KR20090034821A - 핵산 도입용 조성물 - Google Patents

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히데오 고바야시
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다이고 아사노
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홋카이도 시스테무 사이엔스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 세포 독성이 낮고, 피도입 핵산의 세포 내 도입성 및 세포 내에서의 발현을 개선한 핵산 도입용 조성물을 제공한다. 하기 식 (I) (식 중, R1 및 R2 는 동일하거나 또는 상이하며, 탄소수 12∼22 의 포화 또는 불포화의 탄화수소기를 의미하고, R3 는 탄소수 1∼6 의 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 히드록시알킬기를 의미하고, m 은 1∼10 의 정수를 의미하며, X 는 할로겐 원자를 의미한다.) 로 나타내는 화합물 및 인지질을 함유하는 세포에 대한 핵산 도입용 조성물.

Description

핵산 도입용 조성물{COMPOSITION FOR NUCLEIC-ACID INTRODUCTION}
본 발명은, 핵산을 세포 내에 도입하기 위한 조성물에 관한 것이다.
유전자 등의 핵산을 세포 내에 도입하는 방법으로서 카티온성 지질 단독 또는 이것을 함유하는 리포솜과 핵산이 형성하는 복합체를 사용하는 방법이 알려져 있다 (예를 들어, 특허 문헌 1 참조). 실제로, 이 방법용의 시약으로서 예를 들어, 「리포펙트아민」, 「리포펙틴」, 「트랜스펙탐」, 「진트랜스퍼」, 「리포펙트아민 2000」등이 시판되고 있다.
그러나, 이들 시판되는 시약에는, 다음과 같은 문제점이 지적되고 있다. a) 제제로서의 보존 안정성이 나쁘고, 리포솜 등을 사용한 유전자의 세포 내 도입ㆍ발현에 있어서 재현성이 나쁘다. b) 세포 배양을 위한 배지 중에 첨가하는 혈청 (Fetal Bovine Serum) 중에서 매우 불안정하고, 세포를 배양하고 있는 혈청 함유 배지를 일단 무혈청 배지에서 치환하고, 도입 후 또 혈청 함유 배지에서 되돌린다는 번잡한 순서가 사용되고 있다. 또 최근에는, 혈액 중 혹은 체내에 있어서도 매우 불안정하다는 것이 밝혀지고 있다. c) 시판품의 대부분 (예를 들어, 리포펙트아민, 리포펙틴, 리포펙트아민 2000) 은 이미 지질이 물에 분산된 형태로만 제공되어 있고, 여기에 밖에서부터 유전자 수용액을 첨가하는 순서로 되어 있는데, 이것으로는 리포솜의 외측에 유전자가 결합된 복합체는 제조할 수 있어도, 유전자를 내봉(內封)한 리포솜을 제조하는 것은 불가능하다. 또, 리포펙트아민 2000 은 카티온성 지질의 과산화물 형성을 피하기 위해, 과잉 교반, 진탕을 하지 못하여, 세심한 주의가 필요하다는 번잡함이 있다. d) 세포 독성이 매우 강하다.
이와 같이, 유전자 등의 핵산을 카티온성 지질 단독 또는 리포솜을 사용하여 세포 내에 도입시키는 시약은 몇 가지 판매되고는 있지만, 많은 문제를 갖고 있다.
특허 문헌 1 : 일본 공개특허공보 평2-135092호
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은, 세포 독성이 낮고, 피도입 핵산의 세포 내 도입성 및 세포 내에서의 발현을 개선한 핵산 도입용 조성물을 제공하는 것에 관한 것이다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은, 저세포 독성, 핵산의 세포 내 도입성, 나아가서는 세포 내에서의 발현을 개선하는 방법에 대해 예의 검토한 결과, 하기 식 (I)
[화학식 1]
Figure 112008088704201-PCT00001
(식 중, R1 및 R2 는 동일하거나 또는 상이하며, 탄소수 12∼22 의 포화 또는 불포화의 탄화수소기를 의미하고, R3 은 탄소수 1∼6 의 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 히드록시알킬기를 의미하고, m 은 1∼10 의 정수를 의미하고, X 는 할로겐 원자를 의미한다.)
로 나타내는 화합물 및 인지질을 유전자 등의 핵산과 함께 투여 또는 세포에 공급함으로써, 저세포 독성이고, 핵산이 효율적으로 도입되는 것을 알아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하의 발명에 관련된 것이다.
(1) 상기 식 (I) 로 나타내는 화합물 및 인지질을 함유하는 세포에 대한 핵산 도입용 조성물.
(2) 추가로 콜레스테롤 및/또는 콜레스타놀을 조성물 중의 전체 지질량에 대해 0∼50 몰% 함유하는 것인 (1) 에 기재된 조성물.
(3) 식 (I) 로 나타내는 화합물의 함유량이 조성물 중의 전체 지질량에 대해 40∼60 몰% 인 (1) 또는 (2) 에 기재된 조성물.
(4) 식 (I) 로 나타내는 화합물과 인지질의 비 (몰비) 가 2：3 ∼16：1 인 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(5) 식 (I) 중, R1 및 R2 가 탄소수 12∼18 의 알킬기 또는 알케닐기를 의미하고, R3 이 메틸기를 의미하며, m 이 1 을 의미하는 것인 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(6) 식 (I) 중, X 가 염소 원자 또는 브롬 원자를 의미하는 것인 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(7) 인지질이 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 카르디올리핀, 스핑고미엘린, 플라스마로겐 및 포스파티드산에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(8) 인지질이 포스파티딜에탄올아민인 (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(9) 인지질이 디올레오일포스파티딜에탄올아민인 (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(10) N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디올레일-D-글루타메이트클로라이드, 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤을 함유하는 세포에 대한 핵산 도입용 조성물.
(11) 추가로 핵산을 함유하는 것인 (1)∼(10) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(12) 핵산이 쇼트(short) 올리고뉴클레오티드인 (11) 에 기재된 조성물.
(13) 지질막 구조체를 형성하고 있는 것인 (1)∼(12) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(14) 리포솜을 형성하고 있는 것인 (1)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(15) 동결 건조물인 (1)∼(14) 중 어느 하나에 기재된 조성물.
(16) (11)∼(15) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 인ㆍ비트로 또는 인ㆍ비보로 세포에 적용하는 것을 특징으로 하는 핵산의 세포에 대한 도입 방법.
(17) 핵산 도입제를 제조하기 위한 (1)∼(15) 중 어느 하나에 기재된 조성물의 사용.
(18) 하기의 (i)∼(iii) 의 공정 ：
(i) 표적 핵산을 도입한 세포와 피험물질을 접촉시키는 공정,
(ii) 피험물질을 접촉시킨 세포에 있어서의 표적 핵산의 발현량을 측정하는 공정,
(iii) 상기 (ii) 의 측정량이 대조 세포의 표적 핵산의 발현량보다 크거나 또는 작은 피험물질을 선택하는 공정
을 갖는 표적 핵산의 발현 증가 또는 발현 억제 물질의 스크리닝 방법에 있어서, 표적 핵산의 세포에 대한 도입 및/또는 피험물질의 당해 세포에 대한 접촉을 (1)∼(15) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 발현 억제 물질의 스크리닝 방법.
발명의 효과
본 발명의 조성물을 사용하면, 저세포 독성이고, 핵산을 효율적으로 세포에 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 핵산 도입용 시약 또는 의약으로서 유용하다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 핵산 도입용 조성물은 피도입 핵산과 함께 사용하여, 그 핵산을 세포에 도입하기 위한 조성물인데, 적어도, 상기 식 (I) 로 나타내는 화합물 및 인지질을 함유하는 것이면 되고, 피도입 핵산을 함유하는 것 (핵산 함유 조성물), 및 피도입 핵산을 함유하지 않는 것이 포함된다.
본 발명의 조성물에 관련된 식 (I) 로 나타내는 화합물 중의 치환기에 대해 설명한다.
식 (I) 중, R1 및 R2 는 동일하거나 또는 상이하며, 탄소수 12∼22 의 포화 또는 불포화의 탄화수소기를 의미하는 것으로서, 구체적으로는, 도데실기, 트리데실기, 테트라데실기, 펜타데실기, 헥사데실기, 헵타데실기, 옥타데실기, 올레일기, 리놀레일기, 리놀레닐기 등을 들 수 있다. R1 및 R2 로서는, 동일한 것이 바람직하다. 식 (I) 중, R1 및 R2 로서는, 탄소수 12∼18 의 알킬기 또는 알케닐기가 바람직하고, 구체적으로는, 도데실기, 테트라데실기, 헥사데실기, 옥타데실기, 올레일기 등을 바람직한 것으로서 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 탄소수 12∼18 의 알케닐기가 보다 바람직하다.
R3 은 탄소수 1∼6 의 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 히드록시알킬기를 의미하는 것으로서, 탄소수 1∼6 의 알킬기로서는, 메틸기, 에틸기 등을 들 수 있고, 그 중에서도 메틸기가 바람직하다. 탄소수 1∼6 의 히드록시알킬기로서는, 히드록시메틸기, 히드록시에틸기를 들 수 있다.
m 은 1∼10 의 정수를 의미하는 것으로서, m 은 1 또는 10 이 바람직하다.
X 는 할로겐 원자를 의미하는 것으로서, 염소 원자, 브롬 원자 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물에 관련된 식 (I) 로 나타내는 화합물은 공지된 화합물이며, 공지된 방법 (예를 들어, 일본 공개특허공보 평6-200336호 참조) 에 의해 제조할 수 있는 것 외에, 소고 약공 주식회사로부터, N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트클로라이드 (제품명：DC-3-12D), N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-L-글루타메이트클로라이드 (제품명：DC-3-12L), N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디옥타데실-D-글루타메이트클로라이드 (제품명：DC-3-18D), N-ω-트리메틸암모니오데카노일-데헥사데실-D-글루타메이트브로마이드 (제품명：DC-12-16D), N-ω-트리메틸암모니오데카노일-데헥사데실-L-글루타메이트브로마이드 (제품명：DC-12-16L) 등이 시판되고 있고, 이것을 사용해도 된다. 본 발명에 있어서는, N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디올레일-글루타메이트할라이드가 바람직하고, N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디올레일-D-글루타메이트클로라이드가 특히 바람직하다.
본 발명의 조성물에 관련된 일반식 (I) 로 나타내는 화합물의 함유량은, 본 발명의 조성물 중의 전체 지질량에 따라 적절히 결정하면 되는데, 전체 지질량에 대해 20∼80 몰% 로 하는 것이 바람직하고, 40∼60 몰% 로 하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 조성물에 관련된 인지질로서는, 예를 들어, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 카르디올리핀, 스핑고미엘린, 플라스마로겐, 포스파티드산 등을 들 수 있고, 이들은 1 종 또는 2 종 이상을 배합하여 사용할 수 있다.
이 중, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜콜린을 단독 또는 조합하여 사용하는 것이 보다 바람직하고, 포스파티딜에탄올아민을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 이들 인지질의 지방산 잔기로서는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 탄소수 12∼18 의 포화 또는 불포화 지방산 잔기를 들 수 있고, 팔미토일기, 올레오일기, 스테아로일기, 리놀레일기 등이 바람직하다. 본 발명에 관련된 인지질로서는, 디올레오일포스파티딜에탄올아민이 특히 바람직하다.
또, 본 발명의 조성물에 있어서는, 콜레스테롤 및/또는 콜레스타놀 등의 스테롤류를 추가로 배합할 수 있고, 그 배합량으로서는, 조성물 중의 전체 지질량의 0∼50 몰% 가 바람직하고, 16∼50 몰% 가 보다 바람직하다.
상기 인지질의 본 발명의 조성물에 대한 배합량은, 전체 지질량에 따라 적절히 검토하면 되는데, 일반식 (I) 로 나타내는 화합물과 인지질의 비 (몰비) 가 2：3 ∼ 16：1 인 것이 바람직하고, 1.3：1 ∼ 4：1 인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 조성물에 있어서는, (가) 일반식 (I) 로 나타내는 화합물과 인지질의 비 (몰비) 가 1.3：1 ∼ 4：1 인 것이 바람직하고, (나) 일반식 (I) 로 나타내는 화합물과 인지질의 비 (몰비) 가 1.3：1 ∼ 4：1 이며, 또한 일반식 (I) 로 나타내는 화합물의 함유량이 본 발명의 조성물 중의 전체 지질량에 대해 40∼60 몰% 인 것이 보다 바람직하고, (다) 일반식 (I) 로 나타내는 화합물과 인지질의 비 (몰비) 가 1.3：1 ∼ 4：1 이며, 일반식 (I) 로 나타내는 화합물의 함유량이 본 발명의 조성물 중의 전체 지질량에 대해 40∼60 몰% 이며, 또한 스테롤류의 배합량이 본 발명의 조성물 중의 전체 지질량의 16∼50 몰% 가 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물에 적용되는 피도입 핵산으로서는, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA 중 어느 것이어도 되고, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, shRNA, siRNA, miRNA 등의 쇼트 올리고뉴클레오티드나, 효소, 사이토카인 등의 생리 활성 물질, 안티센스 RNA, shRNA, siRNA 를 코드하는 유전자 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 일반식 (I) 로 나타내는 화합물의 함유량은, 핵산을 세포 내에 도입하는 데 충분한 양이면 되고, 핵산의 종류, 용도, 조성물의 형태 등에 따라 적절히 결정하면 되는데, 예를 들어, 핵산 200ng 에 대해 일반식 (I) 로 나타내는 화합물 125∼2000p 몰 함유하는 것이 바람직하고, 250∼1000p 몰 함유하는 것이 보다 바람직하다. 또, 인산기 환산으로 1 몰의 siRNA 에 대해 일반식 (I) 로 나타내는 화합물 0.1∼10 몰 함유하는 것이 바람직하고, 0.5∼2 몰 함유하는 것이 보다 바람직하다. 예를 들어, 27mer 의 siRNA 를 사용하는 경우, siRNA 1 몰에 대해 일반식 (I) 로 나타내는 화합물 5.4∼540 몰 함유하는 것이 바람직하고, 27∼108 몰 함유하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 조성물은 일반식 (I) 로 나타내는 화합물과 인지질이나 이들 외에 원하는 바에 따라 스테롤류를 함유한 단순한 혼합물로서의 형태이어도 되고, 일반식 (I) 로 나타내는 화합물, 인지질 및 스테롤류와의 조합으로 지질막 구조체를 형성한 형태이어도 된다.
당해 지질막 구조체의 형태는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 건조시킨 지질 혼합물 형태, 지질막 구조체가 수계 용매에 분산된 형태, 추가로 이것을 건조시킨 형태나 동결시킨 형태 등을 들 수 있다.
이 중, 지질막 구조체가 수계 용매에 분산된 형태로서는, 예를 들어, 1 장막 리포솜, 다중층 리포솜, O/W 형 에멀션, W/O/W 형 에멀션, 구상 미셀, 끈상 미셀, 부정형의 층상 구조물 등을 들 수 있다. 이들 중 리포솜이 바람직하다. 분산된 상태의 지질막 구조체의 크기는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 리포솜이나 에멀션의 경우에는 입자 직경이 50nm∼5㎛ 이며, 구상 미셀의 경우, 입자 직경이 5∼100nm 이다. 끈상 미셀이나 부정형의 층상 구조물의 경우에는, 그 1 층당 두께가 5∼10nm 이며, 이들이 층을 형성하고 있는 것이 바람직하다.
이하에, 각종 지질막 구조체에 대해, 그 제조예를 설명한다.
1) 건조시킨 혼합물의 형태의 지질막 구조체는, 예를 들어, 지질막 구조체의 구성 성분 모두를 일단 클로로포름 등의 유기 용매에 용해시키고, 이어서 이배퍼레이터에 의한 감압 건고나 분무 건조기에 의한 분무 건조를 실시함으로써 제조할 수 있다.
2) 지질막 구조체가 수계 용매에 분산된 형태는, 상기의 건조시킨 혼합물을 수계 용매에 첨가하고, 추가로 호모게나이저 등의 유화기, 초음파 유화기, 고압 분사 유화기 등에 의해 유화함으로써 제조할 수 있다. 또, 리포솜을 제조하는 방법으로서 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어 역상 증발법 등에 의해서도 제조할 수 있다. 지질막 구조체의 크기를 제어하고자 하는 경우에는, 구멍 직경이 정렬된 멤브레인 필터 등을 사용하여, 고압 하에서 익스트루젼 (압출 여과) 을 실시하면 된다.
수계 용매 (분산매) 의 조성은 특별히 한정되어야 하는 것은 아니고, 예를 들어, 인산염 완충액, 시트르산염 완충액, 인산염 완충화 생리 식염액 등의 완충액, 생리 식염수, 세포 배양용 배지 등을 들 수 있다. 이들 수계 용매 (분산매) 는 지질막 구조체를 안정적으로 분산시킬 수 있는데, 추가로 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 프룩토오스, 이노시톨, 리보오스, 자일로오스 등의 단당류, 젖당, 자당, 셀로비오스, 트레할로스, 말토오스 등의 2 당류, 라피노오스, 멜레지토오스 등의 3 당류, 시클로덱스트린 등의 다당류, 에리트리톨, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 멀티톨 등의 당알코올 등의 당 (수용액) 이나, 글리세린, 디글리세린, 폴리글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜모노알킬에테르, 디에틸렌글리콜모노알킬에테르, 1,3-부틸렌글리콜 등의 다가 알코올 (수용액) 등을 첨가해도 된다. 이 수계 용매 (분산매) 에 분산된 지질막 구조체를 안정적으로 장기간 보존하려면, 응집 등의 물리적 안정성 면에서, 수계 용매 (분산매) 중의 전해질을 최대한 없애는 것이 바람직하다. 또, 지질의 화학적 안정성 면에서, 수계 용매 (분산매) 의 pH 를 약산성에서 중성 부근 (pH 3.0∼8.0) 에 설정하는 것이나 질소 버블링에 의해 용존 산소를 제거하는 것이 바람직하다.
여기서, 당 또는 다가 알코올의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 지질막 구조체가 수계 용매에 분산된 상태에 있어서, 예를 들어, 당 (수용액) 은, 2∼20% (W/V) 가 바람직하고, 5∼10% (W/V) 가 더욱 바람직하다. 또, 다가 알코올 (수용액) 은, 1∼5% (W/V) 가 바람직하고, 2∼2.5% (W/V) 가 더욱 바람직하다. 수계 용매 (분산매) 로서 완충액을 사용하는 경우에는, 완충제의 농도가 5∼50mM 가 바람직하고, 10∼20mM 가 더욱 바람직하다. 수계 용매 (분산매) 에 있어서의 지질막 구조체의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 지질막 구조체의 구성 성분으로서 사용하는 디(C12-16알킬)디메틸암모늄 할라이드 및 인지질, 원하는 바에 따라 스테롤류를 함유하는 전체 지질의 농도는, 0.2∼50mM 가 바람직하고, 1∼10mM 가 더욱 바람직하다.
3) 지질막 구조체가 수계 용매에 분산된 형태를 건조 또는 동결시킨 형태는, 상기의 수계 용매에 분산된 지질막 구조체를 통상적인 동결 건조나 분무 건조에 의한 건조 또는 동결 방법 등에 따라 제조할 수 있다. 수계 용매에 분산된 형태의 지질막 구조체를 일단 제조한 후 추가로 건조시키면, 지질막 구조체의 장기 보존이 가능해지는 것 외에, 이 건조시킨 지질막 구조체에 핵산 함유 수용액을 첨가하면, 효율적으로 지질 혼합물이 수화되기 때문에 핵산을 효율적으로 지질막 구조체에 유지시킬 수 있다는 장점이 있다.
동결 건조나 분무 건조시키는 경우에는, 예를 들어, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 프룩토오스, 이노시톨, 리보오스, 자일로오스 등의 단당류, 젖당, 자당, 셀로비오스, 트레할로스, 말토오스 등의 2 당류, 라피노오스, 멜레지토오스 등의 3 당류, 시클로덱스트린 등의 다당류, 에리트리톨, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 멀티톨 등의 당알코올 등의 당 (수용액) 을 사용하면 안정적으로 장기간 보존할 수 있다. 또, 동결시키는 경우에는, 예를 들어, 상기한 당 (수용액) 이나 글리세린, 디글리세린, 폴리글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜모노알킬에테르, 디에틸렌글리콜모노알킬에테르, 1,3-부틸렌글리콜 등의 다가 알코올 (수용액) 을 각각 사용하면 안정적으로 장기간 보존할 수 있다. 당과 다가 알코올을 조합하여 사용해도 된다.
본 발명의 핵산 도입용 조성물은 피도입 핵산을 함유시킨 조성물 (핵산 함유 조성물) 로 할 수 있는데, 이하에 이 경우의 조성물에 대해 설명한다.
조성물의 형태로서는, 일반식 (I) 로 나타내는 화합물, 인지질과 핵산이나 이들 외에 원하는 바에 따라 스테롤류 등을 함유한 단순히 혼합물로서 존재하고 있어도 되고, 일반식 (I) 로 나타내는 화합물, 인지질 및 스테롤류의 조합으로 형성된 지질막 구조체와 핵산이 혼합된 형태이어도 되고, 추가로 지질막 구조체에 핵산이 유지된 형태이어도 된다. 여기서, 「유지」란, 핵산이 지질막 구조체의 지질막 중, 표면, 내부, 지질층 중, 및/또는 지질층의 표면에 존재하는 것을 의미한다. 지질막 구조체가, 예를 들어 리포솜 등의 미립자인 경우에는, 미립자 내부에 핵산을 봉입할 수도 있다.
또, 지질막 구조체의 형태는, 전술한 지질막 구조체와 마찬가지로, 혼합 건조물 형태, 수계 용매에 분산된 형태, 추가로 이것을 건조시킨 형태나 동결시킨 형태 등을 들 수 있다.
이하에, 각종 지질막 구조체에 대해, 그 제조예를 설명한다.
1) 혼합 건조물 형태로 하는 경우에는, 예를 들어, 지질막 구조체의 구성 성분과 핵산을 일단 클로로포름 등의 유기 용매로 용해시켜 혼합물을 얻고, 다음으로 이것을 이배퍼레이터에 의한 감압 건고나 분무 건조기에 의한 분무 건조시킴으로써 제조할 수 있다.
2) 지질막 구조체와 핵산을 함유하는 수계 용매에 분산된 형태로 하는 경우에는, 그 제조 방법으로서는 몇 가지의 방법이 알려져 있고, 지질막 구조체에 있어서의 핵산의 유지 양식이나 혼합물의 성상 등에 따라, 하기 2-1∼2-5 와 같이 적당한 제조법을 선택할 수 있다.
2-1) 제조법 1
상기 서술한 혼합 건조물에 수계 용매를 첨가하고, 추가로 호모게나이저 등의 유화기, 초음파 유화기, 고압 분사 유화기 등에 의한 유화를 실시하여 제조하는 방법이다. 크기 (입자 직경) 를 제어하는 경우에는, 추가로 구멍 직경이 정렬된 멤브레인 필터를 사용하여, 고압력 하에서 익스트루젼 (압출 여과) 을 실시하면 된다. 이 방법의 경우, 먼저, 지질막 구조체의 구성 성분과 핵산의 혼합 건조물을 만들기 위해, 지질막 구조체와 핵산을 유기 용매에 용해시킬 필요가 있지만, 지질막 구조체의 구성 성분과 핵산의 상호 작용을 최대한으로 사용할 수 있다는 장점이 있다. 즉, 지질막 구조체가 층상 구조를 갖는 경우에도, 핵산은 다중층의 내부에까지 들어갈 수 있고, 이 제조 방법을 사용하면 핵산의 지질막 구조체에 대한 유지율을 높일 수 있다는 장점이 있다.
2-2) 제조법 2
지질막 구조체의 구성 성분을 유기 용매로 일단 용해시킨 후, 유기 용매를 증류 제거한 건조물에, 추가로 핵산을 함유하는 수계 용매를 첨가하고, 유화를 실시하여 제조하는 방법이다. 크기 (입자 직경) 를 제어하는 경우에는, 추가로 구멍 직경이 정렬된 멤브레인 필터를 사용하여, 고압력 하에서 익스트루젼 (압출 여과) 을 실시하면 된다. 유기 용매에는 잘 용해되지 않지만, 수계 용매에는 용해될 수 있는 핵산에 적용할 수 있다. 지질막 구조체가 리포솜인 경우, 내수상 부분에도 핵산을 유지할 수 있다는 장점이 있다.
2-3) 제조법 3
수계 용매에 이미 분산된 리포솜, 에멀션, 미셀, 또는 층상 구조물 등의 지질막 구조체에, 추가로 핵산을 함유하는 수계 용매를 첨가하여 제조하는 방법이다. 대상이 되는 핵산으로서는, 수용성인 것을 이용할 수 있다. 이미 완성되어 있는 지질막 구조체에 외부로부터 핵산을 첨가하는 방법인 점에서, 핵산이 고분자인 경우에는, 핵산은 지질막 구조체의 내부에는 들어가지 못하고, 지질막 구조체의 표면에 존재 (결합) 한 존재 양식을 취할 가능성이 있다. 지질막 구조체로서 리포솜을 사용한 경우, 이 제조법 3 을 사용하면 핵산이 리포솜 입자끼리의 사이에 끼워진 샌드위치 구조 (일반적으로는 복합체 혹은 컴플렉스라고 불리고 있다.) 를 형성하는 것이 알려져 있다. 이 제조법에서는, 지질막 구조체 단독의 수분산액을 미리 제조하기 때문에, 유화시에 있어서의 핵산의 분해 등을 고려할 필요가 없고, 크기 (입자 직경) 의 제어도 하기 쉽다. 따라서, 제조법 1 이나 제조법 2 에 비해 비교적 용이하게 제조할 수 있다.
2-4) 제조법 4
수계 용매에 분산된 지질막 구조체를 제조하여 건조시킴으로써 얻어진 건조물에, 추가로 핵산을 함유하는 수계 용매를 첨가하여 제조하는 방법이다. 제조법 3 과 동일하게 대상이 되는 핵산으로서는, 수용성인 것을 이용할 수 있다. 제조법 3 과의 차이점은, 지질막 구조체와 핵산과의 존재 양식에 있고, 이 제조법 4 에서는, 수계 용매에 분산된 지질막 구조체를 일단 제조한 후에 추가로 건조시킨 건조물을 제조한다는 점에서, 이 단계에서 지질막 구조체는 지질막의 단편으로서 고체 상태에서 존재한다. 이 지질막의 단편을 고체 상태로 존재시키기 위해서는, 상기한 바와 같이 수계 용매에, 추가로 당 (수용액), 바람직하게는 자당 (수용액) 이나 젖당 (수용액) 을 첨가한 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 여기서, 핵산을 함유하는 수계 용매를 첨가하면, 고체 상태에서 존재하고 있던 지질막의 단편은 물의 침입과 함께 신속하게 수화되기 시작하고, 지질막 구조체를 재구축할 수 있다. 이 때, 핵산이 지질막 구조체 내부에 유지된 형태의 구조체를 제조할 수 있다.
제조법 3 에서는, 핵산이 고분자인 경우에는, 핵산은 지질막 구조체 내부에는 들어가지 못하고, 지질막 구조체의 표면에 결합된 존재 양식을 취하는데, 제조법 4 는 이 점에서 크게 상이하다. 즉, 핵산의 일부 또는 전부는 지질막 구조체 내부에 도입된다. 이 제조법 4 는, 지질막 구조체 단독의 분산액을 미리 제조하기 위해, 유화시의 핵산의 분해를 고려할 필요가 없고, 크기 (입자 직경) 의 제어도 하기 쉽다. 따라서, 제조법 1 이나 제조법 2 에 비해 비교적 제조가 용이하다. 또, 이 외에, 일단 동결 건조 또는 분무 건조를 실시하기 때문에, 제제 (핵산 함유 조성물) 로서의 보존 안정성을 보증하기 쉽고, 건조 제제를 핵산의 수용액으로 재수화해도 크기 (입자 직경) 를 원래대로 되돌릴 수 있다는 점, 고분자의 핵산이어도, 지질막 구조체 내부에 핵산을 유지시키기 쉽다는 등의 장점이 있다.
2-5) 그 외
지질막 구조체와 핵산의 혼합물이 수계 용매에 분산된 형태를 제조하기 위한 다른 방법으로서는, 리포솜을 제조하는 방법으로서 잘 알려진 방법, 예를 들어 역상 증발법 등을 채용할 수 있다. 크기 (입자 직경) 를 제어하는 경우에는, 구멍 직경이 정렬된 멤브레인 필터를 사용하여, 고압력 하에서 익스트루젼 (압출 여과) 을 실시하면 된다.
3) 상기의 지질막 구조체와 핵산의 혼합물이 수계 용매에 분산된 분산액을 추가로 건조시키는 형태로 하는 경우에는, 동결 건조나 분무 건조하는 방법 등을 들 수 있다. 이 때의 수계 용매로서는, 상기한 당 (수용액), 바람직하게는 자당 (수용액) 이나 젖당 (수용액) 을 첨가한 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 지질막 구조체와 핵산의 혼합물이 수계 용매에 분산된 분산액을 추가로 동결시키는 방법으로서는, 통상적인 동결 방법을 들 수 있는데, 이 경우의 수계 용매로서는, 당 (수용액) 이나 다가 알코올 (수용액) 을 첨가한 용매를 사용하는 것이 바람직하다.
이렇게 하여 얻어지는 본 발명의 조성물을 사용하면, 세포 내에 핵산을 효율적으로 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 핵산 도입용 시약이나 의약 등의 핵산 도입제로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 인ㆍ비트로의 경우에는, 표적 세포를 함유하는 현탁액에 본 발명의 핵산 함유 조성물을 첨가하거나 당해 핵산 함유 조성물을 함유하는 배지에서 표적 세포를 배양하는 등의 수단에 의해, 당해 표적 세포에 핵산을 도입할 수 있다. 또, 인ㆍ비보의 경우에는, 본 발명의 핵산 함유 조성물을 인간 또는 비인간 동물에 투여하면 된다. 투여 수단으로서는, 경구 투여이어도 되고 비경구 투여이어도 되며, 경구 투여의 제형으로서는, 통상적으로 알려져 있는 것이어도 되고, 예를 들어, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있고, 비경구 투여의 제형으로서는 통상적으로 알려져 있는 것이어도 되고, 예를 들어, 주사제, 점안제, 연고제, 좌제 등을 들 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여이다. 그 중에서도, 주사제가 바람직하고, 투여 방법으로서는, 정맥주사, 표적으로 하는 세포나 장기에 대한 국소 주사가 바람직하다.
또, 본 발명의 핵산 도입용 조성물은 하기의 (1)∼(3) 의 공정：
(1) 표적 핵산을 도입한 세포와 피험물질을 접촉시키는 공정,
(2) 피험물질을 접촉시킨 세포에 있어서의 표적 핵산의 발현량을 측정하는 공정,
(3) 상기 (2) 의 측정량이 대조 세포의 표적 핵산의 발현량보다 크거나 또는 작은 피험물질을 선택하는 공정
을 갖는 표적 핵산의 발현 증가 또는 억제 물질의 스크리닝 방법에 있어서, 표적 핵산의 세포에 대한 도입 및/또는 피험물질의 당해 세포에 대한 접촉 (도입) 에 사용할 수 있다.
여기서, 표적 핵산으로서는, 예를 들어 질환에 관계되는 유전자나 이것을 함유하는 플라스미드 DNA 등을 들 수 있고, 피험물질로서는, 예를 들어 분자량 1 만 미만, 바람직하게는 100∼2000 의 저분자 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, shRNA, siRNA, miRNA 등의 쇼트 뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
핵산 발현량의 측정은, 노던블롯법이나 RT-PCR 법, 정량 PCR 법 등의 공지된 방법, 또는 DNA 어레이를 이용한 측정 방법 등에 의해 실시할 수 있다.
또, 대조 세포로서는, 피험물질을 접촉시키지 않는 세포, 혹은 표적 핵산에 영향을 미치지 않는 쇼트 뉴클레오티드 또는 임의의 물질을 도입한 세포 등을 들 수 있다.
이하에 실시예를 나타내는데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트클로라이드 (소고 약공 주식회사 제조 (제품명：DC-3-12D)), 콜레스테롤 (와코 순약 주식회사 제조), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE ； 닛폰 유지 주식회사 제조) 을 40%, 30%, 30% 의 배합 비율 (몰비) 로 클로로포름에 용해시키고, 이것을 감압 건고시켜 지질 혼합물로 하였다. 이 지질 혼합물에 9% 수크로오스 용액을 첨가하여 65℃ 가온 하, 소니케이터로 간접적으로 초음파 조사함으로써 DC-3-12D 농도 2.5mM 의 리포솜 조(粗) 분산액을 얻었다. 다음으로, 리포솜의 입자 직경을 정렬시키기 위해, 구멍 직경 0.22㎛ 의 필터를 2 장 겹쳐 익스트루더에 세트하고, 약 65℃ 가온, 가압하, 익스트루젼 (압출 여과) 하였다. 또한, 구멍 직경 0.1㎛ 의 필터를 사용하여 동일하게 익스트루젼하고, 이것을 빈 리포솜 분산액으로 하였다. 이 리포솜 분산액을 2㎖ 바이알에 1㎖ 씩 분주하고, 동결 건조시켜, 동결 건조 리포솜 (조제예 1)을 얻었다. 또, NICOMP 380ZLS (Particle Sizing System 사) 를 사용하여, 얻어진 조제예 1 의 평균 입자 직경 및 제타 전위를 측정하였다. 결과를 표 2 에 나타냈다.
실시예 2
N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트클로라이드 대신에, N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-L-글루타메이트클로라이드 (소고 약공 주식회사 제조 (제품명：DC-3-12L)) 를 사용한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 동결 건조 리포솜 (조제예 2) 을 얻고, 평균 입자 직경 및 제타 전위를 측정하였다. 결과를 표 2 에 나타냈다.
실시예 3
N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트클로라이드 대신에, N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디옥타데실-D-글루타메이트클로라이드 (소고 약공 주식회사 제조 (제품명：DC-3-18D)) 를 사용한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 동결 건조 리포솜 (조제예 3) 을 얻고, 평균 입자 직경 및 제타 전위를 측정하였다. 결과를 표 2 에 나타냈다.
실시예 4
N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트클로라이드 대신에, N-ω-트리메틸암모니오데카노일-데헥사데실-D-글루타메이트브로마이드 (소고 약공 주식회사 제조 (제품명：DC-12-16D)) 를 사용한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 동결 건조 리포솜 (조제예 4) 을 얻고, 평균 입자 직경 및 제타 전위를 측정하였다. 결과를 표 2 에 나타냈다.
실시예 5
N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트클로라이드 대신에, N-ω-트리메틸암모니오데카노일-데헥사데실-L-글루타메이트브로마이드 (소고 약공 주식회사 제조 (제품명：DC-12-16L)) 를 사용한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 동결 건조 리포솜 (조제예 5) 을 얻고, 평균 입자 직경 및 제타 전위를 측정하였다. 결과를 표 2 에 나타냈다.
실시예 6
N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트클로라이드 대신에, N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디올레일-D-글루타메이트클로라이드 (일본 공개특허공보 평6-200336호의 제조예 1 의 화합물, 이하, DC-3-18：1D 라고 약칭한다.) 를 사용한 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 하여 동결 건조 리포솜 (조제예 6) 을 얻고, 평균 입자 직경 및 제타 전위를 측정하였다. 결과를 표 2 에 나타냈다.
표 1 에 조제예 1∼6 의 조성을 나타냈다.
Figure 112008088704201-PCT00002
Figure 112008088704201-PCT00003
시험예 1 CHO 세포에 대한 핵산 도입 시험
이하의 배열의 siRNA 의 수용액 (1pmol/㎕) 을 F12Ham 배지에서 6.25 배 희석하여 siRNA 희석 용액으로 하였다. 별도로 조제예 1 중의 DC-3-12D 농도가 약 1mM 가 되도록 적당량의 물을 첨가하여 복수(復水)하였다.
Figure 112008088704201-PCT00004
이 액을 F-12HAM 배지에서 20.8 배 및 125 배로 희석하였다. 각각의 액에 이들과 등량의 siRNA 희석 용액을 첨가, 혼합하고, siRNA/리포솜 복합체를 형성시켰다. 이 때, siRNA 에서 유래된 아니온량과 DC-3-12D 에서 유래된 카티온량의 비는, 각각 약 6 및 1 이 된다. 또한, 이들 액에 이들과 등량의 20% FBS 함유 F-12HAM 배지를 첨가, 혼합하고, siRNA/리포솜 복합체 함유 배지에서 하였다. CHO (pMAM-luc) 세포 (JCRB0136.1, 휴먼 사이언스 연구 자원 뱅크로부터 입수) 의 배지를 siRNA/리포솜 복합체 함유 배지와 교환하고, 트랜스펙션을 개시하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 41 시간 배양한 후, 배지를 1μM 덱사메사존, 10% FBS 함유 F-12HAM 배지와 교환하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 6∼8 시간 배양한 후, 현미경 하에서 세포를 관찰하고, 세포 독성을 스코어화 (-：시야의 85∼100% 정도를 세포가 차지하고 있고, 독성에 의한 손상의 흔적도 관찰되지 않는다, ±：시야의 85∼100% 정도를 세포가 차지하고 있지만, 일부에 독성에 의한 손상의 흔적이 관찰된다, ＋：시야의 70∼80% 정도를 세포가 차지하고 있다, ＋＋：시야의 50∼70% 정도를 세포가 차지하고 있다, ＋＋＋：시야의 50% 정도 미만밖에 세포가 차지하지 않았다) 하여, 결과를 표 3 에 나타냈다. 배지를 제거한 후, PBS 로 세정하였다. PLB 로 세포를 용해시킨 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 컨트롤로서 상기 siRNA 용액 대신에 물을 사용하여 동일한 실험을 실시하였다. 또, 조제예 2∼6 에 대해서도 동일하게 실시하고, 녹다운율 (%) 을 식 (1) 에 기초하여 산출하였다. 결과를 표 3 에 나타냈다.
식 (1)：100 × (siRNA 첨가시의 루시페라아제 활성치/siRNA 무첨가시의 루시페라아제 활성치)
별도로, 양성 컨트롤로서 리포펙트아민 2000 (상품명：인비트로젠사) 을 사용하여, 녹다운율의 평가를 실시하였다.
siRNA 용액 (1pmol/㎕) 을 F-12HAM 배지에서 2.5 배 희석하여 siRNA 희석 용액으로 하였다. 별도로 리포펙트아민 2000 (상품명：인비트로젠사) 을 F-12HAM 배지에서 50 배 희석하였다. 또한, 이 액에 이것과 등량의 siRNA 희석 용액을 첨가하여 siRNA/리포펙트아민 2000 함유 배지에서 하였다. 이 배지 20㎕ 를 별도 배양 중의 CHO (pMAM-luc) 세포 (배지량：100㎕) 에 첨가하고, 트랜스펙션을 개시하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 41 시간 배양한 후, 배지를 1μM 덱사메사존, 10% FBS 함유 F12-Ham 배지와 교환하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 7 시간 배양한 후, 현미경 하에서 세포를 관찰하고, 세포 독성을 전술한 바와 같이 스코어화하였다. 배지를 제거한 후, PBS (-) 로 세정하였다. 1 × PLB 로 세포를 용해시킨 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 컨트롤로서 상기 siRNA 용액 대신에 물을 사용하여 동일한 실험을 실시하고, 식 (1) 에 기초하여 녹다운율 (%) 을 산출하였다. 결과, 세포 독성은 스코어로 하면 - 이었지만, 세포 중에 백색의 반점이 관찰되었다. 녹다운율은 38(%) 이었다.
시험예 2 HeLa 세포에 대한 핵산 도입 시험
이하의 배열의 siRNA 의 수용액 (1pmol/㎕) 을 DULBECCO'S MODIFIED EAGLE'S MEDIUM (이하, DMEM) 배지에서 6.25 배 희석하여 siRNA 희석 용액으로 하였다. 별도로 조제예 1 중의 DC-3-12D 농도가 약 1mM 가 되도록 적당량의 물을 첨가하여 복수하였다.
Figure 112008088704201-PCT00005
이 액을 DMEM 배지에서 28.8 배, 115 배 및 215 배로 희석하였다. 각각의 액에 이들과 등량의 siRNA 희석 용액을 첨가, 혼합하고, siRNA/리포솜 복합체를 형성시켰다. 이 때, siRNA 에서 유래된 아니온량과 DC-3-12D 에서 유래된 카티온량의 비는 각각 약 4, 1 및 0.5 가 된다. 또한 이들 액에 이들과 등량의 20% FBS 함유 DMEM 배지를 첨가, 혼합하고, siRNA/리포솜 복합체 함유 배지에서 하였다. NFAT Reporter HeLa Stable Cell Line (Panomics 사) 의 배지를 siRNA/리포솜 복합체 함유 배지와 교환하고, 트랜스펙션을 개시하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 18 시간 배양한 후, 배지를 10ng/㎖ 의 PMA, 0.5μM Calcium ionophore A23187 및 10% FBS 함유 DMEM 배지와 교환하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 6 시간 배양한 후, 현미경 하에서 세포를 관찰하고, 세포 독성을 시험예 1 과 동일하게 스코어화하여, 결과를 표 3 에 나타냈다. 배지를 제거한 후, PBS 로 세정하였다. PLB 로 세포를 용해시킨 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 컨트롤로서 상기 siRNA 용액 대신에 물을 사용하여 동일한 실험을 실시하였다. 또, 조제예 2∼6 에 대해서도 동일하게 실시하고, 식 (1) 에 기초하여 녹다운율 (%) 을 산출하였다. 결과를 표 3 에 나타냈다.
별도로, 양성 컨트롤로서 리포펙트아민 2000 (상품명：인비트로젠사) 을 사용하여, 녹다운율의 평가를 실시하였다.
siRNA 용액 (1pmol/㎕) 을 DMEM 배지에서 2.5 배 희석하여 siRNA 희석 용액으로 하였다. 별도로 리포펙트아민 2000 을 DMEM 배지에서 100 배 희석하였다. 또한, 이 액에 이것과 등량의 siRNA 희석 용액을 첨가하고, siRNA/리포펙트아민 2000 함유 배지에서 하였다. 이 배지 20㎕ 를 별도 배양 중의 NFAT Reporter HeLa Stable Cell Line (Panomics 사) 의 배지 (100㎕) 에 첨가하고, 트랜스펙션을 개시하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 18 시간 배양한 후, 배지를 10ng/㎖ 의 PMA, 0.5μM Calcium ionophore A23187 및 10% FBS 함유 D-MEM 배지와 교환하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 6 시간 배양한 후, 현미경 하에서 세포의 관찰을 실시하고, 세포 독성을 시험예 1 과 동일하게 스코어화하였다. 배지를 제거한 후, PBS (-) 로 세정하였다. 1 × PLB 로 세포를 용해시킨 후 루시페라아제 활성을 측정하였다. 컨트롤로서 상기 siRNA 용액 대신에 물을 사용하여 동일한 실험을 실시하고, 식 (1) 에 기초하여 녹다운율 (%) 을 산출하였다. 결과, 세포 독성은 스코어로 하면 - 이었지만 세포 중에 백색의 반점이 관찰되었다. 녹다운율은 9(%) 이었다.
Figure 112008088704201-PCT00006
표 3 에서 알 수 있듯이, 본 발명에 관련된 조제예 6 은 특히 우수한 핵산 도입 효율 (녹아웃률) 및 저세포 독성을 나타냈다. 그 중에서도, 리포펙트아민 2000 과 비교해도 세포종에 상관없이, 높은 핵산 도입 효율 및 저세포 독성을 나타냈다 (리포펙트아민 2000 은 HeLa 세포에 높은 핵산 도입 효율을 나타내지만, CHO 세포에 대해서는 불충분하다.). 따라서, R1 및 R2 에 있어서, 알케닐기를 갖는 화합물은 우수한 핵산 도입 효율 및 저세포 독성을 나타낸다는 것을 알았다.
실시예 7
조제예 6 과 동일하게 하여, 표 4 에 나타내는 동결 건조 리포솜 (조제예 7∼22) 을 얻었다. 또, 실시예 1 과 동일하게 하여 평균 입자 직경 및 제타 전위를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타냈다.
Figure 112008088704201-PCT00007
Figure 112008088704201-PCT00008
시험예 3 CHO 세포에 대한 핵산 도입 시험
시험예 1 에서 사용한 siRNA 용액 (1pmol/㎕) 을 F-12HAM 배지에서 6.25 배 희석하여 siRNA 희석 용액으로 하였다. 별도로 조제예 6∼21 중의 DC-3-18：1D 농도가 약 1mM 가 되도록 적당량의 물을 첨가하여 복수하였다. 이 액을 F-12HAM 배지에서 14.4 배, 19.2 배 및 56.7 배로 희석하였다. 각각의 액에 이들과 등량의 siRNA 희석 용액을 첨가, 혼합하고, siRNA/리포솜 복합체를 형성시켰다. 이 때, siRNA 에서 유래된 아니온량과 DC-3-18：1D 에서 유래된 카티온량의 비는, 각각 약 8, 6 및 2 가 된다. 또한, 이들 액에 이들과 등량의 20% FBS 함유 F-12HAM 배지를 첨가, 혼합하고, siRNA/리포솜 복합체 함유 배지에서 하였다. CHO (pMAM-luc) 세포 (JCRB0136.1, 휴먼 사이언스 연구 자원 뱅크로부터 입수) 의 배지를 siRNA/리포솜 복합체 함유 배지와 교환하고, 트랜스펙션을 개시하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 41 시간 배양한 후, 배지를 1μM 덱사메사존, 10% FBS 함유 F-12HAM 배지와 교환하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 6∼8 시간 배양한 후, 현미경 하에서 세포를 관찰하고, 세포 독성을 시험예 1 과 동일하게 하여 스코어화하였다. 배지를 제거한 후, PBS (-) 로 세정하였다. 1 × PLB 로 세포를 용해시킨 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 컨트롤로서 상기 siRNA 용액 대신에 물을 사용하여 동일한 실험을 실시하였다. 식 (1) 에 기초하여 녹다운율 (%) 을 산출하였다. 결과를 표 6 에 나타냈다.
별도로, 양성 컨트롤로서 리포펙트아민 2000 (상품명：인비트로젠사) 을 사용하여, 시험예 1 과 동일하게 세포 독성의 스코어화 및 녹다운율 (%) 을 산출하였다. 결과, 세포 독성은 - 이었지만 세포 중에 백색의 반점이 관찰되었다. 녹다운율은 54(%) 이었다.
Figure 112008088704201-PCT00009
시험예 4 HeLa 세포에 대한 핵산 도입 시험
시험예 2 에서 사용한 siRNA 용액 (1pmol/㎕) 을 DMEM 배지에서 6.25 배 희석하여 siRNA 희석 용액으로 하였다. 별도로 조제예 6∼21 중의 DC-3-18：1D 농도가 약 1mM 가 되도록 적당량의 물을 첨가하여 복수하였다. 이 액을 DMEM 배지에서 28.8 배, 57.7 배, 115 배 및 500 배로 희석하였다. 각각의 액에 이들과 등량의 siRNA 희석 용액을 첨가, 혼합하고, siRNA/리포솜 복합체를 형성시켰다. 또한 이들 액에 이들과 등량의 20% FBS 함유 DMEM 배지를 첨가, 혼합하고, siRNA/리포솜 복합체 함유 배지로 하였다. NFAT Reporter HeLa Stable Cell Line (Panomics 사) 의 배지를 siRNA/리포솜 복합체 함유 배지와 교환하고, 트랜스펙션을 개시하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 18 시간 배양한 후, 배지를 10ng/㎖ 의 PMA, 0.5μM Calcium ionophore A23187 및 10% FBS 함유 DMEM 배지와 교환하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 6 시간 배양한 후, 현미경 하에서 세포의 관찰을 실시하고, 세포 독성을 시험예 1 과 동일하게 스코어화하였다. 배지를 제거한 후, PBS 로 세정하였다. PLB 로 세포를 용해시킨 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 컨트롤로서 상기 siRNA 용액 대신에 물을 사용하여 동일한 실험을 실시하였다. 식 (1) 에 기초하여 녹다운율 (%) 을 산출하였다. 결과를 표 7 에 나타냈다.
별도로, 양성 컨트롤로서 리포펙트아민 2000 (상품명：인비트로젠사) 을 사용하여, 시험예 2 와 동일하게 세포 독성의 스코어화 및 녹다운율 (%) 을 산출하였다. 결과, 세포 독성은 - 이었지만 세포 중에 백색의 반점이 관찰되었다. 녹다운율은 10(%) 이었다.
Figure 112008088704201-PCT00010
표 6 및 7 에서 명확한 바와 같이, 본 발명에 관련된 조제예 6, 8, 9, 12, 15, 18, 19 및 20 은 우수한 핵산 도입 효율 및 저세포 독성을 나타냈다. 그 중에서도, 조제예 6, 8, 12, 15 및 20 이 바람직하고, 조제예 6, 8, 12 및 15 가 더욱 바람직하다는 것을 알았다.
핵산의 도입에 있어서는, 도입 효율 및 세포 독성의 관점에서, 본 발명에 관련된 일반식 (I) 로 나타내는 화합물, 인지질, 콜레스테롤 등의 농도를 적절히 검토함으로써, 보다 우수한 핵산 도입 조성물을 제공할 수 있다는 것을 알았다.
시험예 5 HeLa 세포에 대한 핵산 도입 시험
핵산 봉입형 리포솜과 핵산 컴플렉스형 리포솜에 있어서의 핵산 도입 효율에 대해, 비교 검토를 실시하였다.
(1) 핵산 봉입형 리포솜의 평가
조제예 6 중의 DC-3-18：1D 농도가 약 1mM 가 되도록, 시험예 2 에서 사용한 siRNA 수용액 (34.3pmol/㎕, 18.5pmol/㎕, 4.6pmol/㎕) 을 가하여 복수하고, 동시에 siRNA 봉입형 리포솜을 형성시켰다. 이 액을 DMEM 배지에서 428.6 배, 230.8 배, 57.7 배로 희석하였다. 이들 액에 이들과 등량의 20% FBS 함유 DMEM 배지를 첨가, 혼합하고, siRNA 봉입형 리포솜 함유 배지에서 하였다. NFAT Reporter HeLa Stable Cell Line (Panomics 사) 의 배지를 siRNA 봉입형 리포솜 함유 배지와 교환하고, 트랜스펙션을 개시하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 18 시간 배양한 후, 배지를 10ng/㎖ 의 PMA, 0.5μM Calcium ionophore A23187 및 10% FBS 함유 DMEM 배지와 교환하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 6 시간 배양한 후, 현미경 하에 세포의 관찰을 실시하고, 세포 독성을 시험예 1 과 동일하게 스코어화하였다. 배지를 제거한 후, PBS (-) 로 세정하였다. 1 × PLB 로 세포를 용해시킨 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 컨트롤로서 상기 siRNA 용액 대신에 물을 사용하여 동일한 실험을 실시하고, 식 (1) 에 기초하여 녹다운율 (%) 을 측정하였다. 결과를 표 8 에 나타냈다.
(2) 핵산 컴플렉스형 리포솜의 평가
상기 (1) 에서 사용한 siRNA 수용액 (1pmol/㎕) 을 DMEM 배지에서 희석하고, 80.2fmol/㎕, 80.3fmol/㎕, 81.4fmol/㎕ 의 siRNA 함유 DMEM 배지에서 하였다. 별도로 조제예 6 중의 DC-3-18：1D 농도가 약 1mM 가 되도록 적당량의 물을 첨가하여 복수하였다. 이 액을 80.2fmol/㎕, 80.3fmol/㎕, 81.4fmol/㎕ siRNA 함유 DMEM 배지에서 428.6 배, 230.8 배, 57.7 배로 희석하고, 동시에 siRNA 컴플렉스형 리포솜을 형성시켰다. 이들 액에 이들과 등량의 20% FBS 함유 DMEM 배지를 첨가, 혼합하고, siRNA 컴플렉스형 리포솜 함유 배지에서 하였다. NFAT Reporter HeLa Stable Cell Line (Panomics 사) 의 배지를 siRNA 컴플렉스형 리포솜 함유 배지와 교환하고, 트랜스펙션을 개시하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 18 시간 배양한 후, 배지를 10ng/㎖ 의 PMA, 0.5μM Calcium ionophore A23187 및 10% FBS 함유 DMEM 배지와 교환하였다. 37℃, 5% CO2 로 약 6 시간 배양한 후, 현미경 하에 세포의 관찰을 실시하고, 세포 독성을 시험예 1 과 동일하게 스코어화하였다. 배지를 제거한 후, PBS (-) 로 세정하였다. 1 × PLB 로 세포를 용해시킨 후, 루시페라아제 활성을 측정하였다. 컨트롤로서 상기 siRNA 용액 대신에 물을 사용하여 동일한 실험을 실시하고, 식 (1) 에 기초하여 녹다운율 (%) 을 측정하였다. 결과를 표 8 에 나타냈다.
Figure 112008088704201-PCT00011
표 8 에서 명확한 바와 같이, 리포솜 동결 건조 제제에 직접 siRNA 용액을 첨가한 봉입형 리포솜은 리포솜의 첨가량에 상관없이, 컴플렉스형과 비교하여 높은 녹다운 효과를 나타냈다.
본 발명의 조성물을 사용하면 저세포 독성이고, 핵산이 효율적으로 도입되기 때문에, 핵산 도입용 시약이나 의약 등의 핵산 도입제로서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> HOKKAIDO SYSTEM SCIENCE CO., LTD. <120> Composition for Nucleic acid Transfer <130> HS0001 <150> JP2006-182510 <151> 2006-06-30 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA(sense sequence) <400> 1 acaucacgua cgcggaauac uucgaag 27 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA(antisense sequence) <400> 2 uauguagugc augcgccuua ugaagcu 27 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA(sense sequence) <400> 3 acaucacuua cgcugaguac uucgaag 27 <210> 4 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> siRNA(antisense sequence) <400> 4 uauguaguga augcgacuca ugaagcu 27

Claims (18)

  1. 하기 식 (I)
    [화학식 1]
    Figure 112008088704201-PCT00012
    (식 중, R1 및 R2 는 동일하거나 또는 상이하며, 탄소수 12∼22 의 포화 또는 불포화의 탄화수소기를 의미하고, R3 는 탄소수 1∼6 의 알킬기 또는 탄소수 1∼6 의 히드록시알킬기를 의미하고, m 은 1∼10 의 정수를 의미하며, X 는 할로겐 원자를 의미한다.)
    로 나타내는 화합물 및 인지질을 함유하는 세포에 대한 핵산 도입용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    추가로 콜레스테롤 및/또는 콜레스타놀을 조성물 중의 전체 지질량에 대해 0∼50 몰% 함유하는 것인 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    식 (I) 로 나타내는 화합물의 함유량이 조성물 중의 전체 지질량에 대해 40∼60 몰% 인 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    식 (I) 로 나타내는 화합물과 인지질의 비 (몰비) 가 2：3 ∼ 16：1 인 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    식 (I) 중, R1 및 R2 가 탄소수 12∼18 의 알킬기 또는 알케닐기를 의미하고, R3 이 메틸기를 의미하며, m 이 1 을 의미하는 것인 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    식 (I) 중, X 가 염소 원자 또는 브롬 원자를 의미하는 것인 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인지질이 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 카르디올리핀, 스핑고미엘린, 플라스마로겐 및 포스파티드산에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인지질이 포스파티딜에탄올아민인 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인지질이 디올레오일포스파티딜에탄올아민인 조성물.
  10. N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디올레일-D-글루타메이트클로라이드, 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤을 함유하는 세포에 대한 핵산 도입용 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 핵산을 함유하는 것인 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    핵산이 쇼트(short) 올리고뉴클레오티드인 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    지질막 구조체를 형성하고 있는 것인 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포솜을 형성하고 있는 것인 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동결 건조물인 조성물.
  16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 인ㆍ비트로 또는 인ㆍ비보로 세포에 적용하는 것을 특징으로 하는 핵산의 세포에 대한 도입 방법.
  17. 핵산 도입제를 제조하기 위한 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 사용.
  18. 하기의 (1)∼(3) 의 공정 ：
    (1) 표적 핵산을 도입한 세포와 피험물질을 접촉시키는 공정,
    (2) 피험물질을 접촉시킨 세포에 있어서의 표적 핵산의 발현량을 측정하는 공정,
    (3) 상기 (2) 의 측정량이 대조 세포의 표적 핵산의 발현량보다 크거나 또는 작은 피험물질을 선택하는 공정
    을 갖는 표적 핵산의 발현 증가 또는 억제 물질의 스크리닝 방법에 있어서, 표적 핵산의 세포에 대한 도입 및/또는 피험물질의 당해 세포에 대한 접촉을 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 사용하여 실시하는 것을 특징 으로 하는 표적 핵산의 발현 증가 또는 억제 물질의 스크리닝 방법.
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