CN107243000A - 载药杂化纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种载药杂化纳米粒子，其制备方法包括以下步骤：(1)叠氮化三缩酮化合物的制备；(2)炔丙胺修饰肝素钠的制备；(3)炔丙胺修饰肝素钠接枝叠氮化三缩酮化合物；(4)载药杂化纳米粒子的制备。本发明以天然的聚合物肝素作为纳米粒子的骨架材料，其肝素是构成具有很好的生物安全性，通过特定的制备过程，制备出的载药杂化纳米粒子，其载药杂化纳米粒子的粒径在EPR效应范围内，可实现被动靶向，在过热环境下的响应性，可实现其在肿瘤细胞内高选择性的快速释药，因此制备出的载药杂化纳米粒子具有生物相容性好、其安全性高、无毒副作用等特点。

Description

载药杂化纳米粒子及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种载药杂化纳米粒子及其制备方法。
背景技术
癌症在当今世界上严重威胁人类的健康和生命。癌症的通常治疗手段包括手术，化疗，放疗等。其中阿霉素(DOX)是蒽环霉素类的抗肿瘤药物，具有广谱的恶性肿瘤治疗效果，已在临床上获准使用。其主要通过细胞膜进入细胞后作用于DNA进而杀死癌细胞，但DOX的毒性较大，副作用明显，因此纳米粒子等药物载体系统负载药物用于抗肿瘤的研究得到广泛关注和研究，以期实现安全稳定，有效定向释放药物和准确治疗的效果。开发一种稳定、安全、有效、生物相容性能好的纳米药物递送系统对于肿瘤的治疗研究具有重要的意义，有助于提高化疗药物的抗肿瘤效果，同时减少治疗过程中对正常组织的毒副作用。
天然高分子广泛分布于自然界的各种有机生命体中，有绿色、可再生的优势。天然高分子作为有机生命体的组成成分一般都具有良好的生物相容性和生物降解性。多糖是由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的一种天然高分子化合物、广泛存在于植物、微生物、动物等有机体中，是生物体维持正常生命活动的必需物质。多糖与生命的各种生理机能密切相关，具有多种多样的生物学功能。其中肝素是一种是由二种多糖交替连接而成的多聚体，具有生物活性，无细胞毒性，可生物降解的性能。肝素参与和控制细胞的一些生理功能如抗凝血等，也有研究表明，肝素可以抑制肿瘤生长和转移，肝素及其衍生物被视为较为理想的抗肿瘤制剂。此外，肝素本身含有丰富的亲水基团，利用这些基团的特点，在其侧链上修饰疏水基团，可以形成纳米粒子并对药物进行简单有效的物理包裹，这对一些不能进行化学链接的药物的运输也是一种解决方法，也利于载药体系向临床的推广应用。
在具有环境响应行为的纳米载药系统中，针对肿瘤组织新陈代谢较快，局部温度较正常组织高的特点，热响应型的纳米载药系统近年来也得到广泛关注。其中一种方式是利用碳酸氢盐在受热条件下，产生CO2气体的特点，帮助药物从被包载的状态释放出来。例如以脂质体等物质为基础制备包载有碳酸氢盐(碳酸氢钠或碳酸氢铵)和抗癌药物的纳米粒子，在外部加热至42℃的条件下，除研究其体外的释放，细胞的毒性、入胞等现象以外，也有针对小鼠进行的动物上的抗肿瘤实验。而以脂质体为材料来制备含有碳酸氢铵和阿霉素的纳米载药粒子，是首先将碳酸氢铵包载在脂质体内，再将阿霉素以扩散方式载入脂质体，这种载药方式是利用阿霉素被动扩散的方式进行包载，使得其载药量偏低，一定程度上会限制其应用。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种载药杂化纳米粒子及其制备方法，可有效解决现有载药纳米粒子载药量低，释放药物速度慢，抗肿瘤效果和安全性差的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
载药杂化纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)叠氮化三缩酮化合物的制备
称取2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮，加热使其融化，加入季戊四醇三烯丙基醚和硫代甘油，搅拌溶解后，在365nm紫外灯下搅拌反应1-2h，然后加甲醇溶解，再加石油醚，搅拌静置后取甲醇层，除去溶剂，得到中间物1；中间体1和2,2-二甲氧基丙烷混合，以少量多次加入对甲苯磺酸水合物，于30℃-40℃混合搅拌反应12-16h，加入三乙胺，继续反应0.5h后过柱层析，除去溶剂得中间物2；中间物2和氢化钠溶于无水DMF中，于氮气保护下冰水浴反应1-1.5h后逐滴加入1，6-二溴己烷，反应24-26h后，逐滴加入甲醇以淬灭反应，过滤，水洗，用乙酸乙酯萃取后柱层析分离得中间物3；中间物3溶于无水DMF中后加入叠氮化钠，于75-85℃下搅拌反应48-50h，用乙酸乙酯溶解，然后水洗，取有机相干燥后得到叠氮化三缩酮化合物；其中，季戊四醇三烯丙基醚、硫代甘油和2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮的摩尔比分别为0.8-1.5:2-4:0.01-0.02；中间物1、2,2-二甲氧基丙烷、对甲苯磺酸和三乙胺摩尔比为0.8-1.5:3-6:0.05-0.15:0.05-0.15；中间物2、氢化钠和1，6-二溴己烷摩尔比为0.8-1.2:3-6:1-3；中间物3和叠氮化钠的摩尔比为1:4-7；
(2)炔丙胺修饰肝素钠的制备
将肝素钠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中，加入炔丙胺后调节溶液pH值为6-7，室温反应24-26h，去离子水透析72h后冷冻干燥；其中，肝素钠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和炔丙胺质量比为0.8-1.2:0.5-0.65:0.3-0.4:0.02-0.04；
(3)炔丙胺修饰肝素钠接枝叠氮化三缩酮化合物
炔丙胺修饰的肝素钠、叠氮化三缩酮化合物、五水硫酸铜和抗坏血酸钠以质量比为0.8-1.2:1.2-1.8:0.1-0.16:0.6-1.0的比例混溶于DMSO中，氮气保护下于35-45℃反应24-26h，DMSO透析后再用水透析除去有机溶剂，冷冻干燥；
(4)载药杂化纳米粒子的制备
将溶解有抗肿瘤药物的氯仿与溶解有步骤(3)所得物的PBS溶液按体积比为1:15混合，对混合液进行超声探头作用，将得到的乳液置于黑暗环境下挥发除去溶剂中的氯仿，再加入胱胺盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，交联反应24h，利用去离子水透析，除去未被包裹的抗肿瘤药物后，置于2mol/L的碳酸氢铵溶液中24h，再利用去离子水透析，最后用0.22μm的过滤器过滤收集，冷冻干燥，形成含有碳酸氢盐的载药杂化纳米粒子；其中，抗肿瘤药物和步骤(3)所得物的质量比为1-3:8-10；步骤(3)所得物与胱胺盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为8-12:0.8-1.2:4-6:2-4。
进一步地，步骤(1)中季戊四醇三烯丙基醚、硫代甘油和2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮的摩尔比分别为1:3:0.01。
进一步地，步骤(1)中中间物1、2,2-二甲氧基丙烷、对甲苯磺酸和三乙胺摩尔比为1:4:0.1:0.1。
进一步地，步骤(1)中中间物2、氢化钠和1，6-二溴己烷摩尔比为1:4:2。
进一步地，步骤(1)中中间物3和叠氮化钠的摩尔比为1:5。
进一步地，步骤(2)中肝素钠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和炔丙胺质量比为1:0.56:0.34:0.029。
进一步地，步骤(3)中炔丙胺修饰的肝素钠、叠氮化三缩酮化合物、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的质量比为1:1.5:0.125:0.8。
进一步地，步骤(3)中反应温度为40℃，反应时间为24h。
进一步地，步骤(4)中步骤(3)所得物与胱胺盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为10:1:5:3。
本发明提供的载药杂化纳米粒子及其制备方法，具有以下有益效果：
(1)本发明利用肿瘤细胞内新陈代谢较快，温度较高以及利用外部条件可加热的特点，引发纳米粒子内部的碳酸氢铵盐的分解，释放CO2气体，促使药物释放，有效发挥药效。
(2)本发明首先制备末端叠氮化三缩酮化合物，将肝素钠用炔丙基胺修饰以后，利用点击反应将缩酮化合物接枝在肝素钠上，再利用超声乳化法制得包载碳酸氢铵和阿霉素复合物的纳米粒子。在过热条件下碳酸氢铵和阿霉素的复合物分解，释放CO2气体，药物在气体作用下释放出来，从而产生相应药物疗效。
(3)本发明以天然的聚合物肝素作为纳米粒子的骨架材料，其肝素是构成具有很好的生物安全性，通过特定的制备过程，制备出的过热条件下二氧化碳气体促进药物快速释放的抗肿瘤载药杂化纳米粒子，其载药杂化纳米粒子的粒径在EPR效应范围内，可实现被动靶向；载药杂化纳米粒子在过热环境下的响应性，可实现其在肿瘤细胞内高选择性的快速释药，因此制备出的载药杂化纳米粒子具有生物相容性好、其安全性高、无毒副作用等特点。
附图说明
图1为过热条件下可产生CO2促进药物释放的抗肿瘤载药杂化纳米粒子示意图；
图2为合成叠氮化三缩酮化合物线路图；
图3为三缩酮化合物接枝在肝素钠上的合成线路图；
图4中(a)，(b)，(c)，(d)分别为为中间体1，2，3以及叠氮化三缩酮化合物核磁氢谱图；
图5为炔丙胺修饰的肝素钠产物核磁氢谱图；
图6为接枝三缩酮化合物后产物核磁氢谱图；
图7为载药杂化纳米粒子室温下在中性水中粒径分布图；
图8为载药杂化纳米粒子的扫描电镜图；
图9为载药杂化纳米粒子的透射电镜图；
图10为不同温度下抗肿瘤载药杂化纳米粒子在水中粒径变化图；
图11为单个载药杂化纳米粒子的透射电镜初始成像(a)与持续成像图(b)；
图12为含有不同浓度阿霉素的载药杂化纳米粒子在与肿瘤细胞经过42℃孵育后细胞毒性图；
图13为含有不同浓度阿霉素的载药杂化纳米粒子在与肿瘤细胞经过37℃的孵育后细胞毒性图；
图14为不同浓度的空白纳米粒子在与肿瘤细胞经过42℃的孵育后细胞毒性图；
图15为不同浓度的空白纳米粒子在与肿瘤细胞经过37℃的孵育后细胞毒性图；
图16为不同浓度的空白纳米粒子在与MC3T3细胞经过37℃的孵育后细胞毒性图；
图17为不同温度下载药杂化纳米粒子与肿瘤细胞共孵育后的激光共聚焦图片；
图18为肿瘤细胞摄取载药杂化纳米粒子后的流式检测结果图(以空白组和自由药组为对照)；
图19为载药杂化纳米粒子对荷瘤小鼠的体内抑制肿瘤生长数据(以自由药盐酸阿霉素DOX·HCl和生理盐水Saline为对照组)；
图20为载药杂化纳米粒子对荷瘤老鼠的体重影响数据(以自由药盐酸阿霉素DOX·HCl和生理盐水Saline为对照组)。
具体实施方式
本发明以季戊四醇三烯丙基和硫代甘油为原料，先后通过巯烯点击反应，缩酮化反应，威廉姆森醚合成，叠氮化反应制备叠氮化缩酮化合物；再以多糖肝素钠作为骨架材料，利用点击反应接枝缩酮化合物制备疏水基团修饰的肝素高分子，将该所得物溶解于PBS缓冲液中，再包裹上抗肿瘤药物，利用超声乳化法制备纳米粒子，在透析袋中置于碳酸氢铵溶液中放置24h，最后利用透析袋透析，除去多余碳酸氢铵，过滤膜后得到过热条件可产生二氧化碳气体的载药杂化纳米粒子，示意图见图1。具体制备过程如下：
实施例1叠氮化三缩酮化合物的制备
叠氮化三缩酮化合物的制备路线示意图见图2，具体为：称取少量2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮置于圆底烧瓶中，外部快速加热使其融化，然后加入季戊四醇三烯丙基醚和硫代甘油，搅拌溶解后，在365nm紫外灯下搅拌反应1h，然后加少量甲醇溶解，再加大量石油醚，搅拌静置后取甲醇层，除去溶剂，得到中间物1；中间体1和2,2-二甲氧基丙烷混合，以少量多次缓慢加入对甲苯磺酸水合物，于30℃-40℃混合搅拌反应12h，加入三乙胺，继续反应0.5h后通过柱层析分离(V石油醚:V乙酸乙酯＝4:1)，最后除去溶剂得中间物2；中间物2和氢化钠溶于无水DMF中，于氮气保护下冰水浴反应1h后逐滴加入1，6-二溴己烷，反应24h后，逐滴加入甲醇以淬灭反应，过滤，水洗，用乙酸乙酯萃取后柱层析分离(V石油醚:V乙酸乙酯＝6:1)得中间物3；中间物3溶于无水DMF中后加入叠氮化钠，于80℃下搅拌反应48h，用乙酸乙酯溶解，然后水洗3次，取有机相干燥后得到叠氮化三缩酮化合物；其中，季戊四醇三烯丙基醚、硫代甘油和2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮的摩尔比分别为1:3:0.01；中间物1、2,2-二甲氧基丙烷、对甲苯磺酸和三乙胺摩尔比为1:4:0.1:0.1；中间物2、氢化钠和1，6-二溴己烷摩尔比为1:4:2；中间物3和叠氮化钠的摩尔比为1:5。
将中间物1，2溶于CD3OD中，做400MHz 1H-NMR扫描，中间物3，叠氮化三缩酮化合物溶于CDCl3中做400MHz 1H-NMR扫描，结果见图4，图中(a)、(b)、(c)、(d)分别表示中间物1，2，3和叠氮化三缩酮化合物的1H-NMR谱图。
实施例2炔丙胺修饰肝素钠的制备
将肝素钠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中，加入炔丙胺后调节溶液pH值为6-7，室温反应24h，用去离子水透析72h后冷冻干燥；其中，肝素钠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和炔丙胺质量比为1:0.56:0.34:0.029。
将所得的产物溶于D2O，做400MHz 1H-NMR扫描，结果见图5。
实施例3炔丙胺修饰肝素钠接枝叠氮化三缩酮化合物
炔丙胺修饰肝素钠接枝叠氮化三缩酮化合物的制备路线图见图3，具体为：炔丙胺修饰的肝素钠、叠氮化三缩酮化合物、五水硫酸铜和抗坏血酸钠以质量比为1:1.5:0.125:0.8的比例混溶于DMSO中，氮气保护下于40℃反应24h，DMSO透析72h后再用水透析72h除去有机溶剂，冷冻干燥。
将所得产物溶于D2O做400M 1H-NMR扫描，核磁图谱如图6所示。
实施例4载药杂化纳米粒子的制备
将溶解有抗肿瘤药物(阿霉素)的氯仿缓慢滴入溶解有步骤(3)所得物的PBS溶液中，滴加时快速搅拌，溶解有抗肿瘤药物的氯仿和溶解有步骤(3)所得物的PBS溶液按体积比为1:15混合，滴加完毕后，对混合液进行超声探头作用，得到乳液，将得到的乳液置于黑暗环境下挥发除去溶剂中的氯仿，再加入胱胺盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应24h，利用去离子水透析72h，除去未被包裹的抗肿瘤药物以及PBS后，置于2mol/L的碳酸氢铵溶液中24h，再利用去离子水透析72h，除去多余的碳酸氢铵，最后用0.22μm的过滤器过滤收集，冷冻干燥，形成含有碳酸氢盐的载药杂化纳米粒子；其中，抗肿瘤药物和步骤(3)所得物的质量比为1:10；步骤(3)所得物与胱氨盐酸盐，EDC·HCl，NHS的质量比为10:1:5:3。
将未加阿霉素的纳米粒子作为空白对照即空白纳米粒子。
通过马尔文激光粒度仪测定载药杂化纳米粒子的粒径大小及分布，结果见图7，由图7可知载药杂化纳米粒子的粒径为166±63nm。
用扫描电子显微镜(SEM)观察载药杂化纳米粒子的尺寸及形态，结果见图8，由图8可知，载药杂化纳米粒子呈规则的颗粒状，且大小分布均匀，同时用透射电子显微镜观察载药粒子的结构，尺寸结果与SEM结果相符，形貌上形状更加规则，可见纳米粒子边缘半透明膜结构，中间较规则黑色阴影为矿化后阿霉素与碳酸氢铵盐的结合物，见图9。
实施例5不同温度下一定时间内粒径变化及分布
将所得载药杂化纳米粒子分散于中性水中形成溶液，设定不同温度，通过马尔文激光粒度仪分别测定其粒径分布，结果分别见图10。
如图10所示，37℃和42℃温度下，纳米粒子的粒径与室温条件下相比，粒径变化均不大。
在TEM电子束持续照射下，杂化纳米粒子内部规则状包裹物逐渐变小，而外层膜的相对位置几乎没有变化，如图11所示，纳米粒子周围出现气泡，上述结果验证了该载药杂化纳米粒子的稳定性以及在过热条件下的药物释放性能。
实施例6细胞毒性评价
采用CCK-8法测定本发明中载药杂化纳米粒子对细胞的抑制作用：将一定数量的小鼠乳腺癌细胞4T1接种于96孔板中，培养24h后，分别加入不同浓度的载药杂化纳米粒子，在42℃条件下共孵育2h后，继续在37℃下培养24h后,每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃下避光孵育1h，用酶标仪测定450nm处96孔板各孔的吸光值，计算细胞存活率，每个实验组设置5个平行样，实验结果如图12所示，载药杂化纳米粒子的抗肿瘤效率随着浓度的增加而增加。
用上述同样方法，只在37℃条件下将载药杂化纳米粒子和4T1细胞在共孵育24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃下避光孵育1h后，用酶标仪测定450nm处96孔板各孔的吸光值，计算细胞存活率。实验结果如图13所示，没有在42℃条件下的孵育，各个浓度组的细胞均有较高存活率且不依赖阿霉素浓度变化而变化，此处实验结果验证了过热条件有助于阿霉素从纳米粒子中的释放，从而产生治疗效果。
用上述同样的方法，对空白纳米粒子进行评价，在42℃和37℃条件下，空白纳米粒子与4T1细胞共孵育24h后，结果如图14和图15所示，横坐标为不同浓度的空白纳米粒子，纵坐标为细胞存活率(Cell Viability 100％)，加入不同浓度的没有药物的空白纳米粒子，各组细胞均有较高的存活率，证明了在42℃条件下培养细胞2h对于细胞的正常增殖没有影响，而且与图12，图13中阿霉素浓度相比，浓度更高的空白材料对于4T1细胞也没有明显毒性，综合图12，图13，图14，图15证明了确实是在42℃条件下阿霉素的有效释放引起细胞存活率随阿霉素浓度变化而变化。
用上述同样的方法，将一定数量的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3接种于96孔板中，培养24h后，分别加入不同浓度的空白纳米粒子，在37℃下培养24h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，在37℃下避光孵育1h，用酶标仪测定450nm处96孔板各孔的吸光值，计算细胞存活率，每个实验组设置5个平行样，实验结果如图16所示，MC3T3细胞存活率不受空白纳米粒子浓度影响，各组均有较高的存活率，证明该纳米粒子材料具有良好的生物相容性和较小的毒性。
实施例8细胞摄取评价
利用激光共聚焦显微镜对细胞摄取该载药杂化纳米粒子进行评价：接种一定数量的对数期小鼠乳腺癌细胞4T1于两个玻底皿中，在37℃条件下培养24h，将含有10μg/mL阿霉素的载药杂化纳米粒子分别加入玻底皿中，其中一组在37℃下与细胞共孵育5h，另一组在42℃下与细胞共孵育1.5h，然后在激光共聚焦显微镜下观察载药杂化纳米粒子在细胞内的分布情况，结果见图17。左边一列为阿霉素通道下图片，中间为明场图片，右边为重合后的图片。如图17所示，在37℃即使共培养5h，仅有少量阿霉素信号可在细胞中得以观察到；在42℃下仅仅共孵育1.5h后，可以观察到细胞中有明显的阿霉素荧光信号。证明了该载药杂化纳米粒子可以很好的被肿瘤细胞摄取，但是需要在过热环境刺激下释放药物，杀死肿瘤细胞。
利用流式细胞仪对细胞摄取该载药杂化纳米粒子进行评价：接种一定数量的对数期小鼠乳腺癌细胞4T1于六孔板中，细胞分三组，每组三个平行样。在37℃下培养24h后，其中一组空白，另一组加入含有10μg/mL阿霉素的载药杂化纳米粒子，并分别在37℃和42℃条件下共孵育1.5h；另一组加入相同浓度的阿霉素盐酸盐后在37℃条件下培养1.5h，收集细胞后检测细胞内阿霉素荧光信号相对强度，如图18所示，与空白组相比，与阿霉素盐酸盐共孵育的细胞内荧光信号最强，与载药杂化纳米粒子在42℃条件下共孵育的细胞内信号次之，明显高于空白组，这是因为阿霉素盐酸盐可通过扩散直接大量进入细胞，而载药杂化纳米粒子在进入细胞后需要进一步将阿霉素释放出来，有响应过程的发生。此结果进一步证明了载药杂化纳米粒子能够有效进入细胞并且可在过热条件下释放出阿霉素。
实施例9体内抗肿瘤效果评价
选用BALB/c雌性毛鼠(6-8周，20-21g)建立皮下乳腺癌肿瘤模型，待肿瘤生长至150mm3时，将荷瘤毛鼠随机分组，每组5只，共分4组，即空白对照组，自由对照组，载药杂化纳米粒子组1(37℃组)，载药杂化纳米粒子组2(42℃组)。通过尾静脉注射方式分别将200μL生理盐水(空白对照组)，自由药(盐酸阿霉素，DOX·HCl)和载药杂化纳米粒子注射入荷瘤毛鼠体内，阿霉素总计计量为3μg/kg(毛鼠体重)。每3天注射一次，共计4次给药。其中42℃组的毛鼠在注射四个小时后肿瘤部位用加热板热敷0.5h后继续饲养。每组老鼠每隔3天记录肿瘤体积和荷瘤毛鼠体重变化，观察期为15天。统计肿瘤体积变化和体重变化，结果分别如图19，图20所示。图19结果表明，载药杂化纳米粒子表现出比自由药(盐酸阿霉素，DOX·HCl)组更好的肿瘤生长抑制作用。在第15天，与原始肿瘤体积大小相比，42℃组的肿瘤体积增长仅为466.48％左右，37℃组的肿瘤体积增长在596.94％左右，而自由药组的增长为1145.03％左右，空白对照组则达到2009.27％左右的增长。这一结果说明本发明的载药杂化纳米粒子体系能够较好的抑制模型动物实体瘤生长，相对正常体温情况，在肿瘤过热处理后能够明显抑制肿瘤的生长。图20结果表明，注射载药杂化纳米粒子的小鼠体重持续增长，且增长较其他几组快，而注射自由药的小鼠体重增长缓慢，在四次注射后体重还有降低，这是自由药对于机体的毒性引起的。综合图19，图20的结果说明本发明的载药杂化纳米粒子不仅具有良好的抑制肿瘤生长的效果，同时对老鼠机体的毒性很小，安全性好。

Claims (10)

1.载药杂化纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)叠氮化三缩酮化合物的制备
称取2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮，加热使其融化，加入季戊四醇三烯丙基醚和硫代甘油，搅拌溶解后，在365nm紫外灯下搅拌反应1-2h，然后加甲醇溶解，再加石油醚，搅拌静置后取甲醇层，除去溶剂，得到中间物1；中间体1和2,2-二甲氧基丙烷混合，加入对甲苯磺酸水合物，于30℃-40℃混合搅拌反应12-16h，加入三乙胺，继续反应0.5h后过柱层析，除去溶剂得中间物2；中间物2和氢化钠溶于无水DMF中，于氮气保护下冰水浴反应1-1.5h后逐滴加入1，6-二溴己烷，反应24-26h后，逐滴加入甲醇以淬灭反应，过滤，水洗，用乙酸乙酯萃取后柱层析分离得中间物3；中间物3溶于无水DMF中后加入叠氮化钠，于75-85℃下搅拌反应48-50h，用乙酸乙酯溶解，然后水洗，取有机相干燥后得到叠氮化三缩酮化合物；其中，季戊四醇三烯丙基醚、硫代甘油和2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮的摩尔比分别为0.8-1.5:2-4:0.01-0.02；中间物1、2,2-二甲氧基丙烷、对甲苯磺酸和三乙胺摩尔比为0.8-1.5:3-6:0.05-0.15:0.05-0.15；中间物2、氢化钠和1，6-二溴己烷摩尔比为0.8-1.2:3-6:1-3；中间物3和叠氮化钠的摩尔比为1:4-7；
(2)炔丙胺修饰肝素钠的制备
将肝素钠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中，加入炔丙胺后调节溶液pH值为6-7，室温反应24-26h，去离子水透析72h后冷冻干燥；其中，肝素钠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和炔丙胺质量比为0.8-1.2:0.5-0.65:0.3-0.4:0.02-0.04；
(3)炔丙胺修饰肝素钠接枝叠氮化三缩酮化合物
炔丙胺修饰的肝素钠、叠氮化三缩酮化合物、五水硫酸铜和抗坏血酸钠以质量比0.8-1.2:1.2-1.8:0.1-0.16:0.6-1.0混合，溶于DMSO中，氮气保护下于35-45℃反应24-26h，DMSO透析后再用水透析除去有机溶剂，冷冻干燥；
(4)载药杂化纳米粒子的制备
将溶解有抗肿瘤药物的氯仿与溶解有步骤(3)所得物的PBS溶液按体积比为1:15混合，对混合液进行超声探头作用，将得到的乳液置于黑暗环境下挥发除去溶剂中的氯仿，再加入胱胺盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，交联反应24h，利用去离子水透析，除去未被包裹的抗肿瘤药物后，置于2mol/L的碳酸氢铵溶液中24h，再利用去离子水透析，最后用0.22μm的过滤器过滤收集，冷冻干燥，形成含有碳酸氢盐的载药杂化纳米粒子；其中，抗肿瘤药物和步骤(3)所得物的质量比为1-3:8-10；步骤(3)所得物与胱胺盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为8-12:0.8-1.2:4-6:2-4。
2.根据权利要求1所述的载药杂化纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中季戊四醇三烯丙基醚、硫代甘油和2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮的摩尔比分别为1:3:0.01。
3.根据权利要求1所述的载药杂化纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中中间物1、2,2-二甲氧基丙烷、对甲苯磺酸和三乙胺摩尔比为1:4:0.1:0.1。
4.根据权利要求1所述的载药杂化纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中中间物2、氢化钠和1，6-二溴己烷摩尔比为1:4:2。
5.根据权利要求1所述的载药杂化纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中中间物3和叠氮化钠的摩尔比为1:5。
6.根据权利要求1所述的载药杂化纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(2)中肝素钠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和炔丙胺质量比为1:0.56:0.34:0.029。
7.根据权利要求1所述的载药杂化纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(3)中炔丙胺修饰的肝素钠、叠氮化三缩酮化合物、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的质量比为1:1.5:0.125:0.8。
8.根据权利要求1所述的载药杂化纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(3)中反应温度为40℃，反应时间为24h。
9.根据权利要求1所述的载药杂化纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(4)中步骤(3)所得物与胱胺盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为10:1:5:3。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法制备得到的载药杂化纳米粒子。
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