ES2255047T3 - Tipificacion de adn y polimorfismos repetidos en tandem cortos e identificacion de repeticiones polimorficas en tandem corto. - Google Patents

Tipificacion de adn y polimorfismos repetidos en tandem cortos e identificacion de repeticiones polimorficas en tandem corto.

Info

Publication number
ES2255047T3
ES2255047T3 ES92906069T ES92906069T ES2255047T3 ES 2255047 T3 ES2255047 T3 ES 2255047T3 ES 92906069 T ES92906069 T ES 92906069T ES 92906069 T ES92906069 T ES 92906069T ES 2255047 T3 ES2255047 T3 ES 2255047T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sequence
baselineskip
seq
dna
repeated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES92906069T
Other languages
English (en)
Inventor
C. Thomas Caskey
Albert O. Edwards
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baylor College of Medicine
Original Assignee
Baylor College of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24597796&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2255047(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Baylor College of Medicine filed Critical Baylor College of Medicine
Application granted granted Critical
Publication of ES2255047T3 publication Critical patent/ES2255047T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572—Chemical means
    • B01J2219/00574—Chemical means radioactive
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572—Chemical means
    • B01J2219/00576—Chemical means fluorophore
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572—Chemical means
    • B01J2219/00578—Chemical means electrophoric
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pens And Brushes (AREA)
  • Electrical Discharge Machining, Electrochemical Machining, And Combined Machining (AREA)
  • Non-Silver Salt Photosensitive Materials And Non-Silver Salt Photography (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Exhaust Gas Treatment By Means Of Catalyst (AREA)

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA PRUEBA DE DNA PARA DETECTAR POLIMORFISMOS. EL METODO INCLUYE LOS PASOS DE EXTRAER DNA A UNA MUESTRA A COMPROBAR, AMPLIFICAR EL DNA EXTRAIDO E IDENTIFICAR LOS PRODUCTOS DE EXTENSION AMPLIFICADOS PARA CADA SECUENCIA DIFERENTE. CADA SECUENCIA DIFERENTE SE ETIQUETA DE FORMA DIFERENTE. UNA SECUENCIA DE REPETICION DE TANDEM CORTO PUEDE CARACTERIZARSE POR LA FORMULA (AWGXTYCZ)N, EN DONDE A, G, T Y C REPRESENTAN LOS NUCLEOTIDOS, W, X, Y Y Z REPRESENTAN EL NUMERO DE NUCLEOTIDOS Y OSCILAN ENTRE 0 Y 7 Y LA SUMA DE W, X, Y Y Z OSCILA ENTRE 3 Y 7 Y N REPRESENTA EL NUMERO DE REPETICION Y OSCILA ENTRE 5 Y 50.

Description

Tipificación de ADN y polimorfismos repetidos en tándem cortos e identificación de repeticiones polimórficas en tándem corto.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona en general con un método de tipificación de ADN para detección de secuencia repetida en tándem corto. Más particularmente, se relaciona con el método de detección de secuencia repetida en tándem corto el cual muestra polimorfismos en el número de repeticiones para la detección o identificación de muestras médicas y forenses, paternidad, origen de muestras y origen de tejidos. Adicionalmente, se relaciona además con el método de identificación de repeticiones en tándem corto polimórficas y genomas.
Antecedentes de la invención
El volumen de crímenes cometidos en los Estados Unidos ha aumentado con el incremento de población y expansión de los centros de población. Una gran porción de crímenes violentos involucra la creación de evidencia de fluidos corporales que tienen el potencial de suministrar información significativa acerca del perpetrador de una ofensa particular. Aunque la comunidad científica forense ha hecho tremendos esfuerzos para usar estas evidencias, los resultados han estado limitados históricamente y no son útiles en muchas situaciones, cuando tienen que ver con restos humanos y evidencias de la escena del crimen. La identificación por marcadores genéticamente heredados ha sido vista por mucho tiempo como una posibilidad que podría superar la mayoría de los problemas que se encuentran cunado la identificación no se logra mediante huellas digitales, odontología forense, registros médicos u otros médicos. El establecimiento de un método heredado genéticamente que podría ser utilizado para identificación tendría tremendo impacto sobre la investigación de los crímenes violentos, de asalto sexual y asesinato, identificación de restos humanos y personas desaparecidas y disputas sobre paternidad.
Los métodos que permiten la comparación de muestras de tejidos no identificados con individuos específicos tendrían amplia aplicación en los sistemas de justicia criminal y las ciencias forenses. Con la posible excepción de los gemelos monozigóticos, cada individuo en la población humana tiene una única composición genética la cual podría ser usada para identificar específicamente cada individuo. Este fenómeno presenta la posibilidad teórica de usar la variación de secuencia de ADN para determinar si una muestra forense fue derivada de algún individuo dado.
Los sistemas de marcador genético, que incluyen grupos sanguíneos e isoenzimas han sido usados por forenses y serologistas médicos para proporcionar estimaciones de rango de individualidad de 1:1000 1:1,000,000 usando 10 a 15 marcadores. Los números en este rango no están a menudo disponibles, puesto que un gran porcentaje de la evidencia no produce resultados para 10 sistemas de marcadores genéticos. Los científicos forenses, investigadores y el sistema judicial han estado usando inclusiones tan bajas como 1:5 a 1:100 en una población para reforzar su caso contra los acusados.
Los campos de la serología forense y médica, pruebas de paternidad y origen de tejidos y muestras han sido alterados por el uso de la variación de secuencia del ADN, por ejemplo, secuencias satélite y número variables de repeticiones de tándem (VNTRS) o AMP-FLPS, en el laboratorio criminalístico, la corte, hospitales y laboratorios de investigación y prueba. Las probabilidades de inclusión establecidas por los laboratorios que llevan a cabo los análisis en tales casos a menudo exceden 1:1,000,000. La primera implementación de la tipificación de ADN en ciencia forense fue el uso de Jeffreys de una sonda de ADN multilocus de "huella digital" que identificó a un sospechoso en u caso de asesinato que ocurrió en Inglaterra. En los Estados Unidos un perfil de ADN ha sido establecido usando una batería de sondas VNTR de locus sencillo altamente polimórfico no enlazadas. El uso de estas baterías de sondas permite el desarrollo de un perfil de ADN compuesto para un individuo. Estos perfiles pueden ser comparados con bases de datos étnicos que usan los principios de Hardy-Weinberg para determinar la probabilidad de correspondencia entre el sospechoso y la muestra forense desconocida.
La aplicación de los VNTR a un mapeo del gen, genética de población e identificación personal ha estado limitada por la baja frecuencia en la distribución asimétrica de estas repeticiones en el genoma y por la inhabilidad para determinar con precisión los alelos con la hibridrización Southern basada en los esquemas de detección. La inhabilidad para hacer determinaciones precisas de alelos complica la aplicación del VNTR a la identificación personal. SE han diseñado protocolos de organización en los cuales todos los alelos 5 que se presentan dentro de una región del gel son tratados como el mismo alelo para los cálculos de genotipo. Puesto que la distribución de alelos aparece continua debido al limitado poder de resolución del gel Southern, los heterocigotos con alelos de tamaño similar podrían marcados como homozigotos. Estos aspectos han llevado a reivindicar que los loci VNTR no están en equilibrio de Hadad-Weinberg, y por lo tanto el método para calcular al significado de una correspondencia no está
acordado.
Aunque estos métodos han mejorado marcadamente el poder de los científicos médicos y forense para distinguir entre individuos, sufren de un cierto número de deficiencia que incluyen pérdida de sensibilidad, ausencia de control interno, costos, intensidad de tiempo, tamaños de muestra relativamente grandes e inhabilidad para ejecutar una identificación precisa de alelos y problemas con la identificación de muestras de ADN degradadas.
Estudios médicos y forenses también han empleado la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para examinar variaciones en el locus HLA. El PCR ha sido también usado para amplificar VNTR o AMP-FLP cortos. El uso de PCR apunta hacia algunos de los problemas de sensibilidad y degradación de las muestras, sin embargo, el sistema de tipificación de HLA, tiene todavía algunos problemas. Una técnica más simple, más ponderosa, es necesaria la cual haga uso de los más recientes avances en la tecnología del ADN.
La presente invención involucra una novedosa aplicación de estos avances en la ciencia forense y médica. En la presente invención han sido identificadas novedosas clases de repeticiones (STR) de tándem corto o simple, primariamente triméricas y tetraméricas altamente polimórficas. Estos STR tienen características apropiadas para la inclusión de un ensayo de perfilado de ADN. Este ensayo incorpora estándares internos o externos, que suministran mayor sensibilidad, requieren tiempos de análisis más cortos, costes más bajos y permite una identificación precisa de alelos. Los STR se amplifican con gran fidelidad y los patrones de alelos son interpretados fácilmente. La amplificación de secuencias reiteradas en tándem altamente polimórficas puede ser la de coste más efectivo y de método poderos disponibles para la comunidad médica y forense.
El ensayo de perfilado de ADN de la presente invención tiene aspectos que representan mejoras significativas sobre la tecnología existente y trae una capacidad incrementada y precisión para el perfilado del ADN para la justicia criminal, pruebas de paternidad y otros usos médicos y forenses.
En WO9004040 se describen procesos para analizar polimorfismos de longitud en dominios de ADN que usan iniciadores para secuencias simples de ADN, PCR controlado por iniciador y análisis de los productos de reacción. Aunque hay descripción de que las secuencias simples y simples críticas de ADN son elementos repetitivos que están presentes en genomas eucarióticos, no hay sugerencias de que los tetranucleótidos puedan ser efectivos como objetivos del método de tipificación de ADN basado en PCR.
En Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 9178-82, 89 (Chehab et al.) se enseña la utilización de PCR multiplex en el cual cada par iniciador porta un marcador diferente. Sin embargo, no hay guías hacia el uso de tetranucleótidos.
En Genomics, 8, 403-406, 90 (Fries et al.) se describe un método para detección de polimorfismos, pero sólo con respecto a repeticiones de dicnucleótidos.
De acuerdo con ello, se provee en concordancia con un aspecto de la presente invención:
Un objeto de la presente invención es un perfilado del ADN usando polimorfismos repetidos de tándem corto.
Un objeto adicional de la presente invención es un método para identificar la fuente de ADN en una muestra médica forense. Un objeto adicional de la presente invención es suministrar un ensayo automatizado para el perfilado de ADN.
Un objeto adicional de la presente invención es la provisión de un método para la identificación y detección de polimorfismos repetidos de tándem corto para expandir el poder de discriminación del ensayo de perfilado de ADN.
Un objeto adicional de la presente invención es extender el poder de discriminación de un ensayo de perfilado de ADN.
Un objeto adicional de la presente invención es suministrar un kit para detectar polimorfismos repetidos de tándem corto.
Así, para alcanzar los objetivos anteriores, se provee de acuerdo con un aspecto de la presente invención un ensayo de perfilado de ADN para detección de polimorfismos en secuencias repetidas de tándem corto que tiene una secuencia flanqueadora, comprendiendo las etapas de:
\bullet extracción del ADN de la muestra que se va a probar;
\bullet amplificar una secuencia repetida de tándem corto en el ADN extraído usando una pareja de iniciador (es) de oligonucleótidos para producir productos de extensión amplificados, en donde la secuencia repetida de tándem corto es de la fórmula (AwGxTyCz)n, donde A, G, T y C representan los nucleótidos; w, x, y y z representan el número de cada nucleótido y varía de 0 a 7 y la suma de w+x+y+z varía de 4 a 7; y n representa el número de repeticiones y varía de 5 a 50; y
\bullet detector dichos polimorfismos identificando dichos productos de extensión amplificados para cada secuencia repetida de tándem corto, donde cada producto de extensión es distinguible de otros por un tamaño diferente y/o por un marcador diferente enlazado y/o unión a un oligonucleótido específicamente marcado y donde cada iniciador de cada par de iniciadores seleccionado para ser sustancialmente complementario a una cadena diferente en la secuencia flanqueadora de cada secuencia repetida de tándem corto que va a ser amplificada.
Un objeto adicional de la presente invención es extender el poder de discriminación del ensayo de perfilado del ADN.
Un objeto adicional de la presente invención es suministrar un kit para detectar polimorfismos repetidos de tándem corto.
Así, para cumplir los objetivos anteriores se provee de acuerdo con un aspecto de la presente invención un ensayo de perfilado de ADN que comprende los pasos de: extraer del ADN de una muestra que va a ser probada; llevar a cabo una reacción de cadena de polimerasa multiplex sobre el ADN extraído; e identificar los productos de extensión amplificados de la reacción en cadena de polimerasa multiplex para cada secuencia diferente, donde cada diferente secuencia es marcada diferencialmente.
EL ensayo de perfilado de ADN es aplicable a cualquier muestra a partir de la cual puede extraerse el ADN amplificable. En los usos médicos y forenses las muestras son seleccionadas del grupo que consiste de sangre, semen, frotis vaginal, tejido, cabello, saliva, orine y mezcla de fluidos corporales.
Modalidades específicas de la invención incluyen el uso de ; secuencias repetidas de tándem corto seleccionadas del grupo de secuencias de nucleótidos no duplicativas que consiste en:
(AAAC)n, (AAAG)n, (AAAT)n, (AACC)n, (AACG)n, (AACT)n, (AAGC)n, (AAGG)n, (AAGT)n, (AATC)n, (AATG)n, (AATT)n, (ACAG)n, (ACAT)n, (AGAT)n, (ACCC)n, (ACCG)n, (ACCT)n, (ACGC)n, (ACGG)n, (ACGT)n, (ACTC)n, (ACTG)n, (ACTT)n, (AGCC)n, (AGCG)n, (AGCT)n, (AGGC)n, (AGGG)n, (ATCC)n, (ATCG)n,
(ATGC)n, (CCCG)n, (CCGG)n y combinaciones de las mismas donde n es el número de repetición y varía de 5 a 40 aproximadamente.
En otra modalidad de la presente invención el marcado diferencial para cada secuencia específico es seleccionado del grupo consistente de agentes de fluorescencia, radioisótopos, agentes de quimiluminiscencia, enzimas, colorantes y anticuerpos. Una modalidad específica usa los compuestos fluorescentes Texas Red, tetrametilrodamina-5-(y-5) isotiocianato, ácido aminoeanóico NBD y fluoresesin-5-isotiocianato.
El ensayo puede ser automatizado usando un analizador automatizado de ADN marcado con fluorescente capaz de distinguir, simultáneamente, diferentes fluorescencias durante el paso de identificación.
Otra modalidad de la presente invención incluye un kit que contiene iniciadores oligonucleótidos de la secuencia repetida de tándem corto.
Una modalidad adicional incluye un método para determinar repeticiones de tándem corto polimórficas que comprende los pasos de: determinación de secuencias de nucleótidos no duplicativos de la fórmula (AwGxTyCz) donde A, G, T y C representan los nucleótidos; y W, x, y, y z representan el número de cada nucleótido en la secuencia y varía entre 0 y 7 con la suma de w+x+y+z variando de 4 a 7; identificación y búsqueda de (AwGxTyCz)n en bases de datos que contengan secuencias genéticas conocidas, en donde n representa el número de repeticiones en tándem de la secuencia y es al menos 5 aproximadamente; extraer cada secuencia de nucleótido y su secuencia flanqueante encontrada en el paso de búsqueda; identificar las secuencias extraídas, las cuales tienen secuencias flanqueantes únicas; sintetizar pares iniciadores de oligonucleótidos que corresponden a la secuencia de flanqueo; llevar a cabo el PCR con los pares de iniciadores sobre las muestras de ADN de una población de prueba, y examinar los productos de extensión de PCR para detectar las repeticiones en tándem corto polimórficas.
Objetivos, aspectos y ventajas diversos y adicionales serán evidentes y la invención será más fácilmente entendida a partir de una lectura de la siguiente especificación y por referencia a los dibujos acompañantes, que forman una parte de la misma, donde los ejemplos de las modalidades actualmente preferidas de la invención se dan para propósito de revelación.
Descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra la estrategia usada para determinar la secuencia que flanquea un STR.
La figura 2 muestra el desarrollo de un locus STR polimórfico.
La figura 3 muestra ejemplos de los productos del multiplex y ensayos de PCR sencillos usados en generar datos de 1 genotipo del multilocus.
La figura 3A muestra el multiplex PCR (mPCR) de HUMHPRTB[AGAT]n (arriba) y HUMFABP[AAT]n*. La figura 3B muestra el mPCR de HUMRENA4[ACAG]n (arriba) y HUMTH01[AATG]n. La figura 3C muestra el PCR sencillo de HUMARA[AGC]n*.
Las figures 4A a 4A representan gráficamente las distribuciones relativas de frecuencia de alelos. Los recuentos de alelos fueron usados para calcular y representar gráficamente las frecuencias relativas de alelos en: 4A HUMRENA4[ACAG]n; 4B HUMTH01[AATG]n; 4C HUMARA[AGC]n; 4D HUMHPRTB[AGAT]n; y 4E HUMFABP[AAT]n.
La figura 5 muestra el resultado de un ensayo de tipificación de ADN fluorescente. El programa de análisis mide las intensidades de los perfiles fluorescentes con relación a la señal más fuerte.
Los dibujos y figuras no están necesariamente en escala y ciertos aspectos de la invención pueden ser exagerados en escala o mostrados en forma esquemática en interés de la claridad y la concisión.
Descripción detallada de la invención
Será fácilmente evidente para un experto en la técnica que diversas sustituciones y modificaciones pueden ser hechas a la invención revelada aquí sin apartarse del alcance del espíritu de la invención.
Como se usa aquí, el término "repetición de tándem corto" (STR) se refiere a todas las secuencias entre 2 y 7 nucleótidos de largo los cuales son reiterados *^{\text{no acuerdo con la invención}} en tándem dentro del organismo humano. Los STR pueden ser representados por la fórmula (AwGx-TyCz)n donde A, G, T y C representan los nucleótidos los cuales pueden estar en cualquier orden; w, x, y y z representan el número de cada nucleótido en la secuencia y varía entre 0 y 7 con la suma de w+x+y+z variando entre 4 y 7; y n representa el número de veces que la secuencia es repetida en tándem y está entre 5 y 10 aproximadamente. La mayoría de los perfiles útiles usualmente ocurren cuando la suma de w+x+y+z varían entre 3 y 7 y n varía entre 5 y 40.
Como se usa aquí secuencia "no duplicativa" significa la secuencia y su complemento. Esto está representado en su forma alfabética más baja como se muestra en la Tabla 1. Por ejemplo, (ACT) representa ACT, CTA, TAC, AGT, TAG y GTA. Cada secuencia representativa puede representar un máximo de dos veces el número de nucleótidos en la secuencia.
Como se usa aquí "secuencia de flanqueo" se refiere a la secuencia de nucleótidos en uno u otro lado del STR. "Secuencias de flanqueo únicas" son aquellas secuencias de flanqueo las cuales solo se encuentran en una ubicación dentro del genoma.
El término "iniciadores de oligonucleótidos" se usa aquí para definir una molécula que comprende más de tres desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Su longitud exacta dependerá de muchos factores relacionados con la función última y uso del iniciador del oligonucleótido, incluyendo temperatura, fuente del iniciador y uso del método. El iniciador del oligonucleótido puede presentarse de forma natural, como en un digerido de restricción purificado, o ser producido sintéticamente. El iniciador del oligonucleótido es capaz de actuar como un punto de iniciación para síntesis cuando se coloca bajo condiciones que inducen síntesis de un producto de extensión de iniciador complementario a la cadena del ácido nucleico. Las condiciones pueden incluir la presencia de nucleótido y un agente inductor tal como una ADN polimerasa a una temperatura y pH apropiados. En una modalidad preferida, el iniciador es un oligodesoxirribonucleótido de cadena sencilla de longitud suficiente para iniciar la síntesis de un producto de extensión a partir de una secuencia específica en la presencia de un agente inductor. La sensibilidad y la especificidad de los iniciadores del oligonucleótido son determinadas por la longitud del iniciador y la unicidad de la secuencia dentro de una muestra dada del ADN plantilla. En la presente invención los iniciadores de oligonucleótidos son usualmente aproximadamente mayor de 15 meros y en la modalidad preferida tiene de 20 a 30 meros de longitud aproximadamente.
Cada par de iniciadores es seleccionado para detectar un diferente STR. Cada iniciador de cada par aquí es seleccionado para ser sustancialmente complementario a una cadena diferente en la secuencia de flanqueo de cada secuencia específica que va a ser ampliada. Así, un iniciador de cada par es suficientemente complementario para hibridizarse con una parte de la secuencia en el sentido de la cadena y el otro iniciador de cada par es suficientemente complementario para hibridizarse con una parte diferente de la misma secuencia en la cadena antisentido. Aunque la secuencia de iniciador no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla, cuanto más cercanamente la terminación 3' refleje la secuencia exacta, mejor es el enlace durante la etapa de fijación.
Según se usa aquí el término "producto de extensión" se refiere a la secuencia de nucleótido la cual es sintetizada a partir de la terminación 3' del iniciador del oligonucleótido y el cual es complementario a la cadena a la cual el iniciador del oligonucleótido está enlazado.
Según se usa aquí, el término "marcado diferencialmente" indica que cada producto de extensión puede ser distinguido de todos los otros porque tiene un marcador diferente unido y/o es de un tamaño diferente y/o se enlaza a un oligonucleótido marcado específicamente. Un experto en la técnica reconocería que una variedad de marcadores está disponible. Por ejemplo, estos pueden incluir radioisótopos, agentes de fluorescencia, agentes de quimiluminiscencia, colorantes, enzimas y anticuerpos. Diversos factores afectan la escogencia del marcador. Incluye el efecto del marcador sobre la velocidad de hibridización y enlace del iniciador al ADN, la sensibilidad del marcador, la facilidad de hacer el iniciador marcado, sondas o productos de extensión, la habilidad para automatizar, la instrumentación disponible, conveniencia y similares. Por ejemplo, la marcación de radioisótopos diferenciales podría incluir ^{32}P, ^{3}H y ^{14}C; agentes de fluorescencia diferencial de marcación podrían incluir fluorescein-5-isotiocianato, tetrametilrodamina-5-(y-6)isotiocianato,Texas Red y ácido minoeanóico NBD; o una mezcla de marcadores tales como radioisótopos, agentes de fluorescencia y agentes de quimiluminiscencia.
Cada secuencia especifica diferente de ADN, la cual va a ser detectada aquí, es derivada del ADN genómico. La fuente del ADN genómico que va ser probado puede ser cualquier muestra médica o forense. Ejemplos de muestras médicas y forenses incluyen sangre, semen, frotis vaginal, tejido, cabello, saliva, orina y mezcla de fluidos corporales. Estas mezclas pueden ser frescas, antiguas, secas y/o parcialmente degradadas. Las muestras pueden ser colectadas de la evidencia en la escena de un crimen.
El término "muestra forense" según se usa aquí significa usar la tecnología para problemas legales que incluyen pero no se limitan a muestras criminales, de pruebas de paternidad y una mezcla. El término "muestra médica" según se usa aquí significa el uso de la tecnología para problemas médicos que incluyen pero no se limitan a la investigación, diagnóstico y trasplantes de tejidos y órganos.
Según se usa aquí, el término "polimorfismo" se refiere a la variación genética en las repeticiones en tándem o secuencias de flanqueo. Un ejemplo de este polimorfismo es el número de veces que la secuencia de nucleótidos 3 a 7 se repite.
Según se usa aquí, el término "reacción en cadena de polimerasa multiplex" (mPCR) se refiere a una variación novedosa de PCR. Es un procedimiento para llevar a cabo simultáneamente PCR sobre más de dos secuencias diferentes. La reacción de mPCR comprende: tratar dicho ADN extraído para formar cadenas complementarias en encadenamiento sencillo, adicionado una pluralidad de iniciadores oligonucleótidos emparejados marcados, o cada iniciador pareado específico para una diferente secuencia repetida en tándem corto, un iniciador de cada par sustancialmente complementario a una parte de la secuencia en el sentido de la cadena y el otro iniciador de cada par sustancialmente complementario a una parte diferente de la misma secuencia en la cadena antisentido complementaria, fijando la pluralidad de los iniciadores primarios a sus secuencias complementarias, extendiendo simultáneamente dicha pluralidad de iniciadores fijados desde el término 3' de cada iniciador para sintetizar un producto de extensión complementario a las cadenas fijadas de cada iniciador, o sirviendo dichos productos de extensión, después de la separación de su complemento, como plantillas para la síntesis de un producto de extensión para el otro iniciador de cada par, separando dichos productos de extensión de dichas plantillas para producir moléculas de encadenado sencillo, amplificando dichas moléculas de encadenamiento sencillo repitiendo al menos un a vez dichos pasos de separación, separación, extensión y fijación. En el proceso de mPCR el método preferido para tres loci incluye: (1) iniciadores compuestos composiciones y longitudes de base GC similares; (2) tiempos de extensión más largos hasta 8 veces los tiempos normalmente utilizados; y (3), minimización del número de ciclos de PCR llevados a cabo para alcanzar la detección por ejemplo aproximadamente 23 a 25 ciclos.
La reacción mPCR es optimizada para cada reacción. En algunas reacciones mPCR la optimización incluye además más enzima que la que normalmente se añade a una reacción de PCR.
Según se usa aquí, el término "probabilidad de correspondencia" se refiere a la oportunidad de que dos personas no relacionadas tengan el mismo genotipo combinado en los loci examinados.
Una modalidad de la presente invención es un ensayo de perfil de ADN para la detección de polimorfismos en una repetición de tándem corto que comprende los pasos de: extracción de ADN de una muestra que se va a probar; amplificación del ADN extraído; e identificación de dicho producto de extensión amplificado para cada secuencia diferente, en donde cada secuencia diferente tiene un marcador diferencial. Aunque se conoce una variedad de procedimientos de amplificación conocidos, la modalidad preferida emplea PCR o mPCR.
En una modalidad de la presente invención se usa un estándar externo. En una modalidad preferida se usa un estándar interno. El estándar está compuesto de alelos marcados de los loci STR de interés. Un experto en la técnica reconocerá que la escogencia del estándar y los intervalos escogidos dependerá del marcador y la resolución deseada. Por ejemplo, en un ensayo de perfilado de ADN, los alelos STR de una muestra de ADN pueden ser localizados con más de un bp de resolución usando un estándar interno de marca cada 3-5 bp.
En un ensayo preferido, se usan secuencias repetidas en tándem corto de nucleótidos caracterizados por la fórmula (AwGxTyCz)n donde A, G, T y C representan los nucleótidos, w, x, y y z representan el número de cada nucleótido y varían de 0 a 7 y la suma x+y+w+z varía de 4 a 7 y n representa el número y de repetición y varía de repetición y varía de 5 a 40. En otro ensayo preferido la suma de x+w+y+z es ó 4. En la modalidad preferida del ensayo de perfilado, al menos dos STR son ensayados simultáneamente.
En la modalidad más preferida el ensayo de perfilado de ADN es automatizado. Esta automatización puede ser lograda por una variedad de métodos. Un método es usar un analizador automatizado de marcación de ADN capaz de distinguir simultáneamente dirigentes agentes de fluorescencia, marcadores radioactivos o agentes de quimiluminiscencia, durante el paso de identificación. Un experto en la técnica reconocerá rápidamente que una variedad de instrumentación satisface un requerimiento. Un ejemplo de tal analizador usado en el ensayo preferido es el dispositivo de secuencia de ADN Applied Biosystems 370A Fluorescent ("dispositivo 370A") el cual tiene la capacidad para distinguir entre cuatro diferentes especies fluorescentes durante la electroforesis.
Otro aspecto de la presente invención es un método de detección de STR polimórficos para uso en el ensayo del perfilado de ADN. El método para detección de STR polimórfico comprende los pasos de: determinación de posibles secuencias de nucleótidos no duplicativos de la fórmula (AwGxTyCz), donde A, G, T y C representan cada uno el respectivo nucleótido y w, x, y y z representan el número de cada nucleótido en la secuencia y varía entre 0 y 7 con la suma de w+x+y+z variando entre 4 y 7;buscar e identificar (AwGxTyCz)n en bases de datos que contengan secuencias genéticas conocidas e identificar la secuencia (AwGxTyCz)n de dicha secuencia genética y su secuencia flanqueante, en donde representa el número de repeticiones en tándem de la secuencia, y es al menos 5 aproximadamente; extracción de cada secuencia identificada y su secuencia de flanqueo; identificación de la secuencia extraída la cual tiene una única secuencia de flaqueo; sintetizar los pares de iniciadores de oligonucleótidos en las secuencias de flanqueo únicas; llevar a cabo un PCR con los pares de iniciadores sobre las muestras de ADN de una población de prueba; y examinar los productos de extensión del PCR para detectar los STR polimórficos.
Un aspecto adicional de la presente invención es la provisión de un kit para ensayos de perfilado de ADN. El kit está compuesto de un contenedor que contiene un par de iniciadores de oligonucleótidos para amplificación de un STR. En la modalidad preferida, el número de pares de iniciadores de STR es seleccionado tal como la frecuencia de genotipo (p) y es al menos 10^{6}. Esto requiere usualmente 6-10 pares de iniciadores STR.
Una adición más al kit puede ser un contenedor que contenga estándares marcados. Una mejora adicional al kit es la adición de reactivos para mPCR.
Los siguientes ejemplos son ofrecidos a manera de ilustración y no pretenden limitar la intención de manera alguna. En los ejemplos, todos los porcentajes corresponden a peso, sin son sólidos, y a volumen si son líquidos, y todas las temperaturas están en grados Celsius a menos que se especifique de otra manera. Aquéllos indicados por un asterisco "*" están fuera de la invención reivindicada.
Ejemplo 1
Identificación por ordenador de los loci STR
Los STR fueron identificados por búsqueda en todas las secuencias humanas en el repositorio de secuencias de ADN del GenBank ADN, de la presencia a de todas las posibles clases de STR diméricos, triméricos y tetraméricos. Un experto en la técnica reconocerá rápidamente que una búsqueda similar usando repeticiones de nucleótidos 5 a 7 puede ser usada para identificar STR de 5 a 7 nucleótidos de longitud. Las posibles secuencias de nucleótidos no duplicativos usada en esta búsqueda son dadas por su representación alfabética más baja.
TABLA 1 Posibles STR no duplicativos
1
Como se muestra en la Tabla 2, la búsqueda por ordenador identificó un número considerable de STR. La búsqueda de diméricos fue fijada para identificar secuencias en las cuales el STR estaba repetido al menos 10 veces y la búsqueda de triméricos y tetraméricos fue fijada para identificar secuencias las cuales estaban repetidas al menos 5 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2
STR Humano en el ADN de GenBank
Longitud del monómero Dinucleótido Trinucleótido Tetranucleótido
(10 ó mas) (5 ó más) (5 ó más)
Fracción observada 5/6 10/10 16/34
Número total 217 101 67
La fracción observada se refiere al número de diferentes clases de STR observado del número total de clases de STR posibles. Todas las clases de repeticiones de triméricos estaban presentes y aproximadamente la mitad de las posibles secuencias de tetraméricos estaba representada.
Aproximadamente el 50% de los STR estudiados eran polimórficos. Los STR triméricos y tetraméricos tienen características de marcadores polimórficos útiles para el mapeo genético y físico del genoma humano e identificación de personas en las ciencias forense y médica.
Ejemplo 2
Identificación biológica molecular de loci de STR
Además del procedimiento para identificar los STR en GenBank, están disponibles otros métodos para identificar loci de STR adicionales. Por ejemplo, las sondas de oligonucleótidos par alas posibles 50 únicas secuencias diméricas, triméricas y tetraméricas pueden ser sintetizadas y usadas para visualizar las bibliotecas de ADN humano totales. En un ejemplo el bacteriófago recombinante lambda del cromosoma humano X fue analizado en placa a una densidad de placa de 255 formando unidades por 15 placa. La capa recolectada de las placas se hibridiza a nucleótidos marcados en el extremo 5' ^{32}P de los motivos STR. Se usaron métodos estándar de hibridización. Los oligonucleótidos fueron marcados de acuerdo con los protocolos estándar.
Con secuencias de nucleótidos hasta por encima de 100 bp las condiciones para hibridización podrían ser estimadas usando la siguiente fórmula:
T_{i} = T_{m} - 15^{o}C
T_{m} = 16\text{.}6 \ log[M] + 0\text{.}41 [P_{gc}] + 81\text{.}5 - P_{m} - B/L - 0\text{.}65 [Pf]
donde:
M es la concentración molar de Na^{+}, hasta un máximo de 0.5 (1 X SSC contiene 0.165 M Na^{+});
P_{gc} es el porcentaje de bases G o C en los nucleótidos y es 1-16 entre 30 y 70;
P_{m} es el porcentaje de bases no correspondientes, si es conocido;
P_{f} es el porcentaje de formamida en el regulador;
B es 675 para sondas sintéticas hasta de 100 bases;
L es la longitud de la sonda en bases.
LA fórmula fue usada para llegar a las condiciones en la Tabla 3:
TABLA 3
Oligo (ml) 2X P_{f} (%) H_{2}O (ml) V (ml)
Id secuencia Mezcla Hib Formamida (ml)
1152 [AATC]_{7\text{.}5} 12.5 10 2.5 10 25
1154 [AGAT]_{7\text{.}5} 12.5 10 2.5 10 25
1525 [AAT]_{10} 12.5 0 0 12.5 25
1526 [AATG]_{7\text{.}5} 12.5 10 2.5 10 25
1528 [ACAG]_{7\text{.}5} 12.5 30 7.5 5 25
La mezcla de hibridización 2X que contenía 37.5 ml de 20 X SSC, 15 ml de 50 X Denhardts, 7.5 ml de 20% SDS, y 15 ml de H_{2}O. La hibridización fue llevada a acabo a 42ºC.
Estas condiciones fueron usadas para determinar la frecuencia de cada STR mostrado en el cromosoma X usando lambda recombinante de una biblioteca genómica de cromosomas X escogida a una rejilla (Tabla 4).
TABLA 4
La frecuencia de STR triméricos y tetraméricos
STR Bacteriófago positivo (%) Frecuencia (kb/STR)
[AAT] 5 300
[AATC] 5 300
[AATG] 3 500
[ACAG] 3 500
[AGAT] 3 500
Un total de 1020 bacteriófagos recombinantes fueron hibridizados a oligonucleótidos 30 bp radiomarcados (por ejemplo, [AATC]_{7\text{.}5}. Los cálculos se basaron en un tamaño de inserto promedio de 15 kb en la biblioteca. Estos resultados de hibridización y los resultados de los estudios en el GenBank sugieren la presencia de aproximadamente 400 millones de STR en el genoma humano. Los resultados del cromosoma X han sido extendidos al genoma humano completo mediante uso de la biblioteca genómica completa del fago lambda. Así, es factible la identificación de suficientes STR para extender el ensayo de tipificación del ADN a muy altos niveles de individualización (por ejemplo, uno en un billón).
Ejemplo 3
Determinación de STR flanqueantes de la secuencia de ADN
Los clones que contiene STR, como por ejemplo, M13, lambda, cósmido y YAC pueden ser identificados por cualquier procedimiento que lleve a la hibridización a uno de los oligonucleótidos centrales. La mayoría de los métodos de hibridización son usualmente laboriosos para determinar la secuencia de segmentos de ADN únicos que flanqueen a ambos lados del STR. En la presente invención se uso la estrategia llamada STR-PCR. Esta estrategia está mostrada en forma esquemática en (figura 1).
La estrategia STR-PCR estaba basada en el método de Riley, et al, Nucleic Acids Res. 18: 2887 (1990). El método de Riley fue diseñado para amplificar las terminaciones de las moléculas YAC de un ADN genómico total de levadura. Este método fue adaptado para amplificar los segmentos de ADN flanqueantes del STR, y acoplados al secuenciamiento directo del ADN de los productos a través de una tecnología de secuenciamiento de ADN en fase sólida. Este procedimiento involucra los siguientes pasos: (1) Los extremos romos son generados para flanquear ambos lados de un STR en un segmento de ADN clonado por digestión con una enzima de restricción sencilla. Las enzimas múltiples pueden ser usadas, separadamente para generar una longitud de secuencia flanqueante en el intervalo de 100-150 bp. (2) Un enlazante que contiene una región de ADN no complementaria está ligado a la población de moléculas de extremo romo. (3) Las secuencias flanqueantes son amplificadas en reacciones separadas. La terminación izquierda es amplificada con el iniciador PCR anclado y un indicador de una cadena de STR. La terminación derecha es amplificada con el mismo iniciador PCR anclado y un iniciador de otra cadena del STR. El iniciador del STR puede ser biotinilado (*). (4) El producto PCR biotinilado (*) final. (5) La cadena biotinilada puede ser capturada con perlas recubiertas con avidina. Y (6) la secuencia flanqueante puede ser obtenida por extensión a partir del iniciador de secuenciamiento en la presencia de didesoxinucleótidos.
Los resultados de usar la estrategia STR-PCR se muestran en la Figura 2. La amplificación de ala secuencia de ADN que flanquea ambos lados de un (AGAT) STR de una bacteriófago recombinante se muestra en la Figura 2A. Mientras la Figura 2B muestra secuenciamiento directo de ADN de plantillas de cadena simple siguiendo la captura y separación de cadenas de los productos de amplificación biotinilados de lAE[AGAT]-2 con perlas magnéticas recubiertas con avidita. La Figura 2C demuestra el uso de oligonucleótidos complementarios a la secuencia de STR flanqueantes para amplificar el locus de STR en una familia.
Fueron sintetizados los iniciadores de oligonucleótidos los cuales generan un enlazante de extremo romo al fijarse. Ejemplos de estos oligonucleótidos son SEQ ID Nos: 1, 2, 3 y 4. Oligonucleótidos (SEQ ID Nos: 1 y 2) del enlazante de doble cadena, oligonucleótido (SEQ ID No: 3) es el iniciador de PCR para el ancla y el oligonucleótido (SEQ ID No: 4) es el iniciador de secuenciamiento del ADN.
El oligonucleótido (SEQ ID No: 1) fue fosforilado y fijado al (SEQ ID No: 2) para formar el enlazante de cadena doble por protocolo estándar. En este procedimiento 10 \mul de un oligonucleótido enlazante (SEQ. ID No: 1) (100 mM; 1 nanomol) se combina con aproximadamente 10 \mul de ^{32}P-gamma-ATP (10 mM); aproximadamente 5 \muL de regulador PNK ; aproximadamente 3 \muL de T4 PNKinasa (30 U); aproximadamente 22 \muL de H_{2}O para un volumen final de 50 \mul aproximadamente (a 37ºC aproximadamente, por 40 minutos aproximadamente; y a 65ºC aproximadamente, por 5 minutos aproximadamente). Luego se adicionan 10 \mul aproximadamente de otro oligonucleótido enlazante (SEQ ID No: 2). Esta mezcla es mantenida a 95ºC aproximadamente por 5 minutos aproximadamente.
Aunque el método Riley enseñaba que ambos oligonucleótidos deberías ser fosforilados, la presente invención ha descubierto que es suficiente y posiblemente mejor fosforilar sólo el primer oligonucleótido.
El siguiente procedimiento era para ligar el enlazante de doble cadena (Ancla de PCR) para el ADN del bacteriófago lambda recombinante. Primero cada clon fue digerido con enzimas de restricción de corte frecuente las cuales dan terminaciones romas. Por ejemplo: AluI, HaeIII, y RsaI. Segundo, el enlazante estaba ligado al extreme romo del ADN. Tercero, los segmentos flanqueantes fueron amplificados. En este procedimiento la muestra fue digerida con suficiente enzima para cortar el ADN (0.5 ml de enzima aproximadamente) en 1.5 \mul aproximadamente de un regulador de restricción One Phor All Plus Restriction Buffer (Pharmacia) aproximadamente 250 ng del ADN del Fago Lambda (50 kb) y suficiente H_{2}O para llevar el volumen final a 15 \mul aproximadamente. La temperatura fue mantenida a 37ºC aproximadamente hasta que el ADN fue cortado.
Después de la digestión, se añadió un cóctel para ligar. Aunque se conoce una variedad de cócteles, la presente invención usó: hasta 2.0 \mul aproximadamente de Annealed Oligonucleotides con 0.05 \mul aproximadamente de DTT 1 M, 3.0 \mul aproximadamente de rATP 0,1 M, 0.25 \mul aproximadamente de T4 ADN ligasa (Pharmacia), 1.5 \mul aproximadamente de One Phor All Plus Restriction Buffer y 9.7 \mul de H_{2}O aproximadamente. La mezcla fue mantenida a 15ºC aproximadamente por al menos 2 horas aproximadamente. Tiempos más largos, por ejemplo, durante la noche, podrían dar mejores resultados.
A continuación, los segmentos flanqueantes fueron amplificados, La mezcla de amplificación incluyó 3 \mul aproximadamente del STR-PCR Primer (10 X Cetus; 10 mM), aproximadamente 3 mL of Anchor-PCR Primer (lo mismo que con el iniciador STR-PCR), 3 \mul aproximadamente de mezcla de dNTP (10 X Cetus; 2 mM), aproximadamente 3 \muL de PCR Buffer (10 X Cetus, sin Mg++), aproximadamente 3.0 mL de 0.01 M, aproximadamente 1 mL de ADN, aproximadamente 14.2 mL de H_{2}O, y aproximadamente 0.3 mL de Amplitaq (Cetus).
La mezcla fue calentada por 2 minutos aproximadamente a 95ºC aproximadamente, luego el ensayo de PCR sobre la mezcla incluyó 25 a 30 ciclos de 45 segundos aproximadamente a 95ºC aproximadamente, luego 30 segundos aproximadamente a 60ºC aproximadamente, luego 1 minuto aproximadamente a 72ºC aproximadamente. Finalmente, la mezcla fue mantenida a 72ºC por 10 minutos aproximadamente, luego transferida a 4ºC aproximadamente. En este procedimiento la STR-PCR fue llevada a cabo separadamente para ambas cadenas de STR. El control de la concentración de Mg++ parecía ser importante.
Los producto amplificados fueron secuenciados. Si los iniciadores de STR están biotinilados (por ejemplo, por la metodología Aminolink 2 Applied Biosystems, Inc.) los productos fueron capturados con perolas recubiertas con avidita (Dynal). Fue removida la cadena de ADN no deseada. Las condiciones preferidas para el aislamiento de los productos amplificados fue como sigue: 25 \mul aproximadamente de M280 Beads de Dynal se mezclaron con aproximadamente 25 \mul de PCR Product. Esto fue mantenido por 30 minutos aproximadamente a 25ºC aproximadamente en una rueda giratoria. El sobrenadante fue removido y se adicionaron 150 \mul aproximadamente de NaOH 0.15 M. Esto fue mantenido por 5 minutos a 25ºC aproximadamente. El sobrenadante se removió entonces y el material restante fue lavado al menos una vez con agua y resuspendido en 7 \mul de agua aproximadamente para secuenciamiento del ADN. Cualesquiera reacciones estándar de secuenciamiento de ADN pueden ser usadas. En la presente invención el secuenciamiento fue llevado a cabo como para cualquier plantilla de cadena
sencilla.
Ejemplo 4
Frecuencia de variación polimórfica de STR y ejemplos
Diecisiete STR presentes bien dentro del locus HPRT humano o bien en secuencias humanas en la base de datos del Gen Bank fueron probados en cuanto a variación en la población humana. Nueve fueron polimórficos.
Las amplificaciones fueron llevadas a cabo con un termociclizador Cetus- PerkinElmer, enzima Amplitaq y condiciones de regulador recomendadas en un volumen de 15 \mul aproximadamente. Las condiciones de amplificación fueron 95ºC aproximadamente por 45 segundos aproximadamente; luego 60ºC aproximadamente por 30 segundos aproximadamente, luego 72ºC aproximadamente por 30 segundos aproximadamente. Y fueron corridos 23 a 28 ciclos aproximadamente. Los productos amplificados fueron radiomarcados por inclusión de 2 \muCi ^{32}P-dCTP (3000 Ci/mmol) en el PCR. El HUMHPRTB [AGAT]n y HUMFABP [AAT]n loci, y el HUMRENA4 [ACAG]n y HUMTH01 [AATG]n loci, fueron estudiados como un PCR multiplex PCR para dos loci. Aproximadamente 50 ng de ADN genómico fueron usados en los PCR. Los productos PCR fueron diluidos 2:5 en formamida, desnaturalizados a 95ºC aproximadamente por 2 minutos aproximadamente, y cargados sobre un gel de secuenciamiento de ADN (6% aproximadamente (39:1) acrilamida:bisacrilamida, con urea 7 M aproximadamente, y 0.04% TEMED aproximadamente). Reacciones de control sin ADN agregado fueron incluidas en cada juego de amplificaciones. Los productos de amplificación variaron en tamaño desde entre aproximadamente 100 a 350 bp. Esto permitió una precisa determinación de las longitudes de los alelos.
Los datos del GenBank para el nombre del locus, secuencia de repetición aproximada, Primer SEQ ID No:, número de alelos observados, número de cromosomas estudiados y frecuencias de heterocigotos predichas promedio se muestran en la Tabla 6.
\newpage
2 
\newpage
En la Tabla 6 se muestran los rasgos de los loci STR polimórficos 9, El rango de frecuencias de heterocigotos representa el valor obtenido por al menos el grupo racial más polimórfico. Los alelos del loci, mostrados con un rango de números de reiteración(por ejemplo, HUMFABP[AAT]*8-15) fueron secuenciados para permitir asociación precisa del número de reiteraciones en tándem con alelos específicos. El número de reiteración del clon del GenBank está dado por loci en el cual el rango en el número de repeticiones es desconocido. Se usa la representación alfabética más baja de cada motivo de STR, con el complemento reverso (c:) indicado cuando sea apropiado para loci STR compuestos. La variabilidad en la población humana fue probada con un ensayo de PCR radioactivo.
Ejemplo 5
Ejemplos de datos del ensayo de PCR radiactivo para 5 loci STR
Los datos de genotipo para cinco loci STR fueron determinados en dos PCR multiplex y uno sencillo (Figura 3). Ambas cadenas del ADN de los productos amplificados son radiomarcadas y los alelos de diferentes loci tienen apariencia distinta basada en la movilidad relativa de las dos cadenas de ADN. Los alelos HUMHPRTB [AGAT]n y HUMTHO1 [AATG]n aparecen como bandas doblete cercanamente espaciadas, mientras que los alelos HUMRENA4 [ACAG]n y HUMFABP [AAT]*n aparecen usualmente como singletes. Los alelos HUMARA [AGC]*n aparecen como dobletes ampliamente espaciados, tales que alelos adyacentes se superponen. La cadena más rápida de alelos j HUMHPRTB 15 [AGAT]n usualmente aparece como un doblete, debido a la adición incompleta de una base extra, no complementaria al extremo 3' del producto. Las movilidades relativas de las cadenas están influenciadas por la composición del gel de archilamida. Los datos para la >Figura 3 fueron seleccionados de exámenes de población como una representación nítida de la claridad con la cual fue hecha la designación de alelos. Los autorradiogramas fueron sobreexpuestos para ilustrar las tenues bandas de artefactos que difieren en el número de repeticiones la cuales se cree que surgen durante el PCR.
Fueron secuenciados alelos representativos de cada STR polimórfico. <los resultados muestran que la variación en tamaño es una función de los números de repetición.
Ejemplo 6
Genética de población de STR en cuatro grupos étnicos humanos
Los STR triméricos y tetraméricos representan una rica fuente de marcadores altamente polimórficos en el genoma humano. Se llevó a cabo el análisis de un examen de genotipo multilocus de 40 o más individuos en poblaciones Negra, Blanca, Hispana y Asiática en EEUU, en cinco loci STR localizados en los cromosomas 1, 4, 11 y X. Las frecuencias de heterocigotos de los loci variaban desde 0.34 a 0.91 y el número de alelos de 6 a 17 para las 20 combinaciones de raza y locus. Frecuencias de alelos relativas exhiben diferencias entre razas y distribuciones unimodales, bimodales y complejas. Los datos de genotipo a partir de los loci fueron consistentes con el equilibrio de Hardy-Weinberg por tres pruebas y la sub-heterogeneidad de la población dentro de cada grupo étnico no fue detectada por dos pruebas adicionales. No fueron detectadas mutaciones en u total de 860 meiosis para dos a cinco loci estudiados en diversos parentescos. Un estimativo indirecto de las ratas de mutación dan valores desde 2.5 x 10^{-5} a 15 x 10^{-5} para los cinco loci. Ratas de mutación más altas parecen estar asociadas con más repeticiones en tándem del motivo central. El genotipo más frecuente de todos los cinco loci combinados parece tener una frecuencia de 6.51 x 10^{-4}. Juntos, estos resultados sugieren que los loci STR trimérico y tetramérico son marcadores ideales para entender el mecanismo de producción de nuevas mutaciones en regiones del ADN hipervariables y son apropiados para identificación de personas en las ciencias médicas y forenses.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
\newpage
3
Muestras
El ADN fue extraído de muestras de sangre obtenidas en bancos de sangre locales de donantes voluntarios no relacionados. El personal del banco de sangre designó visualmente a los donantes como Negros, Blancos u otros. Los Hispanos y Orientales fueron identificados con base en el apellido. Fueron estudiados un total de 40 individuos en cada uno de estos cuatro grupos étnicos. Los datos de genotipo en 40 familias (10 franceses, 27 mormones de UTA, 2 venezolanos y un Maíz) fueron determinados con [HUMHPRTB (AGAT)n y HUMFABP (AAT)*n. Cinco loci STR fueron estudiados en familias adicionales para un mínimo de 31 meiosis. Los loci STR son designados por su nombre de locus del GenBank y la representación alfabética más baja de los 44 motivos de repetición triméricos y tetraméricos posibles únicos. Por ejemplo, HUMHPRTB (AGAT)n se refiere al (CTAT) STR polimórfico localizado en el intrón 3 del gen (HPRT) hipoxantina fosforibosiltransferasa humana. Los loci estudiados, sus números de acceso al GenBank, asignaciones cromosomales, iniciadores de amplificación y rango de los tamaños de producto (basados en la secuencia del GenBank) se dan en la Tabla 7.
En la Tabla 8 los alelos son numerados de acuerdo con el número de repeticiones en tándem presentes en los productos de amplificación. El número de motives repetidos fue determinado por secuenciamiento directo del ADN de los productos amplificados, o por subclonación en M13 para el secuenciamiento. EL número de repeticiones de los fragmentos subclonados fue verificado con respecto a la fuente del ADN genómico original por amplificación del segmento clonado. Cálculos y estadísticas
Una variedad de pruebas genéticas en población estándar fueron empleadas para valorar las frecuencias de heterozigotos, frecuencias de alelos y asociación aleatoria de alelos en diferentes loci. Estas pruebas incluyen mediciones de errores estándar, estadísticas G para la prueba de relación de relaciones de probabilidad, distribuciones binomiales, equilibrio Hardy-Weinberg y resumen estadístico (sk_{2}).
Frecuencias relativas de alelos
Las frecuencias de alelos y sus errores estándar fueron calculados a partir de los genotipos de aproximadamente 40 individuos para las combinaciones de cinco loci STR y cuatro poblaciones (Tabla 8).
Frecuencias de alelos y sus errores estándar en 5 loci STR en 4 poblaciones
Frecuencias de alelos (%) y errores estándar (%) en alelo (a)
Blancos Negros Hispanos Asiáticos Combinado (b)
LOCUS - HUMHPRTB[AGAT]_{n}
7 0.4 \pm 0.4 - - - - - - - - - 0.3 \pm 13
9 0.4 \pm 0.4 1.6 \pm 1.6 - - - - - - 0.5 \pm 0.4
10 0.4 \pm 0.4 1.6 \pm 1.6 - - - - - - 0.5 \pm 0.4
11 12.1 \pm 2.2 3.2 \pm 2.2 8.9 \pm 3.8 11.3 \pm 4.4 10.1 \pm 1.5
12 34.4 \pm 3.2 29.0 \pm 5.8 39.3 \pm 6.5 26.4 \pm 6.1 33.2 \pm 2.4
13 33.0 \pm 3.1 30.6 \pm 5.9 39.3 \pm 6.5 39.6 \pm 6.7 34.4 \pm 2.4
14 14.7 \pm 2.4 21.0 \pm 5.2 5.4 \pm 30 13.2 \pm 4.7 14.2 \pm 1.8
15 2.2 \pm 1.0 11.3 \pm 4.0 7.1 \pm 34 9.4 \pm 4.0 5.3 \pm 1.1
16 2.2 \pm 1.0 1.6 \pm 1.6 - - - - - - 1.5 \pm 0.6
(n^{d}) 224 62 56 53 395
LOCUS - HUMTHO1[AATG]_{n}
6 26.2 \pm 4.9 12.5 \pm 3.7 21.3 \pm 4.6 8.8 \pm 3.2 17.2 \pm 2.1
7 8.8 \pm 3.2 32.5 \pm 5.2 30.0 \pm 5.1 23.7 \pm 4.8 23.8 \pm 2.4
8 11.3 \pm 3.5 21.3 \pm 4.6 6.3 \pm 2.7 3.8 \pm 2.1 10.6 \pm 1.7
9 16.2 \pm 4.1 21.3 \pm 4.6 13.7 \pm 3.9 47.5 \pm 5.6 24.7 \pm 2.4
10 36.2 \pm 5.4 12.5 \pm 3.7 28.7 \pm 5.1 7.5 \pm 2.9 21.3 \pm 2.3
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} Designaciones alélicas que se refieren al número de repeticiones del motivo de secuencia central indicado en la columna de locus. \end{minipage}
^{b} Alelos de todos los cuatro grupos raciales fueron combinados para esta columna.
^{c} Un guión indica la ausencia de ese alelo en la muestra respectiva.
^{d} Se refiere al número de muestras de cromosomas.
* no de acuerdo con la invención
Frecuencias de alelos y sus errores estándar en 5 loci STR en 4 poblaciones
Frecuencias de alelos (%) y errores estándar (%) en alelo (a)
LOCUS - HUMTHO1[AATG]_{n}
11 1.3 \pm 1.2 - - - - - - 7.5 \pm 2.9 22 \pm 2.3
12 - - - - - - - - - 1.3 \pm 1.2 03 \pm 0.3
(n) 80 80 80 80 320
LOCOS - HUMRENA4[ACAG]_{n}
7 - - - 2.5 \pm 1.7 - - - - - - 0.6 \pm 0.5
8 80.3 \pm 4.6 71.2 \pm 5.1 76.2 \pm 4.8 69.7 \pm 5.3 74.4 \pm 2.5
9 - - - 3.8 \pm 2.1 - - - - - - 1.0 \pm 0.6
10 7.9 \pm 3.1 11.3 \pm 3.5 6.3 \pm 2.7 19.7 \pm 4.6 11.2 \pm 1.8
11 11.8 \pm 3.7 10.0 \pm 3.4 12.5 \pm 3.7 3.9 \pm 2.2 9.6 \pm 1.7
12 - - - 1.3 \pm 1.2 5.0 \pm 2.4 6.6 \pm 2.8 3.2 \pm 1.0
(n) 76 80 80 76 312
LOCOS - HUMFABP[AAT]*_{n}
8 - - - 2.5 \pm 1.7 1.3 \pm 12 - - - 0.6 \pm 0.3
9 0.3 \pm 0.3 27.5 \pm 5.0 1.3 \pm 12 5.1 \pm 2.5 5.2 \pm 1.0
10 49.7 \pm 2.9 32.5 \pm 5.2 55.0 \pm 5.6 66.7 \pm 5.3 50.4 \pm 2.2
11 17.4 \pm 2.2 2.5 \pm 1.7 8.8 \pm 3.2 6.4 \pm 2.8 12.3 \pm 1.4
12 3.4 \pm 1.0 5.0 \pm 2.4 2.5 \pm 1.7 2.6 \pm 1.8 3.4 \pm 0.8
13 24.8 \pm 2.5 12.5 \pm 3.7 25.0 \pm 4.8 19.2 \pm 4.4 22.2 \pm 1.8
14 4.4 \pm 1.2 16.3 \pm 4.1 6.2 \pm 2.7 - - - 5.8 \pm 1.0
15 - - - 1.3 \pm 1.2 - - - - - - 0.2 \pm 0.2
(n) 298 80 80 78 536
LOCUS - HUMARA[AGC]*_{n}
13 - - - 1.6 \pm 1.6 - - - - - - 0.4 \pm 0.4
15 - - - - - - - - - 5.7 \pm 3.2 1.3 \pm 0.8
16 - - - 1.6 \pm 1.6 - - - - - - 0.4 \pm 0.4
17 1.7 \pm 1.7 17.7 \pm 4.9 - - - 1.9 \pm 1.9 5.7 \pm 1.5
18 1.7 \pm 1.7 16.1 \pm 4.7 9.3 \pm 3.9 3.8 \pm 2.6 7.9 \pm 1.8
19 10.2 \pm 3.9 8.1 \pm 3.5 9.3 \pm 3.9 9.4 \pm 4.0 9.2 \pm 1.9
20 15.3 \pm 4.7 9.7 \pm 3.8 3.7 \pm 2.6 5.7 \pm 3.2 8.8 \pm 1.9
21 16.9 \pm 4.9 8.1 \pm 3.5 18.5 \pm 5.3 18.9 \pm 5.4 15.4 \pm 2.4
22 8.5 \pm 3.6 17.7 \pm 4.9 9.3 \pm 3.9 17.0 \pm 5.2 13.6 \pm 2.3
23 15.3 \pm 4.7 4.8 \pm 2.7 9.3 \pm 3.9 15.1 \pm 4.9 11.0 \pm 2.1
24 20.3 \pm 5.2 6.5 \pm 3.1 13.0 \pm 4.6 3.8 \pm 2.6 10.5 \pm 2.0
25 6.8 \pm 3.3 1.6 \pm 1.6 11.1 \pm 4.3 5.7 \pm 3.2 6.1 \pm 1.6
26 3.4 \pm 2.4 - - - 5.6 \pm 3.1 11.3 \pm 4.3 4.8 \pm 1.4
27 - - - 1.6 \pm 1.6 1.8 \pm 1.8 1.9 \pm 1.9 13 \pm 0.8
28 - - - 3.2 \pm 2.2 1.8 \pm 1.8 - - - 1.3 \pm 0.8
29 - - - 1.6 \pm 1.6 5.6 \pm 3.1 - - - 1.8 \pm 0.9
30 - - - - - - 1.8 \pm 1.8 - - - 0.4 \pm 0.4
(n) 59 62 54 53 228
\begin{minipage}[t]{155mm} designaciones alélicas que se refieren al número de repeticiones del motivo de secuencia central indicado en la columna locus. \end{minipage}
* no de acuerdo con la invención
Las frecuencias de algunos alelos específicos (por ejemplo, alelo 7 de HUMTH01 [AATG]n y alelo 17 de HUMARA [AGC]*n) son claramente variables a través de los cuatro grupos raciales. Las distribuciones de frecuencias de alelos por raza se dan en la Figura 4. Con la excepción de HUMHPRTB (AGAT)n, el cual es unimodal y simétrico, las distribuciones de frecuencia de alelos parecen bimodales o más compleja. EL alelo más común, sin embargo, parece ser el mismo para algunos loci (por ejemplo, HUMRENA4 (ACAG)n), mientras que en otros loci los alelos predominantes no coinciden entre razas (por ejemplo, HUMARA (AGC)*n).
\newpage
Genotipos más frecuentes
4 
\newpage
Las frecuencias de los genotipos más comunes de sistemas de tipificación de ADN refleja la utilidad del ensayo en la práctica. Los genotipos más frecuentes para los cinco loci STR tienen frecuencias desde 0.048 a 0.645 en las 20 combinaciones de los STR de las razas (Tabla 9). Los genotipos más comunes para todos los cinco loci combinados (p) tienen frecuencias desde 1.40 x 10^{-4} hasta 6.54 x 10^{-4} en los cuatro grupos raciales.
La probabilidad de correspondencia P2) para el genotipo más común de todos los cinco loci combinados fue 4.24 x 10^{-7}. Las frecuencias de los genotipos menos comunes para todos los cinco loci combinados fueron del orden de 10^{-17}. Los cálculos de probabilidad en la Tabla 15 son solo relevantes para individuos femeninos puesto de dos de los loci están unidos por X. El genotipo masculino más común para todos los cinco loci combinados tiene frecuencias de 6.8 x 10^{-4} hasta 36.4 x 10^{-4} en los cuatro grupos raciales.
Los mejores marcadores para individualización en medicina y ciencia forense pueden ser aquéllos con distribuciones de frecuencias de alelos simétricas y similares. La escogencia de la base de datos étnica apropiada parece menos crítica en tales loci para las cuatro poblaciones éticas que hemos estudiado.
Las bandas de artefactos tenues las cuales se cree que surgen durante el PCR, ayudan en la determinación del genotipo con relación a estándares externos. Es posible encontrar entre las líneas de alelo a alelo sobre radiogramas sobreexpuestos, tales que aun los alelos ampliamente separados que difieren por aproximadamente 6 unidades de repeticiones sean contados con exactitud. EL uso de mPCR con marcadores fluorescentes y estándares internos mejora con esta exactitud.
Los datos demuestran que los datos de genotipo de repeticiones en tándem triméricas y tetraméricos fueron exacta y eficientemente obtenidos vía PCR multiplex. La fidelidad con la cual los STR triméricos y tetraméricos fueron amplificados comparada con los STR diméricos hace que estas nuevas clases de marcadores polimórficos sean bien apropiadas para aplicación en tipificación de ADN en ciencia forense y medicina.
Ejemplo 7
Ensayo de perfilado de ADN fluorescente con estándares internos
La tipificación de ADN es una técnica poderosa para determinar la relación, si la hay, entre dos muestras de ADN genómicas. Las aplicaciones para la tipificación del ADN incluyen identificación personal y pruebas de paternidad en ciencia forense, y determinaciones de Fuentes de muestra en trasplantes, diagnóstico prenatal y validación de pedigrí. Varios aspectos de los STR polimórficos sugieren que podrían formar las bases de un ensayo de tipificación de ADN poderoso y simple. El pequeño tamaño de las unidades amplificadas permite que varios loci sean fácilmente amplificados simultáneamente por mPCR y analizados con identificación de alelos precisa sobre geles de secuenciamiento de ADN. La precisión, sensibilidad y velocidad de detección de los alelos con PCR ofrece oportunidades especiales para el estudio de espécimenes forenses. Por ejemplo, STR triméricos y tetramérico muestran excelente fidelidad de amplificación indicando que las huellas de genotipificación pueden ser fácilmente interpretadas y dóciles a la automatización. La detección de los fragmentos de ADN fluorescentes puede ser usada para estándares internos de tamaño y cuantificación precisa de alelos.
Para la tipificación genética, los alelos de tres loci STR cromosómicamente no unidos fueron ampliados simultáneamente en un mPCR (Figura 5). Un iniciador de cada uno de los tres juegos de iniciadores de amplificación está marcado diferencialmente con uno de los cuatro colorantes fluorescentes usados con el dispositivo de secuenciamiento de ADN. En el sistema ABI 370A, un colorante reservado para el estándar interno, mientras que tres colorantes están disponibles para la amplificación de los productos de los loci STR. Teóricamente, cualquier región dada del gel de secenciamiento puede contener estándares internos así como alelos de los tres loci STR no enlazados. Usado a su máximo potencial la metodología tiene enorme poder de identificación personal de alta
exactitud.
La amplificación incorpora un marcador fluorescente dentro de una terminación y un sitio MluI en el otro extreme de cada producto en el mpCR (Figura 5). Siguiendo la amplificación de los loci STR de una muestra de ADN genómico, la actividad residual de la T. aquaticus polimerasa es destruida y una longitud de fragmento homogénea es alcanzada para cada alelo por digestión con MluI. Los productos multiplex tratados son entonces mezclados con los estándares internos y cargados sobre un gel de secuenciamiento para análisis en un ABI 370A. Los estándares internos fueron generados combinando productos de amplificación de individuos de genotipo conocido tales que la relación molar de cada alelo observado era aproximadamente igual. Los alelos combinados fueron diluidos, reamplificados y tratados con MluI. Este esquema para generar marcadores internos de tamaño estándar asegura un suministro virtualmente ilimitado de estándares.
La combinación de un sistema de detección cuantitativo y mPCR permitió niveles adicionales de control interno y precisión. Usando productos de mPCR sintetizados bajo condiciones de amplificación estandarizadas, la intensidad fluorescente de alelos específicos en diferentes loci, estaba relacionada. Debido a la relación entre alelos de diferentes loci, fue posible distinguir entre homozigoticidad y hemizigoticidad en un locus dado (Figura 5). Mientras que una falla en la amplificación de alelos puede ocurrir por polimorfismo en el sitio de enlace del iniciador, el fracaso fue detectable por cuantificación. Esta capacidad cuantitativa remueve 1 a duda que se ha forjado en el uso de VNTR debido a la observación de exceso de homozigoticidad en estudios de población. La naturaleza cuantitativa de la identificación de alelos también facilita el análisis de muestras corporales mezcladas lo cual ocurre en forénsica, diagnóstico prenatal, la detección aneuploidia cromosomática y mosaicismo somático verdadero vistos en pacientes con anormalidades cromosómicas y en el seguimiento de trasplantes de médula ósea.
El potencial de individualización promedio (PI) de los tres loci juntos fue uno en 500 individuos. Estas frecuencias de genotipo combinadas (tres loci) de los individuos en los paneles A y B fueron 0,00026 y 0,0085 asumiendo el equilibrio Hardy-Weinberg. La adición de tres loci más dará un PI de aproximadamente uno en 200,000 mientras que la adición de seis loci más dará un PI de uno en 90 millones. Se han hecho PCR multiplex de esta complejidad. Son conocidos ocho y nueve sitios genéticos de mPCR para los genes de la hipoxantina fosforibosiltransferasa y
distrofina.
Los oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador de ADN Applied Biosystems (ABI) 380B. Los oligonucleótidos no derivados no fueron purificados después de la desprotección y liofilización. La química ABI Aminolink 2 fue usada para derivar oligonucleótidos para marcaje con biotina y fluorescente, después de lo cual fueron precipitados con etanol y purificados por electroforesis en gel de poliacrilamida. Los colorantes fluorescentes (Molecular Probes, Eugene, OR) usados en el ensayo fueron (i) ácido aminoheanóico NBD, para todos los marcadores de estándar interno, (ii) éster succimidilo de (ii) 5-(y-6)-carboxifluoresceína para los loci HUMTH01 [AATG]n y HUMHPRTB [AGAT]n, y (iii) Texas Red^{TM} cloruro de sulfonilo para el locus HUMFABP [AAT]*n. Los juegos de iniciadores tenían el primer iniciador derivado y el segundo iniciador que contenía un sitio de restricción MluI. Los iniciadores usados: HUMTH01(AATG)n, (SEQ. ID NOS: 13, 23); HUMFABP(ATT)*n (SEQ ID NOS; 5, 24); HUMHPRTB(AGAT)n (SEQ ID. NOS; 19, 25). La amplificación simultánea con todos los seis iniciadores fue llevada a cabo con 25 ciclos por desnaturalización a 95ºC aproximadamente por 45 segundos aproximadamente, fijando a 60ºC aproximadamente por 30 segundos aproximadamente, y extendiendo a 72ºC por 30 segundos aproximadamente, usando un termociclizador Perkin-Elmer-Cetus, Amplitaq y condiciones de regulador. La concentración del iniciador en el multiplex fueron aproximadamente 0.06 \muM para HUMTH01 [AATG]n, aproximadamente 1.6 mM para HUMFABP [AAT]*n, y aproximadamente 0.56 mM para HUMHPRTB [AGAT]n. Siguiendo la amplificación, los productos fueron extraídos con fenol, precipitados con etanol y digeridos con MluI. Los productos multiplex digeridos fueron combinados entonces con los estándares internos de tamaño y se sometieron a electroforesis través de un gel de poliacrilamida al 6.5% y urea 8.3 M a 1300-1500 v, 24 mA y 32 W a una temperatura de aproximadamente 46ºC. Los estándares de tamaño internos fueron preparados por amplificación de alelos específicos a partir de individuos de genotipo conocido. Los productos fueron cuantificados, cuantificados para dar una equimolaridad cercana, diluidos aproximadamente 5000 veces y reamplificados con aproximadamente 12 ciclos.
En la figura 5A se muestran los perfiles fluorescentes de de los cócteles del estándar interno cuando se combinan y se someten a electroforesis en una línea sencilla de un dispositivo secuenciador de ADN ABI 370. En la Figura 5B los estándares internos fueron combinados con los productos de amplificación de un PCR multiplex compuesto de (de izquierda a derecha) los loci HUMTH01 (AATG)n, (I), HUMFABP (AAT)*n (II), y HUMHPRTB (AGAT)n (III). El individuo mostrado es heterozigótico para todos los tres marcadores. En la Figura 5C se muestra la amplificación multiplex de un individuo homozigótico en el locus HUMFABP (AAT)*n y hemizigótico en HUMHPRTB
(AGAT)n.
Ejemplo 8
Esquemas de detección alternativos: radiactiva, tinción con plata, intercalación
Puesto que algunos laboratorios forenses podrían no tener acceso a dispositivos de detección fluorescente, los marcadores STR pueden ser detectados con sistemas electroforéticos no desnaturalizantes y desnaturalizantes, usando marcación alternativa como estrategia de detección, por ejemplo, métodos de detección radiactiva y tinción con plata, métodos de tinción con bromuro de etidio, son todos aplicables. Los loci STR 6-15 están distribuidos en 4 a 5 reacciones mPCR separadas, cada uno conteniendo 2-4 loci. Los tres loci son seleccionados de tal forma que los productos de amplificación corren en regiones no superpuestas del gel (esto es, las longitudes del par de bases de los alelos de diferentes loci no se superponen). Los alelos de muestras desconocidas son identificados con referencia a estándares externos en líneas adyacentes (Pueden ser empleados los mismos cócteles usados en el esquema de detección fluorescente (Figura 5)).
Ejemplo 9
Especificidad de especies
La especificidad de especies de amplificación de todos los loci STR puede ser determinada. Los ADN de primates, por ejemplo, humanos, babún, chimpancé, gorrilla y diversas cepas bacterianas y de levaduras son comparados. Adicionalmente, son también examinadas la Drosophila, animales de granja comunes, mascotas caseras comunes y flora humana común. No hay dificultad en obtener las muestras, ya que sólo 10 \mug de ADN se necesitan para llevar a cabo más de 100 estudios. La alta similitud de secuencia entre humanos y otros primates sugiere que algunos de los loci amplifican genomas a partir de los primates no humanos. Es importante documentar cuáles loci pueden ser amplificados a partir de cuáles especies, para óptimos rendimientos del método en el campo forense. La amplificación no se ve en no primates.
Ejemplo 10
Kits
EL kit incluye un contenedor que contiene un par iniciador de oligonucleótido para amplificar repeticiones en tándem corto. El kit puede también incluir estándares. Un kit incluye estándares y tres pares de iniciadores de oligonucleótido. En una modalidad preferida, el kit incluye suficientes pares de iniciadores de oligonucleótidos necesarios para llevara a cabo mPCR para al menos 6-10 loci. El kit puede además incluir los reactivos y protocolos establecidos para el uso del kit. Estos kits suministran eficiente y efectiva transferencia y distribución del método a la comunidad forense. Los oligonucleótidos y las mezclas de reacción en estos kits pueden ser guardados a -70ºC por periodos extensos de tiempo. Esto facilita la producción en masa y control de calidad de los reactivos necesarios para suministrar para suministrar reactivos preciso a un costo razonable.
Ejemplo 11
Novedosa secuencia de STR
Una secuencia de repetición de tándem corto novedosa (SEQ ID. NO. 26) fue identificada a partir de un clon lambda que contenía la biblioteca del cromosoma X con un oligonucleótido de 30 pares de bases de la secuencia AGAT repetida en tándem. Este locus fue identificado como HUMSTRXI. La secuencia que flanquea la repetición AGAT fue amplificada y secuenciada. Los oligonucleótidos fueron diseñados para amplificar la repetición AGAT SEQ ID. NOS. 21 y 22.
El número de repeticiones AGAT es variable. La longitud exacta de la secuencia fue inferida por la longitud de las secuencias repetidas de tándem corto polimórficas, con verificación de las secuencias terminales. El STR está entre aproximadamente la base 153 y 203 del SEQ ID. NO. 26. El iniciador de sentido está entre las bases 61 y 84 que corresponde a SED ID Nº 22 y el iniciador antisentido es el complemento reverse de la secuencia entre las bases 346 y 369 y corresponde a SEQ ID. NO. 21.
Ejemplo 12
Resultados y beneficios esperados
La metodología novedosa de la presente invención suministra la más ponderosa técnica hasta la fecha para la caracterización de sangre y otros fluidos corporales. El incremento en la evidencia creíble que este ensayo produce podría traducirse en un incremento en la tasa de convictos por crímenes violentos tales como asalto sexual y asesinato. Más importante aun, muchos sospechosos inocentes serina categóricamente librados de falsas acusaciones. Aplicaciones adicionales podrían resultar en un poder investigativo incrementado en la identificación de personas desaparecidas, niños raptados, personal militar, y restos humanos de desastres naturales y físicos. La sensibilidad de los métodos de identificación de fluidos corporales podría también ser incrementada bastante más allá de los límites actuales. Esto proporcionaría obvios beneficios en el número de casos en los cuales las evidencias útiles fueran disponibles.
Otra mejora significativa sobre la tecnología de ADN actualmente usada es la disminución profunda en la cantidad de tiempo requerida para suministrar resultados y la cantidad de trabajo requerida para producir los resultados. EL tiempo de prueba real para las nuevas metodologías es solo el 10% del tiempo requerido par alas técnicas de perfilado de ADN existentes. Además, la tecnología existente es de uso investigativo limitado en asaltos sexuales y homicidios, debido a la longitud de tiempo requerido para obtener resultados.
El ensayo de perfilado de STR ADN permite una precisa determinación de alelos. El análisis de bases de datos para la estabilidad del locus, hetereogenicidad de población, frecuencia de alelos en población, la herencia mendeliana, son enormemente simplificados. La recolección de datos a partir del ensayo de perfil de STR fluorescente se presta por sí mismo para al automatización, reduciendo por lo tanto la posibilidad de error del operador. Las designaciones de alelos discretos definidas promueve la generación de un banco de datos nacional.
Los loci desarrollados, los métodos de ensayo de perfilado, y los estudios de población son de interés para la comunidad científica en general. El perfilado del ADN tiene aplicación directa en el diagnóstico médico y en los laboratorios de investigación para la verificación de la identidad de un espécimen.
Un experto en la técnica apreciará rápidamente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como los inherentes a los mismos. Los oligonucleótidos, métodos, procedimientos y técnicas descritos aquí son actualmente representativos de las modalidades preferidas, se pretende que sean considerados como ejemplos y no se deben entender como limitaciones del alcance. Cambios en los mismos y otros usos se les ocurrirán a los expertos en la técnica, los cuales están comprendidos dentro del espíritu de la invención o definidos por el alcance de las reivindicaciones anexas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTES: Albert O. Edwards y Charles Thomas Caskey
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PERFILADO DE ADN CON POLIMORFISMOS REPETIDOS DE TÁNDEM CORTO E IDENTIFICACIÓN DE STR POLIMÓRFICOS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 26
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRIGIRSE A: Fulbright & Jaworski Patent Department
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1301 McKinney, Suite 5100
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Houston
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Texas
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: U.S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 77010-3095
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco,3.5 pulgadas (1.44 MB)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC/AT
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: BASIC
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FECHA DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: THOMAS D. PAUL
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 32,714
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: D-5217
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (713) 651-5325
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (713) 651-5246
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: WESTERN UNION 762829
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 52
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 52
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACGAGAATC GCTGTCTCTG CAGT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAGTATCAG TTTCATAGGG TCACC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTTCGTTT CCATTGTCTG TCCG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCAGAATCT GTTCCAGAGC GTGC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGTGAAGG TTGCTGTTCC TCAT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTGAGTCCC AGTTGCCAGT CTAC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTGGTCACC TTGGAAAGTG GCAT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(12) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAGGGCTGT ATGGAATACG TTCA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(13) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAAGCACCAA GCTGAGCAAA CAGA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(14) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGGGCTGAA AAGCTCCCGAT TAT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTCAAAGGG TATCTGGGCT CTGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(16) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGAGACAG GATGTCTGGC ACAT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(17) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCATCTCTCT CCTTAGCTGT CATA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(18) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAGTACCTT CCCTCCTCTA CTCA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(19) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCTATGGAG CTGGTAGAAC CTGA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(20) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGCCACAGA TAATACACAT CCCC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(21) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCTCCAGAA TAGTTAGATG TAGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(22) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCCTTGTGG CCTTCCTTAA ATGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(23) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTCTCCAGC ACCCAAGGAA GTCA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(24) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTACGCGTAT TCAAAGGGTA TCTGGGCTCT GG 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(25) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTACGCGTCT CGGACAGTAT TCAGTTCGTT TC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(26) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTACGCGTTC TCCAGAATAG TTAGATGTAG GTAT 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(27) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 504
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENCADENAMIENTO: Sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
8

Claims (26)

1. Un ensayo de perfilado de ADN para detector polimorfismos en una secuencia repetida de tándem corto que tiene una secuencia flanqueante, que comprende los pasos de:
\bullet
extraer el ADN de una muestra que va a ser probada;
\bullet
amplificar una secuencia repetida de tándem corto en el ADN extraído usando un par(es) iniciador de oligonucleótidos para producir productos de extensión amplificados, donde la secuencia repetida de tándem corto es de la fórmula (AwGxTyCz)n, donde A, G, T, y C representan los nucleótidos; w, x, y y z representan el número de cada nucleótido y varían de 0 a 7 y la suma de w+x+y+z varía de 4 a 7; y n representa el número de repeticiones y varía de 5 a 50; y
\bullet
detector dichos polimorfismos por identificación de dichos productos de extensión amplificados para cada secuencia repetida de tándem corto, en donde cada producto de extensión es distinguible de otros por un tamaño diferente y/o por marcador unido diferente y/o por un enlace a una oligonucleótido marcado específicamente y donde cada iniciador de cada par iniciador es seleccionado para ser sustancialmente complementario a una cadena diferente en la secuencia flanqueante de cada secuencia repetida de tándem corto que va a ser amplificada.
2. El ensayo de perfilado de ADN de la reivindicación 1, para detector polimorfismos en al menos dos secuencias repetidas de tándem corto que tienen una secuencia flanqueante, donde para al menos uno de los cuales la suma de w+x+y+z varía de 4 a 7 y n varía de 5 a 50.
3. El ensayo según se reivindica en una de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende además un estándar externo.
4. El ensayo según se reivindica en una de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende además un estándar interno.
5. El ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, donde la muestra que va a ser probada es una muestra forense o médica seleccionada de sangre, semen, frotis vaginal, tejido, cabello, saliva, orina o mezcla de fluidos corporales.
6. El ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, donde la al menos una secuencia de tándem corto no es un grupo de secuencia de nucleótido no duplicativa alfabética representada que consiste de:
(AAAC)n, (AAAG)n, (AAAT)n, (AACC)n, (AACT)n, (AACG)n, (AAGC)n, (AAGG)n, (AAGT)n, (AATC)n, (AATG)n, (AATT)n, (ACAG)n, (ACAT)n, (AGAT)n, (ACCC)n, (ACCG)n, (ACCT)n, (ACGC)n, (ACGG)n, (ACGT)n, (ACTO)n, (ACTG)n, (ACTT)n, (AGCC)n, (AGCG)n, (AGCT)n, (AGGC)n, (AGGG)n, (ATCC)n, (ATCG)n,
(ATGC)n, (CCCG)n, (CCGG)n, o una combinación de los mismos, donde n es el número de repeticiones y varía de 5 a 40 aproximadamente.
7. El ensayo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde n varía de 5 a 20.
8. El ensayo como se reivindica en una de las reivindicaciones 2 a 7, donde el ADN es amplificado por PCR multiplex.
9. El ensayo según se reivindica en una de las 1 reivindicaciones 1 a 2, que comprende además un estándar en cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde le marcador es un agente de fluorescencia, radioisótopo, agente de quimiluminiscencia, colorante, enzima o anticuerpo.
10. El ensayo según se reivindica en la reivindicación 9, donde el marcador es fluorescente y es Texas Red, ácido aminohexanoico NBD, tetracianatorodamina-5- (ó -6) isotiocianato, o fluorescein-5-isotiocianato.
11. El ensayo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además el paso de 1 distinguir simultáneamente marcadores diferenciales durante el paso de detección, donde dichos marcadores son distinguidos mediante un analizador de marcador de ADN automatizado.
12. El ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, donde un par iniciador es seleccionado de oligonucleótidos que tiene las secuencias SEQ ID. NO. 9 y 10, SEQ ID. NO. 11 y 12, SEQ ID. NO. 13 y 14, SEQ ID NO. 15 y 16, SEQ ID NO. 17 y 18, SEQ ID NO. 19 y 20, SEQ ID. NO. 21 y 22, SEQ ID NO, 19 y 25 y SEQ ID NO. 13 y 23.
13. Un kit para un ensayo de perfilado de ADN como se 1 reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes para detector polimorfismos en una secuencia repetida de tándem corto de la fórmulas (AWGXTYCZ)n, donde A, G, T y C representa cada nucleótido respectivo, w, x, y y z representan el número de cada nucleótido y varía de 0 a 7 con la suma de w+x+y+z que varía de 4 a 7, y n representa un número de repeticiones y varía de 5 a 50, comprendiendo el kit:
un contenedor que tiene pares de iniciadores de oligonucleótidos para amplificar secuencia(s) repetida de tándem corto, donde cada iniciador de cada par iniciador es complementario sustancialmente de una cadena diferente en la secuencia flanqueante de cada secuencia repetida de tándem corto.
14. El kit de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además un estándar marcado.
15. El kit de acuerdo con las reivindicaciones 13 a 14, que comprende además un contenedor que contiene reactivos para la reacción en cadena de la polimerasa multiplex.
16. Un método para detector una secuencia repetida de tándem corto polimórfica que tiene una secuencia flanqueante que comprende los pasos de:
\bullet determinar posibles secuencias de nucleótidos no duplicativos de la fórmula (AWGXTYCZ)n donde A, G, T y C representan cada nucleótido y w, x, y y z representan el número de cada nucleótido y varían de 0 a 7 con la suma de w+x+y+z que varía de 4 a 7;
\bullet buscar (AWGXTYCZ)n en bases de datos que contengan secuencias genéticas conocidas, donde n representa el número de repeticiones en tándem de la secuencia genética y es al menos 5; identificar la secuencia (AWGXTYCZ)n y su secuencia flanqueante;
\bullet extraer cada secuencia identificada encontrada en la etapa de búsqueda y su secuencia flanqueante usando pares iniciadores de oligonucleótidos; y
\bullet identificar las secuencias extraídas las cuales tienen secuencias flanqueantes únicas, y donde cada iniciador del par iniciador es seleccionado para ser sustancialmente complementario a una cadena diferente en la secuencia flanqueante de cada secuencia repetida.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 16 que comprende además los pasos de:
\bullet sintetizar los pares iniciadores de oligonucleótidos complementarios a las secuencias flanqueantes únicas;
\bullet llevar a cabo una reacción en cadena de polimerasa con los pares iniciadores sobre muestras de ADN de una población de prueba; Y
\bullet detectar las repeticiones de tándem corto polimórficas en los productos de extensión de la reacción en cadena de la polimerasa.
18. Un método de detección de una secuencia repetida en tándem corto polimórfica en bibliotecas de fagos que comprende los pasos de:
\bullet sintetizar sondas de oligonucleótidos marcados complementarios a una secuencia repetida de tándem corto de la fórmula (AWGXTYCZ)n, donde A, G, T y C representa cada nucleótido respectivo, w, x, y y z representa el número de cada nucleótido en la secuencia y varía de 0 a 7 con la suma de w+x+y+z que varía de 4 a 7, y n representa el número de repeticiones y varía de 5 a 50;
\bullet hibridizar las sondas de oligonucleótidos marcados en bibliotecas del fago humano 2 total; y
\bullet secuenciar las placas hibridizadas.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, donde el paso de secuenciamiento incluye subclonar la placa hibridizada.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 18 donde el paso de secuenciamiento incluye el paso de la reacción directa en cadena de la polimerasa de la placa hibridizada.
21. Un oligonucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 26 siendo variable el número de secuencias repetidas AGAT de tándem corto.
22. El oligonucleótido de la reivindicación 21 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 26.
23. Uso de un oligonucleótido que tiene las secuencias SEQ ID. NO. 1, SEQ ID. NO. 2, SEQ ID. NO. 3, y SEQ ID. NO. 4 para determinar las secuencias flanqueantes de las secuencias repetidas en tándem corto.
24. Un ensayo de perfilado de ADN para detector polimorfismos en al menos dos secuencias repetidas de tándem corto, que incluyen una primeras secuencia repetida de tándem corto y una segunda secuencia repetida de tándem, comprendiendo el ensayo los pasos de: Extraer el ADN de una muestra que va a ser probada, Amplificar las al menos dos secuencias repetidas de tándem corto en el ADN extraído usando pares de iniciadores de oligonucleótidos para producir productos de extensión amplificados, donde la primera secuencia repetida de tándem corto es de la fórmula (AwGxTyCz)n, donde A, G, T, y C representan los nucleótidos; w, x, y y z representan el número de cada nucleótido y varía de 0 a 7 y la suma de w+x+y+z varía de 4 a 7; y n representa el número de repeticiones y varía de 5 a 50; y la segunda secuencia repetida de tándem corto está representada por el por el grupo de secuencia de nucleótido no duplicativo representado alfabético consistente de (AAC)n, (AAG)n, (AAT)n, (ACC)n, (ACG)n, (AGC)n,
(ACT)n, (AGG)n y (ATC)n, donde A, G, T, C, y n tienen los mismos significados como se definió antes; y detectar dichos polimorfismos por identificación de dichos productos de extensión amplificados para la secuencia alcanzada.
25. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 24, donde un par iniciador es usado seleccionado de un grupo que consiste de SEQ ID. NO. 9 y 10, SEQ ID. NO. 11 y 12, SEQ ID. NO. 13 y 14, SEQ ID. NO. 15 y 16, SEQ ID. NO. 17 y 18, SEQ ID. NO. 19 y 20, SEQ ID. NO. 21 y 22, SEQ ID. NO. 19 y 25 y SEQ ID. NO. 13 y 23.
26. El ensayo de la reivindicación 24 donde una secuencia de repetición de tándem corto es amplificada usando un segundo par iniciador seleccionado de SEQ ID. NO. 5 y 6, SEQ ID. NO. 5 y 24 y SEQ ID. NO. 7 y 8.
ES92906069T 1991-01-31 1992-01-28 Tipificacion de adn y polimorfismos repetidos en tandem cortos e identificacion de repeticiones polimorficas en tandem corto. Expired - Lifetime ES2255047T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US647655 1991-01-31
US07647655 US5364759B2 (en) 1991-01-31 1991-01-31 Dna typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2255047T3 true ES2255047T3 (es) 2006-06-16

Family

ID=24597796

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES92906069T Expired - Lifetime ES2255047T3 (es) 1991-01-31 1992-01-28 Tipificacion de adn y polimorfismos repetidos en tandem cortos e identificacion de repeticiones polimorficas en tandem corto.

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5364759B2 (es)
EP (3) EP0639228B1 (es)
AT (2) ATE486957T1 (es)
AU (1) AU670231B2 (es)
CA (1) CA2101859A1 (es)
DE (2) DE69233553T2 (es)
DK (1) DK0639228T3 (es)
ES (1) ES2255047T3 (es)
WO (1) WO1992013969A1 (es)

Families Citing this family (180)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5766847A (en) * 1988-10-11 1998-06-16 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Process for analyzing length polymorphisms in DNA regions
DE3834636A1 (de) 1988-10-11 1990-04-19 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichen
US5851762A (en) * 1990-07-11 1998-12-22 Gene Type Ag Genomic mapping method by direct haplotyping using intron sequence analysis
US20100267023A1 (en) * 1992-09-24 2010-10-21 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
US6114114A (en) * 1992-07-17 2000-09-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Comparative gene transcript analysis
US6303297B1 (en) 1992-07-17 2001-10-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Database for storage and analysis of full-length sequences
US5840484A (en) * 1992-07-17 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Comparative gene transcript analysis
JP3598123B2 (ja) * 1993-07-15 2004-12-08 浜松ホトニクス株式会社 核酸の変性検出装置
FR2711672B1 (fr) * 1993-10-29 1995-12-08 France Etat Armement Procédé de sélection et/ou d'obtention de sondes capables de détecter de nouvelles régions à nombre variable de répétitions en tandem, sondes pouvant être ainsi obtenues et leurs utilisations.
US6207373B1 (en) 1998-02-25 2001-03-27 Nanogen, Inc. Methods for determining nature of repeat units in DNA
US6331274B1 (en) 1993-11-01 2001-12-18 Nanogen, Inc. Advanced active circuits and devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6225059B1 (en) 1993-11-01 2001-05-01 Nanogen, Inc. Advanced active electronic devices including collection electrodes for molecular biological analysis and diagnostics
GB9326052D0 (en) * 1993-12-21 1994-02-23 Zeneca Ltd Sequences
WO1995021269A1 (en) * 1994-02-04 1995-08-10 Perlin Mark K Method and apparatus for analyzing genetic material
US5962332A (en) * 1994-03-17 1999-10-05 University Of Massachusetts Detection of trinucleotide repeats by in situ hybridization
US5599666A (en) * 1994-03-28 1997-02-04 Promega Corporation Allelic ladders for short tandem repeat loci
US6479235B1 (en) * 1994-09-30 2002-11-12 Promega Corporation Multiplex amplification of short tandem repeat loci
US7008771B1 (en) 1994-09-30 2006-03-07 Promega Corporation Multiplex amplification of short tandem repeat loci
CA2118048C (en) * 1994-09-30 2003-04-08 James W. Schumm Multiplex amplification of short tandem repeat loci
US5843660A (en) * 1994-09-30 1998-12-01 Promega Corporation Multiplex amplification of short tandem repeat loci
EP0804618B1 (en) * 1994-11-28 1999-01-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphisms
US6180339B1 (en) 1995-01-13 2001-01-30 Bayer Corporation Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi
US5763169A (en) * 1995-01-13 1998-06-09 Chiron Diagnostics Corporation Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi
EP0721987A1 (en) * 1995-01-16 1996-07-17 Keygene N.V. Amplification of simple sequence repeats
WO1996023078A1 (en) * 1995-01-27 1996-08-01 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Computer system storing and analyzing microbiological data
US5908749A (en) * 1995-02-17 1999-06-01 Tge Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for high resolution HLA typing
US5635351A (en) * 1995-03-14 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Genetic gain and loss in gliomas
JP3579497B2 (ja) * 1995-05-12 2004-10-20 株式会社飼料作物改良増殖技術研究所 Ｍｉプライマーを用いたｐｃｒ反応による個体識別方法
DE69617274T2 (de) * 1995-06-06 2002-08-08 Beth Israel Hospital Verfahren und vorrichtung für diagnostischen dns-test
US5683880A (en) * 1995-07-07 1997-11-04 Myriad Genetics, Inc. Linkage analysis of genes with diseases using difference spectrum analysis
CA2248084A1 (en) 1996-03-04 1997-09-12 Genetrace Systems, Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
US5994064A (en) 1996-04-24 1999-11-30 Identigene, Inc. Simple and complex tandem repeats with DNA typing method
EP2290364A1 (en) 1996-04-25 2011-03-02 BioArray Solutions Ltd. Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
EP0910666B1 (en) * 1996-05-02 2006-08-09 Applera Corporation Quantitation of rna transcripts using genomic dna as the internal amplification competitor
US6156512A (en) * 1996-05-23 2000-12-05 Promega Corp Allelic ladders for short tandem repeat loci
WO1998008980A1 (en) * 1996-08-28 1998-03-05 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method for detecting cell proliferative disorders
AU4174397A (en) 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cdna and genomic dna
US5965363A (en) 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
CA2274587A1 (en) 1996-12-10 1998-06-18 Genetrace Systems Inc. Releasable nonvolatile mass-label molecules
US6306588B1 (en) * 1997-02-07 2001-10-23 Invitrogen Corporation Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof
US5939316A (en) * 1997-03-27 1999-08-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Chromosome 18 marker
US5955355A (en) * 1997-03-27 1999-09-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Chromosome 18 marker
US5866412A (en) * 1997-03-27 1999-02-02 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Chromosome 18 marker
US5914394A (en) * 1997-03-27 1999-06-22 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of neuropsychiatric disorders
GB9713597D0 (en) 1997-06-28 1997-09-03 Sec Dep Of The Home Department Improvements in and relating to forensic identification
US6013444A (en) * 1997-09-18 2000-01-11 Oligotrail, Llc DNA bracketing locus compatible standards for electrophoresis
US6764822B1 (en) 1997-09-19 2004-07-20 Sequenom, Inc. DNA typing by mass spectrometry with polymorphic DNA repeat markers
US6173525B1 (en) 1997-09-19 2001-01-16 Cantharellus Ab Chanterelle mycelium
US6090558A (en) * 1997-09-19 2000-07-18 Genetrace Systems, Inc. DNA typing by mass spectrometry with polymorphic DNA repeat markers
US20020064792A1 (en) * 1997-11-13 2002-05-30 Lincoln Stephen E. Database for storage and analysis of full-length sequences
US6143951A (en) * 1997-12-23 2000-11-07 Agribio Tech., Inc. Alfalfa line called WL-C290 and method for producing same
US6238863B1 (en) * 1998-02-04 2001-05-29 Promega Corporation Materials and methods for indentifying and analyzing intermediate tandem repeat DNA markers
US6635418B2 (en) * 1998-02-13 2003-10-21 Igen International, Inc. Assay methods for nucleic acid in a sample
WO1999043855A1 (en) * 1998-02-26 1999-09-02 Genomics Collaborative, Inc. Unique identifier for biological samples
EP1064295A4 (en) 1998-03-16 2004-06-16 Millennium Pharm Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSING AND TREATING CHROMOSOME-18p RELATED DISORDERS
US20040176572A1 (en) * 1998-03-16 2004-09-09 Freimer Nelson B. Methods of compositions for diagnosing and treating chromosome-18p related disorders
US6248528B1 (en) 1998-04-06 2001-06-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of neuropsychiatric disorders
US6104028A (en) * 1998-05-29 2000-08-15 Genetrace Systems Inc. Volatile matrices for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry
US6274339B1 (en) 1999-02-05 2001-08-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of body weight disorders, including obesity
US6713277B1 (en) 1998-07-21 2004-03-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and composition for the diagnosis and treatment of body weight disorders, including obesity
US20040199544A1 (en) * 2000-11-02 2004-10-07 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for providing an expression data mining database
KR100326937B1 (ko) 1998-09-23 2002-03-13 정연보 접착성 쉬트로 사람의 표피 ｄｎａ 샘플을 획득하는 방법
US20020038013A1 (en) * 2000-02-04 2002-03-28 Gregory Donoho Novel human membrane proteins and polynucleotides encoding the same
US20020031802A1 (en) * 2000-05-12 2002-03-14 Yi Hu Novel seven transmembrane proteins and polynucleotides encoding the same
WO2000042182A1 (en) 1999-01-19 2000-07-20 Lexicon Genetics Incorporated Mammalian cortexin-like proteins and polynucleotides encoding the same
CA2359747A1 (en) * 1999-02-09 2000-08-17 Lexicon Genetics Incorporated Human uncoupling proteins and polynucleotides encoding the same
EP1175501A4 (en) * 1999-05-12 2002-11-27 Invitrogen Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING THE SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF A NUCLEIC ACID SYNTHESIS
US6359195B1 (en) 1999-07-01 2002-03-19 W-L Research, Inc. Alfalfa line called WL-W316 and method for producing same
GB9917309D0 (en) * 1999-07-23 1999-09-22 Sec Dep Of The Home Department Improvements in and relating to forensic investigations
WO2001012847A2 (en) * 1999-08-11 2001-02-22 Universiteit Gent Isolation of cells from forensic samples for dna-typing
US6716614B1 (en) * 1999-09-02 2004-04-06 Lexicon Genetics Incorporated Human calcium dependent proteases, polynucleotides encoding the same, and uses thereof
CA2384663A1 (en) * 1999-09-08 2001-03-15 Lexicon Genetics Incorporated Human g-protein coupled 7 transmembrane receptor and polynucleotides encoding the same
US6541252B1 (en) 2000-05-19 2003-04-01 Lexicon Genetics Incorporated Human kinases and polynucleotides encoding the same
AU782326B2 (en) 1999-10-12 2005-07-21 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Human LDL receptor family proteins and polynucleotides encoding the same
AU1198701A (en) * 1999-10-13 2001-04-23 Lexicon Genetics Incorporated Novel human membrane proteins
WO2001029084A2 (en) * 1999-10-18 2001-04-26 Lexicon Genetics Incorporated Novel human proteins and polynucleotides encoding the same
US7076437B1 (en) 1999-10-29 2006-07-11 Victor Levy Process for consumer-directed diagnostic and health care information
AU2070701A (en) * 1999-12-07 2001-06-18 Lexicon Genetics Incorporated Novel human membrane proteins and polynucleotides encoding the same
WO2001051634A1 (en) * 2000-01-12 2001-07-19 Lexicon Genetics Incorporated Human olfactory receptor and polynucleotides encoding the same
US6761877B2 (en) * 2000-02-18 2004-07-13 Biocrystal, Ltd. Functionalized encapsulated fluorescent nanocrystals
US20040234967A1 (en) * 2000-03-24 2004-11-25 Moskowitz David W. Diagnostic polymorphisms of tgf-beta-rii promoter
US20040170992A1 (en) * 2000-03-24 2004-09-02 Moskowitz David W. Diagnostic polymorphisms of tgf-beta1 promoter
AU2001259156A1 (en) * 2000-04-27 2001-11-07 Lexicon Genetics Incorporated Novel membrane proteins and polynucleotides encoding the same
US6790667B1 (en) * 2000-05-30 2004-09-14 Lexicon Genetics Incorporated Human mitochondrial proteins and polynucleotides encoding the same
WO2001094417A2 (en) * 2000-06-09 2001-12-13 Lexicon Genetics Incorporated Novel human seven transmembrane proteins and polynucleotides encoding the same
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
CA2413978C (en) 2000-06-21 2008-12-16 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis
WO2002016435A2 (en) * 2000-08-22 2002-02-28 Lexicon Genetics Incorporated Human 7tm proteins and polynucleotides encoding the same
EP1197550A3 (en) * 2000-08-25 2002-11-20 Pfizer Products Inc. Methods and compositions for diagnosing and treating disorders involving angiogenesis
US6803211B2 (en) 2000-08-25 2004-10-12 Pfizer Inc. Methods and compositions for diagnosing and treating disorders involving angiogenesis
CA2427113A1 (en) * 2000-10-27 2002-09-12 Lexicon Genetics Incorporated Novel human 7tm proteins and polynucleotides encoding the same
AU2002232936A1 (en) * 2000-10-30 2002-05-15 Lexicon Genetics Incorporated Human 7TM proteins and polynucleotides encoding the same
US6929911B2 (en) * 2000-11-01 2005-08-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for determining genetic affiliation, substructure and gene flow within human populations
KR100415726B1 (ko) * 2000-12-08 2004-01-24 (주)진 뱅크 Dna 채취용 스티커 및 이를 이용한 dna 채취방법
JP3929250B2 (ja) * 2001-03-08 2007-06-13 株式会社ルネサステクノロジ 半導体装置
US6780588B2 (en) 2001-05-07 2004-08-24 Applera Corporation Methods for the reduction of stutter in microsatellite amplification
US6841349B2 (en) * 2001-05-07 2005-01-11 Applera Corporation Applied Biosystems Group Methods for the reduction of stutter in microsatellite amplification
US6653082B2 (en) 2001-05-17 2003-11-25 Baylor College Of Medicine Substrate-bound cleavage assay for nucleic acid analysis
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
IL161391A0 (en) 2001-10-15 2004-09-27 Bioarray Solutions Ltd Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection
US6783940B2 (en) 2001-10-31 2004-08-31 Applera Corporation Method of reducing non-specific amplification in PCR
WO2003040395A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Applera Corporation Universal nucleotides for nucleic acid analysis
JP2003157004A (ja) * 2001-11-21 2003-05-30 Id Technica:Kk 識別手段を付加する添加物及びその添加物を含有する識別情報保持物
EP2002827A2 (en) 2001-12-05 2008-12-17 The Baylor College Of Medicine Methods and compositions for control of bone formation via modulation of sympathetic tone
WO2003094841A2 (en) * 2002-05-06 2003-11-20 Functional Genetics, Inc. Mammalian genes involed in rapamycin resistance and tumorgenesis: annexin xiii genes
US20040018497A1 (en) * 2002-07-26 2004-01-29 Warden Craig H Human obesity LIPIN3 polynucleotide and polypeptide sequences and methods of use thereof
WO2004020582A2 (en) * 2002-08-15 2004-03-11 Functional Genetics, Inc. Mammalian genes involved in rapamycin resistance and tumorgenesis: rapr6 genes
AU2003265525A1 (en) * 2002-08-15 2004-03-19 Functional Genetics, Inc. Mammalian genes involved in rapamycin resistance and tumorgenesis: rapr7 genes
US7157228B2 (en) * 2002-09-09 2007-01-02 Bioarray Solutions Ltd. Genetic analysis and authentication
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
WO2004050839A2 (en) 2002-11-27 2004-06-17 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
AU2003300963A1 (en) * 2002-12-13 2004-07-09 Gene Codes Forensics, Inc. Method for profiling and identifying persons by using data samples
WO2004063389A2 (en) * 2003-01-10 2004-07-29 Primera Biosystems, Inc. Methods of detecting differences in genomic sequence representation
US20040157220A1 (en) * 2003-02-10 2004-08-12 Purnima Kurnool Methods and apparatus for sample tracking
US20070042433A1 (en) * 2003-03-26 2007-02-22 Jianxin Bao Neuregulin protein regulation of synaptic proteins
US20040219537A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Fenrich Richard K. Epidermal collection method, kit, and device
US9394565B2 (en) 2003-09-05 2016-07-19 Agena Bioscience, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
WO2005029705A2 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
CA2539651A1 (en) * 2003-09-22 2005-04-07 Rosetta Inpharmatics Llc Synthetic lethal screen using rna interference
WO2005031305A2 (en) 2003-09-22 2005-04-07 Bioarray Solutions, Ltd. Surface immobilized polyelectrolyte with multiple functional groups capable of covalently bonding to biomolecules
JP2007521017A (ja) 2003-10-28 2007-08-02 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 固定化捕捉プローブを用いる遺伝子発現分析法の最適化
JP2007509629A (ja) 2003-10-29 2007-04-19 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 二本鎖ｄｎａの切断による複合核酸分析
US20050112591A1 (en) * 2003-11-25 2005-05-26 Applera Corporation Novel method for isolating single stranded product
US20050136417A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-23 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
CN101233240A (zh) 2004-03-26 2008-07-30 斯昆诺有限公司 与质量分析结合的甲基化特异性扩增产物的碱基特异性切割
US20050239889A1 (en) * 2004-04-26 2005-10-27 Jean Gosselin In vivo release of endogenous anti-microbial mediators by leukotriene B4 (LTB4) administration
WO2005115435A2 (en) * 2004-04-30 2005-12-08 Bas Medical, Inc. Methods and compositions for control of fetal growth via modulation of relaxin
US9023614B2 (en) * 2004-07-09 2015-05-05 Tofy Mussivand Method for collecting cells for macromolecular analysis
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
US7745207B2 (en) 2006-02-03 2010-06-29 IntegenX, Inc. Microfluidic devices
WO2006032044A2 (en) 2004-09-15 2006-03-23 Microchip Biotechnologies, Inc. Microfluidic devices
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US20080004410A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Yu-Chin Lai Hydrophilic macromonomers having alpha,beta-conjugated carboxylic terminal group and medical devices incorporating same
US8163480B2 (en) * 2006-10-05 2012-04-24 Quest Diagnostics Investments Incorporated Nucleic acid size detection method
US20080206758A1 (en) * 2006-10-17 2008-08-28 Lcm Technologies, Inc. Polynucleic acid-attached particles and their use in genomic analysis
CN101715483A (zh) 2007-02-05 2010-05-26 微芯片生物工艺学股份有限公司 微流体和纳米流体装置、系统和应用
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
WO2009091934A1 (en) 2008-01-17 2009-07-23 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes and compositions
KR20110030415A (ko) 2008-01-22 2011-03-23 인터젠엑스 인크. 만능 샘플 제조 시스템 및 집적 분석 시스템에서의 용도
EP2350900A4 (en) * 2008-10-14 2014-10-15 Bioaccel SYSTEM AND METHOD FOR DETECTING AN ALLELY STR GENOTYPS FROM SNPS
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
EP2719774B8 (en) 2008-11-07 2020-04-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of monitoring conditions by sequence analysis
US9394567B2 (en) 2008-11-07 2016-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis
CN102341691A (zh) 2008-12-31 2012-02-01 尹特根埃克斯有限公司 具有微流体芯片的仪器
DK3059337T3 (da) 2009-01-15 2019-07-22 Adaptive Biotechnologies Corp Adaptive immunity profiling og metoder til frembringelse af monoklonale antibodier
WO2010112033A2 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Østjysk Innovation A/S Method for estimating the risk of having or developing multiple sclerosis using sequence polymorphisms in a specific region of chromosome x
WO2010141326A1 (en) 2009-06-02 2010-12-09 Integenx Inc. Fluidic devices with diaphragm valves
AU2010256429B2 (en) 2009-06-05 2015-09-17 Integenx Inc. Universal sample preparation system and use in an integrated analysis system
SG10201403451QA (en) 2009-06-25 2014-09-26 Hutchinson Fred Cancer Res Method of measuring adaptive immunity
US20110070590A1 (en) 2009-09-22 2011-03-24 Jan Rohozinski Primers and Methods for Determining RhD Zygosity
US8584703B2 (en) 2009-12-01 2013-11-19 Integenx Inc. Device with diaphragm valve
US8512538B2 (en) 2010-05-28 2013-08-20 Integenx Inc. Capillary electrophoresis device
WO2012024657A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 IntegenX, Inc. Microfluidic devices with mechanically-sealed diaphragm valves
EP2606154B1 (en) 2010-08-20 2019-09-25 Integenx Inc. Integrated analysis system
CN103717751A (zh) 2011-05-19 2014-04-09 塞昆纳姆股份有限公司 用于多重核酸鉴定的产品和方法
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
US20150136604A1 (en) 2011-10-21 2015-05-21 Integenx Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
US10865440B2 (en) 2011-10-21 2020-12-15 IntegenX, Inc. Sample preparation, processing and analysis systems
EP2768982A4 (en) 2011-10-21 2015-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp QUANTIFICATION OF ADAPTIVE IMMUNOCELL GENOMES IN A COMPLEX MIX OF CELLS
EP3904536A1 (en) 2011-12-09 2021-11-03 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
EP3372694A1 (en) 2012-03-05 2018-09-12 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits
DK2831276T3 (da) 2012-05-08 2016-08-01 Adaptive Biotechnologies Corp Sammensætninger og fremgangsmåde til at måle og kalibrere amplifikations-bias i multipleks-PCR-reaktioner
EP2904111B1 (en) 2012-10-01 2017-12-06 Adaptive Biotechnologies Corporation Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization
WO2015160439A2 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
CN110560187B (zh) 2013-11-18 2022-01-11 尹特根埃克斯有限公司 用于样本分析的卡盒和仪器
ES2741740T3 (es) 2014-03-05 2020-02-12 Adaptive Biotechnologies Corp Métodos que usan moléculas sintéticas que contienen segmentos de nucleótidos aleatorios
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
GB2544198B (en) 2014-05-21 2021-01-13 Integenx Inc Fluidic cartridge with valve mechanism
CN113092563A (zh) 2014-10-22 2021-07-09 尹特根埃克斯有限公司 用于样品制备、处理和分析的系统和方法
EP3212790B1 (en) 2014-10-29 2020-03-25 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
JP2018512881A (ja) 2015-04-24 2018-05-24 アジーナ バイオサイエンス， インコーポレイテッド 少数バリアントの検出および定量のための方法マルチプレックス法
US10233489B2 (en) 2015-04-24 2019-03-19 Agena Bioscience, Inc. Multiplexed method for the identification and quantitation of minor alleles and polymorphisms
US10822647B2 (en) 2016-07-12 2020-11-03 Biodynamics S.R.L. Methods for using long ssDNA polynucleotides as primers (superprimers) in PCR assays

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IS1355B6 (is) * 1984-11-12 1989-04-19 Lister Institute Of Preventive Medicine Fjölkjarna kannar
US4987066A (en) * 1986-11-07 1991-01-22 Max Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Process for the detection of restriction fragment length polymorphisms in eukaryotic genomes
GB8716367D0 (en) * 1987-07-10 1987-08-19 Reeders S T Genetic identification
EP0337625A3 (en) * 1988-04-13 1991-07-24 Imperial Chemical Industries Plc Probes
AU3694689A (en) * 1988-04-28 1989-11-24 Mark H. Skolnick Amplified sequence polymorphisms (asps)
DE3834636A1 (de) * 1988-10-11 1990-04-19 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichen
GB2228086A (en) * 1988-11-25 1990-08-15 Ici Plc Characterisation of genomic DNA
AU5640090A (en) * 1989-03-21 1990-11-05 Collaborative Research Inc. A dna diagnostic test using an exonuclease activity

Also Published As

Publication number Publication date
EP1967593A2 (en) 2008-09-10
ATE305519T1 (de) 2005-10-15
WO1992013969A1 (en) 1992-08-20
ATE486957T1 (de) 2010-11-15
US5364759B2 (en) 1999-07-20
DK0639228T3 (da) 2006-02-20
AU670231B2 (en) 1996-07-11
AU1334392A (en) 1992-09-07
EP1609875A2 (en) 2005-12-28
DE69233798D1 (de) 2010-12-16
EP0639228A4 (en) 1993-12-22
DE69233553D1 (de) 2006-02-09
EP1609875B1 (en) 2010-11-03
EP1609875A3 (en) 2007-11-28
CA2101859A1 (en) 1992-08-01
EP1609875B9 (en) 2011-03-02
DE69233553T2 (de) 2006-07-06
EP1967593A3 (en) 2008-11-12
EP0639228A1 (en) 1995-02-22
EP0639228B1 (en) 2005-09-28
US5364759A (en) 1994-11-15
US5364759B1 (en) 1997-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2255047T3 (es) Tipificacion de adn y polimorfismos repetidos en tandem cortos e identificacion de repeticiones polimorficas en tandem corto.
Edwards et al. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats.
CA1237685A (en) Process for amplifying nucleic acid sequences
AU778438B2 (en) Fixed address analysis of sequence tags
US5068176A (en) Method for the simultaneous determination of dna sequence variations at a large number of sites, and a kit suitable therefor
CA2435917A1 (en) Highly sensitive method for the detection of cytosine methylation patterns
AU8162498A (en) Methods for the detection of multiple single nucleotide polymorphisms in a single reaction
JP2005537030A (ja) 核酸を分析する方法
DE69936379T2 (de) Verfahren zur genotypisierung und dna-analyse
WO1995015400A1 (en) Genotyping by simultaneous analysis of multiple microsatellite loci
US6692915B1 (en) Sequencing a polynucleotide on a generic chip
DE10119468A1 (de) Mikroarray-Verfahren zur Anreicherung von DNA-Fragmenten aus komplexen Mischungen
EP1186669A1 (de) Verfahren zur spezifischen Bestimmung von DNA-Sequenzen mittels paralleler Amplifikation
US20090061440A1 (en) Method for amplifying plural nucleic acid sequences for discrimination
Landegren et al. Locked on target: strategies for future gene diagnostics
Yurov et al. Recent patents on molecular cytogenetics
US20020172948A1 (en) Method and system for nucleic acid sequencing
US20060078881A1 (en) Method and kit for detection of mutations in mitochondrial dna
US20020182606A1 (en) Detection of single nucleotide polymorphisms
CA2266750A1 (en) Cleaved amplified rflp detection methods
WO2008088236A1 (ru) Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)
JP2006101844A (ja) 標的核酸を検出又は定量する方法
DE60226230T2 (de) Bestimmungsverfahren für das vorhandensein von verlängerungsprodukten
Rosenthal et al. DNA sequencing by chemical degradation using one, two, and four different fluorophores
Zhang et al. Molecular profiling of human gliomas by cDNA expression array