JP6067330B2 - Rhoキナーゼ阻害剤を含むビタミンA付加リポソーム製剤 - Google Patents
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Description
はじめにリポソームに内包化されたY-27632の定量・内包化率の測定が可能かを検討するため、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により既知濃度のY-27632を測定し、ピーク面積を指標として絶対検量線を作成した。その結果、各濃度とピーク面積は良好な直線性を示し、Y-27632の定量が可能であることを確認した(図1)。
DPPG:ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
(1)Y-27632(Wako, Osaka, Japan)を20 mg/mLでPBSに溶解した。
(2)マイクロチューブにリポソーム約0.025gを量りとり、(1)のY-27632溶液を0.4 mL加え、転倒混和し、30分間静置した。
(3)(2)の溶液を遠心濃縮チューブに移し、1,500×gで5分間遠心した。その後、下記の操作を記載の順序で行った。
↓ PBS 1 mLを加え、ピペッティング
↓ 遠心 1,500×g 5 分
↓ PBS 1 mLを加え、ピペッティング
↓ 遠心 1,500×g 5 分
↓ PBS 1mLを加え、ピペッティング
↓ 遠心 1,500×g 5 分
↓ リバース 1,500×g 5 分
↓ 孔径220 nmのフィルターに通してリポソームのサイズを調製
↓ ビタミンA(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)の溶液(6.0 mg/2.0 mL)400 mLを加え、ピペッティング
↓ 遠心 1,500×g 5 分 (1.5 mLになるまで)
↓ リバース 1,500×g 5 分
(4)パラフィルムで封をして、アルミ泊で覆い、冷蔵保存した。
上記1で得られたビタミンA付加リポソーム(VA付加リポソーム)の標的指向性を検討した。組織・細胞内でのY-27632の濃度の正確な測定は困難であるため、蛍光タンパクである緑色蛍光タンパク質(GFP)を上記1と同様の方法によりリポソームに内包化し、ラットに静脈内投与し、組織・細胞内のGFPの蛍光を観察した。雄Wisterラット(4週齢)にコリン欠乏食を6週間摂取させたラットを脂肪肝ラットとして使用し、普通食を6週間摂取させたラットを正常肝ラットとして使用した。
上記1で得られたリポソームを、脂肪肝ラットより分離・培養した肝星細胞に投与し、肝星細胞への影響を検討した。肝星細胞の収縮力は、コラーゲンゲルコントラクションアッセイ法およびファイロジン染色により検討した。上記2と同様にして肝星細胞を分離し、24ウェルプレートに0.3mlずつ分注したコラーゲンゲル培養キット(Nitta Gelatin, Osaka, Japan)上に1x106細胞/ウェルで播種し、24時間培養した。Y-27632単独、Y-27632内包化VA非付加リポソーム、およびY-27632内包化VA付加リポソームを、0.01、0.1、1、10μMの濃度でそれぞれ投与し、1時間後にコラーゲンゲルがウェルの底面から剥離された面積を測定した(各n=4)。Y-27632単独群のコントロールは薬剤非投与、Y-27632内包化VA非付加リポソーム群のコントロールは薬剤非内包化VA非付加リポソーム、Y-27632内包化VA付加リポソーム群のコントロールは薬剤非内包化VA付加リポソームとした。コラーゲンゲルコントラクションアッセイの結果を図7〜8に、ファイロジン染色の結果を図9〜11に示す。
正常肝ラットを用い、虚血30分前に薬剤投与を行い、70分間の虚血の後に再灌流とした。コントロール群、Y-27632単独0.1mg/kg群、10mg/kg群、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.03mg/kg群、0.1mg/kg群でそれぞれn=10とした。虚血再灌流後7日目までの生存率を測定した。虚血再灌流は、ラットをエーテル麻酔のもと、開腹下にマイクロクリップを用いて行った後、閉腹を行った。結果は、Y-27632単独10mg/kg群、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.1mg/kg群において生存率が90%、100%であり、コントロール群と比べ有意に改善していた(p<0.01, p<0.01)(図12)。Y-27632内包化VA付加リポソームはY-27632単独の1/100の量で同等の効果があることが示された。
正常肝ラットを用い、虚血30分前に薬剤投与を行い、45分間の虚血の後に再灌流とした。コントロール群、Y-27632単独0.1mg/kg群、1mg/kg群、10mg/kg群、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.03mg/kg群、0.1mg/kg群、0.3mg/kg群、1mg/kg群でそれぞれn=5とした。虚血再灌流後3時間で採血を行い、血清AST値の測定を行った。虚血再灌流はラットをエーテル麻酔のもと、開腹下にマイクロクリップを用いて行った後、閉腹を行った。結果は、Y-27632単独10mg群、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.1mg/kg群、0.3mg/kg群、1mg/kg群において、コントロール群と比べ血清AST値が有意に低下していた(p<0.05, p<0.01, p<0.01, p<0.01)(図13)。Y-27632内包化VA付加リポソームはY-27632単独の1/100の量でも同等の効果があることが示された。
正常肝ラットを用い、エーテル麻酔のもと、大腿動脈より24ゲージ針を留置し、カニュレーション法で薬剤投与時の平均動脈圧の変化の測定を行った。圧測定にAP601G (NIHON KODEN)を用いた。Y-27632単独10mg/kg群、0.1mg/kg群、Y-27632内包化VA非付加リポソーム0.1mg/kg群、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.1mg/kg群でそれぞれn=5とした。薬剤投与後、Y-27632単独10mg/kg群では約60mmHgの血圧低下を認めたが、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.1mg/kg群では約30mmHgと有意に血圧低下が小さい結果であった(p<0.01)(図14)。また、その後の血圧の回復も良好であった。
脂肪肝ラットを用い、開腹下に薬剤投与時の腸管血流、肝血流の推移を測定した。開腹はエーテル麻酔下に行い、虚血の30分前に尾静脈より薬剤を投与し、マイクロクリップを用いて肝虚血を行い、45分後に再灌流を行った。腸管血流、肝血流の測定はレーザー光による血流測定装置であるmoorFLPI リアルタイム血流画像化装置(LMS)を用いて行った。薬剤非投与のコントロール群、Y-27632内包化VA非付加リポソーム0.1mg/kg群、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.1mg/kg群とし、それぞれn=5とした。腸管血流においては虚血再灌流後、Y-27632内包化VA非付加リポソーム0.1mg/kg群、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.1mg/kg群において、コントロール群と比べ有意な血流の回復が見られたのに対し、肝血流においてはY-27632内包化VA付加リポソーム0.1mg/kg群においてのみ、コントロール群と比べ有意な血流の回復が見られた。この結果から、Y-27632内包化VA付加リポソームは、肝臓により選択的に作用し、肝血流を改善する効果があることが示された。
脂肪肝ラットを用い、虚血30分前に薬剤投与を行い、45分間虚血、再灌流後15分の時点で門脈灌流圧の測定を行った。虚血再灌流はラットをエーテル麻酔のもと、開腹下にマイクロクリップを用いて行った。ラット門脈に24Gカニューレを挿入し、Krebs-Henseleit Bufferを用いて0.3ml/min/mlで灌流し、門脈灌流圧の測定はAP601G (NIHON KODEN)を用いて行った。虚血なし群(IR-)、虚血あり薬剤なしのコントロール群、Y-27632単独0.1mg/kg群、10mg/kg群、Y-27632内包化VA非付加リポソーム0.1mg/kg群、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.1mg/kg群でそれぞれn=5とした。Y-27632単独10mg/kg群、Y-27632内包化VA非付加リポソーム0.1mg/kg群、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.1mg/kg群では、それぞれ有意に肝虚血再灌流後の門脈灌流圧の低下を認めた(図16)。この結果から、Y-27632内包化VA付加リポソームはY-27632単独の1/100の量でも類洞の血管抵抗を低下させ、類洞血流を改善させる効果があることが示された。
脂肪肝ラットを用い、虚血30分前に薬剤投与を行い、45分間の虚血の後に再灌流とした。コントロール群、Y-27632単独10mg/kg群、Y-27632内包化VA非付加リポソーム0.1mg/kg群、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.1mg/kg群でそれぞれn=10とした。虚血再灌流後7日目までの生存率を測定した。虚血再灌流は、ラットをエーテル麻酔のもと、開腹下にマイクロクリップを用いて行い、その後閉腹を行った。結果は、Y-27632単独10mg/kg群、Y-27632内包化VA非付加リポソーム0.1mg/kg群、Y-27632内包化VA付加リポソーム0.1mg/kg群において生存率が60%、60%、70%であり、それぞれコントロール群と比べ有意に改善していた(p<0.01, p<0.01, p<0.01)(図17)。Y-27632内包化VA非付加リポソームおよびY-27632内包化VA付加リポソームはY-27632単独の1/100の量で同等の効果があることが示された。
Claims (5)
- Rhoキナーゼ阻害剤を含む、ビタミンA付加リポソーム製剤であって、Rhoキナーゼ阻害剤がY-27632である、肝虚血再灌流障害を処置するための、製剤。
- リポソームの構成脂質の総脂質量とビタミンAの比率がモル比で1:0.01〜1:0.03である、請求項1に記載の製剤。
- Rhoキナーゼ阻害剤とビタミンAの比率がモル比で1:3〜1:5である、請求項1または2に記載の製剤。
- リポソームが中性荷電リポソームである、請求項1〜3のいずれかに記載の製剤。
- リポソームの構成脂質の総脂質量とビタミンAの比率がモル比で1:0.01〜1:0.03であり、Rhoキナーゼ阻害剤とビタミンAの比率がモル比で1:3〜1:5であり、かつリポソームが中性荷電リポソームである、請求項1に記載の製剤。
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