JP5709219B2 - 金−銀コアシェルナノロッド粒子及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、金−銀コアシェルナノロッド粒子及びその製造方法に関する。

金ナノロッド粒子はロッド形状（棒状）の金ナノ粒子であり、可視光域（〜５２０ｎｍ）と近赤外域（〜９００ｎｍ）との２つの波長域に吸収をもつ。これらはそれぞれ短軸方向及び長軸方向の表面プラズモン共鳴に由来するもので、近赤外域の吸収は金ナノロッド粒子に特有のものである。また、吸収された光エネルギーは熱に変換され、これをフォトサーマル効果と呼ぶ。近赤外域は生体透過性が高いため、金ナノロッド粒子は、その強い近赤外吸収能を活かしたバイオイメージングや、発生する熱を利用したフォトサーマル治療への応用が期待されている（非特許文献１，２）。

近年になり、金ナノロッド粒子をコアとし、その表面を銀からなるシェル層で被覆した金−銀コアシェルナノロッド粒子も報告されている（非特許文献３）。銀で被覆することにより、粒子の吸収域はブルーシフトする。また、銀の固有プラズモン吸収は金よりも大きいため、銀で被覆することによりフォトサーマル効果を増強させることができる。

Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｓｙｓｔ．， Ｖｏｌ．２４， Ｎｏ．３， ｐ．２６０ Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｖｏｌ．１３０， Ｎｏ．３２， ｐ．１０６４３−１０６４７ Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， Ｖｏｌ．３８， Ｎｏ．１， ｐ．６０−６１

ところで、金ナノロッド粒子は通常、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）等のカチオン性界面活性剤のミセル中で作製されるため、表面がＣＴＡＢ等によって保護された状態で存在する。また、金−銀コアシェルナノロッド粒子も、ＣＴＡＢ等によって保護された金ナノロッド粒子の表面で銀を析出させることにより作製されるため、シェル層の表面がＣＴＡＢ等によって保護された状態で存在する。しかしながら、ＣＴＡＢ等のカチオン性界面活性剤は細胞毒性が非常に高いため、このままでは医学的応用に際して問題がある。

金ナノロッド粒子については、ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）の末端にチオール基が結合した化合物（ＳＨ−ＰＥＧ）によってＣＴＡＢ等のカチオン性界面活性剤を置き換えることで、医学的応用が可能であることが報告されている（非特許文献１，２）。しかしながら、金−銀コアシェルナノロッド粒子については、このようにＣＴＡＢ等のカチオン性界面活性剤を他の化合物で置き換えた報告はない。本発明者らの実験によれば、金ナノロッド粒子の表面のＣＴＡＢをＳＨ−ＰＥＧで置き換えると、銀からなるシェル層を形成することができなかった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、ＣＴＡＢ等のカチオン性界面活性剤が他の化合物で置き換えられた金−銀コアシェルナノロッド粒子及びその製造方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねたところ、ＣＴＡＢ等のカチオン性界面活性剤を、特定のブロック共重合体又はグラフト共重合体で置き換えることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、以下のようなものを提供する。

（１）金ナノロッド粒子をコアとし、上記金ナノロッド粒子の表面に、銀からなるシェル層が被覆され、上記シェル層の表面に、共重合体が吸着した金−銀コアシェルナノロッド粒子であり、上記共重合体は、一般式（Ｉ）で表される基を有する重合性モノマー（Ａ）を少なくとも重合させたブロック共重合体又はグラフト共重合体であることを特徴とする金−銀コアシェルナノロッド粒子。
（式中、Ｒ^ａは、炭素数２〜７のアルキレン基を表す。）

（２）上記共重合体は、上記重合性モノマー（Ａ）と、一般式（ＩＩ）で表される繰り返し構造を有する重合性モノマー（Ｂ）とのブロック共重合体又はグラフト共重合体である（１）に記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子。
（式中、Ｒ^ｂは、炭素数２〜５のアルキレン基を表し、ｎは、５〜２０００の任意の整数を表す。）

（３）上記重合性モノマー（Ａ）が、一般式（ＩＩＩ）で表される（１）又は（２）に記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子。
（式中、Ｒ^１ａは、炭素数２〜７のアルキレン基を表し、Ｒ^２ａは、水素原子又はメチル基を表す。）

（４）上記重合性モノマー（Ｂ）が、一般式（ＩＶ）で表される（２）に記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子。
（式中、Ｒ^１ｂは、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基を表し、Ｒ^２ｂは、炭素数２〜５のアルキレン基を表し、Ｒ^３ｂは、水素原子又はメチル基を表し、ｎは、５〜２０００の任意の整数を表す。）

（５）上記重合性モノマー（Ｂ）の質量平均分子量が、２００〜８００００である（２）又は（４）に記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子。

（６）上記重合性モノマー（Ａ）と上記重合性モノマー（Ｂ）とのモル比が、１：９９〜９９：１である（２）、（４）、又は（５）に記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子。

（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子を含有するフォトサーマル治療剤。

（８）金ナノロッド粒子をコアとし、上記金ナノロッド粒子の表面に、銀からなるシェル層が被覆され、上記シェル層の表面に、ブロック共重合体又はグラフト共重合体が吸着した金−銀コアシェルナノロッド粒子の製造方法であって、カチオン性界面活性剤を鋳型として、金ナノロッド粒子を形成する工程と、上記カチオン性界面活性剤を、ブロック共重合体又はグラフト共重合体に置き換えることにより、ブロック共重合体又はグラフト共重合体が吸着した金ナノロッド粒子を形成する工程と、上記ブロック共重合体又はグラフト共重合体が吸着した金ナノロッド粒子の表面で銀を析出させることにより、上記シェル層を形成する工程とを含み、上記ブロック共重合体又はグラフト共重合体が、一般式（Ｉ）で表される基を有する重合性モノマー（Ａ）を少なくとも重合させたブロック共重合体又はグラフト共重合体であることを特徴とする金−銀コアシェルナノロッド粒子の製造方法。
（式中、Ｒ^ａは、炭素数２〜７のアルキレン基を表す。）

本発明によれば、一般式（Ｉ）で表される基を有する重合性モノマー（Ａ）を少なくとも重合させたブロック共重合体又はグラフト共重合体によって、ＣＴＡＢ等のカチオン性界面活性剤が置き換えられた金−銀コアシェルナノロッド粒子を製造することができる。上記共重合体は、細胞に対して毒性を示さないので、金−銀コアシェルナノロッド粒子の有するフォトサーマル効果を利用した治療が期待できる。

Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液の吸収スペクトルを示す図である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の写真である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液の吸収スペクトルを示す図である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した図（１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液の添加量：（Ａ）６０μｌ，（Ｂ）１２０μｌ，（Ｃ）２４０μｌ，（Ｄ）３６０μｌ）である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の長軸と短軸とのアスペクト比を示す図である。 ＳＨ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子の表面でＡｇを析出させた試験液の吸収スペクトルを示す図である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の分散安定性（塩溶液中）を示す図（１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液の添加量：（Ａ）１２０μｌ，（Ｂ）２４０μｌ）である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の分散安定性（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中）を示す図である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子のフォトサーマル効果（レーザー強度依存性）の評価結果を示す図である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子のフォトサーマル効果（粒子濃度依存性）の評価結果を示す図である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子のフォトサーマル効果の評価結果（金ナノロッド粒子との比較（１））を示す図である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子のフォトサーマル効果の評価結果（金ナノロッド粒子との比較（２））を示す図である。 Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液の吸収スペクトルを示す図である。 Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した図（１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液の添加量：（Ａ）１２０μｌ，（Ｂ）２４０μｌ，（Ｃ）３６０μｌ，（Ｄ）４８０μｌ）である。 細胞毒性の評価結果を示す図（（Ａ）Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子，（Ｂ）ＣＴＡＢ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子）である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の細胞取り込みを位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察した図である。 Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の細胞に対するフォトサーマル効果を位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察した図である。

以下、本発明の具体的な実施形態について、詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。

［金−銀コアシェルナノロッド粒子］
本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子は、金ナノロッド粒子をコアとし、上記金ナノロッド粒子の表面に、銀からなるシェル層が被覆され、上記シェル層の表面に、共重合体が吸着したものである。ここで、上記共重合体は、一般式（Ｉ）で表される基を有する重合性モノマー（Ａ）を少なくとも重合させたブロック共重合体又はグラフト共重合体である。

本発明において、金ナノロッド粒子とは、短軸方向の長さに対する長軸方向の長さの比（アスペクト比）が１よりも大きい、ロッド（棒）の形状を有するナノスケールの金の粒子をいう。金ナノロッド粒子の粒径は、長軸の長さが１０〜５００ｎｍであることが好ましく、２０〜２００ｎｍであることがより好ましい。また、短軸の長さが１〜５００ｎｍであることが好ましく、１〜５０ｎｍであることがより好ましい。上記金ナノロッド粒子の粒径は、調製溶液中の金イオンの濃度等により制御することができる。長軸及び短軸の長さが上記範囲であれば、良好な分散安定性を示す。さらに、本発明において、金ナノロッド粒子は、アスペクト比が１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。アスペクト比が上記範囲であれば、良好な分散安定性を示す。なお、金ナノロッド粒子は、シード法等の従来公知の方法により合成してもよいし、市販品を用いてもよい。

本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子では、コアである上記金ナノロッド粒子の表面に、銀からなるシェル層が被覆されている。被覆されるシェル層の厚みは、上記金ナノロッド粒子の表面を均一に被覆していれば、特に限定されるものではないが、通常、長軸方向では１〜１００ｎｍであり、短軸方向では１〜１００ｎｍである。また、好ましくは、長軸方向では１〜５０ｎｍであり、短軸方向では１〜５０ｎｍである。シェル層の厚みは、金ナノロッド粒子の分散液における銀イオンの濃度や上記金ナノロッド粒子のアスペクト比等により制御することができる。上記範囲であれば、分散安定性に優れる。なお、本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子では、シェル層の厚みを変化させることにより、プラズモン吸収の波長や強度を制御することができ、また、シェル層を厚くすることにより、近赤外光を照射した場合に、吸収した光を熱エネルギーに変換するフォトサーマル効果を高めることができることから、分散安定性を考慮しつつ、用途に応じて、適宜調整すればよい。

本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子では、上記シェル層の表面に、一般式（Ｉ）で表される基を有する重合性モノマー（Ａ）を少なくとも重合させたブロック共重合体又はグラフト共重合体が吸着している。

［重合性モノマー（Ａ）］
重合性モノマー（Ａ）は、上記一般式（Ｉ）で表される基を有する重合可能なモノマーである。Ｒ^ａは、炭素数２〜７のアルキレン基であることを特徴とし、炭素数３〜５のアルキレン基であることが好ましい。本発明では、共重合体のアルキレン基の炭素数を変えることで、金−銀コアシェルナノロッド粒子間の疎水的凝集力を制御することができる。アルキレン基の炭素数を上記範囲とすることで、小さくて安定した粒径の金−銀コアシェルナノロッド粒子を得ることができる。

重合性モノマー（Ａ）は、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、後述の重合性モノマー（Ｂ）と重合することができる。

本発明では、共重合体は、重合性モノマー（Ａ）が一般式（ＩＩＩ）で表されることが好ましい。

ここで、Ｒ^１ａは、炭素数２〜７のアルキレン基であり、炭素数３〜５のアルキレン基であることが好ましい。また、Ｒ^２ａは、水素原子又はメチル基である。

［重合性モノマー（Ｂ）］
重合性モノマー（Ｂ）は、一般式（ＩＩ）で表される繰り返し構造を有する重合可能なモノマーである。Ｒ^ｂは、炭素数２〜５のアルキレン基であることを特徴とし、炭素数２〜３であることが好ましい。アルキレン基の炭素数を上記範囲とすることで、分子の親水性と柔軟性とが高まる。また、ｎは、５〜２０００の任意の整数であることを特徴とし、１０〜５００であることが好ましい。ｎを上記範囲とすることで、親水性と柔軟性とが高まる。一般式（ＩＩ）で表される繰り返し構造の単位としては、特に限定されないが、例えば、エチレンオキシド、プロピレンオキシド等が挙げられる。

重合性モノマー（Ｂ）は、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、官能基の種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、上述の重合性モノマー（Ａ）と重合することができる。

本発明では、共重合体は、重合性モノマー（Ｂ）が一般式（ＩＶ）で表されることが好ましい。

ここで、Ｒ^１ｂは、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基であり、炭素数２〜５のアルキル基であることが好ましい。Ｒ^２ｂは、炭素数２〜５のアルキレン基であり、Ｒ^３ｂは、水素原子又はメチル基である。また、ｎは、５〜２０００の任意の整数であることを特徴とし、１０〜５００であることが好ましい。

［重合性モノマー（Ｃ）］
重合性モノマー（Ｃ）は、リガンドを有する。

リガンドとしては、例えば、糖鎖、糖、糖タンパク質、糖脂質、タンパク質、抗原、抗体、ペプチド、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ等の核酸等の特定の対象物質に対して特異的相互作用を示す分子認識素子が挙げられる。これらのリガンドを結合させることにより、共重合体に種々の機能を付加することができる。

重合性モノマー（Ｃ）は、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、重合性モノマー（Ａ）と重合することができる。

本発明では、共重合体は、重合性モノマー（Ｃ）が下記一般式（Ｖ）で表されるものであることが好ましい。

ここで、Ｒ^１ｃは、水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２ｃは、−Ｏ−又は−ＮＨ−である。また、Ｘは、スペーサーであり、Ｚは、リガンドである。

重合性モノマー（Ｃ）では、スペーサーは、上述のリガンドを導入することができれば特に限定されないが、例えば、繰り返し単位数１〜２００のオリゴアルキレンオキシ基、アルキレン基等が挙げられ、好ましくは繰り返し単位数１〜５０のオリゴエチレンオキシ基又はアルキレン基である。アルキレン基は、直鎖状でも分枝状でもよい。アルキレン基の炭素数は特に限定されないが、好ましくはＣ１〜Ｃ８である。繰り返し単位数１〜５０のエチレンオキシ基やＣ１〜Ｃ８のアルキレン基であれば、共重合体の運動性が良好となるので好ましい。なお、共重合体は、このスペーサーを介して上述のリガンドが結合していてもよい。

［共重合体］
本発明における共重合体は、上記重合性モノマー（Ａ）を少なくとも重合させたブロック共重合体又はグラフト共重合体である。本発明における共重合体の重合方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができるが、付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）等のリビングラジカル重合法が好ましい。リビングラジカル重合法によれば、合成する共重合体の分子量や分子量分布を制御することができる。以下に、本発明における共重合体が、重合性モノマー（Ａ）と重合性モノマー（Ｂ）とを共重合させた共重合体である場合の合成方法を例示する。なお、重合方法はリビングラジカル重合法による。

まず、ＲＡＦＴによる場合について例示する。重合性モノマー（Ｂ）と、連鎖移動剤と、重合開始剤とを所定の溶媒に溶解し、溶存酸素を含む反応容器中の酸素を完全に除いた後、重合開始剤が開裂する温度以上であって、且つ、１００℃以下の温度で２４〜４８時間加熱することにより、重合性モノマー（Ｂ）が重合したポリマー（以下、Ｂブロックと称する）の末端に連鎖移動剤が導入されたマクロ連鎖移動剤を合成する。次に、このマクロ連鎖移動剤と、重合性モノマー（Ａ）とを所定の溶媒に溶解し、重合開始剤が開裂する温度以上であって、且つ、１００℃以下の温度で２４〜３００時間加熱することにより、Ｂブロックと、重合性モノマー（Ａ）が重合したポリマー（以下、Ａブロックと称する）とが直列に結合した、本発明における共重合体（ブロック共重合体）を合成することができる。

また、重合性モノマー（Ａ）と、重合性モノマー（Ｂ）と、連鎖移動剤と、重合開始剤とを所定の溶媒に溶解し、重合開始剤が開裂する温度以上であって、且つ、１００℃以下の温度で２４〜３００時間加熱することにより、Ｂブロックと、Ａブロックとが櫛型に結合した、本発明における共重合体（グラフト共重合体）を合成することができる。

重合開始剤は、特に限定されず、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）等のアゾ系重合開始剤、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム等の硫酸塩系重合開始剤、過酸化ベンゾイル、ラウロイルパーオキサイド等の有機過酸化物系重合開始剤等が挙げられる。

重合開始剤の好適な使用量は、重合性モノマー（Ａ）と重合性モノマー（Ｂ）との合計量に対して、０．１〜１０質量％である。また、グラフト共重合体の場合、分子量を調整するために、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、２−プロパンチオール、１−ブタンチオール等の連鎖移動剤を添加してもよい。

重合温度及び重合時間は、上記のように例示したが、温度や所望の最終生成物の性質に依存する。好ましくは３０〜９０℃、より好ましくは５０〜７０℃で、１〜９６時間である。

次に、ＡＴＲＰによる場合について説明する。まず、重合性モノマー（Ｂ）と、ハロゲン化アルキル剤と、触媒とを所定の溶媒に溶解し、反応させることにより、Ｂブロックの末端にハロゲン化アルキル剤が導入されたマクロハロゲン化アルキル剤を合成する。次に、このマクロハロゲン化アルキル開始剤と、重合性モノマー（Ａ）とを所定の溶媒に溶解し、さらに触媒を加え、室温以上であって、且つ、１００℃以下の温度で６〜５０時間加熱することにより、Ｂブロックと、Ａブロックとが直列に結合した、本発明における共重合体（ブロック共重合体）を合成することができる。

ＡＴＲＰに用いられるハロゲン化アルキル開始剤は、特に限定されず、例えば、２−ブロモイソブチリルブロミド、２−クロロイソブチリルクロリド、ブロモアセチルブロミド、ブロモアセチクロリド、ベンジルブロミド等が挙げられる。

触媒としては、例えば、１価の銅、２価のルテニウム等の遷移金属錯体を用いることができる。

なお、重合反応に用いる溶媒は、特に限定されず、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、ジメチルスルホキシド、これらの混合液等が挙げられる。

本発明では、共重合体の質量平均分子量（ポリスチレンを標準物質としたＧＰＣによる測定）が、１０００〜５０００００であることが好ましく、２０００〜１０００００であることがより好ましい。なお、上記範囲であれば、金−銀コアシェルナノロッド粒子に界面安定性を付与することができる。

本発明では、重合性モノマー（Ｂ）の質量平均分子量（ポリスチレンを標準物質としたＧＰＣによる測定）が、２００〜８００００であることが好ましく、５００〜２００００であることがより好ましい。重合性モノマー（Ｂ）の分子量を変化させることで、金−銀コアシェルナノロッド粒子の溶媒中での分散安定性を制御することができる。なお、上記範囲であれば、金−銀コアシェルナノロッド粒子を溶媒中で安定に分散させることができる。

本発明では、共重合体における重合性モノマー（Ａ）と重合性モノマー（Ｂ）とのモル比が、１：９９〜９９：１であることが好ましく、１０：９０〜９０：１０であることがより好ましい。重合性モノマー（Ａ）と重合性モノマー（Ｂ）とのモル比を変化させることで、親疎水バランスを制御することができる。なお、上記範囲とすることで、金−銀コアシェルナノロッド粒子の表面に対して安定に吸着させることができ、また、金−銀コアシェルナノロッド粒子を溶媒中で安定に分散させることができる。

本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子は、細胞毒性があるＣＴＡＢ等のカチオン性界面活性剤が、細胞毒性のない共重合体によって置き換えられているので、例えば、医療検査や治療といった医学的応用が可能である。また、本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子は、塩を含む溶液中や血清を含む溶液中において、優れた分散安定性を示す。したがって、金−銀コアシェルナノロッド粒子が有するフォトサーマル効果を利用した腫瘍組織の治療への応用が期待できる。

［フォトサーマル治療剤］
本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子は、フォトサーマル治療剤に用いることができる。本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子を含有するフォトサーマル治療剤の投与方法としては、例えば、治療すべき患部への皮下注射や静脈注射の他、外科的手段等が挙げられる。本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子をフォトサーマル治療剤に用いる場合、本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子を投与した後、患部に対して一定期間、光を照射する。光の波長域は、好ましくは５００〜１５００ｎｍ、より好ましくは７００〜９００ｎｍである。上記範囲の波長であれば、本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子は効果的に熱を発生する。光を照射する方法としては、例えば、レーザー、パルスレーザー等の光源が挙げられる。また、本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子をフォトサーマル治療剤に用いる場合、その治療対象となる疾患としては、例えば、ガン等が挙げられる。

［金−銀コアシェルナノロッド粒子の製造方法］
以下、本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子の製造方法について説明する。なお、上述した金−銀コアシェルナノロッド粒子と共通する部分についての説明は、省略する。
本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子の製造方法は、カチオン性界面活性剤を鋳型として、金ナノロッド粒子を形成する工程と、上記カチオン性界面活性剤を、ブロック共重合体又はグラフト共重合体に置き換えることにより、ブロック共重合体又はグラフト共重合体が吸着した金ナノロッド粒子を形成する工程と、上記ブロック共重合体又はグラフト共重合体が吸着した金ナノロッド粒子の表面で銀を析出させることにより、シェル層を形成する工程とを含み、上記ブロック共重合体又はグラフト共重合体が、一般式（Ｉ）で表される基を有する重合性モノマー（Ａ）を少なくとも重合させたブロック共重合体又はグラフト共重合体であることを特徴とする。

本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子は、具体的には、以下の方法により製造することができる。まず、シード法等の従来公知の方法により、金ナノロッド粒子を製造する。具体的には、カチオン性界面活性剤とハロゲン化金酸とを含む溶液に、還元剤を添加して撹拌し、金を析出させることにより、金ナノ粒子の分散液を得る。次に、カチオン性界面活性剤と無機銀塩とを含む溶液に、ハロゲン化金酸を添加して撹拌した後、還元剤をさらに添加して撹拌する。得られた溶液に、上記金ナノ粒子の分散液を添加して撹拌することにより、カチオン性界面活性剤によって保護された金ナノロッド粒子の分散液を得る。なお、金ナノロッド粒子は、市販品を用いてもよい。

ここで、カチオン性界面活性剤としては、例えば、第４級アンモニウム塩であるヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（ＣＴＡＣ）等を好適に用いることができる。ハロゲン化金酸としては、例えば、塩化金酸を好適に用いることができる。還元剤としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウムを好適に用いることができる。

次に、カチオン性界面活性剤によって保護された金ナノロッド粒子の分散液を遠心分離に供し、得られた沈殿物を、上記共重合体を含む溶液に分散して撹拌した後、透析膜を用いて透析する。透析後の分散液は、遠心分離に供した後、沈殿物を水に分散することにより、上記共重合体により保護された金ナノロッド粒子の分散液を得る。

ここで、遠心分離は、２００００〜１４００００ｒｐｍで行うことが好ましい。透析膜は、分画分子量２０００〜１００００の再生セルロース製膜を用いることが好ましい。上記遠心分離により、毒性の高いカチオン性界面活性剤を含む上澄みを取り除き、上記透析膜を用いて透析することにより、上記共重合体を金ナノロッド粒子の表面に吸着させる。

そして次に、上記共重合体により保護された金ナノロッド粒子の分散液に、無機銀塩を添加した後、還元剤、塩基を順次添加して撹拌した後、透析膜を用いて透析する。透析後の分散液は、遠心分離に供した後、沈殿物を水に分散することにより、上記共重合体により保護された金−銀コアシェルナノロッド粒子の分散液を得る。

ここで、無機銀塩としては、例えば、硝酸銀、酢酸銀等が挙げられ、硝酸銀が分散安定性、毒性等が優れる点において好ましい。無機銀塩の使用量は、通常、金ナノロッドに対して０．１〜５当量であり、好ましくは０．１〜１当量である。上記範囲であれば、分散安定性に優れる金−銀コアシェルナノロッド粒子を得ることができる。なお、上記無機銀塩の使用量を調整することにより、シェル層の厚みを制御することができる。

還元剤としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、アスコルビン酸、クエン酸が挙げられ、アスコルビン酸が還元反応の制御性が優れる点において好ましい。塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられ、水酸化ナトリウムが入手容易性、低価格の点において好ましい。

以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら制限を受けるものではない。

［グラフト共重合体の合成］
以下の反応スキームに示すように、重合性モノマー（Ａ）と重合性モノマー（Ｂ）とを共重合させて、グラフト共重合体（Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ）を合成した。

＜重合性モノマー（Ａ）の合成（ｍ＝３）＞
（合成例１）
４−ピリジンプロパノール６．８５ｇ（５０ｍｍｏｌ）と、メタクリル酸４．７３ｇ（５５ｍｍｏｌ）と、４−（１−ピロリジニル）ピリジン７４０ｍｇ（５ｍｍｏｌ）とを、無水ジクロロメタン１００ｍｌに溶解後、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１１．３ｇ（５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応させた。ろ過により、不溶性尿素を除去後、減圧下で溶媒を除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（カラム：シリカ、溶媒：ヘキサン／酢酸エチル）により、精製し、無色の油である重合性モノマー（Ａ）８．５１２４ｇ（４１．４ｍｍｏｌ）を得た（収率８２．８％）。

＜Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧの合成＞
（合成例２）
合成例１にて得られた本発明の重合性モノマー（Ａ）である４−ピリジンプロパノール−メタクリレート２０５ｍｇ（１０ｍｍｏｌ）と、本発明の重合性モノマー（Ｂ）であるα−メチル−ω−メタクリロイル−ポリエチレングリコール２０８ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）と、４−ピリジンプロパノール−メタクリレートに対して１質量％のＡＩＢＮとを、ＤＭＦ（４ｍｌ）に溶解後、凍結脱気を３回繰り返し、６０℃で２４時間反応させた。その反応液を、ＤＭＦに対して２０倍量の再沈殿溶媒（イソプロピルアルコール／ジエチルエーテル＝体積比１／２０）に滴下し、数分撹拌した。その後、遠心分離、凍結乾燥を経て、白色粉末であるＰｙ−ｇ−ＰＥＧ２０２ｍｇ（１．８μｍｏｌ）を得た（収率４９％）。得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧの数平均分子量（Ｍｎ）は１１３，１８０であり、分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．６３４であり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とピリジン（Ｐｙ）との共重合比率（ＰＥＧ／Ｐｙ）は１０．３％であった。なお、分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した。

［Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧで保護された金−銀コアシェルナノロッド粒子の調製］
＜ＣＴＡＢ保護金ナノロッド粒子の調製＞
臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）保護金ナノロッド粒子の調製は、Ｓｅｅｄ法に従った。０．１ＭのＣＴＡＢ溶液２．５ｍｌと、１ｍＭの塩化金酸（ＨＡｕＣｌ_４）溶液２．５ｍｌとを混合した溶液に、氷浴した１０ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）溶液０．３ｍｌ添加し、５分間撹拌して金シード分散液を得た。次に、０．１ＭのＣＴＡＢ溶液５０ｍｌと、１ｍＭの硝酸銀（ＡｇＮＯ_３）溶液４．５ｍｌとを混合した溶液に、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ_４溶液５０ｍｌを添加し、３０分間撹拌した後、さらに０．０１Ｍのアスコルビン酸水溶液２．５ｍｌを添加した。この溶液に、上記金シード分散液を２．５ｍｌ添加し、２５℃の恒温槽にて１日間撹拌し、ＣＴＡＢ保護金ナノロッド粒子分散液を得た。

＜Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子の調製＞
上記方法により得られたＣＴＡＢ保護金ナノロッド粒子分散液を、超遠心分離機（Ｏｐｔｉｍａ ＴＬＸ，ベックマンコールター）により、遠心分離（回転数：２１０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数１回）することにより、沈殿物を得た。次に、合成例２で得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧを２０ｍｌの水に溶解し、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ溶液を得た。そして、このＰｙ−ｇ−ＰＥＧ溶液を用いて、濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなるように、上記沈殿物を再分散（全量１０ｍｌ）し、２５℃の恒温槽にて２日間撹拌した後、透析膜（分画分子量：約１００００）に入れ、３０００ｍｌの水にて２日間透析した。透析後の分散液は、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：２１０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数：２回）した後、得られた沈殿物を、全量が１００ｍｌとなるように、滅菌水に再分散し、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液を得た。

＜Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子の表面でのＡｇの析出＞
上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液５ｍｌに、１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液を添加（６０μｌ，１２０μｌ，２４０μｌ，３６０μｌ）した。これらの溶液に、０．１Ｍのアスコルビン酸水溶液０．１ｍｌを添加し、次いで、０．１ＭのＮａＯＨ水溶液を０．２ｍｌ添加した。その後、２５℃の恒温槽にて１日間撹拌した後、透析膜（分画分子量：約１００００）に入れ、３０００ｍｌの水にて３日間透析した。透析後の溶液は、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：１８０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数：１回）した後、得られた沈殿物を、全量が１００ｍｌとなるように、滅菌水に再分散し、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液を得た。

［Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液のプラズモン吸収の測定］
一般に、数十ｎｍサイズ領域の金属ナノ粒子は、その金属の種類、形状に応じて、表面プラズモン励起に起因する特徴的な光学吸収を示す。例えば、球状の金ナノ粒子の分散液では、５２０ｎｍ付近に吸収を示し、ロッド形状の場合には、ロッドの短軸に起因する５２０ｎｍ付近の吸収のほかに、ロッドの長軸に起因する長波長側（９００ｎｍ付近）の吸収を示すことが知られている。上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液について、プラズモン吸収を分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３Ａ Ｄｉｏｄ Ａｒｒａｙ，Ａｇｉｌｅｎｔ社製）により測定したところ、５２０ｎｍ付近の吸収以外に、９００ｎｍ付近に大きな吸収が認められた（図１）。また、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液は、金ナノ粒子特有の赤色を呈していた。

［Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子の粒径の測定及び形状の確認］
上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子の粒径をダイナミック光散乱光度計（ＤＬＳ，ＤＬＳ−７０００，大塚電子社製）により測定した。また、粒子の粒径及び形状を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＨＩＴＡＣＨＩ Ｈ−９５００，日立ハイテクノロジーズ社製）により観察した。その結果、平均粒径が短軸９．５±２ｎｍ、長軸４０．９±４．５ｎｍのロッド形状であることが確認された（図２）。

［Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液のプラズモン吸収の測定］
上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液について、プラズモン吸収を分光光度計により測定したところ、銀の析出量が増加するにしたがって、銀固有のプラズモン吸収波長（４００ｎｍ付近）側へのシフト及び吸収の増大が認められた（図３）。銀固有のプラズモン吸収は、金よりも大きいため、銀の析出によるシェル層の形成により、プラズモン吸収が増大したものと考えられる。また、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液は、銀の析出量が増加するにしたがって、赤色から青色に変化した。

［Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の粒径の測定及び形状の確認］
上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の形状をＴＥＭにより観察したところ、金ナノロッドの周囲に銀のシェル層が形成されていることが確認された。また、粒子の粒径及び銀シェル層の厚みをＴＥＭにより測定し、長軸と短軸とのアスペクト比（長軸／短軸）を求めたところ、銀の析出量が増加するにしたがって、粒子の形状が球状に近づくことが確認された（図４，図５）。

［ＳＨ−ＰＥＧで保護された金−銀コアシェルナノロッド粒子の調製］
＜ＣＴＡＢ保護金ナノロッド粒子の調製＞
ＣＴＡＢ保護金ナノロッド粒子の調製についても、Ｓｅｅｄ法に従った。０．１ＭのＣＴＡＢ溶液２．５ｍｌと、１ｍＭのＨＡｕＣｌ_４溶液２．５ｍｌとを混合した溶液に、氷浴した１０ｍＭのＮａＢＨ_４溶液０．３ｍｌ添加し、５分間撹拌して金シード分散液を得た。次に、０．１ＭのＣＴＡＢ溶液５０ｍｌと、１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液４．５ｍｌとを混合した溶液に、０．５ｍＭのＨＡｕＣｌ_４溶液５０ｍｌを添加し、３０分間撹拌した後、さらに０．０１Ｍのアスコルビン酸水溶液２．５ｍｌを添加した。この溶液に、上記金シード分散液を２．５ｍｌ添加し、２５℃の恒温槽にて１日間撹拌し、ＣＴＡＢ保護金ナノロッド粒子分散液を得た。

＜ＳＨ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子の調製＞
上記方法により得られたＣＴＡＢ保護金ナノロッド粒子分散液を、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：２１０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数１回）することにより、沈殿物を得た。次に、ＳＨ−ＰＥＧ（末端がチオール化されたポリエチレングリコール，２Ｍ４Ｅ０Ｈ０１）を１００ｍｌの水に溶解し、ＳＨ−ＰＥＧ溶液を得た。そして、このＳＨ−ＰＥＧ溶液を用いて、濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなるように、上記沈殿物を再分散し、２５℃の恒温槽にて２日間撹拌した後、透析膜（分画分子量：約１００００）に入れ、３０００ｍｌの水にて２日間透析した。透析後の分散液は、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：２１０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数：２回）した後、得られた沈殿物を、全量が１００ｍｌとなるように、滅菌水に再分散し、ＳＨ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液を得た。

＜ＳＨ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子の表面での銀の析出＞
上記方法により得られたＳＨ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液５ｍｌに、１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液を１２０μｌ添加した。この分散液に、０．１Ｍのアスコルビン酸水溶液０．１ｍｌを添加し、次いで、０．１ＭのＮａＯＨ水溶液を０．２ｍｌ添加した。その後、２５℃の恒温槽にて１日間撹拌した後、透析膜（分画分子量：約１００００）に入れ、３０００ｍｌの水にて３日間透析した。透析後の分散液は、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：１８０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数：１回）した後、得られた沈殿物を、全量が１００ｍｌとなるように、滅菌水に再分散し、試験液を得た。

［プラズモン吸収の測定］
上記方法により得られた試験液について、プラズモン吸収を分光光度計により測定したところ、銀の析出量の増加に伴う、銀固有のプラズモン吸収波長（４００ｎｍ付近）側へのシフト及び吸収の増大は認められなかった（図６）。このことから、ＳＨ−ＰＥＧで保護された金ナノロッド粒子の表面で銀を析出させても、シェル層が形成されず、金−銀コアシェルナノロッド粒子が生成できないことが確認された。

［Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の分散安定性の評価］
＜塩における分散＞
上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液（１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液の添加量：１２０μｌ，２４０μｌ）を、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：１５０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数１回）することにより、沈殿物を得た。次いで、これらの沈殿物に、塩化ナトリウム水溶液を０．０５Ｍ又は０．１５Ｍの濃度となるように添加し、再分散した後、２５℃の恒温槽にて２日間撹拌した。そして、得られた分散液のプラズモン吸収を分光光度計により測定した。その結果、いずれの分散液においても、プラズモン吸収の強度及び位置に大きな変化が認められなかった（図７）。このことから、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子は、塩における分散性が高いことが確認された。

＜１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭにおける分散＞
上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液（１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液の添加量：１２０μｌ）を、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：１５０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数１回）することにより、沈殿物を得た。次いで、この沈殿物に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％含むＤＭＥＭを５０ｍｌ添加し、再分散した。そして、この分散液のプラズモン吸収を分光光度計により、経時的に測定した。その結果、凝集による吸光度の減少や最大吸収波長の変化が全く認められなかった（図８）。このことから、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子は、血清中において、極めて安定な分散性を示すことが確認された。

［Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子のフォトサーマル効果の評価］
＜レーザー強度依存性＞
上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液（１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液の添加量：４８０μｌ）を用いて、粒子濃度が９６μｇ／ｍｌの分散液を調製した。該調製した溶液を１ｃｍのプラスチックセルに入れ、ＯＰＯレーザー（ＳＬ４５４Ｇ ｐｕｌｓｅｄ Ｎｄ：ＹＡＧ ｌａｓｅｒ，Ｓｐｅｃｔｒｏｎ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ製）を用いて、８００ｎｍのレーザー光を照射（照射エネルギー：３０ｍＷ／ｃｍ^２，１５０ｍＷ／ｃｍ^２，３００ｍＷ／ｃｍ^２，４５０ｍＷ／ｃｍ^２，照射面積：１ｍｍ^２）した。レーザー照射実験の際は、カットフィルターを使用し、Ｓｉｇｎａｌ光又はＩｄｌｅｒ光をカットした。出てきたレーザー光は、レンズ（ＳＬＢ−３０−５０ＰＭ，球面平凸レンズ，シグマ光機株式会社製）を用いて集光させた。なお、レーザー光の照射直前まで、セルは２５℃の恒温槽に入れ、開始温度を一定にした。その結果、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子のフォトサーマル効果は、レーザー強度に依存することが確認された（図９）。

＜粒子濃度依存性＞
上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液（１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液の添加量：２４０μｌ）を用いて、粒子濃度が２４μｇ／ｍｌ、４８μｇ／ｍｌ、７２μｇ／ｍｌ、９６μｇ／ｍｌの分散液を調製した。該調製した溶液を１ｃｍのプラスチックセルに入れ、ＯＰＯレーザー（ＳＬ４５４Ｇ ｐｕｌｓｅｄ Ｎｄ：ＹＡＧ ｌａｓｅｒ，Ｓｐｅｃｔｒｏｎ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ製）を用いて、８００ｎｍのレーザー光を照射（照射エネルギー：４５０ｍＷ／ｃｍ^２，照射面積：１ｍｍ^２）した。レーザー照射実験の際は、カットフィルターを使用し、Ｓｉｇｎａｌ光又はＩｄｌｅｒ光をカットした。出てきたレーザー光は、レンズ（ＳＬＢ−３０−５０ＰＭ，球面平凸レンズ，シグマ光機株式会社製）を用いて集光させた。なお、レーザー光の照射直前まで、セルは２５℃の恒温槽に入れ、開始温度を一定にした。その結果、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子のフォトサーマル効果は、粒子濃度に依存することが確認された（図１０）。

＜金ナノロッド粒子との比較（１）＞
金ナノロッド粒子は、近赤外光を照射すると、吸収した光エネルギーを熱に変換するフォトサーマル効果を示すことが知られている。そこで、上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液（１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液の添加量：０μｌ）及び上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液（１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液の添加量：１２０μｌ，１８０μｌ，２４０μｌ）について、フォトサーマル効果の比較を行った。各分散液２ｍｌを、１ｃｍのプラスチックセルに入れ、ＯＰＯレーザー（ＳＬ４５４Ｇ ｐｕｌｓｅｄ Ｎｄ：ＹＡＧ ｌａｓｅｒ，Ｓｐｅｃｔｒｏｎ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ製）を用いて、励起光源である三倍波（３５５ｎｍ）を発振させる。レーザー光は、ｍｉｄｂａｎｄ ＯＰＯ ＶｉｓＩＲ２装置（ＧＷＵ ｌａｓｅｒｔｅｃｈｎｉｋ製）内のＢＢＯｔｙｐｅの非線形光学結晶（β−ＢａＢ_２Ｏ_４）の角度を変えることにより、波長可変なレーザー光となる。なお、繰り返し周波数は、１０Ｈｚであり、パルス幅は２−３ｎｓである。本装置では、４００〜２２００ｎｍと幅広い領域の波長を取り出すことが可能である。レーザー照射実験の際は、カットフィルターを使用し、Ｓｉｇｎａｌ光又はＩｄｌｅｒ光をカットした。出てきたレーザー光は、レンズ（ＳＬＢ−３０−５０ＰＭ，球面平凸レンズ，シグマ光機株式会社製）を用いて集光させた。８００ｎｍのレーザー光を照射（照射エネルギー：０．５ｍＷ／ｃｍ^２・ｐｕｌｓｅ，照射面積：１ｍｍ^２）した。なお、レーザー光の照射直前まで、セルは２０℃の恒温槽に入れ、開始温度を一定にした。その結果、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子では、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子に比して、フォトサーマル効果が高いことが確認された（図１１）。これは、銀の固有プラズモン吸収が金よりも大きいため、銀で被覆することによりフォトサーマル効果が増強されたことによるものと考えられる。

＜金ナノロッド粒子との比較（２）＞
次に、レーザー光の照射エネルギーと、セルの開始温度とを変えて、上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子と、金ナノロッド粒子とのフォトサーマル効果の比較を行った。測定試料には、上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液（１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液の添加量：０μｌ）及び上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液（１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液の添加量：８０μｌ，１８０μｌ）を用いた。そして、８００ｎｍのレーザー光の照射エネルギーを４５０ｍＷ／ｃｍ^２とし、セルを入れた恒温槽の温度を２５℃とした以外は、上記の金ナノロッド粒子との比較（１）と同様の方法にて行った。その結果、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子は、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子に比して、フォトサーマル効果が高いことが明確に示された（図１２）。

［ブロック共重合体の合成］
以下の反応スキームに示すように、重合性モノマー（Ａ）と重合性モノマー（Ｂ）とを共重合させて、ブロック共重合体（Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧ）を合成した。

＜ＲＡＦＴ剤の合成＞
（合成例３）
４−ブロモメチル安息香酸３ｇ（１３．９５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン２５ｍｌに溶解させ、４−ブロモメチル安息香酸のテトラヒドロフラン溶液を得た。次いで、アルゴン雰囲気下、１−ブタンチオール１．８０ｍｌ（１６．７４ｍｍｏｌ、４−ブロモメチル安息香酸に対して１．２当量）、ジアザビシクロウンデセン２．５ｍｌ（１６．７４ｍｍｏｌ、４−ブロモメチル安息香酸に対して１．２当量）、及び二硫化炭素１．０１ｍｌ（１６．７４ｍｍｏｌ、４−ブロモメチル安息香酸に対して１．２当量）を脱水テトラヒドロフラン７５ｍｌに加え、室温で３０分間撹拌した。撹拌後、上記４−ブロモメチル安息香酸のテトラヒドロフラン溶液を滴下し、さらに室温で６時間撹拌した。ＴＬＣにより反応の進行を確認し、セライト濾過及び濃縮後、ベンゼンに溶解させた。さらに、１Ｍ塩酸及びイオン交換水で洗浄し、次いで、無水硫酸マグネシウムを用いて脱水処理した後、濃縮し、フリーズドライすることにより、ＲＡＦＴ剤を得た（収量：３．７８ｇ、収率：９３．９％）。

＜モノマー（Ｂ）−マクロ−ＲＡＦＴ剤の合成＞
（合成例４）
アルゴン雰囲気下、合成例３にて得られたＲＡＦＴ剤７２０ｍｇ（２．４ｍｍｏｌ、後述するモノマー（Ｂ）に対して１０当量）を脱水ベンゼンに溶解させ、オキサリルクロライド２４２μｌ（２．８８ｍｍｏｌ、ＲＡＦＴ剤に対して１．２当量）、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ｃａｔ．）を少量加え、撹拌した後、ＴＬＣにより酸塩化物の生成を確認し、濃縮した。次いで、該酸塩化物を脱水ベンゼン７ｍｌに溶解し、さらに、脱水ベンゼンに溶解させたトリエチルアミン４００μｌ（２．８８ｍｍｏｌ、ＲＡＦＴ剤に対して１．２当量）、及び本発明のモノマー（Ｂ）であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（５Ｋ）１２００ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を加えた後、７０℃のオイルバス中で１晩撹拌した。その後、セライト濾過及び濃縮を行い、２０倍量のイソプロピルエーテルで再沈殿を行った。得られた沈殿物をクロロホルムに溶解させ、濃縮後、フリーズドライすることにより、モノマー（Ｂ）が重合したポリマーの末端にＲＡＦＴ剤が導入された、ＰＥＧ−マクロ−ＲＡＦＴ剤を得た（収量：１０６０ｍｇ、収率：８３．３％、末端修飾率：８５％）。

＜Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧの合成＞
（合成例５）
合成例４にて得られたＰＥＧ−マクロ−ＲＡＦＴ剤２００ｍｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）と、合成例１にて得られた本発明の重合性モノマー（Ａ）である４−ピリジンプロパノール−メタクリレート２５０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ、ＰＥＧ−マクロ−ＲＡＦＴ剤に対して２０当量）とを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３ｍｌに溶解し、重合管に入れ、さらにＡＩＢＮ３．０ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ、ＰＥＧ−マクロ−ＲＡＦＴ剤に対して０．３当量）を加えた。凍結脱気を３回行い、アルゴンガスに置換した後、７０℃のオイルバス中で３日間撹拌した。その後、セライト濾過及び濃縮を行い、２０倍量のイソプロピルエーテルで再沈殿を２回行った。得られた沈殿物をフリーズドライすることにより、Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧを得た（収量：３６９ｍｇ、収率：８２％）。得られたＰｙ−ｂ−ＰＥＧの理論数平均分子量（Ｍｗ（ｔｈ））は５５３０であり、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は０．２８７８であり、ＰＥＧ−マクロ−ＲＡＦＴ剤とＰｙとＡＩＢＮとの共重合比率（ＰＥＧ−マクロ−ＲＡＦＴ剤／Ｐｙ／ＡＩＢＮ）は１／２０／０．２であった。また、粒子径分布（ヒストグラム粒径）は２８．０±１８．０ｎｍであり、平均粒子径（キュムラント粒径）は１９．２ｎｍであった。なお、理論数平均分子量は、^１Ｈ−ＮＭＲによりＰＥＧのエチレンオキシド鎖を基準にＰｙ鎖の連鎖数から算出した。粒子径分布（ヒストグラム粒径）は、動的光散乱により、平均粒子径（キュムラント粒径）は、動的光散乱により、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は、動的光散乱により算出した。

＜Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子の調製＞
上記方法により得られたＣＴＡＢ保護金ナノロッド粒子分散液を、超遠心分離機（Ｏｐｔｉｍａ ＴＬＸ，ベックマンコールター）により、遠心分離（回転数：２１０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数：１回）することにより、沈殿物を得た。次に、合成例５で得られたＰｙ−ｂ−ＰＥＧを２０ｍｌの水に溶解し、Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧ溶液を得た。そして、このＰｙ−ｂ−ＰＥＧ溶液を用いて、濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなるように、上記沈殿物を再分散（全量１０ｍｌ）し、２５℃の恒温槽にて２日間撹拌した後、透析膜（分画分子量：約１００００）に入れ、３０００ｍｌの水にて２日間透析した。透析後の分散液は、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：２１０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数：２回）した後、得られた沈殿物を、全量が１００ｍｌとなるように、滅菌水に再分散し、Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液を得た。

＜Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子の表面でのＡｇの析出＞
上記方法により得られたＰｙ−ｂ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液５ｍｌに、１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液を添加（１２０μｌ，２４０μｌ，３６０μｌ，４８０μｌ）した。これらの溶液に、０．１Ｍのアスコルビン酸水溶液０．１ｍｌを添加し、次いで、０．１ＭのＮａＯＨ水溶液を０．２ｍｌ添加した。その後、２５℃の恒温槽にて１日間撹拌した後、透析膜（分画分子量：約１００００）に入れ、３０００ｍｌの水にて３日間透析した。透析後の溶液は、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：１８０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数：１回）した後、得られた沈殿物を、全量が１００ｍｌとなるように、滅菌水に再分散し、Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液を得た。

［Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液のプラズモン吸収の測定］
上記方法により得られたＰｙ−ｂ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液について、プラズモン吸収を分光光度計により測定したところ、銀の析出量が増加するにしたがって、銀固有のプラズモン吸収波長（４００ｎｍ付近）側へのシフト及び吸収の増大が認められた（図１３）。銀固有のプラズモン吸収は、金よりも大きいため、銀の析出によるシェル層の形成により、プラズモン吸収が増大したものと考えられる。また、Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液は、銀の析出量が増加するにしたがって、黄色から青色に変化した。

［Ｐｙ−ｂ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の形状の確認］
上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の形状を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＨＩＴＡＣＨＩ Ｈ−９５００，日立ハイテクノロジーズ社製）により観察したところ、金ナノロッドの周囲に銀のシェル層が形成されていることが確認された（図１４）。

［Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の細胞毒性の評価］
＜Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧで保護された金−銀コアシェルナノロッド粒子の調製＞
上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金ナノロッド粒子分散液５ｍｌに、１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液を添加（６０μｌ，１２０μｌ，１８０μｌ，２４０μｌ，３００μｌ，３６０μｌ）した。これらの分散液に、０．１Ｍのアスコルビン酸水溶液０．１ｍｌを添加し、次いで、０．１ＭのＮａＯＨ水溶液を０．２ｍｌ添加した。その後、２５℃の恒温槽にて１日間撹拌した後、透析膜（分画分子量：約１００００）に入れ、３０００ｍｌの水にて３日間透析した。透析後の分散液は、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：１８０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数：１回）した後、得られた沈殿物を、全量が５０ｍｌとなるように、滅菌水に再分散し、濃度８．５μｇ／ｍｌ、１１．３μｇ／ｍｌ、１７μｇ／ｍｌ、２２．６μｇ／ｍｌ、３４μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、及び６０μｇ／ｍｌのＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液を得た。

＜ＣＴＡＢで保護された金−銀コアシェルナノロッド粒子の調製＞
上記方法により得られたＣＴＡＢ保護金ナノロッド粒子分散液５ｍｌに、１ｍＭのＡｇＮＯ_３溶液を添加（６０μｌ，１２０μｌ，１８０μｌ，２４０μｌ，３００μｌ，３６０μｌ）した。これらの分散液に、０．１Ｍのアスコルビン酸水溶液０．１ｍｌを添加し、次いで、０．１ＭのＮａＯＨ水溶液を０．２ｍｌ添加した。その後、２５℃の恒温槽にて１日間撹拌した後、透析膜（分画分子量：約１００００）に入れ、３０００ｍｌの水にて３日間透析した。透析後の分散液は、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：１８０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数：１回）した後、得られた沈殿物を、全量が５０ｍｌとなるように、滅菌水に再分散し、濃度８．５μｇ／ｍｌ、１１．３μｇ／ｍｌ、１７μｇ／ｍｌ、２２．６μｇ／ｍｌ、及び３４μｇ／ｍｌのＣＴＡＢ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液を得た。

評価には、上記方法により得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液及び上記方法により得られたＣＴＡＢ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液を用いた。各分散液２０ｍｌを、超遠心分離機により、遠心分離（回転数：１８０００ｒｐｍ，時間：３０分，回数：１回）した後、得られた沈殿物を、全量が１００ｍｌとなるように、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％含むＤＭＥＭを添加し、再分散した。次いで、この再分散液をフィルター（マイレクス−ＧＶ フィルター，０．２２μｍ，ミリポア社製）により精製した。精製後の各再分散液０．５ｍｌに、ＨｅＬａ細胞（細胞数：５×１０^４）を添加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。そして、細胞増殖測定キット（ＭＴＴ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて、細胞毒性を評価した。その結果、ＣＴＡＢ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液は、細胞に対する毒性の高いことが確認された。これに対して、本発明のＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の分散液は、細胞に対して毒性を示さないことが確認された（図１５）。

［Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の細胞取り込み］
上記と同様の方法にて、粒子濃度が９６μｇ／ｍｌの金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液を得た。該分散液を、遠心分離（回転数：１８０００ｒｐｍ，時間：１５分，回数：１回）することにより、沈殿物を得た。該沈殿物を、上記合成例２で得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧを蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したＰｙ−ｇ−ＰＥＧ−ＦＩＴＣ溶液に再分散した（最終Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ−ＦＩＴＣ濃度：０．５ｍｇ／ｍｌ）。該再分散液を、冷暗所で３日間撹拌した後、遠心分離（回転数：１８０００ｒｐｍ，時間：１５分，回数：１回）することにより、沈殿物を得た。該沈殿物を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに再分散し、ＦＩＴＣ標識されたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の濃度が３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌの再分散液を得た。

該再分散液をフィルター（マイレクス−ＧＶ フィルター，０．２２μｍ，ミリポア社製）により精製した後、該精製後の再分散液１ｍｌに、ＨｅＬａ細胞（細胞数：２×１０^５）を添加し、３７℃で４時間インキュベーションした。そして、新たな１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに交換した後、細胞を位相差顕微鏡（Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｄ１，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）、及び蛍光顕微鏡（Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｄ１，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）により観察したところ、ＦＩＴＣ標識されたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子が、該粒子の濃度依存的に、細胞に取り込まれていることが確認された（図１６）。

［Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の細胞に対するフォトサーマル効果の評価］
上記と同様の方法にて、粒子濃度が９６μｇ／ｍｌの金−銀コアシェルナノロッド粒子分散液を得た。該分散液を、遠心分離（回転数：１８０００ｒｐｍ，時間：１５分，回数：１回）することにより、沈殿物を得た。該沈殿物を、上記合成例２で得られたＰｙ−ｇ−ＰＥＧ溶液に再分散した（最終Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ濃度：０．５ｍｇ／ｍｌ）。該再分散液を、冷暗所で３日間撹拌した後、遠心分離（回転数：１８０００ｒｐｍ，時間：１５分，回数：１回）することにより、沈殿物を得た。該沈殿物を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに再分散し、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の濃度が６０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの再分散液を得た。

スフェロイド作成用微細加工基板に、ＢＡＥＣ細胞（細胞数：３×１０^５）を播種し、１日間培養後、ＨｅｐＧ２細胞（細胞数：５×１０^５）を播種し、スフェロイドを形成させた。ここに、上記Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の再分散液（粒子濃度：６０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）１ｍｌを添加し、３７℃で４時間インキュベーションした後、新たな１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに交換した後、ＯＰＯレーザー（ＳＬ４５４Ｇ ｐｕｌｓｅｄ Ｎｄ：ＹＡＧ ｌａｓｅｒ，Ｓｐｅｃｔｒｏｎ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ製）を用いて、８００ｎｍのレーザー光を照射（照射エネルギー：１０００ｍＷ／ｃｍ^２，照射時間：１０分間，照射面積：１ｃｍ^２）した。次いで、再度、新たな１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに交換した後、カルセイン ＡＭにより染色した生存細胞と、エチジウムホモダイマーにより染色した死細胞とを、蛍光顕微鏡（Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｄ１，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）にて観察したところ、Ｐｙ−ｇ−ＰＥＧ保護金−銀コアシェルナノロッド粒子の発散する熱により、細胞が死滅されたことが確認された（図１７）。

以上より、本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子によれば、塩溶液中だけでなく、血清を含む溶液中であっても優れた分散安定性を示し、且つ細胞に対して毒性を示さず、安全性が高いことが明らかとなった。また、本発明の金−銀コアシェルナノロッド粒子は、細胞内に取り込まれ、光照射により効率的に熱を発生するので、該熱を利用したフォトサーマル治療等の医療デバイスとしての応用が期待できる。

Claims (8)

1. 金ナノロッド粒子をコアとし、前記金ナノロッド粒子の表面に、銀からなるシェル層が被覆され、前記シェル層の表面に、共重合体が吸着した金−銀コアシェルナノロッド粒子であり、前記共重合体は、一般式（Ｉ）で表される基を有する重合性モノマー（Ａ）を少なくとも重合させたブロック共重合体又はグラフト共重合体であることを特徴とする金−銀コアシェルナノロッド粒子。
   （式中、Ｒ^ａは、炭素数２〜７のアルキレン基を表す。）
2. 前記共重合体は、前記重合性モノマー（Ａ）と、一般式（ＩＩ）で表される繰り返し構造を有する重合性モノマー（Ｂ）とのブロック共重合体又はグラフト共重合体である請求項１に記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子。
   （式中、Ｒ^ｂは、炭素数２〜５のアルキレン基を表し、ｎは、５〜２０００の任意の整数を表す。）
3. 前記重合性モノマー（Ａ）が、一般式（ＩＩＩ）で表される請求項１又は２に記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子。
   （式中、Ｒ^１ａは、炭素数２〜７のアルキレン基を表し、Ｒ^２ａは、水素原子又はメチル基を表す。）
4. 前記重合性モノマー（Ｂ）が、一般式（ＩＶ）で表される請求項２に記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子。
   （式中、Ｒ^１ｂは、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基を表し、Ｒ^２ｂは、炭素数２〜５のアルキレン基を表し、Ｒ^３ｂは、水素原子又はメチル基を表し、ｎは、５〜２０００の任意の整数を表す。）
5. 前記重合性モノマー（Ｂ）の質量平均分子量が、２００〜８００００である請求項２又は４に記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子。
6. 前記重合性モノマー（Ａ）と前記重合性モノマー（Ｂ）とのモル比が、１：９９〜９９：１である請求項２、４、又は５に記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の金−銀コアシェルナノロッド粒子を含有するフォトサーマル治療剤。
8. 金ナノロッド粒子をコアとし、前記金ナノロッド粒子の表面に、銀からなるシェル層が被覆され、前記シェル層の表面に、ブロック共重合体又はグラフト共重合体が吸着した金−銀コアシェルナノロッド粒子の製造方法であって、カチオン性界面活性剤を鋳型として、金ナノロッド粒子を形成する工程と、前記カチオン性界面活性剤を、ブロック共重合体又はグラフト共重合体に置き換えることにより、ブロック共重合体又はグラフト共重合体が吸着した金ナノロッド粒子を形成する工程と、前記ブロック共重合体又はグラフト共重合体が吸着した金ナノロッド粒子の表面で銀を析出させることにより、前記シェル層を形成する工程とを含み、前記ブロック共重合体又はグラフト共重合体が、一般式（Ｉ）で表される基を有する重合性モノマー（Ａ）を少なくとも重合させたブロック共重合体又はグラフト共重合体であることを特徴とする金−銀コアシェルナノロッド粒子の製造方法。
   （式中、Ｒ^ａは、炭素数２〜７のアルキレン基を表す。）