JP5600299B2 - ベシクル製剤 - Google Patents

Description

本発明は、生理活性物質を肝実質細胞内へ効率よく導入させることができ、かつ生理活性物質を肝実質細胞内で有効に作用させるための小胞体及びその利用に関する。

本発明は、抗ウイルス剤、化学療法剤、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸、アプタマー、デコイ及びこれらの類縁体、小核酸分子例えばsiRNA、miRNA、dsRNA、又はshRNA等の生理活性物質を肝実質細胞内へ効率よく導入させることができ、かつ生理活性物質を肝実質細胞内で有効に作用させるための小胞体に関する。

肝実質細胞に、遺伝子などの核酸や抗腫瘍剤などの生理活性物質を導入して、遺伝子発現、遺伝子制御、腫瘍縮小を試みる例が知られている。

核酸関連の導入では、ウイルスベクターを用いた例としてScherr等の論文（非特許文献１）及び公開特許（特許文献１）、水圧をかけて細胞内に導入するハイドロダイナミックインジェクションの例としてSong等の論文（非特許文献２）や公開特許（特許文献２）がある。しかしながら、ウイルスベクターを用いる導入方法は人への安全性に問題があり、広く一般の治療目的には適さない。また、水圧をかける導入方法は生体外で細胞への導入は可能でも、治療目的で人への使用には適さない。

また肝実質細胞へのデリバリー方法として、肝臓表面の糖レセプターを標的としたレセプター媒介性エンドサイトーシスを利用する方法が知られている。アシアロ糖たんぱく質レセプター（非特許文献３）は肝細胞に特異的であり、ガラクトース末端を有する糖たんぱく質例えばアシアロオルソムコイドに結合する。この原理を利用したガラクトース修飾カチオン性コレステロールを含んだリポソーム組成物（特許文献３）が紹介されている。しかしながら、siRNAをデリバリーする実施例において、ガラクトースを修飾していない場合と比べてやや効果があがるものの、肺、腎臓、脾臓、および心臓においても遺伝子発現が見られていることから、肝臓特異的にsiRNAがデリバリーされてはいないことが分かり、有効な技術とはいえない。

ラクトースをリン脂質のホスファチジルエタノールアミンに結合させてカチオニックリポソームに配合させた組成物（非特許文献４）や、糖修飾ペプチドを用いてリポソームと同様に肝臓の糖レセプターを標的としたデリバリー（特許文献４）も提案されている。

しかしながら、肝臓の糖レセプターを標的としたリポソームのデリバリーではエンドサイトーシスにて取り込まれた後、エンドソーム内にて核酸の分解が行われ遺伝子発現、及び遺伝子制御の効果はほとんど発揮されないという問題があった。

一方、生体の防御システムである細網内皮系（以下RES：reticulo-endothelial system）を回避して血液滞留性を高め、その結果肝実質細胞へのデリバリー効率を高める技術も紹介されている（特許文献５）。リポソーム表面に水溶性のポリマー(メトキシポリエチレングリコール：ｍPEG)を化学結合させてRESによる異物認識から回避させる技術であるが、passive targetingと称され制癌剤Doxorubicinのリポソーム製剤として市販（Doxil）されている技術と同様のものである。血管透過性の亢進により腫瘍組織や新生血管部位に集積しやすい特長があるほか、RES細胞にも一部取り込まれるために肝実質細胞への効率的なデリバリー技術とはいえない。

脂溶性ビタミンであるビタミンE(トコフェロール)は酸化防止機能を有することから、脂質小胞体中の不飽和脂肪酸の酸化を防止する目的で小胞体に少量（一般には0.2％程度）添加される形で使用されている（特許文献６、７）。

また、食事由来のビタミンEが小腸から吸収されて血液中で血清成分のカイロミクロンにより肝臓まで運搬されること、更に食事由来以外のビタミンEが血液中ではHDL（高比重リポタンパク質）やLDL（低比重リポタンパク質）に運搬されやすいことを利用して、ビタミンEの主成分であるα−トコフェロールをsiRNAと化学結合させてsiRNAを肝臓へのデリバリーに用いる例がNishina等により報告されている（非特許文献５）。しかしながら、siRNAとα−トコフェロールとを１：１で結合させるための工業スケールでの製造の困難さ、さらにプロドラッグとしての高純度を求められることから、未反応原料や副生成物の除去が必要となる。これらの製造工程と精製工程に由来する収率の低さ、また肝臓導入後に加水分解によるsiRNAの遊離が必要であることから、治療効果を得るためには高価なsiRNAを多量に使用しなければならないという経済的な問題があった。

また、ビタミンAを市販の細胞導入用カチオニックリポソームさらにプラスミドやsiRNAのような核酸と混合させエマルジョンとし、肝星細胞にデリバリーする方法が知られている（特許文献８）。肝星細胞は細網内皮系細胞と同様に非実質細胞で、細胞内に脂肪滴をもちビタミンAを高濃度に貯蔵している。このビタミンAを用いる非実質細胞への送達方法の場合、血液中に大量のビタミンAが存在すれば、血液中のビタミンA結合蛋白によって肝星細胞（非実質細胞）にデリバリーされ易くなるので粒径のコントロールや表面チャージ等のコントロールの必要はない。しかしながら、肝実質細胞内に特異的に生理活性物質を送達する場合には、非実質細胞に粒子がトラップされないように、粒子全体の粒径と表面チャージを適切に調節する必要があり、これまで肝実質細胞への送達用に最適化されたデリバリー粒子は開発されていなかった。

特開2007-110995号 特開2008-054681号 特開2007-112768号 特開1999-290073号 特開2004-196675号 特開2007-112768号 特表2008-530215号 特開2008-50375号

Scherr, M. et al., Oligonucleotides, 2003 ; 13 : 353-363 Song, E. et al., Nature Medicine, 2003 ; 9 : 347-351 Wu, GY and Wu, CH, J. Biol. Chem., 1987 ; 262 : 4429-4432 Watanabe, T. et al., J. Hepatol., 2007 ; 47 : 744-750 Nishina, K. et al., Molecular Therapy, 2008 ; 16(4) : 734-740

本発明は、以上の状況を鑑みてなされたものであり、その目的は、生理活性物質を効率的かつ特異的に肝実質細胞にデリバリー導入させることができ、かつ生理活性物質を肝実質細胞内で有効に作用させるための組成物に関する。

本発明者らは、肝実質細胞へのデリバリー技術について鋭意検討した結果、生理活性物質を含んだ小胞体表面に、血清成分を認識するために十分な量のビタミンEを吸着または化学結合させることにより、血清成分が生理活性物質を含む小胞体を極めて効率よく肝実質細胞にデリバリーさせ、かつ生理活性物質が速やかに効果を発揮できる事を見出し、本発明を完成したものである。

ビタミンEが血液中で肝実質細胞に運搬されやすい性質を、生理活性物質との結合を介さずに、生理活性物質のデリバリーファクターとして利用する極めて安全かつ効率的な方法を見出したものである。

即ち、本発明は以下〔１〕〜〔２４〕の発明に係るものである。
〔１〕下記(i)および(ii)を含む小胞体であって、該小胞体表面にビタミンEが吸着されている、又はビタミンEが小胞体を構成する両親媒性物質に化学結合されていることを特徴とする小胞体。
(i) 両親媒性物質
(ii) カチオン性を有する物質及び／又はアニオン性を有する物質を含む有機物質
〔２〕前記カチオン性を有する物質がカチオニック脂質であることを特徴とする、〔１〕に記載の小胞体。
〔３〕前記カチオニック脂質が下記式（I）で表されるものであることを特徴とする、〔２〕に記載の小胞体。
式（I）

(式中、R¹およびR²は、同一または異なる炭素数１２から２２の飽和または不飽和の炭化水素基を意味し、R³は炭素数１から６のアルキル基または炭素数１から６のヒドロキシアルキル基を意味し、ｍは１から１０の整数を意味し、Xはハロゲン原子を意味する。)
〔４〕前記カチオニック脂質が、飽和又は不飽和脂肪族1級アミン（ステアリルアミン、オレイルアミン）、 飽和又は不飽和2級、3級アミン（ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン）、及び第4級アミン塩（ＤＯＤＡＣ（ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド：dioctadecyldimethylammonium chloride）、ＤＴＤＡＢ（ジテトラデシルジメチルアンモニウムブロマイド：ditetradecyldimethylammonium bromide）、ＤＯＴＭＡ（N-(2,3-ジオレオイル)プロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウム：N-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium）、ＤＤＡＢ（ジドデシルアンモニウムブロマイド：didodecylammonium bromide）、ＤＴＡＢ（ジテトラデシルアンモニウムブロマイド：ditetradecylammonium bromide）、ＤＯＴＡＰ（1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニノプロパン：1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane）、O,O'-ジテトラデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオーアセチル)−ジエタノールアミンクロリド：O,O'-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonio-acetyl)-diethanolamine chloride, O,O'-ジヘキサデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオーアセチル)−ジエタノールアミンクロリド：O,O'-dihexadecanoyl-N-(α-trimethylammonio-acetyl)-diethanolamine chloride, O,O'-ジオクタデカノイル-N-(α-トリメチルアンモニオーアセチル)−ジエタノールアミンクロリド：O,O'-dioctadecanoyl-N-(α-trimethylammonio-acetyl)-diethanolamine chloride,ＤＣ−Ｃｈｏｌ（3β-N-(N',N',-ジメチルアミノエタン)カルバモルコレステロールハイドロクロリド：3β-N-(N',N',-dimethyl-aminoethane)-carbamol cholesterol hydro chloride）、ＤＭＲＩＥ（1,2-ジミリストイルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム：1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium）、ＤＯＳＰＡ（2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミナムトリフルオロアセテート：2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate））からなる群から選択される少なくとも1種類以上を含むことを特徴とする、〔２〕に記載の小胞体。
〔５〕前記両親媒性物質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）付加ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、スフインゴミエリン、カルジオリピン、及びプラスマロゲンからなる群から選択される少なくとも1種類以上のリン脂質であることを特徴とする、〔１〕に記載の小胞体。
〔６〕前記ホスファチジルコリンが、卵黄ホスファチジルコリン、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、水素添加大豆ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイル-オレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレノイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ジエルシロイルホスファチジルコリン、ジエイコサノイルホスファチジルコリン、ジエイコサトリエノイルホスファチジルコリン、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルコリン、ジドコサエノイルホスファチジルコリン、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルコリンからなる群から選択され、
前記ホスファチジルエタノールアミンが、卵黄ホスファチジルエタノールアミン、水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、大豆ホスファチジルエタノールアミン、水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイル-オレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレノイルホスファチジルエタノールアミン、ジデカノイルホスファチジルエタノールアミン、ジエルシロイルホスファチジルエタノールアミン、ジエイコサノイルホスファチジルエタノールアミン、ジエイコサトリエノイルホスファチジルエタノールアミン、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルエタノールアミン、ジドコサエノイルホスファチジルエタノールアミン、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択され、
前記ホスファチジルグリセロールが、卵黄ホスファチジルグリセロール、水素添加卵黄ホスファチジルグリセロール、大豆ホスファチジルグリセロール、水素添加大豆ホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイル-オレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレノイルホスファチジルグリセロール、ジデカノイルホスファチジルグリセロール、ジエルシロイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサノイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサトリエノイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルグリセロール、ジドコサエノイルホスファチジルグリセロール、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルグリセロールからなる群から選択され、
前記ホスファチジルセリンが、卵黄ホスファチジルセリン、水素添加卵黄ホスファチジルセリン、大豆ホスファチジルセリン、水素添加大豆ホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイル-オレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレノイルホスファチジルセリン、ジデカノイルホスファチジルセリン、ジエルシロイルホスファチジルセリン、ジエイコサノイルホスファチジルセリン、ジエイコサトリエノイルホスファチジルセリン、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルセリン、ジドコサエノイルホスファチジルセリン、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルセリンからなる群から選択され、
前記ホスファチジルイノシトールが、卵黄ホスファチジルイノシトール、水素添加卵黄ホスファチジルイノシトール、大豆ホスファチジルイノシトール、水素添加大豆ホスファチジルイノシトール、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、パルミトイル-オレオイルホスファチジルイノシトール、ジリノレオイルホスファチジルイノシトール、ジリノレノイルホスファチジルイノシトール、ジデカノイルホスファチジルイノシトール、ジエルシロイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサノイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサトリエノイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルイノシトール、ジドコサエノイルホスファチジルイノシトール、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルイノシトールからなる群から選択され、
前記メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）付加ホスファチジルエタノールアミンが、ｍＰＥＧ２０００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００-ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、及びｍＰＥＧ５０００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択され、
前記ホスファチジン酸が、卵黄ホスファチジン酸、水素添加卵黄ホスファチジン酸、大豆ホスファチジン酸、水素添加大豆ホスファチジン酸、ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミトイル-オレオイルホスファチジン酸、ジリノレノイルホスファチジン酸、ジデカノイルホスファチジン酸、ジエルシロイルホスファチジン酸、ジエイコサノイルホスファチジン酸、ジエイコサトリエノイルホスファチジン酸、ジエイコサペンタエノイルホスファチジン酸、ジドコサエノイルホスファチジン酸、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジン酸からなる群から選択され、
前記スフインゴミエリンが、卵黄由来スフインゴミエリン又は牛乳由来スフインゴミエリンであり、
前記カルジオリピンが、卵黄カルジオリピン、水素添加卵黄カルジオリピン、大豆カルジオリピン、水素添加大豆カルジオリピン、ジラウロイルカルジオリピン、ジミリストイルカルジオリピン、ジパルミトイルカルジオリピン、ジステアロイルカルジオリピン、ジオレオイルカルジオリピン、パルミトイル-オレオイルカルジオリピン、ジリノレオイルカルジオリピン、ジリノレノイルカルジオリピン、ジデカノイルカルジオリピン、ジエルシロイルカルジオリピン、ジエイコサノイルカルジオリピン、ジエイコサトリエノイルカルジオリピン、ジエイコサペンタエノイルカルジオリピン、ジドコサエノイルカルジオリピン、及びジドコサヘキサエノイルカルジオリピンからなる群から選択されるという特徴を有する、〔５〕に記載の小胞体。
〔７〕前記カチオン性を有する物質が、カチオン性ポリマーであることを特徴とする〔１〕に記載の小胞体。
〔８〕前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン又はポリリジンであることを特徴とする〔７〕に記載の小胞体。
〔９〕前記アニオン性を有する物質が、酸性リン脂質であることを特徴とする〔１〕に記載の小胞体。
〔１０〕前記酸性リン脂質が、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、メトキシポリエチレングリコール付加ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸からなる群から選択される少なくとも1種類以上を含むことを特徴とする、〔９〕に記載の小胞体。
〔１１〕前記ホスファチジルグリセロールが、卵黄ホスファチジルグリセロール、水素添加卵黄ホスファチジルグリセロール、大豆ホスファチジルグリセロール、水素添加大豆ホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイル-オレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレノイルホスファチジルグリセロール、ジデカノイルホスファチジルグリセロール、ジエルシロイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサノイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサトリエノイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルグリセロール、ジドコサエノイルホスファチジルグリセロール、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルグリセロールからなる群から選択され、
前記ホスファチジルセリンが、卵黄ホスファチジルセリン、水素添加卵黄ホスファチジルセリン、大豆ホスファチジルセリン、水素添加大豆ホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイル-オレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレノイルホスファチジルセリン、ジデカノイルホスファチジルセリン、ジエルシロイルホスファチジルセリン、ジエイコサノイルホスファチジルセリン、ジエイコサトリエノイルホスファチジルセリン、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルセリン、ジドコサエノイルホスファチジルセリン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルセリンからなる群から選択され、
前記ホスファチジルイノシトールが、卵黄ホスファチジルイノシトール、水素添加卵黄ホスファチジルイノシトール、大豆ホスファチジルイノシトール、水素添加大豆ホスファチジルイノシトール、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、パルミトイル-オレオイルホスファチジルイノシトール、ジリノレオイルホスファチジルイノシトール、ジリノレノイルホスファチジルイノシトール、ジデカノイルホスファチジルイノシトール、ジエルシロイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサノイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサトリエノイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルイノシトール、ジドコサエノイルホスファチジルイノシトール、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルイノシトールからなる群から選択され、
前記メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）付加ホスファチジルエタノールアミンが、ｍＰＥＧ２０００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００-ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、及びｍＰＥＧ５０００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択され、
前記ホスファチジン酸が、卵黄ホスファチジン酸、水素添加卵黄ホスファチジン酸、大豆ホスファチジン酸、水素添加大豆ホスファチジン酸、ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミトイル-オレオイルホスファチジン酸、ジリノレノイルホスファチジン酸、ジデカノイルホスファチジン酸、ジエルシロイルホスファチジン酸、ジエイコサノイルホスファチジン酸、ジエイコサトリエノイルホスファチジン酸、ジエイコサペンタエノイルホスファチジン酸、ジドコサエノイルホスファチジン酸、およびジドコサヘキサエノイルホスファチジン酸からなる群から選択されることを特徴とする、〔１０〕に記載の小胞体。
〔１２〕前記ビタミンEが、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、及びδ−トコフェロールからなる群から選択される少なくとも1種類以上を含むことを特徴とする、〔１〕に記載の小胞体。
〔１３〕前記ビタミンEが、dl-α-トコフェロールであることを特徴とする〔１〕に記載の小胞体。
〔１４〕前記カチオン性を有する物質が、小胞体を構成する物質全体のモル数の10〜50％の範囲で含まれていることを特徴とする〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の小胞体。
〔１５〕前記ビタミンEが、小胞体を構成する物質全体のモル数の、3〜30％の範囲で吸着又は化学結合されていることを特徴とする〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の小胞体。
〔１６〕前記ビタミンEが、小胞体を構成する物質全体のモル数の、5〜20％の範囲で吸着又は化学結合されていることを特徴とする〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の小胞体。
〔１７〕前記小胞体の粒径が50〜150nmの範囲であることを特徴とする、〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の小胞体。
〔１８〕プラスミドDNA、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ウイルス剤、及び細胞傷害性物質からなる群から選択される少なくとも1種類以上の生理活性物質を小胞体が内封する、及び／又は該生理活性物質が小胞体の成分に疎水的又は静電的に結合することを特徴とする、〔１〕〜〔１７〕のいずれかに記載の小胞体。
〔１９〕小胞体表面のゼータ電位がアニオニックであることを特徴とする〔１８〕に記載の小胞体。
〔２０〕前記生理活性物質が、抗ウイルス剤であることを特徴とする〔１８〕に記載の小胞体。
〔２１〕前記細胞傷害性物質が、代謝拮抗剤、プラチナ系剤、アルキル化剤、植物アルカロイド、分子標的薬、生物学的応答調節剤、及び抗がん性抗生物質からなる群から選択される少なくとも1種類以上を含むことを特徴とする、〔１８〕に記載の小胞体。
〔２２〕前記代謝拮抗剤が、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、及びメトトレキサートからなる群から選択され、
前記プラチナ製剤が、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、及びネダプラチンからなる群から選択され、
前記アルキル化剤が、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、及びラニムスチンからなる群から選択され、
前記植物アルカロイドが、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチンから選ばれるものであり、分子標的薬がイマチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブからなる群から選択され、
前記生物学的応答調節剤が、インターフェロンーα、インターフェロンーβ、インターフェロンーγ、インターロイキンからなる群から選択され、
前記抗がん性抗生物質が、アクラルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンC、及びミトキサントロンからなる群から選択されることを特徴とする、〔２１〕に記載の小胞体。
〔２３〕〔１８〕〜〔２２〕のいずれかに記載の小胞体、及び薬学的に許容される担体を含む、生理活性物質を血清存在下で肝実質細胞に送達するために用いられるキット。
〔２４〕〔１８〕〜〔２２〕のいずれかに記載の小胞体を、対象に投与する工程を含む、対象において生理活性物質を肝実質細胞に送達する方法。

インビトロ系でのリポソームによるsiRNAの導入結果を示す図である。ルシフェラーゼ遺伝子を含むHCVレプリコン細胞R6 FLR41-14細胞に、〔比較例１〕のリポソーム分散液あるいはトコフェロールを加えて調整した〔実施例1〕及び〔実施例２〕記載のリポソーム分散液を用いてsiRNAを導入し、そのHCV複製阻害活性を検討した。高濃度での成績を示した。 インビトロ系でのリポソームによるsiRNAの導入結果を示す図である。ルシフェラーゼ遺伝子を含むHCVレプリコン細胞R6 FLR41-14細胞に、〔比較例１〕及び〔比較例２〕のリポソーム分散液あるいはトコフェロールを加えて調整した〔実施例1〕及び〔実施例２〕記載のリポソーム分散液を用いてsiRNAを導入し、そのHCV複製阻害活性を検討した。低濃度での成績を示した。 HCV遺伝子をスイッチング発現するトランスジェニック（Cre/loxP/HCV-MxCre Tg）マウスの遺伝子発現原理を示す図である。 HCV遺伝子をスイッチング発現するトランスジェニック（Cre/loxP/HCV-MxCre Tg）マウスのHCVコア遺伝子発現量の経日変化を示す図である。 遺伝子発現43日後のCre/loxP/HCV-MxCre Tgマウスに〔実施例1〕で製造したリポソーム分散液とsi197-1複合体(0.3mg siRNA/kg体重)を投与して、そのHCV遺伝子発現阻害活性の評価結果を示す図である。

本発明は、下記(i)および(ii)を含む小胞体であって、該小胞体表面にビタミンEが吸着されている、又はビタミンEが小胞体を構成する両親媒性物質に化学結合されていることを特徴とする小胞体に関する。
(i) 両親媒性物質
(ii) カチオン性を有する物質及び／又はアニオン性を有する物質を含む有機物質

本発明で使用される両親媒性物質は、好ましくは水中で互いに会合してナノからサブミクロンの小胞体を形成する。また、本発明の両親媒性物質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）付加ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、スフインゴミエリン、カルジオリピン、プラスマロゲンで代表されるリン脂質やコレステロールのポリ多糖（プルラン、マンナン等）縮合体、ポリエチレングリコールのポリアミノ酸（ポリアスパラギン酸など）縮合体からなる群から選択される少なくとも1種類以上のリン脂質及び／又は少なくとも１種以上のポリマー縮合体を挙げることができる。本発明においては、両親媒性物質として前記リン脂質及び／又は前記ポリマー縮合体とコレステロールが併用されていてもよい。

本発明において、ホスファチジルコリンとしては、卵黄ホスファチジルコリン、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、水素添加大豆ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイル-オレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレノイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ジエルシロイルホスファチジルコリン、ジエイコサノイルホスファチジルコリン、ジエイコサトリエノイルホスファチジルコリン、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルコリン、ジドコサエノイルホスファチジルコリン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルコリン等を例示することができる。

ホスファチジルエタノールアミンとしては、卵黄ホスファチジルエタノールアミン、大豆ホスファチジルエタノールアミン、水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイル-オレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレノイルホスファチジルエタノールアミン、ジデカノイルホスファチジルエタノールアミン、ジエルシロイルホスファチジルエタノールアミン、ジエイコサノイルホスファチジルエタノールアミン、ジエイコサトリエノイルホスファチジルエタノールアミン、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルエタノールアミン、ジドコサエノイルホスファチジルエタノールアミン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミン等を例示することができる。

ホスファチジルグリセロールとしては、卵黄ホスファチジルグリセロール、水素添加卵黄ホスファチジルグリセロール、大豆ホスファチジルグリセロール、水素添加大豆ホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイル-オレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレノイルホスファチジルグリセロール、ジデカノイルホスファチジルグリセロール、ジエルシロイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサノイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサトリエノイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルグリセロール、ジドコサエノイルホスファチジルグリセロール、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルグリセロール等を例示することができる。

ホスファチジルセリンとしては、卵黄ホスファチジルセリン、水素添加卵黄ホスファチジルセリン、大豆ホスファチジルセリン、水素添加大豆ホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイル-オレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレノイルホスファチジルセリン、ジデカノイルホスファチジルセリン、ジエルシロイルホスファチジルセリン、ジエイコサノイルホスファチジルセリン、ジエイコサトリエノイルホスファチジルセリン、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルセリン、ジドコサエノイルホスファチジルセリン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルセリン等を例示することができる。

ホスファチジルイノシトールとしては、卵黄ホスファチジルイノシトール、水素添加卵黄ホスファチジルイノシトール、大豆ホスファチジルイノシトール、水素添加大豆ホスファチジルイノシトール、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、パルミトイル-オレオイルホスファチジルイノシトール、ジリノレオイルホスファチジルイノシトール、ジリノレノイルホスファチジルイノシトール、ジデカノイルホスファチジルイノシトール、ジエルシロイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサノイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサトリエノイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルイノシトール、ジドコサエノイルホスファチジルイノシトール、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルイノシトール等を例示することができる。

メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）付加ホスファチジルエタノールアミンとしては、ｍＰＥＧ２０００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００-ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ２０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等から選ぶことができる。

ホスファチジン酸としては、卵黄ホスファチジン酸、水素添加卵黄ホスファチジン酸、大豆ホスファチジン酸、水素添加大豆ホスファチジン酸、ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミトイル-オレオイルホスファチジン酸、ジリノレノイルホスファチジン酸、ジデカノイルホスファチジン酸、ジエルシロイルホスファチジン酸、ジエイコサノイルホスファチジン酸、ジエイコサトリエノイルホスファチジン酸、ジエイコサペンタエノイルホスファチジン酸、ジドコサエノイルホスファチジン酸、ジドコサヘキサエノイルホスファチジン酸等を例示することができる。

スフインゴミエリンとしては、卵黄由来スフインゴミエリン又は牛乳由来スフインゴミエリンを例示することができ、
カルジオリピンとしては卵黄カルジオリピン、水素添加卵黄カルジオリピン、大豆カルジオリピン、水素添加大豆カルジオリピン、ジラウロイルカルジオリピン、ジミリストイルカルジオリピン、ジパルミトイルカルジオリピン、ジステアロイルカルジオリピン、ジオレオイルカルジオリピン、パルミトイル-オレオイルカルジオリピン、ジリノレオイルカルジオリピン、ジリノレノイルカルジオリピン、ジデカノイルカルジオリピン、ジエルシロイルカルジオリピン、ジエイコサノイルカルジオリピン、ジエイコサトリエノイルカルジオリピン、ジエイコサペンタエノイルカルジオリピン、ジドコサエノイルカルジオリピン、ジドコサヘキサエノイルカルジオリピン等を例示することができる。

なお、ここで記載したものは一例であり、同種の構造を有するものであればここに記載した化合物に限定せずに使用できるものである。

本発明において、生理活性物質として核酸等のポリアニオン性物質を使用する場合、小胞体の構成成分として電気的結合のためにカチオン性を有する物質を使用することができる。カチオン性を有する物質としては、好ましくはカチオニック脂質を例示することができ、より好ましくは、下記式（I）で表される化合物を例示することが出来る。
式（I）

(式中、R1およびR2は、同一または異なって、炭素数１２から２２の飽和または不飽和の炭化水素基を意味し、R3は炭素数１から６のアルキル基または炭素数１から６のヒドロキシアルキル基を意味し、ｍは１から１０の整数を意味し、Xはハロゲン原子を意味する。)

該化合物としては、N-（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−D−グルタメート クロリド、N-（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−L−グルタメート クロリド、N-（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオクタデシル−D−グルタメート クロリド、N-（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオレイル−D−グルタメート クロリド、N-ω−トリメチルアンモニオデカノイルデヘキサデシル−D−グルタメート ブロマイド、N-ω−トリメチルアンモニオデカノイルデヘキサデシル−L−グルタメート ブロマイド等を例示することができ、これらは市販されて（相互薬工株式会社）いるものを用いることができる。その他のカチオン性物質としては、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族1級アミン；ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和2級、3級アミン；或いはＤＯＤＡＣ（ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド：dioctadecyldimethylammonium chloride）、ＤＯＴＭＡ（N-(2,3-ジオレオイル)プロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウム：N-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium）、ＤＤＡＢ（ジドデシルアンモニウムブロマイド：didodecylammonium bromide）、ＤＯＴＡＰ（1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニノプロパン：1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane）、
ＤＣ−Ｃｈｏｌ（3β-N-(N',N',-ジメチルアミノエタン)カルバモルコレステロールハイドロクロリド：3β-N-(N',N',-dimethyl-aminoethane)-carbamol cholesterol hydro chloride）、ＤＭＲＩＥ（1,2-ジミリストイルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム：1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium）、ＤＯＳＰＡ（2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミナムトリフルオロアセテート：2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate ）からなる群から選択される少なくとも1種類以上の混合物を用いても良い。

また、ポリカチオンであるポリエチレンイミンやポリリジンを用いることもできる。
本発明において、生理活性物質として細胞傷害性物質、低分子抗ウイルス剤等の非極性物質或いは極性基を多く有しない物質を使用する場合、（１）小胞体内部に内包する或いは（２）膜構成成分と疎水結合させて膜中に入れるか、のいずれかの方法が用いられる。これらの場合は静電反発を利用して小胞体同士の凝集を防止する目的で、アニオン性を有する物質を使用することができる。アニオン性を有する物質としては、好ましくは酸性リン脂質を例示することができる。
酸性リン脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、メトキシポリエチレングリコール付加ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸を例示することができる。

ホスファチジルグリセロールとしては、卵黄ホスファチジルグリセロール、水素添加卵黄ホスファチジルグリセロール、大豆ホスファチジルグリセロール、水素添加大豆ホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイル-オレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレノイルホスファチジルグリセロール、ジデカノイルホスファチジルグリセロール、ジエルシロイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサノイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサトリエノイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルグリセロール、ジドコサエノイルホスファチジルグリセロール、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルグリセロールを例示することができる。

ホスファチジルセリンとしては、卵黄ホスファチジルセリン、水素添加卵黄ホスファチジルセリン、大豆ホスファチジルセリン、水素添加大豆ホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイル-オレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレノイルホスファチジルセリン、ジデカノイルホスファチジルセリン、ジエルシロイルホスファチジルセリン、ジエイコサノイルホスファチジルセリン、ジエイコサトリエノイルホスファチジルセリン、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルセリン、ジドコサエノイルホスファチジルセリン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルセリンを例示することができる。

ホスファチジルイノシトールとしては、卵黄ホスファチジルイノシトール、水素添加卵黄ホスファチジルイノシトール、大豆ホスファチジルイノシトール、水素添加大豆ホスファチジルイノシトール、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、パルミトイル-オレオイルホスファチジルイノシトール、ジリノレオイルホスファチジルイノシトール、ジリノレノイルホスファチジルイノシトール、ジデカノイルホスファチジルイノシトール、ジエルシロイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサノイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサトリエノイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルイノシトール、ジドコサエノイルホスファチジルイノシトール、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルイノシトールを例示することができる。

メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）付加ホスファチジルエタノールアミンとしては、ｍＰＥＧ２０００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００-ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、及びｍＰＥＧ５０００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを例示することができる。

ホスファチジン酸としては、卵黄ホスファチジン酸、水素添加卵黄ホスファチジン酸、大豆ホスファチジン酸、水素添加大豆ホスファチジン酸、ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミトイル-オレオイルホスファチジン酸、ジリノレノイルホスファチジン酸、ジデカノイルホスファチジン酸、ジエルシロイルホスファチジン酸、ジエイコサノイルホスファチジン酸、ジエイコサトリエノイルホスファチジン酸、ジエイコサペンタエノイルホスファチジン酸、ジドコサエノイルホスファチジン酸、およびジドコサヘキサエノイルホスファチジン酸を例示することができる。

本発明において、小胞体表面に吸着或いは化学結合させるビタミンEは、特に限定されるものではないが、好ましくはα−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、及びδ−トコフェロールからなる群から選択される少なくとも1種類以上のビタミンEを例示することができる。また、ビタミンEのより好ましい例としては、dl-α-トコフェロールを挙げることができる。

小胞体表面に吸着或いは化学結合させるビタミンEの量は、血清中の粒子が認識するに十分な量であるが、具体的には小胞体を構成する物質全体のモル数の、好ましくは3〜30％の範囲で吸着又は化学結合されている必要があり、より好ましくは5〜20％の範囲で吸着又は化学結合されている必要がある。これら結合の割合が小さい場合は血清粒子のビタミンE認識力が弱く、肝実質細胞へのデリバリー効率が悪い。多過ぎる場合は、吸着したビタミンE同士が疎水結合により小胞体同士が会合しやすくなるために平均粒径が増大する。平均粒径が増大することにより血液中のRESにトラップされやすくなり、その結果肝実質細胞へのデリバリー効率も低下する。結合の場合には、両親媒性物質であるホスファチジルエタノールアミンのアミノ基の先端にグルタール酸等の二塩基酸を結合させ、一方のカルボン酸とビタミンEの水酸基を縮合させたエステルなどが用いられる。血清成分が認識できれば良いので、二塩基酸の代わりに末端が活性基で置換されたポリエチレングリコールを用いても良い。ビタミンEを結合させる方法はこれらに留まらず、一般に知られている方法のいずれでも可能である。

ビタミンEを上記の範囲内で添加することにより、血清粒子による認識力が適正化され、小胞体同士の会合も防止できることから、肝実質細胞への効率的なデリバリーが実現できる。

小胞体の粒子径は、生体外の実質肝細胞へのデリバリーの場合20〜500nmでも十分であるが、生体内静脈投与の場合には 50〜150nmに制御することにより、RESにトラップされること無く、血清中のLDLに代表される粒子によって肝実質細胞まで運ばれる。

小胞体の粒径が小さすぎる場合は、生理活性物質をデリバリーする効率が悪く、大きすぎる場合は生体内のRESにトラップされて、肝実質細胞までデリバリーされにくくなる。従って、vivoにおいてデリバリー効果を十分に発揮させるためには50〜150nmの粒径を有する小胞体が全体の６０％以上であることがより好ましい。本発明は、50nmから150nmの粒径を有する小胞体が、小胞体集団全体の６０％以上であることを特徴とする小胞体集団も包含する。

本発明は、プラスミドDNA、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ウイルス剤、及び細胞傷害性物質からなる群から選択される少なくとも1種類以上の生理活性物質を小胞体が内封する、及び／又は該生理活性物質が小胞体の成分に疎水的又は静電的に結合する小胞体に関する。

本発明は、小胞体表面のゼータ電位がアニオニックである小胞体に関する。該生理活性物質が小胞体の成分に静電的に結合することによりアニオニックとなることが好ましいが、その形態は特に限定されるものではない。

本発明において生理活性物質として用いられるsiRNAは特に限定されないが、好ましくは、配列番号：１に記載のオリゴリボヌクレオチド、及び配列番号：２に記載のオリゴヌクレオチドを含むsiRNAを例示することができる。

本発明において生理活性物質として用いられる抗ウイルス剤は、抗HCV剤や抗HBV剤などウイルス性肝疾患の治療を目的とした薬剤であれば特に限定されないが、好ましくは抗HCV剤である。本発明の抗ウイルス薬としては、HCVやHBVに対するプラスミドDNA、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸系の薬剤だけでなく、低分子抗ウイルス剤なども含まれる。低分子抗ウイルス剤は特に限定されないが、ウイルス遺伝子がコードするポリメラーゼやプロテアーゼなどの阻害剤、その他抗ウイルス活性を有する低分子化合物であればよく、具体的な化合物としてはリバビリン（1-β-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-tri-azole-3-carboxamide）などを例示することができる。

本発明において、細胞傷害性物質としては、代謝拮抗剤、プラチナ系剤、アルキル化剤、植物アルカロイド、分子標的薬、生物学的応答調節剤、及び抗がん性抗生物質からなる群から選択される少なくとも1種類以上を含む細胞傷害性物質を例示することができる。

代謝拮抗剤としては、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、及びメトトレキサートを例示することが出来る。

プラチナ製剤としては、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、及びネダプラチンを例示することができる。

アルキル化剤としては、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、及びラニムスチンを例示することができる。

植物アルカロイドとしては、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチンから選ばれるものであり、分子標的薬がイマチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブを例示することができる。

生物学的応答調節剤としては、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、インターロイキンを例示することができる。

抗がん性抗生物質としては、アクラルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンC、及びミトキサントロンを例示することができる。

本発明は、当該小胞体、及び薬学的に許容される担体を含む、生理活性物質を血清存在下で肝実質細胞に送達するために用いられるキットに関する。

本発明の医薬組成物およびキットには、薬学的に許容される担体が含まれてもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤(アスコルビン酸等)、緩衝剤(リン酸、クエン酸、他の有機酸等)、防腐剤、界面活性剤(PEG、Tween等)、キレート剤(EDTA等)、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール(エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、PEG等)、非イオン性界面活性剤(ポリソルベート80、HCO-50)等と併用してもよい。

また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる。

また本発明のキットは、キットを使用するための方法が記載された取扱説明書が添付されていてもよい。

本発明は、当該小胞体を、対象に投与する工程を含む、対象において生理活性物質を肝実質細胞に送達する方法に関する。本発明の小胞体は、対象に投与された後、対象内の血清成分により、選択的に肝実質細胞へ送達される。

本発明において対象への投与は経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与である。本発明の小胞体からなる組成物の形態（剤型）としては、特に制限はなく、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与剤型、凍結乾燥剤型、溶液剤型などが挙げられる。

注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、対象の状態（対象がヒト患者である場合には、患者の年齢、症状）によって適宜投与方法を選択することができる。

血清粒子によりデリバリーされた生理活性物質を含む小胞体は、肝実質細胞内で直ちに生理活性作用を発揮する。例えば生理活性物質がsiRNAの場合には、従来技術である肝細胞表面の糖タンパク受容体を経由してデリバリーされた生理活性物質がライソゾーム内で代謝分解されるのに対して、本発明技術によれば４８時間以内にノックダウン効果が見られる。

また、一般にはsiRNAを小胞体の表面に静電結合させたカチオニックリポソームが知られているが、細胞表面とのインタラクションのためにアニオンであるsiRNAをカチオニック脂質或いはカチオニックポリマーより低い量で添加し、小胞体表面のゼータ電位をプラス（カチオン性）として用いられる。しかしながら、カチオン性が残存したままで血中に投与すると肺に存在するRESや血清中のアルブミンなどにトラップ或いは結合しやすいために、肝実質細胞へのデリバリー効率が低くなる。これを避けるためには、小胞体の表面のゼータ電位をマイナス電位とすることがきわめて重要で、siRNAなどの核酸系生理活性物質の小胞体への添加量をカチオニック脂質或いはカチオニックポリマーの等電点より多く使用する必要がある。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

１．生体外肝実質細胞へのsiRNAのデリバリー（in vitro）
〔実施例１〕
N-（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオレイル−D−グルタメート クロリド (相互薬工株式会社、日本；製品名：DC-3-18:1)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(日油株式会社、日本)及びコレステロール（和光純薬株式会社、日本）を、配合比４０：３０：３０(モル比)にて適量のクロロホルムに溶解させ、これを減圧下に溶媒を留去させながら乾固させて、脂質混合物とした。

溶媒が確実に除去できるまでデシケーターにて乾燥させた後、この脂質混合物に９％スクロース溶液を加え、65℃加温下、ソニケーターで間接的に超音波照射することで全体の脂質濃度2.5 mMのリポソーム粗分散液を得た。次に、リポソームの粒子径を揃えるため、孔径0.2 μmのフイルターを２枚重ねてエクストル―ダーにセットし、約６５℃加温・加圧下にエクストルージョン（押し出しろ過）した。更に孔径0.1 μmのフイルターを２枚用いて同様にエクストルージョンし、これを空のリポソーム分散液とした。平均粒径は136.1 nmであった。

DL-α-トコフェロール（東京化成株式会社、日本）5 μmolに対して400 μLのエチルアルコールの割合で溶解させて、0.2 μmのフイルターでろ過した液（トコフェロール液）を調整した。
50 mＬバイアル中に、リポソーム分散液10 mＬを入れ更にトコフェロール液400 μLを入れて（全脂質モル数に対して20 ％）、ボルテックスにて20 秒間混合攪拌した。更に1時間室温にて1時間インキュベーションしてビタミンE吸着リポソーム分散液を得た。平均粒径は124.2 nmであった。

〔実施例２〕
DL-α-トコフェロール（東京化成株式会社、日本）2.5 μmolに対して400 μLのエチルアルコールの割合で溶解させて、0.2 μmのフイルターでろ過した液（トコフェロール液）を調整した。
50 mＬバイアル中に、〔実施例１〕で作製したリポソーム分散液10 mLを入れ更にトコフェロール液400 μLを入れて（全脂質モル数に対して10.0 ％）、ボルテックスにて20秒間混合攪拌した。更に室温にて１時間インキュベーションしてビタミンE吸着リポソーム分散液を得た。平均粒径は136.7 nmであった。

〔実施例３〕
DL-α-トコフェロール（東京化成株式会社、日本）3.75 μmolに対して400 μLのエチルアルコールの割合で溶解させて、0.2 μmのフイルターでろ過した液（トコフェロール液）を調整した。
50 mＬバイアル中に、〔実施例１〕で作製したリポソーム分散液10 mＬを入れ更にトコフェロール液400 μLを入れて（全脂質モル数に対して15.0 ％）、ボルテックスにて20 秒間混合攪拌した。更に１時間室温にて１時間インキュベーションしてビタミンE吸着リポソーム分散液を得た。平均粒径は133.5 nmであった。

〔実施例４〕
N-（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオレイル−D−グルタメート クロリド (相互薬工株式会社、日本；製品名：DC-3-18:1D)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(日油株式会社、日本)及びコレステロール（和光純薬株式会社、日本）を配合比４０：３０：３０(モル比)にて適量のクロロホルムに溶解させ、これを減圧下に溶媒を留去させながら乾固させて、脂質混合物とした。溶媒が確実に除去できる間でデシケーターにて乾燥させた後、この脂質混合物に９％スクロース溶液を加え、65℃加温下、ソニケーターで間接的に超音波照射することで全体の脂質濃度2.5mMのリポソーム粗分散液を得た。次に、リポソームの粒子径を揃えるため、孔径０．２μmのフイルターを２枚重ねてエクストル―ダーにセットし、約６５℃加温・加圧下にエクトルージョン（押し出しろ過）した。更に孔径０．１μmのフイルターを２枚用いて同様にエクトルージョンし、これを空のリポソーム分散液とした。平均粒径は１３８．７nmであった。
次にNano-Mizer mark II NM2-L200（吉田機械興業株式会社、日本）にて、１００MPaの加圧下に3回通過させて更なる微粒子化処理を行った結果、平均粒径は５５．７nmであった。

DL-α-トコフェロール（東京化成株式会社、日本）５μmolに対して４００μLのエチルアルコールの割合で溶解させて、０．２μmのフイルターでろ過した液（トコフェロール液）を調整した。
５０mＬバイアル中に、リポソーム分散液１０mＬを入れ更にトコフェロール液３２０μLを入れて（全脂質モル数に対して１６％）、ボルテックスにて２０秒間混合攪拌した。更に１時間室温にて１時間インキュベーションしてビタミンE吸着リポソーム分散液を得た。平均粒径は５８．０nmであった。

〔比較例１〕
〔実施例１〕で作製した平均粒径136.1 nmのリポソーム分散液をそのまま用いた(トコフェロール無添加)。
〔比較例２〕
DL-α-トコフェロール（東京化成株式会社、日本）20 μmolを400 μLのエチルアルコールに溶解させて、0.2 μmのフイルターでろ過した液（トコフェロール液）を調整した。

50 mLバイアル中に、〔実施例１〕で作製したリポソーム分散液5 mLを入れ更に調整したトコフェロール液200μLを入れて（全脂質モル数に対して80．0 ％）、ボルテックスにて20秒間混合攪拌した。更に室温にて１時間インキュベーションしてビタミンE吸着リポソーム分散液を得た。平均粒径は190.1 nmであった。

標記調整した種々のリポソーム（上記〔実施例１〕〜〔実施例３〕及び〔比較例１〕〜〔比較例２〕）を用いて、生体外の肝実質細胞への導入試験(in vitro試験)およびマウスへの導入試験(in vivo試験)を行い、実施例と比較例とを比べて本発明の効果を以下に示す。
なお、実施例はこれだけに留まるわけではなく、一例に過ぎないことを明記しておく。

〔細胞試験実施例１〕デザインしたsiRNAのC型肝炎ウイルス(HCV)レプリコン複製阻害活性の検討
C型肝炎は、日本国内で200万人、世界的には２億人以上にものぼる感染者が存在する、重大な感染症の一つである。その大きな特徴は、C型肝炎ウイルス（HCV）がヒトに感染すると、80〜90％の高率で持続感染化し、慢性肝炎、さらには肝細胞がんを引き起こすことにある。現行のペグインターフェロン・リバビリン併用療法により治療成績の向上をみたものの、未だに治療効果は十分とは言えず、より有効で副作用の少ない治療の開発が急務となっている。そこで、短い二本鎖RNA (siRNA)によるHCVの制御を試みた。

短い二本鎖RNA (siRNA)が哺乳類細胞のインターフェロン(IFN)応答を回避し、RNAiを引き起こす発見から、遺伝子ノックダウン法としてこれまで広く用いられてきた。しかし近年siRNAもOff Target効果によりIFN応答を誘導することが報告され、単に二本鎖RNA (dsRNA)の長さを短くすることだけでなくさらに配列、核酸修飾など改良が検討されている。本発明者らは、新規の抗ウイルス療法として期待されるRNA干渉（RNA interference; RNAi）によるHCV複製阻害と、治療応用に向けたsiRNAによるHCVターゲッティングを進めてきた。しかし、siRNAを効率よく標的臓器である肝臓に導入するのが困難であり、ドラッグデリバリーシステム（DDS）の開発が急務となっている。この問題を解決するために以下の検討を行った。

<siRNAのHCVレプリコン細胞へのトランスフェクション>
本実施例では、ルシフェラーゼ遺伝子を含むHCVレプリコン細胞としてR6 FLR41-14細胞（Watanabe, T. et al., Gene Theraphy 13: 883-892 (2006)）を用いて、siRNAアッセイを行った。各々の細胞の細胞数を数え、10% 非働化済FCSを含むDMEM+GlutaMax-Iにけん濁し、R6 FLR41-14細胞は4500cells/100 μL/wellで96wellにまき、翌日にsiRNAのトランスフェクションを行った。siRNAはsi197-1（センス鎖5'- AUCAUGAGCACAAAUCCUAAA -3'、配列番号：１、アンチセンス鎖(3'- CGUAGUACUCGUGUUUAGGAU -5'、配列番号：２）を使用した。siRNAの終濃度は、0.01、0.04、0.11、0.33、1、1.1、3、3.3、10、30、90 nMとした。

各siRNAサンプルを0.23%のNaHCO₃を含むopti-MEMで、90nMから3倍階段希釈で10段階の希釈系列を作製した。50 μLのsiRNA溶液に0.5 μLの〔比較例１〕のリポソーム分散液、あるいはトコフェロールを加えて調整した〔実施例1〕及び〔実施例２〕記載のリポソーム分散液をそれぞれ加えた。十分に混和後、室温で20分間インキュベートして、siRNA-Liposome複合体を作製した。各希釈系列のサンプルを、ルシフェラーゼアッセイ用の細胞培養用マルチプレート96FII（白）（住友ベークライト、日本 cat.#MS-8096W）と細胞毒性測定用の96ウェルプレート（BD, cat.#353072）にそれぞれn=3で10 μL/96-wellで加えた。〔比較例１〕のリポソーム分散液あるいはトコフェロールを加えて調整した〔実施例1〕及び〔実施例２〕記載のリポソーム分散液のみをそれぞれ加えたウェル(Lipo CTRL)をコントロールとした。37℃、5% CO₂にてインキュベートし、72時間後にルシフェラーゼアッセイおよびWST-8による細胞毒性試験を行った。
それぞれの、コンジュゲート前後の粒径とゼータ電位を表１に示した。

表１からsiRNAをコンジュゲートさせる前後で、ぜータ電位がカチオニックからアニオニックに変換できていることがわかる。

<ルシフェラーゼ活性測定方法>
ルシフェラーゼ活性測定においては、Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega, cat.#E2620)を使用した。方法は論文（Watanabe, T. et al., Gene Therapy 13: 883-892 (2006)）にしたがった。
ルシフェラーゼアッセイ用96ウェルプレートの全ウェルの培地を廃棄し、5% 非働化済FCSを含むDMEM+GlutaMax-Iを75 μL/wellで加え、培地交換した。Bright-Glo Luciferase Assay Systemを75μL/wellで加えて、Mithras LB 940（Berthold）で1分間振とうした後、ルシフェラーゼ活性を測定した。

<細胞毒性測定>
細胞毒性測定においては、Cell Counting Kit-8（Dojindo, cat.#343-07623）を使用した。
Cell Counting Kit-8溶液を、5%非働化済FCSを含むDMEM+GlutaMax-Iで7%に希釈し、アッセイ用の溶液を作製した。細胞毒性試験用の96ウェルプレートの全ウェルの培地を廃棄し、上述のアッセイ用の溶液を100 μL/wellで加え、37℃、5% CO2にて1時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Bio-Rad model 550）を用いて、波長450 nm（参照波長655 nm）を測定した。
その結果トコフェロールを付加した〔実施例１〕及び〔実施例２〕で製造のリポソーム分散液は強力なHCVレプリコン複製阻害活性を示し、細胞毒性については軽微であることが明らかになった。〔比較例１〕のリポソーム分散液に比較して〔実施例２〕で製造のリポソームは約100倍、〔実施例１〕で製造のリポソーム分散液は約1000倍のHCVレプリコン複製阻害活性を示した（図１、図２）。

２．生体内肝実質細胞へのsiRNAのデリバリー（in vivo）
〔動物試験実施例１〕デザインしたsiRNAのHCV遺伝子導入マウスでの阻害活性の検討
<HCV遺伝子導入マウス>
HCVの持続感染成立機序、慢性肝炎・肝硬変・肝癌への推移機構解明の為に、病態モデルのトランスジェニック( Tg )マウス作製が行われてきた。HCV感染により近いモデルとして、任意の時期にHCV遺伝子をスイッチング発現することができるCre/loxP recombinant systemを用いたHCV構造蛋白質領域発現Tgマウス ( CN2 マウス )が樹立された。これまではスイッチングの方法として、Cre DNA recombinaseを発現する組換えアデノウイルス(AxCANCre)の静脈内投与が行われてきた。しかしAxCANCre法では、マウスのアデノウイルスに対する免疫応答も惹起されてしまう。そこで本発明者らはCre/loxPシステムでHCV遺伝子を導入したトランスジェニックマウスとCreを誘導するMx-Creトランスジェニックマウスを交配することにより、任意の時期にHCV遺伝子をスイッチング発現するトランスジェニック（Cre/loxP/HCV-MxCre Tg）マウスを作製した。MxCre Tg マウスでは、Cre DNA recombinaseがインターフェロン(IFN)反応性 Mx1プロモーターによって発現される為、poly-IpC(以下pIpCと記載する、二重鎖 RNA)の投与によるIFNの誘導によってスイッチングが起こる。このマウスにpIpCを1日置きに3回腹腔内投与した。初回投与後0.5日目からHCV コア蛋白質の発現が認められ、7日目で915 pg/mg（肝総蛋白質量）とピークに達した。その後、減少傾向にあるものの、21日目でも435 pg/mgと発現が持続されている。さらに、この発現は６ヶ月を過ぎても同レベルで維持されていた（図３、図４）。

<siRNAのHCV遺伝子導入マウスへの投与>
遺伝子発現43日後のCre/loxP/HCV-MxCre Tgマウスに〔実施例１〕で製造したリポソーム分散液とsi197-1複合体(0.3mg siRNA/kg体重)を投与して、そのRNAi活性を評価した。投与後２日目に剖検し、肝臓組織のサンプリングを行った。この肝臓中のHCVコア蛋白質量をELISA法（オーソ HCV コア蛋白 ELISA キット）にて定量し、RNAi活性を評価した。絶食、非絶食群ともにsiCTRL (ダーマコン社; siCTRL３)投与群に比較して顕著なHCVコア蛋白質量の低下が認められた（図５）。これは、これまでに報告された物（Watanabe, T. et al., J. Hepatology 47: 744-750 (2007)）に比較して50倍以上強い阻害活性を示すことが明らかとなった。

本発明の組成物を用いれば、生体外だけでなく生体内の肝実質細胞に生理活性物質を血清存在下で非常に効率良く導入することができることから、試薬としてのみならず、医薬としても非常に有用である。

また、本発明は、ビタミンEを粒子に吸着または化学結合させることにより、血清中のLDL（低比重リポタンパク質）等がビタミンEを認識し肝実質細胞のレセプターを介して肝実質細胞内に粒子を送達させるところに特徴がある。粒子の粒径および表面チャージが最適化されていることから、これらの粒子は非実質細胞には取り込まれず、小胞体粒子を肝実質細胞内に特異的に送達することが可能となる。

Claims (15)

1. 下記(i)および(ii)を含む小胞体であって、該小胞体表面にビタミンEが吸着されているか、又はビタミンEが小胞体を構成する両親媒性物質に化学結合されており、ビタミンEが、小胞体を構成する物質全体のモル数の、２０％の割合で吸着または化学結合されていることを特徴とする小胞体。
   (i) 両親媒性物質
   (ii) 下記式（I）で表されるカチオニック脂質
   式（I）
   

   

   (式中、R¹およびR²は、同一または異なる炭素数１２から２２の飽和または不飽和の炭化水素基を意味し、R³は炭素数１から６のアルキル基または炭素数１から６のヒドロキシアルキル基を意味し、ｍは１から１０の整数を意味し、Xはハロゲン原子を意味する。)
2. 前記式（I）で表されるカチオニック脂質が、
   N-（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−D−グルタメート クロリド、
   N-（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−L−グルタメート クロリド、
   N-（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオクタデシル−D−グルタメート クロリド、及び
   N-（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオレイル−D−グルタメート クロリド、
   からなる群から選択される、請求項１に記載の小胞体。
3. 前記両親媒性物質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）付加ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、スフインゴミエリン、カルジオリピン、及びプラスマロゲンからなる群から選択される少なくとも1種類以上のリン脂質であることを特徴とする、請求項１または２に記載の小胞体。
4. コレステロールをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の小胞体。
5. 前記ホスファチジルコリンが、卵黄ホスファチジルコリン、水素添加卵黄ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、水素添加大豆ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイル-オレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレノイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ジエルシロイルホスファチジルコリン、ジエイコサノイルホスファチジルコリン、ジエイコサトリエノイルホスファチジルコリン、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルコリン、ジドコサエノイルホスファチジルコリン、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルコリンからなる群から選択され、
   前記ホスファチジルエタノールアミンが、卵黄ホスファチジルエタノールアミン、水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、大豆ホスファチジルエタノールアミン、水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイル-オレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレノイルホスファチジルエタノールアミン、ジデカノイルホスファチジルエタノールアミン、ジエルシロイルホスファチジルエタノールアミン、ジエイコサノイルホスファチジルエタノールアミン、ジエイコサトリエノイルホスファチジルエタノールアミン、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルエタノールアミン、ジドコサエノイルホスファチジルエタノールアミン、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択され、
   前記ホスファチジルグリセロールが、卵黄ホスファチジルグリセロール、水素添加卵黄ホスファチジルグリセロール、大豆ホスファチジルグリセロール、水素添加大豆ホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイル-オレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレノイルホスファチジルグリセロール、ジデカノイルホスファチジルグリセロール、ジエルシロイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサノイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサトリエノイルホスファチジルグリセロール、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルグリセロール、ジドコサエノイルホスファチジルグリセロール、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルグリセロールからなる群から選択され、
   前記ホスファチジルセリンが、卵黄ホスファチジルセリン、水素添加卵黄ホスファチジルセリン、大豆ホスファチジルセリン、水素添加大豆ホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイル-オレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレノイルホスファチジルセリン、ジデカノイルホスファチジルセリン、ジエルシロイルホスファチジルセリン、ジエイコサノイルホスファチジルセリン、ジエイコサトリエノイルホスファチジルセリン、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルセリン、ジドコサエノイルホスファチジルセリン、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルセリンからなる群から選択され、
   前記ホスファチジルイノシトールが、卵黄ホスファチジルイノシトール、水素添加卵黄ホスファチジルイノシトール、大豆ホスファチジルイノシトール、水素添加大豆ホスファチジルイノシトール、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、パルミトイル-オレオイルホスファチジルイノシトール、ジリノレオイルホスファチジルイノシトール、ジリノレノイルホスファチジルイノシトール、ジデカノイルホスファチジルイノシトール、ジエルシロイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサノイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサトリエノイルホスファチジルイノシトール、ジエイコサペンタエノイルホスファチジルイノシトール、ジドコサエノイルホスファチジルイノシトール、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジルイノシトールからなる群から選択され、
   前記メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）付加ホスファチジルエタノールアミンが、ｍＰＥＧ２０００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−水素添加卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−水素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００-ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ５０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ２０００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ｍＰＥＧ３４００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、及びｍＰＥＧ５０００−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択され、
   前記ホスファチジン酸が、卵黄ホスファチジン酸、水素添加卵黄ホスファチジン酸、大豆ホスファチジン酸、水素添加大豆ホスファチジン酸、ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミトイル-オレオイルホスファチジン酸、ジリノレノイルホスファチジン酸、ジデカノイルホスファチジン酸、ジエルシロイルホスファチジン酸、ジエイコサノイルホスファチジン酸、ジエイコサトリエノイルホスファチジン酸、ジエイコサペンタエノイルホスファチジン酸、ジドコサエノイルホスファチジン酸、及びジドコサヘキサエノイルホスファチジン酸からなる群から選択され、
   前記スフインゴミエリンが、卵黄由来スフインゴミエリン又は牛乳由来スフインゴミエリンであり、
   前記カルジオリピンが、卵黄カルジオリピン、水素添加卵黄カルジオリピン、大豆カルジオリピン、水素添加大豆カルジオリピン、ジラウロイルカルジオリピン、ジミリストイルカルジオリピン、ジパルミトイルカルジオリピン、ジステアロイルカルジオリピン、ジオレオイルカルジオリピン、パルミトイル-オレオイルカルジオリピン、ジリノレオイルカルジオリピン、ジリノレノイルカルジオリピン、ジデカノイルカルジオリピン、ジエルシロイルカルジオリピン、ジエイコサノイルカルジオリピン、ジエイコサトリエノイルカルジオリピン、ジエイコサペンタエノイルカルジオリピン、ジドコサエノイルカルジオリピン、及びジドコサヘキサエノイルカルジオリピンからなる群から選択されるという特徴を有する、請求項３または４に記載の小胞体。
6. 前記ビタミンEが、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、及びδ−トコフェロールからなる群から選択される少なくとも1種類以上を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の小胞体。
7. 前記ビタミンEが、dl-α-トコフェロールであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の小胞体。
8. 前記カチオニック脂質が、小胞体を構成する物質全体のモル数の10〜50％の範囲で含まれていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の小胞体。
9. 前記小胞体の粒径が50〜150nmの範囲であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の小胞体。
10. プラスミドDNA、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ウイルス剤、及び細胞傷害性物質からなる群から選択される少なくとも1種類以上の生理活性物質を小胞体が内封する、及び／又は該生理活性物質が小胞体の成分に疎水的又は静電的に結合することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の小胞体。
11. 小胞体表面のゼータ電位がアニオニックであることを特徴とする請求項１０に記載の小胞体。
12. 前記生理活性物質が、抗ウイルス剤であることを特徴とする請求項１０に記載の小胞体。
13. 前記細胞傷害性物質が、代謝拮抗剤、プラチナ系剤、アルキル化剤、植物アルカロイド、分子標的薬、生物学的応答調節剤、及び抗がん性抗生物質からなる群から選択される少なくとも1種類以上を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の小胞体。
14. 前記代謝拮抗剤が、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、及びメトトレキサートからなる群から選択され、
    前記プラチナ製剤が、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、及びネダプラチンからなる群から選択され、
    前記アルキル化剤が、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、及びラニムスチンからなる群から選択され、
    前記植物アルカロイドが、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチンから選ばれるものであり、分子標的薬がイマチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブからなる群から選択され、
    前記生物学的応答調節剤が、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、インターロイキンからなる群から選択され、
    前記抗がん性抗生物質が、アクラルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンC、及びミトキサントロンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の小胞体。
15. 請求項１０〜１４のいずれかに記載の小胞体、及び薬学的に許容される担体を含む、生理活性物質を血清存在下で肝実質細胞に送達するために用いられるキット。

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