504
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
Claims (26)
1. Un ensayo de perfilado de ADN para detector
polimorfismos en una secuencia repetida de tándem corto que tiene
una secuencia flanqueante, que comprende los pasos de:
- \bullet
- extraer el ADN de una muestra que va a ser probada;
- \bullet
- amplificar una secuencia repetida de tándem corto en el ADN extraído usando un par(es) iniciador de oligonucleótidos para producir productos de extensión amplificados, donde la secuencia repetida de tándem corto es de la fórmula (AwGxTyCz)n, donde A, G, T, y C representan los nucleótidos; w, x, y y z representan el número de cada nucleótido y varían de 0 a 7 y la suma de w+x+y+z varía de 4 a 7; y n representa el número de repeticiones y varía de 5 a 50; y
- \bullet
- detector dichos polimorfismos por identificación de dichos productos de extensión amplificados para cada secuencia repetida de tándem corto, en donde cada producto de extensión es distinguible de otros por un tamaño diferente y/o por marcador unido diferente y/o por un enlace a una oligonucleótido marcado específicamente y donde cada iniciador de cada par iniciador es seleccionado para ser sustancialmente complementario a una cadena diferente en la secuencia flanqueante de cada secuencia repetida de tándem corto que va a ser amplificada.
2. El ensayo de perfilado de ADN de la
reivindicación 1, para detector polimorfismos en al menos dos
secuencias repetidas de tándem corto que tienen una secuencia
flanqueante, donde para al menos uno de los cuales la suma de
w+x+y+z varía de 4 a 7 y n varía de 5 a 50.
3. El ensayo según se reivindica en una de las
reivindicaciones 1 a 2, que comprende además un estándar
externo.
4. El ensayo según se reivindica en una de las
reivindicaciones 1 a 2, que comprende además un estándar
interno.
5. El ensayo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, donde la muestra que va a ser probada es
una muestra forense o médica seleccionada de sangre, semen, frotis
vaginal, tejido, cabello, saliva, orina o mezcla de fluidos
corporales.
6. El ensayo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, donde la al menos una secuencia de tándem
corto no es un grupo de secuencia de nucleótido no duplicativa
alfabética representada que consiste de:
(AAAC)n, (AAAG)n, (AAAT)n,
(AACC)n, (AACT)n, (AACG)n, (AAGC)n,
(AAGG)n, (AAGT)n, (AATC)n, (AATG)n,
(AATT)n, (ACAG)n, (ACAT)n, (AGAT)n,
(ACCC)n, (ACCG)n, (ACCT)n, (ACGC)n,
(ACGG)n, (ACGT)n, (ACTO)n, (ACTG)n,
(ACTT)n, (AGCC)n, (AGCG)n, (AGCT)n,
(AGGC)n, (AGGG)n, (ATCC)n,
(ATCG)n,
(ATGC)n, (CCCG)n, (CCGG)n, o una combinación de los mismos, donde n es el número de repeticiones y varía de 5 a 40 aproximadamente.
(ATGC)n, (CCCG)n, (CCGG)n, o una combinación de los mismos, donde n es el número de repeticiones y varía de 5 a 40 aproximadamente.
7. El ensayo como se reivindica en cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, donde n varía de 5 a 20.
8. El ensayo como se reivindica en una de las
reivindicaciones 2 a 7, donde el ADN es amplificado por PCR
multiplex.
9. El ensayo según se reivindica en una de las 1
reivindicaciones 1 a 2, que comprende además un estándar en
cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde le marcador es
un agente de fluorescencia, radioisótopo, agente de
quimiluminiscencia, colorante, enzima o anticuerpo.
10. El ensayo según se reivindica en la
reivindicación 9, donde el marcador es fluorescente y es Texas Red,
ácido aminohexanoico NBD, tetracianatorodamina-5-
(ó -6) isotiocianato, o
fluorescein-5-isotiocianato.
11. El ensayo como se reivindica en cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, que comprende además el paso de 1
distinguir simultáneamente marcadores diferenciales durante el paso
de detección, donde dichos marcadores son distinguidos mediante un
analizador de marcador de ADN automatizado.
12. El ensayo de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 11, donde un par iniciador es seleccionado de
oligonucleótidos que tiene las secuencias SEQ ID. NO. 9 y 10, SEQ
ID. NO. 11 y 12, SEQ ID. NO. 13 y 14, SEQ ID NO. 15 y 16, SEQ ID
NO. 17 y 18, SEQ ID NO. 19 y 20, SEQ ID. NO. 21 y 22, SEQ ID NO, 19
y 25 y SEQ ID NO. 13 y 23.
13. Un kit para un ensayo de perfilado de ADN
como se 1 reivindica en cualquiera de las reivindicaciones
precedentes para detector polimorfismos en una secuencia repetida
de tándem corto de la fórmulas (AWGXTYCZ)n, donde A, G, T y
C representa cada nucleótido respectivo, w, x, y y z representan el
número de cada nucleótido y varía de 0 a 7 con la suma de w+x+y+z
que varía de 4 a 7, y n representa un número de repeticiones y varía
de 5 a 50, comprendiendo el kit:
un contenedor que tiene pares de iniciadores de
oligonucleótidos para amplificar secuencia(s) repetida de
tándem corto, donde cada iniciador de cada par iniciador es
complementario sustancialmente de una cadena diferente en la
secuencia flanqueante de cada secuencia repetida de tándem
corto.
14. El kit de acuerdo con la reivindicación 13,
que comprende además un estándar marcado.
15. El kit de acuerdo con las reivindicaciones 13
a 14, que comprende además un contenedor que contiene reactivos
para la reacción en cadena de la polimerasa multiplex.
16. Un método para detector una secuencia
repetida de tándem corto polimórfica que tiene una secuencia
flanqueante que comprende los pasos de:
\bullet determinar posibles secuencias de
nucleótidos no duplicativos de la fórmula (AWGXTYCZ)n donde
A, G, T y C representan cada nucleótido y w, x, y y z representan
el número de cada nucleótido y varían de 0 a 7 con la suma de
w+x+y+z que varía de 4 a 7;
\bullet buscar (AWGXTYCZ)n en bases de
datos que contengan secuencias genéticas conocidas, donde n
representa el número de repeticiones en tándem de la secuencia
genética y es al menos 5; identificar la secuencia
(AWGXTYCZ)n y su secuencia flanqueante;
\bullet extraer cada secuencia identificada
encontrada en la etapa de búsqueda y su secuencia flanqueante
usando pares iniciadores de oligonucleótidos; y
\bullet identificar las secuencias extraídas
las cuales tienen secuencias flanqueantes únicas, y donde cada
iniciador del par iniciador es seleccionado para ser
sustancialmente complementario a una cadena diferente en la
secuencia flanqueante de cada secuencia repetida.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 16
que comprende además los pasos de:
\bullet sintetizar los pares iniciadores de
oligonucleótidos complementarios a las secuencias flanqueantes
únicas;
\bullet llevar a cabo una reacción en cadena de
polimerasa con los pares iniciadores sobre muestras de ADN de una
población de prueba; Y
\bullet detectar las repeticiones de tándem
corto polimórficas en los productos de extensión de la reacción en
cadena de la polimerasa.
18. Un método de detección de una secuencia
repetida en tándem corto polimórfica en bibliotecas de fagos que
comprende los pasos de:
\bullet sintetizar sondas de oligonucleótidos
marcados complementarios a una secuencia repetida de tándem corto
de la fórmula (AWGXTYCZ)n, donde A, G, T y C representa cada
nucleótido respectivo, w, x, y y z representa el número de cada
nucleótido en la secuencia y varía de 0 a 7 con la suma de w+x+y+z
que varía de 4 a 7, y n representa el número de repeticiones y
varía de 5 a 50;
\bullet hibridizar las sondas de
oligonucleótidos marcados en bibliotecas del fago humano 2 total;
y
\bullet secuenciar las placas hibridizadas.
19. El método de acuerdo con la reivindicación
18, donde el paso de secuenciamiento incluye subclonar la placa
hibridizada.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 18
donde el paso de secuenciamiento incluye el paso de la reacción
directa en cadena de la polimerasa de la placa hibridizada.
21. Un oligonucleótido que tiene la secuencia de
SEQ ID NO: 26 siendo variable el número de secuencias repetidas
AGAT de tándem corto.
22. El oligonucleótido de la reivindicación 21
que tiene la secuencia SEQ ID NO: 26.
23. Uso de un oligonucleótido que tiene las
secuencias SEQ ID. NO. 1, SEQ ID. NO. 2, SEQ ID. NO. 3, y SEQ ID.
NO. 4 para determinar las secuencias flanqueantes de las secuencias
repetidas en tándem corto.
24. Un ensayo de perfilado de ADN para detector
polimorfismos en al menos dos secuencias repetidas de tándem corto,
que incluyen una primeras secuencia repetida de tándem corto y una
segunda secuencia repetida de tándem, comprendiendo el ensayo los
pasos de: Extraer el ADN de una muestra que va a ser probada,
Amplificar las al menos dos secuencias repetidas de tándem corto en
el ADN extraído usando pares de iniciadores de oligonucleótidos
para producir productos de extensión amplificados, donde la primera
secuencia repetida de tándem corto es de la fórmula
(AwGxTyCz)n, donde A, G, T, y C representan los nucleótidos;
w, x, y y z representan el número de cada nucleótido y varía de 0 a
7 y la suma de w+x+y+z varía de 4 a 7; y n representa el número de
repeticiones y varía de 5 a 50; y la segunda secuencia repetida de
tándem corto está representada por el por el grupo de secuencia de
nucleótido no duplicativo representado alfabético consistente de
(AAC)n, (AAG)n, (AAT)n, (ACC)n,
(ACG)n, (AGC)n,
(ACT)n, (AGG)n y (ATC)n, donde A, G, T, C, y n tienen los mismos significados como se definió antes; y detectar dichos polimorfismos por identificación de dichos productos de extensión amplificados para la secuencia alcanzada.
(ACT)n, (AGG)n y (ATC)n, donde A, G, T, C, y n tienen los mismos significados como se definió antes; y detectar dichos polimorfismos por identificación de dichos productos de extensión amplificados para la secuencia alcanzada.
25. El ensayo de acuerdo con la reivindicación
24, donde un par iniciador es usado seleccionado de un grupo que
consiste de SEQ ID. NO. 9 y 10, SEQ ID. NO. 11 y 12, SEQ ID. NO. 13
y 14, SEQ ID. NO. 15 y 16, SEQ ID. NO. 17 y 18, SEQ ID. NO. 19 y
20, SEQ ID. NO. 21 y 22, SEQ ID. NO. 19 y 25 y SEQ ID. NO. 13 y
23.
26. El ensayo de la reivindicación 24 donde una
secuencia de repetición de tándem corto es amplificada usando un
segundo par iniciador seleccionado de SEQ ID. NO. 5 y 6, SEQ ID.
NO. 5 y 24 y SEQ ID. NO. 7 y 8.
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