CN107082747B - 用于定向药物输送和增强siRNA活性的化合物 - Google Patents

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Abstract

本文描述式I的化合物:
Figure DDA0001226144030000011
其中R1和R2独立地选自C10至C18的烷基、C12至C18的烯基、和油基；其中R3和R4独立地选自C1至C6烷基、和C2至C6链烷醇；其中X选自‑CH2‑、‑S‑、和‑O‑或不存在；其中Y选自‑(CH2)n、‑S(CH2)n、‑O(CH2)n‑、噻吩、‑SO2(CH2)n‑、和酯，其中n＝1‑4；其中a＝1‑4；其中b＝1‑4；其中c＝1‑4；和其中Z是抗衡离子；化合物由以下结构组成：(定向分子)m‑接头‑(定向分子)n,其中所述定向分子是类视黄醇或脂溶性维生素，其在靶细胞上具有特异性受体；其中m和n独立地是0、1、2和3；其中接头包含聚乙二醇(PEG)或类PEG分子，以及包含这些化合物中的一种或两种的组合物和药物制剂，所述化合物对于输送治疗剂有用；和使用这些组合物和药物制剂的方法。

Description

用于定向药物输送和增强siRNA活性的化合物
本发明是申请日为2012年6月8日，申请号为201280027912.7，标题为“用于定向药物输送和增强siRNA活性的化合物”的专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年6月8号递交的美国临时申请No.61/494,840和61/494,710的权利，将其全部内容通过援引合并入本文。
技术领域
本发明涉及阳离子脂质和脂溶性维生素化合物的用途，以定向包含siRNA的治疗性分子和增强其活性。
背景技术
肝纤维化可由活化的肝星形细胞(HSC)引起，导致多种胶原分子和纤连蛋白沉积在间质组织上。这可引起肝硬化、肝功能衰竭、和/或肝细胞癌。另外长期的胰腺炎因为与肝纤维化的一样的机制的胰纤维化发生(Madro等人，2004；Med Sci Monit.10:RA166-70；Jaster,2004,Mol Cancer.6:26)。另外，星形细胞存在声带与喉的声带病症中，例如声带瘢痕、声带粘膜纤维化、和喉纤维化。为了预防和治疗在这些器官中的和身体的其它部位的纤维化，人们对开发药物载体和药物载体试剂盒有需求。
星形细胞是治疗纤维化的重要目标候选物之一(Fallowfield等人，2004,ExpertOpin Ther Targets.8:423-35；Pinzani等人，2004,Dig Liver Dis.36:231-42)。在纤维化期间，星形细胞由来自邻近细胞的细胞活素活化，并被活化。已知星形细胞是维生素A的贮藏细胞，属于肌成纤维细胞家族，并产生许多引起肝纤维化的因子。
预防或治疗纤维化的治疗性方法尝试控制胶原新陈代谢、提升胶原降解系统、和抑制星形细胞的活化，但是在所有情况下，因为作用的特异性和/或器官特异性低，存在有限的功效和不利的副作用的问题。
抑制胶原蛋白的合成还没有确立为治疗性方法。因为有引起副作用的可能性，定向胶原生产的分子的潜能是有限的。直接抑制胶原生产将是预防或治疗纤维化的显而易见的方法。为了这样做，需要控制各种胶原类型(collagen Types)I至IV中的一种或多种。实现此的方法可以是通过胶原特异性分子伴侣蛋白HSP47，其对于(对各种胶原是必需的)分子内运输和分子成熟是必需的。因此，如果在器官的星形细胞中可以特异地控制HSP47的功能，那么有可能抑制器官中的肝纤维化。
许多技术可用于运送例如siRNA的治疗剂进细胞，包括使用病毒转染系统和非病毒转染系统。非病毒转染系统可包括，例如聚合物、脂质、脂质体、微胶粒、树状具体、和纳米材料。先前已有研究用于细胞转染的聚合物的实例包括阳离子聚合物，例如聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖、和聚(2-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(pDMAEMA)。
各种系统具有其各自的优点和缺点。例如病毒系统可获得高转染率，但是可能不如一些非病毒系统安全。此外，病毒系统可能是复杂的和/或制备是昂贵的。已有报导例如阳离子聚合物的非病毒转染系统用于转化质粒DNA进入细胞。但是使用阳离子聚合物的一些缺点包括其对细胞的毒性和/或它们缺乏稳定性。
因此，迫切需求使用阳离子成分的新的化合物、组合物、和方法以改进包含核酸的治疗药物至细胞、组织和有机体的输送。
发明内容
本发明的一方面是式I的化合物
Figure BDA0001226144010000021
其中R1和R2独立地选自C10至C18的烷基、C12至C18的烯基、和油基；其中R3和R4独立地选自C1至C6烷基、和C2至C6链烷醇；其中X选自-CH2-、-S-、和-O-、或不存在；其中Y选自-(CH2)n、-S(CH2)n、-O(CH2)n-、噻吩、-SO2(CH2)n-、和酯，其中n＝1-4；其中a＝1-4；其中b＝1-4；其中c＝1-4；其中Z是抗衡离子。
一方面，本发明提供促进药物输送到靶细胞的化合物，其包含结构(定向分子)m-接头-(定向分子)n，其中定向分子类视黄醇，其在靶细胞上具有特异性受体或活化/结合位点；其中m和n独立地是0、1、2、或3；和其中接头包含聚乙二醇(PEG)或类PEG分子。
一个实施方式中，类视黄醇选自维生素A、维甲酸(retinoic acid)、维A酸(tretinoin)、阿达帕林、4-羟基(苯基)视黄酰胺(4-HPR)、棕榈酸视黄酯、视黄醇、饱和维甲酸、和饱和的去甲基化的维甲酸。
在另一个实施方式中，接头选自双酰胺-PEG、三酰胺-PEG、四酰胺-PEG、Lys-双酰胺-PEG Lys、Lys-三酰胺-PEG-Lys、Lys-四酰胺-PEG-Lys、Lys-PEG-Lys、PEG2000、PEG1250、PEG1000、PEG750、PEG550、PEG-Glu、Glu、C6、Gly3、和GluNH。
在另一个实施方式中，该化合物选自类视黄醇-PEG-类视黄醇、(类视黄醇)2-PEG-(类视黄醇)2、VA-PEG2000-VA、(类视黄醇)2-双酰胺-PEG-(类视黄醇)2、(类视黄醇)2-Lys-双酰胺-PEG-Lys-(类视黄醇)2。
在另一个实施方式中，类视黄醇选自维生素A、维甲酸(retinoic acid)、维A酸(tretinoin)、阿达帕林、4-羟基(苯基)视黄酰胺(4-HPR)、棕榈酸视黄酯、视黄醇、饱和维甲酸、和饱和的去甲基化的维甲酸。
在另一个实施方式中，该化合物是以下结构式的合成物(composition)
Figure BDA0001226144010000031
其中q、r、和s各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。
在另一个实施方式中，该化合物的结构式包括：
Figure BDA0001226144010000041
另一方面，本发明提供星形细胞特异性药物载体，其包含星形细胞特异性量的类视黄醇分子，所述类视黄醇分子包含结构(类视黄醇)m-接头-(类视黄醇)n；其中m和n独立地是0、1、2、或3；其中接头包含聚乙二醇(PEG)或类PEG分子。
在另一个实施方式中，本发明提供包含脂质体合成物的组合物。在其它实施方式中，所述脂质体合成物包含脂质分子双层的脂质囊泡。
在某些实施方式中，在药物载体到达星形细胞之前，类视黄醇分子至少部分地暴露于该药物载体的外部。
在另一个实施方式中，类视黄醇是脂质分子的0.1摩尔％至20摩尔％。
本发明中也提供实施方式，其中脂质分子包含一种或多种选自以下的脂质：HEDC、DODC、HEDODC、DSPE、DOPE、和DC-6-14。在另一个实施方式中，所述脂质分子还包含S104。
在某些实施方式中，药物载体包含核酸。
在其它实施方式中，所述核酸是能够敲除星形细胞中hsp47 mRNA的表达的siRNA。
在另一方面，本发明提供促进药物输送至靶细胞的化合物，其包含结构(脂质)m-接头-(定向分子)n，其中定向分子类视黄醇或脂溶性维生素，其在靶细胞上具有特异性受体或活化/结合位点；其中m和n独立地是0、1、2、或3；其中接头包含聚乙二醇(PEG)分子。
在一个实施方式中，脂质选自以下的一种或多种：DODC、HEDODC、DSPE、DOPE、和DC-6-14。
在另一个实施方式中，类视黄醇选自维生素A、维甲酸(retinoic acid)、维A酸(tretinoin)、阿达帕林、4-羟基(苯基)视黄酰胺(4-HPR)、棕榈酸视黄酯、视黄醇、饱和维甲酸、和饱和的去甲基化的维甲酸。
在本发明的另一实施方式中，脂溶性维生素是维生素D、维生素E、或维生素K。
在另一个实施方式中，接头选自双酰胺-PEG、三酰胺-PEG、四酰胺-PEG、Lys-双酰胺-PEG Lys、Lys-三酰胺-PEG-Lys、Lys-四酰胺-PEG-Lys、Lys-PEG-Lys、PEG2000、PEG1250、PEG1000、PEG750、PEG550、PEG-Glu、Glu、C6、Gly3、和GluNH。
在本发明的另一实施方式中，选自DSPE-PEG-VA、DSPE-PEG2000-Glu-VA、DSPE-PEG550-VA、DOPE-VA、DOPE-Glu-VA、DOPE-Glu-NH-VA、DOPE-Gly3-VA、DC-VA、DC-6-VA、和AR-6-VA。
附图说明
图1描述本发明的某些实施方式的敲除功效。这包括与DC-6-14脂复合物与HEDC脂质体对照的比较。
图2描述使用阳离子脂质的基因敲除的体外比较。
图3描述对用本发明的示例性HEDODC脂质体制剂的体内基因表达的评价(*表示p<0.05)。
图4描述用实施例15的示例性HEDC脂质体制剂的体外基因表达的评价。误差棒表示标准方差(n＝3)。基于最优满足显示了S形的剂量反应曲线。从该曲线计算EC50值。这表明为11.8nM。
图5显示了使用大鼠DMNQ模型的体内测量结果。减去从首次用于实验的组确定的背景gp46 mRNA水平之后，将所有测试组的值标准化至载体组的平均gp46 mRNA(表达为载体组的百分比)。处理后的平均gp46 mRNA水平显示剂量依赖反应并将曲线拟合成S形剂量反应曲线。计算得ED50值为0.79mg/kg。
图6显示了使用大鼠DMNC模型的体内测量结果。减去从首次用于实验的组确定的背景gp46 mRNA水平之后，将所有测试组的值标准化至载体组的平均gp46 mRNA(表达为载体组的百分比)。通过定量RT-PCR
Figure BDA0001226144010000051
测验确定MRPL19 mRNA水平。将gp46的mRNA水平标准化至MRPL19水平。(***表示p<0.02。)
图7显示了使用大鼠肺博来霉素模型的体内测量结果。条形图总结了各组的Azan-染色的肺部分的纤维化(T.Ashcroft)得分。使用Prism5软件的单因素ANOVA、Bonferroni多对比测试进行统计学分析。
图8通过装饰添加VA-偶联物至脂质体增强了siRNA的活性。
图9通过共溶(co-solubilization)添加VA-偶联物至脂质体增强了siRNA的活性。
图10通过共溶添加VA-偶联物至脂质体增强了siRNA的活性。
图11通过共溶添加VA-偶联物至脂复合物增强了siRNA的活性。
图12通过共溶添加VA-偶联物至脂复合物与通过装饰比。
图13小鼠CCl4模型的体内功效。
图14装饰的与共溶的类视黄醇偶联物的体内功效相比。
图15体外功效(pHSC)，脂质体制剂中的类视黄醇偶联物的作用。
图16显示了类视黄醇偶联物含量(mol％)与体内(大鼠DMNQ)功效的关系。用包含0.75mg/kg的siRNA剂量的0、0.25、0.5、1、和2％的DiVA的制剂或PBS(载体)静脉注射的雄性Sprague-Dawley大鼠，在最后一次注射DMN后一个小时。
具体实施方式
式I的化合物在本发明的范围内
Figure BDA0001226144010000061
其中R1和R2独立地选自C10至C18的烷基、C12至C18的烯基、和油基；其中R3和R4独立地选自C1至C6烷基、和C2至C6链烷醇；其中X选自-CH2-、-S-、和-O-、或不存在；其中Y选自-(CH2)n、-S(CH2)n、-O(CH2)n-、噻吩、-SO2(CH2)n-、和酯，其中n＝1-4；其中a＝1-4；其中b＝1-4；其中c＝1-4；其中Z是抗衡离子。
本发明的化合物在本文中也指在已知为“阳离子脂质”的化合物的类别中。阳离子脂质是包含至少一个脂质结构部分和与抗衡离子联结的带正电的氮的化合物。“脂质”在本领域理解为由疏水性烷基或烯基结构部分和羧酸或酯结构部分组成。
在此以前，据发现式I的化合物的氨基-烷基-羟基(-N-烷基-OH)结构部分给予本发明的制剂之前用先前报道的阳离子脂质没有见到的性质。与不包含式I的化合物的制剂相比，包含式I的化合物的本发明的制剂产生优异的蛋白表达减少。特别令人惊奇的是包含式I的化合物的本发明的制剂减少HSP47表达的能力。
本发明的优选的化合物包括其中R1和R2各自独立地是C10-C30烷基的那些。在更优选的实施方式中，R1和R2各自独立地是C10-C20烷基。在甚至更优选的实施方式中，R1和R2各自独立地是C12-C18烷基。特别优选的实施方式包括其中R1和R2各自独立地是C13-C17烷基的那些。最优选的是其中R1和R2各为C13烷基的那些化合物。
在其它实施方式中，R1和R2各自独立地是C10-C30烯基。在更优选的实施方式中，R1和R2各自独立地是C10-C20烯基。在仍另一实施方式中，R1和R2各自独立地是C12-C18烯基。在还另一实施方式中，R1和R2各自独立地是C13-C17烯基。本发明最优选地化合物包括其中R1和R2各为C17烯基的那些。
也对于式I的化合物，R3和R4独立地选自C1至C6烷基。在优选的实施方式中，R3和R4各自独立地是C1-C3烷基。最优选地，R3和R4各为甲基。在其它实施方式中，R3和R4中的至少一个是–CH2CH2OH。
最优选地是其中a＝b＝c＝1的那些式I的化合物。
Z可以是任何氮抗衡离子，如该术语在本领域易于理解地。优选的氮抗衡离子包括卤离子和甲磺酸根(SO3CH3 -)，氯离子和溴离子是特别优选的。与其它前述的其中阳离子脂质的作用依赖于抗衡离子的阳离子脂质相比，令人惊奇地式I的化合物的效果表现出不与所选的抗衡离子相关联。
示例性的式I的化合物包括：
Figure BDA0001226144010000081
Figure BDA0001226144010000091
本发明的范围内是促进药物输送至靶细胞的化合物，其包含结构(定向分子)m-接头-(定向分子)n，其中定向分子类视黄醇或脂溶性维生素，其在靶细胞上具有特异性受体或活化/结合位点；其中m和n独立地是0、1、2、或3；其中接头包含聚乙二醇(PEG)分子或类PEG分子，并标示为“式A”。
本发明也提供促进药物输送至靶细胞的化合物，其包含结构(脂质)m-接头-(定向分子)n，其中定向分子是类视黄醇或脂溶性维生素，其在靶细胞上具有特异性受体或活化/结合位点；其中m和n独立地是0、1、2、或3；其中接头包含聚乙二醇(PEG)分子、类PEG分子，并被标示为“式B”。
此前聚发现式A或式B的化合物给予本发明的制剂先前未见的性质。包含式A或式B的化合物的本发明的制剂，与不含这些化合物的制剂相比，产生优异的基因表达减少。特别令人惊奇的是包含式A的化合物的本发明的制剂能够减少HSP47的表达。
在某些优选的实施方式中，类视黄醇选自维生素A、维甲酸(retinoic acid)、维A酸(tretinoin)、阿达帕林、4-羟基(苯基)视黄酰胺(4-HPR)、棕榈酸视黄酯、视黄醇、饱和维甲酸、和饱和的去甲基化的维甲酸。
优选的实施方式包含化合物，其中接头选自双酰胺-PEG、三酰胺-PEG、四酰胺-PEG、Lys-双酰胺-PEG Lys、Lys-三酰胺-PEG-Lys、Lys-四酰胺-PEG-Lys、Lys-PEG-Lys、PEG2000、PEG1250、PEG1000、PEG750、PEG550、PEG-Glu、Glu、C6、Gly3、和GluNH。在其它实施方式中，PEG是单分散的。
另一实施方式提供化合物，其中式A选自类视黄醇-PEG-类视黄醇、(类视黄醇)2-PEG-(类视黄醇)2、VA-PEG2000-VA、(类视黄醇)2-双酰胺-PEG-(类视黄醇)2、(类视黄醇)2-Lys-双酰胺-PEG-Lys-(类视黄醇)2。
在另一优选的实施方式中，该化合物是结构式
Figure BDA0001226144010000101
其中q、r、和s各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。
在其它优选的实施方式中，化合物的结构式包含
Figure BDA0001226144010000102
本发明的其它实施方式包含示于表1中的结构
表1
Figure BDA0001226144010000111
Figure BDA0001226144010000121
包含结构式I中的至少一种化合物和脂质体的本发明的组合物还可包含一种或多种类视黄醇偶联物。在本发明优选的实施方式中，基于组合物或制剂的总重量，类视黄醇偶联物将以约0.3至约30重量％的浓度存在，这相当于约0.1至约10摩尔％，其相当于约0.1至约10的摩尔比例。优选地，类视黄醇偶联物是类视黄醇-接头-脂质分子或类视黄醇-接头-类视黄醇分子。
类视黄醇偶联物的实例包括式II的化合物的那些：
Figure BDA0001226144010000122
其中q、r、和s各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，及其对映异构体或非对映异构体。
优选的式II的化合物包括其中q、r、和s各自独立地是1、2、3、4、5、6，或7的那些。更优选的是的其中q、r、和s各自独立地是3、4、或5那些式II的化合物。最优选的是其中q是3、r是5、和s是3的那些式II的化合物。式II的化合物的一个实例是
Figure BDA0001226144010000131
DiVA-PEG-DiVA包含立构中心，并且所有对映异构体和非对映异构体被认为是在本发明的范围之内的。
在本发明的组合物中(包括那些式I的阳离子脂质的)阳离子脂质的浓度，基于脂质组合物的总重量，可从1至约80重量％。更优选地，浓度是从1至约75重量％。甚至更优选地，浓度是从约30至约75重量％。从约30至约75重量％的浓度对应于至约30至60摩尔％和约30-60的摩尔比例。最优选的是具有阳离子脂质浓度为约50重量％的那些组合物。含有可离子化阳离子脂质和季胺阳离子脂质的混合物的制剂中，优选的mol％是从5％至45mol％，甚至更优选的是大约20摩尔％的可离子化阳离子脂质和20摩尔％的式I的季胺阳离子脂质的混合物。
此类组合物也可包含水介质。在这些实施方式中，包括式I的那些的阳离子脂质可以封装的脂质体中，并可能不易接近所述水介质。另外，包括式I的那些的阳离子脂质可定位在脂质体的外表面并易于接近水介质.
包含至少一种结构式I的化合物和脂质体遗迹任选地例如结构式II的化合物的类视黄醇偶联物的本发明的组合物也可包含siRNA。包含结构式A或B化合物的至少一种和siRNA的制剂也在本发明的范围之内。
据想象，任何siRNA分子可用在本发明的范围之内。所述siRNA可包含编码人hsp47的序列的mRNA的反义序列，所述人hsp47的序列由SEQ ID NO:1示例，其显示如下。
Figure BDA0001226144010000132
Figure BDA0001226144010000141
Figure BDA0001226144010000151
例如，
正义(5'->3')GGACAGGCCUCUACAACUATT(SEQ.ID.NO.2)
反义(3'->5')TTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU(SEQ.ID.NO.3).
此类组合物也可包含水介质。优选地，此类组合物基本上由至少一种在电荷复合物中的结构式I的化合物与siRNA组成。包含结构式I的化合物和siRNA的此类组合物可进一步包含液体介质。在一个实施方式中，所述液体介质适用于注射进入活的有机体。在本发明任何描述的实施方式的范围之内的液体介质可以是水性的，即完全由水溶剂组成，并包含盐、缓冲液和/或其它药物赋形剂。在另一个实施方式中，该液体介质可由水溶剂与例如有机溶剂的另一液体溶剂组合组成。在本发明任何描述的实施方式的范围之内的液体介质也可包含至少一种有机溶剂。有机溶剂本质上是本领域熟知的，并包括C1至C4醇、二甲基亚砜(“DMSO”)等。包含水合至少一种有机溶剂的混合物的那些液体介质也在在本发明任何描述的实施方式的范围之内。
包含至少一种结构式I的化合物和脂质体的组合物也在本发明的范围之内。一些实施方式可包含式I的化合物和脂质体的混合物。其它实施方式除了不在结构式I的范围内的阳离子脂质可包含脂质体和一种或多种式I的化合物。
在一些实施方式中，将由脂质体封装siRNA使得该siRNA不易于接近水介质。在其它实施方式中，将不用脂质体封装siRNA。在此类实施方式中，siRNA可复合(complex)在脂质体的外表面上。在这些实施方式中，siRNA易于接近水介质。
其它实施方式包含星形细胞特异性药物载体，其包括脂质体合成物。所述脂质体合成物包含脂质分子双层的脂质囊泡。在某些实施方式中，在药物载体到达星形细胞之前，优选类视黄醇分子至少部分地暴露于药物载体的外部。
本发明的某些实施方式提供脂质分子，其包括一种或多种选自HEDC、DODC、HEDODC、DSPE、DOPE、和DC-6-14的脂质。在其它实施方式中，脂质分子可进一步包括S104。
Figure BDA0001226144010000161
在一些实施方式中，将由脂质体封装siRNA使得该siRNA不易于接近水介质。在其它实施方式中，将不用脂质体封装siRNA。在此类实施方式中，siRNA可配位在脂质体的外表面上。在这些实施方式中，siRNA易于接近水介质。
其它实施方式包含星形细胞特异性药物载体，其包括脂质体合成物。所述脂质体合成物包含脂质分子双层的脂质囊泡。在其它实施方式中，在药物载体到达星形细胞之前，类视黄醇分子至少部分地暴露于药物载体的外部。
在某些优选的实施方式中，类视黄醇是脂质分子的0.1摩尔％至20摩尔％。
前述组合物也可包含本质上是本领域熟知的PEG-偶联的脂质，其包括PEG-磷脂和PEG-神经酰胺，包括选自下列的一种或多种：PEG2000-DSPE、PEG2000-DPPE、PEG2000-DMPE、PEG2000-DOPE、PEG1000-DSPE、PEG1000-DPPE、PEG1000-DMPE、PEG1000-DOPE、PEG550-DSPE、PEG550-DPPE、PEG-550DMPE、PEG-1000DOPE、PEG-胆固醇、PEG2000-神经酰胺、PEG1000-神经酰胺、PEG750-神经酰胺、和PEG550-神经酰胺。
前述本发明的组合物可包含一种或多种磷脂，例如，1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(“DSPC”)、二棕榈酰卵磷脂(“DPPC”)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(“DPPE”)、和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(“DOPE”)。优选地，有益的磷脂是DOPE。
例如，使用各种PEG-脂质制备在本发明的范围内的脂质体，所述PEG-脂质使用本文描述的共溶方法加入。这些制剂包含阳离子脂质：DOPE:胆固醇:DiVA-PEG-DiVA:PEG-脂质(50:10:38:5:2的摩尔比例)，并且各制剂在本文描述的使用200nM的浓度的人/大鼠HSP-47-C siRNA的pHSC体外检验中进行测试。下表中显示结果：
PEG-脂质 gp46基因敲除(％) 标准方差
未处理的 0 5.6
RNAimax对照 50.0 7.9
PEG-BML 95.5 1.7
PEG1000-DMPE 93.2 0.8
PEG1000-DPPE 92.8 1.3
PEG1000-DSPE 93.5 0.8
PEG1000-DOPE 90.7 2.5
PEG2000-神经酰胺 91.8 1.0
PEG2000-DMPE 93.7 3.4
PEG2000-DPPE 91.1 1.4
PEG2000-DSPE 89.4 1.7
前述本发明的组合物可包含一种或多种磷脂，例如，1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(“DSPC”)、二棕榈酰卵磷脂(“DPPC”)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(“DPPE”)、和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(“DOPE”)。优选地，有益脂质是DOPE。
除了式I的阳离子脂质，其它脂质也可能有用。这些包括可离子化的阳离子脂质，其包括以下示出的S104。
Figure BDA0001226144010000181
输送制剂可由与可离子化的阳离子脂质组合的式I的阳离子脂质组成。可离子化的阳离子脂质可包含例如S104。可离子化的阳离子脂质可以0至45摩尔％的浓度存在，包括选自5、10、15、20、25、30、35、40、和45摩尔％的浓度。
除了药学上可接受的载体和稀释剂外包含任何前述组合物的药物制剂也在本发明的范围之内。本发明的药物制剂包含至少一种治疗剂。优选地，该治疗剂是siRNA。据想象，在本发明的范围之内可使用任何siRNA分子。
除了药学上可接受的载体和稀释剂外包含任何前述组合物的药物制剂也在本发明的范围之内。本发明的药物制剂包含至少一种治疗剂。优选地，该治疗剂是siRNA。据想象，在本发明的范围之内可使用任何siRNA分子。如前文描述地，siRNA包括如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:4所示的序列。
在优选的包含siRNA的本发明的制剂中，siRNA由脂质体封装。在其它实施方式中，所述siRNA可在脂质体之外。在那些实施方式中，siRNA可定位于脂质体的外部。
阳离子脂质:siRNA(脂质的氮比siRNA的磷酸的比例，“N:P”)的有用范围是0.2至5.0。对于本发明的组合物和制剂，N:P特别优选的范围是1.5至2.5。
优选的本发明的制剂包括包含如下的那些：HEDC:S104:DOPE:胆固醇:PEG-DMPE:DiVA-PEG-DiVA(20:20:30:25:5:2的摩尔比例)和HEDC:S104:DOPE:胆固醇:PEG-DMPE:DiVA-PEG-DiVA(20:20:30:25:5:2的摩尔比例)，其中DiVA-PEG-DiVA是共溶的。DODC:DOPE:胆固醇:Peg-脂质:DiVA-PEG-DiVA(50:10:38:2:5的摩尔比例)和DODC:DOPE:胆固醇:Peg-脂质:DiVA-PEG-DiVA制剂，其中DiVA-PEG-DiVA是共溶的。
本发明的其它制剂包括包含HEDODC:DOPE:胆固醇-PEG-脂质:DiVA-PEG-DiVA(50:10:38:2:5的摩尔比例)和HEDODC:DOPE:胆固醇-PEG-脂质:DiVA-PEG-DiVA的那些制剂，其中DiVA-PEG-DiVA是共溶的。
其它优选的本发明的制剂包括包含DC-6-14:DOPE:胆固醇:DiVA-PEG-DiVA(40:30:30:5,摩尔比例)和DC-6-14:DOPE:胆固醇:DiVA-PEG-DiVA的那些，其中DiVA-PEG-DiVA是共溶的。
输送治疗剂至患者的方法也在本发明的范围之内。这些方法包括提供包含任何前述组合物的药物制剂和药学上可接受的载体或稀释剂；并将该药物制剂给药至患者。
定义
本文中使用的“烷基”指直链或支链的完全饱和的(没有双键或三键)烃基，例如，具有通式-CnH2n+1的基团。所述烷基可具有1至50个碳原子(每当其在本文中出现，例如“1至50”的数值范围指在给定的范围内的各整数；例如，“1至50个碳原子”指该烷基可包含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，多至并包括50个碳原子，虽然该定义也涵盖没有标明数值范围的术语“烷基”)。所述烷基也可以是具有1至30个碳原子的中等尺寸的烷基。所述烷基也可以是具有1至5个碳原子的低级烷基。该化合物的烷基可标示为“C1-C4烷基”或类似的标示。只是为了举例，“C1-C4烷基”指烷基链中有1至4个碳原子，即该烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、和叔丁基。典型的烷基包括但不以任何方式限制为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
本文中使用的“烯基”指在直链或支链的烃链中含有一个或多个双键的烷基。烯基可以是未取代的或取代的。当取代时，除非另外指明，取代基可选自关于烷基取代上文公开的相同的基团。
本文中使用的“炔基”指在直链或支链的烃链中含有一个或多个三键的烷基。炔基可以是未取代的或取代的。当取代时，除非另外指明，取代基可选自关于烷基取代上文公开的相同的基团。
本文中使用的“卤”指F、Cl、Br、和I。
本文中使用的“甲磺酸盐”指–OSO2CH3。
本文中使用的术语“药物制剂”指本文公开的组合物与一种或多种其它化学成分的混合物，所述其它化学成分例如是稀释剂或其它药物载体。该药物制剂促进该组合物至有机体的给药。本领域存在多种将药物制剂给药的技术，其包括但不限于注射和胃肠外给药。
本文中使用的术语“药物载体”指促进化合物进入细胞或组织的化学化合物。例如二甲基亚砜(DMSO)是普遍使用的载体，因为其促进有机体的细胞或组织摄入许多有机化合物。
本文中使用的术语“稀释剂”指在将溶解目标制剂(例如，可包含化合物、类视黄醇、第二脂质、稳定剂、和/或治疗剂的制剂)的水中稀释的并使得该制剂的生活活性形式稳定化的化学化合物。本领域将溶解于缓冲溶液的盐作为稀释剂。普遍使用的一种缓冲溶液是磷酸盐缓冲液，因为它模仿了人血液的盐浓度。因为缓冲盐可以在低浓度控制溶液的pH，缓冲的稀释剂很少改变制剂的生物活性。本文中使用的“赋形剂”指加入制剂中以非限制地给组合物提供体积、稠度、稳定性、结合能力、润滑、分解能力等的惰性物质。“稀释剂”是一种赋形剂。
本文中使用的“治疗剂”指当以治疗有效量给药至哺乳动物时，对哺乳动物提供益处的化合物。本文中的治疗剂可指药物。本领域技术人员将理解，术语“治疗剂”不限于是获得监管机构批准的药物。“治疗剂”可与本文描述的化合物(类视黄醇)和/或第二脂质起作用地相关联。例如，本文中描述的第二脂质可形成脂质体，例如如本文中描述地，治疗剂可与脂质体起作用地相关联。
本文中使用的“脂复合物制剂”指那些制剂，其中siRNA在脂质体之外。在优选的脂复合物制剂中，siRNA与脂质体的外表面复合。其它优选的脂复合物制剂包括其中siRNA易于接近存在于脂质体外的任何介质的那些。
本文中使用的“脂质体制剂”其中将siRNA封装在脂质体内的那些制剂。在优选的脂质体制剂中，siRNA不易于接近存在于脂质体外的任何介质。
本文中使用的术语“共溶”指在形成空的囊泡之前，向阳离子脂质混合物中添加成分。
本文中使用的术语“装饰”指在囊泡形成之后添加成分。
本文中使用的“DC-6-14”指以下阳离子脂质化合物：
Figure BDA0001226144010000211
本文中使用的“DODC”指以下阳离子脂质化合物：
Figure BDA0001226144010000212
本文中使用的“HEDODC”指以下阳离子脂质化合物：
Figure BDA0001226144010000213
本文中使用的“类视黄醇”由四个以头尾的方式相接的类异戊二烯单元组成的化合物类别的成员，参见G.P.Moss,“Biochemical Nomenclature and Related Documents,”第二版，Portland Press，第247-251页(1992)。对于展示出有质量的视黄醇生物活性的类视黄醇，“维生素A”是通用的描述。本文中使用的类视黄醇指天然的或合成的类视黄醇，其包括第一代、第二代、和第三代类视黄醇。天然存在的类视黄醇的实例包括但不限于(1)11-顺视黄醇、(2)全反式视黄醇、(3)棕榈酸视黄酯、(4)全反式维甲酸、和(5)13-顺维甲酸。此外，术语“类视黄醇”包括视黄醇、视黄醛、维甲酸、rexinoid、去甲基化的和/或饱和的维甲酸、及其衍生物。
本文中使用的“类视黄醇偶联物”指包含至少一个类视黄醇结构部分的分子。
本文中使用的“类视黄醇-接头-脂质分子”指包含至少一个类视黄醇结构部分的分子，所述类视黄醇结构部分通过至少一个接头(例如PEG结构部分)连接至至少一个脂质结构部分。
本文中使用的“类视黄醇接头-类视黄醇分子”指包含至少一个类视黄醇结构部分的分子，所述类视黄醇结构部分通过至少一个接头(例如PEG结构部分)连接至至少一个(可以相同或不同的)其它类视黄醇结构部分。
本文中使用的“维生素D”具有抗佝偻病活性的维生素的通用的描述。维生素D组包含：维生素D2(钙化醇)、维生素D3(辐照的22-二氢麦角甾醇)、维生素D4(辐照的脱氢谷甾醇)和维生素D5(辐照的脱氢谷甾醇)。
本文中使用的“维生素E”具有抗氧化剂活性的分子组的通用的描述。维生素E家族包含α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚，α-生育酚是最普遍的。(Brigelius-Floheand Traber,The FASEB Journal.1999；13:1145-1155)。
本文中使用的“维生素K”是止血因子的通用的描述，并包含维生素K1(植物胨二酮(phytonodione))、维生素K2(甲基萘醌类)、维生素K3、维生素K4和维生素K5。维生素K1和K2是天然的，但K3-5是合成的。
本文中使用的“类视黄醇-接头-脂质分子”指包含至少一个类视黄醇结构部分的分子，所述类视黄醇结构部分通过至少一个接头(例如PEG结构部分)连接至至少一个脂质结构部分。
本文中使用的“类视黄醇接头-类视黄醇分子”指包含至少一个类视黄醇结构部分的分子，所述类视黄醇结构部分通过至少一个接头(例如PEG结构部分)连接至至少一个(可相同或不同的)其它类视黄醇结构部分。
本文中使用的术语“脂质”和“亲脂的”以本领域技术人员理解的其通常含义用在本文中。脂质和亲脂基团的非限制性实例包括脂肪酸、固醇、C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C5-C50芳基、C5-C50杂芳基、C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C2-C50羧基烯基、和C2-C50羧基杂烯基。脂肪酸是饱和的或不饱和的长链单羧酸，其包含例如，12至24个碳原子。脂质的特征是基本上可水溶的，在水中的溶解性小于约0.01％(重量基础)。本文中使用的术语“脂质结构部分”和“亲脂的结构部分”指已连接至另一基团的脂质或其部分。例如，脂质基团可能通过脂质的官能团(例如羧酸基团)与单体的合适的官能团之间的化学反应而连至另一化合物(例如单体)。
本文中使用的“siRNA”指小的干扰RNA，在本领域也已知为短的干扰RNA或沉默RNA。siRNA是一类双链RNA分子，在本领域已知其具有各种作用，最显著的是干扰特定基因的表达和蛋白表达。
本文中使用的“由脂质体封装”指成分基本上或全部在脂质体结构中。
本文中使用的“易于接近水介质”指能够与水介质接触的成分。
本文中使用的“不易于接近水介质”指不能够与水介质接触的成分。
本文中使用的“复合在脂质体的外表面”指与脂质体的外表面起作用地相关联的成分。
本文中使用的“定位于脂质体的外表面”指在或接近脂质体的外表面的成分。
本文中使用的“电荷复合的”指静电结合。
本文中使用的术语“起作用地相关联”指本文描述的化合物、治疗剂、类视黄醇、和/或第二脂质之间的静电相互作用。此类相互作用可以是化学键的形式，包括但不限于共价键、极性共价键、离子键、静电作用、配位共价键、芳香族键、氢键、偶极、或范德华相互作用。那些本领域普通技术人员能够理解此类相互作用的相对强度可能大范围地不同。
本文中以本领域技术人员理解的其通常含义使用术语“脂质体”，并意指包含连接至极性的亲水性基团的脂质的脂质双层结构，所述极性的亲水性基团在水性介质中形成基本上闭合的结构。在一些实施方式中，脂质体可与一种或多种化合物起作用地相关联，所述化合物例如是治疗剂和类视黄醇或类视黄醇偶联物。脂质体可能由单脂质双层(即，单层状的)组成或其可由两个或多个同一中心的脂质双层(即，多层状的)组成。另外，脂质体在形状上可以大致是球形或椭圆体形。
术语“促进药物输送至靶细胞上”指本发明的类视黄醇或脂溶性维生素化合物的增强的能力，以增强治疗分子例如siRNA至细胞的输送。并不意在受理论限制，类视黄醇或脂溶性维生素化合物以可测量的特异性与靶细胞上的特异性受体或(活化/结合位点)相互作用。例如，当结合亲和性(Ka)为106M-1或更大，优选地是107M-1或更大，更优选地108M-1或更大，和最优选地109M-1或更大时，通常考虑结合是特异性的。例如，通过斯卡查德分析(Scatchard,Ann.NY Acad.Sci.51:660,1949)，本领域普通技术人员可容易地确定抗体的结合亲和性。
核酸输送系统可包括，例如，水性的和非水性的胶、乳油、复乳、微乳、脂质体、软膏、水性的和非水性的溶液、洗剂、气溶胶、烃基和粉末，并可含有赋形剂，例如增溶剂、渗透增强剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，和亲水性聚合物(例如，卡波(polycarbophil)和聚乙烯吡咯烷酮)。
除了结构式I的阳离子脂质，其它脂质可能是有用的。这些包括可离子化的阳离子脂质，其包括
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输送制剂可由与可离子化的阳离子脂质组合的结构式I的阳离子脂质组成。可离子化的阳离子脂质可包含例如S104。可离子化的阳离子脂质可以0至45摩尔％的浓度存在，包含选自5、10、15、20、25、30、35、40、和45摩尔％的浓度。
偶联至聚乙二醇(PEG)分子的脂质可存在于脂质体颗粒中。PEG-脂质包括：
1,2-二肉豆蔻油酰基(二肉豆蔻油酰基)-sn-甘油基-3-磷乙醇胺-N-PEG(PEG-DMPE)
1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷乙醇胺-N-PEG(PEG-DPPE)，
1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷乙醇胺-N-PEG(PEG-DSPE)，或
1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷乙醇胺-N-PEG(PEG-DOPE)和/或
PEG-神经酰胺。
输送制剂可由式I的阳离子脂质与PEG-脂质组合组成。PEG-脂质可以如下浓度存在：0至15摩尔％，优选地1至10摩尔％，包括选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10摩尔％的浓度。
非阳离子脂质的非限制性实例包括磷脂，例如卵磷脂、磷脂酰基乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰基乙醇胺、磷脂酰基丝氨酸、磷脂酰基肌醇、神经磷脂、蛋神经磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸酯、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二棕榈酰卵磷脂(DPPC)、二油酰基磷脂酰基甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰基甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基-卵磷脂(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰基乙醇胺(POPE)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰基甘油(POPG)、二油酰基磷脂酰基乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰-磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰基乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰基乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰基乙醇胺、二甲基-磷脂酰基乙醇胺、二反油酸酰基-磷脂酰基乙醇胺(DEPE)、硬脂酰基油酰基-磷脂酰基乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂酰基胆碱、二亚油酰基磷脂酰基胆碱、及其混合物。也可使用其它二酰基卵磷脂和二酰基磷脂酰基乙醇胺磷脂。在这些脂质中的酰基优选地是衍生自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基，例如，月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、或油酰基。
在某些实施方式中，磷脂在颗粒中存在的量包括从约0摩尔％至约55摩尔％，更具体地以选自5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、和55％的浓度。作为非限制性实例，所述磷脂是DOPE。
非阳离子脂质的附加实例包括固醇，例如胆固醇及其衍生物例如胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪甾醇、胆甾烯基-2'-羟乙基醚、胆甾烯基-4'-羟基丁基醚、及其混合物。
在某些实施方式中，在颗粒中存在的胆固醇或胆固醇衍生物的量包括从约0摩尔％至约55摩尔％，更具体地是选自5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、和55摩尔％的浓度。作为非限制性实例，胆固醇存在于脂质颗粒中。
在某些其它实施方式中，存在于包含磷脂和胆固醇混合物的脂质颗粒中的胆固醇构成颗粒中存在的总脂质的约30摩尔％至约40摩尔％、约30摩尔％至约35摩尔％、或从约35摩尔％至约40摩尔％。作为非限制性实例，包含磷脂和胆固醇的混合物的颗粒可包含颗粒中存在的总脂质的约34摩尔％的胆固醇。
在进一步的实施方式中，存在于包含磷脂和胆固醇混合物的脂质颗粒中的胆固醇构成颗粒中存在的总脂质的约10摩尔％至约30摩尔％、从约15摩尔％至约25摩尔％、或从约17摩尔％至约23摩尔％。作为非限制性实例，包含磷脂和胆固醇的混合物的颗粒可包含颗粒中存在的总脂质的约20摩尔％的胆固醇。
对于输送核酸有用的类视黄醇或类视黄醇偶联物处于该状态：它溶解于可溶解或保留其的介质中，或与该介质混合。
任何类视黄醇或类视黄醇偶联物可用于本发明中，只要其是被星形细胞积极地积累的；类视黄醇的实例包括但不限于维甲酸、阿达帕林、棕榈酸视黄醇酯，和特别地维生素A、饱和的维生素A、维甲酸、和视黄醇。类视黄醇-偶联物的实例包括PEG-类视黄醇偶联物。本发明利用星形细胞的性质以积极地嵌入类视黄醇和/或类视黄醇偶联物，和通过使用类视黄醇和/或类视黄醇偶联物作为药物载体或通过结合至或包含在另一药物载体成分中，将所需的材料或体特异性地输送至星形细胞。类视黄醇是具有其中四个类异戊二烯单元以头尾方式相接的骨架的化合物类别的成员。参见G.P.Moss,“Biochemical Nomenclatureand Related Documents”，第二版，Portland Press，第247-251页(1992)。维生素A是有质量地显示视黄醇的生物活性的类视黄醇的通用的描述。在本说明书中的所述类视黄醇促进特定物质至癌细胞和CAF(即，所述物质靶向这些细胞)的输送。此种类视黄醇不是具体限制的，其实例包括视黄醇、维生素A、饱和的维生素A、视黄醇、维甲酸、视黄醇和脂肪酸的酯、脂肪醇和维甲酸的酯、阿维A酯、维甲酸、异维甲酸、阿达帕林、阿维A(acitretine)、他扎罗汀、和棕榈酸视黄醇酯，以及维生素A的类似物，例如芬维A胺、和贝沙罗汀。类视黄醇-偶联物包括PEG-偶联物，例如，二VA-PEG-二VA和VA-PEG-VA。
因此本发明的药物载体可包含除了类视黄醇和/或类视黄醇-偶联物之外的药物载体成分。此类成分不是特定限制的，可以使用医药和药物领域已知的任何成分，但优选其能够包含类视黄醇和/或类视黄醇偶联物。此外，本发明的药物载体可包含改善进入星形细胞的物质，例如视黄醇-结合蛋白(RBP)。类视黄醇和/或类视黄醇偶联物与本发明的药物载体的结合或包含也可通过将类视黄醇和/或类视黄醇偶联物与另一药物载体成分通过化学和/或方法结合或包含来进行。可选地，类视黄醇和/或类视黄醇偶联物与本发明的药物载体的结合或包含也可通过在药物载体制备期间，将具有形成亲和性(formation-affinity)的类视黄醇和/或类视黄醇偶联物混合入药物载体成分来进行。
结合至本发明的药物载体的或本发明的药物载体中包含的类视黄醇和/或类视黄醇偶联物的量，相对于药物载体成分的重量比例可以是0.1摩尔％至20摩尔％，优选地0.2％至10％，和更优选地0.5％至5摩尔％，包括选自值0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0摩尔％的浓度。
在某些实施方式中，本发明提供通过在室内混合来生产脂质体。这包括方法：在第一贮藏库中提供包含核酸(例如干扰RNA)的水性溶液、在第二贮藏库中提供有机脂质溶液、并将所述水性溶液和所述有机脂质溶液混合，使得所述有机脂质溶液与所述水性溶液混合以生产在有机溶剂梯度中封装核酸(例如，siRNA)的脂质体。
使用混合方法形成的脂质体典型地具有从约40nm至约250nm、从约50nm至约150nm、从约60nm至约150nm的尺寸。由此形成的颗粒不聚集，并任选地控制尺寸以实现均一的粒度。
本发明的药物载体可以是任何形式，只要可将所需的材料或体运送至靶星形细胞，形式的实例包括但不限于聚合物胶束、脂质体、乳液、微球体和纳米球体。此外，本发明的药物载体可在其内部包含待输送的物质、连接至待输送的物质外表、或与待输送的物质混合，只要在该制剂最后到达星形细胞之前，其中包含的类视黄醇和/或类视黄醇偶联物至少是部分地暴露于制剂的外表。
本发明的药物载体特异性地定向星形细胞并产生令人期待的效果，例如，通过有效运输至星形细胞所需材料或体(例如控制星形细胞的活性或生长的药物)，展现出最大效果以及最小副作用的对纤维化的抑制或预防。本发明的药物载体输送的材料或体不是特别地限制的，但它优选地使得能够在活体内进行从给药位置到星形细胞存在的肝、胰等的物理运动的尺寸。因此本发明的药物载体不仅能运送材料(例如原子、分子、化合物、蛋白、或核酸)而且能运送体(例如载体、病毒颗粒、细胞、一种或多种元素构成的药物释放系统、或微型装置(micromachine))。材料或体优选地具有在星形细胞上施加一些作用的性质，其实例包括标记星形细胞的一个实例和控制星形细胞的活性或生长的一个实例。
因此，在本发明的一个实施方式中，它是控制星形细胞的活性或生长的药物载体输送的药物。这可以是直接或间接地抑制参与增进纤维化的星形细胞的物理化学作用的任何药物，其实例包括但不限于TGFβ活性抑制剂(例如截短的TGFβII类受体和可溶的TGFβII类受体)、生长因子制剂(例如HGF及其表达载体)、MMP生产启动子(例如含MMP基因的腺病毒载体)、TIMP生产抑制剂(例如反义TIMP核酸)、PPARγ配体、细胞活化抑制剂和/或细胞生长抑制剂例如血管紧张素活性抑制剂、a PDGF活性抑制剂、钠通道抑制剂，和程序性细胞死亡诱导剂例如化合物861和胶霉素、脂连蛋白和具有Rho激酶抑制活性的化合物例如(+)-顺-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨甲酰基)环己烷。此外，在本说明书中用于控制星形细胞的活性或生长的药物可以是直接或间接地促进(直接或间接地参与抑制纤维化的)星形细胞的物理化学作用的任何药物，其实例包括但不限于促进胶原降解系统的药物，例如MMP生产促进剂、例如MMP表达载体、HGF、和具有类HGF活性的药物(例如HGF类似物和表达其的载体)。
本说明书中控制星形细胞的活性或生长的药物的其它实例包括用于控制例如胶原的细胞外基质的新陈代谢的药物，例如具有抑制目标分子(例如siRNA、核酶、和反义核酸(包括RNA、DNA、PNA、及其复合物))表达作用的物质，具有突出的副作用的物质，以及表达相同物质的载体，所述药物定向例如由星形细胞生产的细胞外基质要素分子或定向一种或多种具有生产或分泌细胞外基质要素分子功能的分子。
本发明也涉及治疗星形细胞相关的病症的药物，所述药物包含药物载体和控制星形细胞的活性或生长的药物，还涉及药物载体在生产治疗星形细胞相关的病症的药物组合物中的用途。所述星形细胞相关的病症在本文中指其中星形细胞直接或间接地参与病症的过程的病症，即病症的发生、加剧、改善、减轻、康复等，其实例包括肝病症，例如肝炎，特别是慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化、和肝癌，和胰病症，例如胰腺炎、特别是慢性胰腺炎、胰纤维化、和胰腺癌。
在本发明的药中，药物载体可在其内部包含药物、可连接至含药物物质的外表面、或与药物混合，只要在该制剂最后到达星形细胞之前，包含在药物载体中的类视黄醇和/或类视黄醇偶联物至少是部分地暴露于制剂的外表。因此，基于药物释放的给药途径或方式，可将药物用适合的材料(例如随时间崩解的肠溶衣或材料)覆盖或将药物加入合适的药物释放系统中。
因此本发明包含药物载体和药物制剂试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个容器，所述容器包含药物载体成分、类视黄醇和/或类视黄醇偶联物、/或药物中的一种或多种，并且包含以此试剂盒中的形式提供的药物载体或药物的必需成分。除了上述的那些，本发明的试剂盒可包含说明书等，其中描述了制备方法或药物载体和本发明的药物的给药。此外，本发明的试剂盒可包含完善本发明的药物载体或药物的所有成分，但无需必要包含所有成分。因此，本发明的试剂盒不需要包含在医疗场所通常可得的试剂或溶剂、实验器材等，例如，无菌水、盐水或葡萄糖溶液。
本发明还涉及治疗星形细胞相关的病症的方法，所述方法包括将有效量的药物给药至需要其的治疗对象。这里有效量指抑制目标病症开始、减轻其症状、或预防其发展的量，并优选地是预防目标病症开始或治愈目标病症的量。也优选地不会引起超过给药益处的不利效果的量。这个量可以如下恰当地确定：通过使用培养的细胞等的试管内测试，或提供动物模型(例如小鼠、大鼠、狗或猪)中的测试，并且此类测试方法是本领域技术人员熟知的。
在本发明的方法中，术语“治疗对象”指任何活的个体，优选地是动物，更优选地是哺乳动物，和仍更优选地是人个体。在本说明书中，治疗对象可以是健康的或受一些病症影响的，在治疗所意向的病症的情况下，治疗对象典型地指受该病症影响的或有风险被影响的治疗对象。
此外，术语“治疗”包括为治愈、暂时缓解、预防病症等目的的所有类型的医学科接受的预防的和/或治疗性干预。例如，当所述病症是肝纤维化时，术语“治疗”包括为包括延迟或停止纤维化发展、损伤的消退或消失、预防纤维化的发生、或预防复发的各种目的，医学可接受的干预。
本说明书也涉及使用药物载体输送药物至星形细胞的方法。这个方法包括但不限于将待输送的物质支撑在药物载体上的步骤，和将载有待输送的所述物质的药物载体施用或加至含星形细胞的活体或培养基，例如，培养基。根据任何已知方法、本说明书中描述的方法等，可恰当地完成这些步骤。这个输送方法可与另一输送方法组合，所述另一输送方法例如，在其中星形细胞存在的器官是目标的输送方法等。
可改造核酸分子以单独地或与其它疗法组合，用于预防或治疗纤维化(例如，肝、肾、腹膜、和肺)疾病、性状、情况和/或病症，和/或与细胞或组织中的hsp47水平关联的或对其有反应的任何其它性状、疾病、病症或情况。核酸分子可包含用于给药至受治疗者的输送载体(包括脂质体)，载体(carrier)和稀释剂及它们的盐，和/或可以药学上可接受的制剂存在。
本发明的核酸分子可包含表3中显示的序列。此类核酸分子的实例基本上由表3中提供的序列组成。
核酸分子可通过肺输送给药，例如通过吸入气溶胶或由吸入装置或雾化吸入器给药的喷雾干燥的制剂，所述肺输送提供快速局部吸收核酸分子进入相关的肺组织中。可通过磨碎干的或冻干的核酸组合物，然后将微米化的组合物通过例如，400目筛以破碎或分离出大的结块来制备包含可呼吸的微米化的核酸组合物干颗粒的固体微粒组合物。包含本发明的核酸组合物的固体微粒组合物任选地包含用以加速气溶胶以及其它治疗性化合物的形成的分散剂。合适的分散剂是乳糖，其可以任何合适的比例(例如1比1的重量比例)与核酸混合。
液体颗粒的气溶胶可包含本文公开的核酸分子，其可通过任何合适的方法生产，例如用雾化吸入器(见例如，美国专利No.4,501,729)。雾化吸入器是可商购的装置，其通过加快压缩的气体(典型地空气或氧气)通过窄文丘里室口的方法或通过超声振动的方法将活性成分的溶液或悬浮液转变为治疗性气溶胶雾。用在雾化吸入器中的合适的制剂包含不高于制剂的40％重量比，优选地低于20％重量比的量的液体载体中的活性成分。所述载体典型地是水或稀释的含水乙醇溶液，优选地通过加入例如氯化钠或其它合适的盐制成与体液等张。如果不是无菌地制备制剂，任选的添加剂包括防腐剂，例如，甲基羟基苯甲酸盐、抗氧化剂、风味剂、挥发油、缓冲剂和乳化剂和其它制剂表面活性剂。包含活性组合物和表面活性剂的固体颗粒的气溶胶同样地可用任何固体微粒气溶胶生成器产生。用于将固体微粒治疗剂给药至受治疗者的气溶胶生成器产生如上解释的可呼吸的颗粒，并产生以适合给药人类的速率的、包含预定测量剂量的治疗性组合物的气溶胶体积。固体微粒气溶胶生成器的一个说明性类型是吹药器。通过吹入法给药的合适的制剂包括可通过吹药器输送的细细粉碎的粉末。在吹药器中，将粉末(例如，其定量可有效实施本文的治疗)装在典型地由凝胶或塑料制成的胶囊或灌流器中，所述凝胶或塑料会刺破或原位打开，粉末在吸入时或通过手动操作的泵由吸通过装置的空气输送。在吹药器中使用的粉末单单由活性成分组成或由包含活性成分、合适的粉末稀释剂(例如乳糖)、和任选的表面活性剂的粉末混合物组成。活性成分典型地包含0.1至100重量比的制剂。第二种气溶胶生成器包含定量吸入器。定量吸入器是加压的气溶胶分配器，典型地在液化的推进物中其包含活性成分的悬浮液或溶液。在使用期间，这些装置通过改造以输送定量体积的阀释放制剂.以生产含有活性成分的细粒喷雾。适合的推进物包括某些氯氟烃化合物，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。所述制剂可另外包含一种或多种共溶剂，例如，乙醇、乳化剂和气体制剂表面活性剂，例如油酸或脱水山梨糖醇三油酸酯、抗氧化物和适合的调味剂。肺输送的其它方法描述在例如，US20040037780、US6592904、US6582728、和US6565885中。WO08132723总地涉及气溶胶输送寡核苷酸，和具体地siRNA，至呼吸系统。
核酸分子可给药至中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)。实验证明neuron可有效体内吸收核酸。参见例如，Sommer等人，1998,Antisense Nuc.Acid Drug Dev.,8:75；Epa等人，2000,Antisense Nuc.Acid Drug Dev.,10:469；Broaddus等人，1998,J.Neurosurg.,88:734；Karle等人，1997,Eur.J.Pharmocol.,340:153；Bannai等人，1998,Brain Research,784:304；Rajakumar等人，1997,Synapse,26:199；Wu-pong等人，1999,BioPharm,12:32；Bannai等人，1998,Brain Res.Protoc.,3:83；and Simantov等人，1996,Neuroscience,74:39。因此核酸分子适合于输送至在CNS和/或PNS中的细胞或被其吸收。
由多种不同策略输送核酸分子到CNS。可使用的至CNS的输送的传统方法包括但不限于鞘内的和脑心室内的(intracerebroventricular)给药、导管和泵的植入、在受伤或损伤位置直接注射或灌注、注射入脑动脉系统，或通过化学或渗透打开血-脑屏障。其它方法可包括使用各种传输和载体系统，例如通过使用偶联物和可生物降解的聚合物。此外，基因治疗方法，例如描述在Kaplitt等人，美国专利No.6,180,613和Davidson，WO 04/013280中，可用于在CNS中表达核酸分子。
核酸分子可与聚乙烯亚胺(例如，直链或支链的PEI)和/或聚乙烯亚胺衍生物一起制剂或复合，包括例如接枝的PEI，例如半乳糖PEI、胆固醇PEI、抗体衍生的PEI、和聚乙二醇(PEG)PEI(PEG-PEI)及其衍生物(参见例如Ogris等人，2001,AAPA PharmSci,3,1-11；Furgeson等人，2003,Bioconjugate Chem.,14,840-847；Kunath等人，2002,Pharm Res 19:810-17；Choi等人，2001,Bull.Korean Chem.Soc.,22:46-52；Bettinger等人，1999,Bioconjugate Chem.,10:558-561；Peterson等人，2002,Bioconjugate Chem.13:845-54；Erbacher等人，1999,J Gene Med 1:1-18；Godbey等人，1999.,PNAS,96:5177-81；Godbey等人，1999,J Controlled Release,60:149-60；Diebold等人，1999,J Biol Chem,274:19087-94；Thomas等人，2002,PNAS,99,14640-45；和Sagara，美国专利No.6,586,524)。
核酸分子可包含生物联接剂，例如如在Vargeese等人，美国序号No.10/427,160；美国专利No.6,528,631；美国专利No.6,335,434；美国专利No.6,235,886；美国专利No.6,153,737；美国专利No.5,214,136；美国专利No.5,138,045中描述的核酸偶联物。
本文公开的组合物、方法和试剂盒可包含表达载体，其包含以允许核酸分子表达的方式包含编码至少一种本发明的核酸分子的核酸序列。将核酸分子或一种或多种能够表达dsRNA链的载体引进细胞环境的方法将依赖于细胞类型和其环境的补偿。核酸分子或载体构造可直接加进细胞中(即，细胞内地)；或胞外引入腔、胞间隙、引进有机体的循环、口服引入或可通过将有机体或细胞在含dsRNA的溶液中洗浴来加入。所述细胞优选地是哺乳动物细胞；更优选地是人细胞。表达载体的核酸分子可包含正义区域和反义区域。反义区域可包含与编码hsp47的RNA或DNA序列互补的序列，正义区域可包含与反义区域互补的序列。核酸分子可含有具有互补的正义和反义区域的两个完全不同的链。所述核酸分子可包含具有互补的正义和反义区域的单链。
与目标RNA分子相互作用的核酸分子和编码目标RNA(例如，目标RNA分子在本文中提供Genbank登录号提及)的下调基因可从插入DNA或RNA载体的翻译单元表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达核酸分子的病毒质粒可以基于但不限于腺伴随病毒、反转录病毒、腺病毒、或甲病毒属构造。可如上述地输送能够表达核酸分子的重组载体，并继续留存在靶细胞上。可选地，可使用病毒载体以提供核酸分子的瞬时表达。如必需此类载体可以重复给药。一旦表达，通过RNA干扰(RNAi)核酸分子结合并下调基因功能或表达。核酸分子表达载体的输送可以是全身的，例如通过静脉或肌下给药，通过给药至从受治疗者外植而后重新引入该受治疗者的靶细胞上，或通过任何将允许进入所需的靶细胞上的其它方法。
另一方面，本公开涉及药物制剂，其包含一种或多种生理上可接受的表面活性剂、药物载体、稀释剂、赋形剂、和悬浮剂、或其组合；以及本文公开的制剂(例如，该制剂可包含化合物、类视黄醇、第二脂质、稳定剂、和/或治疗剂)。可接受的其它治疗用的药物载体或稀释剂在制药领域是众所周知的，并描述在例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990)中，将其全部内容通过援引插入于此。防腐剂、稳定剂、染料等可提供在药物制剂中。例如，苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸酯可加作防腐剂。另外可使用抗氧化剂和悬浮剂。在各种实施方式中，乙醇、酯、硫酸化脂肪醇等可用作表面活性剂；蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、结晶的纤维素、甘露醇、轻质无水硅酸盐、铝酸镁、铝酸正硅酸镁、合成硅酸铝、碳酸钙、碳酸氢钠、磷酸氢钙、羧基甲基纤维素钙等可用作赋形剂；椰子油、橄榄油、芝麻油、花生油、大豆可用作悬浮剂或润滑剂；作为例如纤维素或蔗糖的碳水化合物的衍生物的邻苯二甲酸乙酸纤维素、或乙酸甲酯-甲基丙烯酸酯共聚物作为聚乙烯的衍生物可用作悬浮剂；和增塑剂例如邻苯二甲酸酯等可以用作悬浮剂。
可将本文描述的药物制剂给药至人患者本身，或在药物制剂中，其中它们与其它活性成分(如在组合疗法中)、或合适的药物载体或赋形剂混合。本申请的化合物的制剂和给药技术可在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,PA，第18版，1990中找到。
合适的给药途径可包括，例如胃肠外输送，例如肌内的、皮下的、静脉的、髓内注射，以及鞘内的、直接心室内的、腹膜的、鼻内的、或眼内注射。也可以缓释或控释剂型给药所述制剂(例如，该制剂可包含化合物、类视黄醇、第二脂质、稳定剂、和/或治疗剂)达到以预定速率持久地和/或定时地、脉冲地给药，所述缓释或控释剂型包括长效注射剂、渗透泵等。此外，给药途径可以是局部或全身的。
药物制剂可以其自身已知的方式生产，例如，通过常规混合、溶解、造粒、制丸、研磨、乳化、胶封、包埋或压片过程。
可以任何常规方式配置药物制剂，使用一种或多种生理上可接受的药物载体，其包含促进加工活性化合物成可制药使用的制剂的赋形剂和助剂。合适的制剂依赖于选择的给药途径。若合适和按本领域所理解的(例如在上述的Remington’s PharmaceuticalSciences中)可使用任何熟知的技术、药物载体、和赋形剂。
可将可注射物制备为常规形式，作为液体溶液或悬浮液、适于液体中的溶液或悬浮液的注射前的固体形式、或作为乳剂。合适的赋形剂是例如，水、盐水、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖(dextrose)、甘露醇、乳糖、卵磷脂、清蛋白、谷氨酸钠、半胱氨酸盐酸物等。另外，若需要，可注射的药物制剂可包含少量无毒的辅助物质，例如润湿剂、pH缓冲剂等。生理相容的缓冲液包括但不限于Hanks’s溶液、Ringer’s溶液、或生理盐水。若需要，可使用增强吸收的制剂。
胃肠外给药(例如通过大丸注射(bolus injection)或持续输液)的药物制剂，包括水溶形式的活性制剂(例如，该制剂可包含化合物、类视黄醇、第二脂质、稳定剂、和/或治疗剂)的水溶液。此外，活性化合物的混悬剂可制备为恰当的油状注射混悬剂。水相注射悬浮液可包含增大悬浮液粘度的物质，例如羧基甲基纤维素钠、山梨醇、或葡聚糖。任选地，所述悬浮液也可包含合适的稳定剂或增大化合物溶解度的药剂使得能够制备高浓缩的溶液。注射用制剂可以具有添加的防腐剂的单位剂型呈现，例如，在安瓿中或在多剂量容器中。制剂可使用此类形式：在油相或水相载体中的混悬剂、溶液或乳剂，并可包含配方试剂(例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂)。可选地，活性成分在用前可以是用以与合适的载体(载体，例如，无菌的无致热源的水)组合的粉末形式。
除了前述的制剂，所述制剂也可配置成长效制剂。此类长效制剂可通过肌下注射给药。因此制剂(例如，可包含化合物、类视黄醇、第二脂质、稳定剂、和/或治疗剂的制剂)可与合适的聚合的或疏水的材料(例如在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制，或作为微溶的衍生物，例如，微溶的盐。
本文的一些实施方式涉及输送治疗剂至细胞的方法。例如，一些实施方式涉及输送例如siRNA的治疗剂至细胞的方法。根据本文描述的方法适合使用的细胞包括原核细胞、酵母或较高级的真核细胞，包括植物和动物细胞(例如，哺乳动物细胞)。在一些实施方式中，细胞可以是人纤维肉瘤细胞(例如，HT1080细胞系)。在其它实施方式中，细胞可以是癌细胞。可使用是癌模型系统的细胞系，包括但不限于乳腺癌(MCF-7，MDA-MB-438细胞系)、U87成胶质细胞瘤细胞系、B16F0细胞(黑素瘤)、HeLa细胞(宫颈癌)、A549细胞(肺癌)，和大鼠肿瘤细胞系GH3和9L。在这些实施方式中，本文描述的制剂可用于转染细胞。这些实施方式可包括让细胞与包含治疗剂的本文描述的制剂接触，因而输送治疗剂至细胞。
本文公开的是治疗由异常纤维化刻画的情况的方法，其可包括将治疗有效量的本文描述的制剂给药。由异常纤维化刻画的情况可包括癌症和/或纤维性疾病。可由本文描述的制剂治疗或改善的癌症类型包括但不限于肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、和结肠癌。在一个实施方式中，可治疗或改善的癌症是胰腺癌。在另一个实施方式中，可治疗或改善的癌症是肺癌。可由本文描述的制剂治疗或改善的纤维性疾病的类型包括但不限于肝纤维化、肝硬化、胰腺炎、胰纤维化、囊性纤维化、声带瘢痕、声带粘膜纤维化、喉纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、和生肾系统纤维化。在一个实施方式中，可以治疗或改善的状况是肝纤维化。
本文描述的制剂或药物组合物可以适合的方式给药至受治疗者。在其它中，给药方法的非限制性实例包括(a)通过皮下地、腹膜内地、静脉内地、肌内地、皮内地、眼眶内地、囊内地、脊柱内地、胸骨内地等注射给药，包括输液泵输送；(b)局部给药例如通过直接注射进肾或心脏部位，例如长效制剂植入；以及本领域技术人员认为合适的以让活性化合物与活组织接触。
适用于给药的药物组合物包括制剂(例如，该制剂可包含化合物、类视黄醇、第二脂质、稳定剂、和/或治疗剂)，其中包含有效达到预期目的的量的活性成分。要求作为剂量的本文中公开的化合物的治疗有效量将依赖于给药途径、动物类型(包括被治疗的人)、和考虑中的特定动物的物理特征。可制定剂量以达到合意的效果，但其将取决于本领域技术人员将认识到的例如体重、饮食、同时进行的药物治疗因素和其它因素。更具体地，治疗有效量指有效预防、减轻或改善疾病症状或延长被治疗的受治疗者存活的组合物的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
如对本领域技术人员显而易见地，给药的有用的体内剂量和给药的具体模式将依赖于被治疗的哺乳动物物种的年龄、体重、所用的具体化合物、和使用这些化合物的具体用途而变化。由本领域技术人员使用常规药理学方法来实现有效剂量水平的确定，即必需以达到合意的效果的剂量水平。典型地，产品的临床应用从低剂量水平开始，剂量水平增大直到达到合意的效果。可选地，使用已有的药理学方法，可接受的体外研究可用于确立有用的剂量和通过本发明的方法确定的组合物的给药途径。
在非人动物研究中，潜在产品的应用从较高的剂量开始，剂量水平降低直到不在达到合意的效果或不利副作用消失。根据所需的效果和治疗的指征，剂量可广泛地变化。典型地，剂量是约10微克/kg至约100mg/kg体重，优选地约100微克/kg至约10mg/kg体重。可选地，如本领域技术人员理解地，剂量可以基于患者的表面积并计算。
个体内科医生可考虑患者的情况选择药物组合物的确切制剂、给药途径和剂量。(参见例如，Fingl等，1975,in“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，将其全部内容通过援引在此合并入本文，特别地引用第一章第1页)。典型地，给药至患者的组合物的剂量范围可以是患者体重的从约0.5至约1000mg/kg。按患者需要，在一天或多天的过程中，剂量可以是单一的或系列(两个或更多个)。在已在至少一些条件下确立的化合物的人剂量的情况下，剂量将大致相同，或剂量是已确立的人剂量的约0.1％至约500％，更优选地约25％至约250％。当未确立人剂量时，如新开发的药物组合物的情况下，合适的人剂量可从ED50或ID50值、或体外或体内研究所得的由动物毒性研究和功效研究限定的其它适当的值来推断。
需注意因为毒性或器官功能障碍主治医师会知道如何和何时终止、中断或调整给药。相反地，如果临床反应不足够，主治医师也将知道调整治疗到更高的水平(排除毒性)。在感兴趣的病症的管理的给药剂量的大小将与要治疗的病症的严重程度和给药途径而有所不同。例如可通过标准的预后评价方法部分地评价情况的严重程度。此外，根据个体患者的年龄、体重和反应，剂量和可能剂量频率也将变化。与上文讨论的类似的程序可能用于兽药。
虽然是在每一药物的基础上确定确切的剂量，但是在大多数情况下可作出关于剂量的泛化。对于成人患者每日的剂量方案可以是，例如，约0.1mg至2000mg各活性成分的剂量，优选地约1mg至约500mg，例如5至200mg。在其它实施方式中，使用各活性成分的静脉内的、皮下的，或肌肉内的剂量是约0.01mg至约100mg，优选地约0.1mg至约60mg，例如约1至约40mg。在给药药学上可接受的盐的情况下，可以按游离基(free base)计算剂量。在一些实施方式中，每天给药制剂1至4次。可选地可通过持续的静脉滴注给药所述制剂，优选地以各活性成分高至约1000mg每天的剂量。如本领域技术人员将理解的，在一些情况下有必要将本文公开的制剂以超过或甚至远远超过上述的优选的剂量范围给药，以有效地和强劲地治疗特别侵袭性的疾病和感染。在一些实施方式中，在一段持续治疗时间(例如一周或更长，或几个月或几年)里给药所述制剂。
可单独调整剂量和间期以提供活性结构部分的足以维持调节作用的血浆水平，或最低有效浓度(MEC)。对于各化合物MEC将变化，但可从体外数据估计。要实现MEC的剂量将取决于个体特征和给药途径。但是，HPLC测验或生物测验可用于确定血浆浓度。
剂量间期也可使用MEC值确定。应使用在10-90％，优选地在30-90％之间和最优选地在50-90％之间的时间里维持血浆水平高于MEC的方案给药组合物。
在局部给药或选择性吸收的情况下，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关联。
给药的制剂量可以取决于被治疗的受治疗者、治疗者的重量、疾病的严重程度、给药方式、以及处方医生的判断。
可使用已知方法评价本文公开的制剂(例如，该制剂可包含化合物、类视黄醇、第二脂质、稳定剂、和/或治疗剂)的功效和毒性。例如，通过测定对细胞系(例如哺乳动物和优选地人的细胞系)的体外毒性来确立具体化合物或该化合物的共享某些化学结构部分的子集的毒理学。此类研究的结果经常预测动物(例如哺乳动物，或更具体地人)中的毒性。可选地，可使用已知方法确定在动物模型(例如小鼠、大鼠、兔或猴)中具体化合物的毒性。可使用几种公认的方法确定具体化合物的功效，所述方法例如体外方法、动物模型、或人的临床试验。公认的体外模型存在于几乎每一类别的情况中，包括但不限于癌症、心血管疾病和各种免疫功能障碍。类似地，可接受的动物模型可用于确定化学品治疗此类情况的功效。当选择模型以确定功效时，本领域技术人员可由本领域的技术状态引导区选择合适的模型、剂量和给药途径，以及方案。的人人的临床试验也可用于确定化合物在人体内的功效。
如果需要，所述制剂可以包装或分配装置呈现，其可含有一个或多个含有活性成分的单位剂型。所述包装可例如包含金属或塑料薄片，例如吸塑包装。所述包装或分配装置可能带有给药说明书。所述包装或分配装置也可能以规范制造、使用或销售药品的政府机构规定的形式含有与容器有关的注意书，该注意书是经过用于人和动物给药的药物形式的机构批准的反映。此类注意书，例如，可以是处方药获得美国食品和药物管理局批准的标签，或批准的产品插页。也可制备包含配制在相容的药物载体中的化合物的组合物，置于适宜的容器中，并标记用于所指示情况的治疗。
需理解，在本文描述的任何具有一个或多个立构中心的化合物中，如果没有明确地指明绝对的立体化学，则每个中心可以独立地为R-构型或S-构型或其混合物。因此，本文提供的化合物可以是对映体纯的或是立体异构混合物。另外，需理解在任何具有产生(定义为E或Z的)几何异构体的一个或多个双键的化合物中，各双键可以独立地是E或Z或其混合物。同样地，也意在包括所有互变异构形式。
通过参考以下实施例进一步示范本发明。这些实施例仅仅是用作说明的，并不意在限制本发明。
实施例
实施例1：制备2-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(HEDC)
Figure BDA0001226144010000381
制备中间体1：2,2'-(叔丁氧基羰基氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(HEDC-BOC-IN)
Figure BDA0001226144010000382
将N-BOC-二乙醇胺(194g，0.946mol)、三乙胺(201g，2.03mol)和二氨基吡啶(23.1g，0.19mol)在DCM(1750mL)中的溶液冷却至0℃。在0-10℃，50分钟的时间里加入肉豆蔻酰氯(491g，1.99mol)在DCM(440mL)中的溶液，让该混合物温热至环境温度。在20-24℃和1.5小时之后TLC显示完全转化。加入水(1750mL)并由pH计测量出pH 8.3。分离有机相、用(1)6％的NaHCO3(500mL)、(2)0.3M HCl(1700mL)、(3)12.5％氯化钠(1700mL)清洗并用无水硫酸镁(120g)干燥。在50℃和50mBar蒸发滤液获得622g的2,2'-(叔丁氧基羰基氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(HEDC-BOC-IN)。将静置固化的该蒸馏残余物用于下一步骤中。
制备中间体2：2,2'-(叔丁氧基羰基氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(HEDC-胺-IN)TFA盐
Figure BDA0001226144010000391
在50℃的浴中短暂加热将HEDC-BOC-IN(620g，0.990mol)转变为液态，然后冷却至低于25℃。在30分钟时间内将TFA(940mL，1.39kg，1.18mol)加入该液体中，使用适度的冷却使得温度保持在不高于25℃。加入三分之二量的TFA时，观察到显著的气体释放。在环境温度下过夜搅拌该反应混合物。TLC显示痕量HEDC-BOC-IN。将该反应混合物加热以在减压(125-60mBar)下从50-55℃的水浴蒸馏TFA。并持续蒸馏直至其变得很慢。在具有10％氢氧化钠的涤气器中将TFA烟雾吸收。加入庚烷(2000mL)、搅拌、并减压下蒸馏。将庚烷(2000mL)加入部分固化的残余物中，并将该混合物加热至45℃，在该温度形成稍显混浊的溶液。冷却该溶液、在40℃接种，并在40-36℃搅拌25分钟的时间形成沉淀。冷却并在室温搅拌40分钟的时间后，通过过滤隔离大量结晶(heavy crystals)沉淀，并用庚烷(1000mL)清洗滤饼。在环境温度和减压(<1mBar)下过夜干燥湿的滤饼(914g)以获得作为白色晶体的635g(100％)的2,2'-(叔丁氧基羰基氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(HEDC-胺-IN)TFA盐。
制备中间体3:2,2'-(2-(二甲基氨基)乙酰基氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(HEDC-DiMeGly-IN)
Figure BDA0001226144010000392
将N,N-二甲基甘氨酸(56.6g，548毫摩尔)，HOBt水合物(83.9g，548毫摩尔)和EDC盐酸盐(105g，548毫摩尔)加至DMF(3.5L)，并将该混合物在环境温度下搅拌一小时的时间。形成澄清溶液。将HEDC-胺-IN TFA盐(270g，442毫摩尔)与DCM(1.15L)和6％碳酸氢钠(1.15L)混合。将带有游离胺的分离的有机相加至DMF中的偶联混合物中，观察到沉淀以及大约9℃的温度上升。加入三乙胺(47.0g，464毫摩尔)，在25-30℃搅拌该反应混合物5小时的时间。TLC显示不完全转化，加入额外的EDC盐酸盐(29.5g，154毫摩尔)。在环境温度下过夜搅拌后，观察到澄清溶液，并且此时TLC显示完全转化。将该反应混合物与DCM(2.3L)以及2％碳酸氢钠(7L)混合。用1.25％氯化钠(各5L)清洗有机相两次并用无水硫酸镁(186g)干燥。在50℃和30mBar蒸发滤液以获得253g粗油。将该粗材料装入填充了2.6kg硅胶60(40-63μ)的柱子中。用甲苯:乙酸乙酯(8:2)(4L)，随后用乙酸乙酯:甲醇(1:1)(5L)洗脱该产品。蒸发含产品的级分(3.5-8L)(50℃/250-20mBar)以获得油状的208g(66％)的2,2'-(2-(二甲基氨基)乙酰基氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(HEDC-DiMeGly-IN)。
HEDC的制备：2-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物
Figure BDA0001226144010000401
将HEDC-DiMeGly-IN(206g，337毫摩尔)和2-溴乙醇(274g，2.19mol)的混合物在80℃搅拌2小时的时间。HPLC显示有8.1％未反应的二甲基甘氨酸中间体。在80℃和额外的40分钟之后，HPLC显示有7.8％未反应的二甲基甘氨酸中间体。加入温热的(65℃)乙酸乙酯(2L)。用热的乙酸乙酯(0.5L)清洗热溶液的空滤(blank filtration)。将组合的滤液冷却至0℃，通过接种引发结晶。将产品的悬浮液缓慢冷却并在-16至-18℃搅拌40分钟的时间。过滤分离沉淀，并用冷的乙酸乙酯(200mL)清洗滤饼。过夜干燥(20℃/<1mBar)获得211g粗材料。然后从乙酸乙酯(2.1L)和乙醇(105mL)的混合物通过加热至35℃并在25℃接种重结晶该材料。在10℃分离沉淀，用冷乙酸乙酯(300mL)清洗并过夜干燥(20℃/<1mBar)以获得161g的(66％)2-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(HEDC)。HPLC显示为99.5％的纯度。QTOF MS ESI+:m/z 655.6(M+H)。
实施例2：制备2-(双(3-(十四酰氧基)丙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代-乙胺鎓溴化物(Pr-HEDC)
Figure BDA0001226144010000411
制备中间体1：3,3'-氮烷二基双(丙-1-醇)
Figure BDA0001226144010000412
将3-氨基-1-丙醇(14.5mL，19.0毫摩尔)，1-氯-3-羟基丙烷(8mL，95.6毫摩尔)和H2O(～50mL)的混合物回流超过24小时。然后加入氢氧化钾(5.40g)。溶解后，将全部H2O蒸发以留下黏性油和大量氯化钾。过滤这些并用无水丙酮和二氯甲烷清洗。Na2SO4上干燥有机相、过滤并浓缩。然后通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化产品以获得12.5g 3,3'-氮烷二基双(丙-1-醇)。
制备中间体2：叔丁基双(3-羟丙基)氨基甲酸酯
Figure BDA0001226144010000413
将3,3'-氮烷二基双(丙-1-醇)(12.5g，95.4mmol)稀释在DCM(25mL)中。在Ar气层下搅拌时缓慢加入二-叔丁基碳酸氢酯(26g，119.25mmol)在DCM(25mL)中的溶液。让反应搅拌过夜。浓缩反应混合物。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得叔丁基双(3-羟丙基)氨基甲酸酯。
制备中间体3：((叔丁氧基羰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)双十四烷酸酯
Figure BDA0001226144010000414
将叔丁基双(3-羟丙基)氨基甲酸酯(4.00g，17.3毫摩尔)，三乙胺(4.80ml，34.6毫摩尔)和4-二甲基氨基吡啶(529mg，4.33毫摩尔)溶解在氯仿(50mL)中。当在冰浴中搅拌时，在～15分钟内加入肉豆蔻酰氯溶液。添加以这样的方式进行：反应温度不超过30℃。让反应在室温下搅拌过夜。第二天，加入MeOH(50mL)和0.9％的盐溶液(50mL)以淬灭该反应。分离有机层并用1M的NaHCO3清洗。用Na2SO4干燥溶剂、过滤并真空浓缩以获得油状的((叔丁氧基羰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)双十四烷酸酯。
制备中间体4：氮烷二基双(丙烷-3,1-二基)双十四烷酸酯TFA盐
Figure BDA0001226144010000421
将((叔丁氧基羰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)双十四烷酸酯(11.3g，17.3毫摩尔)溶解在TFA/CHCl3(1:1，20mL)中，并让该混合物在室温下搅拌15分钟。然后将该混合物真空浓缩。重复其一次。然后将残余物溶解在DCM中并用H2O清洗，用Na2SO4干燥，并真空浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得作为TFA盐的氮烷二基双(丙烷-3,1-二基)双十四烷酸酯(750mg)。
制备中间体5：((2-(二甲基氨基)乙酰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)双十四烷酸酯
Figure BDA0001226144010000422
用DCM(5mL)稀释氮烷二基双(丙烷-3,1-二基)双十四烷酸酯TFA盐(750mg，1.35毫摩尔)并加至预活化的N,N-二甲基甘氨酸(154mg，1.49mmol)、HATU(616mg，1.62mmol)和DIEA(495uL，2.84mmol)在DCM(5mL)中的混合物中。用氩气冲洗产品并在室温下过夜搅拌，然后浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得465mg((2-(二甲基氨基)乙酰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)双十四烷酸酯。
制备Pr-HEDC：2-(双(3-(十四酰氧基)丙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物
Figure BDA0001226144010000423
在密封系统中，将((2-(二甲基氨基)乙酰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)双十四烷酸酯(246mg，0.385毫摩尔)溶解在ACN(10mL)中，并加入2-溴乙醇(500uL)。用惰性气体冲洗该反应小管然后密封。将该混合物加热至80℃，过夜搅拌，然后冷却并真空浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得99mg的2-(双(3-(十四酰氧基)丙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物。QTOF MS ESI+：m/z 683.6(M+H)。
实施例3：制备2-(双(3-(油酰基氧基)丙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(Pr-HE-DODC)
Figure BDA0001226144010000431
制备中间体1：(Z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)二油酸酯
Figure BDA0001226144010000432
将叔丁基双(3-羟丙基)氨基甲酸酯(前述合成)、三乙胺和DMAP溶解在氯仿中。当在冰浴中搅拌时，15分钟内加入油酰氯溶液。添加以这样的方式进行：反应温度不超过30℃。让反应在室温下搅拌过夜。第二天，加入MeOH(50mL)和0.9％的盐溶液(50mL)以淬灭该反应。分离有机层并用1M的NaHCO3清洗。用Na2SO4干燥溶剂、过滤并真空浓缩以获得油。就这样不经进一步纯化使用(Z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)二油酸酯。
制备中间体2：(Z)-氮烷二基双(丙烷-3,1-二基)二油酸酯TFA盐
Figure BDA0001226144010000433
将(Z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)二油酸酯(13.2g，17.3毫摩尔)溶解在在TFA/CHCl3(1:1，20mL)中，并让该混合物在室温下搅拌15分钟。然后真空浓缩该混合物。重复其一次。然后将残余物溶解在DCM中并用H2O清洗，用Na2SO4干燥，并浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得(Z)-氮烷二基双(丙烷-3,1-二基)二油酸酯TFA盐(750mg)。
制备中间体3：(Z)-((2-(二甲基氨基)乙酰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)二油酸酯
Figure BDA0001226144010000441
用DCM(5mL)稀释(Z)-氮烷二基双(丙烷-3,1-二基)二油酸酯TFA盐(750mg，1.13毫摩尔)并加至预活化的N,N-二甲基甘氨酸(128mg，1.24毫摩尔)、HATU(517mg，1.36毫摩尔)和DIEA(413uL，2.37毫摩尔)在DCM(5mL)中的混合物中。用氩气冲洗烧瓶并在室温下过夜搅拌。浓缩该反应混合物并进行具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱获得(Z)-((2-(二甲基氨基)乙酰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)二油酸酯。
制备Pr-HE-DODC：2-(双(3-(油酰基氧基)丙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物
Figure BDA0001226144010000442
在密封系统中，将(Z)-((2-(二甲基氨基)乙酰基)氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基)二油酸酯(269mg，0.360毫摩尔)溶解在ACN(10mL)中并加入2-溴乙醇(200uL)。用惰性气体冲洗该反应小管然后密封。将该反应加热至80℃，并让其过夜搅拌。然后将该反应混合物冷却并浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得2-(双(3-(油酰基氧基)丙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(129mg)。QTOF MS ESI+：m/z 791.7(M+H)。
实施例4：制备3-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-3-氧代-丙-1-胺鎓溴化物(HE-Et-DC)
Figure BDA0001226144010000443
制备中间体1：((3-(二甲基氨基)丙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯
Figure BDA0001226144010000444
合成前述的氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯TFA盐。用DCM(10mL)稀释氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯TFA盐(1.5g，2.85毫摩尔)并加至3-(二甲基氨基)丙酸HCl盐(482mg，3.14毫摩尔)、HATU(1.30g，3.42毫摩尔)和DIEA(1.04mL，5.98毫摩尔)在DCM(10mL)中的预活化的混合物中。用氩气冲洗该圆底烧瓶并在室温下让该反应混合物过夜搅拌。浓缩该反应混合物。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得((3-(二甲基氨基)丙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯。
制备HE-Et-DC：3-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-3-氧代丙-1-胺鎓溴化物
Figure BDA0001226144010000451
在密封系统中，将((3-(二甲基氨基)丙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(606mg，0.970mmol)溶解在ACN(10mL)中并加入2-溴乙醇(500uL)。用惰性气体冲洗该反应小管然后密封。将该反应加热至80℃，并过夜搅拌。然后冷却并浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得3-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-3-氧代丙-1-胺鎓溴化物(80mg)。QTOF MS ESI+：m/z 669.6(M+H)。
实施例5：制备3-(双(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-3-氧代丙-1-胺鎓溴化物(HE-Et-DODC)
Figure BDA0001226144010000452
制备中间体1：(Z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯
Figure BDA0001226144010000453
将N-Boc二乙醇胺(Aldrich 15268，Lot#0001406013，MW 205.25；17.81g，0.087mole)、三乙胺(Aldrich，MW 101.19；24.4ml，0.176mole)和4-(二甲基氨基)吡啶(Aldrich，MW 122.17；2.76g，1.3g，0.023mole)溶解在350ml氯仿中。搅拌时，在10分钟内加入油酰氯(MW 300.91；61.6g，0.174mole)在100ml氯仿中的溶液(可选地，加油酰氯时将N-Boc二乙醇胺的氯仿溶液浸没于冰/水浴中)。添加以这样的方式进行：反应温度不超过50℃。让反应在室温下搅拌2小时。加入200ml甲醇(EMD MX0485-5，Lot 50350)和200ml 0.9％盐溶液(氯化钠，BDH，BDH8014，Lot#92717)的混合物以淬灭该反应。分离有机层并用2×100ml稀碳酸氢钠(Aldrich S6014，Batch#095K0143)水溶液清洗。通过旋转蒸发去除溶剂以获得59.5g如浅黄色油的粗产品(MW 734.14；59.5g，0.081摩尔，产率100％)。不经进一步纯化将该材料用于下一步骤中。1H NMR(400MHz,CDCl3)0.87(t,6H,CH3),1.20-1.40(m,40H,CH2),1.45(s,9H,tBu CH3),1.59(m,4H,CH2CH2C(＝O)),2.00(m,8H,CH2CH＝CH),2.33(t,4H,CH2C(＝O)),3.48(m,4H,NCH2CH2O),4.18(m,4H,NCH2CH2O),5.33(m,4H,CH＝CH)。
制备中间体2：(Z)-氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯TFA盐
Figure BDA0001226144010000461
用100ml的三氟乙酸(Alfa Aesar Stock#A12198，Lot#D07W005，MW 114.02；100ml，1.35摩尔)和100ml的氯仿(Aldrich 154733，Lot#KBF5943V)处理(Z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(59.5g，0.081摩尔)两次。各由室温下搅拌10分钟构成，并在各次处理的最后通过旋转蒸发将溶剂去除。在第二次处理后，通过旋转蒸发浓缩该反应混合物。将残余物溶解在200ml二氯甲烷中，并用100ml水洗涤该混合物两次。通过使用甲醇(EMD MX0485-5，Lot 50350)和二氯甲烷(EMD DX0835-5，Lot 51090)作为洗脱剂的硅胶色谱纯化残余物以获得44g(Z)-氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯TFA盐(44.0g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)0.87(t,6H,CH3),1.20-1.40(m,40H,CH2),1.59(m,4H,CH2CH2C(＝O)),2.00(m,8H,CH2CH＝CH),2.33(t,4H,CH2C(＝O)),3.31(m,4H,NCH2CH2O),4.38(m,4H,NCH2CH2O),5.33(m,4H,CH＝CH)。
制备中间体3：(((Z)-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯
Figure BDA0001226144010000471
用DCM(10mL)稀释(Z)-氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯TFA盐(1.50g，2.37毫摩尔)并加至3-(二甲基氨基)丙酸HCl盐(383mg，2.49毫摩尔)、HATU(1034mg，2.72毫摩尔)和DIEA(831uL，4.77毫摩尔)在DCM(10mL)中的预活化的混合物中。用氩气冲洗该圆底烧瓶并在室温下让该反应混合物过夜搅拌。浓缩该反应混合物。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得(Z)-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯。
制备HE-Et-DODC：3-(双(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-3-氧代-丙-1-胺鎓溴化物
Figure BDA0001226144010000472
在密封系统中，将(((Z)-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(588mg，0.802毫摩尔)溶解在ACN(10mL)中并加入2-溴乙醇(200uL)。用惰性气体冲洗该反应小管然后密封。将该反应加热至80℃，并过夜搅拌，然后冷却并真空浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得3-(双(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-3-氧代丙-1-胺鎓溴化物(160mg)。QTOF MS ESI+：m/z 764.3(M+H)。
实施例6：制备4-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物(HE-Pr-DC)
Figure BDA0001226144010000473
制备中间体1：((4-(二甲基氨基)丁酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯
Figure BDA0001226144010000481
合成前述的氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯TFA盐。用DCM(5mL)稀释氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯TFA盐(1.00g，1.90毫摩尔)并加至4-(二甲基氨基)丁酸HCl盐(382mg，2.28毫摩尔)、HATU(867mg，2.28mmol)和DIEA(728uL，4.18毫摩尔)在DCM(5mL)中的预活化的混合物中。用氩气冲洗该烧瓶并在室温下让该反应混合物过夜搅拌，然后浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得((4-(二甲基氨基)丁酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯。
制备HE-Pr-DC：4-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物
Figure BDA0001226144010000482
在密封系统中，将((4-(二甲基氨基)丁酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(300mg，0.469毫摩尔)溶解在ACN(5mL)中并加入2-溴乙醇(500uL)。用惰性气体冲洗该反应小管然后密封。将该反应加热至80℃，并过夜搅拌，然后浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得4-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物(140mg).LCMS ESI+：m/z 684.4(M+H).
实施例7：制备4-(双(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物(HE-Pr-DODC)
Figure BDA0001226144010000483
制备中间体1：(Z)-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯
Figure BDA0001226144010000491
合成前述的(Z)-氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯TFA盐。用DCM(5mL)稀释(Z)-氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯TFA盐(1.00g，1.58毫摩尔)并加至4-(二甲基氨基)丁酸HCl盐(317mg，1.89毫摩尔)、HATU(719mg，1.89毫摩尔)和DIEA(606uL，3.48毫摩尔)在DCM(5mL)中的预活化的混合物中。用氩气冲洗该烧瓶并在室温下让该反应混合物过夜搅拌，然后浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得(Z)-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯。
制备HE-Pr-DODC：4-(双(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物
Figure BDA0001226144010000492
在密封系统中，将((4-(二甲基氨基)丁酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(400mg，0.535毫摩尔)溶解在ACN(5mL)中并加入2-溴乙醇(500uL)。用惰性气体冲洗该反应小管然后密封。将该反应加热至80℃，并过夜搅拌，然后浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得4-(双(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-4-氧代丁-1-胺鎓溴化物(255mg).LCMS ESI+：m/z 792.5(M+H)。
实施例8：制备2-(双(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-N,N-双(2-羟乙基)-N-甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(HE2DODC)
Figure BDA0001226144010000493
制备中间体1：(Z)-((2-溴乙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯
Figure BDA0001226144010000501
合成前述的(Z)-氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯TFA盐。将(Z)-氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯TFA盐(1.50g，2.34毫摩尔)溶解在DCM(20mL)中并置于冰浴中。加入溴乙酰溴(214uL，2.46毫摩尔)再加入三乙胺(685uL，4.91毫摩尔)。移去冰浴并让该反应在室温下惰性气体中搅拌过夜，然后用DCM稀释至100mL，并用1M HCl(75mL)、H2O(75mL)、饱和的NaHCO3溶液(75mL)和饱和的盐水溶液(75mL)清洗。用DCM(25mL)重新萃取所有水洗液，用MgSO4干燥有机物、过滤并真空浓缩。用乙酸乙酯的硅胶色谱进行纯化获得(Z)-((2-溴乙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(1.22g)。
制备HE2DODC：2-(双(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-N,N-双(2-羟乙基)-N-甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物
Figure BDA0001226144010000502
在密封系统中，加入与N-甲基二乙胺(1.58mL，13.8毫摩尔)组合的(Z)-((2-溴乙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(2.08g，2.75毫摩尔)。用惰性气体冲洗该反应小管然后密封。将该反应加热至50℃，并过夜搅拌，然后浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得2-(双(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-N,N-双(2-羟乙基)-N-甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(479mg)。LCMS ESI+：m/z 793.7(M+H)。
实施例9：制备2-(双(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰基(dienoyl)氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(HEDC-DLin)
Figure BDA0001226144010000503
以和HEDC相似的方式制备2-(双(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰基氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物，用(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰氯替代肉豆蔻酰氯。
实施例10：制备2-(双(2-(十二酰氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物(HEDC-12)
Figure BDA0001226144010000511
以和HEDC类似的方式制备2-(双(2-(十二酰氧基)乙基)氨基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙胺鎓溴化物，将月桂基氯化物替换为肉豆蔻酰氯。
实施例11：制备2-((2-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基乙胺鎓溴化物(HES104)
Figure BDA0001226144010000512
制备中间体1：((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2，1-二基)双十四烷酸酯(S104).
Figure BDA0001226144010000513
合成前述的氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯TFA盐。0-5℃将氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯TFA盐(152g，238毫摩尔)和DCM(2.3L)以及10％的碳酸氢钾(1.15L)搅拌。分离有机相并用DCM(1.15L)进一步萃取水相。合并的有机相与硫酸镁水合物(236g)一起在0-5℃搅拌30分钟，过滤并用DCM(1.15L)清洗。向合并的滤液中加入2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酸盐酸盐(57.0g，285毫摩尔)、EDC盐酸盐(68.4g，357毫摩尔)和DMAP(2.91g，23.8毫摩尔)，并在环境温度下搅拌该悬浮液，在这段时间后，澄清溶液形成。加入MQ-水(2.3L)和甲醇(460mL)，并在搅拌10分钟的时间之后，分离澄清的有机相。用DCM(575mL)萃取混浊的水相(pH 3.0)。浓缩合并的有机萃取液，获得143g的作为盐酸盐的粗材料。将该粗材料(142.6g)转移至有DCM(500mL)的蒸馏烧瓶中，并加入乙酸乙酯(1L)。在大气压下加热该溶液至蒸馏，并持续蒸馏70分钟的时间以获得残余物温度为76℃。添加乙酸乙酯(800mL)获得1.4L的总体积，并加入乙醇(70mL)。将50℃的澄清溶液冷却至37℃，并加入晶种。在37-35℃和10分钟的时间里观察到开始大量结晶，冷却该悬浮液并在0℃过夜搅拌，通过过滤分离沉淀，用冷的乙酸乙酯(210mL)清洗。在环境温度下和油泵真空里，一段4.5小时的时间干燥至恒重得到134g作为盐酸盐的重结晶材料，是白色结晶固体。将磷酸三钾(85g，0.40mol)和磷酸氢二钾(226g，1.30mol)加至纯化水(1.7L)中，让所形成的pH为10.9的溶液冷却至18-20℃。加入DCM(1.3L)和重结晶的S104盐酸盐(133g，0.188mol)，并搅拌该混合物10分钟的时间。以中等速度(在35分钟的时间里)分离澄清的有机相，并用DCM(650mL)进一步萃取混浊的水相。合并的有机相与无水硫酸镁(65g)一起搅拌40分钟的时间，过滤该混合物，并用DCM(200m L)清洗。在减压(低至20mBar，在该压力持续蒸发1小时)下从50℃的水浴蒸发合并的滤液。在油泵真空从15-20℃水浴的额外蒸发导致126g部分固化的油。在-20℃的冷浴中的冷却给予完全固化，在-20℃油泵真空下的干燥之后，本发明人获得126g的((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(S104)。HPLC显示98.1％的纯度。
制备HES104：2-((2-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基乙胺鎓溴化物
Figure BDA0001226144010000521
在封闭系统中，加入与2-溴乙醇(687uL，9.69毫摩尔)组合的((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(1.00g，1.49毫摩尔)。用惰性气体冲洗该反应管然后密封。将反应加热至75℃并让其搅拌过夜，然后冷却，并在真空中浓缩。通过用DCM/MeOH梯度的硅胶色谱的纯化获得2-((2-(双(2-(十四酰氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基乙胺鎓溴化物(HES104)(790mg)。LCMS ESI+：m/z 715.7(M+H)。
实施例12：制备2-((2-(双(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基乙胺鎓溴化物(HES104-DO)
Figure BDA0001226144010000531
制备中间体1：(Z)-((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯
Figure BDA0001226144010000532
合成前述的(Z)-氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯TFA盐。在0-5℃在DCM(60mL)和10％K2CO3(30mL)中搅拌(Z)-氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯TFA盐(4.06g，6.41毫摩尔)。30分钟后，分离有机相并用DCM(30mL)进一步萃取水相。合并的有机相与无水硫酸镁在0-5℃一起搅拌30分钟的时间，过滤，并用DCM(30m L)清洗。向组合的滤液中加入2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酸(1.26g，7.70毫摩尔)、EDC的HCl盐(1.84g，9.62毫摩尔)、DMAP(78.3mg，0.64毫摩尔)。在室温下过夜搅拌该薄悬浮液；在一段时间之后，该溶液变得澄清。第二天，加入去离子水(60mL)和甲醇(30mL)。搅拌10分钟后，分离该澄清有机层。用DCM萃取该混浊水相。浓缩合并的有机萃取物。通过硅质塞过滤粗材料，并吸收到DCM(40mL)中，并加入PBS(pH＝11，50mL)。在室温搅拌该混合物10分钟。然后，分离有机相并用DCM(15mL)再萃取水相。合并的有机相与无水硫酸镁一起搅拌30分钟的时间。然后过滤该混合物，并用DCM清洗。真空浓缩该合并的滤液以获得(Z)-((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(3.44g)。
制备HES104-DO
Figure BDA0001226144010000533
在密封系统中，加入与2-溴乙醇(319uL，4.50)组合的(Z)-((2-((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)乙酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(540mg，0.693mmol)。用惰性气体冲洗该反应小管然后密封。将该反应加热至75℃，并让其过夜搅拌。第二天，冷却并真空浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得2-((2-(双(2-(油酰基氧基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)硫代)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基乙胺鎓溴化物(324mg)。
LCMS ESI+：m/z 823.8(M+H)。
实施例13：制备2-((双(2-(油酰基氧基)乙基)氨甲酰基)硫代)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基乙胺鎓溴化物(HETU104-DO)
Figure BDA0001226144010000541
制备中间体1：(Z)-((((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯
Figure BDA0001226144010000542
合成前述的(Z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯。将(Z)-((叔丁氧基羰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(4.2g，5.72毫摩尔)溶解在DCM(20mL)中并在冰浴中冷却至0℃。加入TFA(20mL)并让混合物在惰性气体层下搅拌20分钟。之后，在真空中浓缩混合物。在10％的K2CO3(20mL)和DCM(20mL)之间分配残余物。在冰浴中搅拌该混合物20分钟。收集有机部分，并用DCM(2x10mL)萃取混浊的水层。合并的有机萃取物与无水MgSO4一起加入并在0℃搅拌20分钟。过滤该悬浮液并用DCM(10mL)清洗。将双光气(1.38mL，11.4毫摩尔)加至DCM中的(Z)-氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯材料中并在室温下惰性气体层下搅拌。第二天，在真空中去除DCM和过量双光气。在DCM(50mL)和三乙胺(5.2mL，37.2毫摩尔)中吸收2-(二甲基氨基)乙硫醇HCl盐(4.05g，28.6毫摩尔)，并将其加至(Z)-((氯羰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯残余物中。让反应混合物在室温下过夜搅拌。第二天，用DCM稀释该混合物并用0.3M HCl(75mL)、水(75mL)和10％的K2CO3(75mL)清洗。用DCM(25mL)反萃取所有水相洗液。在无水MgSO4上干燥有机相，过滤并在真空中浓缩。通过用DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得(Z)-((((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(1.90g)。
制备HETU104DO
Figure BDA0001226144010000551
在密封系统中，加入与2-溴乙醇(370uL，5.22毫摩尔)组合的(Z)-((((2-(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)二油酸酯(615mg，0.804毫摩尔)。用惰性气体冲洗该反应小管然后密封。将该反应加热至75℃，并让其过夜搅拌，然后冷却并真空浓缩。通过具有DCM/MeOH梯度的硅胶色谱纯化获得2-((双(2-(油酰基氧基)乙基)氨甲酰基)硫代)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基乙胺鎓溴化物(473mg)。LCMS ESI+：m/z 809.8(M+H)。
实施例14：合成Dope-Glu-VA
制备(Z)-(2R)-3-(((2-(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1，2-二基二油酸酯(DOPE-Glu-VA)
Figure BDA0001226144010000552
制备中间体1：5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酸
Figure BDA0001226144010000553
在琥珀色的小瓶中，将戊二酸酐(220mg，1.93毫摩尔)和视黄醇(500mg，1.75毫摩尔)溶解在二氯甲烷(5mL)中。加入三乙胺(513ul，3.68毫摩尔)并用氩气冲洗该小管。让反应混合物在室温下搅拌4小时。浓缩该材料并通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化。集中级分并浓缩以获得淡黄色油(700mg)。通过NMR核实产品。
制备DOPE-Glu-VA：(Z)-(2R)-3-(((2-(5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯
Figure BDA0001226144010000561
在用氩气冲洗的琥珀色的小管中将1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(500mg，0.672毫摩尔)，N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(306.5mg，0.806毫摩尔)和5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酸(269mg，0.672毫摩尔)溶解在氯仿/DMF(10mL，1:1的混合物)中并加入N,N-二异丙基乙胺(300uL，1.68毫摩尔)。让反应混合物在室温下过夜搅拌。浓缩该反应混合物，然后通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化。收集级分并浓缩以获得淡黄色油(460mg，61％)。通过NMR核实产品。1H NMR(400MHz),δH：8.6(d,1H),8.27(d,1H),6.57-6.61(dd,1H),6.08-6.25(m,4H),5.57(t,1H),5.30-5.34(m,4H),5.18(m,1H),4.68-4.70(d,2H),4.28-4.35(m,1H),4.05-4.15(m,1H),3.81-3.97(m,4H),3.52-3.62(m,1H),3.35-3.45(m,2H),2.95-3.05(m,1H),2.33-2.35(t,3H),2.2-2.3(m,7H),1.9-2.05(m,17H),1.85(s,3H),1.69(s,3H),1.5-1.65(m,6H),1.4-1.5(m,2H),1.18-1.38(m,～40H),1.01(s,3H),0.84-0.88(m,12H).
实施例15：DOPE-Glu-NH-VA
制备(Z)-(2R)-3-(((2-(4-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)丁酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(DOPE-Glu-NH-VA)
Figure BDA0001226144010000562
制备中间体1：(Z)-(2R)-3-(((2-(4-氨基丁酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯
Figure BDA0001226144010000571
将1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(2500mg，3.36毫摩尔)，Boc-GABA-OH(751mg，3.70毫摩尔)和N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(1531mg，4.03毫摩尔)溶解在DMF/氯仿(25mL，1:1的混合物)中。加入N,N-二异丙基乙胺(880uL，5.05毫摩尔)并让该混合物在室温氩气层下过夜。用～200mL水稀释反应混合物，并用二氯甲烷(3x100ml)萃取产物。用～75mL的pH 4.0的PBS缓冲液清洗产物，用硫酸钠干燥有机物，过滤并浓缩。然后通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化材料，并浓缩获得无色油(2.01g，64％)。通过NMR核实产品。然后在30mL的2M HCl/二乙醚中吸收该材料。让反应在室温下水浴中搅拌。2小时后，浓缩该溶液以获得(Z)-(2R)-3-(((2-(4-氨基丁酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯。
制备DOPE-Glu-NH-VA：(Z)-(2R)-3-(((2-(4-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)丁酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯
Figure BDA0001226144010000572
将(Z)-(2R)-3-(((2-(4-氨基丁酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(1200mg，1.45毫摩尔)、维甲酸(500mg，1.66毫摩尔)和N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(689mg，1.81毫摩尔)悬浮在DMF/氯仿(10mL，1:1的混合物)中。加入N,N-二异丙基乙胺(758uL，4.35毫摩尔)。用氩气冲洗圆底烧瓶并覆盖铝箔。在室温下搅拌反应混合物4小时，在二氯甲烷(75mL)和H2O(75mL)中分配，用二氯甲烷萃取，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。通过使用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化获得(Z)-(2R)-3-(((2-(4-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)丁酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(292mg，18％)。通过LCMS&NMR表征该产品。1H NMR(400MHz),δH：8.55(s,1H),8.2(d,1H),7.3(s,1H),6.6(dd,1H),6.10-6.27(m,5H),5.5(t,1H),5.31(s,4H),5.1-5.2(m,2H),4.68(d,2H),4.3(d,2H),4.1(m,2H),3.9(m,8H),3.58(q,4H),3.4(s,4H),3.0(q,4H),2.33-2.35(t,3H),2.2-2.3(m,7H),1.9-2.05(m,17H),1.85(s,3H),1.69(s,3H),1.5-1.65(m,6H),1.4-1.5(m,2H),1.18-1.38(m,～40H),1.01(s,3H),0.84-0.88(m,12H).MS：m/z 1112.44(M+H+).
实施例16：DSPE-PEG550-VA
制备(2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-二甲基-4,44-二氧代-52-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂-3,43-二氮杂五十二烷-45,47,49,51-四烯-1-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯(DSPE-PEG550-VA)
Figure BDA0001226144010000581
制备中间体1：(2R)-3-((((2,2-二甲基-4,44-二氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧杂-5,45-二氮杂庚四十烷-47-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯
Figure BDA0001226144010000591
在用氩气冲洗的20mL的闪烁管中，将1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(200mg，0.267毫摩尔)，t-Boc-N-酰氨基-dPEG12-酸(211mg，0.294毫摩尔)和N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(122mg，0.320毫摩尔)溶解在氯仿/甲醇/H2O(6mL，65:35:8)中。加入N,N-二异丙基乙胺(116uL，0.668毫摩尔)。让反应在25℃搅拌4小时并浓缩。然后用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化材料以获得作为油(252mg，65％)的(2R)-3-((((2,2-二甲基-4,44-二氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧杂-5,45-二氮杂庚四十烷-47-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯。
制备DSPE-PEG550-VA：(2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-二甲基-4,44-二氧代-52-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂-3,43-二氮杂五十二烷-45,47,49,51-四烯-1-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯
Figure BDA0001226144010000601
将(2R)-3-((((2,2-二甲基-4,44-二氧代-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧杂-5,45-二氮杂庚四十烷-47-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯(252mg，0.174毫摩尔)溶解在二乙醚(5mL)中。将反应置于室温下的水浴中。加入2M HCl/二乙醚(2mL，4毫摩尔)并让混合物搅拌约1小时。然后，在真空中去除溶剂和过量HCl。在用氩气冲洗的圆底烧瓶中的2mL的N,N-二甲基甲酰胺中悬浮该材料。加入维甲酸(57.5mg，0.191毫摩尔)、N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(79mg，0.209毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(106uL，0.609毫摩尔)。材料没有完全溶解，所以加入更多的氯仿/甲醇/H2O(1mL，体积比为65:35:8的混合物)以获得反应均一性。3.5小时之后，浓缩反应混合物。然后通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化材料以获得作为褐色固体(210mg，74％)的(2R)-3-(((((45E,47E,49E,51E)-46,50-二甲基-4,44-二氧代-52-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-十二氧杂-3,43-二氮杂五十二烷-45,47,49,51-四烯-1-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二硬脂酸酯。通过NMR&LCMS核实产物。1H NMR(400MHz),δH：8.6(s,1H),8.25(d,1H),6.8-6.9(dd,1H),6.3-6.4(m,1H),6.12-6.25(dd,5H),5.71(s,1H),5.18(m,2H),4.33(dd,2H),4.13(m,2H),3.95(m,2H),3.74(m,8H),3.63(s,～48H),3.0(q,2H),2.5(t,3H),2.35(s,3H),2.25(t,8H),1.97(m,7H),1.7(3,3H),1.5(m,2H),1.36(m,12H),1.23(m,～56H),1.01(s,6H),0.86(t,12H).MS：m/z 1630.28(M+H+)。
实施例17：DSPE-PEG2000-Glu-VA
制备DSPE-PEG2000-Glu-VA
Figure BDA0001226144010000611
制备中间体1：5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酸
Figure BDA0001226144010000612
在琥珀色小管中，将戊二酸酐(115mg，1.01毫摩尔)和视黄醇(240mg，0.838毫摩尔)溶解在二氯甲烷(3mL)中。加入三乙胺(257ul，1.84毫摩尔)并用氩气冲洗该小管。让反应在室温下搅拌过夜。浓缩反应混合物，然后通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化获得作为淡黄色油(700mg，78％)的5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酸。用NMR表征该材料。
制备DSPE-PEG2000-Glu-VA
Figure BDA0001226144010000613
在用氩气冲洗的琥珀色闪烁管中，将5-(((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯-1-基)氧基)-5-氧代戊酸(43mg，0.108毫摩尔)，DSPE-PEG2000-NH2(250mg，0.090毫摩尔)和N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(45mg，0.117毫摩尔)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中。加入N,N-二异丙基乙胺(47uL，0.270毫摩尔)，让反应在室温下搅拌过夜，然后通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化以获得淡黄色油(59mg，20.7％)。通过NMR核实产物。1H NMR(400MHz),δH：706(m,1H),6.59-6.66(dd,1H),6.06-6.30(m 5H),5.56-5.60(t,1H),5.17-5.23(m,2H),4.35-4.42(dd,2H),4.12-4.25(m,5H),3.96-3.97(m,6H),3.79-3.81(t,1H),3.66(m,～180H),3.51-3.58(m,2H),3.4-3.48(m,4H),3.3-3.38(m,2H),2.25-2.45(m,14H),1.5-2.0(m,15H),1.23-1.32(m,～56H),1.01(s,3H),0.85-0.88(t,12H)。
实施例18：DOPE-Gly3-VA
制备(Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-二甲基-4,7,10,13-四氧代-21-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-3,6,9,12-四氮杂二十一碳-14,16,18,20-四烯-1-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(DOPE-Gly3-VA)
Figure BDA0001226144010000621
制备中间体1：(Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯
Figure BDA0001226144010000622
将Boc-Gly-Gly-Gly-OH(382mg，1.34毫摩尔)和N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(532mg，1.4毫摩尔)溶解在DMF(5mL)中。加入N,N-二异丙基乙胺(488uL，2.8毫摩尔)并让该混合物在室温下搅拌10-15分钟。然后加入1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(833mg，1.12毫摩尔)在氯仿(5mL)中的溶液并用氩气冲洗该反应管。室温下16小时候，浓缩反应混合物并在二氯甲烷(50mL)和H2O(50mL)之间分配，用二氯甲烷(3x50mL)萃取，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化该材料获得无色油状残余物。向其中加入2M HCl/二乙醚(5mL)，让该反应婚外在水浴中搅拌约2小时。浓缩该反应混合物，用二氯甲烷(75mL)吸收残余物，用饱和的碳酸氢钠溶液(75mL)清洗，用二氯甲烷(3x75mL)萃取产品，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩以获得作为半固体的(765mg，90％)(Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯。通过NMR核实。
制备DOPE-Gly3-VA：(Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-二甲基-4,7,10,13-四氧代-21-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-3,6,9,12-四氮杂二十一碳-14,16,18,20-四烯-1-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯
Figure BDA0001226144010000631
将(Z)-(2R)-3-(((2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(765mg，0.836毫摩尔)、维甲酸(301mg，1.00毫摩尔)、和N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(413mg，1.09毫摩尔)悬浮在N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中。加入N,N-二异丙基乙胺(437uL，2.51毫摩尔)，并用氩气冲洗该反应小管。在材料溶剂化中将氯仿(5mL)加入酸中。在覆盖了铝箔的圆底烧瓶中让反应在室温下搅拌～4小时。在H2O(100mL)和二氯甲烷(100mL)之间分配材料。用二氯甲烷(3x100mL)萃取，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。然后通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化材料获得作为橙色油(704mg，70％)的(Z)-(2R)-3-(((((14E,16E,18E,20E)-15,19-二甲基-4,7,10,13-四氧代-21-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-3,6,9,12-四氮杂二十一碳-14,16,18,20-四烯-1-基)氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯。通过LCMS&NMR核实产品。1H NMR(400MHz),δH：6.90(t,1H),6.21(q,2H),6.08-6.12(d,2H),5.83(s,1H),5.31(s,4H),5.30(s,2H),4.37(d,1H),4.15(m,1H),3.91(m,8H),3.59(m,2H),3.29(m,2H),3.01(m,2H),2.28(m,6H),1.95-1.98(m,12H),1.44(s,3H),1.5-1.6(m,2H),1.44(m,6H),1.24(m,～48H),1.00(s,6H),0.86(t,3H)。MS：m/z 1198.42(M+H+)。
实施例19：VA-PEG-VA
制备N1,N19-双((16E,18E,20E,22E)-17,21-二甲基-15-氧代-23-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧杂-14-氮杂二十三碳-16,18,20,22-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺(VA-PEG-VA)
Figure BDA0001226144010000641
制备VA-PEG-VA：N1,N19-双((16E,18E,20E,22E)-17,21-二甲基-15-氧代-23-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧杂-14-氮杂二十三碳-16,18,20,22-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺
Figure BDA0001226144010000642
将维甲酸(2913mg，9.70毫摩尔)、N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(3992mg，10.50毫摩尔)和二酰氨基-dPEG11-二胺(3000mg，4.04毫摩尔)悬浮在N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中。加入N,N-二异丙基乙胺(4222μL，24.24毫摩尔)，并用氩气冲洗该小管。在覆盖了铝箔的圆底烧瓶中让反应在室温下搅拌过夜。第二天，在乙酸乙酯(125mL)和水(125mL)之间分配材料。用乙酸乙酯(3x125mL)萃取，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。然后通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化材料。收集级分并浓缩获得黄色油(2900mg，54.9％)。通过LCMS&NMR核实产品。1H NMR(400MHz),δH：7.1(s,2H),6.87(t,2H),6.51(t,2H),6.12-6.20(dd,8H),5.66(s,2H),3.6-3.8(m,～44H),3.4(q,4H),3.3(q,4H),2.46(t,4H),2.32(s,6H),1.9-2.05(m,10H),1.7-1.85(m,15H),1.6(m,4H),1.3-1,5(m,6H),1.01(s,12H)。QTOF MS：m/z 1306(M+H+)。
实施例20：VA-PEG2000-VA
制备(2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-六四十氧杂四十碳庚烷(hectane)-1,140-二基)双(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)(VA-PEG2000-VA)
Figure BDA0001226144010000651
制备VA-PEG2000-VA：(2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-六四十碳氧杂四十庚烷(hectane)-1,140-二基)双(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)
Figure BDA0001226144010000652
将维甲酸(109mg，0.362毫摩尔)，N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(149mg，0.392毫摩尔)和胺-PEG2K-胺(333mg，0.151毫摩尔)悬浮在N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中。加入N,N-二异丙基乙胺(158μL，0.906毫摩尔)，并用氩气冲洗该管。在覆盖了铝箔的圆底烧瓶中让反应在室温下搅拌过夜。第二天，在乙酸乙酯(30mL)和水(30mL)之间分配材料。用乙酸乙酯(3x125mL)萃取，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。然后通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化材料。收集级分并浓缩获得作为黄色油(97mg，23％)的(2E,2'E,4E,4'E,6E,6'E,8E,8'E)-N,N'-(3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132,135,138-六四十碳氧杂四十碳庚烷(hectane)-1,140-二基)双(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)。通过LCMS&NMR核实产物。1H NMR(400MHz),δH：6.85-6.92(t,2h),6.20-6.32(M,6H),6.08-6.12(d,4H),5.72(s,2H),3.55-3.70(m,～180H),3.4-3.5(m,4H),2.79(m,4H),2.78(s,6H),2.33(s,6H),2.05(m,4H),1.97(s,6H),1.80(m,2H),1.79(s,6H),1.69(s,6H),1.60(m,4H),1.45(m,4H),1.01(s,12H)。QTOF MS：m/z 2651(M+H+)。
实施例21：DSPE-PEG2000-VA
Figure BDA0001226144010000661
制备DSPE-PEG2000-VA
Figure BDA0001226144010000662
将DSPE-PEG2000-NH2(250mg，0.090毫摩尔)、维甲酸(3 3mg，0.108毫摩尔)和N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(45mg，0.117毫摩尔)溶解在N,N-二甲基甲酰胺中。将N,N-二异丙基乙胺(47μL，0.270毫摩尔)加入混合物中。用氩气冲洗该琥珀色的闪烁管，并让其在室温下搅拌3天。然后通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化材料。收集级分并浓缩以获得作为黄色油(245mg，89％)的DSPE-PEG2000-VA。通过NMR核实产物。1H NMR(400MHz),δH：6.86(dd,1H),6.25(m,1H),6.09-6.21(dd,4H),5.71(s,1H),5.1-5.2(m,1H),4.3-4.4(d,1H),4.1-4.2(m,3H),3.85-4.0(m,4H),3.8(t,1H),3.5-3.75(m,～180H),3.4-3.5(m,8H),3.3(m,2H),2.35(s,3H),2.26(m,4H),1.70(s,3H),1.55-1.65(m,6H),1.47(m,2H),1.23(s,～60H),1.01(s,6H),0.85(t,6H)。
实施例22：diVA-PEG-diVA，也已知为“DiVA”
制备N1,N19-双((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环-己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基(四烯酰氨基))-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂三十碳-23,25,27,29-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺(diVA)
Figure BDA0001226144010000671
制备中间体1：四苄基((5S,57S)-6,22,40,56-四氧代-11,14,17,25,28,31,34,37,45,48,51-十一氧杂-7,21,41,55-四氮杂六十烷(tetraazahenhexacontance)-1,5,57,61-四基)四氨基甲酸酯，也已知为Z-DiVA-PEG-DiVA-IN
Figure BDA0001226144010000672
用氮气吹扫冷却至5-10℃的1L的反应烧瓶，并填充二氯甲烷(300mL)、d-PEG-11-二胺(量批次(Quanta lot)EK1-A-1100-010，50.0g，0.067mol)、Z-(L)-Lys(Z)-OH(61.5g，0.15mol)、和HOBt水合物(22.5g，0.15mol)。将4-甲基吗啉(4-MMP)(15.0g，0.15mol)加入该悬浮液中，观察到稍放热的反应。在30分钟时间里将EDC盐酸盐(43.5g，0.23mol)和4-MMP(20.0g，0.20mol)在二氯甲烷(150mL)中的悬浮液加入，并需要适度冷却以保持温度在20-23℃。在环境温度下过夜搅拌稍混浊的溶液，HPLC显示反应完全。加入去离子水(300mL)，在搅拌10分钟之后，观察到快速的相分离。用二氯甲烷(150mL)萃取水相–具有稍微较慢的相分离。用6％碳酸氢钠(300mL)清洗合并的有机萃取物，并用硫酸镁(24g)干燥。减压下从40-45℃的水浴蒸发得到132g粗产物。将粗产物(131g)在8％甲醇的乙酸乙酯中的溶液装至硅胶60柱(40-63μ)，其装填有8％甲醇的乙酸乙酯。用8％甲醇的乙酸乙酯(7.5L)洗脱该柱。减压下将充分含有纯产物的级分(5.00-7.25L)从45℃的水浴蒸发，83.6g纯化的产物。将纯化的产物(83.6g)在二氯甲烷(200mL)中的溶液装至已用二氯甲烷(250mL)冲洗的Dowex 650C柱(H+)(200g)。用二氯甲烷(200mL)洗脱该柱。用硫酸镁(14g)干燥含有级分的合并的产物(300-400mL)，并在减压下从45℃的水浴蒸发以获得四苄基((5S,57S)-6,22,40,56-四氧代-11,14,17,25,28,31,34,37,45,48,51-十一氧杂-7,21,41,55-四氮杂六十烷(tetraazahenhexacontance)-1,5,57,61-四基)四氨基甲酸酯，也已知为Z-DiVA-PEG-DiVA-IN(77.9g，HPLC纯度94.1％)。
制备中间体2：N1,N19-双((S)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂二十基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺，也称为DiVA-PEG-DiVA-IN
Figure BDA0001226144010000681
用氮气吹扫1L的反应烧瓶，并装入甲醇(600mL)和Z-DiVA-PEG-DiVA-IN(92.9,60.5毫摩尔)。在氮气下搅拌该混合物直至获得溶液。加入催化剂10％Pd/C/50％水(Aldrich，10g)。将混合物排出，然后用氮气均衡压力。将混合物排出，然后用氢气均衡压力。确保在反应混合物上有稳定的低氢气流，开始搅拌。在氢气流中持续氢化一小时。然后关闭该系统，并在～0.1bar持续氢化1小时。将混合物排出，然后用氢气再加压至～0.1bar。在另一小时的氢化之后，排出混合物，然后用氢气再加压至0.1bar。继续在氢气下的搅拌15小时，此后通过HPLC不能检测到任何原材料。将混合物排出，然后用氮气均衡压力。将混合物排出，然后用氢气均衡压力。然后在硅藻土545垫上过滤反应混合物。用甲醇(100mL)清洗滤饼。最后在45℃和低于50mbar的压力浓缩合并的滤液。加入甲苯(100mL)，最后在45℃和低于40mbar的压力再次浓缩所得的混合物以获得N1,N19-双((S)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂二十基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺，也已知为DiVA-PEG-DiVA-IN(63.4g)，其作为静置将固化的油。
制备DiVA-PEG-DiVA：N1,N19-双((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂三十碳-23,25,27,29-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺
Figure BDA0001226144010000691
将2L的反应器填充氩气，并加入二氯甲烷(500mL)、DiVA-PEG-DiVA-IN(52.3g，52.3毫摩尔)、维甲酸(70.6g，235毫摩尔)和4-N,N-二甲基氨基吡啶(2.6g，21.3毫摩尔)。在氩气下搅拌该混合物直至溶解(～20分钟)。将反应温度保持在10-20℃，在10-15分钟的时间里分次加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)(EDCI)(70.6g，369毫摩尔)(在前30-60分钟该反应稍微放热)。用铝箔覆盖该反应器，并让混合物在18-21℃搅拌15-20小时。加入丁基化的羟基甲苯(BHT)(25mg)，然后在该混合物上保持氩气氛围的同时将该反应混合物倒至6％的碳酸氢钠水溶液(500mL)。分离有机相。用二氯甲烷(50mL)清洗水相。在惰性氛围下并避光，用硫酸镁(150g)干燥合并的有机相。过滤(优选加压过滤)去除干燥剂并用二氯甲烷(500mL)清洗滤饼。在减压下用35-40℃水浴通过蒸发浓缩滤液。向油状残余物中加入甲苯(150mL)并再次蒸发以获得210g半固体残余物。将残余物溶解在二氯甲烷(250mL)中并加至从硅胶60(1.6kg)和0.5％甲醇的二氯甲烷制备的柱子上(4L)。用二氯甲烷(7.2L)，2)，3％甲醇的二氯甲烷(13L)、5％甲醇的二氯甲烷(13L)、10％甲醇的二氯甲烷(18L)洗脱该柱子。取一个10L的级分，然后取2.5L的级分。对避光的级分进行取样、用氩气冲洗然后密封。用TLC(10％甲醇的二氯甲烷，UV)分析所取的级分。包含DiVA-PEG-DiVA的级分进一步用HPLC分析。以相同方式再纯化纯度<85％的5级分(给予32g蒸发残余物)，只是用硅胶和溶剂的原始量的25％。合并通过HPLC纯度>85％的级分并在减压下使用35-40℃的水浴蒸发。将蒸发残余物(120g)再溶解在二氯甲烷(1.5L)中并缓慢(约1小时)地通过从离子交换Dowex650C，H+形式(107g)制备的柱子。然后用二氯甲烷(1L)冲洗柱子。将合并的洗脱物(3277.4g)混合均匀并蒸发一个样品(25mL，33.33g)，最后在室温和<0.1mBar的压力下获得0.83g的泡馍。因此从该图可计算固体材料的总量产量为80.8g(72.5％)。将剩余的3.24kg溶液浓缩至423g。进一步浓缩266g的该溶液以获得浆料然后再溶解在无水乙醇(200mL)中。继续在减压下使用35-40℃水浴蒸发以获得最终的94.8g的乙醇溶液，其含有50.8g(53.6％w/w)的N1,N19-双((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂三十碳-23,25,27,29-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺，也已知为DiVA-PEG-DiVA，也已知为“DiVA”。通过NMR&QTOF表征。1H NMR(400MHz),δH：7.07(t,2H),7.01(t,2H),6.87-6.91(m,4.0H),6.20-6.24(m,10H),6.10-6.13(m,8H),5.79(s,2H),5.71(s,2H),4.4(q,2H),3.70(t,6H),3.55-3.65(m,～34H),3.59(t,6H),3.4(m,2H),3.25-3.33(m,10H),3.16(m,2H),2.44(t,4H),2.33(s,12H),1.97-2.01(m,12H),1.96(s,6H),1.7-1.9(m,12H),1.69(s,12H),1.5-1.65(m,12H),1.35-1.5(m,24H),1.01(s,24H)。QTOF MS ESI+：m/z 2128(M+H+)。
实施例23：DOPE-VA
制备(Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(DOPE-VA)
Figure BDA0001226144010000701
制备DOPE-VA：(Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯
Figure BDA0001226144010000711
向在-78℃搅拌的维甲酸(250mg，0.83毫摩尔)在二乙基醚中的溶液(20mL)通过针筒加入(二乙基氨基)三氟化硫(130μl，0.90毫摩尔)在冷醚(20mL)中的溶液。将反应混合物移出冷浴并在室温下继续搅拌2小时。最后，通过旋转蒸发去除溶剂。在固体Na2CO3(50mg)存在下将残余物再溶解于氯仿(50mL)中。向该溶液中加入1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(600mg，0.81毫摩尔)并在室温下搅拌该反应混合物另外24小时。通过旋转蒸发去除溶剂。通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化残余物获得Z)-(2R)-3-(((2-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)乙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)丙烷-1,2-二基二油酸酯(240mg，28％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)0.87(t,6H,CH3),1.01(s,6H,CH3)1.20-1.40(m,40H,CH2),1.40-1.60(m,8H,CH2),1.70(s,3H,CH3-C＝C),1.80-2.10(m,8H),2.32(m,4H,CH2C(＝O)),3.50(m,2H),3.92-4.18(m,5H),4.35(m,2H),5.20(m,1H,NHC(＝O)),5.31(m,4H,CH＝CH),5.80-6.90(m,6H,CH＝CH)。
实施例24：DC-VA
制备(((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰基(tetraenoyl))氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(DC-VA)
Figure BDA0001226144010000712
制备DC-VA：(((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯
Figure BDA0001226144010000721
向在-78℃搅拌的维甲酸(600mg，2.0毫摩尔)的二乙醚(25mL)溶液中通过针筒加入(二乙基氨基)三氟化硫(0.3ml，2.1毫摩尔)在5mL的冷醚中的溶液。将该反应混合物移出冷浴，在室温下继续搅拌另外1小时。通过旋转蒸发将溶剂去除之后，在2固体Na2CO3(25mg)的存在下将残余物再次溶解于二氯甲烷(20mL)中。向该溶液中加入氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(1.05g，2.0毫摩尔)，并在室温下搅拌该反应混合物另外24小时。用二氯甲烷(50mL)稀释反应混合物并用MgSO4干燥。通过旋转蒸发去除溶剂后，通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化残余物以获得(((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰基)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(800mg，50％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)0.87(t,6H,CH3),1.02(s,6H,CH3)1.20-1.40(m,40H,CH2),1.40-1.60(m,8H,CH2),1.70(s,3H,CH3-C＝C),1.97(s,3H,CH3-C＝C),2.05(m,2H,CH2),2.15(s,3H,CH3-C＝C),2.32(m,4H,CH2C(＝O)),3.67(m,4H,NCH2CH2O),4.15-4.30(m,4H,NCH2CH2O),5.80-6.90(m,6H,CH＝CH)。
实施例25：DC-6-VA
制备((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)己酰)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(DC-6-VA)
Figure BDA0001226144010000722
制备中间体1：((6-氨基己酰)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯TFA盐
Figure BDA0001226144010000731
将氮烷二基双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯(2.5g，4.8毫摩尔)、Boc-氨基己酸(1.3g，5.6毫摩尔)、N,N’-二环己基碳二亚胺(1.3g，6.3毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(2.6mL，0.015毫摩尔)的混合物溶解在吡啶(40mL)中。在60℃过夜搅拌该溶液。用二氯甲烷(50mL)稀释该混合物并用盐水(3x50mL)清洗。用旋转蒸发浓缩之后，用三氟乙酸/二氯甲烷(100mL,1:1)处理残余物。浓缩混合物并再溶解于二氯甲烷(50mL)中，并用盐水(3x50mL)清洗。分离有机层并浓缩以获得((6-氨基己酰)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯TFA盐(1.5g，33％)。
制备DC-6-VA：((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)己酰)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)
Figure BDA0001226144010000732
向在-78°搅拌的维甲酸(800mg，2.67毫摩尔)在二乙醚(40mL)的溶液中通过针筒加入(二乙基氨基)三氟化硫(0.4mL，22.80毫摩尔)在冷醚(7mL)中的溶液。将该反应混合物移出冷浴，在室温下继续搅拌另外1小时。通过旋转蒸发将溶剂去除之后，在固体Na2CO3(40mg)的存在下将残余物再次溶解于二氯甲烷(25mL)中。向该溶液中加入((6-氨基己酰)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)双十四烷酸酯TFA盐(1.5g，1.6毫摩尔)，并在室温下搅拌该反应混合物另外24小时。用二氯甲烷(50mL)稀释反应混合物并用MgSO4干燥。通过旋转蒸发去除溶剂后，通过用5％甲醇/二氯甲烷作为洗脱剂的柱层析纯化残余物以获得((6-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)己酰)氮烷二基)双(乙烷-2,1-二基)(360mg，24％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)0.87(t,6H,CH3),1.02(s,6H,CH3)1.20-1.40(m,42H,CH2),1.40-1.60(m,12H,CH2),1.70(s,3H,CH3-C＝C),1.97(s,3H,CH3-C＝C),2.05(m,2H,CH2),2.15(s,3H,CH3-C＝C),2.32(m,6H,CH2C(＝O)),3.20(m,2H,CH2NHC(＝O)),3.56(m,4H,NCH2CH2O),4.15-4.30(m,4H,NCH2CH2O),5.10(m,1H),5.80-6.90(m,6H,CH＝CH)。
实施例26：合成satDiVA
制备N1,N19-双((16S)-16-(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺(satDIVA).
Figure BDA0001226144010000741
制备中间体1：3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酸
Figure BDA0001226144010000742
将全反式维甲酸(2000mg，6.66毫摩尔)与超声处理的酸(the aid ofsonication)溶解在己烷/IPA(3:1，40mL)中。将材料放入帕尔摇动瓶并用惰性气体冲洗。加入10％的Pd/C(200mg)并再次用惰性气体冲洗该管。将材料放在Parr-摇动器上过夜，含有>70psi的氢气。然后通过硅藻土垫过滤该反应混合物并浓缩以获得3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酸(2g)。
制备satDIVA：N1,N19-双((16S)-16-(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺
Figure BDA0001226144010000751
以与diva-PEG-diVA相似的方式从上述的N1,N19-双((S)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂二十基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺制备N1,N19-双((16S)-16-(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺，也称作satDIVA，用3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酸替换全反式维甲酸。QTOF MS ESI+：m/z 2161,2163,2165&2167(M+H+)。
实施例27：合成simDiVA
制备N1,N19-双((S)-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-16-(9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酰氨基)-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺(simDiVA).
Figure BDA0001226144010000752
制备中间体1：2，6，6-三甲基环己-1-烯-1-基三氟甲磺酸酯
Figure BDA0001226144010000753
在氮气下-78℃向2,2,6-三甲基环己酮在THF中的溶液滴加2M二异丙酰胺锂溶液。在-78℃搅拌该混合物3h。然后滴加N-苯基-双(三氟甲磺酰亚胺)在THF中的溶液(在-78℃)。在干冰中包裹反应烧瓶并过夜搅拌。在室温下继续搅拌3小时，在该时间下所有材料溶解。浓缩反应混合物，并在剧烈搅拌下将残余物缓慢加至己烷(350mL)。过滤去除固体材料并用己烷(2x50mL)清洗。浓缩滤液并加入更多己烷(150mL)。过滤去除固体材料并浓缩滤液。再重复所述沉淀一次，之后通过闪式色谱(硅胶，己烷)纯化残余物以获得作为无色油(23.2g，60％产率)的2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基三氟甲磺酸酯。
制备中间体2：9-(溴锌)壬酸乙酯
Figure BDA0001226144010000761
氮气下在干反应管中装入锌粉末(3.70g，56.6毫摩尔)、碘(479mg，1.89毫摩尔)和干DMA(20mL)。在室温下搅拌该混合物直至碘颜色消失。加入乙基9-溴壬酸酯，在80℃搅拌该混合物4小时，然后在室温下过夜。(通过GCMS分析已水解的反应混合物确定锌插入反应完成)。不经进一步处理在随后的步骤中使用该反应混合物。GCMS m/z 186[M]+(壬酸乙酯)。
制备中间体3：9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酸乙酯
Figure BDA0001226144010000762
向反应管中氮气下在二甲基乙酰胺中的刚制备的乙基-9-(溴锌)壬酸酯(37.7毫摩尔)中加入2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基三氟甲磺酸酯(10.8g，39.6毫摩尔)，然后加入四(三氟化硫苯基膦)钯(0)(872mg，0.754毫摩尔)。密封该管并在95℃搅拌该混合物2小时。让反应混合物冷却然后倒入二乙醚(100mL)中。将上层到处，并用二乙醚(2x25mL)清洗下层两次。用饱和的NH4Cl和盐水清洗合并的醚层，干燥(MgSO4)并浓缩以获得粗材料(～12g)。通过闪式色谱(硅胶，0至1.5％EtOAc在己烷中)纯化该材料。在真空下搅拌所得的油8小时以去除大部分副产物壬酸乙酯，然后通过第二闪式色谱(硅胶，0至15％的甲苯在己烷中)纯化。由LCMS和GCMS分析级分。收集最纯的级分并在25℃以下的温度下浓缩以获得作为无色油(6.16g，两步产率为53％)的乙基9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酸酯。LCMS ESI+m/z 309[M+H]+；GCMS m/z 308[M]+。
制备中间体4：9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酸
Figure BDA0001226144010000771
向在乙醇(80mL)中的乙基9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酸酯(13.2g，42.9毫摩尔)加入4M KOH(43mL)。在室温下搅拌混合物1.5小时。加入水(350mL)并将溶液用叔丁基甲基醚(2x100mL)清洗。将水相SimVA冷却，用4M HCl(～45mL)酸化，并用戊烷(3x100mL)萃取。用水(200mL)清洗合并的戊烷萃取液，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩并在高真空下干燥。将该材料再溶解于戊烷(100mL)中，浓缩并在高真空下再干燥一次以获得作为无色油(11.1g，92％产率)的9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酸。MS ESI-m/z 279[M-H]-。
制备simdiVA：N1,N19-双((S)-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-16-(9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酰氨基)-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺。
Figure BDA0001226144010000772
从前述的N1,N19-双((S)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂二十基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺可以与diVA相似的方式制备simDIVA，将全反式维甲酸替换为9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)壬酸。QTOF MS ESI+：m/z 2050(M+H+)
实施例28：合成DiVA-PEG18
制备(2E,2'E,2”E,4E,4'E,4”E,6E,6'E,6”E,8E,8'E,8”E)-N,N',N”-((5R,69R,76E,78E,80E,82E)-77,81-二甲基-6,68,75-三氧代-83-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64-十九氧杂-7,67,74-三氮杂三氟化硫八十-76,78,80,82-四烯-1,5,69-三基)三(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)(DIVA-PEG18).
Figure BDA0001226144010000781
以与diVA类似的方式制备(2E,2'E,2”E,4E,4'E,4”E,6E,6'E,6”E,8E,8'E,8”E)-N,N',N”-((5R,69R,76E,78E,80E,82E)-77,81-二甲基-6,68,75-三氧代-83-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64-十九氧杂-7,67,74-三氮杂三氟化硫八十-76,78,80,82-四烯-1,5,69-三基)三(3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)，也已知为DIVA-PEG18，将PEG18二胺替换为二酰氨基-dPEG11-二胺。LCMS ESI+：m/z 2305(M+Na)。
实施例29：合成TriVA
制备TriVA
Figure BDA0001226144010000782
不能生成此结构的名称
制备中间体1：(S)-甲基-6-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-((S)-2,6-双(((苄氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸酯
Figure BDA0001226144010000783
用惰性气体吹扫烧瓶，并将H-Lys(Z)-OMe的HCl盐(4g，12.1mmol)、HOBt水合物(1.84g，13.6毫摩尔)、Z-Lys(Z)-OH(5.64g，13.6mmol)悬浮在二氯甲烷(50mL)中。将NMM(1.5mL，13.6mmol)加至该悬浮液中，该溶液变得澄清。在10分钟的时间里加入EDC HCl盐(4.01g，20.9毫摩尔)和NMM(2.0mL，18.2毫摩尔)在二氯甲烷(50mL)中的悬浮液。室温下过夜搅拌该反应，然后用1M HCl(100mL)、H2O(100mL)、饱和的碳酸氢盐溶液(100mL)和饱和的盐溶液(100mL)清洗。用二氯甲烷(50mL)反萃取所有水相。用Na2SO4干燥有机物、过滤并浓缩。通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化材料以获得(S)-甲基6-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-((S)-2,6-双(((苄氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸酯(6.91g)。
制备中间体2：(S)-6-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-((S)-2,6-双(((苄氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸
Figure BDA0001226144010000791
将6-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-((S)-2,6-双(((苄氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸酯(6.91g，10mmol)用甲醇(50mL)溶解。加入KOH(2.24g，40mmol)并让混合物在35℃搅拌。2小时后，通过加入H2O(200mL)淬灭反应并用二乙醚(50mL)清洗混合物。然后，用1M的HCl酸调整pH至～2。用二氯甲烷(3x100mL)萃取产物，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩以获得(S)-6-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-((S)-2,6-双(((苄氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸(4g)。
制备中间体3：(Cbz)6-保护的N1,N19-双((16S,19S)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧杂-14,17-二氮杂二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺
Figure BDA0001226144010000801
用惰性气体冲洗圆底烧瓶，并将二酰氨基-dPEG11-二胺(1g，1.35mmol)、(S)-6-(((苄氧基)羰基)氨基)-2-((S)-2,6-双(((苄氧基)羰基)氨基)己酰氨基)己酸(2.05g，3.03毫摩尔)、HOBt水合物(409mg，3.03mmol)悬浮在二氯甲烷(25mL)中。将NMM(333uL，3.03毫摩尔)加入悬浮液中，溶液变得澄清。在10分钟的时间内将EDC HCl盐(893mg，4.66毫摩尔)和NMM(445uL，4.05毫摩尔)在二氯甲烷(25mL)中的悬浮液加入。让反应在室温下过夜搅拌，然后用1M HCl(100mL)、H2O(100mL)、饱和的碳酸氢盐溶液(100mL)和饱和的盐溶液(100mL)清洗。将所有水相洗液用二氯甲烷(50mL)反萃取。用Na2SO4干燥有机物，过滤并浓缩。通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化材料以获得(Cbz)6-保护的N1,N19-双((16S,19S)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧杂-14,17-二氮杂二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺(480mg)。
制备中间体4：N1,N19-双((16S,19S)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧杂-14,17-二氮杂二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺
Figure BDA0001226144010000811
在圆底烧瓶中将(Cbz)6-保护的N1,N19-双((16S,19S)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧杂-14,17-二氮杂二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺溶解于甲醇(30mL)中并用惰性气体冲洗。加入10％Pd/C(135mg)并再次用惰性气体冲洗该烧瓶，然后通过真空泵去除所有空气。加上8”H2气球，并让反应在室温下搅拌。2小时后，由通过硅藻土用甲醇清洗的过滤移除Pd/C，并浓缩以获得N1,N19-双((16S,19S)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧杂-14,17-二氮杂二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺(823mg)。
制备TriVA
Figure BDA0001226144010000812
在二氯甲烷中搅拌N1,N19-双((16S,19S)-19,23-二氨基-16-(4-氨基丁基)-15,18-二氧代-4,7,10-三氧杂-14,17-二氮杂二十三烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺，并加入DMAP和维甲酸。加入NMM并在室温下和惰性气体冲洗的铝箔覆盖的圆底烧瓶中搅拌该溶液。在10分钟时间内将EDC HCl盐&NMM在二氯甲烷(20mL)中的悬浮液缓慢加入。在室温下过夜搅拌反应。第二天，用二氯甲烷稀释至100mL。用H2O(100mL)、饱和的碳酸氢盐溶液(100mL)和饱和的盐溶液(100mL)清洗。将所有水相洗液用二氯甲烷(50mL)反萃取。用Na2SO4干燥有机物，过滤并浓缩。用二氯甲烷/乙醇梯度洗脱的碱性氧化铝色谱纯化材料以获得TriVA(780mg)。LCMS ESI+：m/z 2972(M+Na)。
实施例30：合成4TTNPB
制备N1,N19-双((R)-1,8-二氧代-7-(4-((E)-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢-萘-2-基)丙-1-烯-1-基)苯甲酰氨基)-1-(4-((E)-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)丙-1-烯-1-基)苯基)-13,16,19-三氧杂-2,9-二氮杂二十二烷-22-基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺(4TTNPB).
Figure BDA0001226144010000821
以与N1,N19-双((S,23E,25E,27E,29E)-16-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环-己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-24,28-二甲基-15,22-二氧代-30-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂三十碳-23,25,27,29-四烯-1-基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺(也称为diVA)类似的方式，从N1,N19-双((S)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂二十基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺制备N1,N19-双((R)-1,8-二氧代-7-(4-((E)-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢-萘-2-基)丙-1-烯-1-基)苯甲酰氨基)-1-(4-((E)-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)丙-1-烯-1-基)苯基)-13,16,19-三氧杂-2,9-二氮杂二十二烷-22-基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺，也称作4TTNPB，用TTNPB替换全反式维甲酸。LCMS ESI+：m/z 2343(M+Na)。
实施例31：合成4Myr
制备N1,N19-双((R)-15,22-二氧代-16-十四烷酰氨基-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂五碳-三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺(4Myr).
Figure BDA0001226144010000831
制备4Myr：N1,N19-双((R)-15,22-二氧代-16-十四烷酰氨基-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂-五碳-三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺
Figure BDA0001226144010000832
将N1,N19-双((S)-16,20-二氨基-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂二十基)-4,7,10,13,16-五碳氧杂十九烷-1,19-二酰胺(上述合成)溶解在二氯甲烷中并置于冰浴中。加入肉豆蔻酰氯而后三乙胺。移去冰浴并让反应在室温下惰性气体层下过夜搅拌。第二天，用二氯甲烷稀释至100mL，并用1M HCl(75mL)、H2O(75mL)、饱和的碳酸氢盐溶液(75mL)和饱和的盐溶液(75mL)清洗。用二氯甲烷(25mL)反萃取所有的水相洗液。用MgSO4干燥有机物，过滤并浓缩。通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱的纯化获得N1,N19-双((R)-15,22-二氧代-16-十四烷酰氨基-4,7,10-三氧杂-14,21-二氮杂-五碳-三十烷基)-4,7,10,13,16-五氧杂十九烷-1,19-二酰胺(410mg)。LCMS ESI+：m/z 1841(M+H)。
实施例32：合成DiVA-242
制备N1,N16-双((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基-环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-19,23-二甲基-10,17-二氧代-25-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-3,6-二氧杂-9,16-二氮杂二十五碳-18,20,22,24-四烯-1-基)-4,7,10,13-四氧杂十六烷-1,16-二酰胺，也称为DIVA-242
Figure BDA0001226144010000841
制备中间体1：二-叔丁基(10,25-二氧代-3,6,13,16,19,22,29,32-八氧杂-9,26-二氮杂三十四烷-1,34-二基)二氨基甲酸酯
Figure BDA0001226144010000842
用惰性气体冲洗含有二氯甲烷(25mL)的圆底烧瓶，并加入双dPeg4酸(1000mg，3.40毫摩尔)、N-Boc-3,6-二氧杂-1,8-辛烷二胺(1816uL，7.65毫摩尔)和HOBt水合物(1034mg，7.65毫摩尔)。将NMM(841uL，7.65毫摩尔)加入悬浮液中，溶液变得澄清。加入EDCHCl盐(2249mg，11.7毫摩尔)&NMM(1121uL，10.2毫摩尔)在二氯甲烷(25mL)中的溶液，而后DMAP(62mg，0.51毫摩尔)。让反应在室温下过夜搅拌。然后用二氯甲烷稀释至100mL并用H2O(100mL)，10％K2CO3(100mL)和饱和的盐溶液(100mL)清洗，用二氯甲烷(30mL)反萃取所有水相洗液，用MgSO4干燥，过滤并浓缩。通过用二氯甲烷/甲醇梯度的硅胶色谱纯化获得二-叔丁基(10,25-二氧代-3,6,13,16,19,22,29,32-八氧杂-9,26-二氮杂三十四烷-1,34-二基)二氨基甲酸酯(2.57g)。
制备中间体2：N1,N16-双(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4,7,10,13-四氧杂十六烷-1,16-二酰胺TFA盐
Figure BDA0001226144010000843
将二-叔丁基(10,25-二氧代-3,6,13,16,19,22,29,32-八氧杂-9,26-二氮杂三十四烷-1,34-二基)二氨基甲酸酯溶解在二氯甲烷(15mL)中，并放入冰浴中。用惰性气体冲洗该圆底烧瓶并加入TFA(15mL)。让混合物搅拌20分钟。然后浓缩该反应混合物以获得N1,N16-双(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4,7,10,13-四氧杂十六烷-1,16-二酰胺TFA盐(1885mg)。
制备DIVA-242：N1,N16-双((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-19,23-二甲基-10,17-二氧代-25-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-3,6-二氧杂-9,16-二氮杂二十五碳-18,20,22,24-四烯-1-基)-4,7,10,13-四氧杂十六烷-1,16-二酰胺
Figure BDA0001226144010000851
以与diVA相同的方案从N1,N16-双(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4,7,10,13-四氧杂十六烷-1,16-二酰胺TFA盐合成N1,N16-双((R,18E,20E,22E,24E)-11-((2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)九碳-2,4,6,8-四烯酰氨基)-19,23-二甲基-10,17-二氧代-25-(2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-3,6-二氧杂-9,16-二氮杂二十五碳-18,20,22,24-四烯-1-基)-4,7,10,13-四氧杂十六烷-1,16-二酰胺(DIVA-242)。LCMS ESI+：m/z 1940(M+H)。
实施例33：核酸-脂质颗粒的形成
在配方方案中的siRNA指具有定向HSP47/gp46的21-mer的双链siRNA序列，其中HSP47(小鼠)和gp46(大鼠)是同源的-不同物种的同一基因：
用于体外测验的大鼠HSP47-C双链siRNA(大鼠pHSCs)
正义(5'->3')GGACAGGCCUCUACAACUATT(SEQ.ID NO.2)
反义(3'->5')TTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU(SEQ.ID NO.3)
用于体内测验的制剂内的小鼠HSP47-C双链siRNA(小鼠CCl4模型)
正义(5'->3')GGACAGGCCUGUACAACUATT(SEQ.ID NO.4)
反义(3'->5')TTCCUGUCCGGACAUGUUGAU(SEQ.ID NO.5)
阳离子脂质原液制备。通过将在乙醇中的浓度分别为6.0、5.1和2.7和2.4mg/mL的阳离子脂质、DOPE、胆固醇、和diVA-PEG-diVA合并制备阳离子脂质贮存液。如果需要，将溶液温热至50℃以促进阳离子脂质溶解在溶液中。
空脂质体的制备。将阳离子脂质贮存液在35-40℃通过注射针在每注射口上以1.5mL/min注射入快速搅拌的水相混合物中。将阳离子脂质贮存液对水相溶液的比例(v/v)定在35:65。混合时，自然形成空的囊泡。然后在乙醇含量降至～12％之前让所得的囊泡在35-40℃平衡10分钟。然后将空的脂质体对10X体积的水相缓冲液渗滤以去除乙醇。
脂复合物的制备。用9％的蔗糖将根据上述方法制备的空的囊泡稀释至使得阳离子脂质的浓度为1mM的终体积。向搅拌的溶液每mL稀释的空囊泡中(“EV”)加入100μL在无RNA酶水中的5％葡萄糖并混合均匀。然后一次加入150μL在无RNA酶水中的10mg/mL的siRNA溶液并混合均匀。然后用5％葡萄糖溶液稀释混合物，每mL使用的EV用1.750mL。在室温下以200rpm搅拌混合物10分钟。在使用适当选择的蠕动泵(例如Midgee Hoop，UFP-100-H24LA)的交叉流超滤系统中使用具有～100000MWCO的半渗透膜，将该混合物浓缩至初始体积(或所需体积)的约1/3，然后相对5倍于样品体积的含有3％蔗糖和2.9％葡萄糖的水溶液进行渗滤。然后将产物通过用前是无菌条件下的0.8/0.2微米孔径的滤器的组合过滤。
含非-diVA siRNA的脂质体的形成。以50:10:38:2的摩尔比例将阳离子脂质、DOPE、胆固醇、和PEG-偶联的脂质溶解在无水乙醇(200标准强度)中。在50mM柠檬酸盐缓冲液中溶解siRNA并将温度调至35-40℃。然后在搅拌时将乙醇/脂质混合物加至含siRNA的缓冲液中以自发形成装载了siRNA的脂质体。将脂质与siRNA组合以达到最终脂质比siRNA的比例为15:1(重量：重量)。范围可以是5:1至15:1，优选地7:1至15:1。将装载了siRNA的脂质体相对10X体积的PBS(pH 7.2)渗滤以去除乙醇并交换缓冲液。将终产品过滤通过0.22μm无菌级别的PES滤器以减少生物负荷(bioburden)。该方法获得具有平均粒径为50-100nm的脂质体，其具有PDI<0.2和>85％的包载效率。
含siRNA的与diVA共溶的脂质体的形成。使用上述方法制备siRNA-diVA-脂质体制剂。在加至含siRNA的缓冲液之前，将DiVA-PEG-diVA与其它脂质(50:10:38:2比例的阳离子脂质、DOPE、胆固醇、和PEG-偶联的脂质)共溶于无水乙醇中。diVA-PEG-diVA的摩尔含量范围是0.1至5摩尔比例(50:10:38:2:0.1至50:10:38:2:5)。该方法获得具有平均粒径为50-100nm的脂质体，其具有PDI<0.2和>85％的包载效率。
用阳离子脂质的含siRNA的脂质体的形成。使用上述方法制备siRNA-diVA-脂质体制剂和siRNA-脂质体制剂。阳离子脂质可以是，例如，HEDC、HEDODC、DC-6-14、或这些阳离子脂质的任何组合。
用diVA装饰的含siRNA的脂质体的形成。使用上述方法制备siRNA-脂质体制剂，并稀释至siRNA在PBS中的浓度为0.5mg/mL。阳离子脂质可以是HEDC、HEDODC、DC-6-14、或这些阳离子脂质的任意组合。将diVA-PEG-diVA溶解在无水乙醇(200标准强度)至10至50mg/mL的终浓度。将适量乙醇溶液加至siRNA-脂质体溶液以获得最终的摩尔百分比在2至10摩尔％之间。用吸液管将溶液上下吸以混合。调整diVA-PEG-diVA浓度和添加乙醇的体积以保持添加体积>1.0μL，并且最终的乙醇浓度<3％(体积/体积)。然后在体外或体内评价之前，在环境温度下在定轨摇床上将装饰的脂质体轻柔地摇动1小时。
下表阐明本发明优选的实施方式，其表示为摩尔比例、以及相当的摩尔％和重量百分比。
Figure BDA0001226144010000871
Figure BDA0001226144010000872
Figure BDA0001226144010000873
Figure BDA0001226144010000881
实施例34：使用脂质体的制剂的转染
对于LX-2和pHSC的转染方法相同。将本发明脂质体制剂或脂复合物制剂以所需的浓度与生长培养基混合。将100μl的该混合物加至96孔板的孔中，并在培养箱中37℃和5％的CO2下培育细胞30分钟。30分钟之后，用新鲜的生长培养基更换培养基。48小时的转染之后，使用
Figure BDA0001226144010000882
溶菌试剂(Applied Biosystems)根据生产者的说明书处理细胞。
定量RT-PCR测量HSP47 mRNA的表达(qRT-PCR)：从Applied Biosystems购买HSP47和GAPDH
Figure BDA0001226144010000886
测验和一步RT-PCR预混。各PCR反应包含以下成分：一步RT-PCR混合物5μl、
Figure BDA0001226144010000883
RT酶混合物0.25μl、
Figure BDA0001226144010000884
基因表达测验探针(HSP47)0.25μl、
Figure BDA0001226144010000885
基因表达测验探针(GAPDH)0.5μl、无RNA酶水3.25μl、细胞溶解产物0.75μl，总体积10μl。GAPDH用作HSP47 mRNA水平的相对定量的内源控制。在使用内置的相对定量方法的ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosciences)中进行定量RT-PCR。将所有值标准化为模拟转染的细胞的平均HSP47表达，并表达为HSP47表达与模拟的相比的百分比。
体内试验：体重范围为24-30克的雌性C57Bl/6退役的育种者小鼠(CharlesRiver)用于该研究。动物被随机地(重量)分布为10组，每组10个动物。如必要由Bio-Quant’s IACUC和/或主治兽医核准所有动物程序，并且所有动物健康问题得到解决和记录。用异氟烷将小鼠麻醉，并通过下腔静脉放血。
通过每两天一次共7天(第0、2、4、6天)的腹膜内注射CCl4(CCl4在橄榄油中，1:7(体积/体积)，每克体重1μL)诱导热激蛋白47(HSP47)的增量调节。第3天，用本发明的脂质体或脂复合物制剂或PBS通过IV注射入尾静脉对小鼠进行连续4天(第3、4、5、6)的处理。一组的10只小鼠(首次用于实验的)既不接受CCl4处理也不接受IV注射，作为正常HSP47基因表达的对照组。
实验时间安排
Figure BDA0001226144010000891
在第7天和最终的IV注射之后大约24小时，杀死所有剩余的小鼠，并在收集肝样品用于PCR分析之前用PBS灌注肝。收集来自各小鼠肝的约150mg样品并放入1.5mL的RNAlater稳定试剂(Qiagen)中并保存在2-8℃直至分析时。不从透明的(clear)和标记肝损伤和/或坏死的区域收集肝样品。
使用RNeasy柱(Qiagen)根据生产者的规程，从小鼠肝提取总RNA。将20ng的总RNA用于定量RT-PCR以测量HSP47表达。HSP47和GAPDH
Figure BDA0001226144010000894
测验以及一步RT-PCR预混购买自Applied Biosystems。各PCR反应包含以下成分：一步RT-PCR混合物5μl、
Figure BDA0001226144010000895
RT酶混合物0.25μl、
Figure BDA0001226144010000896
基因表达测验探针(HSP47)0.25μl、
Figure BDA0001226144010000893
基因表达测验探针(GAPDH)0.5μl、无RNA酶水3.25μl、RNA 0.75μl，总体积10μl。GAPDH用作HSP47 mRNA水平的相对定量的内源控制。在使用内置的相对定量方法的ViiA 7实时PCR系统(AppliedBiosciences)中进行定量RT-PCR。将所有值标准化为首次用于实验的动物组的平均HSP47表达，并表达为与首次用于实验的组相比的HSP47表达的百分比。
在图1中描述的制剂如下：
Figure BDA0001226144010000892
*VA-PEG-VA和diVA-PEG-diVA是通过共溶加入。VA通过过程后装饰加入的。
在图2中描述的制剂如下：
Figure BDA0001226144010000901
*diVA-PEG-diVA是通过共溶加入。VA通过过程后装饰加入的。
在图3中描述的制剂如下。
Figure BDA0001226144010000902
*diVA-PEG-diVA是通过共溶加入。VA通过过程后装饰加入的。
实施例35：体外功效(pHSC)–剂量反应
pHSC体外测验描述:
在96孔板中将初级肝星形细胞(pHSC)与具有增大浓度的siRNA制剂(HEDC:S104:DOPE:Chol:Peg-DMPE:DiVA，20:20:30:25:5:2)一起培育。30分钟后，清洗细胞并用新鲜的生长培养基处理并在37℃培育48小时。那时，溶解细胞，并通过定量RT-PCR
Figure BDA0001226144010000912
测验测量gp46和GAPDH mRNA水平。将gp46的mRNA水平标准化至GAPDH水平。标准化的gp46水平表达为未处理的对照细胞的百分比。图4显示了结果。误差棒表示标准方差(n＝3)。使用Graphpad将数据拟合为S型剂量反应曲线获得EC50为11.8nM。
实施例36：毒性
HepG2细胞毒性测验描述：
HepG2细胞是衍生自人肝细胞癌的黏着细胞系，将其培养在10％FBS(Hyclone，Logan，Utah Cat#SH30910)补充的MEM/EBSS(Hyclone，Logan，Utah，Cat#SH30024.01)中。将HepG2细胞以5000细胞/孔的密度接种于96孔Optilux黑色板(BD Falcon，Cat#BD353220)中过夜。将制剂加入每孔中以最终显示siRNA浓度(n＝3)。制剂添加后48小时，用CellTiter-Glo细胞活力荧光测验试剂盒(Promega，Cat#G7572)根据生产者的说明书测定细胞活力。在清晰度发光酶标仪(502-Biotek，Winooski，Vermont)上测量化学发光信号。基于化学发光信号的百分比计算活力。基于相对模拟处理的孔标准化的制剂处理的孔的化学发光信号的百分比计算活力。
用本发明人的最有效的式I的季胺阳离子脂质研究制剂，本发明人评价了式I的季胺阳离子脂质与它们各自的可离子化的合成前体的组合(如以下实施例所示，i-DC和HEDC、INT4和DODC，S104和HES104)。
Figure BDA0001226144010000911
下表提供来自不同制剂的示例性结果。季胺阳离子脂质和可离子化的阳离子脂质的组合令人惊奇地并出乎意料地比含单个阳离子脂质的脂质体无毒(见下表中实施例HEDC比HEDC+iDC；和DODC比DODC+INT4)。HEDC+S104组合被确认为另一优选的配方。
Figure BDA0001226144010000921
体内毒性
在初步体内毒性研究中，HEDC:S104(20:20)制剂特别耐受。当以高至25mg/kg(大鼠)和12mg/kg(猴子)的剂量进行静脉注射时，没有观察到毒性。这在该领域被认为是优良的。例如，Alnylam Pharmaceuticals在2012年3月1号在AsiaTIDES会议上公开了他们的最小毒性的第三代脂质纳米颗粒具有10mg/kg的NOAEL(单剂量，大鼠)。
实施例37：体内功效(大鼠DMNQ)
在短期肝损伤模型(称作Quick模型，DMNQ)中评价目标制剂的体内活性。在该模型中，短期肝损伤是由用肝毒剂例如二甲基亚硝胺(DMN)的处理引发，并伴随着gp46 mRNA水平的上升。为了引发这些变化，用DMN对雄性Sprague-Dawley大鼠进行连续6天腹膜注射。在DMN治疗期间的最后，基于个体动物体重将动物随机分组。并在DMN的最后一次注射之后一小时，将制剂作为单一的静脉剂量给药。二十四小时之后，切除肝叶并通过定量RT-PCR
Figure BDA0001226144010000931
测验确定gp46和MRPL19的mRNA二者的水平。将gp46 mRNA的水平标准化为MRPL19的水平。
在第4、5、6天用10mg/kg的DMN以1、2、3和5mg/kg通过腹膜给药处理雄性Sprague-Dawley大鼠以引发肝损伤。最后一次注射DMN之后一个小时，用0.5、0.75、1.0、和2mg/kg的siRNA剂量的包含HEDC:S104:DOPE:Chol:Peg-DMPE:DiVA(20:20:30:25:5:2)的制剂，或PBS(载体)对动物(n＝8/组)进行静脉注射。24小时之后，从来自各动物的右肝叶的部分纯化总siRNA并储存在4℃直至RNA分离。对照组包含PBS载体组(DMN-处理的)和首次用于实验的(未处理的；无DMN)组。图5显示了测量结果。减去从首次用于实验的组确定的背景gp46mRNA水平之后，将所有测试组的值标准化至载体组的平均gp46 mRNA(表达为载体组的百分比)。处理后的平均gp46 mRNA水平显示剂量依赖反应并拟合曲线成S型剂量反应曲线，得到0.79mg/kg的EC50。
实施例38：体内功效(大鼠DMNC)
用DMN通过腹膜给药处理雄性Sprague Dawley大鼠(130-160g)以引发肝纤维化。DMN处理方案是前三周以10mg/kg(即，以5.0mg/mL DMN和2.0mL/kg体重的剂量)每周3次(星期一、星期三和星期五)，和从第22天至57天以一半的5mg/kg剂量(即，以5.0mg/mL DMN和1.0mL/kg体重的剂量)。使用相同的时间表用PBS(DMN的溶剂)注射假组动物(sham groupanimal)。第22天，在最后的DMN处理之后24小时收集血液样品并测验肝疾病生物标记以确认DMN处理的有效性。基于体重将DMN处理的动物分配到不同的处理组中，并确保各组中动物的平均体重和体重范围没有明显区别。在第25天将来自预处理组的动物杀死，来评价治疗开始之前疾病的发展阶段。在第25天开始用含有gp46 siRNA的制剂的治疗，以特定的siRNA剂量进行每周两次的治疗，共10次。在第59天，最后一次制剂治疗之后48小时和最后的DMN处理之后的72小时，通过CO2吸入杀死动物。切除肝叶并通过定量RT-PCR
Figure BDA0001226144010000942
测验确定gp46和MRPL19 mRNA二者的水平。将gp46的mRNA水平标准化为MRPL19水平。
以10mg/kg的DMN(每周3次)然后从第22天至57天以5mg/kg(即，以5.0mg/mL DMN和1.0mL/kg体重的剂量)通过腹膜注射给药处理雄性Sprague-Dawley大鼠以诱发肝纤维化。最后一次注射DMN之后一个小时，用1.5、1.0、0.75、和0.5mg/kg的siRNA的包含HEDC:S104:DOPE:Chol:Peg-DMPE:DiVA(20:20:30:25:5:2)的制剂，或PBS(载体)对动物(n＝10/组)进行静脉注射,10次(每周2次)。在第59天，从来自各动物的右肝叶的部分纯化总siRNA并储存在4℃直至RNA的分离。对照组包含PBS载体组(DMN-引发的，PBS处理的，n＝7)和假组(在DMN和制剂位置用PBS处理；n＝10)组。图6显示测量结果。减去从首次用于实验的组确定的背景gp46 mRNA水平之后，将所有测试组的值标准化至载体组的平均gp46 mRNA(表达为载体组的百分比)。在第25天将来自预处理组(n＝7)的动物杀死，来评价治疗开始之前疾病的发展阶段。单因素Anova分析及随后的Dunnett’s测试显示与载体组相比在所有治疗组中有明显的gp46基因敲除(***，P<0.001)。
下表总结了本文描述的化合物，以及在体内和体外测试这些化合物的结果。
Figure BDA0001226144010000941
Figure BDA0001226144010000951
实施例39：体内抗肺纤维化
将溶解在0.1mL盐水中的0.45mg博来霉素(BLM)通过麻醉下气管内的插套管(MicroSprayer，Penn-Century,Inc.)对雄性S-D大鼠(每组8大鼠，8周老，Charles RiverLaboratories Japan,Inc.)一次性给药进肺，以产生博来霉素肺纤维化模型。用该方法，一般在约2周后在肺里发生显著纤维化。在博来霉素给药后的2周开始，将脂质体制剂(1.5mg/kg作为siRNA的量，体积为1ml/kg，即，对200g的大鼠是200μl)或PBS(体积为1ml/kg)通过尾静脉给药至大鼠，总共10次(两天一次)。在最后一次治疗之后两天将大鼠杀死，对肺组织进行组织学研究(见图7)。单因素Anova分析和Bonferroni多对比测试用于评价统计学上显著的不同。
根据常规方法，将切除的肺的一部分进行福尔马林固定，并进行azan染色(偶氮卡红、苯胺蓝桔G溶液)。
图7中的组织学评分(T.Ashcroft score)结果显示，在制剂给药组(治疗)中，纤维化的分显著下降。
实施例40：在LX-2细胞系和大鼠初级肝星形细胞(pHSCs)中VA-siRNA-脂质体制剂的敲除功效的体外评价
在培养箱中37℃和5％的CO2下将LX2细胞(Dr.S.L.Friedman，Mount SinaiSchool of Medicine，NY)培养在补充了10％胎牛血清(Invitrogen)的DMEM(Invitrogen)中。在培养箱中，使用TryPLExpress溶液(Invitrogen)将细胞在37℃胰蛋白酶解3分钟。通过在血细胞计数器中计数细胞来测定细胞浓度，并接种3000细胞/孔入96孔板。在转染前让细胞生长24小时。
根据之前出版的方法(Nat.Biotechnol.2008,26(4):431-42)，从Sprague-Dawley大鼠分离大鼠初级肝星形细胞(pHSCs)。在补充了10％胎牛血清的DMEM中培养pHSC。在分离后用它们于体外筛查之前细胞生长至两个传代。在96孔板中以1000细胞/孔的细胞密度接种细胞并在用它们于转染之前让其生长48小时。
用VA-siRNA-脂质体制剂转染。对LX-2和pHSC细胞的转染方法是一样的。以所需的浓度将VA-siRNA-脂质体或VA-siRNA-脂复合物制剂与生长培养基混合。向96孔板的细胞中加入100μl的该混合物并在5％CO2的培养箱中于37℃培育细胞30分钟。30分钟后，用新鲜的生长培养基替换培养基。转染48小时后，根据生产者的说明书使用Cell-to-Ct溶解剂(Applied Biosystems)处理细胞。
定量(q)RT-PCR以测量HSP47 mRNA的表达。HSP47和GAPDH
Figure BDA0001226144010000971
测验以及一步RT-PCR预混购自Applied Biosystems。各PCR反应包含以下组分：一步RT-PCR混合物5μl，
Figure BDA0001226144010000973
RT酶混合物0.25μl，
Figure BDA0001226144010000972
基因表达测验探针(HSP47)0.25μl，
Figure BDA0001226144010000974
基因表达测验探针(GAPDH)0.5μl，无RNA酶水3.25μl，细胞溶解产物0.75μl，总体积10μl。GAPDH用作HSP47 mRNA水平的相对定量的内源控制。在使用内置的相对定量方法的ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosciences)中进行定量RT-PCR。将所有值标准化为模拟转染细胞的平均HSP47表达，并表达为与模拟转染细胞相比的HSP47表达的百分比。
涉及制剂方案的siRNA是具有21-聚体定向HSP47/gp46双链的siRNA序列，其中HSP47(小鼠)和gp46(大鼠)是同源的-在不同种类中的相同基因：
用于体外测验的大鼠HSP47-C双链siRNA(大鼠pHSCs)
正义(5'->3')GGACAGGCCUCUACAACUATT(SEQ.ID NO.1)
反义(3'->5')TTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU(SEQ.ID NO.2).
阳离子脂质贮存液制备。通过在乙醇中将阳离子脂质与DOPE、胆固醇、和diVA-PEG-DiVA分别以6.0、5.1和2.7和2.4mg/mL的浓度组合制备阳离子脂质的贮存液。如果需要，将溶液温热至约50℃以促进阳离子脂质溶出进溶液。
空脂质体的制备。将阳离子脂质贮存液在40±1℃通过注射针在每注射口上以1.5mL/min注射入快速搅拌的9％蔗糖的水相混合物中。将阳离子脂质贮存液对水相溶液的比例(v/v)定在35:65。混合时，自然形成空的囊泡。然后在乙醇含量降至～12％之前让所得的囊泡在40℃平衡10分钟。
脂复合物制备。用9％的蔗糖将根据上述方法制备的空的囊泡稀释至1mM浓度的阳离子脂质的终体积。向搅拌的溶液每mL稀释的空囊泡(“EV”)加入100μL在无RNA酶水中的5％葡萄糖并混合均匀。然后一次性加入150μL在无RNA酶水中的10mg/mL的siRNA溶液并混合均匀。然后用5％葡萄糖溶液稀释混合物，每mL的EV使用1.750mL。在室温下以200rpm搅拌混合物10分钟。在用适当选择的蠕动泵(例如Midgee Hoop，UFP-100-H24LA)的交叉流超滤系统中使用具有～100000MWCO的半渗透膜，将该混合物浓缩至初始体积(或所需体积)的约1/3，然后相对5倍于样品体积的含有3％蔗糖和2.9％葡萄糖的水溶液进行渗滤。然后用前将产物通过是无菌条件下的0.8/0.2微米孔径的滤器的组合过滤。
含非-diVA siRNA的脂质体的形成。以50:10:38:2的摩尔比例将阳离子脂质、DOPE、胆固醇、和PEG-偶联的脂质(例如，Peg-脂质)溶解在无水乙醇(200标准强度)中。在50mM柠檬酸盐缓冲液中溶解siRNA并将温度调至35-40℃。然后在搅拌时将乙醇/脂质混合物加至含siRNA的缓冲液中以自发形成装载了siRNA的脂质体。将脂质与siRNA组合以达到最终脂质比siRNA的比例为15:1(重量：重量)。范围可以是5:1至15:1，优选地7:1至15:1。将装载了siRNA的脂质体相对10X体积的PBS(pH 7.2)渗滤以去除乙醇并交换缓冲液。将终产品过滤通过0.22μm无菌级别的PES滤器以减少生物负荷(bioburden)。该方法获得具有平均粒径为50-100nm的脂质体，其具有PDI<0.2和>85％的包载效率。
含siRNA的与diVA共溶的脂质体的形成。使用上述方法制备siRNA-diVA-脂质体制剂。在加至含siRNA的缓冲液之前，将diVA-PEG-diVA与其它脂质(50:10:38:2比例的阳离子脂质、DOPE、胆固醇、和PEG-偶联的脂质)共溶于无水乙醇中。diVA-PEG-diVA的摩尔含量范围是0.1至5摩尔比例。该方法获得具有平均粒径为50-100nm的脂质体，其具有PDI<0.2和>85％的包载效率。
用阳离子脂质的含siRNA的脂质体的形成。使用上述方法制备siRNA-diVA-脂质体制剂和siRNA-脂质体制剂。阳离子脂质可以是，例如，DODC、HEDC、HEDODC、DC-6-14、或这些阳离子脂质的任何组合。将diVA-PEG-diVA溶解在无水乙醇(200标准强度)至10至50mg/mL的终浓度。将适量乙醇溶液加至siRNA-脂质体溶液以获得在2至10摩尔％之间的最终的摩尔百分比。用吸液管将溶液上下吸以混合。调整diVA-PEG-diVA浓度和添加乙醇的体积以保持添加体积>1.0μL，并且最终的乙醇浓度<3％(体积/体积)。然后在体外或体内评价之前，在环境温度下在定轨摇床上将装饰的脂质体轻柔地摇动1小时。
结果
图8显示了将VA-偶联物通过装饰加至脂质体提高了siRNA的敲除功效，增强了siRNA的活性。Peg-脂质。用于所有样品的剂量是867nM siRNA HSP47-C。结果显示在将VA-偶联物加入脂质体的每种情况下，与不含类视黄醇的脂质体相比并与用游离的(非偶联的)视黄醇装饰的脂质体相比，siRNA活性增强了。RNAiMAX是可商购的转染试剂。
图9显示通过共溶将VA-偶联物添加至脂质体提高了siRNA的敲除功效。这些是含DODC的通过共溶添加的VA-偶联物的脂质体。配方是50:10:38:2:X，其中X＝1至10(DODC:DOPE:胆固醇:PEG-脂质:VA-偶联物，摩尔比率)。在各情况下的浓度是100nM siRNA HSP47-C。结果显示通过共溶将VA-偶联物添加至脂质体增强siRNA的活性。
图10显示通过共溶将VA-偶联物添加至脂质体戏剧性地提高了siRNA的敲除功效。结果包含三种不同的脂质体，DC-6-14、DODC、HEDODC，其通过共溶添加VA-偶联物。对所有的配方是一样的50:10:38:2，阳离子脂质:DOPE:胆固醇:Peg-脂质，仅仅阳离子脂质变化。siRNA的浓度对所有的是一样的200nM的siRNA HSP47-C。结果显示当通过共溶制备时，在添加VA-偶联物至具有不同阳离子脂质的脂质体显著增强了siRNA活性。
图11显示通过共溶向具有DC-6-14阳离子脂质的脂复合物添加VA-偶联物和将脂质体的外部涂覆siRNA增强了siRNA的活性。配方是40％的脂复合物制剂，40:30:30，DC-6-14:DOPE:胆固醇。在各情况下的浓度是867nM siRNA HSP47-C。结果显示通过共溶将VA-偶联物添加至脂质体增强siRNA的活性。
图12显示通过共溶向脂复合物添加VA-偶联物与通过装饰添加的具有VA-偶联物的脂复合物的比较。这些结果来自DC-6-14和DODC脂复合物。该配方由40:30:30的DC-6-14:DOPE:胆固醇组成。在各样品中的浓度是867nM siRNA HSP47-C。相对于通过装饰添加的VA-偶联物，通过共溶的VA-偶联物添加显著提高体外的敲除功效。
实施例41：体内实验
使用重量范围为24-30克的雌性C57Bl/6退役的育种者小鼠(Charles River)。动物被随机地(重量)分布为10组，每组10个动物。如必要由Bio-Quant’s IACUC和/或主治兽医核准所有动物程序，并且所有动物健康问题得到解决和记录。用异氟烷将小鼠麻醉，并通过下腔静脉放血。
将小鼠HSP47-C双链siRNA用于体内测验的制剂中(小鼠CCl4模型)
正义(5'->3')GGACAGGCCUGUACAACUATT(SEQ.ID NO.3)
反义(3'->5')TTCCUGUCCGGACAUGUUGAU(SEQ.ID NO.4)
通过每两天一次共7天(第0、2、4、6天)的腹膜内注射CCl4(CCl4在橄榄油中，1:7(体积/体积)，每克体重1μL)诱导热激蛋白47(HSP47)的增量调节。第3天，用本发明的脂质体或脂复合物制剂或PBS通过IV注射入尾静脉对小鼠进行连续4天(第3、4、5、6)的处理。一组的10只小鼠(首次用于实验的)既不接受CCl4处理也不接受IV注射，作为正常HSP47基因表达的对照组。
实验时间安排
Figure BDA0001226144010001001
在第7天和最终的IV注射之后大约24小时，杀死所有剩余的小鼠，并在收集肝样品用于PCR分析之前用PBS灌注肝。收集来自各小鼠肝的约150mg样品并放入1.5mL的RNAlater稳定试剂(Qiagen)中并保存在2-8℃直至分析时。不从透明的(clear)和标记肝损伤和/或坏死的区域收集肝样品。
使用RNeasy柱(Qiagen)根据生产者的规程，从小鼠肝提取总RNA。将20ng的总RNA用于定量RT-PCR以测量HSP47表达。HSP47和GAPDH
Figure BDA0001226144010001005
测验以及一步RT-PCR预混购买自Applied Biosystems。各PCR反应包含以下成分：一步RT-PCR混合物5μl、
Figure BDA0001226144010001002
RT酶混合物0.25μl、
Figure BDA0001226144010001003
基因表达测验探针(HSP47)0.25μl、
Figure BDA0001226144010001004
基因表达测验探针(GAPDH)0.5μl、无RNA酶水3.25μl、RNA 0.75μl，总体积10μl。GAPDH用作HSP47 mRNA水平的相对定量的内源控制。在使用内置的相对定量方法的ViiA 7实时PCR系统(AppliedBiosciences)中进行定量RT-PCR。将所有值标准化为首次用于实验的动物组的平均HSP47表达，并表达为与首次用于实验的组相比的HSP47表达的百分比。
实施例42：定向偶联物HEDC:S104:DOPE:Chol:PEG-DMPE:DiVA的脂溶性维生素的体外功效
测试具有50nM siRNA的脂质体制剂。所述脂质体是以下之一：HEDC:S104:DOPE:Chol:PEG-DMPE:DiVA(+DiVA)或缺乏维生素A结构部分的对照(-DiVA)，并将其培育在含有大鼠肝星形细胞的96孔培育板中30分钟。30分钟后，用新鲜的生长培养基替换培养基。48小时后，将细胞溶解，并通过定量RT-PCR
Figure BDA0001226144010001012
测验测量gp46和GAPDH的mRNA水平，并将gp46水平标准化至GAPDH水平。
体外功效(pHSC)，2％DiVA siRNA的2％diVA的作用是有效的并具有14nM的EC50。PHSC与在50nM的siRNA的缺少用于定向的维生素A结构部分(-DiVA)的制剂或包含维生素A结构部分(+DiVA)的制剂一起培育在96孔板中。30分钟之后，用新鲜的生长培养基替换培养基。48小时后，将细胞溶解，并通过定量RT-PCR
Figure BDA0001226144010001013
测验测量gp46和GAPDH的mRNA水平，并将gp46水平标准化至GAPDH水平。将标准化的gp46水平表达为模拟控制细胞的百分比。误差棒表示标准方差(n＝3)。含DiVA的治疗之后的平均gp46水平与基于单尾t检验的(one-tailed t-test)模拟控制治疗的显著不同(P<0.001)。
比较DiVA和satDiVA
在96孔板中将脂质体制剂转染入大鼠pHSC中30分钟。48小时之后，用
Figure BDA0001226144010001014
溶解剂(Applied Biosystems)处理细胞并用qRT-PCR定量HSP47的mRNA水平。将HSP47表达标准化为模拟控制。通过测量在六个半对数剂量的siRNA并将数据拟合至Graphpad
Figure BDA0001226144010001015
5.04中的“典型S型剂量反应函数”的HSP47敲除(KD)来确定EC50。
结果显示DiVA和Sat DiVA二者增强了KD的功效(下表和图15)。DiVA的EC50是12nM和Sat DiVA的EC50是14nM。
Figure BDA0001226144010001011
类视黄醇偶联物比非-类视黄醇偶联物
据发现在体外类视黄醇偶联物相对于非类视黄醇等价物(见4TTNBB和4Myr对比类视黄醇偶联物等价物satDiVA和DiVA)一贯更有效。
Figure BDA0001226144010001021
实施例43：定向偶联物HEDC:S104:DOPE:Chol:PEG-DMPE:DiVA的脂溶性维生素的体内功效
在短期肝损伤模型(称作Quick模型，DMNQ)中评价目标制剂的体内活性。在该模型中，短期肝损伤是由用肝毒剂例如二甲基亚硝胺(DMN)的处理引发，并伴随着gp46 mRNA水平的上升。为了引发这些变化，用DMN对雄性Sprague-Dawley大鼠进行连续6天的腹膜注射。在DMN治疗期间的最后，基于个体动物体重将动物随机分组。将制剂作为单一的IV剂量给药，并在DMN的最后一次注射之后一小时施用。二十四小时之后，切除肝叶并通过定量RT-PCR
Figure BDA0001226144010001022
测验确定gp46和MRPL19的mRNA二者的水平。
结果(图16)显示类视黄醇偶联物的量和功效之间的关联是明显的。只需要0.25摩尔％即可看见在大鼠DMNQ模型中的明显作用。用2摩尔％DiVA观察到对gp46表达的强势敲除。图16显示用10mg/kg的DMN以1、2、3和5mg/kg在第4、5、6天通过腹膜给药以引发肝损伤处理的雄性Sprague-Dawley大鼠。最后一次注射DMN之后一个小时，用含有0、0.25、0.5、1、和2％DiVA的0.75mg/kg siRNA剂量的制剂，或PBS(载体)对动物(n＝8/组)进行静脉注射。24小时之后，从来自各动物的右肝叶的部分纯化总siRNA并储存在4℃直至RNA的分离。对照组包含PBS载体组(DMN-处理的)和首次用于实验的(未处理的；无DMN)组。减去从首次用于实验的组确定的背景gp46 mRNA水平之后，将所有测试组的值标准化至载体组的平均gp46mRNA(表达为载体组的百分比)。
用DMN通过腹膜给药处理雄性Sprague Dawley大鼠(130-160g)以引发肝纤维化。DMN处理方案是前三周以10mg/kg(即，以5.0mg/mL DMN和2.0mL/kg体重的剂量)每周3次(星期一、星期三和星期五)，和从第22天至57天以一半的5mg/kg剂量(即，以5.0mg/mL DMN和1.0mL/kg体重的剂量)。使用相同的时间表用PBS(DMN的溶剂)注射假组动物(sham groupanimal)。在最后的DMN处理之后的第22、24天，收集血液样品并测验肝疾病生物标记以确认DMN处理的有效性。基于体重将DMN处理的动物分配到不同的处理组中，并确保各组中动物的平均体重和体重范围没有明显区别。在第25天将来自预处理组的动物杀死，来评价治疗开始之前疾病的发展阶段。在第25天开始用含有gp46siRNA的制剂的治疗，以特定的siRNA剂量进行每周两次的治疗，共10次。在第59天，最后一次制剂治疗之后48小时和最后的DMN处理之后的72小时，通过CO2吸入杀死动物。切除肝叶并通过定量RT-PCR
Figure BDA0001226144010001031
测验确定gp46和MRPL19 mRNA二者的水平。
本文中提及或引用的文章、专利和专利申请，和所有其它文件以及可用的电子信息的内容，在这里通过援引将其全部内容以特定地并单独地指出各个出版物通过援引合并相同的程度合并入本文。
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对本文公开的说明书进行各种替换和改变而不背离本说明书的范围和精神对本领域技术人员将是显而易见的。因此，此类附加实施方式是在本发明和随附的权利要求书的范围之内。本说明书教导本领域技术人员测试对本文描述的化学改变的各种组合和/或替换以产生具有提高的的活性的核酸构造，以调节RNAi活性。这种提高的活性可包括提高的稳定性、提高的生物利用度、和/或调节RNAi的细胞反应提高的活化。因此，本文描述的特定实施方式不是限制性的，本领域技术人员易于理解无需过度实验可测试本文中描述的改变的特定组合以确认具有提高的RNAi活性的核酸分子。
在无本发明特定公开的要素、限制下可合适地实践本文中阐述性地描述的说明书。因此，例如，除非本文中另有说明或与上下文明确地相抵触，在描述说明书的上下文中术语“一”和“所述”以及类似的指示(特别是在随附的权利要求书文中)应解释为涵盖了单数和复数二者。术语“包括”、“具有”、“包含”、“含有”等应理解为扩展性的和无限制的(例如，意指“包括但不限于”)。除非本文中另外指出，本文中值范围的叙述只意在用作单独地提及落入范围内的各单独的值的速记方法，并且每个单独的值以其在本文中被单独引用那样被结合到本说明书中。除非本文中另有说明或与上下文明确地相抵触，本文中描述的所有方法可以任何合适的顺序进行。除非另有要求，使用任何和所有本文提供的实施例或示例性语言，仅仅是为了更好地说明本说明书，并不构成对本说明书的范围的限制。在说明书中没有语言应被解释为指示任何未要求保护的元素对本说明书的实践是必需的。此外，本文所用的术语和表达被用作描述而不是限制，并不意在使用这些术语和表达排除所显示和描述特征或其部分的任何等价物，但据认知在所要求保护的说明书的范围内进行各种改变是可能的。因此，许理解虽然通过优选的实施方式和任选的特征、其中所包含的说明书的改进和变化具体地公开了本说明书，但是本领域技术人员可借用这里所公开的，并且此类改进和变化被认为是在本说明书的范围之内。
这里广泛地并一般性地描述了本说明书。落入此一般性公开的较窄种类和亚属组也构成本说明书的一部分。这包括本说明书的一般性描述，条件或负面限制是从该种类中去除任何题材，不管被去除的材料是否在本文中被具体引述。其它实施方式是在随附的权利要求书中。另外，以Markush组描述本说明书的特征或方面的地方，本领域技术人员将认识到因此本说明书也以按照Markush组成员的个别成员或亚组来描述。
序列表
<110> 日东电工株式会社
<120> 用于定向药物输送和增强siRNA活性的化合物
<130> F3137WO (NITT-0017)
<140> PCT/US2012/041753
<141> 2012-06-08
<150> 61/494,840
<151> 2011-06-08
<150> 61/494,710
<151> 2011-06-08
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2208
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ucuuuggcuu uuuuuggcgg agcuggggcg cccuccggaa gcguuuccaa cuuuccagaa 60
guuucucggg acgggcagga gggggugggg acugccauau auagaucccg ggagcagggg 120
agcgggcuaa gaguagaauc gugucgcggc ucgagagcga gagucacguc ccggcgcuag 180
cccagcccga cccaggccca ccguggugca cgcaaaccac uuccuggcca ugcgcucccu 240
ccugcuucuc agcgccuucu gccuccugga ggcggcccug gccgccgagg ugaagaaacc 300
ugcagccgca gcagcuccug gcacugcgga gaaguugagc cccaaggcgg ccacgcuugc 360
cgagcgcagc gccggccugg ccuucagcuu guaccaggcc auggccaagg accaggcagu 420
ggagaacauc cuggugucac ccgugguggu ggccucgucg cuagggcucg ugucgcuggg 480
cggcaaggcg accacggcgu cgcaggccaa ggcagugcug agcgccgagc agcugcgcga 540
cgaggaggug cacgccggcc ugggcgagcu gcugcgcuca cucagcaacu ccacggcgcg 600
caacgugacc uggaagcugg gcagccgacu guacggaccc agcucaguga gcuucgcuga 660
ugacuucgug cgcagcagca agcagcacua caacugcgag cacuccaaga ucaacuuccg 720
cgacaagcgc agcgcgcugc aguccaucaa cgagugggcc gcgcagacca ccgacggcaa 780
gcugcccgag gucaccaagg acguggagcg cacggacggc gcccugcuag ucaacgccau 840
guucuucaag ccacacuggg augagaaauu ccaccacaag augguggaca accguggcuu 900
cauggugacu cgguccuaua ccgugggugu caugaugaug caccggacag gccucuacaa 960
cuacuacgac gacgagaagg aaaagcugca aaucguggag augccccugg cccacaagcu 1020
cuccagccuc aucauccuca ugccccauca cguggagccu cucgagcgcc uugaaaagcu 1080
gcuaaccaaa gagcagcuga agaucuggau ggggaagaug cagaagaagg cuguugccau 1140
cuccuugccc aagggugugg uggaggugac ccaugaccug cagaaacacc uggcugggcu 1200
gggccugacu gaggccauug acaagaacaa ggccgacuug ucacgcaugu caggcaagaa 1260
ggaccuguac cuggccagcg uguuccacgc caccgccuuu gaguuggaca cagauggcaa 1320
ccccuuugac caggacaucu acgggcgcga ggagcugcgc agccccaagc uguucuacgc 1380
cgaccacccc uucaucuucc uagugcggga cacccaaagc ggcucccugc uauucauugg 1440
gcgccugguc cggccuaagg gugacaagau gcgagacgag uuauagggcc ucagggugca 1500
cacaggaugg caggaggcau ccaaaggcuc cugagacaca ugggugcuau ugggguuggg 1560
ggggagguga gguaccagcc uuggauacuc cauggggugg ggguggaaaa acagaccggg 1620
guucccgugu gccugagcgg accuucccag cuagaauuca cuccacuugg acaugggccc 1680
cagauaccau gaugcugagc ccggaaacuc cacauccugu gggaccuggg ccauagucau 1740
ucugccugcc cugaaagucc cagaucaagc cugccucaau caguauucau auuuauagcc 1800
agguaccuuc ucaccuguga gaccaaauug agcuaggggg gucagccagc ccucuucuga 1860
cacuaaaaca ccucagcugc cuccccagcu cuaucccaac cucucccaac uauaaaacua 1920
ggugcugcag ccccugggac caggcacccc cagaaugacc uggccgcagu gaggcggauu 1980
gagaaggagc ucccaggagg ggcuucuggg cagacucugg ucaagaagca ucgugucugg 2040
cguugugggg augaacuuuu uguuuuguuu cuuccuuuuu uaguucuuca aagauaggga 2100
gggaaggggg aacaugagcc uuuguugcua ucaauccaag aacuuauuug uacauuuuuu 2160
uuuucaauaa aacuuuucca augacauuuu guuggagcgu ggaaaaaa 2208
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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oligonucleotide"
<220>
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uaguuguaca ggccugucct t 21

Claims (18)

1.化合物，由(维甲酸)m-接头-(维甲酸)n的结构组成，其中m和n＝1、2或3，且其中所述接头由聚乙二醇(PEG)、Glu、Gly3和/或GluNH组成。
2.权利要求1的化合物，其中所述接头选自双酰胺-PEG、三酰胺-PEG、四酰胺-PEG、Lys-双酰胺-PEG Lys、Lys-三酰胺-PEG-Lys、Lys-四酰胺-PEG-Lys、Lys-PEG-Lys、PEG2000、PEG1250、PEG1000、PEG750、PEG550、PEG-Glu、Glu、C6、Gly3、和GluNH。
3.权利要求1的化合物，其中所述化合物选自维甲酸-PEG-维甲酸、VA-PEG2000-VA、(维甲酸)2-Lys-双酰胺-PEG-Lys-(维甲酸)2。
4.权利要求3的化合物，其中所述化合物是下式的化合物：
Figure FDA0002669047810000011
其中q、r和s各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。
5.权利要求3的化合物，其中所述化合物是下式的化合物：
Figure FDA0002669047810000012
6.权利要求3的化合物，选自以下任一结构：
Figure FDA0002669047810000013
Figure FDA0002669047810000021
7.权利要求1的化合物，其中所述PEG是单分散的。
8.药物载体，包含权利要求1-7任一项的化合物。
9.权利要求8的药物载体，形式为包含脂质分子的脂质体。
10.权利要求9的药物载体，其中在所述药物载体到达星形细胞之前，所述维甲酸至少部分暴露于所述药物载体的外部。
11.权利要求9的药物载体，其中所述维甲酸是脂质分子的0.1摩尔％至20摩尔％。
12.权利要求9的药物载体，其中所述脂质分子包含选自下组的一种或多种脂质：HEDC、DODC、HEDODC、DSPE、DOPE和DC-6-14。
13.权利要求9的药物载体，其中所述脂质分子包含式I的化合物
Figure FDA0002669047810000031
其中R1和R2独立地选自C12至C18的烷基、C12至C18的烯基和油基；其中R3和R4独立地选自C1至C6的烷基和C2至C6的链烷醇；其中X选自-CH2-、-S-、和-O-或不存在；其中Y选自-(CH2)n、-S(CH2)n和-O(CH2)n-，其中n＝1-4；其中a＝1-4；其中b＝1-4；其中c＝1-4；和其中Z是抗衡离子。
14.权利要求13的药物载体，其中所述抗衡离子是卤离子或甲磺酸根。
15.权利要求13的药物载体，其中所述脂质分子包含选自下组的化合物：
Figure FDA0002669047810000041
Figure FDA0002669047810000051
16.权利要求12-15任一项的药物载体，其中所述脂质分子进一步包含S104。
17.组合物，包含权利要求8-16任一项的药物载体和治疗剂。
18.权利要求17的组合物，其中所述治疗剂是核酸。
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GR01 Patent grant
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