KR20220084366A - CAR mRNA 전달을 위한 지질 나노입자 및 그것의 제형 - Google Patents

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KR20220084366A
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마이클 미첼
마가렛 빌링슬리
네이선 싱
칼 에이치. 준
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 발명은 CAR을 암호화하는 mRNA 분자, 핵산 분자, 및/또는 치료제를 선택된 표적, 예컨대 세포에 전달하기 위한 지질 나노입자(LNP) 또는 그것의 조성물에 관한 것이다. 그러므로, 다양한 측면으로, 본 발명은 또한 상기 LNP 또는 그것의 조성물을 사용하여 그것을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

CAR mRNA 전달을 위한 지질 나노입자 및 그것의 제형
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019년 10월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 62/916,942호의 우선권 및 이익을 주장하며, 상기 출원의 개시는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 암 연구소에 위해 부여된 R01-CA-226983 및 미국 국립보건원에 의해 부여된 DP2 TR002776에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 특정 권리를 가지고 있다.
FDA-승인 암요법인 키메릭 항원 수용체(CAR) T 세포의 생성은 암 표적화 CAR 경막 단백질을 발현하도록 환자 T 세포를 변경하고 그것을 환자에게 다시 주입하는 것에 의존한다. CAR 발현을 유도하기 위하여, 임상 적용을 위한 현재 제조 과정은 바이러스-기반 세포 조작에 의존한다. T 세포를 조작하기 위하여 바이러스를 사용하는 것은 T 세포 표면 상에서의 영구적인 CAR 발현으로 이어진다. 강력하지만, 이것은 CAR T 세포 요법과 관련된 불리한 부작용(즉, 사이토카인 폭풍, 신경독성)을 증폭시킬 수 있다. 추가로, 임의의 제조 실수는 또한 영구적이며 치명적인 결과로 이어질 수 있다. 그러므로, 임상 연구자들은 CAR을 암호화하는 mRNA가 T 세포에 전달되는 mRNA-기반 CAR T 세포 생성을 조사하기 시작하였다. 이것은 원치 않은 독성 부작용을 완화시키기 위한 수단으로서 유망한 결과를 나타낸 T 세포 상에서 일시적으로 발현된 CAR로 이어진다.
그러나, T 세포는 분명하게 트랜스펙션이 문제가 된다. 그러므로, mRNA를 T 세포에 전달하기 위하여, 가장 일반적으로 사용되는 방법은 전기천공법(EP)이다. EP는 세포막에 구멍을 개방하기 위하여 전기 펄스를 사용하고 세포와 함께 용액 중의 무언가(이 경우, mRNA)가 세포질에 진입하는 것을 허용한다. mRNA를 세포 안에 가져오는 것에는 효과적이지만, EP는 T 세포에 독성인 경향이 있고, 변경된 게놈 발현으로 이어질 수 있으며, 생체내 번역에 대한 가능성이 없다.
2017년에, FDA는 CD19 CAR T 세포 요법을 그것의 높은 관해 지속률을 유도하는 능력을 감안하여 재발 또는 난치성 급성 림프모세포성 백혈병(ALL)의 치료를 위해 승인하였다(Liu Y et al., 2017, Drugs of Today, 53:597-608; Maude SL et al., 2014, N Engl J Med., 371:1507-1517). 동일 년도에, 치료법은 또한 대부분의 환자에서 완전한 관해를 보였기 때문에 재발 또는 난치성 거대 B 세포 림프종의 치료를 위해 승인되었다(Bouchkouj N et al., 2019, Clin Cancer Res, 25:1702-1708; Yip A et al., 2018, Nat Rev Drug Discov, 17:161). 이들 성공 이후, 만성 림프모세포성 백혈병(Porter DL et al., 2011, N Engl J Med, 365:725-733), 교모세포종(Brown CE et al., 2016, N Engl J Med, 375:2561-2569), 및 난치성 다발성 골수종(Berdeja JG et al., 2017, J Clin Oncol, 35)을 포함하여 다른 암의 치료를 위한 CAR T 세포 요법에 대한 많은 연구가 시작되었지만 아직 FDA 승인을 받지는 못하였다. 이들 자가 치료법의 개발은 CAR T 세포를 생성하기 위한 생체외 세포 조작에 의존한다. 이런 형태의 암 면역요법을 생성하기 위하여, 환자 T 세포가 수득되고, CD19 특이적 CAR을 발현하도록 변형되고, 환자에게 재주입된다. 경막 CAR 구성물은 T 세포가 암성 B 세포를 표적화하여 그것에 결합하여 세포자멸사를 유도하고 그로써 환자 자신의 면역 체계를 사용하여 암을 근절하는 것을 허용한다(Benmebarek M et al., 2019, Int J Mol Sci, 20:1283).
이 방법은 대부분의 환자에서 오래 지속되는 관해를 유도하는 강력한 CAR T 세포를 생산하지만(Maude SL et al., 2014, N Engl J Med, 371:1507-1517; Bouchkouj N et al., 2019, Clin Cancer Res, 25:1702-1708; Yip A et al., 2018, Nat Rev Drug Discov;17:161), 치료법은 환자 면역 반응에 기여하는 심각한 부작용 및 바이러스 형질도입 및 생산 오류와 관련된 잠재적 위험을 가지고 있다(Bouchkouj N et al., 2019, Clin Cancer Res, 25:1702-1708; June CH et al., 2015, Sci Transl Med, 7; June CH et al., 2014, Cancer Immunol Immunother, 63:969-975; Fesnak AD et al., 2016, Nat Rev Cancer, 16: 566-581; Vormittag P et al., 2018, Curr Opin Biotechnol, 53:164-181; Ruella M et al., 2018, Nat Med., 24:1499-1503). 치료법을 받은 성인 환자의 거의 70%에서 발생하는 것으로 나타난 즉각적인 반응(Hartsell A et al., 2019, Biol Blood Marrow Transplant., 25:S336-S337)은 대식세포 활성화 증후군, 신경독성, 및 사이토카인 폭풍을 포함한다(Bouchkouj N et al., 2019, Clin Cancer Res, 25: 1702-1708; June CH et al., 2014, Cancer Immunol Immunother, 63:969-975; Zheng PP et al., 2019, Trends Immunol, 40:274-278). 비록 초기 부작용의 일부는 항-IL-6 수용체 항체로 완화될 수 있지만(Maude SL et al., 2014, N Engl J Med, 371:1507-1517), 장기간 효과는 똑같이 심각할 수 있다. 암성 B 세포를 표적화한 후, 지속적인 CD19 특이적 CAR T 세포는 모든 CD19 양성 세포의 제거로 이어질 수 있고, 그것은 B 세포 무형성 및 저감마글로불린혈증을 초래한다(Porter DL et al., 2011, N Engl J Med, 365:725-733; June CH et al., 2014, Cancer Immunol Immunother, 63:969-975; Dotti G et al., 2014, Immunol Rev, 257:107-126; Yang G et al., 2015, Cell, 344:1173-1178). 이들 독성 문제 외에, FDA 승인된 것을 포함하여 연속적으로 발현되는 CAR T 세포는 바이러스 형질도입을 통해 가장 일반적으로 생성되고, 또한 독성 삽입 돌연변이생성에 대한 안전성 문제를 나타낸다(Porter DL et al., 2011, N Engl J Med, 365:725-733; June CH et al., 2015, Sci Transl Med, 7; Fesnak AD et al., 2016, Nat Rev Cancer, 16:566-581; Vormittag P et al., 2018, Curr Opin Biotechnol, 53:164-181; Dotti G et al., 2014, Immunol Rev; 257:107-126). 추가로, 영구적인 변경은 생산 오류의 경우에 치명적 결과를 나타낼 수 있다. 한 경우에, 생체외 CAR T 세포 조작 중에 단일 암성 B 세포의 우연한 형질도입이 환자 사망으로 이어졌다(Ruella M et al., 2018, Nat Med, 24:1499-1503). 전체적으로, 이들 부작용은 이런 강력한 치료법과 관련된 위험을 강조하고 보다 안전한 CAR T 세포를 생성하기 위해 CAR T 세포 제조 방법을 개선하는 데 대한 조사의 동기부여가 된다.
바이러스를 통해 조작된 CAR T 세포 요법과 관련된 위에서 언급된 문제(즉, 불리한 부작용, 예컨대 신경독성, 사이토카인 폭풍, 및 저감마글로불린혈증)를 극복하기 위한 한 가지 잠재적 해결책은 CAR 발현을 유도하기 위하여 mRNA 트랜스펙션을 이용하는 것이다. mRNA는 그것이 게놈 통합 없이 번역되기 때문에 CAR의 일시적인 발현을 허용한다(Riley RS et al., 2019, Nat Rev Drug Discov, 18:175-196). 나아가, 시험관내 전사된(IVT) mRNA의 맞춤형 구조는 그것이 최대화된 트랜스펙션 및 번역을 위해 조작되는 것을 허용한다(Pardi N et al., 2018, Nat Rev Drug Discov, 17:261-279; Smits E et al., 2004, Leukemia, 18:1898-1902).
mRNA-유도 CAR T 세포 요법은 ALL, 흑색종, 및 호지킨 림프종을 포함한 다양한 암에 대한 이전 연구에서 검증되었고, CAR T 세포를 안정적으로 발현하는 것만큼 효과적으로 단기간 질환 부담을 감소시키는 것으로 나타났다(Yang G et al., 2015, Cell, 344:1173-1178; Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Harrer DC et al., 2017, BMC Cancer, 17:551; Pardi N et al., 2015, J Control Release, 217:345-351; Svoboda J et al., 2018, Blood, 132:1022-1027; Rabinovich PM et al., 2006, Hum Gene Ther, 17: 1027-1035; Zhao Y et al., 2010, Cancer Res, 70:9053-9061; Singh N et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:1059-1070; Tasian SK et al., 2017, Blood, 129:2395-2407; Foster JB et al., 2018, Hum Gene Ther, 30:168-178; Barrett DM et al., 2014, Annu Rev Med, 65:333-347; Beatty GL et al., 2014, Cancer Immunol Res., 2:112-120; Yoon SH et al., 2009, Cancer Gene Ther, 16:489-497). 이런 잠재력을 감안하여, mRNA CAR T 세포 요법은 다른 것들 중에서도 대장암 및 B 세포 림프종을 포함한 암에 대해 수많은 진행 중인 임상 시험이 있다(Foster JB et al., 2019, Mol Ther, 27:747-756). 이들 이전의 조사는 CAR 발현이 전형적으로 1주 미만 동안 지속되어, 재투여 없이 장기간 치료 이익을 제공하는 mRNA-유도 치료법의 능력을 제한하는 것을 확인시켜주었다(Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Foster JB et al., 2018, Hum Gene Ther, 30:168-178; Beatty GL et al., 2014, Cancer Immunol Res., 2:112-120). 그러나, 그것은 또한 더 적은 온-표적(on-target), 종양 외(off-tumor) 효과를 유발하는 잠재력을 가지며, 더 적은 독성을 제공하는 것으로 나타났다(Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Zhao Y et al., 2010, Cancer Res, 70:9053-9061; Foster JB et al., 2018, Hum Gene Ther, 30:168-178; Barrett DM et al., 2014, Annu Rev Med, 65:333-347; Beatty GL et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:112-120).
추가적으로, T 세포에 전달되는 mRNA의 양은 T 세포 상에서의 CAR 발현 수준에 영향을 미치고 조정 가능한 독성을 허용하는 것으로 나타났으며, 이것은 mRNA-기반 CAR 발현이 CAR T 세포 요법과 관련된 부작용, 예컨대 사이토카인 방출을 완화시키는 수단을 제공할 수 있음을 가리킨다(Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Zhao Y et al., 2010, Cancer Res, 70:9053-9061). 이전의 연구는 다양한 암에서 mRNA-유도 CAR T 세포 요법을 검증하였고, 그것이 CAR T 세포를 안정적으로 발현시키는 것처럼 효과적으로 단기간 질환 부담을 감소시키는 것으로 나타났다(Yang G et al., 2015, Cell, 344:1173-1178; Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Harrer DC et al., 2017, BMC Cancer, 17:551; Pardi N et al., 2015, J Control Release, 217:345-351; Svoboda J et al., 2018, Blood, 132:1022-1027; Rabinovich PM et al., 2006, Hum Gene Ther, 17: 1027-1035; Zhao Y et al., 2010, Cancer Res, 70:9053-9061; Singh N et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:1059-1070; Tasian SK et al., 2017, Blood, 129:2395-2407; Foster JB et al., 2018, Hum Gene Ther, 30:168-178; Barrett DM et al., 2014, Annu Rev Med, 65:333-347; Beatty GL et al., 2014, Cancer Immunol Res., 2:112-120; Yoon SH et al., 2009, Cancer Gene Ther, 16:489-497). 이런 잠재력을 감안하여, mRNA CAR T 세포 요법이 다른 것들 중에서도 대장암 및 B 세포 림프종을 포함하여 암에 대해 수많은 임상 시험이 진행 중이다(Foster JB et al., 2019, Mol Ther, 27:747-756).
그러나, 네이키드 mRNA(naked mRNA)는 빠르게 분해되고 세포막을 쉽게 가로지를 수 없기 때문에, T 세포에서 기능적으로 흡수되기 위해서는 전달 방법이 필요하다. 현재, 전기천공법(EP)은 T 세포를 포함하여 다양한 세포에 mRNA를 효과적으로 전달하기 위해 사용되지만(Smits E et al., 2004, Leukemia, 18:1898-1902; Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; DiTommaso T et al., 2018, PNAS, 115), 많은 단점이 있다. EP 중에 발생하는 막 파괴는 고른 전달을 위해 세포 전체에 일관된 막 침투를 보장하는 데 실패하면서 세포 내용물 및 세포독성의 손실 위험이 있다. 이것은 낮은 생존력으로 이어질 수 있고, 생존 세포 집단의 거동을 변경시킬 수 있다(DiTommaso T et al., 2018, PNAS, 115; Dullaers M et al., 2004, Mol Ther, 10:768-779; Singh N et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:1059-1070). 그러므로, 도입유전자의 장기간 발현 및 전기천공법 이후 세포에서의 거동에 대한 추가의 연구가 핵산 전달의 이런 방법과 관련된 잠재적 위험을 이해하기 위해 필요하다(Lambricht L et al., 2016, Expert Opin Drug Deliv, 13: 295-310; Nickoloff JA et al., 1995, Animal Cell Electroporation and Electrofusion Protocols Methods in Molecular Biology, 273-280).
그러므로, 다양한 질환 또는 장애의 치료를 위해 CAR을 암호화하는 mRNA 분자를 세포에 전달하는 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요가 기술분야에 있다. 본 발명은 이런 충족되지 못한 필요를 만족시킨다.
한 측면으로, 본 발명은, 부분적으로, 적어도 하나의 mRNA 분자 및 식 (I)의 구조를 가지는 적어도 하나의 화합물 또는 그것의 염을 포함하는 지질 나노입자(LNP)에 관한 것이다:
Figure pct00001
식(I).
일부 구현예에서, A1 및 A2는 독립적으로 C, C(H), N, S, 또는 P이다. 일부 구현예에서, 각각의 L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 독립적으로 C, C(H)2, C(H)(R19), O, N(H), 또는 N(R19)이다. 일부 구현예에서, 각각의 R1, R2, R3a, R3b, R4a, R4b, R5a, R5b, R6a, R6b, R7a, R7b, R8a, R8b, R9a, R9b, R10a, R10b, R11a, R11b, R12a, R12b, R13a, R13b, R14a, R14b, R15a, R15b, R16, R17, R18, 및 R19는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알킬, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, -Y(R20)z`(R21)z``-헤테로사이클로알킬, 치환된-(R20)z`(R21)z``-헤테로사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알케닐, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알키닐, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, -Y(R20)z`(R21)z``-아릴, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, -Y(R20)z`(R21)z``-헤테로아릴, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-헤테로아릴, 알콕시카르보닐, 선형 알콕시카르보닐, 분지형 알콕시카르보닐, 아미도, 아미노, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, 하이드록실, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 하이드록시아릴, 알콕시, 카르복실, 카르복실레이트, 에스테르, -Y(R20)z`(R21)z``-에스테르, -Y(R20)z`(R21)z``, =O, -NO2, -CN, 또는 설폭시이다.
일부 구현예에서, Y는 C, N, O, S, 또는 P이다. 일부 구현예에서, 각각의 R20 및 R21은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알콕시카르보닐, 선형 알콕시카르보닐, 분지형 알콕시카르보닐, 아미도, 아미노, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, 하이드록실, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 하이드록시아릴, 알콕시, 카르복실, 카르복실레이트, 에스테르, =O, -NO2, -CN, 또는 설폭시이다.
일부 구현예에서, 각각의 z` 및 z``는 독립적으로 0, 1, 또는 2로 표시되는 정수이다. 일부 구현예에서, 각각의 m, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w, 및 x는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5로 표시되는 정수이다.
다양한 구현예에서, mRNA 분자는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화한다.
일부 구현예에서, 식(I)의 구조를 가지는 화합물은 다음의 구조를 가지는 화합물이다:
Figure pct00002
식(II);
Figure pct00003
식(III);
Figure pct00004
식(IV);
Figure pct00005
식(V);
Figure pct00006
식(VI); 또는
Figure pct00007
식(VII).
일부 구현예에서, 각각의 R1, R2, R3, R4, 및 R5는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알콕시카르보닐, 선형 알콕시카르보닐, 분지형 알콕시카르보닐, 아미도, 아미노, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, 하이드록실, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 하이드록시아릴, 알콕시, 카르복실, 카르복실레이트, 또는 에스테르이다.
일부 구현예에서, 각각의 m, n, o, p, 및 q는 독립적으로 0 내지 25의 정수이다. 일부 구현예에서, 각각의 r, s, t, u, v, w, 및 x는 독립적으로 0, 1, 2; 3, 4, 또는 5로 표시되는 정수이다.
일부 구현예에서, 식(I)의 구조를 가지는 화합물은 다음 구조를 가지는 화합물이다:
Figure pct00008
식(VIII);
Figure pct00009
식(IX);
Figure pct00010
식(X);
Figure pct00011
식(XI);
Figure pct00012
식(XII);
Figure pct00013
식(XIII);
Figure pct00014
식(XIV); 또는
Figure pct00015
식(XV).
일부 구현예에서, 식 (I)의 구조를 가지는 화합물은 이온화 가능한 지질이다. 일부 구현예에서, mRNA 분자는 식 (I)의 구조를 가지는 화합물 내에 캡슐화된다.
일부 구현예에서, LNP는 식 (I)의 구조를 가지는 화합물 또는 그것의 염을 약 1 몰% 내지 약 100 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 식 (I)의 구조를 가지는 화합물 또는 그것의 염을 약 10 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 적어도 하나의 헬퍼 지질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 적어도 하나의 헬퍼 지질은 약 0.01 몰% 내지 약 99.9 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 적어도 하나의 헬퍼 지질을 약 0.5 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함한다.
일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 인지질, 콜레스테롤 지질, 중합체, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
일부 구현예에서, 인지질은 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE) 또는 그것의 유도체, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 또는 그것의 유도체, 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE) 또는 그것의 유도체, 스테아로일올레오일포스파티딜콜린(SOPC) 또는 그것의 유도체, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티딜에탄올 아민(SOPE) 또는 그것의 유도체, N-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTAP) 또는 그것의 유도체, 또는 그것들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, LNP는 인지질을 약 15 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함한다.
일부 구현예에서, 콜레스테롤 지질은 콜레스테롤 또는 그것의 유도체이다. 일부 구현예에서, LNP는 콜레스테롤 지질을 약 20 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함한다.
일부 구현예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 그것의 유도체이다. 일부 구현예에서, LNP는 중합체를 약 0.5 몰% 내지 약 10 몰%의 농도 범위로 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 적어도 하나의 핵산 분자, 보조제, 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 핵산 분자는 치료제이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 cDNA, mRNA, miRNA, sgRNA, siRNA, 변형된 RNA, 안타고미르(antagomir), 안티센스 분자, 가이드 RNA 분자, CRISPR 가이드 RNA 분자, 펩타이드, 치료 펩타이드, 표적화된 핵산, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
일부 구현예에서, mRNA는 하나 이상의 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, 항원은 적어도 하나의 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 인플루엔자 항원, 종양 관련 항원, 종양 특이적 항원, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 프로모터 또는 조절 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 mRNA 분자, 핵산 분자, 보조제, 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합이 식 (I)의 구조를 가지는 화합물 내에 캡슐화된다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 또한, 부분적으로, 본원에 기술된 적어도 하나의 LNP를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 조성물은 백신이다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 또한, 부분적으로, 이를 필요로 하는 대상체에게 적어도 하나의 CAR을 암호화하는 mRNA 분자를 전달하는 방법에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 상기 방법은 치료적 유효량의 본원에 기술된 하나 이상의 LNP 또는 그것의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 CAR을 암호화하는 mRNA 분자를 표적에게 전달한다.
일부 구현예에서, 표적은 면역 세포, T 세포, 상주 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 암 세포, 질환 또는 장애 관련 세포, 질환 또는 장애와 관련된 조직, 뇌 조직, 중추신경계 조직, 폐 조직, 정점 표면 조직, 상피 세포, 내피 세포, 간 조직, 장 조직, 결장 조직, 소장 조직, 대장 조직, 대변, 골수, 대식세포, 비장 조직, 근육 조직, 관절 조직, 종양 세포, 병든 조직, 림프절 조직, 림프 순환, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
일부 구현예에서, 방법은 LNP 또는 그것의 조성물의 단일 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 LNP 또는 그것의 조성물의 다중 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 피내, 피하, 근육내, 심실내, 척수강내, 구강 전달, 정맥내, 기관내, 복강내, 자궁내 전달, 또는 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 전달 경로에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 적어도 하나의 핵산 분자, 보조제, 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염, 인플루엔자 감염, 암, 관절염, 심장 질환, 심혈관 질환, 신경 장애 또는 질환, 유전적 질환, 자가면역 질환, 태아 질환, 태아 발달에 영향을 미치는 유전적 질환, 또는 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 치료하거나 예방한다.
한 구현예에서, LNP 조성물은 백신이다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 또한, 부분적으로, CAR을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자 및 적어도 하나의 핵산 분자, 보조제, 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합을 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 상기 방법은 치료적 유효량의 본원에 기술된 하나 이상의 LNP 또는 그것의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 mRNA 분자 및 핵산 분자, 보조제, 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합을 표적에 전달한다. 그러므로, 다양한 구현예에서, 상기 방법은 유전자 전달 방법이다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 또한, 부분적으로, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 상기 방법은 치료적 유효량의 본원에 기술된 하나 이상의 LNP 또는 그것의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다음의 발명의 바람직한 구현예의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 발명을 예시할 목적으로, 현재 바람직한 구현예가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 발명은 도면에 도시된 구현예의 정확한 배열 및 수단에 제한되지 않는 것이 이해되어야 한다.
도 1a 내지 도 1c를 포함하는 도 1은 LNP 제형 및 CAR mRNA 로딩된 LNP의 개략도를 도시한다. 도 1a는 미세유체 혼합을 통해 LNP를 생성하기 위해 사용된 구성요소의 개략도 및 결과적으로 생성된 LNP의 예상된 구조를 도시한다. 도 1b는 동적 광산란을 사용하여 대략 70 nm의 직경을 나타내는 C14-4(또한 C14-494로도 언급됨) LNP의 대표적인 샘플의 크기(z-평균) 분포를 도시한다. 오차 막대는 3개 샘플 전체의 표준 편차를 나타낸다. 도 1c는 암성 세포를 제거하기 위해 T 세포에서 CAR 발현을 유도하고 종양 세포 표적화를 초래하는 CAR mRNA 로딩된 LNP의 개략도를 도시한다.
도 2a 내지 도 2c를 포함하는 도 2는 본 연구에서 스크리닝된 지질의 라이브러리를 생성하기 위해 사용된 대표적인 에폭시드-종결 알킬 사슬 및 대표적인 폴리아민 코어를 도시한다. 지질은 마이클 부가 화학(Michael addition chemistry)을 통해 만들어졌다. 본원에서 기술된 발명은 이 다이아그램에 의해 명명되는 바 C14-4(또한 C14-494로도 언급됨)이다. 도 2a는 이온화 가능한 지질 라이브러리를 생성하기 위해 사용된 지질 꼬리의 대표적인 구조를 도시한다. 도 2b는 이온화 가능한 지질 라이브러리를 생성하기 위해 사용된 아민 코어의 대표적인 구조를 도시한다. 도 2c는 과잉의 지질 꼬리를 아민 코어와 반응시킴으로써 이온화 가능한 지질을 합성하기 위해 사용된 마이클 부가 반응 화학의 개략도를 도시한다.
도 3a 내지 도 3e를 포함하는 도 3은 다양한 조건 하에서 대표적인 루시페라제 발현을 도시한다. 결과는 바탕값을 빼고 미처리 세포에 대해 표준화되었다. 도 3b, 도 3d, 및 도 3e에 대해 n = 3. 도 3a는 최고 성능 LNP를 나타내는, LNP 라이브러리 및 리포펙타민으로 48시간 동안 30 ng/60,000개 세포의 용량으로 처리된 후 Jurkat 세포의 대표적인 루시페라제 발현을 도시한다. 결과는 미처리 세포에 대해 표준화되었고 바탕값은 뺐다. * = p < 0.05, 리포펙타민에 대해 대응 표본 학생 T 테스트, n = 4. 도 3b는 최고 LNP 제형을 측정하기 위해 상위 5개의 성능 LNP제형으로 처리된 Jurkat 세포의 대표적인 루시페라제 발현을 도시한다. 결과는 미처리 세포에 대해 표준화되었고 바탕값은 뺐다. * = p < 0.05, C14-4(또한 C14-494로도 언급됨)와 각각의 다른 제형 사이의 tukey의 다중 비교 테스트. 도 3c는 상위 5개의 LNP 제형의 대표적인 직경(z-평균), 다분산도 지수, 및 mRNA 농도(± 표준 편차)를 보고하는 표를 도시한다. 도 3d는 단백질의 일시적인 발현을 확인한 30 ng/60,000개 세포의 C14-4(또한 C14-494로도 언급됨)로 24시간 동안 처리된 Jurkat 세포에서 시간에 따른 대표적인 루시페라제 발현을 도시한다. 결과는 24시간 째에 발현에 대해 표준화되었고 바탕값은 뺐다. 도 3e는 C14-4(또한 C14-494로도 언급됨) LNP와 관련된 최소 독성을 보여주는 리포펙타민 또는 C14-4(또한 C14-494로도 언급됨)를 사용하여 30 ng mRNA/60,000개 세포로 48시간 동안 Jurkat 세포의 대표적인 생존력을 도시한다.
도 4a 내지 도 4c를 포함하는 도 4는 다양한 조건 하에서 대표적인 루시페라제 발현을 도시한다. 도 4a 및 도 4c의 경우, 루시페라제 발현은 최저 처리(75 ng/60,000개 세포)에 대해 표준화되었고 생존력은 미처리에 대해 표준화되었으며 바탕값은 뺐다. n = 3. 도 4a는 미정제 C14-4(또한 C14-494로도 언급됨) LNP로 24시간 동안 처리된 일차 T 세포의 대표적인 루시페라제 발현 및 생존력을 도시한다. 도 4b는 루시페라제 mRNA를 캡슐화하는 미정제 및 순수한 C14-4(또한 C14-494로도 언급됨) LNP에 대해 LNP pKa를 측정하기 위한 TNS 검정의 대표적인 결과를 도시한다. pKa는 최대 TNS 형광 값의 절반에 상응하는 pH로서 계산되었다. 도 4c는 독성은 증가하지 않으면서 증가된 루시페라제 발현을 보여주는 미정제 또는 정제된 C14-4(또한 C14-494로도 언급됨)로 처리된 일차 T 세포의 대표적인 루시페라제 발현 및 생존력을 도시한다. * = p < 0.05, 대응 표본 학생 T 테스트.
도 5a 내지 도 5d를 포함하는 도 5는 CAR T 세포에 대한 대표적인 결과를 도시한다. 도 5a는 유동 세포분석을 사용하여 평가된 일차 T 세포 상에서의 CAR의 표면 발현이 미정제 C14-4(또한 C14-494로도 언급됨)와 비교하여 정제된 C14-4(또한 C14-494로도 언급됨) 및 EP 처리 그룹에서 평균 형광 강도(MFI)로서 평가된 증가된 발현을 나타낸 것을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다. 도 5b는 미처리 대조군에 대해 표준화된 대표적인 MFI 값의 비교를 도시한다. 도 5c는 처리에 대해 표준화되고 바탕값을 뺀, 각각의 그룹으로 처리된 일차 T 세포의 대표적인 생존력을 도시한다, n = 3. 도 5d는 상이한 이펙터 대 표적 비율에서 48시간 동안 공동 플레이팅된 Nalm6 및 CAR T 세포의 대표적인 결과를 도시한다. n = 3개 웰.
도 6은 이온화 가능한 지질 라이브러리를 생성하기 위해 사용된 아민 코어의 대표적인 명명 구조를 도시한다.
도 7은 LNP 제형 전체에서 LNP 크기, 단분산도, 및 유사한 mRNA 로딩에서 좁은 범위를 보여주는 각각의 LNP 제형의 대표적인 직경(z-평균), PDI, 및 mRNA 농도를 도시한다.
도 8은 루시페라제 mRNA를 캡슐화하는 미정제 및 정제 C14-4(또한 C14-494로도 언급됨) LNP의 특징의 대표적인 비교를 도시한다. 평균 n = 3+ ± 표준 편차.
도 9a 및 도 9b를 포함하는 도 9는 스크리닝된 상이한 몰비%를 가지는 대표적인 라이브러리 A 제형 및 이온화 가능한 지질(예컨대, C14-494)가 LNP로 통합되었을 때 모두 여전히 이온화 가능한 것을 보여주는 데이터를 도시한다. 본 연구에서, "S2" 제형은 부형제의 표준 C14-494 제형으로서 설정되었다. 도 9a는 몰비로서 표시된, 대표적인 라이브러리 A 제형에 대한 대표적인 제조 파라미터를 도시한다. 도 9b는 라이브러리 A 제형에 대한 대표적인 pKa 비율을 도시한다. 라이브러리 A의 pKa는, TNS 검정을 사용하여, 전부 여전히 이온화 가능한 것을 보여주었다.
도 10은 상이한 몰비%를 가지는 대표적인 라이브러리 A 제형에 대한 대표적인 제조 파라미터를 도시한다. 이들 대표적인 제형의 선택은 라이브러리 A를 스크리닝한 결과를 토대로 선택되었다.
도 11은 두 라이브러리의 대표적인 표준화된 전달 유효성을 도시한다. 1보다 큰 값(점선)은 양성 대조군에 비해 전달 유효성의 증가를 나타낸다.
도 12는 라이브러리 A 제형의 대표적인 표준화된 세포 생존력을 도시한다. 점선은 100% 생존력을 표시한다.
도 13은 라이브러리 B 제형의 대표적인 표준화된 세포 생존력을 도시한다. 점선은 100% 생존력을 표시한다.
도 14a 및 도 14b를 포함하는 도 14는 대표적인 mRNA 전달 및 생존력 부형제 조성물: 시험관내 라이브러리를 도시한다. Jurkat은 24시간 동안 30 ng/60,0000개 세포로 처리되었다. 라이브러리 A는 비교를 위해 오렌지색으로 나타낸다; 라이브러리 B는 청색으로 나타낸다. 도 14a는 대표적인 mRNA 전달 부형제 조성물: 시험관내 라이브러리를 도시한다. 도 14b는 대표적인 생존력 전달 부형제 조성물: 시험관내 라이브러리를 도시한다.
도 15는 B10 및 리포펙타민에 대한 상대적 루시페라제 활성을 입증하는 대표적인 결과를 도시한다.
도 16a 및 도 16b를 포함하는 도 16은 상이한 농도/용량에서 다양한 대표적인 제형에 대한 대표적인 발광 및 생존력 결과를 도시한다. Jurkat은 24시간 동안 ("S2" 제형은 부형제의 표준 C14-494 제형으로서 설정됨) 루시페라제-암호화 mRNA로 처리되었다. * 발광 및 독성학에 대해 0 ng으로 표준화되었다 - 모든 처리 그룹에 대해 도 16a 및 도 16b에서 그래프로 표시된 값은 미처리 그룹에 대해 표준화된 값이다. 보다 구체적으로, 각 처리 그룹에 대한 발광 및 독성 판독값은 발광의 척도였다. 각각의 처리에 대한 미가공 값(발광)은 처리를 받지 않은 세포 그룹에서 측정된 미가공 값(발광)으로 나누어졌다. 그러므로, 그래프로 표시된 값은 미처리 세포에 비교된 전달 또는 독성을 나타낸다. 이것은 -실험마다 달라지는 - 바탕값 발광이 인자로서 제거되는 것을 허용한다. 나아가, 이 실험은 3개의 별도의 Jurkat 세포 집단/계대(3개의 생물학적 복제물)로 별도로 3회 완료되었고, 각각의 실험에서 세포는 삼중 웰에 플레이팅되었다(3개의 기술적 복제물). 그러므로, 결과는 반복 가능하고(생물학적 복제물) 및 믿을만한(기술적 복제물) 것을 보장한다. 도 16a는 상이한 농도에서 다양한 대표적인 제형에 대한 대표적인 발광 결과를 도시한다. 도 16b는 상이한 농도에서 다양한 대표적인 제형에 대한 대표적인 생존력 결과를 도시한다.
도 17a 내지 도 17c를 포함하는 도 17은 환자 A, 환자 B, 및 환자 C에 대한 대표적인 부형제 조성물: 생체외를 도시한다. 도 17a는 환자 A에 대한 대표적인 부형제 조성물: 생체외를 도시한다. 도 17b는 환자 B에 대한 대표적인 부형제 조성물: 생체외를 도시한다. 도 17c는 환자 C에 대한 대표적인 부형제 조성물: 생체외를 도시한다.
본 발명은 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 mRNA의 다양한 표적(예컨대, 세포)에의 전달을 위한 지질 나노입자(LNP) 또는 그것의 조성물에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 발명은 CAR을 암호화하는 mRNA뿐만 아니라 다양한 핵산 분자, 보조제, 및/또는 치료제를 적어도 하나의 LNP 또는 그것의 조성물을 사용하여 다양한 표적(예컨대, 세포)에 전달하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 적어도 하나의 이온화 가능한 지질 및 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 발명은 그것을 필요로 하는 대상체에서 다양한 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 적어도 하나의 이온화 가능한 지질 및 CAR을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자를 포함하는 LNP 또는 그것의 조성물을 제공한다.
정의
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 실험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기술된다.
본원에서 사용되는 바, 각각의 다음의 용어는 이 섹션에서 관련된 의미를 가진다.
"하나"를 나타내는 용어는 그 용어의 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
양, 시간적 기간, 등과 같은 측정 가능한 값을 나타낼 때 본원에서 사용되는 "약"은 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게 ±5%, 보다 더 바람직하게 ±1%, 더욱 더 바람직하게 ±0.1%의 변량을 포함하는 것을 의미하며, 그러한 변량이 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문이다.
"알킬"은 포화 또는 불포화된(즉, 하나 이상의 이중 및/또는 삼중 결합을 함유함) 탄소와 수소 원자만으로 이루어지며, 1 내지 24개의 탄소 원자(C1-C24 알킬), 1 내지 12개의 탄소 원자(C1-C12 알킬), 1 내지 8개의 탄소 원자(C1-C8 알킬) 또는 1 내지 6개의 탄소 원자(C1-C6 알킬)를 가지며 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 부착되는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 사슬 라디칼을 나타내는 것으로, 예컨대, 메틸, 에틸, n 프로필, 1-메틸에틸(아이소 프로필), n 부틸, n 펜틸, 1,1 다이메틸에틸(t 부틸), 3 메틸헥실, 2 메틸헥실, 에테닐, 프로프 1 에닐, 부트-1-에닐, 펜트-1-에닐, 펜타-1,4-다이에닐, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 등이다. 특별히 다르게 명시되지 않는 한, 알킬 기는 선택적으로 치환된다. 용어 "알킬"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 일부로서, 다르게 명시되지 않는 한, 지정된 수의 탄소 원자를 가지는 직쇄형 또는 분지형 사슬 탄화수소를 의미하며(즉, C1-6은 1 내지 6개 탄소 원자를 의미함) 직쇄형, 분지형 사슬, 또는 고리형 치환기를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "치환된 알킬"은, 상기에서 정의된 바, 할로겐, -OH, 알콕시, -NH2, -N(CH3)2, -C(=O)OH, 트라이플루오로메틸, -C≡N, C(=O)O(C1-C4)알킬, -C(=O)NH2, -SO2NH2, -C(=NH)NH2, 및 -NO2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나, 2, 또는 3개의 치환기에 의해 치환된, 바람직하게는 할로겐, -OH, 알콕시, -NH2, 트라이플루오로메틸, -N(CH3)2, 및 -C(=O)OH로부터 선택된, 보다 바람직하게는 할로겐, 알콕시 및 -OH로부터 선택된 하나 또는 2개의 치환기를 함유하는 알킬을 의미한다. 치환된 알킬의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 2,2-다이플루오로프로필, 2-카르복시사이클로펜틸 및 3-클로로프로필을 들 수 있다.
"알킬렌" 또는 "알킬렌 사슬"은 포화된 또는 불포화된(즉, 하나 이상의 이중(알케닐렌) 및/또는 삼중 결합(알키닐렌)을 함유함), 탄소와 수소 만으로 이루어지고, 예를 들어, 1 내지 24개의 탄소 원자(C1-C24 알킬렌), 1 내지 15개의 탄소 원자(C1-C15 알킬렌), 1 내지 12개의 탄소 원자(C1-C12 알킬렌), 1 내지 8개의 탄소 원자(C1-C8 알킬렌), 1 내지 6개의 탄소 원자(C1-C6 알킬렌), 2 내지 4개의 탄소 원자(C2-C4 알킬렌), 1 내지 2개의 탄소 원자(C1-C2 알킬렌)를 가지는, 분자의 나머지를 라디칼 기에 연결시키는 직쇄형 또는 분지형 이가 탄화수소 사슬을 나타내며, 예컨대, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, n-부틸렌, 에테닐렌, 프로페닐렌, n-부테닐렌, 프로피닐렌, n-부티닐렌, 등이다. 알킬렌 사슬은 단일 또는 이중 결합을 통해 분자의 나머지에 부착되며 단일 또는 이중 결합을 통해 라디칼 기에 부착된다. 알킬렌 사슬의 분자의 나머지에 대한 및 라디칼 기에 대한 부착점은 사슬 내의 한 탄소 또는 임의의 2개의 탄소를 통해서일 수 있다. 명세서에서 특별하게 다르게 명시되지 않는 한, 알킬렌 사슬은 선택적으로 치환될 수 있다.
"사이클로알킬" 또는 "탄소고리형 고리"는 융합된 또는 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있고, 3 내지 15개의 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지면서, 포화 또는 불포화되고 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 부착된 탄소 및 수소 원자만으로 이루어진 안정적인 비방향족 단화식 또는 다환식 탄화수소 라디칼을 나타낸다. 단환식 라디칼로는, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 및 사이클로옥틸을 들 수 있다. 다환식 라디칼로는, 예를 들어, 아다만틸, 노르보르닐, 데칼리닐, 7,7 다이메틸 바이사이클로[2.2.1]헵타닐, 등을 들 수 있다. 특별히 다르게 명시되지 않는 한, 사이클로알킬 기는 선택적으로 치환된다.
"사이클로알킬렌"은 이가 사이클로알킬 기이다. 명세서에서 특별하게 다르게 명시되지 않는 한, 사이클로알킬렌 기는 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "헤테로알킬"은 그 자체로 또는 또 다른 용어와 함께, 다르게 명시되지 않는 한, 명시된 수의 탄소 원자 및 O, N, Si, P, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 또는 2개의 헤테로원자로 이루어지는 안정적인 직쇄형 또는 분지형 사슬 알킬 기를 의미하며, 여기서 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차화될 수 있다. 헤테로원자(들)는 헤테로알킬 기의 나머지와 그것이 부착되는 단편 사이를 포함하여 헤테로알킬 기의 임의의 위치에 배치될 수 있을 뿐만 아니라, 헤테로알킬 기의 가장 먼 곳의 탄소 원자에 부착될 수 있다. 예로는: -O-CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-OH, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, 및 -CH2CH2-S(=O)-CH3을 들 수 있다. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3, 또는 -CH2-CH2-S-S-CH3과 같이 최대 2개의 헤테로원자가 연속적일 수 있다.
"헤테로사이클릴" 또는 "헤테로고리형 고리"는 2 내지 12개의 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자로 이루어지는 안정적인 3- 내지 18-원 비-방향족 고리 라디칼을 나타낸다. 명세서에서 구체적으로 다르게 명시되지 않는 한, 헤테로사이클릴 라디칼은 단환식, 이환식, 삼환식 또는 사환식 고리 시스템일 수 있고, 이것들은 융합된 또는 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있으며; 헤테로사이클릴 라디칼의 질소, 탄소 또는 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고; 질소 원자는 선택적으로 사차화될 수 있으며; 헤테로사이클릴 라디칼은 부분적으로 또는 전체적으로 포화될 수 있다. 그러한 헤테로사이클릴 라디칼의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 다이옥솔라닐, 티에닐[1,3]다이티아닐, 데카하이드로아이소퀴놀릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 아이소티아졸리디닐, 아이소옥사졸리디닐, 모르폴리닐, 옥타하이드로인돌릴, 옥타하이드로아이소인돌릴, 2-옥소피페라지닐, 2-옥소피페리디닐, 2-옥시피롤리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 퀴누클리디닐, 티아졸리디닐, 테트라하이드로퓨릴, 트라이티아닐, 테트라하이드로피라닐, 티오모르폴리닐, 티아모르폴리닐, 1-옥소-티오모르폴리닐, 및 1,1-다이옥소-티오모르폴리닐을 들 수 있다. 특별히 다르게 명시되지 않는 한, 헤테로사이클릴 기는 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "방향족"은 하나 이상의 다중불포화된 고리를 가지며 방향족 특징을 가지는, 즉(4n+2) 비편재화된 π(파이) 전자(여기서 n은 정수임)를 가지는 탄소고리 또는 헤테로고리를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 단독으로 또는 다른 용어와 함께 사용되는 용어 "아릴"은, 다르게 명시되지 않는 한, 하나 이상의 고리(전형적으로 하나, 2 또는 3개의 고리)를 함유하는 탄소고리 방향족 시스템을 의미하여 그러한 고리는 예컨대 바이페닐과 같이 펜던트 방식으로 함께 부착될 수 있거나, 또는 나프탈렌과 같이 융합될 수 있다. 예로는 페닐, 안트라실, 및 나프틸을 들 수 있다. 바람직하게는 페닐 및 나프틸이며, 가장 바람직하게는 페닐이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"은 N, O, Si, P, 및 S로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 아릴 기를 나타내며; 여기서 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 질소 원자(들)는 선택적으로 사차화될 수 있다. 헤테로아릴 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 다중고리형 헤테로아릴은 부분적으로 포화된 하나 이상의 고리를 포함할 수 있다. 예로는 테트라하이드로퀴놀린, 2,3-다이하이드로벤조퓨릴, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-아이소옥사졸릴, 4-아이소옥사졸릴, 5-아이소옥사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-퓨릴, 3-퓨릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-아이소퀴놀릴, 5-아이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 들 수 있다.
비-방향족 헤테로고리의 예로는 단환식 기, 예컨대 아지리딘, 옥시란, 티이란, 아제티딘, 옥세탄, 티에탄, 피롤리딘, 피롤린, 이미다졸린, 피라졸리딘, 다이옥솔란, 설폴란, 2,3-다이하이드로퓨란, 2,5-다이하이드로퓨란, 테트라하이드로퓨란, 티오판, 피페리딘, 1,2,3,6-테트라하이드로피리딘, 1,4-다이하이드로피리딘, 피페라진, 모르폴린, 티오모르폴린, 피란, 2,3-다이하이드로피란, 테트라하이드로피란, 1,4-다이옥산, 1,3-다이옥산, 호모피페라진, 호모피페리딘, 1,3-다이옥세판, 4,7-다이하이드로-1,3-다이옥세핀 및 헥사메틸렌옥사이드를 들 수 있다.
헤테로아릴 기의 예로는 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐(특히 2- 및 4-피리미디닐), 피리다지닐, 티에닐, 퓨릴, 피롤릴(특히 2-피롤릴), 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 피라졸릴(특히 3- 및 5-피라졸릴), 아이소티아졸릴, 1,2,3-트라이아졸릴, 1,2,4-트라이아졸릴, 1,3,4-트라이아졸릴, 테트라졸릴, 1,2,3-티아다이아졸릴, 1,2,3-옥사다이아졸릴, 1,3,4-티아다이아졸릴 및 1,3,4-옥사다이아졸릴을 들 수 있다.
다환식 헤테로고리의 예로는 인돌릴(특히 3-, 4-, 5-, 6- 및 7-인돌릴), 인돌리닐, 퀴놀릴, 테트라하이드로퀴놀릴, 아이소퀴놀릴(특히 1- 및 5-아이소퀴놀릴), 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀릴, 시놀리닐, 퀴녹살리닐(특히 2- 및 5-퀴녹살리닐), 퀴나졸리닐, 프탈라지닐, 1,8-나프티리디닐, 1,4-벤조다이옥사닐, 쿠마린, 다이하이드로쿠마린, 1,5-나프티리디닐, 벤조퓨릴(특히 3-, 4-, 5-, 6- 및 7-벤조퓨릴), 2,3-다이하이드로벤조퓨릴, 1,2-벤즈아이소옥사졸릴, 벤조티에닐(특히 3-, 4-, 5-, 6-, 및 7-벤조티에닐), 벤즈옥사졸릴, 벤조티아졸릴(특히 2-벤조티아졸릴 및 5-벤조티아졸릴), 퓨리닐, 벤즈이미다졸릴(특히 2-벤즈이미다졸릴), 벤즈트라이아졸릴, 티오크산티닐, 카르바졸릴, 카르볼리닐, 아크리디닐, 피롤리지디닐, 및 퀴놀리지디닐을 들 수 있다.
헤테로사이클릴 및 헤테로아릴 모이어티의 상기 언급된 목록은 대표적인 것이며 제한하지 않는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "아미노 아릴"은 아미노 모이어티를 함유하는 아릴 모이어티를 나타낸다. 그러한 아미노 모이어티로는, 한정하는 것은 아니지만 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민, 마스킹된 아민, 또는 보호된 아민을 들 수 있다. 그러한 삼차 아민, 마스킹된 아민, 또는 보호된 아민은 일차 아민 또는 이차 아민 모이어티로 전환될 수 있다. 추가적으로, 아미노 모이어티는 한정하는 것은 아니지만, 화학적 반응성을 포함한, 아민 모이어티와 유사한 화학적 특징을 가지는 아민 유사 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오"는 용어의 종래 의미로 사용되며, 각각 산소 원자, 아미노 기, 황 원자를 통해 분자에 연결된 알킬 기를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 단독으로 또는 다른 용어와 함께 사용된 용어 "알콕시"는, 다르게 명시되지 않는 한, 산소 원자를 통해 분자의 나머지에 연결된, 상기 정의된 지정된 수의 탄소 원자를 가지는 알킬 기를 의미하며, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 1-프로폭시, 2-프로폭시(아이소프로폭시) 및 고급 유사체 및 이성질체를 들 수 있다. 바람직한 것은(C1-C3) 알콕시, 특히 에톡시 및 메톡시이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 단독으로 또는 또 다른 치환기의 부분으로서, 다르게 명시되지 않는 한, 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드 원자, 바람직하게 불소, 염소, 또는 브롬, 보다 바람직하게, 불소 또는 염소를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "치환된"은 적어도 하나의 수소 원자가 비-수소 원자, 예컨대 한정하는 것은 아니지만: F, Cl, Br, 및 I와 같은 할로겐 원자; 옥소 기(=O); 하이드록실 기(-OH); 알콕시 기(-ORa, 여기서 Ra는 C1-C12 알킬 또는 사이클로알킬임); 카르복실 기(-OC(=O)Ra 또는 -C(=O)ORa, 여기서 Ra는 H, C1-C12 알킬 또는 사이클로알킬임); 아민 기(-NRaRb, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 사이클로알킬임); C1-C12 알킬 기; 및 사이클로알킬 기로 대체된 상기 기(예컨대, 알킬, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클릴) 중 임의의 것을 의미한다. 일부 구현예에서 치환기는 C1-C12 알킬 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 사이클로알킬 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 할로 기, 예컨대 플루오로이다. 다른 구현예에서, 치환기는 옥소 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 하이드록실 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 알콕시 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 카르복실 기이다. 다른 구현예에서, 치환기는 아민 기이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "나노입자"는 1 마이크로미터 미만의, 나노미터 규모의 입자 크기를 가지는 입자를 나타낸다. 예를 들어, 나노입자는 최대 약 50 nm의 입자 크기를 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 나노입자는 최대 약 10 nm의 입자 크기를 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 나노입자는 최대 약 6 nm의 입자 크기를 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "나노입자"는 한정하는 것은 아니지만, 나노클러스터, 나노소포, 미셸, 라멜라 모양 입자, 폴리머솜, 덴드라이머, 및 기술분야의 사람들에게 알려져 있는 다양한 다른 소형 제조의 다른 나노 규모 입자를 포함한 많은 나노입자를 나타낸다. 나노입자의 모양 및 조성은 구형, 막대, 와이어, 디스크, 케이지, 코어-쉘 구조 및 많은 다른 모양을 생성하기 위해 원자의 축합 중에 특정 결정 면(crystal facet)의 성장을 선택적으로 선호함으로써 안내될 수 있다. 나노캡슐의 범주 내에 속하는 실체의 정의 및 이해는 기술분야에 숙련된 자들에게 알려져 있고, 그러한 정의는 참조로 및 본 출원의 주제의 일반적 본질을 이해할 목적으로 본원에 포함된다.
본원에서 사용되는 바, "핵산"은 그것이 데옥시리보뉴클레오사이드 또는 리보뉴클레오사이드로 구성되었든, 포스포트라이에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카보네이트, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카바메이트, 티오에테르, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로다이티오에이트, 가교된 포스포로티오에이트 또는 설폰 결합, 및 그러한 결합의 조합과 같은 포스포다이에스테르 결합 또는 변형된 결합으로 구성되었든 임의의 핵산을 포함하는 것을 의미한다. 용어 핵산은 또한 특히 5개의 생물학적으로 발생하는 염기(아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 및 우라실) 외의 염기로 구성된 핵산을 포함한다. 용어 "핵산"은 전형적으로 큰 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다.
"분리된"은 자연적인 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "분리된" 것이 아니지만, 그것의 자연적인 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "분리된" 것이다. 분리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재하거나, 또는 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
"분리된 핵산"은 자연적으로 발생하는 상태에서 옆에 있는 서열, 즉, DNA 단편으로부터 분리되었고, 단편에 정상적으로 인접한 서열, 즉, 자연적으로 발생하는 게놈에서 단편에 인접한 서열로부터 제거된 핵산 분절 또는 단편을 나타낸다. 용어는 또한 핵산에 자연적으로 수반되는 다른 구성요소로부터 실질적으로 정제된 핵산, 즉, 세포에서 자연적으로 수반되는 RNA 또는 DNA 또는 단백질에도 적용된다. 그러므로 용어는, 예를 들어, 벡터에 통합된, 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스에 통합된, 또는 원핵세포 또는 진핵세포의 게놈 DNA 또는 RNA에 통합된, 또는 다른 서열과 독립적인 별도의 분자로서(즉, PCR 또는 제한 효소 분해에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편으로서) 존재하는 재조합 DNA 또는 RNA를 포함한다. 용어는 또한 추가의 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA 또는 RNA를 포함한다.
mRNA 분자의 "코딩 영역"은 또한 mRNA 분자의 번역 중에 전달 RNA 분자의 안티-코돈 영역과 매칭되거나 중지 코돈을 암호화하는 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진다. 그러므로 코딩 영역은 mRNA 분자에 의해 암호화된 성숙 단백질에 존재하지 않는 아미노산 잔기(예컨대, 단백질 유출 신호 서열에 존재하는 아미노산 잔기)에 대한 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 잔기를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "DNA"는 데옥시리보핵산으로서 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "RNA"는 리보핵산으로서 정의된다.
"암호화하는"은 뉴클레오타이드의 규정된 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 규정된 아미노산 서열 및 그것으로부터 발생된 생물학적 특성을 가진 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오타이드의 특정 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 고유한 특성을 나타낸다. 그러므로, 유전자는 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성한다면 단백질을 암호화한다. 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열에 동일하고 보통 서열 목록으로 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비코딩 가닥은 둘 다 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로서 언급될 수 있다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 나타낸다. 발현 벡터는 발현을 위해 충분한 시스-작용 요소를 포함한다; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 기술분야에 알려져 있는 모든 것, 예컨대 코스미드, 플라스미드(예컨대, 네이키드 또는 리포솜에 함유됨) RNA, 및 재조합 폴리뉴클레오타이드를 통합하는 바이러스(예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
"상동성"은 두 폴리펩타이드 사이 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 나타낸다. 두 비교된 서열 전부에서 한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 모노머 하위유닛에 의해 차지되는 경우, 예컨대, 두 DNA 분자의 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 차지된다면, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 두 서열 사이의 상동성 퍼센트는 비교된 위치의 수로 나누어진 두 서열에 의해 공유된 매칭되는 또는 상동성 위치의 수 X 100의 함수이다. 예를 들어, 만약 두 서열의 10개의 위치 중 6개가 매칭되거나 상동한다면 두 서열은 60% 상동성이다. 예를 들어, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 비교는 두 서열이 최대 상동성을 제공하도록 정렬될 때 이루어진다.
"면역원"은 면역 반응을 생성하기 위해 신체에 도입되는 임의의 물질을 나타낸다. 그 물질은 물리적 분자, 예컨대 단백질이거나, 벡터, 예컨대 DNA, mRNA, 또는 바이러스에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 일반적으로 발생하는 뉴클레오사이드(N-글리코시드 결합을 통해 리보스 또는 데옥시리보스 당에 결합된 핵염기)에 대해 다음의 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 나타내며, "C"는 시티딘을 나타내고, "G"는 구아노신을 나타내며, "T"는 티미딘을 나타내고, "U"는 우리딘을 나타낸다.
다르게 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 축퇴성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이란 구절은 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
다르게 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 축퇴성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수 있다. 더불어, 뉴클레오타이드 서열은 세포에서 번역 기계에 의해 번역될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드를 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 사슬로서 정의된다. 나아가, 핵산은 뉴클레오타이드의 중합체이다. 그러므로, 본원에서 사용되는 핵산 및 폴리뉴클레오타이드는 상호교환 가능하다. 당업자는 핵산이 모노머 "뉴클레오타이드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오타이드라는 일반적인 지식을 가지고 있다. 모노머 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드로 가수분해될 수 있다. 본원에서 사용되는 바 폴리뉴클레오타이드는, 한정하는 것은 아니지만, 제한 없이, 재조합 수단, 즉 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 통상적인 클로닝 기술 및 PCRTM 등을 사용하는 핵산 서열의 클로닝을 포함한 기술분야에서 활용 가능한 임의의 수단에 의해, 및 합성 수단에 의해 얻어지는 모든 핵산 서열을 포함한다.
특정 경우에, 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 "핵산"이며, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 핵산을 나타낸다. "변형된 뉴클레오사이드"는 변형을 포함한 뉴클레오사이드를 나타낸다. 예를 들어, 100개 이상의 상이한 뉴클레오사이드 변형이 RNA에서 확인되었다(Rozenski, et al., 1999, The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197).
본원에서 사용되는 바, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 상호교환 가능하게 사용되며, 펩타이드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 나타낸다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩타이드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 둘 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 용어는 보통 기술분야에서 예를 들어 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로서 언급되는 짧은 사슬, 및 일반적으로 기술분야에서 단백질로서 언급되며 많은 유형이 있는 더 긴 사슬 둘 다를 나타낸다. "폴리펩타이드"로는, 예를 들어, 다른 것들 중에서도 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 호모다이머, 헤테로다이머, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 들 수 있다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 그것들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 폴리펩타이드"는 재조합 DNA 또는 RNA 방법을 사용함으로써 생성된 폴리펩타이드로서 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 DNA"는 상이한 공급원으로부터의 DNA의 조각을 연결함으로써 생성된 DNA로서 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 RNA"는 상이한 공급원으로부터의 DNA의 조각을 연결함으로써 생성된 RNA로서 정의된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "동일한"은 동일한 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 나타낸다.
더불어, 용어 "실질적으로 동일한"은, 본원에서 사용되는 바, 비교 창, 또는 비교 알고리즘을 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬될 때 동일한 순차적 단위의 백분율을 가지는 둘 이상의 서열을 나타낸다. 단지 예를 들자면, 둘 이상의 서열은 만약 순차적 단위가 명시된 영역에 걸쳐 약 60% 동일하거나, 약 65% 동일하거나, 약 70% 동일하거나, 약 75% 동일하거나, 약 80% 동일하거나, 약 85% 동일하거나, 약 90% 동일하거나, 또는 약 95% 동일하다면 "실질적으로 동일"하다. 그러한 백분율은 둘 이상의 서열의 "퍼센트 동일성"을 기술하기 위한 것이다. 서열의 동일성은 길이가 적어도 약 75-100개의 순차적 단위인 영역에 걸쳐, 길이가 적어도 약 50개의 순차적 단위인 영역에 걸쳐, 또는 명시되지 않은 경우, 전체 서열에 대해 존재할 수 있다. 이 정의는 또한 테스트 서열의 보체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "변이체는 각각 참조 핵산 서열 또는 펩타이드 서열과 서열이 상이하지만 참조 분자의 필수 생물학적 특성을 보유하고 있는 핵산 서열 또는 펩타이드 서열이다. 핵산 변이체의 서열의 변화는 참조 핵산에 의해 암호화된 펩타이드의 아미노산 서열을 변경시킬 수 없거나, 아미노산 치환, 첨가, 결실, 융합 및 절단을 초래할 수 있다. 펩타이드 변이체의 서열의 변화는 전형적으로 제한되거나 보존적이어서, 참조 펩타이드 및 변이체의 서열은 전체적으로 밀접하게 유사하고, 많은 영역에서 동일하다. 변이체 및 참조 펩타이드는 임의의 조합의 하나 이상의 치환, 첨가, 결실에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 핵산 또는 펩타이드의 변이체는 자연적으로 발생하는, 예컨대 대립유전자 변이체이거나, 또는 자연적으로 발생하는 것으로 알려져 있지 않은 변이체일 수 있다. 핵산 및 펩타이드의 비-자연적으로 발생하는 변이체는 돌연변이생성 기법에 의해 또는 직접 합성에 의해 만들어질 수 있다. 다양한 구현예에서, 변이체 서열은 참조 서열에 대해 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 89%, 적어도 88%, 적어도 87%, 적어도 86%, 적어도 85% 동일하다.
본원에서 사용되는 바, "단편"은 그것의 표적에 결합하는 면역글로불린 분자의 가변 영역, 즉 항원 결합 영역의 적어도 일부로서 정의된다. 면역글로불린의 불변 영역의 일부가 포함될 수도 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "결합"은 링커의 작용기와 또 다른 분자 사이의 화학적 반응으로부터 형성된 결합 또는 화학적 모이어티를 나타낸다. 그러한 결합으로는, 한정하는 것은 아니지만, 공유 결합 및 비공유 결합을 들 수 있는 한편, 그러한 화학적 모이어티로는, 한정하는 것은 아니지만, 에스테르, 카보네이트, 이민 포스페이트 에스테르, 하이드라존, 아세탈, 오르토에스테르, 펩타이드 결합, 및 올리고뉴클레오타이드 결합을 들 수 있다. 가수분해적으로 안정적인 결합은 한정하는 것은 아니지만, 장기간 동안, 아마도 심지어 무한하게, 생리적 조건 하에서를 포함하여, 결합이 물에서 실질적으로 안정하고 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않는 것을 의미한다. 가수분해적으로 불안정하거나 분해 가능한 결합은 결합이 물 또는, 예를 들어, 혈액을 포함한 수성 용액에서 분해 가능한 것을 의미한다. 효소적으로 불안정하거나 분해 가능한 결합은 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있는 것을 의미한다. 단지 예를 들자면, PEG 및 관련 중합체는 중합체 백본에 또는 중합체 백본과 중합체 분자의 하나 이상의 말단 작용기 사이의 링커 기에 분해 가능한 결합을 포함할 수 있다. 그러한 분해 가능한 결합으로는, 한정하는 것은 아니지만, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산과 생물학적 활성제 상의 알코올 기와의 반응에 의해 형성된 에스테르 결합을 들 수 있고, 그러한 에스테르 기는 일반적으로 생리 조건 하에서 가수분해되어 생물학적 활성제를 방출한다. 다른 가수분해적으로 분해 가능한 결합으로는 한정하는 것은 아니지만 카보네이트 결합; 아민과 알데하이드의 반응으로부터 생성된 이민 결합; 알코올이 포스페이트 기와 반응함으로써 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 하이드라지드와 알데하이드의 반응 생성물인 하이드라존 결합; 알데하이드와 알코올의 반응 생성물인 아세탈 결합; 포르메이트와 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 결합; 한정하는 것은 아니지만, PEG와 같은 중합체 단부에 있는 것을 포함한 아민 기와, 펩타이드의 카르복실 기에 의해 형성된 펩타이드 결합; 및 한정하는 것은 아니지만, 중합체 단부에 있는 것을 포함한 포스포라미다이트 기와, 올리고뉴클레오타이드의 5' 하이드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오타이드 결합을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "유전자"는 단백질 또는 기능성 RNA(예를 들어, tRNA)를 암호화하는 핵산 분자를 나타낸다. 유전자는 최종 단백질 또는 RNA 생성물을 암호화하지 않는 영역, 예컨대 5' 또는 3' 미번역 영역, 인트론, 리보솜 결합 부위, 프로모터 또는 인핸서 영역, 또는 다른 관련된 및/또는 조절 서열 영역을 포함할 수 있다.
용어 "유전자 발현" 및 "발현"은 본원에서 유전자, 예컨대 DNA 서열로부터의 유전되는 정보가 기능성 유전자 생성물, 예컨대 단백질 또는 RNA로 만들어지는 과정을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "프로모터" 또는 "조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우에, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고 다른 경우에, 이 서열은 또한 인핸서 서열 및 유전자 생성물의 발현에 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들어, 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종성 핵산 서열 사이의, 이종성 핵산 서열의 발현을 초래하는 기능적 연결을 나타낸다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터는 만약 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 또는 RNA 서열은 연속적이고, 필요하다면 동일한 판독 프레임에서 2개의 단백질 코딩 영역을 연결시킨다.
본원에서 사용되는 바 용어 "특이적으로 결합하는"은, 항체와 관련하여, 특정 항원을 인식하지만 샘플 중의 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 못하는 항체를 의미한다. 예를 들어, 한 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 다른 종으로부터의 항원에도 결합할 수 있다. 그러나, 그러한 종-교차 반응성 자체는 항체의 특이적 분류를 변경시키지 못한다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 그러한 교차 반응성 자체는 항체의 특이적 분류를 변경시키지 못한다. 일부 경우에, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체, 단백질, 또는 펩타이드의 제2 화학적 종과의 상호작용과 관련하여 상호작용이 화학적 종 상의 특정 구조(예컨대, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존적인 것을 의미하기 위해 사용될 수 있다; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 그것에 결합한다. 만약 항체가 에피토프 "A"에 대해 특이적이라면, 에피토프 A(또는 유리, 미표지 A)를 함유하는 분자의 존재는 표지된 "A" 및 항체를 함유한 반응에서, 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "키메릭 항원 수용체" 또는 대안으로 "CAR"은 적어도 하나의 세포외 항원 결합 도메인, 경막 도메인, 및 하기에서 정의되는 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드 구성물을 나타낸다. 한 측면으로, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 관련된 제타 사슬이다. 한 측면으로, 세포질 신호전달 도메인은 하기에서 정의되는 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 한 측면으로, 공동자극 분자는 4 1BB(즉, CD137), CD3, 및/또는 CD28로부터 선택된다. 한 측면으로, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 경막 도메인, 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 융합 단백질을 포함한다. 한 측면으로, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 경막 도메인 및 공동 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 융합 단백질을 포함한다. 한 측면으로, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 경막 도메인 및 하나 이상의 공동 자극 분자(들)로부터 유래된 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 융합 단백질을 포함한다. 한 측면으로, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 경막 도메인 및 하나 이상의 공동 자극 분자(들)로부터 유래된 적어도 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 융합 단백질을 포함한다. 한 측면으로 CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노-말단(N-ter)에서 선택적 리더 서열을 포함한다. 한 측면으로, CAR은 세포외 항원 인식 도메인의 N-말단에서 리더 서열을 추가로 포함하며, 리더 서열은 세포 프로세싱 및 CAR의 세포막에의 국지화 중에 scFv 도메인으로부터 선택적으로 절단된다.
항체 또는 그것의 항체 단편을 포함하는 CAR 조성물의 일부는 다양한 형태로 존재할 수 있고 이때 항원 결합 도메인은 예를 들어, 단일 사슬 항체 단편(sdAb), 단일 사슬 항체(scFv) 및 인간화된 항체를 포함하는 연속 폴리펩타이드 사슬의 일부로서 발현된다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). 한 측면으로, 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 한 구현예에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원" 또는 "Ag"는 적응 면역 반응을 촉발시키는 분자로서 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생성, 또는 특정 면역 생성 능력 세포의 활성화, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 숙련된 전문가는 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함한 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 나아가, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA 또는 RNA로부터 유래될 수 있다. 숙련된 전문가는 그러므로 적응 면역 반응을 유도하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 부분 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 DNA 또는 RNA가 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항원"을 암호화하는 것을 이해할 것이다. 나아가, 기술분야의 숙련된 사람은 항원이 유전자의 전장 뉴클레오타이드 서열에 의해서만 암호화될 필요가 없는 것을 이해할 것이다. 본 발명은, 한정하는 것은 아니지만, 하나 이상의 유전자의 부분 뉴클레오타이드 서열의 용도를 포함하며, 이들 뉴클레오타이드 서열은 원하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 배열되는 것이 쉽게 나타난다. 더욱이, 숙련된 전문가는 항원이 "유전자"에 의해 암호화될 필요가 전혀 없는 것을 이해할 것이다. 항원은 합성으로 생성되거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있는 것이 쉽게 나타난다. 그러한 생물학적 샘플로는, 한정하는 것은 아니지만 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "보조제(adjuvant)"는 항원 특이적 적응 면역 반응을 증강시키는 임의의 분자로서 정의된다.
"질환"은 동물이 항상성을 유지할 수 없고, 만약 질환이 개선되지 않으면 동물의 건강이 계속해서 악화되는 동물의 건강 상태이다.
대조적으로, 동물의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만, 동물의 건강 상태는 장애가 없을 때보다는 덜 유리한 동물의 건강 상태이다. 치료되지 않은 채로 방치되면, 장애는 반드시 동물의 건강 상태의 추가적 감소를 유발하지는 않는다.
"암"은, 본원에서 사용되는 바, 세포의 비정상적인 성장 또는 분할을 나타낸다. 일반적으로, 암 세포의 성장 및/또는 수명은 그 주변의 정상 세포 및 조직의 성장 및/또는 수명을 초과하고, 그것과 조화를 이루지 않는다. 암은 양성이거나, 악성 전이거나 악성일 수 있다. 암은 다양한 세포 및 조직, 이를테면 구강(예컨대, 입, 혀, 인두, 등), 소화계(예컨대, 식도, 위, 소장, 결장, 직장, 간, 담관, 담낭, 췌장, 등), 호흡계(예컨대, 후두, 폐, 기관지, 등), 뼈, 관절, 피부(예컨대, 기저 세포, 편평 세포, 수막종, 등), 유방, 생식계(예컨대, 자궁, 난소, 전립선, 고환, 등), 비뇨기계(예컨대, 방광, 신장, 요관, 등), 눈, 신경계(예컨대, 뇌, 등), 내분비계(예컨대, 갑상선, 등), 및 조혈계(예컨대, 림프종, 골수종, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 등)에서 발생한다.
본원에서 사용되는 "유효량"은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질환 또는 장애 상태의 적어도 하나의 신호 또는 증상의 억제, 감소, 완화, 또는 근절에 의해 얻어진다.
용어 "치료적 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 전문가가 추구하는 조직, 시스템, 또는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도할 대상 화합물의 양을 나타낸다. 용어 "치료적 유효량"은 투여되었을 때 치료되는 장애 또는 질환의 하나 이상의 신호 또는 증상의 발생을 방지하거나, 어느 정도 완화시키기에 충분한 화합물의 양을 포함한다. 치료적 유효량은 화합물, 질환 및 그것의 중증도 및 치료되는 대상체의 연령, 체중, 등에 따라 달라질 것이다.
용어 "환자", "대상체", "개체", 등은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 시험관내에 있거나 제자리에 있거나, 본원에서 기술된 방법을 따를 수 있는 임의의 동물, 또는 그것의 세포 또는 임의의 다세포 유기체, 또는 그것의 세포를 나타낸다. 특정 비제한적인 구현예에서, 환자, 대상체 또는 개체는 인간이다. 특정 비제한적인 구현예에서, 환자, 대상체 또는 개체는 태아이다. 특정 비제한적인 구현예에서, 환자, 대상체 또는 개체는 배아이다.
용어 "조절하는"은, 본원에서 사용되는 바, 치료 또는 화합물의 부재시 대상체에서의 반응 수준과 비교된, 및/또는 그렇지 않으면 동일하지만 미처리 대상체에서의 반응 수준과 비교된 대상체에서의 반응 수준의 검출 가능한 증가 또는 감소를 매개하는 것을 의미한다. 용어는 대상체, 바람직하게, 인간에서 자연적인 신호 또는 반응을 교란하는 및/또는 영향을 미치고 그로써 유익한 치료 반응을 매개하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어로서 질환을 "치료"하는 것은 대상체가 경험하는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 신호 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "트랜스펙션된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포에 전달되거나 도입되는 과정을 나타낸다. "트랜스펙션된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 트랜스펙션되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상체 세포 및 그것의 자손을 포함한다.
본원에서 사용되는 구절 "전사 제어 하에서" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 RNA 중합효소에 의한 전사의 개시 및 폴리뉴클레오타이드의 발현을 제어하기 위해 프로모터가 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 정확한 위치 및 방향에 있는 것을 의미한다.
"벡터"는 분리된 핵산을 포함하고 세포 내부에 분리된 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성이다.
선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함한, 수많은 벡터가 기술분야에 알려져 있다. 그러므로, 용어 "벡터"는 자가 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 용어는 또한, 예컨대, 폴리리신 화합물, 리포솜, 등과 같이, 핵산의 세포로의 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 등을 들 수 있다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"(예컨대, 선택적으로 치환된)는 계속해서 기술된 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수 있고, 그 기술은 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "선택적으로 치환된 알킬"은 알킬 라디칼이 치환되거나 치환되지 않을 수 있고 기술은 치환된 알킬 라디칼 및 치환되지 않은 알킬 라디칼을 모두 포함하는 것을 의미한다.
범위: 본 개시 전체에서, 발명의 다양한 측면은 범위 방식으로 제공될 수 있다. 범위 방식의 기술은 단순히 편리 및 간경함을 위한 것이며 발명의 범주에 대한 융통성 없는 제한으로서 해석되지 않아야 하는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기술은 그 범위 내에 있는 개별적인 수치뿐만 아니라 모든 가능한 하위범위를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기술은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계 없이 적용된다.
설명
본 발명은, 부분적으로, 신규한 지질 나노입자(LNP) 또는 그것의 조성물이 CAR을 암호화하는 mRNA 분자를 향상된 효율 및 낮은 독성으로 T 세포에 전달한다는 발견에 관한 것이다. 그러므로, 일부 측면으로, 본 발명은 또한 CAR을 암호화하는 mRNA뿐만 아니라 다양한 핵산 분자, 보조제, 및/또는 치료제를 적어도 하나의 LNP 또는 그것의 조성물을 사용하여 다양한 표적(예컨대, 세포, 조직, 등)에 전달하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 적어도 하나의 이온화 가능한 지질 및 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 발명은 적어도 하나의 mRNA 분자 및 적어도 하나의 LNP를 포함하는 적어도 하나의 LNP 또는 그것의 조성물을 사용하여 그것을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
지질 나노입자(LNP) 및 그것의 조성물
본 발명은, 부분적으로, 적어도 하나의 mRNA 분자 및 적어도 하나의 지질을 포함하는 신규한 지질 나노입자(LNP)에 관한 것이다. 한 측면으로, 본 발명은, 부분적으로, 본 발명의 적어도 하나의 LNP를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 그러므로, 다양한 측면으로, 본 발명은, 부분적으로, 적어도 하나의 mRNA 분자 및 적어도 하나의 지질을 포함하는 신규한 LNP 조성물에 관한 것이다.
다양한 구현예에서, 지질은 이온화 가능한 지질이다. 다양한 구현예에서, 지질은 식 (I)의 구조를 가지는 화합물 또는 그것의 염이다:
Figure pct00016
식(I).
일부 구현예에서, A1은 C, C(H), N, S, 또는 P이다. 일부 구현예에서, A2는 C, C(H), N, S, 또는 P이다.
일부 구현예에서, L1은 C, C(H)2, C(H)(R19), O, N(H), 또는 N(R19)이다. 일부 구현예에서, L2는 C, C(H)2, C(H)(R19), O, N(H), 또는 N(R19)이다. 일부 구현예에서, L3은 C, C(H)2, C(H)(R19), O, N(H), 또는 N(R19)이다. 일부 구현예에서, L4는 C, C(H)2, C(H)(R19), O, N(H), 또는 N(R19)이다. 일부 구현예에서, L5는 C, C(H)2, C(H)(R19), O, N(H), 또는 N(R19)이다. 일부 구현예에서, L6은 C, C(H)2, C(H)(R19), O, N(H), 또는 N(R19)이다.
일부 구현예에서, R1, R2, R3a, R3b, R4a, R4b, R5a, R5b, R6a, R6b, R7a, R7b, R8a, R8b, R9a, R9b, R10a, R10b, R11a, R11b, R12a, R12b, R13a, R13b, R14a, R14b, R15a, R15b, R16, R17, R18, 또는 R19는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알킬, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, -Y(R20)z`(R21)z``-헤테로사이클로알킬, 치환된-(R20)z`(R21)z``-헤테로사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알케닐, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알키닐, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, -Y(R20)z`(R21)z``-아릴, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, -Y(R20)z`(R21)z``-헤테로아릴, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-헤테로아릴, 알콕시카르보닐, 선형 알콕시카르보닐, 분지형 알콕시카르보닐, 아미도, 아미노, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, 하이드록실, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 하이드록시아릴, 알콕시, 카르복실, 카르복실레이트, 에스테르, -Y(R20)z`(R21)z``-에스테르, -Y(R20)z`(R21)z``, =O, -NO2, -CN, 또는 설폭시이다.
다양한 구현예에서, Y는 C, N, O, S, 또는 P이다.
일부 구현예에서, R20 또는 R21은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알콕시카르보닐, 선형 알콕시카르보닐, 분지형 알콕시카르보닐, 아미도, 아미노, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, 하이드록실, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 하이드록시아릴, 알콕시, 카르복실, 카르복실레이트, 에스테르, =O, -NO2, -CN, 또는 설폭시이다.
일부 구현예에서, z`는 0, 1, 2, 또는 3으로 표시되는 정수이다. 일부 구현예에서, z``는 0, 1, 2, 또는 3으로 표시되는 정수이다.
일부 구현예에서, m, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w, 또는 x는 0 내지 25의 정수이다. 다양한 구현예에서, m, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w, 또는 x는 0, 1, 2; 3, 4, 또는 5로 표시되는 정수이다.
일부 구현예에서, 식(I)의 구조를 가지는 화합물은 다음 구조를 가지는 화합물이다:
Figure pct00017
식(II);
Figure pct00018
식(III);
Figure pct00019
식(IV);
Figure pct00020
식(V);
Figure pct00021
식(VI); 또는
Figure pct00022
식(VII).
그러므로, 다양한 구현예에서, R1, R2, R3, R4, 또는 R5는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알콕시카르보닐, 선형 알콕시카르보닐, 분지형 알콕시카르보닐, 아미도, 아미노, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, 하이드록실, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 하이드록시아릴, 알콕시, 카르복실, 카르복실레이트, 또는 에스테르이다.
일부 구현예에서, m, n, o, p, 또는 q는 0 내지 25의 정수이다. 일부 구현예에서, r, s, t, u, v, w, 또는 x는 0, 1, 2; 3, 4, 및 5로 표시되는 정수이다.
일부 구현예에서, 식(I)의 구조를 가지는 화합물은 다음 구조를 가지는 화합물이다:
Figure pct00023
식(VIII);
Figure pct00024
식(IX);
Figure pct00025
식(X);
Figure pct00026
식(XI);
Figure pct00027
식(XII);
Figure pct00028
식(XIII);
Figure pct00029
식(XIV); 또는
Figure pct00030
식(XV).
다양한 구현예에서, mRNA 분자는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA 분자는 식 (I)의 구조를 가지는 화합물 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, mRNA 분자는 식 (I)-(XV)의 구조를 가지는 화합물 내에 캡슐화된다.
다양한 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 지질을 약 0.1 몰% 내지 약 100 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 지질을 약 1 몰% 내지 약 100 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 지질을 약 10 몰% 내지 약 70 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 지질을 약 10 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 지질을 약 15 몰% 내지 약 45 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 지질을 약 35 몰% 내지 약 40 몰%의 농도 범위로 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 1 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 2 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 5 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 5.5 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 10 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 12 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 15 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 20 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 25 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 30 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 35 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 37 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 40 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 45 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 50 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 60 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 70 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 80 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 90 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 95 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 95.5 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 99 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 99.9 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 식(I)-(XV)의 구조를 가지는 하나 이상의 화합물을 약 100 몰%의 농도로 포함한다.
다양한 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 적어도 하나의 헬퍼 화합물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 헬퍼 화합물은 헬퍼 지질, 헬퍼 중합체, 또는 그것들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 인지질, 콜레스테롤 지질, 중합체, 양이온성 지질, 중성 지질, 대전된 지질, 스테로이드, 스테로이드 유사체, 중합체 콘쥬게이션된 지질, 안정화 지질, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
다양한 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 0 몰% 내지 약 100 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 0.01 몰% 내지 약 99.9 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 0.1 몰% 내지 약 90 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 0.1 몰% 내지 약 70 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 5 몰% 내지 약 95 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 0.5 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 0.5 몰% 내지 약 47 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 2.5 몰% 내지 약 47 몰%의 농도 범위로 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 0.01 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 0.1 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 0.5 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 1 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 1.5 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 2 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 2.5 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 5 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 10 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 12 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 15 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 16 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 20 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 25 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 30 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 35 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 37 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 40 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 45 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 46.5 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 47 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 50 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 60 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 63 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 70 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 80 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 90 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 95 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 95.5 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 99 몰%의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 하나 이상의 헬퍼 화합물을 약 100 몰%의 농도로 포함한다.
일부 구현예에서, 인지질은 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE) 또는 그것의 유도체, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 또는 그것의 유도체, 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE) 또는 그것의 유도체, 스테아로일올레오일포스파티딜콜린(SOPC) 또는 그것의 유도체, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티딜에탄올 아민(SOPE) 또는 그것의 유도체, N-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTAP) 또는 그것의 유도체, 또는 그것들의 임의의 조합이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 인지질을 약 0 몰% 내지 약 100 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 인지질을 약 15 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 인지질을 약 10 몰% 내지 약 40 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 인지질을 약 16 몰% 내지 약 40 몰%의 농도 범위로 포함한다.
일부 구현예에서, 콜레스테롤 지질은 콜레스테롤 또는 그것의 유도체이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 콜레스테롤 지질을 약 0 몰% 내지 약 100 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 콜레스테롤 지질을 약 20 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 콜레스테롤 지질을 약 20 몰% 내지 약 47 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 콜레스테롤 지질을 약 47 몰%의 농도로 및 DOPE를 약 16 몰%의 농도로 포함한다.
일부 구현예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 그것의 유도체이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 중합체를 약 0 몰% 내지 약 100 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 중합체를 약 0.5 몰% 내지 약 10 몰%의 농도 범위로 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 중합체를 약 0.5 몰% 내지 약 2.5 몰%의 농도 범위로 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "양이온성 지질"은 pH가 지질의 이온화 가능한 기의 pK 아래로 저하됨에 따라 양이온성이거나 양이온성이 되지만(양성자화), 높은 pH 값에서 점진적으로 보다 중성이 되는 지질을 나타낸다. 그러면 지질은 pK보다 아래의 pH 값에서, 음전하 핵산과 회합할 수 있다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 pH 감소에 대해 양전하를 띄는 양쪽이온성 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 선택적 pH, 예컨대 생리적 pH에서 순 양전하를 운반하는 많은 지질 종 중 임의의 것을 포함한다. 그러한 지질로는, 한정하는 것은 아니지만, N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드(DODAC); N-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드(DDAB); N-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTAP); 3-(N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤(DC-Chol), N-(1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N-2-(스퍼민카르복사미도)에틸)-N,N-다이메틸암모늄 트라이플루오르아세테이트(DOSPA), 다이옥타데실아미도글리실 카르복시스퍼민(DOGS), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄 프로판(DODAP), N,N-다이메틸-2,3-다이올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N-(1,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE)를 들 수 있다. 추가적으로, 본 발명에서 사용될 수 있는 양이온성 지질의 많은 상업적 제제가 이용 가능하다. 이것들로는, 예를 들어, LIPOFECTIN®(GIBCO/BRL(Grand Island, N.Y.)사로부터의, DOTMA 및 1,2-다이올레오일-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 리포솜); 리포펙타민®(GIBCO/BRL사로부터의, N-(1-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N-(2-(스퍼민카르복사미도)에틸)-N,N-다이메틸암모늄 트라이플루오로아세테이트(DOSPA) 및(DOPE)를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 리포솜); 및 TRANSFECTAM®(Promega Corp.(Madison, Wis.)사로부터의, 에탄올에 다이옥타데실아미도글리실 카르복시스퍼민(DOGS)을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 지질)을 들 수 있다. 다음의 지질은 양이온성이며 생리적 pH 아래에서 양전하를 가진다: DODAP, DODMA, DMDMA, 1,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이리놀레닐옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLenDMA).
한 구현예에서, 양이온성 지질은 아미노 지질이다. 발명에 유용한 적합한 아미노 지질로는 WO 2012/016184(그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것들을 들 수 있다. 대표적인 아미노 지질로는, 한정하는 것은 아니지만, 1,2-다이리놀레이옥시-3-(다이메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-다이리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-다이리놀레오일-3-다이메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-다이리놀레일티오-3-다이메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-다이리놀레일옥시-3-트라이메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-다이리놀레오일-3-트라이메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-다이리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 3-(N,N-다이리놀레일아미노)-1,2-프로판다이올(DLinAP), 3-(N,N-다이올레일아미노)-1,2-프로판다이올(DOAP), 1,2-다이리놀레일옥소-3-(2-N,N-다이메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 및 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[1,3]-다이옥솔란(DLin-K-DMA)을 들 수있다.
용어 "중성 지질"은 생리적 pH에서 전하를 띄지 않은 또는 중성 양쪽이온성 형태의 어느 하나로 존재하는 많은 지질 종 중 임의의 하나를 나타낸다. 대표적인 중성 지질로는 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 다이하이드로 스핑고미엘린, 세팔린, 및 세레브로사이드를 들 수 있다.
예시의 중성 지질로는, 예를 들어, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE) 및 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 다이미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)-말레이미드-PEG, 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)-말레이미드-PEG2000, 16-O-모노메틸 PE, 16-O-다이메틸 PE, 18-1-트란스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티딜에탄올 아민(SOPE), 스테아로일올레오일포스파티딜콜린(SOPC), 및 1,2-다이엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(트란스DOPE)을 들 수 있다. 한 구현예에서, 중성 지질은 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다.
일부 구현예에서, 조성물은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE, 및 SM으로부터 선택된 중성 지질을 포함한다.
"스테로이드"는 다음 탄소 골격을 포함하는 화합물이다:
Figure pct00031
.
특정 구현예에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유사체는 콜레스테롤이다. 이들 구현예 중 일부에서, 양이온성 지질의 몰비.
용어 "음이온성 지질"은 생리적 pH에서 음전하인 임의의 지질을 나타낸다. 이들 지질로는 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티드산, N-도데카노일포스파티딜에탄올아민, N-석시닐포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 연결된 다른 음이온성 변형 기를 들 수 있다.
용어 "중합체 콘쥬게이션된 지질"은 지질 부분 및 중합체 부분을 둘 다 포함하는 분자를 나타낸다. 중합체 콘쥬게이션된 지질의 예는 페길화된 지질이다. 용어 "페길화된 지질"은 지질 부분과 폴리에틸렌 글리콜 부분을 둘 다 포함하는 분자를 나타낸다. 페길화된 지질은 기술분야에 알려져 있고 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-다이미리스토일글리세롤(PEG-s- DMG) 등을 포함한다.
특정 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 폴리에틸렌 글리콜-지질(페길화된 지질)인 추가의, 안정화-지질을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌 글리콜-지질로는 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티드산, PEG-변형된 세라미드(예컨대, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형된 다이알킬아민, PEG-변형된 다이아실글리세롤, PEG-변형된 다이알킬글리세롤을 들 수 있다. 대표적인 폴리에틸렌 글리콜-지질로는 PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA, 및 PEG-s-DMG를 들 수 있다. 한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카르바밀]-1,2-다이미리스틸옥실프로필-3-아민(PEG-c-DMA)이다. 한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG)이다. 다른 구현예에서, LNP 또는 그것의 조성물은 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-다이미리스토일글리세롤(PEG-DMG)과 같은 페길화된 다이아실글리세롤(PEG-DAG), 페길화된 포스파티딜에타놀로아민(PEG-PE), 4-O-(2',3'-다이(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄다이오에이트(PEG-S-DMG)와 같은 PEG 석시네이트 다이아실글리세롤(PEG-S-DAG), 페길화된 세라미드(PEG-cer), 또는 ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-다이(테트라데칸옥시)프로필)카바메이트 또는 2,3-다이(테트라데칸옥시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트와 같은 PEG 다이알콕시프로필카바메이트를 포함한다.
특정 구현예에서, 추가 지질은 LNP 또는 그것의 조성물에 약 1 몰% 내지 약 10 몰%의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 추가 지질은 LNP 또는 그것의 조성물에 약 1 몰% 내지 약 5 몰%의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 추가 지질은 LNP 또는 그것의 조성물에 약 1 몰% 또는 약 2.5 몰%의 양으로 존재한다.
용어 "지질 나노입자"는 하나 이상의 지질, 예를 들어 식(I)-(XV)의 지질을 포함하는 적어도 하나의 나노미터 정도의 크기(예컨대, 1-1,000 nm)를 가지는 입자를 나타낸다.
다양한 구현예에서, LNP는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm의 평균 직경을 가진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 LNP는 실질적으로 무독성이다. 그러므로, 다양한 구현예에서, 본 발명의 LNP 조성물은 실질적으로 무독성이다.
다양한 구현예에서, 본원에서 기술된 LNP는 관심 있는 표적에 쉽게 수송된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에서 기술된 LNP는 관심 있는 조직에 쉽게 수송된다. 일부 구현예에서, 본원에서 기술된 LNP는 세포막을 통해 세포로 쉽게 수송된다. 일부 구현예에서, 본원에서 기술된 LNP는 세포막을 통해 세포로 효율적으로 수송된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 LNP는 세포막을 통해 세포로 향상된 효능으로 수송된다.
그러므로, 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 LNP 조성물은 관심 있는 조직에 쉽게 수송된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 LNP 조성물은 세포막을 통해 세포에 쉽게 수송된다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 LNP 조성물은 세포막을 통해 세포에 효율적으로 수송된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 LNP 조성물은 세포막을 통해 세포에 향상된 효능으로 수송된다.
다양한 측면으로, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 핵산 분자, 하나 이상의 보조제, 하나 이상의 치료제, 또는 그것들의 조합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산 분자, 하나 이상의 보조제, 하나 이상의 치료제, 또는 그것들의 조합은 식 (I)의 구조를 가지는 화합물 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산 분자, 하나 이상의 보조제, 하나 이상의 치료제, 또는 그것들의 조합은 식 (I)-(XV)의 구조를 가지는 화합물 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산 분자, 하나 이상의 보조제, 하나 이상의 치료제, 또는 그것들의 조합은 LNP로 캡슐화된다.
다양한 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 분자이다. 한 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자이다. 그러한 핵산의 예로는, 한정하는 것은 아니지만: cDNA, mRNA, miRNA, siRNA, sgRNA, 변형된 RNA, 안타고미르, 안티센스 분자, 가이드 RNA 분자, CRISPR 가이드 RNA 분자, 펩타이드, 치료 펩타이드, 표적화된 핵산, 및 그것들의 임의의 조합을 들 수 있다.
한 구현예에서, mRNA는 루시페라제를 암호화한다.
다양한 구현예에서, 핵산 분자는 치료제이다. 일부 구현예에서, 치료제는 분리된 핵산이다. 다양한 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자이다. 다양한 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 cDNA, mRNA, miRNA, siRNA, 안타고미르, 안티센스 분자, 또는 CRISPR 가이드 RNA 분자이다. 한 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 치료 펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 치료제는 표적화된 핵산을 억제하는 siRNA, miRNA, sgRNA 또는 안티센스 분자이다.
한 구현예에서, 조성물은 프로모터 또는 조절 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 핵산은 핵산이 핵산의 발현을 지시할 수 있도록 프로모터 또는 조절 서열을 포함한다. 그러므로, 한 구현예에서, 발명의 대사산물 기반 중합체 또는 중합체 입자를 포함하는 조성물은 발현 벡터를 포함하며, 발명은 관심 있는 세포 또는 조직에서 외인성 DNA의 동시 발현과 함께 외인성 DNA를 관심 있는 세포 또는 조직에 도입하는 방법을 포함한다.
한 구현예에서, 핵산 분자는 mRNA이다. 한 구현예에서, 조성물은 mRNA를 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 LNP로 캡슐화된 mRNA를 포함한다. 다양한 구현예에서, LNP로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 조성물은, 예를 들어, 증가된 안정성, 낮거나 없는 선천성 면역원성, 및 향상된 번역을 포함하여, 분리된 mRNA를 넘는 특정 장점을 가진다.
한 구현예에서, mRNA는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화한다.
한 구현예에서, RNA는 변형된 RNA이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 잔기의 0.1% 내지 100%가 변형된다. 또 다른 구현예에서, 잔기의 0.1%가 변형된다. 또 다른 구현예에서, 변형된 잔기의 분율은 0.2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 14%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 16%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 18%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 25%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 35%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 45%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 80%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 90%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 100%이다.
또 다른 구현예에서, 분율은 5% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 8% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 15% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70% 미만이다.
또 다른 구현예에서, 주어진 뉴클레오사이드의 잔기(즉, 우리딘, 시티딘, 구아노신, 또는 아데노신)의 0.1%가 변형된다. 또 다른 구현예에서, 변형된 주어진 뉴클레오타이드의 분율은 0.2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 0.8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2.5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 5%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 8%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 14%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 16%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 18%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 25%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 35%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 45%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 80%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 90%이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 100%이다.
또 다른 구현예에서, 변형된 주어진 뉴클레오타이드의 분율은 8% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 10% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 5% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 3% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 1% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 2% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 4% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 6% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 12% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 15% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 20% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 30% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 40% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 50% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 60% 미만이다. 또 다른 구현예에서, 분율은 70% 미만이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 LNP에 캡슐화된 RNA는 동일한 서열을 가진 분리된 RNA 분자보다 더 효율적으로 세포에서 번역된다. 또 다른 구현예에서, LNP에 캡슐화된 RNA는 표적 세포에 의해 번역될 향상된 능력을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 번역은 그것의 미변형 대응물에 비해 2배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 3배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 5배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 7배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 10배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 15배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 20배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 50배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 100배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 200배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 500배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 1000배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 번역은 2000배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서, 인자는 10-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 10-100배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 10-200배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 10-300배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 10-500배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 20-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 30-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 50-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 100-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 인자는 200-1000배이다. 또 다른 구현예에서, 번역은 임의의 다른 상당한 양 또는 범위의 양만큼 향상된다.
특정 구현예에서, mRNA는 어떠한 병태생리학적 경로를 활성화하지 않으며, 매우 효율적으로 및 전달 후 거의 즉시 번역되고, 생체내에서 여러 날 동안 지속되는 연속적인 단백질 생성에 대한 주형으로서 작용한다(Kariko et al., 2008, Mol Ther 16:1833-1840; Kariko et al., 2012, Mol Ther 20:948-953). 특정 경우에, LNP 내에 캡슐화된 mRNA에 의해 암호화된 항원은 분리된 mRNA에 의해 암호화된 항원과 비교하여 항원-특이적 항체 생성의 더 큰 생산을 유도한다.
한 구현예에서, 핵산 분자는 항원을 암호화한다. 한 구현예에서, 핵산 분자는 복수의 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 하나 이상의 항원을 암호화한다. 한 구현예에서, 치료제는 항원이다.
다양한 구현예에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 인플루엔자 항원, 종양 관련 항원, 종양 특이적 항원, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함한다. 한 구현예에서, 발명은 보조제를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
한 구현예에서, 항원은 핵산 분자의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 그것들의 변이체, 그것들의 단편, 또는 그것들의 조합을 포함한다. 한 구현예에서, 핵산 서열은 변형된 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서 항원-암호화 핵산 서열은 본원의 다른 곳에서 상세하게 기술된 것과 같이 RNA를 포함한다. 특정 경우에, 핵산 서열은 펩타이드 결합에 의해 항원에 연결된 링커 또는 태그 서열을 암호화하는 추가 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 핵산 분자에 의해 암호화된 항원은 임의의 수의 유기체, 예를 들어, 바이러스, 기생충, 박테리아, 진균, 또는 포유류로부터의 단백질, 펩타이드, 그것들의 단편, 또는 그것들의 변이체, 또는 그것들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 항원은 자가면역 질환, 알레르기, 또는 천식과 관련된다. 다른 구현예에서, 항원은 암, 헤르페스, 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 인간 유두종 바이러스(HPV), 에볼라, 폐렴구균, 헤모필루스 인플루엔자, 수막구균, 뎅기열, 결핵, 말라리아, 노로바이러스 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 관련된다. 특정 구현예에서, 항원은 둘 이상의 상이한 유기체의 아미노산 서열을 토대로 한 공통 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항원을 암호화하는 핵산 서열은 조성물이 전달되는 유기체에서 효과적인 번역을 위해 최적화된다.
한 구현예에서, 항원은 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원을 포함하여서, 항원은 종양에 대한 적응 면역 반응을 유도한다. 한 구현예에서, 항원은 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원의 단편을 포함하여서, 항원은 종양에 대한 적응 면역 반응을 유도한다. 특정 구현예에서, 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원은 숙주 단백질의 돌연변이 변이체이다.
그러므로, 한 구현예에서, 조성물은 항원을 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 조성물은 항원을 암호화하는 RNA를 포함한다. 항원은 한정하는 것은 아니지만, 대상체에서 적응 면역 반응을 유도하는 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단백질을 포함하여 임의의 분자 또는 화합물일 수 있다.
한 구현예에서, 항원은 병원체와 관련된 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함하여서, 항원은 항원에 대한 적응 면역 반응을 유도하고, 따라서 병원체에 대한 적응 면역 반응을 유도한다. 한 구현예에서, 항원은 병원체와 관련된 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 단편을 포함하여서, 항원은 병원체에 대한 적응 면역 반응을 유도한다.
특정 구현예에서, 항원은 본원에 기술된 항원의 아미노산 서열에 실질적으로 상동하고 원래의 아미노산 서열의 면역원성 기능을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 항원의 아미노산 서열은 원래의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 60%, 유리하게 적어도 70%, 바람직하게 적어도 85%, 및 보다 바람직하게 적어도 95% 정도의 동일성을 가진다.
바이러스 항원 - 한 구현예에서, 항원은 바이러스 항원, 또는 그것의 단편, 또는 그것의 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 바이러스 항원은 다음 패밀리 중 하나로부터의 바이러스로부터 유래된다: 아데노바이러스과(Adenoviridae), 아레나바이러스과(Arenaviridae), 부냐바이러스과(Bunyaviridae), 칼리시바이러스과(Caliciviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 파포바바이러스과(Papovaviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 파르보바이러스과(Parvoviridae), 피코르나바이러스과(Picornaviridae), 폭스바이러스과(Poxviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 레트로바이러스과(Retroviridae), 라브도바이러스과(Rhabdoviridae), 또는 토가바이러스과(Togaviridae). 특정 구현예에서, 바이러스 항원은 유두종 바이러스, 예를 들어, 인간 유두종 바이러스(HPV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 폴리오 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 두창 바이러스(바리올라 중증 및 경증), 천연두 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 리노바이러스, 뎅기열 바이러스, 말 뇌염 바이러스, 루벨라 바이러스, 황열병 바이러스, 노워크 바이러스, A형 간염 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV-I), 털세포 백혈병 바이러스(HTLV-II), 캘리포니아 뇌염 바이러스, 한타 바이러스(출혈열), 광견병 바이러스, 에볼라열 바이러스, 마버그 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 호흡기 융합 바이러스(RSV), 헤르페스 심플렉스 1(경구 헤르페스), 헤르페스 심플렉스 2(생식기 헤르페스), 대상 포진(수두-대상포진, 또는 수두), 사이토메갈로바이러스(CMV), 예를 들어 인간 CMV, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 플라비바이러스, 수족구병 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 라싸 바이러스, 아레나바이러스, 또는 암 유발 바이러스로부터 유래된다.
간염 항원 - 한 구현예에서, 항원은 간염 바이러스 항원(즉, 간염 항원), 또는 그것의 단편, 또는 그것의 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 간염 항원은 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스(HDV), 및/또는 E형 간염 바이러스(HEV)로부터의 항원 또는 면역원을 포함한다. 특정 구현예에서, 간염 항원은 전장 또는 전장 단백질의 면역원성 단편이다.
한 구현예에서, 간염 항원은 HAV로부터의 항원을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 간염 항원은 HAV 캡시드 단백질, HAV 비-구조 단백질, 그것들의 단편, 그것들의 변이체 또는 그것들의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 간염 항원은 HCV로부터의 항원을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 간염 항원은 HCV 뉴클레오캡시드 단백질(즉, 코어 단백질), HCV 엔벨로프 단백질(예컨대, E1 및 E2), HCV 비-구조 단백질(예컨대, NS1, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b), 그것들의 단편, 그것들의 변이체 또는 그것들의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 간염 항원은 HDV로부터의 항원을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 간염 항원은 HDV 델타 항원, 그것들의 단편, 또는 그것들의 변이체를 포함한다.
한 구현예에서, 간염 항원은 HEV로부터의 항원을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 간염 항원은 HEV 캡시드 단백질, 그것들의 단편, 또는 그것들의 변이체를 포함한다.
한 구현예에서, 간염 항원은 HBV로부터의 항원을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 간염 항원은 HBV 코어 단백질, HBV 표면 단백질, HBV DNA 중합효소, 유전자 X에 의해 암호화된 HBV 단백질, 그것들의 단편, 그것들의 변이체 또는 그것들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 간염 항원은 HBV 유전자형 A 코어 단백질, HBV 유전자형 B 코어 단백질, HBV 유전자형 C 코어 단백질, HBV 유전자형 D 코어 단백질, HBV 유전자형 E 코어 단백질, HBV 유전자형 F 코어 단백질, HBV 유전자형 G 코어 단백질, HBV 유전자형 H 코어 단백질, HBV 유전자형 A 표면 단백질, HBV 유전자형 B 표면 단백질, HBV 유전자형 C 표면 단백질, HBV 유전자형 D 표면 단백질, HBV 유전자형 E 표면 단백질, HBV 유전자형 F 표면 단백질, HBV 유전자형 G 표면 단백질, HBV 유전자형 H 표면 단백질, 그것들의 단편, 그것들의 변이체 또는 그것들의 조합을 포함한다.
인간 유두종 바이러스(HPV) 항원 - 한 구현예에서, 항원은 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원, 또는 그것의 단편, 또는 그것의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 항원은 자궁경부암, 직장암, 및/또는 다른 암을 유발하는 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 및 58로부터의 항원을 포함한다. 한 구현예에서, 항원은 생식기 사마귀를 유발하고, 두경부암의 원인인 것으로 알려져 있는 HPV 유형 6 및 11로부터의 항원을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, HPV 항원은 HPV E6 또는 E7 도메인, 또는 임의의 HPV 유형으로부터의 그것의 단편, 또는 변이체를 포함한다.
RSV 항원 - 한 구현예에서, 항원은 RSV 항원 또는 그것의 단편, 또는 그것의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, RSV 항원은 인간 RSV 융합 단백질(또한 본원에서 "RSV F", "RSV F 단백질" 및 "F 단백질"로도 언급됨), 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, 인간 RSV 융합 단백질은 RSV 하위유형 A와 B 사이에서 보존된다. 특정 구현예에서, RSV 항원은 RSV Long 스트레인(GenBank AAX23994.1)으로부터의 RSV F 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV A2 스트레인(GenBank AAB59858.1)으로부터의 RSV F 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, RSV 항원은 RSV F 단백질의 단량체, 다이머 또는 트라이머, 또는 그것의 단편 또는 변이체이다. 발명에 따르면, 특정 구현예에서, RSV F 단백질은 융합전 형태 또는 융합후 형태로 존재한다.
한 구현예에서, RSV 항원은 인간 RSV 부착 당단백질(또한 본원에서 "RSV G", "RSV G 단백질" 및 "G 단백질"로도 언급됨), 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 인간 RSV G 단백질은 RSV 하위유형 A와 B가 상이하다. 한 구현예에서, 항원은 RSV Long 스트레인(GenBank AAX23993)으로부터의 RSV G 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RSV 항원은: RSV 하위유형 B 분리물 H5601, RSV 하위유형 B 분리물 H1068, RSV 하위유형 B 분리물 H5598, RSV 하위유형 B 분리물 H1123으로부터의 RSV G 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다.
다른 구현예에서, RSV 항원은 인간 RSV 비-구조 단백질 1("NS1 단백질"), 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV Long 스트레인(GenBank AAX23987.1)으로부터의 RSV NS1 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV 비-구조 단백질 2("NS2 단백질"), 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV Long 스트레인(GenBank AAX23988.1)으로부터의 RSV NS2 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RSV 항원은 인간 RSV 뉴클레오캡시드("N" 단백질), 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV Long 스트레인(GenBank AAX23989.1)으로부터의 RSV N 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체이다. 한 구현예에서, RSV 항원은 인간 RSV 포스포단백질("P" 단백질), 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV Long 스트레인(GenBank AAX23990.1)으로부터의 RSV P 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RSV 항원은 인간 RSV 매트릭스 단백질("M" 단백질), 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV Long 스트레인(GenBank AAX23991.1)으로부터의 RSV M 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, RSV 항원은 인간 RSV 작은 소수성("SH") 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV Long 스트레인(GenBank AAX23992.1)으로부터의 RSV SH 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RSV 항원은 인간 RSV 매트릭스 단백질2-1("M2-1") 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV Long 스트레인(GenBank AAX23995.1)으로부터의 RSV M2-1 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV 매트릭스 단백질 2-2("M2-2") 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV Long 스트레인(GenBank AAX23997.1)으로부터의 RSV M2-2 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV 중합효소 L("L") 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, RSV 항원은 RSV Long 스트레인(GenBank AAX23996.1)으로부터의 RSV L 단백질, 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다.
인플루엔자 항원 - 한 구현예에서, 항원은 인플루엔자 항원 또는 그것들의 단편, 또는 그것들의 변이체를 포함한다. 인플루엔자 항원은 하나 이상의 인플루엔자 혈청형에 대해 포유류에서 적응 면역 반응을 유도할 수 있는 것이다. 특정 구현예에서, 항원은 전장 번역 생성물 헤마글루티닌(HA)O, 하위단위 HA1, 하위단위 HA2, 그것들의 변이체, 그것들의 단편 또는 그것들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 인플루엔자 헤마글루티닌 항원은 인플루엔자 A 혈청형 H1, 인플루엔자 A 혈청형 H2, 또는 인플루엔자 B의 하나 이상의 스트레인으로부터 유래된다.
한 구현예에서, 인플루엔자 항원은 그것에 대한 면역 반응이 유도될 수 있는 특정 인플루엔자 면역원에 대해 효과적일 수 있는 적어도 하나의 항원성 에피토프를 함유한다. 특정 구현예에서, 항원은 온전한 인플루엔자 바이러스에 존재하는 면역원성 부위 및 에피토프의 전체 레퍼토리를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 인플루엔자 항원은 H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, 또는 BHA 항원을 포함한다. 특정 구현예에서, 인플루엔자 항원은 뉴라미니다제(NA), 매트릭스 단백질, 뉴클레오단백질, M2 엑토도메인-뉴클레오-단백질(M2e-NP), 그것들의 변이체, 그것들의 단편, 또는 그것들의 조합을 포함한다.
인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원 - 한 구현예에서, 항원은 HIV 항원 또는 그것의 단편, 또는 그것의 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, HIV 항원은 엔벨로프(Env) 단백질 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, HIV 항원은 gp120, gp41, 또는 그것들의 조합으로부터 선택된 Env 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, HIV 항원은 nef, gag, pol, vif, vpr, vpu, tat, rev, 또는 그것들의 단편 또는 변이체 중 적어도 하나를 포함한다.
HIV 항원은 HIV의 임의의 스트레인으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서 HIV 항원은 HIV 그룹 M, N, O, 및 P, 및 하위유형 A, HIV 하위유형 B, HIV 하위유형 C, HIV 하위유형 D, 하위유형 E, 하위유형 F, 하위유형 G, 하위유형 H, 하위유형 J, 또는 하위유형 K로부터의 항원을 포함한다. 한 구현예에서, HIV 항원은 HIV-R3A 스트레인(R3A-Env)으로부터의 Env 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다.
기생충 항원 - 특정 구현예에서, 항원은 기생충 항원 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 기생충은 원생동물, 연충(helminth), 또는 체외기생충이다. 특정 구현예에서, 연충(즉, 벌레)은 편충(예컨대, 흡충 및 촌충), 가시머리 벌레, 또는 둥근 벌레(예컨대, 요충)이다. 특정 구현예에서, 체외기생충은 이, 벼룩, 진드기 및 응애이다.
특정 구현예에서, 기생충은 다음 질환을 유발하는 임의의 기생충이다: 가시메바 각막염(Acanthamoeba keratitis), 아메바증(Amoebiasis), 회충증(Ascariasis), 바베시아증(Babesiosis), 대장섬모충증(Balantidiasis), 아프리카너구리회충증(Baylisascariasis), 샤가스병(Chagas disease), 간흡충증(Clonorchiasis), 코클리오미아속(Cochliomyia), 크립토스포리디움증(Cryptosporidiosis), 열두조충증(Diphyllobothriasis), 메디나충증(Dracunculiasis), 포충증(Echinococcosis), 코끼리피부병(Elephantiasis), 요충증(Enterobiasis), 간질증(Fascioliasis), 비대흡충증(Fasciolopsiasis), 사상충증(Filariasis), 편모충증(Giardiasis), 악구충증(Gnathostomiasis), 막양조충증(Hymenolepiasis), 등포자충증(Isosporiasis), 카타야마열병(Katayama fever), 리슈만편모충증(Leishmaniasis), 라임병(Lyme disease), 말라리아, 요코가와흡충증(Metagonimiasis), 구더기증(Myiasis), 회선사상충증(Onchocerciasis), 이감염증(Pediculosis), 옴(Scabies), 주열흡충증(Schistosomiasis), 수면병(Sleeping sickness), 분선충증(Strongyloidiasis), 조충증(Taeniasis), 개회충증(Toxocariasis), 톡소포자충증(Toxoplasmosis), 선모충증(Trichinosis), 및 편충증(Trichuriasis).
특정 구현예에서, 기생충은 가시아메바속(Acanthamoeba), 고래회충(Anisakis), 회충(Ascaris lumbricoides), 말파리(Botfly), 대장섬모충(Balantidium coli), 베드버그(Bedbug), 조충류(조충)(Cestoda(tapeworm)), 털진드기과(Chiggers), 코클리오미아 호미니보락스(Cochliomyia hominivorax), 적리아메바(Entamoeba histolytica), 파시올라 헤파티카(Fasciola hepatica), 람블 편모충(Giardia lamblia), 구충(Hookworm), 리슈만편모충(Leishmania), 설충(Linguatula serrata), 간 흡충(Liver fluke), 로아 사상충(Loa loa), 파라고니무스속(Paragonimus) - 폐 흡충(lung fluke), 요충(Pinworm), 열대열원충(Plasmodium falciparum), 주열흡충(Schistosoma), 분선충(Strongyloides stercoralis), 응애(Mite), 조충(Tapeworm), 톡소포자충(Toxoplasma gondii), 파동편모충속(Trypanosoma), 편충(Whipworm), 또는 사상충(Wuchereria bancrofti)이다.
말라리아 항원 - 한 구현예에서, 항원은 말라리아 항원(즉, PF 항원 또는 PF 면역원), 또는 그것들의 단편, 또는 그것들의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 항원은 말라리아를 유발하는 기생충으로부터의 항원을 포함한다. 한 구현예에서, 말라리아 유발 기생충은 열대열원충이다.
일부 구현예에서, 말라리아 항원은 열대열원충 면역원 CS; LSA1; TRAP; CelTOS; 및 Ama1 중 하나 이상을 포함한다. 면역원은 전장이거나 전장 단백질의 면역원성 단편일 수 있다.
박테리아 항원 - 한 구현예에서, 항원은 박테리아 항원 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 박테리아는 다음 문(phylum) 중 어느 하나로부터 유래된다: 아키도박테리아(Acidobacteria), 악티노박테리아(Actinobacteria), 아퀴피케(Aquificae), 박테리오데스(Bacteroidetes), 칼디세리쿰균(Caldiserica), 클라미디아(Chlamydiae), 녹색유황세균(Chlorobi), 녹만균(Chloroflexi), 크리시오게네스균(Chrysiogenetes), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 탈철간균(Deferribacteres), 이상구균-서열균류(Deinococcus-Thermus), 딕티오글로무스균(Dictyoglomi), 엘루시마이크로비움균(Elusimicrobia), 피브로박테르균문(Fibrobacteres), 후벽균문(Firmicutes), 푸소박테리움균(Fusobacteria), 겜마티모나스균문(Gemmatimonadetes), 렌티스파이라문(Lentisphaerae), 니트로스피라(Nitrospira), 부유균문(Planctomycetes), 프로테아박테리아(Proteobacteria), 스피로카에테(Spirochaetes), 시네르기스테스균(Synergistetes), 테네리쿠테스(Tenericutes), 열탈유간균문(Thermodesulfobacteria), 열포균(Thermotogae), 및 우미균(Verrucomicrobia).
특정 구현예에서, 박테리아는 그람 양성균 또는 그람 음성균이다. 특정 구현예에서, 박테리아는 호기성 박테리아 또는 혐기성 박테리아이다. 특정 구현예에서, 박테리아는 독립영양 박테리아 또는 종속영양 박테리아이다. 특정 구현예에서, 박테리아는 중온성(mesophile), 호중성, 극한성, 호산성, 호알칼리성, 호열성, 저온친화성, 호염성, 또는 호삼투성이다.
특정 구현예에서, 박테리아는 탄저균(anthrax bacterium), 항생물질 내성 박테리아, 질환 유발 박테리아, 식중독균, 감염성 박테리아, 살모넬라균, 포도상 구균 박테리아, 연쇄상 구균 박테리아, 또는 파상풍 박테리아이다. 특정 구현예에서, 박테리아는 마이코박테리아(mycobacteria), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 탄저균(Bacillus anthracis), 메티실린 내성 황색 포도구균(MRSA) 또는 클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile)이다.
결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 항원 - 한 구현예에서, 항원은 결핵균 항원(즉, TB 항원 또는 TB 면역원), 또는 그것의 단편, 또는 그것의 변이체를 포함한다. TB 항원은 TB 항원의 Ag85 패밀리, 예를 들어, Ag85A 및 Ag85B로부터 유래될 수 있다. TB 항원은 TB 항원의 Esx 패밀리, 예를 들어, EsxA, EsxB, EsxC, EsxD, EsxE, EsxF, EsxH, EsxO, EsxQ, EsxR, EsxS, EsxT, EsxU, EsxV, 및 EsxW로부터 유래될 수 있다.
진균 항원 - 한 구현예에서, 항원은 진균 항원 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, 진균은 아스페르길루스 종(Aspergillus species), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 효모(Candida yeasts)(예컨대, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)), 콕시디오이데스속(Coccidioides), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티(Cryptococcus gattii), 더마토파이트(dermatophyte), 푸사리움 종(Fusarium species), 히스토플라스마 캅슐라툼(Histoplasma capsulatum), 털곰팡이아문(Mucoromycotina), 주폐포자충(Pneumocystis jirovecii), 스포로트릭스 첸키아이(Sporothrix schenckii), 엑세로킬룸(Exserohilum), 또는 클라도스포리움(Cladosporium)이다.
종양 항원 - 특정 구현예에서, 항원은 예를 들어 종양 관련 항원 또는 종양 특이적 항원을 포함하여 종양 항원을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, "종양 항원" 또는 "과증식성 장애 항원" 또는 "과증식성 장애와 관련된 항원"은 특정 과증식성 장애에 공통되는 항원을 나타낸다. 특정 측면으로, 본 발명의 과증식성 장애 항원은, 한정하는 것은 아니지만, 원발성 또는 전이성 흑색종, 중피종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암 및 유방암과 같은 선암종, 전립선암, 난소암, 췌장암, 등을 포함한 암으로부터 유래된다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T 세포 매개 면역 반응을 유도하는 종양 세포에 의해 생성된 단백질이다. 한 구현예에서, 본 발명의 종양 항원은 포유류의 암 종양으로부터 유래된 종양 침윤 림프구(TIL)에 의해 면역원적으로 인식되는 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 항원의 선택은 발명의 조성물에 의해 치료되거나 예방될 암의 특정 유형에 따라 좌우될 것이다.
종양 항원은 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 신경교종-관련 항원, 암성배아 항원(CEA), β-인간 융모막 성선자극 호르몬, 알파피토단백질(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글루불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장의 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제(prostase), 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인(prostein), PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase), 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린(mesothelin)을 들 수 있다.
한 구현예에서, 종양 항원은 악성 종양과 관련된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격을 위한 표적 항원으로서 작용할 수 있는 많은 단백질을 발현한다. 이들 분자로는 한정하는 것은 아니지만 흑색종에서 MART-1, 티로시나제 및 GP 100과 같은 조직-특이적 항원 및 전립선 암에서 전립선 산 포스파타제(PAP) 및 전립선-특이적 항원(PSA)을 들 수 있다. 다른 표적 분자가 종양유전자 HER-2/Neu/ErbB-2와 같은 형질전환-관련 분자 그룹에 속한다. 또 다른 그룹의 표적 항원은 암성배아 항원(CEA)과 같은 종양-태아 항원이다. B-세포 림프종에서 종양-특이적 이디오타입 면역글로불린은 개별 종양에 독특한 진정한 종양-특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. CD19, CD20 및 CD37과 같은 B-세포 분화 항원은 B-세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보이다. 이들 항원 중 일부(CEA, HER-2, CD19, CD20, 이디오타입)가 단클론성 항체를 사용한 수동 면역요법을 위한 표적으로서 제한된 성공으로 사용되었다.
발명에 대해 언급된 종양 항원의 유형은 또한 종양 특이적 항원(TSA) 또는 종양 관련 항원(TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 독특하며 신체의 다른 세포 상에서는 발생하지 않는다. TAA 관련 항원은 종양 세포에 독특하지 않으며 대신 또한 항원에 대한 면역학적 내성 상태를 유도하지 못하는 조건 하에서 정상 세포에서도 발현된다. 종양에서 항원의 발현은 면역 시스템이 항원에 대해 반응하는 것을 가능하게 하는 조건 하에서 일어날 수 있다. TAA는 면역 체계가 미성숙하고 반응할 수 없을 때 태아 발달 중에 정상 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있거나 또는 그것은 정상 세포 상에서는 매우 낮은 수준으로 정상적으로 존재하지만 종양 세포 상에서는 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비제한적인 예로는 다음을 들 수 있다: MART-1/MelanA(MART-I)와 같은 분화 항원, gp100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15와 같은 종양-특이적 다중계통 항원; CEA와 같은 과다발현된 배아 항원; p53, Ras, HER-2/neu와 같은 과다발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제 유전자; 염색체 전좌로부터 발생된 독특한 종양 항원; 예컨대 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA 및 인간 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 큰, 단백질-기반 항원으로는 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-피토단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS를 들 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항원은 한정하는 것은 아니지만 CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, MY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, 등을 포함한다.
특정 구현예에서, 핵산 분자는 항원에 대한 적응 면역 반응을 유도하는 항원을 암호화한다. 특정 구현예에서, 치료제는 항원에 대한 적응 면역 반응을 유도하는 항원이다.
본원에서 기술되는 항원 또는 보조제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 대안으로, 결과적으로 생성된 폴리뉴클레오타이드가 발명에 따르는 폴리펩타이드를 암호화하는 조건으로, 원래의 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 서열 변이, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 범주는 본원에 인용된 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상동하고 관심 있는 항원 또는 보조제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 뉴클레오타이드 서열은 그것의 뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 적어도 60%, 유리하게 적어도 70%, 바람직하게 적어도 85%, 및 보다 바람직하게 적어도 95% 정도의 동일성을 가질 때 본원에 기술된 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 것에 대해 "실질적으로 동일"하다. 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 실질적으로 상동하는 뉴클레오타이드 서열은 전형적으로 뉴클레오타이드 서열에 함유된 정보를 토대로, 예를 들어 보존성 또는 비-보존성 치환을 도입함으로써 항원의 생산 유기체로부터 분리될 수 있다. 가능한 변형의 다른 예로는 서열에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 서열의 임의의 단부에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 첨가, 또는 서열의 임의의 단부 또는 내부에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 들 수 있다. 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 동일성 정도는 컴퓨터 알고리즘 및 기술분야의 숙련된 사람들에게 널리 알려져 있는 방법을 사용하여 측정된다.
한 구현예에서, 발명은 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 구성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 구성물은 복수의 항원을 암호화하는 복수의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 구성물은 1개 이상, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 항원을 암호화한다. 한 구현예에서, 발명은 보조제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 구성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 구성물은 항원을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 보조제를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 각각이 하나 이상의 항원을 암호화하는 복수의 구성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 1개 이상, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 구성물을 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 구성물; 및 보조제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 구성물을 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 구성물은 번역 제어 요소에 작동 가능하게 결합된다. 구성물은 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위해 작동 가능하게 결합된 조절 서열을 통합하고, 그로써 발현 카세트를 형성할 수 있다.
한 구현예에서, 발명의 조성물은 시험관내 전사된(IVT) RNA를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 발명의 조성물은 항원을 암호화하는 IVT RNA를 포함하며, 이때 항원은 적응 면역 반응을 유도한다. 특정 구현예에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 종양 특이적 항원, 또는 종양 관련 항원 중 적어도 하나이다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 항원 또는 항원들의 조합에 제한되지 않는다.
예를 들어, 한 구현예에서, 조성물은 LNP로 캡슐화된 항원-암호화 핵산 분자를 포함한다. 특정 경우에, LNP는 핵산 분자의 세포 흡수를 향상시킨다.
한 측면으로, 핵산 분자는 항원을 암호화하는 IVT RNA이다. 그러므로, 한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항원을 암호화하는 IVT RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 발명의 조성물은 복수의 항원을 암호화하는 IVT RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 발명의 조성물은 보조제를 암호화하는 IVT RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 발명의 조성물은 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 보조제를 암호화하는 IVT RNA를 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 보조제를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 그러므로, 한 구현예에서, 조성물은 보조제를 포함한다. 한 구현예에서, 보조제-암호화 핵산 분자는 IVT RNA이다. 한 구현예에서, 보조제-암호화 핵산 분자는 RNA이다.
예시의 보조제로는, 한정하는 것은 아니지만, 신호 서열이 결실된 IL-15 및 선택적으로 IgE로부터의 신호 펩타이드를 포함하여 알파 인터페론, 감마 인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선-발현 케모카인(TECK), 점막-관련 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86을 들 수 있다. 유용한 보조제일 수 있는 다른 유전자로는 다음을 암호화하는 것들을 들 수 있다: MCP-I, MIP-Ia, MIP-Ip, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-I, VLA-I, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-I, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Fit, Apo-1, p55, WSL-I, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-I, Ap-I, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-I, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP 1, TAP2, 항-CTLA4-sc, 항-LAG3-Ig, 항-TIM3-Ig 및 그것들의 기능성 단편.
일부 구현예에서, 조성물은 양이온성 지질 및 중성 지질, 대전된 지질, 스테로이드 및 중합체 콘쥬게이션된 지질(예컨대, 페길화된 지질)로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 지질 나노입자의 지질 부분에 또는 지질 나노입자의 지질의 일부 또는 전부에 의해 감싸진 수성 공간에 캡슐화됨으로써, 그것을 효소적 분해 또는 숙주 유기체 또는 세포의 메커니즘, 예컨대 역면역 반응에 의해 유도된 다른 바람직하지 못한 효과로부터 보호한다.
한 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 양이온성 지질, 및 하나 이상의 안정화 지질을 포함한다. 안정화 지질은 중성 지질 및 페길화된 지질을 포함한다.
한 구현예에서, 조성물은 양이온성 지질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "양이온성 지질"은 pH가 지질의 이온화 가능한 기의 pK 아래로 저하됨에 따라 양이온성이거나 양이온성이 되지만(양성자화), 높은 pH 값에서 점진적으로 보다 중성이 되는 지질을 나타낸다. 그러면 지질은 pK보다 아래의 pH 값에서, 음전하 핵산과 회합할 수 있다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 pH 감소에 대해 양전하를 띄는 양쪽이온성 지질을 포함한다.
특정 구현예에서, 양이온성 지질은 선택적 pH, 예컨대 생리적 pH에서 순 양전하를 운반하는 많은 지질 종 중 임의의 것을 포함한다. 그러한 지질로는, 한정하는 것은 아니지만, N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드(DODAC); N-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드(DDAB); N-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTAP); 3-(N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤(DC-Chol), N-(1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N-2-(스퍼민카르복사미도)에틸)-N,N-다이메틸암모늄 트라이플루오르아세테이트(DOSPA), 다이옥타데실아미도글리실 카르복시스퍼민(DOGS), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄 프로판(DODAP), N,N-다이메틸-2,3-다이올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N-(1,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE)를 들 수 있다. 추가적으로, 본 발명에 사용될 수 있는 양이온성 지질의 많은 상업적 제제가 활용 가능하다. 이것들로는, 예를 들어, LIPOFECTIN®(GIBCO/BRL(Grand Island, N.Y.)사로부터의, DOTMA 및 1,2-다이올레오일-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 리포솜); 리포펙타민®(GIBCO/BRL사로부터의, N-(1-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N-(2-(스퍼민카르복사미도)에틸)-N,N-다이메틸암모늄 트라이플루오로아세테이트(DOSPA) 및(DOPE)를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 리포솜); 및 TRANSFECTAM®(Promega Corp.(Madison, Wis.)사로부터의, 에탄올에 다이옥타데실아미도글리실 카르복시스퍼민(DOGS)을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 양이온성 지질)을 들 수 있다. 다음의 지질은 양이온성이며 생리적 pH 아래에서 양전하를 가진다: DODAP, DODMA, DMDMA, 1,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이리놀레닐옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLenDMA).
한 구현예에서, 양이온성 지질은 아미노 지질이다. 발명에 유용한 적합한 아미노 지질로는 WO 2012/016184(그 전문이 참조로 본원에 포함된)에서 기술된 것들을 들 수 있다. 대표적인 아미노 지질로는, 한정하는 것은 아니지만, 1,2-다이리놀레이옥시-3-(다이메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-다이리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-다이리놀레오일-3-다이메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-다이리놀레일티오-3-다이메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-다이리놀레일옥시-3-트라이메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-다이리놀레오일-3-트라이메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-다이리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 3-(N,N-다이리놀레일아미노)-1,2-프로판다이올(DLinAP), 3-(N,N-다이올레일아미노)-1,2-프로판다이올(DOAP), 1,2-다이리놀레일옥소-3-(2-N,N-다이메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 및 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[1,3]-다이옥솔란(DLin-K-DMA)을 들 수 있다.
특정 구현예에서, 양이온성 지질은 조성물에 약 30 내지 약 95 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 조성물에 약 30 내지 약 70 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 조성물에 약 40 내지 약 60 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 양이온성 지질은 조성물에 약 50 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 조성물은 양이온성 지질만을 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 입자의 형성 중에 입자의 형성을 안정화시키는 하나 이상의 추가 지질을 포함한다. 적합한 안정화 지질로는 중성 지질 및 음이온성 지질을 들 수 있다.
용어 "중성 지질"은 생리적 pH에서 전하를 띠지 않거나 중성인 양쪽이온성 형태로 존재하는 많은 지질 종 중 임의의 하나를 나타낸다. 대표적인 중성 지질로는 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 다이하이드로 스핑고미엘린, 세팔린, 및 세레브로사이드를 들 수 있다.
예시의 중성 지질로는, 예를 들어, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE) 및 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 다이미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)-말레이미드-PEG, 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE)-말레이미드-PEG2000, 16-O-모노메틸 PE, 16-O-다이메틸 PE, 18-1-트란스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티딜에탄올 아민(SOPE), 스테아로일올레오일포스파티딜콜린(SOPC), 및 1,2-다이엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(트란스DOPE) 및 SM을 들 수 있다. 한 구현예에서, 중성 지질은 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다.
일부 구현예에서, 조성물은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로부터 선택된 중성 지질을 포함한다.
다양한 구현예에서, 조성물은 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 추가로 포함한다. "스테로이드"는 다음 탄소 골격을 포함하는 화합물이다:
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특정 구현예에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유사체는 콜레스테롤이다. 이들 구체예 중 일부에서, 양이온성 지질의 몰비.
용어 "음이온성 지질"은 생리적 pH에서 음전하인 임의의 지질을 나타낸다. 이들 지질로는 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티드산, N-도데카노일포스파티딜에탄올아민, N-석시닐포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 연결된 다른 음이온성 변형 기를 들 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물은 당지질(예컨대, 모노시알로강글리오시드 GM1)을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 중합체 콘쥬게이션된 지질을 포함한다. 용어 "중합체 콘쥬게이션된 지질"은 지질 부분과 중합체 부분을 모두 포함하는 분자를 나타낸다. 중합체 콘쥬게이션된 지질의 예는 페길화된 지질이다. 용어 "페길화된 지질"은 지질 부분과 폴리에틸렌 글리콜 부분을 모두 포함하는 분자를 나타낸다. 페길화된 지질은 기술분야에 알려져 있고 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-다이미리스토일글리세롤(PEG-s- DMG) 등을 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 폴리에틸렌 글리콜-지질(페길화된 지질)인 추가의, 안정화-지질을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌 글리콜-지질로는 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티드산, PEG-변형된 세라미드(예컨대, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형된 다이알킬아민, PEG-변형된 다이아실글리세롤, PEG-변형된 다이알킬글리세롤을 들 수 있다. 대표적인 폴리에틸렌 글리콜-지질로는 PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA, 및 PEG-s-DMG를 들 수 있다. 한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카르바밀]-1,2-다이미리스틸록실프로필-3-아민(PEG-c-DMA)이다. 한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG)이다. 다른 구현예에서, LNP는 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-다이미리스토일글리세롤(PEG-DMG)과 같은 페길화된 다이아실글리세롤(PEG-DAG), 페길화된 포스파티딜에타놀로아민(PEG-PE), 4-O-(2',3'-다이(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄다이오에이트(PEG-S-DMG)와 같은 PEG 석시네이트 다이아실글리세롤(PEG-S-DAG), 페길화된 세라미드(PEG-cer), 또는 ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-다이(테트라데칸옥시)프로필)카바메이트 또는 2,3-다이(테트라데칸옥시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트와 같은 PEG 다이알콕시프로필카바메이트를 포함한다. 다양한 구현예에서, 양이온성 지질의 페길화된 지질에 대한 몰비는 약 100:1 내지 약 25:1의 범위이다.
특정 구현예에서, 추가 지질은 LNP에 약 1 내지 약 10 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 추가 지질은 LNP에 약 1 내지 약 5 몰 퍼센트의 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 추가 지질은 LNP에 약 1 몰 퍼센트 또는 약 1.5 몰 퍼센트로 존재한다.
특정 구현예에서, 핵산 분자는, 지질 나노입자에 존재할 때, 수용액에서 뉴클레아제로의 분해에 대해 내성이다.
다양한 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 트랜스펙션 시약을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 지질-기반 트랜스펙션 시약이다. 또 다른 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 단백질-기반 트랜스펙션 시약이다. 또 다른 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 폴리에틸렌이민 기반 트랜스펙션 시약이다. 또 다른 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 칼슘 포스페이트이다. 또 다른 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 Lipofectin®, 리포펙타민®, 또는 TransIT®이다. 또 다른 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 트랜스펙션 시약이다.
또 다른 구현예에서, 트랜스펙션 시약이 리포솜을 형성한다. 리포솜은, 또 다른 구현예에서, 세포내 안정성을 증가시키고, 흡수 효율을 증가시키며 생물학적 활성을 개선시킨다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 세포막을 구성하는 지질과 유사한 양식으로 배열된 지질로 구성된 중공 구형 소포이다. 또 다른 구현예에서, 그것은 수용성 화합물을 포획하기 위한 내부 수성 공간을 가지며 직경이 0.05 내지 수 마이크론의 크기 범위를 가진다. 또 다른 구현예에서, 리포솜은 생물학적 활성 형태로 RNA를 세포에 전달할 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 핵산 분자가 부착되거나, 하나 이상의 핵산 분자가 캡슐화되어 있는 입자를 형성할 수 있는 임의의 지질을 포함할 수 있다. 용어 "지질"은 지방산(예컨대, 에스테르)의 유도체이고 일반적으로 물에는 불용성이지만 많은 유기 용매에 용해될 수 있는 것을 특징으로 하는 유기 화합물 군을 나타낸다. 지질은 일반적으로 적어도 3개 부류: (1) 지방 및 오일뿐만 아니라 왁스를 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "합성 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질"로 나누어진다.
특정 구현예에서, 조성물은 LNP를 관심 있는 세포, 세포 집단, 조직, 또는 그것들의 임의의 조합에 표적화할 수 있는 하나 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 표적화 모이어티는 LNP를 세포 표면에서 발견되는 수용체로 향하게 하는 리간드이다.
특정 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 내부화 도메인을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 조성물은 LNP의 내부화를 유도하기 위해 세포에 결합하는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 하나 이상의 내부화 도메인은 세포 표면 상에서 발견되는 수용체에 결합하여 LNP의 수용체-매개 흡수를 유도한다. 특정 구현예에서, LNP는 생체내에서 생체분자와 결합할 수 있으며, 여기서 LNP-결합 생체분자는 그런 후 세포-표면 수용체에 의해 인식되어 내부화를 유도할 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, LNP는 전신성 ApoE와 결합하고, LNP 및 관련된 운반물(예컨대, 하나 이상의 핵산 분자, 하나 이상의 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합)의 흡수를 유발한다.
RNA는 합성에 의해 생성된 플라스미드 DNA 주형을 사용하여 시험관내 번역에 의해 생성된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 있는 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 중합효소를 사용하여 PCR에 의해 직접 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 전환될 수 있다. DNA의 공급원은, 예를 들어, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 DNA의 임의의 다른 적절한 공급원일 수 있다. 한 구현예에서, 시험관내 전사를 위한 원하는 주형은, 예를 들어 본원의 다른 곳에서 기술된 병원체 또는 종양과 관련된 항원을 포함하여, 적응 면역 반응을 유도할 수 있는 항원이다. 한 구현예에서, 시험관내 전사를 위한 원하는 주형은 적응 면역 반응을 향상시킬 수 있는 보조제이다.
한 구현예에서, PCR을 위해 사용될 DNA는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터의 자연적으로 발생하는 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 한 구현예에서, DNA는 유전자의 일부의 관심 있는 전장 유전자이다. 유전자는 5' 및/또는 3' 미번역 영역(UTR)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 유전자는 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, PCR을 위해 사용될 DNA는 인간 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR을 위해 사용될 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR을 위해 사용될 DNA는 박테리아, 바이러스, 기생충, 및 진균을 포함하여, 병원성 또는 공생 유기체로부터의 유전자이다. 또 다른 구현예에서, PCR을 위해 사용될 DNA는 박테리아, 바이러스, 기생충, 및 진균을 포함하여, 병원성 또는 공생 유기체로부터 유래되며, 5' 및 3' UTR을 포함한다. DNA는 대안으로 정상적으로는 자연적으로 발생하는 유기체에서 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시의 인공 DNA 서열은 융합 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 형성하기 위해 함께 결찰되는 유전자의 부분을 함유하는 것이다. 함께 결찰되는 DNA 부분은 단일 유기체로부터 유래되거나 하나 이상의 유기체로부터 유래될 수 있다.
PCR을 위한 DNA의 공급원으로서 사용될 수 있는 유전자로는 유기체에서 적응 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 들 수 있다. 바람직한 유전자는 단기 치료에 유용한 유전자, 또는 투여량 또는 발현된 유전자와 관련하여 안전성 문제가 있는 유전자이다.
다양한 구현예에서, 플라스미드가 트랜스펙션에 사용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 사용된다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력이 있는 화학적 구조가 또한 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게 5' 및 3' UTR을 가진다. 한 구현예에서, 5' UTR은 0 내지 3000개 뉴클레오타이드의 길이이다. 코딩 영역에 첨가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는, 한정하는 것은 아니지만, UTR의 상이한 영역에 어닐링되는 PCR을 위한 프라이머를 설계하는 것을 포함한, 상이한 방법에 의해 달라질 수 있다. 이런 접근법을 사용하여, 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람은 전사된 RNA의 트랜스펙션 후에 최적 번역 효율을 달성하기 위해 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 있는 유전자에 대한 자연적으로 발생하는, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안으로, 관심 있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열이 전방향 및 역방향 프라이머에 UTR 서열을 통합시킴으로써 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 첨가될 수 있다. 관심 있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형시키는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열에서 AU-풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다. 그러므로, 3' UTR은 기술분야에 잘 알려져 있는 UTR의 특성을 토대로 전사된 RNA의 안정성을 증가시키기 위해 선택되거나 설계될 수 있다.
한 구현예에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 Kozak 서열을 함유할 수 있다. 대안으로, 관심 있는 유전자에 대해 내인성이 아닌 5' UTR이 위에서 기술된 것처럼 PCR에 의해 첨가되는 경우, 공통 Kozak 서열이 5' UTR 서열을 첨가함으로써 다시 설계될 수 있다. Kozak 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 모든 RNA에 필요한 것으로 나타나지 않는다. 많은 mRNA의 경우 Kozak 서열에 대한 필요성은 기술분야에 알려져 있다. 다른 구현예에서 5' UTR은 그것의 RNA 게놈이 세포에서 안정적인 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서 다양한 뉴클레오타이드 유사체가 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해 3' 또는 5' UTR에 사용될 수 있다.
유전자 클로닝에 대한 필요성 없이 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위하여, 전사의 프로모터가 전사될 서열의 상류의 DNA 주형에 부착되어야 한다. RNA 중합효소를 위한 프로모터로서 기능하는 서열이 전방향 프라이머의 5' 단부에 첨가되는 경우, RNA 중합효소 프로모터는 전사될 오픈 리딩 프레임의 상류의 PCR 생성물에 통합된다. 한 바람직한 구현예에서, 프로모터는 본원의 다른 곳에서 기술되는 것과 같이 T7 RNA 중합효소 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터로, 한정하는 것은 아니지만, T3 및 SP6 RNA 중합효소 프로모터를 들 수 있다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오타이드 서열은 기술분야에 알려져 있다.
바람직한 구현예에서, mRNA는 리보솜 결합, 번역의 개시 및 세포에서 mRNA의 안정성을 결정하는 5' 단부 및 3' 폴리(A) 꼬리 상의 두 캡을 가진다. 원형 DNA 주형 상에서, 예를 들어, 플라스미드 DNA, RNA 중합효소는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 연쇄체 생성물을 생성한다. 3' UTR의 단부에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후에 폴리아데닐화될 때 진핵 트랜스펙션에서 효과적인 정상적인 크기의 mRNA를 초래한다.
선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 중합효소는 전사체의 3' 단부를 주형의 마지막 염기를 지나 연장시킬 수 있다(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36(1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65(2003).
폴리A/T 구간을 DNA 주형에 통합시키는 종래 방법은 분자 클로닝이다. 그러나 플라스미드 DNA에 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있고, 그것은 플라스미드 증식을 위해 재조합 무능 박테리아 세포의 사용을 통해 개선될 수 있다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 폴리(A) 중합효소, 예컨대 대장균 폴리A 중합효소(E-PAP) 또는 효모 폴리A 중합효소의 사용으로 시험관내 전사 후에 추가로 연장될 수 있다. 한 구현예에서, 폴리(A) 꼬리의 길이를 100개 뉴클레오타이드부터 300 내지 400개 뉴클레오타이드로 증가시키면 RNA의 번역 효율에서 약 2배 증가를 초래할 수 있다. 추가적으로, 상이한 화학적 기의 3' 단부에의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 그러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오타이드, 압타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 중합효소를 사용하여 폴리(A) 꼬리에 통합될 수 있다. ATP 유사체는 추가로 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다.
5' 캡은 또한 mRNA 분자에 안정성을 제공할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 방법에 의해 생성된 RNA는 5' cap1 구조를 포함한다. 그러한 cap1 구조는 천연두 캡핑 효소 및 2'-O-메틸 트랜스퍼라제 효소(CellScript, Madison, WI)를 사용하여 생성될 수 있다. 대안으로, 5' 캡은 기술분야에 알려져 있고 본원에서 기술된 기법을 사용하여 제공된다(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444(2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95(2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966(2005)).
항원 또는 보조제를 코딩하는 핵산 서열은 기술분야에 알려져 있는 재조합 방법을 사용하여, 예를 들어 표준 기법을 사용하여, 유전자를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝함으로써, 그것을 포함하는 것으로 알려져 있는 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 그것을 함유한 세포 및 조직으로부터 직접 분리함으로써 얻어질 수 있다. 대안으로, 관심 있는 유전자는 합성에 의해 생성될 수 있다.
핵산은 많은 유형의 벡터로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은, 한정하는 것은 아니지만 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함한 벡터에 클로닝될 수 있다. 특히 관심 있는 벡터로는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 서열분석 벡터 및 시험관내 전사에 최적화된 벡터를 들 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단으로는 콜로이드 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 수중유 에멀션, 미셸, 혼합 미셸, 및 리포솜을 포함한 지질-기반 시스템을 들 수 있다. 시험관내에서 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시의 콜로이드 시스템은 리포솜(예컨대, 인공 막 소포)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시의 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제형의 사용은 숙주 세포에 핵산을 도입하기 위해 고려된다(시험관내, 생체외 또는 생체내). 또 다른 측면으로, 핵산은 지질과 관련될 수 있다. 지질과 관련된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오타이드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜에 포획되거나, 리포솜과 복합체를 형성하거나, 지질을 함유한 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중에 현탁액으로서 함유되거나, 미셸에 함유되거나 복합체를 형성하거나, 또는 그렇지 않으면 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/RNA 또는 지질/발현 벡터 관련된 조성물은 용액 중에 임의의 특정 구조로 한정되지 않는다. 예를 들어, 그것은 이중층 구조로 존재하거나, 미셸로서 존재하거나, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 그것은 또한 단순히 용액에 산재되어, 크기나 모양이 균일하기 않은 응집체를 형성할 가능성이 있을 수 있다. 지질은 자연적으로 발생하거나 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 그것의 유도체, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급처로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 다이미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 Sigma(St. Louis, MO)사로부터 얻어질 수 있고; 다이세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(Plainview, NY)사로부터 얻어질 수 있으며; 콜레스테롤("Chol")은 Calbiochem-Behring사로부터 얻어질 수 있고; 다이미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 기타 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)사로부터 얻어질 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 보관될 수 있다. 클로로포름은 그것이 메탄올보다 쉽게 증발되기 때문에 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 폐쇄된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막과 내부 수성 매질이 있는 소포 구조를 가지는 것으로 특징지어질 수 있다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 가진다. 그것은 인지질이 과잉 수성 용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 구성요소는 폐쇄된 구조가 형성되기 전에 자체 재배열을 진행하고 물을 포획하여 지질 이중층 사이에서 용질을 용해시킨다(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상적인 소포 구조와 용액에서 상이한 구조를 가지는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셸 구조를 취하거나 단순히 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재한다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
LNP 백신
발명의 한 측면으로, 본원에 기술된 조성물은 백신이다. 백신으로서 유용한 조성물의 경우, 조성물은 세포, 조직, 또는 포유류(예컨대, 인간)에서 항원에 대한 적응 면역 반응을 유도해야 한다. 특정 경우에, 백신은 포유류에서 보호 면역 반응을 유도한다. 본원에서 사용되는 바, "면역원성 조성물"은 항원(예컨대, 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 항원을 암호화하는 핵산, 항원 또는 세포 구성요소를 발현하거나 제공하는 세포, 또는 그것들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 조성물은 본원에 기술된 임의의 펩타이드 항원의 전부 또는 일부, 또는 그것의 면역원적으로 기능성인 동등물을 포함하거나 암호화된다. 다른 구현예에서, 조성물은 추가적인 면역조절제 또는 그러한 작용제를 암호화하는 핵산을 포함하는 혼합물이다. 면역조절제로는 한정하는 것은 아니지만 추가 항원, 면역조절제, 항원 제공 세포 또는 보조제를 들 수 있다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 추가 작용제(들)이, 임의의 조합으로 항원 또는 면역조절제에 공유 결합된다. 특정 구현예에서, 항원성 조성물은 HLA 앵커 모티프 아미노산에 콘쥬게이션되거나 그것을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "백신"은 동물에 접종될 때 면역을 유도하는 물질을 나타낸다.
본 발명의 백신은 핵산 및/또는 세포 구성요소의 조성이 다를 수 있다. 비제한적인 예에서, 항원을 암호화하는 핵산은 또한 보조제와 함께 제형화될 것이다. 물론, 본원에 기술된 다양한 조성물은 추가로 추가 구성요소를 포함할 수 있는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 백신 구성요소가 지질, 리포솜, 또는 지질 나노입자에 포함될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 백신은 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명의 백신, 및 그것의 다양한 구성요소는 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 또는 본 개시의 측면에서 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 알려져 있는 것과 같이 제조 및/또는 투여될 수 있다.
항원의 발현에 의한 면역의 유도는 생체내에서 또는 시험관내에서 항원에 대한 숙주의 면역 체계의 전부 또는 임의의 일부분의 반응을 관찰함으로써 검출될 수 있다.
예를 들어, 세포독성 T 림프구의 유도를 검출하는 방법이 잘 알려져 있다. 살아있는 신체에 진입하는 외래 물질은 APC의 작용에 의해 T 세포 및 B 세포에 제공된다. 항원 특이적 방식으로 APC에 의해 제공된 항원에 반응하는 T 세포는 항원에 의한 자극으로 인해 세포독성 T 세포(또한 세포독성 T 림프구 또는 CTL로도 언급됨)로 분화한다. 이들 항원 자극된 세포는 그런 후 증식한다. 이 과정은 본원에서 T 세포의 "활성화"로서 언급된다. 그러므로, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 그것들의 조합의 에피토프에 의한 CTL 유도는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 그것들의 조합의 에피토프를 APC에 의해 T 세포에 제공하고, CTL의 유도를 검출함으로써 평가될 수 있다. 나아가, APC는 B 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 대식세포, 호산성 세포 및 NK 세포를 활성화하는 효과를 가지고 있다.
APC로서 수지상 세포(DC)를 사용하여 CTL의 유도 작용을 평가하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. DC는 APC들 중에서 강력한 CTL 유도 작용을 가지는 대표적인 APC이다. 발명의 방법에서, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 그것들의 조합의 에피토프는 초기에 DC에 의해 발현된 후 이 DC가 T 세포와 접촉된다. DC와 접촉된 후 관심 있는 세포에 대해 세포독성 효과를 가지는 T 세포의 검출은 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 그것들의 조합의 에피토프가 세포독성 T 세포를 유도하는 활성을 가지고 있음을 보여준다. 나아가, 유도된 면역 반응은 또한 고정된 펩타이드 또는 펩타이드의 조합을 운반하는 항원 제공 세포의 존재 하에 CTL에 의해 생성되고 방출된 IFN-감마를 항-IFN-감마 항체를 사용하여 시각화함으로써, 예컨대 ELISPOT 검정에 의해 측정함으로써 조사될 수 있다.
DC와 별도로, 말초혈 단핵 세포(PBMC)가 또한 APC로서 사용될 수 있다. CTL의 유도는 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 PBMC를 배양함으로써 향상되는 것으로 보고된다. 유사하게, CTL은 키호울 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 IL-7의 존재 하에 PBMC를 배양함으로써 유도되는 것으로 나타났다.
이들 방법에 의해 CTL-유도 활성을 가진 것으로 확인된 항원은 DC 활성화 효과 및 후속되는 CTL-유도 활성을 가지는 항원이다. 나아가, APC에 의한 항원의 제공으로 인해 획득된 세포독성을 가지는 CTL은 또한 항원-관련 장애에 대한 백신으로서 사용될 수 있다.
항원의 발현에 의한 면역의 유도는 항원에 대한 항체 생성의 유도를 관찰함으로써 추가로 확인될 수 있다. 예를 들어, 항원에 대한 항체가 항원을 암호화하는 조성물로 면역화된 실험실 동물에서 유도될 때, 그리고 항원 관련 병리가 그런 항체에 의해 억제되는 경우, 조성물은 면역을 유도하는 것으로 측정된다.
항원의 발현에 의한 면역의 유도는 CD4+ T 세포의 유도를 관찰함으로써 추가로 확인될 수 있다. CD4+ T 세포는 또한 표적 세포를 용해하지만, 주로 CTL 및 항체 생성을 포함하여 다른 유형의 면역 반응의 유도에 도움을 준다. CD4+ T 세포 도움의 유형은 Th1, Th2, Th9, Th17, T조절, 또는 T 여포 헬퍼(Tfh) 세포로서 특징지어질 수 있다. CD4+ T 세포 공급의 각각의 하위유형은 특정 유형의 면역 반응을 돕는다. 본 발명에 대해 특히 관심 있는 것은, Tfh 하위유형이 고친화성 항체의 생성에 도움을 제공하는 것이다.
제약학적 LNP 조성물
본원에 기술된 제약학적 조성물의 제형은 제약학 기술분야에서 알려져 있거나 이후에 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 그러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 하나 이상의 다른 부속 성분과 결합시키는 단계, 및 그런 후, 필요하거나 바람직하다면, 생성물을 원하는 단일- 또는 다중 용량 단위로 형상화하거나 포장하는 단계를 포함한다.
비록 본원에 제공된 제약학적 조성물의 설명이 주로 인간에 대한 윤리적인 투여에 적합한 제약학적 조성물에 향해 있지만, 숙련된 전문가는 그러한 조성물이 일반적으로 모든 부류의 동물에 대한 투여에 적합한 것을 이해할 것이다. 조성물을 다양한 동물에 대한 투여에 적합하게 만들기 위해 인간에 대한 투여에 적합한 제약학적 조성물의 변형은 잘 이해되며, 통상적인 지식을 가진 수의학적 제약학자라면 그러한 변형을 설계하고 필요하다면 단지 통상적인 실험으로 수행할 수 있다. 발명의 제약학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는, 한정하는 것은 아니지만, 인간 및 다른 영장류, 비인간 영장류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 및 개와 같은 상업적으로 관련된 포유류를 포함한 포유류를 포함한다.
발명의 방법에 유용한 제약학적 조성물은 안과, 경구, 직장, 질, 비경구, 국소적, 폐, 비내, 볼, 정맥내, 뇌실내, 피내, 근육내, 피하, 심실내, 척수강내, 기관내, 복강내, 자궁내 전달, 또는 다른 투여 경로 또는 그것들의 임의의 조합에 적합한 제형으로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 다른 고려되는 제형으로는 사출 나노입자, 리포솜 제제, 활성 성분을 함유한 재밀봉된 적혈구, 및 면역원성-기반 제형을 들 수 있다.
발명의 제약학적 조성물은 대용량으로, 단일 단위 용량으로서, 또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 제약학적 조성물의 별개의 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 또는 예를 들어, 그러한 투여량의 절반 또는 1/3과 같은 그러한 투여량의 편리한 분획과 같다.
발명의 제약학적 조성물 중의 활성 성분, 제약학적으로 허용되는 담체, 및 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 정체, 크기, 및 상태에 따라 및 추가로 조성물이 투여될 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 100%(중량/중량)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
활성 성분 외에, 발명의 제약학적 조성물은 하나 이상의 추가적인 제약학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
발명의 제약학적 조성물의 제어된- 또는 지속성 방출 제형은 종래 기술을 사용하여 만들어질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 제약학적 조성물의 "비경구 투여"는 대상체의 조직의 물리적 파괴 및 조직의 파괴를 통한 제약학적 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 그러므로 비경구 투여는, 한정하는 것은 아니지만, 조성물의 주입, 수술 절개를 통한 조성물의 적용, 조직-침투 비수술 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 제약학적 조성물의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 비경구 투여는, 한정하는 것은 아니지만, 안구내, 유리체내, 피하, 복강내, 자궁내 전달, 근육내, 피내, 흉골내 주사, 종양내, 정맥내, 뇌실내 및 신장 투석 주입 기법을 포함하는 것으로 고려된다.
비경구 투여에 적합한 제약학적 조성물의 제형은 제약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균 등장성 식염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 그러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형은 단위 투여 형태, 예컨대 앰풀 또는 보존제를 함유한 다중 용량 용기로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형으로는, 한정하는 것은 아니지만, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀션, 페이스트, 및 이식 가능한 지속성 방출 또는 생분해 가능한 제형을 들 수 있다. 그러한 제형은, 한정하는 것은 아니지만, 현탁제, 안정화제, 또는 분산제를 포함한 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형의 한 구현예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예컨대 멸균 발열원-유리수)로 재구성되기 위한 건조(즉 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
제약학적 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 이런 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있고, 활성 성분 외에, 본원에서 기술된 분산제, 습윤제, 또는 현탁제와 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 그러한 멸균된 주사 가능한 제형은 무독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 예컨대 물 또는 1,3-부탄 다이올을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용되는 희석제 및 용매로는, 한정하는 것은 아니지만, 링거액, 등장성 염화 나트륨 용액, 및 합성 모노- 또는 다이-글리세라이드와 같은 고정 오일을 들 수 있다. 유용한 다른 비경구적으로 투여 가능한 제형으로는 활성 성분을 미정질 형태로, 리포솜 제제에, 또는 생분해 가능한 중합체 시스템의 구성요소로서 포함하는 것들을 들 수 있다. 지속성 방출 또는 이식을 위한 조성물은 에멀션, 이온 교환 수지, 난용성 중합체, 또는 난용성 염과 같은 제약학적으로 허용되는 중합체 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
발명의 제약학적 조성물은 구강을 통한 폐 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 그러한 제형은 활성 성분을 포함하고 약 0.5 내지 약 7 나노미터, 바람직하게는 약 1 내지 약 6 나노미터 범위의 직경을 가지는 건조 입자를 포함할 수 있다. 그러한 조성물은 편리하게 추진제 스트림이 분말을 분산시키도록 분말을 분산시키기 위해 추진제 스트림을 향하게 할 수 있는 건조 분말 저장소를 포함하거나 또는 밀봉된 용기에서 저비등 추진제에 용해된 또는 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치와 같은 자체 추진 용매/분말-분산 용기를 사용하는 장치를 사용하여 투여하기 위한 건조 분말 형태이다. 바람직하게, 그러한 분말은 입자의 중량 기준으로 적어도 98%가 0.5 나노미터보다 큰 직경을 가지며 입자의 수 기준으로 적어도 95%가 7 나노미터보다 적은 직경을 가지는 입자를 포함한다. 보다 바람직하게, 입자의 중량 기준으로 적어도 95%는 1 나노미터보다 큰 직경을 가지며 입자의 수 기준으로 적어도 90%는 6 나노미터보다 적은 직경을 가진다. 건조 분말 조성물은 바람직하게 당과 같은 고체 미세 분말 희석제를 포함하며 단위 용량 형태로 편리하게 제공된다.
저비등 추진제는 일반적으로 대기압에서 65℉ 미만의 비등점을 가지는 액체 추진제를 포함한다. 일반적으로 추진제는 조성물의 50 내지 99.9%(중량/중량)를 구성할 수 있고, 활성 성분은 조성물의 0.1 내지 20%(중량/중량)를 구성할 수 있다. 추진제는 액체 비이온성 또는 고체 음이온성 계면활성제 또는 고체 희석제(바람직하게는 활성 성분을 포함하는 입자와 동일한 차수의 입자 크기를 가짐)와 같은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제약학적 조성물의 제형은 제약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균된 등장성 식염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 그러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 주사 가능한 제형은 단위 투여 형태로, 예컨대 앰풀로 또는 보존제를 함유한 다중 용량 용기로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형으로는, 한정하는 것은 아니지만, 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀션, 페이스트, 및 이식 가능한 지속성 방출 또는 생분해 가능한 제형을 들 수 있다. 그러한 제형은, 한정하는 것은 아니지만, 현탁제, 안정화제, 또는 분산제를 포함한, 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형의 한 구현예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예컨대 멸균 발열원-유리수)로 재구성되기 위한 건조(즉 분말 또는 과립) 형태로 제공된다.
제약학적 조성물은 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장, 또는 판매될 수 있다. 이런 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있고, 활성 성분 외에, 본원에서 기술된 분산제, 습윤제, 또는 현탁제와 같은 추가 성분을 포함할 수 있다. 그러한 멸균된 주사 가능한 제형은 무독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 예컨대 물 또는 1,3-부탄 다이올을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용되는 희석제 및 용매로는, 한정하는 것은 아니지만, 링거액, 등장성 염화 나트륨 용액, 및 합성 모노- 또는 다이-글리세라이드와 같은 고정 오일을 들 수 있다. 유용한 다른 비경구적으로 투여 가능한 제형으로는 활성 성분을 미정질 형태로, 리포솜 제제에, 또는 생분해 가능한 중합체 시스템의 구성요소로서 포함하는 것들을 들 수 있다. 지속성 방출 또는 이식을 위한 조성물은 에멀션, 이온 교환 수지, 난용성 중합체, 또는 난용성 염과 같은 제약학적으로 허용되는 중합체 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "추가적 성분"으로는, 한정하는 것은 아니지만, 다음 중 하나 이상을 들 수 있다: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 비활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향미제; 착색제; 보존제; 젤라틴과 같이 생리적으로 분해 가능한 조성물; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁제; 분산 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생물질; 항진균제; 안정화제; 및 제약학적으로 허용되는 중합체 또는 소수성 물질. 발명의 제약학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가적 성분"은 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences(1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA)(본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.
발명의 치료 화합물 또는 조성물은 질환 또는 장애를 앓고 있거나 발생의 위험이 있는(또는 발생한 것으로 의심되는) 대상체에게 예방적으로(즉, 질환 또는 장애를 예방하기 위하여) 또는 치료적으로(즉, 질환 또는 장애를 치료하기 위하여) 투여될 수 있다. 그러한 대상체는 표준 임상 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 예방적 투여는 질환의 명백한 임상 증상이 나타나기 전에 발생하여, 질환 또는 장애가 예방되거나 또는 대안으로 그것의 진행이 지연된다. 의학 분야의 맥락에서, 용어 "예방"은 질병으로부터의 사망률 또는 이환율의 부담을 감소시키는 임의의 활동을 포함한다. 예방은 일차, 이차 및 삼차 예방 수준에서 발생할 수 있다. 일차 예방이 질환의 발생을 피하는 것인 한편, 이차 및 삼차 수준의 예방은 질환의 진행 및 증상의 출현을 방지하는 것뿐만 아니라 이미 확립된 질환의 부정적 영향을 기능을 복원시키고 질환-관련 합병증을 감소시킴으로써 감소시키는 것을 목적으로 하는 활동을 포함한다.
전달 방법
한 측면으로, 본 발명은 CAR을 암호화하는 mRNA 분자, 핵산 분자, 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합을 관심 있는 표적에 전달하는 방법을 제공한다. 그러한 표적의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 면역 세포, T 세포, 상주 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 암성 세포, 질환 또는 장애와 관련된 세포, 질환 또는 장애와 관련된 조직, 뇌 조직, 중추 신경계 조직, 폐 조직, 정점 표면 조직, 상피 세포, 내피 세포, 간 조직, 장 조직, 결장 조직, 소장 조직, 대장 조직, 대변, 골수, 대식세포, 비장 조직, 근육 조직, 관절 조직, 종양 세포, 병든 조직, 림프절 조직, 림프 순환, 또는 그것들의 임의의 조합을 들 수 있다.
다양한 구현예에서, 방법은 치료적 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 LNP 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 방법은 본 발명의 LNP 또는 그것의 조성물이 CAR을 암호화하는 mRNA 분자, 핵산 분자, 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합을 세포에 전달하는 단계를 포함한다. 그러한 세포의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, T 세포, 상주 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 암성 세포, 질환 또는 장애와 관련된 세포, 상피 세포, 내피 세포, 종양 세포, 또는 그것들의 임의의 조합을 들 수 있다.
한 측면으로, 본 발명은 또한 CAR을 암호화하는 mRNA 분자를 그것을 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법을 개시한다. 다양한 구현예에서, 방법은 치료적 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 LNP 또는 그것의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 측면으로, 본 발명은 또한 CAR을 암호화하는 mRNA 분자, 뿐만 아니라 핵산 분자, 보조제, 및/또는 치료제를 그것을 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법을 개시한다. 다양한 구현예에서, 방법은 치료적 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 LNP 또는 그것의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 방법은 mRNA 분자뿐만 아니라 핵산 분자, 보조제, 및/또는 치료제를 대상체의 세포, 조직, 또는 둘 다에 전달하는 본 발명의 LNP 또는 그것의 조성물을 포함한다.
한 측면으로, 방법은 유전자 전달 방법이다.
한 구현예에서, 방법은 관심 있는 표적(예컨대, 세포, 조직, 등)에 본 발명의 LNP 조성물을 사용하는 일시적인 트랜스펙션의 형태로서 도입될 수 있는 본원에 기술된 IVT RNA를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 조성물의 단일 투여를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 다중 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 피내 전달 경로, 피하 전달 경로, 근육내 전달 경로, 심실내 전달 경로, 척수강내 전달 경로, 경구 전달 경로, 정맥내 전달 경로, 기관내 전달 경로, 복강내 전달 경로, 자궁내 전달 경로, 또는 그것들의 임의의 조합에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 치료적 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 LNP 또는 그것의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, CAR을 암호화하는 mRNA 분자, 핵산 분자, 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합을 관심 있는 표적(예컨대, 세포, 조직, 등)에 전달하기 위한 방법은 많은 상이한 방법, 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 전기천공법(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)),(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.) 또는 유전자 펄서 II(BioRad, Denver, Colo.), 멀티포레이터(Eppendort, Hamburg Germany), TransIT®-mRNA 트랜스펙션 키트(Mirus, Madison WI), 리포펙션을 사용하는 양이온성 리포솜 매개 트랜스펙션, 중합체 캡슐화, 펩타이드 매개 트랜스펙션, 또는 "유전자 총"과 같은 바이오리스틱 입자 전달 시스템(예를 들어, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70(2001) 참고)을 포함한 상업적으로 이용 가능한 방법 중 임의의 방법과 동시에 수행된다.
특정 경우에, 암호화 mRNA를 전달함으로써 단백질을 발현시키는 것은 단백질, 플라스미드 DNA 또는 바이러스 벡터를 사용하는 방법보다 많은 장점을 가진다. mRNA 트랜스펙션 중에, 원하는 단백질의 코딩 서열은 세포에 전달되는 유일한 물질이고, 그로써 플라스미드 골격, 바이러스 유전자, 및 바이러스 단백질과 관련된 모든 부작용을 피할 수 있다. 보다 중요하게, DNA- 및 바이러스-기반 벡터와 달리, mRNA는 게놈에 통합될 위험을 포함하지 않고 단백질 생성은 mRNA 전달 직후 시작된다. 예를 들어, 고수준의 순환 단백질이 암호화 mRNA의 생체내 주입 후 15 내지 30분 이내에 측정되었다. 특정 구현예에서, 단백질보다 mRNA를 사용하는 것이 또한 많은 장점을 가진다. 순환에서의 단백질의 반감기는 자주 짧고, 그러므로 단백질 치료는 빈번한 투여를 필요로 하는 한편, mRNA는 여러 날 동안 연속적인 단백질 생성을 위한 주형을 제공한다. 단백질의 정제는 문제의 소지가 있고 그것은 부작용을 유발하는 응집체 및 다른 불순물을 함유할 수 있다(Kromminga and Schellekens, 2005, Ann NY Acad Sci 1050:257-265).
숙주 세포에서 mRNA 서열의 존재를 확인하기 위하여, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 그러한 검정으로는, 예를 들어, 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있는 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 노던 블롯팅 및 RT-PCR; "생화학적" 검정, 예컨대 특정 펩타이드의 존재 또는 부재를, 예컨대 면역원성 수단에 의해(ELISA 및 웨스턴 블롯) 또는 발명의 범주 내에 속하는 작용제를 확인하기 위한 본원에 기술된 검정에 의해 검출하는 것을 들 수 있다.
치료 방법
본 발명은 CAR을 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 포함하는 본 발명의 유효량의 적어도 하나의 LNP 또는 그것의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 적응 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 다양한 측면으로, 본 발명은 하나 이상의 LNP 및 CAR을 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 포함하는 적어도 하나의 LNP 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 적응 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 측면으로, 조성물은 핵산 분자, 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 항원을 암호화한다.
한 구현예에서, 방법은 대상체에서 항원과 관련된 감염, 암, 또는 질환 또는 장애에 대한 면역을 제공한다. 그러므로 본 발명은 항원과 관련된 감염, 암, 또는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 예시의 항원 및 관련된 감염, 질환, 및 종양은 본원의 다른 곳에서 기술된다.
예를 들어, 방법은 투여된 조성물의 항원의 유형에 따라 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염, 관절염, 심장 질환, 심혈관 질환, 신경 장애 또는 질환, 유전적 질환, 자가면역 질환, 태아 질환, 태아 발달에 영향을 미치는 유전적 질환, 또는 암을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
다음은 개시된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암의 비제한적인 예이다: 급성 림프모세포성(acute lymphoblastic); 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia); 부신 암종(adrenocortical carcinoma); 부신 암종, 아동(adrenocortical carcinoma, childhood); 충수암(appendix cancer); 기저세포 암종(basal cell carcinoma); 담관암, 간외(bile duct cancer, extrahepatic); 방광암(bladder cancer); 골암(bone cancer); 골육종 및 악성 섬유성 조직구종(osteosarcoma and malignant fibrous histiocytoma); 뇌간 교종, 아동(brain stem glioma, childhood); 뇌종양, 성인(brain tumor, adult); 뇌종양, 뇌간 교종, 아동(brain tumor, brain stem glioma, childhood); 뇌종양, 중추신경계 비정형 기형/횡문근 종양(brain tumor, central nervous system atypical teratoid/rhabdoid tumor, childhood); 중추신경계 배아 종양(central nervous system embryonal tumor); 뇌 성상세포종(cerebellar astrocytoma); 뇌 성상세포종/악성 신경교종(cerebral astrocytotna/malignant glioma); 두개인두종(craniopharyngioma); 뇌실막모세포종(ependymoblastoma); 뇌실막종(ependymoma); 속질모세포종(medulloblastoma); 수질상피종(medulloepithelioma); 중등도 분화형의 송과샘 실질 종양(pineal parenchymal tumor of intermediate differentiation); 천막상부 원시성 신경외배엽 종양 및 송과체모세포종(supratentorial primitive neuroectodermal tumor and pineoblastoma); 시각 경로 및 시상하부 교종(visual pathway and hypothalamic glioma); 뇌 및 척수 종양(brain and spinal cord tumor); 유방암(breast cancer); 기관지 종양(bronchial tumor); 버킷 림프종(Burkitt lymphoma); 유암종 종양(carcinoid tumor); 유암종 종양, 위장(carcinoid tumor, gastrointestinal); 중추신경계 비정형 기형/횡문근 종양(central nervous system atypical teratoid/rhabdoid tumor); 중추신경계 배아 종양(central nervous system embryonal tumor); 중추신경계 림프종(central nervous system lymphoma); 소뇌 성상세포종 뇌 성상세포종/악성 신경교종, 아동(cerebellar astrocytoma cerebral astrocytoma/malignant glioma, childhood); 자궁경부암(cervical cancer); 척색종, 아동(chordoma, childhood); 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia); 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia); 만성 골수증식성 장애(chronic myeloproliferative disorders); 결장암(colon cancer); 대장암(colorectal cancer); 두개인두종(craniopharyngioma); 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma); 식도암(esophageal cancer); 종양의 유잉 패밀리(Ewing family of tumor); 성선외 생식세포 종양(extragonadal germ cell tumor); 간외 담관암(extrahepatic bile duct cancer); 안암, 안내 흑색종(eye cancer, intraocular melanoma); 안암, 망막모세포종(eye cancer, retinoblastoma); 담낭암(gallbladder cancer); 위(위)암(gastric(stomach) cancer); 위장 유암종 종양(gastrointestinal carcinoid tumor); 위장 간질 종양(gastrointestinal stromal tumor(gist)); 생식 세포 종양, 두개외(germ cell tumor, extracranial); 생식 세포 종양, 성선외(germ cell tumor, extragonadal); 생식 세포 종양, 난소(germ cell tumor, ovarian); 임신성 융모성 종양(gestational trophoblastic tumor); 신경교종(glioma); 신경교종, 아동 뇌 줄기(glioma, childhood brain stem); 신경교종, 아동 뇌 성상세포종(glioma, childhood cerebral astrocytoma); 신경교종, 아동 시각 경로 및 시상하부(glioma, childhood visual pathway and hypothalamic); 털세포 백혈병(hairy cell leukemia); 두경부암(head and neck cancer); 간세포(간) 암(hepatocellular(liver) cancer); 조직구증, 랑게르한스 세포(histiocytosis, langerhans cell); 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma); 하인두암(hypopharyngeal cancer); 시상하부 및 시각 경로 신경교종(hypothalamic and visual pathway glioma); 안내 흑색종(intraocular melanoma); 샘세포 종양(islet cell tumor); 신장(신세포) 암(kidney(renal cell) cancer); 랑게르한스 세포 조직구증(Langerhans cell histiocytosis); 후두암(laryngeal cancer); 백혈병, 급성 림프모세포성(leukemia, acute lymphoblastic); 백혈병, 급성 골수성(leukemia, acute myeloid); 백혈병, 만성 림프구성(leukemia, chronic lymphocytic); 백혈병, 만성 골수성(leukemia, chronic myelogenous); 백혈병, 털세포(leukemia, hairy cell); 입술 및 구강암(lip and oral cavity cancer); 간암(liver cancer); 폐암, 비-소세포(lung cancer, non-small cell); 폐암, 소세포(lung cancer, small cell); 림프종, 에이즈-관련(lymphoma, aids-related); 림프종, 버킷(lymphoma, burkitt); 림프종, 피부 T-세포(lymphoma, cutaneous T-cell); 림프종, 비-호지킨 림프종(lymphoma, non-Hodgkin lymphoma); 림프종, 일차 중추신경계(lymphoma, primary central nervous system); 거대글로불린혈증, 발덴스트롬(macroglobulinemia, Waldenstrom); 뼈의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종(malignant fibrous histiocvtoma of bone and osteosarcoma); 속질모세포종(medulloblastoma); 흑색종(melanoma); 흑색종, 안내(눈)(melanoma, intraocular(eye)); 머클 세포 암종(Merkel cell carcinoma); 중피종(mesothelioma); 엄폐 원발성 전이성 편평 목암(metastatic squamous neck cancer with occult primary); 구강암(mouth cancer); 다중 내분비 신생물 증후군,(아동)(multiple endocrine neoplasia syndrome,(childhood)); 다발성 골수종/형질 세포 신생물(multiple myeloma/plasma cell neoplasm); 진균증(mycosis); 진균모양(fungoides); 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes); 골수이형성/골수증식성 질환(myelodysplastic/myeloproliferative diseases); 골수성 백혈병, 만성(myelogenous leukemia, chronic); 골수성 백혈병, 성인 급성(myeloid leukemia, adult acute); 골수성 백혈병, 아동 급성(myeloid leukemia, childhood acute); 골수종, 다발성(myeloma, multiple); 골수증식성 장애, 만성(myeloproliferative disorders, chronic); 비강 및 부비동암(nasal cavity and paranasal sinus cancer); 비인두암(nasopharyngeal cancer); 신경모세포종(neuroblastoma); 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer); 구강암(oral cancer); 구강암(oral cavity cancer); 구인두암(oropharyngeal cancer); 골육종 및 뼈의 악성 섬유성 조직구종(osteosarcoma and malignant fibrous histiocytoma of bone); 난소암(ovarian cancer); 난소 상피암(ovarian epithelial cancer); 난소 생식세포 종양(ovarian germ cell tumor); 난소 저악성 잠재적 종양(ovarian low malignant potential tumor); 췌장암(pancreatic cancer); 췌장암, 샘세포 종양(pancreatic cancer, islet cell tumor); 유두종증(papillomatosis); 부갑상선암(parathyroid cancer); 페니스암(penile cancer); 인두암(pharyngeal cancer); 갈색세포종(pheochromocytoma); 중등도 분화형의 송과샘 실질 종양(pineal parenchymal tumor of intermediate differentiation); 송과모세포종 및 천막상부 원시 신경외배엽 종양(pineoblastoma and supratentorial primitive neuroectodermal tumor); 뇌하수체 종양(pituitary tumor); 형질 세포 신생물/다발성 골수종(plasma celt neoplasm/multiple myeloma); 흉막폐모세포종(pleuropulmonary blastoma); 원발성 중추신경계 림프종(primary central nervous system lymphoma); 전립선암(prostate cancer); 직장암(rectal cancer); 신세포(신장) 암(renal cell(kidney) cancer); 신장 골반 및 요관, 이행 세포암(renal pelvis and ureter, transitional cell cancer); 염색체 15 상의 nut 유전자를 포함하는 호흡기 암종(respiratory tract carcinoma involving the nut gene on chromosome 15); 망막모세포종(retinoblastoma); 횡문근육종(rhabdomyosarcoma); 침샘암(salivary gland cancer); 육종, 종양의 유잉 패밀리(sarcoma, ewing family of tumor); 육종, 카포시(sarcoma, Kaposi); 육종, 연조직(sarcoma, soft tissue); 육종, 자궁(sarcoma, uterine); 세자리 증후군(sezary syndrome); 피부암(비흑색종)(skin cancer(nonmelanoma)); 피부암(흑색종)(skin cancer(melanoma)); 피부 암종, 머클 세포(skin carcinoma, Merkel cell); 소세포 폐암(small cell lung cancer); 소장암(small intestine cancer); 연조직 육종(soft tissue sarcoma); 편평 세포 암종, 엄폐 원발성, 전이성 편평 목암(squamous cell carcinoma, squamous neck cancer with occult primary, metastatic); 위(위)암(stomach(gastric) cancer); 천막상부 원시성 신경외배엽 종양(supratentorial primitive neuroectodermal tumor); T-세포 림프종, 피부(T-cell lymphoma, cutaneous); 고환암(testicular cancer); 인후암(throat cancer); 흉선종 및 흉선 암종(thymoma and thymic carcinoma); 갑상선암(thyroid cancer); 신장 골반 및 요관의 이행 세포 암(transitional cell cancer of the renal pelvis and ureter); 융모세포 종양, 임신성(trophoblastic tumor, gestational); 요도암(urethral cancer); 자궁암, 자궁내막(uterine cancer, endometrial); 자궁 육종(uterine sarcoma); 질암(vaginal cancer); 외음부암(vulvar cancer); 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia); 및 빌름스 종양(Wilms tumor).
한 구현예에서, 조성물은 항원과 관련된 감염, 질환, 심장 질환, 심혈관 질환, 신경 장애 또는 질환, 유전적 질환, 자가면역 질환, 또는 암을 가진 대상체에게 투여된다. 한 구현예에서, 조성물은 항원과 관련된 감염, 질환, 심장 질환, 심혈관 질환, 신경 장애 또는 질환, 유전적 질환, 자가면역 질환, 또는 암이 발병된 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 조성물은 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 등과 접촉될 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 조성물은 유전적 요인, 환경적 요인, 등을 통해 암 발생 가능성이 증가된 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 조성물은 피내 전달 경로, 피하 전달 경로, 근육내 전달 경로, 심실내 전달 경로, 척수강내 전달 경로, 경구 전달 경로, 정맥내 전달 경로, 기관내 전달 경로, 복강내 전달 경로, 자궁내 전달 경로, 또는 그것들의 임의의 조합에 의해 투여된다.
또 다른 구현예에서, 항원-암호화 RNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 동일한 서열을 가지는 비변형 시험관내-합성된 RNA 분자보다 상당히 더 많은 적응 면역반응을 유도한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 그것의 비변형 대응물보다 2배 더 큰 적응 면역 반응을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 3배 인자만큼 향상된다. 또 다른 구현예에서 적응 면역 반응은 5배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 7배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 10배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 15배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서 적응 면역 반응은 20배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 50배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 100배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 200배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 500배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 1000배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 2000배 인자만큼 증가된다. 또 다른 구현예에서, 적응 면역 반응은 또 다른 배수 차이만큼 증가된다.
또 다른 구현예에서, "상당히 더 많은 적응 면역 반응을 유도하는"은 적응 면역 반응의 검출 가능한 증가를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 적응 면역 반응의 배수 증가를 나타낸다(예컨대, 위에서 열거된 1의 배수 증가). 또 다른 구현예에서, 용어는 RNA를 포함하는 본 발명의 조성물이 동일한 종을 가진 분리된 RNA 분자보다 더 적용 용량 또는 빈도로 투여될 수 있지만 여전히 효과적인 적응 면역 반응을 유도하도록 하는 증가를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 증가는 RNA를 포함하는 본 발명의 조성물이 효과적인 적응 면역 반응을 유도하기 위해 단일 용량을 사용하여 투여될 수 있게 되는 정도이다.
또 다른 구현예에서, RNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 동일한 서열을 가지는 분리된 시험관내 합성 RNA 분자보다 상당히 더 적은 선천성 면역원성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, RNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 그것의 분리된 대응물보다 2배 더 적은 선천성 면역 반응을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 3배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 5배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 7배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 10배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 15배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 20배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 50배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 100배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 200배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 500배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 1000배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 2000배 인자만큼 감소된다. 또 다른 구현예에서, 선천성 면역원성은 또 다른 배수 차이만큼 감소된다.
또 다른 구현예에서, "상당히 더 적은 선천성 면역원성을 나타낸다"는 선천성 면역원성의 검출 가능한 감소를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 선천성 면역원성의 배수 감소를 나타낸다(예컨대, 위에서 열거된 1의 배수 감소). 또 다른 구현예에서, 용어는 RNA를 포함하는 본 발명의 유효량의 조성물이 검출 가능한 선천성 면역 반응을 촉발시키지 않으면서 투여될 수 있도록 하는 감소를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 용어는 RNA를 포함하는 본 발명의 조성물이 재조합 단백질의 생성을 검출 가능하게 감소시키기에 충분한 선천성 면역 반응을 유도하지 않으면서 반복적으로 투여될 수 있게 하는 감소를 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 감소는 RNA를 포함하는 본 발명의 조성물이 재조합 단백질의 검출 가능한 생성을 제거하기에 충분한 선천성 면역 반응을 유도하지 않으면서 반복적으로 투여될 수 있게 되는 정도이다.
한 측면으로, 본 발명은 부분적으로, 그것을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 방법은 치료적 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 LNP 또는 그것의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 핵산 분자, 치료제, 또는 그것들의 조합을 관심 있는 표적(예컨대, 세포, 조직, 등)에 전달한다.
한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 보조제를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 항원을 암호화하는 제1 핵산 분자 및 하나 이상의 보조제를 암호화하는 제2 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 하나 이상의 항원을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 제1 조성물을 투여하는 단계 및 하나 이상의 보조제를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 방법은 복수의 항원, 보조제, 또는 그것들의 조합을 암호화하는 복수의 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 발명의 방법은 투여 후 적어도 여러 날 동안 본원에 기술된 항원 또는 보조제의 지속적인 발현을 허용한다. 그러나, 방법은, 특정 구현예에서, 또한 일시적인 발현을 제공하는데, 특정 구현예에서, 핵산이 대상체 게놈에 통합되지 않기 때문이다.
특정 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 항원 또는 보조제의 안정적인 발현을 제공하는 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA의 투여는 선천성 면역 반응을 거의 내지는 전혀 초래하지 않는 한편, 효과적인 적응 면역 반응을 유도한다.
치료 방법에서 발명의 조성물의 투여는 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 많은 상이한 방법으로 이루어질 수 있다. 한 구현예에서, 발명의 방법은 예를 들어 장 또는 비경구 투여를 포함하여, 대상체의 전신 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 조성물의 피내 전달을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 조성물의 정맥내 전달을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 조성물의 근육내 전달을 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 피하 전달을 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 흡입을 포함한다. 한 구현예에서, 방법은 조성물의 비내 전달을 포함한다.
발명의 조성물은 단독으로, 또는 또 다른 작용제와 함께 대상체에게 투여될 수 있는 것이 인정될 것이다.
그러므로 발명의 치료 및 예방 방법은 발명의 방법을 실시하기 위하여 본원에 기술된 항원, 보조제, 또는 그것들의 조합을 암호화하는 제약학적 조성물의 사용을 포함한다. 발명의 실시에 유용한 제약학적 조성물은 ng/kg/일 내지 100 mg/kg/일의 용량을 전달하기 위해 투여될 수 있다. 한 구현예에서, 발명은 포유류에서 10 nM 내지 10 μM의 본 발명의 화합물의 농도를 초래하는 용량의 투여를 예상한다.
전형적으로, 발명의 방법에서 포유류, 바람직하게 인간에게 투여될 수 있는 투여량은 포유류의 체중 kg당 0.01 μg 내지 약 50 mg의 범위이지만, 투여되는 정확한 투여량은, 한정하는 것은 아니지만, 포유류의 유형 및 치료되는 질환의 유형, 포유류의 연령 및 투여 경로를 포함한 임의의 많은 요인에 따라 달라질 것이다. 바람직하게, 화합물의 투여량은 포유류 체중 kg당 약 0.1 μg 내지 약 10 mg으로 달라질 것이다. 보다 바람직하게, 투여량은 포유류 체중 kg당 약 1 μg 내지 약 1 mg으로 달라질 것이다.
조성물은 하루에 여러번 정도로 빈번하게 포유류에게 투여될 수 있거나, 또는 덜 빈번하게, 예컨대 하루 1회, 주 1회, 2주마다 1회, 월 1회, 또는 그것보다 덜 빈번하게, 예컨대 수개월마다 1회 또는 심지어 년 1회 또는 그것보다 적게 투여될 수 있다. 투여 빈도는 숙련된 전문가에게 쉽게 명백해질 것이며, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 치료되는 질환의 유형 및 중증도, 포유류의 유형 및 연령, 등을 포함하는 임의의 많은 요인에 따라 좌우될 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 백신의 투여는 단일 투여에 의해 수행되거나 다중 투여에 의해 부스팅될 수 있다.
한 구현예에서, 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 항원 또는 보조제를 암호화하는 하나 이상의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 첨가 효과를 나타내며, 이때의 조합의 투여의 전체적인 효과는 각각의 항원 또는 보조제를 투여하는 효과의 합과 대략 동일하다. 다른 구현예에서, 방법은 상조 효과를 가지며, 이때의 조합을 투여하는 전체적인 효과는 각각의 항원 또는 보조제를 투여하는 효과의 합보다 더 크다.
한 구현예에서, 방법은 예를 들어 피내 투여를 포함하여, 대상체에게 조성물의 전신적 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 복수의 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 단일 용량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 이때 단일 용량은 적응 면역 반응을 유도하는 데 효과적이다.
실험예
발명은 다음의 실험예를 참조하여 상세하게 한층 더 기술된다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며, 다르게 명시되지 않는 한 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 그러므로, 발명은 어떤 방식으로든 다음의 실시예에 제한되는 것으로서 해석되지 않아야 하며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 분명해지는 임의의 및 모든 변동을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가 설명 없이, 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람은 전술된 설명 및 이어지는 예시적인 예를 사용하여, 본 발명을 만들고 활용할 수 있으며 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 그러므로 다음의 작업예는 본 발명의 바람직한 구현예를 구체적으로 지적하며, 개시의 나머지를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: mRNA-기반 T 세포 조작을 위한 이온화 가능한 지질 나노입자
지질- 및 중합체-기반 물질로 구성된 나노입자(NP)-기반 전달 시스템은 기계적 및 바이러스 세포 조작 방법을 사용하여 직면한 문제를 극복하기 위한 유망한 수단을 제공한다(DiTommaso T et al., 2018, PNAS, 115; Hajj KA et al., 2017, Nat Rev Mater, 2; McKinlay CJ et al., 2018, PNAS, 115:E5859-E5866, Mukalel AJ et al., 2019, Cancer Lett, 458:102-112). NP는 핵산 운반물을 안정화하고, 세포내 전달을 도우며, 독성을 완화시키는 능력을 포함하여 수많은 잠재적 이익을 가지고 있다(Pardi N et al., 2018, Nat Rev Drug Discov, 17:261-279; Fornaguera C et al., 2018, Adv Healthc Mater, 7:1-11; Zhang R et al., 2018, J Control Release, 292:256-276; Islam MA et al., 2015, Biomater Sci, 1519-1533). EP에 비교하여 감소된 독성을 포함하여 유망한 결과를 가진 세포로의 mRNA 전달을 위한 중합체-기반 NP에 대한 일부 조사가 있었다(McKinlay CJ et al., 2018, PNAS, 115:E5859-E5866; Olden BR et al., 2018, J Control Release, 282:140-147; Moffett HF et al., 2017, Nat Commun, 8:389; Demoulins T et al., 2016, Biol Med, 12:711-722; Anderson DG et al., 2003, Angew Chem Int Ed Engl, 42:3153-3158).
그러나, 이온화 가능한 지질 나노입자(LNP) 전달 시스템은 Alnylam의 온파트로(Onpattro)의 승인을 받은 RNA 전달의 맥락에서 중합체보다 더 임상적으로 진전된 것이다(Pardi N et al., 2018, Nat Rev Drug Discov, 17:261-279; Garber K et al., 2018, Nat Biotechnol, 36:777). 추가적으로, LNP는 생리적으로 관련된 pH에서 중성으로 유지되지만 산성 환경에서, 예컨대 엔도솜에서 전하를 생성하여 궁극적으로 엔도솜 탈출을 돕고 강력한 세포내 핵산 전달을 유발하는 이온화 가능한 지질 코어를 가지고 있다(Hajj KA et al., 2017, Nat Rev Mater, 2; Kauffman KJ et al., 2016, J Control Release, 240:227-234; Oberli MA et al., 2017, Nano Lett, 17:1326-1335; Fan YN et al., 2018, Biomater Sci Royal Society of Chemistry, 6:3009-3018). 이것은 면역 세포를 포함한 다양한 세포 유형 전체에서 최소 독성으로 검증되었고, 림프구 전달에 대한 이전 작업은 LNP가 상업적으로 이용 가능한 리포펙타민보다 더 효과적으로 mRNA를 전달하는 것을 나타냈다(Hajj KA et al., 2017, Nat Rev Mater, 2; McKinlay CJ et al., 2018, PNAS, 115:E5859-E5866; Zhang R et al., 2018, J Control Release, 292:256-276; Kauffman KJ et al., 2016, J Control Release, 240:227-234; Oberli MA et al., 2017, Nano Lett, 17:1326-1335; Love KT et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107:9915-9915).
추가로, LNP의 쉽게 변형될 수 있는 조성물은 특정 세포 유형으로의 흡수를 최대화하기 위해 조성물의 물리화학적 특성의 조정을 하용하는 한편 그것의 이온화 가능한 특성은 그것이 음전하의 핵산 운반물과 정전기적으로 복합체를 형성하는 것을 허용한다(Hajj KA et al., 2017, Nat Rev Mater, 2; McKinlay CJ et al., 2018, PNAS, 115:E5859-E5866; Zhang R et al., 2018, J Control Release, 292:256-276; Kauffman KJ et al., 2016, J Control Release, 240:227-234; Love KT et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107:9915-9915; Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15:7300-7306). 이들 특성은 LNP를 인간 CAR T 세포 조작을 위한 LNP 플랫폼의 개발에 대한 이 연구를 위한 이상적인 플랫폼으로 만들어준다.
본원에 기술된 연구는 T 세포를 트랜스펙션하기 위한 C14-4 지질 나노입자(LNP)를 생성하기 위해 신규한 이온화 가능한 지질 C14-4를 활용한다. 데이터는 C14-4 LNP를 사용하는 것이 EP와 비교하여 더 낮은 독성으로 동일한 효능의 T 세포 트랜스펙션을 허용하는 것을 보여준다. 추가적으로, C14-4 LNP로 만들어진 CAR T 세포는 암세포 사멸의 측면에서 EP-생성 CAR T 세포와 동일하게 기능하였다. C14-4 LNP의 추가 장점으로는 그것이 환자 T 세포 수득 및 재주입을 피하기 위해 생체내 T 세포 조작에 적용될 가능성을 가진다는 것과, 그것이 mRNA 전달을 향상시키기기 위해 추가로 최적화될(C14-4 LNP 제형 파라미터를 변형시킴에 의해) 능력을 이미 보였다는 것을 들 수 있다.
C14-4 LNP는 두 임상 제조 환경, 예컨대 CAR T 세포를 생성 및 연구 환경을 위해 T 세포를 조작하는 완전히 새로운 방법을 제공할 수 있다. C14-4가 리포펙타민(세포-기반 연구에서 황금 표준 트랜스펙션 시약)과 비교할 때 mRNA 전달을 향상시킬 수 있었기 때문에, 그것을 CAR 적용을 넘어 T 세포를 연구하기 위해 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 24개 LNP의 다양한 라이브러리를 생성하고(도 2a), 특성화하였고(도 2b), 불멸화된 인간 T 세포주인 Jurkat 세포에의 루시페라제 mRNA 전달에 대해 스크리닝하였다. 이온화 가능한 지질을 먼저 마이클 부가 화학을 통해 합성하였고, 이때 폴리아민 코어는 다양한 길이의 과잉 에폭시드-종결 알킬 사슬과 반응하였다(도 2c). 여기서, 지질을 T 세포에의 mRNA 전달에 대해 평가하였다.
LNP를 제형화하기 위하여, 이온화 가능한 지질을 에탄올에서 3가지의 다른 부형제: (i) LNP 안정성 및 막 융합을 위해 콜레스테롤, (ii) LNP의 이중층 구조를 강화하고 엔도솜 탈출을 촉진하기 위하여 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민(DOPE), 및 (iii) 응집 및 비특이적 세포내이입을 줄이기 위하여 C14-PEG와 조합하였다(Granot Y et al., 2017, Semin Immunol, 34:68-77; Varkouhi AK et al., 2011, J Control Release, 151:220-228; Mui BL et al., 2013, Mol Ther Acids, 2:1-8). 이 에탄올 상을 그런 후 미세유체 장치에서 수성 상 mRNA와 혼합하였다(도 1). 이들 부형제 및 그것들의 몰비를, 일반적으로 (i) 인지질 구성요소로서 DOPE, (ii) 이온화 가능한 지질의 감소된 몰 백분율, 및 (iii) 증가된 농도의 콜레스테롤 및 지질-PEG를 이용한, mRNA 전달을 위한 이전에 최적화된 LNP 제형을 토대로 선택하였다(Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15: 300-7306; Ball RL e al., 2018, Nano Lett, 18:3814-3822). 부형제의 몰비의 변동이 물리화학적 특성 및 궁극적으로 LNP의 강력한 전달에 영향을 미치는 것을 감안하여, 구성요소의 몰비를 이들 실험 내내 일정하게 유지하였다(Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15: 300-7306; Ball RL e al., 2018, Nano Lett, 18:3814-3822; Cheng Q et al., 2018, Adv Mater, 30:1805308).
LNP를 그것의 기능성 mRNA를 전달하는 능력에 대해 평가하기 위하여, 루시페라제를 암호화된 리포터 단백질로서 선택하였다. 이 스크린은 일반적으로 사용되는 트랜스펙션 시약인 리포펙타민에 비교하여 mRNA 전달이 향상된 7개의 LNP 제형을 나타냈다(Cardarelli F et al., 2016, Sci Reports, 6:25879). 추가로, Jurkat 세포(불멸화된 인간 T 세포)에의 mRNA 전달에 대해 24개의 LNP를 스크리닝할 때, 최고 LNP 제형, C14-4 LNP를 그것의 강력한 전달 및 낮은 독성에 대한 추가 개발을 위해 선택하였다. 그런 후 C14-4 LNP를 일차 T 세포의 트랜스펙션을 위해 최적화하였고, 포화된 이온화 가능한 지질의 정제가 미정제 생성물보다 개선된 mRNA 전달로 이어진 것으로 나타났다. 플랫폼의 번역 가능성을 설명하기 위하여, 최적화된 C14-4 LNP를 사용하여 CAR T 세포를 생성하기 위하여 CAR mRNA를 캡슐화하였다(도 1c). EP-기반 mRNA 전달과 비교하여, C14-4 LNP는 처리된 T 세포에서 더 적은 독성을 유발하였고 트랜스펙션된 T 세포에서 유사한 양의 표면 CAR 발현을 초래하였다. ALL 세포와의 공동 배양 검정에서, LNP-생성된 CAR T 세포는 EP-생성된 CAR T 세포와 동일한 강력한 암세포 사멸 능력을 입증하였다. 그러므로, LNP는 CAR T 세포의 mRNA-기반 생체외 조작을 위한 대체 전략으로서 검증되었다.
이 데이터를 기반으로, C14-4 LNP는 두 임상 제조 환경, 예컨대 CAR T 세포를 생성 및 연구 환경을 위해 T 세포 조작에 대한 신규한 방법을 제공할 수 있다. C14-4가 리포펙타민(세포-기반 연구에서 황금 표준 트랜스펙션 시약)과 비교할 때 mRNA 전달을 향상시킬 수 있었기 때문에, 그것을 CAR 적용을 넘어 T 세포를 연구하기 위해 사용할 수 있다. 후속적인 연구는 T 세포 및 T 세포주로의 mRNA 전달을 추가로 향상시키기 위해 C14-4 LNP 제형을 최적화하는 유망한 결과를 나타냈다. C14-4 LNP는 또한 일차 인간 T 세포로 더 낮은 독성으로 EP처럼 효과적으로 CD-19 CAR mRNA를 전달하는 것으로 나타났다.
LNP 라이브러리의 특성화
이 연구에서, 이온화 가능한 지질 나노입자(LNP)를 T 세포에의 mRNA 전달에 대해 조사하였다. LNP는 생체내에서 및 생체외에서 높은 효능 및 낮은 독성으로 다양한 세포 및 조직 표적에 세포내적으로 mRNA를 전달하는 것으로 나타났기 때문에 LNP를 선택하였다. 가장 최근에, LNP는 다양한 면역 세포 유형에 핵산 전달을 위해 활용되었다(Berdeja JG et al., 2017, J Clin Oncol, 35; Oberli MA et al., 2017, Nano Lett, 17:1326-1335; Love KT et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107:9915-9915; Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15:7300-7306; Midoux P et al., 2014, Expert Rev Vaccines, 14:221-234; Lokugamage MP et al., 2019, Adv Mater, 1902251:1-8).
T 세포에 특이적으로 mRNA 전달을 조사하기 위하여, 24개의 상이한 LNP 제형의 라이브러리를 먼저 이온화 가능한 지질 물질을 마이클 부가 화학을 통해 합성함으로써 생성하였고, 이때 폴리아민 코어는 다양한 길이의 과잉량의 에폭시드-종결 알킬 사슬과 반응하였다(도 2 및 도 6). 이 라이브러리에서 합성된 특정 이온화 가능한 지질은 이전에 LNP로 제형화된 이온화 가능한 지질의 구조적 유사체이고 면역 세포에 siRNA 및 mRNA를 전달하는 것으로 나타났다(Oberli MA et al., 2017, Nano Lett, 17:1326-1335; Love KT et al., 2010, Proc Natl Acad Sci, 107:9915-9915; Leuschner F et al., 2012, Nat Biotechnol, 29:1005-1010).
지질을 다양한 세포 유형보다는 T 세포에 특이적으로 mRNA 전달하는 것에 대해 평가하였다. LNP를 제형화하기 위하여, 이온화 가능한 지질을 에탄올에서 3가지의 다른 부형제: (i) LNP 안정성 및 막 융합을 위해 콜레스테롤, (ii) LNP의 이중층 구조를 강화하고 엔도솜 탈출을 촉진하기 위하여 DOPE, 및 (iii) 응집 및 비특이적 세포내이입을 줄이기 위하여 C14-PEG와 조합하였다(Granot Y et al., 2017, Semin Immunol, 34:68-77; Varkouhi AK et al., 2011, J Control Release, 151:220-228; Mui BL et al., 2013, Mol Ther Acids, 2:1-8). 그런 후 이 에탄올 상을 미세유체 장치에서 수성 상 mRNA와 혼합하였다(도 1a). 이들 부형제 및 그것들의 몰비를, 일반적으로 (i) 인지질 구성요소로서 DOPE, (ii) 이온화 가능한 지질의 감소된 몰 백분율, 및 (iii) 증가된 농도의 콜레스테롤 및 지질-PEG를 이용한, mRNA 전달을 위해 이전에 최적화된 LNP 제형을 토대로 선택하였다(Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15: 300-7306; Ball RL e al., 2018, Nano Lett, 18:3814-3822). 부형제의 몰비의 변동이 물리화학적 특성 및 궁극적으로 LNP의 강력한 전달에 영향을 미치는 것을 감안하여, 구성요소의 몰비를 이들 실험 내내 일정하게 유지하였다(Kauffman KJ et al., 2015, Nano Lett, 15:7300-7306; Ball RL et al., 2018, Nano Lett, 18:3814-3822; Cheng Q et al., 2018, Adv Mater, 30:1805308).
그런 후 결과적으로 생성된 LNP를 동적 광산란(DLS) 및 A260 흡광도 측정을 사용하여 크기 및 mRNA 농도에 대해 특성화하였다. z-평균 측정으로서 보고된 LNP의 직경은 51.05 내지 97.01 nm 범위였고 PDI는 0.3 미만이였다(도 7). A260 흡광도로서 측정된 mRNA 농도는 LNP 제형 전체에서 일관성을 보였고, 33.3 내지 48.3 ng/μL의 범위였다. 종합적으로, 이들 결과는 24개의 상이한 LNP 제형의 제형이 T 세포 전달을 위한 이 연구에서 사용될 mRNA를 캡슐화하는 것을 확인시켜주었다.
Jurkat 세포에의 mRNA 전달에 대한 LNP의 스크리닝
LNP를 그것의 기능성 mRNA를 전달하는 능력에 대해 평가하기 위하여, 루시페라제를 암호화된 리포터 단백질로서 선택하였다. 루시페린의 첨가 후, mRNA로부터 번역된 루시페라제 단백질만이 반응하여 발광 신호를 생성하여, 기능성 mRNA 전달과 상관이 있는 쉽게 검출 가능한 출력을 생성한다(Hajj KA et al., 2019, Small, 15:1-7). 이들 실험에서 사용된 루시페라제 mRNA는 N1-메틸-PseudoU 및 5-메틸-C 변형을 활용하였고, mRNA 번역을 증강시키고 LNP 내에 성공적으로 캡슐화하는 것으로 나타났다(Pardi N et al., 2015, J Control Release, 217:345-351; Svitkin YV et al., 2017, Nucelic Acids Res, 45:6023-6036; Trixl L et al., 2018, WIREs RNA, 10:1-17). 이들 변형은 LNP에서의 mRNA 캡슐화, mRNA의 전달, 및 전체 면역원성을 변경시킬 수 있어서, 이들 특이적 LNP 전달 비히클을 위해 최적화된 변형에 대한 추가의 연구는 미래 작업에서 탐색될 수 있다(Pardi N et al., 2015, J Control Release, 217:345-351; Zhang R et al., 2018, J Control Release, 292:256-276; Kariko K et al., 2005, Immunity, 23:165-175; Li J et al., 2017, ACS Nano, 11:2531-2544; Shen X et al., 2018, Nucleic Acids Res, 46:1584-1600; Sahin U et al., 2014, Nat Rev Drug Discovery,13:759-780).
루시페라제 mRNA의 기능성 전달을 T 세포 거동을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 불멸화된 인간 T 세포주인 Jurkat 세포를 사용하여 관찰하였다(Olden BR et al., 2018, J Control Release, 282:140-147; Abraham RT et al., 2004, Nat Rev Immunol, 4:1-8; Cancer P et al., 2018, Nucleic Acids Ther, 28:285-296). 루시페라제 mRNA를 캡슐화하는 LNP를 사용하여 30 ng/60,000개 세포의 농도로 Jurkat 세포를 처리하였다. 48시간 후, 루시페라제 발현을 발광 측정을 통해 평가하였다. LNP 제형으로부터의 발광 측정을 미처리 세포 그룹에 대해 표준화하고 시험관내에서 황금 표준으로 광범위하게 간주되는 일반적으로 사용된 트랜스펙션 시약인 상업적으로 이용 가능한 리포펙타민과 비교하였다(Cardarelli F et al., 2016, Sci Reports, 1-8; Wang T et al., 2018, Molecules, 23). 라이브러리 스크린은 7개의 LNP 제형이 리포펙타민보다 상당히 더 높은 루시페라제 발현을 초래한 것을 나타냈고, 이것은 루시페라제 mRNA를 Jurkat 세포에 전달하는 개선된 능력을 나타낸다(도 3a). 이들 7개 중에서, 3개의 제형은 C12 꼬리가 있는 이온화 가능한 지질을 가졌고, 3개는 C14 꼬리를 가졌으며, 하나는 C16 꼬리를 가졌다. 폴리아민 코어 3, 6, 및 7은 지질 꼬리 길이와 관계없이 리포펙타민과 비교하여 트랜스펙션을 향상시키지 못하였다. 그러나, 전부 단지 한 고리 및 추가 산소의 유사한 구조를 가진 폴리아민 코어 2, 4, 및 5는 가장 높은 결과적인 루시페라제 발현을 보인 5개의 제형, 즉, C14-4, C14-2, C14-5, C16-2, 및 C12-4 LNP를 생성하는 데 기여하였다.
그런 후 이들 상위 5개의 LNP 제형을 다양한 mRNA 농도에 걸쳐 비교하여 Jurkat 세포 트랜스펙션에 대한 최고 LNP 제형 및 최적의 LNP 용량을 모두 측정하였다. 결과는 원래의 라이브러리 스크린으로부터 최고 성능 LNP 제형인 C14-4 LNP가 상위 5개 제형 중 최고 루시페라제 발현을 유도한 것을 확인하였다(도 3b). 루시페라제 발현의 증가는 20 ng 이상의 용량에서 모든 다른 LNP 제형과 비교하여 상당하였고, 이것은 Jurkat 세포에서 C14-4 LNP에 대한 최적 용량이 30 ng인 것을 나타냈다. C14-4 LNP의 향상된 성능은, 제형이 70.17 nm의 직경 및 35.6 ng/μL의 농도를 가지기 때문에, 크기 또는 mRNA 농도의 차이를 반영하지 못한다(도 3c). Jurkat 세포에 미치는 C14-4 LNP의 독성은 최소한이었고 세포 생존력은 리포펙타민 처리된 그룹 및 미처리 그룹과 비슷하였으며 C14-4 LNP로 처리한 후 생존력은 95% 이상으로 측정되었다.
추가로, C14-4를 통해 전달된 mRNA의 일시적인 발현을 검증하기 위하여, LNP로 처리된 Jurkat 세포에서의 루시페라제 발현을 96시간 동안 관찰하였다. 결과는 24시간째와 비교하여 48시간째에 발현의 23% 감소 및 72시간 째에 84% 감소를 보였으며, 96시간 째에는 검출 가능한 발현이 없었음을 보였고(도 3d), 이것은 일시적인 루시페라제 발현을 확인시켜주고 후속 실험을 위해 24시간 시점 사용에 대한 정보를 주었다. 종합적으로, 이들 결과는 mRNA 전달을 위한 최고 제형으로서 C14-4 LNP의 선택을 허용하였고 시험관내에서 C14-4 LNP에 대한 최적화된 트랜스펙션 방법을 제공하였다.
일차 인간 T 세포에의 지질 나노입자-매개 mRNA 전달
임상에서 암 면역요법을 위해 사용된 CAR T 세포는 수확된 환자 T 세포(CD3+)를 사용하여 생성되기 때문에, 최고 성능 C14-4 LNP를 Jurkat 세포주를 능가하는 번역 가능성을 증명하기 위해 일차 인간 T 세포에 mRNA를 전달하기 위해 사용하였다. Jurkat 세포주에 대한 V 한계는 CD4+ T 세포로부터만 유래된다는 것인 반면 일차 T 세포는 또한 CD8+ 표현형을 포함한다(Abraham RT et al., 2004, Nat Rev Immunol, 4:1-8). 그러나, 일차 T 세포는 트랜스펙션을 달성하기 위하여 활성화를 필요로 한다(Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Harrer DC et al., 2017, BMC Cancer, 17:551). CD3 및 CD28 항체로 표면이 코팅된 널리 임상적으로 사용되는 자기 비드인 다이나비드를 CAR T 임상 실험에서 사용된 것과 유사한 양상으로 T 세포의 활성화에 사용하였다(Hajj KA et al., 2019, Small, 15:1-7; Wang X et al., 2016, Mol Ther Oncolytics, 3:1-7; Lee DW et al., 2015, Lancet, 385:517-528). 분리된 T 세포를 1:1 비율의 CD4+:CD8+로 현탁하고 다양한 농도에서 루시페라제 mRNA를 캡슐화한 C14-4 LNP로 처리하였다. 24시간 후, 루시페라제 발현 및 세포 생존력을 정량화하였다(도 4a). LNP는 T 세포에서 mRNA 용량-의존적 방식으로 루시페라제 발현을 유도하였고, 이것은 T 세포에의 루시페라제 mRNA의 성공적인 전달을 나타낸다. 추가로, 최소 독성을 최고 용량에서만 관찰하였고, 이것은 C14-4 LNP의 일차 세포와의 생체부합성을 나타낸다.
추가로 C14-4의 T 세포에의 mRNA 전달에 대한 잠재력을 조사하기 위하여, 전체 포화된 이온화 가능한 지질을 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하였고, 정제된 생성물을 사용하여 C14-4 LNP를 제조하였다. 이들 정제된 C14-4 LNP를 미정제 C14-4 이온화 가능한 지질로부터 만들어진 C14-4 LNP와 비교하여 어떤 구조가 강력한 mRNA 전달을 담당했는지를 검증하였다. 정제된 C14-4 LNP의 DLS 및 A260 흡광도 특성화는 65.19 nm의 직경 및 29.8 ng/μL의 mRNA 농도를 나타냈고, 그것은 미정제 C14-4 생성물로 만들어진 LNP와 크게 다르지 않았다(도 8). 각각의 제형의 mRNA를 캡슐화하는 능력을 평가하기 위해 Ribogreen 검정을 사용하여, 미정제 및 정제된 제형이 각각 92.5% 및 86.3%의 유사한 캡슐화 효율을 가진 것으로 나타났다. 마지막으로, TNS 검정으로, 두 LNP 제형을 그것들의 표면 이온화, 또는 LNP가 50% 양성자화되는 pH로서 정의되고 어떤 pH가 LNP의 표면 전하 및 안정성에 영향을 미치는 지를 나타내는 pKa에 대해 평가하였다(Hajj KA et al., 2019, Small,15:1-7). 이온화 가능한 지질은 7 미만의 pKa를 가지는데, 이것은 산성 엔도솜 구획에서 대전되게 하여 캡슐화된 mRNA의 방출을 초래한다(Hajj KA et al., 2019, Small,15:1-7; Zhang J et al., 2011, Langmuir, 27:9473-9483). 미정제 및 정제된 C14-4 LNP는 둘 다 이온화 가능한 것으로 나타났고, 정제된 제형이 약간 더 높은 pKa 값을 가졌다(도 4b).
미정제 및 정제된 C14-4 LNP를 그런 다음 그것들의 일차 T 세포에서 mRNA를 전달하는 능력에 대해 비교하였다. T 세포를 1:1 비율의 CD4+ 대 CD8+로 현탁하고 다이나비드로 활성화한 후 LNP로 처리하였다. 루시페라제 mRNA를 캡슐화하는 미정제 및 정제된 C14-4 LNP를 루시페라제 발현 및 생존력에 대해 두 농도에서 조사하였다(도 4c). 두 농도에서 모두, 정제된 C14-4 LNP는 미정제 LNP 제형과 비교하여 약간 증가된 루시페라제 발현을 나타냈고, 두 제형 모두 세포 생존력에는 최소한의 효과를 나타냈다. 전체적으로, 어떠한 독성의 증가 없이 루시페라제 발현의 증가는 일차 T 세포 mRNA 전달에 대한 최고 성능 제형으로서 정제된 C14-4 LNP를 나타낸다.
LNP는 더 낮은 독성으로 일차 T 세포에 EP처럼 효과적으로 CAR mRNA를 전달한다
발광 측정을 통해 T 세포에 대한 기능성 루시페라제-암호화된 mRNA 전달을 정량화한 후, C14-4 LNP를 전달 비히클의 임상적으로 관련된 적용으로서 CAR mRNA 전달을 위해 활용하였다. 초기 연구가 일시적인 CAR 발현이 독성 및 표적외 효과와 관련된 장애를 극복할 수 있음을 시사했기 때문에, mRNA로 생성된 CAR T 세포를 수많은 임상 시험에 활용하였다(Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Zhao Y et al., 2010, Cancer Res, 70:9053-9061; Foster JB et al., 2019, Mol Ther, 27:747-756). 그러나, 이들 연구에서, mRNA는 일반적으로 사용되고, 강력하지만 T 세포막을 전기적으로 투과화하는 것에 의존하는 독성 트랜스펙션 방법인 전기천공법(EP)을 통해 T 세포에 전달되었다(Smits E et al., 2004, Leukemia, 18:1898-1902; Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Svoboda J et al., 2018, Blood, 132:1022-1027; DiTommaso T et al., 2018, PNAS, 115; Dullaers M et al., 2004, Mol Ther, 10:768-779; Singh N et al., 2014, Cancer Immunol Res., 2:1059-1070). 여기서, CD19+ CAR mRNA를 캡슐화하는 C14-4 LNP를 EP와 비교하여 독성을 유발하지 않으면서 기능성 CAR T 세포를 생성하는 능력을 측정하였다.
LNP를 사용하여 동일한 450 ng/μL mRNA 농도에서 EP에 대한 비교로 1:1 CD4+:CD8+ 비율에서 일차 T 세포를 처리하였다. 결과적으로 생성된 T 세포 집단을 형광단 표지된 항체 및 유동 세포분석을 사용하여 CD19+ CAR 발현에 대해 분석하고, 그것을 평균 형광 강도(MFI)와 관련하여 정량화하였다(도 5a). 결과적으로 생성된 최고 MFI는 EP를 사용하여 처리된 T 세포 및 정제된 C14-4 LNP에서 초래된 한편, 미정제 C14-4 LNP는 더 적당한 MFI를 생성하였다. 이들 값을 T 세포의 미처리 대조군 그룹에 대해 표준화했을 때, EP는 미처리 세포보다 MFI에서 10배 증가를 보였고 정제된 C14-4 LNP는 9.4배 증가를 보인 한편 미정제 C14-4 LNP는 단지 4.5배 MFI를 증가시켰다. 그러므로, 루시페라제 mRNA 전달로 관찰되는 것과 같이, 미정제 C14-4 제형은 그것의 정제된 대응물보다 발현을 유도하는 데 덜 효과적이었다. EP 처리와 비교하여 LNP 제형으로 처리된 T 세포의 생존력을 또한 정량화하였고(도 5c), 이것은 EP와 비교하여 LNP 처리로 상당히 감소된 독성을 나타냈다. 이전에 루시페라제 mRNA 전달로 볼 수 있었던 것과 같이, 정제된 및 미정제 LNP는 각각 76% 및 78%의 유사하게 높은 생존력을 가진다. 이것은 EP 처리된 T 세포에서 관찰된 31% 생존력과는 대조적이며, 현재 활용되는 이 mRNA 전달 과정의 세포독성 본질을 강조한다. 전체적으로, 이들 결과는 생체외에서 T 세포로의 mRNA 전달에 대한 EP를 능가하는 C14-4 LNP를 활용할 때의 안전성 이익을 강조한다.
T 세포에서 유사한 CD19+ CAR 발현을 유도하는 EP 및 정제된 C14-4 LNP를 사용하여, 2가지 mRNA 전달 방법을 공동 플레이팅된 암세포 사멸 검정을 사용하여 기능성 CAR 발현에 대해 평가하였다. 조작된 CAR T 세포를 루시페라제를 발현하는 CD19+ 급성 림프모세포성 백혈병(ALL) 세포, Nalm6과 함께 플레이팅함으로써, 암세포 사멸을 Nalm6 세포 단독과 비교한 발광의 감소로서 평가할 수 있다. 이 검정 및 세포주는 둘 다 이전 연구에서 CAR T 세포 기능성 및 치료 가능성을 입증하는 데 일상적으로 사용되었다(Barrett DM et al., 2011, Hum Gene Ther, 22:1575-1586; Castella M et al., 2019, Mol Ther Methods Clin Dev, 12:134-144; An N et al., 2016, Oncotarget., 7; Li X et al., 2018, Cell Rep, 23:2130-2141; .Pan Y et al., 2018, PNAS, 115:1-6). 여기서, 정제된 C14-4 LNP 또는 EP를 통해 전달된 mRNA로 조작된 CAR T 세포를 T 세포 대 이펙터 세포 비율 범위에서 비교하였다. 48시간 후, EP 및 C14-4 LNP 처리 그룹은 거의 동일하게 수행하였고 미처리 그룹보다 많은 암세포 사멸을 초래하였다(도 5a). 그러므로, 정제된 C14-4 LNP는 현재 mRNA CAR T 세포에 대한 전달의 표준인 EP와 비슷하게 mRNA-유도 CAR T 세포를 성공적으로 생성하였다. 종합적으로, 이들 결과는 정제된 C14-4 LNP를 EP와 비교하여 유사한 효능 및 감소된 T 세포 독성으로 mRNA-기반 CAR T 세포 조작에 대한 방법으로서 검증한다.
요약하면, 본원에 기술된 데이터는 T 세포로의 mRNA 전달에 효과적인 신규한 이온화 가능한 지질 및 신규한 LNP 제형을 개시한다. 본 발명은, 부분적으로, 신규한 LNP 시스템을 사용하여 T 세포에 대한 mRNA의 표적화된 전달의 문제점을 해결한다. 본 발명은, 부분적으로, T 세포로의 mRNA의 강력한 전달을 위해 사용된 C14-4로서 언급된 이온화 가능한 지질 및 그것의 LNP 제형(콜레스테롤, 인지질, 및 PEG 구성요소를 포함함)을 개시한다. 미정제 지질 및 정제된 전체 포화된 지질을 모두 사용하였다. 본원에 기술된 연구는 또한 C14-4 및 C14-4 LNP 제형의 T 세포에 mRNA를 전달하는 능력을 입증하고 현재의 황금 기준 시약 리포펙타민의 낮은 독성 및 향상된 효능은 C14-4가 T 세포가 조작되는 방식을 변경시키는 잠재력을 제공한다. 이것은 발명이 미래의 상업적 잠재력을 가지는 임상적 영역, 예컨대 CAR T 세포 치료제에 적용될 수 있지만, 또한 T 세포가 특히 트랜스펙션이 어렵기 때문에 실험실-기반/연구 환경에도 적용할 수 있다.
추가 연구를, 가능하게는 항체-기반 표적화제 또는 다른 표적화 리간드를 첨가하여 이 지질 나노입자를 생체내 T 세포에의 mRNA 전달에 사용하는 것으로 옮겨갔다. 부형제 비율(인지질, 콜레스테롤, PEG, 및 C14-4의 몰비를 다르게 함) 및 이온화 가능한 지질 대 mRNA의 비율의 측면에서 LNP 제형의 추가의 최적화를 또한 조사한다. 이것은 예컨대 선형 대신 분지형 알킬 사슬을 사용하여 새로운 부형제 또는 변형의 C14-4 지질 자체로의 도입으로 이어질 수 있다. 추가로, 루시페라제 및 CAR 이외의 다른 mRNA 운반물을 조사한다.
이들 실험에서 사용한 물질 및 방법을 이제 기술한다.
지질 합성
이온화 가능한 지질을 에폭시드 종결 알킬 사슬(Avanti Polar Lipids)을 폴리아민 코어(Enamine, Monmouth Jct, NJ)와 마이클 부가 화학을 사용하여 반응시킴으로써 합성하였다. 구성요소를 7배 과잉량의 알킬 사슬과 조합하고 자석 교반 막대를 사용하여 48시간 동안 80℃에서 혼합하였다. 그런 후 미정제 생성물을 용매 증발을 위해 Rotavapor R-300(BUCHI, Newark, DE)에 옮기고, 지질을 에탄올에 현탁시켰다. 마지막으로, 최고 성능 지질(C14-4)을 정제하기 위하여, 지질 분획을 CombiFlash Nextgen 300+ 크로마토그래피 시스템(Teledyne ISCO, Lincoln, NE)을 통해 분리하고 포화된 지질 분획을 액체 크로마토그래피-질량 분석을 사용하여 분자량에 의해 확인하였다.
CAR mRNA 합성
mRNA를 이전에 기술된 것과 같이 표준 시험관내 전사 방법을 사용하여 제조하였다(Singh N et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:1059-1070). 간단히 설명하면, CD19를 표적화하고 CD3제타 및 4-IBB 공동자극 도메인을 포함하고 있는 2세대 렌티바이러스 벡터를 암호화하는 플라스미드 DNA를 밤새 선형화한 후, T7 m메시지 ULTRA 키트(Thermo Fisher)를 제조사 설명서대로 사용하여 mRNA를 제조하였다. 그런 후 mRNA를 폴리A 꼬리를 달고 캡핑하고, RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
LNP 제형 및 특성화
LNP를 합성하기 위하여, mRNA를 함유한 수성 상 및 지질 및 콜레스테롤 구성요소를 함유한 에탄올 상을 이전에 기술된 것과 같이 미세유체 장치를 사용하여 혼합하였다(Chen D et all., 2012, J Am Chem Soc, 134:6948-6951). 간단히 설명하면, 수성 상을 10 mM 시트레이트 완충제 및 N1-메틸-PseudoU 및 5-메틸-C 치환이 있는 루시페라제 mRNA(Trilink Biotechnologies, San Diego, CA)를 1 mg/mL에서 사용하여 제조하였다. 에탄올 상을 제조하기 위하여, 이온화 가능한 지질, 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민(DOPE)(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), 콜레스테롤(Sigma, St. Louis, MO), 및 지질-고정된 PEG(Avanti Polar Lipids) 구성요소를 각각 35%, 16%, 46.5%, 및 2.5%의 설정 몰비로 조합하였다. Pump33DS 주사기 펌프(Harvard Apparatus, Holliston, MA)를 사용하여 에탄올 및 수성 상을 미세유체 장치에서 3:1 비율로 혼합하였다(Chen D et all., 2012, J Am Chem Soc, 134:6948-6951). 혼합 후, LNP를 1x PBS에 대해 2시간 동안 투석한 후 0.22 μm 필터를 통해 멸균하였다. 그런 후 Zetasizer Nano(Malvern nstruments, Malvern, UK) 상에서 수행된 동적 광산란(DLS)을 사용하여 1x PBS에 현탁된 LNP의 직경(z-평균) 및 다분산도 지수(PDI)를 삼중으로 측정하였다. NanoDrop ND-1000 분광분석기(ThermoFisher, Waltham, MA)를 사용하여 각각의 LNP 제형의 mRNA 농도를 얻었다.
최고 성능 LNP 제형의 추가 분석은 LNP의 캡슐화 효율 및 pKa를 각각 측정하기 위한 Quant-iT Ribogreen(ThermoFisher) 및 6-(프톨루이디닐)나프탈렌-2-설폰산(TNS) 검정을 포함하였다. Quant-iT Ribogreen을 이전에 기술된 것과 같이 수행하였다(Heyes J et al., 2005, J Control Release, 107:276-287). 간단히 설명하면, 동일한 농도의 LNP를 Triton X-100(Sigma)으로 처리하여 LNP를 용해시키거나 미처리 상태로 놓아두고 10분 후, 두 그룹을 96 웰-플레이트에 RNA 표준과 함께 삼중으로 플레이팅하였다. 형광 Ribogreen 시약을 제조사 지시대로 첨가하고, 결과적으로 생성된 형광을 플레이트 판독기 상에서 측정하였다. 값을 표준 곡선과 비교하여 RNA 함량을 정량화하고, 캡슐화 효율을 계산하였다. LNP pKa를 측정하기 위하여, 이전에 기술된 것과 같이 TNS 검정을 사용하여 표면 이온화를 측정하였다(Hajj KA et al., 2019, Small, 15:1-7.). 150 mM 염화 나트륨, 20 mM 인산 나트륨, 25 mM 암모늄 시트레이트, 및 20 mM 암모늄 아세테이트의 완충 용액을 조정하여 0.5의 증분으로 pH 값을 2에서 12의 범위에 도달하게 하였다. LNP를 96 웰-플레이트에서 삼중 웰의 각각의 pH-조정 용액에 첨가하였다. 그런 후 TNS를 각각의 웰에 6 μM의 최종 TNS 농도에 도달하도록 첨가하고, 결과적으로 생성된 형광을 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 그런 후 pKa를 형광 강도가 그것의 최대 값의 50% - 50% 양성자화를 반영함-가 되는 pH로서 계산하였다.
Jurkat 세포의 mRNA 트랜스펙션
불멸화된 인간 T 세포주(Abraham RT et al., 2004, Nat Rev Immunol, 4:1-8)인 Jurkat 세포(ATCC TIB-152)를 10% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 L-글루타민을 가진 RPMI-1640(ThermoFisher,)에서 배양하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 60 μL의 배지에 웰당 60,000개 세포로 플레이팅하고 즉시 다양한 농도로 PBS에 희석된 60 μL의 LNP로 처리하였다. 양성 대조군 비교로서 사용된 리포펙타민 MessengerMAX 트랜스펙션 시약(ThermoFisher)을 제조사 프로토콜대로 mRNA와 10분 동안 조합하여 LNP 그룹과 동일한 mRNA 농도를 사용하여 웰을 처리하기 위해 사용하였다. 48시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 300 xg에서 4분 동안 원심분리하고 50 μL의 1x 용해 완충액(Promega, Madison, WI) 및 100 μL의 루시페라제 검정 기질(Promega)에 재현탁하였다. 그런 후 발광을 Infinite M Plex 플레이트 판독기(Tecan, Morrisville, NC)를 사용하여 정량화하였다. 각각의 그룹으로부터의 발광 신호를 미처리 세포 또는 최저 농도 처리 그룹에 대해 표준화하고, 시약이 있지만 세포는 없는 웰로서 측정된 바탕값을 뺐다. 세포독성을 평가하기 위하여, Jurkat 세포를 동일한 조건 하에서 플레이팅하고 60,000개 세포당 30 ng mRNA에서 C14-4 또는 리포펙타민으로 처리하였다. 48시간 후, 60 μL의 CellTiter-Glo(Promega)를 각각의 웰에 첨가하고, ATP 생성에 상응하는 발광을 플레이트 판독기를 사용하여 정량화하였다. 각각의 그룹으로부터의 발광 신호를 미처리 세포에 대해 표준화하고, 바탕값을 뺐다.
일차 T 세포의 mRNA 트랜스펙션
일차 T 세포(CD3+)를 펜실베이니아 대학 인간 면역학 코어로부터 얻어서 1:1 비율의 CD4:CD8로 조합하였다. 그런 후 LNP로 처리할 세포를 밤새 인간 Tactivator CD3/CD28 다이나비드(ThermoFisher)로 3:1의 비드 대 세포 비율에서 활성화하였다. 활성화 후, 세포를 60 μL의 배지에서 96-웰 플레이트의 웰당 60,000개 세포로 플레이팅하고 다양한 mRNA 농도에서 LNP로 처리하였다. 전기천공법을 위해, T 세포를 배지로 3회 세척하고, 108개 세포/mL로 재현탁하고, 1 mL의 T 세포당 100 μg의 농도로 전사된 mRNA와 혼합하였다. 그런 후 세포를 2-mm 큐벳에서 ECM830 전기 사각형파 천공기(Harvard Apparatus BTX)를 사용하여 전기천공하였다. 루시페라제 mRNA 처리를 포함할 실험을 위해, 위에서 기술한 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 48시간 후 발광 및 24시간 후 독성을 평가하였다. CAR mRNA 처리를 위해, 표면 CAR 발현을 Novartis Pharmaceuticals사에 의해 풍부하게 제공받은, CD19 CAR에 대한 항이디오타입 항체를 사용하여 검출하였다. CAR mRNA 처리의 독성을 CellTiter Glo 키트를 사용하여 위에서 기술한 것과 같이 평가하였다.
기능성 검정
CAR T 세포를 ALL 세포주인 루시페라제-발현 Nalm-6 세포와 함께 다양한 이펙터 대 표적 비율로 공동 플레이팅하였다. 공동 배양 48시간 후, D-루시페린 칼륨 염(Perkin-Elmer, Waltham, MA)을 세포 배양물에 최종 농도가 15 μg/mL이 되도록 첨가하고 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 발광을 Synergy H4 이미저(BioTek, Winooski, VT)를 사용하여 검출하고, 신호를 BioTek Gen5 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 퍼센트 특이적 용해를 이펙터가 없는 표적 세포의 대조군을 사용하여 계산하였다.
실시예 2: T 세포 전달을 위한 지질 나노입자 조작
부형제 비율의 측면에서 C14-4 제형 파라미터의 추가의 최적화는 이미 시작되었다. 생성된 제형의 두 라이브러리가 첨부된다(라이브러리 A 및 후속적으로 라이브러리 A로부터의 결과를 토대로 한 라이브러리 B; 라이브러리 A로부터의 대표적인 제형을 A#로 명명하고, 라이브러리 B로부터의 대표적인 제형은 B#임). 둘 다 C14-4 지질을 사용하여 만들어졌지만, 새로운 제형의 일부는 독성의 증가 없이 원래의 C14-4 제형을 능가하는 T 세포주에서의 향상된 mRNA 전달을 입증하였다.
이온화 가능한 LNP는 핵산을 포함한, 치료용 거대분자의 세포내 전달을 위한 비히클로서의 큰 가능성을 보였다(Mukalel A.J., 2019, Cancer Lett, 458:102-112). LNP 제형은 많지만, 그것들은 일반적인 부형제: 막 안정성을 위한 콜레스테롤, 엔도솜 탈출을 보조하기 위한 인지질, 및 면역원성을 감소시키기 위한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용한다(Reichmuth A.M., 2016, Ther Deliv, 7:319-334). 달라지는 부형제 조합은 LNP의 물리화학적 특성을 상당히 변화시킬 수 있고, 그로써 그것의 전달 용량에 영향을 미칠 수 있다(Kauffman K., 2015, Nano Lett, 15:7300-7306). 이 연구 과정에서, LNP의 2개의 라이브러리를 T 세포에 대해 조작하였다(도 8 및 도 9). 큰 범위의 구성요소 변동을 16개의 대표적인 제형만으로 관찰할 수 있도록 제형을 직교 DOE 설계를 사용하여 선택하였다.
각각의 제형은 다양한 몰비의 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 헬퍼 지질, 및 지질-콘쥬게이션된 PEG를 함유하였다. 각각의 제형의 z-평균 직경 및 pKa를 각각 동적 광산란, 2-(p-톨루이디닐)나프탈렌-6-설폰산(TNS) 검정, 및 260 nm 흡광도 측정을 사용하여 측정하였다. 불멸화된 인간 T 세포인 Jurkat 세포를 각각의 제형으로 48시간 동안 처리하고 시험관내 세포내 전달에 대해 평가하였다. 각각의 제형의 세포독성을 상업적 세포-역가 Glo 검정을 통해 유사하게 평가하였다.
최적화된 제형에 대한 데이터를 도 9 및 도 10에 도시한다. 각각의 제형의 시험관내 전달 효율을 표준 루시페라제 발현 검정을 사용하여 평가하였다. 간단히 설명하면, 반딧불이 루시페라제를 암호화하는 mRNA를 함유한 LNP를 불멸화된 인간 T 세포인 Jurkat 세포에 60,000개 세포당 30 ng의 mRNA 농도로 전달하였다. 48시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 용해시키고 반딧불이 루시페린으로 처리하였다. 그런 후 LNP-매개 트랜스펙션의 정도를 플레이트 판독기 상에서 발광 강도로서 측정하였다. 각각의 제형의 세포독성을 상업적 세포-역가 Glo 검정을 사용하여 유사하게 평가하였다.
라이브러리 A의 특성화는 부형제 조성물과 관련된 전달의 많은 경향을 나타냈다. 라이브러리 A에서 최적의 부형제 조건은 차세대 라이브러리 B의 개발로 이어졌다. 라이브러리 B의 제형은 라이브러리 A의 것보다 훨씬 더 큰 캡슐화 효율 및 더 큰 z-평균 직경을 입증하였고 라이브러리 B의 많은 제형은 심지어 라이브러리 A로부터의 최고 성능 제형을 능가하여 위에서 언급된 경향을 지지한다. 추가적으로, 라이브러리 B의 모든 제형은 48시간 동안 80%를 넘은 생존력을 나타내는 것으로 관찰되었다. 그러므로, T 세포에의 세포내 전달을 위한 다수의 고도로 강력한 LNP 제형의 개발이 보고된다. 이들 LNP는 암 면역요법을 포함한, 미래의 T 세포 조작 응용에 사용하기 위한 잠재력을 가지고 있다.
실시예 3: T 세포에 mRNA를 전달하는 능력(최소한의 독성으로)을 개선하기 위한 LNP의 부형제 조성의 변경
본 실시예는 대표적인 라이브러리 A 및 라이브러리 B 제형에 대해 얻어진 in vitro 및 ex vitro 데이터를 입증한다. 시험관내 연구에서, 다양한 부형제 농도를 가진 C14-494의 16개의 대표적인 제형을 포함하는 라이브러리 A(예컨대, 도 9a)를 Jurkat 세포주(불멸화된 인간 T 세포)에 루시페라제 mRNA를 전달하는 능력에 대해 스크리닝하였다. 라이브러리 A 결과를 토대로 생성된 라이브러리 B(예컨대, 도 10)를 또한 시험관내 연구로 Jurkat에서 스크리닝하였다. 추가로 생체외 연구는 라이브러리 A 및 B의 대표적인 최고 성능 제형을 사용하여 일차 T 세포에의 루시페라제 mRNA의 전달에 집중하였다.
보다 구체적으로, Jurkat을 24시간 동안 30 ng/60,0000개 세포로 처리하였다. 라이브러리 A로부터의 데이터를 토대로 하여 라이브러리 B에 대해 만들어진 조정으로 보다 많은 "히트" 제형(또는 표준 제형 S2보다 더 높은 전달을 달성한 제형)을 만들었고 LNP 제형에서 전체적으로 더 적은 독성을 유발하였다. 루시페라제 활성을 LNP(루시페라제 mRNA를 함유함)와 인큐베이션한 후 24시간 후에 루시페라제 검정을 사용하여 측정하였다(도 14a). 퍼센트 생존력을 동일한 시점에서 세포 역가 Glo 검정으로 측정하였다(도 14b). 각각의 막대는 3개의 생물학적 복제물(각각 3개의 기술적인 복제물 포함)을 함유하며 0 ng 처리에 대해 표준화되었다.
리포펙타민 비교(도 15)는 제형 B10이 이 상업적으로 이용 가능한 표준을 능가한 것을 보여주었다. 나아가, 독성학 결과는 어느 쪽도 Jurkat에 대해 독성이 없었음을 입증하였다.
추가적으로, Jurkat을 24시간 동안 루시페라제-암호화 mRNA로 처리하여 상이한 농도/용량에서 다양한 대표적인 제형에 대한 발광 및 생존력을 평가하였다(도 16a 및 도 16b). 나아가, 3개의 상이한 일차 환자 T 세포 샘플을 밤새 활성화하고 표준, A16, 또는 B10 제형의 용량으로 처리하였다(도 17a 내지 도 17c). 루시페라제 암호화 mRNA 전달 값을 0 ng 처리에 대해 표준화하였다. 도너 다양성은 상이한 전체 루시페라제 판독값을 초래하였다. 나아가, 추가 연구는 일차 T 세포에 CAR mRNA를 전달하기 위한 최고 성능 LNP(제형 B10)의 평가에 집중된다.
본원에서 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원, 및 출판물의 개시는 본원에서 그 전문이 참조로 포함된다. 본 발명은 특정 구현예를 참조로 하여 개시되었지만, 본 발명의 다른 구현예 및 변화가 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 기술분야에 숙련된 사람들에 의해 고안될 수 있는 것이 분명하다. 첨부되는 청구범위는 모든 그러한 구현예 및 동등한 변화를 포함하는 것으로 해석되어야 할 것으로 의도된다.

Claims (46)

  1. 적어도 하나의 mRNA 분자 및 식(I)의 구조를 가지는 적어도 하나의 화합물 또는 그것의 염을 포함하는 지질 나노입자(LNP):
    Figure pct00033

    식(I),
    상기 식에서 A1 및 A2는 C, C(H), N, S, 및 P로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    각각의 L1, L2, L3, L4, L5, 및 L6은 C, C(H)2, C(H)(R19), O, N(H), 및 N(R19)로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    각각의 R1, R2, R3a, R3b, R4a, R4b, R5a, R5b, R6a, R6b, R7a, R7b, R8a, R8b, R9a, R9b, R10a, R10b, R11a, R11b, R12a, R12b, R13a, R13b, R14a, R14b, R15a, R15b, R16, R17, R18, 및 R19는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알킬, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, -Y(R20)z`(R21)z``-헤테로사이클로알킬, 치환된-(R20)z`(R21)z``-헤테로사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알케닐, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알키닐, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, -Y(R20)z`(R21)z``-아릴, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, -Y(R20)z`(R21)z``-헤테로아릴, 치환된 -Y(R20)z`(R21)z``-헤테로아릴, 알콕시카르보닐, 선형 알콕시카르보닐, 분지형 알콕시카르보닐, 아미도, 아미노, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, 하이드록실, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 하이드록시아릴, 알콕시, 카르복실, 카르복실레이트, 에스테르, -Y(R20)z`(R21)z``-에스테르, -Y(R20)z`(R21)z``, =O, -NO2, -CN, 및 설폭시로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    Y는 C, N, O, S, 및 P로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
    각각의 R20 및 R21은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알콕시카르보닐, 선형 알콕시카르보닐, 분지형 알콕시카르보닐, 아미도, 아미노, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, 하이드록실, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 하이드록시아릴, 알콕시, 카르복실, 카르복실레이트, 에스테르, =O, -NO2, -CN, 및 설폭시로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    z` 및 z``는 각각 독립적으로 0, 1, 또는 2로 표시되는 정수이고; 및
    m, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w, 및 x는 각각 독립적으로 0, 1, 2; 3, 4, 또는 5로 표시되는 정수이며; 및
    상기 mRNA 분자는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식(I)의 구조를 가지는 화합물은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된 구조를 가지는 화합물인 것인 LNP:
    Figure pct00034

    식(II);
    Figure pct00035

    식(III);
    Figure pct00036

    식(IV);
    Figure pct00037

    식(V);
    Figure pct00038

    식(VI); 및
    Figure pct00039

    식(VII),
    상기 식에서 각각의 R1, R2, R3, R4, 및 R5는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알콕시카르보닐, 선형 알콕시카르보닐, 분지형 알콕시카르보닐, 아미도, 아미노, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, 하이드록실, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 하이드록시아릴, 알콕시, 카르복실, 카르복실레이트, 및 에스테르로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    m, n, o, p, 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 25의 정수이고; 및
    r, s, t, u, v, w, 및 x는 각각 독립적으로 0, 1, 2; 3, 4, 및 5로 표시되는 정수이다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 식(I)의 구조를 가지는 화합물은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된 구조를 가지는 화합물인 것인 LNP:
    Figure pct00040

    식(VIII);
    Figure pct00041

    식(IX);
    Figure pct00042

    식(X);
    Figure pct00043

    식(XI);
    Figure pct00044

    식(XII);
    Figure pct00045

    식(XIII);
    Figure pct00046

    식(XIV); 및
    Figure pct00047

    식(XV);
    상기 식에서 각각의 R1, R2, R3, R4, 및 R5는 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 사이클로알키닐, 치환된 사이클로알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알콕시카르보닐, 선형 알콕시카르보닐, 분지형 알콕시카르보닐, 아미도, 아미노, 아미노알킬, 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미노아릴, 아미노아세테이트, 아실, 하이드록실, 하이드록시알킬, 하이드록시알케닐, 하이드록시알키닐, 하이드록시아릴, 알콕시, 카르복실, 카르복실레이트, 및 에스테르로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되고; 및
    m, n, o, p, 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 25의 정수이다.
  4. 제1항에 있어서, 식(I)의 구조를 가지는 화합물은 이온화 가능한 지질인 것인 LNP.
  5. 제1항에 있어서, 상기 mRNA 분자는 식(I)의 구조를 가는 화합물 내에 캡슐화되는 것인 LNP.
  6. 제1항에 있어서, 상기 LNP는 식(I)의 구조를 가지는 화합물 또는 그것의 염을 약 1 몰% 내지 약 100 몰%의 농도 범위로 포함하는 것인 LNP.
  7. 제6항에 있어서, 상기 LNP는 식(I)의 구조를 가지는 화합물 또는 그것의 염을 약 10 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함하는 것인 LNP.
  8. 제1항에 있어서, 상기 LNP는 적어도 하나의 헬퍼 지질을 추가로 포함하는 것인 LNP.
  9. 제8항에 있어서, 상기 LNP는 적어도 하나의 헬퍼 지질을 약 0.01 몰% 내지 약 99.9 몰%의 농도 범위로 포함하는 것인 LNP.
  10. 제9항에 있어서, 상기 LNP는 적어도 하나의 헬퍼 지질을 약 0.5 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함하는 것인 LNP.
  11. 제8항에 있어서, 상기 헬퍼 지질은 인지질, 콜레스테롤 지질, 중합체, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 LNP.
  12. 제11항에 있어서, 상기 인지질은 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE) 또는 그것의 유도체, 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 또는 그것의 유도체, 다이스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE) 또는 그것의 유도체, 스테아로일올레오일포스파티딜콜린(SOPC) 또는 그것의 유도체, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티딜에탄올 아민(SOPE) 또는 그것의 유도체, N-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTAP) 또는 그것의 유도체, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 LNP.
  13. 제11항에 있어서, 상기 LNP는 인지질을 약 15 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함하는 것인 LNP.
  14. 제11항에 있어서, 상기 콜레스테롤 지질은 콜레스테롤 또는 그것의 유도체인 것인 LNP.
  15. 제11항에 있어서, 상기 LNP는 콜레스테롤 지질을 약 20 몰% 내지 약 50 몰%의 농도 범위로 포함하는 것인 LNP.
  16. 제11항에 있어서, 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 그것의 유도체인 것인 LNP.
  17. 제11항에 있어서, 상기 LNP는 중합체를 약 0.5 몰% 내지 약 10 몰%의 농도 범위로 포함하는 것인 LNP.
  18. 제1항에 있어서, 상기 LNP는 핵산 분자, 보조제(adjuvant), 치료제, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 추가로 포함하는 것인 LNP.
  19. 제18항에 있어서, 상기 핵산 분자는 치료제인 것인 LNP.
  20. 제18항에 있어서, 상기 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자인 것인 LNP.
  21. 제18항에 있어서, 상기 핵산 분자는 cDNA, mRNA, miRNA, siRNA, sgRNA, 변형된 RNA, 안타고미르, 안티센스 분자, 가이드 RNA 분자, CRISPR 가이드 RNA 분자, 펩타이드, 치료 펩타이드, 표적화된 핵산, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 LNP 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 mRNA는 하나 이상의 항원을 암호화하는 것인 LNP.
  23. 제22항에 있어서, 상기 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 인플루엔자 항원, 종양 관련 항원, 및 종양 특이적 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 LNP.
  24. 제18항에 있어서, 상기 핵산 분자는 프로모터 또는 조절 서열을 포함하는 것인 LNP.
  25. 제18항에 있어서, CAR을 암호화하는 mRNA 분자, 핵산 분자, 보조제(adjuvant), 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합은 식(I)의 구조를 가지는 화합물 내에 캡슐화되는 것인 LNP.
  26. 제1항의 적어도 하나의 LNP를 포함하는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 조성물은 백신인 것인, 조성물.
  28. CAR을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법으로서, 제1항의 LNP 또는 그것의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 LNP 또는 그것의 조성물은 CAR을 암호화하는 mRNA 분자를 표적에게 전달하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 표적은 면역 세포, T 세포, 상주 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 암성 세포, 질환 또는 장애와 관련된 세포, 질환 또는 장애와 관련된 조직, 뇌 조직, 중추신경계 조직, 폐 조직, 정점 표면 조직, 상피 세포, 내피 세포, 간 조직, 장 조직, 결장 조직, 소장 조직, 대장 조직, 대변, 골수, 대식세포, 비장 조직, 근육 조직, 관절 조직, 종양 세포, 병든 조직, 림프절 조직, 림프 순환, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 방법은 LNP 또는 그것의 조성물의 단일 투여를 포함하는 것인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 방법은 LNP 또는 그것의 조성물의 다중 투여를 포함하는 것인 방법.
  32. 제28항에 있어서, 상기 LNP 또는 그것의 조성물은 피내, 피하, 근육내, 심실내, 척수강내, 구강 전달, 정맥내, 기관내, 복강내, 자궁내 전달, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 전달 경로에 의해 투여되는 것인 방법.
  33. 제28항에 있어서, 상기 LNP 또는 그것의 조성물은 적어도 하나의 핵산 분자, 보조제, 치료제, 또는 그것의 임의의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 핵산 분자는 치료제인 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자인 것인 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 핵산 분자는 cDNA, mRNA, miRNA, siRNA, sgRNA, 안타고미르, 안티센스 분자, 가이드 RNA 분자, CRISPR 가이드 RNA 분자, 펩타이드, 치료 펩타이드, 표적화된 핵산, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 mRNA는 하나 이상의 항원을 암호화하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 인플루엔자 항원, 종양 관련 항원, 및 종양 특이적 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 방법은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염, 인플루엔자 감염, 암, 관절염, 심장 질환, 심혈관 질환, 신경 장애 또는 질환, 유전적 질환, 자가면역 질환, 태아 질환, 태아 발달에 영향을 미치는 유전적 질환, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 치료 또는 예방하는 것인 방법.
  40. 제33항에 있어서, 상기 핵산 분자는 프로모터 또는 조절 서열을 포함하는 것인 방법.
  41. 제33항에 있어서, CAR을 암호화하는 mRNA 분자, 핵산 분자, 보조제(adjuvant), 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합은 식(I)의 구조를 가지는 화합물 내에 캡슐화되는 것인 방법.
  42. 제28항에 있어서, 상기 LNP 조성물은 백신인 것인 방법.
  43. CAR을 암호화하는 적어도 하나의 mRNA 분자 및 적어도 하나의 핵산 분자, 보조제(adjuvant), 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합을 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법으로서, 제18항의 LNP 또는 그것의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 LNP 또는 그것의 조성물은 mRNA 분자 및 핵산 분자, 보조제(adjuvant), 치료제, 또는 그것들의 임의의 조합을 표적에게 전달하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 표적은 면역 세포, T 세포, 상주 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 암성 세포, 질환 또는 장애와 관련된 세포, 질환 또는 장애와 관련된 조직, 뇌 조직, 중추신경계 조직, 폐 조직, 정점 표면 조직, 상피 세포, 내피 세포, 간 조직, 장 조직, 결장 조직, 소장 조직, 대장 조직, 대변, 골수, 대식세포, 비장 조직, 근육 조직, 관절 조직, 종양 세포, 병든 조직, 림프절 조직, 림프 순환, 및 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 방법은 유전자 전달 방법인 것인, 방법.
  46. 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 제1항의 LNP 또는 그것의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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