CN108728390A - 一种生产a82846b的基因工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产A82846B的基因工程菌，即在出发菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的基因组中整合了内源卤化酶基因chaA，或者与内源卤化酶基因chaA同源性不小于84％的外源卤化酶基因的工程菌。本发明还公开了上述基因工程菌的制备方法，及将上述基因工程菌发酵且从发酵液中获得A82846B的方法。本发明基因工程菌过表达导入的卤化酶基因并生产A82846B，其A82846B的产量(mg/L)或目的产物在总产物中的占比有显著地提高，本发明提高了生产效率及降低生产成本的同时，还减少了环境污染。

Description

一种生产A82846B的基因工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种生产A82846B的基因工程菌及其构建/制备方法与应用。

背景技术

随着抗菌药物应用的增多，细菌的耐药性问题日益严重，耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)在皮肤感染中的比例逐年上升。临床通常使用糖肽类抗生素万古霉素和替考拉宁等治疗由MRSA引起的严重感染。然而，耐万古霉素菌株的迅速出现，使得寻找新型抗MRSA抗菌药物迫在眉睫。奥利万星(oritavancin)是第二代糖肽类抗生素，于2014年8月由美国FDA批准上市，用于治疗敏感革兰氏阳性菌(包括MRSA)引起的急性细菌性皮肤和结构感染，是继万古霉素和替考拉宁等第一代糖肽类抗生素之后的新型有效的抗生素。

A82846B是奥利万星的合成前体，分子式是C86H97Cl2N10O26，它是万古霉素的结构类似物，结构与多数糖肽类抗生素的结构类似。目前，大规模微生物发酵法是生产A82846B的主要方式，发酵液还会有A82846A和A82846C产生。A82846A和A82846C都是A82846B的结构类似物，三者的结构式如下式1所示，三者的区别在于糖肽骨架的2位和6位氨基酸残基的取代基上的氯原子，A82846B在2和6位取代基上各有一个氯原子，A82846A只在2位取代基有一个氯原子，A82846C没有氯原子(表1)。抗菌活性依次是A82846B>A82846A>A82846C。氯原子能促使抗生素形成二聚体，形成活性口袋，更利于与细菌结合，因此含有两个氯的A82846B抗菌活性更强。发酵液中A82846A和A82846C产生，给A82846B的生产和后续的分离纯化增加了成本。

表1.A82846三种产物R1和R2位点的基团组成

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中上述A82846B发酵过程中，副产物A82846A和A82846C产生，给生产A82846B及后续的分离纯化增加时间及经济成本等缺陷；提供一种生产A82846B的基因工程菌及其构建方法和应用，可以利用基因工程技术提高生产A82846B的效率，降低成本。

随着分子生物学技术的发展，利用基因工程手段能够定向改造或修饰抗生素的生物合成基因簇，获得新型抗生素或提高抗生素产量。然而，本发明的难点在于A82846B目标产物及其副产物A82846A和A82846C的产生在其生产菌中的基因调控机理尚未清楚，特别是A82846A、A82846B与A82846C间的相互转化，以及与其内部存在的卤化酶的关系均不清楚。本发明通过诸多研究和试验，发现将内源卤化酶基因导入产A82846B的宿主菌，使之过表达，或在宿主菌中外源表达与该内源卤化酶基因同源性较高的卤化酶基因，将A82846A和A82846C转化为A82846B，获得的工程菌产物中各物质的含量发生了变化，副产物A82846A和A82846C的产量和/或比例显著降低，和/或A82846B产量和/或比例明显提高。

因此，本发明的技术方案之一是：一种生产A82846B的基因工程菌，其是在生产A82846B的出发菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的基因组中整合了内源卤化酶基因chaA，或者与所述内源卤化酶基因chaA同源性为约84％或84％以上且来源于糖肽类抗生素生产菌的外源卤化酶基因的工程菌。

所述外源卤化酶基因优选来源于放线菌纲(Actinobacteria)；更优选拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)或游动放线菌属(Actinoplanes)。

进一步优选地，所述拟无枝酸菌属是东方拟无枝酸菌或地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis balhimycina)；和/或，所述的游动放线菌属是替考游动放线菌(Actinoplanes teichomyceticus)或游动放线菌(Actinoplanes sp.)。

根据本发明，所述的卤化酶基因chaA优选来源于东方拟无枝酸菌NRRL18099菌株，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(GeneBank编号AJ223998.1)。所述外源卤化酶基因是来源于东方拟无枝酸菌ATCC 10007的万古霉素(vancomycin)卤化酶基因vcm8，其核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示；地中海拟无枝酸菌DSM 5908的巴新霉素(balhimycin)卤化酶基因bhaA，其核苷酸序列优选如SEQ ID No.3所示；替考游动放线菌ATCC 31131的替考拉宁卤化酶基因thaA，其核苷酸序列优选如SEQ ID No.4所示；或游动放线菌(Actinoplanes sp.)ATCC 53533的卤化酶基因halI基因，其核苷酸序列优选如SEQ ID No.5所示。

根据本发明，所述生产A82846B的出发菌东方拟无枝酸菌可以选择常规产A82846B的天然菌株或其突变菌株，更优选为NRRL 18099天然菌株。

本发明在一较佳实施例中，是在宿主菌NRRL 18099中导入东方拟无枝酸菌NRRL18099的卤化酶基因chaA，使卤化酶过表达。

本发明在一较佳实施例中，是在宿主菌NRRL 18099中导入东方拟无枝酸菌ATCC10007的万古霉素(vancomycin)卤化酶基因vcm8，使卤化酶过表达。

本发明在又一较佳实施例中，是在宿主菌NRRL 18099中导入地中海拟无枝酸菌DSM 5908的balhimycin卤化酶基因bhaA，使卤化酶过表达。

本发明的再一较佳实施例是在宿主菌NRRL 18099中导入替考游动放线菌ATCC31131的teicoplanin卤化酶基因thaA，使卤化酶过表达。

本发明的另一较佳实施例是在宿主菌NRRL 18099中导入游动放线菌ATCC 53533的卤化酶基因halI，使卤化酶过表达。

本发明的再一技术方案是：一种本发明上述基因工程菌的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：

1)PCR扩增或人工合成chaA、vcm8、bhaA、thaA或halI卤化酶全基因；

2)构建chaA、vcm8、bhaA、thaA或halI的重组质粒；

3)将构建的重组质粒转化到中间宿主菌；

4)将带有重组质粒的中间宿主菌和生产A82846B的出发菌接合培养。

较佳地，所述重组质粒的骨架为permE152质粒或pSET152；优选地，所述的中间宿主菌为大肠杆菌ET12567/pUZ8002；进一步优选地，所述的培养为在MS琼脂培养基培养，温度为28℃。

本发明的另一技术方案是：一种A82846B的制备方法，包括将上述任一种基因工程菌发酵，从发酵液中获得A82846B。培养发酵方法可以选用现有A82846B生产菌、特别是东方拟无枝酸菌的培养发酵方法。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明通过在A82846B的生产菌东方拟无枝酸菌中过表达内源的卤化酶基因chaA及外源的vancomycin卤化酶基因vcm8、balhimycin卤化酶基因bhaA、teicoplanin卤化酶基因thaA和halI基因等，可以将A82846A和A82846C转化为A82846B，提高A82846B产量和/或在总产量中所占的比例，和/或降低两种副产物A82846A和A82846C的产量或和/在总产量中所占的比例，提高了生产效率，降低生产成本，减少环境污染。

附图说明

图1为permE152质粒图谱。permE*和ter分别为红霉素启动子和终止子序列，int为整合酶基因，Rep Origin1为复制起始位点，acc(3)IV为安普霉素抗性基因，attP为整合位点。

图2为pSET152质粒图谱。

图3为导入内源卤化酶基因(chaA)的工程菌NRRL18099/pchaA152发酵产物HPLC图谱。

图4为导入外源卤化酶基因(vcm8)的工程菌发酵产物HPLC图谱。

图5为宿主菌发酵产物HPLC图谱。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

内源卤化酶基因chaA的扩增、克隆和表达

(1)东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)菌株NRRL 18099(购自NRRL)的基因组提取及内源卤化酶基因chaA的扩增：

将NRRL 18099接种于25ml TSB(上海源聚生物公司)培养基中，28℃、220rpm振荡培养(上海知楚仪器有限公司)48h。将培养液用12000rpm离心(湖南湘仪仪器开发有限公司)5min，倒出上清，回收菌体。使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒，按照供应商(上海捷瑞生物工程有限公司)说明书提供的提取方法进行基因组提取。

引物由上海百力格生物技术有限公司合成，其设计如下：

ChaA-F:5’-CATATGATGTCGGTCGAAGACTTCGATGTGG-3’(请参见SEQ ID NO.6)；

ChaA-R:5’-GGCGCGCCTATTTCGTAGATCCTTCGA-3’(请参见SEQ ID NO.7)。

在引物5’端分别加上NdeI和AscI(内切酶均购自ThermoFisher Scientific)酶切位点。

PCR体系如下表2所述：

表2.chaA扩增体系各组分及体积

组分	体积
		5*PS buffer	10μl
dNTP	4μl
		Enzyme primeSTAR	0.5μl
chaA-F	1μl
		chaA-R	1μl
基因组DNA	1μg
		ddH2O	加至50μl

各引物的工作浓度均为50μM/L，dNTP的工作浓度为2.5mM/L，PCR扩增试剂盒来自大连Takara公司。PCR反应条件如下：预变性96℃，5min；96℃变性10s、63℃退火10s、72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸10min。结果特异性扩增出约1.5kb的DNA片段，将PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳(上海天能科技有限公司)，电压120V，45min，切胶回收，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程有限公司)进行胶回收，最后溶到30μl纯水中。将纯化得到的DNA片段使用Pmd18-T Vector Cloning Kit试剂盒(大连Takara公司制造)连接得到带有目的DNA片段的Pmd18-T载体上。转化DH5α大肠杆菌感受态(康为世纪生物科技有限公司)。提取质粒后对目的DNA片段序列进行测序分析(上海百力格生物技术有限公司)，结果如SEQ ID NO.1所示，确认是chaA基因。得到带chaA的质粒Pmd18-T-chaA。

(2)表达质粒pchaA152的构建：

将上述(1)中获得的质粒Pmd18-T-chaA用NdeI/AscI双酶切，胶回收目的片段chaA，将该片段插入到permE152质粒(质粒图谱见图1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示)的NdeI和AscI位点之间得表达质粒pchaA152。permE152质粒是本实验室在pSET152质粒(长沙优宝生物科技有限公司，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示)的基础上构建的质粒，它含有红霉素启动子ermE*和终止子序列，含有安普霉素抗性基因，可用作接合子的筛选标记。将红霉素启动子ermE*和终止子ter*序列与一段DNA序列拼接在一起形成启动子-DNA序列-终止子的片段(其拼接核苷酸序列如SEQ ID NO:12中第465～第2141位所示)，两端分别加上XbaI、BamHI位点，中间DNA序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:12中第779～第1759位所示)的两端分别加上NdeI和AscI位点，送至北京唯尚立德生物科技有限公司进行全基因合成，并连接至PWSV质粒(北京唯尚立德生物科技有限公司)中获得PWSV-ermE-DNA序列-ter*的过渡质粒，用XbaI、BamHI分别双酶切上述过渡质粒和pSET152质粒，连接即得permE152质粒。将重组质粒pchaA152转化中间宿主大肠杆菌ET12567/pUZ8002(长沙优宝生物科技有限公司)。

(3)基因工程菌的构建

将宿主菌NRRL 18099接种到新鲜的斜面上，28℃培养5-6天，待白色的菌体长出，用接种铲铲取约1cm³的菌体接种到25ml TSB液体培养基(上海博微生物科技有限公司)中，28℃，200rpm，培养2天，按1％接种量转接到25ml TSB培养基中，28℃，200rpm，培养1天。离心去上清得菌丝体，用LB液体培养基洗涤2次，最终悬浮于2ml的LB液体培养基中，此为宿主菌液。

将携带质粒pchaA152的中间宿主大肠杆菌ET12567/pUZ8002接种到5ml含氯霉素、卡那霉素和安普霉素(生工生物工程有限公司)的浓度分别为25μg/ml、25μg/ml和50μg/ml(氯霉素、卡那霉素抗性来源来自宿主菌的pUZ8002)的LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0-7.2，高压灭菌121℃，20分钟)中，37℃，200rpm，过夜培养。按1％的接种量转接到25ml的相同培养基中，37℃，200rpm培养约4小时后，使OD值为0.4-0.6，用LB液体培养基洗涤2次，最终悬浮于2ml的LB液体培养基中，此为带有内源chaA质粒的大肠杆菌液。

将上述所制的宿主菌液与中间宿主大肠杆菌液按体积比1:1混合于离心管中，充分混合后，涂布MS琼脂培养基(热榨黄豆饼粉20g/L、甘露醇20g/L、琼脂20g/L)。28℃培养15h后，再用1ml含450μg/ml的安普霉素和50μg/ml的萘啶酮酸的无菌水覆盖平板，进一步于28℃培养一周，获得安普霉素抗性株。

(4)基因工程菌的验证

对于上述步骤(3)所得的安普霉素抗性株进行抗性验证，将宿主菌和获得的安普抗性的基因工程菌株分别接种到含有安普霉素(50μg/ml)的斜面上，28℃培养6天，观察到仅宿主菌在含有安普霉素的斜面上不生长，而带转化子的基因工程菌则能生长。

进一步验证，按照细菌基因组提取方法提取转化子的基因组，设计安普霉素抗性基因引物：

Amp-F:5’-GTGCAATACGAATGGCGAAAAGCC-3’(请参见SEQ ID NO.8)；

Amp-R:5’-TCAGCCAATCGACTGGCGAGC-3’(请参见SEQ ID NO.9)。

以Amp-F/Amp-R为引物，以重组子基因组DNA为模板，按照实施例1中PCR反应体系，反应条件如下：预变性96℃，5min；96℃变性10s、62℃退火10s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。扩增后经琼脂糖电泳验证到约700bp的条带，分析确定了pchaA-15质粒以自身的attP整合位点与放线菌染色体上的attB位点在整合酶作用下整合进入了宿主菌染色体。

(5)基因工程菌发酵

种子培养基可参考专利申请“CN104805161A”，其组成如下：3g/L的酵母粉、11g/L的聚合蛋白胨，3g/L的麦芽浸粉和17g/L的葡萄糖，培养基的pH值为6.8。将上述获得的基因工程菌接种于种子培养基，于28℃摇床培养48h可得种子培养液。

发酵培养基和发酵工艺可参考本申请人的专利申请“CN201610505436.5”，培养基的组成如下：葡萄糖8g/L，酵母干粉0.6g/L，麦芽糊精5.0g/L，KCl 0.54g/L，CaCO₃ 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.017g/L，泡敌0.1g/L，PH6.4～6.7，控制残糖量0.1～0.3g/L。移取200ml种子培养液至5L玻璃发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司)，培养基体积为2L，发酵时间为6天，发酵温度32℃～35℃。

实施例2

外源卤化酶基因的扩增、克隆和表达

(1)外源卤化酶基因的全基因合成

外源卤化酶基因包括通过Blast氨基酸序列比对得到的与自身卤化酶同源性较高的卤化酶的基因：vancomycin卤化酶合成基因vcm8、balhimycin卤化酶基因bhaA以及teicoplanin卤化酶合成基因thaA等，如下表3所列。

表3.外源卤化酶基因其菌株来源及编号

将上表中的基因vcm8序列与终止子序列(SEQ ID No.10)拼接在一起，在目的基因序列起始添加NdeI酶切位点，在终止子序列末端添加BamHI酶切位点，形成NdeI-vcm8-终止子-BamHI顺序的序列，送至北京唯尚立德生物科技有限公司进行全基因合成，并连接至PWSV质粒中获得PWSV-vcm8。同样方法，可获得其他外源卤化酶基因的全基因，上述基因均连接至PWSV质粒中获得相应的重组质粒。

(2)外源卤化酶基因表达载体的构建：

对携带目的基因vcm8的PWSV-vcm8质粒(北京唯尚立德生物科技有限公司合成)用NdeI和BamHI双酶切从而获得目的基因片段，插入到含ermE*启动子的pSET152质粒的NdeI和BamHI中间，即可获得重组质粒pvcm8152。其余表达载体pbhaA152、pthaA152和phalI152的构建也分别由NdeI和BamHI双酶切从而获得目的基因片段，并将目的基因片段分别插入到含ermE*启动子的pSET152质粒的NdeI和BamHI中间，即可获得。

(3)基因工程菌的构建，将步骤(2)中获得的外源卤化酶基因表达载体分别以实施例1步骤(3)中同样的方法构建。

(4)基因工程菌的验证：对于上述步骤(3)所得的安普霉素抗性株分别进行抗性验证，方法同实施例1步骤(4)。

(5)基因工程菌发酵：将上述步骤(4)所得的基因工程菌，分别进行发酵，方法同实施例1步骤(5)。

对比实施例1

对比例卤化酶基因的扩增、克隆和表达

(1)对比例卤化酶基因的全基因合成

对比例卤化酶基因为丰加链霉菌(Streptomyces toyocaensis)的卤化酶基因bu52(SEQ ID No.11)，如下表4所列。

表4.对比例卤化酶基因其菌株来源及编号

将上表中的基因bu52与终止子序列(SEQ ID No.10)拼接在一起，在目的基因序列起始添加NdeI酶切位点，在终止子序列末端添加BamHI酶切位点，送至北京唯尚立德生物科技有限公司进行全基因合成，并连接至PWSV质粒中获得PWSV-bu52。

(2)对比例卤化酶基因表达载体的构建：

对携带目的基因bu52的PWSV-bu52质粒(北京唯尚立德生物科技有限公司合成)用NdeI和BamHI双酶切从而获得目的基因片段，插入到含ermE*启动子的pSET152质粒的NdeI和BamHI中间，即可获得重组质粒pSETbu52152。

(3)基因工程菌的构建，将步骤(2)中获得的卤化酶基因表达载体pSETbu52152以实施例1步骤(3)中同样的方法构建。

(4)基因工程菌的验证：对于上述步骤(3)所得的安普霉素抗性株分别进行抗性验证，方法同实施例1步骤(4)。

(5)基因工程菌发酵：将上述步骤(4)所得的基因工程菌，及不含重组质粒的野生NRRL18099宿主菌(作为对照)分别进行发酵，方法同实施例1步骤(5)。

效果实施例1

工程菌发酵产物分析：含实施例1-2及对比实施例1中获得的6种重组质粒的NRRL18099基因工程菌，及不含重组质粒的野生NRRL 18099宿主菌，分别经发酵以后，经HPLC分析A82846各种类似物的含量。HPLC分析方法简述如下：对发酵液进行预处理：取发酵液1mL，加入2倍体积的甲醇，涡旋震荡混匀，超声30min，离心(4000×g)10min，将所得的上清液用HPLC法测定。色谱条件为：色谱柱ZORBAX SB-C8柱(4.6×150mm，3.5μm)；流动相1％磷酸二氢铵溶液(A)：乙腈(B)，梯度洗脱，0→25min，A：B＝95：5→50:50；流速1.0mL/min；检测波长225nm；柱温30℃；进样量10μL。结果如下表5所示：

表5.基因工程菌发酵产物

从以上实施例可得出结论：导入自身来源的卤化酶基因chaA和万古霉素卤化酶基因vcm8对产物影响最显著，杂质的比例显著降低，或目的产物A82846B的产量显著提高。其中，导入自身来源的卤化酶基因chaA的菌株A82846B的产量占总产量54.50％，增加到野生菌株(27.12％)的2.01倍。导入万古霉素卤化酶基因vcm8的菌株A82846B的产量占总产量37.78％，增加到野生菌株产量的1.39倍。此外，并不是所有的外源卤化酶的导入都会造成A82846B的产量提高，或A82846B的产量在总产物中所占的比例增加。对比实施例中，来自于丰加链霉菌(Streptomyces toyocaensis)的bu52基因，其导入造成A82846B的产量下降到606mg/L，且其在总产物中的比例下降到22.63％，由此可见，并非任何卤化酶基因导入到宿主菌中，都能造成A82846B产量的提高，在宿主菌中导入chaA、vcm8、bhaA、thaA及halI等卤化酶基因，其造成A82846B产量的提高，或副产物A82846A和A82846C的降低的效果非常显著。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海医药工业研究院

中国医药工业研究总院

<120> 一种生产A82846B的基因工程菌及其制备方法和应用

<130> P1710199C

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> Amycolatopsis orientalis

<220>

<223> 基因chaA

<400> 1

atgtcggtcg aagacttcga tgtggttgtt gctggtggcg ggcctgccgg ttcgaccgtg 60

gccaccttgg tggcgatgca ggggcatcgg gtgctgttgc tggagaaaga ggtctttccc 120

cggtaccaga tcggtgagtc gctgctgcct gccacggtgc acggggtgtg ccggatgctc 180

ggcatcacgg acgagctggc caatgccggg ttcccggtga agcggggcgg cactttccgc 240

tggggtgcgc gtccggagcc gtggacgttc cacttcggta tctccgccaa gatggcgggc 300

tcgacgtcgc acgcctatca ggtcgagcgg gcgcggttcg acgagatctt gctgaacaac 360

gccaagcgca agggcgtggt cgtgcgggaa gggtccccgg tcaccgatgt ggtggaagac 420

ggtgagcggg tcaccggtct gcggtacacc gacgccgatg gcaacgagcg tgaagtgtca 480

gcgcgcttcg tgatcgacgc gtcgggcaac aagagccgcc tctactccaa ggtcggcggt 540

tcgcggaact actcggagtt cttccgcagc ctcgcgctgt tcggctactt cgagggtggc 600

aagcggctgc ccgcgccggt ctcgggaaac atcctgagcg ttgccttcga cagcggctgg 660

ttctggtaca tcccgctgag cgacacgctg accagcgtcg gcgcggtggt gcgccgggag 720

gacgccgaga agatccaggg tgaccgggag aaggcgctca acgccctgat cgccgagtgc 780

ccgctgatct cggagtacct cgcgaacgcg accagggtga cgaccggcaa gtacggggag 840

ttacgcgtcc gcaaggacta ctcctaccag caggagacct actggcggcc ggggatgatc 900

ctgatcggcg acgccgcgtg cttcgtggac ccggtgttct cgtccggtgt gcacctggcg 960

acctacagcg cgctgctcgc ggcccggtca atcaacagcg tcctggcggg cgatctggac 1020

gagaagaccg cactgaacga gttcgaaatg cggtatcgcc gcgagtacgg ggtgttctac 1080

gagttcctcg tgtcgttcta tcagatgaac gtgaatgagg agtcgtattt ctggcaggcc 1140

aagaaggtca cgcagaacca gagcaccgat atcgagtcgt tcgtcgaact gatcggtggg 1200

gtgtcgtccg gtgagaccgc gctgacggcc gctgaccgga tcgccgcgcg cagtgccgaa 1260

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ctcggcgagg acgccgaacc cgagctgccg ctgttccccg gcggcctggt gacctcgccc 1440

gacggaatga aatggctgcc gcaccatccg gcatga 1476

<210> 2

<211> 1476

<212> DNA

<213> Amycolatopsis orientalis

<220>

<223> 基因vcm8

<400> 2

atgtcggtcg aagatttcga tgtggtggtt gccggtggcg ggccgggtgg ttcgaccgtg 60

gccacactgg tcgcgatgca gggccatcgg gtgctgttgc tggagaagga ggtctttccc 120

cggtaccaga tcggtgaatc gctgctgccc gccacggtgc acggcgtgtg ccggatgctc 180

ggcgtcgccg acgagctggc gggggcgggg ttcccgatca agcggggcgg cacgttccgc 240

tggggtgccc ggccggagcc gtggacattc cacttcggca tctccgccaa gatggccggc 300

tcgacgtcgc acgcctacca ggtcgagcgg gcgcggttcg acgagatcct gctgaacaac 360

gccaaaagca agggcgtcgt cgtgcgggaa ggctgctctg tccacgatgt ggtggaagac 420

ggtgagcggg tcaccggcgc gaagtacacc gaccccgacg gcaacgagcg tgaggtgtcg 480

gcgcgtttcg tgatcgacgc gtcgggcaac aagagccgcc tctattccaa ggtcggcggt 540

tcacggaact actcggagtt cttccgcagc ctcgcgttgt tcggctactt cgagggcggc 600

aagcggctgc cggagccggt gtcggggaac atcctgagcg tggccttcga caacggctgg 660

ttctggtaca tcccgttgag cgacacgctc accagtgtcg gcgcggtggt gcgccgggag 720

gacgccgaca agatccaggg tgaccgcgag aaggccctca acgccttgat cgccgaatgc 780

ccgctgatct cggaatacct ctcgaacgcg accagggtga cgaccggcaa gtacggggaa 840

ctgcgtgtcc gcaaggacta ttcgtaccag caggagacct actggcggcc gggcatggtc 900

ctggtcggcg acgccgcgtg cttcgtggac ccggtgttct cctccggggt gcacctggcg 960

acctacagcg cgctgctcgc ggcccggtcg atcaacagcg tcctcgccgg cgatctcgac 1020

gagaagaccg cgctgaacga gttcgaagcg cggtatcgcc gggaatacgg cgtcttctac 1080

gaattcctcg tttccttcta tcagatgaac gtcaacgagg agtcgtactt ctggcaggcc 1140

aagaaggtca cccagaacca gagcaccgac atcgagtcgt tcgtcgaact gatcggcggg 1200

gtgtcctcgg gggagaccgc gctgacggcc gccgaccgga tcgccgcgcg cagtgccgaa 1260

ttcgccgccg cggtggacga gatggccggt ggcgacgggg acaacatggt gccgatgttc 1320

aagtcgacgg tcgtcaagca ggcgatgcag gaggcgggcc aggtccagat gaaggcgctg 1380

ctcggcgagg acgccgaacc cgagctgccg ctgttccccg gcggactggt gacttcgccc 1440

gacggcatga agtggctgcc gcaccacccg gcctga 1476

<210> 3

<211> 1476

<212> DNA

<213> Amycolatopsis mediterranei

<220>

<223> 基因bhaA

<400> 3

atgtcggtcg aagacttcga cgtggtggtg gcgggcggcg ggccgggtgg ttcgacggtg 60

gccacgctgg tggccatgca gggacaccgg gtgctgctgc tggagaaaga ggttttcccg 120

cggtatcaga tcggtgagtc gctgctgccc gccacggtgc acggcgtgtg ccggatgctc 180

ggcatctccg acgagctggc caatgccggg ttcccgatca agcgcggcgg cacgttccgc 240

tggggcgccc ggccggagcc gtggacgttc cacttcggca tctcggccaa gatggccggc 300

tcgacgtcgc acgcctacca ggtcgagcgg gcgcggttcg acgagatgct gctgaacaac 360

gccaagcgca agggcgtggt cgtgcgggag gggtgcgcgg tcaccgatgt ggtggaagac 420

ggcgagcggg tcaccggtgc gcggtacacc gatcccgacg gcaccgagcg ggaagtgtcg 480

gcgcggttcg tgatcgacgc gtcgggcaac aagagccggc tctacaccaa ggtcggcggt 540

tcgcggaact attcggagtt cttccgcagc ctcgcgctgt tcggttactt cgagggtggc 600

aagcggctgc ccgagccggt ctccgggaac atcctgagtg tggccttcga cagcggctgg 660

ttctggtaca tcccgctgag cgacacgctg accagcgtcg gcgcggtggt gcgccgggag 720

gacgccgaga agatccaggg tgaccgggag aaggccctca acacgctgat cgccgagtgc 780

ccgctgatct cggaatacct cgcggacgcg acccgggtga cgaccggccg gtacggggaa 840

ctgcgcgtcc gcaaggacta ctcctaccag caggagacct actggcggcc gggcatgatc 900

ctggtcggcg acgccgcgtg tttcgtggac ccggtgttct cctccggtgt gcacctggcg 960

acctacagcg cgctgctcgc ggcccggtcg atcaacagcg tcctcgccgg cgacctggac 1020

gagaagaccg cgctgaacga gttcgagctg cggtatcgcc gtgagtacgg cgtgttctac 1080

gagttcctcg tgtccttcta ccagatgaac gtgaacgagg agtcgtactt ctggcaggcc 1140

aagaaggtca cgcagaacca gagcaccgac gtcgagtcgt tcgtcgagct gatcggcgga 1200

gtgtcgtccg gggagaccgc gctgacggcc gccgaccgca tcgccgcgcg cagtgccgag 1260

ttcgccgcgg cggtggacga gatggcgggc ggggacggcg acaacatggt gccgatgttc 1320

aagtcgacgg tggtccagca ggcgatgcag gaagcgggcc aggtgcagat gaaggcgctg 1380

ctcggcgagg acgccgaacc cgagctgccc ctgttccccg gtggcctggt gacctcgccc 1440

gaacggatga agtggctgcc tcaccaccct gcgtga 1476

<210> 4

<211> 1476

<212> DNA

<213> Actinoplanes teichomyceticus

<220>

<223> 基因thaA

<400> 4

atgccggtgg aagagttcga cgtggtggtg gccggtggcg ggccggccgg ttcgaccgtg 60

gccacgctgg tggccatgca gggccatcgg gtgctgctgc tggagaagga gaccttcccc 120

cggtaccaga tcggcgagtc gttgctgccc tccaccgtcc acggggtgtg ccggatgctc 180

ggcgtctcgg acgagctggc ggcagccggc ttccccgtca agcgcggcgg caccttccgc 240

tggggcgccc gcccggagcc gtggacgttc tccttcgccg tctcgcccct gatgaacggc 300

ccgacgtcgt tcgcgtacca ggtcgaacgg gcgcgcttcg acgagatcct gctgcgtaac 360

gcgcagcgca agggcgtcga cgtgcgcgag ggatgctcgg tcaccggggt gatcgaaggc 420

gacgagcgga tcaccggggt gcgttacacc gaccccgacg gcggcgagca cgaggtgtcg 480

gcgcggttcg tggtcgacgc gtcgggcaac aagagccggc tgtactccca ggtcggcggc 540

gtccgcaact attcggagtt cttccgcagc ctggcgctgt tcggttactt cgagaacggc 600

aagcggctgc cggagccgta ctcgggcaac atcctgagcg tcgcgttcga cagcggctgg 660

ttctggtaca tcccgctgag cgacacgatg accagcgtcg gcgcggtggt gcgccgggag 720

atggcggaga agatccaggg cgaccgggag aaggcgctcc aggccctgat cgccgaatgc 780

ccgctgatct ccgactacct cgccgacgcg cgccggatca ccaccggccg gtacggagaa 840

ctgcgggtcc gcaaggacta ctcgtatcac cagaccagct actggcggcc cgggatgatc 900

ctggtcgggg acgccgcgtg cttcgtggac ccggtgttct cctcgggcgt gcacctggcg 960

acctacagcg cgctgctggc ggcgcggtcg atcaacagcg tgctcgccga ggacctggac 1020

gagaagaccg cgctgagtga gttcgaggcc cgctaccgcc gcgagtacgg ggtgttctac 1080

gagttcctgg tgtccttcta ccagatgaac gtcaacgagg agtcgtactt ctggcaggcc 1140

aagaaggtca ccaacaacaa gcacaccgag atcgagtcgt tcgtggagct gatcggcggg 1200

gtgtcgtcgg gtgaggcggc gctggccacg gccggccgga tcgccgagcg cagcgccgag 1260

ttcgccgcgg ccgtggacca gatggccgcc agcgccgacg gcaacatggt gccgatgtac 1320

aagtcggaag tggtcaagca ggtgatgcag gagggcggcc aggtgcagat gaaggcggtg 1380

ctcggcgcgg acgccgagcc cgagctgccg ctgttccccg gcgggctggt ggtctcgccc 1440

gacgggatga agtggctgcc ctaccgtccc gcctga 1476

<210> 5

<211> 1470

<212> DNA

<213> Actinoplanes sp. ATCC53553

<220>

<223> 基因halI

<400> 5

gtggaagagt tcgatgtggt ggtggccggt ggcgggccgg ccggttcgac ggtggcttcc 60

ctggtggcca tgcagggtca tcgggtgttg ctgctggaga aggaggtctt tccccggtac 120

cagatcggcg agtcgttgct gccctccacc gtccacgggg tgtgccggat gctcggcgtc 180

accgaagaac tggcggaggc cggtttcccg acgaagcggg gtggcacctt ccgctggggt 240

gcgcgcccgg agccgtggac gttctccttc gctgtttcgt cccggatgac cggcccgacg 300

tcgttcgcgt accaggtcga gcgggcgcgt ttcgatgaga tcctgctgcg taacgcgcag 360

cgcaagggtg tcgaggtgcg tgagggctgc tcggtcgccg gtgtgatcga aggggacgag 420

cgggtcgccg gcctgcgcta caccgactcc gacggcggtg agcacgaggt gcgtgcgcgc 480

ttcgtggtcg atgcgtcggg caacaagagc cggctgtatt ccagtgtcgg cgggacccgg 540

aactactcgg agttcttccg cagcctggcg cttttcggct acttcgagaa cggcaagcgg 600

ctgccggcgc cgaactcggg caacatcctc agcgtggcct tcgacagtgg ctggttctgg 660

tacatcccgc tgagcgacac gatgaccagc gtcggcgcgg tggtgcgccg ggagatggcg 720

gagaagatcc agggcgaccg ggagaaggcg ctccaggctc tgatcgccga atgcccgctg 780

atctccgagt atctgcagga tgcccgccgg atcaccaccg gcaggtacgg ggagctgcgg 840

gtccgcaagg actactccta tctccagacg agcttctggc ggcccgggat gattctggtc 900

ggcgatgccg cgtgcttcgt ggatccggtc ttctcctcgg gcgtgcatct ggcgacctac 960

agtgcgttgc tcgccgcgcg ttcgatcaac agcgtcctcg cggacgacct ggatgagaag 1020

accgcgctga ccgagttcga ggcgcggtac cgccgcgagt acggggtgtt ctacgagttc 1080

ctcgtctcgt tctacgagat gaacgtgaac gaggagtcgt acttctggca ggcgaagaag 1140

gtcaccaaga acaagcgcac ggagctggag tcgttcgtgg aactgatcgg cggagtgtcg 1200

tccggcgagg cggcgctgac cacgtccggc aggatcaccg agcgcagcgc cgagttcgcc 1260

gcggccgtgg atcagatggc ttccagcgac gacggcaaca tggtgccgat gttcaagtcg 1320

caggtggtca agcaggtcat gcaggagggc ggtcaggtgc agatgaaggc cgtgctcggc 1380

gaggacgccg agcccgaact gccgctcttc cccggcggcc tggtggcctc acccgacggg 1440

atgaaatggc tgccctacca tcccgcgtga 1470

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物chaA-F

<400> 6

catatgatgt cggtcgaaga cttcgatgtg g 31

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物chaA-R

<400> 7

ggcgcgccta tttcgtagat ccttcga 27

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Amp-F

<400> 8

gtgcaatacg aatggcgaaa agcc 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Amp-R

<400> 9

tcagccaatc gactggcgag c 21

<210> 10

<211> 365

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 终止子序列

<400> 10

gcgccaaagt tttgtcgtct ttccagacgt tagtaaatga attttctgta tgaggttttg 60

ctaaacaact ttcaacagtt tcagcggagt gagaatagaa aggaacaact aaaggaattg 120

cgaataataa ttttttcacg ttgaaaatct ccaaaaaaaa aggctccaaa aggagccttt 180

aattgtatcg gtttatcagc ttgctttcga ggtgaatttc ttaaacagct tgataccgat 240

agttgcgccg acaatgacaa caaccatcgc ccacgcataa ccgatatatt cggtcgctga 300

ggcttgcagg gagtcaaagg ccgcttttgc gggatctcgt cgaaggcggc gggggcgccg 360

gacgc 365

<210> 11

<211> 1470

<212> DNA

<213> Streptomyces toyocaensis

<220>

<223> 基因bu52

<400> 11

atgtcggtgg aaacgttcga cgttgtggtg gcgggaggcg gaccgggggg ttcgaccgtg 60

gccgccctgg tcgccatgca gggccaccga gtgctgctgc tggagaaaga ggtattcccg 120

cggtatcaga taggcgagtc attacttccg tccacggttc acggggtgtg ccggctgctg 180

ggtgtcaccg atgaactcgc ggcggctaaa ttcccggtga agcgcggcgg tactttccgc 240

tggggtgcca ggccggaacc gtggacgttc tccttcgcgg tgtccccgcg gatgaccggg 300

ccgacctcgt tcgcctatca ggtggaacgg gcgcggttcg acgagatcct gctgaacaac 360

gccaagagca agggtgtgac ggtccgcgag ggatgctcgg tcaccgcggt ggtcgaggag 420

ggcgaccggg tcaccggcct gcggtacacc gactccgacg gcggtgagca cgaggtcggc 480

gcgcgtttcg tgatcgacgc gtcgggcaac aagagccggc tgcacgccag cgtcggtggt 540

actcgcgaat actcggagtt cttccgcagc ctggccctgt tcggctattt cgagaacggc 600

aaacggcttc cggagcccta ttcgggcaat attctgagcg tcgccttcga cagcggctgg 660

ttctggtaca ttccgctgag cgacacgctc accagcgtgg gcgtggtggt ccgccgcgaa 720

atggccgaaa agatccaggg cgaccgggaa aaggcctaca acgccctgat cgccgaatgt 780

ccgctgatcg cggagtatct gtcggacgcg cgtcgggtga cgaccgggaa ttacggggaa 840

ctgcgggtac gcaaagacta ttcctaccac cagacgaagt tctggcgccc gggaatgatt 900

ctcgtgggcg acgccgcgtg tttcgtcgac ccggtgttct cctccggcgt gcatctggcg 960

acctacagcg ccctgctggc cgcccgttcg atcaacagcg tgctcgcggg cgacctggac 1020

gagaagaccg ccttcgacga gttcgagggc cggtaccgtc gggaatacgg ggtcttctac 1080

gagttcctcg tgtcgttcta ccagatgaac gtgaacgagg aatcgtattt ctggcacgcc 1140

aagaaggtca cgaacaacga gcacacggag ttcgagtcct tcgtggacct ggtcggcggg 1200

gtggcgtccg gcgagacggc gctcgcggcg tccaggctcg ccgagcgcag cgccgagttc 1260

gccggcgccg tcgaccagat ggcgggcggt gacgacgggg acatggtgcc gctgttcaag 1320

tcgcacgtgg tcaagcaggt gatgcaggag ggcggccagg tccagatgaa ggcggtcctc 1380

ggcgaggacg ccgcaccgga ggagcctgtc ttccctggcg ggctggtgtc ctcgcccgac 1440

gggatgaagt ggcttcccta ccgtggatga 1470

<210> 12

<211> 7385

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 质粒permE152

<400> 12

atctacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca 60

gctctcgcag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt 120

cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttg atcggcactt 180

tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggaattta tgcggtgtga 240

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 300

gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 360

agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 420

ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgg gctgcaggtc gactctagag gtaccagccc 480

gacccgagca cgcgccggca cgcctggtcg atgtcggacc ggagttcgag gtacgcggct 540

tgcaggtcca ggaaggggac gtccatgcga gtgtccgttc gagtggcggc ttgcgcccga 600

tgctagtcgc ggttgatcgg cgatcgcagg tgcacgcggt cgatcttgac ggctggcgag 660

aggtgcgggg aggatctgac cgacgcggtc cacacgtggc accgcgatgc tgttgtgggc 720

acaatcgtgc cggttggtag gatctgcagc cacagaacca ctccacagga ggacccatat 780

gaagctgatc accgtgctcg gtgcgtcggg cttcatcggc tcggctgtca cgcgtgcact 840

ggcgcagcag ccaatccggc tgcgagcggt ggcgcgcagg cagttcacgc ccgcgcccgg 900

cctggccgag acgaccgtcg tcgccgctga tctcaccgac cgtgtcgcgc tcgccgacgc 960

ggtcgcggga tcggacgcgg tcgtgtacct gctgctgtcc gacggcggat ggcgcgcggt 1020

cgagaccgag gacgccgaac gcgtgaacgt gggcgtcatg cgggacctca tcgacgtcac 1080

cggcagcgac aacgggacgc ccccggtggt ggtgttcggc ggtaccgtct cgcaggtcgg 1140

tgtgccaccg cgggagccgc tcgacggcag cgagcccgac aacccggcga ctccctacga 1200

catccagaag ctgacagcgg aacagatcct caagaccgcc acggcaaacg gccaggtgcg 1260

cggcatcagc ctgcgtctgc cgacgatatt cggtgaaacc acggcacacg gcgcgaacca 1320

cgaccgcggt gtcgtgtcgt ccatggcgcg gcgagcgctc gacggccagg cactcaccat 1380

ctggggcgac ggcagcgtgc gacgcgacgt cgtccatgtc gaggacgtcg cggcggcgtt 1440

caccgcggca ctggccaacc cggattccct tgtcggcggc cactggctga tcggcgcggg 1500

ccgaggcgat cagcttgggg agatcttccg cctcgtggca cgggaagtgg ccgagcagac 1560

cgggcagcgc ccggtcgagg tgacccgggt ggaaccaccg tcgcacgcac ctgagatgga 1620

tttccgcagc gtcaccatcg attcctcgcc gttccgggcg gtcaccggct ggcgcccaga 1680

gatttcgctg tccgacggag tgcgtcgcac cgtcgccgca ttcacgacct cagtccacgg 1740

aaaggctcgc gcatgaggcg cgccaaagtt ttgtcgtctt tccagacgtt agtaaatgaa 1800

ttttctgtat gaggttttgc taaacaactt tcaacagttt cagcggagtg agaatagaaa 1860

ggaacaacta aaggaattgc gaataataat tttttcacgt tgaaaatctc caaaaaaaaa 1920

ggctccaaaa ggagccttta attgtatcgg tttatcagct tgctttcgag gtgaatttct 1980

taaacagctt gataccgata gttgcgccga caatgacaac aaccatcgcc cacgcataac 2040

cgatatattc ggtcgctgag gcttgcaggg agtcaaaggc cgcttttgcg ggatctcgtc 2100

gaaggcggcg ggggcgccgg acgcggccgg gttcccgggg gatccgcggc cgcgcgcgat 2160

atcgaattcg taatcatgtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 2220

ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 2280

taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 2340

cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 2400

tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 2460

gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 2520

atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 2580

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 2640

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 2700

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 2760

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 2820

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 2880

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 2940

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 3000

aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 3060

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 3120

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 3180

atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 3240

atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttgg ttcatgtgca gctccatcag 3300

caaaagggga tgataagttt atcaccaccg actatttgca acagtgccgt tgatcgtgct 3360

atgatcgact gatgtcatca gcggtggagt gcaatgtcgt gcaatacgaa tggcgaaaag 3420

ccgagctcat cggtcagctt ctcaaccttg gggttacccc cggcggtgtg ctgctggtcc 3480

acagctcctt ccgtagcgtc cggcccctcg aagatgggcc acttggactg atcgaggccc 3540

tgcgtgctgc gctgggtccg ggagggacgc tcgtcatgcc ctcgtggtca ggtctggacg 3600

acgagccgtt cgatcctgcc acgtcgcccg ttacaccgga ccttggagtt gtctctgaca 3660

cattctggcg cctgccaaat gtaaagcgca gcgcccatcc atttgccttt gcggcagcgg 3720

ggccacaggc agagcagatc atctctgatc cattgcccct gccacctcac tcgcctgcaa 3780

gcccggtcgc ccgtgtccat gaactcgatg ggcaggtact tctcctcggc gtgggacacg 3840

atgccaacac gacgctgcat cttgccgagt tgatggcaaa ggttccctat ggggtgccga 3900

gacactgcac cattcttcag gatggcaagt tggtacgcgt cgattatctc gagaatgacc 3960

actgctgtga gcgctttgcc ttggcggaca ggtggctcaa ggagaagagc cttcagaagg 4020

aaggtccagt cggtcatgcc tttgctcggt tgatccgctc ccgcgacatt gtggcgacag 4080

ccctgggtca actgggccga gatccgttga tcttcctgca tccgccagag gcgggatgcg 4140

aagaatgcga tgccgctcgc cagtcgattg gctgagctca tgagcggaga acgagatgac 4200

gttggagggg caaggtcgcg ctgattgctg gggcaacacg tggagcggat cggggattgt 4260

ctttcttcag ctcgctgatg atatgctgac gctcaatgcc gtttggcctc cgactaacga 4320

aaatcccgca tttggacggc tgatccgatt ggcacggcgg acggcgaatg gcggagcaga 4380

cgctcgtccg ggggcaatga gatatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tatcgggccc 4440

tggccagcta gctagagtcg acctgcaggt ccccggggat cggtcttgcc ttgctcgtcg 4500

gtgatgtact tcaccagctc cgcgaagtcg ctcttcttga tggagcgcat ggggacgtgc 4560

ttggcaatca cgcgcacccc ccggccgttt tagcggctaa aaaagtcatg gctctgccct 4620

cgggcggacc acgcccatca tgaccttgcc aagctcgtcc tgcttctctt cgatcttcgc 4680

cagcagggcg aggatcgtgg catcaccgaa ccgcgccgtg cgcgggtcgt cggtgagcca 4740

gagtttcagc aggccgccca ggcggcccag gtcgccattg atgcgggcca gctcgcggac 4800

gtgctcatag tccacgacgc ccgtgatttt gtagccctgg ccgacggcca gcaggtaggc 4860

cgacaggctc atgccggccg ccgccgcctt ttcctcaatc gctcttcgtt cgtctggaag 4920

gcagtacacc ttgataggtg ggctgccctt cctggttggc ttggtttcat cagccatccg 4980

cttgccctca tctgttacgc cggcggtagc cggccagcct cgcagagcag gattcccgtt 5040

gagcaccgcc aggtgcgaat aagggacagt gaagaaggaa cacccgctcg cgggtgggcc 5100

tacttcacct atcctgcccg gctgacgccg ttggatacac caaggaaagt ctacacgaac 5160

cctttggcaa aatcctgtat atcgtgcgaa aaaggatgga tataccgaaa aaatcgctat 5220

aatgaccccg aagcagggtt atgcagcgga aaagatccgt cgacctgcag gcatgcaagc 5280

tctagcgatt ccagacgtcc cgaaggcgtg gcgcggcttc cccgtgccgg agcaatcgcc 5340

ctgggtgggt tacacgacgc ccctctatgg cccgtactga cggacacacc gaagccccgg 5400

cggcaaccct cagcggatgc cccggggctt cacgttttcc caggtcagaa gcggttttcg 5460

ggagtagtgc cccaactggg gtaacctttg agttctctca gttgggggcg tagggtcgcc 5520

gacatgacac aaggggttgt gaccggggtg gacacgtacg cgggtgctta cgaccgtcag 5580

tcgcgcgagc gcgagaattc gagcgcagca agcccagcga cacagcgtag cgccaacgaa 5640

gacaaggcgg ccgaccttca gcgcgaagtc gagcgcgacg ggggccggtt caggttcgtc 5700

gggcatttca gcgaagcgcc gggcacgtcg gcgttcggga cggcggagcg cccggagttc 5760

gaacgcatcc tgaacgaatg ccgcgccggg cggctcaaca tgatcattgt ctatgacgtg 5820

tcgcgcttct cgcgcctgaa ggtcatggac gcgattccga ttgtctcgga attgctcgcc 5880

ctgggcgtga cgattgtttc cactcaggaa ggcgtcttcc ggcagggaaa cgtcatggac 5940

ctgattcacc tgattatgcg gctcgacgcg tcgcacaaag aatcttcgct gaagtcggcg 6000

aagattctcg acacgaagaa ccttcagcgc gaattgggcg ggtacgtcgg cgggaaggcg 6060

ccttacggct tcgagcttgt ttcggagacg aaggagatca cgcgcaacgg ccgaatggtc 6120

aatgtcgtca tcaacaagct tgcgcactcg accactcccc ttaccggacc cttcgagttc 6180

gagcccgacg taatccggtg gtggtggcgt gagatcaaga cgcacaaaca ccttcccttc 6240

aagccgggca gtcaagccgc cattcacccg ggcagcatca cggggctttg taagcgcatg 6300

gacgctgacg ccgtgccgac ccggggcgag acgattggga agaagaccgc ttcaagcgcc 6360

tgggacccgg caaccgttat gcgaatcctt cgggacccgc gtattgcggg cttcgccgct 6420

gaggtgatct acaagaagaa gccggacggc acgccgacca cgaagattga gggttaccgc 6480

attcagcgcg acccgatcac gctccggccg gtcgagcttg attgcggacc gatcatcgag 6540

cccgctgagt ggtatgagct tcaggcgtgg ttggacggca gggggcgcgg caaggggctt 6600

tcccgggggc aagccattct gtccgccatg gacaagctgt actgcgagtg tggcgccgtc 6660

atgacttcga agcgcgggga agaatcgatc aaggactctt accgctgccg tcgccggaag 6720

gtggtcgacc cgtccgcacc tgggcagcac gaaggcacgt gcaacgtcag catggcggca 6780

ctcgacaagt tcgttgcgga acgcatcttc aacaagatca ggcacgccga aggcgacgaa 6840

gagacgttgg cgcttctgtg ggaagccgcc cgacgcttcg gcaagctcac tgaggcgcct 6900

gagaagagcg gcgaacgggc gaaccttgtt gcggagcgcg ccgacgccct gaacgccctt 6960

gaagagctgt acgaagaccg cgcggcaggc gcgtacgacg gacccgttgg caggaagcac 7020

ttccggaagc aacaggcagc gctgacgctc cggcagcaag gggcggaaga gcggcttgcc 7080

gaacttgaag ccgccgaagc cccgaagctt ccccttgacc aatggttccc cgaagacgcc 7140

gacgctgacc cgaccggccc taagtcgtgg tgggggcgcg cgtcagtaga cgacaagcgc 7200

gtgttcgtcg ggctcttcgt agacaagatc gttgtcacga agtcgactac gggcaggggg 7260

cagggaacgc ccatcgagaa gcgcgcttcg atcacgtggg cgaagccgcc gaccgacgac 7320

gacgaagacg acgcccagga cggcacggaa gacgtagcgg cgtagcgaga cacccgggaa 7380

gcctg 7385

<210> 13

<211> 5715

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 质粒pSET152

<400> 13

atctacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca 60

gctctcgcag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt 120

cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttg atcggcactt 180

tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggaattta tgcggtgtga 240

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 300

gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 360

agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 420

ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgg gctgcaggtc gactctagag gatccgcggc 480

cgcgcgcgat atcgaattcg taatcatgtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 540

gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 600

atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 660

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 720

tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 780

agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 840

aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 900

gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 960

tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 1020

cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 1080

ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 1140

cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 1200

atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 1260

agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 1320

gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 1380

gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 1440

tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 1500

agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 1560

gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttgg ttcatgtgca 1620

gctccatcag caaaagggga tgataagttt atcaccaccg actatttgca acagtgccgt 1680

tgatcgtgct atgatcgact gatgtcatca gcggtggagt gcaatgtcgt gcaatacgaa 1740

tggcgaaaag ccgagctcat cggtcagctt ctcaaccttg gggttacccc cggcggtgtg 1800

ctgctggtcc acagctcctt ccgtagcgtc cggcccctcg aagatgggcc acttggactg 1860

atcgaggccc tgcgtgctgc gctgggtccg ggagggacgc tcgtcatgcc ctcgtggtca 1920

ggtctggacg acgagccgtt cgatcctgcc acgtcgcccg ttacaccgga ccttggagtt 1980

gtctctgaca cattctggcg cctgccaaat gtaaagcgca gcgcccatcc atttgccttt 2040

gcggcagcgg ggccacaggc agagcagatc atctctgatc cattgcccct gccacctcac 2100

tcgcctgcaa gcccggtcgc ccgtgtccat gaactcgatg ggcaggtact tctcctcggc 2160

gtgggacacg atgccaacac gacgctgcat cttgccgagt tgatggcaaa ggttccctat 2220

ggggtgccga gacactgcac cattcttcag gatggcaagt tggtacgcgt cgattatctc 2280

gagaatgacc actgctgtga gcgctttgcc ttggcggaca ggtggctcaa ggagaagagc 2340

cttcagaagg aaggtccagt cggtcatgcc tttgctcggt tgatccgctc ccgcgacatt 2400

gtggcgacag ccctgggtca actgggccga gatccgttga tcttcctgca tccgccagag 2460

gcgggatgcg aagaatgcga tgccgctcgc cagtcgattg gctgagctca tgagcggaga 2520

acgagatgac gttggagggg caaggtcgcg ctgattgctg gggcaacacg tggagcggat 2580

cggggattgt ctttcttcag ctcgctgatg atatgctgac gctcaatgcc gtttggcctc 2640

cgactaacga aaatcccgca tttggacggc tgatccgatt ggcacggcgg acggcgaatg 2700

gcggagcaga cgctcgtccg ggggcaatga gatatgaaaa agcctgaact caccgcgacg 2760

tatcgggccc tggccagcta gctagagtcg acctgcaggt ccccggggat cggtcttgcc 2820

ttgctcgtcg gtgatgtact tcaccagctc cgcgaagtcg ctcttcttga tggagcgcat 2880

ggggacgtgc ttggcaatca cgcgcacccc ccggccgttt tagcggctaa aaaagtcatg 2940

gctctgccct cgggcggacc acgcccatca tgaccttgcc aagctcgtcc tgcttctctt 3000

cgatcttcgc cagcagggcg aggatcgtgg catcaccgaa ccgcgccgtg cgcgggtcgt 3060

cggtgagcca gagtttcagc aggccgccca ggcggcccag gtcgccattg atgcgggcca 3120

gctcgcggac gtgctcatag tccacgacgc ccgtgatttt gtagccctgg ccgacggcca 3180

gcaggtaggc cgacaggctc atgccggccg ccgccgcctt ttcctcaatc gctcttcgtt 3240

cgtctggaag gcagtacacc ttgataggtg ggctgccctt cctggttggc ttggtttcat 3300

cagccatccg cttgccctca tctgttacgc cggcggtagc cggccagcct cgcagagcag 3360

gattcccgtt gagcaccgcc aggtgcgaat aagggacagt gaagaaggaa cacccgctcg 3420

cgggtgggcc tacttcacct atcctgcccg gctgacgccg ttggatacac caaggaaagt 3480

ctacacgaac cctttggcaa aatcctgtat atcgtgcgaa aaaggatgga tataccgaaa 3540

aaatcgctat aatgaccccg aagcagggtt atgcagcgga aaagatccgt cgacctgcag 3600

gcatgcaagc tctagcgatt ccagacgtcc cgaaggcgtg gcgcggcttc cccgtgccgg 3660

agcaatcgcc ctgggtgggt tacacgacgc ccctctatgg cccgtactga cggacacacc 3720

gaagccccgg cggcaaccct cagcggatgc cccggggctt cacgttttcc caggtcagaa 3780

gcggttttcg ggagtagtgc cccaactggg gtaacctttg agttctctca gttgggggcg 3840

tagggtcgcc gacatgacac aaggggttgt gaccggggtg gacacgtacg cgggtgctta 3900

cgaccgtcag tcgcgcgagc gcgagaattc gagcgcagca agcccagcga cacagcgtag 3960

cgccaacgaa gacaaggcgg ccgaccttca gcgcgaagtc gagcgcgacg ggggccggtt 4020

caggttcgtc gggcatttca gcgaagcgcc gggcacgtcg gcgttcggga cggcggagcg 4080

cccggagttc gaacgcatcc tgaacgaatg ccgcgccggg cggctcaaca tgatcattgt 4140

ctatgacgtg tcgcgcttct cgcgcctgaa ggtcatggac gcgattccga ttgtctcgga 4200

attgctcgcc ctgggcgtga cgattgtttc cactcaggaa ggcgtcttcc ggcagggaaa 4260

cgtcatggac ctgattcacc tgattatgcg gctcgacgcg tcgcacaaag aatcttcgct 4320

gaagtcggcg aagattctcg acacgaagaa ccttcagcgc gaattgggcg ggtacgtcgg 4380

cgggaaggcg ccttacggct tcgagcttgt ttcggagacg aaggagatca cgcgcaacgg 4440

ccgaatggtc aatgtcgtca tcaacaagct tgcgcactcg accactcccc ttaccggacc 4500

cttcgagttc gagcccgacg taatccggtg gtggtggcgt gagatcaaga cgcacaaaca 4560

ccttcccttc aagccgggca gtcaagccgc cattcacccg ggcagcatca cggggctttg 4620

taagcgcatg gacgctgacg ccgtgccgac ccggggcgag acgattggga agaagaccgc 4680

ttcaagcgcc tgggacccgg caaccgttat gcgaatcctt cgggacccgc gtattgcggg 4740

cttcgccgct gaggtgatct acaagaagaa gccggacggc acgccgacca cgaagattga 4800

gggttaccgc attcagcgcg acccgatcac gctccggccg gtcgagcttg attgcggacc 4860

gatcatcgag cccgctgagt ggtatgagct tcaggcgtgg ttggacggca gggggcgcgg 4920

caaggggctt tcccgggggc aagccattct gtccgccatg gacaagctgt actgcgagtg 4980

tggcgccgtc atgacttcga agcgcgggga agaatcgatc aaggactctt accgctgccg 5040

tcgccggaag gtggtcgacc cgtccgcacc tgggcagcac gaaggcacgt gcaacgtcag 5100

catggcggca ctcgacaagt tcgttgcgga acgcatcttc aacaagatca ggcacgccga 5160

aggcgacgaa gagacgttgg cgcttctgtg ggaagccgcc cgacgcttcg gcaagctcac 5220

tgaggcgcct gagaagagcg gcgaacgggc gaaccttgtt gcggagcgcg ccgacgccct 5280

gaacgccctt gaagagctgt acgaagaccg cgcggcaggc gcgtacgacg gacccgttgg 5340

caggaagcac ttccggaagc aacaggcagc gctgacgctc cggcagcaag gggcggaaga 5400

gcggcttgcc gaacttgaag ccgccgaagc cccgaagctt ccccttgacc aatggttccc 5460

cgaagacgcc gacgctgacc cgaccggccc taagtcgtgg tgggggcgcg cgtcagtaga 5520

cgacaagcgc gtgttcgtcg ggctcttcgt agacaagatc gttgtcacga agtcgactac 5580

gggcaggggg cagggaacgc ccatcgagaa gcgcgcttcg atcacgtggg cgaagccgcc 5640

gaccgacgac gacgaagacg acgcccagga cggcacggaa gacgtagcgg cgtagcgaga 5700

cacccgggaa gcctg 5715

Claims (10)

1.一种生产A82846B的基因工程菌，其特征在于，其是在生产A82846B的出发菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的基因组中整合了内源卤化酶基因chaA，或者与所述内源卤化酶基因chaA同源性不小于84％且来源于糖肽类抗生素生产菌的外源卤化酶基因的工程菌。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述外源卤化酶基因来源于放线菌纲(Actinobacteria)。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的放线菌纲为拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)或游动放线菌属(Actinoplanes)。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述拟无枝酸菌属是东方拟无枝酸菌或地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)；和/或，所述的游动放线菌属是替考游动放线菌(Actinoplanes teichomyceticus)或游动放线菌(Actinoplanes sp.)。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述外源卤化酶基因是来源于东方拟无枝菌的vcm8、地中海拟无枝酸菌的bhaA、替考游动放线菌的thaA或游动放线菌的halI基因。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述的卤化酶基因chaA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，vcm8的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，bhaA的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，thaA的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，halI的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

7.如权利要求1-6任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述生产A82846B的出发菌为东方拟无枝酸菌NRRL18099天然菌株。

8.一种如权利要求1-7任一项所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下列步骤：

1)PCR扩增或人工合成chaA、vcm8、bhaA、thaA或halI卤化酶全基因；

2)构建chaA、vcm8、bhaA、thaA或halI的重组质粒；

3)将构建的重组质粒转化到中间宿主菌；

4)将带有重组质粒的中间宿主菌和生产A82846B的出发菌进行接合培养。

9.如权利要求8所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述重组质粒的骨架为permE152质粒或pSET152；优选地，所述的中间宿主菌为大肠杆菌ET12567/pUZ8002；优选地，所述的接合培养为在MS琼脂培养基培养，温度为28℃。

10.一种A82846B的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求1-7任一项所述的基因工程菌发酵，从发酵液中获得A82846B。