KR101727333B1 - 베시클 제제 - Google Patents

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KR101727333B1
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요시오 나카노
레이 하치스
유키오 미즈타니
마사유키 스도
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추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
고에키자이단호진 도쿄도 이가쿠 소고겐큐쇼
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Abstract

혈청성분이 비타민 E를 간실질세포로 운반하는 성질을 이용하여, 비타민 E를 소포체 표면에 흡착 또는 화학결합시킴으로써, 소포체에 포함되는 생리활성물질을 간실질세포에 효율적이고 또한 특이적으로 송달할 수 있는 것을 명백하게 하였다.

Description

베시클 제제{Vesicle preparation}
본 발명은 생리활성물질을 간실질세포 내에 효율적으로 도입시킬 수 있고, 또한 생리활성물질을 간실질세포 내에서 유효하게 작용시키기 위한 소포체 및 그의 이용에 관한 것이다.
본 발명은, 항바이러스제, 화학요법제, 펩티드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산, 앱타머(aptamer), 디코이(Decoy) 및 이들의 유연체(類緣體), 소핵산분자, 예를 들면 siRNA, miRNA, dsRNA, 또는 shRNA 등의 생리활성물질을 간실질세포 내로 효율적으로 도입시킬 수 있고, 또한 생리활성물질을 간실질세포 내에서 유효하게 작용시키기 위한 소포체에 관한 것이다.
간실질세포에, 유전자 등의 핵산이나 항종양제 등의 생리활성물질을 도입하여, 유전자 발현, 유전자 제어, 종양 축소를 시도하는 예가 알려져 있다.
핵산 관련의 도입의 경우는, 바이러스 벡터를 사용한 예로서 Scherr 등의 논문(비특허문헌 1) 및 공개특허(특허문헌 1), 수압을 가하여 세포 내로 도입하는 하이드로다이나믹 인젝션의 예로서 Song 등의 논문(비특허문헌 2)이나 공개특허(특허문헌 2)가 있다. 그러나, 바이러스 벡터를 사용하는 도입방법은 인간에 대한 안전성에 문제가 있어, 널리 일반적인 치료목적에는 적합하지 않다. 또한, 수압을 가하는 도입방법은 생체외에서 세포로의 도입은 가능해도, 치료 목적으로 인간에 대한 사용은 적합하지 않다.
또한 간실질세포로의 운반방법으로서, 간장 표면의 당 수용체를 표적으로 한 수용체 매개성 엔도사이토시스를 이용하는 방법이 알려져 있다. 아시알로 당 단백질 수용체(비특허문헌 3)는 간세포에 특이적으로, 갈락토오스 말단을 갖는 당단백질, 예를 들면 아시알로오로소뮤코이드에 결합한다. 이 원리를 이용한 갈락토오스 수식 양이온성 콜레스테롤을 포함한 리포솜 조성물(특허문헌 3)이 소개되어 있다. 그러나, siRNA를 운반하는 실시예에 있어서, 갈락토오스를 수식하고 있지 않은 경우에 비해 약간 효과가 올라가나, 폐, 신장, 비장 및 심장에 있어서도 유전자 발현이 보이고 있는 것으로부터, 간장 특이적으로 siRNA가 운반되고 있지는 않은 것을 알 수 있어, 유효한 기술이라고는 할 수 없다.
락토오스를 인지질의 포스파티딜에탄올아민에 결합시켜서 양이온성 리포솜에 배합시킨 조성물(비특허문헌 4)이나, 당 수식 펩티드를 사용하여 리포솜과 동일하게 간장의 당 수용체를 표적으로 한 운반(특허문헌 4)도 제안되어 있다.
그러나, 간장의 당 수용체를 표적으로 한 리포솜의 운반의 경우는 엔도사이토시스로 삽입된 후, 엔도솜 내에서 핵산의 분해가 행해져 유전자 발현 및 유전자 제어의 효과는 거의 발휘되지 않는다는 문제가 있었다.
한편, 생체의 방어시스템인 세망내피계(이하 RES:reticulo-endothelial system)를 회피하여 혈액 체류성을 높이고, 그 결과 간실질세포로의 운반 효율을 높이는 기술도 소개되어 있다.(특허문헌 5). 리포솜 표면에 수용성의 폴리머(메톡시폴리에틸렌글리콜: mPEG)를 화학결합시켜서 RES에 의한 이물질 인식으로부터 회피시키는 기술이나, 수동 표적화(passive targeting)로 불려 제암제 독소루비신(Doxorubicin)의 리포솜 제제로서 시판(Doxil)되고 있는 기술과 동일한 것이다. 혈관 투과성의 항진에 의해 종양조직이나 신생혈관부위에 집적되기 쉬운 특장이 있는 것 외에, RES 세포에도 일부 삽입되기 때문에 간실질세포로의 효율적인 운반기술이라고는 할 수 없다.
지용성 비타민인 비타민 E(토코페롤)는 산화방지기능을 갖는 것으로부터, 지질 소포체 중의 불포화지방산의 산화를 방지할 목적으로 소포체에 소량(일반적으로는 0.2% 정도) 첨가되는 형태로 사용되고 있다(특허문헌 6, 7).
또한, 식사 유래의 비타민 E가 소장으로부터 흡수되어 혈액 중에서 혈청성분인 카이로미크론에 의해 간장까지 운반되는 것, 또한 식사 유래 이외의 비타민 E가 혈액 중에서는 HDL(고비중 리포단백질)이나 LDL(저비중 리포단백질)로 운반되기 쉬운 것을 이용하여, 비타민 E의 주성분인 α-토코페롤을 siRNA와 화학결합시켜서 siRNA를 간장으로의 운반에 사용하는 예가 Nishina 등에 의해 보고되어 있다(비특허문헌 5). 그러나, siRNA와 α-토코페롤을 1:1로 결합시키기 위한 공업 스케일에서의 제조의 곤란함, 또한 프로드러그로서의 고순도가 요구되는 것으로부터, 미반응 원료나 부생성물의 제거가 필요해진다. 이들의 제조공정과 정제공정에 유래하는 수율의 낮음, 또한 간장 도입 후에 가수분해에 의한 siRNA의 유리(遊離)가 필요한 것으로부터, 치료효과를 얻기 위해서는 고가의 siRNA를 다량으로 사용해야만 한다는 경제적인 문제가 있었다.
또한, 비타민 A를 시판의 세포 도입용 양이온성 리포솜을, 추가로 플라스미드나 siRNA와 같은 핵산과 혼합시켜 에멀젼으로 하고, 간성세포(hepatic satellite cell)로 운반하는 방법이 알려져 있다.(특허문헌 8). 간성세포는 세망내피계 세포와 마찬가지로 비실질세포로, 세포 내에 지방적(fat droplet)을 가져 비타민 A를 고농도로 저장하고 있다. 이 비타민 A를 사용하는 비실질세포로의 송달방법의 경우, 혈액 중에 대량의 비타민 A가 존재하면, 혈액 중의 비타민 A 결합 단백에 의해 간성세포(비실질세포)로 운반되기 쉬워지기 때문에 입경의 조절이나 표면전하(surface charge) 등을 조절할 필요는 없다. 그러나, 간실질세포 내에 특이적으로 생리활성물질을 송달하는 경우에는, 비실질세포에 입자가 트랩되지 않도록, 입자 전체의 입경과 표면전하를 적절히 조절할 필요가 있어, 지금까지 간실질세포로의 송달용으로 최적화된 운반입자는 개발되어 있지 않았다.
일본국 특허공개 제2007-110995호 일본국 특허공개 제2008-054681호 일본국 특허공개 제2007-112768호 일본국 특허공개 제1999-290073호 일본국 특허공개 제2004-196675호 일본국 특허공개 제2007-112768호 일본국 특허공표 제2008-530215호 일본국 특허공개 제2008-50375호
Scherr, M. et al., Oligonucleotides, 2003 ; 13 : 353-363 Song, E. et al., Nature Medicine, 2003 ; 9 : 347-351 Wu, GY and Wu, CH, J. Biol. Chem., 1987 ; 262 : 4429-4432 Watanabe, T. et al., J. Hepatol., 2007 ; 47 : 744-750 Nishina, K. et al., Molecular Therapy, 2008 ; 16(4) : 734-740
본 발명은, 이상의 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은, 생리활성물질을 효율적이고 또한 특이적으로 간실질세포로 운반 도입시킬 수 있으며, 또한 생리활성물질을 간실질세포 내에서 유효하게 작용시키기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은, 간실질세포로의 운반기술에 대해 예의 검토한 결과, 생리활성물질을 포함한 소포체 표면에, 혈청성분을 인식하기 위해 충분한 양의 비타민 E를 흡착 또는 화학결합시킴으로써, 혈청성분이 생리활성물질을 포함하는 소포체를 매우 효율적으로 간실질세포로 운반시키고, 또한 생리활성물질이 신속하게 효과를 발휘할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성한 것이다.
비타민 E가 혈액 중에서 간실질세포로 운반되기 쉬운 성질을, 생리활성물질과의 결합을 매개로 하지 않고, 생리활성물질의 운반 팩터로서 이용하는 매우 안전하고 또한 효율적인 방법을 발견한 것이다.
즉, 본 발명은 이하 [1]~[24]의 발명에 관한 것이다.
[1] 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 소포체로서, 그 소포체 표면에 비타민 E가 흡착되어 있거나, 또는 비타민 E가 소포체를 구성하는 양친매성 물질에 화학결합되어 있는 것을 특징으로 하는 소포체.
(i) 양친매성 물질
(ii) 양이온성을 갖는 물질 및/또는 음이온성을 갖는 물질을 포함하는 유기물질
[2] 상기 양이온성을 갖는 물질이 양이온성 지질인 것을 특징으로 하는, [1]에 기재된 소포체.
[3] 상기 양이온성 지질이 하기 화학식 I으로 표시되는 것인 것을 특징으로 하는, [2]에 기재된 소포체.
[화학식 I]
(화학식 중, R1 및 R2는, 동일 또는 상이한 탄소수 12 내지 22의 포화 또는 불포화의 탄화수소기를 의미하고, R3는 탄소수 1 내지 6의 알킬기 또는 탄소수 1 내지 6의 히드록시알킬기를 의미하며, m은 1 내지 10의 정수를 의미하고, X는 할로겐원자를 의미한다.)
[4] 상기 양이온성 지질이, 포화 또는 불포화 지방족 1급 아민(스테아릴아민, 올레일아민), 포화 또는 불포화 2급, 3급 아민(디스테아로일트리메틸암모늄 프로판, 디올레오일트리메틸암모늄 프로판) 및 제4급 아민염(DODAC(디옥타데실디메틸암모늄 클로라이드: dioctadecyldimethylammonium chloride), DTDAB(디테트라데실디메틸암모늄 브로마이드: ditetradecyldimethylammonium bromide), DOTMA(N-(2,3-디올레일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄: N-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium), DDAB(디도데실암모늄 브로마이드: didodecylammonium bromide), DTAB(디테트라데실암모늄 브로마이드: ditetradecylammonium bromide), DOTAP(1,2-디올레오일옥시-3-트리메틸암모니오 프로판: 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane), O,O'-디테트라데칸오일-N-(α-트리메틸암모니오-아세틸)-디에탄올아민 클로라이드: O,O'-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonio-acetyl)-diethanolamine chloride, O,O'-디헥사데칸오일-N-(α-트리메틸암모니오-아세틸)-디에탄올아민 클로라이드: O,O'-dihexadecanoyl-N-(α-trimethylammonio-acetyl)-diethanolamine chloride, O,O'-디옥타데칸오일-N-(α-트리메틸암모니오-아세틸)-디에탄올아민 클로라이드: O,O'-dioctadecanoyl-N-(α-trimethylammonio-acetyl)-diethanolamine chloride, DC-Chol(3β-N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바몰 콜레스테롤 하이드로 클로라이드: 3β-N-(N',N'-dimethyl-aminoethane)-carbamol cholesterol hydro chloride), DMRIE(1,2-디미리스토일옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸암모늄: 1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium), DOSPA(2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미넘 트리플루오로아세테이트: 2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, [2]에 기재된 소포체.
[5] 상기 양친매성 물질이, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 부가 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 스핑고미엘린, 카르디올리핀(cardiolipin) 및 플라스마로겐(plasmalogen)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상의 인지질인 것을 특징으로 하는, [1]에 기재된 소포체.
[6] 상기 포스파티딜콜린이, 난황 포스파티딜콜린, 수소첨가 난황 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 수소첨가 대두 포스파티딜콜린, 디라우로일 포스파티딜콜린, 디미리스토일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린, 디스테아로일 포스파티딜콜린, 디올레오일 포스파티딜콜린, 팔미토일-올레오일 포스파티딜콜린, 디리놀레오일 포스파티딜콜린, 디리놀레노일 포스파티딜콜린, 디데칸오일 포스파티딜콜린, 디에루시코일 포스파티딜콜린, 디에이코사노일 포스파티딜콜린, 디에이코사트리에노일 포스파티딜콜린, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜콜린, 디도코사에노일 포스파티딜콜린 및 디도코사헥사에노일 포스파티딜콜린으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 포스파티딜에탄올아민이, 난황 포스파티딜에탄올아민, 수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, 대두 포스파티딜에탄올아민, 수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, 디라우로일 포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민, 팔미토일-올레오일 포스파티딜에탄올아민, 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민, 디리놀레노일 포스파티딜에탄올아민, 디데칸오일 포스파티딜에탄올아민, 디에루시코일 포스파티딜에탄올아민, 디에이코사노일 포스파티딜에탄올아민, 디에이코사트리에노일 포스파티딜에탄올아민, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜에탄올아민, 디도코사에노일 포스파티딜에탄올아민 및 디도코사헥사에노일 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
상기 포스파티딜글리세롤이, 난황 포스파티딜글리세롤, 수소첨가 난황 포스파티딜글리세롤, 대두 포스파티딜글리세롤, 수소첨가 대두 포스파티딜글리세롤, 디라우로일 포스파티딜글리세롤, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤, 디팔미토일 포스파티딜글리세롤, 디스테아로일 포스파티딜글리세롤, 디올레오일 포스파티딜글리세롤, 팔미토일-올레오일 포스파티딜글리세롤, 디리놀레오일 포스파티딜글리세롤, 디리놀레노일 포스파티딜글리세롤, 디데칸오일 포스파티딜글리세롤, 디에루시코일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사노일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사트리에노일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜글리세롤, 디도코사에노일 포스파티딜글리세롤 및 디도코사헥사에노일 포스파티딜글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 포스파티딜세린이, 난황 포스파티딜세린, 수소첨가 난황 포스파티딜세린, 대두 포스파티딜세린, 수소첨가 대두 포스파티딜세린, 디라우로일 포스파티딜세린, 디미리스토일 포스파티딜세린, 디팔미토일 포스파티딜세린, 디스테아로일 포스파티딜세린, 디올레오일 포스파티딜세린, 팔미토일-올레오일 포스파티딜세린, 디리놀레오일 포스파티딜세린, 디리놀레노일 포스파티딜세린, 디데칸오일 포스파티딜세린, 디에루시코일 포스파티딜세린, 디에이코사노일 포스파티딜세린, 디에이코사트리에노일 포스파티딜세린, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜세린, 디도코사에노일 포스파티딜세린 및 디도코사헥사에노일 포스파티딜세린으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
상기 포스파티딜이노시톨이, 난황 포스파티딜이노시톨, 수소첨가 난황 포스파티딜이노시톨, 대두 포스파티딜이노시톨, 수소첨가 대두 포스파티딜이노시톨, 디라우로일 포스파티딜이노시톨, 디미리스토일 포스파티딜이노시톨, 디팔미토일 포스파티딜이노시톨, 디스테아로일 포스파티딜이노시톨, 디올레오일 포스파티딜이노시톨, 팔미토일-올레오일 포스파티딜이노시톨, 디리놀레오일 포스파티딜이노시톨, 디리놀레노일 포스파티딜이노시톨, 디데칸오일 포스파티딜이노시톨, 디에루시코일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사노일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사트리에노일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜이노시톨, 디도코사에노일 포스파티딜이노시톨 및 디도코사헥사에노일 포스파티딜이노시톨로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 부가 포스파티딜에탄올아민이, mPEG2000-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디올레오일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디올레오일 포스파티딜에탄올아민 및 mPEG5000-디올레오일 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
상기 포스파티드산이, 난황 포스파티드산, 수소첨가 난황 포스파티드산, 대두 포스파티드산, 수소첨가 대두 포스파티드산, 디라우로일 포스파티드산, 디미리스토일 포스파티드산, 디팔미토일 포스파티드산, 디스테아로일 포스파티드산, 디올레오일포스파티드산, 디리놀레오일 포스파티드산, 팔미토일-올레오일 포스파티드산, 디리놀레노일 포스파티드산, 디데칸오일 포스파티드산, 디에루시코일 포스파티드산, 디에이코사노일 포스파티드산, 디에이코사트리에노일 포스파티드산, 디에이코사펜타에노일 포스파티드산, 디도코사에노일 포스파티드산 및 디도코사헥사에노일 포스파티드산으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 스핑고미엘린이, 난황 유래 스핑고미엘린 또는 우유 유래 스핑고미엘린이며,
상기 카르디올리핀이, 난황 카르디올리핀, 수소첨가 난황 카르디올리핀, 대두 카르디올리핀, 수소첨가 대두 카르디올리핀, 디라우로일 카르디올리핀, 디미리스토일 카르디올리핀, 디팔미토일 카르디올리핀, 디스테아로일 카르디올리핀, 디올레오일 카르디올리핀, 팔미토일-올레오일 카르디올리핀, 디리놀레오일 카르디올리핀, 디리놀레노일 카르디올리핀, 디데칸오일 카르디올리핀, 디에루시코일 카르디올리핀, 디에이코사노일 카르디올리핀, 디에이코사트리에노일 카르디올리핀, 디에이코사펜타에노일 카르디올리핀, 디도코사에노일 카르디올리핀 및 디도코사헥사에노일 카르디올리핀로 이루어진 군으로부터 선택된다는 특징을 갖는, [5]에 기재된 소포체.
[7] 상기 양이온성을 갖는 물질이 양이온성 폴리머인 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 소포체.
[8] 상기 양이온성 폴리머가 폴리에틸렌이민 또는 폴리리신인 것을 특징으로 하는 [7]에 기재된 소포체.
[9] 상기 음이온성을 갖는 물질이 산성 인지질인 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 소포체.
[10] 상기 산성 인지질이, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 메톡시폴리에틸렌글리콜 부가 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, [9]에 기재된 소포체.
[11] 상기 포스파티딜글리세롤이, 난황 포스파티딜글리세롤, 수소첨가 난황 포스파티딜글리세롤, 대두 포스파티딜글리세롤, 수소첨가 대두 포스파티딜글리세롤, 디라우로일 포스파티딜글리세롤, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤, 디팔미토일 포스파티딜글리세롤, 디스테아로일 포스파티딜글리세롤, 디올레오일 포스파티딜글리세롤, 팔미토일-올레오일 포스파티딜글리세롤, 디리놀레오일 포스파티딜글리세롤, 디리놀레노일 포스파티딜글리세롤, 디데칸오일 포스파티딜글리세롤, 디에루시코일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사노일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사트리에노일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜글리세롤, 디도코사에노일 포스파티딜글리세롤 및 디도코사헥사에노일 포스파티딜글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 포스파티딜세린이, 난황 포스파티딜세린, 수소첨가 난황 포스파티딜세린, 대두 포스파티딜세린, 수소첨가 대두 포스파티딜세린, 디라우로일 포스파티딜세린, 디미리스토일 포스파티딜세린, 디팔미토일 포스파티딜세린, 디스테아로일 포스파티딜세린, 디올레오일 포스파티딜세린, 팔미토일-올레오일 포스파티딜세린, 디리놀레오일 포스파티딜세린, 디리놀레노일 포스파티딜세린, 디데칸오일 포스파티딜세린, 디에루시코일 포스파티딜세린, 디에이코사노일 포스파티딜세린, 디에이코사트리에노일 포스파티딜세린, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜세린, 디도코사에노일 포스파티딜세린, 디도코사헥사에노일 포스파티딜세린으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
상기 포스파티딜이노시톨이, 난황 포스파티딜이노시톨, 수소첨가 난황 포스파티딜이노시톨, 대두 포스파티딜이노시톨, 수소첨가 대두 포스파티딜이노시톨, 디라우로일 포스파티딜이노시톨, 디미리스토일 포스파티딜이노시톨, 디팔미토일 포스파티딜이노시톨, 디스테아로일 포스파티딜이노시톨, 디올레오일 포스파티딜이노시톨, 팔미토일-올레오일 포스파티딜이노시톨, 디리놀레오일 포스파티딜이노시톨, 디리놀레노일 포스파티딜이노시톨, 디데칸오일 포스파티딜이노시톨, 디에루시코일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사노일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사트리에노일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜이노시톨, 디도코사에노일 포스파티딜이노시톨 및 디도코사헥사에노일 포스파티딜이노시톨로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 부가 포스파티딜에탄올아민이, mPEG2000-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디올레오일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디올레오일 포스파티딜에탄올아민 및 mPEG5000-디올레오일 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
상기 포스파티드산이, 난황 포스파티드산, 수소첨가 난황 포스파티드산, 대두 포스파티드산, 수소첨가 대두 포스파티드산, 디라우로일 포스파티드산, 디미리스토일 포스파티드산, 디팔미토일 포스파티드산, 디스테아로일 포스파티드산, 디올레오일포스파티드산, 디리놀레오일 포스파티드산, 팔미토일-올레오일 포스파티드산, 디리놀레노일 포스파티드산, 디데칸오일 포스파티드산, 디에루시코일 포스파티드산, 디에이코사노일 포스파티드산, 디에이코사트리에노일 포스파티드산, 디에이코사펜타에노일 포스파티드산, 디도코사에노일 포스파티드산 및 디도코사헥사에노일 포스파티드산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, [10]에 기재된 소포체.
[12] 상기 비타민 E가, α-토코페롤, β-토코페롤, γ-토코페롤 및 δ-토코페롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, [1]에 기재된 소포체.
[13] 상기 비타민 E가 dl-α-토코페롤인 것을 특징으로 하는 [1]에 기재된 소포체.
[14] 상기 양이온성을 갖는 물질이, 소포체를 구성하는 물질 전체의 몰수의 10~50%의 범위에서 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 [1]~[13] 중 어느 하나에 기재된 소포체.
[15] 상기 비타민 E가, 소포체를 구성하는 물질 전체의 몰수의 3~30%의 범위에서 흡착 또는 화학결합되어 있는 것을 특징으로 하는 [1]~[14] 중 어느 하나에 기재된 소포체.
[16] 상기 비타민 E가, 소포체를 구성하는 물질 전체의 몰수의 5~20%의 범위에서 흡착 또는 화학결합되어 있는 것을 특징으로 하는 [1]~[14] 중 어느 하나에 기재된 소포체.
[17] 상기 소포체의 입경이 50~150 ㎚의 범위인 것을 특징으로 하는, [1]~[16] 중 어느 하나에 기재된 소포체.
[18] 플라스미드 DNA, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항바이러스제 및 세포상해성 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상의 생리활성물질을 소포체가 내봉(內封)하는, 및/또는 그 생리활성물질이 소포체의 성분에 소수적 또는 정전적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, [1]~[17] 중 어느 하나에 기재된 소포체.
[19] 소포체 표면의 제타 전위가 음이온성인 것을 특징으로 하는 [18]에 기재된 소포체.
[20] 상기 생리활성물질이 항바이러스제인 것을 특징으로 하는 [18]에 기재된 소포체.
[21] 상기 세포상해성 물질이, 대사길항제, 플래티나계제(platinating agent), 알킬화제, 식물 알칼로이드, 분자 표적약, 생물학적 응답 조절제 및 항암성 항생물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, [18]에 기재된 소포체.
[22] 상기 대사길항제가, 에노시타빈, 카페시타빈, 카르모푸르, 클라드리빈, 겜시타빈, 시타라빈, 시타라빈 옥포스페이트, 테가푸르, 테가푸르·우라실, 테가푸르·기메라실·오테라실 칼륨, 독시플루리딘, 넬라라빈, 히드록시카르바미드, 플루오로우라실, 플루다라빈, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 플래티나 제제가, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 시스플라틴 및 네다플라틴으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
상기 알킬화제가, 이포스파미드, 시클로포스파미드, 다카르바진, 테모졸로미드, 니무스틴, 부설판, 멜팔란 및 라니무스틴으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 식물 알칼로이드가, 이리노테칸, 에토포시드, 소브족산, 도세탁셀, 노기테칸, 파클리탁셀, 비노렐빈, 빈크리스틴, 빈데신, 빈블라스틴으로부터 선택되는 것이며,
분자 표적약이 이마티니브, 에를로티니브, 수니티니브, 세툭시마브, 소라페니브, 패니투무마브, 베바시주마브, 보르테조미브로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 생물학적 응답 조절제가, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터류킨으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
상기 항암성 항생물질이, 아클라루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 독소루비신, 피라루비신, 블레오마이신, 마이토마이신 C 및 미톡산트론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, [21]에 기재된 소포체.
[23] [18]~[22] 중 어느 하나에 기재된 소포체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 생리활성물질을 혈청 존재하에서 간실질세포에 송달하기 위해 사용되는 키트.
[24] [18]~[22] 중 어느 하나에 기재된 소포체를, 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 대상에 있어서 생리활성물질을 간실질세포에 송달하는 방법.
도 1은 인 비트로계에서의 리포솜에 의한 siRNA의 도입 결과를 나타내는 도면이다. 루시페라아제 유전자를 포함하는 HCV 레플리콘 세포 R6 FLR41-14세포에, [비교예 1]의 리포솜 분산액 또는 토코페롤을 첨가하여 조제한 [실시예 1] 및 [실시예 2] 기재의 리포솜 분산액을 사용하여 siRNA를 도입해서, 그 HCV 복제 저해활성을 검토하였다. 고농도에서의 성적을 나타내었다.
도 2는 인 비트로계에서의 리포솜에 의한 siRNA의 도입 결과를 나타내는 도면이다. 루시페라아제 유전자를 포함하는 HCV 레플리콘 세포 R6 FLR41-14세포에, [비교예 1] 및 [비교예 2]의 리포솜 분산액 또는 토코페롤을 첨가하여 조제한 [실시예 1] 및 [실시예 2] 기재의 리포솜 분산액을 사용하여 siRNA를 도입해서, 그 HCV 복제 저해활성을 검토하였다. 저농도에서의 성적을 나타내었다.
도 3은 HCV 유전자를 스위칭 발현하는 트랜스제닉(Cre/loxP/HCV-MxCre Tg) 마우스의 유전자 발현 원리를 나타내는 도면이다.
도 4는 HCV 유전자를 스위칭 발현하는 트랜스제닉(Cre/loxP/HCV-MxCre Tg) 마우스의 HCV 코어 유전자 발현량의 경일(經日)변화를 나타내는 도면이다.
도 5는 유전자 발현 43일 후의 Cre/loxP/HCV-MxCre Tg 마우스에 [실시예 1]에서 제조한 리포솜 분산액과 si197-1 복합체(0.3 ㎎ siRNA/㎏ 체중)를 투여하여, 그 HCV 유전자 발현 저해활성의 평가결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은, 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 소포체로서, 그 소포체 표면에 비타민 E가 흡착되어 있거나, 또는 비타민 E가 소포체를 구성하는 양친매성 물질에 화학결합되어 있는 것을 특징으로 하는 소포체에 관한 것이다.
(i) 양친매성 물질
(ii) 양이온성을 갖는 물질 및/또는 음이온성을 갖는 물질을 포함하는 유기물질
본 발명에서 사용되는 양친매성 물질은, 바람직하게는 수중에서 서로 회합(會合)하여 나노에서 서브미크론의 소포체를 형성한다. 또한, 본 발명의 양친매성 물질로서는, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 부가 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 스핑고미엘린, 카르디올리핀, 플라스마로겐으로 대표되는 인지질이나 콜레스테롤의 폴리 다당(플루란, 만난 등) 축합체, 폴리에틸렌글리콜의 폴리아미노산(폴리아스파라긴산 등) 축합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상의 인지질 및/또는 적어도 1종 이상의 폴리머 축합체를 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 양친매성 물질로서 상기 인지질 및/또는 상기 폴리머 축합체와 콜레스테롤이 병용되고 있어도 된다.
본 발명에 있어서, 포스파티딜콜린으로서는, 난황 포스파티딜콜린, 수소첨가 난황 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 수소첨가 대두 포스파티딜콜린, 디라우로일 포스파티딜콜린, 디미리스토일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린, 디스테아로일 포스파티딜콜린, 디올레오일 포스파티딜콜린, 팔미토일-올레오일 포스파티딜콜린, 디리놀레오일 포스파티딜콜린, 디리놀레노일 포스파티딜콜린, 디데칸오일 포스파티딜콜린, 디에루시코일 포스파티딜콜린, 디에이코사노일 포스파티딜콜린, 디에이코사트리에노일 포스파티딜콜린, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜콜린, 디도코사에노일 포스파티딜콜린, 디도코사헥사에노일 포스파티딜콜린 등을 예시할 수 있다.
포스파티딜에탄올아민으로서는, 난황 포스파티딜에탄올아민, 대두 포스파티딜에탄올아민, 수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, 디라우로일 포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민, 팔미토일-올레오일 포스파티딜에탄올아민, 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민, 디리놀레노일 포스파티딜에탄올아민, 디데칸오일 포스파티딜에탄올아민, 디에루시코일 포스파티딜에탄올아민, 디에이코사노일 포스파티딜에탄올아민, 디에이코사트리에노일 포스파티딜에탄올아민, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜에탄올아민, 디도코사에노일 포스파티딜에탄올아민, 디도코사헥사에노일 포스파티딜에탄올아민 등을 예시할 수 있다.
포스파티딜글리세롤로서는, 난황 포스파티딜글리세롤, 수소첨가 난황 포스파티딜글리세롤, 대두 포스파티딜글리세롤, 수소첨가 대두 포스파티딜글리세롤, 디라우로일 포스파티딜글리세롤, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤, 디팔미토일 포스파티딜글리세롤, 디스테아로일 포스파티딜글리세롤, 디올레오일 포스파티딜글리세롤, 팔미토일-올레오일 포스파티딜글리세롤, 디리놀레오일 포스파티딜글리세롤, 디리놀레노일 포스파티딜글리세롤, 디데칸오일 포스파티딜글리세롤, 디에루시코일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사노일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사트리에노일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜글리세롤, 디도코사에노일 포스파티딜글리세롤, 디도코사헥사에노일 포스파티딜글리세롤 등을 예시할 수 있다.
포스파티딜세린으로서는, 난황 포스파티딜세린, 수소첨가 난황 포스파티딜세린, 대두 포스파티딜세린, 수소첨가 대두 포스파티딜세린, 디라우로일 포스파티딜세린, 디미리스토일 포스파티딜세린, 디팔미토일 포스파티딜세린, 디스테아로일 포스파티딜세린, 디올레오일 포스파티딜세린, 팔미토일-올레오일 포스파티딜세린, 디리놀레오일 포스파티딜세린, 디리놀레노일 포스파티딜세린, 디데칸오일 포스파티딜세린, 디에루시코일 포스파티딜세린, 디에이코사노일 포스파티딜세린, 디에이코사트리에노일 포스파티딜세린, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜세린, 디도코사에노일 포스파티딜세린, 디도코사헥사에노일 포스파티딜세린 등을 예시할 수 있다.
포스파티딜이노시톨로서는, 난황 포스파티딜이노시톨, 수소첨가 난황 포스파티딜이노시톨, 대두 포스파티딜이노시톨, 수소첨가 대두 포스파티딜이노시톨, 디라우로일 포스파티딜이노시톨, 디미리스토일 포스파티딜이노시톨, 디팔미토일 포스파티딜이노시톨, 디스테아로일 포스파티딜이노시톨, 디올레오일 포스파티딜이노시톨, 팔미토일-올레오일 포스파티딜이노시톨, 디리놀레오일 포스파티딜이노시톨, 디리놀레노일 포스파티딜이노시톨, 디데칸오일 포스파티딜이노시톨, 디에루시코일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사노일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사트리에노일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜이노시톨, 디도코사에노일 포스파티딜이노시톨, 디도코사헥사에노일 포스파티딜이노시톨 등을 예시할 수 있다.
메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 부가 포스파티딜에탄올아민으로서는, mPEG2000-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, PEG2000-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디올레오일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디올레오일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디올레오일 포스파티딜에탄올아민 등으로부터 선택할 수 있다.
포스파티드산으로서는, 난황 포스파티드산, 수소첨가 난황 포스파티드산, 대두 포스파티드산, 수소첨가 대두 포스파티드산, 디라우로일 포스파티드산, 디미리스토일 포스파티드산, 디팔미토일 포스파티드산, 디스테아로일 포스파티드산, 디올레오일포스파티드산, 디리놀레오일 포스파티드산, 팔미토일-올레오일 포스파티드산, 디리놀레노일 포스파티드산, 디데칸오일 포스파티드산, 디에루시코일 포스파티드산, 디에이코사노일 포스파티드산, 디에이코사트리에노일 포스파티드산, 디에이코사펜타에노일 포스파티드산, 디도코사에노일 포스파티드산, 디도코사헥사에노일 포스파티드산 등을 예시할 수 있다.
스핑고미엘린으로서는, 난황 유래 스핑고미엘린 또는 우유 유래 스핑고미엘린을 예시할 수 있고,
카르디올리핀으로서는 난황 카르디올리핀, 수소첨가 난황 카르디올리핀, 대두 카르디올리핀, 수소첨가 대두 카르디올리핀, 디라우로일 카르디올리핀, 디미리스토일 카르디올리핀, 디팔미토일 카르디올리핀, 디스테아로일 카르디올리핀, 디올레오일 카르디올리핀, 팔미토일-올레오일 카르디올리핀, 디리놀레오일 카르디올리핀, 디리놀레노일 카르디올리핀, 디데칸오일 카르디올리핀, 디에루시코일 카르디올리핀, 디에이코사노일 카르디올리핀, 디에이코사트리에노일 카르디올리핀, 디에이코사펜타에노일 카르디올리핀, 디도코사에노일 카르디올리핀, 디도코사헥사에노일 카르디올리핀 등을 예시할 수 있다.
또한, 여기에서 기재한 것은 일례로, 동종의 구조를 갖는 것이면 여기에 기재한 화합물에 한정하지 않고 사용할 수 있는 것이다.
본 발명에 있어서, 생리활성물질로서 핵산 등의 폴리음이온성 물질을 사용하는 경우, 소포체의 구성성분으로서 전기적 결합을 위해 양이온성을 갖는 물질을 사용할 수 있다. 양이온성을 갖는 물질로서는, 바람직하게는 양이온성 지질을 예시할 수 있고, 보다 바람직하게는, 하기 화학식 I으로 표시되는 화합물을 예시할 수 있다.
[화학식 I]
Figure 112011048168711-pct00002
(화학식 중, R1 및 R2는, 동일 또는 상이하고, 탄소수 12 내지 22의 포화 또는 불포화의 탄화수소기를 의미하며, R3는 탄소수 1 내지 6의 알킬기 또는 탄소수 1 내지 6의 히드록시알킬기를 의미하고, m은 1 내지 10의 정수를 의미하며, X는 할로겐원자를 의미한다.)
상기 화합물로서는, N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트 클로라이드, N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-L-글루타메이트 클로라이드, N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디옥타데실-D-글루타메이트 클로라이드, N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디올레일-D-글루타메이트 클로라이드, N-ω-트리메틸암모니오데칸오일 데헥사데실-D-글루타메이트 브로마이드, N-ω-트리메틸암모니오데칸오일 데헥사데실-L-글루타메이트 브로마이드 등을 예시할 수 있고, 이들은 시판되고 있는 것(소고 약품공업 주식회사)을 사용할 수 있다. 기타 양이온성 물질로서는, 스테아릴아민, 올레일아민 등의 포화 또는 불포화 지방족 1급 아민;디스테아로일트리메틸암모늄 프로판, 디올레오일트리메틸암모늄 프로판 등의 포화 또는 불포화 2급, 3급 아민; 또는 DODAC(디옥타데실디메틸암모늄 클로라이드: dioctadecyldimethylammonium chloride), DOTMA(N-(2,3-디올레일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄: N-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium), DDAB(디도데실암모늄 브로마이드: didodecylammonium bromide), DOTAP(1,2-디올레오일옥시-3-트리메틸암모니오 프로판: 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane),
DC-Chol(3β-N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바몰 콜레스테롤 하이드로 클로라이드: 3β-N-(N',N'-dimethyl-aminoethane)-carbamol cholesterol hydro chloride), DMRIE(1,2-디미리스토일옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸암모늄: 1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium), DOSPA(2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미넘 트리플루오로아세테이트: 2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상의 혼합물을 사용해도 된다.
또한, 폴리양이온인 폴리에틸렌이민이나 폴리리신을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 생리활성물질로서 세포상해성 물질, 저분자 항바이러스제 등의 비극성물질 또는 극성기를 많이 갖지 않는 물질을 사용하는 경우, (1) 소포체 내부에 내포하거나 또는 (2) 막 구성성분과 소수 결합시켜서 막 중에 넣는 것 중 어느 하나의 방법이 사용된다. 이들의 경우는 정전 반발을 이용하여 소포체끼리의 응집을 방지할 목적으로, 음이온성을 갖는 물질을 사용할 수 있다. 음이온성을 갖는 물질로서는, 바람직하게는 산성 인지질을 예시할 수 있다.
산성 인지질로서는, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 메톡시폴리에틸렌글리콜 부가 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산을 예시할 수 있다.
포스파티딜글리세롤로서는, 난황 포스파티딜글리세롤, 수소첨가 난황 포스파티딜글리세롤, 대두 포스파티딜글리세롤, 수소첨가 대두 포스파티딜글리세롤, 디라우로일 포스파티딜글리세롤, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤, 디팔미토일 포스파티딜글리세롤, 디스테아로일 포스파티딜글리세롤, 디올레오일 포스파티딜글리세롤, 팔미토일-올레오일 포스파티딜글리세롤, 디리놀레오일 포스파티딜글리세롤, 디리놀레노일 포스파티딜글리세롤, 디데칸오일 포스파티딜글리세롤, 디에루시코일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사노일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사트리에노일 포스파티딜글리세롤, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜글리세롤, 디도코사에노일 포스파티딜글리세롤 및 디도코사헥사에노일 포스파티딜글리세롤을 예시할 수 있다.
포스파티딜세린으로서는, 난황 포스파티딜세린, 수소첨가 난황 포스파티딜세린, 대두 포스파티딜세린, 수소첨가 대두 포스파티딜세린, 디라우로일 포스파티딜세린, 디미리스토일 포스파티딜세린, 디팔미토일 포스파티딜세린, 디스테아로일 포스파티딜세린, 디올레오일 포스파티딜세린, 팔미토일-올레오일 포스파티딜세린, 디리놀레오일 포스파티딜세린, 디리놀레노일 포스파티딜세린, 디데칸오일 포스파티딜세린, 디에루시코일 포스파티딜세린, 디에이코사노일 포스파티딜세린, 디에이코사트리에노일 포스파티딜세린, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜세린, 디도코사에노일 포스파티딜세린, 디도코사헥사에노일 포스파티딜세린을 예시할 수 있다.
포스파티딜이노시톨로서는, 난황 포스파티딜이노시톨, 수소첨가 난황 포스파티딜이노시톨, 대두 포스파티딜이노시톨, 수소첨가 대두 포스파티딜이노시톨, 디라우로일 포스파티딜이노시톨, 디미리스토일 포스파티딜이노시톨, 디팔미토일 포스파티딜이노시톨, 디스테아로일 포스파티딜이노시톨, 디올레오일 포스파티딜이노시톨, 팔미토일-올레오일 포스파티딜이노시톨, 디리놀레오일 포스파티딜이노시톨, 디리놀레노일 포스파티딜이노시톨, 디데칸오일 포스파티딜이노시톨, 디에루시코일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사노일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사트리에노일 포스파티딜이노시톨, 디에이코사펜타에노일 포스파티딜이노시톨, 디도코사에노일 포스파티딜이노시톨 및 디도코사헥사에노일 포스파티딜이노시톨을 예시할 수 있다.
메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 부가 포스파티딜에탄올아민으로서는, mPEG2000-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-수소첨가 난황 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-수소첨가 대두 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디라우로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디미리스토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG5000-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민, mPEG2000-디올레오일 포스파티딜에탄올아민, mPEG3400-디올레오일 포스파티딜에탄올아민 및 mPEG5000-디올레오일 포스파티딜에탄올아민을 예시할 수 있다.
포스파티드산으로서는, 난황 포스파티드산, 수소첨가 난황 포스파티드산, 대두 포스파티드산, 수소첨가 대두 포스파티드산, 디라우로일 포스파티드산, 디미리스토일 포스파티드산, 디팔미토일 포스파티드산, 디스테아로일 포스파티드산, 디올레오일포스파티드산, 디리놀레오일 포스파티드산, 팔미토일-올레오일 포스파티드산, 디리놀레노일 포스파티드산, 디데칸오일 포스파티드산, 디에루시코일 포스파티드산, 디에이코사노일 포스파티드산, 디에이코사트리에노일 포스파티드산, 디에이코사펜타에노일 포스파티드산, 디도코사에노일 포스파티드산 및 디도코사헥사에노일 포스파티드산을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 소포체 표면에 흡착 또는 화학결합시키는 비타민 E는, 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 α-토코페롤, β-토코페롤, γ-토코페롤 및 δ-토코페롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상의 비타민 E를 예시할 수 있다. 또한, 비타민 E의 보다 바람직한 예로서는, dl-α-토코페롤을 들 수 있다.
소포체 표면에 흡착 또는 화학결합시키는 비타민 E의 양은, 혈청 중의 입자가 인식하는 충분한 양이나, 구체적으로는 소포체를 구성하는 물질 전체의 몰수의 바람직하게는 3~30%의 범위에서 흡착 또는 화학결합되어 있을 필요가 있고, 보다 바람직하게는 5~20%의 범위에서 흡착 또는 화학결합되어 있을 필요가 있다. 이들 결합의 비율이 작은 경우는 혈청 입자의 비타민 E 인식력이 약하여, 간실질세포로의 운반 효율이 나쁘다. 지나치게 많은 경우는, 흡착된 비타민 E끼리 소수 결합에 의해 소포체끼리 회합하기 쉬워지기 때문에 평균입경이 증대한다. 평균입경이 증대됨으로써 혈액 중의 RES에 트랩되기 쉬워지고, 그 결과 간실질세포로의 운반 효율도 저하된다. 결합의 경우에는, 양친매성 물질인 포스파티딜에탄올아민의 아미노기의 선단에 글루타르산 등의 이염기산을 결합시키고, 한쪽의 카르복실산과 비타민 E의 수산기를 축합시킨 에스테르 등이 사용된다. 혈청성분을 인식할 수 있으면 되기 때문에, 이염기산 대신에 말단이 활성기로 치환된 폴리에틸렌글리콜을 사용해도 된다. 비타민 E를 결합시키는 방법은 이들에 한정되지 않고, 일반적으로 알려져 있는 방법 중 어느 것이어도 가능하다.
비타민 E를 상기의 범위 내에서 첨가함으로써, 혈청 입자에 의한 인식력이 적정화되어, 소포체끼리의 회합도 방지할 수 있는 것으로부터, 간실질세포로의 효율적인 운반을 실현할 수 있다.
소포체의 입자경은, 생체외의 간실질세포로의 운반의 경우 20~500 ㎚여도 충분하나, 생체내 정맥 투여의 경우에는 50~150 ㎚로 제어함으로써, RES에 트랩되지 않고, 혈청 중의 LDL로 대표되는 입자에 의해 간실질세포까지 운반된다.
소포체의 입경이 지나치게 작은 경우는, 생리활성물질을 운반하는 효율이 나쁘고, 지나치게 큰 경우는 생체내의 RES에 트랩되어, 간실질세포까지 운반되기 어려워진다. 따라서, 인 비보에 있어서 운반효과를 충분히 발휘시키기 위해 50~150 ㎚의 입경을 갖는 소포체가 전체의 60% 이상인 것이 보다 바람직하다. 본 발명은, 50 ㎚~150㎚의 입경을 갖는 소포체가, 소포체 집단 전체의 60% 이상인 것을 특징으로 하는 소포체 집단도 포함한다.
본 발명은, 플라스미드 DNA, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항바이러스제 및 세포상해성 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상의 생리활성물질을 소포체가 내봉하는, 및/또는 그 생리활성물질이 소포체의 성분에 소수적 또는 정전적으로 결합하는 소포체에 관한 것이다.
본 발명은, 소포체 표면의 제타 전위가 음이온성인 소포체에 관한 것이다. 그 생리활성물질이 소포체의 성분에 정전적으로 결합함으로써 음이온성이 되는 것이 바람직하나, 그 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 생리활성물질로서 사용되는 siRNA는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는, 서열번호:1에 기재된 올리고리보뉴클레오티드 및 서열번호:2에 기재된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 siRNA를 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서 생리활성물질로서 사용되는 항바이러스제는, 항HCV제나 항HBV제 등 바이러스성 간질환의 치료를 목적으로 한 약제이면 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 항HCV제이다. 본 발명의 항바이러스제로서는, HCV나 HBV에 대한 플라스미드 DNA, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 등의 핵산계의 약제뿐 아니라, 저분자 항바이러스제 등도 포함된다. 저분자 항바이러스제는 특별히 한정되지 않으나, 바이러스 유전자가 코드하는 폴리머라제나 프로테아제 등의 저해제, 기타 항바이러스활성을 갖는 저분자화합물이면 되고, 구체적인 화합물로서는 리바비린(1-β-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-tri-azole-3-carboxamide) 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포상해성 물질로서는, 대사길항제, 플래티나계제, 알킬화제, 식물 알칼로이드, 분자 표적약, 생물학적 응답 조절제 및 항암성 항생물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상을 포함하는 세포상해성 물질을 예시할 수 있다.
대사길항제로서는, 에노시타빈, 카페시타빈, 카르모푸르, 클라드리빈, 겜시타빈, 시타라빈, 시타라빈 옥포스페이트, 테가푸르, 테가푸르·우라실, 테가푸르·기메라실·오테라실 칼륨, 독시플루리딘, 넬라라빈, 히드록시카르바미드, 플루오로우라실, 플루다라빈, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트를 예시할 수 있다.
플래티나 제제로서는, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 시스플라틴 및 네다플라틴을 예시할 수 있다.
알킬화제로서는, 이포스파미드, 시클로포스파미드, 다카르바진, 테모졸로미드, 니무스틴, 부설판, 멜팔란 및 라니무스틴을 예시할 수 있다.
식물 알칼로이드로서는, 이리노테칸, 에토포시드, 소브족산, 도세탁셀, 노기테칸, 파클리탁셀, 비노렐빈, 빈크리스틴, 빈데신, 빈블라스틴으로부터 선택되는 것이며,
분자 표적약이 이마티니브, 에를로티니브, 수니티니브, 세툭시마브, 소라페니브, 패니투무마브, 베바시주마브, 보르테조미브를 예시할 수 있다.
생물학적 응답 조절제로서는, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터류킨을 예시할 수 있다.
항암성 항생물질로서는, 아클라루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 독소루비신, 피라루비신, 블레오마이신, 마이토마이신 C 및 미톡산트론을 예시할 수 있다.
본 발명은, 당해 소포체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 생리활성물질을 혈청 존재하에서 간실질세포에 송달하기 위해 사용되는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 약학조성물 및 키트에는, 약학적으로 허용되는 담체가 포함되어도 된다. 약학적으로 허용되는 담체로서는, 예를 들면, 멸균수나 생리식염수, 안정제, 부형제, 산화방지제(아스코르브산 등), 완충제(인산, 구연산, 다른 유기산 등), 방부제, 계면활성제(PEG, Tween 등), 킬레이트제(EDTA 등), 결합제 등을 들 수 있다. 또한, 기타 저분자량의 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴이나 면역글로불린 등의 단백질, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 및 리신 등의 아미노산, 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물, 만니톨이나 소르비톨 등의 당알코올을 포함하고 있어도 된다. 주사용의 수용액으로 하는 경우에는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약을 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨 등을 들 수 있고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, HCO-50) 등과 병용해도 된다.
또한, 필요에 따라, 마이크로캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로캡슐)에 봉입하거나, 콜로이드 드러그 운반시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 하는 것도 가능하다.
또한 본 발명의 키트는, 키트를 사용하기 위한 방법이 기재된 취급설명서가 첨부되어 있어도 된다.
본 발명은, 당해 소포체를, 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 대상에 있어서 생리활성물질을 간실질세포에 송달하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 소포체는, 대상에 투여된 후, 대상 내의 혈청성분에 의해, 선택적으로 간실질세포로 송달된다.
본 발명에 있어서 대상으로의 투여는 경구, 비경구투여의 어느 것도 가능하나, 바람직하게는 비경구투여이다. 본 발명의 소포체로 되는 조성물의 형태(제형)로서는, 특별히 제한은 없고, 주사제형, 경비투여제형, 경폐투여제형, 경피투여제형, 동결건조제형, 용액제형 등을 들 수 있다.
주사제형의 예로서는, 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한, 대상의 상태(대상이 인간 환자인 경우에는, 환자의 연령, 증상)에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다.
혈청입자에 의해 운반된 생리활성물질을 포함하는 소포체는, 간실질세포 내에서 즉시 생리활성작용을 발휘한다. 예를 들면 생리활성물질이 siRNA인 경우에는, 종래기술인 간세포 표면의 당단백 수용체를 경유하여 운반된 생리활성물질이 리소좀 내에서 대사 분해되는 것에 반하여, 본 발명 기술에 의하면 48시간 이내에 녹다운효과가 보인다.
또한, 일반적으로는 siRNA를 소포체의 표면에 정전 결합시킨 양이온성 리포솜이 알려져 있으나, 세포 표면과의 인터랙션을 위해 음이온인 siRNA를 양이온성 지질 또는 양이온성 폴리머보다 낮은 양으로 첨가하고, 소포체 표면의 제타 전위를 플러스(양이온성)로 하여 사용된다. 그러나, 양이온성이 잔존한 채로 혈중에 투여하면 폐에 존재하는 RES나 혈청 중의 알부민 등에 트랩 또는 결합하기 쉽기 때문에, 간실질세포로의 운반 효율이 낮아진다. 이것을 피하기 위해서는, 소포체 표면의 제타 전위를 마이너스 전위로 하는 것이 매우 중요하여, siRNA 등의 핵산계 생리활성물질의 소포체로의 첨가량을 양이온성 지질 또는 양이온성 폴리머의 등전점보다 많이 사용할 필요가 있다.
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
1. 생체외 간실질세포로의 siRNA의 운반(in vitro)
[실시예 1]
N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디올레일-D-글루타메이트 클로라이드(소고 약품공업 주식회사, 일본; 제품명: DC-3-18:1), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(니치유 주식회사, 일본) 및 콜레스테롤(와코순약 주식회사, 일본)을, 배합비 40:30:30(몰비)으로 적량의 클로로포름에 용해시키고, 이것을 감압하에 용매를 증류 제거시키면서 건고시켜서, 지질 혼합물로 하였다.
용매를 확실히 제거할 수 있을 때까지 데시케이터(desiccator)에서 건조시킨 후, 이 지질 혼합물에 9% 수크로오스 용액을 첨가하여, 65℃ 가온하, 소니케이터(sonicator)로 간접적으로 초음파 조사함으로써 전체의 지질농도 2.5 mM의 리포솜 조(crude)분산액을 얻었다. 다음으로, 리포솜의 입자경을 고르게 하기 위해, 공경(孔徑) 0.2 ㎛의 필터를 2매 겹쳐 압출기(extruder)에 세팅하고, 약 65℃ 가온·가압하에 압출 여과(extrusion)하였다. 추가로 공경 0.1 ㎛의 필터를 2매 사용하여 동일하게 압출 여과하여, 이것을 빈(empty) 리포솜 분산액으로 하였다. 평균입경은 136.1 ㎚였다.
DL-α-토코페롤(도쿄화성 주식회사, 일본) 5 μ㏖에 대해 400 μL의 에틸알코올의 비율로 용해시켜서, 0.2 ㎛의 필터로 여과한 액(토코페롤액)을 조제하였다.
50 mL 바이알 중에, 리포솜 분산액 10 mL를 넣고 추가로 토코페롤액 400 μL를 넣어(전체 지질 몰수에 대해 20%), 교반기로 20초간 혼합 교반하였다. 추가로 실온에서 1시간 인큐베이션하여 비타민 E 흡착 리포솜 분산액을 얻었다. 평균입경은 124.2 ㎚였다.
[실시예 2]
DL-α-토코페롤(도쿄화성 주식회사, 일본) 2.5 μ㏖에 대해 400 μL의 에틸알코올의 비율로 용해시켜서, 0.2 ㎛의 필터로 여과한 액(토코페롤액)을 조제하였다.
50 mL 바이알 중에, [실시예 1]에서 제작한 리포솜 분산액 10 mL를 넣고 추가로 토코페롤액 400 μL를 넣어(전체 지질 몰수에 대해 10.0%), 교반기로 20초간 혼합 교반하였다. 추가로 실온에서 1시간 인큐베이션하여 비타민 E 흡착 리포솜 분산액을 얻었다. 평균입경은 136.7 ㎚였다.
[실시예 3]
DL-α-토코페롤(도쿄화성 주식회사, 일본) 3.75 μ㏖에 대해 400 μL의 에틸알코올의 비율로 용해시켜서, 0.2 ㎛의 필터로 여과한 액(토코페롤액)을 조제하였다.
50 mL 바이알 중에, [실시예 1]에서 제작한 리포솜 분산액 10 mL를 넣고 추가로 토코페롤액 400 μL를 넣어(전체 지질 몰수에 대해 15.0%), 교반기로 20초간 혼합 교반하였다. 추가로 실온에서 1시간 인큐베이션하여 비타민 E 흡착 리포솜 분산액을 얻었다. 평균입경은 133.5 ㎚였다.
[실시예 4]
N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디올레일-D-글루타메이트 클로라이드(소고 약품공업 주식회사, 일본; 제품명: DC-3-18:1D), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(니치유 주식회사, 일본) 및 콜레스테롤(와코순약 주식회사, 일본)을 배합비 40:30:30(몰비)으로 적량의 클로로포름에 용해시키고, 이것을 감압하에 용매를 증류 제거시키면서 건고시켜서, 지질 혼합물로 하였다. 용매를 확실히 제거할 수 있을 때까지 데시케이터에서 건조시킨 후, 이 지질 혼합물에 9% 수크로오스 용액을 첨가하여, 65℃ 가온하, 소니케이터로 간접적으로 초음파 조사함으로써 전체의 지질농도 2.5 mM의 리포솜 조분산액을 얻었다. 다음으로, 리포솜의 입자경을 고르게 하기 위해, 공경 0.2 ㎛의 필터를 2매 겹쳐 압출기에 세팅하고, 약 65℃ 가온·가압하에 압출 여과하였다. 추가로 공경 0.1 ㎛의 필터를 2매 사용하여 동일하게 압출 여과하고, 이것을 빈 리포솜 분산액으로 하였다. 평균입경은 138.7 ㎚였다.
다음으로 Nano-Mizer mark II NM2-L200(요시다 기계흥업 주식회사, 일본)으로, 100 MPa의 가압하에 3회 통과시켜서 추가적인 미립자화처리를 행한 결과, 평균입경은 55.7 ㎚였다.
DL-α-토코페롤(도쿄화성 주식회사, 일본) 5 μ㏖에 대해 400 μL의 에틸알코올의 비율로 용해시켜서, 0.2 ㎛의 필터로 여과한 액(토코페롤액)을 조제하였다.
50 mL 바이알 중에, 리포솜 분산액 10 mL를 넣고 추가로 토코페롤액 320 μL를 넣어(전체 지질 몰수에 대해 16%), 교반기로 20초간 혼합 교반하였다. 추가로 실온에서 1시간 인큐베이션하여 비타민 E 흡착 리포솜 분산액을 얻었다. 평균입경은 58.0 ㎚였다.
[비교예 1]
[실시예 1]에서 제작한 평균입경 136.1 ㎚의 리포솜 분산액을 그대로 사용하였다(토코페롤 무첨가).
[비교예 2]
DL-α-토코페롤(도쿄화성 주식회사, 일본) 20 μ㏖을 400 μL의 에틸알코올에 용해시켜서, 0.2 ㎛의 필터로 여과한 액(토코페롤액)을 조제하였다.
50 mL 바이알 중에, [실시예 1]에서 제작한 리포솜 분산액 5 mL를 넣고 추가로 조제한 토코페롤액 200 μL를 넣어(전체 지질 몰수에 대해 80.0%), 교반기로 20초간 혼합 교반하였다. 추가로 실온에서 1시간 인큐베이션하여 비타민 E 흡착 리포솜 분산액을 얻었다. 평균입경은 190.1 ㎚였다.
표기 조제한 각종 리포솜(상기 [실시예 1]~[실시예 3] 및 [비교예 1]~[비교예 2])을 사용하여, 생체외의 간실질세포로의 도입시험(in vitro 시험) 및 마우스로의 도입시험(in vivo 시험)을 행하여, 실시예와 비교예를 비교하여 본 발명의 효과를 이하에 나타낸다.
또한, 실시예는 이것에만 한정되지 않고, 이 실시예는 일례에 지나지 않는 것을 명기해 둔다.
[세포시험 실시예 1] 디자인한 siRNA의 C형 간염 바이러스(HCV) 레플리콘 복제 저해활성의 검토
C형 간염은, 일본 국내에서 200만명, 세계적으로는 2억명 이상에 달하는 감염자가 존재하는, 심각한 감염증의 하나이다. 그 커다란 특징은, C형 간염 바이러스(HCV)가 인간에 감염되면, 80~90%의 높은 비율로 지속 감염화되어, 만성간염, 더 나아가서는 간세포암을 일으키는 것에 있다. 현행의 페그인터페론·리바비린 병용요법에 의해 치료성적의 향상을 보았으나, 아직 치료효과는 충분하다고는 할 수 없어, 보다 유효하고 부작용이 적은 치료의 개발이 급선무가 되어 있다. 이에, 짧은 이중 가닥 RNA(siRNA)에 의한 HCV의 제어를 시도하였다.
짧은 이중 가닥 RNA(siRNA)가 포유류 세포의 인터페론(IFN) 응답을 회피하여, RNAi를 일으키는 발견으로부터, 유전자 녹다운법으로서 지금까지 널리 사용되어 왔다. 그러나 최근 들어 siRNA도 Off Target 효과에 의해 IFN 응답을 유도하는 것이 보고되어, 단순히 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 길이를 짧게 하는 것 뿐 아니라, 추가로 서열, 핵산 수식 등 개량이 검토되고 있다. 본 발명자들은, 신규 항바이러스요법으로서 기대되는 RNA 간섭(RNA interference; RNAi)에 의한 HCV 복제 저해와, 치료 응용을 위한 siRNA에 의한 HCV 타겟팅을 진행해 왔다. 그러나, siRNA를 효율적으로 표적 장기인 간장에 도입하는 것이 곤란하여, 드러그 운반시스템(DDS)의 개발이 급선무가 되어 있다. 이 문제를 해결하기 위해 이하의 검토를 행하였다.
<siRNA의 HCV 레플리콘 세포로의 트랜스펙션>
본 실시예에서는, 루시페라아제 유전자를 포함하는 HCV 레플리콘 세포로서 R6 FLR41-14세포(Watanabe, T. et al., Gene Theraphy 13: 883-892 (2006))를 사용하여, siRNA 어세이를 행하였다. 각각의 세포의 세포 수를 세어, 10% 비동화제 FCS를 포함하는 DMEM+GlutaMax-I에 현탁하고, R6 FLR41-14세포는 4500 cells/100 μL/well로 96 well에 뿌려, 다음날에 siRNA의 트랜스펙션을 행하였다. siRNA는 si197-1(센스 가닥 5'-AUCAUGAGCACAAAUCCUAAA-3', 서열번호:1, 안티센스 가닥(3'-CGUAGUACUCGUGUUUAGGAU-5', 서열번호:2)을 사용하였다. siRNA의 종농도는, 0.01, 0.04, 0.11, 0.33, 1, 1.1, 3, 3.3, 10, 30, 90 nM로 하였다.
각 siRNA 샘플을 0.23%의 NaHCO3를 포함하는 opti-MEM으로, 90 nM으로부터 3배단계 희석으로 10단계의 희석계열을 제작하였다. 50 μL의 siRNA 용액에 0.5 μL의 [비교예 1]의 리포솜 분산액, 또는 토코페롤을 첨가하여 조제한 [실시예 1] 및 [실시예 2] 기재의 리포솜 분산액을 각각 첨가하였다. 충분히 혼화 후, 실온에서 20분간 인큐베이트하여, siRNA-Liposome 복합체를 제작하였다. 각 희석계열의 샘플을, 루시페라아제 어세이용의 세포 배양용 멀티플레이트 96FII(화이트)(스미토모 베이클라이트, 일본 cat.#MS-8096W)와 세포독성 측정용 96 웰 플레이트(BD, cat.#353072)에 각각 n=3으로 10 μL/96-well로 첨가하였다. [비교예 1]의 리포솜 분산액 또는 토코페롤을 첨가하여 조제한 [실시예 1] 및 [실시예 2] 기재의 리포솜 분산액만을 각각 첨가한 웰(Lipo CTRL)을 대조로 하였다. 37℃, 5% CO2에서 인큐베이트하여, 72시간 후에 루시페라아제 어세이 및 WST-8에 의한 세포독성시험을 행하였다.
각각의, 콘쥬게이트 전후의 입경과 제타 전위를 표 1에 나타내었다.
Figure 112011048168711-pct00003
표 1로부터 siRNA를 콘쥬게이트시키기 전후에서, 제타 전위가 양이온성에서 음이온성으로 변환되어 있는 것을 알 수 있다.
<루시페라아제 활성 측정방법>
루시페라아제 활성 측정에 있어서는, Bright-Glo Luciferase Assay System(Promega, cat.#E2620)을 사용하였다. 방법은 논문(Watanabe, T. et al., Gene Therapy 13: 883-892 (2006))에 따랐다.
루시페라아제 어세이용 96 웰 플레이트의 전체 웰의 배지를 폐기하고, 5% 비동화제 FCS를 포함하는 DMEM+GlutaMax-I을 75 μL/well로 첨가하여, 배지 교환하였다. Bright-Glo Luciferase Assay System을 75 μL/well로 첨가하여, Mithras LB 940(Berthold)으로 1분간 진탕한 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다.
<세포독성 측정>
세포독성 측정에 있어서는, Cell Counting Kit-8(Dojindo, cat.#343-07623)을 사용하였다.
Cell Counting Kit-8 용액을, 5% 비동화제 FCS를 포함하는 DMEM+GlutaMax-I으로 7%로 희석하여, 어세이용의 용액을 제작하였다. 세포독성 시험용의 96 웰 플레이트의 전체 웰의 배지를 폐기하고, 전술한 어세이용의 용액을 100 μL/well로 첨가하여, 37℃, 5% CO2에서 1시간 인큐베이트하였다. 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad model 550)를 사용하여, 파장 450 ㎚(참조 파장 655 ㎚)를 측정하였다.
그 결과 토코페롤을 부가한 [실시예 1] 및 [실시예 2]에서 제조한 리포솜 분산액은 강력한 HCV 레플리콘 복제 저해활성을 나타내고, 세포독성에 대해서는 경미한 것이 명백해졌다. [비교예 1]의 리포솜 분산액에 비해 [실시예 2]에서 제조한 리포솜은 약 100배, [실시예 1]에서 제조한 리포솜 분산액은 약 1000배의 HCV 레플리콘 복제 저해활성을 나타내었다(도 1, 도 2).
2. 생체내 간실질세포로의 siRNA의 운반(in vivo)
[동물시험 실시예 1] 디자인한 siRNA의 HCV 유전자 도입 마우스에서의 저해활성의 검토
<HCV 유전자 도입 마우스>
HCV의 지속 감염 성립 메커니즘, 만성간염·간경변·간암으로의 추이 기구 해명을 위해, 병태모델의 트랜스제닉(Tg) 마우스 제작이 행해져 왔다. HCV 감염에 보다 가까운 모델로서, 임의의 시기에 HCV 유전자를 스위칭 발현할 수 있는 Cre/loxP recombinant system을 이용한 HCV구조 단백질영역 발현 Tg 마우스(CN2 마우스)가 수립되었다. 지금까지는 스위칭의 방법으로서, Cre DNA recombinase를 발현하는 재조합 아데노바이러스(AxCANCre)의 정맥 내 투여가 행해져 왔다. 그러나 AxCANCre법의 경우는, 마우스의 아데노바이러스에 대한 면역 응답도 야기되어 버린다. 이에 본 발명자들은 Cre/loxP 시스템으로 HCV 유전자를 도입한 트랜스제닉 마우스와 Cre를 유도하는 Mx-Cre 트랜스제닉 마우스를 교배함으로써, 임의의 시기에 HCV 유전자를 스위칭 발현하는 트랜스제닉(Cre/loxP/HCV-MxCre Tg) 마우스를 제작하였다. MxCre Tg 마우스의 경우는, Cre DNA recombinase가 인터페론(IFN) 반응성 Mx1 프로모터에 의해 발현되기 때문에, poly-IpC(이하 pIpC로 기재한다, 이중 가닥 RNA)의 투여에 의한 IFN의 유도에 의해 스위칭이 일어난다. 이 마우스에 pIpC를 1일 간격으로 3회 복강 내 투여하였다. 초회 투여 후 0.5일째부터 HCV 코어 단백질의 발현이 인정되고, 7일째에서 915 pg/㎎(간 총 단백질량)으로 피크에 도달하였다. 그 후, 감소경향이 있으나, 21일째에서도 435 pg/㎎으로 발현이 지속되고 있다. 또한, 이 발현은 6개월을 경과해도 동일한 레벨로 유지되고 있었다(도 3, 도 4).
<siRNA의 HCV 유전자 도입 마우스로의 투여>
유전자 발현 43일 후의 Cre/loxP/HCV-MxCre Tg 마우스에 [실시예 1]에서 제조한 리포솜 분산액과 si197-1 복합체(0.3 ㎎ siRNA/㎏ 체중)를 투여하여, 그 RNAi 활성을 평가하였다. 투여 후 2일째에 부검하여, 간장 조직의 샘플링을 행하였다. 이 간장 중의 HCV 코어 단백질량을 ELISA법(오르소 HCV 코어 단백 ELISA 키트)으로 정량하여, RNAi 활성을 평가하였다. 절식, 비절식군 모두 siCTRL(다마콘사; siCTRL3) 투여군에 비해 현저한 HCV 코어 단백질량의 저하가 확인되었다(도 5). 이것은, 지금까지 보고된 것(Watanabe, T. et al., J. Hepatology 47: 744-750 (2007))에 비해 50배 이상 강한 저해활성을 나타내는 것이 명백해졌다.
본 발명의 조성물을 사용하면, 생체외뿐 아니라 생체내의 간실질세포에 생리활성물질을 혈청 존재하에서 매우 효율적으로 도입할 수 있는 것으로부터, 시약으로서 뿐 아니라, 의약으로서도 매우 유용하다.
또한, 본 발명은, 비타민 E를 입자에 흡착 또는 화학결합시킴으로써, 혈청 중의 LDL(저비중 리포단백질) 등이 비타민 E를 인식하여 간실질세포의 수용체를 매개로 간실질세포 내에 입자를 송달시키는 점에 특징이 있다. 입자의 입경 및 표면전하가 최적화되어 있는 것으로부터, 이들의 입자는 비실질세포에는 삽입되지 않고, 소포체 입자를 간실질세포 내에 특이적으로 송달하는 것이 가능해진다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA TOKYO METROPOLITAN ORGANIZATION FOR MEDICAL RESEARCH HOKKAIDO SYSTEM SCIENCE CO., LTD. <120> vesicle formulation <130> C1-A0807P <150> JP 2008-301763 <151> 2008-11-26 <160> 2 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 1 aucaugagca caaauccuaa a 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 2 uaggauuugu gcucaugaug c 21

Claims (24)

  1. 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 소포체로서, 그 소포체 표면에 비타민 E가 흡착되어 있고, 비타민 E가, 소포체를 구성하는 물질 전체의 몰수의 20%의 비율로 흡착되어 있는 것을 특징으로 하는 소포체.
    (i) 포스파티딜에탄올아민
    (ii) 하기 화학식 I으로 표시되는 양이온성 지질
    [화학식 I]
    Figure 112016116689899-pct00004

    (화학식 중, R1 및 R2는, 동일 또는 상이한 탄소수 12 내지 22의 포화 또는 불포화의 탄화수소기를 의미하고, R3는 탄소수 1 내지 6의 알킬기 또는 탄소수 1 내지 6의 히드록시알킬기를 의미하며, m은 1 내지 10의 정수를 의미하고, X는 할로겐원자를 의미한다.)
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 I으로 표시되는 양이온성 지질이,
    N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트 클로라이드,
    N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-L-글루타메이트 클로라이드,
    N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디옥타데실-D-글루타메이트 클로라이드 및
    N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디올레일-D-글루타메이트 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 성분인 것인 소포체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 포스파티딜에탄올아민이 디올레오일 포스파티딜에탄올아민인 것인 소포체.
  4. 제3항에 있어서,
    콜레스테롤을 추가로 포함하는 소포체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 비타민 E가, α-토코페롤, β-토코페롤, γ-토코페롤 및 δ-토코페롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 소포체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 비타민 E가 dl-α-토코페롤인 것을 특징으로 하는 소포체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양이온성 지질이, 소포체를 구성하는 물질 전체의 몰수의 10~50%의 범위에서 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 소포체.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소포체의 입경이 50~150 ㎚의 범위인 것을 특징으로 하는 소포체.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    플라스미드 DNA, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항바이러스제 및 세포상해성 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상의 생리활성물질을 소포체가 내봉하거나,
    그 생리활성물질이 소포체의 성분에 소수적 또는 정전적으로 결합하거나,
    또는
    그 생리활성물질을 소포체가 내봉하기도 하고 그 생리활성물질이 소포체의 성분에 소수적 또는 정전적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 소포체.
  12. 제11항에 있어서,
    소포체 표면의 제타 전위가 음이온성인 것을 특징으로 하는 소포체.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 생리활성물질이 항바이러스제인 것을 특징으로 하는 소포체.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 세포상해성 물질이, 대사길항제, 플래티나계제, 알킬화제, 식물 알칼로이드, 분자 표적약, 생물학적 응답 조절제 및 항암성 항생물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 소포체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 대사길항제가, 에노시타빈, 카페시타빈, 카르모푸르, 클라드리빈, 겜시타빈, 시타라빈, 시타라빈 옥포스페이트, 테가푸르, 테가푸르·우라실, 테가푸르·기메라실·오테라실 칼륨, 독시플루리딘, 넬라라빈, 히드록시카르바미드, 플루오로우라실, 플루다라빈, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 플래티나 제제가, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 시스플라틴 및 네다플라틴으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 알킬화제가, 이포스파미드, 시클로포스파미드, 다카르바진, 테모졸로미드, 니무스틴, 부설판, 멜팔란 및 라니무스틴으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 식물 알칼로이드가, 이리노테칸, 에토포시드, 소브족산, 도세탁셀, 노기테칸, 파클리탁셀, 비노렐빈, 빈크리스틴, 빈데신, 빈블라스틴으로부터 선택되는 것이며, 분자 표적약이 이마티니브, 엘로티니브, 스니티니브, 세툭시마브, 소라페니브, 파니튜무마브, 베바시주마브, 볼테조미브로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 생물학적 응답 조절제가, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터류킨으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 항암성 항생물질이, 아클라루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 독소루비신, 피라루비신, 블레오마이신, 마이토마이신 C 및 미톡산트론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 소포체.
  16. 제11항에 기재된 소포체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 생리활성물질을 혈청 존재하에서 간실질세포에 송달하기 위해 사용되는 키트.
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