JP2021176932A - カルボキシ化分解性ポリロタキサン及びその製造方法 - Google Patents
カルボキシ化分解性ポリロタキサン及びその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021176932A JP2021176932A JP2020082376A JP2020082376A JP2021176932A JP 2021176932 A JP2021176932 A JP 2021176932A JP 2020082376 A JP2020082376 A JP 2020082376A JP 2020082376 A JP2020082376 A JP 2020082376A JP 2021176932 A JP2021176932 A JP 2021176932A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polyrotaxane
- group
- degradable
- polyrotaxane compound
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 *CCC(*)CC(CC(*)CC(*)CCN=O)*=C Chemical compound *CCC(*)CC(CC(*)CC(*)CCN=O)*=C 0.000 description 2
Images
Abstract
【課題】カルボキシ基で修飾された複数の環状分子と、末端基を有する直鎖状分子とを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を提供することを目的とする。【解決手段】酸分解性ポリロタキサンの環状分子にカルボキシエステルを導入する工程と、弱アルカリ水溶液下でエステルの脱保護を行う工程とを含む製造方法により、カルボキシ基で修飾された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を提供することができる。【選択図】図２
Description
本発明は、カルボキシ基で修飾された複数の環状分子を有する、酸分解性のポリロタキサン化合物、およびその合成方法に関する。より詳細には、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリンを有する、酸分解性のポリロタキサン化合物、およびその合成方法に関する。また、カルボキシ基で修飾された複数の環状分子を有する、酸分解性のポリロタキサン化合物の疾患治療薬としての使用にも関する。
近年、グルコースが環状に結合したシクロデキストリン類の類縁体であるヒドロキシプロピル化β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）がニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ病）に対する医薬として期待されている。米国で進められているフェーズＩ／ＩＩ試験の結果では、ＨＰ−β−ＣＤによる治療効果が認められたものの、全例で聴覚障害を示すことが明らかとなり、安全性が懸念されている（非特許文献１）。
本発明者らは、このようなＨＰ−β−ＣＤの体内動態、副作用の問題点を改善し、より安全かつ効果的な薬剤の確立を目的に、β−ＣＤ空洞部に高分子鎖が貫通した骨格のポリロタキサンを用いたＮＰＣ 病治療を提唱してきた（特許文献１）。ポリロタキサンはβ−ＣＤ空洞部が高分子鎖によって占められているため、β−ＣＤ空洞部に由来する毒性等を回避できることを明らかにしている。また、ポリロタキサンが細胞内へと取り込まれた後に、酸性ｐＨのリソソームで分解する設計を施すことで、細胞内環境特異的にβ−ＣＤを放出し、リソソームに蓄積したコレステロールに作用することが可能となり、医薬としての機能（コレステロールの包接と排泄の促進）も示す。実際に酸分解型ポリロタキサンはＮＰＣ病モデルマウスに対し、従来のＨＰ−β−ＣＤよりも低濃度でコレステロール蓄積を抑制し、治療効果を示すことが明らかにされている（非特許文献２）。
Lancet 2017, 390, 1758-1768
A. Tamura, N. Yui. J. Control.Release 2018, 269, 148-158
これまでに使用してきた酸分解型ポリロタキサンは親水性官能基である２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル基（ＨＥＥ基）を化学修飾することで、ポリロタキサンの水溶化を行ってきた。HEE基は水溶性に優れる反面、細胞内への取り込み効率が低いことが課題であった。ポリロタキサンの投与量をさらに低減させる、治療効果を増加させるためには、単に水溶性だけではなく、細胞内への取り込み効率を改善する官能基の化学修飾が必要である。これまでに、負電荷のカルボキシ基を化学修飾したポリロタキサン（非分解型）がマクロファージのスカベンジャーレセプターに作用し、取り込みを顕著に増加させることを明らかにしている（H. Matsui et al. Macromol. Biosci. 2018, 18,1800059；この論文では非分解性のα−ＣＤ／ＰＥＧ型ポリロタキサンで実験を行っている）。よってカルボキシ基はポリロタキサンの医薬応用において有用な化学修飾であると期待される。しかしながら、上記の酸分解性ポリロタキサンへのカルボキシ基の化学修飾は、カルボキシ基に由来する酸のため合成反応中に分解を引き起こすため困難であった。また、これまでに報告した合成方法は強アルカリ性条件での反応が必要であるが、この条件でも酸分解性ポリロタキサンの分解が起こる。よって、酸分解性ポリロタキサンへのカルボキシ基の化学修飾は非常に困難な課題であった。
本技術では、医薬応用のための酸分解型ポリロタキサンへのカルボキシ基の化学修飾を可能とする合成方法を提供する。具体的には、保護基を用いた多段階の合成ステップにより、強アルカリ条件での反応を避けるとともに、弱アルカリ条件で脱保護を行うことで、カルボキシ基に由来する酸による酸分解型ポリロタキサンの分解を抑制する合成方法を考案し、カルボキシ基修飾ポリロタキサンを得ることに成功した。この方法を用いることで複数種のリンカー構造の異なるカルボキシ基修飾酸分解型ポリロタキサンの合成に成功した。
本発明者らは、カルボキシ基修飾ポリロタキサンはスカベンジャーレセプターが発現しているマウス樹上細胞（ＤＣ２．４細胞）、マウスマクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）への取り込みが従来のＨＥＥ基修飾ポリロタキサンよりも顕著に増加することを明らかにした。また、スカベンジャーレセプターが発現していないマウス線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞）、NPC病患者由来皮膚線維芽細胞においても、カルボキシ基修飾ポリロタキサンは、従来のＨＥＥ基修飾酸分解型ポリロタキサンよりも高い取り込みを示すことが明らかになった。よって、カルボキシ基修飾酸分解型ポリロタキサンは従来の課題であった細胞への取り込み効率を改善することから、有用な設計であると考えられる。
本発明の態様は以下の事項に関する。
［１］カルボキシ基で修飾された複数の環状分子と、末端基を有する直鎖状分子とを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物。
［２］細胞内の酸性環境下で分解する、［１］記載のポリロタキサン化合物。
［３］ｐＨ４．０〜６．０の酸性環境下で分解する、［１］または［２］記載のポリロタキサン化合物。
［４］環状分子がβ−シクロデキストリンである、［１］〜［３］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［５］シクロデキストリンの水酸基が修飾されている、［１］〜［４］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［６］シクロデキストリンが１分子あたり１〜２１個のカルボキシ基を有する、［１］〜［５］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［７］シクロデキストリンがリンカーを介してカルボキシ基により修飾されている、［１］〜［６］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［８］リンカーが、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、又は−Ｏ−を含む、［１］〜［７］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［９］カルボキシ基が置換又は非置換のアルキルカルボキシ基である、［１］〜［８］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１０］カルボキシ基が、メチルカルボキシ基、エチルカルボキシ基、プロピルカルボキシ基、ブチルカルボキシ基、ペンチルカルボキシ基、又はヘキシルカルボキシ基である、［１］〜［９］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１１］カルボキシ基が、−ＣＯ−ＯＣＨ３、−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−ＣＯ−ＯＣ6Ｈ5、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ5、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣＨ３、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ5、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣＨ３、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ５、又は−Ｒａ−ＣＯ−ＯＲｂ（ここで、Ｒａは単結合又はＣ１−６アルキレン基、ＲｂはH又は直鎖状、分岐状又は環状のＣ１−６アルキル基をそれぞれ表す）で表される置換カルボキシ基である、［１］〜［９］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１２］カルボキシ基が、カルボキシメチルカルバメート基、カルボキシエチルカルバメート基、又はカルボキシプロピルカルバメート基である、［１］〜［１０］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１３］直鎖状分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む、［１］〜［１２］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１４］直鎖状分子がポロキサマーを含む、［１］〜［１３］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１５］直鎖状分子の分子量が４０００〜７０００である、［１］〜［１４］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１６］直鎖状分子と環状分子との分子数の比率が１：１０〜１：２０あることを特徴とする、［１］〜［１５］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１７］末端基が、置換基を有する又は有さないＯ−トリフェニルメチル基、置換基を有する又は有さないＳ−トリフェニルメチル基、および置換基を有する又は有さないＮ−トリフェニルメチル基から成る群より選択される、［１］〜［１６］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１８］末端基が直鎖状分子にペプチド結合、カーバメート結合、エステル結合、またはエーテル結合を介して連結されている、［１］〜［１７］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１９］カルボキシ基で修飾された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の製造方法であって、酸分解性ポリロタキサンの環状分子にカルボキシエステルを導入する工程と、弱アルカリ水溶液下でエステルの脱保護を行う工程とを含む、方法。
［２０］カルボキシ基で修飾された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の製造方法であって、ポロキサマーの両末端に一級アミノ基を有するポロキサマーを得る工程（工程Ａ）、前記ポロキサマーとβ−シクロデキストリンとを反応させて擬ポリロタキサンを得る工程（工程Ｂ）、前記擬ポリロタキサンの両末端をＮ−トリチルグリシンでキャッピングする工程（工程Ｃ）、カルボキシエステルを酸分解性ポリロタキサンの環状分子に導入する工程（工程Ｄ）、および弱アルカリ水溶液下でエステルを脱保護させる工程（工程Ｅ）とを含む、方法。
［２１］水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、又はナトリウムメトキシド溶液を用いて、カルボキシエステルを環状分子に導入した酸分解性ポリロタキサンのエステルを脱保護させる［１９］又は［２０］記載の方法。
［２２］カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを促進するための組成物。
［２３］カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための医薬組成物。
［２４］カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物。
［２５］カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを促進するための方法。
［２６］対象に対して、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための方法。
［２７］対象に対して、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための方法。
［２８］細胞においてオートファジーを誘導するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［２９］癌を治療するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［３０］細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［３１］ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［３２］環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物。
［３３］環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物。
［１］カルボキシ基で修飾された複数の環状分子と、末端基を有する直鎖状分子とを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物。
［２］細胞内の酸性環境下で分解する、［１］記載のポリロタキサン化合物。
［３］ｐＨ４．０〜６．０の酸性環境下で分解する、［１］または［２］記載のポリロタキサン化合物。
［４］環状分子がβ−シクロデキストリンである、［１］〜［３］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［５］シクロデキストリンの水酸基が修飾されている、［１］〜［４］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［６］シクロデキストリンが１分子あたり１〜２１個のカルボキシ基を有する、［１］〜［５］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［７］シクロデキストリンがリンカーを介してカルボキシ基により修飾されている、［１］〜［６］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［８］リンカーが、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、又は−Ｏ−を含む、［１］〜［７］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［９］カルボキシ基が置換又は非置換のアルキルカルボキシ基である、［１］〜［８］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１０］カルボキシ基が、メチルカルボキシ基、エチルカルボキシ基、プロピルカルボキシ基、ブチルカルボキシ基、ペンチルカルボキシ基、又はヘキシルカルボキシ基である、［１］〜［９］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１１］カルボキシ基が、−ＣＯ−ＯＣＨ３、−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−ＣＯ−ＯＣ6Ｈ5、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ5、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣＨ３、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ5、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣＨ３、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ５、又は−Ｒａ−ＣＯ−ＯＲｂ（ここで、Ｒａは単結合又はＣ１−６アルキレン基、ＲｂはH又は直鎖状、分岐状又は環状のＣ１−６アルキル基をそれぞれ表す）で表される置換カルボキシ基である、［１］〜［９］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１２］カルボキシ基が、カルボキシメチルカルバメート基、カルボキシエチルカルバメート基、又はカルボキシプロピルカルバメート基である、［１］〜［１０］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１３］直鎖状分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む、［１］〜［１２］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１４］直鎖状分子がポロキサマーを含む、［１］〜［１３］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１５］直鎖状分子の分子量が４０００〜７０００である、［１］〜［１４］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１６］直鎖状分子と環状分子との分子数の比率が１：１０〜１：２０あることを特徴とする、［１］〜［１５］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１７］末端基が、置換基を有する又は有さないＯ−トリフェニルメチル基、置換基を有する又は有さないＳ−トリフェニルメチル基、および置換基を有する又は有さないＮ−トリフェニルメチル基から成る群より選択される、［１］〜［１６］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１８］末端基が直鎖状分子にペプチド結合、カーバメート結合、エステル結合、またはエーテル結合を介して連結されている、［１］〜［１７］のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
［１９］カルボキシ基で修飾された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の製造方法であって、酸分解性ポリロタキサンの環状分子にカルボキシエステルを導入する工程と、弱アルカリ水溶液下でエステルの脱保護を行う工程とを含む、方法。
［２０］カルボキシ基で修飾された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の製造方法であって、ポロキサマーの両末端に一級アミノ基を有するポロキサマーを得る工程（工程Ａ）、前記ポロキサマーとβ−シクロデキストリンとを反応させて擬ポリロタキサンを得る工程（工程Ｂ）、前記擬ポリロタキサンの両末端をＮ−トリチルグリシンでキャッピングする工程（工程Ｃ）、カルボキシエステルを酸分解性ポリロタキサンの環状分子に導入する工程（工程Ｄ）、および弱アルカリ水溶液下でエステルを脱保護させる工程（工程Ｅ）とを含む、方法。
［２１］水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、又はナトリウムメトキシド溶液を用いて、カルボキシエステルを環状分子に導入した酸分解性ポリロタキサンのエステルを脱保護させる［１９］又は［２０］記載の方法。
［２２］カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを促進するための組成物。
［２３］カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための医薬組成物。
［２４］カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物。
［２５］カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを促進するための方法。
［２６］対象に対して、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための方法。
［２７］対象に対して、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための方法。
［２８］細胞においてオートファジーを誘導するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［２９］癌を治療するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［３０］細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［３１］ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用。
［３２］環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物。
［３３］環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物。
本発明の一態様によると、カルボキシ基で修飾された複数の環状分子と、末端基を有する直鎖状分子とを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物が提供される。このようなポリロタキサン化合物は、酸性環境下で分解し、カルボキシ基で修飾された複数の環状分子を放出することができる。
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明者らは、酸分解性ポリロタキサンにカルボキシエステルを導入する工程と、弱アルカリ水溶液下でのエステルの脱保護を含む方法により、カルボキシ基で修飾された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を製造した。
ポリロタキサン（ＰＲＸ）化合物
ロタキサンは、大環状分子を直鎖状分子が貫通し、直鎖状分子の両末端に嵩高い部位を結合させることで、立体障害でリングが軸から抜けなくなったものである。ポリロタキサンでは、複数の大環状分子の環内を１本の直鎖状分子が貫いている。
ロタキサンは、大環状分子を直鎖状分子が貫通し、直鎖状分子の両末端に嵩高い部位を結合させることで、立体障害でリングが軸から抜けなくなったものである。ポリロタキサンでは、複数の大環状分子の環内を１本の直鎖状分子が貫いている。
本発明において用いられる直鎖状分子や環状分子は特に限定されないが、直鎖状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体（ポロキサマー）、ポリエチレンイミン、ポリアミノ酸、及びポリメチルビニルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上であることが好ましい。また、直鎖状分子の平均分子量は１０００〜２００００、特に２０００〜１００００あるいは４０００〜７０００であることが好ましく、例えば、分子量およそ５０００のポロキサマーが使用されうる。
環状分子としては、α、β又はγ−シクロデキストリンであることが好ましいが、これと類似の環状構造を持つものであってもよく、そのような環状構造としては環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン、環状ポリアミン等が挙げられる。コレステロール包接能の観点から好ましい環状分子は、β−またはγ−シクロデキストリンであり、β−シクロデキストリンが特に好ましい。
本発明に係るポリロタキサンに含まれる環状分子はカルボキシ基を有する。環状分子は、好ましくはシクロデキストリンであり、シクロデキストリンの水酸基がカルボキシ化されている。シクロデキストリンは、好ましくはβ−シクロデキストリンである。β−シクロデキストリンは、例えば、１分子あたり１〜２１個、好ましくは２〜７個のカルボキシ基を有するように修飾されうる。カルボキシ基は、置換された又は非置換のアルキルカルボキシ基の一部であっても良く、例えば、メチルカルボキシ基、エチルカルボキシ基、プロピルカルボキシ基、ブチルカルボキシ基、ペンチルカルボキシ基、又はヘキシルカルボキシ基であっても良い。カルボキシ基は場合により、置換基を含んでいてもよく、例えば、−ＣＯ−ＯＣＨ３、−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−ＣＯ−ＯＣ6Ｈ5、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ5、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣＨ３、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ5、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣＨ３、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ５、又は−Ｒａ−ＣＯ−ＯＲｂにより表される基であっても良い（ここで、Ｒａは単結合又はＣ１−６アルキレン基、ＲｂはH又は直鎖状、分岐状又は環状のＣ１−６アルキル基をそれぞれ表す）。また、環状分子は、カルボキシ基以外の置換基をさらに有していても良い。他の置換基としては、例えば、２−ヒドロキシエトキシエチル（ＨＥＥ）基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ基と称することもある）、メチル基、一級アミノ基、糖鎖、若しくはポリエチレングリコールなどの水溶性高分子や、トランスフェリンや抗体などのタンパク質分子、オリゴアルギニンなどのペプチド分子などが挙げられる。これらの基は、環状分子に直接結合していても、リンカーを介して結合していても良い。リンカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルバミン酸エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−）、カルボネート結合（−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−）、エーテル結合（−Ｏ−）などが挙げられる。一実施態様においては、リンカーとして、カルバミン酸エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）が好適に用いられる。よって、カルボキシ基は、カルボキシメチルカルバメート基、カルボキシエチルカルバメート基、又はカルボキシプロピルカルバメート基の形をとっていても良い。
直鎖状分子と環状分子の組み合わせとしては、β−シクロデキストリンとポロキサマーとの組合せが好ましい。なお、β−シクロデキストリンとポロキサマーとの組合せによるポリロタキサンの合成は、上記の特許文献１にも開示されており、その内容は参照により本明細書にも取り込まれる。好ましい直鎖状分子の分子数と環状分子の分子数との比率は１：４〜１：５０であり、１：８〜１：２０の比率がより好ましく、例えば、１：１０〜１：２０の比率が用いられる。すなわち、好ましくは直鎖状分子１分子に４〜５０個の環状分子が含まれ、より好ましくは８〜３０個の環状分子が含まれ、例えば、１０〜２０個の環状分子が含まれうる。
本発明において用いられる末端基（嵩高い置換基とも言う）としては、例えば、Ｏ−トリフェニルメチル（Ｏ−Ｔｒｔ）基、Ｓ−トリフェニルメチル（Ｓ−Ｔｒｔ）基、Ｎ−トリフェニルメチル（Ｎ−Ｔｒｔ）基が挙げられるが、限定はされない。末端基は立体障害効果により、ポリロタキサンの環状分子が線状分子から抜け出ることを防ぐ働きを有する。末端基は、置換基を有するＯ−トリフェニルメチル基、Ｓ−トリフェニルメチル基、Ｎ−トリフェニルメチル基などであってもよい。好ましくは、Ｎ−トリフェニルメチル基が用いられる。Ｎ−Ｔｒｔ基は、弱酸性環境下において分解され、ポリロタキサン骨格が崩壊し、β−ＣＤなどの環状分子がリリースされる。末端基は、ペプチド結合、カーバメート結合、エステル結合、エーテル結合などを介して直鎖状分子に連結されうるが、好ましくはペプチド結合が用いられる。よって、本発明の一態様は、環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物に関する。β−シクロデキストリンが有する置換基は、好ましくはカルボキシ基であるが、限定はされず、例えば、２−ヒドロキシエトキシエチル（ＨＥＥ）基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ基と称することもある）、メチル基、一級アミノ基、糖鎖、若しくはポリエチレングリコールなどの水溶性高分子や、トランスフェリンや抗体などのタンパク質分子、オリゴアルギニンなどのペプチド分子などであってもよい。これらの基は、環状分子に直接結合していても、リンカーを介して結合していても良い。リンカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルバミン酸エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−）、カルボネート結合（−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−）、エーテル結合（−Ｏ−）などが挙げられる。
本発明に係るポリロタキサン化合物は、酸分解性の結合を直鎖状分子内に含む構造、又は酸分解性の結合を介して末端基が直鎖状分子に連結された構造を有していても良い。酸分解性の結合としては、例えば、アセタール結合、ケタール結合、ジスルフィド結合、エステル結合、オルトエステル結合、ビニルエーテル結合、ヒドラジド結合、アミド結合などが挙げられるが、限定はされない。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。末端基としては、例えば、Ｎ−トリチルグリシン、１以上のベンゼン環を有する基、１以上の第三ブチルを有する基等が使用されうるが、これらに限定はされない。１以上のベンゼン環を有する基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フレオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジルエステル（ＯＢｚ）基等が挙げられ、また、１以上の第三ブチルを有する基としては、第三ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）基、アミノ酸第三ブチルエステル（ＯＢｕ基）等が挙げられる。なお、酸分解性の結合と末端基とは、直接的に連結されている必要はなく、当業者に公知のリンカー部分を介して連結されていてもよい。
本発明に係るポリロタキサンの数平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１万〜１０万程度とすることが好ましい。
本発明に係るポリロタキサン化合物としては、直鎖状分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含むポロキサマーであり、環状分子がβ−シクロデキストリンであり、末端基がＮ−トリフェニルメチル基であり、末端基が直鎖状分子にペプチド結合を介して連結されていることが特に好ましい。この場合、ポロキサマーの分子量は４０００〜７０００（例えば、約５０００）であり、直鎖状分子１分子あたりのβ−シクロデキストリンの数は１０〜２０個（例えば、約１２個）でありうる。よって、本発明に係るポリロタキサン化合物は、以下に示す化学構造を有するポリロタキサンを含む：
ここで、ｍは、ポロキサマー中のポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である（ここでは、括弧内にポリプロピレングリコールの繰返し単位を３つ記載しているため、「ｍ／３」と記載しているが、ｍが３の倍数である必要は無い）。ｎは、ポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｍ及びｎはそれぞれ例えば０から２００の整数、１０から１００の整数、又は３０から７０の整数であり、使用するポロキサマーに応じて適宜決定されうる。ｘは、β−シクロデキストリンの数を示す整数である。Ｒは、置換基を示しており化学結合Ｌを介してβ−シクロデキストリンに結合している。化学結合Ｌは、例えば、シクロデキストリンの水酸基を修飾することにより形成されるカルバミン酸エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−）、カルボネート結合（−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−）、またはエーテル結合（−Ｏ−）でありうる。本開示において、置換基Ｒは、置換された又は非置換のカルボキシ基又はアルキルカルボキシ基であり、例えば、−ＣＯ−ＯＨ、−ＣＯ−ＯＣＨ３、−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−ＣＯ−ＯＣ6Ｈ5、−ＣＨ２ーＣＯ−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ5、−Ｃ２Ｈ４ーＣＯ−ＯＨ、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣＨ３、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ5、−Ｃ３Ｈ６ーＣＯ−ＯＨ、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣＨ３、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ５、又は−Ｒａ−ＣＯ−ＯＲｂ（ここで、Ｒａは単結合又はＣ１−６アルキレン基、Ｒｂは直鎖状、分岐状又は環状のＣ１−６アルキル基をそれぞれ表す）でありうる。図示の都合上、β−シクロデキストリン上の置換基（例えば、カルボキシメチル基）は１つのみが示されているが、置換基の数は複数であってもよい。場合によっては、化学結合Ｌは介さなくてもよい。Ｚは、キャッピング分子（例えば、Ｎ−トリフェニルメチル基などの末端基）を示しており、化学結合Ｙ（例えば、ペプチド結合）を介して主軸高分子両末端に結合している。化学結合Ｙは酸分解性の結合でありうるが、場合によっては、化学結合Ｙは介さなくてもよい。
細胞内環境
本発明に係るポリロタキサン化合物は、酸性環境下で分解する酸分解性のポリロタキサン化合物であり、例えば、ｐＨ４．０〜６．０の酸性環境下で分解する。上述のとおり、末端基としてＮ−Ｔｒｔ基を用いた場合、Ｎ−Ｔｒｔ基は弱酸性環境下において分解され、ポリロタキサン骨格が崩壊し、β−ＣＤなどの環状分子がリリースされる。
本発明に係るポリロタキサン化合物は、酸性環境下で分解する酸分解性のポリロタキサン化合物であり、例えば、ｐＨ４．０〜６．０の酸性環境下で分解する。上述のとおり、末端基としてＮ−Ｔｒｔ基を用いた場合、Ｎ−Ｔｒｔ基は弱酸性環境下において分解され、ポリロタキサン骨格が崩壊し、β−ＣＤなどの環状分子がリリースされる。
ヒトを含む真核生物の細胞内には、リソソームや後期エンドソームといった小胞が存在しており、これらの小胞の内腔は酸性化されていることが知られている。例えば、リソソームの内腔のｐＨは５前後である。よって、本発明に係るポリロタキサン化合物は、これらの小胞に取り込まれることにより分解されうる。本発明に係るポリロタキサン化合物は、分解に伴い、β−ＣＤなどの環状分子をリリースする。例えば、リソソーム内でβ−シクロデキストリンが放出された場合、リソソーム内に存在するコレステロールを包接することができ、それにより、リソソーム内のコレステロールの過剰蓄積を原因とするニーマン・ピック病Ｃ型などのライソゾーム病が治療もしくは予防されうる。
上述のとおり、β−シクロデキストリンは、コレステロールの包接能を有することが知られている。細胞内のコレステロールをβ−シクロデキストリンが包接することで、細胞内の過剰なコレステロールが引き起こす疾患の治療が可能であることが当業者には理解される。よって、本発明の一態様は、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患を治療するための医薬組成物に関する。また、別の観点からは、本発明の一態様は、対象に対して、好ましくはヒトに対して、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための方法に関する。さらに、本発明の一態様は、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用にも関する。細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患としては、ライソゾーム病、より具体的には、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ病）、ニーマン・ピック病Ａ型（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病Ａ型）、ニーマン・ピック病Ｂ型（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病Ｂ型）、ニーマン・ピック病Ｃ型（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ病Ｃ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス（「Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ Ｓａｎｄｈｏｆｆ ＡＢ型」と称することもある。）、クラッベ病（Ｋｒａｂｂｅ病）、異染性白質変性症、マルチプルサルタファーゼ欠損症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｕｌｆａｔｅｓｅ欠損症）、ファーバー病（Ｆａｒｂｅｒ病）、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型（「ハンター病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＩＩ型（「サンフィリポ病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＶ型、ムコ多糖症ＶＩ型（「マロトー・ラミー病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＶＩＩ型（「スライ病」と称することもある。）、ムコ多糖症ＩＸ型（「Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ欠損症」と称することもある。）、シアリドーシス、ガラクトシアリドーシス、Ｉ−ｃｅｌｌ病／ムコリピドーシスＩＩＩ型、α−マンノシドーシス、β−マンノシドーシス、フコシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、シンドラー／神崎病（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ／神崎病）、ウォルマン病（Ｗｏｌｍａｎ病）、ダノン病（Ｄａｎｏｎ病）、遊離シアル酸蓄積症、セロイドリポフスチノーシス、ファブリー病が挙げられる。なお、前記ライソゾーム病は、オートファゴソームの蓄積を生じる、オートファジー機能異常に起因する疾患でもある。
よって、本発明の一態様は、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物に関する。また、別の観点からは、本発明の一態様は、対象に対して、好ましくはヒトに対して、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための方法に関する。さらに、本発明の一態様は、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用にも関する。また、本発明の一態様は、上述のように、環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物にも関する。さらに、本発明の一態様は、環状分子として置換基を有するβ−シクロデキストリンと、直鎖状分子として末端にＮ−トリフェニルメチル基を有するポロキサマーとを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）を治療または予防するための医薬組成物にも関する。
オートファジー
本発明者らは、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を作用させることにより、細胞にオートファジーを誘導できることを見出した。シクロデキストリンは、好ましくはβ−シクロデキストリンである。よって、本発明の一態様は、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを誘導するための組成物に関する。また、別の観点からは、本発明の一態様は、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを誘導するための方法に関する。さらに、本発明の一態様は、細胞においてオートファジーを誘導するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用にも関する。
本発明者らは、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を作用させることにより、細胞にオートファジーを誘導できることを見出した。シクロデキストリンは、好ましくはβ−シクロデキストリンである。よって、本発明の一態様は、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを誘導するための組成物に関する。また、別の観点からは、本発明の一態様は、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを誘導するための方法に関する。さらに、本発明の一態様は、細胞においてオートファジーを誘導するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用にも関する。
また、本発明に係るカルボキシ基で修飾されたポリロタキサンは、細胞にオートファジー性細胞死を誘発しうる。オートファジー性細胞死を利用して、癌細胞に細胞死を誘導できることが当業者には知られている。よって、本発明の一態様は、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、癌を治療するための医薬組成物、好ましくはアポトーシス耐性の癌を治療するための医薬組成物に関する。また、別の観点からは、本発明の一態様は、対象に対して、好ましくはヒトに対して、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、癌を治療するため、特にアポトーシス耐性の癌を治療するための方法に関する。さらに、本発明の一態様は、癌を治療するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用にも関する。
また、本発明に係るカルボキシ基で修飾されたポリロタキサンは、細胞にオートファジーを誘導することから、オートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するために使用されうることが当業者には理解される。よって、本発明の一態様は、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、オートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための医薬組成物に関する。また、別の観点からは、本発明の一態様は、対象に対して、好ましくはヒトに対して、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を投与する工程を含む、オートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための方法に関する。さらに、本発明の一態様は、オートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための薬剤の製造における、カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の使用にも関する。オートファジーの機能障害に起因する疾患としては、例えば、上述のライソゾーム病や、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患が挙げられる。
製造方法
カルボキシ化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物は、酸分解性ポリロタキサンの環状分子にカルボキシエステルを導入する工程と、弱アルカリ水溶液下でのエステルの脱保護を含む方法により、製造されうる。より具体的には、本発明に係る製造方法の一態様は、ポロキサマーの両末端に一級アミノ基を有するポロキサマーを得る工程（工程Ａ）、前記ポロキサマーとβ−シクロデキストリンとを反応させて擬ポリロタキサンを得る工程（工程Ｂ）、前記擬ポリロタキサンの両末端をＮ−トリチルグリシンでキャッピングする工程（工程Ｃ）、前記カルボキシエステルを酸分解性ポリロタキサンの環状分子に導入する工程（工程Ｄ）、および弱アルカリ水溶液下でエステルを脱保護させる工程（工程Ｅ）を含む。カルボキシエステルは、例えば、カルボキシメチルカルバメートメチルエステル、カルボキシメチルカルバメートエチルエステル（ＥＭＣ）、カルボキシメチルカルバメートプロピルエステル、カルボキシメチルカルバメートブチルエステル、カルボキシメチルカルバメートベンジルエステル、カルボキシエチルカルバメートメチルエステル（ＭＥＣ）、カルボキシエチルカルバメートエチルエステル、カルボキシエチルカルバメートプロピルエステル、カルボキシエチルカルバメートブチルエステル、カルボキシエチルカルバメートベンジルエステル、又はカルボキシプロピルカルバメートメチルエステル（ＭＰＣ）、カルボキシプロピルカルバメートエチルエステル、カルボキシプロピルカルバメートプロピルエステル、カルボキシプロピルカルバメートブチルエステル、カルボキシプロピルカルバメートベンジルエステル、でありうるが、これらに限定はされない。
カルボキシ化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物は、酸分解性ポリロタキサンの環状分子にカルボキシエステルを導入する工程と、弱アルカリ水溶液下でのエステルの脱保護を含む方法により、製造されうる。より具体的には、本発明に係る製造方法の一態様は、ポロキサマーの両末端に一級アミノ基を有するポロキサマーを得る工程（工程Ａ）、前記ポロキサマーとβ−シクロデキストリンとを反応させて擬ポリロタキサンを得る工程（工程Ｂ）、前記擬ポリロタキサンの両末端をＮ−トリチルグリシンでキャッピングする工程（工程Ｃ）、前記カルボキシエステルを酸分解性ポリロタキサンの環状分子に導入する工程（工程Ｄ）、および弱アルカリ水溶液下でエステルを脱保護させる工程（工程Ｅ）を含む。カルボキシエステルは、例えば、カルボキシメチルカルバメートメチルエステル、カルボキシメチルカルバメートエチルエステル（ＥＭＣ）、カルボキシメチルカルバメートプロピルエステル、カルボキシメチルカルバメートブチルエステル、カルボキシメチルカルバメートベンジルエステル、カルボキシエチルカルバメートメチルエステル（ＭＥＣ）、カルボキシエチルカルバメートエチルエステル、カルボキシエチルカルバメートプロピルエステル、カルボキシエチルカルバメートブチルエステル、カルボキシエチルカルバメートベンジルエステル、又はカルボキシプロピルカルバメートメチルエステル（ＭＰＣ）、カルボキシプロピルカルバメートエチルエステル、カルボキシプロピルカルバメートプロピルエステル、カルボキシプロピルカルバメートブチルエステル、カルボキシプロピルカルバメートベンジルエステル、でありうるが、これらに限定はされない。
本発明に係る方法において、カルボキシエステルを環状分子に導入した酸分解性ポリロタキサンのエステルを脱保護させる際には、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、又はナトリウムメトキシド溶液などの弱アルカリ水溶液を用いることができ、水酸化ナトリウムによる脱保護が望ましく、水酸化ナトリウムなどの弱アルカリ水溶液の濃度は、０．１ｍｏｌ／Ｌから２ｍｏｌ／Ｌ程度、好ましくは、０．４ｍｏｌ／Ｌから６ｍｏｌ／Ｌ程度、より具体的には例えば、０．５ｍｏｌ／Ｌ、反応時間は１時間から２４時間程度、好ましくは約３時間から６時間、反応温度は１０℃から８０℃程度、好ましくは２０℃から４０℃で撹拌することで行うことができる。
医薬組成物
本発明に係るポリロタキサン化合物は、上記のような疾患の治療または予防に用いる医薬組成物中の有効成分として利用することができる。よって、本発明の一つの態様は、疾患の治療または予防に用いる医薬組成物に関する。本発明に係る医薬組成物中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。担体にも、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。本発明に係る医薬組成物における含有量についても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。好ましくは、本発明に係る医薬組成物は、体温付近、例えば、３４℃〜４２℃、より好ましくは３５℃〜３８℃あるいは３７℃において水溶性である。
本発明に係るポリロタキサン化合物は、上記のような疾患の治療または予防に用いる医薬組成物中の有効成分として利用することができる。よって、本発明の一つの態様は、疾患の治療または予防に用いる医薬組成物に関する。本発明に係る医薬組成物中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。担体にも、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。本発明に係る医薬組成物における含有量についても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。好ましくは、本発明に係る医薬組成物は、体温付近、例えば、３４℃〜４２℃、より好ましくは３５℃〜３８℃あるいは３７℃において水溶性である。
本発明に係る医薬組成物の剤形としては、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、吸入散剤などが挙げられる。注射剤としては、例えば、本発明に係るポリロタキサン化合物に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
本発明に係る医薬組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、医薬組成物の剤形、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与としては、脳室内投与などが挙げられる。
本発明に係る医薬組成物の投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、好ましくはヒトである。
本発明に係る医薬組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与形態や、投与対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
本発明に係る医薬組成物の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記疾患に感受性の患者に対して予防的に投与されてもよいし、症状を呈する患者に治療的に投与されてもよい。また、投与回数としても、特に制限はなく、投与対象の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
＜例１：ポリロタキサンの製造＞
線状高分子としてプルロニック（登録商標）Ｐ１２３（シグマ−アルドリッチ社製、ポリエチレングリコ−ル（以下、「ＰＥＧ」と称することがある。）とポリプロピレングリコ−ル（以下、「ＰＰＧ」と称することがある。）が、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの順に重合した共重合体；ＰＰＧ部分の数平均分子量は３８５０、ＰＥＧ部分の数平均分子量は８６０×２）を用い、以下のようにして、その両末端を一級アミノ基に変換させた（図１）。
線状高分子としてプルロニック（登録商標）Ｐ１２３（シグマ−アルドリッチ社製、ポリエチレングリコ−ル（以下、「ＰＥＧ」と称することがある。）とポリプロピレングリコ−ル（以下、「ＰＰＧ」と称することがある。）が、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの順に重合した共重合体；ＰＰＧ部分の数平均分子量は３８５０、ＰＥＧ部分の数平均分子量は８６０×２）を用い、以下のようにして、その両末端を一級アミノ基に変換させた（図１）。
前記プルロニック（登録商標）Ｐ１２３を２０ｇ量り取り、三方コックを取り付けたナス型フラスコへ加えた。反応容器内を窒素に置換後、窒素雰囲気下でテトラヒドロフラン（関東化学社製）を１００ｍＬ加えて溶解させた。窒素雰囲気下でトリエチルアミン（富士フイルム和光純薬社製）を７．５ｍＬ、塩化メタンスルホニル（富士フイルム和光純薬社製）を４．２ｍＬ加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、反応中に生じた沈殿物をろ過により除き、ロータリーエバポレーターで濃縮した。メタノールで希釈後、透析膜に封入し（スペクトルポア社製、分画分子量１０００）、２日間透析をすることで未反応物を除去した。ロータリーエバポレーターで濃縮することで両末端にメシル基を有するプルロニック（登録商標）Ｐ１２３（以下、「Ｐ１２３−Ｍｓ」と称することがある。）を１４．２ｇ得た。
前記Ｐ１２３を１０ｇ量り取り、アンモニア水（関東化学社製）を５０ｍＬ加えて溶解させ、室温で７２時間撹拌した。反応後、得られた溶液を透析膜に封入し（スペクトルポア社製、分画分子量１０００）、３日間透析をすることで未反応物を除去した。回収した溶液を凍結乾燥することで両末端に一級アミノ基を有するプルロニック（登録商標）Ｐ１２３（以下、「Ｐ１２３−ＮＨ２」と称することがある。）を６．１ｇ得た。
前記Ｐ１２３−ＮＨ２と、β−シクロデキストリン（以下、「β−ＣＤ」と称することがある。）を用い、以下のようにして、擬ポリロタキサンを調製した（図１）。
前記β−ＣＤ（日本食品化工社製、商品名：セルデックスＢ−１００）を４０ｇ、塩化リチウム（富士フイルム和光純薬社製）を９．０ｇ量り取り、広口瓶に加え、超純水２Ｌに溶解させた。前記Ｐ１０３−ＮＨ２を４．０８ｇ量り取り、少量の超純水に溶解させた。Ｐ１２３−ＮＨ２溶液をβ−ＣＤ溶液に加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、得られた沈殿物を遠心分離（６５００ｒｐｍ、５分）により回収した。回収した固体を凍結乾燥することで擬ポリロタキサンを得た。
前記擬ポリロタキサンの両端部を、以下のようにしてＮ−トリチルグリシン（シグマ−アルドリッチ社製）でキャッピングすることにより、複数のβ−ＣＤを貫通した線状高分子の両端部に酸性ｐＨ環境下で脱離する嵩高い置換基を有するポリロタキサン（以下、「ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（図１）。
前記擬ポリロタキサンを全量、Ｎ−トリチルグリシンを４．５５ｇ、ＤＭＴ−ＭＭ（富士フイルム和光純薬社製）を３．９７ｇ量り取り、広口瓶に加え、アセトニトリル（関東化学社製）を２０３ｍＬ、メタノール（関東化学社製）を６１ｍＬ加え、室温で２４時間撹拌した。反応後、得られた沈殿物を遠心分離（６５００ｒｐｍ、１０分）により回収した。アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、超純水の順で得られた沈殿物を洗浄し、未反応物を除去した。回収した固体を凍結乾燥することで末端がＮ−トリチルグリシンでキャッピングされたポリロタキサンを３．８５ｇ得た。
＜例２：カルボキシメチルカルバメート化ポリロタキサンの製造＞
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤにカルボキシメチルカルバメートエチルエステル（以下、「ＥＭＣ」と称することがある。）基を以下のようにして導入し（図２）、カルボキシメチルカルバメートエチルエステル化ポリロタキサン（以下、「ＥＭＣ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子当たりのβ−ＣＤ平均貫通数は１２．５、ＥＭＣ修飾数は３１．３）。
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤにカルボキシメチルカルバメートエチルエステル（以下、「ＥＭＣ」と称することがある。）基を以下のようにして導入し（図２）、カルボキシメチルカルバメートエチルエステル化ポリロタキサン（以下、「ＥＭＣ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子当たりのβ−ＣＤ平均貫通数は１２．５、ＥＭＣ修飾数は３１．３）。
前記ポリロタキサンを２００ｍｇ、１，１’−カルボニルジイミダゾール（シグマ−アルドリッチ社製）を１４０ｍｇ量り取り、三方コックを取り付けたナス型フラスコへ加えた。反応容器内を窒素に置換後、窒素雰囲気下で脱水ジメチルスルホオキシド（富士フイルム和光純薬社製）１０ｍＬに溶解させた。広口瓶にグリシンエチル塩酸塩（東京化成社製）を１．２ｇ、トリエチルアミン（富士フイルム和光純薬社製）を１．２ｍＬ、ジメチルスルホキシド（関東化学社製）を５ｍＬ量り取り、室温で１０分間攪拌させ、ポリロタキサン溶液に加えた。室温で２４時間攪拌後、得られた溶液を透析膜に封入し（スペクトルポア社製、分画分子量１０００）、３日間透析をすることで未反応物を除去した。回収した溶液を凍結乾燥することでＥＭＣ−ＰＲＸを２４０ｍｇ得た。
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤにカルボキシメチルカルバメート（以下、「ＣＭＣ」と称することがある。）基を以下のようにして導入し（図２）、カルボキシメチルカルバメート化ポリロタキサン（以下、「ＣＭＣ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子当たりのβ−ＣＤ平均貫通数は１２．５、ＣＭＣ修飾数は３１．３）。ＣＭＣ−ＰＲＸの一般化学構造を以下に示す：
ここで、ｍは、ポロキサマー中のポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｎは、ポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｌは、β−シクロデキストリンの数を示す整数である。ここでは、β−シクロデキストリンが括弧内の環状構造として示されている。図示の都合上、β−シクロデキストリン上の置換基は１つのみが示されているが、置換基の数は複数であってもよい。
前記ＥＭＣ−ＰＲＸを２００ｍｇ量り取り、広口瓶へ加えた。０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加え、室温で６時間攪拌させた。反応後、得られた溶液を透析膜に封入し（スペクトルポア社製、分画分子量１０００）、ｐＨ９のアンモニア水溶液で３日間透析をすることで未反応物を除去した。回収した溶液を凍結乾燥することでＣＭＣ−ＰＲＸを１４０ｍｇ得た。
前記ＥＭＣ−ＰＲＸについて、溶離液を１０ｍＭ ＬｉＢｒ含有ジメチルスルホオキシドとしたサイズ排除クロマトグラフィー測定（島津製作所社製）、ジメチルスルホキシド−ｄ６（関東化学社製）中で測定した４００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトル測定（ブルカー社製）、及びフーリエ変換赤外分光測定（パーキンエルマー社製）を行った。また、前記ＣＭＣ−ＰＲＸについて、重水（関東化学社製）中で測定した４００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトル測定、及びフーリエ変換赤外分光測定を行った。
図３に示すサイズクロマトグラフィーの結果において、ＰＲＸ、及びＥＭＣ−ＰＲＸは溶出時間がβ−ＣＤよりも早く高分子量化していることから、合成が確認された。また、遊離β−ＣＤやＮ−トリチル基のピークが見られないことから、ＥＭＣ−ＰＲＸは超分子構造を損なうことなく高純度で合成されたことが示された。図４のＥＭＣ−ＰＲＸのプロトン核磁気共鳴スペクトルの結果から、ポリロタキサンのβ−ＣＤに導入されたＥＭＣ基の修飾数がＰＲＸ１分子あたり３１．１であることが明らかとなった。また、図４のＣＭＣ−ＰＲＸのプロトン核磁気共鳴スペクトルの結果から、エチルエステル基に由来するピークが消失していることより、エチルエステル基の脱保護を確認した。図５のフーリエ変換赤外分光スペクトルの結果から、ＥＭＣ−ＰＲＸのエステル結合に由来する１７２４、１２０８ｃｍ−１のピークがＣＭＣ−ＰＲＸでは変化し、カルボキシアニオン由来のピークが１６０４、１４０２ｃｍ−１に表れたことからもエチルエステル基の脱保護を確認した。
＜例３：カルボキシエチルカルバメート化ポリロタキサンの製造＞
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤにカルボキシエチルカルバメートメチルエステル（以下、「ＭＥＣ」と称することがある。）基を以下のようにして導入し（図６）、カルボキシメチルカルバメートエチルエステル化ポリロタキサン（以下、「ＭＥＣ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子当たりのβ−ＣＤ平均貫通数は１２．５、ＭＥＣ修飾数は２７．５）。
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤにカルボキシエチルカルバメートメチルエステル（以下、「ＭＥＣ」と称することがある。）基を以下のようにして導入し（図６）、カルボキシメチルカルバメートエチルエステル化ポリロタキサン（以下、「ＭＥＣ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子当たりのβ−ＣＤ平均貫通数は１２．５、ＭＥＣ修飾数は２７．５）。
前記ポリロタキサンを２００ｍｇ、１，１’−カルボニルジイミダゾール（シグマ−アルドリッチ社製）を１４０ｍｇ量り取り、三方コックを取り付けたナス型フラスコへ加えた。反応容器内を窒素に置換後、窒素雰囲気下で脱水ジメチルスルホオキシド（富士フイルム和光純薬社製）１０ｍＬに溶解させた。広口瓶にβ−アラニンメチルエステル塩酸塩（東京化成社製）を１．２ｇ、トリエチルアミン（富士フイルム和光純薬社製）を１．２ｍＬ、ジメチルスルホキシド（関東化学社製）を５ｍＬ量り取り、室温で１０分間攪拌させ、ポリロタキサン溶液に加えた。室温で２４時間攪拌後、得られた溶液を透析膜に封入し（スペクトルポア社製、分画分子量１０００）、３日間透析をすることで未反応物を除去した。回収した溶液を凍結乾燥することでＭＥＣ−ＰＲＸを２２４ｍｇ得た。
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤにカルボキシエチルカルバメート（以下、「ＣＥＣ」と称することがある。）基を以下のようにして導入し（図６）、カルボキシメエルカルバメート化ポリロタキサン（以下、「ＣＥＣ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子当たりのβ−ＣＤ平均貫通数は１２．５、ＣＥＣ修飾数は２７．５）。ＣＥＣ−ＰＲＸの一般化学構造を以下に示す：
ここで、ｍは、ポロキサマー中のポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｎは、ポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｌは、β−シクロデキストリンの数を示す整数である。ここでは、β−シクロデキストリンが括弧内の環状構造として示されている。図示の都合上、β−シクロデキストリン上の置換基は１つのみが示されているが、置換基の数は複数であってもよい。
前記ＭＥＣ−ＰＲＸを２００ｍｇ量り取り、広口瓶へ加えた。０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加え、室温で６時間攪拌させた。反応後、得られた溶液を透析膜に封入し（スペクトルポア社製、分画分子量１０００）、ｐＨ９のアンモニア水溶液で３日間透析をすることで未反応物を除去した。回収した溶液を凍結乾燥することでＣＥＣ−ＰＲＸを１４６ｍｇ得た。
前記ＭＥＣ−ＰＲＸについて、溶離液を１０ｍＭ ＬｉＢｒ含有ジメチルスルホオキシドとしたサイズ排除クロマトグラフィー測定（島津製作所社製）、ジメチルスルホキシド−ｄ６（関東化学社製）中で測定した４００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトル測定（ブルカー社製）、及びフーリエ変換赤外分光測定（パーキンエルマー社製）を行った。また、前記ＣＥＣ−ＰＲＸについて、重水（関東化学社製）中で測定した４００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトル測定、及びフーリエ変換赤外分光測定を行った。
図７に示すサイズクロマトグラフィーの結果において、ＭＥＣ−ＰＲＸは溶出時間がβ−ＣＤよりも早く高分子量化していることから、合成が確認された。また、遊離β−ＣＤやＮ−トリチル基のピークが見られないことから、ＭＥＣ−ＰＲＸは超分子構造を損なうことなく高純度で合成されたことが示された。図８のＭＥＣ−ＰＲＸのプロトン核磁気共鳴スペクトルの結果から、ポリロタキサンのβ−ＣＤに導入されたＭＥＣ基の修飾数がＰＲＸ１分子あたり２７．５であることが明らかとなった。また、図８のＣＥＣ−ＰＲＸのプロトン核磁気共鳴スペクトルの結果から、エチルエステル基に由来するピークが消失していることより、エチルエステル基の脱保護を確認した。図９のフーリエ変換赤外分光スペクトルの結果から、ＭＥＣ−ＰＲＸのエステル結合に由来する１７２７、１２５５ｃｍ−１のピークがＣＥＣ−ＰＲＸでは変化し、カルボキシアニオン由来のピークが１５７９、１４０７ｃｍ−１に表れたことからもエチルエステル基の脱保護を確認した。
＜例４：カルボキシプロピルカルバメート化ポリロタキサンの製造＞
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤにカルボキシプロピルカルバメートメチルエステル（以下、「ＭＰＣ」と称することがある。）基を以下のようにして導入し（図１０）、カルボキシメチルカルバメートエチルエステル化ポリロタキサン（以下、「ＭＰＣ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子当たりのβ−ＣＤ平均貫通数は１２．５、ＭＰＣ修飾数は２２．５）。
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤにカルボキシプロピルカルバメートメチルエステル（以下、「ＭＰＣ」と称することがある。）基を以下のようにして導入し（図１０）、カルボキシメチルカルバメートエチルエステル化ポリロタキサン（以下、「ＭＰＣ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子当たりのβ−ＣＤ平均貫通数は１２．５、ＭＰＣ修飾数は２２．５）。
前記ポリロタキサンを２００ｍｇ、１，１’−カルボニルジイミダゾール（シグマ−アルドリッチ社製）を１４０ｍｇ量り取り、三方コックを取り付けたナス型フラスコへ加えた。反応容器内を窒素に置換後、窒素雰囲気下で脱水ジメチルスルホオキシド（富士フイルム和光純薬社製）１０ｍＬに溶解させた。広口瓶に４−アミノ酪酸メチル塩酸塩（東京化成社製）を１．３ｇ、トリエチルアミン（富士フイルム和光純薬社製）を１．２ｍＬ、ジメチルスルホキシド（関東化学社製）を５ｍＬ量り取り、室温で１０分間攪拌させ、ポリロタキサン溶液に加えた。室温で２４時間攪拌後、得られた溶液を透析膜に封入し（スペクトルポア社製、分画分子量１０００）、３日間透析をすることで未反応物を除去した。回収した溶液を凍結乾燥することでＭＰＣ−ＰＲＸを２１８ｍｇ得た。
前記ポリロタキサンのβ−ＣＤにカルボキシプロピルカルバメート（以下、「ＣＰＣ」と称することがある。）基を以下のようにして導入し（図１０）、カルボキシメエルカルバメート化ポリロタキサン（以下、「ＣＰＣ−ＰＲＸ」と称することがある。）を得た（ポリロタキサン１分子当たりのβ−ＣＤ平均貫通数は１２．５、ＣＰＣ修飾数は２２．５）。ＣＰＣ−ＰＲＸの一般化学構造を以下に示す：
ここで、ｍは、ポロキサマー中のポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｎは、ポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す整数である。ｌは、β−シクロデキストリンの数を示す整数である。ここでは、β−シクロデキストリンが括弧内の環状構造として示されている。図示の都合上、β−シクロデキストリン上の置換基は１つのみが示されているが、置換基の数は複数であってもよい。
前記ＭＰＣ−ＰＲＸを２００ｍｇ量り取り、広口瓶へ加えた。０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加え、室温で６時間攪拌させた。反応後、得られた溶液を透析膜に封入し（スペクトルポア社製、分画分子量１０００）、ｐＨ９のアンモニア水溶液で３日間透析をすることで未反応物を除去した。回収した溶液を凍結乾燥することでＣＰＣ−ＰＲＸを１６３ｍｇ得た。
前記ＭＰＣ−ＰＲＸについて、溶離液を１０ｍｍｏｌ／Ｌで臭化リチウムを溶解したジメチルスルホオキシドとしたサイズ排除クロマトグラフィー測定（島津製作所社製）、ジメチルスルホキシド−ｄ６（関東化学社製）中で測定した４００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトル測定（ブルカー社製）、及びフーリエ変換赤外分光測定（パーキンエルマー社製）を行った。また、前記ＣＰＣ−ＰＲＸについて、重水（関東化学社製）中で測定した４００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトル測定、及びフーリエ変換赤外分光測定を行った。
図１１に示すサイズクロマトグラフィーの結果において、ＭＰＣ−ＰＲＸは溶出時間がβ−ＣＤよりも早く高分子量化していることから、合成が確認された。また、遊離β−ＣＤやＮ−トリチル基のピークが見られないことから、ＭＰＣ−ＰＲＸは超分子構造を損なうことなく高純度で合成されたことが示された。図１２のＭＰＣ−ＰＲＸのプロトン核磁気共鳴スペクトルの結果から、ポリロタキサンのβ−ＣＤに導入されたＭＰＣ基の修飾数がＰＲＸ１分子あたり２２．５であることが明らかとなった。また、図１２のＣＰＣ−ＰＲＸのプロトン核磁気共鳴スペクトルの結果から、エチルエステル基に由来するピークが消失していることより、エチルエステル基の脱保護を確認した。図１３のフーリエ変換赤外分光スペクトルの結果から、ＭＰＣ−ＰＲＸのエステル結合に由来する１７２３、１２５５ｃｍ−１のピークがＣＰＣ−ＰＲＸでは変化し、カルボキシアニオン由来のピークが１５７１、１４０６ｃｍ−１に表れたことからもエチルエステル基の脱保護を確認した。
＜例５：ｐＫa測定＞
各カルボキシ化ポリロタキサンをカルボキシ基の濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように２０ｍｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に溶解させた。これらの溶液に対し、自動滴定装置（ＡＵＴ−７０１、東亜ディーケーケー社製）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液を４０μＬずつ、１０秒間隔で滴下し、ｐＨの変化を記録した。結果を図１４に示す。
各カルボキシ化ポリロタキサンをカルボキシ基の濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように２０ｍｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に溶解させた。これらの溶液に対し、自動滴定装置（ＡＵＴ−７０１、東亜ディーケーケー社製）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液を４０μＬずつ、１０秒間隔で滴下し、ｐＨの変化を記録した。結果を図１４に示す。
［試料］
（１）ＣＭＣ−ＰＲＸ（例２で作製）
（２）ＣＥＣ−ＰＲＸ（例３で作製）
（３）ＣＰＣ−ＰＲＸ（例４で作製）
（１）ＣＭＣ−ＰＲＸ（例２で作製）
（２）ＣＥＣ−ＰＲＸ（例３で作製）
（３）ＣＰＣ−ＰＲＸ（例４で作製）
図１４の結果から、いずれのカルボキシ化ポリロタキサンもｐＨ７．４では約９０％がイオン化していることが明らかとなった。また、ＣＭＣ−ＰＲＸ、ＣＥＣ−ＰＲＸ、ＣＰＣ−ＰＲＸのｐＫａ値はそれぞれ４．８７、５．２１、５．２７であり、カルボキシ基と環状分子間のアルキル基の数によってｐＫａが変化することが明らかになった。
＜例６：透過率測定＞
各カルボキシ化ポリロタキサンをｐＨ２．２から７．４の間に調整した各緩衝溶液に５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた。これらの溶液に対し、紫外−可視分光光度計（Ｖ−５５０、日本分光社製）を用いて６００ｎｍの波長の透過率を測定した。結果を図１５に示す。
各カルボキシ化ポリロタキサンをｐＨ２．２から７．４の間に調整した各緩衝溶液に５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた。これらの溶液に対し、紫外−可視分光光度計（Ｖ−５５０、日本分光社製）を用いて６００ｎｍの波長の透過率を測定した。結果を図１５に示す。
［試料］
（１）ＣＭＣ−ＰＲＸ（例２で作製）
（２）ＣＥＣ−ＰＲＸ（例３で作製）
（３）ＣＰＣ−ＰＲＸ（例４で作製）
（１）ＣＭＣ−ＰＲＸ（例２で作製）
（２）ＣＥＣ−ＰＲＸ（例３で作製）
（３）ＣＰＣ−ＰＲＸ（例４で作製）
図１５の結果から、いずれのカルボキシ化ポリロタキサンもｐＨの低下により、溶液の透過率が減少し、沈殿を生じた。これはカルボキシ基がｐＫａ以下のｐＨで脱イオン化することで水への溶解性が低下したためであると考えられる。透過率の低下を生じるｐＨは、ＣＭＣ−ＰＲＸではｐＨ３．１、ＣＥＣ−ＰＲＸではｐＨ３．７、ＣＰＣ−ＰＲＸではｐＨ４．２であり、カルボキシ基と環状分子間のアルキル基の数が少ないほど低いｐＨで透過率の低下を生じた。これはアルキル鎖長が長くなることで分子の疎水性が増大し、脱イオン化による溶解性の低下が起こりやすいことを示唆している。
＜例7：細胞への取り込み量評価＞
＜試料の調製＞
培養細胞と接触した際のカルボキシ化ポリロタキサン誘導体の取り込み量を明らかとするために、試料として用いる４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−Ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＢＯＤＩＰＹ―ＥＤＡ）で修飾したＣＭＣ−ＰＲＸ（以下、「ＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸ」と称する）、ＣＥＣ−ＰＲＸ（以下、「ＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸ」と称する）、ＣＰＣ−ＰＲＸ（以下、「ＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸ」と称する）を以下のようにして調製した。
＜試料の調製＞
培養細胞と接触した際のカルボキシ化ポリロタキサン誘導体の取り込み量を明らかとするために、試料として用いる４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−Ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＢＯＤＩＰＹ―ＥＤＡ）で修飾したＣＭＣ−ＰＲＸ（以下、「ＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸ」と称する）、ＣＥＣ−ＰＲＸ（以下、「ＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸ」と称する）、ＣＰＣ−ＰＲＸ（以下、「ＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸ」と称する）を以下のようにして調製した。
−ＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸの調製−
例２で調製したＣＭＣ−ＰＲＸ ５ｍｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＥＤＡ ０．７６ｍｇ、ＤＭＴ−ＭＭ ２．８６ｍｇをサンプル瓶に測り取り５ｍＬの炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．２）に溶解し、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量６，０００の透析膜（スペクトラポア社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸを得た。ＢＯＤＩＰＹの修飾数は紫外−可視分光光度計を用いて５０２ｎｍの吸光度より算出した。未標識ＣＭＣ−ＰＲＸとＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸを混合し、ＣＭＣ−ＰＲＸ一分子に対するＦＩＴＣ修飾数が０．１分子となるよう調整した。
例２で調製したＣＭＣ−ＰＲＸ ５ｍｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＥＤＡ ０．７６ｍｇ、ＤＭＴ−ＭＭ ２．８６ｍｇをサンプル瓶に測り取り５ｍＬの炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．２）に溶解し、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量６，０００の透析膜（スペクトラポア社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸを得た。ＢＯＤＩＰＹの修飾数は紫外−可視分光光度計を用いて５０２ｎｍの吸光度より算出した。未標識ＣＭＣ−ＰＲＸとＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸを混合し、ＣＭＣ−ＰＲＸ一分子に対するＦＩＴＣ修飾数が０．１分子となるよう調整した。
−ＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸの調製−
例３で調製したＣＥＣ−ＰＲＸ ５ｍｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＥＤＡ ０．７６ｍｇ、ＤＭＴ−ＭＭ ２．８６ｍｇをサンプル瓶に測り取り５ｍＬの炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．２）に溶解し室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量６，０００の透析膜（スペクトラポア社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸを得た。ＢＯＤＩＰＹの修飾数は紫外−可視分光光度計を用いて５０２ｎｍの吸光度より算出した。未標識ＣＥＣ−ＰＲＸとＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸを混合し、ＣＥＣ−ＰＲＸ一分子に対するＦＩＴＣ修飾数が０．１分子となるよう調整した。
例３で調製したＣＥＣ−ＰＲＸ ５ｍｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＥＤＡ ０．７６ｍｇ、ＤＭＴ−ＭＭ ２．８６ｍｇをサンプル瓶に測り取り５ｍＬの炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．２）に溶解し室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量６，０００の透析膜（スペクトラポア社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸを得た。ＢＯＤＩＰＹの修飾数は紫外−可視分光光度計を用いて５０２ｎｍの吸光度より算出した。未標識ＣＥＣ−ＰＲＸとＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸを混合し、ＣＥＣ−ＰＲＸ一分子に対するＦＩＴＣ修飾数が０．１分子となるよう調整した。
−ＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸの調製−
例４で調製したＣＰＣ−ＰＲＸ ５ｍｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＥＤＡ ０．７６ｍｇ、ＤＭＴ−ＭＭ ２．８６ｍｇをサンプル瓶に測り取り５ｍＬの炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．２）に溶解し、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量６，０００の透析膜（スペクトラポア社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸを得た。ＢＯＤＩＰＹの修飾数は紫外−可視分光光度計を用いて５０２ｎｍの吸光度より算出した。未標識ＣＰＣ−ＰＲＸとＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸを混合し、ＣＰＣ−ＰＲＸ一分子に対するＦＩＴＣ修飾数が０．１分子となるよう調整した。
例４で調製したＣＰＣ−ＰＲＸ ５ｍｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＥＤＡ ０．７６ｍｇ、ＤＭＴ−ＭＭ ２．８６ｍｇをサンプル瓶に測り取り５ｍＬの炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．２）に溶解し、室温で２４時間撹拌した。反応後、分画分子量６，０００の透析膜（スペクトラポア社製）へ加え、超純水に対し透析をすることで未反応物を除去した。回収した水溶液を凍結乾燥することでＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸを得た。ＢＯＤＩＰＹの修飾数は紫外−可視分光光度計を用いて５０２ｎｍの吸光度より算出した。未標識ＣＰＣ−ＰＲＸとＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸを混合し、ＣＰＣ−ＰＲＸ一分子に対するＦＩＴＣ修飾数が０．１分子となるよう調整した。
＜フローサイトメトリー＞
２４ｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ社製）にＮＩＨ／３Ｔ３、ＤＣ ２．４、ＲＡＷ２６４．７細胞を０．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、一日３７℃で培養した。培地を２７０μＬの培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して２ｍＭに調整した下記試料を３０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（富士フイルム和光純薬社製）を各ウエルに添加し細胞を剥離させた。細胞を１．５ｍＬチューブに集め、リン酸緩衝溶液で１回洗浄した。その後、０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液を加え、３５μｍセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）により濾過した。
２４ｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ社製）にＮＩＨ／３Ｔ３、ＤＣ ２．４、ＲＡＷ２６４．７細胞を０．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、一日３７℃で培養した。培地を２７０μＬの培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して２ｍＭに調整した下記試料を３０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（富士フイルム和光純薬社製）を各ウエルに添加し細胞を剥離させた。細胞を１．５ｍＬチューブに集め、リン酸緩衝溶液で１回洗浄した。その後、０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液を加え、３５μｍセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）により濾過した。
細胞の蛍光強度をＮｏｖｏ−Ｃｙｔｅ ２０００（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により求めた。細胞１０，０００個を数え、その平均値を図１６に示す。
［試料］
（１）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸ（例２で作製）
（２）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸ（例３で作製）
（３）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸ（例４で作製）
（４）ＢＯＤＩＰＹ−２−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ修飾ＰＲＸ（以下、「ＢＯＤＩＰＹ−ＨＥＥ−ＰＲＸ」と称することがある。；下記構造式（１）で表される化合物；ＷＯ２０１７／１８８２５７Ａ１を参考に合成し、ＢＯＤＩＰＹを化学修飾し、ＰＲＸ１分子当たりの修飾数が０．１となるように調整した；下記構造式（１）では、ｍは、ポロキサマー中のポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示す整数であり、ｎは、ポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す整数であり、ｌは、β−シクロデキストリンの数を示す整数である。ここでは、β−シクロデキストリンが括弧内の環状構造として示されている。図示の都合上、β−シクロデキストリン上の置換基は１つのみが示されている前記ＨＥＥ基の修飾が１個の場合を示している。）
（１）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸ（例２で作製）
（２）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸ（例３で作製）
（３）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸ（例４で作製）
（４）ＢＯＤＩＰＹ−２−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ修飾ＰＲＸ（以下、「ＢＯＤＩＰＹ−ＨＥＥ−ＰＲＸ」と称することがある。；下記構造式（１）で表される化合物；ＷＯ２０１７／１８８２５７Ａ１を参考に合成し、ＢＯＤＩＰＹを化学修飾し、ＰＲＸ１分子当たりの修飾数が０．１となるように調整した；下記構造式（１）では、ｍは、ポロキサマー中のポリプロピレングリコールの繰返し単位の数を示す整数であり、ｎは、ポリエチレングリコールの繰返し単位の数を示す整数であり、ｌは、β−シクロデキストリンの数を示す整数である。ここでは、β−シクロデキストリンが括弧内の環状構造として示されている。図示の都合上、β−シクロデキストリン上の置換基は１つのみが示されている前記ＨＥＥ基の修飾が１個の場合を示している。）
ＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸ、ＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸ、ＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸはいずれの細胞においても従来品であるＢＯＤＩＰＹ−ＨＥＥ−ＰＲＸよりも顕著に高い細胞内への取り込みを示した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてはＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸの取り込みが最も高く、ＤＣ２．４細胞とＲＡＷ２６４．７細胞においてはＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸの取り込みが最も高い結果となった。これらの結果より、カルボキシ基とポリロタキサン間のアルキル鎖長により細胞への取り込み効率が変化すること、及び細胞種によって取り込まれやすいアルキル鎖長があることが明らかになった。
＜例８：ＮＰＣ病患者由来皮膚線維芽への取り込み量評価＞
＜フローサイトメトリー＞
２４ｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ社製）にＮＰＣ病患者由来皮膚線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｕｔｅより入手）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、一日３７℃で培養した。培地を２７０μＬの培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して２ｍＭに調整した下記試料を３０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（富士フイルム和光純薬社製）を各ウエルに添加し細胞を剥離させた。細胞を１．５ｍＬチューブに集め、リン酸緩衝溶液で１回洗浄した。その後、０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液を加え、３５μｍセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）により濾過した。
＜フローサイトメトリー＞
２４ｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ社製）にＮＰＣ病患者由来皮膚線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｕｔｅより入手）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、一日３７℃で培養した。培地を２７０μＬの培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して２ｍＭに調整した下記試料を３０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（富士フイルム和光純薬社製）を各ウエルに添加し細胞を剥離させた。細胞を１．５ｍＬチューブに集め、リン酸緩衝溶液で１回洗浄した。その後、０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液を加え、３５μｍセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）により濾過した。
細胞の蛍光強度をＮｏｖｏ−Ｃｙｔｅ ２０００（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により求めた。細胞１０，０００個を数え、その平均値を図１６に示す。
［試料］
（１）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸ
（２）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸ
（３）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸ
（４）ＢＯＤＩＰＹ−ＨＥＥ−ＰＲＸ
（１）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸ
（２）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸ
（３）ＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸ
（４）ＢＯＤＩＰＹ−ＨＥＥ−ＰＲＸ
ＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸ、ＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸ、ＢＯＤＩＰＹ−ＣＰＣ−ＰＲＸはＮＰＣ病患者由来皮膚線維芽細胞において従来品であるＢＯＤＩＰＹ−ＨＥＥ−ＰＲＸよりも有意に高い細胞内への取り込みを示した。特にＢＯＤＩＰＹ−ＣＭＣ−ＰＲＸ、ＢＯＤＩＰＹ−ＣＥＣ−ＰＲＸの取り込みが高い結果となった。これらの結果より、カルボキシ基とポリロタキサン間のアルキル鎖長がメチル、エチルの場合にＮＰＣ病患者由来皮膚線維芽細胞への取り込みが顕著に増加することが明らかになった。
＜例９：ＮＰＣ病患者由来皮膚線維芽のコレステロール量変化＞
ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞、およびヒト正常皮膚線維芽細胞（Ｃｏｒｅｉｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手）を用い、以下のようにして細胞中のコレステロール量を調べた。
２４ｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ社製）にＮＰＣ病患者由来皮膚線維芽細胞、またはヒト正常皮膚線維芽細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、一日３７℃で培養した。培地を２７０μＬの培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して５ｍＭに調整した下記試料を３０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を各ウエルに添加し細胞を剥離させた。細胞を１．５ｍＬチューブに集め、リン酸緩衝溶液で１回洗浄した。その後、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（富士フイルム和光純薬社製）を１ｍＬ加え、細胞を溶解させた。
各細胞溶解液を５０μL用いて、ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により総タンパク質量を定量した。
また、残りの細胞溶解液を１０ｍＬガラスチューブに移し、内部標準であるコレステロールーｄ７（Ａｖａｎｔｉ社製）を8μＬ（５０μｇ／ｍＬ）、クロロホルム：メタノール混合溶媒（体積比で１：２）を３．７５ｍＬ、クロロホルムを１．２５ｍＬ、超純水を１．２５ｍＬ加え混合した。分離した下層を回収し、窒素フローにより乾燥させた。脱水ピリジンを１５０μＬ、Ｎ−メチルーＮ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（富士フイルム和光純薬社製）を５０μＬ加え、６０℃で３０分間反応させ、誘導体化を行った。
なお、比較として、ヒト正常皮膚線維芽細胞を用い、試料を投与しなかった場合、及びＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料を投与しなかった場合についても同様にして試験した。
ＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞、およびヒト正常皮膚線維芽細胞（Ｃｏｒｅｉｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手）を用い、以下のようにして細胞中のコレステロール量を調べた。
２４ｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ社製）にＮＰＣ病患者由来皮膚線維芽細胞、またはヒト正常皮膚線維芽細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、一日３７℃で培養した。培地を２７０μＬの培地に交換後、シクロデキストリン濃度に換算して５ｍＭに調整した下記試料を３０μＬずつ各ウエルに添加し、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、リン酸緩衝溶液で細胞を２回洗浄後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を各ウエルに添加し細胞を剥離させた。細胞を１．５ｍＬチューブに集め、リン酸緩衝溶液で１回洗浄した。その後、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（富士フイルム和光純薬社製）を１ｍＬ加え、細胞を溶解させた。
各細胞溶解液を５０μL用いて、ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により総タンパク質量を定量した。
また、残りの細胞溶解液を１０ｍＬガラスチューブに移し、内部標準であるコレステロールーｄ７（Ａｖａｎｔｉ社製）を8μＬ（５０μｇ／ｍＬ）、クロロホルム：メタノール混合溶媒（体積比で１：２）を３．７５ｍＬ、クロロホルムを１．２５ｍＬ、超純水を１．２５ｍＬ加え混合した。分離した下層を回収し、窒素フローにより乾燥させた。脱水ピリジンを１５０μＬ、Ｎ−メチルーＮ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（富士フイルム和光純薬社製）を５０μＬ加え、６０℃で３０分間反応させ、誘導体化を行った。
なお、比較として、ヒト正常皮膚線維芽細胞を用い、試料を投与しなかった場合、及びＮＰＣ病患者由来皮膚繊維芽細胞を用い、試料を投与しなかった場合についても同様にして試験した。
コレステロールはガスクロマトグラフィー質量分析装置ＧＣＭＳ−ＱＰ２０２０（島津製作所社製）を用いて定量した。細胞内の遊離コレステロール量は、遊離コレステロール量（ｎｍｏｌ）／総タンパク質量（ｍｇ）で表記した。その平均値を図１８に示す。
［試料］
（１）ＣＭＣ−ＰＲＸ
（２）ＣＥＣ−ＰＲＸ
（３）ＣＰＣ−ＰＲＸ
（４）ＨＥＥ−ＰＲＸ
（１）ＣＭＣ−ＰＲＸ
（２）ＣＥＣ−ＰＲＸ
（３）ＣＰＣ−ＰＲＸ
（４）ＨＥＥ−ＰＲＸ
ＮＰＣ病患者由来皮膚線維芽細胞中のコレステロール量はＣＭＣ−ＰＲＸ、ＣＥＣ−ＰＲＸを作用させた場合に、従来品であるＨＥＥ−ＰＲＸよりも有意に低下した。これらの結果より、カルボキシ基とポリロタキサン間のアルキル鎖長がメチル、エチルの場合にＮＰＣ病患者由来皮膚線維芽細胞中の遊離コレステロールを従来品よりも効果的に低下させることが明らかになった。
本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
上記のとおり、酸分解性ポリロタキサンへカルボキシエステルを導入する工程と、弱アルカリ水溶液下でエステルの脱保護を行う工程を含む製造方法によって、カルボキシ化された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物が製造された。特に、カルボキシ基で修飾された複数のβ−シクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物は、細胞への取り込み効率の面で優れており、リソソーム内のコレステロールの過剰蓄積を原因とするニーマン・ピック病Ｃ型などのライソゾーム病の治療もしくは予防等において有用となりうる。
Claims (24)
- カルボキシ基で修飾された複数の環状分子と、末端基を有する直鎖状分子とを含む、酸分解性のポリロタキサン化合物。
- 細胞内の酸性環境下で分解する、請求項１記載のポリロタキサン化合物。
- ｐＨ４．０〜６．０の酸性環境下で分解する、請求項１または２記載のポリロタキサン化合物。
- 環状分子がβ−シクロデキストリンである、請求項１〜３のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- シクロデキストリンの水酸基が修飾されている、請求項１〜４のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- シクロデキストリンが１分子あたり１〜２１個のカルボキシ基を有する、請求項１〜５のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- シクロデキストリンがリンカーを介してカルボキシ基により修飾されている、請求項１〜６のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- リンカーが、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、又は−Ｏ−を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- カルボキシ基が置換又は非置換のアルキルカルボキシ基である、請求項１〜８のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- カルボキシ基が、メチルカルボキシ基、エチルカルボキシ基、プロピルカルボキシ基、ブチルカルボキシ基、ペンチルカルボキシ基、又はヘキシルカルボキシ基である、請求項１〜９のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- カルボキシ基が、−ＣＯ−ＯＣＨ３、−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−ＣＯ−ＯＣ6Ｈ5、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−ＣＨ２−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ5、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣＨ３、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−Ｃ２Ｈ４−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ5、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣＨ３、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ３Ｈ７、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯＣ４Ｈ９、−Ｃ３Ｈ６−ＣＯ−ＯCH2−Ｃ6Ｈ５、又は−Ｒａ−ＣＯ−ＯＲｂ（ここで、Ｒａは単結合又はＣ１−６アルキレン基、ＲｂはH又は直鎖状、分岐状又は環状のＣ１−６アルキル基をそれぞれ表す）で表される置換カルボキシ基である、請求項１〜９のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- カルボキシ基が、カルボキシメチルカルバメート基、カルボキシエチルカルバメート基、又はカルボキシプロピルカルバメート基である、請求項１〜１１のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- 直鎖状分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- 直鎖状分子がポロキサマーを含む、請求項１〜１３のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- 直鎖状分子の分子量が４０００〜７０００である、請求項１〜１４のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- 直鎖状分子と環状分子との分子数の比率が１：１０〜１：２０であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- 末端基が、置換基を有する又は有さないＯ−トリフェニルメチル基、置換基を有する又は有さないＳ−トリフェニルメチル基、および置換基を有する又は有さないＮ−トリフェニルメチル基から成る群より選択される、請求項１〜１６のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- 末端基が直鎖状分子にペプチド結合、カーバメート結合、エステル結合、またはエーテル結合を介して連結されている、請求項１〜１７のいずれか一項記載のポリロタキサン化合物。
- カルボキシ基で修飾された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の製造方法であって、酸分解性ポリロタキサンの環状分子にカルボキシエステルを導入する工程と、弱アルカリ水溶液下でエステルの脱保護を行う工程とを含む、方法。
- カルボキシ基で修飾された複数の環状分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物の製造方法であって、ポロキサマーの両末端に一級アミノ基を有するポロキサマーを得る工程、前記ポロキサマーとβ−シクロデキストリンとを反応させて擬ポリロタキサンを得る工程、前記擬ポリロタキサンの両末端をＮ−トリチルグリシンでキャッピングする工程、カルボキシエステルを酸分解性ポリロタキサンの環状分子に導入する工程、および弱アルカリ水溶液下でエステルを脱保護させる工程とを含む、方法。
- 水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、又はナトリウムメトキシド溶液を用いて、カルボキシエステルを環状分子に導入した酸分解性ポリロタキサンのエステルを脱保護させる、請求項１９又は２０記載の方法。
- カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞においてオートファジーを誘導するための組成物。
- カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、細胞内のコレステロール蓄積に起因する疾患またはオートファジーの機能障害に起因する疾患を治療または予防するための医薬組成物。
- カルボキシ基で修飾された複数のシクロデキストリン分子を含む、酸分解性のポリロタキサン化合物を含有する、ニーマン・ピック病Ｃ型を治療または予防するための医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020082376A JP2021176932A (ja) | 2020-05-08 | 2020-05-08 | カルボキシ化分解性ポリロタキサン及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020082376A JP2021176932A (ja) | 2020-05-08 | 2020-05-08 | カルボキシ化分解性ポリロタキサン及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021176932A true JP2021176932A (ja) | 2021-11-11 |
Family
ID=78409255
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020082376A Pending JP2021176932A (ja) | 2020-05-08 | 2020-05-08 | カルボキシ化分解性ポリロタキサン及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2021176932A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116239708A (zh) * | 2023-03-20 | 2023-06-09 | 山东滨州智源生物科技有限公司 | 一种封端聚轮烷及其制备方法和应用 |
| WO2023190243A1 (ja) * | 2022-03-30 | 2023-10-05 | デンカ株式会社 | 超分子ハイドロゲルの調製方法、及び生体材料としての応用 |
-
2020
- 2020-05-08 JP JP2020082376A patent/JP2021176932A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023190243A1 (ja) * | 2022-03-30 | 2023-10-05 | デンカ株式会社 | 超分子ハイドロゲルの調製方法、及び生体材料としての応用 |
| CN116239708A (zh) * | 2023-03-20 | 2023-06-09 | 山东滨州智源生物科技有限公司 | 一种封端聚轮烷及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7897584B2 (en) | Taxanes covalently bounded to hyaluronic acid or hyaluronic acid derivatives | |
| EP1981512B1 (en) | Modified macromolecule | |
| EP1792927B1 (en) | Novel block copolymer, micelle preparation, and anticancer agent containing the same as active ingredient | |
| KR101857900B1 (ko) | 공유결합된 치료제 전달을 위한 사이클로덱스트린-기초 중합체 | |
| US8383758B2 (en) | Biodegradable polyketal polymers and methods for their formation and use | |
| US6730735B2 (en) | Conjugate of polyethylene glycol and chitosan | |
| KR101444274B1 (ko) | 약제복합체용 블록 공중합체 및 의약조성물 | |
| JPWO2006115293A1 (ja) | ｐＨ応答性高分子ミセルの調製に用いる新規ブロック共重合体及びその製造法 | |
| JP6464087B2 (ja) | ポリロタキサン、及び医薬組成物 | |
| JP2021176932A (ja) | カルボキシ化分解性ポリロタキサン及びその製造方法 | |
| WO2022052413A1 (zh) | 具有不对称膜结构的载药聚合物囊泡及其制备方法与在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用 | |
| Brunato et al. | PEG-polyaminoacid based micelles for controlled release of doxorubicin: Rational design, safety and efficacy study | |
| WO2017188257A1 (ja) | メチル化ポリロタキサンおよびその合成方法 | |
| JP2002508758A (ja) | 生物的に活性な材料 | |
| JP2024028941A (ja) | 血液中のＣａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓを処置するための方法および医薬組成物 | |
| JP2003504312A (ja) | 生物学的に活性な材料 | |
| WO2002083154A1 (en) | Use of cationic dextran derivatives for protecting dose-limiting organs | |
| CN111346234B (zh) | 去铁胺-八臂星型聚乙二醇结合物及其应用 | |
| JPH06321927A (ja) | 抗腫瘍ミトキサントロンのポリマー組成物 | |
| CN115379862A (zh) | 用于合成透明质酸和紫杉醇的缀合物的方法 | |
| CN111956609A (zh) | 一种免疫检查点阻断多肽前药纳米胶束及制备方法与应用 | |
| JP2003034653A (ja) | 最適化されたｄｄｓ化合物 | |
| CN115109258A (zh) | 7-乙基-10-羟基喜树碱聚合物、制备方法及其应用 | |
| JP2017141198A (ja) | 局所麻酔薬を含有するポリイオンコンプレックスを有効成分とする局所疼痛制御用組成物 | |
| AU2002246164A1 (en) | Use of cationic dextran derivatives for protecting dose-limiting organs |