CN103690511A

CN103690511A - 一种负载替加氟囊泡的制备方法

Info

Publication number: CN103690511A
Application number: CN201310712443.9A
Authority: CN
Inventors: 马明放; 郝爱友
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2014-04-02

Abstract

本发明公开了一种负载替加氟囊泡的制备方法，是以单[6-对甲基苯磺酰基]-β-环糊精为原料一步合成单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精，并由该化合物与替加氟在水溶液中自组装形成负载替加氟的新制剂替加氟囊泡。本发明有效解决了替加氟在水中不稳定的技术问题，获得的囊泡水溶液对替加氟起到缓释的作用，同时可以提高替加氟的抗癌效果，为替加氟在临床上的应用提供了新的制剂形式。

Description

一种负载替加氟囊泡的制备方法

技术领域

本发明涉及一种替加氟制剂的制备方法，尤其涉及一种负载替加氟囊泡的制备方法。

背景技术

替加氟（Ftorafur）为氟尿嘧啶的衍生物，其结构式如下：

替加氟在体内经肝脏活化逐渐转变为氟尿嘧啶而起到抗肿瘤的作用；其属抗嘧啶类药物，在体内干扰、阻断DNA、RNA及蛋白质的合成，为细胞周期特异性药物，化疗指数为氟尿嘧啶的2倍，毒性仅为氟尿嘧啶的1/4～1/7。替加氟主要治疗消化道肿瘤，例如胃癌、结肠癌、直肠癌和胰腺癌，也可用于治疗乳腺癌、支气管癌和肝癌等。

替加氟虽为一种药效很好的抗癌药物，但是其有在水溶液中容易结晶析出、代谢半衰期短以及药物生物分布广泛的缺点，限制了其在临床上的应用。现有的替加氟制剂形式主要是口服制剂和小水针制剂。而口服制剂的生物利用率低，小水针制剂遇冷易析出替加氟，都给替加氟的临床应用增加了难度。因此，设计一种克服上述缺陷的新替加氟制剂较为迫切。

环糊精，是由D型吡喃葡萄糖以1,4-糖苷键连接的低聚糖，以其价格低廉、水溶性好、良好地生物相容性和易于修饰的优点而广泛地应用于超分子化学。环糊精疏水性的空腔可以通过非共价键包合一些水溶性较差的药物分子，形成超分子双亲分子，从而进一步自组装形成结构有序的囊泡。环糊精不仅可以起到在水溶液中稳定药物分子的作用，而且可以增加药物分子的溶解度。得到的囊泡通过EPR效应，可以有效地起到药物缓释的作用。基于此，开发具有高生物相容性替加氟运载体系，有望成为克服替加氟缺点的突破口。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种水溶性抗癌药物新制剂即负载替加氟囊泡的制备方法。

本发明的技术方案是：由单[6-对甲基苯磺酰基]-β-环糊精为原料一步合成单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精，并由该化合物与替加氟在水溶液中自组装形成负载替加氟的新制剂囊泡。

本发明所述负载替加氟囊泡的制备方法，步骤是：

1）室温下将单[6-对甲基苯磺酰基]-β-环糊精加入到N-甲基吡咯烷酮中，搅拌至完全溶解，然后加入上述单[6-对甲基苯磺酰基]-β-环糊精1.5倍摩尔量的1,4-丁二胺，再滴加三乙胺作催化剂，在60-80℃下反应7-11小时，TLC检测反应进程，待反应完全后，冷却反应液至室温，将反应液倒入丙酮中，产生大量白色颗粒，抽滤并用丙酮洗涤滤饼，得到单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精粗产物；

2）将环糊精衍生物粗产物使用硅胶色谱柱分离纯化，得到单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精纯品；其中所述硅胶色谱柱的洗脱剂是体积比为5:2:1的异丙醇、水和30%氨水的混合液；

3）按1.1-2.5g:1L的比例将纯化后的单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶于三次蒸水中，超声波混合2-8分钟，配制成单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶液；按0.1-0.5g:1L的比例将替加氟溶于三次蒸水中，超声波混合2-8分钟，配制成替加氟溶液；

4）按体积比1:1将步骤3）所述替加氟溶液与单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶液混合，25±1℃下，超声波混合20-50分钟，得到平均直径为200±10nm的负载替加氟囊泡。

上述负载替加氟囊泡的制备方法中：步骤1）所述反应温度优选是70℃，反应时间优选是10小时。

上述负载替加氟囊泡的制备方法中：步骤3）所述单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶液配制优选是按2.41g:1L的比例溶于三次蒸水中，然后超声波混合3分钟。

上述负载替加氟囊泡的制备方法中：步骤3）所述替加氟溶液配制优选是按0.4g:1L的比例溶于三次蒸水中，然后超声波混合3分钟。

上述负载替加氟囊泡的制备方法中：步骤4）所述超声波混合时间优选为30分钟。

上述环糊精衍生物（单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精）的合成方程式如下：

本发明将环糊精衍生物与替加氟在水溶液中自组装形成水溶性的低毒囊泡载药体系，可以很好地稳定替加氟在水溶液中的存在，避免替加氟遇冷析出。同时可以起到缓释替加氟释放的作用，延长了其生物半衰期。这种将药物分子包裹到环糊精空腔进而负载在超分子囊泡中的策略，为克服替加氟的缺陷提供了新的途径。

本发明的囊泡体系还可以增强替加氟抑制癌细胞增殖和分化的能力，进而增强抗癌疗效，为替加氟在临床上的应用提供了新的可实施的制剂形式。实验证实，本发明制备的负载替加氟的囊泡在室温下至少可以保持稳定3个星期以上。生化实验显示，负载替加氟的囊泡相比于替加氟原药对人类结肠癌细胞HT-29具有更强的细胞增殖抑制能力和细胞周期抑制能力。

已有研究表明，大小在200纳米左右的粒子更容易通过EPR效应滞留在癌变组织部位，并且更容易被细胞所吞噬。因此，负载替加氟的囊泡更容易被癌细胞摄取，从而提高了替加氟的抗癌效果。同时，由于替加氟包埋在了环糊精衍生物的空腔之中，替加氟从空腔中释放出来需要一定的时间，这就避免了替加氟的快速代谢，对替加氟起到的缓释作用。替加氟包埋在环糊精空腔之中还可以起到稳定替加氟的作用，解决了替加氟遇冷析出的缺点。因此，本发明所制备的负载替加氟的囊泡体系可以很好的稳定替加氟在水溶液中的存在，缓释替加氟的释放，同时提高替加氟的抗癌效果。

本发明所得的环糊精衍生物与替加氟在水溶液中自组装形成的囊泡经过透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）、动态光散射（DLS）、X射线粉末衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）和二维核磁（2D NMR ROSEY）进一步得到了证明，结果见附图。

附图说明

图1透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）图像照片。

其中，a和b：负载替加氟囊泡在水相中的TEM图像；c和d：负载替加氟囊泡在水相中的SEM图像；e和f：负载替加氟囊泡在水相中的AFM图像。

图2负载替加氟囊泡动态光散射（DLS）图。

图3X射线粉末衍射（XRD）谱图。

其中，1：替加氟；2：环糊精衍生物；3：替加氟和环糊精衍生物的机械混合物；4：替加氟和环糊精衍生物的包合物。

图4傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）谱图。

图5二维核磁（2D NMR ROSEY）谱图。

图6负载替加氟的囊泡和替加氟在不同浓度下对人类结肠癌细胞增殖抑制试验结果。

图7负载替加氟的囊泡和替加氟在不同浓度下对人类结肠癌细胞周期抑制试验结果。其中，a，b和c：替加氟囊泡（浓度分别是a：6.25μM，b：12.5μM和c：25μM）对人类结肠癌细胞周期抑制试验结果；d，e和f：替加氟（浓度分别是d：6.25μM，e：12.5μM和f：25μM）对人类结肠癌细胞周期抑制试验结果；g：空白对照（没有加替加氟的纯水）对人类结肠癌细胞周期抑制试验结果；h：不同浓度下（6.25μM，12.5μM和25μM），替加氟和替加氟囊泡对人类结肠癌细胞周期抑制能力（G1期/S期细胞数量比率）的对比图。注：G1，S和G2分别代表癌细胞的G1，S和G2分裂期。

具体实施方式

实施例1：单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精的合成

室温下将2.578g（2mmol）单[6-对甲基苯磺酰基]-β-环糊精加入到40ml无水N-甲基吡咯烷酮中，搅拌至完全溶解，然后加入0.264g（3mmol）1,4-丁二胺，加2滴三乙胺作催化剂，混合液在搅拌下于70oC反应10小时，薄层色谱检测反应进程。待反应完全后，冷却反应液至室温，将反应液倒入50ml丙酮中，产生大量白色颗粒，抽滤，滤饼用丙酮洗涤3次，收集得到单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精粗产物。

将上述环糊精衍生物使用硅胶色谱柱分离纯化（洗脱剂为异丙醇、水和30%氨水，其体积比为5：2：1），得到单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精纯品。

上述产品量重2.19g，产率91%，白色粉末，Rf=0.51。

表征数据如下：

¹H NMR(400MHz,D₂O,300K,DHO,δppm):4.96(d,J=4.0Hz,1H,H-1),4.70(s,D₂O),3.85(t,J=20.0Hz,1H,H-3),3.77(d,J=4.0Hz,2H,H-6),3.75-3.72(m,1H,H-5),3.55-3.52(m,1H,H-2),3.49(t,J=20.0Hz,1H,H-4),2.85(t,J=12.0Hz,CH₂,2H),2.55(t,J=16.0Hz,CH₂,2H),1.58-1.52(m,CH₂,2H),1.51-1.43(m,CH₂,2H).FT-IR(KBr pellet,υcm^-1):3451.94(vs,sh,ν_NH2),2933.53(vs,sh,ν_CH2),1635.58(w,m,δ_NH2),1161.97(m,sh,ν_C-N),1038.90(s,sh,δ_CH),595.29(w,δ_CH2).ESI-MS Calcd.for C₄₆H₇₉N₂O₃₄m/z1204.11,found m/z1204.46.

实施例2：负载替加氟囊泡的制备

室温下将0.241g单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶于100ml三次蒸水中，超声3分钟，得到2×10^-3mol/L单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶液；室温下将0.04g替加氟溶于100ml三次蒸水中，超声3分钟，得到2×10^-3mol/L替加氟溶液。

取25ml2×10^-3mol/L单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶液和25ml2×10^-3mol/L替加氟溶液制备成50ml混合溶液，超声30分钟，得到负载替加氟超分子囊泡的水溶液。

实施例3：负载替加氟囊泡的制备

按1.1g:1L的比例将纯化后的单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶于三次蒸水中，超声波混合2分钟，配制成单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶液；按0.1g:1L的比例将替加氟溶于三次蒸水中，超声波混合2分钟，配制成替加氟溶液；

按体积比1:1的比例将上述替加氟溶液与单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶液混合，25±1℃下，超声波混合20分钟，得到平均直径为200±10nm的负载替加氟囊泡。

实施例4：负载替加氟囊泡的制备

按2.5g:1L的比例将纯化后的单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶于三次蒸水中，超声波混合8分钟，配制成单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶液；按0.5g:1L的比例将替加氟溶于三次蒸水中，超声波混合8分钟，配制成替加氟溶液；

按体积比1:1的比例将上述替加氟溶液与单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶液混合，25±1℃下，超声波混合50分钟，得到平均直径为200±10nm的负载替加氟囊泡。

实施例5：细胞增殖抑制试验

利用负载替加氟囊泡和替加氟原药对人结肠癌细胞HT-29的细胞增殖抑制试验的对照，检测负载替加氟囊泡的抗癌效果。试验中，使用96孔的培养板，每孔含4×10³个细胞，分别用负载替加氟囊泡和替加氟原药（不同浓度下，6.25μM～50μM）处理48小时，最后通过MTT试验测得负载替加氟囊泡和替加氟原药对癌细胞的增殖抑制能力。

结果见图6，结果显示：不同浓度的负载替加氟的囊泡相比于替加氟原药对人结肠癌细胞HT-29具有更强的细胞增殖抑制能力。

实施例6：细胞周期抑制试验

利用负载替加氟囊泡和替加氟原药（不同浓度下，6.25μM～25μM）对人结肠癌细胞HT-29的细胞周期抑制试验的对照，检测负载替加氟囊泡的抗癌效果。试验中，使用PI染料染色，以区分不同时间段内凋亡的细胞。最后用流式细胞分析仪检测细胞周期抑制结果。

结果见图7，显示：不同浓度的负载替加氟的囊泡相比于替加氟原药对人结肠癌细胞HT-29具有更强的细胞周期抑制能力。

Claims

1.一种负载替加氟囊泡的制备方法，步骤是：

2.根据权利要求1所述负载替加氟囊泡的制备方法，其特征在于：步骤1）所述反应温度是70℃，反应时间是10小时。

3.根据权利要求1所述负载替加氟囊泡的制备方法，其特征在于：步骤3）所述单[6-脱氧-N-丁基胺基]-β-环糊精溶液配制是按2.41g:1L的比例溶于三次蒸水中，然后超声波混合3分钟。

4.根据权利要求1所述负载替加氟囊泡的制备方法，其特征在于：步骤3）所述替加氟溶液配制是按0.4g:1L的比例溶于三次蒸水中，然后超声波混合3分钟。

5.根据权利要求1所述负载替加氟囊泡的制备方法，其特征在于：步骤4）所述超声波混合时间为30分钟。