WO1996035807A1 - Procede de discrimination individuelle par pcr utilisant une amorce mi - Google Patents

Procede de discrimination individuelle par pcr utilisant une amorce mi Download PDF

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WO1996035807A1
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dna
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individual
pcr reaction
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Motoshige Kawata
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Forage Crop Breeding And Seed Research Institute
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying an animal or a plant individual based on a difference in DNA nucleotide sequence as an indicator.More specifically, the present invention relates to a method for identifying an individual living organism by a PCR reaction. Compared with the conventional method using a primer prepared based on an arbitrary base sequence, the present invention relates to a method that enables the method to be performed more effectively.
  • a primer a specific DNA fragment (M PCR reaction using DNA primers, and the amplified DNA fragments are separated and stained by Acrylamide electrophoresis and silver staining.
  • the present invention relates to a new method for identifying an individual organism, which is characterized by identifying an organism. Background art
  • the present inventors have prepared a DNA fragment (MI primer) having a mirror-symmetric left-right base sequence found by the present inventors based on a known or arbitrary base sequence.
  • the DNA fragment showing polymorphism is more clearly observed among the test individuals compared to the primer that was used, and therefore, the use of the Ml primer as a primer in the PCR reaction is effective for individual identification.
  • the inventors have found that the present invention has been completed. Summary of the Invention
  • the present invention provides a method for identifying an individual by a PCR reaction using an M I primer.
  • a PlR reaction is carried out using a DNA fragment of a test individual and a primer having a symmetric base sequence, and the amplified DNA fragment is subjected to DNIA by acrylic acid electrophoresis and silver staining.
  • the present invention relates to a method for identifying an individual living organism, comprising separating and staining an isolated DNA, and identifying a test individual based on a difference between amplified DNA fragments.
  • the primer having a symmetric base sequence is selected from 5′—CCC TAAAGAA ATC CC-3 ′, 5′-TTTAGG GCGG GATTT-3 ′ and 5′—AG GGCC TTC CGG GA—3 ′.
  • the present invention relates to a method for identifying the above-mentioned individual organism, which is a kind of the above-mentioned, and a method for identifying the above-mentioned individual organism, wherein the individual organism is an animal or plant individual.
  • a plurality of DNA fragments exhibiting polymorphism among test individuals can be clearly confirmed, so that individual identification based on DNA sequence differences can be performed efficiently.
  • a plurality of DNA fragments exhibiting polymorphism among test individuals can be clearly confirmed.
  • a DNA fragment showing a polymorphism between test individuals is more clearly observed. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a method for identifying individuals of animals and plants based on differences in DNA base sequences.
  • the present invention makes it possible to clearly confirm a plurality of DNA fragments showing polymorphism among test individuals by using a specific primer (Ml primer) in an individual identification method by PCR. It is intended to provide a new individual identification method.
  • the present invention for solving the above-mentioned problems is to carry out a PCR reaction using total DNA of a test individual with primers having base sequences symmetrical to the left and right.
  • a method for identifying an individual living organism characterized by separating and staining DNA by silver staining and identifying test individuals based on differences in amplified DNA fragments.o
  • the primers having a symmetric base sequence are (5′—CC CTAAAGAAATC CC-3 ′), (5′-TTTAG GGCGG GATTT-3 ′) and (5′-AG G
  • G C C TTC C GGGA-3 ′ a method for identifying an individual organism as described above, which is a kind selected from the group consisting of:
  • Another embodiment of the present invention is the method for identifying an individual organism according to claim 1, wherein the individual organism is an animal or plant individual.
  • the present invention relates to a method for identifying a DNA of an individual organism by a PCR reaction.
  • the amplified DNA fragments are separated and stained for DNA by acrylamide electrophoresis and silver staining, and test individuals are identified based on differences in amplified DNA fragments.
  • the MI primer can be any primer (Mirror Image Primer, MI primer) consisting of a DNA fragment having a mirror-symmetric bilateral base (nucleotide) sequence.
  • MI primer Marror Image Primer, MI primer
  • Ml primers can be designed with an appropriate structure and used by synthesizing them with a DNA synthesizer.Otherwise, a base sequence having a mirror structure is searched for in the DNA of an organism and extracted from it. It is also possible to use it.
  • the PCR reaction solution used for the PCR reaction uses the above-mentioned MI primer as a primer, and the total DNA, DNA polymerase, and four types of nucleotides (dATP, dCTP, d GT P, d TTP), calcium ion, magnesium ion, ⁇ buffer, and gelatin, and may be prepared by a conventional method.
  • nucleotides dATP, dCTP, d GT P, d TTP
  • ⁇ buffer calcium ion
  • magnesium ion calcium ion
  • ⁇ buffer ⁇ buffer
  • gelatin there is no particular limitation. 5 ng, 0.5 units of DNA polymerase, 100 / M each of 4 types of nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), and KC1 as potassium ion 0. 0 5 M, Mg C l 2 and 0. 0 0 2 M as magnesium ions, p H buffer as T ris- CI to 0.1 0 1 M,
  • the PCR reaction solution prepared as described above is subjected to a PCR reaction.
  • the PCR reaction is performed using a PCR automation device such as DNA Thermal Cycler PJ480 (manufactured by Takara Shuzo) in a conventional manner. Just follow them.
  • the PCR reaction conditions are as follows: treatment at 94 ° C for 2 minutes, followed by treatment at 94 ° C for 2 minutes, 56 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. It is desirable to repeat the treatment twice, and finally, to treat with 72 for 5 minutes, and by adjusting the temperature conditions of the PCR reaction, it is possible to amplify a plurality of DNA fragments.
  • the whole DNA can be selectively amplified by the PCR reaction in the DNA region sandwiched between the binding portions of the primers.
  • the DNA fragment amplified in the PCR reaction is separated by acrylamide electrophoresis.
  • the acrylamide electrophoresis was carried out using a gel of 5% acrylamide (mass ratio of acrylamide to BIS acrylamide is 29: 1), and was measured at 100 V. Electrophoresis under voltage conditions is used as a preferable one, but is not limited to this, and it is possible to use agarose gel electrophoresis and other similar or similar ones .
  • the separated DNA is stained by silver staining, and the difference in the electrophoretogram of the obtained DNA fragment is observed, whereby the difference between the test individuals is obtained. Confirm and determine multiple DNA fragments showing polymorphism.
  • the present invention can be used as an individual identification method for animals and plants regardless of the type of organism, and includes plants such as rice, corn, soybean, wheat, oats, etc. It can be used as an individual identification method for organisms including mammals, microorganisms such as yeasts and lactic acid bacteria, and humans.
  • the feature of the MI primer used in the present invention is that the base sequence is symmetrical as described above, as shown in the Examples described later.
  • the temperature conditions of the PCR reaction it is possible to clearly confirm a plurality of DNA fragments exhibiting polymorphism among test individuals.
  • more DNA fragments showing polymorphism among test individuals are more clearly observed as compared with the conventional primer prepared based on the known nucleotide sequence. This is presumed to be due to the fact that nucleotide sequences having a mirror structure and homology to the nucleotide sequence of the MI primer are scattered in the DNA.
  • FIG. 1 shows a primer (Ml primer) having a symmetric base (nucleotide) sequence according to the present invention.
  • Figure 2 shows the fragmentation of a DNA fragment amplified by PCR using a primer (5'-GTTGC GATCC-3 ') prepared based on an arbitrary base sequence of 10 bases by the conventional method. An electrophoretogram by cracrylamide electrophoresis is shown.
  • FIG. 3 shows the results of PCR using primers (5 '— GGG GTG GAC GGGGC-3') prepared based on the 14-base sequence of a known human satellite DNA (lambda 33.3) by the conventional method.
  • the electrophoretogram of the DNA fragment amplified by the reaction by acrylamide electrophoresis is shown.
  • FIG. 4 shows the electrophoresis diagram of the DNA fragment amplified by the PCR reaction using the 15-base MI primer (5′—CCC TA AA GAAATC CC-3 ′) of the present invention, by acrylic acid electrophoresis. Show.
  • FIG. 5 shows an electrophoretic diagram by acrylamide electrophoresis of a DNA fragment amplified by a PCR reaction using a 15-base MI primer (5′—TTTAGGGCGGGATTT-3 ′) of the present invention.
  • FIG. 6 is an electrophoretic diagram of a DNA fragment amplified by a PCR reaction using a 14-base Ml primer (5′—AG GGCC TTCCG GGA—3 ′) of the present invention by acrylamide electrophoresis. Is shown.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an electrophoretogram of an amplified DNA fragment by acrylic acid electrophoresis.
  • the maize inbred lines tested were the sum of “Na35”, “Na42j”, “H84”, “Na30”, “Na28”, and “Na2”. There are six types.
  • the DNA was prepared by partially modifying the previous report (Murray MG and WF Thompson, Nucleic Acid Res. 8: 4321-4325 (1980)). After sowing the corn seeds in the dark, the seedlings 5 days later are frozen with liquid nitrogen, crushed, and then subjected to DNA extraction buffer 1 (0.14 IV [sorbitol, 0.22 MT ris—HC 1 , 0.022 M EDTA, 0.8 M NaCl, 0.8% CTAB, 1% sodium lauryl sulfate), and treat at 65 ° C for 30 minutes, followed by DNA extraction. Buffer 2 (24: 1 mixture of black form and isoamyl alcohol) was added and shaken for 30 minutes.
  • centrifugation 1,000 g was performed for 15 minutes using a high-speed centrifuge, and the DNA solution in the upper layer was recovered.
  • -HC 0.01 MEDTA DNA extraction buffer 4 (10% CATB, 0.8 MNaCl) were added and left to stand for 30 minutes. Thereafter, centrifugation (1,000 g) was performed for 15 minutes using a high-speed centrifuge, and the precipitate was recovered.
  • the DNA extraction buffer 5 (0.01 MT ris-HCl, 0.0 0 1 MEDTA, dissolved in 1 MNaC 1).
  • Cesium chloride and bromide chloride were added to the DNA solution, and the mixture was centrifuged with an ultracentrifuge for 8 hours (120,000 g) to collect the DNA fraction.Then, cesium chloride and bromide were added. DNA was prepared by removing thidium.
  • the n + 1st arbitrary The MI primer was designed so that the base sequence would be symmetrical about the bases.
  • Single-stranded DNA was synthesized using a DNAZRNA synthesizer 8905 manufactured by Millipore.
  • the PCR reaction solution uses the above-mentioned MI primers as primers, and the total DNA, DNA polymerase, and four types of nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, d A solution composed of TTP), calcium ion, magnesium ion, pH buffer, and gelatin was used.
  • the PCR reaction solution contained 25 ng of total DNA, 0.5 unit of DNA polymerase, and 4 types of nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) of the test individual. 100 ⁇ ⁇ , KC 1 as potassium ion, 0.05 ⁇ , MgCl 2 as magnesium ion, 0.02 M, Tris-HC1 as pH buffer, 0.0 A 1 M gelatin solution was prepared as a solution containing 0.001%.
  • PCR reaction conditions were as follows: treatment at 94 ° C for 2 minutes, then repeated 40 times for 2 minutes at 94, 1 minute at 56, and 1 minute at 72, and finally at 72 ° C For 5 minutes.
  • a DNA thermal cycler-PJ480 manufactured by Takara Shuzo was used as a PCR automation apparatus.
  • the conditions for acrylamide electrophoresis were as follows: a gel of 5% acrylamide (mass ratio of acrylamide to BIS acrylamide: 29: 1) was used and a constant voltage of 100 V was used. Conditions.
  • the electrophoresis tank for acrylamide electrophoresis uses a double-cooled slab electrophoresis apparatus Na-1123 made by Nippon Aid Co., Ltd. 0 0 was used.
  • a DNA fragment of about 1500 base pairs in length was separated from about 100 base pairs.
  • the processed gel was transferred to a developer included in the kit, shaken for 3 minutes, and then transferred to a stop solution included in the kit, and shaken for 3 minutes to stop the staining reaction. Next, transfer the gel to deionized water and shake for 2 minutes. After three repetitions, the gel was photographed.
  • FIG. 2 shows the results when an arbitrary 10-base sequence (5′—GTTG C GATC C-3 ′) was used as a primer. Polymorphism is observed between the test lines for the DNA fragment indicated by the arrow, but it is unclear.
  • FIG. 3 shows the results obtained when the 14-base sequence (5′-GGGGTGGACGGGGC-3 ′) of human satellite DNA (1 ambda33.3) was used as a primer. The number of DNA fragments amplified by the PCR reaction is large, and it is difficult to distinguish between strains.
  • FIG. 4 shows the results obtained when the M1 primer having a sequence of 15 bases (5′-CCCCTAAAGAAATCCC-3 ′) was used. As indicated by the arrows, the DNA polymorphism between the strains is clearly observed for the three types of DNA fragments.
  • FIG. 5 shows the results obtained when Ml primers having different 15-base sequences (5′—TTTAGGGCGGGATTT-3 ′) were used. As indicated by the arrows, the DNA polymorphism among the three strains is clearly observed for the three types of DNA fragments. Similarly, FIG.
  • FIG. 7 schematically shows DNA fragments showing polymorphism. 7) Identification of test individuals based on differences in DNA fragments amplified by PCR reaction
  • Fig. 7 schematically shows DNA fragments showing polymorphism.
  • the use of the MI primer makes it possible to clearly observe DNA fragments exhibiting polymorphism between test individuals, and that the MI primer is effective for individual identification by using the MI primer as a primer in a PCR reaction. And that DNA fragments showing polymorphism between test lines are more clearly observed as compared with primers prepared based on known or arbitrary nucleotide sequences.
  • a unique bar code DNA fragment
  • the present invention performs a PCR reaction using primers (Ml primers) having mirror-symmetric base sequences, and uses the amplified DNA fragments for acrylamide electrophoresis and silver staining.
  • DNA is separated and stained by the method described above, and the test individuals are identified based on the difference between the amplified DNA fragments.
  • the present invention polymorphisms between test individuals are identified. Since the multiple DNA fragments shown can be clearly confirmed, individual identification based on DNA sequence differences can be performed efficiently.
  • by adjusting the temperature conditions of the PCR reaction a plurality of DNA fragments exhibiting polymorphism among test individuals can be clearly confirmed.
  • a primer prepared based on an arbitrary nucleotide sequence more DNA fragments showing polymorphism among test individuals are clearly observed.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書
M Iプライマーを用いた P C R反応による個体識別方法 技術分野
本発明は、 動物および植物の個体を D N Aの塩基配列の差異を指 標として識別する方法に関するものであり、 さらに詳しく は、 本発 明は、 P C R反応による生物個体の識別を、 既知もしく は任意の塩 基配列をもとに作成したプライマ一を用いる従来法と比較して、 一 層有効に実施することを可能にする方法に係るものであり、 プライ マーとして、 特定の DNA断片 （M lブライマー） を用いて P C R 反応を行い、 増幅された DN A断片をアク リルア ミ ド電気泳動およ び銀染色法によって DN Aを分離、 染色し、 増幅された DNA断片 の差異によって供試個体を識別することを特徴とする生物個体の新 しい識別方法に関するものである。 背景技術
動物および植物の個体を DN Aの塩基配列の差異で識別する技術 は、 供試個体の遺伝的背景を明確にし、 その育成者の権利を保護す る立場から国際的に重要である。 D N Aの塩基配列の差異に基づく 個体識別技術として P C R (P o l ym e r a s e C h a i n R e a c t i o n) 法が用いられている。 P C R法によって個体識 別を行うには、 プライマ一 （P CR反応に不可欠の、 短い DNA断 片） の塩基配列が識別の成否にかかわる重要な要因である。
従来、 このようなプライマ一として、 既知もしく は任意の塩基配 列をもとに作成したプライマーが種々開発されており、 これらの既 知も しく は任意の塩基配列を P C R反応のプライマーとして使用す るこ とにより、 個体識別を行う方法も提案されているが （Skolnick , M.H. and R. B. Wallace, Genomics 2： 273 - 279 (1988)， William s, J.G.K. et al. , Nucleic Acid Res. 18： 6531-6535 (1990)) 、 従来のものでは、 供試個体間で多型を示す複数の DN A断片を鮮明 に確認するには困難な場合が多く、 その改善が強く要請されている 状況にあった。
その他、 DNA断片の差異によって供試個体を識別する方法とし て、 R F L P (Restriction Fragments Length Polymorp ysms) (Ta ngsley, S. D. et al. , Biotechnology 7: 257-264 (1989)) 、 特表 昭 6 2 - 5 0 0 4 2 3号公報、 特表平 6 - 5 0 4 4 2 7号公報、 等 が提案されている。
ところで、 生物の DNA中には、 鏡面構造の左右対称の構造から なる塩基配列が散在すると推定される。 すなわち、 一般に、 進化の 過程では、 遺伝子 （D NA) の変化を伴って、 例えば、 植物種の系 統分化が起きたと考えられる。 異なる植物種の遺伝子 （DNA) の 配列を比較すると、 系統分化の際に、 共通の塩基配列を持つ領域を 介して DNAが組み換わったことが推定できる。 本発明者らは、 ィ ネを材料として、 植物種の DN Aの構造変化について研究を進める 中で、 共通の塩基配列を持つ領域を介した DNAの組み換え （相同 組み換え） が起きるときに、 DN Aが左右対称に塩基配列が向き合 つた構造 （鏡面構造） をとつて結合する場合があることを見いだし た （Kawata' M. et al.. Theor. Appl. Genet. 90： 364-371 (1995 ) ) 。 これより、 進化の過程でイネやトウモロコシをはじめとする 生物の D NAは、 幾度となく起こった DNAの組み換えの痕跡とし て、 鏡面構造を取る塩基配列が D N A中に存在することが推定でき このような状況の中で、 本発明者らは、 上記従来技術に鑑みて、 P C R法による個体識別方法に有用なプライマーを開発することを 目標として種々研究を積み重ねる中で、 このような鏡面構造の左右 対称の構造からなる塩基配列のプライマ一としての有効性について 検討したところ、 当該鏡面構造の塩基配列を P C R反応のプライマ 一として使用するこ とにより、 供試個体の識別を有効に実施し得る との知見を得た。 すなわち、 本発明者らは、 上記した、 本発明者ら が見い出した鏡面構造の左右対称の塩基配列を持つ D N A断片 （M I プライマー） は、 既知もしく は任意の塩基配列をもとにして作成 したプライマ一と比較して、 供試個体間で多型を示す DN A断片が より多く鮮明に観察されること、 そのため、 M l プライマーを P C R反応のプライマーとして使用することにより、 個体識別に有効で あること、 を見い出して、 本発明を完成するに至った。 発明の要約
本発明は、 M I プライマーを用いた P C R反応による個体識別方 法を提供する。
本発明は、 供試個体の DNA断片と、 左右対称の塩基配列を持つ プライマーを用いて P l R反応を行い、 増幅された DNA断片をァ ク リルア ミ ド電気泳動および銀染色法によって DN Aを分離、 染色 し、 増幅された DN A断片の差異によって供試個体を識別するこ と を特徴とする生物個体の識別方法に関する。 また、 本発明は、 左右 対称の塩基配列を持つプライマーが、 5 ' — C C C TAAAGAA ATC C C - 3 ' 、 5 ' -TTTAGG G C G G GATTT- 3 ' および 5 ' — AG G G C C TTC C G G GA— 3 ' から選択される 一種である上記の生物個体の識別方法、 さらに、 生物個体が、 動物 または植物の個体である上記の生物個体の識別方法に関する。
本発明によれば、 供試個体間で多型を示す複数の DN A断片が鲜 明に確認できるので、 D N A配列の差異による個体識別が効率的に 行える。 また、 P C R反応の温度条件を調節するこ とにより、 供試 個体間で多型を示す複数の DN A断片を鮮明に確認することができ る。 さ らに、 既知もしく は任意の塩基配列をもとにして作成したプ ライマ一と比較して、 供試個体間で多型を示す DN A断片がより多 く鮮明に観察される。 発明の開示
本発明は、 動物および植物の個体を D N Aの塩基配列の差異で識 別する方法を提供することを目的とするものである。
また、 本発明は、 P C R法による個体識別方法において、 特定の プライマー （M lプライマー） を使用することによって、 供試個体 間で多型を示す複数の DN A断片を鲜明に確認することを可能にす る新しい個体識別方法を提供することを目的とするものである。
さらに、 本発明は、 P C R法による個体識別方法において有効に 使用される特定のプライマー （M lプライマー） を提供することを 目的とするものである。
上記課題を解決するための本発明は、 供試個体の全 DNAと、 左 右対称の塩基配列を持つプライマーを用いて P C R反応を行い、 増 幅された DN A断片をアク リルアミ ド電気泳動および銀染色法によ つて DNAを分離、 染色し、 増幅された DNA断片の差異によって 供試個体を識別するこ とを特徴とする生物個体の識別方法、 である o
また、 本発明の他の態様は、 左右対称の塩基配列を持つプライマ 一が、 （ 5 ' — C C CTAAAGAAATC C C - 3 ' ) 、 ( 5 ' -TTTAG G G C G G GATTT - 3 ' ) および （ 5 ' - AG G
G C C TTC C GGGA- 3 ' ) から選択される一種である上記の 生物個体の識別方法、 である。
さらに、 本発明の他の態様は、 生物個体が、 動物または植物の個 体である請求項 1記載の生物個体の識別方法、 である。
铳いて、 本発明についてさらに詳細に説明する。
M I プライマーを用いた個体識別法の概要を以下に説明する。 本発明は、 上記のように、 P C R反応による生物個体の D N A識 別方法に係るものであり、 供試個体の全 DNAと、 鏡面構造の左右 対称の塩基配列を持つプライマ一 （M lプライマ一） を用いて P C R反応を行い、 増幅された DNA断片をアク リルア ミ ド電気泳動お よび銀染色法によって DN Aを分離、 染色し、 増幅された DNA断 片の差異によって供試個体を識別することを特徴とするものである 本発明において、 M l プライマーは、 鏡面構造の左右対称の塩基 (ヌ ク レオチ ド） 配列を持つ DNA断片からなるプライマー （M i r r o r I m a g e P r i m e r、 M Iプライマー） であれば 、 いかなるものであってもよ く、 例えば、 一例をあげると、 図 1 に 示されるように、 （ 5 ' — C C C TAAA GAAATC C C— 3 ' ) 、 （ 5 ' - TTTAG G G C G G GATTT - 3 ' ) および （ 5 ' - A G G G C C TT C C G G GA- 3 ' ) が好適なものとして例 示されるが、 これに限らず、 鏡面構造を有する左右対称の塩基配列 を持つものであればその種類を問わず同様に使用することができる
M l プライマーは、 適宜の構造のものを設計し、 DNA合成機で 合成して使用することができるが、 その他、 鏡面構造を取る塩基配 列を生物の DNA中にて検索し、 これから抽出して使用することも 可能である。
P C R反応に供される P C R反応溶液は、 プライマーとして、 上 記 M Iプライマーを使用し、 供試個体の全 DNA、 DNAポリ メラ —ゼ、 4種類のヌ ク レオチ ド （ d ATP， d C TP， d GT P, d TT P) 、 カ リ ウムイオン、 マグネシウムイオン、 ρ Η緩衝液、 ゼ ラチンを含む溶液として常法により調製すればよく、 特に限定され るものではないが、 例えば、 全 DNAを 2 5 n g、 DNAポリ メラ —ゼを 0. 5ユニッ ト、 4種類のヌク レオチ ド （ d ATP, d C T P, d G TP, d T T P ) を各 1 0 0 / M、 カ リ ウムイオンとして K C 1 を 0. 0 5 M、 マグネシウムイオンとして Mg C l 2 を 0. 0 0 2 M、 p H緩衝液として T r i s— C I を 0. 0 1 M、 ゼラチ ンを 0. 0 0 1 %を含む溶液からなる P C R反応溶液が好適なもの ,として例示される。
上記により調製した P C R反応溶液は、 P C R反応に供されるが 、 当該 P C R反応は、 DNAサーマルサイ クラ一 P J 4 8 0 (宝酒 造社製） などの P C R自動化装置を使用し、 常法に準じて行えばよ い。 この場合、 P C R反応の反応条件としては、 9 4 °Cで 2分間処 理の後、 9 4 °Cで 2分間、 5 6 °Cで 1 分間、 7 2 °Cで 1 分間処理を 4 0回繰返し、 最後に、 7 2 で 5分間処理が望ま しく、 また、 P C R反応の温度条件を調節するこ とにより、 複数の D NA断片を増 幅させるこ とができる。 上記全 DNAを、 上記 P C R反応により、 プライマーの結合部に挟まれた DNA領域を選択的に増幅させるこ とができる。
P C R反応で増幅された DN A断片は、 アク リ ルア ミ ド電気泳動 にかけて分離する。 当該アク リルア ミ ド電気泳動としては、 5 %ァ ク リ ルァ ミ ド （アク リルア ミ ドと B I Sァク リルァ ミ ドの質量比は 2 9 : 1 ) のゲルを用いて、 1 0 0 V定電圧条件での泳動が好適な ものとして使用されるが、 これに限らず、 ァガロースゲル電気泳動 をはじめ、 これと同等若しく は類似のものであれば、 同様に使用す るこ とが可能である。
上記ァク リルァミ ド電気泳動による泳動操作を終了した後、 分離 した D NAを銀染色法で染色し、 得られた DNA断片の泳動図の差 異を観察するこ とによって、 供試個体間の多型を示す複数の DN A 断片を確認し、 判定する。
本発明は、 動物および植物の個体識別方法として生物の種類を問 わず利用することが可能であり、 イネ、 トウモロコシ、 ダイズ、 コ ムギ、 ォォムギなどの植物、 ゥシ、 ゥマ、 ブ夕などの哺乳動物、 酵 母菌ゃ乳酸菌などの微生物、 ヒ トを含めた生物の個体識別方法とし て使用することが可能である。
本発明において使用する M I プライマーの特徴は、 上記のように 、 塩基配列が左右対称になっていることであり、 後記の実施例で示 されるように、 P C R反応の温度条件を調節するこ とにより、 供試 個体間で多型を示す複数の DN A断片を鮮明に確認することができ る。 本発明の M Iプライマーは、 既知塩基配列をもとに作成した従 来のプライマーと比較して、 供試個体間で多型を示す DN A断片が より多く鮮明に観察されるが、 その理由は、 M lプライマーの塩基 配列と相同性のある、 鏡面構造の塩基配列が D N A中に散在してい るためと推察される。 図面の簡単な説明
図 1 は、 本発明に係る左右対称の塩基 （ヌ ク レオチ ド） 配列を持 つプライマー （M l プライマー） を示す。
図 2は、 従来法による任意の 1 0塩基の塩基配列をもとにして作 成したプライマー （ 5 ' - GTTG C GATC C - 3 ' ) を用いて P C R反応で増幅させた DN A断片のァク リルア ミ ド電気泳動によ る泳動図を示す。
図 3は、 従来法による既知のヒ トのサテライ ト DNA ( lambda 3 3.3 ) の 1 4塩基の配列をもとにして作成したプライマー （ 5 ' — G G G GTG GAC G G G G C - 3 ' ) を用いて P C R反応で増幅 させた DNA断片のアク リ ルア ミ ド電気泳動による泳動図を示す。 図 4は、 本発明の 1 5塩基の M lプライマー （ 5 ' — C C C TA AA GAAATC C C - 3 ' ) を用いて P C R反応で増幅させた D NA断片のアク リルア ミ ド電気泳動による泳動図を示す。
図 5は、 本発明の 1 5塩基の M lプライマー （ 5 ' — TTTAG G G C G G GATTT- 3 ' ) を用いて P C R反応で増幅させた D N A断片のアク リ ルア ミ ド電気泳動による泳動図を示す。
図 6は、 本発明の 1 4塩基の M lプライマ一 （ 5 ' — AG G G C C TT C C G GGA— 3 ' ) を用いて P C R反応で増幅させた D N A断片のアク リ ルア ミ ド電気泳動による泳動図を示す。
図 7は、 本発明の 3種類の M Iプライマーを用いて P C R反応で 増幅させた DN A断片のアク リルア ミ ド電気泳動による泳動図の模 式図を示す。 発明を実施するための最良の形態
次に、 本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、 本発明は 、 当該実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例
トウモロコシ自殖系統の識別の一実施例を以下に示す。
1 ) 全 DN Aの調製
① 使用した トウモロコシ自殖系統
供試した トウモロコシ自殖系統は、 「N a 3 5」 、 「N a 4 2 j 、 「H 8 4」 、 「N a 3 0」 、 「N a 2 8」 、 「N a 2」 の合計 6 種類である。
② DNA断片の調製方法
DNAの調製方法は、 既出の報告 （Murray M. G. and W. F. Thomp son, Nucleic Acid Res. 8： 4321-4325 (1980)) を一部改変して行 つた。 トウモロコシの種子を暗黒下で播種した後、 五日後の芽生え を液体窒素で凍結後、 粉砕し、 DNA抽出緩衝液 1 ( 0. 1 4 IV [ソ ルビ トール、 0. 2 2 MT r i s— HC 1、 0. 0 2 2 M EDT A、 0. 8 M N a C l、 0. 8 %CTAB、 1 %ラウリル硫酸ナ ト リ ウム） を加えて 6 5 °Cで 3 0分間処理した後、 D N A抽出緩衝 液 2 (ク ロ口ホルムとイ ソア ミ ルアルコールの 2 4 ： 1の混合液） を加えて、 3 0分間振とう した。 次に、 高速遠心機で 1 5分間の遠 心分離 （ 1， 0 0 0 g) を行い、 上層の DNA溶液を回収し、 DN A抽出緩衝液 3 ( 1 % C A T B , 0. 0 5 T r i s -HC 0 . 0 1 M E DTA) および DNA抽出緩衝液 4 ( 1 0 % C A T B 、 0. 8 M N a C l ) を加え、 3 0分間静置した。 その後、 高速 遠心機で 1 5分間の遠心分離 （ 1 , 0 0 0 g ) を行い、 沈澱物を回 収し、 DNA抽出緩衝液 5 ( 0. 0 1 MT r i s —H C l、 0. 0 0 1 M E DTA、 1 M N a C 1 ) に溶解した。 D N A溶液に塩 化セシウム、 臭化工チジゥムを加え、 超遠心機で 8時間の遠心分離 ( 1 2 0 , 0 0 0 g ) を行い、 DNA画分を回収した後、 塩化セシ ゥ厶、 臭化工チジゥムの除去処理を行って DNAを調製した。
2 ) M I プライマーの合成
① M I プライマーの設計
塩基数が偶数 （ 2 n) の場合は、 n番目と n + 1番目の間を境に して、 また、 塩基数が奇数 （ 2 n + l ) の場合は、 n + 1番目の任 意の塩基を中心にして、 塩基配列が左右対称となるように M I ブラ イマ一を設計した。
② DNA合成機にょるM I プライマーの合成
ミ リ ポア社製の DNAZRNA合成機 8 9 0 5を用いて一本鎖 D N Aを合成した。
3 ) P C R反応溶液の調製
① P C R反応溶液の構成
P C R反応溶液は、 プライマーとして、 上記 M lプライマーを使 用し、 供試個体の全 DNA、 DNAポリ メラーゼ、 4種類のヌ ク レ ォチ ド （ d AT P, d C T P, d GT P, d TT P) 、 カ リ ウムィ オン、 マグネシウムイオン、 p H緩衝液、 ゼラチンから構成される 溶液を使用した。
② P C R反応溶液の調製
P C R反応溶液は、 供試個体の全 DNAを 2 5 n g、 DNAポリ メラーゼを 0. 5ユニッ ト、 4種類のヌ ク レオチ ド （ d A T P， d C T P , d GT P, d TT P) を各 1 0 0 〃 Μ、 カ リ ウムイオンと して K C 1 を 0. 0 5 Μ、 マグネシウムイオンとして Mg C l 2 を 0. 0 0 2 M、 p H緩衝液として T r i s — HC 1 を 0. 0 1 M、 ゼラチンを 0. 0 0 1 %を含む溶液として調製した。
4 ) P C R反応による DN A断片の増幅
① P C R反応条件 P C R反応条件は、 9 4 °Cで 2分間処理の後、 9 4でで 2分間、 5 6でで 1 分間、 7 2でで 1 分間処理を 4 0回繰返し、 最後に、 7 2 °Cで 5分間処理とした。
② P C R自動化装置による P C R反応
P C R反応は、 P C R自動化装置として D N Aサーマルサイ クラ - P J 4 8 0 (宝酒造社製） を使用した。
5 ) アク リルアミ ド電気泳動による増幅された DNA断片の分離 ① アク リルア ミ ド電気泳動の条件、 装置
アク リルア ミ ド電気泳動の条件は、 5 %アク リルア ミ ド （ァク リ ルア ミ ドと B I Sアク リルア ミ ドの質量比は 2 9 ： 1 ) のゲルを用 いて、 1 0 0 V定電圧条件とした。 アク リ ルア ミ ド電気泳動のため の泳動槽は、 日本エイ ド—社製の二連冷却式スラブ泳動装置 N a — 1 2 1 3を用い、 電源装置は、 ATT O社製のクロスパワー 5 0 0 を用いた。
② DNA断片の分離 （泳動の結果）
約 1 0 0塩基対から約 1 5 0 0塩基対の長さの DNA断片が分離 された。
6 ) 銀染色法による分離した DNA断片の染色
① 銀染色法の方法、 条件
D N A断片の染色には、 和光純薬社製の 「銀染色 I I キッ トヮコ - J を用い、 泳動終了後のゲルを 1 0 % ト リ クロ口酢酸中で 1 0分 間振とう した後、 キッ ト付属の固定液— 2中にゲルを移して 1 0分 間振とう し、 ついでキッ ト付属の増感液中にゲルを移して 1 0分間 振とう し、 さらに、 脱イオン水中にゲルを移して 1 0分間振とう し た。 次に、 キッ ト付属の染色液中にゲルを移して 1 5分間振とう し た後、 脱イオン水中にゲルを移して 5分間振とうを 3回繰返した。 処理されたゲルは、 キッ ト付属の現像液中に移して 3分間振とう し た後、 キッ ト付属の停止液中に移して 3分間振とう して染色反応を 停止させた。 最後に、 ゲルを脱イオン水中に移して 2分間振とうを 3回繰返した後、 ゲルの写真撮影を行った。
② DNA断片の染色の結果 （図 2〜図 6 )
対照として、 任意の 1 0塩基の配列 （ 5 ' — GTTG C GATC C - 3 ' ) をプライマーに用いた場合の結果を図 2に示した。 矢印 で示した DNA断片について供試系統間に多型が観察されるが、 不 鮮明である。 また、 ヒ トのサテライ ト DNA ( 1 amb d a 3 3 . 3 ) の 1 4塩基の配列 （ 5 ' - GG GGTG GAC G G G G C - 3 ' ) をプライマーに用いた場合の結果を図 3に示した。 P C R反 応によって増幅される DN A断片の数が多く、 各系統間の識別は難 しい。
—方、 M lプライマ一を用いた場合の結果を図 4から図 6に示し た。 1 5塩基の配列 （ 5 ' - C C C TAAAGAAATC C C - 3 ' ) の M lプライマーを用いた場合の結果が図 4である。 矢印で示 したように、 3種類の DNA断片について、 鲜明に各系統間におけ る DN A多型が観察される。 また、 異なる 1 5塩基の配列 （ 5 ' — TTTAG G G C GG GATTT- 3 ' ) の M lプライマーを用い た場合の結果が図 5である。 矢印で示したように、 3種類の DNA 断片について、 鮮明に各系統間における D N A多型が観察される。 同様に、 左右対称である 1 4塩基の配列 （ 5 ' - AG G G C CTT C C G G GA- 3 ' ) の M Iプライマ一を用いた場合の結果が図 6 である。 矢印で示したように、 3種類の DN A断片について、 鮮明 に各系統間における DN A多型が観察される。
なお、 図 7に、 多型を示した DNA断片を模式的にまとめた。 7 ) P C R反応で増幅された DNA断片の差異による供試個体の識 別
① 識別の方法
供試個体間で観察できる DN A断片について、 泳動距離が同等の ものは同一の DNA断片、 泳動距離が異なるものは異なる DNA断 片として供試個体を識別した。 ② トウモロコシ自殖系統の多型を示す複数の DNA断片の判定の 具体的説明
図 7に、 多型を示した DNA断片を模式的にまとめた。 これより 、 M Iプライマーを用いるこ とによって、 供試個体間で多型を示す DN A断片が鮮明に観察されること、 M Iプライマーを P C R反応 のプライマーとして使用することにより、 個体識別に有効であるこ と、 および、 既知の塩基配列もしく は任意の塩基配列をもとにして 作成したプライマーと比較して、 供試系統間で多型を示す DN A断 片がより多く鮮明に観察されるこ とが示された。 M l プライマーを 用いた場合の結果より、 各供試系統について固有のバーコー ド （D NA断片） が確認され、 各供試系統の識別が可能であるこ とが判つ た。
なお、 他の M Iプライマーを使用して同様に試験したところ、 同 様の結果が得られた。 産業上の利用可能性
以上詳述したように、 本発明は、 鏡面構造の左右対称の塩基配列 を持つプライマー （M lプライマー） を用いて P C R反応を行い、 増幅された DNA断片をアク リルアミ ド電気泳動および銀染色法に よって DNAを分離、 染色し、 増幅された DN A断片の差異によつ て供試個体を識別することを特徴とするものであり、 本発明によれ ば、 供試個体間で多型を示す複数の DN A断片が鮮明に確認できる ので、 DNA配列の差異による個体識別が効率的に行える。 また、 P C R反応の温度条件を調節することにより、 供試個体間で多型を 示す複数の DN A断片を鮮明に確認することができる。 さらに、 既 知の塩基配列もしく は任意の塩基配列をもとにして作成したプライ マーと比較して、 供試個体間で多型を示す DN A断片がより多く鲜 明に観察される。 配列表 配列番号 ： 1
配列の長さ ： 1 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A t o m R N A 配列
CCCTAAAGAA ATCCC 15 配列番号 ： 2
配列の長さ ： 1 5
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎮
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A 0 m R N A 配列
TTTAGGGCGG GATTT 15
配列番号 ： 3
配列の長さ ： 1 4
配列の型 ： 核酸
鎖の数 ： 一本鎖
トポロジー ： 直鎖状
配列の種類 ： c D N A t o m R N A 配列
AGGGCCTTCC GGGA 14

Claims

請求の範囲
1 . 供試個体の全 DNAと、 左右対称の塩基配列を 持つプライマー （M l プライマー） を用いて P C R反応を行い、 増 幅された D NA断片をァク リルア ミ ド電気泳動および銀染色法によ つて DNAを分離、 染色し、 増幅された DNA断片の差異によって 供試個体を識別するこ とを特徴とする生物個体の識別方法。
2. 左右対称の塩基配列を持つプライマーが、 （ 5 ' - C C C T AA A G AAAT C C C - 3 ' ) 、 ( 5 ' - TTT A G G G C G G G A TTT - 3 ' ) および （ 5 ' - A G G G C C T T C C G G G A— 3 ' ) から選択される一種である請求項 1 記載の生 物個体の識別方法。
3. 生物個体が、 動物または植物の個体である請求 項 1 記載の生物個体の識別方法。
4. 請求項 1 記載の生物個体の識別方法で使用され る左右対称の塩基配列を持つプライマー。
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