CN100441681C - 生产维生素b6的重组微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了能够生产维生素B6的重组微生物，该微生物含有额外的编码选自下列的酶的组合的基因：i)赤藓糖4-磷酸酯脱氢酶和1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶；ii)赤藓糖4-磷酸酯脱氢酶和吡哆醇5’-磷酸酯合酶；以及iii)赤藓糖4-磷酸酯脱氢酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶和吡哆醇5’-磷酸酯合酶。
Description
本发明涉及重组微生物以及利用该微生物生产维生素B6的方法。
本发明中所述的“维生素B6”包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。维生素B6是人类或其它动物不可缺少的维生素，可用作药物的原材料或食品添加剂。
本发明提供生产维生素B6的重组微生物，其含有克隆的基因，能够过量表达维生素B6生物合成途径中所涉及的酶。
合适的微生物的例子包括埃希氏杆菌属的成员，其能够过量生产维生素B6，例如大肠杆菌AT1024或WG497。
本发明还提供通过培养所述重组微生物使得肉汤培养基中积聚倍数增加的维生素B6从而有效生产维生素B6，以及从肉汤培养基中分离维生素B6的方法。
本发明还提供生产维生素B6的方法，其包括在合适的培养基中培养重组微生物，该重组微生物表达编码维生素B6生物合成途径中相关酶的所克隆基因，以及从肉汤培养基中分离维生素B6。
优选的重组微生物含有编码选自下列的酶或酶的组合的额外核苷酸
i)赤藓糖4-磷酸酯脱氢酶(E4P脱氢酶)，
ii)E4P脱氢酶和1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXP合酶)
iii)E4P脱氢酶和吡哆醇5’-磷酸酯合酶(PNP合酶)，以及
iv)E4P脱氢酶、DXP合酶和PNP合酶。
在大肠杆菌的维生素B6生物合成过程中，PNP(吡哆醇5’-磷酸酯(pyridoxol 5’-phosphate))通过两种中间产物4PHT(4-磷酸羟基-L-苏氨酸)和DXP(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸酯)在4PHT脱氢酶与PNP合酶的催化下缩合而从头合成。4PHT通过起始于E4P(赤藓糖4-磷酸酯(erythrose 4-phosphate)的三步反应途径合成：E4P脱氢酶催化的E4P脱氢反应；4-磷酸-赤藓糖酯(4-phospho-erythronate)脱氢酶催化的4-磷酸-赤藓糖酯脱氢反应；以及磷酸丝氨酸氨基转移酶催化的3-羟基-4-磷酸羟基-α-酮基丁酸酯的氨基化反应。DXP通过甘油醛3-磷酸和丙酮酸酯在DXP合酶的催化下缩合合成。
在这些途径中，任何一步都可能成为瓶颈。在维生素B6的工业生产过程中，可以通过如克服所述瓶颈来增加维生素产生的数量。这可以通过如增加反应中酶的量来实现。本发明还涉及克隆和过表达编码宿主细胞中维生素B6途径所涉及酶的基因。要增加酶的量可以通过如在宿主细胞中引入可表达形式的目的基因如在宿主细胞中可复制的载体，以及额外地(i)增加目的基因的数量，如使用增加了拷贝数量的质粒，和/或(ii)增加转录，如使用启动子元件，和/或(iii)增加翻译比率，如通过使用共有核糖体结合位点。额外的(i)、(ii)和/或(iii)的组合也能够用于增加维生素B6生物合成途径中相关酶的量。
在本发明优选的实施例中，微生物中导入了一种以上维生素B6生物合成途径的基因。
通过已知的方法分离合适的基因。大肠杆菌K-12(ATCC 25404)的完整核苷酸序列是公知的[Battner et al.，Science 277：1453-1474(1997)]并且储存在数据库中。当克隆与维生素B6生物合成有关的大肠杆菌基因时，可以使用聚合酶链反应(PCR)方法。
PCR中，在基因的5’端，引物被设计为扩增包括起始密码子及其前面的核糖体结合位点在内的整个蛋白编码区域。在基因的3’端，中止蛋白合成的密码子也包括在扩增片段中，但是不包括任何转录中止信号。所有的引物均在每个引物的5’端增加特异性限制性内切酶的识别序列。
本发明中，增强编码维生素B6生物合成途径中相关酶的基因的表达是通过将相应的基因以可表达的形式导入宿主细胞来实现的。基因可以是染色体的(如通过同源重组或其它的机理整合到宿主细胞的染色体上)或非染色体的(如由质粒、粘粒、噬菌体或其类似物携带)。
基因能够通过质粒、粘粒、噬菌体或其它介导基因转入宿主细胞的载体导入宿主细胞。载体中可以存在选择性标记物以帮助识别已导入基因的宿主细胞。选择性标记物的例子为对于特定的抗生素，如四环素、氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或新霉素(分别为下述Tc、Ap、Cm、Km和Nm)具有抗性的基因。
一种将基因导入宿主细胞的方法是使用插入了基因的非染色体多拷贝质粒载体。质粒介导的基因导入宿主细胞过程包括先用限制性酶切质粒，而后连接质粒和基因。连接的重组质粒重新环化后，通过现有技术公知的方法如电穿孔、钙依赖性转化和接合转入宿主细胞中。适合将基因插入宿主细胞的质粒包括，但不限于，pBR322及其衍生物如Pkk223-3、pUC载体以及pACYC及其衍生物如pSTV29。此外，粘粒载体如pVK100也适合用于将基因插入宿主细胞中。
扩增的基因置于能够在宿主细胞中表达的载体中，并且根据现有技术转入生产维生素B6的微生物。在将另外的基因作为本发明的第二个基因转入微生物的时候，该基因可以置于与宿主细胞中已有质粒相容的其它载体中，并且转入已经含有第一个质粒的微生物中。
这样获得的微生物培养于含有可同化碳源、可消化氮源、无机盐以及其它微生物生长必需营养成分的培养基中。可用作碳源的是例如葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精或丙三醇。可用作氮源的是例如蛋白胨、豆粉、玉米浆、酵母提取液、肉浸汁、硫酸铵、硝酸铵或其混合物。可用作无机盐的是钙、镁、锌、锰、钴和铁的硫酸盐、盐酸盐或磷酸盐。还可以存在传统的营养素或防沫剂如动物油、植物油或矿物油。合适的培养基pH值范围为约5.0到约9.0，优选6.5到7.5。合适的培养温度范围为约10℃到40℃，优选34℃到37℃。合适的培养时间为约1天到7天，优选2天到3天。在培养过程中，通风并搅拌通常可以获得良好的效果。
肉汤培养基中产生维生素B6的量可以通过卡尔斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)ATCC 9080的比浊法进行测定。维生素B6衍生物如吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺可以分别通过高压液相色谱法进行定量(下述HPLC)。
从肉汤培养基中收集维生素B6可以通过如分离和移除细胞、离子交换树脂处理，冷冻浓缩结晶、薄膜分离以及其它公知技术的任意合适组合来实现。为了除去杂质，采用活性炭吸收和重结晶以进行纯化。
本发明通过以下几个实施例得到更加详细的说明。
一般方法
大肠杆菌AT1024可以免喷从CGSC获得，编号为4559。
在遗传学研究中，如非另外说明，大肠杆菌细胞株培养于由1％Bacto胰化蛋白胨(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)、0.5％Bacto酵母提取物(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)和0.5％NaCL组成的LB培养基中。根据细胞株所具有的抗性特征，如果需要，在培养基中加入Ap(100μg/ml)、Cm(100μg/ml)、Tc(10μg/ml)或其混合物。为此，将Ap溶解于水中，Tc溶解于50％的乙醇中，Cm溶解于乙醇中，溶液过滤灭菌后加入已高压灭菌的培养基中。将Bacto-琼脂(1.5％)加入LB培养基中制备琼脂平板。质粒DNA通过采用QIAGEN Midi试剂盒(QIAGEN GmbH，德国)或自动DNA分离系统PI-59(Kurabo Industry Ltd，日本)从大肠杆菌中分离。染色体DNA通过采用QIAGEN genomic-tips(QIAGEN GmbH，德国)从大肠杆菌K-12中分离。
根据产品说明书使用限制型酶、碱性磷酸酶、连接试剂盒(Takara Bio.Inc，Shiga，日本)、TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Japan K.K.，日本)以及KODDash(Toyobo Co.，Ltd.，日本)。在限制性酶切分析中，DNA片断在琼脂糖凝胶(1.0％)中分级并且通过采用商业可获得的系统QIAeXII(QIAGENGmbH，德国)的提取方法从凝胶中分离。使用ALF DNA测序仪(AmershamBiosciences Corp.，NJ，USA)测定DNA序列。
转化中，细胞在LB培养基(50ml于200ml烧杯)中以160rpm的转速37℃培养2.5-3小时。在光密度(600nm)为约0.4的时，将细胞旋转沉积并且加入十分之一体积的0.1M MgCl2。将细胞与0.1到100ng的DNA在4℃下培养30分钟，接着在37℃下培养1小时后，将其涂抹于含有合适抗生素的LB培养基上。
实施例1：构建重组质粒pKK-epd
使用改进的HF PCR试剂盒通过10pmol的两个引物，SEQ ID NO：1和2从100ng大肠杆菌K-12的染色体DNA中扩增epd基因。反应条件如下；保持94℃15秒后，25个94℃下15秒，68℃下3分钟的循环。扩增的1.0kb片断直接使用TOPO TA克隆试剂盒克隆到pCRII-TOPO载体中。该扩增区域的序列证实与编号NC_000913中的epd(3070692-3071711，互补链)的CDS区域相同。扩增区域的DNA用PstI酶切并且从琼脂糖凝胶中回收。该DNA连接到用PstI切开并且去磷酸化的pKK223-3表达载体(AmershamBiosciences Corp.，NJ，USA)。转化入大肠杆菌JM109活性细胞(Takara Bio.Inc，shiga，日本)后，生产转化的质粒并用限制性酶进行分析。获得了重组质粒pKK-epd，其中epd基因以与载体中tac启动子相同的方向插入pKK223-3的PstI位点。用QIAGEN Midi试剂盒从大肠杆菌JM109/pKK-epd制备质粒pKK-epd。
实施例2：构建重组质粒pKK-serC
扩增大肠杆菌K-12的serC基因，使用的方法除了采用两引物SEQ IDNO：3和4以外与实施例1所述相同。获得的1.1kb PCR产物插入到pCRII-TOPO中。该扩增区域的序列证实与编号NC_000913中的serC(956876-957964)的CDS区域相同。扩增区域的DNA插入到pKK223-3中产生pKK-serC，使用的方法除了酶切时用SmaI外与实施例1相同。用QIAGEN Midi试剂盒从大肠杆菌JM 109/pKK-serC制备质粒pKK-serC。
实施例3：构建重组质粒pKK-dxs
扩增大肠杆菌K-12的dxs基因，使用的方法除了采用两引物SEQ IDNO：5和6以外与实施例1所述相同。获得的1.9kb PCR产物插入到pCRII-TOPO中，该扩增区域的序列证实与编号NC_000913中的dxs(437539-439401，互补链)的CDS区域相同。扩增区域的DNA插入到pKK223-3中产生pKK-serC，使用的方法除了酶切时用EcoRI外与实施例1相同。用QIAGEN Midi试剂盒从大肠杆菌JM109/pKK-dxs制备质粒pKK-dxs。
实施例4：构建重组质粒pKK-pdxB
扩增大肠杆菌K-12的pdxB基因，使用的方法除了采用两引物SEQ IDNO：7和8以外与实施例1所述相同。反应条件如下；保持94℃15秒后，25个94℃下15秒，58℃下1分钟，72℃下1分钟的循环。获得的1.15kb PCR产物插入到pCRII-TOPO中。该扩增区域的序列证实与编号NC_000913中的pdxB(2434735-2435871，互补链)的CDS区域相同。扩增区域的DNA插入到pKK223-3中产生pKK-pdxB，使用的方法除了酶切时用EcoRI外与实施例1相同。用QIAGEN Midi试剂盒从大肠杆菌JM109/pKK-pdxB制备质粒pKK-pdxB。
实施例5：构建重组质粒pKK-pdxJ
扩增大肠杆菌K-12的pdxJ基因，使用的方法除了采用两引物SEQ IDNO：9和10以外与实施例4所述的程序相同。获得的0.75kb PCR产物插入到pCRII-TOPO中。该扩增区域的序列证实与编号NC_000913中的pdxJ(2699018-2699749，互补链)的CDS区域相同。扩增区域的DNA插入到pKK223-3中产生pKK-pdxJ，使用的方法除了酶切时用HindIII外与实施例1相同。用QIAGEN Midi试剂盒从大肠杆菌JM109/pKK-pdxJ制备质粒pKK-pdxJ。
实施例6：构建重组质粒pKK-pdxA
使用KOD Dash通过10pmol的两个引物，SEQ ID NO：11和12从100ng大肠杆菌K-12的染色体DNA中PCR扩增pdxA基因。反应条件如下；保持94℃1分钟后，30个94℃下30秒，48℃下2秒，74℃下30秒的循环。获得的1.0kb PCR产物插入到pCRII-TOPO中，该扩增区域的序列证实与编号NC_000913中的pdxA(52427-53416，互补链)的CDS区域相同。扩增区域的DNA用MunI和EcoRI双酶切并且从琼脂糖凝胶中回收。该DNA片断插入到pKK223-3中产生pKK-pdxA，使用的方法除了酶切时用EcoRI外与实施例1相同。用QIAGEN Midi试剂盒从大肠杆菌JM109/pKK-pdxA制备质粒pKK-pdxA。
实施例7：构建重组质粒pVK-pdxJ
用ScaI和SphI酶切实施例5中获得的质粒pKK-pdxJ。从琼脂糖凝胶中纯化获得的含有tac启动子和pdxJ的2kb片断。从大肠杆菌HB 101/pVK100中得到质粒pVK100，用BglII进行酶切，用钝化试剂盒进行末端钝化并且去磷酸化。将2kb片断连接到所获得得pVK100中。用该连接混合物转化大肠杆菌HB 101活性细胞(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)并且用限制性酶分析转化的质粒。获得重组质粒pVK-pdxJ，其中tac启动子和pdxJ基因以与抗性基因Km相同的方向插入pVK100的BglII位点。用QIAGEN Midi试剂盒从大肠杆菌HB101/pVK-pdxJ制备质粒pVK-pdxJ。
实施例8：构建重组质粒pVK-dxs
用BamHI酶切实施例3中获得的质粒pKK-dxs并且从琼脂糖凝胶中纯化获得的含有tac启动子和dxs的2.2kb片断。质粒pVK100用BglII进行酶切并且去磷酸化。如实施例7一样，将2.2kb片断连接到所获得的pVK100中产生pVK-dxs，其中tac启动子和dxs基因以与抗性基因Km相同的方向插入pVK100的BglII位点。用QIAGEN Midi试剂盒从大肠杆菌HB101/pVK-dxs制备质粒pVK-dxs。
实施例9：构建重组质粒pSTV-dxs
将实施例8中获得的2.2kb片断连接到用BamHI进行酶切并且去磷酸化的pSTV29(TaKaRa Bio Inc.，日本)中。如实施例7一样，获得重组质粒pSTV-dxs，其中tac启动子和dxs基因以与LacZ基因相同的方向插入pSTV29的BamHI位点。用QIAGEN Midi试剂盒从大肠杆菌HB101/pSTV-dxs制备质粒pSTV-dxs。
实施例10：制备含有重组质粒的微生物
将质粒pKK-epd、pKK-serC、pKK-dxs、pKK-pdxB、pKK-pdxJ和pKK-pdxA分别转化大肠杆菌AT1024制备大肠杆菌AT1024/pKK-epd、大肠杆菌AT1024/pKK-serC、大肠杆菌AT1024/pKK-dxs、大肠杆菌AT1024/pKK-pdxB、大肠杆菌AT1024/pKK-pdxJ和大肠杆菌AT1024/pKK-pdxA。将质粒pVK-dxs转化大肠杆菌AT1024/pKK-pdxJ制备大肠杆菌AT1024/pKK-pdxJ和pVK-dxs。将质粒pVK-pdxJ转化大肠杆菌AT1024/pKK-epd制备大肠杆菌AT1024/pKK-epd和pVK-pdxJ。将质粒pVK-dxs转化大肠杆菌AT1024/pKK-epd制备大肠杆菌AT1024/pKK-epd和pVK-dxs。将质粒pSTV-dxs转化大肠杆菌AT1024/pKK-epd和pVK-pdxJ制备大肠杆菌AT1024/pKK-epd、pVK-pdxJ和pSTV-dxs。每种重组细胞株按以下方法冻存。每种重组细胞株在含有合适抗生素的液体LB培养基中培养过夜。收集细胞，生理盐水漂洗，悬浮于灭菌的OD600＝5的15％丙三醇溶液中，-120℃冷藏室中保存。需要时，在使用前解冻该冻存物。
实施例11：重组大肠杆菌生产维生素B6
重组大肠杆菌细胞株采用如下方式培养。将实施例10中获得的每45μl冻存物接种到装有5ml含有合适抗生素的种子培养基[10g/L丙三醇，10g/LBacto胰化蛋白胨，5g/L Bacto酵母提取物，5g/LNaCl(pH值未调节)]的试管中。37℃下摇动试管16个小时后，每0.1ml培养物分装到装有50ml含有合适抗生素的PY30培养基(20g/L丙三醇，10g/L Bacto胰化蛋白胨，5g/L Bacto酵母提取物，5g/L NaCl，200mg/L的MgSO4·7H2O，10mg/L的FeSO4·7H2O，10mg/L的MnSO4·5H2O，pH6.8)的烧瓶中。37℃下以180rpm摇动烧瓶。培养31个小时后，如下述使用卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080的比浊法测定肉汤培养基的上清液中维生素B6的含量。肉汤培养基的上清液与吡哆醇氢氧化物的标准溶液(0-100mg每升)依次用蒸馏水稀释到2.09×10-4。将100μl稀释的溶液、1.5ml蒸馏水和40μl的1N H2SO4依序加入试管。120℃高压灭菌20分钟后，将已灭菌的1.5ml含有卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080 OD600＝0.028的维生素B6检验培养液(Nissui Seiyaku Co.，日本)加入试管。试管放置于呈30°的斜面并且在28℃下静止培养17个小时。通过加入5ml 0.2N的盐酸中止细胞的增长，而后用UV-2200分光光度计(shimadzu Co.Ltd.，日本)测量样品在660nm的吸光度。样品中维生素B6的含量可以通过比较样品的浊度与卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080的标准增长曲线得到。
表1显示重组大肠杆菌细胞株产生的维生素B6的浓度。在含有一个附加质粒的重组大肠杆菌细胞株中，仅有三株显示维生素B6的产量有所增加。即，含有pKK-epd质粒、pKK-pdxJ质粒和pKK-dxs质粒的重组细胞株分别获得了14.2mg/L、5.1mg/L和3.9mg/L的维生素B6；其为宿主大肠杆菌AT1024的维生素B6产量的7.1倍、2.55倍和1.95倍。此外，本发明中导入两个质粒pKK-epd和pVK-dxs或pKK-epd和pVK-pdxJ可以将维生素B6产量提高到49.2mg/L或57.9mg/L，但是导入pKK-pdxJ和pVK-dxs获得的维生素B6产量为5.4mg/L。换言之，在含有两个附加质粒的组合的重组大肠杆菌细胞株中，仅有含epd的组合显示明显增加了维生素B6的量，这表明了含有epd的组合的增效作用。此外，通过导入三个质粒，pKK-epd、pVK-pdxJ和pSTV-dxs到一个宿主细胞中，维生素B6的量进一步增加到78.5mg/L。其与宿主细胞株相比增长了39.3倍。
上述结果表明将epd、pdxJ和dxs导入同一个宿主细胞可以对大肠杆菌AT1024中维生素B6的生产产生协同作用。
表1
| 微生物 | 维生素B<sub>6</sub>(mg/L) | 增长倍数 |
| 大肠杆菌AT1024 | 2.0 | 1.0 |
| 大肠杆菌AT1024/pKK-serC | 1.3 | 0.65 |
| 大肠杆菌AT1024/pKK-pdxA | 1.5 | 0.75 |
| 大肠杆菌AT1024/pKK-pdxB | 2.0 | 1.0 |
| 大肠杆菌AT1024/pKK-dxs | 3.9 | 1.95 |
| 大肠杆菌AT1024/pKK-pdxJ | 5.1 | 2.55 |
| 大肠杆菌AT1024/pKK-epd | 14.2 | 7.1 |
| 大肠杆菌AT1024/pKK-pdxJ/pVK-dxs | 5.4 | 2.7 |
| 大肠杆菌AT1024/pKK-epd/pVK-pdxJ | 57.9 | 28.9 |
| 大肠杆菌AT1024/pKK-epd/pVK-dxs | 49.2 | 24.6 |
| 大肠杆菌 | 78.5 | 39.3 |
| AT1024/pKK-epd/pVK-pdxJ/pSTV-dxs |
实施例12：从肉汤培养基中分离维生素B6
在与实施例11所述相同的条件下培养大肠杆菌AT1024/pKK-epd，pVK-pdxJ和pSTV-dxs，从其肉汤培养基中回收产生的维生素B6。如下所述通过HPLC测定每个纯化步骤的吡哆醇及浓度。将50μl含有100mg/l 4’-脱氧吡哆醇氢氧化物的溶液作为中间物质加入到200μl吡哆醇氯化物标准溶液或样品中，而后根据如下所述分析该混合物。分析条件为：柱：Capcell pak C18SG120(4.6×250mm)(Shiseido Co.，Ltd.，Tokyo，日本)；流动相：0.1M高氯酸钠，0.1M磷酸钾和2％氰化甲烷(pH 3.5)；柱温度：25-26℃；流量：1.0ml/min；探测器：紫外辐射(下述UV)(292nm)。
将两升培养了31个小时含有78.7mg/L维生素B6的肉汤培养基以7500rpm离心10分钟。用1N盐酸将所获得的上清液的pH值调节到3.1，而后将上清液加入装有350mlAmberlite CG 120(H+形式，100-200孔，Rohm andHaas Company，Philadelphia，Pennsylvania，USA)的柱(5.5×15cm)中。该柱用500ml去离子水洗过后用5％的氢氧化铵洗脱。减压浓缩维生素B6部分。所获得的残余物用10ml去离子水溶解，将溶液加入装有380ml Dowex 1×4(OH-形式，200-400孔，Dow Chemical Co.，Ltd.，Midland Michigan，USA)的柱(5.5×16cm)中，而后用500ml去离子水洗涤。接着用0.1N HCL洗脱该柱。含有吡哆醇的级分减压浓缩为小体积。用少量热乙醇溶解固体残余后，溶液保持在4℃过夜。通过过滤收集所获得的沉淀物而后真空干燥得到128mg粗结晶。在乙醇中重结晶得到98mg熔点为160℃的白色晶体。产物的红外吸收、UV吸收和NMR光谱结果与确定的吡哆醇的相同。
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>扩增epd基因的引物2
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cctgcagacg ctgcttgcgt 20
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tcccgggagg ggaaatggct 20
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ccgaattcag gagtggagta gggattatg 29
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<223>扩增pdxA基因的引物2
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gaattctcat tgggtgttaa caat 24
Claims (2)
1、能够生产维生素B6的重组微生物，其中所述微生物含有额外的编码选自下列的酶的组合的基因：
i)赤藓糖4-磷酸酯脱氢酶和1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶；
ii )赤藓糖4-磷酸酯脱氢酶和吡哆醇5’-磷酸酯合酶；以及
iii)赤藓糖4-磷酸酯脱氢酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶和吡哆醇5’-磷酸酯合酶，其中所述微生物属于埃希氏杆菌属。
2、制备维生素B6的方法，其包括下列步骤：
i)在发酵肉汤培养基中培养权利要求1的重组微生物；并且
ii)从发酵肉汤培养基中分离所得的维生素B6。
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