CN111000822B - 阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物技术领域，涉及血小板与中性粒细胞融合膜包被的阿霉素‑吲哚菁绿仿生纳米颗粒及其在制备治疗肿瘤转移疾病药物中的用途。本发明所述的血小板与中性粒细胞杂化膜包被的仿生纳米颗粒包含阿霉素、吲哚菁绿、纳米载体材料、血小板膜及中性粒细胞杂化膜，各成分的重量百分组成是：阿霉素占8‑10％，吲哚菁绿占8‑10％，纳米载体材料占30‑40％，余量为血小板及中性粒细胞杂化膜。本发明的仿生纳米颗粒具有通过高亲和力膜粘附受体同时捕获和清除循环肿瘤细胞和肿瘤来源外泌体的能力，并有效地切断外泌体和免疫细胞之间的联系。不仅可以完全消融原发肿瘤，而且可以在异种移植和原位乳腺肿瘤模型中高效抑制乳腺癌转移。

Description

阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒及其用途

技术领域

本发明涉及药物技术领域，涉及一种共载阿霉素和吲哚菁绿的仿生纳米颗粒及其用途，具体地说，是涉及一种彻底消融原发肿瘤，靶向循环肿瘤细胞及外泌体从而抑制肿瘤转移的血小板与中性粒细胞融合膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒及其在制备治疗肿瘤转移疾病药物中的用途。

背景技术

转移性乳腺癌(IV期)是一种恶性肿瘤，其中疾病已扩散到远端。转移导致约90％的乳腺癌死亡，尽管癌症治疗有显着进展，但它们并没有有效地提高转移性乳腺癌的存活率。其主要原因是目前的治疗方法不能有效地消除血液中游离的循环肿瘤细胞(CTCs)和肿瘤来源的外泌体。

循环肿瘤细胞在从原发肿瘤中脱落后，在转移前微环境中繁殖。其可以锚定在“转移前生态位”的土壤中繁殖。转移研究的最新进展表明，中性粒细胞在转移生态位建立的早期阶段发挥着重要作用。理查德等人报道，中性粒细胞和血小板参与产生“转移前生态位”，并参与炎症过程，促进循环肿瘤细胞在转移前的转移。此外，中性粒细胞和血小板还通过形成中性粒细胞或血小板掩蔽的循环肿瘤细胞聚集体来保护血液循环中的循环肿瘤细胞免受宿主免疫攻击和物理应激。

当代证据表明，肿瘤衍生的外泌体影响侵袭-转移级联的所有阶段，参与构成转移前生态位，与免疫细胞相互作用并抑制其正常功能，从而形成免疫抑制微环境。同时，肿瘤细胞与其衍生的外泌体具有相似的表面受体。报导证明肿瘤细胞和肿瘤来源的外泌体膜包被纳米粒子之间有高度的同源靶向相互作用。

细胞膜包被技术是赋予纳米颗粒生物界面特征的很有前景的策略。本发明构建了血小板与中性粒细胞杂交膜(PNM)包被金纳米笼(AuNPs)，定义为PNMAuDIs。其可以通过血小板和中性粒细胞与循环肿瘤细胞和外泌体之间的特异性粘附连接来中和肿瘤来源的外泌体，从而抑制肿瘤转移。到目前为止暂无报道杀伤循环肿瘤细胞及外泌体的纳米颗粒，切断外泌体和免疫细胞之间的联系，并改善免疫抑制肿瘤微环境的相关报道。

发明内容

本发明所解决的技术问题是为了克服现有技术的缺陷，同时考虑血小板及中性粒细胞对循环肿瘤细胞及其衍生外泌体的天然靶向性，靶向递送阿霉素-吲哚菁绿触发化疗及光热治疗的双重作用，提供了血小板-中性粒细胞杂化膜包被的共载阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒(PNMAuDIs)，采用金纳米粒共载阿霉素和吲哚菁绿，在载体表面包被血小板与中性粒细胞杂化膜，通过静脉注射，可通过增强的通透性和滞留作用(EPR)在原发肿瘤中积聚，并通过化疗光热消融原发肿瘤。通过粘附性受体之间作用有效地切断外泌体和免疫细胞之间的联系。其在体外显示更多的细胞摄取，更深的肿瘤穿透和对肿瘤细胞的更高的细胞毒性。在体内，其不仅可以完全消融原发肿瘤，而且可以在异种移植和原位乳腺肿瘤模型中高效抑制乳腺癌转移。

具体地，

本发明的第一个目的是，克服免疫清除和无法清除循环肿瘤细胞及外泌体，提供阿霉素-吲哚菁绿的一种新剂型，即一种可靶向循环肿瘤细胞及衍生外泌体的抑制肿瘤转移的血小板与中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒(PNMAuDIs)。

本发明的第二个目的是，提供所述血小板与中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒的制备方法。

本发明的第三个目的是，提供所述血小板与中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：提供血小板与中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒，所述的仿生纳米颗粒为表面包被血小板与中性粒细胞杂化膜、内部包载阿霉素与吲哚菁绿的纳米载体。

具体地，所述的血小板与中性粒细胞杂化膜包被的仿生纳米颗粒包含阿霉素、吲哚菁绿、纳米载体材料、血小板膜及中性粒细胞杂化膜，其中，各成分的重量百分组成是：阿霉素占8-10％，吲哚菁绿占8-10％，纳米载体材料占30-40％，余量为血小板及中性粒细胞杂化膜。

血小板及中性粒细胞杂化膜中，血小板与中性粒细胞的质量比为1：1。

本发明中所述的阿霉素和吲哚菁绿还可以为阿霉素或吲哚菁绿的衍生物。

所述的阿霉素与吲哚菁绿的重量比为：0.5-2.0：1。

所述的纳米载体材料可以是任何能够包载阿霉素-吲哚菁绿或其衍生物的载体，包括介孔硅、量子点、金纳米笼中的一种或几种；优选的，所述的纳米载体材料为金纳米笼。

阿霉素、吲哚菁绿、纳米载体材料之间的重量比为：(1-2)：(1-2)：(3-5)，优选为：1：1：4。

所述的纳米粒的粒径为69-75nm。

所述的血小板及中性粒细胞杂化膜为鼠源性，由鼠血小板及中性粒细胞提取而来。

所述的血小板-中性粒细胞杂化膜1mg包被1mg的阿霉素-吲哚菁绿纳米粒核心。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：在包载阿霉素与吲哚菁绿的纳米载体外面包被血小板-中性粒细胞杂化膜。所述的制备方法包括以下步骤：

(1)制备阿霉素-吲哚菁绿金纳米笼核心；

(2)制备血小板-中性粒细胞杂化膜；

(3)将血小板-中性粒细胞杂化膜包被于阿霉素-吲哚菁绿金纳米笼核心表面。

其中，

步骤(1)所述的金纳米笼在南京先丰纳米购买。

其中，阿霉素、吲哚菁绿、纳米载体材料之间的重量比为：(1-2)：(1-2)：(3-5)，优选为：1：1：4。

步骤(2)中，分别提取血小板膜和中性粒细胞膜，将两者混合超声得到血小板-中性粒细胞膜，血小板与中性粒细胞的质量比为：1：1。

血小板膜的制备：富血小板血浆采用EDTA抗凝后，离心除去红细胞，取上清加入前列环素抑制血小板激活，离心，再用含蛋白酶抑制剂的PBS重悬。血小板采用重复冻融法制备血小板膜。液氮速冻血小板后室温溶解，反复此操作，离心，然后用含蛋白酶抑制剂的PBS反复洗涤重悬。

中性粒细胞膜的制备：通过差速离心法提取中性粒细胞膜，中性粒细胞沉淀用三蒸水重悬。溶液-80℃冷冻后，真空冻干得到中性粒细胞膜，-20℃保存。

步骤(3)中，将步骤(1)的阿霉素-吲哚菁绿纳米粒加入到步骤(2)制备的血小板-中性粒细胞杂化膜中，超声处理制备血小板-中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿纳米载体。

阿霉素-吲哚菁绿纳米粒冻干之后，1mg与1mg血小板-中性粒细胞杂化膜进行混合包被。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种靶向循环肿瘤细胞及外泌体抑制肿瘤转移的血小板-中性粒细胞杂化膜包被的共载阿霉素和吲哚菁绿的仿生纳米颗粒在制备治疗肿瘤转移的药物中的应用。

所述的肿瘤转移尤其指乳腺癌的肺或肝转移。

本发明制备了阿霉素-吲哚菁绿纳米载体，并对其性质进行了考察，同时制备了血小板膜PM、中性粒细胞膜NM、血小板-中性粒细胞杂化膜PNM、未包被的单载阿霉素纳米粒AuDs、未包被的单载吲哚菁绿纳米粒AuIs、未包被的共载阿霉素吲哚菁绿纳米粒AuDIs、包被血小板膜以及共载阿霉素吲哚菁绿纳米粒PMAuDIs、包被中性粒细胞膜以及共载阿霉素吲哚菁绿纳米粒NMAuDIs、包被血小板-中粒粒细胞杂化膜以及共载阿霉素吲哚菁绿纳米粒PNMAuDIs、包被血小板-中性粒细胞杂化膜以及单载阿霉素纳米粒PNMAuDs、包被血小板-中性粒细胞杂化膜以及单载吲哚菁绿纳米粒PNMAuIs，详细考察内容如下：

1)合成阿霉素-吲哚菁绿纳米载体，制备血小板-中性粒细胞杂化膜，通过超声和挤出将血小板-中性粒细胞杂化膜包被于阿霉素-吲哚菁绿纳米载体表面，对其理化性质进行表征，如粒径、电位、形态、SDS-PAGE及western-blot表征蛋白情况、包封率、药物释放曲线、体外光热效果等。

2)考察血小板-中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒(PNMAuDIs)对4T1细胞的粘附性及肿瘤球渗透。

3)考察血小板-中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒(PNMAuDIs)的细胞毒性及细胞摄取。

4)考察血小板-中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒(PNMAuDIs)体外结合外泌体的能力及给药前后体内免疫细胞数量的变化。

5)考察血小板-中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒(PNMAuDIs)在后背部接瘤的Balb/c小鼠体内的行为及抗转移治疗效果。

6)考察血小板-中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒(PNMAuDIs)在右侧第四对乳腺脂肪垫上接瘤的Balb/c小鼠体内的行为及抗转移治疗效果。

本发明采取了血小板与中性粒细胞3：1；2：1；1：1；1：2；1：3制备了血小板与中性粒细胞融合膜包被的PNMAuDIs，并进行了原位接瘤药效验证。两者在不同的比例条件下给药后的肿瘤体积不同，当血小板与中性粒细胞的比例高于或低于1：1时，其肿瘤体积均有所增加，由此确定血小板与中性粒细胞比例为1：1，其结果如图10所示。

结果表明，本发明制备的血小板-中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒在治疗肿瘤转移尤其指乳腺癌的肺或肝转移具有明显的效果，可以用于制备抗肿瘤药物，尤其是抗肿瘤转移药物。

附图说明

图1：PNMAuDIs的制备示意图；

其中阿霉素和吲哚菁绿被包载于金纳米笼中，血小板-中性粒细胞杂化膜通过静电作用包被于纳米载体的表面。

图2：PNMAuDIs的表征；

A为纳米粒的粒径；

B为纳米粒的外观图片。

C为纳米粒Zeta电位；

D为纳米粒电镜表征。比例尺：60纳米；

E为纳米粒的SDS-PAGE蛋白电泳分析；

F为血小板与中性粒细胞融合的FRET表征；

G为血小板与中性粒细胞及纳米粒的关键蛋白的western-blot分析；

H为血小板/中性粒细胞包被纳米粒及杂化膜包被纳米粒的共聚焦显微镜分析。红色：中性粒细胞膜；绿色：血小板膜；

图3：PNMAuDIs的体外细胞作用；

A为共聚焦分析给予激光前后纳米粒在4T1细胞中的摄取。比例尺：15μm；

B为流式细胞术量化给予激光前后纳米粒在4T1细胞中的摄取；

C为不同浓度的ICG和DOX对4T1细胞进行各种处理后24h的体外细胞毒性；

D为在有和没有激光的情况下从PNMAuDIs体外释放阿霉素的表征；

E为4T1 3D肿瘤球中纳米粒的渗透表征；

F为纳米粒体外光热效率；

G为纳米粒在体外4度对4T1细胞的粘附。比例尺：5μm；

图4：PNMAuDIs中和外泌体的表征；

A为用DiD标记的PNMAuDI孵育的DiO染色的外泌体的共聚焦图像，比例尺：1μm；

B为4T1衍生的外泌体的TEM图像(上)和外泌体与PNMAuDIs之间的相互作用(下)。比例尺:500nm；

C为流式细胞术图像分析纳米粒对CD4⁺Foxp3⁺T细胞数量的变化；

D为Foxp3⁺T细胞的定量；

E为流式细胞术图像分析纳米粒对CD8⁺和CD4⁺T细胞数量的变化；

F为CD8⁺T细胞的定量

G为外泌体在体外与PNMAuDIs孵育2小时后的粒径大小；

H为外泌体在体外与PNMAuDIs孵育2小时后的Zeta电位大小

I为流式细胞术图像分析纳米粒对M2样巨噬细胞(CD206^hi)和M1样巨噬细胞(CD80^hi)数量的变化；

J为CD4⁺T细胞的定量

K为M2样巨噬细胞(CD206^hi)的定量

L为M1样巨噬细胞(CD80^hi)的定量

图5：PNMAuDIs在后背部接瘤的Balb/c小鼠体内的行为；

A为注射AuDIs和PNMAuDIs后2,6,12和24小时的4T1背部肿瘤模型的体内荧光成像；

B为主要器官荧光成像；

C为为主要器官ROI分析；

D为20天时的肿瘤生长曲线和肿瘤图像。与**p<0.01，***p<0.001

图6：PNMAuDIs在后背部接瘤的Balb/c小鼠抗转移治疗效果；

A为给药后12小时PNMAuDIs的体内光热成像；

B为各种处理后的小鼠存活期；

C为各种处理后小鼠体重的变化；

D为肺的75％饱和苦味酸染色和主要器官切片的H&E染色的照片：

白色圆圈表明可见的转移部位；黄色和红色箭头分别显示肺和肝转移；

比例尺：1mm；

图7：PNMAuDIs在原位接瘤的Balb/c小鼠体内的行为；

A为注射AuDIs和PNMAuDIs后2,6,12和24小时的4T1原位模型的体内荧光成像情况；

B为离题器官荧光成像；

C为给药后12小时主要器官荧光定量；

D为PNMAuDIs体内光热效力，***p<0.001；

图8：PNMAuDIs在原位接瘤的Balb/c小鼠抗转移治疗效果；

A为生物发光图像；

B为每组每只鼠肿瘤生长曲线；

C为每组代表性肿瘤图；

D为肺的75％饱和苦味酸染色和主要器官切片的H&E染色的照片。白色圆圈表明可见的转移部位。黄色和红色箭头分别显示肺和肝转移。比例尺：1mm；

E为每组鼠肿瘤生长曲线；

F为各组给药后小鼠生存期；

G为各组给药后小鼠体重变化，**p<0.01，***p<0.001

图9：纳米粒的粒径，分散系数，包封率以及Zeta电位；

图10：血小板与中性粒细胞的不同质量比对给药后肿瘤体积的影响。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。

其中，阿霉素、吲哚菁绿、纳米载体材料金纳米笼之间的重量比为：(1-2)：(1-2)：(3-5)，优选粒径小分散程度好的：1：1：4。

实施例1：合成血小板膜包被的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒及表征

作为内核的AuDIs通过使用金纳米笼(0.1mg mL^-1)与DOX(0.05mg mL^-1)和ICG(0.05mg mL^-1)在室温下搅拌36小时进行孵育来进行制备。将最终混合物16000g离心力离心25min离心并用PBS洗涤以除去DOX和ICG的残留物。类似的处理用于制备具有/不具有DOX或ICG的AuDs或AuIs。

富血小板血浆采用EDTA抗凝后，100g离心20min除去红细胞，取上清加入前列环素抑制血小板激活，800g离心20分钟，再用含蛋白酶抑制剂的PBS重悬。血小板采用重复冻融法制备血小板膜。液氮速冻血小板后室温溶解，反复此操作5次，4000g离心，然后用含蛋白酶抑制剂的PBS反复洗涤重悬待用。

取50mL离心管，小心加入15mL小鼠外周血中性粒细胞分离液。用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，500g离心25min。离心后，离心管中将出现两层环状乳白色细胞层。用吸管小心吸取分离液中的下层，加入3倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解10min，300g离心10min，弃红色上清。重复裂解步骤，得中性粒细胞。采用差速离心法加入提取中性粒细胞膜，加入15ml缓冲液重悬，转移至Dounce玻璃匀浆器中，冰上匀浆100次。将所得溶液加入50mL离心管中，1000g离心5min。吸取上清，10000g离心20min。吸取上清，加入6.5mL离心管，100000g离心1小时。弃上清，PBS重悬待用。

通过血小板膜重量：中性粒细胞＝1：1，在37℃超声处理12分钟完成膜融合过程。后加入膜重量相等的内核颗粒100W 10min超声处理进行包被。之后此混合物用200nm聚碳酸酯膜挤出器挤出，反复10次以后，转子搅拌过夜即得。其余纳米粒制备方法同上。

金纳米笼合成过程如图1所示。用DOX和ICG孵育AuNPs制备AuDIs，其中D表示DOX，I表示ICG。并且应用相同的处理来制备具有DOX或ICG的AuDs或AuIs。然后将AuDIs与杂化膜一起孵育以获得PNMAuDIs，并且平行处理用于制备具有血小板膜(PM)或中性粒细胞膜(NM)的PMAuDIs或NMAuDIs。PNMAuDIs的平均粒径为73.4nm，高于核心AuDIs的粒径(图2a)。PNMAuDIs的平均zeta电位为-20.0mV，低于AuDIs的电位(图2c)。颗粒尺寸的增加和zeta电位的降低共同表明AuDIs被杂化膜成功涂覆。如图2b所示，它们载不同的药显示不同的颜色。为了证实NM和PM的膜融合，NM用

共振能量转移(FRET)对染料，DiD和DiI染色。将PM加入到两种染料掺杂的NM中用于膜融合。如图2f所示，随着PM与NM的重量比增加，在565nm处有荧光反射并且荧光在670nm处减少。结果表明，两种膜的完全融合削弱了原始NM中FRET对染料之间的相互作用。类似地，对膜蛋白标记物序列的SDS-PAGE蛋白质检测显示在杂化膜蛋白质谱中从PM和NM遗传的独特蛋白质的良好保存(图2e)。进行蛋白质印迹检查以分析PNMAuDIs的特定蛋白质标志物。作为细胞粘附分子的P-选择蛋白与CD41和CD61组合，共同产生用于血小板的关键粘附分子的整联蛋白αIIbβ3。他们在PMAuDIs和PNMAuDIs上共存。L-选择素，一种细胞粘附分子，以及在细胞迁移中起关键作用的LFA-1，共存于NMAuDIs和PNMAuDIs。参与细胞粘附和识别的β1整合素和抑制巨噬细胞摄取的CD47均由血小板和中性粒细胞表达，类似于PMAuDIs，NMAuDIs和PNMAuDIs(图2g)。此外，用免疫金和透射电子显微镜(TEM)成像检查显示杂化膜和PNMAuDI同时呈现PM和NM生物标记物(图2d)，证实了均质杂交生物膜的形成。将用DiI标记的PM的蛋白质重量比1：1标记为用DiI标记的NM，制备杂化膜，然后将混合的杂化膜包被内核。对于PNMAuNPs，注意到来自DiO和DiI的共定位的黄色荧光信号。由特定的单染料标记的膜制成的PMAuNPs和NMAuNP呈现离散的绿色和红色光斑(图2h)。这些结果证明了天然细胞膜与AuNP上杂化膜的完整性的完全融合。

实施例2：PNMAuDIs对4T1细胞的作用情况

共聚焦显微镜用于检查PNMAuDIs的细胞内化。将4T1细胞与PNMAuDIs，NMAuDIs，PMAuDIs，ICG和DOX分别在有/无激光照射下孵育6小时。如图3a所示，在细胞质中发现绿色ICG荧光，而在细胞核内发现红色DOX荧光。在4T1细胞中，PNMAuDIs加上激光辐射显示出ICG和DOX的最强的细胞内荧光，表明相互作用受体的更高亲和力改善了PNMAuDIs的细胞摄取(图3b)。为了检验PNMAuDIs的光热效率，记录了温度变化。通过热成像相机进行激光照射。当在1W·cm^-2下暴露于激光5分钟时，生理盐水，ICG，AuDIs和PNMAuDIs的温度分别升高至30.2,50.3,57.3和58.1℃。在ICG溶液中，由于ICG和AuDIs的AuNP的协同光热效率，与AuDIs相比存在较低的温度。此外，PNMAuDIs显示出比AuDIs更高的温度(图3f)，这是由于低热耗散和有效升高的能量，导致不可逆的肿瘤细胞破坏。如图3d所示，12小时后仅有约40％的来自PNMAuDIs的阿霉素在没有激光照射的情况下释放，但在激光照射下约70％的阿霉素释放，表明激光照射介导的温度升高促成阿霉素快速释放。与荧光标记的纳米颗粒在4℃温育1小时后，PNMAuDIs在4T1细胞中具有最高的荧光信号，表明杂化膜包被增强了对肿瘤细胞的靶向亲和力(图3g)。

使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定检查PNMAuDIs对4T1细胞的体外细胞毒性。在所有研究浓度下，与DOX相比，PNMAuDIs在暴露于激光照射后显示出显着改善的细胞毒性(图3c)，IC50值低至231.8ng·mL^-1，低于243.0ng·mL^-1的PMAuDIs和285.1ng·mL^-1的NMAuDIs。由于增强的细胞摄取和光热效应，PNMAuDIs对CD44，ICAM-1和VCAM-1受体共同过表达的4T1细胞具有高度细胞毒性。因此，我们推测ICG，DOX，激光照射和PNM涂层的结合具有很高的抗癌功效。培养3D细胞球体以检查PNMAuDI的体外渗透性。从球状体的z-堆叠图像观察到，DOX和AuDIs的内化不充分。PNMAuDIs加上激光辐射和强大的穿透能力导致PNMAuDIs在肿瘤核心中的深入分布(图3e)。

实施例3：PNMAuDIs体外结合外泌体的能力

最新的报道表明，肿瘤来源的外泌体对侵袭-转移级联反应至关重要。其中，外泌体能够实现不受控制的疾病进展，促进癌症生长的生态位并抑制免疫细胞的功能。为了探索外泌体与PNMAuDIs的结合能力，用DiO染色外泌体，用DiD预标记血小板和中性粒细胞膜。共聚焦用于探索PNMAuDIs和外泌体之间的相互作用。如图4a所示，NMAuDIs，PMAuDIs，PNMAuDIs与外泌体一起孵育，其中所有PNMAuDIs是共定位最多的。此外，还通过电镜观察并证明了共定位(图4b)。粒径的增加和zeta电位的降低也证实了PNMAuDIs和外泌体的共定位，可能是因为肿瘤细胞和肿瘤分泌的外泌体之间膜蛋白的相似性(图4g，h)。此外，为了探索PNMAuDIs和外泌体的相互作用能力以及对免疫抑制微环境的影响，将4T1细胞注射到小鼠第四脂肪垫的右侧。之后，我们在第10天检查了肿瘤的免疫状况。如图4i所示，用PNMAuDIs治疗后，M2样TAMs(CD206^hiCD11b⁺F4/80⁺)下降，M1样TAMs(CD80^hiCD11b⁺F4/80⁺)增加(图4l)。此外，还观察到肿瘤微环境中调节性T细胞(Treg)的减少(图4c，d)。值得注意的是，PNMAuDIs增加肿瘤浸润淋巴细胞(TILs，CD3⁺)，尤其是肿瘤中的细胞毒性T淋巴细胞(CTL，CD3⁺CD8⁺)(图4e，f)。因此，我们的结果显示PNMAuDIs在肿瘤微环境中中和肿瘤衍生的外泌体的优越能力，激活了先天免疫系统。

实施例4：考察PNMAuDIs在背部接瘤的Balb/c小鼠体内的行为及抗转移治疗效果。

为了比较AuDIs和PNMAuDIs的抗转移和靶向性能，使用4T1背部肿瘤携带的balb/c小鼠。如图5a-c所示，PNMAuDIs显示肿瘤分布比AuDIs增加3.9倍，表明优异的肿瘤靶向能力。肿瘤中PNMAuDIs分布的升高是由PNMAuDIs对粘附受体过度表达的4T1细胞的主动靶向作用引起的。我们研究了PNMAuDIs的光热潜力。通过红外热像仪观察温度变化，在注射后12小时进行激光照射(图6a，支持信息)。我们注意到AuDIs治疗组的肿瘤温度仅略有变化，因为靶向能力差。最后阶段的温度低于40℃，这不能破坏肿瘤。相比之下，PNMAuDIs在肿瘤部位的位置将温度升高到接近56℃，这足以预防肿瘤转移。我们检查了PNMAuDIs的体内治疗潜力。将携带4T1背部肿瘤的BALB/c小鼠用于体内化学光热处理。在20天内，对于NMAuDIs，PMAuDIs，PNMAuDIs加激光照射，三组都发挥了良好的抗肿瘤作用。为了研究PNMAuDIs在体内抑制乳腺癌转移的可能性，H&E的染色结果显示，用NIR激光照射的PNMAuDIs处理的小鼠中没有明显的肿瘤转移，与肝癌和肺癌转移明显的其他小鼠组相比(图6d)。此外，如图6b所示，PNMAuDIs治疗的小鼠具有75天的延长的存活期。因此，PNMAuDIs显示出用于乳腺癌抗转移的化学/光热疗法的杰出纳米平台。

实施例5：考察PNMAuDIs在右侧第四对乳腺脂肪垫上接瘤的Balb/c小鼠体内的行为及抗转移治疗效果。

使用原位4T1-luc荷瘤小鼠的尾静脉给PNMAuDIs和AuDIs，以比较PNMAuDIs和AuDIs在血液和淋巴循环系统中的功效和肿瘤靶向能力。注射后6小时，PNMAuDIs在肿瘤位置具有更高的荧光强度(图7a)，并且高水平维持超过6小时。这些结果说明了PNMAuDIs的巨大肿瘤靶向能力，因为它们精确地结合在4T1细胞生物膜上过表达的粘附受体。此外，给PNMAuDIs的肿瘤的荧光强度比给AuDIs的肿瘤的荧光强度高6.1倍(图7b，c)，证明了PNMAuDIs的强靶向能力。与AuDIs相比，注射后12小时PNMAuDIs的光热容量升高(图7d)。

然后我们检查了PNMAuDIs在原位模型中的治疗潜力和抗转移作用。在各种处理后，在携带4T1-luc肿瘤的BALB/c小鼠中进行体内化疗光热疗法(图8a)。在20天内，PNMAuDIs加激光照射完全破坏了肿瘤，治疗后20天肿瘤几乎消失(图8e)。检查体内生物发光成像以监测4T1-luc癌症生长并在不同治疗组中扩散。在用4T1-luc细胞原位注射后39天的体内生物发光成像的基础上，基于PNMAuDIs的光热化学疗法完全破坏了肿瘤，并且在第20天治疗后未观察到明显的转移，这与肿瘤的成像结果一致(图8a)。此外，PNMAuDIs组的体重没有明显改变(图8g)。参照H&E染色部分，用PNMAuDI处理的小鼠的重要器官中没有肿瘤转移(图8d)。此外，用PNMAuDI治疗的小鼠具有51天的延长的存活期(图8f)。因此，PNMAuDIs代表了一种非常有效的化学/光热纳米医学，用于治疗原位癌转移。

Claims (9)

1.阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒，其特征在于，包含阿霉素、吲哚菁绿、纳米载体材料、血小板及中性粒细胞杂化膜，其中，各成分的重量百分组成是：阿霉素占8-10%，吲哚菁绿占8-10%，纳米载体材料占30-40%，余量为血小板及中性粒细胞杂化膜，所述的纳米载体材料为金纳米笼。

2.如权利要求1所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，阿霉素、吲哚菁绿、纳米载体材料之间的重量比为：1-2：1-2：3-5。

3.如权利要求1所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，阿霉素、吲哚菁绿、纳米载体材料之间的重量比为：1：1：4。

4.如权利要求1-3任何一项所述的仿生纳米颗粒，其特征在于，所述的血小板及中性粒细胞杂化膜为鼠源性，由鼠血小板及中性粒细胞提取而来，血小板与中性粒细胞的质量比为1：1；血小板及中性粒细胞提取的血小板及中性粒细胞杂化膜1mg包被1mg的阿霉素-吲哚菁绿纳米粒核心。

5.如权利要求1所述的阿霉素-吲哚菁绿仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备阿霉素-吲哚菁绿金纳米笼核心；

（2）制备血小板-中性粒细胞杂化膜；

（3）将血小板-中性粒细胞杂化膜包被于阿霉素-吲哚菁绿金纳米笼核心表面。

6.如权利要求5所述的制备方法，步骤（2）中富血小板血浆采用EDTA抗凝后，离心除去红细胞，取上清加入前列环素抑制血小板激活，离心，再用含蛋白酶抑制剂的PBS重悬；血小板采用重复冻融法制备血小板膜，液氮速冻血小板后室温溶解，反复此操作，离心，然后用含蛋白酶抑制剂的PBS反复洗涤重悬；

通过差速离心法提取中性粒细胞膜，中性粒细胞沉淀用三蒸水重悬；溶液-80℃冷冻后，真空冻干得到中性粒细胞膜，-20℃保存；通过超声得到血小板-中性粒细胞1：1杂化膜。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将步骤（1）的阿霉素-吲哚菁绿纳米笼核心加入到步骤（2）制备的血小板-中性粒细胞杂化膜中，超声处理制备血小板-中性粒细胞杂化膜包被的阿霉素-吲哚菁绿纳米载体；

阿霉素-吲哚菁绿纳米粒冻干之后，1mg与1mg血小板-中性粒细胞杂化膜进行混合包被。

8.权利要求1-4任何一项所述的仿生纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.权利要求1-4任何一项所述的仿生纳米颗粒在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

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