CN117015386A - 细胞周转因子用于增加组织再生的用途 - Google Patents

Abstract

本披露提供了处理组织、器官、类器官或器官培养物的方法，该方法包括在体外用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理组织、器官、类器官或器官培养物。本披露还提供了增加受试者的器官中组织的再生的方法，该方法包括向该受试者施用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物，其中向该受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加该组织的再生。

Description

细胞周转因子用于增加组织再生的用途

相关申请

本申请要求2020年12月21日提交的美国临时申请号63/128,530的优先权，将该申请的全部内容明确地通过引用并入本文。

背景技术

在多细胞生物中，据信细胞死亡是维持组织稳态和消除潜在有害细胞的关键且主动过程。

发明内容

在某些方面，本披露涉及增加哺乳动物受试者的器官中组织的再生的方法，该方法包括向该受试者施用一定量的组合物并持续一定的时间，该量和该时间足以增加该组织的再生，其中该组合物通过以下制备：(a)使哺乳动物细胞暴露于应激条件，和(b)收集经暴露的细胞或来自这些经暴露的细胞的条件培养液以产生该组合物。在一些实施例中，应激条件是诱导内质网应激的化合物。在一些实施例中，应激条件选自由以下构成的组：硫代乙酰胺、衣霉素、PhenolaTi、玉米赤霉烯酮、志贺毒素-2、四氯化碳(CCL4)和对乙酰氨基酚。在一些实施例中，应激条件是硫代乙酰胺。在一些实施例中，暴露于应激条件的哺乳动物细胞属于组织或器官中存在的类型。在一些实施例中，暴露于应激条件的哺乳动物细胞选自由以下构成的组：肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、肌肉细胞、骨细胞、肠内衬细胞、心脏细胞、肺脏细胞、皮肤细胞、神经元、中枢神经系统(CNS)的细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。在一些实施例中，暴露于应激条件的哺乳动物细胞是肝脏细胞，并且器官是肝脏。在一些实施例中，将细胞或条件培养液进一步分级以产生组合物。在一些实施例中，暴露于应激条件的哺乳动物细胞对于受试者是自体的。在一些实施例中，哺乳动物受试者是人。

在某些方面，本披露涉及增加受试者的器官中组织的再生的方法，该方法包括向该受试者施用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子(cellturnover factor)的组合物，其中向该受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加该组织的再生。在某些方面，本披露涉及将包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物递送至需要增加组织再生的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用该组合物。

在一些实施例中，组织是肝脏组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍：慢性肝损伤、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、药物性肝损伤、暴发性和晚发性肝衰竭(LOHF)、暴发性肝炎(FH)、肝硬化、肝纤维化、暴发性肝衰竭(FHF)、乙型肝炎和丙型肝炎。在一些实施例中，组织是肾脏组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：糖尿病、类风湿性关节炎、肾炎综合征、肾病综合征、高血压肾病、多囊肾病、进行性慢性肾脏疾病、慢性肾衰竭、法布里病、胱氨酸贮积症、肾消耗病、奥尔波特综合征、再灌注损伤、急性肾损伤、肾纤维化和肾移植。在一些实施例中，组织是胰腺组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍：胰腺癌、糖尿病、胰岛素抵抗、低血糖、高血糖、脂酶缺乏症、胆囊收缩素(CCK)缺乏症、急性胰腺炎、慢性胰腺炎和遗传性胰腺炎。在一些实施例中，组织是肠内衬组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：炎性胃肠道障碍、克罗恩病、炎性肠病(IBD)、憩室炎、寄生虫感染、细菌感染、功能性胃肠道障碍、溃疡性结肠炎(UC)和肠的手术切除。在一些实施例中，组织是心脏组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的心血管疾病：心肌梗死、心力衰竭、由缺血性事件导致的心脏损伤和由非缺血性事件导致的心脏损伤。在一些实施例中，组织是肺脏组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺癌、闭塞性细支气管炎机化性肺炎(BOOP)、2019冠状病毒病(COVID-19)、间皮瘤、囊性纤维化、哮喘、特发性肺纤维化、衰老导致的肺衰竭、肺纤维化、间质性肺病(ILD)、肺动脉高压和α1-抗胰蛋白酶障碍。在一些实施例中，组织是肌肉组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：肌炎、自身免疫性疾病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、肌少症、儿童沙尔科-马里-图思病、衰老导致的肌肉损失、损伤引起的肌肉劳损、肌肉萎缩、肌营养不良、皮肌炎、吉兰-巴雷综合征、多发性硬化、脊髓灰质炎和多肌炎。

在一些实施例中，组合物被配制成靶向组织再生增加的器官。在一些实施例中，组合物被配制成靶向肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、肠内衬、心脏或肺脏。在一些实施例中，组合物被配制成靶向肝脏。在一些实施例中，组合物被配制成靶向肾脏。在一些实施例中，向受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以减少组织再生增加的组织中的坏死。在一些实施例中，向受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以减少组织再生增加的组织中的脂肪变性。在一些实施例中，向受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加组织再生增加的器官的重量。在一些实施例中，向受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加组织中的一种或多种细胞增殖标志物蛋白的表达。

在某些方面，本披露涉及增加移植的器官或组织中的组织再生的方法，该方法包括离体用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理器官或组织，其中用一定量的组合物处理该器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以增加该器官或组织在移植至受试者后的组织再生。

在某些方面，本披露涉及处理组织、器官、类器官或器官培养物的方法，该方法包括在体外使组织、器官、类器官或器官培养物与包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物接触。

在某些方面，本披露涉及制备用于移植至受试者的器官或组织的方法，该方法包括离体用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理器官或组织。

在一些实施例中，用一定量的组合物处理器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以增加该器官或组织在移植至受试者后的组织再生。在一些实施例中，用一定量的组合物处理器官或组织，相对于使用未用该组合物处理的器官或组织进行移植的受试者，该量足以在将该器官或组织移植至受试者后增加该受试者的存活率。在一些实施例中，用一定量的组合物处理器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以改善该器官或组织在移植至受试者后的植入。在一些实施例中，用一定量的组合物处理器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以延长该器官或组织在移植至受试者前的活力。在一些实施例中，应激条件包括非生物应激、生物应激和/或化学应激。在一些实施例中，应激条件包括非生物应激。在一些实施例中，非生物应激选自由以下构成的组：营养物质剥夺、热、冷、辐射、缺氧、渗透压和pH应激。在一些实施例中，应激条件包括生物应激。在一些实施例中，生物应激选自由以下构成的组：使用天然存在的病毒的病毒感染、细菌感染和真菌感染。在一些实施例中，应激条件诱导细胞经历凋亡。在一些实施例中，应激条件包括化学应激。在一些实施例中，化学应激包括使细胞与促进这些细胞产生细胞周转因子的化合物接触。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞对于受试者是同种异体的。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞对于受试者是自体的。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞选自由以下构成的组：肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、肌肉细胞、骨细胞、肠内衬细胞、心脏细胞、肺脏细胞、皮肤细胞、神经元、中枢神经系统(CNS)的细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。在一些实施例中，上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞或免疫细胞来自肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、骨、肠内衬、心脏、肺脏、皮肤或中枢神经系统。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞来自出现组织再生的相同类型的组织。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞是肝脏细胞，并且出现组织再生的组织是肝脏组织；暴露于应激条件的细胞是肾脏细胞，并且出现组织再生的组织是肾脏组织；暴露于应激条件的细胞是肺脏细胞，并且出现组织再生的组织是肺脏组织；暴露于应激条件的细胞是肌肉细胞，并且出现组织再生的组织是肌肉组织；暴露于应激条件的细胞是骨细胞，并且出现组织再生的组织是骨组织；暴露于应激条件的细胞是胰腺细胞，并且出现组织再生的组织是胰腺组织；暴露于应激条件的细胞是心脏细胞，并且出现组织再生的组织是心脏组织；暴露于应激条件的细胞是肠内衬细胞，并且出现组织再生的组织是肠内衬；暴露于应激条件的细胞是皮肤细胞，并且出现组织再生的组织是皮肤组织；暴露于应激条件的细胞是CNS的细胞，并且出现组织再生的组织是CNS组织；暴露于应激条件的细胞是上皮细胞，并且出现组织再生的组织是上皮；或者暴露于应激条件的细胞是内皮细胞，并且出现组织再生的组织是内皮。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞不来自出现组织再生的相同类型的组织。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞是癌细胞。在一些实施例中，癌细胞是永生化的。在一些实施例中，癌细胞是从受试者分离的原代细胞。在一些实施例中，组合物不包含完整的细胞。在一些实施例中，组合物包含从暴露于应激条件的细胞制备的无细胞提取物。在一些实施例中，组合物包含来自暴露于应激条件的细胞的条件培养液。在一些实施例中，组合物包含条件培养液的功能性级分。在一些实施例中，通过基于分子量从条件培养液分离分子来制备功能性级分。在一些实施例中，组合物包含一种或多种从细胞分离的细胞周转因子。在一些实施例中，纯化或部分纯化一种或多种细胞周转因子。在一些实施例中，组合物包含至少十种细胞周转因子。在一些实施例中，组合物包含至少两种细胞周转因子。在一些实施例中，组合物仅包含一种细胞周转因子。在一些实施例中，器官是实质器官。在一些实施例中，器官选自肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、肠内衬、心脏或肺脏。在一些实施例中，器官具有损伤。在一些实施例中，损伤是由药物、毒素、病毒感染或对器官进行的手术引起的。在一些实施例中，在器官损伤后向受试者施用组合物。在一些实施例中，受试者需要对器官进行的手术。在一些实施例中，在对器官进行手术前向受试者施用组合物。在一些实施例中，在对器官进行手术后向受试者施用组合物。在一些实施例中，手术包含涉及器官的癌症切除。在一些实施例中，组织选自由以下构成的组：肝脏组织、肾脏组织、胰腺组织、肌肉组织、肠内衬、心脏组织和肺脏组织。在一些实施例中，该方法进一步包括制备包含一种或多种细胞周转因子的组合物的步骤。在一些实施例中，制备组合物的步骤包括使细胞暴露于应激条件。

在某些方面，本披露涉及增加受试者的器官中组织的再生的方法，该方法包括向该受试者施用包含诱导该受试者中的靶细胞的细胞周转的化合物的组合物，其中施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加该组织的再生。在一些实施例中，化合物诱导靶细胞中的内质网(ER)应激。在一些实施例中，ER应激包含未折叠蛋白反应。在一些实施例中，化合物诱导靶细胞中的凋亡。在一些实施例中，化合物诱导靶细胞中活性氧物质(ROS)的产生。在一些实施例中，靶细胞中ROS的产生处于足以诱导该靶细胞死亡的水平。在一些实施例中，化合物是小分子。在一些实施例中，化合物是蛋白质。在一些实施例中，化合物靶向组织再生增加的器官。在一些实施例中，化合物靶向肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、骨、肠内衬、心脏或肺脏。在一些实施例中，化合物与靶向组织再生增加的器官的抗体缀合。

在一些实施例中，抗体与组织再生增加的器官的组织特异性抗原特异性结合。在一些实施例中，抗体靶向肝脏。在一些实施例中，化合物是毒素。在一些实施例中，化合物选自由以下构成的组：硫代乙酰胺、衣霉素、PhenolaTi、玉米赤霉烯酮、志贺毒素-2、四氯化碳(CCL4)和对乙酰氨基酚。在一些实施例中，化合物是化学治疗剂。在一些实施例中，化合物不是诱导铁依赖性细胞分解的化合物。在一些实施例中，靶细胞是肝脏细胞，并且组织是肝脏组织；靶细胞是肾脏细胞，并且组织是肾脏组织；靶细胞是肺脏细胞，并且组织是肺脏组织；靶细胞是肌肉细胞，并且组织是肌肉组织；靶细胞是骨细胞，并且组织是骨组织；靶细胞是胰腺细胞，并且组织是胰腺组织；靶细胞是心脏细胞，并且组织是心脏组织；靶细胞是肠内衬细胞，并且组织是肠内衬；靶细胞是皮肤细胞，并且组织是皮肤组织；靶细胞是CNS的细胞，并且组织是CNS组织；靶细胞是上皮细胞，并且组织是上皮；或者靶细胞是内皮细胞，并且组织是内皮。在一些实施例中，靶细胞在组织再生增加的器官或组织中。在一些实施例中，靶细胞在与组织再生增加的器官或组织邻接的组织中。在一些实施例中，靶细胞选自由以下构成的组：上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞是单核细胞或巨噬细胞。

附图说明

图1显示了实例1中描述的小鼠部分肝切除肝脏再生研究的给药和样品收集时间表。

图2A和2B分别显示了假手术(sham)小鼠或用条件培养液(CM)或HGF质粒处理的小鼠在第2天和第4天时的肝脏重量。柱从左至右为假手术、CM0、HGF质粒、CM1、CM2、CM3、CM5、CM6和CM7。

图3A和3B分别显示了假手术小鼠或用条件培养液(CM)或HGF质粒处理的小鼠在第2天和第4天时的肝脏指数。柱从左至右为假手术、CM0、HGF质粒、CM1、CM2、CM3、CM5、CM6和CM7。

图4显示了假手术小鼠或用CM0或HGF质粒处理的小鼠的血浆中的HGF浓度。每一天从左到右的柱为假手术、CM0和HGF质粒。

图5显示了假手术小鼠或用CM或HGF质粒处理的小鼠在第2天时的脂肪变性评分。柱从左至右为假手术、CM0、HGF质粒、CM1、CM2、CM3、CM5、CM6和CM7。

图6A和6B分别显示了假手术小鼠或用CM或HGF质粒处理的小鼠在第2天和第4天时的坏死评分。柱从左至右为假手术、CM0、HGF质粒、CM1、CM2、CM3、CM5、CM6和CM7。

图7显示了假手术小鼠或用CM或HGF质粒处理的小鼠的H&E染色的代表性图像。

图8A和8B分别显示了假手术小鼠或用CM或HGF质粒处理的小鼠在第2天和第4天时的PCNA。柱从左至右为假手术、CM0、HGF质粒、CM1、CM2、CM3、CM5、CM6和CM7。

图9显示了假手术小鼠或用CM或HGF质粒处理的小鼠的PCNA染色的代表性图像。箭头指示阳性细胞。

图10A和10B分别显示了假手术小鼠或用CM或HGF质粒处理的小鼠在第2天和第4天时的Ki67水平。柱从左至右为假手术、CM0、HGF质粒、CM1、CM2、CM3、CM5、CM6和CM7。

图11显示了假手术小鼠或用CM或HGF质粒处理的小鼠的PCNA染色的代表性图像。箭头指示阳性细胞。

具体实施方式

本披露涉及增加受试者的器官中组织的再生的方法，该方法包括向该受试者施用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物，其中向该受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加该组织的再生。本披露还涉及处理组织、器官、类器官或器官培养物的方法，该方法包括在体外用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理组织、器官(例如，用于移植的器官)、类器官或器官培养物。

诸位申请人已经令人惊讶地表明，在肝脏损伤的小鼠模型中，由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子增加组织再生。因此，由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的施用可用于治疗将受益于组织再生增加的障碍。

I.定义

如本文所用，术语“非生物应激条件”是指不包括使细胞与病毒、细菌、真菌或其他活的生物接触的任何应激条件。合适的非生物应激条件包括但不限于如本文定义的环境应激条件和化学应激条件。

如本文所用，术语“生物应激条件”是指包括使细胞与病毒、细菌、真菌或其他活的生物接触的应激条件。在一些实施例中，生物应激条件包括用病毒、细菌、真菌或其他活的生物感染细胞。

如本文所用，术语“化学应激条件”是指包括使细胞与诱导这些细胞产生细胞周转因子的化合物接触的应激条件。合适的化合物包括但不限于小分子、核酸和蛋白质。

如本文所用，术语“环境应激条件”是指包括使细胞暴露于诱导这些细胞产生细胞周转因子的环境的应激条件。合适的环境应激条件包括但不限于营养物质剥夺、热、冷、辐射、缺氧、渗透压和pH应激。

术语“施用(administer、administering或administration)”包括将药物组合物或药剂递送至受试者的系统或递送至受试者内或上的特定区域的任何方法。

如本文所用，“组合施用”、“共同施用”或“组合疗法”应理解为使用分开的配制品或单一药物配制品施用两种或更多种活性剂，或以任何顺序连续施用，使得存在两种(或全部)活性剂在发挥其生物学活性方面重叠的时间段。本文预期一种活性剂(例如细胞周转因子)可改善第二治疗剂的活性，例如可使靶细胞对第二治疗剂的活性敏感或可与第二治疗剂具有协同作用。“组合施用”不要求同时、以相同的频率或通过相同的施用途径来施用药剂。如本文所用，“组合施用”、“共同施用”或“组合疗法”包括施用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物以及一种或多种另外的治疗剂。

如本文所用，“细胞周转”是指重新排列和散布细胞内物质并可能最终导致细胞死亡的动态过程。细胞周转包括从细胞中产生和释放细胞周转因子。

如本文所用，“细胞周转因子”是由经历细胞周转的细胞产生的分子和细胞片段，其最终从该细胞中释放并影响其他细胞的生物活性。细胞周转因子可包括蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、核酸、小分子和细胞片段(例如囊泡和细胞膜片段)。

如本文所用，“细胞周转通路基因”是指编码促进、诱导或以其他方式促成细胞周转通路的多肽的基因。

如本文所用，“萨诺传递(Thanotransmission)”是细胞之间的通讯，它是靶信号传导细胞中细胞周转通路激活的结果，该通路发信号通知应答细胞以进行生物应答。可在靶信号传导细胞中通过调节所述细胞中的细胞周转通路基因，通过例如病毒或其他基因疗法将促进这样的通路的基因递送至该靶信号传导细胞来诱导萨诺传递。细胞周转通路因此而被激活的靶信号传导细胞可通过由该信号传导细胞主动释放的因子，或通过在该信号传导细胞的细胞周转(例如，细胞死亡)期间暴露于应答细胞的信号传导细胞的细胞内因子来发信号通知该应答细胞。

如本文所用，术语“增加”(或“激活”)和“减少”是指相对于参考，调节分别产生参数的更大或更小的量、功能或活性。例如，在施用本文所述的制剂之后，参数(例如，组织再生、细胞增殖)相对于施用前该参数的量，可以在受试者中增加或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。通常，在施用已达到所叙述作用的时间，例如在开始治疗方案后至少一天、一周、一个月、3个月、6个月时，测量施用后的指标。类似地，临床前参数(如通过本文所述的制剂的测试哺乳动物中的组织再生)相对于施用前参数的量，可增加或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。

如本文所用，“小分子”是分子量小于1000Da的分子。在一些实施例中，小分子的分子量小于900、800、700、600或500Da。在某些实施例中，小分子不包括核酸分子。在某些实施例中，小分子不包括长度超过三个氨基酸的肽。

通过本发明的方法治疗的“受试者”可以意指人或非人动物，优选哺乳动物，更优选人。在某些实施例中，在使用本发明的方法开始治疗之前，受试者患有可检测的或经诊断的障碍。在实施例中，受试者是非人哺乳动物。在实施例中，受试者是非人哺乳动物，如非人灵长类动物(例如猴、猿)、有蹄类动物(例如牛、水牛、绵羊、山羊、猪、骆驼、美洲驼、羊驼、鹿、马、驴)、肉食动物(例如狗、猫)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠)或兔类动物(例如兔)。

“治疗有效量”意指当施用于患者以治疗障碍时足以对该障碍实现这种治疗的化合物的量。当施用用于预防障碍时，该量足以避免或延迟该障碍的发作。“治疗有效量”将根据化合物、障碍及其严重程度以及待治疗患者的年龄、体重等而变化。治疗有效量不需要是治愈性的。治疗有效量不需要预防障碍或病症永不发生。相反，治疗有效量是将至少延迟或减少疾病或病症的发作、严重程度或进展的量。

如本文所用，“治疗(treatment、treating)”及其同源词是指旨在改善、缓解、稳定、预防或治愈疾病、病理状况或障碍的受试者的医学管理。该术语包括活性治疗(旨在改善疾病、病理状况或障碍的治疗)、病因治疗(针对相关疾病、病理状况或障碍的原因的治疗)、姑息治疗(设计用于缓解症状的治疗)、预防性治疗(旨在最大程度减少或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍发展的治疗)；以及支持治疗(用于补充另一疗法的治疗)。

II.细胞周转与细胞周转因子的产生

细胞周转是动态过程，其重新排列和散布细胞内的物质，并导致产生和释放可能对其他细胞的生物学活性产生深远影响的细胞周转因子。细胞周转可发生在受调节的细胞死亡的过程期间，并受多种分子机制控制。不同类型的细胞周转导致产生不同的细胞周转因子，并从而介导不同的生物学作用，例如组织再生。例如，诸位申请人已经令人惊讶地表明，细胞暴露于应激条件(例如，用硫代乙酰胺处理)可导致在体内增加组织再生的细胞周转因子的产生。

可导致增加组织再生的细胞周转因子的产生和释放的细胞周转通路包括但不限于坏死性凋亡(例如，线粒体通透性转换(MPT)驱动的坏死性凋亡)、凋亡(例如，外在凋亡或内在凋亡)、铁死亡、细胞焦亡、NETotic细胞死亡、ETotic细胞死亡、细胞侵入性细胞死亡、PARP1依赖性细胞死亡(parthanotos)、炎性细胞死亡、自噬依赖性细胞死亡、溶酶体依赖性细胞死亡、和氧自由基诱导死亡、及其组合，如下所述。

坏死性凋亡

在某些实施例中，细胞暴露于应激条件诱导细胞的坏死性凋亡(例如，MPT驱动的坏死性凋亡)。如本文所用，术语“坏死性凋亡”是指受体相互作用蛋白激酶3(RIP1-和/或RIPK3)/混合谱系激酶样(MLKL)依赖性坏死。几种损害导致线粒体内膜突然失去渗透稳态，从而启动被称为线粒体通透性转换(MPT)驱动的坏死性凋亡的受调节的坏死性凋亡的变体。几种触发因素可诱导坏死性凋亡，包括烷基化DNA损伤、兴奋毒素、和死亡受体的连接。例如，当通过遗传操纵(例如，通过基因敲除或RNA干扰(RNAi))抑制或通过药理学试剂(例如，化学半胱天冬酶抑制剂)阻断半胱天冬酶(并且特别是半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-10)时，RIPK3使MLKL磷酸化，从而导致MLKL组装到膜孔中，这最终激活坏死性细胞死亡的执行。参见Galluzzi等人,2018,Cell Death Differ.[细胞死亡与分化]3月；25(3):486–541，将其通过引用以其全文并入本文。

几种方法在本领域中是已知的，并且可用于鉴定经历坏死性凋亡的细胞，并通过检测特定标志物与其他类型的细胞周转和/或细胞死亡区分开。这些包括RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化，其通过抗体检测这些翻译后修饰，典型地通过细胞的免疫印迹或免疫染色。坏死性凋亡可通过不存在半胱天冬酶激活、快速膜透化、MLKL再定位至膜、RIPK3和MLKL蓄积成洗涤剂不溶性部分、RIPK3/MLKL复合物形成和MLKL寡聚化来区别于凋亡和细胞焦亡。坏死性凋亡可通过对RIPK3和MLKL两者以及它们的激活的要求而在遗传和药理学上定义。

凋亡

在某些实施例中，细胞暴露于应激条件诱导细胞的凋亡。凋亡是半胱天冬酶驱动的程序性细胞死亡过程，其导致DNA片段化、细胞骨架和核蛋白降解、蛋白质交联、凋亡小体形成、吞噬细胞受体的配体表达和吞噬细胞摄取。

在某些实施例中，细胞暴露于应激条件诱导细胞的外在凋亡。如本文所用，术语“外在凋亡”是指由特异性跨膜受体感知和传播的细胞外应激信号诱导的凋亡性细胞死亡的实例。外在凋亡可通过配体如FAS/CD95配体(FASL/CD95L)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和TNF(配体)超家族成员10(TNFSF10，最常被称为TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL))与多种死亡受体(即，分别为FAS/CD95、TNFα受体1(TNFR1)和TRAIL受体(TRAILR)1-2)的结合来启动。可替代地，外在促凋亡信号可由所谓的“依赖性受体”(包括netrin受体(例如，UNC5A-D和在结直肠癌中缺失(DCC)))发出，其仅在其特异性配体的浓度降到临界阈值水平以下时发挥致死功能。参见Galluzzi等人,2018,Cell Death Differ.[细胞死亡与分化]3月；25(3):486–541，将其通过引用以其全文并入本文。

几种方法在本领域中是已知的，并且可用于鉴定经历凋亡的细胞，并通过检测特定标志物与其他类型的细胞周转和/或细胞死亡区分开。凋亡需要半胱天冬酶激活，并且可通过半胱天冬酶激活的抑制剂来抑制和/或通过半胱天冬酶(如半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-9)的不存在来预防死亡。半胱天冬酶激活通过切割特异性底物如PARP和DFF45以及超过600种另外的蛋白质而系统地分解细胞。随着磷脂酰丝氨酸的外化和伴随的膜起泡，凋亡性细胞膜最初保持完整。线粒体外膜典型地被破坏而释放到胞质蛋白如CytoC和HTRA2中。核DNA被切割成离散的片段，这些片段可通过本领域已知的测定来检测。

铁死亡

在某些实施例中，细胞暴露于应激条件诱导细胞的铁死亡。如本文所用，术语“铁死亡”是指受调节的细胞死亡过程，该过程是铁依赖性的并且涉及活性氧物质的产生。在一些实施例中，铁死亡涉及脂质氢过氧化物的铁依赖性蓄积至致死水平。对铁死亡的敏感性与众多生物学过程紧密相关，这些过程包括氨基酸、铁和多不饱和脂肪酸代谢，以及谷胱甘肽、磷脂、NADPH和辅酶Q10的生物合成。铁死亡涉及代谢功能失调，其导致独立于线粒体、但在一些细胞环境中依赖NADPH氧化酶的胞质ROS和脂质ROS两者的产生(参见例如Dixon等人,2012,Cell[细胞]149(5):1060-72，将其通过引用以其全文并入本文)。

几种方法在本领域中是已知的，并且可用于鉴定经历铁死亡的细胞，并通过检测特定标志物与其他类型的细胞周转和/或细胞死亡区分开。(参见例如Stockwell等人,2017,Cell[细胞]171:273-285，将其通过引用以其全文并入本文)。例如，因为铁死亡可由致命的脂质过氧化引起，所以测量脂质过氧化提供了一种鉴定经历铁依赖性细胞分解的细胞的方法。C11-BODIPY和Liperfluo是亲脂性ROS传感器，可提供快速、间接的手段来检测脂质ROS(Dixon等人,2012,Cell[细胞]149:1060-1072)。液相色谱(LC)/串联质谱(MS)分析也可用于直接检测特定的氧化的脂质(Friedmann Angeli等人,2014,Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]16:1180-1191；Kagan等人,2017,Nat.Chem.Biol.[自然化学生物学]13:81-90)。异前列腺素和丙二醛(MDA)也可用于测量脂质过氧化(Milne等人,2007,Nat.Protoc.[自然实验手册]2:221-226；Wang等人,2017,Hepatology[肝脏病学]66(2):449-465)。用于测量MDA的试剂盒是可商购的(碧云天公司(Beyotime)，海门市(Haimen)，中国)。

用于研究铁死亡的其他有用的测定包括测量铁丰度和GPX4活性。可以使用电感耦合等离子体-MS或钙黄绿素AM淬灭以及其他特定的铁探针来测量铁丰度(Hirayama和Nagasawa,2017,J.Clin.Biochem.Nutr.[临床生物化学与营养学杂志]60:39-48；Spangler等人,2016,Nat.Chem.Biol.[自然化学生物学]12:680-685)，而GPX4活性可以使用LC-MS使用细胞裂解物中的磷脂酰胆碱过氧化氢还原来检测(Yang等人,2014,Cell[细胞]156:317-331)。另外，可以通过测量谷胱甘肽(GSH)含量来评估铁死亡。GSH可以例如通过使用可商购的GSH-Glo谷胱甘肽测定(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))来测量。

铁死亡也可以通过测量一种或多种标志物蛋白的表达来评估。合适的标志物蛋白包括但不限于谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)和环氧合酶2(COX-2)。可以使用本领域已知的合适技术来确定标志物蛋白或编码标志物蛋白的核酸的表达水平，这些技术包括但不限于聚合酶链反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、定量实时PCR、单链构象多态性分析(SSCP)、错配切割检测、异双链体分析、RNA印迹分析、蛋白质印迹分析、原位杂交、阵列分析、脱氧核糖核酸测序、限制片段长度多态性分析、及其组合或子组合。

细胞焦亡

在某些实施例中，细胞暴露于应激条件诱导细胞的细胞焦亡。如本文所用，“细胞焦亡”是指半胱天冬酶1、半胱天冬酶4或半胱天冬酶5依赖性程序性细胞死亡的固有炎性过程。细胞焦亡的最显著的生物化学特征是早期诱导的邻近介导的半胱天冬酶-1的激活。半胱天冬酶-1、4或5的细胞焦亡激活可在称为炎性体的多蛋白平台的背景下发生，炎性体涉及NOD样受体(NLR)或其他传感器，如胞质DNA传感器黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)，其募集促进半胱天冬酶-1激活的衔接蛋白ASC。半胱天冬酶-4/5可被LPS直接激活。在这两种情况下，活性半胱天冬酶-1催化热解白介素-1β(IL-1β)和IL-18的蛋白水解成熟和释放。此外，在一些(但不是全部)情况下，半胱天冬酶激活靶向GSDM-D以驱动膜破裂和细胞死亡。参见Galluzzi等人,2018,Cell Death Differ.[细胞死亡与分化]3月；25(3):486–541。

几种方法在本领域中是已知的，并且可用于鉴定经历细胞焦亡的细胞，并通过检测特定标志物与其他类型的细胞周转和/或细胞死亡区分开。细胞焦亡需要半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-4或半胱天冬酶-5活性，并且通常伴随前IL-1b和/或前IL-18的加工、这些成熟细胞因子的释放以及GSDM-D的半胱天冬酶-1/4/5切割片段的膜透化。

另外的细胞周转通路

可导致增加组织再生的细胞周转因子的产生和释放的另外的细胞周转通路包括NETotic细胞死亡、ETotic细胞死亡、细胞侵入性细胞死亡、PARP1依赖性细胞死亡、炎性细胞死亡、自噬依赖性细胞死亡、溶酶体依赖性细胞死亡和氧自由基诱导死亡。

“NETotic细胞死亡”或“NETosis”是涉及中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的释放的细胞死亡形式，这些陷阱是加载有可捕获并杀死多种细菌、真菌和原生动物病原体的抗微生物分子的染色质结构。NET的释放是体内针对病原体的一线防御之一。参见Remijsen等人,2011,Cell Death&Differentiation[细胞死亡与分化]18:581–588。

“ETotic细胞死亡”或“ETosis”是涉及中性粒细胞和肥大细胞形成细胞外陷阱(ET)的细胞死亡通路，并且其是先天免疫应答中的重要机制。ET由带有捕获并杀死微生物的抗微生物肽和酶的染色质-DNA骨架组成。参见Wartha等人,2008,Science Signaling[科学信号传导]第1卷,第21期,第pe25页。

“细胞侵入性细胞死亡”或“细胞侵入性死亡”是涉及活细胞侵袭另一细胞的细胞质的细胞死亡通路。参见Overholtzer等人,2007,Cell[细胞]131(5):966–979。

“PARP1依赖性细胞死亡”是由聚(ADP-核糖)(PAR)的蓄积和来自线粒体的凋亡诱导因子(AIF)的核转位引起的程序性细胞死亡形式。参见David等人,2009,Front Biosci[生物科学前沿](Landmark编辑).2009；14:1116–1128。

“氧自由基诱导死亡”是将KEAP1的活性氧物质(ROS)传感能力与涉及PGAM5和AIFM1的细胞死亡通路连接起来的半胱天冬酶非依赖性细胞死亡通路。当细胞内ROS水平升高并与病原体相遇时，氧自由基诱导死亡具有抗炎性。参见Scaturro等人,2019,CurrentOpinion in Immunology[免疫学当前观点],第56卷,2019年2月,第37-43页。

通过应激条件诱导细胞周转和细胞周转因子的产生

本文提供的方法可涉及施用通过使细胞暴露于诱导细胞周转和细胞周转因子的产生的应激条件而产生的组合物。在一些实施例中，应激条件包括非生物应激条件，例如环境应激条件或化学应激条件。在一些实施例中，应激条件包括生物应激条件，例如使细胞与病毒、细菌、真菌或其他活的生物接触。

在一些实施例中，非生物应激条件包括环境应激条件或由其组成。适用于进行本发明的方法的环境应激条件包括但不限于营养物质剥夺、热、冷、辐射、缺氧、渗透压和pH应激。

适用于诱导细胞周转和产生细胞周转因子的营养物质剥夺可以包括在缺乏足够的营养物质以维持细胞生长的培养液中培养细胞，该培养液如Hank平衡盐溶液(HBSS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一个实施例中，营养物质剥夺包括硒缺乏或由其组成。

适用于诱导细胞周转和产生细胞周转因子的热应激条件可包括使细胞暴露于比该细胞的最佳培养温度(例如37℃)高至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、10、20、30、40或50℃的温度。适用于诱导细胞周转和产生细胞周转因子的冷应激条件可包括使细胞暴露于比该细胞的最佳培养温度(例如37℃)低至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、10、20、30、40或50℃的温度。

适用于诱导细胞周转和产生细胞周转因子的辐射应激条件可包括例如UV辐射、γ辐射、X射线、红外辐射或微波。用辐射处理细胞的方法是本领域已知的，并且描述于例如US2012/0045418中，将其通过引用以其全文并入本文。可以以例如至少10、20、30、40或50Gy对细胞进行辐照以诱导细胞分解。在一些实施例中，应激条件不包括辐射。在一些实施例中，应激条件不包括UV辐射、γ辐射、X射线、红外辐射或微波中的一种或多种。

缺氧是细胞被剥夺足够的氧气供应的条件。适用于诱导细胞周转和产生细胞周转因子的缺氧应激条件可包括使细胞暴露于比该细胞的最佳氧浓度低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的氧浓度。

可以通过向细胞的培养液中添加盐(例如NaCl)来增加渗透压。适用于诱导细胞周转和产生细胞周转因子的渗透压应激条件可包括使细胞暴露于比该细胞的最佳渗透压高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％的渗透压。

也可以通过使细胞暴露于比该细胞的最佳pH高或低的pH而在该细胞中诱导细胞周转和细胞周转因子的产生。细胞的培养液的pH可以通过向该培养液中添加酸或碱来调节。在一些实施例中，细胞的培养液的pH为至少5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5或8.0。在一些实施例中，细胞的培养液的pH为低于8.0、7.5、7.2、7.0、6.5、6.0、5.5或6.0。这些值中的任一个都可用于定义培养液的pH范围。例如，在一些实施例中，培养液的pH为6.5至7.2、7.5至8.0、或6.0至6.5。

在一些实施例中，非生物应激条件包括化学应激条件或由其组成。化学应激条件包括使细胞与诱导细胞周转并促进该细胞产生细胞周转因子的化合物接触。

诱导细胞周转并产生细胞周转因子的化合物可以包括小分子、核酸或蛋白质。如本文所用，“小分子”是分子量小于1000Da的分子。在一些实施例中，小分子的分子量小于900、800、700、600或500Da。在某些实施例中，小分子不包括核酸分子。在某些实施例中，小分子不包括长度超过三个氨基酸的肽。

诱导细胞周转的核酸可包括但不限于反义DNA分子、反义RNA分子、双链RNA、siRNA、cDNA或成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-cas)系统指导RNA。在一些实施例中，核酸编码当在细胞中表达时诱导细胞周转和细胞周转因子释放的蛋白质。在一些实施例中，核酸通过抑制细胞中一个或多个基因的表达来诱导细胞周转和细胞周转因子的释放。

诱导细胞周转的核酸包括与细胞中的靶序列互补的单链和双链(即，具有长度为至少15个核苷酸的互补区的核酸治疗剂)核酸两者。反义核酸治疗剂是典型地长度为约16至30个核苷酸的单链核酸治疗剂，并且其与细胞中的靶核酸序列互补。

在一些实施例中，诱导细胞周转的核酸是单链反义RNA分子。反义RNA分子与靶mRNA内的序列互补。反义RNA可以通过与mRNA碱基配对并物理性地阻碍翻译机制以化学计量的方式抑制翻译，参见Dias,N.等人,(2002)Mol Cancer Ther[分子癌症疗法]1:347-355。反义RNA分子可具有与靶mRNA互补的约15-30个核苷酸。针对反义核酸、化学修饰和治疗性用途的专利包括例如：美国专利号5,898,031，其涉及含化学修饰的RNA的治疗性化合物；美国专利号6,107,094，其涉及使用这些化合物作为治疗剂的方法；美国专利号7,432,250，其涉及通过施用单链化学修饰的RNA样化合物来治疗患者的方法；以及美国专利号7,432,249，其涉及含有单链化学修饰的RNA样化合物的药物组合物。美国专利号7,629,321涉及使用具有多个RNA核苷和至少一个化学修饰的单链寡核苷酸切割靶mRNA的方法。将本段中列出的每一个专利的全部内容通过引用并入本文。

诱导细胞周转的核酸还包括双链核酸治疗剂。如本文中可互换使用的，“RNAi药剂”、“双链RNAi药剂”、双链RNA(dsRNA)分子，也称为“dsRNA药剂”、“dsRNA”、“siRNA”、“iRNA药剂”是指具有双链体结构的核糖核酸分子的复合物，该双链体结构包含两条反平行且基本上互补(如下文所定义)的核酸链。如本文所用，RNAi药剂还可以包括dsiRNA(参见例如，美国专利公开20070104688，将其通过引用并入本文)。通常，每条链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但是如本文所述，每条链或两条链也可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。另外，如本说明书中所用，“RNAi药剂”可包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi药剂可包括在多个核苷酸处的实质性修饰。这样的修饰可以包括本文披露的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书及权利要求书的目的，如在siRNA类型分子中所用，任何这样的修饰由“RNAi药剂”涵盖。在本发明的方法中使用的RNAi药剂包括具有如例如在WO/2012/037254和WO 2009/073809中披露的化学修饰的药剂，将每一个文献的全部内容通过引用并入本文。

诱导细胞周转的蛋白质可包括抑制细胞中的一种或多种蛋白质的活性的蛋白质，例如单克隆或多克隆抗体。如本文所用，术语“抗体”是指由四条多肽链、两条重(H)链和两条轻(L)链构成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其任何功能性片段、突变体、变体或衍生物。这样的突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。在全长抗体中，每条重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插有更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类别的免疫球蛋白分子。在一些实施例中，抗体是全长抗体。在一些实施例中，抗体是鼠抗体。在一些实施例中，抗体是人抗体。在一些实施例中，抗体是人源化抗体。在其他实施例中，抗体是嵌合抗体。嵌合抗体和人源化抗体可以通过本领域技术人员熟知的方法制备，这些方法包括CDR接枝方法(参见例如，美国专利号5,843,708、6,180,370、5,693,762、5,585,089、和5,530,101)、链混编策略(参见例如，美国专利号5,565,332；Rader等人(1998)PROC.NAT’L.ACAD.SCI.USA[美国国家科学院院刊]95:8910-8915)、分子建模策略(美国专利号5,639,641)等。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)是指抗体的保留特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。这样的抗体实施例也可以是双特异性、二重特异性或多特异性形式；与两种或更多种不同的抗原特异性结合。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含由二硫桥在铰链区处连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人(1989)NATURE[自然]341:544-546；和WO 90/05144A1，将其内容通过引用并入本文)，其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过使它们能够形成为单一蛋白链的合成接头来相连，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)SCIENCE[科学]242:423-426；和Huston等人(1988)PROC.NAT’L.ACAD.SCI.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。这样的单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。也涵盖其他形式的单链抗体，如双抗体。抗原结合部分也可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,NatureBiotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。

如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，每个可变区命名为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所用，术语“CDR组”是指能够结合抗原的单个可变区中存在的三个CDR的组。这些CDR的确切边界已根据不同的系统进行了不同的定义。由Kabat描述的系统(Kabat等人,SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICAL INTEREST[免疫学感兴趣的蛋白质的序列](国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health),马里兰州贝塞斯达市(Bethesda,Md.)(1987)和(1991))不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了定义三个CDR的精确的残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia及其同事发现Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性(Chothia等人(1987)J.MOL.BIOL.[分子生物学杂志]196:901-917，和Chothia等人(1989)NATURE[自然]342:877-883)。这些子部分被命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDR，其边界与Kabat CDR重叠。定义与KabatCDR重叠的CDR的其他边界描述于Padlan等人(1995)FASEB J.[美国实验生物学会联合会杂志]9:133-139，和MacCallum等人(1996)J.MOL.BIOL.[分子生物学杂志]262(5):732-45。还有其他CDR边界定义可能并不严格遵循上述系统之一，但仍会与Kabat CDR重叠，尽管根据以下预测或实验发现，它们可以被缩短或延长：特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合。尽管优选的实施例使用Kabat或Chothia定义的CDR，但是本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一个定义的CDR。

在一些实施例中，诱导细胞周转的化合物是免疫缀合物或抗体药物缀合物。如本文所用，术语“免疫缀合物”或“抗体药物缀合物”是指抗体或其抗原结合片段与另一药剂如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针等的连接。连接可以是共价键、或非共价相互作用，如通过静电力。为了形成免疫缀合物，可以使用本领域已知的各种接头。另外，可以以融合蛋白的形式提供免疫缀合物，该融合蛋白可从编码该免疫缀合物的多核苷酸表达。如本文所用，“融合蛋白”是指通过最初编码单独的蛋白质(包括肽和多肽)的两个或更多个基因或基因片段的连接而产生的蛋白质。融合基因的翻译产生具有源自每个最初蛋白质的功能特性的单个蛋白质。

Fab(片段抗原结合)抗体片段是包含抗体的单价抗原结合结构域的免疫反应性多肽，其由以下组成：由重链可变区(V_H)和重链恒定区1(C_H1)部分组成的多肽以及由轻链可变(V_L)和轻链恒定(C_L)部分组成的多肽，其中C_L和C_H1部分优选地通过Cys残基之间的二硫键结合在一起。

在一些实施例中，诱导细胞周转的化合物是抗肿瘤剂。适用于在本文披露的方法中使用的抗肿瘤剂包括但不限于化学治疗剂(例如，烷化剂，如六甲蜜胺、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、洛莫司汀、美法仑、奥沙利铂、替莫唑胺、噻替派；抗代谢物，如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)；卡培他滨阿糖胞苷/>氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨/>羟基脲、氨甲蝶呤、培美曲塞/>抗肿瘤抗生素，如蒽环类(例如柔红霉素、多柔比星表柔比星、依达比星)、放线菌素-D、博来霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌(还用作拓扑异构酶II抑制剂)；拓扑异构酶抑制剂，如托泊替康、伊立替康(CPT-11)、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、米托蒽醌(还用作抗肿瘤抗生素)；有丝分裂抑制剂，如多西他赛、雌莫司汀、伊沙匹隆、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春瑞滨；皮质类固醇，如泼尼松、甲基泼尼松/>地塞米松/>；酶，如L-天冬酰胺酶和硼替佐米/>)。抗肿瘤剂还包括生物抗癌剂，例如抗TNF抗体，例如阿达木单抗或英夫利昔单抗；抗CD20抗体(如利妥昔单抗)、抗VEGF抗体(如贝伐珠单抗)；抗HER2抗体，如曲妥珠单抗；抗RSV，如帕利珠单抗。

在一些实施例中，诱导细胞周转的化合物是毒素，例如，诱导ER应激和/或未折叠蛋白反应的毒素。诱导ER应激和/或未折叠蛋白反应的毒素是本领域已知的，并在本文中描述。在一些实施例中，诱导细胞周转的化合物不是诱导铁依赖性细胞周转(例如铁死亡)的药剂。

在一些实施例中，应激条件包括生物应激条件。在一些实施例中，生物应激条件选自病毒感染(例如使用天然存在的病毒)、细菌感染和真菌感染。

在一些实施例中，病毒选自由以下构成的组：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、人疱疹病毒1(HHV-1)、HHV-2、HHV-3、HHV-4、HHV-5、HHV-6、HHV-7、HHV-8、人乳头瘤病毒(HPV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、HIV、SARS-CoV-2、登革病毒、基孔肯亚病毒、寨卡病毒、诺沃克病毒和西尼罗病毒。

在一些实施例中，细菌选自由以下构成的组：结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(例如，耐多药结核分支杆菌(MDR-TB))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))和引起细菌性脑膜炎的细菌。引起细菌性脑膜炎的细菌包括但不限于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)。

本文所述的应激条件可对诱导细胞产生细胞周转因子的细胞具有多种影响。例如，在一些实施例中，应激条件诱导细胞经历本文所述的任何细胞周转通路，例如坏死性凋亡、凋亡、铁死亡、细胞焦亡、及其组合。在特定的实施例中，应激条件诱导细胞经历凋亡(例如，外在凋亡)。

在一些实施例中，应激条件(例如，如本文所述的诱导细胞周转的化合物)在经历细胞周转的细胞中诱导内质网(ER)应激。ER是真核生物中蛋白质折叠和成熟的重要位点。在ER内合成蛋白质的细胞要求与其折叠能力匹配。然而，生理需求或折叠中的异常可能导致失衡，该失衡可能导致错误折叠的蛋白质的蓄积，也称为“ER应激”。ER应激是慢性和急性肝脏疾病进展中、尤其是肝纤维化的进展和恢复中的重要机制。过度和长期的ER应激诱导凋亡，这被认为是肝纤维化发展的重要通路。

ER应激可以包括未折叠蛋白反应。未折叠蛋白反应(UPR)是在经历ER应激的细胞中重新调节ER折叠能力以恢复蛋白质稳态的细胞信号传导系统。参见Adams等人,2019,Mol.Biosci.[分子生物科学]6(11):1-12。在一些实施例中，应激条件(例如，如本文所述的诱导细胞周转的化合物)在经历细胞周转的细胞中诱导未折叠蛋白反应。

在一些实施例中，应激条件在经历细胞周转的细胞中诱导活性氧物质(ROS)的产生。在一些实施例中，靶细胞中ROS的产生处于足以诱导经历细胞周转的细胞的死亡的水平。

诱导ER应激和/或未折叠蛋白反应的化合物包括但不限于硫代乙酰胺、衣霉素、PhenolaTi、玉米赤霉烯酮、志贺毒素-2、四氯化碳(CCL4)和对乙酰氨基酚。在特定的实施例中，诱导细胞周转的药剂是硫代乙酰胺。

硫代乙酰胺是在小鼠模型中诱导肝硬化和ER应激的有机硫化合物(C₂H₅NS)。参见Su等人,2020,World J Gastroenterol.[世界胃肠病学杂志]7月28日；26(28):4094–4107。

衣霉素是同源核苷抗生素的混合物，其抑制UDP-HexNAc：聚异戊烯醇-P HexNAc-1-P酶家族。在真核生物中，这包括GlcNAc磷酸转移酶(GPT)，其在糖蛋白合成的第一步中催化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸从UDP-N-乙酰葡糖胺转移到磷酸长萜醇。衣霉素阻断N-连接的糖基化(N-聚糖)，并且用衣霉素处理培养的人细胞导致细胞周期停滞在G1期。还表明了其诱导未折叠蛋白反应。参见Chan等人,2005,FASEB journal[美国实验生物学会联合会杂志],第19卷,第11期:1510-1512。

PhenolaTi是基于钛(IV)的化合物(双(苯酚根合)双(烷氧基)Ti(IV))，其用作无毒的抗癌药物。PhenolaTi诱导MCF7乳腺癌细胞的凋亡和在G2/M期处的细胞周期停滞，并且基因表达研究支持ER作为PhenolaTi的推定细胞靶标。参见Miller等人,2020,iScience[i科学]23(7):101262。PhenolaTi具有以下结构：

已证明硒缺乏通过引发更具侵袭性的ER应激而加重毒素诱导的大鼠心肌细胞损伤。参见Xu等人,2018,Chem Biol Interact[化学-生物相互作用].285:96-105。

玉米赤霉烯酮(ZEA)是来自镰刀菌属(Fusarium)物种的真菌毒素，其常见于许多食品中，并已知其发挥雌激素活性，这些活性可能导致生殖功能失调。已证明玉米赤霉烯酮经由小鼠的ER应激-自噬-氧化应激通路改变细胞骨架结构。参见Zheng等人,2020,SciRep.[科学报告]8(1):3320，公布的校正见于Sci Rep.[科学报告]2020年6月25日；10(1):10658中。

志贺毒素-2由肠出血性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)产生，并负责诱导ER应激和肾脏损伤。毒素的A亚基损伤真核生物核糖体，并停止靶细胞中的蛋白质合成。内质网(ER)应激反应被假设为诱导凋亡，从而促进器官损伤。参见Parello等人,2015,Toxins[毒素]7(1):170-186。

四氯化碳(CCl₄)诱导毒素介导的肝纤维化。该毒素在肝脏中通过细胞色素P450系统代谢，形成三氯甲基自由基(CCl₃*)。该侵袭性自由基化学攻击核酸、蛋白质和脂质，干扰脂质代谢和稳态，并引发肝的脂肪变性。还证明了CCl4诱导ER应激。参见Borkham-Kamphorst等人,2020,International Journal of Molecular Sciences[国际分子科学杂志]21(15):5230。

对乙酰氨基酚过量给药是美国药物诱导的肝衰竭的主要原因。已知对乙酰氨基酚的肝脏毒性是由细胞色素P450产生的活性代谢物N-乙酰苯并醌亚胺引起的。研究已经证明了ER应激在对乙酰氨基酚诱导的肝脏毒性中的作用。参见Chen等人,2014,J Environ SciHealth CEnviron Carcinog Ecotoxicol Rev.[环境科学与健康杂志C部分：环境致癌作用与生态毒理学综述]32(1):83–104。

当以足够的量或强度存在并持续足够的时间段时，这样的应激条件能够诱导细胞周转的过程。在某些实施例中，诱导细胞周转的应激条件诱导细胞周转因子(例如，促进组织再生的细胞周转因子)的产生，但不导致细胞死亡。在一些实施例中，应激条件在细胞群体中的一部分(例如，该群体的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞)中诱导细胞周转，使得该细胞群体中的该部分细胞产生细胞周转因子(例如，促进组织再生的细胞周转因子)。细胞死亡可能发生在该细胞群体中的该部分细胞的全部或仅部分中。

根据本发明的方法，使细胞暴露于应激条件持续足够的时间以诱导细胞周转因子的产生。在一些实施例中，使细胞暴露于应激条件持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或60分钟。在一些实施例中，使细胞暴露于应激条件持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48、60或72小时。

可以使任何类型的细胞暴露于本文所述的应激条件用于产生细胞周转因子。合适的细胞包括但不限于：肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、肌肉细胞、骨细胞、肠内衬细胞、心脏细胞、肺脏细胞、皮肤细胞、神经元、中枢神经系统(CNS)的细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。在一些实施例中，上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞或免疫细胞来自肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、骨、肠内衬、心脏、肺脏、皮肤或中枢神经系统。在一些实施例中，肝脏细胞是肝细胞、肝星形细胞、库普弗细胞或肝窦间隙内皮细胞。在一些实施例中，肝脏细胞包含肝细胞、肝星形细胞、库普弗细胞或肝窦间隙内皮细胞中的一种或多种。在一些实施例中，肝脏细胞包含肝细胞。在一些实施例中，肝脏细胞是肝细胞。

在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞来自出现组织再生的相同类型的组织。例如，在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞是肝脏细胞，并且出现组织再生的组织是肝脏组织；暴露于应激条件的细胞是肾脏细胞，并且出现组织再生的组织是肾脏组织；暴露于应激条件的细胞是肺脏细胞，并且出现组织再生的组织是肺脏组织；暴露于应激条件的细胞是肌肉细胞，并且出现组织再生的组织是肌肉组织；暴露于应激条件的细胞是骨细胞，并且出现组织再生的组织是骨组织；暴露于应激条件的细胞是胰腺细胞，并且出现组织再生的组织是胰腺组织；暴露于应激条件的细胞是心脏细胞，并且出现组织再生的组织是心脏组织；或者暴露于应激条件的细胞是肠内衬细胞，并且出现组织再生的组织是肠内衬；暴露于应激条件的细胞是皮肤细胞，并且出现组织再生的组织是皮肤组织；暴露于应激条件的细胞是CNS的细胞，并且出现组织再生的组织是CNS组织；暴露于应激条件的细胞是上皮细胞，并且出现组织再生的组织是上皮；或者暴露于应激条件的细胞是内皮细胞，并且出现组织再生的组织是内皮。

在其他实施例中，暴露于应激条件的细胞不来自出现组织再生的相同类型的组织。

在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞是癌细胞，例如肉瘤、黑色素瘤、癌、白血病或淋巴瘤的细胞。

术语“肉瘤”通常是指由像胚胎结缔组织的物质构成的肿瘤，并且通常由嵌入纤维状或均质物质中的紧密堆积的细胞组成。可以暴露于应激条件的肉瘤细胞的实例包括例如来自以下的细胞：软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、阿贝西米肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、威尔姆斯瘤肉瘤(Wilms'tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素性出血肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、詹恩逊氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网织红细胞肉瘤、鲁斯氏肉瘤(Rous sarcoma)、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、子宫肉瘤、粘液性脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、梭形细胞肉瘤、促结缔组织增生肉瘤和毛细血管扩张肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。

术语“黑色素瘤”意指源自皮肤和其他器官的黑色素细胞系统的肿瘤。可以用暴露于应激条件的黑色素瘤细胞包括例如来自以下的细胞：肢端雀斑样痣黑色素瘤(acral-lentiginous melanoma)、无黑色素性黑色素瘤、良性青少年黑色素瘤、Cloudman黑色素瘤、S91黑色素瘤、Harding-Passey黑色素瘤、青少年黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、舌下黑色素瘤和浅表扩散性黑色素瘤。

术语“癌”是指由上皮细胞构成的恶性新生长，趋于浸润周围组织并引起转移。如本文所述，可以暴露于应激条件的癌细胞包括例如来自以下的细胞：腺泡癌、腺癌、腺囊癌、腺样囊性癌、腺瘤癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底上皮细胞癌、基底样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、支气管癌、支气管源性癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒膜上皮癌、胶样癌(colloid carcinoma)、结肠的结肠腺癌、粉刺性癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬脑膜癌、胚胎性癌、脑样癌(encephaloidcarcinoma)、上皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性胃癌(carcinoma ex ulcere)、纤维癌、胶样癌(gelatiniformcarcinoma)、胶状癌、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、粒层细胞癌、发母质癌、多血癌、肝细胞癌、许特耳氏细胞癌(Hurthle cell carcinoma)、透明癌(hyalinecarcinoma)、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩切氏癌(Krompecher'scarcinoma)、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticularcarcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinomamedullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素性癌、软癌(carcinoma molle)、默克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)、粘液性癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatode)、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌(carcinoma ossifican)、骨样癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、脑样癌(pultaceous carcinoma)、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、阴囊癌(carcinoma scroti)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、茄状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌(carcinoma spongiosum)、鳞状细胞癌(squamouscarcinoma)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌(verrucous carcinoma)、宫颈鳞状细胞癌、扁桃体鳞状细胞癌和绒毛状癌。

术语“白血病”是指以未成熟白细胞(称为“母细胞”)的异常增加为特征的血液或骨髓的癌症类型。白血病是覆盖广泛疾病的广义术语。反过来，它是影响血液、骨髓和淋巴系统的甚至更广泛疾病组的一部分，这些疾病都被称为血液赘生物。白血病可分为四个主要类别：急性淋巴细胞(或淋巴母细胞)白血病(ALL)、急性骨髓性(或髓系或非淋巴细胞)白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)。白血病的另外的类型包括毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞白血病和成人T细胞白血病。在某些实施例中，白血病包括急性白血病。在某些实施例中，白血病包括慢性白血病。

术语“淋巴瘤”是指从淋巴细胞发展而来的一组血细胞肿瘤。淋巴瘤的两个主要类别是霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。淋巴瘤包括淋巴组织的任何赘生物。主要类别是淋巴细胞的癌症，淋巴细胞是既属于淋巴液又属于血液并遍及两者的白细胞类型。

在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞来自多种类型的实体瘤，例如乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、膀胱癌、泌尿生殖道癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、肾(肾细胞)癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌(例如甲状腺乳头状癌)、皮肤癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、口癌和口腔癌、食道癌、腺样囊性癌、神经母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌、甲状腺癌、头颈癌、肾癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌、子宫颈癌、髓母细胞瘤和外阴癌。在某些实施例中，皮肤癌包括黑色素瘤、鳞状细胞癌和皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。

在一个实施例中，癌细胞是永生化的。在一个实施例中，癌细胞是从受试者分离的原代细胞。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞不包含癌细胞。

在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞是免疫细胞，包括但不限于以下中的任一种或多种：肥大细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞(例如B-淋巴细胞(B-细胞))和T-淋巴细胞(T-细胞))。在其他实施例中，暴露于应激条件的细胞不包含免疫细胞。

在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞是血细胞，例如红细胞、白细胞(例如外周血单核细胞(PBMC))或血小板。在其他实施例中，暴露于应激条件的细胞不包含血细胞。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞不包含白细胞。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞不包含外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞不包含T-细胞。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞不包含恶性T-细胞。

暴露于应激条件的细胞的来源不受限制，并且可以包括从施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物的靶组织、器官或受试者分离的细胞。例如，在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞对于施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物的组织、器官或受试者是自体的。在一些实施例中，暴露于应激条件的细胞对于施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物的组织、器官或受试者是同种异体的。

包含细胞周转因子的组合物

根据本文提供的方法，除了一种或多种细胞周转因子外，包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物还可含有多种组分，这取决于例如制备该组合物的方法。例如，在一些实施例中，除了一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子外，组合物还包含这些细胞，例如，这些细胞包括一种或多种细胞周转因子。在其他实施例中，可以使暴露于应激条件的细胞与一种或多种细胞周转因子分离以制备组合物。例如，在一些实施例中，组合物包含从暴露于应激条件的细胞制备的无细胞提取物，例如，该无细胞提取物包含一种或多种细胞周转因子。例如，可以通过对悬浮在培养液中的细胞进行离心并收集上清液来制备无细胞提取物。在一个实施例中，包含一种或多种细胞周转因子的组合物不包含暴露于应激条件的细胞。在一个实施例中，包含一种或多种细胞周转因子的组合物不包含完整的细胞。

包含一种或多种细胞周转因子的组合物可以通过在培养液中培养细胞并使这些细胞暴露于如本文所述的应激条件来制备。在一个实施例中，在暴露于应激条件后，从细胞培养物中收集含有一种或多种细胞周转因子的条件培养液。在暴露于应激条件后，可以进一步培养细胞以允许释放另外的细胞周转因子。在一些实施例中，在暴露于应激条件后，培养细胞持续至少5、10、15、20、30、45或60分钟，或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48或72小时。在一个实施例中，组合物包含来自暴露于应激条件的细胞的条件培养液。在一个实施例中，从暴露于应激条件的细胞中分离一种或多种细胞周转因子，使得包含一种或多种细胞周转因子的组合物不含有完整的细胞。

可以将包含一种或多种细胞周转因子的组合物分级以分离或浓缩一种或更多种具有组织再生活性的细胞周转因子。例如，在一个实施例中，组合物包含来自暴露于应激条件的细胞的条件培养液的功能性级分。在一些实施例中，通过用酶(例如蛋白酶)处理条件培养液以降解该条件培养液中的特定类别的化合物(例如蛋白质)并增加其他分子(例如小分子和核酸)的相对丰度来制备功能性级分。合适的酶包括但不限于蛋白酶和核酸酶(例如RNA酶或DNA酶)。在一些实施例中，包含一种或多种细胞周转因子的功能性级分对蛋白酶消化或核酸酶消化(例如，RNA酶消化或DNA酶消化)具有抗性。在一些实施例中，一种或多种细胞周转因子对蛋白酶消化或核酸酶消化(例如，RNA酶消化或DNA酶消化)具有抗性。

条件培养液的功能性级分也可以通过基于其分子量分离分子来制备。例如，在一些实施例中，从条件培养液中分离分子量小于50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0.5的细胞周转因子。在一些实施例中，从条件培养液中分离分子量小于50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0.5kDa的细胞周转因子。这些值中的任一个都可以用于定义组合物中一种或多种细胞周转因子的大小范围。例如，在一些实施例中，组合物中一种或多种细胞周转因子的分子量小于50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0.5kDa。在一些实施例中，组合物中的一种或多种细胞周转因子的分子量大于50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0.5kDa。在一些实施例中，组合物中的一种或多种细胞周转因子的分子量为0.5至50kDa、0.5至25kDa、25至50kDa、10至20kDa、20至30kDa、30至40kDa或40至50kDa。分离具有特定分子量的化合物的方法是本领域已知的。例如，在一些实施例中，将条件培养液用有机溶剂提取，然后进行HPLC分级。在其他实施例中，使条件培养液经受尺寸排阻色谱，并收集不同的级分。例如，可以将条件培养液施加到尺寸排阻柱上并在FPLC上进行分级。

可以评价条件培养液的功能性级分以鉴定具有特定活性(例如组织再生活性)的级分。例如，细胞增殖测定(如BrdU和MTT测定)可用于鉴定具有组织再生活性的条件培养液的级分。

BrdU细胞增殖测定使用抗BrdU抗体检测细胞增殖期间掺入细胞DNA中的5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)。当用含有BrdU的标记培养液培养细胞时，该嘧啶类似物代替胸苷掺入增殖细胞新合成的DNA中。去除标记培养液后，将细胞固定，并用我们的固定/变性溶液使DNA变性。然后添加BrdU小鼠mAb以检测掺入的BrdU。DNA的变性对于改善掺入的BrdU对检测抗体的可及性是必要的。然后使用抗小鼠IgG、HRP连接的抗体来识别结合的检测抗体。添加HRP底物TMB以显色。显色的吸光度的大小与掺入细胞中的BrdU的量成正比，这是细胞增殖的直接指示。

使用MTT测定来测量细胞代谢活性，作为细胞活力、增殖和细胞毒性的指标。该比色测定基于代谢活性细胞将黄色四唑盐(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物或MTT)还原为紫色甲瓒结晶。有活力的细胞含有NAD(P)H依赖性氧化还原酶，这些酶将MTT还原为甲瓒。使用增溶溶液将不溶性甲瓒结晶溶解，并通过使用多孔分光光度计测量500-600纳米处的吸光度来将所得的有色溶液定量。溶液越黑，有活力的代谢活性细胞的数目就越多。

用于鉴定具有组织再生活性的条件培养液的级分的另外的方法包括但不限于伤口愈合测定、基质出芽、transwell迁移测定、内皮细胞管形成测定和酶原测定-基质降解。在基质出芽中，培养内皮细胞，然后将其嵌入胶原基质中，并分析管的形成。参见Tetzlaff等人,2018,Bio-Protocol[生物学方案]8(17):e2995。可使用transwell细胞迁移测定来测量化合物或组合物对于细胞对化学引诱物的趋化能力的影响。还可以确定化合物或组合物对细胞迁移模式和细胞侵入3-D基质的能力的影响。参见Justus等人,2014,J Vis Exp.[可视化实验杂志](88):51046。

技术人员将认识到除了条件培养液的功能性级分的效用之外，还可以进一步分析该功能性级分以鉴定例如具有组织再生活性的单种细胞周转因子。在一些实施例中，组合物仅包含一种从暴露于应激条件的细胞中分离并具有组织再生活性的细胞周转因子。在一些实施例中，组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种从暴露于应激条件的细胞中分离并具有组织再生活性的细胞周转因子。在一些实施例中，组合物包含至少十种细胞周转因子，例如至少十种具有组织再生活性的细胞周转因子。在一些实施例中，组合物包含至少两种细胞周转因子，例如至少两种具有组织再生活性的细胞周转因子。在一些实施例中，组合物仅包含一种细胞周转因子，例如仅一种具有再生活性的细胞周转因子。

在一些实施例中，组合物被配制成靶向组织再生增加的器官。在一些实施例中，组合物被配制成靶向肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、肠内衬、心脏或肺脏。在一些实施例中，组合物被配制成靶向肝脏。在一些实施例中，组合物被配制成靶向肾脏。

III.增加组织再生的方法

A.施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物

本文所述的细胞周转因子可用于增加受试者(例如，将受益于组织再生增加的受试者)的组织或器官中的组织再生。因此，在一些方面，本披露涉及增加哺乳动物受试者的器官中组织的再生的方法，该方法包括向该受试者施用一定量的组合物并持续一定的时间，该量和该时间足以增加该组织的再生，其中该组合物通过以下制备：(a)使哺乳动物细胞暴露于应激条件，和(b)收集经暴露的细胞或来自这些经暴露的细胞的条件培养液以产生该组合物。在一些实施例中，应激条件是硫代乙酰胺。

在一些实施例中，暴露于应激条件的哺乳动物细胞选自由以下构成的组：肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、肌肉细胞、骨细胞、肠内衬细胞、心脏细胞、肺脏细胞、皮肤细胞、神经元、中枢神经系统的细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。在一些实施例中，暴露于应激条件的哺乳动物细胞是肝脏细胞(例如，肝细胞)。在一些实施例中，出现组织再生的器官是肝脏。在一些实施例中，肝脏具有损伤。在一些实施例中，受试者患有选自由以下构成的组的肝脏障碍：慢性肝损伤、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、药物性肝损伤、暴发性和晚发性肝衰竭(LOHF)、暴发性肝炎(FH)、肝硬化、肝纤维化、暴发性肝衰竭(FHF)、乙型肝炎和丙型肝炎。在特定的实施例中，暴露于应激条件的细胞是肝脏细胞(例如，肝细胞)，并且出现组织再生的器官是肝脏。在特定的实施例中，应激条件是硫代乙酰胺，暴露于应激条件的细胞是肝脏细胞(例如，肝细胞)，并且出现组织再生的器官是肝脏。

在某些方面，本披露还涉及将包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物递送至需要增加组织再生的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用该组合物。本披露进一步涉及增加受试者的器官中组织的再生的方法，该方法包括向该受试者施用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物，其中向该受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加该组织的再生。

在其他实施例中，在体外用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理组织或器官，然后将经处理的组织或器官移植至受试者内。例如，在一些方面，本披露涉及处理组织、器官、类器官或器官培养物的方法，该方法包括在体外用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理组织、器官、类器官或器官培养物。本披露还涉及制备用于移植至受试者的器官或组织的方法，该方法包括离体用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理器官或组织。本披露进一步涉及增加移植的器官或组织中的组织再生的方法，该方法包括离体用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理器官或组织，其中用一定量的组合物处理该器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以增加该器官或组织在移植至受试者后的组织再生。

在体外用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理组织或器官也可以与如本文所述的向受试者施用该组合物组合。例如，在一些实施例中，在体外用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理组织或器官，并且将该组织或器官移植至受试者内。可以进一步在移植后向接受移植的组织或器官的受试者施用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物，例如，以进一步增加移植的组织或器官中的组织再生。在一些实施例中，用于在体外处理组织或器官的、包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物是与在移植后向受试者施用的相同组合物。在其他实施例中，用于在体外处理组织或器官的、包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物不同于在移植后向受试者施用的、包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物。

可以以一定量施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物，该量足以实现对组织再生的希望的效果。例如，在一些实施例中，用一定量的组合物处理器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以增加该器官或组织在移植至受试者后的组织再生。在一些实施例中，用一定量的组合物处理器官或组织，相对于使用未用该组合物处理的器官或组织进行移植的受试者，该量足以在将该器官或组织移植至受试者后增加该受试者的存活率。在一些实施例中，用一定量的组合物处理器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以改善该器官或组织在移植至受试者后的植入。在一些实施例中，用一定量的组合物处理器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以延长该器官或组织在移植至受试者前的活力。

在一些实施例中，向受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以减少组织再生增加的组织中的坏死。在一些实施例中，向受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以减少组织再生增加的组织中的脂肪变性。在一些实施例中，向受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加组织再生增加的器官的重量。在一些实施例中，向受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加组织中的一种或多种细胞增殖标志物蛋白的表达。在一些实施例中，一种或多种细胞增殖标志物蛋白选自由增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki67构成的组。

在一些实施例中，相对于对应的未施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物的对照受试者，施用该包含一种或多种细胞周转因子的组合物使组织再生增加、存活率增加、植入改善、活力延长、组织再生增加的器官的重量增加、或一种或多种细胞增殖标志物蛋白的表达增加了至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些实施例中，相对于对应的未施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物的对照受试者，施用该包含一种或多种细胞周转因子的组合物使组织再生增加的组织中的坏死和/或脂肪变性减少了至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

在一些实施例中，相对于对应的未施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物的对照受试者群体，施用该包含一种或多种细胞周转因子的组合物使需要这样的治疗的受试者群体中的组织再生增加、存活率增加、植入改善、活力延长、组织再生增加的器官的重量增加、或一种或多种细胞增殖标志物蛋白的表达增加了至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些实施例中，相对于对应的未施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物的对照受试者群体，施用该包含一种或多种细胞周转因子的组合物使需要这样的治疗的受试者群体中的组织再生增加的组织中的坏死和/或脂肪变性减少了至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

在一些实施例中，器官(例如，肝脏、肺脏、胰腺、肾脏、心脏、肌肉、皮肤和胃肠道器官(例如，口、食道、胃、小肠、大肠和肛门))中的组织再生是通过在施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物之前和之后测量器官功能来确定的。下面描述作为确定组织再生的手段的测量器官功能的示例性方法。

肝脏

可以通过确定从受试者获得的样品中与肝脏功能相关的一种或多种化合物(例如蛋白质)的水平来测量受试者的肝脏功能。例如，可以在施用包含一种或更多种细胞周转因子的组合物之前和之后确定与肝脏功能相关的一种或多种化合物的水平，以测量该组合物对肝脏功能的影响。合适的样品包括但不限于实体组织(例如肝脏组织)、细胞(例如肝脏细胞)、全血、血清、血浆、唾液、尿和粪便。合适的与肝脏功能相关的化合物包括但不限于丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白、胆红素、γ-谷氨酰转移酶(GGT)和L-乳酸脱氢酶(LD)。

在一些实施例中，与肝脏功能相关的化合物的水平升高指示肝脏损伤，使得在用包含一种或多种细胞周转因子的组合物治疗后该化合物的水平降低指示肝脏功能和肝脏组织再生的改善。例如，ALT是在肝脏中发现的酶，其帮助将蛋白质转换为肝脏细胞的能量。当肝脏受损时，ALT被释放到血流中，并且水平升高。AST是帮助代谢氨基酸的酶。像ALT一样，AST正常以低水平存在于血液中。AST水平增加可能指示肝脏损伤、疾病或肌肉损伤。ALP是在肝脏和骨中发现的酶，并且对于分解蛋白质是重要的。ALP高于正常的水平可能指示肝脏损伤或疾病，如胆管阻塞或某些骨病。胆红素是红细胞正常分解期间产生的物质。胆红素通过肝脏并排泄在粪便中。胆红素水平升高(黄疸)可能指示肝脏损伤或疾病或某些类型的贫血。GGT是血液中的酶。高于正常的水平可能指示肝脏或胆管损伤。LD是在肝脏中找到的酶。LD的水平升高可能指示肝脏损伤。ALT、AST、ALP、胆红素、GGT和LD的水平升高指示肝脏损伤，在用包含一种或多种细胞周转因子的组合物治疗后这些化合物的水平降低指示肝脏功能和肝脏组织再生的改善。

在一些实施例中，与肝脏功能相关的化合物的水平降低指示肝脏损伤，使得在用包含一种或多种细胞周转因子的组合物治疗后该化合物的水平增加指示肝脏功能和肝脏组织再生的改善。例如，白蛋白是肝脏中产生的几种蛋白质之一，需要其来对抗感染和执行其他功能。白蛋白低于正常的水平可能指示肝脏损伤或疾病。因此，在施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物后白蛋白水平增加指示肝脏功能和肝脏组织再生的改善。

也可以通过确定血液中的总蛋白水平或凝血酶原时间(PT)来测量肝脏功能。血液中总蛋白水平的降低可以指示肝脏功能的降低。因此，在施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物后总蛋白水平增加指示肝脏功能和肝脏组织再生的改善。

凝血酶原时间(PT)也可用于测量肝脏功能。PT是血液凝结所需的时间。PT升高可能指示肝脏损伤，但其也可能被某些稀释血液的药物(如华法林)升高。因此，在施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物后PT降低指示肝脏功能和肝脏组织再生的改善。

肺脏

作为检测受试者的肺脏组织再生的手段，测量肺脏功能的方法包括但不限于肺量计法、肺容量测试、肺弥散量测试、脉搏血氧测量、动脉血气测试和呼气一氧化氮分数测试。可以在施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物之前和之后进行这些测试中的一种或多种以检测肺脏组织再生。

肺量计法测量气流速率并估计肺脏大小。在该测试中，你将通过连接至计算机的管道规律地并尽最大努力呼吸多次。一些受试者可能会由于所需的呼吸努力而感到头晕或疲劳。

肺容量测试是测量肺脏能容纳多少空气的最准确的方式。该程序类似于肺量计法，只是受试者将处于墙壁透明的小房间中。一些受试者可能会由于所需的呼吸努力而感到头晕或疲劳。

肺弥散量评估氧气从呼吸的空气中进入血液的程度。对于该测试，受试者通过管吸气和呼气几分钟，而不必剧烈呼吸。还可以对受试者抽血以测量血液中血红蛋白的水平。

脉搏血氧测量估计血液中的氧气水平。对于该测试，将探针放置在手指或另一皮肤表面(如耳)上。它不会引起疼痛，并且几乎没有或没有风险。

动脉血气测试直接测量血液中的气体(如氧气和二氧化碳)水平。动脉血气测试通常在医院进行，但也可以在医生办公室进行。对于该测试，从动脉(通常在测量脉搏的手腕中)取血，并确定血液中的气体水平。

呼气一氧化氮分数测试测量呼出的空气中有多少一氧化氮。对于该测试，受试者呼气到连接至便携式装置的管中，该装置测量一氧化氮的水平。该测试需要稳定但不剧烈的呼吸。它几乎没有或没有风险。

胰腺

作为检测受试者的胰腺组织再生的手段，测量胰腺功能的方法包括但不限于促胰液素胰腺功能测试和粪便弹性蛋白酶测试。也可以通过成像方法检测胰腺组织的再生，这些成像方法包括但不限于用造影染料进行的计算机断层扫描(CT)、腹部超声、内镜逆行胰胆管造影(ERCP)、内镜超声和磁共振胰胆管造影。可以在施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物之前和之后进行这些测试中的一种或多种以检测胰腺组织再生。

促胰液素胰腺功能测试测量胰腺对激素促胰液素的应答能力。小肠在部分消化的食物存在下产生促胰液素。正常情况下，促胰液素刺激胰腺分泌具有高浓度碳酸氢盐的液体。该液体中和胃酸，并且是允许许多酶在食物的分解和吸收中发挥作用所必需的。患有涉及胰腺的疾病(例如，慢性胰腺炎、囊性纤维化或胰腺癌)的人可能患有胰腺功能异常。在进行促胰液素胰腺功能测试中，医疗专业人员将管向下放入喉咙，进入胃，然后进入十二指肠(小肠上部)。插入促胰液素，将十二指肠分泌物中的内容物抽吸(用吸出来去除)约一小时并对其进行分析。

粪便弹性蛋白酶测试测量弹性蛋白酶，弹性蛋白酶是在胰腺产生的液体中发现的酶。弹性蛋白酶消化并降解多种蛋白质。在该测试期间，分析患者的粪便样品中弹性蛋白酶的存在。

用造影染料进行的计算机断层扫描(CT)帮助排除腹痛的其他原因，并且还可以确定胰腺内或周围是否存在炎症(肿胀)、瘢痕或液体积聚。

腹部超声可以检测胆结石和来自腹部炎症的液体(腹水)。其也可以显示出胆总管扩大、脓肿或假性囊肿。

在内镜逆行胰胆管造影(ERCP)期间，医疗专业人员将管向下放入喉咙，进入胃，然后进入十二指肠。使小导管通入胰腺和胆管中，并注射染料以帮助医生观看X射线上的胆总管、其他胆管和胰管的结构。

在内镜超声期间，将附接至发光镜的探针向下放入喉咙并进入胃。声波显示腹中器官的图像。当侵入性测试(如ERCP)可能使病症恶化时，内镜超声可能揭示胆结石，并可帮助诊断重度胰腺炎。

磁共振胰胆管造影是可用于观看胆管和胰管的磁共振成像(MRI)类型。MRI/MRCP对胰腺的成像非常良好，并且不使用辐射。

肾脏

作为检测受试者的肾脏组织再生的手段，测量肾脏功能的方法包括血液测试，如血清肌酐、肾小球滤过率(GFR)、血尿素氮(BUN)；以及成像测试，如超声和CT扫描。

肌酐是来自身体肌肉的正常磨损和撕扯的废弃产物。血液中的肌酐水平可根据年龄、种族和体型而变化。女性肌酐水平大于1.2和男性肌酐水平大于1.4可能是肾脏工作不正常的早期迹象。随着肾脏疾病进展，血液中的肌酐水平升高。

肾小球滤过率(GFR)测试(通过使用肾脏疾病饮食调整(MDRD)或慢性肾脏疾病流行病学合作(CKD-EPI)方程的数学公式计算)测量肾脏从血液中去除废物和多余液体的良好程度。这项测试是使用年龄和性别根据血清肌酐水平计算的，其中对非裔美国人后裔的那些进行调节。正常的GFR可根据年龄而变化(随着受试者年龄的增长，其可降低)。GFR的正常值为90或以上。GFR低于60是肾脏工作不正常的迹象。一旦GFR降低到15以下，就有很高的风险需要用于肾衰竭的治疗，如透析或肾脏移植。

血尿素氮(BUN)。尿素氮来自食物中蛋白质的分解。正常BUN水平为7至20。随着肾脏功能下降，BUN水平升高。

超声使用声波对肾脏成像。这项测试可以用于寻找肾脏大小或位置的异常，或者寻找障塞物(如结石或肿瘤)。

CT扫描使用X射线对肾脏成像。这项测试也可用于寻找结构异常和阻塞物的存在。该测试可能需要使用静脉内造影染料，这可能引起患有肾脏疾病的那些人的担忧。

也可以通过肾脏活检和/或尿测试(如尿液分析、尿蛋白测试、微量白蛋白尿和肌酐清除率)来评估肾脏组织。

由于以下原因中的一个或多个，可能偶尔进行活检：为了鉴定特定的疾病过程并确定其是否将对治疗产生应答；为了评价肾脏中已发生的损伤的量；和/或为了找出为什么肾脏移植可能效果不好。肾脏活检是通过使用具有锋利刃口的细针切下小块的肾脏组织以在显微镜下检查进行的。

一些尿测试只需要几汤匙的尿。其他测试需要收集完整的24小时内产生的所有尿。24小时尿测试显示肾脏产生多少尿，可以更准确地测量肾脏工作的良好程度以及一天内有多少蛋白质从肾脏泄漏到尿中。

尿液分析包括尿样品的显微镜检查以及浸条测试。浸条是浸入尿样品中的经化学处理的条带。在异常情况(如过量的蛋白质、血液、脓、细菌)存在下，条带的颜色发生变化。尿液分析可以帮助检测多种肾脏和泌尿道障碍，包括慢性肾脏疾病、糖尿病、膀胱感染和肾结石。

尿蛋白测试可以作为尿液分析的一部分进行，或者通过单独的浸条测试进行。尿中过量的蛋白质被称为蛋白尿。阳性浸条测试(1+或更高)应使用更具特异性的浸条测试(如白蛋白特异性浸条)或定量测量(如白蛋白与肌酐的比率)来确认。

微量白蛋白尿是更灵敏的浸条测试，其可以检测尿中微量的称为白蛋白的蛋白质。如果发生肾脏疾病的风险增加的人(如患有糖尿病或高血压的那些)的蛋白尿标准浸条测试为阴性，则他们应进行微量白蛋白尿测试或具有白蛋白与肌酐的比率。

肌酐是来自身体肌肉的正常磨损和撕扯的废弃产物。肌酐清除率测试将24小时的尿样品中的肌酐与血液中的肌酐水平进行比较，以显示肾脏每分钟过滤出多少废弃产物。

心脏

作为检测受试者的心脏组织再生的手段，测量心脏功能的方法包括但不限于超声心动图显像、经食道超声心动图显像(TEE)、心电图(ECG或EKG)、磁共振成像(MRI)、CT扫描、运动心脏压力测试、药理应激测试、倾斜测试、动态节律监测测试、霍尔特监测、移动心脏遥测(MCT)和冠状动脉造影。

超声心动图显像利用声波产生心脏的图像。这种常见的测试允许医师观看心脏如何跳动以及血液是如何移动通过心脏。来自超声心动图显像的图像用于鉴定心肌和瓣膜的各种异常。该测试可以在休息时进行，或者伴随运动来进行以提高心率(参见下面的运动心脏压力测试)。

经食道超声心动图显像(TEE)使用高频声波(超声)获取心脏和进出心脏的动脉的细节照片。产生用于TEE的声波的回声换能器附接至细管，该细管穿过口，向下进入喉咙并进入非常靠近心脏的上腔的食道。

心电图(ECG或EKG)测量心跳的电活动以提供两种信息。首先，通过测量ECG上的时间间隔，医生可以确定电波通过心脏需要多长时间。找出波从心脏的一个部分传播到下一个部分需要多长时间显示出电活动是正常、缓慢、快速还是不规则的。其次，通过测量通过心肌的电活动量，心脏病学家可能能够找出心脏的部分是否过大或过度工作。

磁共振成像(MRI)使用磁场和射频波来创建身体内的器官和结构的细节照片。它可以用来检查心脏和血管，并鉴定受中风影响的脑的区域。

CT扫描是使用计算机来产生心脏的横截面图像的X射线成像技术。其也称为心脏计算机断层扫描、计算机化轴向断层扫描或CAT扫描，可用于检查心脏和血管的问题。其还用于鉴定脑中的血管是否已经受到中风的影响。

运动心脏压力测试也称为运动耐受测试(ETT)，其显示在跑步机或固定自行车上运动期间心脏的血液供应是否充足以及心律是否正常。该测试在运动的同时监测疲劳的水平、心率、呼吸、血压和心脏活动。该测试可以与核成像或超声心动图显像组合进行。

药理应激测试：通过手臂上的IV线给予药品以扩张动脉，这会增加心率和血流量，类似于运动的效果。该测试可以与核成像、超声心动图显像或MRI组合进行。

倾斜测试：通常用于确定患者感到头昏或头晕的原因。在测试期间，患者躺在缓慢向上倾斜的桌上。该测试测量血压和心率对重力的应答。护士或技术人员保持跟踪血压和心率(脉搏)以观看它们在测试期间如何变化。

动态节律监测测试：霍尔特监测、事件记录器和移动心脏遥测(MCT)是基于门诊的研究心律持续长时间段的动态监测测试。

冠状动脉造影：用于检查向心脏供血的冠状动脉的X射线类型。将导管插入手臂或腹股沟的血管，并输送到心脏和冠状动脉。然后通过导管注射特殊的染料并获取图像。

肌肉

作为检测受试者的肌肉组织再生的手段，测量肌肉功能的方法包括但不限于握力测试、上肢和下肢力量测试、最大力量测试、压腿和膝盖伸展测试、步态速度测试、椅子站立测试(CST)、简易体能状况量表(SPPB)测试和计时起立行走(TUG)测试。这些测试描述于例如Beaudart等人2019,Calcif Tissue Int[国际钙化组织]105,1–14中。

最大力量通过1RM(1次重复最大阻力)进行定量，其中在受试者可以完成一次运动的最高阻力下进行评价。为了找出1RM，以增加的阻力重复运动几次，直到不能完成单次重复。

步态速度测试——存在两种主要类型的步态速度测试：短距离步行测试(2.4m距离、4m距离、6m距离和10m距离)和远距离步行测试(400m步行测试和6min步行测试)。

胃肠(GI)道

上GI道通常被认为是口、食道、胃和小肠的第一部分(十二指肠)。下GI道从小肠延伸到大肠(结肠)再到肛门。作为检测受试者的上GI组织再生的手段，测量上GI道功能的方法包括但不限于上GI系列(咽钡或钡餐)、胃镜检查、内镜逆行胰胆管造影(ERCP)、内镜超声、pH监测和食管/胃压力测定。作为检测下GI组织再生的手段，测量下GI道功能的方法包括结肠镜检查、钡灌肠造影、柔性乙状结肠镜检查、虚拟结肠镜检查、胶囊内镜检查和直肠动力学检查。作为检测受试者的GI组织再生的手段，测量GI道功能的另外的方法包括但不限于粪便钙卫蛋白测试、粪便隐血测试、粪便免疫化学测试(FIT)、氢呼吸测试、乳糖耐受性测试、粪便酸度测试、肝脏活检、磁共振成像和超声。

皮肤

皮肤组织再生可以通过视觉评价(例如通过确定瘢痕疙瘩评分)来确定。瘢痕疙瘩是发生在皮肤损伤部位处凸出的瘢痕组织的过度生长。瘢痕疙瘩评分可以例如通过患者和观察者瘢痕评估量表(POSAS)来确定。参见Draaijers等人,2004,Plast Reconstr Surg[整形修复手术]113:1960–1965。瘢痕由患者和医生两者以十步制对观察者量表上的六个项目进行数字评定：血管性、色素沉着、厚度、凸纹、柔韧性和表面积。患者量表由瘢痕的疼痛、发痒、颜色、硬度、厚度和不规则性组成。

在一些实施例中，用本文所述的组合物处理的器官是实质器官。如本文所用，术语“实质器官”是指具有牢固组织一致性并且既不是中空的(如胃肠道的器官)也不是液体(如血液)的内部器官。实质器官包括但不限于肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、心脏和肺脏。在一些实施例中，器官是胃肠道的器官。胃肠道的器官包括食道、胃、小肠和大肠。

在一些实施例中，用本文所述的组合物处理的器官具有损伤，例如，由药物、毒素、病毒感染或对器官进行的手术引起的损伤。可以在器官损伤后向受试者施用组合物，例如以改善该器官中的组织再生和/或改善该受试者的存活率。

在一些实施例中，向需要对器官进行手术的受试者施用包含一种或多种细胞周转因子的组合物。可以在对器官进行手术之前和/或对器官进行手术之后向受试者施用组合物。手术可包括涉及器官的癌症切除。

可以用本文所述的组合物处理任何能够再生的组织。在一些实施例中，组织选自由以下构成的组：肝脏组织、肾脏组织、胰腺组织、肌肉组织、肠内衬、心脏组织和肺脏组织。

受试者可能患有与待再生的组织或器官相关的特定障碍。例如，在一些实施例中，待再生的组织是肝脏组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍：慢性肝损伤、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、药物性肝损伤、暴发性和晚发性肝衰竭(LOHF)、暴发性肝炎(FH)、肝硬化、肝纤维化、暴发性肝衰竭(FHF)、乙型肝炎和丙型肝炎。

在一些实施例中，待再生的组织是肾脏组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：糖尿病、类风湿性关节炎、肾炎综合征、肾病综合征、高血压肾病、多囊肾病、进行性慢性肾脏疾病、慢性肾衰竭、法布里病、胱氨酸贮积症、肾消耗病、奥尔波特综合征、再灌注损伤、急性肾损伤、肾纤维化和肾移植。

在一些实施例中，待再生的组织是胰腺组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍：胰腺癌、糖尿病、胰岛素抵抗、低血糖、高血糖、脂酶缺乏症、胆囊收缩素(CCK)缺乏症、急性胰腺炎、慢性胰腺炎和遗传性胰腺炎。

在一些实施例中，待再生的组织是肠内衬组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：炎性胃肠道障碍、克罗恩病、炎性肠病(IBD)、憩室炎、寄生虫感染、和细菌感染、功能性胃肠道障碍、溃疡性结肠炎(UC)以及肠的手术切除。

在一些实施例中，待再生的组织是心脏组织，并且受试者患有心血管疾病。可以通过本文所述的方法治疗的心血管疾病包括但不限于心肌梗死、心力衰竭、由缺血性事件导致的心脏损伤和由非缺血性事件导致的心脏损伤。

在一些实施例中，待再生的组织是肺脏组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺癌、闭塞性细支气管炎机化性肺炎(BOOP)、2019冠状病毒病(COVID-19)、间皮瘤、和囊性纤维化、哮喘、特发性肺纤维化、衰老导致的肺衰竭、肺纤维化、间质性肺病(ILD)、肺动脉高压以及α1-抗胰蛋白酶障碍。

在一些实施例中，待再生的组织是肌肉组织，并且受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：肌炎、自身免疫性疾病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、肌少症、儿童沙尔科-马里-图思病、衰老导致的肌肉损失、损伤引起的肌肉劳损、肌肉萎缩、肌营养不良、皮肌炎、吉兰-巴雷综合征、多发性硬化、脊髓灰质炎和多肌炎。在一些实施例中，损伤是运动损伤。在一些实施例中，肌肉萎缩是脊髓性肌萎缩(SMA)。在一些实施例中，肌营养不良选自由以下构成的组：迪谢内肌营养不良、贝克肌营养不良、先天性肌营养不良、强直性肌营养不良(也称为斯坦内特病或营养不良性肌强直)、面肩肱型肌营养不良(FSHD)、肢带型肌营养不良、眼咽型肌营养不良(OPMD)、远端型肌营养不良(也称为远端肌病)和埃默里-德赖弗斯肌营养不良。

本文所述的方法可进一步包括制备包含一种或多种细胞周转因子的组合物的步骤。在一些实施例中，制备组合物的步骤包括使细胞暴露于应激条件。

B.施用诱导细胞周转的化合物

本披露还涉及诱导细胞周转的化合物的用途，该用途通过向受试者、器官或组织直接施用该化合物来增加组织再生。化合物对细胞周转的诱导导致在组织或受试者的靶细胞中产生细胞周转因子，这些细胞周转因子促进该受试者、器官或组织中的组织再生。例如，在某些方面，本披露涉及增加受试者的器官中组织的再生的方法，该方法包括向该受试者施用包含诱导该受试者中的靶细胞的细胞周转的化合物的组合物，其中施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加该组织的再生。

可以向组织、器官或受试者施用本文所述的任何诱导细胞周转的化合物(例如，诱导细胞周转的小分子、核酸和蛋白质)以增加组织的再生。在一些实施例中，向组织或受试者施用以增加组织的再生的化合物是毒素。例如，可以向受试者或组织施用一定剂量的毒素，该剂量足以诱导细胞周转和细胞周转因子的产生，但低于对该组织造成重度损伤的剂量。

在一些实施例中，向组织或受试者施用以增加组织的再生的化合物诱导ER应激和/或未折叠蛋白反应。诱导ER应激和/或未折叠蛋白反应的化合物在本文中描述，并且包括但不限于硫代乙酰胺、衣霉素、PhenolaTi、玉米赤霉烯酮、志贺毒素-2、四氯化碳(CCL4)和对乙酰氨基酚。在一些实施例中，向组织或受试者施用以增加组织的再生的化合物是抗肿瘤剂，例如本文所述的抗肿瘤剂之一。在一些实施例中，向组织或受试者施用以增加组织的再生的化合物不是诱导铁依赖性细胞周转(例如，铁死亡)的化合物。

诱导细胞周转的化合物可以靶向特定的细胞、组织或器官，以诱导靶细胞产生促进组织再生的细胞周转因子。可以使用本领域已知的各种方法使化合物靶向靶细胞、组织或器官。例如，在一些实施例中，通过与对靶细胞、组织或器官具有特异性的抗体缀合，诱导细胞周转的化合物靶向特定的细胞、组织或器官。例如，在一些实施例中，诱导细胞周转的化合物是抗体-药物缀合物。抗体可以靶向组织再生增加的组织或器官。在一些实施例中，抗体与组织再生增加的器官的组织特异性抗原特异性结合。在一些实施例中，抗体靶向肝脏。在一些实施例中，抗体靶向肾脏。

在一些实施例中，通过使用特定的配制品或包封方法使化合物(例如毒素)靶向特定的器官或组织。例如，在一些实施例中，配制品或包封方法使化合物靶向肝脏。在一些实施例中，配制品或包封方法使化合物靶向肾脏。使化合物靶向肝脏或肾脏的配制品和包封的实例在下表1中提供。

表1.靶向肝脏或肾脏的配制品和包封方法

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1.Poelstra K,Prakash J,Beljaars L.Drug targeting to thediseasedliver.J Control Release.2012；161(2):188-197.doi:10.1016/j.jconrel.2012.02.011

2.Cuestas ML,Mathet VL,JR,Sosnik A.Drug delivery systems andliver targeting for the improved pharmacotherapy of the hepatitis B virus(HBV)infection.Pharm Res.2010；27(7):1184-1202.doi:10.1007/s11095-010-0112-z

3.Singh L,Indermun S,Govender M,et al.Drug Delivery Strategies forAntivirals against Hepatitis B Virus.Viruses.2018；10(5):267.Published 2018May17.doi:10.3390/v10050267

5.Liu CP,Hu Y,Lin JC,Fu HL,Lim LY,Yuan ZX.Targeting strategies fordrug delivery to the kidney:From renal glomeruli to tubules.Med Res Rev.2019；39(2):561-578.doi:10.1002/med.21532

6.Haas M,Moolenaar F,Meijer DK,de Zeeuw D.Specific drug delivery tothe kidney.Cardiovasc Drugs Ther.2002；16(6):489-496.doi:10.1023/a:1022913709849

7.Barile L,Vassalli G.Exosomes:Therapy delivery tools and biomarkersof diseases.Pharmacol Ther.2017；174:63-78.doi:10.1016/j.pharmthera.2017.02.020

在一些实施例中，诱导细胞周转的化合物靶向组织再生增加的器官中的细胞。例如，在一些实施例中，靶细胞是肝脏细胞，并且再生的组织是肝脏组织。在一些实施例中，靶细胞是肾脏细胞，并且再生的组织是肾脏组织。在一些实施例中，靶细胞是肺脏细胞，并且再生的组织是肺脏组织；靶细胞是肌肉细胞，并且再生的组织是肌肉组织；靶细胞是骨细胞，并且再生的组织是骨组织；靶细胞是胰腺细胞，并且再生的组织是胰腺组织；靶细胞是心脏细胞，并且再生的组织是心脏组织；靶细胞是肠内衬细胞，并且再生的组织是肠内衬；靶细胞是皮肤细胞，并且再生的组织是皮肤组织；靶细胞是CNS的细胞，并且再生的组织是CNS组织；靶细胞是上皮细胞，并且再生的组织是上皮；或者靶细胞是内皮细胞，并且再生的组织是内皮。

靶细胞也可以在与组织再生增加的器官或组织邻接的组织中。例如，在一些实施例中，靶细胞在组织再生增加的器官或组织的50μm、100μm、500μm、1mm或2mm内。

在一些实施例中，用于诱导细胞周转的化合物的靶细胞驻留在再生的组织内，但不同于再生的细胞类型。例如，在一些实施例中，靶细胞是驻留在肝脏中的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞，并且由该靶细胞产生的细胞周转因子诱导肝脏组织的再生。在一些实施例中，靶细胞是驻留在肾脏中的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞，并且由该靶细胞产生的细胞周转因子诱导肾脏组织的再生。在一些实施例中，靶细胞是驻留在肺脏中的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞，并且由该靶细胞产生的细胞周转因子诱导肺脏组织的再生；靶细胞是驻留在骨中的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞，并且由该靶细胞产生的细胞周转因子诱导骨组织的再生；靶细胞是驻留在肌肉中的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞，并且由该靶细胞产生的细胞周转因子诱导肌肉组织的再生；靶细胞是驻留在胰腺中的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞，并且由该靶细胞产生的细胞周转因子诱导胰腺组织的再生；靶细胞是驻留在心脏中的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞，并且由该靶细胞产生的细胞周转因子诱导心脏组织的再生；靶细胞是驻留在肠内衬中的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞，并且由该靶细胞产生的细胞周转因子诱导肠内衬组织的再生；或者靶细胞是驻留在CNS中的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞，并且由该靶细胞产生的细胞周转因子诱导CNS组织的再生。在一些实施例中，免疫细胞是单核细胞或巨噬细胞。

V.药物组合物和施用方式

本文所述的药物组合物可以以任何合适的配制品向受试者施用。这些包括例如液体、半固体和固体剂型。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗性应用。

在某些实施例中，组合物适用于口服施用。在某些实施例中，配制品适用于肠胃外施用，包括局部施用和静脉内、腹膜内、肌内和皮下注射。在特定的实施例中，组合物适用于静脉内施用。

肠胃外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。对于静脉内施用，配制品可以是水溶液。水溶液可以包括汉克氏溶液(Hank’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水缓冲液或其他合适的盐或组合，以实现用于肠胃外递送配制品的合适的pH和渗透压。水溶液可用于稀释配制品至希望的浓度用以施用。水溶液可以含有增加溶液黏度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。在一些实施例中，配制品包括磷酸盐缓冲盐溶液，其含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠和注射用水。

适用于局部施用的配制品包括适用于穿透皮肤的液体或半液体制剂，如搽剂、洗剂、乳膏、软膏或糊剂，以及适用于向眼、耳或鼻施用的滴剂。适用于口服施用的配制品包括含有惰性稀释剂或可吸收的可食用载剂的制剂。用于口服施用的配制品可以被封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者其可以被压制成片剂，或者其可以与饮食中的食物直接合并。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料之外，它还可以含有液体载剂。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式修饰剂量单位的物理形式。适用于本发明的药物组合物包括其中含有有效量的活性成分以实现其预期目的的组合物。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细披露。除了活性成分之外，这些药物组合物还可含有合适的药学上可接受的载剂，包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂。

如对于本领域技术人员而言将显而易见的是，待施用的有用的体内剂量和特定的施用方式将根据年龄、体重、患病的严重程度和所治疗的哺乳动物物种、所使用的特定化合物、以及使用这些化合物的特定用途而变化。本领域技术人员可以使用常规方法，例如人临床试验、动物模型和体外研究来确定有效的剂量水平，即达到希望的结果所需的剂量水平。

在某些实施例中，组合物经口服递送。在某些实施例中，组合物经肠胃外施用。在某些实施例中，组合物通过注射或输注来递送。在某些实施例中，组合物局部地(包括经黏膜)递送。在某些实施例中，组合物通过吸入递送。在一个实施例中，本文提供的组合物可通过直接注射至肿瘤来施用。在一些实施例中，组合物可通过静脉内注射或静脉内输注来施用。在某些实施例中，施用是全身性的。在某些实施例中，施用是局部的。

实例

实例1：用来自暴露于应激条件的AML-12小鼠肝细胞的细胞周转因子处理的小鼠部分肝切除肝脏再生模型的评价

方法

条件培养液的制备

将AML-12小鼠肝细胞以550万个细胞/板铺板在10cm板中。该细胞系的基础培养液是DMEM:F12培养液。为了制备完全生长培养液，将以下组分添加到500mL的基础培养液中：补充有：10％胎牛血清、10μg/ml胰岛素、0.5μg/ml转铁蛋白、5ng/ml硒和40ng/ml地塞米松。细胞在过夜生长到至少70％的汇合度。将细胞用PBS2X；7ml具有ITS补充物、不具有地塞米松的无血清培养液洗涤，然后用化合物处理。将细胞处理48h，然后收集条件培养液用于加工。

通过吸移将细胞与培养液一起收集，并将培养液+细胞收集在50mL锥形管中。将100uL的每个样品等分，以用CTG测试活力(将100uL的混合细胞/培养液添加至96孔板+100uL的CTG)。将样品的剩余部分呢离心沉淀(在300g下5min)。将上清液用0.45uM过滤器过滤，并将流穿物通过转移到3kDA截止Amicon过滤单元，并在4000g下旋转30-45分钟。用5-10ml PBS洗涤柱。共洗涤柱3次。收集每种条件下所有>3kDa的上清液级分。将1X PBS添加到每个合并的样品中以获得12ml/条件的总体积。将1ml等分到单独的管中用于蛋白质定量和蛋白质组学。将剩余的11ml分成2管，每管5.5ml(在第0天和第1天给药)。将样品置于-80℃下，并用于体内研究。

表2.条件培养液(CM)处理

小鼠肝脏再生模型的评价

我们在通过部分肝切除诱导的小鼠肝脏再生模型中评价了测试组合物CM0、CM1、CM2、CM3、CM4、CM5、CM6和CM7的功效。将肝细胞生长因子(HGF)-质粒用作阳性对照。将HGF-质粒用盐水稀释至10.5μg/ml的浓度。将测试制品CM0、CM1、CM2、CM3、CM4、CM5、CM6和CM7也用盐水稀释(测试制品:盐水＝1:4)。

C57BL/6小鼠(每个治疗组10只)在手术前2小时接受测试制品，并在手术后24小时经由流体动力学尾静脉(HTV)注射接受第2剂量。注射体积为体重的8％。对于手术，用异芴(1％-2.5％)麻醉小鼠。通过2-3cm的上腹部中线切口暴露肝脏。用4-0丝线结扎肝左外叶和左内叶的顶部，使结尽可能靠近肝叶的基部。在线的正上方去除捆绑的肝叶。分别用5-0丝缝合肌肉和皮肤。对于进行假手术的动物，除了肝脏不进行结扎或横切外，手术程序相同。

在第1、2、3和4天收集血浆。在第2天和第4天对动物实施安乐死以收集肝脏。图1显示了给药和样品收集时间表。将全血样品收集到EDTA抗凝管中，并加工成血浆。

在实验结束时收集肝脏样品。记录肝脏重量。将来自肝右外叶的肝脏组织去除并储存在含有10％ NBF的管中用于病理学评价，并固定24小时。将样品包埋在石蜡中，并进行加工以获得4μm切片，用于使用苏木精-伊红染色。使用预定的评分系统半定量地评价坏死和脂肪变性的严重程度(表3)。

表3.肝脏坏死和脂肪变性的病理学评价标准

级别	坏死
		0	无
1	很少(<25％实质)
		2	很多(>25％实质)

级别	脂肪变性
		0	<10％
1	10％-20％
		2	20％-30％
3	>30％

对于免疫组织化学染色，将4μm厚的切片放在载玻片上，并在干燥过夜后，通过二甲苯去除石蜡。然后将切片放入分级的乙醇系列中，并浸入蒸馏水中。在热诱导的柠檬酸盐抗原(pH 6.0)揭开去掩蔽后，将切片浸入3％过氧化氢溶液中5min。为了避免非特异性染色，然后在室温下将切片在封闭血清(DAKO公司编号X0909)中孵育15min，随后使用以1:600或1:1500稀释的初级兔多克隆抗PCNA抗体(艾博抗公司(Abcam)，编号ab92552)或抗Ki67抗体(艾博抗公司，编号ab15580)持续1小时。添加与HRP缀合的次级山羊多克隆抗体(DAKO公司，编号K4003)。对于阳性细胞的图像分析，使用PCNA/Ki67染色的切片，并通过Aperio CS2扫描机进行扫描。使用HALO v2.3工作站“IHC核v1”模块。

体内动物数据表示为平均值±SEM。统计分析使用以下进行：单因素方差分析(OneWay ANOVA)，随后是邓尼特(Dunnett)多重比较或双因素方差分析(Two Way ANOVA)，随后是Bonferroni多重比较。当N太小或数据不遵循高斯分布时，使用非参数检验，像曼-惠特尼(Mann-Whitney)等。当p<0.05时，认为差异是显著的。

结果

在第2天和第4天记录肝脏重量和体重。通过将肝脏重量除以体重来计算肝脏指数。手术显著降低了肝脏重量和肝脏指数。在第2天和第4天，对于肝脏重量，与CM0组相比，用HGF质粒、CM1、CM2、CM3、CM5、CM6和CM7进行的处理没有显示出显著性差异(图2A和2B)。在第2天，与CM0组相比，用HGF质粒和CM5处理显著增加了肝脏指数。在第2天和第4天，对于肝脏指数，CM1、CM2、CM3、CM6和CM7没有显示出显著性差异(图3A和3B)。

在第1天和第2天，部分肝切除处理(CM0和HGF组)显著增加了内源性血浆HGF的表达水平。HGF HTV注射通过HGF的外源性表达进一步增加HGF的表达。对于CM0组，内源性HGF表达的增加降低，并且在第3天无法检测到。与CM0组相比，HGF质粒处理组在第3天显著增加血浆HGF的水平。在第4天，在假手术、CM0和HGF质粒组中经由ELISA未检测到血浆HGF(图4)。

在第2天，与CM0组相比，CM1、CM2、CM3和CM6处理显著增加肝脏的脂肪变性。在第2天，HGF、CM5和CM7倾向于增加肝脏脂肪变性。在第4天，未观察到肝脏脂肪变性(图5)。与假手术组相比，部分肝切除处理组显著增加肝脏坏死。在第2天和第4天，对于肝脏坏死，与CM0组相比，CM1、CM2、CM3、CM6和CM7处理没有显示出差异，而在第2天，HGF质粒和CM 5处理倾向于减少肝脏坏死(图6A、6B和7)。

部分肝切除处理后，在肝脏组织中观察到细胞增殖标志物增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki67(图8A、8B、9、10A、10B和11)。与假手术组相比，部分肝切除处理在第2天倾向于增加PCNA的表达，并且在第4天显著增加PCNA的表达。与CM0组相比，CM5处理在第2天显著增加PCNA的表达，而HGF质粒、CM1、CM2、CM3、CM6和CM7处理在第2天和第4天没有显示出PCNA表达的差异。这些结果指示CM5处理增加肝脏细胞的增殖。与假手术组相比，部分肝切除处理在第2天和第4天显著增加Ki67的表达。与CM0组相比，CM1和CM5处理在第2天倾向于增加Ki67的表达，而HGF质粒、CM2、CM3、CM6和CM7处理在第2天和第4天没有显示出Ki67表达的差异。

结论

用来自暴露于应激条件的肝脏细胞的细胞周转因子处理肝脏(即，用硫代乙酰胺处理)在处理的小鼠部分肝切除肝脏再生模型中诱导肝脏组织再生和较低水平的坏死性凋亡。

CM0、CM1、CM2、CM3、CM4、CM6、CM7(分别为无处理、多柔比星、衣霉素、维奈托克、冻融、TNF-α加半胱天冬酶抑制剂加比瑞那帕、和RSL3)没有显示出再生性作用。CM5处理在第2天显著增加肝脏指数和肝脏细胞的PCNA表达，这指示CM5处理增加肝脏细胞再生。另外，CM5处理倾向于在第2天增加肝脏细胞Ki67的表达并减少肝脏坏死，这进一步支持CM5处理在增加肝脏细胞再生中的作用。

等同物

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规试验确认本文所描述的特定实施例和方法的许多等同物。这样的等同物旨在由以下权利要求书的范围涵盖。

通过引用并入

本申请中提到的每个参考文献、专利和专利申请均特此通过引用以其全文并入，如同单独说明将每个参考文献并入。

Claims (96)

1.一种增加哺乳动物受试者的器官中组织的再生的方法，该方法包括向该受试者施用一定量的组合物并持续一定的时间，该量和该时间足以增加该组织的再生，其中该组合物通过以下制备：(a)使哺乳动物细胞暴露于应激条件下，和(b)收集经暴露的细胞或来自这些经暴露的细胞的条件培养液以产生该组合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中该应激条件是诱导内质网应激的化合物。

3.如权利要求1所述的方法，其中该应激条件选自由以下构成的组：硫代乙酰胺、衣霉素、PhenolaTi、玉米赤霉烯酮、志贺毒素-2、四氯化碳(CCL4)和对乙酰氨基酚。

4.如权利要求1所述的方法，其中该应激条件是硫代乙酰胺。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中暴露于该应激条件的哺乳动物细胞属于该组织或器官中存在的类型。

6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中暴露于该应激条件的哺乳动物细胞选自由以下构成的组：肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、肌肉细胞、骨细胞、肠内衬细胞、心脏细胞、肺脏细胞、皮肤细胞、神经元、中枢神经系统(CNS)的细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。

7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中暴露于该应激条件的哺乳动物细胞是肝脏细胞，并且该器官是肝脏。

8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将这些细胞或这些条件培养液进一步分级以产生该组合物。

9.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中暴露于该应激条件的哺乳动物细胞对于该受试者是自体的。

10.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该哺乳动物受试者是人。

11.一种增加受试者的器官中组织的再生的方法，该方法包括向该受试者施用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物，其中向该受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加该组织的再生。

12.一种将包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物递送至需要增加组织再生的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用该组合物。

13.如权利要求1、11或12所述的方法，其中该组织是肝脏组织，并且该受试者患有选自由以下构成的组的障碍：慢性肝损伤、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、药物性肝损伤、暴发性和晚发性肝衰竭(LOHF)、暴发性肝炎(FH)、肝硬化、肝纤维化、暴发性肝衰竭(FHF)、乙型肝炎和丙型肝炎。

14.如权利要求1、11或12所述的方法，其中该组织是肾脏组织，并且该受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：糖尿病、类风湿性关节炎、肾炎综合征、肾病综合征、高血压肾病、多囊肾病、进行性慢性肾脏疾病、慢性肾衰竭、法布里病、胱氨酸贮积症、肾消耗病、奥尔波特综合征、再灌注损伤、急性肾损伤、肾纤维化和肾移植。

15.如权利要求1、11或12所述的方法，其中该组织是胰腺组织，并且该受试者患有选自由以下构成的组的障碍：胰腺癌、糖尿病、胰岛素抵抗、低血糖、高血糖、脂酶缺乏症、胆囊收缩素(CCK)缺乏症、急性胰腺炎、慢性胰腺炎和遗传性胰腺炎。

16.如权利要求1、11或12所述的方法，其中该组织是肠内衬组织，并且该受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：炎性胃肠道障碍、克罗恩病、炎性肠病(IBD)、憩室炎、寄生虫感染、细菌感染、功能性胃肠道障碍、溃疡性结肠炎(UC)和肠的手术切除。

17.如权利要求1、11或12所述的方法，其中该组织是心脏组织，并且该受试者患有选自由以下构成的组的心血管疾病：心肌梗死、心力衰竭、由缺血性事件导致的心脏损伤和由非缺血性事件导致的心脏损伤。

18.如权利要求1、11或12所述的方法，其中该组织是肺脏组织，并且该受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺癌、闭塞性细支气管炎机化性肺炎(BOOP)、2019冠状病毒病(COVID-19)、间皮瘤、囊性纤维化、哮喘、特发性肺纤维化、衰老导致的肺衰竭、肺纤维化、间质性肺病(ILD)、肺动脉高压和α1-抗胰蛋白酶障碍。

19.如权利要求1、11或12所述的方法，其中该组织是肌肉组织，并且该受试者患有选自由以下构成的组的障碍或病症：肌炎、自身免疫性疾病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、肌少症、儿童沙尔科-马里-图思病、衰老导致的肌肉损失、损伤引起的肌肉劳损、肌肉萎缩、肌营养不良、皮肌炎、吉兰-巴雷综合征、多发性硬化、脊髓灰质炎和多肌炎。

20.如权利要求1、11或12所述的方法，其中该组合物被配制成靶向组织再生增加的器官。

21.如权利要求1、11或12所述的方法，其中该组合物被配制成靶向肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、肠内衬、心脏或肺脏。

22.如权利要求1、11或12所述的方法，其中该组合物被配制成靶向肝脏。

23.如权利要求1、11或12所述的方法，其中该组合物被配制成靶向肾脏。

24.如权利要求1、11或12所述的方法，其中向该受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以减少该组织再生增加的组织中的坏死。

25.如权利要求1、11或12所述的方法，其中向该受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以减少该组织再生增加的组织中的脂肪变性。

26.如权利要求1、11或12所述的方法，其中向该受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加该组织再生增加的器官的重量。

27.如权利要求1、11或12所述的方法，其中向该受试者施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加该组织中的一种或多种细胞增殖标志物蛋白的表达。

28.一种增加移植的器官或组织中的组织再生的方法，该方法包括离体用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理器官或组织，其中用一定量的组合物处理该器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以增加该器官或组织在移植至受试者后的组织再生。

29.一种处理组织、器官、类器官或器官培养物的方法，该方法包括在体外使组织、器官、类器官或器官培养物与包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物接触。

30.一种制备用于植入至受试者的器官或组织的方法，该方法包括离体用包含一种或多种由暴露于应激条件的细胞产生的细胞周转因子的组合物处理器官或组织。

31.如权利要求29或30所述的方法，其中用一定量的组合物处理该器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以增加该器官或组织在移植至该受试者后的组织再生。

32.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中用一定量的组合物处理该器官或组织，相对于使用未用该组合物处理的器官或组织进行移植的受试者，该量足以在将该器官或组织移植至该受试者后增加该受试者的存活率。

33.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中用一定量的组合物处理该器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以改善该器官或组织在移植至该受试者后的植入。

34.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中用一定量的组合物处理该器官或组织，相对于未用该组合物处理的器官或组织，该量足以延长该器官或组织在移植至该受试者前的活力。

35.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中该应激条件包括非生物应激、生物应激和/或化学应激。

36.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中该应激条件包括非生物应激。

37.如权利要求36所述的方法，其中该非生物应激选自由以下构成的组：营养物质剥夺、热、冷、辐射、缺氧、渗透压和pH应激。

38.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中该应激条件包括生物应激。

39.如权利要求38所述的方法，其中该生物应激选自由以下构成的组：使用天然存在的病毒的病毒感染、细菌感染和真菌感染。

40.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中该应激条件诱导这些细胞经历凋亡。

41.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中该应激条件包括化学应激。

42.如权利要求41所述的方法，其中该化学应激包括使这些细胞与促进这些细胞产生细胞周转因子的化合物接触。

43.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中这些暴露于应激条件的细胞对于该受试者是同种异体的。

44.如权利要求11、12和28至30中任一项所述的方法，其中这些暴露于应激条件的细胞对于该受试者是自体的。

45.如权利要求11、12和28至30中任一项所述的方法，其中这些暴露于应激条件的细胞选自由以下构成的组：肝脏细胞、肾脏细胞、胰腺细胞、肌肉细胞、骨细胞、肠内衬细胞、心脏细胞、肺脏细胞、皮肤细胞、神经元、中枢神经系统(CNS)的细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。

46.如权利要求45所述的方法，其中这些上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞或免疫细胞来自该肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、骨、肠内衬、心脏、肺脏、皮肤或中枢神经系统。

47.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中这些暴露于应激条件的细胞来自出现该组织再生的相同类型的组织。

48.如权利要求47所述的方法，其中这些暴露于应激条件的细胞是肝脏细胞，并且出现该组织再生的组织是肝脏组织；这些暴露于应激条件的细胞是肾脏细胞，并且出现该组织再生的组织是肾脏组织；这些暴露于应激条件的细胞是肺脏细胞，并且出现该组织再生的组织是肺脏组织；这些暴露于应激条件的细胞是肌肉细胞，并且出现该组织再生的组织是肌肉组织；这些暴露于应激条件的细胞是骨细胞，并且出现该组织再生的组织是骨组织；这些暴露于应激条件的细胞是胰腺细胞，并且出现该组织再生的组织是胰腺组织；这些暴露于应激条件的细胞是心脏细胞，并且出现该组织再生的组织是心脏组织；这些暴露于应激条件的细胞是肠内衬细胞，并且出现该组织再生的组织是肠内衬；这些暴露于应激条件的细胞是皮肤细胞，并且出现该组织再生的组织是皮肤组织；这些暴露于应激条件的细胞是CNS的细胞，并且出现该组织再生的组织是CNS组织；这些暴露于应激条件的细胞是上皮细胞，并且出现该组织再生的组织是上皮；或者这些暴露于应激条件的细胞是内皮细胞，并且出现该组织再生的组织是内皮。

49.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中这些暴露于应激条件的细胞不来自出现该组织再生的相同类型的组织。

50.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中这些暴露于应激条件的细胞是癌细胞。

51.如权利要求50所述的方法，其中这些癌细胞是永生化的。

52.如权利要求50所述的方法，其中这些癌细胞是从受试者分离的原代细胞。

53.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中该组合物不包含完整的细胞。

54.如权利要求1至53中任一项所述的方法，其中该组合物包含从这些暴露于应激条件的细胞制备的无细胞提取物。

55.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中该组合物包含来自这些暴露于应激条件的细胞的条件培养液。

56.如权利要求55所述的方法，其中该组合物包含这些条件培养液的功能性级分。

57.如权利要求56所述的方法，其中通过基于分子量从这些条件培养液分离分子来制备该功能性级分。

58.如权利要求1至57中任一项所述的方法，其中该组合物包含一种或多种从这些细胞分离的细胞周转因子。

59.如权利要求58所述的方法，其中纯化或部分纯化该一种或多种细胞周转因子。

60.如权利要求1至59中任一项所述的方法，其中该组合物包含至少十种细胞周转因子。

61.如权利要求1至59中任一项所述的方法，其中该组合物包含至少两种细胞周转因子。

62.如权利要求1至59中任一项所述的方法，其中该组合物仅包含一种细胞周转因子。

63.如权利要求1、11和28至30中任一项所述的方法，其中该器官是实质器官。

64.如权利要求1、11和28至30中任一项所述的方法，其中该器官选自肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、肠内衬、心脏或肺脏。

65.如权利要求1、11、28至20、63和64中任一项所述的方法，其中该器官具有损伤。

66.如权利要求65所述的方法，其中该损伤是由药物、毒素、病毒感染或对该器官进行的手术引起的。

67.如权利要求65或66所述的方法，其中在该器官损伤后向该受试者施用该组合物。

68.如权利要求1、11和63至67中任一项所述的方法，其中该受试者需要对该器官进行的手术。

69.如权利要求68所述的方法，其中在对该器官进行手术前向该受试者施用该组合物。

70.如权利要求68或69所述的方法，其中在对该器官进行手术后向该受试者施用该组合物。

71.如权利要求67至70中任一项所述的方法，其中该手术包括涉及该器官的癌症切除。

72.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中该组织选自由以下构成的组：肝脏组织、肾脏组织、胰腺组织、肌肉组织、肠内衬、心脏组织和肺脏组织。

73.如权利要求1、11、12和28至30中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括制备包含该一种或多种细胞周转因子的组合物的步骤。

74.如权利要求73所述的方法，其中制备该组合物的步骤包括使这些细胞暴露于该应激条件。

75.一种增加受试者的器官中组织的再生的方法，该方法包括向该受试者施用包含诱导该受试者中的靶细胞的细胞周转的化合物的组合物，其中施用一定量的组合物，相对于未用该组合物治疗的受试者，该量足以增加该组织的再生。

76.如权利要求75所述的方法，其中该化合物诱导该靶细胞中的内质网(ER)应激。

77.如权利要求76所述的方法，其中该ER应激包括未折叠蛋白反应。

78.如权利要求75所述的方法，其中该化合物诱导该靶细胞中的凋亡。

79.如权利要求75所述的方法，其中该化合物诱导该靶细胞中活性氧物质(ROS)的产生。

80.如权利要求75所述的方法，其中该靶细胞中ROS的产生处于足以诱导该靶细胞死亡的水平。

81.如权利要求75至80中任一项所述的方法，其中该化合物是小分子。

82.如权利要求75至80中任一项所述的方法，其中该化合物是蛋白质。

83.如权利要求75至82中任一项所述的方法，其中该化合物靶向该组织再生增加的器官。

84.如权利要求75至83中任一项所述的方法，其中该化合物靶向肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、骨、肠内衬、心脏或肺脏。

85.如权利要求75所述的方法，其中该化合物与靶向该组织再生增加的器官的抗体缀合。

86.如权利要求85所述的方法，其中该抗体与该组织再生增加的器官的组织特异性抗原特异性结合。

87.如权利要求85或86所述的方法，其中该抗体靶向肝脏。

88.如权利要求75至87中任一项所述的方法，其中该化合物是毒素。

89.如权利要求88所述的方法，其中该化合物选自由以下构成的组：硫代乙酰胺、衣霉素、PhenolaTi、玉米赤霉烯酮、志贺毒素-2、四氯化碳(CCL4)和对乙酰氨基酚。

90.如权利要求75所述的方法，其中该化合物是化学治疗剂。

91.如权利要求75至90中任一项所述的方法，其中该化合物不是诱导铁依赖性细胞分解的化合物。

92.如权利要求75至91中任一项所述的方法，其中该靶细胞是肝脏细胞，并且该组织是肝脏组织；该靶细胞是肾脏细胞，并且该组织是肾脏组织；该靶细胞是肺脏细胞，并且该组织是肺脏组织；该靶细胞是肌肉细胞，并且该组织是肌肉组织；该靶细胞是骨细胞，并且该组织是骨组织；该靶细胞是胰腺细胞，并且该组织是胰腺组织；该靶细胞是心脏细胞，并且该组织是心脏组织；该靶细胞是肠内衬细胞，并且该组织是该肠内衬；该靶细胞是皮肤细胞，并且该组织是皮肤组织；该靶细胞是该CNS的细胞，并且该组织是CNS组织；该靶细胞是上皮细胞，并且该组织是上皮；或者该靶细胞是内皮细胞，并且该组织是内皮。

93.如权利要求75至91中任一项所述的方法，其中该靶细胞在该组织再生增加的器官或组织中。

94.如权利要求75至91中任一项所述的方法，其中该靶细胞在与该组织再生增加的器官或组织邻接的组织中。

95.如权利要求75所述的方法，其中该靶细胞选自由以下构成的组：上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。

96.如权利要求95所述的方法，其中该免疫细胞是单核细胞或巨噬细胞。