KR20120090931A - 심혈관 및 대사성 질환, 예컨대 제2형 당뇨병의 치료를 위한 ｎｋｇ2ｄ 억제제의 용도 - Google Patents

심혈관 및 대사성 질환, 예컨대 제2형 당뇨병의 치료를 위한 ｎｋｇ2ｄ 억제제의 용도 Download PDF

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나 시옹
밍칸 시아
데이비드 에이치. 로렛
야콥 스텐 페터슨
토라 브리냐 뵈드바스도터
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
더 펜 스테이트 리서어치 파운데이션
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Abstract

본 발명은 NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 제2형 당뇨병 및/또는 심혈관 질환과 같은 병태를 치료 및 검출하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다.

Description

심혈관 및 대사성 질환, 예컨대 제2형 당뇨병의 치료를 위한 ＮＫＧ2Ｄ 억제제의 용도{USE OF NKG2D INHIBITORS FOR TREATING CARDIOVASCULAR AND METABOLIC DISEASES, SUCH AS TYPE 2 DIABETES}
정부 후원 연구
본 발명은 미국 농무부에 의해 수여된 승인 번호 PEN04143 및 미국 국립보건원 (NIH)에 의해 수여된 승인 번호 CA093678 하에 정부 지원을 받았다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 35 U. S. C.§ 1 19(e) 하에 2009년 8월 17일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 제61/234,425호 및 2010년 2월 12일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 제61/304,113호에 대해 우선권을 주장하며, 이들의 전문은 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은 NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 제2형 당뇨병 및/또는 심혈관 질환과 같은 병태의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배경
대다수의 및 증가하는 수의 사람들이 진성 당뇨병을 앓고 있다. 통상 당뇨병으로도 알려진 진성 당뇨병은 췌장 호르몬 인슐린의 상대적 또는 절대적 결핍으로 인해 혈당 수준의 상승을 초래하는 대사성 장애이다. 인슐린은 혈당 수준에 반응하여 췌장으로부터 혈액으로 분비되고, 주요 기능은 혈당을 체내 축적시켜 혈당 수준을 조절하는 것이다.
당뇨병은 제1형 및 제2형으로 알려져 있다. 제1형 당뇨병은 한편의 베타 세포를 표적으로 한 파괴적인 자가 면역 과정과 다른 한편의 베타 세포의 재생 능력 사이의 부적합한 균형으로 인한 췌장 베타 세포의 진행성 손실을 특징으로 한다. 이러한 불균형은 결국 베타 세포 및 내인성 인슐린 분비의 전체적인 손실을 초래한다. 제1형 당뇨병은 당뇨병의 5-10％를 차지한다. 제2형 당뇨병은 인슐린 내성 및 손상된 베타 세포 기능을 특징으로 하며, 이는 손상된 제1 단계 인슐린 분비, 감소된 베타 세포 펄스 질량 및 인슐린 결핍을 포함한다. 제2형 당뇨병은 당뇨병의 90-95％를 차지하는 상기 질환의 가장 흔한 형태이다.
당뇨병을 가진 사람은 당뇨병을 갖지 않은 사람보다 심혈관 질환이 발생할 확률이 2배 내지 4배 더 높다. 심혈관 질환은 지난 수십년에 걸쳐 상당히 개선된 요법에도 불구하고 제2형 당뇨병을 가진 사람들의 주요 합병증이며 주된 사망 원인이다. 심장 발작, 졸중 및 하지 절단의 증가된 위험성은 당뇨병을 가진 사람들의 조기 사망의 주요 원인이다. 비만, 고혈압, 이상지질혈증 및 신체적 비활동을 비롯한 심혈관 질환 위험 인자의 보다 높은 유병률은 제2형 당뇨병이 있는 경우에 통상 존재한다.
심혈관 질환은 가장 심각한 인간 건강 관심사이며, 미국 (U.S.) 내 제1 사망 원인이다. 미국 심장 학회에 따르면, 심혈관 질환 예방 및 요법 비용은 2008년 동안 미국에서만 $448.5 X 109으로 놀랄 만한 것이며, 이는 사회에 큰 재정적 부담을 유발할 것이다. 아테롬성 동맥경화증은 지방 물질 및 세포 성분으로 이루어진 플라크가 동맥 혈관의 내층에 쌓이는 심혈관 질환의 한 형태이다. 상기 질환은 기능이상성 대사성 병태, 예컨대 당뇨병을 가진 환자의 동맥의 민감한 영역에 침전된 비정상적 대사물질에 의해 시작되어, 면역 활성화 및 염증을 비롯한 여러 요인의 관여와 함께 진행된다.
비정상적 대사성 병태, 예컨대 당뇨병은 조직 염증 및 면역 세포 활성화를 유도하는 여러 세포 스트레스 반응을 초래하고, 이는 대사성 기능이상을 악화시켜 심혈관 질환 진행과 같은 장애의 기초가 되는 하위 결과를 유지시키는 악순환을 일으킨다. 그러나, 이러한 과정을 연결하는 분자 사건은 잘 알려져 있지 않아, 대사성 기능이상 및 심혈관 질환 합병증의 치료를 위해 면역계를 조절하려는 노력을 방해한다.
따라서, 대사성 기능이상-관련 질환, 예컨대 당뇨병, 및 또한 심혈관 질환 및 장애의 효과적인 예측, 예방 및 치료 방법이 필요하다.
본 발명의 개요
본 발명은, 제2형 당뇨병 및/또는 대사성 기능이상을 가진 환자 및 동물에서 상향조절되고, 혈관 및 간 염증, 대사성 기능이상 및 심혈관 질환 발생을 위한 면역 세포의 활성화에 있어서 중요한 역할을 할 면역 자극 분자 족의 발견에 관한 것이다. 특히, NKG2D (잠재적 면역 활성화 수용체)에 대한 자극 리간드의 상승된 수준은 제2형 당뇨병성 인간 환자, 및 또한 기능이상성 지질 대사 및 아테롬성 동맥경화증에 대한 동물 모델에서 발견되었다.
따라서, 본 발명은 NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 제2형 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 병태를 치료하기 위한 신규한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 제2형 당뇨병 또는 심혈관 질환 발생에 대한 소인, 또는 제2형 당뇨병 또는 심혈관 질환의 존재를 검출 및 진단하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제를 제2형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 제2형 당뇨병의 치료 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제를 제2형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 제2형 당뇨병의 치료 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제를, NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 병태의 치료 방법을 제공하며, 여기서 병태는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성 기능이상-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제를, NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 병태의 치료 방법을 제공하며, 여기서 병태는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성 기능이상-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은, 제2형 당뇨병을 치료하기 위한, 대상체에서 NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제의 용도에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은, 제2형 당뇨병을 치료하기 위한, 대상체에서 NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제의 용도에 관한 것이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은, NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태를 치료하기 위한, 대상체에서 NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제의 용도에 관한 것으로, 여기서 병태는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성 기능이상-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은, NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태를 치료하기 위한, 대상체에서 NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제의 용도에 관한 것으로, 여기서 병태는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성 기능이상-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시양태에서, NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태는 제2형 당뇨병이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 병태는 심혈관 질환이다.
몇몇 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 가용성 NKG2D, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, NKG2D 리간드, 및 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간의 것 또는 인간화된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 NKG2D (hNKG2D)와 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 NKG2D-발현 세포의 NKG2D-매개 활성화 또는 신호전달을 감소시킨다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 NKG2D와의 결합에서 하나 이상의 NKG2D 리간드와 경쟁한다. 몇몇 실시양태에서, NKG2D 리간드는 MICA/B이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 작용제의 투여는 대상체에서 혈당 수준의 감소, 내당능의 개선, 인슐린 내성의 감소, 체중의 감소, 혈압의 강하, 염증의 감소 또는 대사성 기능이상의 감소 중 하나 이상을 유발한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 정맥내, 복막내 또는 피하 투여된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 항당뇨제, 항비만제, 식욕조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로 인한 또는 당뇨병과 관련된 합병증의 치료제 및/또는 예방제, 및 비만으로 인한 또는 비만과 관련된 합병증 및 장애의 치료제 및/또는 예방제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 작용제를 더 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 추가 작용제는 (a) GLP-1 및 GLP-1 유도체 및 유사체, 엑센딘-4 및 엑센딘-4 유도체 및 유사체, 아밀린 및 아밀린 유도체 및 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드 (예컨대, 나테글리니드 및 레파글리니드), 글루코시다제 억제제, DPP-IV (디펩티딜 펩티다제-IV) 억제제, SGLT2 억제제, SGLT1 억제제 또는 효능제, 가스트린 및 가스트린 유사체 및 유도체, FGF-21 (섬유모세포 성장 인자 21) 및 FGF-21 유도체 및 유사체, 양성자 펌프 억제제, 예컨대 란소프라졸, 오메프라졸, 덱슬란소프라졸, 에소메프라졸, 판토프라졸, 및 라베프라졸, RXR 효능제, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 프로부콜, 덱스트로티록신, PPAR 효능제, 및 아디포넥틴 및 아디포넥틴 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈당 강하제; (b) 항고지방혈증제, HMG CoA 억제제 (스타틴), 예컨대 로바스타틴, 프라바스타틴 및 심바스타틴, 및 피브레이트, 예컨대 겜피브로질 및 클로피브레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액 지질 강하제 또는 지질 대사 조절제; (c) NPY (신경펩티드 Y) 길항제, PYY (폴리펩티드 YY) 효능제, PP (췌장 폴리펩티드) 효능제, Y2 수용체 효능제, Y4 수용체 효능제, 혼합형 Y2/Y4 수용체 효능제, MC4 (멜라노코르틴 4) 효능제, 오렉신 길항제, 글루카곤 및 글루카곤 유도체 및 유사체, CRF (코르티코트로핀 방출 인자) 효능제, CRF BP (코르티코트로핀 방출 인자 결합 단백질) 길항제, 우로코르틴 효능제, β3 효능제, MSH (멜라닌 세포-자극 호르몬) 효능제, MCH (멜라닌 세포-농축 호르몬) 길항제, CCK (콜레시스토키닌) 효능제, 세로토닌 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 재흡수 억제제, 혼합형 세로토닌 및 노르아드레날린성 화합물, 5HT (세로토닌) 효능제, 봄베신 효능제, 갈라닌 길항제, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 화합물, TRH (티레오트로핀 방출 호르몬) 효능제, UCP 2 또는 3 (비-커플링 단백질 2 또는 3) 조절제, 렙틴 효능제, DA 효능제 (브로모크립틴, 도프렉신), 리파제/아밀라제 억제제, RXR (레티노이드 X 수용체) 조절제, 히스타민 H3 길항제, 및 CART (코카인 암페타민 조절 전사) 효능제로 이루어진 군으로부터 선택되는 식품 섭취량 저하제 또는 에너지 소비량 증가제; 및 (d) β-차단제, 예컨대 알프레놀롤, 아테놀롤, 티몰롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤 및 메토프롤롤, ACE (안지오텐신 전환 효소) 억제제, 예컨대 베나제프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 알라트리오프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴, 칼슘 채널 차단제, 예컨대 니페디핀, 펠로디핀, 니카르디핀, 이스라디핀, 니모디핀, 딜티아젬 및 베라파밀, 및 α-차단제, 예컨대 독사조신, 우라피딜, 프라조신 및 테라조신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈압 강하제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 제2형 당뇨병을 치료하는 데 유용하다. 몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태를 치료하는 데 유용하다.
몇몇 실시양태에서, 상기 병태는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성 기능이상-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 병태는 제2형 당뇨병이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 병태는 심혈관 질환이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 가용성 NKG2D, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, NKG2D 리간드, 및 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간의 것 또는 인간화된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 NKG2D (hNKG2D)와 결합한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제이다. 몇몇 실시양태에서, NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제는 MICA/B 억제제이다. 몇몇 실시양태에서, MICA/B 억제제는 MICA/B-특이적 siRNA이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 항당뇨제, 항비만제, 식욕조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로 인한 또는 당뇨병과 관련된 합병증의 치료제 및/또는 예방제, 및 비만으로 인한 또는 비만과 관련된 합병증 및 장애의 치료제 및/또는 예방제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 작용제를 더 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 추가 작용제는 (a) GLP-1 및 GLP-1 유도체 및 유사체, 엑센딘-4 및 엑센딘-4 유도체 및 유사체, 아밀린 및 아밀린 유도체 및 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드 (예컨대, 나테글리니드 및 레파글리니드), 글루코시다제 억제제, DPP-IV (디펩티딜 펩티다제-IV) 억제제, SGLT2 억제제, SGLT1 억제제 또는 효능제, 가스트린 및 가스트린 유사체 및 유도체, FGF-21 (섬유모세포 성장 인자 21) 및 FGF-21 유도체 및 유사체, 양성자 펌프 억제제, 예컨대 란소프라졸, 오메프라졸, 덱슬란소프라졸, 에소메프라졸, 판토프라졸, 및 라베프라졸, RXR 효능제, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 프로부콜, 덱스트로티록신, PPAR 효능제, 및 아디포넥틴 및 아디포넥틴 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈당 강하제; (b) 항고지방혈증제, HMG CoA 억제제 (스타틴), 예컨대 로바스타틴, 프라바스타틴 및 심바스타틴, 및 피브레이트, 예컨대 겜피브로질 및 클로피브레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액 지질 강하제 또는 지질 대사 조절제; (c) NPY (신경펩티드 Y) 길항제, PYY (폴리펩티드 YY) 효능제, PP (췌장 폴리펩티드) 효능제, Y2 수용체 효능제, Y4 수용체 효능제, 혼합형 Y2/Y4 수용체 효능제, MC4 (멜라노코르틴 4) 효능제, 오렉신 길항제, 글루카곤 및 글루카곤 유도체 및 유사체, CRF (코르티코트로핀 방출 인자) 효능제, CRF BP (코르티코트로핀 방출 인자 결합 단백질) 길항제, 우로코르틴 효능제, β3 효능제, MSH (멜라닌 세포-자극 호르몬) 효능제, MCH (멜라닌 세포-농축 호르몬) 길항제, CCK (콜레시스토키닌) 효능제, 세로토닌 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 재흡수 억제제, 혼합형 세로토닌 및 노르아드레날린성 화합물, 5HT (세로토닌) 효능제, 봄베신 효능제, 갈라닌 길항제, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 화합물, TRH (티레오트로핀 방출 호르몬) 효능제, UCP 2 또는 3 (비-커플링 단백질 2 또는 3) 조절제, 렙틴 효능제, DA 효능제 (브로모크립틴, 도프렉신), 리파제/아밀라제 억제제, RXR (레티노이드 X 수용체) 조절제, 히스타민 H3 길항제, 및 CART (코카인 암페타민 조절 전사) 효능제로 이루어진 군으로부터 선택되는 식품 섭취량 저하제 또는 에너지 소비량 증가제; 및 (d) β-차단제, 예컨대 알프레놀롤, 아테놀롤, 티몰롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤 및 메토프롤롤, ACE (안지오텐신 전환 효소) 억제제, 예컨대 베나제프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 알라트리오프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴, 칼슘 채널 차단제, 예컨대 니페디핀, 펠로디핀, 니카르디핀, 이스라디핀, 니모디핀, 딜티아젬 및 베라파밀, 및 α-차단제, 예컨대 독사조신, 우라피딜, 프라조신 및 테라조신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈압 강하제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 제약상 허용되는 담체와 조합한, NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제; 및 (b) 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 제약상 허용되는 담체와 조합한, NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제; 및 (b) 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 제2형 당뇨병을 치료하는 데 유용하다.
몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태를 치료하는 데 유용하다.
몇몇 실시양태에서, 상기 병태는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성-기능이상 관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 병태는 제2형 당뇨병이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 병태는 심혈관 질환이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 가용성 NKG2D, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, NKG2D 리간드, 및 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 작용제는 NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간의 것 또는 인간화된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 NKG2D (hNKG2D)와 결합한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 키트는 항당뇨제, 항비만제, 식욕조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로 인한 또는 당뇨병과 관련된 합병증의 치료제 및/또는 예방제, 및 비만으로 인한 또는 비만과 관련된 합병증 및 장애의 치료제 및/또는 예방제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 작용제를 더 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 추가 작용제는 (a) GLP-1 및 GLP-1 유도체 및 유사체, 엑센딘-4 및 엑센딘-4 유도체 및 유사체, 아밀린 및 아밀린 유도체 및 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드 (예컨대, 나테글리니드 및 레파글리니드), 글루코시다제 억제제, DPP-IV (디펩티딜 펩티다제-IV) 억제제, SGLT2 억제제, SGLT1 억제제 또는 효능제, 가스트린 및 가스트린 유사체 및 유도체, FGF-21 (섬유모세포 성장 인자 21) 및 FGF-21 유도체 및 유사체, 양성자 펌프 억제제, 예컨대 란소프라졸, 오메프라졸, 덱슬란소프라졸, 에소메프라졸, 판토프라졸, 및 라베프라졸, RXR 효능제, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 프로부콜, 덱스트로티록신, PPAR 효능제, 및 아디포넥틴 및 아디포넥틴 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈당 강하제; (b) 항고지방혈증제, HMG CoA 억제제 (스타틴), 예컨대 로바스타틴, 프라바스타틴 및 심바스타틴, 및 피브레이트, 예컨대 겜피브로질 및 클로피브레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액 지질 강하제 또는 지질 대사 조절제; (c) NPY (신경펩티드 Y) 길항제, PYY (폴리펩티드 YY) 효능제, PP (췌장 폴리펩티드) 효능제, Y2 수용체 효능제, Y4 수용체 효능제, 혼합형 Y2/Y4 수용체 효능제, MC4 (멜라노코르틴 4) 효능제, 오렉신 길항제, 글루카곤 및 글루카곤 유도체 및 유사체, CRF (코르티코트로핀 방출 인자) 효능제, CRF BP (코르티코트로핀 방출 인자 결합 단백질) 길항제, 우로코르틴 효능제, β3 효능제, MSH (멜라닌 세포-자극 호르몬) 효능제, MCH (멜라닌 세포-농축 호르몬) 길항제, CCK (콜레시스토키닌) 효능제, 세로토닌 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 재흡수 억제제, 혼합형 세로토닌 및 노르아드레날린성 화합물, 5HT (세로토닌) 효능제, 봄베신 효능제, 갈라닌 길항제, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 화합물, TRH (티레오트로핀 방출 호르몬) 효능제, UCP 2 또는 3 (비-커플링 단백질 2 또는 3) 조절제, 렙틴 효능제, DA 효능제 (브로모크립틴, 도프렉신), 리파제/아밀라제 억제제, RXR (레티노이드 X 수용체) 조절제, 히스타민 H3 길항제, 및 CART (코카인 암페타민 조절 전사) 효능제로 이루어진 군으로부터 선택되는 식품 섭취량 저하제 또는 에너지 소비량 증가제; 및 (d) β-차단제, 예컨대 알프레놀롤, 아테놀롤, 티몰롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤 및 메토프롤롤, ACE (안지오텐신 전환 효소) 억제제, 예컨대 베나제프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 알라트리오프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴, 칼슘 채널 차단제, 예컨대 니페디핀, 펠로디핀, 니카르디핀, 이스라디핀, 니모디핀, 딜티아젬 및 베라파밀, 및 α-차단제, 예컨대 독사조신, 우라피딜, 프라조신 및 테라조신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈압 강하제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 대상체로부터 샘플을 얻는 단계; (b) 상기 샘플을, MICA/B 발현의 존재를 검출하는 하나 이상의 시약과 접촉시키는 단계; (c) 상기 샘플에서 MICA/B 발현의 수준을 측정하는 단계; 및 (d) MICA/B의 과발현을 대상체 내 제2형 당뇨병의 발생 또는 제2형 당뇨병의 존재에 대한 소인과 연관시키는 단계를 포함하는, 대상체 내 제2형 당뇨병의 발생 또는 제2형 당뇨병의 존재에 대한 소인을 검출하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 대상체로부터 샘플을 얻는 단계; (b) 상기 샘플을, MICA/B 발현의 존재를 검출하는 하나 이상의 시약과 접촉시키는 단계; (c) 상기 샘플에서 MICA/B 발현의 수준을 측정하는 단계; 및 (d) MICA/B의 과발현을 대상체 내 심혈관 질환의 발생 또는 심혈관 질환의 존재에 대한 소인과 연관시키는 단계를 포함하는, 대상체 내 심혈관 질환의 발생 또는 심혈관 질환의 존재에 대한 소인을 검출하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 시약은 MICA/B 항체이다.
몇몇 실시양태에서, 샘플은 혈청이다.
몇몇 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 샘플에서 MICA/B가 아닌 심혈관 질환 마커의 발현의 수준을 측정하는 단계, 및 상기 심혈관 질환 마커의 과발현 또는 저발현을 대상체 내 심혈관 질환의 발생 또는 심혈관 질환의 존재에 대한 소인과 연관시키는 단계를 더 포함한다.
도 1은 제2형 당뇨병성 환자의 혈청 내 가용성 MICA 단백질의 검출 및 다른 전-염증성 사이토킨의 발현과의 관련성을 나타내는 일련의 그래프이다. (A) 제2형 당뇨병성 환자의 혈액 내 가용성 MICA의 검출. 당뇨병성 환자의 혈청을 ELISA 키트 (R&D 시스템즈(R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재))를 사용하여 MICA 단백질에 대해 분석하였다. 혈청 MICA 수준을 계산하는 데 기초가 되는 재조합 MICA 단백질을 표준물로 사용하였다. x-축에서, 각각의 수는 환자를 나타낸다. (B 및 C) 인간 전-염증성 4-중 패널 (IL-6, TNF-α, IL-1β 및 IFN-γ) (메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)로 분석한, 동일한 환자의 혈청 내 IL-6 및 TNF-α 수준. (D) CRP ELISA 키트 (칼바이오테크 인크.(Calbiotech Inc., 미국 캘리포니아주 스프링 밸리 소재))로 분석한 제2형 당뇨병성 환자의 혈청 내 C-반응성 단백질 (CRP)의 혈청 수준. (E) 시험된 50명의 암 환자보다 평균적으로 높은 혈청 내 MICA 수준을 갖는 당뇨병 환자. 제2형 당뇨병성 환자에 대한 데이터를 그룹화하고, 50명의 암 환자로부터의 데이터와 비교하였다.
도 2는 인간 대동맥 플라크 상의 면역조직화학적 염색에 의한 MICA/B의 검출을 나타내는 일련의 동결절편의 현미경사진이다. 플라크의 동결절편을 항-MICA/B 항체 (A, C, E, G)로 염색하였다. 인접한 절편을 항-Mac-3 또는 CD31 항체로 염색하여 대식세포 또는 내피세포를 나타내었다 (B, D, F, H). 정상적인 대동맥의 절편을 MICA 염색에 대한 대조군으로 사용하였다 (I).
도 3은 ApoE-/- 마우스의 아테롬성 동맥경화성 플라크에서 NKG2D 리간드의 상향조절을 입증하는 일련의 전기영동 겔의 현미경사진 및 일련의 면역조직화학적으로 염색된 동결절편의 현미경사진이다. (A) 대동맥 플라크 병변의 RNA에서의 NKG2D 리간드 Rae-1δ, Rae-1ε 및 H60b에 대한 전사물의 반-정량적 RT-PCR 분석. (B) 서구식 식이 (WD)-공급된 ApoE-/- 및 연령-매칭된 서구식 식이 및 정상 식이-공급된 야생형 마우스의 대동맥궁 영역으로부터 단리된 RNA 샘플에서의 Rae-1δ, Rae-1ε 및 H60b 전사물의 실시간 RT-PCR 분석. 실험은 2회 수행되었다. (C) 천연 플라크 발생 ApoE-/- 마우스 (우측) 또는 STZ-유도된 당뇨병에 의해 가속화된 플라크 발생 ApoE-/- 마우스 (좌측)로부터의 플라크의 동결절편의 면역조직화학적 염색. 상기 절편을 항-Rae-1 또는 H60 항체 (갈색) 및 항-CD68 항체 (청색)으로 함께 염색하였다. (D) NKG2D 리간드 Rae-1 및 H60에 대한 서구식 식이-공급된 ApoE-/- 마우스의 아테롬성 동맥경화성 대동맥의 면역조직화학적 염색. 동일한 서구식 식이-공급된 ApoE-/- 마우스의 아테롬성 동맥경화성 대동맥궁 영역의 동결절편 (상부 및 중간) 및 "플라크가 없는" 흉부 영역의 동결절편 (하부)을 폴리클로날 염소 항-마우스 항-Rae-1 (R&D 시스템즈) 또는 H60 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology))로 염색하였다. 중간의 도면은 상부 패널의 상자 영역 (100X)의 보다 큰 확대 (400X)였다. (E) ApoE-/- 마우스의 아테롬성 동맥경화성 대동맥 또는 야생형 마우스의 정상 대동맥으로부터 단리된 대식세포 및 내피세포 상의 세포 표면 Rae-1 발현의 유세포 분석. 대식세포를 CD45+CD11b+CD16/32+ 집단에 대해 게이팅하고, 내피세포를 CD45-CD31+ 집단에 대해 게이팅하였다. 회색 부분이 이소형-매칭된 대조군 항체 염색을 나타내었다. (F) 시험관내 처치된 야생형 대식세포에서의 전체 Rae-1 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석. (G) 배지 단독, 및 추가의 oxLDL, 천연 LDL (nLDL) 및 LPS (대조군)의 존재하에 배양된 야생형 대식세포의 다양한 NKG2D 리간드 상향조절에 대한 반-정량적 RT-PCR 분석. (H) 산화된 LDL (oxLDL) 또는 최종당화산물 (AGE)의 존재하에 시험관내 배양된 야생형 대식세포 상의 Rae-1 발현의 유세포 분석. 대식세포를 복막강으로부터 단리하고, 5 μg/ml oxLDL 또는 200 μg/ml AGE를 함유한 배지에서 2일 동안 시험관내 배양한 후, 다음을 제외하고는 패널 E와 유사하게 유세포 분석하였다: 점선은 10배 많은 비표지된 항-pan-Rae-1 항체의 존재하에 염색된 것임.
도 4는 당뇨병성 ApoE-결손 마우스에서 항-NKG2D 항체에 의한 플라크 형성의 저해를 나타내는, ApoE-결손 마우스로부터의 대동맥의 일련의 현미경사진이다. (A) 대표적인 항-NKG2D 또는 대조군 항체로 처치된 당뇨병성 ApoE-결손 마우스의 대동맥 내 플라크 형성. 대동맥을 PBS로 관류시키고, 명백한 불투명 플라크를 해부 현미경으로 관찰하였다. 항-NKG2D 항체-처치된 마우스에서 현저히 감소된 플라크의 크기에 주목한다 (원형 부분). (B) 하나의 대표적인 실험으로부터의 항-NKG2D (MI-6) 및 대조군 항체 (대조군) 처치된 ApoE-/- 마우스에서의 지질 내용물의 침착에 대한 대동맥의 페이스 오일 레드 O 염색. 대동맥을 개방시키고, 10％ 포르말린으로 고정시키고, 오일 레드 O 염료로 염색하였다. 지질 내용물은 암적색으로 염색되었다. 항-NKG2D 항체 처치된 마우스의 대동맥궁 영역에서 유의하게 적은 오일 레드 O 염색에 주목한다.
도 5는 NKG2D/리간드 상호작용의 표적화가 다양한 마우스 모델에서 아테롬성 동맥경화증을 예방한다는 것을 입증하는 일련의 그래프이다. (A) 스트렙토조토신-유도된 당뇨병성 ApoE-/- 마우스에서 아테롬성 동맥경화증 발생에 대한 항-NKG2D 항체의 차단 효과. 대조군 및 항-NKG2D 처치된 당뇨병성 ApoE-/- 마우스의 대동맥에 대한 플라크의 크기를 전체 대동맥궁 영역 중 오일 레드 O 양성 염색 영역의 비에 기초하여 계산하였다. (B 및 C) 스트렙토조토신-유도된 당뇨병성 (B) 또는 서구식 식이-공급된 (C) KLRK1-/-ApoE-/- 마우스 (KLRK1 유전자는 NKG2D 단백질을 코딩함)에서의 아테롬성 동맥경화증 발생에 대한 NKG2D 녹아웃의 효과. 플라크 크기를 패널 A와 동일한 방식으로 계산하였다. ApoE-/- 마우스를 대조군으로 사용하였다.
도 6은 항-NKG2D 항체 처치된 당뇨병성 ApoE-결손 마우스의 혈청 내 감소된 전-염증성 사이토킨을 나타내는 일련의 그래프이다. 2마리의 각각 연령-매칭된 야생형 B6 (야생형), 즉, 1개월령 (소아 ApoE) 또는 8개월령 (노령 ApoE) ApoE-/- 마우스와 함께 4마리의 항-NKG2D (MI-6 Ab)-처치된 및 3마리의 대조군 항체 (Con Ab)-처치된 당뇨병성 ApoE-결손 마우스의 혈청을 마우스 전-염증성-7중 키트 (IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-12p70, IL-10, IL-1β 및 KC/CXCL1) (메조 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재) 상에서 직접 분석하였다. 별표 *는 항-NKG2D 항체 및 대조군 항체 처치된 당뇨병성 ApoE-/- 마우스 사이의 값에서의 통계학상 유의한 차이를 나타낸다.
도 7은 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스 (결함이 있는 NKG2D 유전자를 가짐)의 혈청 내 감소된 전-염증성 사이토킨을 나타내는 일련의 그래프이다. 서구식 식이-공급된 (12마리의 마우스/군) (패널 A) 또는 STZ-유도된 당뇨병성 (4마리의 마우스/군) (패널 B) KLRK1-/-ApoE-/- 및 ApoE-/- 마우스의 혈청을 도 6에서와 같이 마우스 전-염증성-7중 키트 (IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-12p70, IL-10, IL-1β 및 KC/CXCL1) (메조 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)로 직접 분석하였다. 별표는 항-NKG2D 항체 및 대조군 항체 처치된 당뇨병성 ApoE-/- 마우스 사이의 값에서의 통계학상 유의한 차이를 나타낸다 (***p<0.01; *p<0.05).
도 8은 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스 혈청의 현미경사진 한 쌍과 이들 마우스에서 완화된 대사성 병태를 나타내는 그래프 한 쌍을 나타낸다. (A) 서구식 식이-공급된 ApoE-/- 마우스보다 서구식 식이-공급된 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스의 혈청의 보다 투명한 외형. (B) KLRK1-/-ApoE-/- 마우스의 혈액 내 감소된 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준. 패널 A의 혈청을 총 콜레스테롤 및 트리글리세리드에 대해 분석하였다. 별표 **는 KLRK1/ApoE-이중 녹아웃 및 ApoE-녹아웃 마우스 사이의 값에서의 통계학상 유의한 차이를 나타낸다 (**p<0.05). 각각의 군에 대해, 5마리 이상의 마우스를 사용하였다.
도 9는 ApoE-/- 마우스와 비교하여 NKG2D-녹아웃 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스에서의 감소된 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 활성을 나타내는 그래프이다. 각각의 군에 대해, 5마리 이상의 마우스를 사용하였다.
도 10은 NKG2D/리간드 상호작용을 막는 것이 서구식 식이-공급된 ApoE-/- 마우스의 간의 염증을 감소시킨다는 것을 나타내는 한 쌍의 그래프이다. (A) NKG2D-녹아웃 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스의 생체외 배양된 간 추출물에 의한 감소된 IL-6 생성. PBS-관류시킨 간을 서구식 식이-공급된 ApoE-/- 또는 NKG2D-녹아웃 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스로부터 절제하였다. 동일한 중량의 절제된 간을 약 1 mm3 정육면체로 절단하고, 배지에서 1일 또는 3일 동안 배양하였다. 배양 배지를 회수하고, ELISA로 사이토킨에 대해 분석하였다. 실험을 2회 반복하였다. (B) 서구식 식이-공급된 NKG2D-녹아웃 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스의 간에서의 감소된 면역 세포 침윤. 간 하나당 각각의 유형의 면역 세포의 수를 간으로부터 단리된 전체 단핵구 및 각각의 유형의 백분율에 기초하여 계산하였다. 각각의 군에 대해, 3마리 이상의 마우스를 사용하였다. 3개의 독립 실험 중 대표적인 하나를 나타내었다.
도 11은, NKG2D 리간드가 서구식 식이-공급된 ApoE-/- 마우스의 간 세포에서 상향조절되고, NKG2D/리간드 상호작용을 막는 것이 간에서 NKG2D-발현 면역 세포의 활성화를 감소시킨다는 것을 나타내는 일련의 그래프 및 형광 활성화된 세포 선별 분석 플로팅이다. (A) 8주 동안 서구식 식이-공급된 12주령 수컷 ApoE-/- 마우스 및 동일 연령의 야생형 마우스의 간 및 다른 기관에서의 Rae-1δ 전사물의 실시간 RT-PCR 분석. (B) 서구식 식이-공급된 ApoE-/- 마우스 및 야생형 마우스의 간의 정제된 대식세포에서의 Rae-1δ 전사물의 실시간 RT-PCR 분석. (C 및 D) 서구식 식이-공급된 ApoE-/- 마우스의 간 대식세포 (C) 및 간세포 (D)에서의 Rae-1 발현의 유세포 분석. (E) NKG2D-녹아웃 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스의 간 NKT 세포에 의한 IFN-γ 및 IL-4의 감소된 생성. (F) ApoE-/- 마우스의 간 NK 세포에 의한 IFN-γ 생성보다 적은 NKG2D-녹아웃 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스의 간 NK 세포에 의한 IFN-γ 생성. (G) NKG2D-녹아웃 KLRK1-/-ApoE-/- 및 ApoE-/- 마우스의 간 대식세포에 의한 IL-6 생성은 차이가 없음.
도 12는 NKG2D를 표적화하는 것이 제2형 당뇨병을 저해한다는 것을 입증하는 그래프이다. 8주령 ApoE-/- 및 NKG2D-결핍 ApoE-/-KLRK1-/- 마우스에 3개월 동안 서구식 식이를 공급하였다. 이어서, 혈액 혈청을 수집하고, 글루코스 수준을 평가하였다. ApoE-/- 및 ApoE-/-KLRK1-/- 마우스의 글루코스 수준은 각 군의 6마리의 마우스의 평균이였다. 두 군 사이의 차이는 통계학상 유의하다 (p< 0.05).
도 13은 게르빌 사모미스 오베수스(gerbil Psammomys obesus) (또한 모래쥐로도 알려짐), 즉, 제2형 당뇨병의 동물 모델에서의 당뇨병의 발생에 대한 항-NKG2D 항체의 효과를 나타낸다. 수컷 및 암컷 사모미스 오베수스 (할란(Harlan, 이스라엘 예루살렘 소재))가 9주령이 될 때까지 저에너지 (2.4 kcal/g) 식이를 공급하고, 이 후 임의로 고에너지 (3.1 kcal/g)의 무제한(ad libitum) 식이로 바꾸고, 이 기간 동안 최대 10일까지 (유도 기간) 체중 (BW) 및 오전 혈당 (mBG)을 지켜보았다. 증가된 mBG 수준 (2회의 연속적인 판독 결과, mBG > 10 mmol/L로 정의됨)을 나타내는 동물을 다시 저에너지 식이로 바꾸고, 이들의 mBG 수준이 비-당뇨병성 수준으로 돌아오는 10일 후에 실제 연구 (방지 모드)에서 사용하였다. 유도 기간 동안 mBG의 어떠한 증가도 나타내지 않은 동물은 희생시키고, 더이상 사용하지 않았다 (데이터를 나타내지 않음). 사모미스 오베수스를 매주 복막내 주사에 의해 비히클 (N=19) 또는 NKG2D-PE 항체 (클론 CX5) (N=9)로 처치하였다. 연구를 6주에 걸쳐 수행하고, 이 기간 동안 mBG 및 BW를 정기적으로 지켜보았다. 비히클 군의 모든 동물은 14.5 ± 2.6 mM (평균 ± sem)의 평균 mBG를 갖는 심각한 당뇨병성을 나타낸 반면에, NKG2D 항체로 처치된 동물군은 정상 혈당 (mBG<8 mM)을 유지하였고, 8.0 ± 1.9 mM, p<0.0001 (평균 ± sem)의 현저히 낮은 mBG를 가졌다. NKG2D 항체로의 처치는 전체적으로 사모미스 오베수스에서 제2형 당뇨병의 발생을 억제하였으며, 비히클 군의 5마리의 동물들은 연구 기간 동안 심각한 당뇨병성 케톤산증으로 인해 희생당하였다. 두 처치 군에서 BW 증가의 차이는 없었다.
도 14는 사모미스 오베수스 (모래쥐), 즉, 제2형 당뇨병의 동물 모델로부터의 혈액 세포와 결합하는 NKG2D 항체의 유세포 분석을 나타낸다. 투여-의존성 결합은 모래쥐 혈액 내 NK 세포에 대한 항-마우스 NKG2D-PE 항체 (클론 CX5)에 대해 관찰되었다. 이소형 대조군 항체 (래트 IgG1-PE 이소형 대조군 (R3-34) 및 마우스 IgG1-PE 이소형 대조군 (MOPC-21)) 또는 항-인간 NKG2D 항체 (클론 1D11 및 클론 ON72)의 결합이 없었으므로, 상기 결합은 특이적이었다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어는 본 발명이 속하는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 동의어로서 사용되어 길이 또는 번역후 변형, 예를 들어 당화 또는 인산화와는 무관하게 아미노산의 임의의 펩티드-연결된 쇄를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "MICA/B 단백질" 또는 "MICA/B 폴리펩티드"는 MHC 클래스 I 쇄-관련된 A 또는 B 유전자의 발현 생성물, 예컨대 천연 인간 MICA 단백질 (기탁 번호 L14848), 또는 상기와 적어도 65％ (바람직하게는, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99％)의 아미노산 서열 동일성을 공유하며 천연 MICA 단백질의 기능적 활성을 나타내는 단백질, 또는 천연 인간 MICB 단백질 (기탁 번호 NM_005931), 또는 상기와 적어도 65％ (바람직하게는, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99％)의 아미노산 서열 동일성을 공유하며 천연 MICB 단백질의 기능적 활성을 나타내는 단백질을 의미한다. 단백질의 "기능적 활성"은 단백질의 생리학상 기능과 관련된 임의의 활성이다. 예를 들어, 천연 MICA/B 단백질의 기능적 활성은 NKG2D와의 결합, 및 면역 활성화, 예컨대 사이토킨의 분비의 유도를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "NKG2D 단백질" 또는 "NKG2D 폴리펩티드"는 KLRK1 유전자의 발현 생성물, 예컨대 천연 인간 NKG2D 단백질 (기탁 번호 574240), 또는 상기와 적어도 65％ (바람직하게는, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99％)의 아미노산 서열 동일성을 공유하며 천연 NKG2D 단백질의 기능적 활성을 나타내는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 천연 NKG2D 단백질의 기능적 활성은 그의 리간드와의 결합, 및 그의 유전자 발현 및 활성화를 조절하기 위한 면역 세포에의 신호 전달을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자"는 특정 단백질에 대해 코딩하는 핵산 분자, 또는 소정의 경우에서 기능적 또는 구조적 RNA 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "MICA/B 유전자", "MICA 유전자", "MICB 유전자", "MICA/B 폴리뉴클레오티드", "MICA 폴리뉴클레오티드", "MICB 폴리뉴클레오티드", "MICA/B 핵산", "MICA 핵산" 또는 "MICB 핵산"은 천연 인간 MICA 또는 MICB-코딩 핵산 서열, 예를 들어 천연 인간 MICA 유전자 (기탁 번호 L14848); 예를 들어, 천연 인간 MICB 유전자 (기탁 번호 NM_005931), 이로부터 MICA 또는 MICB cDNA가 전사될 수 있는 서열을 갖는 핵산; 및/또는 상기의 대립유전자 변이체 및 상동체를 의미한다. 상기 용어는 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA 및 RNA를 포함한다.
본원에서 사용되는 "KLRK1", "Klrk1", "KLRK1 유전자", "Klrk1 유전자", "NKG2D 유전자", "NKG2D 폴리뉴클레오티드" 또는 "NKG2D 핵산"은 천연 인간 NKG2D-코딩 핵산 서열, 예를 들어 천연 인간 KLRK1 유전자 (기탁 번호 574240); 이로부터 KLRK1 cDNA가 전사될 수 있는 서열을 갖는 핵산; 및/또는 상기의 대립유전자 변이체 및 상동체를 의미한다. 상기 용어는 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA 및 RNA를 포함한다.
본원에서 사용되는 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 2개 이상의 뉴클레오티드의 쇄, 예컨대 RNA (리보핵산) 및 DNA (데옥시리보핵산)를 의미한다. 본원에 기재된 것과 같은 핵산 분자는 RNA 형태 또는 DNA (예를 들어, cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA) 형태일 수 있다. DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있으며, 단일-가닥인 경우에, 코딩 (센스) 가닥 또는 비-코딩 (안티센스) 가닥일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "환자", "대상체" 및 "개체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 치료되고/거나 생물학적 샘플을 얻기 위한 포유동물 (예를 들어, 인간) 대상체를 의미한다.
본원에서 사용되는 "결합하다", "결합" 또는 "상호작용하다"는 한 분자가 샘플 또는 유기체에서의 특정한 제2 분자를 인식하고 그에 부착되지만, 샘플에서의 다른 구조적으로 관련없는 분자를 실질적으로 인식하거나 그에 부착되지는 않는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "표지된"은 프로브 또는 항체와 관련하여 검출가능한 물질과 프로브 또는 항체와의 커플링 (즉, 물리적 연결)에 의한 프로브 또는 항체의 직접 라벨링을 포함하려고 한다.
핵산 분자 또는 폴리펩티드가 언급되는 경우에, 본원에서 사용되는 용어 "천연"은 자연 발생 (예를 들어, WT) 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "진단학적", "진단하다" 및 "진단되는"은 병리 증상의 존재 또는 성질의 확인을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "샘플"은 본원에서 가장 넓은 의미로 사용된다. 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 항체 등을 포함하는 샘플은 체액, 세포 표본 또는 배지 (여기서 세포가 성장됨)의 가용성 분획물, 게놈 DNA, RNA 또는 cDNA, 세포, 조직, 피부, 모발 등을 포함할 수 있다. 샘플의 예에는 타액, 혈청, 생검 표본, 혈액, 요 및 혈장이 포함된다.
본원에서 사용되는 "서열 동일성"은 2개 서열이 소단위 매칭을 최대화하도록 정렬되는 경우에 (즉, 갭(gap) 및 삽입이 고려됨), 2개 서열에서의 상응하는 위치에서의 동일한 소단위의 백분율을 의미한다. 2개 서열 모두에서의 소단위 위치가 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산에 의해 점유되는 경우에 서열 동일성이 존재하며, 예를 들어 소정의 위치가 각각의 2개의 DNA 분자에서 아데닌에 의해 점유되는 경우에 분자는 그 위치에서 동일하다. 예를 들어, 길이가 10개 뉴클레오티드인 서열에서의 7개 위치가 제2의 10개 뉴클레오티드 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 경우에, 2개 서열은 70％ 서열 동일성을 갖는다. 전형적으로, 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, 지네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group; 미국 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터(University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705) 소재)의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 사용하여 측정된다.
핵산 분자에서의 돌연변이가 언급되는 경우에, "침묵" 변화("silent" change)는 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 염기쌍을 치환하지만, 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지는 않는 것이다. "보존적" 변화는 핵산의 단백질-코딩 영역에서의 하나 이상의 코돈이 변화되어 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또다른 아미노산으로 치환되도록 한다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드", "siRNA" "siRNA 올리고뉴클레오티드" 및 "siRNA의"는 명세서를 통해 상호교환적으로 사용되며, 천연 및/또는 변형된 단량체 또는 연결의 선형 또는 환형 올리고머를 포함하며, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 그의 치환된 형태 및 알파-아노머 형태, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 등이 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 규칙적인 패턴의 단량체-대-단량체 상호작용, 예컨대 왓슨-크릭(Watson-Crick) 형의 염기쌍 형성, 후그스틴(Hooegsteen) 또는 역 후그스틴 형의 염기쌍 형성 등에 의해 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 전장 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 및 문맥상 달리 언급되거나 또는 모순되지 않는다면 항원-결합 단편, 항체 변이체 및 그의 다중특이적 분자를 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 포함한다. 일반적으로, 전장 항체는 디술피드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중 (H) 쇄 및 2개의 경 (L) 쇄를 포함하는 당단백질, 또는 그의 항원 결합 부분이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 축약됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성되어 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 축약됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 구성되어 있다. 추가적으로, VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역 사이에 배치된, 상보적 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성(hypervariability)의 영역으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 하기 순서로 배열되는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어져 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체 분자 구조의 일반적 원칙 및 항체의 생성과 관련된 다양한 기법은 예를 들어 문헌 [Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)]에서 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 항-NKG2D 항체는 NKG2D 활성화 및/또는 신호전달을 방해하는 NKG2D의 일부와 결합할 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 항-NKG2D 항체는 또한 NKG2D 리간드 결합 상호작용을 방해하는 NKG2D의 부분과 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 항체의 "항원-결합 단편"은 항원과 검출가능하게 결합할 수 있는 전장 항체의 부분을 포함하는 분자이며, 전형적으로는 적어도 VH 영역의 하나 이상의 부분을 포함한다. 항원-결합 단편은 항체의 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 항원-결합 부분, 및 단일-쇄 구조물을 포함하는 다가 분자를 포함하며, 여기서 VL 및 VH 영역, 또는 이들의 선택된 부분은 합성 링커 또는 재조합 방법에 의해 연결되어 기능적, 항원-결합 분자를 형성한다. 항체의 몇몇 항원-결합 단편은 보다 큰 항체 분자의 실제적인 단편화 (예를 들어, 효소적 절단)에 의해 얻어질 수 있지만, 대부분은 전형적으로는 재조합 기법에 의해 제조된다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하려고 하며, 여기서 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다는 인간 생식계 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된다 (즉, 동일하거나 본질적으로 동일하다). 게다가, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 인간 생식계 이뮤노글로불린 서열"로부터 유래된다". 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내의 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발, 또는 생체내의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)가 포함된다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 또다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그래프팅된 것인 항체를 포함하려고 하지는 않는다.
본원에서 사용되는 "인간화" 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 인간/비-인간 키메라 항체이다. 대개, 인간화 항체는 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이며, 여기서 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종, 예컨대 마우스, 래트, 래빗 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기 (공여자 항체)로 대체된다. 몇몇 경우에서, 인간 이뮤노글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 게다가, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가적으로 재조정하도록 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모든 하나 이상, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 루프에 해당하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 인간 이뮤노글로불린 서열의 잔기이다. 임의로, 인간화 항체는 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함한다. 추가의 세부사항에 대하여, 예를 들어 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)], WO 92/02190, 미국 특허 출원 20060073137, 및 미국 특허 6750325, 6632927, 6639055, 6548640, 6407213, 6180370, 6054297, 5929212, 5895205, 5886152, 5877293, 5869619, 5821337, 5821123, 5770196, 5777085, 5766886, 5714350, 5693762, 5693761, 5530101, 5585089 및 5225539를 참조한다.
본원에서 사용되는 "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의되는 CDR 이외의 이들의 VH 또는 VL 잔기이다.
본원에서 사용되는 "에피토프" 또는 "결합 부위"는 항원-결합 펩티드 (예컨대, 항체)가 특이적으로 결합하는 항원에서의 구역 또는 영역이다. 단백질 에피토프는 결합에 직접적으로 관여하는 아미노산 잔기 (에피토프의 면역우세 성분으로도 불림) 및 결합에 직접적으로 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (다시 말하면, 아미노산 잔기는 특이적 항원 결합 펩티드의 "용매-배재된 표면" 및/또는 "족문(footprint)" 내에 있다). 달리 언급하지 않는다면, 본원에서의 용어 에피토프에는 항-hNKG2D 항체 또는 본 발명에 따른 또다른 hNKG2D-특이적 작용제와 특이적으로 결합하는 hNKG2D의 임의의 특정 영역에서의 아미노산 결합 부위의 형태 모두를 포함한다 (예를 들어, 몇몇 상황에서 본 발명은 특정 아미노산 잔기와 직접 결합하는 항체에 관한 것이다). NKG2D는 수많은 상이한 에피토프를 포함할 수 있으며, 이는 (1) 선형 펩티드 항원 결정기, (2) 성숙 NKG2D 형태에서 서로의 근처에 위치된 하나 이상의 비-연속 아미노산으로 이루어진 형태 항원 결정기; 및 (3) NKG2D에 공유 부착된 분자 구조, 예컨대 카르보수화물 기로 전부 또는 부분적으로 이루어진 번역후 항원 결정기를 제한 없이 포함할 수 있다. 문맥에 의해 달리 구체화되거나 또는 모순되지 않는다면, 형태 항원 결정기는 항원-결합 펩티드의 원자로부터 약 4 Å 거리 내의 NKG2D 아미노산 잔기를 포함한다.
본원에서 사용되는 어구 관심있는 항체 (예를 들어, MS 또는 21F2)와 "본질적으로 동일한 에피토프 또는 결정기와 결합하는"은 항체가 NKG2D 분자 (관심있는 항체가 이에 특이적으로 결합함)에 대하여 관심있는 항체와 "경쟁하는"것을 의미한다.
본원에서 사용되는 항-NKG2D 항체가 NKG2D 분자의 천연 NKG2D-리간드 (예를 들어, MICA)와의 결합을 "차단하는" 능력은 가용성 또는 세포-표면 결합된 NKG2D 및 리간드 분자를 사용하는 검정에서 항체가 NKG2D-분자의 리간드와의 결합을 용량-의존적 방식으로 검출가능하게 감소시킬 수 있다는 것을 의미하며, 여기서 NKG2D 분자는 항체의 부재 하에 리간드와 검출가능하게 결합한다.
본원에서 사용되는 어구 "NKG2D 리간드 결합 상호작용"은 NKG2D와 그의 리간드 (예를 들어, MICA/B, ULBP/RAET1, Mult1, Rae-1δ, Rae-1ε 및 H60b) 사이의 특이적 인식 및 결합 상호작용을 의미한다. NKG2D 리간드 결합 상호작용을 조절할 수 있는 작용제의 예에는 가용성 NKG2D, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, NKG2D 리간드, 및 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제가 포함된다.
고콜레스테롤 및 고트리글리세리드 수준은 심혈관 질환 및 제2형 당뇨병의 위험을 증가시키는 지질 대사성 장애인 것으로 고려된다.
본원에서 사용되는 "당뇨병"은 췌장 호르몬 인슐린의 상대적 또는 절대적 결핍으로 인한 혈당 수준의 상승을 유발하는 대사성 장애를 의미한다. 하기 2가지 형태의 당뇨병이 있다: 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병. 제1형 당뇨병은 한쪽에서 베타 세포를 표적으로 하는 파괴성 자가면역 과정과 다른쪽에서 이들 세포의 재생 능력 사이의 순조롭지 않은 균형으로 인한 췌장 베타 세포의 진행성 손실을 특징으로 한다. 이러한 불균형은 결국 베타 세포 및 내인성 인슐린 분비의 완전한 손실을 유발한다. 제2형 당뇨병은 인슐린 내성 및 손상된 베타 세포 기능을 특징으로 하며, 이에는 손상된 제1기 인슐린 방출, 감소된 베타 세포 펄스량(pulse mass) 및 인슐린 결핍이 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 제2형 당뇨병의 치료에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 "제2형 당뇨병"은 신체가 인슐린의 작용에 내성이 있거나 또는 정상 글루코스 수준을 유지하기에 충분한 인슐린을 생성하지 않는 만성 병태를 의미한다. 또한, 이는 사람에서 질환, 예컨대 이상지질혈증의 초기 단계에 존재하는 대사성 기능이상을 의미한다.
본원에서 사용되는 어구 "심혈관 질환"은 심장 및 혈관과 관련된 기능에 영향을 미치는 비정상적 병태를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "안전한 유효량"은 본원에 기재된 것과 같이 사용되는 경우에 합리적인 이익/위험 비율에 상응하여 과도한 유해한 부작용 (예컨대, 독성, 자극 또는 알레르기성 반응) 없이 원하는 치료학적 반응을 산출하기에 충분한 성분의 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 유효량"은 원하는 치료학적 반응을 산출하기에 효과적인 본원에 기재된 조성물의 양, 예를 들어 아테롬성 동맥경화성 플라크의 발달을 지연시키는데 효과적인 양, 또는 당뇨병성 환자에서 혈당 수준을 저하시키고 체중 손실을 촉진시키는데 효과적인 양을 의미한다.
구체적인 안전한 유효량 또는 치료 유효량은 치료되는 특정 병태, 환자의 신체적 상태, 치료되는 포유동물 또는 동물의 유형, 치료 지속시간, 동시 요법 (존재하는 경우)의 성질, 및 이용되는 구체적인 제제, 및 화합물 또는 그의 유도체의 구조와 같은 인자에 의해 변할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "치료"는 치료제를 환자에게 적용 또는 투여하거나, 또는 치료제를 환자로부터의 단리된 조직 또는 세포주에 적용 또는 투여하는 것으로서 정의되며, 상기 환자는 질환, 질환의 증상 또는 질환에 대한 소인을 관리하거나, 치유하거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변경하거나, 치료하거나, 개선하거나, 낫게하거나 또는 영향을 미칠 목적의, 질환, 질환의 증상 또는 질환에 대한 소인을 갖는다. 예를 들어, 질환 또는 장애의 증상 또는 임상적으로 관련된 징후가 없는 것으로 확인된 환자의 치료는 예방적 또는 방지적 요법인 반면, 질환 또는 장애의 증상 또는 임상적으로 관련된 징후가 확인된 환자의 임상적, 치유적 또는 완화적 "치료"는 일반적으로 예방적 또는 방지적 요법이 되지 않는다. 대상체에서의 제2형 당뇨병의 치료에는 예를 들어 혈당 수준의 저하 및 대상체의 체중의 저하가 포함된다. 제2형 당뇨병 질환 진행의 억제에는 지질 대사성 병태의 예방 또는 억제, 인슐린 내성의 감소, 지질 대사성 장애의 예방 또는 억제, 내당능의 개선 등이 포함된다. 제2형 당뇨병의 치료 및 제2형 당뇨병 질환 진행의 억제에는 당뇨병과 관련된 증상, 장애 또는 질환, 예를 들어 대사성 증후군, 당뇨병성 망막증, 신장 부전증, 불량한 혈액 순환 및 그와 관련된 사지 장애의 완화 또는 예방이 포함될 수 있다. 각각의 치료 형태는 본 발명의 개별적인 측면으로 고려될 수 있다.
통상의 분자 생물학 기법을 포함하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 일반적으로, 이러한 기법은 당업계에 알려져 있으며, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992] (주기적으로 업데이트됨)과 같은 방법론적 논문에 상세하게 기재되어 있다. 또한, 유전자 전달 및 유전자요법의 통상의 방법이 본 발명의 사용에 적합화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gene Therapy: Principles and Applications, ed. T. Blackenstein, Springer Verlag, 1999]; [Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), ed. P.D. Robbins, Humana Press, 1997]; 및 [Retro-vectors for Human Gene Therapy, ed. C.P. Hodgson, Springer Verlag, 1996]을 참조한다. 일반적으로, 면역학 기법은 당업계에 알려져 있으며, 문헌 [Advances in Immunology, volume 93, ed. Frederick W. Alt, Academic Press, Burlington, MA, 2007]; [Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, eds. Gary C. Howard and Matthew R. Kaser, CRC Press, Boca Raton, Fl, 2006]; [Medical Immunology, 6th ed., edited by Gabriel Virella, Informa Healthcare Press, London, England, 2007]; 및 [Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988]과 같은 방법론적 논문에 상세하게 기재되어 있다.
비록 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법, 조성물 및 키트를 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용할 수 있지만, 적합한 방법, 조성물 및 키트는 하기 기재되어 있다.
본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원 및 특허는 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 상충되는 경우에는, 정의를 비롯한 본 명세서가 제어할 것이다. 하기 논의되는 특정 실시양태는 예시적일 뿐이며, 제한하려고 하지는 않는다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 면역 자극 분자 족이 당뇨병 또는 지질-대사성 기능이상을 갖는 환자 및 동물에서 상향조절되며 심혈관 질환 발생에 대해 중요하다는 발견을 기초로 한다. 본원에 기재된 데이터는 MICA/B 단백질이 제2형 당뇨병성 인간 환자의 혈청에서 상승되며 항-NKG2D 항체의 당뇨병성 마우스에의 주입이 NKG2D 리간드 상호작용을 차단하고 아테롬성 동맥경화성 플라크 형성을 유의하게 억제한다고 하는 최초의 증거를 제공한다. 또한, 본원에 기재된 데이터는 NKG2D/리간드 매개 면역 활성화가 제2형 당뇨병성 진행과 관련된다는 것을 나타낸다. 항-NKG2D 항체의 제2형 당뇨병의 동물 모델로의 주입은 당뇨병을 치료하고 혈당 수준을 유의하게 감소시킬 수 있었다. 또한, NKG2D/리간드 상호작용의 차단은 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준의 감소를 비롯하여 비정상적 대사성 병태를 완화시켰다.
따라서, MICA/B 및 다른 NKG2D 리간드는 제2형 당뇨병, 및 또한 당뇨병성 환자에서의 심혈관 질환 발생의 예측을 위한 신규한 분자 마커이고, 이들, 및 또한 NKG2D/리간드 상호작용은 제2형 당뇨병, 및 또한 다른 비정상적 대사성 병태 또는 질환 (예를 들어, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 불량한 혈액 순환, 사지 장애) 및 심혈관 질환 (예를 들어, 아테롬성 동맥경화증)의 예방 또는 치료를 위한 신규한 표적이다.
따라서, 본 발명은 제2형 당뇨병, 및 또한 다른 비정상적 대사성 병태, 예컨대 심혈관 질환 또는 장애의 검출 및 치료를 위한 신규한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다.
NKG2D는 여러 면역 세포, 예컨대 NK, NKT, ab T 및 gd T 세포에 의해 발현되는 면역 자극 분자이다. 그의 동족체 리간드에 의한 NKG2D의 자극은 NKG2D-발현 면역 세포의 활성화를 유발한다. NKG2D에 대한 리간드로서 기능할 수 있는 다수의 분자가 있으며, 이에는 마우스에서의 Rae-1, H60 및 Mult1의 구성원, 및 인간에서의 MICA/B 및 ULBP/RAET1 족의 단백질이 포함된다. 대부분의 NKG2D 리간드는 정상 세포에서 발현되지 않거나 또는 낮은 수준으로 발현되지만, 다양한 질환 병태에서 상향조절되며, 이는 또한 NKG2D-발현 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 이러한 면역 활성화는 숙주 방어, 예컨대 미생물 면역 및 종양 감시에서 중요한 역할을 담당하며, 이는 또한 면역-매개 질환에 기여할 수 있었다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 MICA/B 단백질을 검출하여 대상체에서 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환의 존재의 검출 또는 발생의 예측을 위한 방법 및 키트를 제공한다. 대사성 기능이상-관련 질환에는 고혈당증, 당뇨병성 망막증, 불량한 혈액 순환, 사지 장애 및 이상지질혈증 (예를 들어, 고콜레스테롤 및 고트리글리세리드)이 포함된다.
본원 실시예 1에 기재된 데이터는 NKG2D 리간드가 제2형 당뇨병성 환자에서 상향조절되어 장기 염증 및 관련된 합병증을 촉진할 수 있다는 것을 나타낸다. 본원에 기재된 데이터는 상승된 수준의 MICA/B 단백질이 제2형 당뇨병성 인간 환자의 혈청 및 아테롬성 동맥경화성 플라크에서 검출되었다는 것을 제공한다. 또한, H60 및 Rae-1 (레티노산 초기 유도성 유전자-1) 단백질이 지질 대사 기능이상 및 아테롬성 동맥경화증에 대한 동물 모델인 당뇨병성 또는 비-당뇨병성 ApoE-/- 마우스의 혈관, 특히 아테롬성 동맥경화성 병변 영역, 및 간에서 상향조절되었으며, Mult1이 이들 동물의 혈청에서 상향조절되었다는 것이 발견되었다 (실시예 2 참조). 따라서, NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B 단백질 또는 ULBP/RAET1 단백질)의 상향조절은 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환의 존재의 검출 또는 발생의 예측에 유용할 수 있다.
제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환의 발생에 대한 소인, 또는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환의 존재를 검출하는 전형적인 방법은, 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 생물학적 샘플을 NKG2D 리간드의 발현 (예를 들어, MICA/B 발현)을 검출하는 하나 이상의 시약과 접촉시키는 단계; 생물학적 샘플에서 NKG2D 리간드의 발현의 수준을 측정하는 단계; 및 대상체에서 NKG2D 리간드의 과발현을 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환 발생에 대한 소인과 연관시키는 단계를 포함한다. 실시예 1에서 논의된 데이터에 의해 예시되는 것과 같이, 가용성 MICA/B 발현을 측정하였다. 그러나, 몇몇 실시양태에서, 막 형태의 MICA/B 발현을 측정할 수 있다. MICA/B 대신에 또는 MICA/B 이외에, 임의의 NKG2D 리간드의 발현을 분석할 수 있다. ULBP/RAET1 족의 단백질은 예를 들어 NKG2D 리간드이고, 혈청에 발하여 존재하는 것으로 발견되었으며, 이에 따라 MICA/B는 이들 단백질을 본원에 기재된 방법, 조성물 및 키트에 대한 적합한 마커가 되도록 할 수 있다. 예를 들어, NKG2D 리간드는 문헌 [Waldhauer, I. and A. Steinle, Oncogene, 27:5932-5943 (2008)]에 기재되어 있다.
몇몇 실시양태에서, NKG2D 리간드의 발현 (예를 들어, MICA/B 발현)을 검출하는 시약에는 임의의 적합한 시약, 예컨대 MICA/B 항체 및 가용성 NKG2D가 포함될 수 있다.
일반적으로, 생물학적 샘플은 혈청이다. 그러나, 임의의 적합한 생물학적 샘플을 사용할 수 있다. 추가의 생물학적 샘플의 예에는 생검 표본, 혈장, 요, 피부, 혈액 및 타액이 포함될 수 있다.
임의의 적합한 방법 또는 검정을 사용하여 대상체의 생물학적 샘플에서의 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B) 발현의 수준을 측정할 수 있다. 여러 항체-기반 검출 구성 방식은 당업계에 잘 알려져 있으며, ELISA (효소 결합 면역흡수 검정), 방사능 면역검정, 면역블롯, 웨스턴 블롯, 유세포 분석, 면역형광 검정, 면역침강, 단백질 A 검정, 면역전기영동 검정, 및 다른 관련된 기법이 포함된다. 몇몇 실시양태에서, 항체 결합은 1차 항체 상의 표지의 검출에 의해 검출된다. 또다른 실시양태에서, 1차 항체는 2차 항체 또는 시약의 1차 항체와의 결합의 검출에 의해 검출된다. 추가의 실시양태에서, 2차 항체를 표지한다. 면역검정에서의 결합의 검출을 위한 여러 수단이 당업계에 알려져 있으며, 본원에 기재된 조성물, 키트 및 방법의 범주 내에 있다. MICA/B 또는 다른 NKG2D 리간드에 특이적인 항체는 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B) 발현을 검출하기 위한 이들 절차 중 적어도 하나를 도입하는 진단학적 키트에 제공될 수 있다. 키트는 단백질의 검출 및 키트의 사용을 돕기 위한 다른 성분, 패키징, 설명서 또는 다른 물질을 함유할 수 있다.
제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환의 발생에 대한 소인, 또는 대상체에서 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환의 존재를 검출하는 방법은 MICA/B 또는 다른 NKG2D 리간드(들)의 과발현을 대상체에서 제2형 당뇨병, 심혈관 질환 발생, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환에 대한 소인, 또는 대상체에서 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환을 갖는 것과 연관시키는 것을 포함한다. 하나 이상의 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B)가 생물학적 샘플에서 과발현되는지는, 생물학적 샘플에서의 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B) 발현 수준을 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B)의 발현의 기준 수준 (대조 수준으로도 알려짐)과 비교하여 측정할 수 있다. "기준 수준"은 대조 수준이고, 몇몇 실시양태에서 정상 수준이거나 또는 제2형 당뇨병, 염증성 질환 또는 다른 대사성 기능이상-관련 질환을 가지며, 심혈관 질환에 대한 소인을 갖는 대상체에서 관찰되지 않는 수준이다. 따라서, NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B) 발현의 대조 또는 기준 수준을 기초로, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환 발생에 대해 평가되는 샘플이 기준 수준과 비교하여 NKG2D 리간드의 발현에서의 측정가능한 증가 (즉, 과발현, 상향조절), 감소, 또는 실질적으로 변화 없음을 갖는지를 측정할 수 있다. 소정의 실시양태에서, 기준 수준은 시험되는 대상체로부터의 이전 샘플로부터 확립되어, 대상체의 질환 상태를 시간에 걸쳐 모니터링하고/거나, 소정의 치료학적 프로토콜의 효능을 시간에 걸쳐 평가할 수 있도록 할 수 있다.
대상체에서 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환의 발생에 대한 소인, 또는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 염증 질환의 존재의 검출 방법의 몇몇 실시양태에서, NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B) 이외의 하나 이상의 마커의 발현을 분석한다. 또한, 하나 이상의 마커는 NKG2D 리간드일 수 있으며, 임의의 NKG2D 리간드의 발현을 분석할 수 있다. 측정될 수 있는 추가의 마커의 예에는 C-반응성 단백질, IL-6, TNF-α, sICAM-1, sCD40, ULBP/RAET1 족의 단백질 (예를 들어, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, RAET1G, RAET1L) 등이 포함된다. NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B) 이외의 하나 이상의 마커의 발현이 분석되는 실시양태에서, NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B) 및 다른 바이오마커의 조합은 혈관 질환 및/또는 대사성 기능이상-관련 질환 발생의 보다 신뢰할 수 있는 예상을 제공할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 생물학적 샘플을 NKG2D 리간드의 발현을 검출하는 1종 이상의 시약 및 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B) 이외의 하나 이상의 마커 각각의 발현의 존재를 검출하는 2종 이상의 시약과 접촉시킨다. 생물학적 샘플에서의 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B), 및 2종 이상의 추가의 마커의 발현 수준을 측정하며; NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B)의 과발현은 대상체에서 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 대사성 기능이상-관련 질환 (예를 들어, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 불량한 혈액 순환, 사지 장애 등) 발생에 대한 소인과 연관시킨다. 특정한 2종 이상의 추가의 마커에 따라서, 그의 저발현 또는 과발현을 대상체에서 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 대사성 기능이상-관련 질환 발생에 대한 소인과 연관시킬 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B 또는 ULBP/RAET1 단백질) 발현 (예를 들어, MICA/B 또는 ULBP/RAET1 발현의 억제) 및 활성 (예를 들어, NKG2D와의 결합)을 조절하여 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 또는 대사성 기능이상-관련 질환을 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 조성물은 본원에 기재된 것과 같은 심혈관 질환 (예를 들어, 아테롬성 동맥경화증)에 대해 소인이 있고/거나 발생된 대상체, 및/또는 대사성 기능이상-관련 질환, 예컨대 고콜레스테롤 또는 고트리글리세리드 수준, 당뇨병, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 불량한 혈액 순환, 사지 장애 등을 갖는 대상체의 치료에 유용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 조성물은 하나 이상의 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B 또는 ULBP/RAET1)의 발현 또는 활성/신호전달을 조절하기 위한 치료 유효량의 작용제, 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B 또는 ULBP/RAET1)의 억제제는 세포에서 NKG2D 리간드의 수준을 감소시키고/거나 세포에서 NKG2D 리간드의 활성을 감소시키는 활성이 있다. 세포에서 NKG2D 리간드의 수준을 감소시키는 활성이 있는 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B 또는 ULBP/RAET1)의 억제제는 NKG2D 리간드를 코딩하는 유전자의 전사 또는 번역의 억제제일 수 있다. 또한, 세포에서 NKG2D 리간드의 수준을 감소시키는 활성이 있는 NKG2D 리간드의 억제제는 NKG2D 리간드 및/또는 NKG2D 리간드-코딩 RNA의 분해를 자극할 수 있다. 전사 및/또는 번역의 억제제는 핵산-계 억제제, 예컨대 표적 NKG2D 리간드 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 또한 리보자임 및 DNA 효소 (이는 표적 mRNA의 분해에 촉매적 활성이 있음)일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 NKG2D 리간드를 코딩하는 유전자에 특이적인 siRNA를 포함한다. 서열-특이적 siRNA는 표적 핵산 분자와 결합하여, 그의 발현을 억제한다. siRNA의 전달을 위한 조성물 및 그의 치료 방법이 제공된다. 리보자임, siRNA 및 안티센스 분자의 구축 및 사용 방법은 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Isaka Y., Curr Opin Mol Ther, 9:132-136 (2007)]; [Sioud M. and Iversen P.O., Curr Drug Targets, 6:647-653 (2005)]; [Ribozymes and siRNA Protocols (Methods in Molecular Biology) by Mouldy Sioud, 2 nd ed., 2004, Humana Press, New York, New York]). "안티센스" 핵산은 단백질을 코딩하는 "센스" 핵산에 상보적인, 예를 들어 이중-가닥 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 또는 mRNA 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 전체 MICA/B 코딩 가닥에 상보적이거나, 또는 그의 일부에만 상보적일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 안티센스 핵산 분자는 NKG2D 리간드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 가닥의 "비코딩 영역" (예를 들어, 5' 및 3' 비번역 영역)에 대해 안티센스이다. 안티센스 작용제는 예를 들어 약 8개 내지 약 80개 뉴클레오염기 (즉, 약 8개 내지 약 80개 뉴클레오티드), 예를 들어 약 8개 내지 약 50개 뉴클레오염기, 또는 약 12개 내지 약 30개 뉴클레오염기를 포함할 수 있다. 안티센스 화합물에는 리보자임, 외부 안내 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드 (올리고자임), 및 표적 핵산과 혼성화하여 그의 발현을 조절하는 다른 짧은 촉매 RNA 또는 촉매 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 안티센스 화합물은 표적 유전자에서의 서열에 상보적인 8개 이상의 연속적인 뉴클레오염기의 신장을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화되는 그의 표적 핵산 서열에 100％ 상보적일 필요는 없다. 올리고뉴클레오티드는 표적에의 올리고뉴클레오티드의 결합이 표적 분자의 정상적인 기능을 방해하여 유용성의 손실을 초래하는 경우에 특이적으로 혼성화되며, 생체내 검정 또는 치료학적 처치의 경우에서 특이적 결합이 바람직한 조건, 즉 생리학상 조건하에서, 또는 시험관내 검정의 경우에서 검정이 수행되는 조건 하에서, 올리고뉴클레오티드의 비-표적 서열에의 비-특이적 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 있다.
몇몇 실시양태에서, NKG2D 리간드의 발현 (예를 들어, MICA/B 또는 ULBP/RAET1 발현의 억제) 및 활성 (예를 들어, NKG2D와의 결합)을 조절하여, 심혈관 질환 (예를 들어, 아테롬성 동맥경화증)에 대해 소인이 있고/거나 발생된, 및/또는 비정상적 대사성 병태, 예컨대 고콜레스테롤 또는 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증 등을 갖는, 대사성 기능이상-관련 염증 질환, 예컨대 제2형 당뇨병을 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물은 NKG2D와 하나 이상의 그의 리간드와의 상호작용 (예를 들어, NKG2D/MICA/B 상호작용)을 차단하기 위한 치료 유효량의 작용제, 제약상 허용되는 담체, 및 NKG2D/리간드 상호작용 경로 이외의 경로로부터 기인하는 심혈관 질환, 고혈압 또는 대사성 장애를 치료하기 위한 알려진 약물을 포함한다. 심혈관 질환의 치료를 위한 알려진 약물의 예는 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A 리덕타제 억제제 (스타틴) 중 어느 하나이다. 스타틴의 예에는 세리바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴 또는 로바스타틴, 또는 이들의 제약상 허용되는 염이 포함된다. 스타틴을 포함하는 조성물 및 방법은 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,465,454 참조).
또다른 실시양태에서, 본 발명은 NKG2D와 하나 이상의 그의 리간드의 상호작용 (예를 들어, NKG2D/MICA/B 상호작용)을 차단하기 위한 작용제, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 비정상적 대사성 병태 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 불량한 혈액 순환, 사지 장애, 당뇨병성 망막증 등)을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 작용제, 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다.
본원 실시예 3에 기재된 데이터는 항-NKG2D 항체를 사용하여 NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 것이 NKG2D-발현 세포의 수의 변경 없이 당뇨병성 ApoE-/- 마우스에서의 플라크 형성을 억제할 수 있었다는 것을 나타낸다.
NKG2D와 하나 이상의 그의 리간드와의 상호작용 (예를 들어, NKG2D/MICA/B 상호작용)을 차단하거나 또는 NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하기 위한 임의의 적합한 작용제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 작용제는 가용성 NKG2D, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, NKG2D 리간드, 및 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하거나, 또는 NKG2D와 하나 이상의 그의 리간드와의 상호작용을 차단하는 전형적인 작용제는 NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 NKG2D (hNKG2D)와 결합한다.
NKG2D와 특이적으로 결합하는 임의의 적합한 항체를 사용할 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 항-NKG2D 항체에는 폴리클로날 및 모노클로날 인간 항체, 또는 이뮤노글로불린 가변 영역 중의 하나 이상의 항원 결합 영역을 갖는 이들의 임의의 항원-결합 단편 부분이 포함되며, 이 항체는 NKG2D와 특이적으로 결합한다. 폴리펩티드의 에피토프에 대해 생성되며 천연 또는 재조합 단백질의 적어도 일부와 결합하는 경우에 항체는 NKG2D에 특이적이다. NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 작용제의 또 다른 예는 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B, ULBP)와 특이적으로 결합하는 항체이다. NKG2D 리간드와 특이적으로 결합하는 임의의 적합한 항체를 사용할 수 있다.
경쟁적 억제에 의한 모노클로날 항체 특이성 및 친화도를 측정하기 위한 방법은 문헌 [Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988], [Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)], 및 [Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)]에서 찾아볼 수 있으며, 상기 문헌은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
몇몇 실시양태에서, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체는 하기 기재되는 서열을 갖는 인간 모노클로날 항체 16F16, 16F31, MS 및 21F2이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 모노클로날 항체 MS이다. 이들 항체의 전장, 가변성 및 CDR 서열을 하기 표 1에서 설명한다.
<표 1>
16F16, 16F31, MS 및 21F2에 대한 전장, 가변성 및 CDR 아미노산 서열
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본원에 기재된 것과 같은 항-NKG2D 및 항-NKG2D 리간드 항체는 적절한 동물에의 폴리펩티드 또는 항원 단편의 접종, 림프구 집단의 시험관내 자극, 합성 방법, 하이브리도마 및/또는 이러한 항-NKG2D 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 세포와 같은 (이들로 제한되지는 않음) 방법에 따라 통상적으로 제조될 수 있다. 정제된 재조합 NKG2D 또는 그의 펩티드 단편을 사용한 동물의 면역화는 항-NKG2D 항체의 제조 방법의 예이다. 유사하게, 정제된 재조합 NKG2D 리간드 (예를 들어, ULBP/RAET1 단백질, MICA/B, Mult1 등 중 하나) 또는 그의 펩티드 단편을 사용한 동물의 면역화는 항-NKG2D 리간드 항체의 제조 방법의 예이다.
NKG2D 또는 NKG2D 리간드와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 당업자들에게 알려진 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256:495-497, 1975]; 미국 특허 번호 4,376,110; 문헌 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992)]; [Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988]; [Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)]을 참조하며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 및 이의 임의의 하위부류를 비롯하여 임의의 이뮤노글로불린 클래스일 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마는 시험관내, 동일계 또는 생체내 배양될 수 있다.
또다른 실시양태에서, NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 작용제는 가용성 NKG2D이다. 가용성 NKG2D는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Diefenbach et al., Nat Immunol, vol. 1(2):119-26, 2000] 참조). 한 실시양태에서, 가용성 NKG2D를 임의의 적합한 전달 경로 및 수단에 의해 대상체에게 투여한다. 또다른 실시양태에서, 가용성 NKG2D를 코딩하는 핵산은 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 대사성 기능이상-관련 질환 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 불량한 혈액 순환, 사지 장애, 당뇨병성 망막증 등)을 치료하기 위해 대상체에게 투여할 수 있다. 가용성 NKG2D 단백질을 코딩하는 코딩 서열은 기탁 번호 574240의 뉴클레오티드 서열과 동일할 수 있거나, 또는 이는 유전자 코드의 중복 또는 퇴보의 결과로서 기탁 번호 574240의 폴리뉴클레오티드와 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 상이한 코딩 서열일 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 다른 핵산 분자에는 천연 NKG2D 유전자, 예컨대 천연 NKG2D 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 코딩하는 유전자의 변이체가 포함된다. 이러한 변이체는 예를 들어 천연 NKG2D 유전자의 자연 발생 대립유전자 변이체, 천연 NKG2D 유전자의 상동체, 또는 천연 NKG2D 유전자의 비-자연 발생 변이체일 수 있다. 이러한 변이체는 하나 이상의 염기에서 천연 NKG2D 유전자와는 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 예를 들어, 이러한 변이체의 뉴클레오티드 서열은 천연 NKG2D 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 부가 또는 치환을 특징으로 할 수 있다.
또다른 실시양태에서, NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 작용제는 가용성 NKG2D 리간드일 수 있다. MICA/B의 발하는 (가용성) 형태는 신체를 통해 NKG2D 기능을 억제하는 것으로 나타난다. 이러한 실시양태에서, 가용성 NKG2D 리간드 또는 가용성 NKG2D 리간드를 코딩하는 핵산을 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 대사성 기능이상-관련 질환 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 불량한 혈액 순환, 사지 장애, 당뇨병성 망막증 등)을 치료하기 위해 대상체에게 투여할 수 있다.
다른 실시양태에서, 구조에서의 실질적인 변화를 표시하는 변이체 NKG2D 단백질 또는 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B, ULBP/RAET1 단백질 등)는 코딩된 폴리펩티드에서 덜 보존적인 변화를 유발하는 뉴클레오티드 치환하여 생성될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 치환의 예는 (a) 폴리펩티드 백본의 구조; (b) 폴리펩티드의 전하 또는 소수성; 또는 (c) 아미노산 측쇄의 벌크에서의 변화를 유발하는 것이다. 일반적으로, 단백질 특성에서의 최대 변화를 생성하는 것으로 예상되는 뉴클레오티드 치환은 코톤에서의 비-보존적 변화를 유발하는 것이다. 단백질 구조에서의 주요 변화를 유발할 수 있는 코돈 변화의 예는 (a) 친수성 잔기, 예를 들어 세린 또는 트레오닌의 소수성 잔기, 예를 들어 루이신, 이소루이신, 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌으로의 치환; (b) 시스테인 또는 프롤린의 임의의 다른 잔기로의 치환; (c) 양전성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘의 음전성 잔기, 예를 들어 글루타민 또는 아스파틴(aspartine)으로의 치환; 또는 (d) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 페닐알라닌의 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예를 들어 글리신으로의 치환을 유발하는 것들이다.
본원에 기재된 것과 같은 천연 Klrk1 유전자 또는 천연 Klrk1 mRNA의 자연 발생 대립유전자 변이체는 천연 Klrk1 유전자 또는 천연 Klrk1 mRNA와 적어도 75％ (예를 들어, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 및 99％)의 서열 동일성을 가지며, 천연 Klrk1 단백질과 구조적 유사성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 인간 조직으로부터 단리된 핵산이다. 본원에 기재된 것과 같은 천연 Klrk1 유전자 또는 천연 Klrk1 mRNA의 상동체는 천연 인간 Klrk1 유전자 또는 천연 인간 Klrk1 mRNA와 적어도 75％ (예를 들어, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 및 99％)의 서열 동일성을 가지며 천연 인간 NKG2D 단백질과 구조적 유사성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 다른 종으로부터 단리된 핵산이다. 공용 및/또는 사설 핵산 데이터베이스를 검색하여 천연 Klrk1 유전자 또는 천연 Klrk1 mRNA와 높은 퍼센트 (예를 들어, 70, 80, 90％ 또는 그 이상)의 서열 동일성을 갖는 다른 핵산 분자를 확인할 수 있다.
비-자연 발생 Klrk1 유전자 또는 mRNA 변이체는 천연 인간 Klrk1 유전자 또는 천연 인간 Klrk1 mRNA와 적어도 75％ (예를 들어, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 및 99％)의 서열 동일성을 가지며 천연 인간 NKG2D 단백질과 구조적 유사성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 자연에서 발생하지 않는 (예를 들어, 사람의 손으로 만들어진) 핵산이다. 비-자연 발생 Klrk1 유전자변이체의 예는 NKG2D 단백질의 단편을 코딩하는 것, 엄격한 조건 하에서 천연 Klrk1 유전자 또는 천연 Klrk1 유전자의 상보체와 혼성화하는 것, 천연 Klrk1 유전자 또는 그의 상보체와 적어도 65％의 서열 동일성을 공유하는 것, 및 NKG2D 융합 단백질을 코딩하는 것이다.
본원에 기재된 것과 같은 천연 NKG2D 단백질의 단편을 코딩하는 핵산은 예를 들어 천연 NKG2D 단백질의 2개, 5개, 10개, 25개, 50개, 100개, 150개, 200개 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 코딩하는 것이다. 천연 NKG2D 단백질의 단편을 코딩하는 핵산을 코딩하거나 핵산과 혼성화하는 보다 짧은 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 길이가 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 30개, 50개 염기쌍인 것들)를 프로브, 프라이머 또는 안티센스 분자로서 사용할 수 있다. 천연 NKG2D 단백질의 단편을 코딩하는 핵산은 전장 천연 Klrk1 유전자, Klrk1 mRNA 또는 cDNA, 또는 상기의 변이체의 효소적 절단 (예를 들어, 제한 효소 사용) 또는 화학적 분해에 의해 제조될 수 있다. 앞서 보고된 천연 인간 Klrk1 유전자 및 천연 NKG2D 단백질의 아미노산 서열의 뉴클레오티드 서열을 사용하여, 당업자들은 예를 들어 표준 핵산 돌연변이유발 기법 또는 화학적 합성에 의해 그의 뉴클레오티드 서열에서의 부차적 변이를 갖는 핵산 분자를 생성할 수 있다. 변이체 Klrk1 핵산 분자는 변이체 NKG2D 단백질을 생성하기 위해 발현될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환을 억제하고/거나 비정상적 대사성 병태 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 사지 장애, 불량한 혈액 순환 등)를 치료하기 위한 조성물은 NKG2D와 하나 이상의 그의 리간드와의 상호작용 (예를 들어, NKG2D/MICA/B 상호작용)을 차단하기 위한 작용제 (예를 들어, 항-NKG2D 항체 또는 항-NKG2D 리간드 항체), 제약상 허용되는 담체, 및 심혈관 질환을 치료하기 위한 알려진 약물을 포함한다. 심혈관 질환을 치료하기 위한 알려진 약물의 예는 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A 리덕타제 억제제 (스타틴) 중 어느 하나이다. 스타틴의 예에는 세리바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴 또는 로바스타틴, 또는 이들의 제약상 허용되는 염이 포함된다. 스타틴을 포함하는 조성물 및 방법은 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,465,454 참조).
본원 실시예 3에서 기재된 데이터는 항-NKG2D 항체를 사용하여 NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 것이 당뇨병성 ApoE-/- 마우스에서 아테롬성 동맥경화성 플라크 형성을 유의하게 억제하였음을 예시하여, NKG2D/리간드 상호작용이 심혈관 질환 발생의 촉진에서의 중요한 경로이며, 심혈관 질환의 예방 또는 치료를 위한 약물 표적의 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 추가적으로, 본원 실시예 3 및 4에서 기재된 데이터는 NKG2D 녹아웃 마우스 및 항-NKG2D 항체 연구를 사용하여 아테롬성 동맥경화증 및 염증에서의 NKG2D/리간드 상호작용의 중요한 역할을 예시한다. NKG2D/리간드 상호작용의 차단은 또한 실시예 5에서 예시된 것과 같이 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준의 감소를 비롯하여 비정상적인 대사성 병태를 완화시켰다. 항-NKG2D 항체 처치된 군 및 대조군에서의 사이토킨 발현 프로파일의 추가의 비교는 항-NKG2D 항체 처치가 다발성 전-염증성 사이토킨의 생성을 유의하게 억제하였음을 입증하여, 혈관 염증의 예방에 의해 기능한다는 것을 시사한다 (실시예 4 참조). 또한, 본원에 기재된 데이터는 NKG2D/리간드 매개 면역 활성화가 제2형 당뇨병성 진행에 관여한다는 것을 제공한다. 본원 실시예 7에서 기재된 실험에서, 서구식 식이 공급된 ApoE-/- 마우스와 비교하여, 동일한 식이가 공급된 NKG2D-결핍 ApoE-/-Klrk1-/- 마우스는 혈액 내 글루코스 수준이 상당히 감소되어, 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 NKG2D 또는 그의 리간드의 표적화의 유용성을 입증하였다. 게다가, 실시예 8에서 기재된 것과 같이, 항-NKG2D 항체 처치는 제2형 당뇨병의 설치류 모델에서 고혈당증 및 당뇨병의 발생 및 진행을 예방할 수 있었다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 비정상적 대사성 병태 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 사지 장애, 불량한 혈액 순환 등)를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 소정의 실시양태에서, 본 발명은 제2형 당뇨병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 병태에는, 예를 들어 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 비정상적 대사성 병태 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 사지 장애, 불량한 혈액 순환 등)가 포함된다. 소정의 실시양태에서, 병태는 제2형 당뇨병이다. 소정의 다른 실시양태에서, 병태는 심혈관 질환이다.
전형적인 방법에는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 비정상적 대사성 병태를 억제하기 위한 NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제, 및 제약상 허용되는 담체를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 소정의 실시양태에서, 방법에는 NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 작용제는 상기 기재된 것 중 어느 하나, 예를 들어 가용성 NKG2D, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 가용성 NKG2D 리간드, NKG2D 리간드에 특이적인 항체, NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B) 활성 또는 발현의 억제제일 수 있다. 소정의 실시양태에서, 작용제는 NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 소정의 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간의 것 또는 인간화된 것이다. 소정의 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 NKG2D (hNKG2D)와 결합한다. 소정의 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 NKG2D-발현 세포의 NKG2D-매개 활성화 또는 신호전달을 감소시킨다. 소정의 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 NKG2D와의 결합에서 하나 이상의 NKG2D 리간드와 경쟁한다. 소정의 실시양태에서, NKG2D 리간드는 MICA/B이다.
소정의 실시양태에서, 작용제의 투여는 대상체에서 혈당 수준의 감소, 내당능의 개선, 인슐린 내성의 감소, 체중의 감소, 혈압의 강하, 염증의 감소 또는 대사성 기능이상의 감소 중 하나 이상을 유발한다.
일반적으로, 본원에 기재된 치료학적 방법 (예방적 치료가 포함됨)은, 본원에 기재된 치료 유효량의 조성물을 포유동물, 특히 인간을 비롯하여 치료가 필요한 대상체 (예를 들어, 동물, 인간)에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료는 적합하게는 질환, 장애, 또는 그의 증상을 앓거나, 갖거나, 걸리기 쉽거나 또는 위험이 있는 대상체, 특히 인간에게 투여될 것이다. "위험이 있는" 이러한 대상체의 결정은 대상체 또는 건강 관리 제공자의 진단학적 시험 또는 의견 (예를 들어, 유전자 시험, 효소 또는 단백질 마커, (본원에서 정의된 바와 같은) 마커, 가족력 등)에 의한 임의의 객관적 또는 주관적 결정에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 본원의 조성물은 과도한 NKG2D 신호전달, 발현 또는 활성이 원인이 될 수 있는 임의의 다른 장애의 치료에서 사용할 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체에서 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 비정상적 대사성 병태 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 사지 장애, 불량한 혈액 순환 등)를 치료하는 방법은 치료 과정의 모니터링을 포함한다. 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 비정상적 대사성 병태 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 사지 장애, 불량한 혈액 순환 등)와 관련된 장애 또는 그의 증상을 앓거나 또는 그에 걸리기 쉬운 대상체에서 진단학적 마커 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물 또는 작용제에 의해 조절되는 것으로 본원에서 밝혀진 임의의 표적, 단백질 또는 그의 지시약 등)의 수준의 측정, 또는 진단학적 측정 (예를 들어, 스크리닝, 검정)에 의해 치료 과정을 모니터링할 수 있으며, 여기서 대상체는 질환 또는 그의 증상을 치료하기에 충분한 치료학적 양의 본원에 기재된 것과 같은 조성물을 투여받았다. 방법에서 측정된 마커의 수준을 건강한 정상 대조군 또는 다른 고통받는 환자 중 하나에서의 알려진 마커의 수준과 비교하여, 대상체의 질환 상태를 확립할 수 있다. 일반적으로, 대상체에서의 마커의 제2 수준을 제1 수준의 측정 이후의 시간 지점에서 측정하며, 2개 수준을 비교하여 질환 과정 또는 요법의 효능을 모니터링한다. 소정의 실시양태에서, 본원에 기재된 것과 같은 치료의 시작 전에 대상체에서 마커의 치료전 수준을 측정하며; 이후 이 마커의 치료전 수준을 치료 시작 후의 대상체에서의 마커의 수준과 비교하여 치료 효능을 측정할 수 있다.
NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제 (예를 들어, MICA/B 억제제), 가용성 NKG2D, 가용성 NKG2D 리간드(들), 항-NKG2D 항체, 항-NKG2D 리간드 항체 등을 포함하는 조성물의, 당뇨병, 심혈관 질환 (예를 들어, 아테롬성 동맥경화증) 및/또는 비정상적 대사성 병태 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 사지 장애, 불량한 혈액 순환 등)의 치료를 위한 투여는, 다른 성분과 조합하여 임의의 적합한 수단에 의해, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환 (예를 들어, 억제형 아테롬성 동맥경화성 플라크 형성), 염증성 질환 및/또는 비정상적 대사성 병태 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 사지 장애, 불량한 혈액 순환 등)의 완화, 감소 또는 제거에 효과적인 치료 농도를 생성할 수 있다. NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제 (예를 들어, MICA/B 억제제), 가용성 NKG2D, 가용성 NKG2D 리간드(들), 항-NKG2D 항체, 항-NKG2D 리간드 항체 등은 임의의 적합한 담체 물질에 임의의 적절한 양으로 함유될 수 있고, 이는 일반적으로 조성물의 총 중량의 1 내지 95 중량％의 양으로 존재한다. 조성물은 국소 또는 전신성 투여용으로 적합한 투여 형태 (예를 들어, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내 또는 복막내)로 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 정맥내, 복막내 또는 피하 투여된다. 제약 조성물은 종래의 제약 실무에 따라 제제화될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2000] 및 [Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York]을 참조함).
본원에 기재된 조성물은 제제의 투여 형태, 또는 적합한 전달 소자 또는 통상의 비독성 제약상 허용되는 담체 및 보조제를 함유하는 이식편을 통한 주사, 주입 또는 이식 (피하, 정맥내, 근육내, 복막내 등)에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 이러한 조성물의 제제 및 제형은 제약 제제 당업자에게 널리 공지되어 있다. 제제는 상기 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy]에서 찾아볼 수 있다.
비경구 용도를 위한 조성물은 단위 투여 형태 (예를 들어, 단일-용량 앰풀)로, 또는 여러 용량을 함유하며 적합한 보존제가 첨가될 수 있는 바이알로 제공될 수 있다 (하기를 참조함). 조성물은 액제, 현탁액제, 에멀젼, 주입 소자, 또는 이식을 위한 전달 소자의 형태일 수 있거나, 또는 이는 사용 전에 물 또는 또다른 적합한 비히클과 함께 재구성되는 건조 분말로서 존재할 수 있다. 활성제 이외에도, 조성물은 비경구적으로 허용되는 적합한 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 활성 치료제(들)는 제어 방출을 위해 미소구, 미세캡슐, 나노입자, 리포좀 등으로 혼입될 수 있다. 게다가, 조성물은 현탁화제, 가용화제, 안정화제, pH-조절제, 독성 조절제, 및/또는 분산화제를 포함할 수 있다.
상기에 명시된 바와 같이, 본 발명에 따른 제약 조성물은 멸균 주사용으로 적합한 형태로 존재할 수 있다. 이러한 조성물을 제조하기 위해, 적합한 활성 치료제(들)를 비경구적으로 허용되는 액체 비히클 중에 용해시키거나 또는 현탁시킨다. 허용되는 비히클 및 용매 중에서 물이 사용될 수 있고, 물은 적절한 양의 염산, 수산화나트륨 또는 적합한 완충액, 1,3-부탄디올, 링거액(Ringer's solution), 및 등장성 염화나트륨 용액 및 덱스트로스 용액의 첨가에 의해 적합한 pH로 조절된다. 수성 제제는 또한 하나 이상의 보존제 (예를 들어, 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트)를 함유할 수 있다. 화합물들 중 하나가 수난용성이거나 또는 약간 수용성인 경우, 용해 증진제 또는 가용화제가 첨가될 수 있거나, 또는 용매는 10 내지 60％ w/w의 프로필렌 글리콜 등을 포함할 수 있다.
미소구 및/또는 미세캡슐의 제조에 사용하기 위한 물질은, 예를 들어 생분해성/생침식성 중합체, 예컨대 폴리갈락틴, 폴리-(이소부틸 시아노아크릴레이트), 폴리(2-히드록시에틸-L-글루타민) 및 폴리(락트산)이다. 제어 방출 비경구 제제를 제제화하는 경우 사용될 수 있는 생체적합성 담체는 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란), 단백질 (예를 들어, 알부민), 지질단백질, 또는 항체이다. 이식편에 사용하기 위한 물질은 비-생분해성 (예를 들어, 폴리디메틸 실록산) 또는 생분해성 (예를 들어, 폴리(카프로락톤), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 또는 폴리(오르토 에스테르) 또는 이들의 조합)일 수 있다.
2종 이상의 항-심혈관 질환 치료제 (예를 들어, NKG2D 또는 MICA/B 억제제, 및 스타틴)는 하나의 제제로 함께 혼합될 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 또한, 예를 들어 항당뇨제, 항비만제, 식욕조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로 인한 또는 당뇨병과 관련된 합병증의 치료제 및/또는 예방제, 및 비만으로 인한 또는 비만과 관련된 합병증 및 장애의 치료제 및/또는 예방제로부터 선택되는 제2 활성제 또는 약리학적으로 보다 활성인 작용제와 조합될 수 있다. 약리학적으로 활성인 이러한 물질의 예에는, GLP-1 및 GLP-1 유도체 및 유사체, GLP-2 및 GLP-2 유도체 및 유사체, 엑센딘-4 및 엑센딘-4 유도체 및 유사체, 아밀린 및 아밀린 유도체 및 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드, 글루코시다제 억제제, 글루카곤 길항제, DPP-IV (디펩티딜 펩티다제-IV) 억제제, SGLT2 억제제, SGLT1 억제제, 글루코스신생 및/또는 글리코겐분해의 자극에 관여하는 간성 효소의 억제제, 글루코스 흡수 조절제, 지질 대사를 조절하는 화합물, 예컨대 HMG CoA 억제제 (스타틴)로서의 항고지방혈증제, 식욕 저하 화합물, RXR 효능제 및 β-세포의 ATP-의존성 칼륨 채널에 대한 작용제; 콜레스티라민, 콜레스티폴, 클로피브레이트, 겜피브로질, 로바스타틴, 프라바스타틴, 심바스타틴, 프로부콜, 덱스트로티록신, 나테글리니드, 레파글리니드; β-차단제, 예컨대 알프레놀롤, 아테놀롤, 티몰롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤 및 메토프롤롤, ACE (안지오텐신 전환 효소) 억제제, 예컨대 베나제프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 알라트리오프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴, 칼슘 채널 차단제, 예컨대 니페디핀, 펠로디핀, 니카르디핀, 이스라디핀, 니모디핀, 딜티아젬 및 베라파밀, 및 α-차단제, 예컨대 독사조신, 우라피딜, 프라조신 및 테라조신; CART (코카인 암페타민 조절 전사) 효능제, NPY (신경펩티드 Y) 길항제, PYY (폴리펩티드 YY) 효능제, PP (췌장 폴리펩티드) 효능제, Y2 수용체 효능제, Y4 수용체 효능제, 혼합형 Y2/Y4 수용체 효능제, 아디포넥틴 효능제, PPAR 효능제, MC4 (멜라노코르틴 4) 효능제, 오렉신 길항제, TNF (종양 괴사 인자) 효능제, CRF (코르티코트로핀 방출 인자) 효능제, CRF BP (코르티코트로핀 방출 인자 결합 단백질) 길항제, 우로코르틴 효능제, β3 효능제, MSH (멜라닌 세포-자극 호르몬) 효능제, MCH (멜라닌 세포-농축 호르몬) 길항제, CCK (콜레시스토키닌) 효능제, 세로토닌 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 재흡수 억제제, 혼합형 세로토닌 및 노르아드레날린성 화합물, 5HT (세로토닌) 효능제, 봄베신 효능제, 갈라닌 길항제, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 화합물, TRH (티레오트로핀 방출 호르몬) 효능제, UCP 2 또는 3 (비-커플링 단백질 2 또는 3) 조절제, 렙틴 효능제, DA 효능제 (브로모크립틴, 도프렉신), 리파제/아밀라제 억제제, RXR (레티노이드 X 수용체) 조절제, TR β 효능제; 히스타민 H3 길항제, 가스트린 및 가스트린 유사체 및 유도체, 글루카곤 및 글루카곤 유도체 및 유사체, FGF-21 (섬유모세포 성장 인자 21) 및 FGF-21 유도체 및 유사체, 양성자 펌프 억제제, 예컨대 란소프라졸, 오메프라졸, 덱슬란소프라졸, 에소메프라졸, 판토프라졸, 및 라베프라졸 및 글루코키나제 활성화제가 있다.
상기-언급한 화합물 중 하나 이상 및 임의로 하나 이상의 약리학적으로 활성인 추가 물질과의 본 발명에 따른 조성물의 임의의 적합한 조합은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주됨을 이해해야 한다.
상기에 기재한 다수의 조성물, 방법 및 키트가 제2형 당뇨병 및 심혈관 질환의 치료에 관한 것이지만, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 또한, 제2형 당뇨병 및 심혈관 질환을 비롯한 대상체 내 임의의 대사성 기능이상-관련 질환의 예방에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 질환의 증상을 방지 또는 중지하거나, 질환의 증상의 개시를 지연시키거나, 또는 질환의 중증도를 감소시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은, 대상체가 제2형 당뇨병을 갖는지의 여부에 관계없이, 대상체 내 임의의 대사성 기능이상-관련 질환의 검출, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체 내 상승된 수준의 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 검출 방법이 본원에 기재되고, 이는 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; NKG2D 리간드의 발현 (예를 들어, MICA/B 발현)을 검출하는 하나 이상의 시약과 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 생물학적 샘플에서 NKG2D 리간드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B)의 과발현을, 대상체 내에 상승된 수준의 콜레스테롤 및 트리글리세리드를 갖거나 또는 상승된 수준의 콜레스테롤 및 트리글리세리드가 존재한다는 소인과 연관시키는 단계를 포함한다. 상승된 수준의 콜레스테롤 및 트리글리세리드를 갖는 대상체 (제2형 당뇨병을 갖거나 또는 갖지 않을 수 있음)를 치료하는 방법은, 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준을 낮추기 위한, NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또다른 예로서, 당뇨병성 망막증을 갖는 대상체의 치료 방법이 본원에 기재된다. 이러한 방법은 당뇨병성 망막증을 억제하기 위한, NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 당뇨병성 망막증을 억제하거나 또는 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준을 낮추기 위한, NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 작용제는, 상기에 기재된 것들, 예를 들어 가용성 NKG2D, NKG2D에 특이적인 항체, 가용성 NKG2D 리간드, NKG2D 리간드에 특이적인 항체, NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B) 활성 또는 발현의 억제제 등 중에서 임의의 것일 수 있다. 작용제 및 제약상 허용되는 담체는 상기에 기재된 바와 같은 키트로 패키징될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 대사성 기능이상-관련 질환 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 불량한 혈액 순환, 사지 장애, 당뇨병성 망막증 등)의 치료를 위한 조성물 및 방법은, 세포의 표면으로부터의 NKG2D 리간드의 쉐딩(shedding)을 촉진시키는 작용제를 포함할 수 있다. NKG2D 리간드는 종종 프로테아제에 의해 세포 표면으로부터 절단되고 ("쉐딩"으로 불림), 쉐딩은 일반적으로 쉐드(shed) 리간드를 NKG2D에 결합시켜 NKG2D 활성 (예를 들어, 신호전달)을 하향조절함으로써 NKG2D 신호전달을 억제하는 것으로 생각된다. 쉐딩을 촉진시키거나 또는 억제하는 임의의 작용제는 NKG2D 신호전달 및 활성을 조절할 수 있고, 상기의 실시양태에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 쉐딩에 관여하는 단백질에 대한 항체 또는 항원 결합 단편이, 하나 이상의 NKG2D 리간드의 쉐딩을 촉진시키기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 조성물, 키트 및 방법은 대상체 내 대사성 기능이상-관련 질환의 예방에 사용될 수 있다. 예를 들어, 전문의는 가족력 (유전성) 또는 환경적 인자 (예를 들어, 식이요법, 운동 부족 등)로 인한 것과 관계없이 심혈관 질환 및/또는 대사성 기능이상-관련 질환에 대한 소인을 갖는 대상체에게 본원에 기재된 조성물 및 방법을 적용할 수 있다.
상기에 기재된 조성물은 바람직하게는 유효량, 즉 치료받는 대상체에서 바람직한 결과 (예를 들어, 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 예컨대 아테롬성 동맥경화증의 억제 또는 예방, 혈당 수준 저하 및 제2형 당뇨병 환자에서의 체중 감소 촉진, 대상체 내 콜레스테롤 또는 트리글리세리드 수준의 감소, 대상체에서의 인슐린 내성 감소, 대상체에서의 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 사지 장애, 불량한 혈액 순환 등의 예방 또는 경감)를 생성할 수 있는 양으로 대상체 (예를 들어, 인간)에게 투여된다. 본원에 기재된 조성물의 독성 및 치료 효능은 표준 제약 절차에 의해 측정될 수 있다. 의학 및 수의학 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 어느 한 종의 동물에 대한 투여량은 대상체의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 조성물, 투여 시간 및 투여 경로, 일반 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯한 다수의 인자에 따라 달라진다.
투여되는 치료제의 양은 투여 방식, 환자의 연령 및 체중, 및 암의 임상적 증상에 따라 달라진다. 본원에 기재된 조성물은 전형적으로, 아테롬성 동맥경화성 플라크 형성의 감소, 혈당 수준 감소, 체중 감소, 콜레스테롤 수준 감소, 트리글리세리드 수준 감소, 인슐린 내성 등의 감소를 확인하거나 또는 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B 또는 ULBP/RAET1)의 발현 또는 생물학적 활성, 또는 NKG2D 활성 또는 신호전달을 측정하는 임의의 분석법을 이용하여 분석된 바와 같은, NKG2D 활성 및/또는 신호전달을 억제하는 투여량으로 투여된다.
대상체 (예를 들어, 인간)로부터의 생물학적 샘플에서 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B 또는 ULBP/RAET1 단백질)를 검출하여, 대상체에서의 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 비정상적 대사성 병태 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 사지 장애, 불량한 혈액 순환 등)의 존재를 검출하거나 또는 발생을 예측하기 위한 키트가 본원에 기재된다. 전형적인 키트는, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서의 NKG2D 리간드 (예를 들어, MICA/B 또는 ULBP/RAET1)의 발현을 검출하기 위한 하나 이상의 시약 및 사용 설명서를 포함한다. 한 실시양태에서, 키트는 ULBP/RAET1 또는 MICA/B 단백질에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 검출가능한 라벨, 및 사용 설명서를 포함한다. 일반적으로, 생물학적 샘플은 혈청이다. 그러나, 임의의 적합한 생물학적 샘플이 사용될 수 있다. 추가적인 생물학적 샘플의 예에는 혈액, 혈장, 요, 타액, 피부 및 생검 샘플이 포함된다.
NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 당뇨병 또는 임의의 병태, 예컨대 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및/또는 비정상적 대사성 병태 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 사지 장애, 불량한 혈액 순환 등)를 갖는 대상체 (예를 들어, 인간)를 치료하기 위한 키트가 또한 본원에 기재된다. 한 실시양태에서, 키트는, NKG2D 및 하나 이상의 그의 리간드의 상호작용 (예를 들어, NKG2D/MICA/B 상호작용, NKG2D 및 ULBP/RAET1 단백질들 중 하나의 상호작용 등)을 차단하거나 또는 NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하기 위한 치료 유효량의 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 단위 투여 형태로 함유하는 치료적 또는 예방적 조성물을 포함한다. 작용제는 가용성 NKG2D, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, NKG2D 리간드, 및 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 작용제는 NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간의 것 또는 인간화된 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 NKG2D (hNKG2D)와 결합한다.
원하는 경우, 키트는 또한, 심혈관 질환의 치료를 위한 유효량의 공지된 약물 (예를 들어, 스타틴) 및/또는 비정상적 대사성 병태 (예를 들어, 고콜레스테롤 수준, 고트리글리세리드 수준, 이상지질혈증, 당뇨병성 망막증, 사지 장애, 불량한 혈액 순환 등)의 치료를 위한 약물을 함유한다.
특정 실시양태에서, 키트는 항당뇨제, 항비만제, 식욕조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로 인한 또는 당뇨병과 관련된 합병증의 치료제 및/또는 예방제, 및 비만으로 인한 또는 비만과 관련된 합병증 및 장애의 치료제 및/또는 예방제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 작용제를 더 포함한다.
일반적으로, 본원에 기재된 키트는 패키지 및 사용 설명서를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 치료적 또는 예방적 조성물을 함유하는 멸균 용기를 포함하며, 이러한 용기는 박스, 앰풀, 병, 바이알, 튜브, 백, 주머니, 블리스터-팩, 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 합지, 금속 호일, 또는 의약을 수용하기에 적합한 다른 물질로 만들어질 수 있다.
본 발명은 하기의 구체적인 실시예에 의해 추가로 예시된다. 실시예는 예시의 목적으로만 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 제2형 당뇨병 환자의 혈청 및 아테롬성 동맥경화성 플라크에서의, NKG2D 에 대한 리간드인 MICA 의 검출 및 다른 전-염증성 사이토킨의 발현과의 그의 관련성
대사성 기능이상이 특정 스트레스 반응 면역 자극 분자의 상향조절을 유발할 수 있는지를 결정하기 위해, 당뇨병 및 일부 경우에 이상지질혈증을 또한 갖는 것으로 확인된 제2형 당뇨병성 환자의 군에서 MICA/B 발현을 평가하였다. 제1형 당뇨병성 환자는, 제1형 당뇨병성 NOD 마우스 연구 (문헌 [Ogasawara et al., Immunity, 20:757-767 (2004)])로부터 추론된 바와 같이, 대부분이 자가면역 질환을 갖고 대사성 병태에 대해 독립적인 MICA 상향조절을 가질 수 있기 때문에, 포함시키지 않았다. 환자의 혈관 상에서의 MICA/B 발현을 분석하는 것은 비실제적이기 때문에, 혈액에서의 가용성 MICA (sMICA) 단백질 수준을 분석하였다. sMICA는 세포 표면 상에서 발현되는 막 MICA (mMICA)의 효소 절단된 생성물이고, 이는 다양한 암 환자 및 면역 질환 환자의 혈액에서 검출되지만, 건강한 사람들에서는 검출되지 않는 것으로 이전에 보고된 바 있다. 따라서, 당뇨병성 환자의 혈액에서의 sMICA의 검출은, 혈관 또는 다른 조직에서의 MICA 상향조절을 나타낼 것이다.
22명의 환자들을 시험했고, 이들 환자 중 유의한 백분율의 환자에서 상승된 수준의 sMICA가 검출되었다 (도 1A). 22명의 환자 중에서, 6명 (27％)이 400 pg/㎖보다 높으며 12250 pg/㎖에서 가장 높은 수준의 혈청 MICA를 가졌다 (도 1A, 환자 1 내지 6번). 또한, 4명의 환자 (18％)가 검출가능한 수준의 혈청 sMICA (50 내지 350 pg/㎖)를 가졌다 (도 1A, 환자 7 내지 10번). 당뇨병성 환자에서의 sMICA 수준이 암 환자에서의 sMICA 수준에 얼마나 상응하는지를 결정하기 위해, 다양한 암 환자로부터의 50개의 혈청 샘플을 또한 측정하였다. 50명의 암 환자의 sMICA 수준이 모두 20 pg/㎖ 미만이었기 때문에, 제2형 당뇨병성 환자는 암 환자보다 더 크게 상승한 수준의 sMICA 단백질을 가졌다 (도 1E). 암 환자에서의 sMICA 수준이 암 유형 및 단계에 따라 크게 달라질 수 있지만, 제2형 당뇨병성 환자의 sMICA 수준은 문헌 [Salih et al., J Immunol., 169:4098-4102 (2002)]; [Groh et al., Nature, 419:734-738 (2002)]에 보고된 암 환자의 sMICA 수준과 비교하였을 때 여전히 더 높은 편이었다.
이러한 환자가 1 내지 20년 동안 다양한 건강 상태와 함께 당뇨병을 갖는 것으로 진단된 것을 고려할 때, 이들이 가변적 수준의 sMICA를 갖는다는 것은 놀라운일이 아니다. 이러한 변동에도 불구하고, 특히 MICA가 높은 환자를 MICA-음성 환자와 비교하였을 때, 높은 혈청 sMICA 수준과 관련된 특정한 경향이 발견되었다. 특히, 평균 혈당 수준은 MICA-음성 환자에서보다 MICA가 높은 환자에서 더 높았다 (190±65 대 157±47; p = 0.1). 혈액 내 높은 수준의 sMICA 단백질은, 막 MICA가, 다수의 면역 세포 상에서 발현되는 그의 수용체 NKG2D와의 상호작용을 통해 혈관 염증에 영향을 줄 수 있는 (동맥 상의) 특정 세포 유형 상에서 발현되었음을 나타냈다. 막 형태 및 가용성 형태의 MICA 단백질 둘 모두가 NKG2D와 결합하지만, 이들이 면역 활성화에 대해서는 상이한 효과를 갖는다는 것을 주목해야 한다. NKG2D/mMICA 체결은 면역 세포를 활성화시키는 반면, NKG2D/sMICA 상호작용은 그렇지 않다. 사실, sMICA는 NKG2D 결합에 대해 mMICA와 경쟁함으로써 NKG2D/mMICA 상호작용-매개 면역 활성화를 방해할 수도 있다. 따라서, 당뇨병성 환자의 혈청에서의 여러 염증-관련 사이토킨 및 인자의 발현을 분석하고, 이들을 가용성 MICA 발현과 연관시키도록 시도하였다.
sMICA의 상향조절이 사이토킨 IL-6, TNF-α, IL-1β, 인터페론-γ (IFN-γ) 및 C-반응성 단백질 (CRP) 파라미터들 중 임의의 것과 관련있는지를 결정하기 위해서, 동일한 당뇨병성 환자의 혈청에서의 상기 파라미터들의 수준을 평가하였다 (도 1B 내지 D). IL-1β 및 IFN-γ는 분석의 검출가능한 범위 미만이었다. sMICA/B의 수준과 TNF-α 또는 CRP 수준 사이의 상관관계는 없었으며 (도 1A, C ＆ D), 이는 MICA 발현이 2개의 명확한 염증 마커인 TNF-α 또는 CRP와는 상이하게 조절되었음을 제시한다. 흥미롭게도, 혈청에서의 sMICA/B와 IL-6 발현 사이에 역관계가 존재했다 (도 1A ＆ B). MICA-양성군 (환자 1 내지 10번)에서의 IL-6의 혈청 수준은 MICA-음성군 (환자 11 내지 22번)의 IL-6의 혈청 수준보다 크게 더 낮았으며 (1.21±0.51 ng/㎖ 대 1.85±1.13 ng/㎖, P=0.05), 이는 이러한 두 인자 사이의 상호의존적인 관계를 제시한다.
종합해보면, 이러한 데이터는, MICA/B 분자가 제2형 당뇨병성 환자에서 상향조절되고, 혈관 염증 및 아테롬성 동맥경화증에 관여할 수 있음을 입증하였다. 높은 수준의 sMICA가 당뇨병성 환자에서의 MICA 상향조절을 분명히 나타내지만, 염증 및 아테롬성 동맥경화증에 대한 MICA 상향조절의 순효과는, 가용성 및 막 MICA 단백질의 상대적인 기여도에 따라 달라진다. sMICA의 발생은 보통 면역 활성화를 조절하기 위한 mMICA/NKG2D 상호작용에 대한 보상 메카니즘이다. 따라서, 마우스 모델을 사용하여, 동맥에서의 NKG2D 리간드의 상향조절, 및 염증 및 아테롬성 동맥경화증에서의 그의 중요성을 직접 평가하였다.
NKG2D 리간드 발현의 임상적 관련성을 추가로 확립하기 위해, 인간 환자의 아테롬성 동맥경화성 대동맥 부위에 대해 면역조직화학적 염색을 수행하여, NKG2D의 리간드가 조직에서 상향조절되는지를 결정하였다. 플라크가 없는 대동맥 (도 2I)과는 반대로, 아테롬성 동맥경화성 대동맥 내의 다수의 세포가 MICA/B 항체에 대해 양성으로 염색되었다 (도 2A, C, E 및 G). 인접한 부위에서의 Mac-3 또는 CD31과 중첩되는 MICA/B의 염색 패턴은, 아테롬성 동맥경화성 대동맥의 대식세포 및 내피세포 둘 모두가 MICA/B를 발현시켰음을 제시하였고 (도 2B, D, F, H), 이는 인간에서의 발병 조직 내의 NKG2D 리간드가 유사한 발현 패턴을 가짐을 시사한다.
실시예 2: ApoE -/- 마우스의 아테롬성 동맥경화성 플라크의 세포 및 다른 조직에서의 NKG2D 리간드의 상향조절
NKG2D에 대한 리간드가 당뇨병성 및 이상지질혈증성 마우스의 혈관에서 상향조절되는지를 시험하기 위해, NKG2D 리간드의 발현을 이상지질혈증 및 아테롬성 동맥경화증의 동물 모델인 ApoE-/- 마우스에서 측정하였다. ApoE-/- 마우스에서의 만성 기능이상 대사작용이, 면역 세포가 상당한 부분을 차지하고 있는 아테롬성 동맥경화성 플라크를 발생시킨다는 것이 널리 확립되어있다. 이러한 마우스는 손상된 지질 대사작용을 갖고, 이들이 노화함에 따라 아테롬성 동맥경화증이 발생된다. 아테롬성 동맥경화성 플라크가 발생된 ApoE-결손 마우스의 대동맥에서의 NKG2D 리간드의 상향조절을 분석하였다.
우선, NKG2D 리간드의 mRNA 발현을, 대동맥, 특히 대동맥궁 영역에 아테롬성 동맥경화성 플라크를 갖는 8 내지 10개월령 ApoE-/- 마우스 (당뇨병 유도가 일어나지 않음)의 대동맥에서 조사하였다. 플라크 병변이 상이한 수준의 NKG2D 리간드 발현을 갖는지를 구체적으로 결정하기 위해, 8 내지 10개월령의 비-당뇨병성 ApoE-/- 마우스 ("아테롬성 동맥경화성 ApoE-/-")의 ("플라크가 있는") 아테롬성 동맥경화성 대동맥궁 및 뚜렷한 플라크를 갖지 않는 ("플라크가 없는") 대동맥의 흉부 부분으로부터 RNA를 별개로 단리시켰다 (도 3A를 참조함). 2개월령의 플라크가 없는 ApoE-/- 마우스로부터의 대동맥의 상응하는 부분의 RNA를 대조군 ("플라크가 없는 ApoE-/-")으로서 사용하였다. 상이한 개별 NKG2D 리간드의 상향조절을 보다 구체적으로 결정하기 위해, Rae-1 유전자뿐만 아니라 H60 및 Mult-1 유전자의 상이한 이소형에 대한 이소형-특이적 프라이머를 사용하였다. Rae-1, H60 및 MULT-1은 모두, 상이한 군에 속한 NKG2D 리간드이다 (문헌 [Diefenbach et al., Nature Immunology, 1:119-126 (2000)]; [Takada et al., J Immunol., 180:1678-1685 (2008)]을 참조함). 밀접하게 관련된 5가지 Rae-1 유전자 (>98％가 동일함)가 마우스에 존재하고, H60 유전자의 3가지 상이한 이소형 (H60a, b 및 c)이 확인되었다 (문헌 [Diefenbach et al., Nature Immunology, 1:119-126 (2000)]; [Takada et al., J Immunol., 180:1678-1685 (2008)]을 참조함). Rae-1δ, Rae-1ε 및 H60에 대한 전사를 반-정량적인 방사성 RT-PCR에 의해 분석하였다. 간략히, 올리고-dT 프라이머를 이용하여, RNA 샘플을 초전사 II RNase-H 역전사 효소로 역전사시켰다. RT 생성물을 연속적으로 희석시키고 (각각 5배), P32 dCTP의 존재하에 유전자-특이적 프라이머를 이용하여 PCR 처리하였다. 사용된 프라이머는 보고된 유전자서열을 기반으로 하였다 (문헌 [Diefenbach et al., Nature Immunology, 1:119-126 (2000)]; [Takada et al., J Immunol., 180:1678-1685 (2008)]을 참조함). PCR 생성물을 폴리아크릴아미드 겔 상에 붓고, 이어서 이를 건조시키고, 인-영상 스크린에 노출시켰다. β-액틴을 로딩 대조군으로서 사용하였다.
대조군에서의 전사와 비교하여, Rae-1δ, Rae-1ε 및 H60b에 대한 전사는 아테롬 동맥경화성 ApoE-결손 마우스의 플라크 영역에서 극적으로 상향조절되었다 (도 3A). 아테롬성 동맥경화증이 없는 보다 연소의 ApoE-결손 대조군과 비교하여, Rae-1δ, Rae-1ε 및 H60b 전사가 플라크 영역에서 100배까지 증가하는 것으로 검출되었다 (도 3A). 심지어 동일한 마우스의 대동맥의 비-플라크 부분과 비교하였을 때, Rae-1δ, Rae-1ε 및 H60β 유전자가 플라크 영역에서 10 내지 20배 증가하는 것으로 밝혀졌다 (도 3A). 고령 ApoE-/- 마우스의 대동맥의 비-플라크 영역은, 아테롬성 동맥경화증이 없는 보다 연소인 ApoE-/- 마우스의 상응하는 영역과 비교하였을 때, 보통의 Rae-1δ＆ε 상향조절을 가졌다. NKG2D 리간드 Rae-1δ, Rae-1ε 및 H60b에 대해, 연령-매칭된 야생형 (WT) 대조군에서보다 서구식 식이 (WD)를 공급받은 ApoE-/- 마우스의 대동맥궁에서 훨씬 높은 수준 (10 내지 30배 증가)의 전사가 또한 검출되었다 (도 3B). 이러한 데이터는, 아테롬성 동맥경화성 플라크의 특정 세포 성분이 NKG2D 리간드 발현에 대해 매우 극적인 상향조절을 가짐을 제시한다.
플라크에서의 NKG2D 리간드의 상향조절을 추가로 확인하기 위해, 폴리클로날 항-Rae-1 및 H60 항체를 갖는 ApoE-결손 마우스의 아테롬성 동맥경화성 플라크의 동결절편 상에서 면역조직화학적 염색을 수행하였다. 당뇨병 및 고지방의 서구식 식이가 플라크 형성을 가속화하고 NKG2D 리간드의 상향조절에 관여할 수 있기 때문에, 스트렙토조토신 (STZ) 주사에 의해 당뇨병성이 되거나 또는 서구식 식이를 공급받은 ApoE-결손 마우스에서의 플라크를 또한 조사하였다. STZ 처치에 대해, 6일 동안 연속으로 스트렙토조토신 (STZ) (55 mg/kg, pH 4.5 시트레이트 완충액에 새로 용해됨)을 복막내 주사하여, 6주령 ApoE-결손 마우스 (미국 메인주 바 하버 소재 잭슨 랩(Jackson Lab))에서 당뇨병이 발생하도록 유도하였고, 이를 혈당 농도 (>300 mg/dL)에 의해 확인하였다 (도 3C를 참조함). 당뇨병 유도 2달 후, 대동맥을 단리시키고, 동결보존시켰다. 동결절편을 폴리클로날 산양 항-Rae-1 또는 H60 항체 (각각, R&D 시스템즈 및 산타 크루즈 바이오테크놀로지)에 이어서, 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 당나귀 항-산양 IgG 항체 및 ABC-HRP 염색 시스템으로 염색하였고, 이는 양성 염색 (갈색)을 나타냈다 (산타 크루즈 바이오테크놀로지). 절편을 모노클로날 래트 항-마우스 CD68 항체 (세로테크(Serotec))에 이어서, 알칼리성 포스포타제 (AP)-접합된 당나귀 항-래트 항체 및 ABC-AP 염색 키트 (파란색) (벡터 래보러토리(Vector Laboratory))로, 추가로 염색하였다. 서구식 식이를 공급받는 아테롬성 동맥경화증의 ApoE-/- 모델을 위해, 6주령 ApoE-결손 마우스에서 보통의 식이를 서구식 식이로 변경하였다. 서구식 식이를 받은 지 2달 후, 대동맥을 단리시키고, 동결보존시키고, 항-Rae-1 및 H60 항체 염색에 의해 분석하였다 (도 3D).
Rae-1 및 H60 둘 모두에 대한 양성 염색은 플라크 영역의 절편에서는 분명하였지만, 당뇨병성 및 비-당뇨병성 ApoE 결손 마우스 둘 모두의 아테롬성 동맥경화성 대동맥궁 영역의 중막 또는 외막에서는 훨씬 적었다 (도 3C 및 3D). 대조군에 대해서는, Rae-1 또는 H60 염색은 동일한 마우스의 플라크가 없는 대동맥 영역에서 거의 검출되지 않았다 (도 3D, 바닥 패널). 조직 휴지기 대식세포에 대한 마커인 CD68에 대한 염색은 RAE-1 및 H60 염색과 상당히 중첩되었으며, 이는 플라크-침윤성 대식세포가 NKG2D 리간드를 발현시키는 플라크의 하나 이상의 세포 집단임을 나타내었고, 아테롬성 동맥경화성 대동맥으로부터 직접 단리된 대식세포에서의 Rae-1 발현의 유세포 분석에 의해 이를 추가로 확인하였다 (도 3E). 또한, 아테롬성 동맥경화성 ApoE-/- 마우스의 대동맥으로부터 단리된 내피 세포 또한 더 높은 Rae-1 발현을 가졌다 (도 3E).
이들의 대사 이상을 고려할 때, ApoE-/- 마우스의 대식세포가 혈액 및 조직 내의 증가된 비정상적인 대사물에 반응하여 NKG2D 리간드 발현을 상향조절하였을 가능성이 크다. 따라서, 대식세포가 산화된 LDL (oxLDL) 또는 최종 당화 산물 (AGE)에 의해 시험관내 배양액에서 유도될 수 있는지 여부에 관계없이, 이상지질혈증 및 당뇨병과 관련된 2종의 비정상적인 대사물이 측정되었다. 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스의 대식세포는, oxLDL 및 AGE의 존재하에 배양되는 경우, 다수의 NKG2D 리간드의 발현을 전사 및 단백질 수준 둘 모두에서 크게 상향조절하였다 (도 3F 내지 H). 배양 2일 후, mRNA를 상이하게 처치된 대식세포로부터 단리시키고, 역전사하여 cDNA를 생성시키고, 이를 연속적으로 5배 희석시키고, NKG2D 리간드 Rae-1δ, Rae-1ε 및 H60b의 검출을 위해 PCR 처리하였다 (도 3F를 참조함). 도 3F에서와 동일한 방식으로 처치된 대식세포를 용해시키고, PAGE 겔 상에서 분리시키고, Rae-1 분자의 모든 이소형과 반응하는 항-Rae1 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다 (도 3G를 참조함). oxLDL 또는 AGE로 배양된 야생형 대식세포는 또한 유세포 분석에 기반하여 더 높은 세포 표면 수준의 Rae-1 염색을 가졌다 (도 3H를 참조함). Rae-1 염색은 비착색된 "저온" 항-Rae-1 항체와 경쟁할 수 있었고, 이는 NKG2D 리간드의 특이적 상향조절을 확인시켜주었다 (도 3H).
종합해보면, 이러한 실험은 NKG2D에 대한 다수의 리간드가 지질 및/또는 글루코스 대사 장애를 갖는 마우스의 대동맥에서 상향조절되었음을 입증하였다. 플라크 병변에서의 NKG2D 리간드의 고도의 상향조절은, NKG2D 리간드가 혈관 염증 및 아테롬성 동맥경화증의 진행에 직접적인 역할을 수행함을 제시하였다. 흥미롭게도, 플라크 내의 세포, 예컨대 대식세포만이 NKG2D 리간드의 전사 및 단백질에 대해 가장 고도의 상향조절을 가졌다. 플라크 내의 다수의 세포가 지질 성분에 반응하여 활성화되는 것을 고려할 때, 이러한 데이터는 NKG2D 리간드 상향조절이 상이한 유형의 세포에서의 스트레스-기인 경로 및 면역 활성화 경로 둘 모두를 통해 유도될 가능성이 크다는 것을 제시하였다.
실시예 3: 모노클로날 항- NKG2D 항체와의 NKG2D / 리간드 상호작용의 차단 또는 NKG2D 녹아웃에 의한, ApoE -결손 마우스에서의 플라크 형성의 억제
대동맥, 특히 플라크에서의 NKG2D 리간드 상향조절은, NKG2D-발현 면역 세포를 활성화하여 혈관 염증 및 아테롬성 동맥경화증을 촉진시킬 수 있다. 이를 시험하기 위해, 모노클로날 항-NKG2D 항체 (클론 MI-6)를 당뇨병성 ApoE-결손 마우스 내로 주사하여, 잠재적 NKG2D/리간드 상호작용을 차단하고, 이러한 차단이 플라크 형성을 억제할 수 있는지를 결정하였다. 항-NKG2D 항체의 주사는, NKG2D-발현 면역 세포를 결실시키지 않으면서 마우스에서의 NKG2D/리간드 상호작용을 차단하는 것으로 나타났다 (문헌 [Jamieson and Raulet], 미출간됨). C57BL/6 배경의 6주령 수컷 동형접합 ApoE-결손 마우스에서 STZ 주사에 의해 당뇨병을 유도하여, 플라크 형성을 촉진하였다. STZ 투여 10일 전, 1회 주사 당 모노클로날 항-NKG2D 항체 (클론 MI-6, 래트 lgG2a) 200 ㎍을 ApoE-결손 마우스 내로 복막내 주사하였다. 대조군에서, 마우스가 항-NKG2D 항체 대신에 이소형-매칭된 대조군 항체를 제공받은 것을 제외하고는, 이들을 동일한 방식으로 처치하였다. 당뇨병의 유도 후 8주 동안 마우스에게 계속 보통의 식이를 주었고, 이 기간 동안 항-NKG2D 또는 대조군 항체를 실험 지속기간 내내 1주에 1회씩 마우스에게 제공하였다. 마지막 항체 주사 후 1주째에, 마우스를 희생시키고, 대동맥에서의 아테롬성 동맥경화증 병변에 대해 분석하였다.
이소형-매칭된 대조군 항체로 주사된 것과 비교하여, 항-NKG2D 항체로 주사된 당뇨병성 ApoE-결손 마우스는 플라크 형성에 있어 극적인 감소를 나타냈다 (도 4). 7마리의 항-NKG2D 항체 처치된 마우스 및 8마리의 대조군 항체 처치된 마우스 모두 중에서 (3개의 개별적인 실험), NKG2D-항체 처치된 마우스에서의 플라크의 크기는 대조군 항체 처치된 마우스의 플라크 크기보다 항상 유의하게 더 작았다 (도 4A). 플라크 형성의 억제 정도를 추가로 측정하기 위해, 오일 레드 O 염료를 사용하여, 7마리의 항-NKG2D 항체-처치된 마우스 중 5마리 및 8마리의 대조군 항체-처치된 마우스 중 6마리 (2개의 개별적 실험)에서의 지질 침착 함량에 대해 대동맥의 인 페이스(en face) 염색을 수행하였다. 대조군 항체-처치된 마우스의 대동맥궁 영역에서 방대한 양의 오일 레드 O이 염색되었다 (도 4B, 오른쪽 3개). 이와 반대로, 항-NKG2D 항체-처치된 마우스는 훨씬 적은 농도로 염색되었고 (도 4B, 왼쪽 2개), 이는 항-NKG2D 항체 차단이 지질 침착 및 플라크 형성을 억제하였음을 추가로 입증한다. 평균적으로, 항-NKG2D 항체 처치된 마우스에서의 오일 레드 O 염색 양성 면적이 대조군과 비교하여 약 5배 감소하였다 (도 5A).
NKG2D-항체 처치가 NKG2D-발현 세포의 결실을 유도하지 않으면서 특이적으로 NKG2D를 차단하는 것을 확인함으로써, 동등한 수의 NK1.1 + NK 세포 및 NKT 세포가 항-NKG2D 및 대조군 항체 처치된 마우스에 존재하고, 항-NKG2D 항체 처치된 마우스의 NK 세포가 NKG2D를 정상적으로 발현시킨다는 것이 밝혀졌다. 또한, 항-NKG2D 항체 처치는 NKG2D-발현 면역 세포의 전체적 면역성 결여(anergy)를 초래하지 않았다. 시험관내 분석에서, 항-NKG2D 처치된 마우스의 NK 세포는 대조군 항체 처치된 마우스의 NK 세포만큼 충분히, 인터페론-γ를 발현시키기 위한 항-NK1.1 항체 자극에 반응하였다. 종합해보면, 이러한 실험은 NKG2D/리간드 상호작용-매개 면역 활성화가 아테롬성 동맥경화증에서 중요한 역할을 수행하고, 이러한 상호작용의 차단이 아테롬성 동맥경화증을 억제함을 입증하였다.
아테롬성 동맥경화증에서의 NKG2D/리간드 상호작용의 중요한 역할을 입증하기 위해, ApoE-/- 마우스를 NKG2D 녹아웃 마우스와 교배하여, ApoE/NKG2D 이중 녹아웃 (ApoE-/-KLRK1-/-) 마우스를 생성시켰다. 아테롬성 동맥경화증 발생에 대한 ApoE/NKG2D 이중 녹아웃의 효과를 시험하기 위해 2개의 모델을 시험하였다. 제1 모델은 항-NKG2D 항체 차단 분석 (도 4)에서 사용된 바와 같은, STZ-유도된 당뇨병이다. 제2 모델은 6주령부터 고지방 식이를 공급받은 마우스에서의 서구식 식이-촉진된 아테롬성 동맥경화증이다. 당뇨병의 개시 또는 서구식 식이의 시작 후 8 내지 10주째에, ApoE-/-KLRK1-/- 마우스를 인 페이스 오일 레드 O 염색에 의해 대동맥 상에서의 플라크 형성에 대해 분석하였다. 동일한 방식으로 처치된 ApoE-/-KLRK1 +/+ 마우스와 비교하여, 당뇨병성 및 서구-식이를 공급받은 ApoE-/-KLRK1-/- 마우스 둘 모두는, 오일 레드 O 염색 양성 면적에 기반하여, 극적으로 플라크 크기를 감소시켰다 (도 5B 및 C). 이러한 발견은 아테롬성 동맥경화증에서 NKG2D/리간드 상호작용이 중요한 역할을 수행한다는 유전자적 증거를 제공하였다. 게다가, 이들은 이러한 상호작용이 당뇨병 및 이상지질혈증-관련 아테롬성 동맥경화증 둘 모두에 널리 관여한다는 증거를 또한 제공하고, 이는 상기 분자적 상호작용의 표적화의, 다양한 기원의 아테롬성 동맥경화증의 치료 및 예방을 위한 잠재적 용도를 제시한다.
실시예 4: NKG2D / 리간드 상호작용의 차단이 아테롬성 동맥경화성 ApoE -결손 마우스에서의 전-염증성 사이토킨의 발현을 감소시킴
NKD2D/리간드 상호작용이 다수의 NKG2D-발현 면역 세포 유형에서의 면역 활성화를 매개하기 때문에, NKG2D 항체 차단에 의한 아테롬성 동맥경화증의 억제는 염증 억제를 통해 작용함을 제시하였다. 이를 시험하기 위해, 플라크 분석 시, 항-NKG2D 및 대조군 항체 처치된 당뇨병성 ApoE-/- 마우스로부터의 혈청을 수집하고, 마우스 전-염증성-7중 키트 (메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery))를 사용하여, 혈청에서의 다수의 전-염증성 사이토킨의 수준을 다른 대조군 마우스의 혈청과 함께 분석하였다. 평가한 7가지 사이토킨 중에서 5가지 (IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-10 및 IL-12p70)가, 대조군 항체 처치된 마우스와 비교하여 항-NKG2D 항체 처치된 마우스에서 감소하였다 (도 6). 가장 두드러지게는, IL-6이, 연령-매칭된 건강한 야생형 B6 마우스 또는 이상지질혈증 또는 당뇨병에 걸린 적 없는 연소 ApoE-/- 마우스의 수준으로 극적으로 감소하였다 (10배 초과의 감소, P<0.001). TNF-α는 항-NKG2D 처치된 마우스에서 검출 불가능한 수준으로 감소하였다. 이러한 데이터는, NKG2D/리간드 상호작용의 항체 차단이 당뇨병성 ApoE-/- 마우스에서 염증을 억제하여 아테롬성 동맥경화증을 방지하였음을 나타냈다.
항-NKG2D 항체 처치된 마우스에서의 IL-6의 감소는 당뇨병성 환자의 혈청에서의 가용성 MICA 및 IL-6의 역관계와 연관성이 있다 (도 1). 항-NKG2D 항체 및 sMICA 둘 모두가 NKG2D 매개 면역 활성화를 방해함으로써 작용하는 것을 고려할 때, 인간 환자에서 높은 수준의 sMICA는 염증 억제 메카니즘을 자연히 발생시킬 수 있다.
전-염증성 사이토킨의 생성 감소는 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스에서도 관찰되었다. 당뇨병성 또는 서구식 식이를 공급받은 NKG2D-충분한 ApoE-/- 마우스와 비교하여, 유사하게 처치된 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스는 대부분 감소된 혈청 수준의 전-염증성 사이토킨을 가졌다 (도 7). 다수의 염증성 사이토킨 (IL-6, IFN-γ, IL-12 및 TNF-α)은 또한 NKG2D-항체-처치된 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스의 혈청에서도 감소했다. 특히, IL-6 및 IFN-γ는 모든 모델에서 극적으로 감소했다. 종합해보면, 이러한 결과는 NKG2D/리간드 상호작용의 방지가 염증을 억제하고 아테롬성 동맥경화증을 감소시켰음을 입증한다.
실시예 5: NKG2D / 리간드 상호작용의 방지가 ApoE -/- 마우스에서의 비정상적 대사성 병태를 경감시킴
아테롬성 동맥경화증 및 염증의 감소 이외에, NKG2D/리간드 상호작용의 방지는 대사성 장애 또한 상당히 경감시켰다. 서구-식이를 공급받은 ApoE-/- 마우스로부터의 혈청의 탁한 겉모습과는 현저히 다르게, 유사하게 공급받은 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스의 혈청은 투명하였고 (도 8A), 이는 이들의 혈액 내 지질 성분의 축적이 감소되었음을 제시한다. 이러한 확인으로, 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 혈청 수준은 ApoE-/- 마우스에서보다 KLRK1-/-ApoE-/- 마우스에서 크게 낮아졌다 (도 8B). 비정상적인 지질 대사성 병태가 아테롬성 동맥경화증의 직접적인 원인이 되고 염증을 촉진시킨다는 것을 고려할 때, 이러한 결과는, NKG2D/리간드 상호작용이 염증 및 대사성 기능이상의 양성 피드백 주기를 증가시켜 아테롬성 동맥경화증 진행을 지속시킨다는 것을 제시하였다.
요컨대, 이러한 결과는, 비정상적인 대사성 병태-관련된 NKG2D 리간드의 상향조절이 아테롬성 동맥경화증에 결정적으로 관여하며, NKG2D/리간드 상호작용의 억제가 염증의 감소 및 비정상적인 대사성 장애의 경감에 의해 질환의 진행을 억제하였음을 입증하고, 이는 NKG2D/리간드 상호작용을, 동맥경화증에 대한 치료에서의 매력적인 치료 표적으로서 제시한다.
실시예 6: NKG2D / 리간드 상호작용의 방지가 ApoE -/- 마우스에서의 간 염증을 억제시킴
서구식 식이를 공급받은 NKG2D-녹아웃 ApoE-/- 마우스에서의 감소된 혈청 수준의 콜레스테롤 및 트리글리세리드는, NKG2D/리간드 매개 면역 활성화가 대사성 기능이상을 악화시킨다는 것을 제시하였다. 간은 지질 대사에 관한 주요 기관이기 때문에, NKG2D/리간드 상호작용 매개된 염증은 간의 기능을 손상시킴으로써 비정상적인 대사성 병태를 악화시킬 가능성이 크다. 실제로, ApoE-/- 마우스와 비교하여, NKG2D-녹아웃 ApoE-/- 마우스는 현저히 더 저하된 활성의 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)를 가졌고 (도 9), 이는 간 기능이상이 경감되었음을 나타낸다. 혈청에서의 ALT 활성을, 바이오 사이언티픽(Bioo Scientific; 미국 텍사스주 오스틴 소재)으로부터의 키트를 이용하여 제조사의 지침서에 따라 측정하였다. 각각의 군에 대해, 5마리 이상의 마우스를 사용하였다. **P<0.01.
NKG2D/리간드 상호작용을 방지하는 것이 간 염증의 양을 감소시키는지 시험하였다. ApoE-/- 마우스의 간 외식편과 비교하여, 생체외 배양된 NKG2D-녹아웃 ApoE-/- 마우스의 간 외식편은 현저히 더 적은 IL-6을 생성하였고, 이는 염증이 감소되었음을 나타낸다 (도 10A). 또한, ApoE-/- 마우스의 면역 세포 수와 비교하여, 다양한 면역 세포 (대식세포, NKT 및 NK 세포를 포함함)의 수가 모두 NKG2D-녹아웃 ApoE-/- 마우스의 간에서 감소되었고 (도 10B), 이는 NKG2D/리간드 상호작용을 방지하는 것이 실제로 간 염증을 감소시켰음을 나타낸다.
어떤 면역 세포가 NKG2D/리간드 상호작용에 의해 영향을 받아 간 염증을 일으키는지 조사하였다. 아테롬성 동맥경화성 대동맥과 같이, ApoE-/- 마우스의 간에서 NKG2D 리간드는 고도로 상향조절되었다 (도 11A). 간의 대식세포 및 간세포 둘 모두는, 야생형 대조군과 비교하여 ApoE-/- 마우스에서의 Rae-1 발현을 상향조절하였다 (도 11 B 내지 D). 서구식 식이를 공급받은 ApoE-/- 마우스의 간에서의 상향조절된 리간드에 상응하여, 이러한 마우스의 간의 NKG2D-발현 면역 세포, 예컨대 NK 및 특히 NK T 세포는 상당한 양의 사이토킨 (IFN-γ 및 IL-4를 포함함)의 생성을 보였고, 이는 또한, 마우스가 NKG2D가 부족한 경우에는 현저히 감쇠하였다 (도 11 E 및 F). 반대로, NKG2D를 발현시키지 않는 간 대식세포는 마우스가 NKG2D를 발현시키는지 여부의 관계없이 ApoE-/- 마우스에서 높은 수준의 IL-6을 생성하였다 (도 11 G). 그러나, 이미 언급한 바와 같이, 대식세포의 수는 Klrk1-/-ApoE-/- 마우스에서 실질적으로 감소하였고, 이는 대식세포가 NKG2D 매개 염증에 의해 간접적으로 영향을 받았음을 나타낸다. 이러한 발견은, 비정상적인 대사성 병태가 특히 비정상적인 대사물이 축적되는 조직, 예컨대 아테롬성 동맥경화성 플라크 및 간에서 NKG2D 리간드의 상향조절을 유도하므로, NKG2D/리간드 상호작용이 아테롬성 동맥경화증에 대한 유용한 중재 표적임을 입증하였다.
실시예 7: NKG2D / 리간드 상호작용의 방지가 서구식 식이를 공급받은 ApoE -/- 마우스에서의 글루코스 수준을 감소시킴
한 실험에서, 8주령 ApoE-/- 및 NKG2D-결핍 ApoE-/-Klrk1-/- 마우스에게 3개월 동안 서구식 식이를 공급하였다. 이어서, 식이공급 섭생 말미에 혈액 혈청을 수집하고, 글루코스 수준에 대해 평가하였다. ApoE-/-Klrk-/- 마우스는 평균적으로 3달 동안의 서구식 식이 공급 후에, ApoE-/- 마우스보다 현저히 저하된 글루코스 수준을 가졌고 (도 12), 이는 NKG2D/리간드 상호작용의 방지가 고혈당증 진행을 억제할 수 있음을 제시한다.
실시예 8: 항- NKG2D 항체는 제2형 당뇨병의 설치류 모델에서의 고혈당증 및 당뇨병의 발생 및 진행을 방지함
제2형 당뇨병의 발생 및 진행에 대한 NKG2D 차단의 효과를 추가로 측정하기 위해, 항-NKG2D 항체를 제2형 당뇨병의 게르빌 동물 모델인 사모미스 오베수스 (모래쥐로도 알려짐)에게 투여하였다.
수컷 및 암컷 사모미스 오베수스 (할란, 이스라엘 예루살렘 소재)가 9주령이 될 때까지 저에너지 (2.4 kcal/g) 식이를 공급하고, 9주령이 되었을 때 고에너지 (3.1 kcal/g)의 무제한 식이로 바꾸고, 이 기간 동안 최대 10일까지 (유도 기간) 체중 (BW) 및 오전 혈당 (mBG)을 지켜보았다. 증가된 mBG 수준 (2회의 연속적인 판독 결과, mBG > 10 mmol/L로 정의됨)을 나타낸 동물을 다시 저에너지 식이로 바꾸고, 이들의 mBG 수준이 다시 비-당뇨병성 수준으로 돌아오는 10일 후에 이들을 실제 연구 (방지)에서 사용하였다. 유도 기간 동안 mBG에서 어떠한 증가도 나타내지 않은 동물은 희생시키고, 더이상 사용하지 않았다.
사모미스 오베수스를 복막내 주사에 의해 매주 1회 비히클 (N=19) 또는 NKG2D-PE 항체 클론 CX5 (N=9)로 처치하였다. NKG2D 설치류 항체 제제는 약 10 EU/㎖ 또는 0.96 mg/㎖의 CX5 OP001을 포함한다. PBS 완충액 중에 용해된 45 ㎖의 하나의 바이알을 4℃에서 유지시키고, 사용된 투여 부피는 0.52 ㎖/kg 또는 0.5 mg/kg이었다.
연구를 6주에 걸쳐 수행하고, 이 기간 동안 mBG 및 BW를 정기적으로 지켜보았다. mBG (mmol/ℓ)의 측정을 위해, 혈액 샘플을 꼬리로부터 모세관 끝부분으로 10 ㎕의 유리 모세관 내로 채취하고, 즉시 에펜도르프(eppendorf) 바이알의 완충액 (500 ㎕의 바이오센(Biosen) 분석 완충액) 중에 현탁시키고, 시험 당일 글루코스에 대해 분석하였다.
연구 동안, 심하게 상승된 mBG 및 케톤산증으로 인하여, 비히클 군의 5마리의 동물 및 NKG2D 항체 군의 1마리를 희생시켜야 했다. 상기 연구는 덴마크 법무부 동물 실험 조사기관에 의해 승인받았다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 비히클 또는 NKG2D 항체의 제1 투여 6주 후, 비히클 군의 모든 동물이 14.5 ± 2.6 mM (평균 ± sem)의 평균 mBG를 가지며 심한 당뇨병성이 된 반면, NKG2D 항체로 처치된 동물은 정상 혈당으로 유지되고 (mBG < 8 mM), 크게 더 저하된 8.0 ± 1.9 mM, p<0.0001 (평균 ± sem)의 mBG를 가졌다. 2개의 처치 군에서의 BW 증가의 차이는 없었다. 이러한 발견은, NKG2D가, 제2형 당뇨병에 걸린 인간과 다수의 동일한 특징을 갖는 설치류 동물 모델에서의 명백한 제2형 당뇨병의 발생에 매우 중요한 역할을 수행함 (아마도 염증, 인슐린 내성 및 베타 세포 부전증의 감소를 통한 것임)을 증명한다. NKG2D의 효과를 항체로 차단함으로써, 고에너지 식이로 유발된 사모미스 오베수스에서의 제2형 당뇨병의 발생이 완전히 방지되었다.
항-NKG2D 항체의 특이성을 확인하기 위해, 사모미스 오베수스로부터의 혈액 세포에 대한 NKG2D 항체 결합의 유세포 분석을 수행하였다.
간략히, 모래쥐로부터의 EDTA-안정화된 혈액 분취액 100 ㎕를, NKG2D에 대한 항체 또는 이소형 대조군: 항-마우스 NKG2D-PE (클론 CX5), 래트 IgG1-PE 이소형 대조군, 항-인간 NKG2D-PE (클론 1D11), 마우스 IgG1-PE 이소형 대조군 및 항-인간 NKG2D-PE (클론 ON72)로 염색하였다. 이어서, BD FACS 용해/고정화 용액 및 PBS를 이용하여 혈액을 용해시키고, 고정화하고, 세척하고, PE-접합된 항체의 결합을 LSRII 유세포 분석기상에서 측정하였다. FSC/SSC를 사용하여 비-과립구를 확인하였다.
도 14에 유세포 분석에 의해 나타낸 바와 같이, 모래쥐 혈액 내 NK 세포에 대한 항-마우스 NKG2D-PE 항체 (클론 CX5)의 용량-의존성 결합을 측정하였다. 이러한 결합은, 이소형 대조군 항체 (래트 IgG1-PE 이소형 대조군 (R3-34) 및 마우스 IgG1-PE 이소형 대조군 (MOPC-21)) 또는 항-인간 NKG2D 항체 (클론 1D11 및 클론 ON72)에 대한 결합은 존재하지 않기 때문에 특이적이다.
상기 결과는, 제2형 당뇨병 및 고혈당증의 치료에 대한 NKG2D 표적화의 유용성을 입증한다.
물질 및 방법
마우스 모델 및 인간 환자: C56BL/6 배경의 ApoE-/- 마우스를 잭슨 랩에서 구입하였다. Klrk1-/- 마우스는 앞서 기재되었다. ApoE-/- 및 Klrk1-/- 마우스를 교배하고 새끼들을 이종교배시켜, Klrk1-/-ApoE-/- 마우스를 생성시켰다. 아테롬성 동맥경화증을 촉진시키기 위해, 6주령 수컷에게 알 리비도(al libido) 서구식 식이를 공급하거나 또는 스트렙토조토신 (STZ)으로 주사하여 당뇨병을 유도하고 (문헌 [Park et al., Nat Med, 4:1025-1031 (1998)]), 치료 개시 후 8 내지 10주 동안 분석하였다. NKG2D 항체 차단 실험을 위해, STZ 투여 10일 전에 그리고 그 후 8주 동안 매주, ApoE-/- 마우스를 모노클로날 NKG2D 항체 (클론 MI-6, 래트 lgG2a) (문헌 [Jamieson et al., Immunity, 17:19-29 (2002)])로 주사하였다 (제1 주사 시 200 μg, 및 나머지 주사 1회 당 100 μg).
항체 및 시약: NKG2D 항체 (클론 MI-6)를 하우스에서 제조하였다. Pan-Rae-1 항체를 R&D 시스템즈에서 구매한 반면, 나머지는 BD 바이오사이언시스(BD Biosciences) 또는 이바이오사이언스(eBioscience)에서 구매하였거나 또는 하기 관련 부분에 나타냈다.
인 페이스 오일 레드 O 염색: 상이하게 처치된 마우스의 대동맥을 개구하고, 10％ 포르말린에서 고정화시키고, 오일 레드 O 염료로 염색하였다. 어도비 포토샵(Adobe Photoshop)을 이용한, 염색된 대동맥의 디지털 사진에 기초하여, 오일 레드 O 염색 양성 플라크 면적의 크기를 계산하였다.
면역조직화학적 염색: 마우스 대동맥 플라크의 동결절편을 폴리클로날 산양 항-마우스 Rae-1 또는 H60 항체 (각각, R&D 시스템즈 및 산타 크루즈 바이오테크놀로지)에 이어서, 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 당나귀 항-산양 IgG 항체 및 ABC-HRP 염색 시스템 (갈색) (산타 크루즈 바이오테크놀로지)으로 염색하였다. 모노클로날 래트 항-마우스 CD68 항체 (세로테크)에 이어서, 알칼리성 포스포타제 (AP)-접합된 당나귀 항-래트 항체 및 ABC-AP 염색 키트 (파란색) (벡터 래보러토리)로 상기 절편을 추가로 염색하였다. 인간 대동맥 플라크의 인접한 동결절편을 모노클로날 마우스 항-인간 MICA/B 항체 (클론 6D4, 이바이오사이언스), 항-Mac-3 또는 항-CD31 항체로 염색하였다.
세포 단리: 단핵세포, 내피세포 및 간세포를 보고된 절차에 따라 대동맥 또는 간으로부터 단리시켰다. 단리된 세포를 계수하고, 다양한 분석에 사용하였다.
유세포분석: 세포를 형광 표지된 항체의 적절한 조합물로 염색하고, 유세포분석기 FC500 (베크만 카운터(Beckman Counter))를 사용하여 유세포 분석에 의해 분석하였다.
반-정량적 및 실시간 RT-PCR 분석: 반-정량적 방사성 또는 실시간 RT-PCR에 의해, RNA를 Rae-1δ, Rae-1ε 및 H60b의 전사에 대해 분석하였다.
대식세포의 시험관내 처치: 복막 대식세포를 oxLDL (10 μg/㎖), 천연 LDL (nLDL) (10 μg/㎖), AGE (200 μg/㎖) 또는 LPS (200 ng/㎖)를 함유하는 배지에서 2일 동안 시험관내 배양하고, NKG2D 리간드의 발현에 대해 분석하였다.
Rae-1 총 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석: 대식세포를 용해시키고, PAGE 겔 상에 분리시키고, PEGF 막으로 옮기고, 항-Rae1 항체 (C20, 산타 크루즈 바이오테크놀로지)로 블러팅하고, SEL 시스템으로 진행시켰다.
혈청 사이토킨의 다중 분석: 마우스 혈청을 마우스 전염증성-7중 키트 (IL-6, TNF-α, IFN-γ, IL-12p70, IL-10, IL-1β 및 KC/CXCL1) (메조 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재) 상에서 직접 분석하였다.
혈청 내 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준의 평가: 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 수준을 베트테스트(VetTest)® 화학 분석기 (IDEXX 래보러토리즈 인크.(IDEXX Laboratories, Inc); 미국 메인주 소재) 상에서 분석하였다.
ALT 활성 분석: 바이오 사이언티픽 (미국 텍사스주 오스틴 소재)으로부터의 키트를 제조사의 지시사항에 따라 사용하여, 혈청에서의 ALT 활성을 측정하였다.
간 외식편의 생체외 배양: PBS-관류시킨 간을 서구식 식이를 공급받은 ApoE-/- 또는 Klrk1-/-ΑpoE-/- 마우스로부터 절개하였다. 동등한 중량의 절개된 간을 약 1 mm3 부피로 절개하고, 1 또는 3일 동안 배지에서 배양하였다. 배양 배지를 회수하고, ELISA에 의해 사이토킨에 대해 분석하였다.
세포내 사이토킨 염색: 간으로부터 단리된 단핵세포를 브레펠딘(brefeldin) A의 존재하에 밤새 배지에서 배양하고, 제조사 (이바이오사이언스 및 바이오레전드(Biolegend))의 지침서에 따른 세포내 사이토킨의 염색에 의해, 면역 세포의 게이팅 부분집합에서의 IL-6, IFN-γ 및 IL-4의 생성에 대해 분석하였다.
가용성 MICA의 ELISA 검출: ELISA 키트 (R&D 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용하여, 제2형 당뇨병성 및 암 환자의 혈청을 MICA 단백질에 대해 분석하였다.
통계적 분석: 모든 데이터를 평균 ± sem으로서 나타냈다. 통계적 유의성을 양측 학생 T 시험(two-tail student T test)을 통해 결정하였다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
공보, 특허 출원 및 특허를 비롯한, 본원에 인용된 모든 참조문헌은, 각각의 참조문헌이 개별적으로 그리고 특정하게 명시되어 그 거명에 의해 포함되며 본원에 그의 전문이 제시되는 것과 동일한 정도로, 본원에 그 거명에 의해 포함된다.
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본 발명은 본원에 제시된 측면 또는 청구항에 인용된 특허 대상의 모든 변형 및 등가물을 특허법에 의해 허용되는 최대 범위로 포함한다.
예시적인 실시양태
다음은 본 발명의 예시적인 실시양태이다.
1. NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제를 제2형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 제2형 당뇨병의 치료 방법.
2. NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제를 제2형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 제2형 당뇨병의 치료 방법.
3. NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제를, NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 병태는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성 기능이상-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 상기 병태의 치료 방법.
4. NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제를, NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 병태는 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성 기능이상-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 상기 병태의 치료 방법.
5. 실시양태 3 또는 4에 있어서, 병태가 제2형 당뇨병인 방법.
6. 실시양태 3 또는 4에 있어서, 병태가 심혈관 질환인 방법.
7. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
8. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 작용제가 가용성 NKG2D, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, NKG2D 리간드, 및 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
9. 실시양태 8에 있어서, 작용제가 NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 방법.
10. 실시양태 9에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인간의 것 또는 인간화된 것인 방법.
11. 실시양태 9에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인간 NKG2D (hNKG2D)와 결합하는 것인 방법.
12. 실시양태 9에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 NKG2D-발현 세포의 NKG2D-매개 활성화 또는 신호전달을 감소시키는 것인 방법.
13. 실시양태 9 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 NKG2D와 결합하는 하나 이상의 NKG2D 리간드와 경쟁하는 것인 방법.
14. 실시양태 13에 있어서, NKG2D 리간드가 MICA/B인 방법.
15. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 작용제의 투여가 대상체에서 혈당 수준의 감소, 내당능의 개선, 인슐린 내성의 감소, 체중의 감소, 혈압의 강하, 염증의 감소 또는 대사성 기능이상의 감소 중 하나 이상을 유발하는 것인 방법.
16. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 작용제가 정맥내, 복막내 또는 피하 투여되는 것인 방법.
17. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항당뇨제, 항비만제, 식욕조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로 인한 또는 당뇨병과 관련된 합병증의 치료제 및/또는 예방제, 및 비만으로 인한 또는 비만과 관련된 합병증 및 장애의 치료제 및/또는 예방제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 작용제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
18. 실시양태 17에 있어서, 추가 작용제가 (a) GLP-1 및 GLP-1 유도체 및 유사체, 엑센딘-4 및 엑센딘-4 유도체 및 유사체, 아밀린 및 아밀린 유도체 및 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드 (예컨대, 나테글리니드 및 레파글리니드), 글루코시다제 억제제, DPP-IV (디펩티딜 펩티다제-IV) 억제제, SGLT2 억제제, SGLT1 억제제 또는 효능제, 가스트린 및 가스트린 유사체 및 유도체, FGF-21 (섬유모세포 성장 인자 21) 및 FGF-21 유도체 및 유사체, 양성자 펌프 억제제, 예컨대 란소프라졸, 오메프라졸, 덱슬란소프라졸, 에소메프라졸, 판토프라졸, 및 라베프라졸, RXR 효능제, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 프로부콜, 덱스트로티록신, PPAR 효능제, 및 아디포넥틴 및 아디포넥틴 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈당 강하제; (b) 항고지방혈증제, HMG CoA 억제제 (스타틴), 예컨대 로바스타틴, 프라바스타틴 및 심바스타틴, 및 피브레이트, 예컨대 겜피브로질 및 클로피브레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액 지질 강하제 또는 지질 대사 조절제; (c) NPY (신경펩티드 Y) 길항제, PYY (폴리펩티드 YY) 효능제, PP (췌장 폴리펩티드) 효능제, Y2 수용체 효능제, Y4 수용체 효능제, 혼합형 Y2/Y4 수용체 효능제, MC4 (멜라노코르틴 4) 효능제, 오렉신 길항제, 글루카곤 및 글루카곤 유도체 및 유사체, CRF (코르티코트로핀 방출 인자) 효능제, CRF BP (코르티코트로핀 방출 인자 결합 단백질) 길항제, 우로코르틴 효능제, β3 효능제, MSH (멜라닌 세포-자극 호르몬) 효능제, MCH (멜라닌 세포-농축 호르몬) 길항제, CCK (콜레시스토키닌) 효능제, 세로토닌 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 재흡수 억제제, 혼합형 세로토닌 및 노르아드레날린성 화합물, 5HT (세로토닌) 효능제, 봄베신 효능제, 갈라닌 길항제, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 화합물, TRH (티레오트로핀 방출 호르몬) 효능제, UCP 2 또는 3 (비-커플링 단백질 2 또는 3) 조절제, 렙틴 효능제, DA 효능제 (브로모크립틴, 도프렉신), 리파제/아밀라제 억제제, RXR (레티노이드 X 수용체) 조절제, 히스타민 H3 길항제, 및 CART (코카인 암페타민 조절 전사) 효능제로 이루어진 군으로부터 선택되는 식품 섭취량 저하제 또는 에너지 소비량 증가제; 및 (d) β-차단제, 예컨대 알프레놀롤, 아테놀롤, 티몰롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤 및 메토프롤롤, ACE (안지오텐신 전환 효소) 억제제, 예컨대 베나제프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 알라트리오프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴, 칼슘 채널 차단제, 예컨대 니페디핀, 펠로디핀, 니카르디핀, 이스라디핀, 니모디핀, 딜티아젬 및 베라파밀, 및 α-차단제, 예컨대 독사조신, 우라피딜, 프라조신 및 테라조신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈압 강하제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
19. NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
20. NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
21. 실시양태 19 또는 20에 있어서, 작용제가 제2형 당뇨병의 치료에 유용한 것인 조성물.
22. 실시양태 19 또는 20에 있어서, 작용제가 NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태의 치료에 유용한 것인 조성물.
23. 실시양태 22에 있어서, 병태가 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성 기능이상-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
24. 실시양태 23에 있어서, 병태가 제2형 당뇨병인 조성물.
25. 실시양태 23에 있어서, 병태가 심혈관 질환인 조성물.
26. 실시양태 19 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 작용제가 가용성 NKG2D, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, NKG2D 리간드, 및 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
27. 실시양태 26에 있어서, 작용제가 NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 조성물.
28. 실시양태 27에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인간의 것 또는 인간화된 것인 조성물.
29. 실시양태 27에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인간 NKG2D (hNKG2D)와 결합하는 것인 조성물.
30. 실시양태 26에 있어서, 작용제가 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제인 조성물.
31. 실시양태 30에 있어서, NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제가 MICA/B 억제제인 조성물.
32. 실시양태 31에 있어서, MICA/B 억제제가 MICA/B-특이적 siRNA인 조성물.
33. 실시양태 19 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 항당뇨제, 항비만제, 식욕조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로 인한 또는 당뇨병과 관련된 합병증의 치료제 및/또는 예방제, 및 비만으로 인한 또는 비만과 관련된 합병증 및 장애의 치료제 및/또는 예방제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 작용제를 더 포함하는 조성물.
34. 실시양태 33에 있어서, 추가 작용제가 (a) GLP-1 및 GLP-1 유도체 및 유사체, 엑센딘-4 및 엑센딘-4 유도체 및 유사체, 아밀린 및 아밀린 유도체 및 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드 (예컨대, 나테글리니드 및 레파글리니드), 글루코시다제 억제제, DPP-IV (디펩티딜 펩티다제-IV) 억제제, SGLT2 억제제, SGLT1 억제제 또는 효능제, 가스트린 및 가스트린 유사체 및 유도체, FGF-21 (섬유모세포 성장 인자 21) 및 FGF-21 유도체 및 유사체, 양성자 펌프 억제제, 예컨대 란소프라졸, 오메프라졸, 덱슬란소프라졸, 에소메프라졸, 판토프라졸, 및 라베프라졸, RXR 효능제, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 프로부콜, 덱스트로티록신, PPAR 효능제, 및 아디포넥틴 및 아디포넥틴 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈당 강하제; (b) 항고지방혈증제, HMG CoA 억제제 (스타틴), 예컨대 로바스타틴, 프라바스타틴 및 심바스타틴, 및 피브레이트, 예컨대 겜피브로질 및 클로피브레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액 지질 강하제 또는 지질 대사 조절제; (c) NPY (신경펩티드 Y) 길항제, PYY (폴리펩티드 YY) 효능제, PP (췌장 폴리펩티드) 효능제, Y2 수용체 효능제, Y4 수용체 효능제, 혼합형 Y2/Y4 수용체 효능제, MC4 (멜라노코르틴 4) 효능제, 오렉신 길항제, 글루카곤 및 글루카곤 유도체 및 유사체, CRF (코르티코트로핀 방출 인자) 효능제, CRF BP (코르티코트로핀 방출 인자 결합 단백질) 길항제, 우로코르틴 효능제, β3 효능제, MSH (멜라닌 세포-자극 호르몬) 효능제, MCH (멜라닌 세포-농축 호르몬) 길항제, CCK (콜레시스토키닌) 효능제, 세로토닌 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 재흡수 억제제, 혼합형 세로토닌 및 노르아드레날린성 화합물, 5HT (세로토닌) 효능제, 봄베신 효능제, 갈라닌 길항제, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 화합물, TRH (티레오트로핀 방출 호르몬) 효능제, UCP 2 또는 3 (비-커플링 단백질 2 또는 3) 조절제, 렙틴 효능제, DA 효능제 (브로모크립틴, 도프렉신), 리파제/아밀라제 억제제, RXR (레티노이드 X 수용체) 조절제, 히스타민 H3 길항제, 및 CART (코카인 암페타민 조절 전사) 효능제로 이루어진 군으로부터 선택되는 식품 섭취량 저하제 또는 에너지 소비량 증가제; 및 (d) β-차단제, 예컨대 알프레놀롤, 아테놀롤, 티몰롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤 및 메토프롤롤, ACE (안지오텐신 전환 효소) 억제제, 예컨대 베나제프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 알라트리오프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴, 칼슘 채널 차단제, 예컨대 니페디핀, 펠로디핀, 니카르디핀, 이스라디핀, 니모디핀, 딜티아젬 및 베라파밀, 및 α-차단제, 예컨대 독사조신, 우라피딜, 프라조신 및 테라조신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈압 강하제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
35. (a) 제약상 허용되는 담체와 조합한, NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제; 및
(b) 사용 설명서
를 포함하는 키트.
36. (a) 제약상 허용되는 담체와 조합한, NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제; 및
(b) 사용 설명서
를 포함하는 키트.
37. 실시양태 35 또는 36에 있어서, 작용제가 제2형 당뇨병의 치료에 유용한 것인 키트.
38. 실시양태 35 또는 36에 있어서, 작용제가 NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태의 치료에 유용한 것인 키트.
39. 실시양태 38에 있어서, 병태가 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성 기능이상-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
40. 실시양태 39에 있어서, 병태가 제2형 당뇨병인 키트.
41. 실시양태 39에 있어서, 병태가 심혈관 질환인 키트.
42. 실시양태 35 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 작용제가 가용성 NKG2D, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, NKG2D 리간드, 및 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
43. 실시양태 42에 있어서, 작용제가 NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 키트.
44. 실시양태 43에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인간의 것 또는 인간화된 것인 키트.
45. 실시양태 43에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인간 NKG2D (hNKG2D)와 결합하는 것인 키트.
46. 실시양태 35 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 항당뇨제, 항비만제, 식욕조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로 인한 또는 당뇨병과 관련된 합병증의 치료제 및/또는 예방제, 및 비만으로 인한 또는 비만과 관련된 합병증 및 장애의 치료제 및/또는 예방제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 작용제를 더 포함하는 키트.
47. 실시양태 46에 있어서, 추가 작용제가 (a) GLP-1 및 GLP-1 유도체 및 유사체, 엑센딘-4 및 엑센딘-4 유도체 및 유사체, 아밀린 및 아밀린 유도체 및 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, 메글리티니드 (예컨대, 나테글리니드 및 레파글리니드), 글루코시다제 억제제, DPP-IV (디펩티딜 펩티다제-IV) 억제제, SGLT2 억제제, SGLT1 억제제 또는 효능제, 가스트린 및 가스트린 유사체 및 유도체, FGF-21 (섬유모세포 성장 인자 21) 및 FGF-21 유도체 및 유사체, 양성자 펌프 억제제, 예컨대 란소프라졸, 오메프라졸, 덱슬란소프라졸, 에소메프라졸, 판토프라졸, 및 라베프라졸, RXR 효능제, 콜레스티라민, 콜레스티폴, 프로부콜, 덱스트로티록신, PPAR 효능제, 및 아디포넥틴 및 아디포넥틴 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈당 강하제; (b) 항고지방혈증제, HMG CoA 억제제 (스타틴), 예컨대 로바스타틴, 프라바스타틴 및 심바스타틴, 및 피브레이트, 예컨대 겜피브로질 및 클로피브레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액 지질 강하제 또는 지질 대사 조절제; (c) NPY (신경펩티드 Y) 길항제, PYY (폴리펩티드 YY) 효능제, PP (췌장 폴리펩티드) 효능제, Y2 수용체 효능제, Y4 수용체 효능제, 혼합형 Y2/Y4 수용체 효능제, MC4 (멜라노코르틴 4) 효능제, 오렉신 길항제, 글루카곤 및 글루카곤 유도체 및 유사체, CRF (코르티코트로핀 방출 인자) 효능제, CRF BP (코르티코트로핀 방출 인자 결합 단백질) 길항제, 우로코르틴 효능제, β3 효능제, MSH (멜라닌 세포-자극 호르몬) 효능제, MCH (멜라닌 세포-농축 호르몬) 길항제, CCK (콜레시스토키닌) 효능제, 세로토닌 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 재흡수 억제제, 혼합형 세로토닌 및 노르아드레날린성 화합물, 5HT (세로토닌) 효능제, 봄베신 효능제, 갈라닌 길항제, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 화합물, TRH (티레오트로핀 방출 호르몬) 효능제, UCP 2 또는 3 (비-커플링 단백질 2 또는 3) 조절제, 렙틴 효능제, DA 효능제 (브로모크립틴, 도프렉신), 리파제/아밀라제 억제제, RXR (레티노이드 X 수용체) 조절제, 히스타민 H3 길항제, 및 CART (코카인 암페타민 조절 전사) 효능제로 이루어진 군으로부터 선택되는 식품 섭취량 저하제 또는 에너지 소비량 증가제; 및 (d) β-차단제, 예컨대 알프레놀롤, 아테놀롤, 티몰롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤 및 메토프롤롤, ACE (안지오텐신 전환 효소) 억제제, 예컨대 베나제프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 알라트리오프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴, 칼슘 채널 차단제, 예컨대 니페디핀, 펠로디핀, 니카르디핀, 이스라디핀, 니모디핀, 딜티아젬 및 베라파밀, 및 α-차단제, 예컨대 독사조신, 우라피딜, 프라조신 및 테라조신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈압 강하제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
48. (a) 대상체로부터 샘플을 얻는 단계;
(b) 상기 샘플을, MICA/B 발현의 존재를 검출하는 하나 이상의 시약과 접촉시키는 단계;
(c) 상기 샘플에서 MICA/B 발현의 수준을 측정하는 단계; 및
(d) MICA/B의 과발현을 대상체 내 제2형 당뇨병의 발생 또는 제2형 당뇨병의 존재에 대한 소인과 연관시키는 단계
를 포함하는, 대상체 내 제2형 당뇨병의 발생 또는 제2형 당뇨병의 존재에 대한 소인을 검출하는 방법.
49. (a) 대상체로부터 샘플을 얻는 단계;
(b) 상기 샘플을, MICA/B 발현의 존재를 검출하는 하나 이상의 시약과 접촉시키는 단계;
(c) 상기 샘플에서 MICA/B 발현의 수준을 측정하는 단계; 및
(d) MICA/B의 과발현을 대상체 내 심혈관 질환의 발생 또는 심혈관 질환의 존재에 대한 소인과 연관시키는 단계
를 포함하는, 대상체 내 심혈관 질환의 발생 또는 심혈관 질환의 존재에 대한 소인을 검출하는 방법.
50. 실시양태 48 또는 49에 있어서, 시약이 MICA/B 항체인 방법.
51. 실시양태 48 또는 49에 있어서, 샘플이 혈청인 방법.
52. 실시양태 48 또는 49에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
53. 실시양태 48 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 샘플 내 MICA/B가 아닌 심혈관 질환 마커의 발현의 수준을 측정하는 단계, 및 상기 심혈관 질환 마커의 과발현 또는 저발현을 대상체 내 심혈관 질환의 발생 또는 심혈관 질환의 존재에 대한 소인과 연관시키는 단계를 더 포함하는 방법.
SEQUENCE LISTING <110> The Penn State Research Foundation and The Regents of the University of California <120> COMPOSITIONS, METHODS AND KITS FOR DETECTING AND TREATING ABNORMAL METABOLIC AND CARDIOVASCULAR DISEASES <130> P025-0001PCT <141> 2010-08-16 <150> US 61/234,425 <151> 2009-08-17 <150> 61/304,113 <151> 2010-02-12 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Arg Tyr Phe Asp Trp Phe Pro Leu Asp Tyr Arg Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Arg Tyr Phe Asp Trp Phe Pro Leu Asp Tyr Arg Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Gly Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr 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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ser Ile Thr Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Arg Arg Tyr Phe Asp Trp Phe Pro Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Gln Tyr Asn Gly Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Tyr Gly Met Thr 1 5 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Arg Glu Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val 1 5 10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Thr 1 5 <210> 21 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Asn Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 22 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 23 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Asn Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Leu Thr Met Phe Arg Gly Ile Ile Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 195 200 205 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 210 215 220 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 24 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 25 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Asn Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Asn Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Leu Thr Met Phe Arg Gly Ile Ile Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 28 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile 1 5 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Asn Tyr Trp Val Gly 1 5 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Leu Thr Met Phe Arg Gly Ile Ile Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp Thr 1 5

Claims (15)

  1. 제2형 당뇨병을 치료하기 위한, 대상체에서 NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제의 용도.
  2. 제2형 당뇨병을 치료하기 위한, 대상체에서 NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제의 용도.
  3. 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성 기능이상-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태를 치료하기 위한, 대상체에서 NKG2D 활성화 또는 신호전달을 억제하는 치료 유효량의 작용제의 용도.
  4. 제2형 당뇨병, 심혈관 질환, 염증성 질환 및 대사성 기능이상-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 NKG2D의 억제를 통해 조절되거나 또는 정상화될 수 있는 병태를 치료하기 위한, 대상체에서 NKG2D 리간드 결합 상호작용을 차단하는 치료 유효량의 작용제의 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 가용성 NKG2D, NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, NKG2D 리간드, 및 NKG2D 리간드 활성 또는 발현의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  7. 제6항에 있어서, 작용제가 NKG2D와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 용도.
  8. 제7항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인간의 것 또는 인간화된 것인 용도.
  9. 제7항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인간 NKG2D (hNKG2D)와 결합하는 것인 용도.
  10. 제7항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 NKG2D-발현 세포의 NKG2D-매개 활성화 또는 신호전달을 감소시키는 것인 용도.
  11. 제7항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 NKG2D와의 결합에서 하나 이상의 NKG2D 리간드와 경쟁하는 것인 용도.
  12. 제11항에 있어서, NKG2D 리간드가 MICA/B인 용도.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제의 투여가 대상체에서 혈당 수준의 감소, 내당능의 개선, 인슐린 내성의 감소, 체중의 감소, 혈압의 강하, 염증의 감소 또는 대사성 기능이상의 감소 중 하나 이상을 유발하는 것인 용도.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 정맥내, 복막내 또는 피하 투여되는 것인 용도.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항당뇨제, 항비만제, 식욕조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로 인한 또는 당뇨병과 관련된 합병증의 치료제 및/또는 예방제, 및 비만으로 인한 또는 비만과 관련된 합병증 및 장애의 치료제 및/또는 예방제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 작용제를 더 포함하는 용도.
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