CN101479384B - 核酸导入用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种细胞毒性低、被导入核酸的细胞内导入性及在细胞内的表达得到改善的核酸导入用组合物。一种向细胞导入核酸用组合物，含有下述式(I)所示的化合物和磷脂质，式中，R1和R2相同或不同，表示碳原子数12～22的饱和或不饱和的烃基，R3表示碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的羟烷基，m表示1～10的整数，X表示卤原子。

Description

核酸导入用组合物
技术领域
本发明涉及用于将核酸向细胞内导入的组合物。 
背景技术
作为将基因等的核酸导入到细胞内的方法，已知有使用单独的阳离子性脂质或含有其的脂质体与核酸形成的复合体的方法(例如，参照专利文献1)。实际上，作为该方法用的试剂，市售有例如“Lipofectamine”、“Lipofectin”、“Transfectam”、“Genetransfer”、“Lipofectamine 2000”等。 
但是，这些市售的试剂被指出如下问题。a)作为制剂的保存稳定性差，使用脂质体等的基因在导入细胞内、表达方面的再现性差。b)在用于细胞培养的培养基中添加的血清(Fetal Bovine Serum)中非常不稳定，采用暂时将培养细胞的加有血清的培养基置换成无血清培养基，在导入后再恢复成加有血清的培养基这样的繁琐步骤；另外，最近逐渐明确其在血液中或体内也非常不稳定。c)大多数市售品(例如Lipofectamine、Lipofectin、Lipofectamine 2000)仅以脂质已分散到水中的形态提供，形成由外部向其中添加基因水溶液的步骤，这样，虽可以制造基因结合于脂质体的外侧的复合体，但不能制造内封有基因的脂质体；另外，Lipofectamine 2000为了避免形成阳离子性脂质的过氧化物，而具有不能过度搅拌、振荡，需要细心注意这类的麻烦。d)细胞毒性非常强。 
像这样，虽然市售有几种使用单独的阳离子性脂质或脂质体使基因等核酸导入细胞内的试剂，但存在很多问题。 
专利文献1：特开平2-135092号公报 
发明内容
本发明涉及提供一种细胞毒性低、被导入核酸的细胞内导入性及在 细胞内的表达得到改善的核酸导入用组合物。 
本发明人等对低细胞毒性、改善核酸的细胞内导入性以及在细胞内表达的方法进行了精心研究，结果发现，通过将下述式(I) 
Figure G2007800240802D00021
(式中，R1和R2相同或不同，表示碳原子数12～22的饱和或不饱和的烃基，R3表示碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的羟烷基，m表示1～10的整数，X表示卤原子。) 
所示的化合物和磷脂质与基因等核酸一起给予或供给到细胞，可以低细胞毒性且高效地导入核酸，从而完成了本发明。 
即，本发明涉及以下发明。 
(1)一种向细胞导入核酸用组合物，含有上述式(I)所示的化合物和磷脂质。 
(2)根据(1)所述的组合物，还含有相对于组合物中的全部脂质量为0～50摩尔％的胆甾醇和/或胆甾烷醇。 
(3)根据(1)或(2)所述的组合物，相对于组合物中的全部脂质量，式(I)所示化合物的含量为40～60摩尔％。 
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的组合物，式(I)所示化合物与磷脂质的比(摩尔比)为2:3～16:1。 
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的组合物，式(I)中，R1和R2表示碳原子数12～18的烷基或链烯基，R3表示甲基，m表示1。 
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的组合物，磷脂质为选自磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心肌磷脂、鞘磷脂、缩醛磷脂和磷脂酸中的1种或2种以上。 
(8)根据(1)～(6)中任一项所述的组合物，磷脂质为磷脂酰乙醇胺。 
(9)根据(1)～(6)中任一项所述的组合物，磷脂质为二油酰基磷脂酰乙醇胺。 
(10)一种向细胞导入核酸用组合物，含有N-(α-三甲基铵乙酰基)-二油基-D-谷氨酸酯氯化物、二油酰基磷脂酰乙醇胺和胆甾醇。 
(11)根据(1)～(10)中任一项所述的组合物，还含有核酸。 
(12)根据(11)所述的组合物，核酸为短寡核苷酸。 
(13)根据(1)～(12)中任一项所述的组合物，形成脂质膜结构体。 
(14)根据(1)～(13)中任一项所述的组合物，形成脂质体。 
(15)根据(1)～(14)中任一项所述的组合物，是冻干物。 
(16)一种向细胞导入核酸的方法，其特征在于，将(11)～(15)中任一项所述的组合物在体外或体内应用于细胞。 
(17)(1)～(15)中任一项所述的组合物在用于制造核酸导入剂中的使用。 
(18)一种增加或抑制目的核酸表达的物质的筛选方法，具有下述(i)～(iii)的工序： 
(i)使导入了目的核酸的细胞与被测物质接触的工序， 
(ii)测定使与被测物质接触的细胞中目的核酸表达量的工序， 
(iii)选择上述(ii)的测定量大于或小于对照细胞中目的核酸表达量的被测物质的工序， 
其中，使用(1)～(15)中任一项所述的组合物进行目的核酸向细胞 的导入和/或被测物质与该细胞的接触。 
若使用本发明的组合物，则可以低细胞毒性且高效率地将核酸导入细胞。因此，本发明的组合物作为核酸导入用试剂或药品而有用。 
本发明的核酸导入用组合物是与被导入核酸一起使用，用于将该核酸向细胞导入的组合物，至少含有上述式(I)所示的化合物和磷脂质即可，包括含有被导入核酸的形式(含核酸组合物)及不含有被导入核酸的形式。 
具体实施方式
对本发明的组合物中所述式(I)表示的化合物中的取代基进行说明。 
式(I)中，R1和R2相同或不同，表示碳原子数12～22的饱和或不饱和的烃基，具体而言，可以举出十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、油基、亚油基、亚麻基等。作为R1和R2，优选为相同的物质。式(I)中，作为R1和R2，优选碳原子数12～18的烷基或链烯基，具体而言，作为优选的例子，可举出十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、油基等。在本发明中，更优选碳原子数为12～18的链烯基。 
R3表示碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的羟烷基，作为碳原子数1～6的烷基，可以举出甲基、乙基等，其中，优选甲基。作为碳原子数1～6的羟烷基，可以举出羟甲基、羟乙基。 
m表示1～10的整数，m优选1或10。 
X表示卤原子，可以举出氯原子、溴原子等。 
本发明的组合物中所述式(I)所示的化合物为公知化合物，除了可以用公知的方法(例如，参照特开平6-200336号公报)进行制造之外，还可以使用由相互药工株式会社出售的N-(α-三甲基铵乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸酯氯化物(商品名：DC-3-12D)、N-(α-三甲基铵乙酰基)-双十二烷基-L-谷氨酸酯氯化物(商品名：DC-3-12L)、N-(α-三甲基铵乙酰基)-双十八烷基-D-谷氨酸酯氯化物(商品名：DC-3-18D)、N-ω-三甲基铵癸酰基-双十六烷 基-D-谷氨酸酯溴化物(商品名：DC-12-16D)、N-ω-三甲基铵癸酰基-双十六烷基-L-谷氨酸酯溴化物(商品名：DC-12-16L)等。在本发明中，优选N-(α-三甲基铵乙酰基)-二油基-谷氨酸酯卤化物，特别优选N-(α-三甲基铵乙酰基)-二油基-D-谷氨酸酯氯化物。 
本发明的组合物中所述通式(I)所示化合物的含量可以根据本发明组合物中的全部脂质量来适当确定，相对于全部脂质量，优选20～80摩尔％，更优选40～60摩尔％。 
作为本发明的组合物中所述的磷脂质，可以举出例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心肌磷脂、鞘磷脂、缩醛磷脂、磷脂酸等，它们可以使用1种或将2种以上组合使用。 
其中，更优选将磷脂酰乙醇胺及磷脂酰胆碱单独或组合使用，特别优选使用磷脂酰乙醇胺。作为这些磷脂质的脂肪酸残基没有特别限定，可以举出碳原子数12～18的饱和或不饱和脂肪酸残基，优选棕榈酰基、油酰基、硬脂酰基、亚油酰基等。作为本发明所述的磷脂质，特别优选二油酰基磷脂酰乙醇胺。 
另外，在本发明的组合物中，可以进一步配合胆甾醇和/或胆甾烷醇等甾醇类，其配合量优选为组合物中的全部脂质量的0～50摩尔％，更优选16～50摩尔％。 
上述磷脂质在本发明的组合物中的配合量，可以根据全部脂质量来适当选择，优选通式(I)所示化合物与磷脂质的比(摩尔比)为2∶3～16∶1，更优选1.3∶1～4∶1。 
在本发明的组合物中，(甲)优选通式(I)所示的化合物与磷脂质的比(摩尔比)为1.3:1～4:1；(乙)更优选通式(I)所示化合物与磷脂质的比(摩尔比)为1.3:1～4:1，且通式(I)所示化合物的含量相对于本发明的组合物中的全部脂质量为40～60摩尔％；(丙)进一步优选通式(I)所示化合物与磷脂质的比(摩尔比)为1.3:1～4:1，通式(I)所示化合物的含量相对于本发明的组合物中的全部脂质量为 40～60摩尔％，且甾醇类的配合量为本发明的组合物中的全部脂质量的16～50摩尔％。 
作为适用于本发明的组合物中的被导入核酸，可以是寡核苷酸、DNA、RNA中的任一种，例如可以举出反义寡核苷酸、反义DNA、反义RNA、shRNA、siRNA、miRNA等短寡核苷酸；酶、细胞因子等的生理活性物质；编码反义RNA、shRNA、siRNA的基因等。 
在本发明的组合物中，通式(I)所示化合物的含量只要是用于将核酸导入细胞内的充足的量即可，可以根据核酸的种类、用途、组合物的形态等而适当确定，例如，相对于200ng核酸，优选含有125～2000pmol通式(I)所示的化合物，更优选含有250～1000pmol。另外，以磷酸基换算计，相对于1摩尔的siRNA，优选含有0.1～10摩尔通式(I)所示的化合物，更优选含有0.5～2摩尔。例如，使用27mer的siRNA时，相对于1摩尔siRNA，优选含有5.4～540摩尔通式(I)所示的化合物，更优选含有27～108摩尔。 
本发明的组合物，可以是作为通式(I)所示的化合物和磷脂质、或除此之外根据需要而含有甾醇类的单纯混合物的形态，也可以是将通式(I)所示的化合物、磷脂质及甾醇类组合而形成脂质膜结构体的形态。 
该脂质膜结构体的形态没有特别限定，例如可以举出干燥的脂质混合物形态、脂质膜结构体分散于水系溶剂的形态、进而使其干燥的形态或使其冻结的形态等。 
其中，作为脂质膜结构体分散于水系溶剂的形态，可以例举出，一片膜脂质体、多层脂质体、O/W型乳液、W/O/W型乳液、球状胶束、绳状胶束、无定形的层状结构物等。其中，优选脂质体。分散状态的脂质膜结构体的大小没有特别限定，例如，脂质体、乳液的情况，粒径为50nm～5μm，球状胶束的情况，粒径为5～100nm。绳状胶束、无定形的层状结构物的情况，优选其每1层的厚度为5～10nm，它们形成层。 
以下，对于各种的脂质膜结构体，说明其制造例。 
1)干燥的混合物形态的脂质膜结构体可以通过如下方式制造：例如，先使脂质膜结构体的构成成分全部溶解于氯仿等有机溶剂中，接着 用蒸发器进行减压干躁、或用喷雾干燥机进行喷雾干燥。 
2)脂质膜结构体分散于水系溶剂的形态可以通过如下方式制造：将上述干燥的混合物添加到水系溶剂中，进而用均化器等的乳化机、超声波乳化机、高压喷射乳化机等进行乳化。另外，也可以用作为制造脂质体的方法而周知的方法，例如逆相蒸发法等来制造。在想要控制脂质膜结构体的大小的情况下，可以使用孔径均匀的膜滤器等，在高压下进行挤出(挤压过滤)。 
水系溶剂(分散介质)的组成没有特别限定，例如可以举出磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲生理盐水等的缓冲液、生理盐水、细胞培养用培养基等。这些水系溶剂(分散介质)可以使脂质膜结构体稳定地分散，进而可以添加葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、纤维糖、核糖、木糖等的单糖类，乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等的二糖类，蜜三糖、松三糖等三糖类，环糊精等的多糖类，赤藓醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇等糖醇等的糖(水溶液)，甘油、二甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇单烷基醚、二乙二醇单烷基醚、1，3-丁二醇等的多元醇(水溶液)等。为了使分散于该水系溶剂(分散介质)的脂质膜结构体长期稳定保存，从凝聚等的物理稳定性方面考虑，优选尽量去除水系溶剂(分散介质)中的电解质。另外，从脂质的化学稳定性方面考虑，优选通过将水系溶剂(分散介质)的pH设定在弱酸性到中性附近(pH3.0～8.0)，或通过氮鼓泡来去除溶解氧。 
在此，糖或多元醇的浓度没有特别限定，在脂质膜结构体分散于水系溶剂的状态中，优选例如糖(水溶液)为2～20％(W/V)，更优选5～10％(W/V)。另外，多元醇(水溶液)优选1～5％(W/V)，更优选2～2.5％(W/V)。作为水系溶剂(分散介质)，在使用缓冲液的情况下，优选缓冲剂的浓度为5～50mM，更优选10～20mM。水系溶剂(分散介质)中的脂质膜结构体的浓度没有特别限定，但含有作为脂质膜结构体的构成成分使用的二(C12-16烷基)二甲基铵卤化物及磷脂质、根据需要的甾醇类的全部脂质的浓度优选为0.2～50mM，更优选1～10mM。 
3)使脂质膜结构体分散于水系溶剂的形态干燥或冻结而成的形态，可以通过如下方法制造：将分散于上述水系溶剂的脂质膜结构体用通常 的冻干、喷雾干燥来干燥或冻结的方法等。如果在将分散于水系溶剂的形态的脂质膜结构体制造后进一步干燥，则除了可以长期保存脂质膜结构体以外，还有如下优点：如果将含有核酸的水溶液添加到该干燥的脂质膜结构体，则由于脂质混合物被高效水合而能够使核酸高效地保持在脂质膜结构体中。 
进行冻干、喷雾干燥时，如果使用例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、纤维糖、核糖、木糖等的单糖类，乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、麦芽糖等的二糖类，蜜三糖、松三糖等三糖类，环糊精等的多糖类，赤藓醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇等糖醇等的糖(水溶液)，则可以长期稳定保存。另外，在进行冻结时，如果分别使用例如上述的糖(水溶液)、甘油、二甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇、乙二醇单烷基醚、二乙二醇单烷基醚、1，3-丁二醇等的多元醇(水溶液)，则可以长期稳定保存。也可以将糖和多元醇组合使用。 
本发明的核酸导入用组合物可以制成含有被导入核酸的组合物(含核酸组合物)，以下对这种情况的组合物进行说明。 
作为组合物的形态，可以作为如下混合物而存在：通式(I)所示的化合物、磷脂质和核酸，或除此之外根据需要而含有甾醇类等的单纯的混合物；也可以是如下形态：将通式(I)所示的化合物、磷脂质及甾醇类组合而形成的脂质膜结构体与核酸混合的形态；进而也可以是在脂质膜结构体中保持有核酸的形态。在此，所谓“保持”是指，核酸存在于脂质膜结构体的脂质膜中、表面、内部、脂质层中、和/或脂质层的表面。脂质膜结构体为例如脂质体等的微粒子时，也可以在微粒子内部封入核酸。 
另外，脂质膜结构体的形态，与上述脂质膜结构体同样，可以举出混合干燥物形态，分散于水系溶剂的形态，进而使其干燥的形态、使其冻结的形态等。 
以下，对于各种脂质膜结构体，说明其制造例。 
1)在制成混合干燥物形态的情况下，可以通过如下方式制造：例 如，先用氯仿等有机溶剂使脂质膜结构体的构成成分与核酸溶解得到混合物，接着，对其用蒸发器进行减压干躁、或用喷雾干燥机进行喷雾干燥。 
2)在制成分散于含有脂质膜结构体和核酸的水系溶剂的形态时，作为其制造方法已知有几种方法，根据脂质膜结构体中核酸的保持方式、混合物的性状等，可以如下2-1～2-5那样选择适当的制造方法。 
2-1)制造方法1 
其是将水系溶剂添加到上述的混合干燥物中，进而用均化器等的乳化机、超声波乳化机、高压喷射乳化机等进行乳化而制造的方法。在控制大小(粒径)的情况下，可以进一步使用孔径均匀的膜滤器，在高压下进行挤出(挤压过滤)。该方法的情况，首先，为了制作脂质膜结构体的构成成分和核酸的混合干燥物，必须将脂质膜结构体和核酸溶解于有机溶剂中，具有如下优点：可以最大限度地利用脂质膜结构体的构成成分和核酸的相互作用。即，即使在脂质膜结构体具有层状结构的情况下，核酸也可以进入到多层的内部，如果使用这种制造方法，则具有可以使核酸在脂质膜结构体中的保持率增高的优点。 
2-2)制造方法2 
其是先用有机溶剂将脂质膜结构体的构成成分溶解后，向馏去有机溶剂的干燥物中进一步添加含有核酸的水系溶剂进行乳化而制造的方法。在控制大小(粒径)的情况下，可以进一步使用孔径均匀的膜滤器，在高压下进行挤出(挤压过滤)。可以适用于虽难以溶解于有机溶剂，但能溶解于水系溶剂的核酸。脂质膜结构体为脂质体的情况，具有在内水相部分中也能保持核酸的优点。 
2-3)制造方法3 
其是在已经分散于水系溶剂的脂质体、乳液、胶束、或层状结构物等的脂质膜结构体中，进一步添加含有核酸的水系溶剂而制造的方法。作为成为对象的核酸，可以使用水溶性的物质。由于是从外部向已经完成的脂质膜结构体添加核酸的方法，因而核酸为高分子时，核酸不会进入到脂质膜结构体的内部，可以采取存在(结合)于脂质膜结构体的表 面的存在方式。使用脂质体作为脂质膜结构体时，如果使用该制造方法3，则会形成核酸在脂质体粒子彼此之间夹持的三明治结构(一般称为复合体或复合物)，这是已知的。在该制造方法中，由于预先制造脂质膜结构体单独的水分散液，因而不必考虑乳化时的核酸分解等，也容易控制大小(粒径)。因此，与制造方法1、制造方法2相比，可以较容易地制造。 
2-4)制造方法4 
其是在制造分散于水系溶剂的脂质膜结构体后进行干燥而得到的干燥物中，进一步添加含有核酸的水系溶剂而制造的方法。与制造方法3同样，作为成为对象的核酸，可以利用水溶性的物质。与制造方法3的区别点在于脂质膜结构体和核酸的存在方式，在该制造方法4中，先制造分散于水性溶剂的脂质膜结构体后，进一步制造使其干燥而成的干燥物，因而在该阶段，脂质膜结构体作为脂质膜的片段以固体状态存在。为了使该脂质膜的片段以固体状态存在，优选如上述那样，使用在水系溶剂中进一步添加了糖(水溶液)、优选蔗糖(水溶液)、乳糖(水溶液)的溶剂。在此，如果添加含有核酸的水系溶剂，则以固体状态存在的脂质膜的片段在水侵入的同时迅速开始水合，可以再构建脂质膜结构体。此时，可以制造核酸被保持在脂质膜结构体内部的形态的结构体。 
在制造方法3中，核酸为高分子的情况下，核酸不能进入到脂质膜结构体的内部，采取结合在脂质膜结构体的表面的存在方式，在这一点上，制造方法4大为不同。即，核酸的一部分或全部被摄入脂质膜结构体内部。由于该制造方法4预先制造脂质膜结构体单独的分散液，因而不必考虑乳化时的核酸分解，也容易控制大小(粒径)。因此，与制造方法1、制造方法2相比，制造较为容易。另外，除此之外还有如下优点：由于先进行冻干或喷雾干燥，因而容易保证作为制剂(含核酸组合物)的保存稳定性，即使用核酸的水溶液将干燥制剂再水合，也可以将大小(粒径)恢复到原状；即使是高分子的核酸，也可以容易使核酸保持在脂质膜结构体的内部等。 
2-5)其它 
作为用于制造脂质膜结构体和核酸的混合物分散于水系溶剂的形 态的其它方法，可以采用作为制造脂质体的方法而周知的方法、例如逆相蒸发法等。在控制大小(粒径)的情况下，可以使用孔径均匀的膜滤器，在高压下进行挤出(挤压过滤)。 
3)在制成使上述的脂质膜结构体和核酸的混合物分散于水系溶剂的分散液进一步干燥的形态的情况下，可以举出冻干、喷雾干燥等方法。作为此时的水系溶剂，优选使用上述的添加了糖(水溶液)、优选蔗糖(水溶液)、乳糖(水溶液)的溶剂。作为使脂质膜结构体和核酸的混合物分散于水系溶剂的分散液进一步冻结的方法，可以举出通常的冻结方法，作为此时的水系溶剂，优选使用添加了糖(水溶液)、多元醇(水溶液)的溶剂。 
如果使用如此得到的本发明的组合物，则可以高效地将核酸导入细胞内。因此，本发明的组合物可以作为核酸导入用试剂、药品等的核酸导入剂来使用。例如，在体外的情况下，可以通过将本发明的含核酸组合物添加到含有目的细胞的悬浊液中，或在含有该含核酸组合物的培养基中培养目的细胞等的方法，从而将核酸导入到该目的细胞。另外，在体内的情况下，可以将本发明的含核酸组合物给予人或非人动物。作为给予的方法，可以是经口给予，也可以是非经口给予，作为经口给予的剂型，可以是通常所知的剂型，例如可以举出片剂、散剂、颗粒剂等，作为非经口给予的剂型，可以是通常所知的剂型，例如可以举出注射剂、滴眼剂、软膏剂、栓剂等。优选非经口给予。其中，优选注射剂，作为给予方法，优选静脉注射，对目的细胞、脏器进行局部注射。 
另外，本发明的核酸导入用组合物，在增加或抑制目的核酸表达的物质的筛选方法中，可以在目的核酸向细胞的导入和/或被测物质与该细胞的接触(导入)中使用。所述筛选方法具有下述(1)～(3)的工序： 
(1)使导入了目的核酸的细胞与被测物质接触的工序， 
(2)测定使与被测物质接触的细胞中目的核酸表达量的工序， 
(3)选择上述(2)的测定量大于或小于对照细胞中目的核酸表达量的被测物质的工序。 
在此，作为目的核酸，可例举出与疾病相关的基因及含有其的质粒DNA等，作为被测物质，可以例举出分子量小于1万、优选100～2000 的低分子化合物，反义寡核苷酸、反义DNA、反义RNA、shRNA、siRNA、miRNA等的短寡核苷酸等。 
核酸表达量的测定可以通过如下方法进行：Northern Blot法、RT-PCR法、定量PCR法等公知的方法，或利用DNA阵列的测定方法等。 
另外，作为对照细胞，可以举出未与被测物质接触的细胞、或导入了未对目的核酸产生影响的短核苷酸或任意物质的细胞等。 
实施例 
以下示出实施例，但本发明并不受这些实施例的任何限定。 
实施例1 
将N-(α-三甲基铵乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸酯氯化物(相互药工株式会社制(商品名：DC-3-12D))、胆甾醇(和光纯药株式会社制)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE，日本油脂株式会社制)以40％、30％、30％的配合比例(摩尔比)溶解于氯仿中，使其减压干燥，制成脂质混合物。向该脂质混合物中加入9％蔗糖溶液，在65℃加热下，用SONICATOR间接地照射超声波，从而得到DC-3-12D浓度为2.5mM的脂质体粗分散液。接着，为了将脂质体的粒径均匀化，将2片孔径0.22μm的滤片重叠并置于挤压机上，在约65℃加热、加压条件下，进行挤出(挤压过滤)。进而，使用孔径0.1μm的滤片进行同样的挤压过滤，将此作为空白的脂质体分散液。将该脂质体分散液每个1mL地分注于2mL小瓶中，冻干，得到冻干脂质体(调制例1)。另外，使用NICOMP 380ZLS(Particle Sizing System公司)，测定所得到的调制剂1的平均粒径及ζ电位。结果示于表2中。 
实施例2 
除了使用N-(α-三甲基铵乙酰基)-双十二烷基-L-谷氨酸酯氯化物(相互药工株式会社制(商品名：DC-3-12L))代替N-(α-三甲基铵乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸酯氯化物以外，与实施例1同样地得到冻干脂质体(调制剂2)，测定平均粒径及ζ电位。结果 示于表2中。 
实施例3 
除了使用N-(α-三甲基铵乙酰基)-双十八烷基-D-谷氨酸酯氯化物(相互药工株式会社制(商品名：DC-3-18D))代替N-(α-三甲基铵乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸酯氯化物以外，与实施例1同样地得到冻干脂质体(调制剂3)，测定平均粒径及ξ电位。结果示于表2中。 
实施例4 
除了使用N-ω-三甲基铵癸酰基-双十六烷基-D-谷氨酸酯溴化物(相互药工株式会社制(商品名：DC-12-16D))代替N-(α-三甲基铵乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸酯氯化物以外，与实施例1同样地得到冻干脂质体(调制剂4)，测定平均粒径及ξ电位。结果示于表2中。 
实施例5 
除了使用N-ω-三甲基铵癸酰基-双十六烷基-L-谷氨酸酯溴化物(相互药工株式会社制(商品名：DC-12-16L))代替N-(α-三甲基铵乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸酯氯化物以外，与实施例1同样地得到冻干脂质体(调制剂5)，测定平均粒径及ξ电位。结果示于表2中。 
实施例6 
除了使用N-(α-三甲基铵乙酰基)-二油基-D-谷氨酸酯氯化物(特开平6-200336号公报的制造例1的化合物，以下简称为DC-3-18：1D))代替N-(α-三甲基铵乙酰基)-双十二烷基-D-谷氨酸酯氯化物以外，与实施例1同样地得到冻干脂质体(调制剂6)，测定平均粒径及ξ电位。结果示于表2中。 
表1中示出调制剂1～6的组成。 
表1 
  
  DOP  E   (％)       胆固  醇(％) DC·3·12D    (％)    DC·3·12L    (％)    DC·3·18D    (％)    DC·12·16L     (％)     DC·12·16D     (％)     DC·3·18:1D  (％)   
调制例1  30 30 40 0 0 0 0 0
调制例2    30   30  0   40  0  0  0  0
调制例3  30 30 0 0 40 0 0 0
调制例4  30 30 0 0 0 40 0 0
调制例5    30   30  0  0  0  0   40  0
调制例6  30 30 0 0 0 0 0 40
表2 
  
  平均粒径(nm) ζ电位(mV)
调制例1 110 22
调制例2 132 24
调制例3 145 24
调制例4 118 24
调制例5 123 18
调制例6 96 12
试验例1 向CHO细胞的核酸导入试验 
将以下序列的siRNA的水溶液(1pmol/μL)用F12Ham培养基稀释6.25倍，制成siRNA稀释溶液。另外加入适量的水使调制例1中的DC-3-12D浓度为约1mM，恢复水分。 
有义5′—A C A U C A C G U A C G C G G A A U A C U U C G A—A G—3′(序列号1) 
反义3′—U A—U G U A G U G C A U G C G C C U U AU G A A G C U—5(序列号2)
用F-12HAM培养基将该液体稀释到20.8倍及125倍。在各个液体中添加与其等量的siRNA稀释溶液，进行混合，形成siRNA/脂质体复合体。此时，来源于DC-3-12D的阳离子量与来源于siRNA的阴离子量之比分别为约6及1。进而，向这些液体中添加与它们等量的含有20％FBS的F-12HAM培养基，进行混合，制成含有siRNA/脂质体复合体的培养基。将CHO(pMAM-luc)细胞(JCRB0136.1、由人科学研究资源库获得)的培养基与含有siRNA/脂质体复合体的培养基交换，开始转染。在37℃、5％CO2的条件下进行约41小时培养后，将培养基与含有1μM地塞米松、10％FBS的F-12HAM培养基交换。在37℃、5％CO2的条件下进行约6～8小时培养后，在显微镜下进行细胞观察，对细胞毒性进行评分(-：细胞占视野的85～100％左右，看不到因毒性所致损伤的痕迹；±：虽然细胞占视野的85～100％左右，但可以看到一部分因毒性所致损伤的痕迹；+：细胞占视野的70～80％左右；++：细胞占视野的50～70％左右；+++：细胞仅占视野的小于50％左右)，结果示于表3中。将培养基除去后，用PBS洗净。用PLB溶解细胞后，测定虫荧光素酶活性。作为对照，使用水来代替上述siRNA溶液实施同样的实验。另外，对调制例2～6也同样地实施，基于式(1)算出敲减(knock down)率(％)。结果示于表3中。 
式(1)：100×(siRNA添加时的虫荧光素酶活性值/siRNA无添加时的虫荧光素酶活性值) 
另外，作为阳性对照，使用Lipofectamine2000(商品名：Invitrogen公司)，进行敲减率的评价。 
用F-12HAM培养基将siRNA溶液(1pmol/μL)稀释2.5倍，制成siRNA稀释溶液。另外，用F-12HAM培养基将Lipofectamine2000(商品名：Invitrogen公司)稀释50倍。进而，在该液体中加入与其等量的siRNA稀释溶液，制成含有siRNA/Lipofectamine2000的培养基。将该培养基20μL添加到另外培养中的CHO(pMAM-luc)细胞(培养基量：100μL)，开始转染。在37℃、5％CO2条件下培养约41小时后，将培养基与含有1μM地塞米松、10％FBS的F12-Ham培养基交换。在37℃、5％CO2条件下培养约7小时后，在显微镜下进行细胞观察，对细胞毒性如前述那样进行评分。除去培养基后，用PBS(-)洗 净。用1×PLB溶解细胞后，测定虫荧光素酶活性。作为对照，使用水代替上述siRNA溶液实施同样的实验，基于式(1)算出敲减率(％)。结果，细胞毒性虽然评分为-，但在细胞中可看到白色斑点。敲减率为38(％)。 
试验例2 向HeLa细胞的核酸导入试验 
用DULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM(以下、DMEM)培养基将以下序列的siRNA的水溶液(1pmol/μL)稀释6.25倍，制成siRNA稀释溶液。另外加入适量的水使调制例1中的DC-3-12D浓度为约1mM，恢复水分。 
有5′—A C A U C A C U U A C G C U G A G U A C U U C G A—A G—3’(序列号3) 
反义3’—U A—U G U A G U G A A U G C G A C U C AU G A A G C U—5(序列号4) 
用DMEM培养基将该液体稀释为28.8倍、115倍及215倍。在各个液体中添加与其等量的siRNA稀释溶液，进行混合，形成siRNA/脂质体复合体。此时，来源于DC-3-12D的阳离子量与来源于siRNA的阴离子量之比分别为约4、1及0.5。进而在这些液体中添加与其等量的含有20％FBS的DMEM培养基，进行混合，制成含有siRNA/脂质体复合体的培养基。将NFAT Reporter HeLa Stable Cell Line(Panomics公司)的培养基与含有siRNA/脂质体复合体的培养基交换，开始转染。在37℃、5％CO2的条件下培养约18小时后，将培养基与含有10ng/mL的PMA、0.5μM Calcium ionophore A23187及10％FBS的DMEM培养基交换。在37℃、5％CO2的条件下培养约6小时后，在显微镜下进行细胞观察，与试验例1同样地对细胞毒性进行评分，结果示于表3中。去除培养基后用PBS洗净。用PLB溶解细胞后，测定虫荧光素酶活性。作为对照，使用水代替上述siRNA溶液实施同样的实验。另外，对调制例2～6也同样地实施，基于式(1)算出敲减率(％)。结果示于表3。 
另外，作为阳性对照，使用Lipofectamine 2000(商品名：Invitrogen公司)，进行敲减率的评价。
用DMEM培养基将siRNA溶液(1pmol/μL)稀释2.5倍，制成siRNA稀释溶液。另外用DMEM培养基将Lipofectamine 2000稀释100倍。进而向该液体中添加与其等量的siRNA稀释溶液，制成含有siRNA/Lipofectamine 2000的培养基。将20μL该培养基添加于另外培养中的NFAT Reporter HeLa Stable Cell Line(Panomics公司)的培养基(100μL)中，开始转染。在37℃、5％CO2的条件下培养约18小时后，将培养基与含有10ng/mL的PMA、0.5μM Calcium ionophore A23187及10％FBS的D-MEM培养基交换。在37℃、5％CO2的条件下培养约6小时后，在显微镜下进行细胞观察，与试验例1同样地对细胞毒性进行评分。去除培养基后用PBS(-)洗净。用1×PLB溶解细胞后，测定虫荧光素酶活性。作为对照，使用水代替上述siRNA溶液实施同样的实验，基于式(1)算出敲减率(％)。结果，虽然细胞毒性评分为-，但在细胞中可看到白色斑点。敲减率为9(％)。 
表3 
Figure G2007800240802D0017094316QIETU
上段：敲减率(％)；下段：细胞毒性评分 
由表3可知，本发明所述的调制例6显示出特别优异的核酸导入效率(敲除率(knock out))及低细胞毒性。其中，即使与Lipofectamine2000相比，无论细胞种类如何，都显示出高的核酸导入效率及低细胞毒性(Lipofectamine 2000虽对HeLa细胞显示高的核酸导入效率，但对 CHO细胞不充分)。因此，明确了在R1及R2中，具有链烯基的化合物显示出优异的核酸导入效率及低细胞毒性。 
实施例7 
与调制例6同样，得到表4所示的冻干脂质体(调制例7～22)。另外，与实施例1同样地测定平均粒径及ζ电位。结果示于表5中。 
表4 
  
  DOPE(％) 胆固醇(％) DC·3·18:1D(％)
调制例7 0 50 50
调制例8 10 50 40
调制例9 20 50 30
调制例10 30 50 20
调制例11 0 32 68
调制例12 15 32 53
调制例13 45 32 23
调制例14 5 16 79
调制例15 24 16 60
调制例16 42 16 42
调制例17 63 16 21
调制例18 20 0 80
调制例19 28.6 0 71.4
调制例20 40 0 60
调制例21 60 0 40
调制例22 80 0 20
表5
    平均粒径  (nm)   ξ电位  (mV)
  调制例7   123   20
  调制例8   131   17
  调制例9   88   15
  调制例10   85   24
  调制例11   112   15
  调制例12   116   16
  调制例13   113   20
  调制例14   84   16
  调制例15   89   17
  调制例16   129   19
  调制例17   150   20
  调制例18   108   19
  调制例19   73   15
  调制例20   115   19
  调制例21   87   20
  调制例22   146   25
试验例3向CHO细胞的核酸导入试验 
用F-12HAM培养基将试验例1中使用的siRNA溶液(1pmol/μL)稀释6.25倍，制成siRNA稀释溶液。另外，加入适量的水使调制例6～21中的DC-3-18：1D浓度为约1mM，恢复水分。用F-12HAM培养基将该液体稀释到14.4倍、19.2倍及56.7倍。向各个液体中添加与其等量的siRNA稀释溶液，进行混合，形成siRNA/脂质体复合体。此时，来源于DC-3-18：1D的阳离子量与来源于siRNA的阴离子量之比分别为约8、6及2。进而，向这些液体中添加与它们等量的含有20％FBS的F-12HAM培养基，进行混合，制成含有siRNA/脂质体复合体的培养基。将CHO(pMAM-luc)细胞(JCRB0136.1、由人科学研究资源库获得)的培养基与含有siRNA/脂质体复合体的培养基交换，开始转染。在37℃、5％CO2的条件下进行约41小时培养后，将培养基与含有1μM地塞米松、10％FBS的F-12HAM培养基交换。在37℃、5％CO2的条件下进行约6～8小时培养后，在显微镜下进行细胞观察，与试验例1同样地对细胞毒性进行评分。将培养基除去后，用PBS(-)洗净。用1×PLB溶解细胞后，测定虫荧光素酶活性。作为对照，使用水来代替上述siRNA溶液实施同样的实验。基于式(1)算出敲减率(％)。 结果示于表6中。 
另外，作为阳性对照，使用Lipofectamine 2000(商品名：Invitrogen公司)，与试验例1同样地进行细胞毒性的评分及算出敲减率(％)。结果，虽然细胞毒性为-，但在细胞中可看到白色斑点。敲减率为54(％)。 
表6 
Figure G2007800240802D00201
上段：敲减率(％)；下段：细胞毒性评分
试验例4向HeLa细胞的核酸导入试验 
用DMEM培养基将试验例2中使用的siRNA溶液(1pmol/μL)稀释6.25倍，制成siRNA稀释溶液。另外，加入适量的水使调制例6～21中的DC-3-18：1D浓度为约1mM，恢复水分。用DMEM培养基将该液体稀释到28.8倍、57.7倍、115倍及500倍。向各个液体中添加与其等量的siRNA稀释溶液，进行混合，形成siRNA/脂质体复合体。进而，向这些液体中添加与它们等量的含有20％FBS的DMEM培养基，进行混合，制成含有siRNA/脂质体复合体的培养基。将NFAT ReporterHeLa Stable Cell Line(Panomics公司)的培养基与含有siRNA/脂质体复合体的培养基交换，开始转染。在37℃、5％CO2的条件下进行约18小时培养后，将培养基与含有10ng/mL的PMA、0.5μM Calciumionophore A23187及10％FBS的DMEM培养基交换。在37℃、5％CO2的条件下进行约6小时培养后，在显微镜下进行细胞观察，与试验例1同样地对细胞毒性进行评分。将培养基除去后，用PBS洗净。用PLB溶解细胞后，测定虫荧光素酶活性。作为对照，使用水来代替上述siRNA溶液实施同样的实验。基于式(1)算出敲减率(％)。结果示于表7中。 
另外，作为阳性对照，使用Lipofectamine 2000(商品名：Invitrogen公司)，与试验例2同样地进行细胞毒性的评分及算出敲减率(％)。结果，虽然细胞毒性为-，但在细胞中可看到白色斑点。敲减率为10(％)。 
表7 
Figure G2007800240802D00221
上段：敲减率(％)；下段：细胞毒性评分 
由表6及7可知，本发明所述的调制例6、8、9、12、15、18、19及20显示出优异的核酸导入效率及低细胞毒性。其中，优选调制例6、8、12、15及20，更优选调制例6、8、12及15。 
在核酸的导入中，从导入效率及细胞毒性的观点考虑，明确了通过适当选择本发明所述的通式(I)所示化合物、磷脂质、胆甾醇等的浓度，能提供更优异的核酸导入组合物。
试验例5 向HeLa细胞的核酸导入试验 
对核酸封入型脂质体和核酸复合型脂质体的核酸导入效率进行了比较研究。 
(1)核酸封入型脂质体的评价 
加入试验例2中使用的siRNA水溶液(34.3pmol/μL、18.5pmol/μL、4.6pmol/μL)使调制例6中的DC-3-18：1D浓度为约1mM，恢复水分，同时形成siRNA封入型脂质体。用DMEM培养基将该液体稀释到428.6倍、230.8倍及57.7倍。向这些液体中添加与它们等量的含有20％FBS的DMEM培养基，进行混合，制成含有siRNA封入型脂质体的培养基。将NFAT Reporter HeLa Stable Cell Line(Panomics公司)的培养基与含有siRNA封入型脂质体的培养基交换，开始转染。在37℃、5％CO2的条件下进行约18小时培养后，将培养基与含有10ng/mL的PMA、0.5μM Calcium ionophore A23187及10％FBS的DMEM培养基交换。在37℃、5％CO2的条件下进行约6小时培养后，在显微镜下进行细胞观察，与试验例1同样地对细胞毒性进行评分。将培养基除去后，用PBS(-)洗净。用1×PLB溶解细胞后，测定虫荧光素酶活性。作为对照，使用水来代替上述siRNA溶液实施同样的实验。基于式(1)算出敲减率(％)。结果示于表8中。 
(2)核酸复合型脂质体的评价 
用DMEM培养基将上述(1)中使用的siRNA水溶液(1pmol/μL)稀释，制成含有siRNA 80.2fmol/μL、80.3fmol/μL、81.4fmol/μL的DMEM培养基。另外加入适量的水使调制例6中的DC-3-18：1D浓度为约1mM，恢复水分。用含有siRNA 80.2fmol/μL、80.3fmol/μL、81.4fmol/μL的DMEM培养基将该液体稀释到428.6倍、230.8倍及57.7倍，同时形成siRNA复合型脂质体。向这些液体中添加与它们等量的含有20％FBS的DMEM培养基，进行混合，制成含有siRNA复合型脂质体的培养基。将NFAT Reporter HeLa Stable Cell Line(Panomics公司)的培养基与含有siRNA复合型脂质体的培养基交换，开始转染。在37℃、5％CO2的条件下进行约18小时培养后，将培养基与含有10ng/mL的PMA、0.5μM Calcium ionophore A23187及10％FBS的DMEM培养基交换。 在37℃、5％CO2的条件下进行约6小时培养后，在显微镜下进行细胞观察，与试验例1同样地对细胞毒性进行评分。将培养基除去后，用PBS(-)洗净。用1×PLB溶解细胞后，测定虫荧光素酶活性。作为对照，使用水来代替上述siRNA溶液实施同样的实验。基于式(1)测定敲减率(％)。结果示于表8中。 
表8 
Figure G2007800240802D00241
由表8可知，在脂质体冻干制剂中直接添加siRNA溶液而成的封入型脂质体，无论脂质体的添加量如何，均显示出比复合型高的敲减效果。 
产业上利用的可能性 
如果使用本发明的组合物，则细胞毒性低、可高效地导入核酸，因而作为核酸导入用试剂、药品等的核酸导入剂而有用。

Claims (13)

1.一种向细胞导入核酸用组合物，其特征在于，含有下述式(I)所示的化合物和磷脂质，
Figure FSB00000813041900011
式中，R1和R2相同或不同，表示碳原子数12～18的链烯基，R3表示甲基，m表示1，X表示卤原子，
相对于组合物中的全部脂质量，式(I)所示化合物的含量为40～60摩尔％，
式(I)所示化合物与磷脂质的摩尔比为2∶3～16∶1。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还含有相对于组合物中的全部脂质量为0～50摩尔％的胆甾醇和/或胆甾烷醇。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，式(I)中，X表示氯原子或溴原子。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，磷脂质为选自磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心肌磷脂、鞘磷脂、缩醛磷脂和磷脂酸中的1种或2种以上。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，磷脂质为二油酰基磷脂酰乙醇胺。
6.一种向细胞导入核酸用组合物，其特征在于，含有N-(α-三甲基铵乙酰基)-二油基-D-谷氨酸酯氯化物、二油酰基磷脂酰乙醇胺和胆甾醇。
7.根据权利要求1或6所述的组合物，其特征在于，还含有核酸。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，核酸为短寡核苷酸。
9.根据权利要求1或6所述的组合物，其特征在于，形成脂质膜结构体。
10.根据权利要求1或6所述的组合物，其特征在于，形成脂质体。
11.根据权利要求1或6所述的组合物，其特征在于，是冻干物。
12.一种向细胞导入核酸的方法，其特征在于，将权利要求8～11中任一项所述的组合物在体外应用于细胞。
13.权利要求1～11中任一项所述的组合物在用于制造核酸导入剂中的用途。
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