JP3579497B2 - Ｍｉプライマーを用いたｐｃｒ反応による個体識別方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、動物および植物の個体をＤＮＡの塩基配列の差異を指標として識別する方法に関するものであり、さらに詳しくは、本発明は、ＰＣＲ反応による生物個体の識別を、既知もしくは任意の塩基配列をもとに作成したプライマーを用いる従来法と比較して、一層有効に実施することを可能にする方法に係るものであり、プライマーとして、特定のＤＮＡ断片（ＭＩプライマー）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をアクリルアミド電気泳動および銀染色法によってＤＮＡを分離、染色し、増幅されたＤＮＡ断片の差異によって供試個体を識別することを特徴とする生物個体の新しい識別方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物および植物の個体をＤＮＡの塩基配列の差異で識別する技術は、供試個体の遺伝的背景を明確にし、その育成者の権利を保護する立場から国際的に重要である。ＤＮＡの塩基配列の差異に基づく個体識別技術としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が用いられている。ＰＣＲ法によって個体識別を行うには、プライマー（ＰＣＲ反応に不可欠の、短いＤＮＡ断片）の塩基配列が識別の成否にかかわる重要な要因である。
【０００３】
従来、このようなプライマーとして、既知もしくは任意の塩基配列をもとに作成したプライマーが種々開発されており、これらの既知もしくは任意の塩基配列をＰＣＲ反応のプライマーとして使用することにより、個体識別を行う方法も提案されているが（Ｓｋｏｌｎｉｃｋ， Ｍ．Ｈ． ａｎｄ Ｒ．Ｂ． Ｗａｌｌａｃｅ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２： ２７３−２７９ （１９８８）， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｊ．Ｇ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８： ６５３１−６５３５ （１９９０））、従来のものでは、供試個体間で多型を示す複数のＤＮＡ断片を鮮明に確認するには困難な場合が多く、その改善が強く要請されている状況にあった。
その他、ＤＮＡ断片の差異によって供試個体を識別する方法として、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍｓ）（Ｔａｎｇｓｌｅｙ， Ｓ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７： ２５７−２６４ （１９８９））、特表昭６２−５００４２３号公報、特表平６−５０４４２７号公報、等が提案されている。
【０００４】
ところで、生物のＤＮＡ中には、鏡面構造の左右対称の構造からなる塩基配列が散在すると推定される。すなわち、一般に、進化の過程では、遺伝子（ＤＮＡ）の変化を伴って、例えば、植物種の系統分化が起きたと考えられる。異なる植物種の遺伝子（ＤＮＡ）の配列を比較すると、系統分化の際に、共通の塩基配列を持つ領域を介してＤＮＡが組み換わったことが推定できる。本発明者らは、イネを材料として、植物種のＤＮＡの構造変化について研究を進める中で、共通の塩基配列を持つ領域を介したＤＮＡの組み換え（相同組み換え）が起きるときに、ＤＮＡが左右対称に塩基配列が向き合った構造（鏡面構造）をとって結合する場合があることを見いだした（Ｋａｗａｔａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ９０： ３６４−３７１ （１９９５） ）。これより、進化の過程でイネやトウモロコシをはじめとする生物のＤＮＡは、幾度となく起こったＤＮＡの組み換えの痕跡として、鏡面構造を取る塩基配列がＤＮＡ中に存在することが推定できる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、ＰＣＲ法による個体識別方法に有用なプライマーを開発することを目標として種々研究を積み重ねる中で、このような鏡面構造の左右対称の構造からなる塩基配列のプライマーとしての有効性について検討したところ、当該鏡面構造の塩基配列をＰＣＲ反応のプライマーとして使用することにより、供試個体の識別を有効に実施し得るとの知見を得た。すなわち、本発明者らは、上記した、本発明者らが見い出した鏡面構造の左右対称の塩基配列を持つＤＮＡ断片（ＭＩプライマー）は、既知もしくは任意の塩基配列をもとにして作成したプライマーと比較して、供試個体間で多型を示すＤＮＡ断片がより多く鮮明に観察されること、そのため、ＭＩプライマーをＰＣＲ反応のプライマーとして使用することにより、個体識別に有効であること、を見い出して、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は、動物および植物の個体をＤＮＡの塩基配列の差異で識別する方法を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、ＰＣＲ法による個体識別方法において、特定のプライマー（ＭＩプライマー）を使用することによって、供試個体間で多型を示す複数のＤＮＡ断片を鮮明に確認することを可能にする新しい個体識別方法を提供することを目的とするものである。
さらに、本発明は、ＰＣＲ法による個体識別方法において有効に使用される特定のプライマー（ＭＩプライマー）を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、供試個体の全ＤＮＡと、左右対称の塩基配列を持つプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をアクリルアミド電気泳動および銀染色法によってＤＮＡを分離、染色し、増幅されたＤＮＡ断片の差異によって供試個体を識別することを特徴とする生物個体の識別方法、である。
また、本発明の他の態様は、左右対称の塩基配列を持つプライマーが、（５′−ＣＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣ−３′）、（５′−ＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴ−３′）および（５′−ＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡ−３′）から選択される一種である上記の生物個体の識別方法、である。
さらに、本発明の他の態様は、生物個体が、動物または植物の個体である請求項１記載の生物個体の識別方法、である。
【０００８】
続いて、本発明についてさらに詳細に説明する。
ＭＩプライマーを用いた個体識別法の概要を以下に説明する。
本発明は、上記のように、ＰＣＲ反応による生物個体のＤＮＡ識別方法に係るものであり、供試個体の全ＤＮＡと、鏡面構造の左右対称の塩基配列を持つプライマー（ＭＩプライマー）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をアクリルアミド電気泳動および銀染色法によってＤＮＡを分離、染色し、増幅されたＤＮＡ断片の差異によって供試個体を識別することを特徴とするものである。
【０００９】
本発明において、ＭＩプライマーは、鏡面構造の左右対称の塩基（ヌクレオチド）配列を持つＤＮＡ断片からなるプライマー（Ｍｉｒｒｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ、ＭＩプライマー）であれば、いかなるものであってもよく、例えば、一例をあげると、図１に示されるように、（５′−ＣＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣ−３′）、（５′−ＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴ−３′）および（５′−ＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡ−３′）が好適なものとして例示されるが、これに限らず、鏡面構造を有する左右対称の塩基配列を持つものであればその種類を問わず同様に使用することができる。
ＭＩプライマーは、適宜の構造のものを設計し、ＤＮＡ合成機で合成して使用することができるが、その他、鏡面構造を取る塩基配列を生物のＤＮＡ中にて検索し、これから抽出して使用することも可能である。
ＰＣＲ反応に供されるＰＣＲ反応溶液は、プライマーとして、上記ＭＩプライマーを使用し、供試個体の全ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、カリウムイオン、マグネシウムイオン、ｐＨ緩衝液、ゼラチンを含む溶液として常法により調製すればよく、特に限定されるものではないが、例えば、全ＤＮＡを２５ｎｇ、ＤＮＡポリメラーゼを０．５ユニット、４種類のヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）を各１００μＭ、カリウムイオンとしてＫＣｌを０．０５Ｍ、マグネシウムイオンとしてＭｇＣｌ２ を０．００２Ｍ、ｐＨ緩衝液としてＴｒｉｓ−Ｃｌを０．０１Ｍ、ゼラチンを０．００１％を含む溶液からなるＰＣＲ反応溶液が好適なものとして例示される。
【００１０】
上記により調製したＰＣＲ反応溶液は、ＰＣＲ反応に供されるが、当該ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（宝酒造社製）などのＰＣＲ自動化装置を使用し、常法に準じて行えばよい。この場合、ＰＣＲ反応の反応条件としては、９４℃で２分間処理の後、９４℃で２分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間処理を４０回繰返し、最後に、７２℃で５分間処理が望ましく、また、ＰＣＲ反応の温度条件を調節することにより、複数のＤＮＡ断片を増幅させることができる。上記全ＤＮＡを、上記ＰＣＲ反応により、プライマーの結合部に挟まれたＤＮＡ領域を選択的に増幅させることができる。
ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片は、アクリルアミド電気泳動にかけて分離する。当該アクリルアミド電気泳動としては、５％アクリルアミド（アクリルアミドとＢＩＳアクリルアミドの質量比は２９：１）のゲルを用いて、１００Ｖ定電圧条件での泳動が好適なものとして使用されるが、これに限らず、アガロースゲル電気泳動をはじめ、これと同等若しくは類似のものであれば、同様に使用することが可能である。
上記アクリルアミド電気泳動による泳動操作を終了した後、分離したＤＮＡを銀染色法で染色し、得られたＤＮＡ断片の泳動図の差異を観察することによって、供試個体間の多型を示す複数のＤＮＡ断片を確認し、判定する。
【００１１】
本発明は、動物および植物の個体識別方法として生物の種類を問わず利用することが可能であり、イネ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、オオムギなどの植物、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物、酵母菌や乳酸菌などの微生物、ヒトを含めた生物の個体識別方法として使用することが可能である。
【００１２】
本発明において使用するＭＩプライマーの特徴は、上記のように、塩基配列が左右対称になっていることであり、後記の実施例で示されるように、ＰＣＲ反応の温度条件を調節することにより、供試個体間で多型を示す複数のＤＮＡ断片を鮮明に確認することができる。本発明のＭＩプライマーは、既知塩基配列をもとに作成した従来のプライマーと比較して、供試個体間で多型を示すＤＮＡ断片がより多く鮮明に観察されるが、その理由は、ＭＩプライマーの塩基配列と相同性のある、鏡面構造の塩基配列がＤＮＡ中に散在しているためと推察される。
【００１３】
【実施例】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、当該実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例
トウモロコシ自殖系統の識別の一実施例を以下に示す。
１）全ＤＮＡの調製
▲１▼ 使用したトウモロコシ自殖系統
供試したトウモロコシ自殖系統は、「Ｎａ３５」、「Ｎａ４２」、「Ｈ８４」、「Ｎａ３０」、「Ｎａ２８」、「Ｎａ２」の合計６種類である。
▲２▼ ＤＮＡ断片の調製方法
ＤＮＡの調製方法は、既出の報告（Ｍｕｒｒａｙ Ｍ．Ｇ． ａｎｄ Ｗ．Ｆ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ８： ４３２１−４３２５ （１９８０））を一部改変して行った。トウモロコシの種子を暗黒下で播種した後、五日後の芽生えを液体窒素で凍結後、粉砕し、ＤＮＡ抽出緩衝液１（０．１４Ｍソルビトール、０．２２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２２Ｍ ＥＤＴＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、０．８％ＣＴＡＢ、１％ラウリル硫酸ナトリウム）を加えて６５℃で３０分間処理した後、ＤＮＡ抽出緩衝液２（クロロホルムとイソアミルアルコールの２４：１の混合液）を加えて、３０分間振とうした。次に、高速遠心機で１５分間の遠心分離（１，０００ｇ）を行い、上層のＤＮＡ溶液を回収し、ＤＮＡ抽出緩衝液３（１％ＣＡＴＢ、０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ）およびＤＮＡ抽出緩衝液４（１０％ＣＡＴＢ、０．８Ｍ ＮａＣｌ）を加え、３０分間静置した。その後、高速遠心機で１５分間の遠心分離（１，０００ｇ）を行い、沈澱物を回収し、ＤＮＡ抽出緩衝液５（０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ）に溶解した。ＤＮＡ溶液に塩化セシウム、臭化エチジウムを加え、超遠心機で８時間の遠心分離（１２０，０００ｇ）を行い、ＤＮＡ画分を回収した後、塩化セシウム、臭化エチジウムの除去処理を行ってＤＮＡを調製した。
【００１４】
２）ＭＩプライマーの合成
▲１▼ ＭＩプライマーの設計
塩基数が偶数（２ｎ）の場合は、ｎ番目とｎ＋１番目の間を境にして、また、塩基数が奇数（２ｎ＋１）の場合は、ｎ＋１番目の任意の塩基を中心にして、塩基配列が左右対称となるようにＭＩプライマーを設計した。
▲２▼ ＤＮＡ合成機によるＭＩプライマーの合成
ミリポア社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機８９０５を用いて一本鎖ＤＮＡを合成した。
【００１５】
３）ＰＣＲ反応溶液の調製
▲１▼ ＰＣＲ反応溶液の構成
ＰＣＲ反応溶液は、プライマーとして、上記ＭＩプライマーを使用し、供試個体の全ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、カリウムイオン、マグネシウムイオン、ｐＨ緩衝液、ゼラチンから構成される溶液を使用した。
▲２▼ ＰＣＲ反応溶液の調製
ＰＣＲ反応溶液は、供試個体の全ＤＮＡを２５ｎｇ、ＤＮＡポリメラーゼを０．５ユニット、４種類のヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）を各１００μＭ、カリウムイオンとしてＫＣｌを０．０５Ｍ、マグネシウムイオンとしてＭｇＣｌ２ を０．００２Ｍ、ｐＨ緩衝液としてＴｒｉｓ−ＨＣｌを０．０１Ｍ、ゼラチンを０．００１％を含む溶液として調製した。
【００１６】
４）ＰＣＲ反応によるＤＮＡ断片の増幅
▲１▼ ＰＣＲ反応条件
ＰＣＲ反応条件は、９４℃で２分間処理の後、９４℃で２分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間処理を４０回繰返し、最後に、７２℃で５分間処理とした。
▲２▼ ＰＣＲ自動化装置によるＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ自動化装置としてＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（宝酒造社製）を使用した。
【００１７】
５）アクリルアミド電気泳動による増幅されたＤＮＡ断片の分離
▲１▼ アクリルアミド電気泳動の条件、装置
アクリルアミド電気泳動の条件は、５％アクリルアミド（アクリルアミドとＢＩＳアクリルアミドの質量比は２９：１）のゲルを用いて、１００Ｖ定電圧条件とした。アクリルアミド電気泳動のための泳動槽は、日本エイドー社製の二連冷却式スラブ泳動装置Ｎａ−１２１３を用い、電源装置は、ＡＴＴＯ社製のクロスパワー５００を用いた。
▲２▼ ＤＮＡ断片の分離（泳動の結果）
約１００塩基対から約１５００塩基対の長さのＤＮＡ断片が分離された。
【００１８】
６）銀染色法による分離したＤＮＡ断片の染色
▲１▼ 銀染色法の方法、条件
ＤＮＡ断片の染色には、和光純薬社製の「銀染色ＩＩキットワコー」を用い、泳動終了後のゲルを１０％トリクロロ酢酸中で１０分間振とうした後、キット付属の固定液−２中にゲルを移して１０分間振とうし、ついでキット付属の増感液中にゲルを移して１０分間振とうし、さらに、脱イオン水中にゲルを移して１０分間振とうした。次に、キット付属の染色液中にゲルを移して１５分間振とうした後、脱イオン水中にゲルを移して５分間振とうを３回繰返した。処理されたゲルは、キット付属の現像液中に移して３分間振とうした後、キット付属の停止液中に移して３分間振とうして染色反応を停止させた。最後に、ゲルを脱イオン水中に移して２分間振とうを３回繰返した後、ゲルの写真撮影を行った。
▲２▼ ＤＮＡ断片の染色の結果（図２〜図６）
対照として、任意の１０塩基の配列（５′−ＧＴＴＧＣＧＡＴＣＣ−３′）をプライマーに用いた場合の結果を図２に示した。矢印で示したＤＮＡ断片について供試系統間に多型が観察されるが、不鮮明である。また、ヒトのサテライトＤＮＡ（ｌａｍｂｄａ ３３．３）の１４塩基の配列（５′−ＧＧＧＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＣ−３′）をプライマーに用いた場合の結果を図３に示した。ＰＣＲ反応によって増幅されるＤＮＡ断片の数が多く、各系統間の識別は難しい。
一方、ＭＩプライマーを用いた場合の結果を図４から図６に示した。１５塩基の配列（５′−ＣＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣ−３′）のＭＩプライマーを用いた場合の結果が図４である。矢印で示したように、３種類のＤＮＡ断片について、鮮明に各系統間におけるＤＮＡ多型が観察される。また、異なる１５塩基の配列（５′−ＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴ−３′）のＭＩプライマーを用いた場合の結果が図５である。矢印で示したように、３種類のＤＮＡ断片について、鮮明に各系統間におけるＤＮＡ多型が観察される。同様に、左右対称である１４塩基の配列（５′−ＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡ−３′）のＭＩプライマーを用いた場合の結果が図６である。矢印で示したように、３種類のＤＮＡ断片について、鮮明に各系統間におけるＤＮＡ多型が観察される。
なお、図７に、多型を示したＤＮＡ断片を模式的にまとめた。
【００１９】
７）ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片の差異による供試個体の識別
▲１▼ 識別の方法
供試個体間で観察できるＤＮＡ断片について、泳動距離が同等のものは同一のＤＮＡ断片、泳動距離が異なるものは異なるＤＮＡ断片として供試個体を識別した。
▲２▼ トウモロコシ自殖系統の多型を示す複数のＤＮＡ断片の判定の具体的説明図７に、多型を示したＤＮＡ断片を模式的にまとめた。これより、ＭＩプライマーを用いることによって、供試個体間で多型を示すＤＮＡ断片が鮮明に観察されること、ＭＩプライマーをＰＣＲ反応のプライマーとして使用することにより、個体識別に有効であること、および、既知の塩基配列もしくは任意の塩基配列をもとにして作成したプライマーと比較して、供試系統間で多型を示すＤＮＡ断片がより多く鮮明に観察されることが示された。ＭＩプライマーを用いた場合の結果より、各供試系統について固有のバーコード（ＤＮＡ断片）が確認され、各供試系統の識別が可能であることが判った。
なお、他のＭＩプライマーを使用して同様に試験したところ、同様の結果が得られた。
【００２０】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、鏡面構造の左右対称の塩基配列を持つプライマー（ＭＩプライマー）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をアクリルアミド電気泳動および銀染色法によってＤＮＡを分離、染色し、増幅されたＤＮＡ断片の差異によって供試個体を識別することを特徴とするものであり、本発明によれば、供試個体間で多型を示す複数のＤＮＡ断片が鮮明に確認できるので、ＤＮＡ配列の差異による個体識別が効率的に行える。また、ＰＣＲ反応の温度条件を調節することにより、供試個体間で多型を示す複数のＤＮＡ断片を鮮明に確認することができる。さらに、既知の塩基配列もしくは任意の塩基配列をもとにして作成したプライマーと比較して、供試個体間で多型を示すＤＮＡ断片がより多く鮮明に観察される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る左右対称の塩基（ヌクレオチド）配列を持つプライマー（ＭＩプライマー）を示す。
【図２】従来法による任意の１０塩基の塩基配列をもとにして作成したプライマー（５′−ＧＴＴＧＣＧＡＴＣＣ−３′）を用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図を示す。
【図３】従来法による既知のヒトのサテライトＤＮＡ（ｌａｍｂｄａ ３３．３ ）の１４塩基の配列をもとにして作成したプライマー（５′−ＧＧＧＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＣ−３′）を用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図を示す。
【図４】本発明の１５塩基のＭＩプライマー（５′−ＣＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣ−３′）を用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図を示す。
【図５】本発明の１５塩基のＭＩプライマー（５′−ＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴ−３′）を用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図を示す。
【図６】本発明の１４塩基のＭＩプライマー（５′−ＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡ−３′）を用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図を示す。
【図７】本発明の３種類のＭＩプライマーを用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図の模式図を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、動物および植物の個体をＤＮＡの塩基配列の差異を指標として識別する方法に関するものであり、さらに詳しくは、本発明は、ＰＣＲ反応による生物個体の識別を、既知もしくは任意の塩基配列をもとに作成したプライマーを用いる従来法と比較して、一層有効に実施することを可能にする方法に係るものであり、プライマーとして、特定のＤＮＡ断片（ＭＩプライマー）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をアクリルアミド電気泳動および銀染色法によってＤＮＡを分離、染色し、増幅されたＤＮＡ断片の差異によって供試個体を識別することを特徴とする生物個体の新しい識別方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物および植物の個体をＤＮＡの塩基配列の差異で識別する技術は、供試個体の遺伝的背景を明確にし、その育成者の権利を保護する立場から国際的に重要である。ＤＮＡの塩基配列の差異に基づく個体識別技術としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が用いられている。ＰＣＲ法によって個体識別を行うには、プライマー（ＰＣＲ反応に不可欠の、短いＤＮＡ断片）の塩基配列が識別の成否にかかわる重要な要因である。
【０００３】
従来、このようなプライマーとして、既知もしくは任意の塩基配列をもとに作成したプライマーが種々開発されており、これらの既知もしくは任意の塩基配列をＰＣＲ反応のプライマーとして使用することにより、個体識別を行う方法も提案されているが（Ｓｋｏｌｎｉｃｋ， Ｍ．Ｈ． ａｎｄ Ｒ．Ｂ． Ｗａｌｌａｃｅ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２： ２７３−２７９ （１９８８）， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｊ．Ｇ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８： ６５３１−６５３５ （１９９０））、従来のものでは、供試個体間で多型を示す複数のＤＮＡ断片を鮮明に確認するには困難な場合が多く、その改善が強く要請されている状況にあった。
その他、ＤＮＡ断片の差異によって供試個体を識別する方法として、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍｓ）（Ｔａｎｇｓｌｅｙ， Ｓ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７： ２５７−２６４ （１９８９））、特表昭６２−５００４２３号公報、特表平６−５０４４２７号公報、等が提案されている。
【０００４】
ところで、生物のＤＮＡ中には、鏡面構造の左右対称の構造からなる塩基配列が散在すると推定される。すなわち、一般に、進化の過程では、遺伝子（ＤＮＡ）の変化を伴って、例えば、植物種の系統分化が起きたと考えられる。異なる植物種の遺伝子（ＤＮＡ）の配列を比較すると、系統分化の際に、共通の塩基配列を持つ領域を介してＤＮＡが組み換わったことが推定できる。本発明者らは、イネを材料として、植物種のＤＮＡの構造変化について研究を進める中で、共通の塩基配列を持つ領域を介したＤＮＡの組み換え（相同組み換え）が起きるときに、ＤＮＡが左右対称に塩基配列が向き合った構造（鏡面構造）をとって結合する場合があることを見いだした（Ｋａｗａｔａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ９０： ３６４−３７１ （１９９５） ）。これより、進化の過程でイネやトウモロコシをはじめとする生物のＤＮＡは、幾度となく起こったＤＮＡの組み換えの痕跡として、鏡面構造を取る塩基配列がＤＮＡ中に存在することが推定できる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、ＰＣＲ法による個体識別方法に有用なプライマーを開発することを目標として種々研究を積み重ねる中で、このような鏡面構造の左右対称の構造からなる塩基配列のプライマーとしての有効性について検討したところ、当該鏡面構造の塩基配列をＰＣＲ反応のプライマーとして使用することにより、供試個体の識別を有効に実施し得るとの知見を得た。すなわち、本発明者らは、上記した、本発明者らが見い出した鏡面構造の左右対称の塩基配列を持つＤＮＡ断片（ＭＩプライマー）は、既知もしくは任意の塩基配列をもとにして作成したプライマーと比較して、供試個体間で多型を示すＤＮＡ断片がより多く鮮明に観察されること、そのため、ＭＩプライマーをＰＣＲ反応のプライマーとして使用することにより、個体識別に有効であること、を見い出して、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は、動物および植物の個体をＤＮＡの塩基配列の差異で識別する方法を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、ＰＣＲ法による個体識別方法において、特定のプライマー（ＭＩプライマー）を使用することによって、供試個体間で多型を示す複数のＤＮＡ断片を鮮明に確認することを可能にする新しい個体識別方法を提供することを目的とするものである。
さらに、本発明は、ＰＣＲ法による個体識別方法において有効に使用される特定のプライマー（ＭＩプライマー）を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、供試個体の全ＤＮＡと、左右対称の塩基配列を持つプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をアクリルアミド電気泳動および銀染色法によってＤＮＡを分離、染色し、増幅されたＤＮＡ断片の差異によって供試個体を識別することを特徴とする生物個体の識別方法、である。
また、本発明の他の態様は、左右対称の塩基配列を持つプライマーが、（５′−ＣＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣ−３′）、（５′−ＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴ−３′）および（５′−ＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡ−３′）から選択される一種である上記の生物個体の識別方法、である。
さらに、本発明の他の態様は、生物個体が、動物または植物の個体である請求項１記載の生物個体の識別方法、である。
【０００８】
続いて、本発明についてさらに詳細に説明する。
ＭＩプライマーを用いた個体識別法の概要を以下に説明する。
本発明は、上記のように、ＰＣＲ反応による生物個体のＤＮＡ識別方法に係るものであり、供試個体の全ＤＮＡと、鏡面構造の左右対称の塩基配列を持つプライマー（ＭＩプライマー）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をアクリルアミド電気泳動および銀染色法によってＤＮＡを分離、染色し、増幅されたＤＮＡ断片の差異によって供試個体を識別することを特徴とするものである。
【０００９】
本発明において、ＭＩプライマーは、鏡面構造の左右対称の塩基（ヌクレオチド）配列を持つＤＮＡ断片からなるプライマー（Ｍｉｒｒｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ、ＭＩプライマー）であれば、いかなるものであってもよく、例えば、一例をあげると、図１に示されるように、（５′−ＣＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣ−３′）、（５′−ＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴ−３′）および（５′−ＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡ−３′）が好適なものとして例示されるが、これに限らず、鏡面構造を有する左右対称の塩基配列を持つものであればその種類を問わず同様に使用することができる。
ＭＩプライマーは、適宜の構造のものを設計し、ＤＮＡ合成機で合成して使用することができるが、その他、鏡面構造を取る塩基配列を生物のＤＮＡ中にて検索し、これから抽出して使用することも可能である。
ＰＣＲ反応に供されるＰＣＲ反応溶液は、プライマーとして、上記ＭＩプライマーを使用し、供試個体の全ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、カリウムイオン、マグネシウムイオン、ｐＨ緩衝液、ゼラチンを含む溶液として常法により調製すればよく、特に限定されるものではないが、例えば、全ＤＮＡを２５ｎｇ、ＤＮＡポリメラーゼを０．５ユニット、４種類のヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）を各１００μＭ、カリウムイオンとしてＫＣｌを０．０５Ｍ、マグネシウムイオンとしてＭｇＣｌ２ を０．００２Ｍ、ｐＨ緩衝液としてＴｒｉｓ−Ｃｌを０．０１Ｍ、ゼラチンを０．００１％を含む溶液からなるＰＣＲ反応溶液が好適なものとして例示される。
【００１０】
上記により調製したＰＣＲ反応溶液は、ＰＣＲ反応に供されるが、当該ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（宝酒造社製）などのＰＣＲ自動化装置を使用し、常法に準じて行えばよい。この場合、ＰＣＲ反応の反応条件としては、９４℃で２分間処理の後、９４℃で２分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間処理を４０回繰返し、最後に、７２℃で５分間処理が望ましく、また、ＰＣＲ反応の温度条件を調節することにより、複数のＤＮＡ断片を増幅させることができる。上記全ＤＮＡを、上記ＰＣＲ反応により、プライマーの結合部に挟まれたＤＮＡ領域を選択的に増幅させることができる。
ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片は、アクリルアミド電気泳動にかけて分離する。当該アクリルアミド電気泳動としては、５％アクリルアミド（アクリルアミドとＢＩＳアクリルアミドの質量比は２９：１）のゲルを用いて、１００Ｖ定電圧条件での泳動が好適なものとして使用されるが、これに限らず、アガロースゲル電気泳動をはじめ、これと同等若しくは類似のものであれば、同様に使用することが可能である。
上記アクリルアミド電気泳動による泳動操作を終了した後、分離したＤＮＡを銀染色法で染色し、得られたＤＮＡ断片の泳動図の差異を観察することによって、供試個体間の多型を示す複数のＤＮＡ断片を確認し、判定する。
【００１１】
本発明は、動物および植物の個体識別方法として生物の種類を問わず利用することが可能であり、イネ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、オオムギなどの植物、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物、酵母菌や乳酸菌などの微生物、ヒトを含めた生物の個体識別方法として使用することが可能である。
【００１２】
本発明において使用するＭＩプライマーの特徴は、上記のように、塩基配列が左右対称になっていることであり、後記の実施例で示されるように、ＰＣＲ反応の温度条件を調節することにより、供試個体間で多型を示す複数のＤＮＡ断片を鮮明に確認することができる。本発明のＭＩプライマーは、既知塩基配列をもとに作成した従来のプライマーと比較して、供試個体間で多型を示すＤＮＡ断片がより多く鮮明に観察されるが、その理由は、ＭＩプライマーの塩基配列と相同性のある、鏡面構造の塩基配列がＤＮＡ中に散在しているためと推察される。
【００１３】
【実施例】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、当該実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例
トウモロコシ自殖系統の識別の一実施例を以下に示す。
１）全ＤＮＡの調製
▲１▼ 使用したトウモロコシ自殖系統
供試したトウモロコシ自殖系統は、「Ｎａ３５」、「Ｎａ４２」、「Ｈ８４」、「Ｎａ３０」、「Ｎａ２８」、「Ｎａ２」の合計６種類である。
▲２▼ ＤＮＡ断片の調製方法
ＤＮＡの調製方法は、既出の報告（Ｍｕｒｒａｙ Ｍ．Ｇ． ａｎｄ Ｗ．Ｆ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ８： ４３２１−４３２５ （１９８０））を一部改変して行った。トウモロコシの種子を暗黒下で播種した後、五日後の芽生えを液体窒素で凍結後、粉砕し、ＤＮＡ抽出緩衝液１（０．１４Ｍソルビトール、０．２２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２２Ｍ ＥＤＴＡ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、０．８％ＣＴＡＢ、１％ラウリル硫酸ナトリウム）を加えて６５℃で３０分間処理した後、ＤＮＡ抽出緩衝液２（クロロホルムとイソアミルアルコールの２４：１の混合液）を加えて、３０分間振とうした。次に、高速遠心機で１５分間の遠心分離（１，０００ｇ）を行い、上層のＤＮＡ溶液を回収し、ＤＮＡ抽出緩衝液３（１％ＣＡＴＢ、０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ）およびＤＮＡ抽出緩衝液４（１０％ＣＡＴＢ、０．８Ｍ ＮａＣｌ）を加え、３０分間静置した。その後、高速遠心機で１５分間の遠心分離（１，０００ｇ）を行い、沈澱物を回収し、ＤＮＡ抽出緩衝液５（０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ）に溶解した。ＤＮＡ溶液に塩化セシウム、臭化エチジウムを加え、超遠心機で８時間の遠心分離（１２０，０００ｇ）を行い、ＤＮＡ画分を回収した後、塩化セシウム、臭化エチジウムの除去処理を行ってＤＮＡを調製した。
【００１４】
２）ＭＩプライマーの合成
▲１▼ ＭＩプライマーの設計
塩基数が偶数（２ｎ）の場合は、ｎ番目とｎ＋１番目の間を境にして、また、塩基数が奇数（２ｎ＋１）の場合は、ｎ＋１番目の任意の塩基を中心にして、塩基配列が左右対称となるようにＭＩプライマーを設計した。
▲２▼ ＤＮＡ合成機によるＭＩプライマーの合成
ミリポア社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機８９０５を用いて一本鎖ＤＮＡを合成した。
【００１５】
３）ＰＣＲ反応溶液の調製
▲１▼ ＰＣＲ反応溶液の構成
ＰＣＲ反応溶液は、プライマーとして、上記ＭＩプライマーを使用し、供試個体の全ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、カリウムイオン、マグネシウムイオン、ｐＨ緩衝液、ゼラチンから構成される溶液を使用した。
▲２▼ ＰＣＲ反応溶液の調製
ＰＣＲ反応溶液は、供試個体の全ＤＮＡを２５ｎｇ、ＤＮＡポリメラーゼを０．５ユニット、４種類のヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）を各１００μＭ、カリウムイオンとしてＫＣｌを０．０５Ｍ、マグネシウムイオンとしてＭｇＣｌ２ を０．００２Ｍ、ｐＨ緩衝液としてＴｒｉｓ−ＨＣｌを０．０１Ｍ、ゼラチンを０．００１％を含む溶液として調製した。
【００１６】
４）ＰＣＲ反応によるＤＮＡ断片の増幅
▲１▼ ＰＣＲ反応条件
ＰＣＲ反応条件は、９４℃で２分間処理の後、９４℃で２分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間処理を４０回繰返し、最後に、７２℃で５分間処理とした。
▲２▼ ＰＣＲ自動化装置によるＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ自動化装置としてＤＮＡサーマルサイクラーＰＪ４８０（宝酒造社製）を使用した。
【００１７】
５）アクリルアミド電気泳動による増幅されたＤＮＡ断片の分離
▲１▼ アクリルアミド電気泳動の条件、装置
アクリルアミド電気泳動の条件は、５％アクリルアミド（アクリルアミドとＢＩＳアクリルアミドの質量比は２９：１）のゲルを用いて、１００Ｖ定電圧条件とした。アクリルアミド電気泳動のための泳動槽は、日本エイドー社製の二連冷却式スラブ泳動装置Ｎａ−１２１３を用い、電源装置は、ＡＴＴＯ社製のクロスパワー５００を用いた。
▲２▼ ＤＮＡ断片の分離（泳動の結果）
約１００塩基対から約１５００塩基対の長さのＤＮＡ断片が分離された。
【００１８】
６）銀染色法による分離したＤＮＡ断片の染色
▲１▼ 銀染色法の方法、条件
ＤＮＡ断片の染色には、和光純薬社製の「銀染色ＩＩキットワコー」を用い、泳動終了後のゲルを１０％トリクロロ酢酸中で１０分間振とうした後、キット付属の固定液−２中にゲルを移して１０分間振とうし、ついでキット付属の増感液中にゲルを移して１０分間振とうし、さらに、脱イオン水中にゲルを移して１０分間振とうした。次に、キット付属の染色液中にゲルを移して１５分間振とうした後、脱イオン水中にゲルを移して５分間振とうを３回繰返した。処理されたゲルは、キット付属の現像液中に移して３分間振とうした後、キット付属の停止液中に移して３分間振とうして染色反応を停止させた。最後に、ゲルを脱イオン水中に移して２分間振とうを３回繰返した後、ゲルの写真撮影を行った。
▲２▼ ＤＮＡ断片の染色の結果（図２〜図６）
対照として、任意の１０塩基の配列（５′−ＧＴＴＧＣＧＡＴＣＣ−３′）をプライマーに用いた場合の結果を図２に示した。矢印で示したＤＮＡ断片について供試系統間に多型が観察されるが、不鮮明である。また、ヒトのサテライトＤＮＡ（ｌａｍｂｄａ ３３．３）の１４塩基の配列（５′−ＧＧＧＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＣ−３′）をプライマーに用いた場合の結果を図３に示した。ＰＣＲ反応によって増幅されるＤＮＡ断片の数が多く、各系統間の識別は難しい。
一方、ＭＩプライマーを用いた場合の結果を図４から図６に示した。１５塩基の配列（５′−ＣＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣ−３′）のＭＩプライマーを用いた場合の結果が図４である。矢印で示したように、３種類のＤＮＡ断片について、鮮明に各系統間におけるＤＮＡ多型が観察される。また、異なる１５塩基の配列（５′−ＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴ−３′）のＭＩプライマーを用いた場合の結果が図５である。矢印で示したように、３種類のＤＮＡ断片について、鮮明に各系統間におけるＤＮＡ多型が観察される。同様に、左右対称である１４塩基の配列（５′−ＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡ−３′）のＭＩプライマーを用いた場合の結果が図６である。矢印で示したように、３種類のＤＮＡ断片について、鮮明に各系統間におけるＤＮＡ多型が観察される。
なお、図７に、多型を示したＤＮＡ断片を模式的にまとめた。
【００１９】
７）ＰＣＲ反応で増幅されたＤＮＡ断片の差異による供試個体の識別
▲１▼ 識別の方法
供試個体間で観察できるＤＮＡ断片について、泳動距離が同等のものは同一のＤＮＡ断片、泳動距離が異なるものは異なるＤＮＡ断片として供試個体を識別した。
▲２▼ トウモロコシ自殖系統の多型を示す複数のＤＮＡ断片の判定の具体的説明図７に、多型を示したＤＮＡ断片を模式的にまとめた。これより、ＭＩプライマーを用いることによって、供試個体間で多型を示すＤＮＡ断片が鮮明に観察されること、ＭＩプライマーをＰＣＲ反応のプライマーとして使用することにより、個体識別に有効であること、および、既知の塩基配列もしくは任意の塩基配列をもとにして作成したプライマーと比較して、供試系統間で多型を示すＤＮＡ断片がより多く鮮明に観察されることが示された。ＭＩプライマーを用いた場合の結果より、各供試系統について固有のバーコード（ＤＮＡ断片）が確認され、各供試系統の識別が可能であることが判った。
なお、他のＭＩプライマーを使用して同様に試験したところ、同様の結果が得られた。
【００２０】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、鏡面構造の左右対称の塩基配列を持つプライマー（ＭＩプライマー）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をアクリルアミド電気泳動および銀染色法によってＤＮＡを分離、染色し、増幅されたＤＮＡ断片の差異によって供試個体を識別することを特徴とするものであり、本発明によれば、供試個体間で多型を示す複数のＤＮＡ断片が鮮明に確認できるので、ＤＮＡ配列の差異による個体識別が効率的に行える。また、ＰＣＲ反応の温度条件を調節することにより、供試個体間で多型を示す複数のＤＮＡ断片を鮮明に確認することができる。さらに、既知の塩基配列もしくは任意の塩基配列をもとにして作成したプライマーと比較して、供試個体間で多型を示すＤＮＡ断片がより多く鮮明に観察される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る左右対称の塩基（ヌクレオチド）配列を持つプライマー（ＭＩプライマー）を示す。
【図２】従来法による任意の１０塩基の塩基配列をもとにして作成したプライマー（５′−ＧＴＴＧＣＧＡＴＣＣ−３′）を用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図を示す。
【図３】従来法による既知のヒトのサテライトＤＮＡ（ｌａｍｂｄａ ３３．３ ）の１４塩基の配列をもとにして作成したプライマー（５′−ＧＧＧＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＣ−３′）を用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図を示す。
【図４】本発明の１５塩基のＭＩプライマー（５′−ＣＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣ−３′）を用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図を示す。
【図５】本発明の１５塩基のＭＩプライマー（５′−ＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴ−３′）を用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図を示す。
【図６】本発明の１４塩基のＭＩプライマー（５′−ＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡ−３′）を用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図を示す。
【図７】本発明の３種類のＭＩプライマーを用いてＰＣＲ反応で増幅させたＤＮＡ断片のアクリルアミド電気泳動による泳動図の模式図を示す。
Claims (2)
- 供試個体の全ＤＮＡと、鏡面構造の左右対称の塩基配列を持つプライマーであって、（５′−ＣＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣ−３′）、（５′−ＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴ−３′）および（５′−ＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡ−３′）から選択される一種であるプライマー（ＭＩプライマー）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をアクリルアミド電気泳動および銀染色法によってＤＮＡを分離、染色し、増幅されたＤＮＡ断片の差異によって供試個体を識別することを特徴とするトウモロコシの生物個体の識別方法。
- 請求項１記載の生物個体の識別方法で使用される鏡面構造の左右対称の塩基配列を持つプライマーであって、（５′−ＣＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣ−３′）、（５′−ＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＴ−３′）および（５′−ＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡ−３′）から選択される一種であることを特徴とするプライマー。
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