CN115160514B - 一种光动力-小分子靶向-基因治疗联合用药系统及其制备方法 - Google Patents

一种光动力-小分子靶向-基因治疗联合用药系统及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种药物载体，它是具有式I所示结构的嵌段共聚物；本发明药物载体能够有效包载小分子靶向治疗药物吉非替尼和YAP抑制剂YAP‑siRNA，同时兼具光敏性，形成了一种联合多种治疗方式的联合用药系统成功将小分子靶向治疗、基因治疗和光动力治疗三种方式整合为一体，抗癌作用优异，尤其是对耐药肺癌治疗效果优异，具有很好的临床应用前景。

Description

一种光动力-小分子靶向-基因治疗联合用药系统及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种光动力-小分子靶向-基因治疗联合用药系统及其制备方法。
背景技术
肺癌是目前全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤。根据病理分型，肺癌分为两大类：小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(Non-small cell lungcancer,NSCLC)，其中超过80％的肺癌为NSCLC。虽然分子靶向药物显著提高了NSCLC治疗前景，但其获得性耐药的出现已成为改善癌症患者预后的重大难题。吉非替尼是全球第一个上市的表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKI)，被批准用于NSCLC EGFR突变的一线治疗。吉非替尼组的无进展生存期(Progression free survival,PFS)明显高于常规化疗组(9.5个月vs 6.3个月)，突破了NSCLC临床治疗瓶颈。然而其临床应用一年左右时间产生耐药导致了疾病进展，治疗失败。因此，逆转EGFR耐药是临床非小细胞肺腺癌治疗亟需解决的重要课题。
研究发现，抑制Yes相关蛋白(Yes associated protein,YAP)的表达能够提高肺癌细胞对EGFR-TKI的敏感性，因此，靶向YAP介导的EGFR旁通路抑制剂是改善吉非替尼等表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的有效手段。
然而，能够有效抑制YAP的小干扰RNA(siRNA)在体内应用极不稳定，且难以到达肿瘤部位，因此，在递送方面存在很大的挑战。
此外，光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)是继手术治疗、化疗、放疗和生物疗法之后的第五种癌症治疗手段，是第一个被FDA批准的药物和设备结合的治疗方式，也是传统治疗的理想补充方案。PDT通过用特定波长照射激活光敏剂，产生活性氧(Reactiveoxygen species,ROS)破坏细胞和肿瘤血管来实现其抗肿瘤作用，因此，在传统化疗的基础上结合光动力治疗也是目前癌症治疗的重要方向。
综上所述，由于耐药癌症生物学的复杂性和异质性，联合使用多种治疗药物或多种治疗手段已成为治疗耐药癌症的主要策略。通过适当的药物或治疗方式组合，可以促进治疗协同作用，提高靶向选择性，抑制肿瘤耐药的发展，但无论是对小分子靶向药物、基因治疗的siRNA还是具有光治疗活性的光敏剂类物质而言，其有效的递送始终面临难题。因此，提供一种能够结合光动力、化疗和基因治疗等多种治疗方式的联合用药系统，将在肿瘤治疗领域起到非常重要的作用。
发明内容
本发明提供了一种药物载体，它是具有式I所示结构的嵌段共聚物：
其中，R0为R1、R2、R3分别独立选自乙酰氨基、马来酰亚胺-焦脱镁叶绿酸A基团或肽类树状分子基团；
所述马来酰亚胺-焦脱镁叶绿酸A基团的结构为：
所述肽类树状分子基团的结构为：
q为5～15的整数。
进一步地，上述药物载体分子量为29.44kDa，分子量分布为1.13；
其中，R0为R1为乙酰氨基，R2为马来酰亚胺-焦脱镁叶绿酸A基团，质量分数为3-8％、R3为肽类树状分子基团，摩尔分数为20-40％；m大于4，优选为大于7；p为6-12。
进一步地，上述药物由寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯聚合得到聚合物polyOEGMA后，与TPEP聚合并还原得到侧链带巯基的嵌段共聚物，再与马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A、肽类树状分子发生点击反应制备而成；
所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯结构为：其中q为5～10的整数，优选为9；
所述TPEP结构为：
所述马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A结构为：
所述肽类树状分子的结构为
进一步地，上述聚合物polyOEGMA、TPEP的摩尔比(15～20):500，优选为17:500；
所述侧链带巯基的嵌段共聚物、马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A、肽类树状分子的质量比为(100-200):(10-20):(300-500)，优选为150:12:400。
本发明还提供了上述药物载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯在引发剂和链转移剂的作用下聚合得到聚合物polyOEGMA；
(2)聚合物polyOEGMA与TPEP在引发剂和链转移剂作用下聚合得到嵌段聚合物polyOEGMA-block-polyTPEP；
(3)嵌段聚合物在还原剂作用下反应得到侧链带巯基的嵌段聚合物polyOEGMA-block-polySH；
(4)侧链带巯基的嵌段聚合物polyOEGMA-block-polySH在催化剂作用下与马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A反应，再与肽类树状分子反应，即得。
进一步地，步骤(1)所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、引发剂、链转移剂的摩尔比为(750～850):(1～5):(5～15)，优选为800:3:10；
步骤(2)所述聚合物polyOEGMA、TPEP、引发剂的摩尔比为(15～20):(150～550):(2～7)，优选为17:500:5；
步骤(3)所述嵌段聚合物和还原剂的质量为1:(1～1.2)，优选为1:1；
步骤(4)所述侧链带巯基的嵌段聚合物polyOEGMA-block-polySH、马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A和肽类树状分子的质量比为(100-200):(10-20):(300-500)，优选为150:12:400；
优选地，步骤(1)和/或步骤(2)所述引发剂为ACVA；所述链转移剂为4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸；步骤(3)所述还原剂为二硫苏糖醇；步骤(4)所述的催化剂为三乙胺。
更进一步地，步骤(1)所述聚合的条件为70～80℃反应20～30h；
步骤(2)所述聚合的条件为70～80℃反应20～30h；
步骤(3)所述反应的条件为：20～30℃反应25～50h；
步骤(4)所述与马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A反应的条件为：20～30℃避光反应5～10h；与肽类树状分子反应的条件为20～30℃避光反应25～50h。
本发明还提供了一种光动力-小分子靶向-基因治疗联合用药系统，它由上述药物载体包载表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂和/或Yes相关蛋白小干扰RNA形成；
优选地，所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼，所述Yes相关蛋白小干扰RNA为序列如SEQ ID NO:1所示的YAP-siRNA。
本发明还提供了上述联合用药系统的制备方法，包括如下步骤：
1)将药物载体和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂分别溶于有机溶剂形成溶液，向药物载体溶液中滴加表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂溶液，搅拌混匀，除有机溶剂，加水分散过滤，滤液干燥得到包载吉非替尼的载药粒子；
和/或，2)向溶有Yes相关蛋白小干扰RNA的水溶液中加入步骤1)得到的载药粒子，混匀，即得；
优选地，步骤(1)所述药物载体和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的质量比为(30～50):1；步骤(2)所述载药粒子和Yes相关蛋白小干扰RNA的质量比为(200～1000):1，优选为800:1。
本发明还提供了上述的药物载体或联合用药系统在抗癌药物中的用途，优选地，所述抗癌药物为防治乳腺癌、膀胱癌、肺癌、食管癌、头颈部癌或皮肤癌的药物。
本发明通过提供一种新型药物载体，能够有效包载小分子靶向治疗药物吉非替尼和YAP抑制剂YAP-siRNA，同时兼具光敏性，成功将小分子靶向治疗、基因治疗和光动力治疗三种方式整合为一体，提供了一种联合多种治疗方式的联合用药系统，具有优异的抗癌作用，尤其是对耐药肺癌的治疗效果优异，具有很好的临床应用前景。
本发明所述“马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A”简写为Maleimide-Ppa，所述“肽类树状分子”简写为Py-SS-Dendron。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明中药物载体(Polymer)的合成过程示意图。
图2为本发明中Dendron(G3-Arg)的1H NMR表征。
图3为本发明中Dendron(G3-Arg)-OH的1H NMR表征。
图4为本发明中Py-SS-Dendron(G3-Arg)的1H NMR表征。
图5为本发明中Py-SS-Dendron的HRMS表征。
图6为本发明中polyOEGMA的1H NMR表征。
图7为本发明中polyOEGMA-block-polyTPEP的1H NMR表征。
图8为本发明中polyOEGMA-block-polySH的1H NMR表征。
图9为本发明中药物载体(Polymer)的1H NMR表征。
图10为本发明中药物载体(Polymer)的粒径分布(A)和形貌结构(B)。
图11为本发明中药物载体(Polymer)的紫外吸收光谱图(A)、荧光发射光谱图(B)和产生单线态氧能力表征(C)。
图12为本发明中载药纳米粒(Polymer@Gef)的粒径分布(A)和形貌结构(B)。
图13为本发明中载药纳米粒(Polymer@Gef)与siRNA静电相互作用的琼脂糖电泳图。
图14为本发明中多功能纳米递送系统(Polymer@Gef-YAP-siRNA)的粒径分布(A)和形貌结构(B)。
图15为本发明中多功能纳米递送系统(Polymer@Gef-YAP-siRNA)的血清稳定性。
图16为本发明中多功能纳米递送系统(Polymer@Gef-YAP-siRNA)的激光照射稳定性。
图17为本发明中药物载体的体外光动力治疗毒性。
图18为本发明中多功能纳米递送系统(Polymer@Gef-YAP-siRNA)的体外细胞摄取和亚细胞器共定位。
图19为本发明中多功能纳米递送系统(Polymer@Gef-YAP-siRNA)生成ROS能力评估。
图20为本发明中多功能纳米递送系统(Polymer@Gef-YAP-siRNA)的体外细胞毒性评价。
图21为本发明中多功能纳米递送系统(Polymer@Gef-YAP-siRNA)的体内荧光成像(A)和离体荧光成像(B,C)结果。
图22为本发明中多功能纳米递送系统(Polymer@Gef-YAP-siRNA)的体内药效评价结果。A:肿瘤体积；B:小鼠体重；C:肿瘤重量；D:肿瘤抑制率
图23为本发明中经不同药物组合处理后的肿瘤H&E染色图片。
图24为本发明中经不同药物组合处理后的肿瘤TUNEL染色图片。
图25为本发明中经不同药物组合处理后的小鼠脏器H&E染色图片。(G1)Saline,(G2)Polymer,(G3)Free Gef,(G4)Polymer@YAP-siRNA,(G5)Polymer@Gef,(G6)Polymer@Gef-YAP-siRNA,(G7)Polymer+L,(G8)Polymer@Gef+L,(G9)Polymer@YAP-siRNA+L and(G10)Polymer@Gef-YAP-siRNA+L.
具体实施方式
本发明所用OEGMA购自Sigma-Aldrich(USA)，TPEP、马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A按照“Adv.Mater.2020,32,19074902.ACS Appl.Mater.Interfaces 2018,10,42,35770–35783”公开的方法制备，Py-SS-Dendron由发明人按如下方法自行合成：
(1)Dendron(G2-Lys)-Boc合成步骤：Boc保护的赖氨酸Boc-Lys(Boc)-OH(CAS：2483-46-7)(4.95g,12.68mmol),HBTU(CAS：94790-37-1)(7.64g,20.17mmol)和HOBt(CAS：2592-95-2)(2.69g,20.05mmol)溶解在无水二氯甲烷(150mL)中,抽真空置换氮气,冰浴条件下搅拌20分钟。然后,加入DIPEA(CAS：7087-68-5)(8.40mL,50.68mmol)和L-赖氨酸甲酯盐酸盐H-Lys-OMe·2HCl(CAS:26348-70-9)(1.17g,5.02mmol)，在冰浴中搅拌0.5小时，在室温下再搅拌24小时。随后加入150mL二氯甲烷，再用水、饱和碳酸氢钠溶液、1M稀盐酸溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两次有机溶剂。溶液用无水硫酸钠干燥，在减压条件下蒸发旋干。经硅胶柱层析纯化得到Dendron(G2-Lys)-Boc油状液体，产率为95.12％(3.90g)。
(2)Dendron(G2-Lys)-NH2·4TFA合成步骤：将Dendron(G2-Lys)-Boc(4.10g,5.02mmol)溶解在二氯甲烷/三氟乙酸(1:1,32mL)中。混合物在冰浴中搅拌0.5h，随后在室温下搅拌24h。减压旋蒸多余的溶剂，然后用无水二氯甲烷处理三次。干燥1h后得到Dendron(G2-Lys)-NH2·4TFA油状液体，产率为98.86％(4.33g)。
(3)Dendron(G3-Arg)合成步骤:N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸Boc-Arg(Pbf)-OH(CAS：200124-22-7)(15.88g,30.15mmol)，EDCI(CAS：7084-11-9)(11.56g,60.30mmol),HOBt(CAS：2592-95-2)(8.15g,60.31mmol)和DMAP(CAS：1122-58-3)(3.70g,30.29mmol)溶解在无水二氯甲烷(300mL)中,抽真空置换氮气,冰浴混合搅拌20分钟。然后,加入DIPEA(CAS：7087-68-5)(27.00mL,152.50mmol)和Dendron(G2-Lys)-NH2·4TFA(4.33g,4.96mmol)，在冰浴中搅拌0.5h，在室温下再搅拌24小时。随后加入150mL二氯甲烷，再用水、饱和碳酸氢钠溶液、1M稀盐酸溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两次有机溶剂。溶液用无水硫酸钠干燥，减压旋蒸。经硅胶柱层析纯化得到白色固体Dendron(G3-Arg)，得率为67.55％(8.20g)。通过1H NMR确认了其结构(图2)。
(4)Dendron(G3-Arg)-OH合成步骤:将中间产物Dendron(G3-Arg)(8.20g,3.35mmol)溶于100mL甲醇中，随后加入一水氢氧化锂(2.05g,48.86mmol)。将该溶液在冰浴中搅拌0.5h，并在室温下过夜。溶剂用旋转蒸发法旋干。将二氯甲烷/水(3:1,400mL)加入混合物中，用1M稀盐酸溶液酸化至pH＝1～2，用1M稀盐酸溶液和饱和氯化钠溶液洗涤2次。溶液用无水硫酸钠干燥，在减压条件下蒸发。所得产物为白色固体，得率为99.88％(8.14g)，直接用于下一步。通过1H NMR确认了其结构(图3)。
(5)Py-SS-Dendron(G3-Arg)合成步骤:Dendron(G3-Arg)-OH(8.14g,3.34mmol),EDCI(CAS：7084-11-9)(1.32g,6.89mmol),HOBt(CAS：2592-95-2)(0.94g,6.96mmol)和DMAP(CAS：1122-58-3)(0.45g,3.68mmol)溶解在无水二氯甲烷(300ml)抽真空置换氮气,冰浴条件下混合搅拌20分钟。然后,加入DIPEA(CAS：7087-68-5)(3.00mL,16.94mmol)和Py-SS-NH2·HCl(2.43g,10.91mmol)，在冰浴中搅拌0.5h，在室温下再搅拌24小时。随后加入150mL二氯甲烷，，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤有机溶剂两次。溶液再用无水硫酸钠干燥，在减压条件下旋转蒸发。经硅胶柱层析纯化得到白色固体Py-SS-Dendron(G3-Arg)，产率为69.04％(6.00g)。通过1H NMR确认了其结构(图4)。
(6)Py-SS-Dendron(G3)合成步骤:将Py-SS-Dendron(G3-Arg)(1.80g,0.69mmol)溶解在三氟乙酸(14.25mL)中，抽真空置换氮气,然后加入三异丙基硅烷(375μL)和水(375μL)。然后，混合物在冰浴中搅拌0.5h，在室温下搅拌36h。减压旋蒸。将粗产物缓慢滴入冰乙醚中，搅拌1h，溶剂用无水乙醚过滤洗涤2次，干燥4h后得到白色固体Py-SS-Dendron，得率为96.55％(1.40g)。通过HRMS确认了其结构(图5)。
或者Py-SS-Dendron由本领域技术人员通过本领域常规技术手段合成。
除另有说明外，本发明所用其余原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明药物载体Polymer聚合物的合成
合成路径如图1所示，OEGMA(10.00g，20mmol)，CTA(4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸)(74.35mg，0.25mmol)，ACVA(VA-044)(21.02mg，0.075mmol)，溶解在2,2,2-trifluoroethanol(16mL)中，随后，该溶液在冰浴中充入氩气30分钟。73摄氏度搅拌24h。反应完后直接加液氮淬灭，恢复室温后再用3.5KD截留量透析袋透析36h，冻干得到红色油状液体9.5g polyOEGMA，收率达到94.10％。通过1HNMR确认了其结构(图6)。
polyOEGMA(5.00g,0.17mmol),TPEP(1.27g,5mmol)，ACVA(12.51mg,0.05mmol)溶解在2,2,2-trifluoroethanol(12mL)中，聚合方法同上。反应完后直接加液氮淬灭。无水乙醚纯化得到产物。将该共聚物溶于乙醇(10mL)中，滴入水(30mL)中，透析48h，冻干得到5.91g粉色油状物polyOEGMA-block-polyTPEP，收率94.26％。通过1HNMR确认了其结构(图7)。
2.5g polyOEGMA-block-polyTPEP溶于DMF(20mL)，并添加2.5g DTT。室温搅拌过夜，透析48h，冻干得到polyOEGMA-block-polySH(5.40g)，收率为97.83％。通过1HNMR确认了其结构(图8)。
氩气条件下，150mg巯基功能化的polyOEGMA-block-polySH聚合物溶于3mL DMSO，12mg马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A(Maleimide-Ppa)溶于2mL DMSO，两者混合搅拌8小时。随后加入含400mg Py-SS-Dendron的DMSO溶液(8mL)中，室温搅拌48小时。该反应液避光透析48小时后冻干得黑绿色粘稠物polyOEGMA-block-poly(Dendron(G3)-Ppa),最后用碘乙酰氨基跟巯基反应封端，命名为Polymer，165mg。通过GPC测得其分子量29.44kDa(PDI＝1.13)。通过1HNMR确认了其结构(图9)。
马来酰亚胺-焦脱镁叶绿酸A基团的含量测定：
(1)焦脱镁叶绿酸A标准曲线的测定：配制浓度为100μg/mL的焦脱镁叶绿酸A二甲亚砜溶液，分别稀释至40,20,10,5,2.5,1.25μg/mL。取2mL 40μg/mL的焦脱镁叶绿酸A二甲亚砜溶液，做300-700nm的波长扫描。选取最大吸收波长进行含量测定。然后在选取最大吸收波长下依次测定各稀释溶液的紫外吸收，并制定标准曲线。
(2)药物载体中焦脱镁叶绿酸A含量的测定：首先配制材料浓度为400μg/mL的二甲亚砜溶液，然后在(1)中选取的焦脱镁叶绿酸A最大吸收波长下测定配制材料溶液的紫外吸收，接着利用所得吸光度计算出药物载体中焦脱镁叶绿酸A的浓度，最后利用所得药物载体中焦脱镁叶绿酸A浓度除以配制材料浓度，即为药物载体中焦脱镁叶绿酸A含量。
药物载体中肽类分子基团的含量测定：
利用polyOEGMA-block-poly(Dendron(G3)-Ppa)的GPC分子量减去载体中焦脱镁叶绿酸A的分子量，再减去polyOEGMA-block-polySH的分子量，所得数据除以肽类分子基团的分子量，即为p值。
根据上述方法测定按照本实施例方法制备得到的多个药物载体中肽类树状分子基团含量(摩尔分数)均在20-40％范围内，计算得到p值为6～12，马来酰亚胺-焦脱镁叶绿酸A基团含量(质量分数)均在3-8％范围内。
实施例2、本发明药物载体联合用药系统的制备
1、Polymer@Gef胶束的制备
制备载吉非替尼Polymer胶束(Polymer@Gef)，其中Polymer：吉非替尼质量比＝40：1。首先称取一定量的吉非替尼，用氯仿配成浓度为1mg/mL的母液；称取40mg Polymer，加入5mL氯仿溶解；在Polymer溶液中缓慢滴加1mL吉非替尼溶液，搅拌混匀2小时；然后在30℃水浴条件下旋转蒸发去除有机溶剂，待药物与材料在容量瓶底形成一层均匀的薄膜；最后加5mL去离子水，超声20分钟后磁力搅拌20分钟；0.22μm滤头滤去除未包入胶束的游离药物，冻干后4℃备用。
2、Polymer@Gef-siRNA胶束的制备
制备共载吉非替尼-siRNA Polymer胶束(Polymer@Gef-siRNA)。首先将10ODsiRNA冻干粉用125μL DEPC水溶解成20μM母液。然后称取一定量的Polymer@Gef冻干粉，以Polymer@Gef：siRNA质量比为400，600，800结合siRNA，在室温下摇床1小时，制备完成。siRNA为序列如SEQ ID NO:1～2所示的YAP-siRNA，因此本实施例胶束又称“Polymer@Gef-YAPsiRNA”。
YAP-siRNA序列(5‘-3’)：
正义链(SEQ ID NO.1)：CUGCCACCAAGCUAGAUAATT
反义链(SEQ ID NO.2)：UUAUCUAGCUUGGUGGCAGTT
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、本发明药物载体与给药系统的表征
1、Polymer聚合物药物载体(实施例1)的理化性质表征
1.1、实验方法
(1)外貌形态：制备空白胶束溶液(Polymer终浓度为0.3mg/mL)，取一滴干燥处理，通过透射电镜(TEM)观察Polymer的形态。
(2)粒径、zeta电位：制备载药胶束溶液(Polymer终浓度为1mg/mL)，使用布鲁克海文粒径仪表征样品粒径和zeta电位，每个样品测量三次。
(3)紫外吸收光谱：称取一定量的Polymer溶于去离子水中，用紫外分光光度计对其进行光谱扫描，扫描波长范围为300-800nm。
(4)荧光发射光谱：称取一定量的Ppa和Polymer溶于DMSO溶液中，以405nm激发，扫描600-800nm处发射波长。
(5)Polymer光动力性能评价(SOSG测定)：首先将100uL Polymer(浓度0.5mg/mL)加入2uL SOSG甲醇溶液(浓度0.5mM)，给予660nm激光照射，激光剂量为0.3J/cm2，0.6J/cm2，1.0J/cm2，3.0J/cm2，最后用微型平板阅读器(Ex/Em＝504/525nm)测量样品的荧光强度。
1.2、实验结果
通过动态光散射和透射电镜表征Polymer的粒径、电位和形态，由图10可知，Polymer粒径约为67.75nm，呈规则的核壳型；Zeta电位结果显示，Polymer带正电，为11.31mV。紫外吸收会直接影响光动力转化能力，因此使用紫外可见分光光度计对Polymer进行光谱扫描，由紫外吸收图谱可知，Polymer有两个吸收峰，分别在389nm和678nm处(图11A)，其中678nm处于近红外区。其次与游离Ppa相比，Polymer光学性质没有发生明显变化(图11B)。然后通过SOSG探针评价了Polymer产生单线态氧的能力，即光动力效应。结果显示，随着激光照射强度增加，Polymer产生单线态氧的能力增加(图11C)。
上述结果说明，本发明的药物载体能够形成稳定、分散性好的胶束，并且具有优异的光动力效应，具有优异的载药和应用于光动力治疗的潜力。
2、Polymer@Gef载药胶束(实施例2第一步制备)的表征
2.1实验方法
(1)外貌形态：按2.2.5方法制备载药胶束溶液(Polymer@Gef终浓度为0.3mg/mL)，取一滴干燥处理，通过透射电镜(TEM)观察Polymer-Gef的形态。
(2)粒径分布：按2.2.5方法制备载药胶束溶液(Polymer@Gef终浓度为1mg/mL)，使用布鲁克海文粒径仪表征样品粒径大小，每个样品测量三次。
(3)吉非替尼含量测定
a.吉非替尼标准曲线：称取一定量的吉非替尼，用1％冰醋酸溶液配成浓度为500μg/mL的母液，并依次稀释成40，20，10，5，2.5μg/mL浓度的标准品，以1％冰醋酸溶液作为对照，用紫外可见分光光度计检测200-400nm波长范围内各溶液吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数；
b.载药量(Drug loading,DL)和包封率(Encapsulation efficiency,EE)测定：称取一定量的含药胶束(Polymer@Gef)用1％冰醋酸溶液配成200μg/mL的样品溶液，用紫外可见分光光度计检测。DL％＝载药胶束中吉非替尼的质量/吉非替尼和胶束的总质量×100％，EE％＝载药胶束中吉非替尼的质量/吉非替尼总质量×100％。
2.2实验结果
通过旋转蒸发法制备得到的Polymer@Gef胶束，经DLS测定了其粒径大小，约为112.54nm，较Polymer大，这可能是由于吉非替尼包载所致(图12A)。TEM观察了其形态，如图12B所示，Polymer@Gef纳米粒呈圆球形，且出现典型的核壳结构。通过紫外可见分光光度法确定了吉非替尼的标准曲线，R2＝0.9998,说明吉非替尼在2.5-40μg/mL范围内线性关系良好。通过标准曲线计算了吉非替尼的载药量及包封率，按照Polymer：吉非替尼质量比40:1投药可计算得出载药量和包封率分别为2.37％和97.34％(表1)。
上述结果说明，本发明药物载体Polymer成功包载了吉非替尼，载药量和包封率均较高，可实现吉非替尼的有效递送。
3、Polymer@Gef-siRNA载药胶束(实施例2)的表征
3.1实验方法
(1)凝胶阻滞实验：配制好2％琼脂糖凝胶块，将2.2.8中制备的Polymer@Gef-siRNA样品上样，在含有Gel-Red的Tris-Acetate-EDTA(TAE)缓冲液中进行水平电泳(80V，30min)，并在凝胶成像系统观察分析。
(2)外貌形态：制备载药胶束溶液(Polymer-Gef-siRNA终浓度为0.3mg/mL)，取一滴干燥处理，通过透射电镜(TEM)观察Polymer-Gef-siRNA的形态。
(3)粒径分布：制备载药胶束溶液(Polymer-Gef-siRNA终浓度为1mg/mL)，使用布鲁克海文粒径仪表征样品粒径大小，每个样品测量三次。
(4)siRNA稳定性：血清对siRNA稳定性影响：以裸siRNA作为对照，将Polymer@Gef-siRNA和裸siRNA分别与血清共孵育1h，3h，6h，24h后，肝素对Polymer@Gef-siRNA中siRNA进行提取，然后进行琼脂糖凝胶阻滞实验，并观察分析siRNA完整性。激光照射对siRNA完整性的影响：激光照射(660nm,200mw)30s，60s，120s后，肝素对Polymer@Gef-siRNA中siRNA进行提取，然后进行琼脂糖凝胶阻滞实验，并观察分析siRNA完整性。
3.2实验结果
本发明制备好Polymer@Gef胶束后，进一步通过静电吸附作用制备Polymer@Gef-siRNA。通过凝胶阻滞实验确定siRNA与Polymer@Gef的紧密结合，结果显示，当Polymer@Gef与siRNA在质量比为800:1时，siRNA在水平电泳中无法移动，说明该载体在质量比800:1比例时能很好的吸附siRNA，是一个合格的siRNA载体(图13)。因此，选用此质量比例进行后续试验。经DLS测定Polymer@Gef-siRNA粒径大小约为113.52nm，且分散性好，通过TEM观察其形态，呈规则的核壳圆形(图14)。为进一步研究该递送系统稳定性，我们在Polymer@Gef-siRNA中加入血清，并在不同时间点孵育，如图15所示，游离的siRNA在1小时后已经被完全破坏，而Polymer@Gef-siRNA中的siRNA在8小时内保持完整结构，在24小时也能部分保持完整。此外，经200mw 660nm激光照射不同时间后siRNA也没有被破坏(图16)。
上述结果说明，本发明载体能够有效且稳定地吸附siRNA，保护siRNA结构不受血清、激光照射破坏，可实现siRNA的有效递送。
表1
粒径(nm) PDI
Polymer 67.75±0.99 0.283±0.02
Polymer@Gef 112.54±1.89 0.257±0.01
Polymer@Gef-siRNA 113.52±0.36 0.275±0.01
而且，从上述结果可以看出，本发明的联合用药系统粒径大小小于200nm，不易被机体清除，且利于通过EPR效应在肿瘤富集，其结构呈核壳型，外围有亲水壳，能够延长在体内的循环并且提高siRNA的稳定性，因此，本发明联合用药系统在靶向肿瘤治疗中具有很好的应用潜力。
实验例2、本发明联合用药系统Polymer@Gef-siRNA体外抗耐药肿瘤细胞作用
1、耐药肿瘤细胞
正常人肺纤维细胞(IMR-90细胞)和正常人脐静脉细胞(HUEVC细胞)购买于上海中科院细胞库，耐吉非替尼的人肺腺癌细胞(BB4/PC-9细胞)和人肺腺癌细胞(PC-9细胞)由四川大学华西医院周清华教授课题组提供。为评价BB4/PC-9细胞的耐药程度及敏感性，采用CCK8法分别测定吉非替尼对BB4/PC-9细胞和PC-9细胞的细胞活力影响。将BB4/PC-9细胞和PC-9细胞按5000个/孔的密度接种于96孔板，24小时后，加入不同浓度的吉非替尼。继续孵育48小时后，吸走废液，每孔加入20μl CCK8溶液，30min后，多功能酶标仪检测450nm吸光度，并计算细胞存活率及耐药指数DRI(Drug resistance index)。
DRI＝IC50(BB4/PC-9)/IC50(PC-9)
DRI值是耐药细胞株与其亲本细胞株的IC50比值，用于表征耐药癌细胞株耐药程度。根据DRI数值，细胞可分为三类：低度耐药细胞(DRI：0-2)，中度耐药细胞(DRI：2-10)和高度耐药细胞(DRI：>10)。为了验证BB4/PC-9细胞对吉非替尼的耐药性，我们以PC-9细胞作为敏感细胞对照，用CCK8法测定了吉非替尼处理后，这两种细胞的细胞活力，并计算了DRI值。结果见表2。
表2
吉非替尼对PC-9细胞有良好的体外细胞活力抑制作用，且呈浓度和时间依赖性。BB4/PC-9细胞中吉非替尼的IC50值偏高，48小时DRI值为12.57，72小时DRI值为36.91，说明吉非替尼在BB4/PC-9细胞中抗增殖活性减弱，且随培养时间延长，DRI值也增大，同时，证明本发明所用BB4/PC-9细胞具有高度的吉非替尼耐药性。
2、确定Polymer光照剂量
将BB4/PC-9细胞按接种于96孔板，密度为5000个/孔，24h细胞贴壁后，给予不同浓度Polymer(实施例1)溶液(1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125μg/mL)，6h后换新鲜培养基，然后用660nm激光器经不同激光剂量照射(0J/cm2，0.3J/cm2，0.6J/cm2，1.0J/cm2)细胞，培养24h后，弃含药培养基，每孔加入200μl新鲜培养基，然后加入20μL CCK8溶液继续孵育约30min后，多功能酶标仪检测450nm吸光度。
为了确定细胞水平上光动力治疗剂量，我们通过CCK8法检测了经不同浓度Polymer处理，并采用不同光照剂量激光照射后的BB4/PC-9细胞活力。结果显示，当光照强度一定时，光动力治疗作用随着Polymer给药浓度增大而增强；当Polymer给药浓度一定时，光动力治疗作用随着光照剂量增大而增强(图17)，说明激光照射后Polymer介导的光动力治疗作用在细胞水平上是可行的，且具有浓度依赖性和光照剂量依赖性。在多种处理方式联合治疗时，为了观察协同治疗效果，不宜选用较强光照剂量，因此选用0.3J/cm2作为后续试验光照剂量，此时细胞存活率约为70％。
3、Polymer细胞毒性评价
为进一步研究Polymer@Gef-YAPsiRNA在体外的抗肿瘤作用，首先探讨载药材料Polymer的生物安全性，在不同Polymer浓度液(1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125μg/mL)下测定了4种不同细胞(PC-9，BB4/PC-9，IMR-90和HUEVC)的细胞存活率。在没有光照条件下，细胞与Polymer培养24小时和72小时后，细胞活性基本不受影响。
4、细胞摄取与亚细胞器共定位
待BB4/PC-9细胞长至对数生长期，胰酶消化，250rpm/min离心，吸废液后按1.5×105个/孔的细胞密度接种于六孔板中，每孔2mL细胞悬液，待细胞贴壁24h后，分别进行细胞摄取和亚细胞器共定位实验。
(1)细胞摄取实验：
用Polymer@Gef-FAMsiRNA分别孵育细胞30min，2h和6h后，PBS洗三次，4％多聚甲醛固定15min后DAPI染色1小时，PBS洗三次，用共聚焦显微镜观察细胞摄取过程。
(2)亚细胞器共定位实验：
首先Polymer@Gef-siRNA分别孵育细胞30min，2h和6h，PBS洗三次；然后用Hochest33234染色30min，PBS洗三次；最后Lysotracker Green进行染色10min，PBS洗三次。用共聚焦显微镜观察细胞内化及亚细胞共定位过程。
结果如图18A，随着孵育时间延长，FAM标记siRNA的绿色荧光强度增加，且与Polymer的红色荧光重叠，表明Polymer@Gef能够递送siRNA进入细胞。接下来，将含有Polymer@Gef-NCsiRNA的培养基与BB4/PC-9细胞分别孵育30min，2h和6h，并用Hochest33234染料染细胞核，Lysotracker-Green染溶酶体。通过激光共聚焦显微镜观察Polymer@Gef-siRNA在细胞中的分布，结果如图18B，随着共孵育时间的延长Polymer的红色荧光强度变强，逐渐与溶酶体标记的绿色荧光重叠，说明Polymer@Gef-siRNA进入细胞是通过内吞作用形成内含体的方式，并分布在细胞质中。
5、细胞内产ROS测定
待BB4/PC-9细胞长至对数生长期，胰酶消化，250rpm/min离心，吸废液后按8×104个/mL的细胞密度接种于24孔板中，每孔1mL细胞悬液，待细胞贴壁24h后，更换含有Polymer@Gef-siRNA(实施例2)和H2O2的培养基，37℃孵育6小时后用660nm激光照射，功率为200mw，66s。弃掉培养基，并用PBS洗三次。然后加入含DCF-DA培养基，DCF-DA终浓度为10μM，37℃孵育30min后弃掉培养基并用PBS洗三次。最后用共聚焦显微镜观察细胞内荧光强度。
结果如图19所示。对于对照组，激光照射前后细胞内荧光信号强度无明显变化；在Polymer@Gef-siRNA组，经激光照射后细胞内的荧光信号强度明显高于未光照组，二者有显著性差异。这说明基于焦脱镁叶绿酸-a的纳米材料Polymer形成Polymer@Gef-siRNA纳米给药系统之后能显著增加细胞内ROS的产生，在细胞内表现出很好的光动力效应。
6、Polymer@Gef-siRNA(实施例2)体外抗耐药肿瘤作用
用培养基将Free Gef、Polymer@Gef和Polymer@Gef-YAPsiRNA稀释成8种不同浓度含药培养基，其中吉非替尼浓度为8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μM，siRNA浓度为30nM。将BB4/PC-9细胞按4000个/孔密度接种于96孔板中，贴壁后，用不同浓度的FreeGef、Polymer@Gef和Polymer@Gef-YAPsiRNA处理细胞72h，其中激光组用Polymer@Gef、Polymer@Gef-YAPsiRNA处理6h后，再用220mw、660nm激光照射33s，然后继续培养66h。之后，弃含药培养基，每孔加入200μL新鲜培养基，然后加入20μL CCK8溶液继续孵育约30min后，多功能酶标仪检测450nm吸光度，并计算半数抑制浓度(Half maximalinhibitoryconcentration，IC50)。
为探讨Polymer@Gef-YAPsiRNA对耐药肺癌细胞的作用，我们选用PC-9吉非替尼耐药细胞株BB4/PC-9作为实验对象，以不同组合的吉非替尼纳米药物处理，光照或不光照，并通过CCK8实验评价体外抗肿瘤效果。细胞活性如图20所示，各处理组IC50值如表3所示，Polymer@Gef组的IC50值略高于游离药物，这可能是由于纳米药物和游离药物进入细胞的方式不同导致；其中，Polymer@Gef组的IC50为3.2602μM，是Polymer@Gef-YAPsiRNA组的2.44倍；此外，Polymer@Gef-YAPsiRNA+Laser组抗肿瘤效果最好。在BB4/PC-9细胞中，Polymer@Gef-YAPsiRNA+Laser处理后的IC50值为0.1454μM，而PC-9细胞用Polymer@Gef处理72小时后的IC50为0.405μM，这说明着Polymer@Gef-YAPsiRNA+Laser这种靶向治疗+基因治疗+光动力治疗给药方式可能将一种极具耐药性的癌细胞系作为敏感细胞来处理。
表3
上述结果说明，Polymer即使在较高浓度下，细胞毒性也很低，因此Polymer是一种生物安全性材料，用于装载吉非替尼和siRNA之后形成的Polymer@Gef-siRNA仍将具有良好的生物相容性。而且，本发明联合给药系统Polymer@Gef-siRNA是通过内吞作用以形成内涵体的形式进入细胞，经激光照射后，Polymer@Gef-siRNA能在细胞内产生明显的ROS用于光动力治疗。此外，发明人还通过Western bolt实验检测了仅载有YAP-siRNA的Polymer@YAP-siRNA处理后的BB4/PC-9细胞中YAP的表达情况，结果显示Polymer@YAP-siRNA能有效的抑制YAP蛋白表达。
从对耐药性癌细胞系的抑制结果来看，与Polymer@Gef组相比，Polymer@Gef-YAPsiRNA显著抑制了细胞活性(IC50降低了2.44倍)，说明沉默YAP提高了BB4/PC-9对吉非替尼的敏感性。最后，经选用0.3J/cm2作为体外实验光照剂量，将PDT与Polymer@Gef-siRNA联合应用，IC50降低了22.42倍，这说明依赖本发明联合给药体系实现的靶向治疗+基因治疗+光动力治疗这种三联疗法能将一种极具耐药性的癌细胞系作为敏感细胞来处理，有望逆转耐药。
综上，本发明的Polymer@Gef-siRNA纳米递送平台通过细胞内吞作用成功的递送siRNA进入细胞并抑制YAP蛋白表达，且能在激光照射下产生ROS，与光动力治疗结合，Polymer@Gef-siRNA能最大限度抑制耐药细胞株的增殖能力。
实验例3、Polymer@Gef-siRNA在耐药肺癌模型中的有效性、安全性
1、实验动物
从北京维通利华动物技术有限公司购买4-5周龄雌性Balb/c nude小鼠，并饲养在SPF级别动物房。动物实验严格按照四川大学动物实验伦理和法律规定执行。
2、耐药肺癌模型的建立
取对数期生长细胞，胰酶消化，10％胎牛血清培养基终止消化后，离心去上清。用生理盐水清洗3次细胞悬液后，用不含胎牛血清的培养基重悬细胞，按1×107个/只的细胞密度将BB4/PC-9细胞接种于裸鼠右背部，当肿瘤体积长至50-100mm3时，进行药效实验。
3、体内分布实验
将Balb/c nude荷瘤小鼠随机分成两组，每组三只。尾静脉注射Free Ppa和Polymer@Gef-YAPsiRNA，其中Free Ppa和Polymer@Gef-YAPsiRNA浓度分别为1mg/mL和20mg/mL，每只荷瘤小鼠尾静脉注射200μL溶液，分别于1h,4h,24h,28h,32h进行活体成像采图；32小时后，解剖小鼠取出肿瘤及主要脏器(心，肝，脾，肺，肾)，进行离体器官成像。数据采用Living image Vesion 4.4进行分析。
结果显示，Polymer@Gef-siRNA(实施例2)在肿瘤处的荧光强度随着时间逐渐递增，在32h达到最强；与之相对的是对照组中(注射游离Ppa)，即使在32h后也未在肿瘤处观察到明显的荧光信号(图21A)。注射32h后，处死动物，取出肿瘤及主要脏器(心肝脾肺肾)进行离体成像。离体结果与活体结果一致，Polymer@Gef-siRNA组较游离Ppa组在肿瘤中有较强的荧光信号。游离Ppa组在肝脏和肾脏中富集较多，而其他组织较少，表示游离Ppa在很快被吞噬排泄掉。此外，Polymer@Gef-siRNA组中肝脏，脾脏中可见较高的荧光信号，其他器官与组织中则无明显富集(图21B，C)。
4、体内药效实验
当裸鼠肿瘤体积达到50-100mm3进行药效实验，计为Day 0；将动物随机分为10组(n＝5-6)，分别为1)生理盐水组；2)Polymer(实施例1)组；3)Free Gef组；4)Polymer@Gef(实施例2第一步制备)组；5)Polymer@YAPsiRNA；6)Polymer@Gef-YAPsiRNA(实施例2)；7)Polymer+光照组；8)Polymer@Gef+光照组；9)Polymer@YAPsiRNA+光照组；10)Polymer@Gef-YAPsiRNA+光照组。其中对照组尾静脉注射生理盐水，处理组中吉非替尼组口服灌胃(5mg/kg)，其他组均尾静脉给予NPs(其中吉非替尼和YAP-siRNA剂量分别为5mg/kg，0.3mg/kg)，每两天一次。
结果如图22A所示，生理盐水组和Polymer组肿瘤生长迅速，给药处理组能够抑制肿瘤生长，肿瘤体积(Tumor volume,TV)均小于对照组；与游离吉非替尼组相比，Polymer@Gef、Polymer@YAPsiRNA、Polymer@Gef-YAPsiRNA、Polymer@Gef+L、Polymer@YAPsiRNA+L和Polymer@Gef-YAPsiRNA+L组小鼠肿瘤生长受到抑制(其中，L代表光照)；与Polymer@Gef、Polymer@YAPsiRNA、Polymer@Gef-YAPsiRNA组相比，Polymer@Gef+L、Polymer@YAPsiRNA+L、Polymer@Gef-YAPsiRNA+L等光照组小鼠肿瘤体积明显小于相应的非光照组；与所有给药组相比，Polymer@Gef-YAPsiRNA+L组肿瘤体积最小。
每两天测量肿瘤体积及动物体重，肿瘤体积计算公式为：Volume＝L×W2/2，其中L和W分别是肿瘤中最长边和最短边；治疗结束后安乐死处死小鼠，解剖取出肿瘤，对肿瘤称瘤重(图22C)并计算肿瘤生长抑制率(Tumor growth inhibition,TGI)，肿瘤生长抑制率计算公式为：TGI(％)＝(1-W/W0)×100％，其中W和W0分别是给药组瘤重和对照组瘤重。
结果显示Polymer@Gef-YAPsiRNA联合光照治疗后TGI高达91.56％，明显高于其他组，与肿瘤体积变化结果趋势一致，进一步说明其在耐药肿瘤中的抑瘤效果(图22D)。
此外，肿瘤一部分用中性福尔马林(10％ NBF)固定后，进行H&E、TUNEL染色。肿瘤组织H&E染色显示，Polymer@Gef-YAPsiRNA联合光照组肿瘤细胞表现出细胞质浓缩和细胞核固缩等凋亡细胞死亡的典型特征，且同视野下肿瘤细胞密度最低(图23)；此外，肿瘤组织TUNEL染色结果显示，Polymer@Gef-YAPsiRNA联合光照组凋亡细胞密度明显增加(图24)。给药期间，体重改变无明显差异(图22B)，说明小鼠可以耐受该给药方式和方法。这些结果表明本发明联合给药系统具有良好的抗耐药肿瘤作用。
5、安全性评价实验
在体内药效实验治疗终点时，处死小鼠并进行眼球取血，分别经抗凝和促凝处理后进行血常规及血生化检测。此外，将心、肝、脾、肺和肾等主要脏器用10％ NBF固定后，进行H&E染色。
血常规主要检测指标有：红细胞(Red blood cell,RBC)；血小板(Plateletcounts,PLT)；白细胞(White blood cell,WBC)；红细胞压积(Hematocrit,HCT)；血小板平均体积(Mean platelet volume,MPV)；血红蛋白(Hemoglobin,HGB)。吉非替尼主要经肝脏代谢，且根据Polymer@Gef-siRNA体内分布结果，肾脏也有一些分布，因此生化主要检测指标有：碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)；谷丙转氨酶(Alanineaminotransferase,ALT)；谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)；尿素氮(Bloodurea nitrogen,BUN)；尿素(UREAL)。与对照组相比，给药组各项指标均无较大变化(表4、5)，表明该纳米递送系统治疗后，全身毒性小，肝功和肾功没有受损。为进一步考察体内安全性，接下来对心肝脾肺肾等脏器进行H&E染色，结果显示未见明显病理学异常(图25)。结合血常规、血生化和病理结果一起分析，表明本发明联合给药心痛对动物的各主要脏器均未产生明显的毒性反应，具有良好的生物相容性和安全性。
以上结果说明，本发明联合给药系统在体内抑瘤效果优异，生物相容性好，临床应用潜力很大。
表4
表5
综上，本发明提供了一种新型药物载体，能够有效包载小分子靶向治疗药物吉非替尼和YAP抑制剂YAP-siRNA，同时兼具光敏性，成功将小分子靶向治疗、基因治疗和光动力治疗三种方式整合为一体，提供了一种联合多种治疗方式的联合用药系统，在体内外均具有优异的抗癌作用，尤其是对耐药肺癌的治疗效果优异，具有很好的临床应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种光动力-小分子靶向-基因治疗联合用药系统及其制备方法
<130> GYKH1191-2021P0113565CC
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> YAP-siRNA-1
<400> 1
cugccaccaa gcuagauaat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> YAP-siRNA-2
<400> 2
uuaucuagcu ugguggcagt t 21

Claims (15)

1.一种药物载体，其特征在于，它是具有式I所示结构的嵌段共聚物：
其中，R0为
R1、R2、R3分别独立选自乙酰氨基、马来酰亚胺-焦脱镁叶绿酸A基团或肽类树状分子基团；R1、R2、R3分别不同；
所述马来酰亚胺-焦脱镁叶绿酸A基团的结构为：
所述肽类树状分子基团的结构为：
q为5～15的整数；
所述药物载体由以下方法制备，
(1)寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯在引发剂和链转移剂的作用下聚合得到聚合物polyOEGMA；
(2)聚合物polyOEGMA与TPEP在引发剂和链转移剂作用下聚合得到嵌段聚合物polyOEGMA-block-polyTPEP；
(3)嵌段聚合物在还原剂作用下反应得到侧链带巯基的嵌段聚合物polyOEGMA-block-polySH；
(4)侧链带巯基的嵌段聚合物polyOEGMA-block-polySH在催化剂作用下与马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A反应，再与肽类树状分子反应，
(5)最后将碘乙酰氨基与巯基反应封端；
其中：
步骤(1)所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、引发剂、链转移剂的摩尔比为(750～850):(1～5):(5～15)；
步骤(2)所述聚合物polyOEGMA、TPEP、引发剂的摩尔比为(15～20):(150～550):(2～7)；
步骤(3)所述嵌段聚合物和还原剂的质量为1:(1～1.2)；
步骤(4)所述侧链带巯基的嵌段聚合物polyOEGMA-block-polySH、马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A和肽类树状分子的质量比为(100-200):(10-20):(300-500)。
2.如权利要求1所述的药物载体，其特征在于，分子量为29.44kDa，分子量分布为1.13；
其中，R0为R1为乙酰氨基，R2为马来酰亚胺-焦脱镁叶绿酸A基团，质量分数为3-8％、R3为肽类树状分子基团，摩尔分数为20-40％；
m大于4；p为6-12。
3.如权利要求2所述的药物载体，其特征在于，m大于7。
4.如权利要求1或2所述的药物载体，其特征在于，它由寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯聚合得到聚合物polyOEGMA后，与TPEP聚合并还原得到侧链带巯基的嵌段共聚物，再与马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A、肽类树状分子发生点击反应制备而成；
所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯结构为：其中q为5～10的整数；
所述TPEP结构为：
所述马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A结构为：
所述肽类树状分子的结构为
5.如权利要求4所述的药物载体，其特征在于，q为9。
6.如权利要求4所述的药物载体，其特征在于，所述聚合物polyOEGMA、TPEP的摩尔比为17:500；
所述侧链带巯基的嵌段共聚物、马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A、肽类树状分子的质量比为150:12:400。
7.权利要求1～6任一项所述药物载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯在引发剂和链转移剂的作用下聚合得到聚合物polyOEGMA；
(2)聚合物polyOEGMA与TPEP在引发剂和链转移剂作用下聚合得到嵌段聚合物polyOEGMA-block-polyTPEP；
(3)嵌段聚合物在还原剂作用下反应得到侧链带巯基的嵌段聚合物polyOEGMA-block-polySH；
(4)侧链带巯基的嵌段聚合物polyOEGMA-block-polySH在催化剂作用下与马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A反应，再与肽类树状分子反应，
(5)最后将碘乙酰氨基与巯基反应封端，即得。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、引发剂、链转移剂的摩尔比为(750～850):(1～5):(5～15)；
步骤(2)所述聚合物polyOEGMA、TPEP、引发剂的摩尔比为(15～20):(150～550):(2～7)；
步骤(3)所述嵌段聚合物和还原剂的质量为1:(1～1.2)；
步骤(4)所述侧链带巯基的嵌段聚合物polyOEGMA-block-polySH、马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A和肽类树状分子的质量比为(100-200):(10-20):(300-500)。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、引发剂、链转移剂的摩尔比为800:3:10；
步骤(2)所述聚合物polyOEGMA、TPEP、引发剂的摩尔比为17:500:5；
步骤(3)所述嵌段聚合物和还原剂的质量为1:1；
步骤(4)所述侧链带巯基的嵌段聚合物polyOEGMA-block-polySH、马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A和肽类树状分子的质量比为150:12:400；
步骤(1)和/或步骤(2)所述引发剂为ACVA；所述链转移剂为4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸；步骤(3)所述还原剂为二硫苏糖醇；步骤(4)所述的催化剂为三乙胺。
10.如权利要求7-9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合的条件为70～80℃反应20～30h；
步骤(2)所述聚合的条件为70～80℃反应20～30h；
步骤(3)所述反应的条件为：20～30℃反应25～50h；
步骤(4)所述与马来酰亚胺修饰的焦脱镁叶绿酸A反应的条件为：20～30℃避光反应5～10h；与肽类树状分子反应的条件为20～30℃避光反应25～50h。
11.一种光动力-小分子靶向-基因治疗联合用药系统，其特征在于，它由权利要求1～6任一项所述药物载体包载表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂和/或Yes相关蛋白小干扰RNA形成。
12.如权利要求11所述联合用药系统，其特征在于，所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼，所述Yes相关蛋白小干扰RNA为序列如SEQ ID NO:1～2所示的YAP-siRNA。
13.权利要求11或12所述的联合用药系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将药物载体和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂分别溶于有机溶剂形成溶液，向药物载体溶液中滴加表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂溶液，搅拌混匀，除有机溶剂，加水分散过滤，滤液干燥得到包载吉非替尼的载药粒子；
和/或，2)向溶有Yes相关蛋白小干扰RNA的水溶液中加入步骤1)得到的载药粒子，混匀，即得；
步骤1)所述药物载体和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的质量比为(30～50):1；步骤2)所述载药粒子和Yes相关蛋白小干扰RNA的质量比为(200～1000):1。
14.权利要求13所述的联合用药系统的制备方法，其特征在于，
步骤2)所述载药粒子和Yes相关蛋白小干扰RNA的质量比为800:1。
15.权利要求1～6任一项所述的药物载体或权利要求11所述的联合用药系统在抗癌药物中的用途；所述抗癌药物为防治乳腺癌、膀胱癌、肺癌、食管癌、头颈部癌或皮肤癌的药物。
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