CN110506118A - 用于控制基因表达的组合物和方法 - Google Patents

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CN110506118A CN201880021897.2A CN201880021897A CN110506118A CN 110506118 A CN110506118 A CN 110506118A CN 201880021897 A CN201880021897 A CN 201880021897A CN 110506118 A CN110506118 A CN 110506118A
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Abstract

本发明主要涉及组合物(包括构建体、载体，和细胞)以及用这种组合物控制基因表达的方法。更具体地，本发明涉及R基序序列和/或uORF序列在控制基因表达中的用途。

Description

用于控制基因表达的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年2月2日提交的美国临时专利申请US 62/453,807的权益，其出于所有目的通过引用整体并入。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的授权号为5R01 GM069594-11的政府资助下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。
关于序列表
本申请通过EFS-Web以电子方式提交，包括以txt格式提交的、电子提交的序列表。该txt文件包含2018年2月2日创建的名为“2018-02-02_5667-00424_ST25.txt”的序列表，大小为155,230字节。该txt文件中包含的序列表是说明书的一部分，在此通过引用整体并入本文。
背景技术
自农业问世以来，人类一直在尽力控制植物病害。通过对植物免疫机制的研究所获得的知识已经引起通过植物自身的防御基因(例如主免疫调节因子NPR1)的异位表达以工程(engineering)抗性作物的策略的发展。然而，增强的抗性通常与显著的健康度惩罚(fitness penalty)相关，使得该产品不适合农业应用。
为了满足世界人口爆炸造成的粮食生产需求，并同时希望限制农药对环境的污染，必须制定新的策略来控制作物病害。作为传统的化学控制和育种方法的替代方法，对植物免疫机制的研究使得通过植物自身的抗性赋予基因(resistance-conferring genes)的异位表达来工程抗性成为可能。植物中主动防御的第一线涉及通过宿主的模式识别受体(PRR)识别微生物相关分子模式(MAMP)或损伤相关分子模式(DAMP)，并且被称为模式触发的免疫(PTI)反应。已经显示，MAMP的PRR的异位表达、DAMP信号eATP，以及DAMP分子寡聚半乳糖醛酸苷的体内释放增强了转基因植物的抗性。除PRR介导的基础抗性外，植物基因组还编码数百种细胞内核苷酸结合和富含亮氨酸重复(NB-LRR)免疫受体(也称为“R蛋白”)，以检测在植物细胞内部传递的病原体特异性效应物的存在。已经将单个或堆叠的R基因转化到植物中以赋予效应子触发的免疫(ETI)。除PRR和R基因外，NPR1是另一种用于工程植物抗性的、特别受喜爱的基因。这是因为与由特定的病原体效应子激活的R蛋白不同，NPR1是由一种普遍(general)的植物免疫信号，水杨酸，诱导的广谱抗性的正调节因子(positiveregulator)。R蛋白仅在同一植物家族中起作用，而拟南芥NPR1(AtNPR1)的过表达则可增强多种植物家族(例如水稻、小麦、番茄，和棉花)对多种病原体的抗性。
然而，工程抗病性的主要挑战是克服相关的健康度成本。在没有专门的免疫细胞的情况下，植物的免疫诱导涉及从与生长相关的活动转变为防御。植物通常通过严格控制转录、mRNA核输出和防御蛋白的活性降解来避免自身免疫。目前，主要将转录控制用于工程抗病性。因此，本领域仍然需要新的组合物和方法，其允许更严格的病原体诱导性(pathogen-inducible)防御蛋白表达，从而可以使表达防御蛋白的相关健康度成本最小化。
发明内容
一方面，提供了DNA构建体。所述DNA构建体可包括异源启动子，所述异源启动子可操作地连接到编码RNA转录物的DNA多核苷酸，所述RNA转录物包括位于插入位点的5'端(5’to an insert site)的5'调节序列，其中所述5'调节序列包括R基序序列(R-motifsequence)。可选地，所述DNA构建体可以进一步包括编码表1中SEQ ID NO：1-38的任何一种uORF多肽的uORF多核苷酸或其变体。或者，DNA构建体可包括异源启动子，所述异源启动子可操作地连接到编码RNA转录物的DNA多核苷酸，所述RNA转录物包括位于插入位点的5'端的5'调节序列，其中所述5'调节序列包括编码表1中SEQ ID NO：1-38的任何一种uORF多肽的uORF多核苷酸或其变体。
在另一方面，提供了包括本文所述的任何构建体的载体、细胞，和植物。
在另一方面，提供了控制细胞中异源多肽表达的方法。该方法可包括将本文所述的任何一种构建体或载体引入细胞中。优选地，所述构建体和载体包括编码异源多肽的异源编码序列。
附图说明
图1A-1E示出了在elf18诱导的PTI期间的翻译活性。图1A：35S:uORFsTBF1-LUC报告基因的示意图。报告基因是TBF1外显子1(uORF1/2和N端的73个氨基酸的序列)与由CaMV35S启动子组成型表达的萤火虫荧光素酶基因(LUC)的融合；R：R基序。图1B：响应elf18处理的野生型(WT)和efr-1中的35S:uORFsTBF1-LUC报告基因的翻译。均值±s.e.m.(n＝9)在归一化至时间0的均值之后。图1C、1D：全局翻译活性的多聚核糖体图谱分析(图1C)和TBF1mRNA翻译活性的多聚核糖体图谱分析，计算为elf18处理后的WT和efr-1中的多聚核糖体体/总mRNA的比例(图1D)；小写字母表示多聚核糖体图谱分析中的部分(fraction)。图1E：使用uORFsTBF1-LUC/WT植物构建RS和RF库的示意图。RS：RNA-seq；RF：核糖体足迹。RNase I和Alkaline是产生RNA片段的两种方法。
图2A-2J示出了对elf18处理后的转录组(RSfc)、翻译组(RFfc)和翻译效率(TEfc)的全局分析，并辨认了基于TEfc的新型PTI调节因子2A：log2RSfc和log2RFfc的直方图。μ和δ分别是log2RSfc和log2RFfc的均值和标准差。图2B：示出了RS和RF之间的皮尔逊相关系数r，用在Mock或elf18中的CDS中的RPKM≥1的表达的基因的log2RPKM表示。图2C、2D：RSfc和RFfc之间的关系(图2C)以及RSfc和TEfc之间的关系(图2D)。dn：下；nc：无变化。图2E：示出了RSfc和TEfc之间的重叠的文氏图。图2F：在乙烯相关分子模式和损伤相关分子模式Pep介导的PTI信号通路的已知成分或已知成分的同源物中的RS和TE变化。该路径是从Zipfel17修改而来的。在矩形框中：黑色：RS改变；红色：TE-up；绿色：TE-down。图2G：Elf18诱导的对PsmES4326的抗性。来自2个实验的12个生物学重复样本的均值±s.e.m.。图2H：双LUC系统示意图。Test：所测试的基因的5'前导序列(包括UTR)或3'UTR；LUC：萤火虫荧光素酶；RLUC：海肾荧光素酶；Ter：终止子。图2I：在本塞姆氏烟草中的elf18处理后，对于TE的EIN4 UTR的双重LUC测定。EV：空向量。平均值±s.e.m.(n＝4)。图2J：以多聚核糖体/总mRNA之比计算的elf18处理后的EIN4 TE变化。平均值±s.d.来自具有3个技术重复的2个实验。参见图10A-10C。
图3A-3G示出了R基序对PTI诱导期间TE变化的影响。图3A：R基序共有序列(SEQ IDNO：481)。图3B：证实了响应elf18的含R基序的基因的TE诱导。插入了20个内源基因的5'前导序列作为“测试”序列。图3C、3D：R基序缺失突变(ΔR)对基础翻译活性的影响(图3C)和对elf18的翻译响应性的影响(图3D)。图3E：双荧光素酶报告基因5'UTR中随着GA、G[A]3、G[A]6和G[A]n重复(总长度为120nt)的包含的elf18反应性获得。图3F、3G：R基序和uORF对TBF1基础翻译活性的贡献(图3F)和对elf18的翻译应答(图3G)。本塞姆氏烟草中的LUC/RLUC活性比的均值±s.e.m.(对于图3B、3D-G而言，n＝3，或对于图3C而言，具有3个技术重复的3个实验)标准化至Mock(图3B、3D、3E、3G)或WT 5'前导序列(图3C、3F)。参见图12A-12L。
图4A-4H示出了R基序通过与PAB的相互作用控制对PTI诱导的翻译响应性。图4A：共表达PAB2对含R基序的基因的翻译的影响。在归一化至YFP对照后，LUC/RLUC活性比例的均值±s.e.m.(n＝4)。图4B：体外合成的PAB2的RNA下拉。0.2nmol的GA、G[A]3、G[A]6和G[A]n重复和聚(A)RNA(120nt)被生物素化。珠(beads)：无RNA探针的对照。图4C：G[A]n RNA与增加量的PAB2的结合。图4D：PTI诱导后体内合成的PAB2的G[A]n RNA下拉。YFP：阴性蛋白质对照。“-”或“+”分别表示来自经Mock或elf18处理的组织的PAB2。图4E：在elf18处理后，pab2pab4(pab2/4)突变体中的TBF1 TE变化，计算为多核糖体/总mRNA之比(平均值±s.d.，n＝3)。图4F、4G：在pab2 pab4和pab2 pab8植物中，Elf18诱导的对Psm ES4326的抗性(图4F，均值±s.e.m.，n＝8)，以及在pab2 pab8突变体背景中过表达PAB2的初级转化体(primarytransformants)中(OE-PAB2)，Elf18诱导的对Psm ES4326的抗性(图4G，均值±s.e.m.，对照和efr-1为n＝8，经Mock和elf18处理的OE-PAB2系的n分别为17和13)。对照：在WT背景中表达YFP的转基因植物。基于basta抗性选择对照和OE-PAB2，并通过PCR进一步证实。图4H：PAB通过与R基序的不同的相互作用(differential interactions)在调节基础翻译和elf18诱导的翻译中起相反作用的工作模型。参见图13A-13C。
图5A-5E示出了与图1A-1E有关的在elf18诱导的PTI期间的翻译活性。图5A：在Mock或elf18处理后，野生型(WT)中的35S:uORFsTBF1-LUC报告基因的翻译。均值±s.e.m.(n＝12)在归一化至时间0的LUC活性之后。图5B、5C：在Mock或elf18处理后的WT中的35S:uORFsTBF1-LUC报告基因的转录水平(图5B)以及在elf18处理后的WT或efr-1中的35S:uORFsTBF1-LUC报告基因的转录水平。转录水平表示为归一化至时间0的倍数变化。均值±s.e.m.(n＝3)。图5D、5E：全局翻译活性的多聚核糖体图谱分析(图5D)和TBF1 mRNA翻译活性的多聚核糖体图谱分析，计算为响应WT中的Mock和elf18处理的多聚核糖体/总mRNA的比例(图5E)。小写字母表示多聚核糖体图谱分析中的部分。
图6A-6C示出了对库构建方案的改进。图6A：添加5'去腺苷酸酶和RecJf以去除过量的5'前腺苷酸化的接头(5’pre-adenylylated linker)。对RS和RF的mRNA片段进行大小选择，并通过PNK处理进行去磷酸化，然后进行5'前腺苷酸化的接头的连接。原方法使用凝胶纯化去除多余的接头。在新方法中(粉红色背景)，使用5'去腺苷酸酶从未连接的接头上去除前腺苷酸化的基团(pre-adenylylated group，Ap)，从而可被RecJf裂解。然后可以将所得的样品直接用于逆转录。图6B：比较了去除多余接头的原方法(原)和新方法(新)。使用26和34nt合成RNA用于接头连接。没有接头的RNA标记用作对照。箭头指示多余的接头。DNA阶梯：10bp。图6C：逆转录(RT)示出了新方法相对于原方法的改进。在RT之前，将一半的连接混合物(O)凝胶纯化以除去过量的接头(加载2x)。另一半(N)用5'去腺苷酸酶和RecJf处理，并直接用作RT的模板(加载1x)。加载RT引物作为对照。箭头指示过量的RT引物。
图7A-7H示出了与图2A-2J有关的RS和RF库的质量和可再现性。图7A：BioAnalyzer轮廓(profile)显示了高质量的RS和RF库。除了内部标准(35bp和10380bp)之外，对于两个生物学重复(Rep1/2)的Mock和elf18处理，RS和RF库存在单个～170bp峰。图7B：来自4个RS库和4个RF库的总读数长度分布。图7C：来自4个RS库和4个RF库的总读数中的30nt读数部分。数据显示为与起始密码子的A(框架(frame)1)、U(框架2)和G(框架3)5'对齐的读数的百分比的均值±s.e.m.(n＝4)。图7D：来自4个RS和4个RF库的总读数的5'UTR、CDS和3'UTR的读数密度。将在CDS中的RPKM≥1及UTR长度≥1nt的表达的基因用于箱形图。箱形的顶部、中间和底部线分别表示25％，50％和75％百分位数。图7E：使用RF的30nt读数的第15个核苷酸的、在起始密码子和终止密码子周围的覆盖(coverage)的核苷酸分辨率。图7F：RS和RF样本的两个重复(Rep1/2)之间的相关性。数据显示为在CDS中的RPKM≥1的表达的基因的CDS中的log2RPKM的相关性。显示了皮尔逊相关系数r。图7G、7H：分层聚类显示了两个重复(Rep1/2)中RS(图7G)和RF(图7H)之间的可重复性。颜色越深意味着相关性越高。
图8A-8C示出了用于转录组、翻译组和TE变化分析的流程图和统计方法。图8A：用于读数处理和分配的流程图。图8B：转录组(RSfc)、翻译组(RFfc)和TE变化(TEfc)分析的统计方法和标准。图8C：Mock和elf18处理之间的mORF/uORF比例移位的定义。
图9A-9C示出了对RS、RF和TE数据的附加分析。图9A：Mock和elf18处理的log2TE的正态分布。图9B：内源性TBF1基因中的TE变化。使用IGB将读数覆盖(read coverage)标准化为独特映射的读数。确定Mock和elf18处理中TBF1外显子2的TE，以计算TEfc。图9C：TEfc与外显子长度、5'UTR长度，3'UTR长度和GC组成之间的相关性。
图10A-10C示出了新型调节因子的突变体中的PTI应答，与图2A-2J有关。图10A：MAPK激活。用1μM的elf18溶液处理12天大的ein4-1、eicbp.b和erf7幼苗，并在指定的时间点对其进行收集，以使用针对MAPK3和MAPK6的磷酸特异性抗体进行免疫印迹分析。图10B：胼胝质沉积。用1μM的elf18或Mock浸润3周龄的植物。20小时后，在苯胺蓝中对叶片进行染色，然后进行共聚焦显微镜检查。图10C：在本塞姆氏烟草中进行的瞬时测定中，在elf18处理后，EIN4 UTRs对LUC/RLUC mRNA比例的影响。EV：空向量。均值±s.d.(2个实验，包括3个技术重复)。
图11A-11F示出了uORF介导的翻译控制。图11A、11B：用于识别预测的(图11A)和翻译的(图11B)uORF的步骤的流程图。图11C：uORF和mORF的读数密度。对于那些将读数分配给uORF且并在其mORF中的RPKM≥1的基因，分别为Mock和elf18处理绘制了单个uORF和mORF的log2RPKM。r：皮尔逊相关系数。图11D：elf18处理后mORF/uORF移位的直方图。将elf18的mORF/uORF除以Mock的mORF/uORF之比定义为移位值。数据显示为移位值的log2转换的分布。由z分数确定的、具有显著移位的uORF带有颜色，并示出了其数字。图11E：低氧胁迫下的mORF/uORF移位的直方图11。图11F：文氏图显示了响应elf18和低氧治疗的、具有显著核糖移位的重叠uORF。
图12A-12L示出了响应elf18诱导的R基序介导的翻译控制，与图3A-3G相关。图12A：在标准化至mRNA后，包含5'前导序列的R基序对基础翻译活性的影响(均值±s.e.m.，n＝3)。图12B：R基序缺失(ΔR)对mRNA丰度的影响(平均值±s.d.，具有3个技术重复的2个实验)。图12C-F：R基序缺失和R基序点取代突变对基础翻译的影响(图12C、12E；均值±sem，n＝4)和对mRNA水平的影响(图12D、12F：均值±s.d.，具有3个技术重复的2个实验)对于IAA18和BET10(图12C、12D)和TBF1(图12E、12F)。图12G：进行和不进行elf18处理的WT和R基序缺失突变体中的mRNA水平。来自具有3个技术重复的3个生物学重复的均值±s.d.)。图12H：使用双重LUC测定法测量的R基序缺失(ΔR)对于对elf18的翻译响应性的影响(均值±s.e.m.，n＝3)。图12I：在本塞姆氏烟草中进行的瞬时测定中，当将GA、G[A]3、G[A]6和G[A]n重复插入报告基因的5'UTR时，它们对mRNA水平的影响。来自具有3次技术重复的2次实验的均值±s.d.。图12J、12K：R基序缺失和/或uORF突变对TBF1mRNA丰度的影响(图12J)和对Mock和elf18处理的转录响应性的影响(图12K)。具有3次技术重复的2次实验的均值±s.d.，在归一化至WT后(图12J)或进行Mock处理的WT后(图12K)。图12L：在转基因拟南芥植物中，R基序和uORF对针对elf18的TBF1翻译应答的贡献。1、2和3代表测试的单个转基因系。在归一化至Mock后的来自具有3个技术重复的2个实验的均值±s.e.m.。
图13A-图13C示出了PAB对mRNA转录和与PTI相关的表型的影响，与图4A-4H相关。图13A：共表达PAB2对mRNA丰度的影响。数据为均值±s.d.(具有3个技术重复的3个生物学重复)。图13B：WT、efr-1、pab2 pab4(pab2/4)和pab2 pab8(pab2/8)中的Elf18诱导的幼苗生长抑制(平均值±s.e.m.，n＝5)。图13C：在elf18处理后，通过使用针对MAPK3和MAPK6的磷酸特异性抗体的免疫印迹测量了WT、pab2/4、pab2/8和efr-1幼苗中的MAPK活化。
图14A-14D示出了GCN2在植物的PTI中的作用。图14A-14D：gcn2突变对elf18诱导的eIF2α磷酸化(图14A)、翻译诱导(图14B，LUC活性的均值±sem，n＝8)和uORFsTBF1-LUC报告基因的转录(图14C，LUC mRNA的均值±s.d.，n＝3)的作用，和对Psm ES4326的抗性(图14D，均值±sem，n＝8)。
图15A-15H示出了对uORFsTBF1介导的翻译控制和TBF1启动子介导的转录调控的表征。图15A：用于研究WT uORFsTBF1或突变uorfsTBF1(ATG到CTG)的翻译活性的构建体的示意图。图15B-15D：细胞质合成的萤火虫荧光素酶的活性(图15B；LUC；用伪色的化学发光)；ER合成的GFPER的荧光(图15C；在UV下)；在本塞姆氏烟草中分别瞬时表达2天(图15B、15C)和3天(图15D)后，TBF1-YFP融合体的过表达诱导的细胞死亡(图15D；用乙醇清除)。图15E：双荧光素酶系统的示意图。RLUC：海肾荧光素酶。图15F：响应于Mock、Psm ES4326、Pst DC3000、Pst DC3000 hrcC-(Pst hrcC-)、elf18和flg22，具有双重荧光素酶构建体的转基因拟南芥植物中报告基因翻译的变化。在每个时间点归一化为mock处理的LUC/RLUC活性比的均值±s.e.m.(n＝3)。图15G：(图15F)中的LUC/RLUC的mRNA水平。图15H：内源性TBF1的mRNA水平。UBQ5：内部控制。被标准化为来自具有3个技术重复的2个实验的每个时间点的mock处理的LUC/RLUC mRNA均值±s.d.。参见图19A-19N。
图16A-16I示出了控制snc1的转录和翻译对拟南芥的防御和健康的作用。图16A、16B：控制snc1的转录和翻译对营养生长(图16A)和生殖生长(图16B)的影响。snc1：携带自激活的snc1-1等位基因的突变体。#1和#2：两个独立的携带TBF1p:uORFsTBF1-snc1的转基因品系。图16C、16D：通过喷雾(图16C)或浸润(图16D)接种后，WT、snc1、#1和#2中的PsmES4326的生长。均值±s.e.m(n＝12和24，分别来自第0天和第3天的三个实验)。图16E、16F：Hpa Noco2生长。从7dpi的受感染的植物中收集照片(图16E)和Hpa孢子(图16F)。平均值±s.e.m(n＝12)。图16G-16I：对莲座半径(图16G)、鲜重(图16H)和种子总重量(图16I)的分析。均值±s.e.m.。上方的字母表示显著差异(P<0.05)。对于四个系一起，参见图21A-21H。
图17A-17I示出了控制AtNPR1的转录和翻译对水稻的防御和健康的影响。图17A：在Xoo接种后，在田间生长的T1代AtNPR1转基因植物中观察到的代表性症状。图17B：用于(图17A)的叶病变长度的量化。图17C、17D：T2代植物中的Xoc(图17C)和稻瘟病菌(M.oryzae)(图17D)在生长室中生长后观察到的代表性症状。图17E、17F：(图17C、图17D)的叶病变长度的量化。图17G-17I：T1代AtNPR1转基因水稻在田间条件下的健康度参数，包括株高(图17G)和由单株谷粒数(图17H)和1000谷粒重量决定的谷粒产量(图17I)。WT：受体水稻栽培品种ZH11。均值±s.e.m.。上方的不同字母表示显著差异(P<0.05)。对于四个系一起以及更多的健康度参数，参见图24A-24D和25A-25L。
图18A-18D示出了uORF2TBF1核苷酸和肽序列在植物物种中的保守性。图18A：TBF1mRNA结构的示意图。5'前导序列包含两个uORF：uORF1和uORF2。CDS：编码序列。图18B-18D：在不同的植物物种中的uORF2肽序列(SEQ ID NOS：482-490)的比对(图18B)以及uORF2核苷酸序列的比对(图18C)(SEQ ID NOS：491-499)和系统发生(phylogeny)(图18D)。在这些物种中编码保守氨基酸的相应三联体标有下划线。使用Clustlw2辨认出相同的残基(黑色背景)、相似的残基(灰色背景)和缺失的残基(短划线)。At(Arabidopsis thaliana；AT4G36988)、Pv(Phaseolus vulgaris；XP_007155927)、Gm(Glycine max；XP_006600987)、Gr(Gossypium raimondii；CO115325)、Nb(Nicotiana benthamiana；CK286574)、Ca(Cicerarietinum；XP_004509145)、Pd(Phoenix dactylifera；XP_008797266)、Ma(Musaacuminata subsp.Malaccensis；XP_009410098)、Os(Oryza sativa；Os09g28354)。
图19A-19N示出了在翻译控制中的uORFsTBF1和uORFsbZIP11的表征，与图15A-15H相关。图19A：LUC-YFP融合体(图19A)和GFPER(图19B)的亚细胞定位。SP，来自拟南芥碱性几丁质酶的信号肽；HDEL：ER保留信号。图19C-19E：在表达TBF1的植物中观察到的细胞死亡前2dpi的LUC(图15B；n＝3)的mRNA水平、GFPER(图15C；n＝4)的mRNA水平和TBF1-YFP(图15D；n＝3)的mRNA水平。均值±s.d.。图19F：用于研究WT uORFsbZIP11、突变体uorf2abZIP11(ATG到CTG)或uorf2bbZIP11(ATG到TAG)的翻译活性的5'前导序列的示意图。图19G-19I：uORFsbZIP11介导的对细胞质合成的LUC的翻译控制(图19G；用伪色(pseudo colour)的化学发光)；ER合成的GFPER(图19H；UV下的荧光)；在本塞姆氏烟草中瞬时表达2天(图19G、19H)和3天(图19I)后，TBF1过表达诱导的细胞死亡(图19I；用乙醇清除)。图19J-19L：来自具有3个技术重复实验的2个实验的(图19G)中的LUC、(图19H)中的GFPER，和(图19I)中的TBF1-YFP的mRNA水平。均值±s.d.。图19M：响应本塞姆氏烟草中的elf18，受包含WT uORFsbZIP11、突变体uorf2abZIP11或uorf2bbZIP11的5'前导序列控制的LUC中的TE变化。LUC/RLUC活性比的均值±s.e.m.(n＝4)。图19N：LUC/RLUC mRNA的变化(图19M)。被标准化为来自具有3个技术重复的2个实验的mock处理的LUC/RLUC mRNA均值±s.d.。
图20示出了表达snc1的初级拟南芥转化体中观察到的三种发育表型。在T1(即第一代)拟南芥转基因系中携带35S:uorfsTBF1-snc1、35S:uORFsTBF1-snc1、TBF1p:uorfsTBF1-snc1和TBF1p:uORFsTBF1-snc1的三种发育表型的代表性图像(上)。将Fisher精确检验用于成对统计分析(下)。“总计”中的不同字母表示III型与I+II型之间存在显著差异(P<0.01)。
图21A-21I示出了控制snc1的转录和翻译对拟南芥的防御和健康的作用，与图16A-16I相关。图21A、21B：通过喷雾(图21A；n＝8)或浸润(图21B；n＝12和24，分别来自第0天和第3天的三个实验)接种后，WT、snc1、转基因系#1-4中的Psm ES4326的生长。均值±s.e.m.。图21C：通过在7dpi的孢子计数测量的Hpa Noco 2生长。平均值±s.e.m(n＝12)。图21D-21G：对植物半径(图21D)、鲜重(图21E)、长角果数量(图21F)和种子总重量(图21G)的分析。均值±s.e.m。图21H、21I：Psm ES4326诱导的snc1蛋白(图21H；免疫印迹下方的数字)和mRNA(图21I)的相对水平。来自包含3个技术重复的2个实验的均值±s.d.(图21I)。#1-4：携带TBF1p:uORFsTBF1-snc1的四个独立的转基因系和,#1和#2示于图16A-16I。hpi：PsmES4326感染后的小时数；CBB：考马斯亮蓝。条形图上方的不同字母表示显著差异(P<0.05)。
图22A-22C示出了uORFsTBF1在水稻中的功能性。图22A、22B：携带35S:uorfsTBF1-LUC和35S:uORFsTBF1-LUC的三个独立的初级转基因水稻系(在水稻研究中称为“T0”)的LUC活性(图22A)和mRNA水平(图22B)。3个生物学重复的LUC活性(RLU，相对光单位)的均值±s.e.m.；以及标准化至35S:uorfsTBF1-LUC系#1后，3个技术重复的LUC mRNA水平的均值±s.e.m.。图22C：代表性的类病变病(LMD)表型(上)和在生长室中生长的第二代(T1)中显示LMD的AtNPR1转基因水稻植株的百分比(下)。
图23A-23E示出了控制AtNPR1的转录和翻译对T0代水稻的防御的影响，与图17A-17I相关。图23A-23D：在35S:uorfsTBF1-AtNPR1(图23A)、35S:uORFsTBF1-AtNPR1(图23B)、TBF1p:uorfsTBF1-AtNPR1(图23C)和TBF1p:uORFsTBF1-AtNPR1(图23D)的初级转化体(T0)中被Xoo菌株PXO347感染后的病变长度测量。在T1和T2中进一步分析的系被圈起。图23E：平均叶病变长度受体水稻栽培品种ZH11。均值±s.e.m.。上方的不同字母表示显著差异(P<0.05)。
图24A-24E示出了控制AtNPR1的转录和翻译对T1代水稻中的防御的作用，与图17A-17I相关。图24A、24B：在Xoo接种之后，温室中生长的T1代AtNPR1转基因水稻植株中观察到的代表性症状(图24A)和相应的叶病变长度测量(图24B)。进行PCR以检测转基因基因的存在(+)或不存在(-)。图24C：田间生长的T1代AtNPR1转基因水稻植株中Xoo接种的4个系的叶病变长度的定量。均值±s.e.m.。上方的不同字母表示显著差异(P<0.05)。图24D、24E：响应Xoo感染的AtNPR1 mRNA(图24D)和蛋白质(图24E；免疫印迹下方的数字)的相对水平。均值±s.d.(图24D；n＝3个技术重复)。
图25A-25L示出了在田间条件下控制AtNPR1的转录和翻译对T1水稻的健康度的影响，与图17A-17I相关。上方的不同字母表示显著差异(P<0.05)。
具体实施方式
发明人已经证明，在病原体攻击后，植物不仅重编程其转录活性，而且还快速且瞬时地诱导关键免疫调节因子的翻译；所述的关键免疫调节因子为，例如，转录因子TBF1(Pajerowska-Mukhtar，KM等，Curr.Biol.22，103-112(2012))。此处，在非限制性实施例中，发明人对暴露于微生物相关分子模式(MAMP)elf18的拟南芥进行了全局翻译图谱分析(global translatome profiling)。发明人不仅示出了在该模式触发的免疫(PTI)反应期间的翻译和转录之间缺乏相关性，而且他们的研究还揭示了比转录更为严格的翻译控制。此外，对具有改变的翻译效率(TE)的基因的进一步研究已经使发明人发现了几种新的免疫应答顺式元件(immune-responsive cis-elements)，其可用于以例如诱导的方式严格控制蛋白质表达。新的免疫应答顺式元件包括“R基序(R-motif)”、上游开放阅读框(UpstreamOpen Reading Frame，uORF)，和5'非翻译区(UTR)序列。已发现R基序序列在转录物的5'UTR中高度富集，其响应于PTI诱导具有增加的TE，并定义大多由嘌呤组成的mRNA共有序列。还在具有改变的TE的转录物的5'UTR中识别出uORF序列，并且发现该uORP序列是控制免疫应答转录物翻译的独立顺式元件。为达到以免疫应答或诱导方式严格控制RNA转录物的翻译的目的，R基序和uORF序列可以例如在来自具有改变的TE的基因的全长5'调节序列中单独使用或组合使用。
发明人认为这些新的免疫应答顺式元件可能用于在各种应用中更严格地控制细胞中的蛋白质表达。这些新顺式元件在用于控制植物疾病的新构建体中具有潜在的用途。为此，本发明人还证明TBF1基因的5'UTR区可通过提供对防御蛋白质翻译的更严格控制来用于增强植物的抗病性，并最小化与防御蛋白质表达相关的健康度惩罚；参见例如实施例2。TBF1是免疫诱导后植物生长-防御转换的重要转录因子(Pajerowska-Mukhtar，KM等，Curr.Biol.22，103-112(2012))。在没有病原体攻击的情况下，TBF1的翻译通常被5'区域内的两个uORF严格抑制。
除了TBF1的uORF之外，发明人还认为本文所公开的另外的免疫应答顺式元件可用于控制防御蛋白表达，从而不仅使增强的抗性对植物生长和发育的不利影响最小化，而且通过减少使用作为主要污染源的农药，从而帮助保护环境。通过使广谱病原体的抗性为可诱导的，也可以减轻抗性病原体的选择压力。
虽然在植物中提供增强的抗性是本文公开的组合物和方法的一种潜在用途，但发明人还认识到这种组合物和方法可用于其他植物和非植物应用。例如，从酵母(占所有mRNA的13％)到人类(占所有mRNA的49％)的生物的mRNA中普遍存在的uORF序列表明这些mRNA特征在控制转基因表达中可能具有广泛的用途。
本发明的一个方面提供了构建体。本文中所使用的术语“构建体”是指重组多核苷酸，其包括但不限于DNA和RNA，其可为单链或双链的，并且可以代表有义链或反义链。重组多核苷酸是通过实验室方法形成的多核苷酸，其包括衍生自至少两种不同天然来源的多核苷酸序列，或其可以是合成的。因此，构建体可以包括对内源基因的新修饰，该新修饰通过例如基因编辑技术引入。构建体还可以包括使用例如重组DNA方法(recombinant DNAmethodologies)产生的重组多核苷酸。
本文所使用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸”和“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸(这些术语可互换使用)，或其任何片段。这些短语还指天然或合成来源的DNA或RNA(可以是单链或双链的，可以代表有义链或反义链)。
本文所提供的构建体可以通过本领域技术人员可获得的方法制备。值得注意的是，要求保护的每种构建体都是重组分子，因此在自然界中不存在。通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室方法包括本领域熟知且常用的分子、生物化学和重组DNA技术。可将本领域技术人员所能获得的标准技术用于克隆、DNA和RNA分离、扩增和纯化。这些技术在文献中有详尽的解释。
本发明的DNA构建体可包括可操作地连接到DNA多核苷酸的异源启动子，所述的DNA多核苷酸编码RNA转录物，该RNA转录物包括位于插入位点的5'端的5'调节序列，其中该5'调节序列包括R基序序列。本文所使用的“异源”仅表明启动子、5'调节序列和插入位点或插入插入位点中的编码序列并非天然地在一起。
“插入位点”是一种多核苷酸序列，其允许另一种感兴趣的多核苷酸的掺入。示例性的插入位点可包括，但不限于，包括被一种或多种限制酶识别的序列(即多克隆位点(MCS))的多核苷酸、包括被位点特异性重组系统(例如λ噬菌体重组系统)识别的序列的多核苷酸(即Gateway克隆技术)、FLP/FRT系统，和Cre/lox系统或包括可能被CRISPR/Cas系统所靶向的序列的多核苷酸。插入位点可包括编码异源多肽的异源编码序列。
“5'调节序列”是多核苷酸序列；当该多核苷酸序列在细胞中表达时，当其为DNA时，其被转录，当其为RNA时，其可以或可以不被翻译。例如，5'调节序列可包括未翻译的多核苷酸序列(即R基序序列)，但其控制例如下游开放阅读框的翻译(即异源编码序列)。5'调节序列还可以包括被翻译的开放阅读框(即uORF)，且其可以控制下游开放阅读框的翻译(即异源编码序列)。根据本发明，5'调节序列位于插入位点的5'端。
发明人发现了共有序列，该共有序列的5'区域在PTI诱导期间显著富集TE-up转录物。由于该共有序列几乎只含有嘌呤，因此根据IUPAC核苷酸代码将其命名为“R基序”。本文所使用的“R基序序列”为RNA序列，其(1)包括共有序列(G/A/C)(A/G/C)(A/G/C/U)(A/G/C/U)(A/G/C)(A/G)(A/G/C)(A/G)(A/G/C/U)(A/G/C/U)(A/G/C)(A/C/U)(G/A/C)(A)(A/G/U)(参见，例如，图3A，SEQ ID NO：481)或(2)包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸，所述核苷酸包含G和A核苷酸，其比例为20G：1A至1G：20A中的任意比例。在实施例中，发明人证明包含15个核苷酸，并具有G[A]3、G[A]6或G[A]n(包含具有不同数量的A核苷酸的不同GA重复的RNA序列)重复的R基序序列足以响应elf18。当存在于转录物的5'调节区中时，R基序序列可以在细胞中以免疫应答的方式改变RNA转录物的翻译。R基序序列也可以是编码这种RNA序列的DNA序列。在一些实施方案中，R基序序列可以与上文所述的R基序序列具有40％、60％、80％、90％或95％的序列同一性。R基序序列可包括表2中的SEQ ID NO：113-293的任一序列、多核苷酸，或其变体；所述多核苷酸的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸，所述核苷酸包含G和A核苷酸，其比例为19G：1A至1G：19A中的任意比例。
关于多核苷酸序列(即R基序、uORF或5'调节性多核苷酸序列(regulatorypolynucleotide sequences))，“变体”、“突变体”或“衍生物”可以定义为多核苷酸序列，其在多核苷酸序列中的其中一条的一定的长度上与特定序列具有使用在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站上获得的“BLAST2Sequences”工具的blastn测出的至少50％序列同一性。这样的一对多核苷酸在一定的长度上可以显示出例如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％或更高的序列同一性。
关于多核苷酸序列，术语“百分比同一性”和“％同一性”和“％序列同一性”是指使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配百分比。这种算法可以以标准化和可再现的方式在被比较的序列中插入间隙，以优化两个序列之间的比对，并因此实现两个序列的更有意义的比较。可以如本领域所理解地确定多核苷酸的序列百分比同一性(参见例如美国专利号7,396,664，其通过引用整体并入本文)。国家生物技术信息中心(NCBI)的基本局部比对搜索工具(BLAST)提供了一套常用且可免费获得的序列比较算法，该算法可从多个来源获得，包括从NCBI、Bethesda、Md.的网站。BLAST软件套件包括各种序列分析程序，包括“blastn”，其用于将已知的多核苷酸序列与来自各种数据库的其它多核苷酸序列进行比对。还可获得名为“BLAST 2序列(BLAST 2Sequences)”的工具，其用于两个核苷酸序列的直接成对比较。可以在NCBI网站上以交互方式访问和使用“BLAST 2序列”。“BLAST 2序列”工具可用于blastn和blastp(如上所述)。
关于多核苷酸序列，可以在整个确定的多核苷酸序列的长度上(例如如特定的SEQID号所定义的)测量百分比同一性，或者可以在更短的长度上测量百分比同一性；所述的更短的长度为例如从更大的、确定的序列取出的片段的长度，例如包括至少2个、至少3个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少70个、至少100个，或者至少200个连续核苷酸的片段的长度。这些长度仅是示例性的，且应当理解：本文的表格、图或序列表中所示的序列所支持的任何片段长度都可用于描述可测量百分比同一性的长度。
还提供了与本文所述多核苷酸同源的多核苷酸。本领域技术人员还理解遗传密码的简并性，并且多种多核苷酸可以编码相同的多肽。在一些实施方案中，可以对多核苷酸(即uORF多核苷酸)进行密码子优化以在特定细胞中表达。虽然本文公开了在植物中发现的特定多核苷酸序列，但可以使用编码本文所述多肽的所需形式的任何多核苷酸序列。因此，可以使用非天然存在的序列。为了例如增强多肽或蛋白质的异源表达系统中的表达，这些非天然存在的序列可能是可取的。用于产生简并编码序列的计算机程序是可得到的并且可用于此目的。铅笔、纸、遗传密码和人手也可用于产生简并编码序列。
在一些实施方案中，5'调节序列缺乏TBF1 uORF序列。“TBF1 uORF序列”是指驻留在TBF1基因的5'UTR区域中的上游开放阅读框。TBF1基因是植物免疫应答中重要的植物转录因子。TBF1 uORF序列在美国专利公开号2015/0113685中公开。在一些实施方案中，5'调节序列可能缺少编码US2015/0113685所公开的SEQ ID NO：102(Met Val Val Val Phe IlePhe Phe Leu His His Gln Ile Phe Pro)或其描述的变体的多核苷酸，和/或缺少编码US2015/0113685所公开的SEQ ID NO：103(Met Glu Glu Thr Lys Arg Asn Ser Asp LeuLeu Arg Ser Arg Val Phe Leu Ser Gly Phe Tyr Cys Trp Asp Trp Glu Phe Leu ThrAla Leu Leu Leu Phe Ser Cys)或其描述的变体的多核苷酸。
5'调节序列可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个R基序序列。在一些实施方案中，5'调节序列包括5至25个R基序序列或其中的任何范围。在5'调节序列内，每个R基序序列可以被至少0、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多个碱基分开。
5'调节序列可包括编码表1中SEQ ID NO：1-38的任何uORF多肽的uORF多核苷酸或其变体。在一些实施方案中，5'调节序列包括表1中SEQ ID NO：39-76的任何多核苷酸或其变体。在一些实施方案中，5'调节序列包括以下多核苷酸中的任一种：表1中的SEQ ID NO：77-112、表2中的SEQ ID NO：294-474，或其变体。
本文公开的多肽(即uORF多肽)可包括“变体”多肽、“突变体”及“其衍生物”。本文所使用的术语“野生型”为本领域技术人员所理解的术语，其意指在自然界中出现，区别于变体或突变形式的典型形式的多肽。本文中所使用的“变体”、“突变体”，或“衍生物”是指多肽分子，该多肽分子具有不同于参照蛋白质或多肽分子的氨基酸序列。与参照分子相比，变体或突变体可具有氨基酸残基的一个或多个插入、缺失，或取代。变体或突变体可包括参照分子的片段。例如，相对于uORF“野生型”多肽，uORF多肽突变体或变体多肽可具有至少一个氨基酸残基的一个或多个插入、缺失，或取代。来自拟南芥的“野生型”uORF多肽的多肽序列示于表1中。这些序列可用作参照序列。
本文提供的多肽可以是全长多肽或可以是全长多肽的片段。本文所使用的术语“片段”是氨基酸序列的一部分，其序列与参照序列相同，但长度短于参照序列。片段可以包含上至参照序列的整个长度减去至少一个氨基酸残基。例如，片段可以分别包含参照多肽的5至1000个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，片段可包含参照多肽的至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、250或500个连续氨基酸残基。片段可以优选自分子的某些区域。术语“至少一个片段”包括全长多肽。uORF多肽的片段可包含或基本上由全长uORF多肽的氨基酸序列(参见表1中的SEQ ID NOs)的连续部分组成。片段可包括相对于全长uORF多肽的N末端截短、C末端截短，或N末端和C末端的截短。
多肽中的“缺失”是指氨基酸序列的变化，该变化导致一个或多个氨基酸残基的缺席。缺失可以去除至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、200或更多个氨基酸残基。缺失可以包括内部缺失和/或末端缺失(例如参照多肽的N末端截短、C-末端截短，或N末端和C末端的截短)。
多肽中的“插入”和“添加”是指氨基酸序列的变化，该变化导致一个或多个氨基酸残基的添加。插入或添加可指1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多个氨基酸残基。YTHDF多肽的变体可具有N末端插入、C末端插入、内部插入，或N-末端插入、C-末端插入和内部插入的任何组合。
本文所考虑的多肽变体、突变体，或衍生物的氨基酸序列可包括相对于参照氨基酸序列的保守氨基酸取代。例如，变体、突变体，或衍生多肽可包括相对于参照分子的保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是将氨基酸取代为另外的氨基酸的取代，该取代被预测为对参照多肽的性质的干扰最小。换而言之，保守氨基酸取代基本上保留了参照多肽的结构和功能。保守氨基酸取代通常保留：(a)取代的区域中多肽骨架的结构(例如作为β折叠或α螺旋构象的结构)、(b)在取代位点处的分子的电荷或疏水性，和/或(c)侧链的大部分。
本发明的DNA构建体还可包括异源启动子，该异源启动子可操作地连接到编码RNA转录物的DNA多核苷酸，所述RNA转录物包括位于插入位点5'端的5'调节序列，其中该5'调节序列包括编码表1中SEQ ID NO：1-38的任一uORF多肽的uORF多核苷酸或其变体。在一些实施方案中，DNA构建体中包含的5'调节序列包括表1中SEQ ID NO：39-76的多核苷酸或其变体中的任一。在一些实施方案中，DNA构建体中包含的5'调节序列包括表1中SEQ ID NO：77-112的多核苷酸、表2中SEQ ID NO：294-474的多核苷酸，或其变体中的任一。
本发明的构建体可包括插入位点，该插入位点包括编码异源多肽的异源编码序列。在一些实施方案中，本发明的构建体在细胞中的表达产生包含异源编码序列和5'调节序列的转录物。“异源编码序列”是构建体的区域，其为可识别的片段(或多个片段)，且并没有发现其与自然界中较大的构建体相关联。当异源编码区域编码基因或基因的一部分时，该基因可以被DNA侧接(flanked)，该DNA不侧接源生物的基因组中的遗传DNA。在另一个例子中，异源编码区域为编码序列本身不存在于自然界中的构建体。
“异源多肽”、“多肽”、“蛋白质”，或“肽”可互换使用，以意指氨基酸的聚合物。本文所考虑的“多肽”通常包含天然存在的氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的聚合物。异源多肽可包括但不限于：植物病原体抗性多肽、治疗性多肽、转录因子、CAS蛋白(即Cas9)、报告多肽、赋予药物或农用化学品抗性的多肽，或参与植物的生长或发育的多肽。
本文中所使用的术语“植物病原体抗性多肽”是指任何在植物内表达时使植物对病原体更具抗性的多肽，所述病原体包括但不限于：病毒、细菌、真菌病原体、卵菌病原体、植物纤维，和线虫。合适的植物病原体抗性多肽是本领域已知的，且可包括但不限于：MAMP的模式识别受体(PRR)、细胞内核苷酸结合和富含亮氨酸重复(NB-LRR)免疫受体(也称为“R蛋白”)、snc-1、NPR1如拟南芥NPR1(AtNPR1)，或防御相关转录因子如TBF1、TGA、WRKY，和MYC。NPR1是由一种普遍的植物免疫信号，水杨酸，所诱导的广谱抗性的正调节因子。R蛋白仅在同一植物家族中起作用，而拟南芥NPR1(AtNPR1)的过表达则可增强多种植物家族(例如水稻、小麦、番茄和棉花)对多种病原体的抗性。拟南芥snc1-1(本文简称为snc-1)是NB-LRR免疫受体SNC1的自激活点突变体(autoactivated point mutant)。
在一些实施方案中，异源多肽可以是治疗性多肽、工业酶，或其它有用的蛋白质产物。在例如Leader等，Nature Review-Drug Discovery 7：21-39(2008)中总结了示例性的治疗性多肽。治疗性多肽包括但不限于：酶、抗体、激素、细胞因子、配体、竞争性抑制剂，且可以是天然存在的或工程多肽(engineered polypeptides)。治疗性多肽可包括但不限于：胰岛素、醋酸普兰林肽、生长激素(GH)、促生长素(somatotropin)、美卡舍明、人源化美卡舍明、凝血因子VIII、凝血因子IX、抗凝血酶III(AT-III)、蛋白C、β-葡糖脑苷酶、阿葡糖苷酶α(Alglucosidase-alpha)、拉尼酶(Laronidase)、艾度硫酸酯酶(Idursulphase)、加硫酶(Galsulphase)、阿葡糖苷酶β(Agalsidase-beta)、α1蛋白酶抑制剂、乳糖酶、胰腺酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)、腺苷脱氨酶、免疫球蛋白、人类白蛋白、促红细胞生成素、达贝泊汀α(Darbepoetin-alpha)、非格司亭、培非格司亭、沙格司亭、奥普瑞白介素、人类促卵泡激素(FSH)、人类绒毛膜促性腺素(HCG)、促黄体素α、I型α干扰素(Type I alpha-interferon)、干扰素α2a、干扰素α2b、干扰素αn3、干扰素β1a、干扰素β1b、干扰素γ1b，阿地白介素、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、尿激酶、凝血因子VIIa、屈曲可净α、鲑降钙素、特立帕肽、艾塞那肽、奥曲肽、代勃特明α(Dibotermin-alpha)、重组人骨形态发生蛋白7(rhBMP7)、醋酸组氨瑞林、帕利夫明、贝卡普勒明、胰蛋白酶、奈西立肽、A型肉毒杆菌毒素、胶原酶、人类脱氧核糖核酸酶I、阿法链道酶、透明质酸酶(牛、羊)、透明质酸酶(重组人类)、木瓜蛋白酶、L-天冬酰胺酶、拉布立酶、来匹卢定、比伐卢定、链激酶、阿尼普酶、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、阿来组单抗、利妥昔单抗、曲妥单抗、阿巴西普、阿那白滞素、阿达木单抗、依那西普、英利昔单抗、阿法赛特、依法珠单抗、那他珠单抗、依库丽单抗、抗胸腺细胞球蛋白(兔)、巴利昔单抗、达利珠单抗、莫罗单抗-CD3、奥玛珠单抗、帕里珠单抗、恩夫韦地、阿西单抗、培维索孟、Crotalidae多价免疫Fab(绵羊)、地高辛免疫血清Fab(绵羊)、兰尼单抗、地尼白介素、替坦异贝莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、吉妥珠单抗奥唑米星、托西莫单抗、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HPV疫苗、OspA、抗恒河猴(Rh)免疫球蛋白G98 Rhophylac(Anti-Rhesus(Rh)immunoglobulin G98 Rhophylac)、重组纯化蛋白衍生物(DPPD)、胰高血糖素、生长激素释放激素(GHRH)、分泌素、促甲状腺激素(TSH)、促甲状腺激素(thyrotropin)、卡罗单抗喷地肽、沙妥莫单抗喷地肽(Satumomab pendetide)、阿西莫单抗、巯诺莫单抗(Nofetumomab)、阿西肽(Apcitide)、英西单抗喷替酸(Imciromab pentetate)、法索单抗锝(Technetiumfanolesomab)、HIV抗原，和丙型肝炎抗原。
本发明的构建体可包括异源启动子。术语“异源启动子”、“启动子”、“启动子区域”，或“启动子序列”通常指基因的转录调节区，其可以在插入位点的5'侧或3'侧、异源编码序列的编码区中，或内含子中被发现。通常，启动子为DNA调节区域，该DNA调节区域能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列的转录。典型的5'启动子序列在其3'端被转录起始位点限定，并向上游(5'方向)延伸，以包括在高于背景的、可检测的水平启动转录所必需的最少数量的碱基或元件。启动子序列内有转录起始位点(通过用核酸酶S1作图(mapping)方便地定义)以及负责RNA聚合酶的结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。异源启动子可以是内源基因的内源启动子；例如使用基因组编辑技术，该内源基因被修饰以包括本文所述的异R基序、uORF，和/或5'调节序列(即单独或组合)。异源启动子与选择的5'UTR可为天然结合的(natively associated)，但与异源编码序列可操作地连接。
在一些实施方案中，插入位点(无论是否包括异源编码序列)与启动子可操作地连接。在本文中，当多核苷酸与第二多核苷酸序列处于功能关系时，其“可操作地连接(operably connected)”或“可操作地连接(operably linked)”。例如，如果启动子与编码序列或插入位点连接，使其可以影响编码序列的转录，则该启动子与该插入位点或该插入位点中的异源编码序列可操作地连接。在各种实施方案中，多核苷酸可以与至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种，或至少10种启动子可操作地连接。
可用于本发明实践的启动子包括但不限于组成型、诱导型、时间调节型、发育调节型、化学调节型、组织优选型，和组织特异型启动子。用于在植物中表达的合适启动子包括但不限于来自任何植物物种的TBF1启动子，其包括拟南芥、花椰菜花叶病毒35S启动子、泛素、tCUP隐蔽组成型启动子(tCUP cryptic constitutive promoter)、Rsyn7启动子、病原体诱导型启动子、玉米In2-2启动子、烟草PR-1a启动子、糖皮质激素诱导型启动子、雌激素诱导型启动子，和四环素诱导型启动子及四环素阻抑型启动子(tetracycline-repressible promoter)。其它启动子包括T3、T7和SP6启动子序列，其通常用于RNA的体外转录。在哺乳动物细胞中，典型的启动子包括但不限于：劳氏肉瘤病毒(RSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、巨细胞病毒(CMV)、SV40病毒等的启动子，以及翻译延伸因子EF-1α启动子或泛素启动子。本领域技术人员熟悉用于各种细胞类型的各种其它启动子。在一些实施方案中，异源启动子包括植物启动子。在一些实施方案中，异源启动子包括可被植物病原体或化学诱导剂诱导的植物启动子。异源启动子可为种子特异性或果实特异性启动子。
本发明的DNA构建体可包括可操作地连接到编码RNA转录物的DNA多核苷酸的异源启动子，该RNA转录物包含位于异源编码序列的5'端的5'调节序列，该异源编码序列编码包含SEQ ID NO：475的AtNPR多肽，其中该5'调节序列包含SEQ ID NO：476(uORFsTBF1)。在一些实施方案中，此类构建体的异源启动子可包括SEQ ID NO：477(35S启动子)或SEQ ID NO：478(TBF1p)。在一些实施方案中，此类DNA构建体可包括SEQ ID NO：479(35S：uORFsTBF1-AtNPR1)或SEQ ID NO：480(TBF1p：uORFsTBF1-AtNPR1)。
提供了包括本文描述的任何构建体的载体(vector)。术语“载体”意指多核苷酸，其能够转运与其连接的另一多核苷酸。在一些实施方案中，载体可以是“质粒”，其指的是环状双链DNA环，额外的DNA片段可以连接(ligate)到该环状双链DNA环中。另一种类型的载体是为病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中额外的多核苷酸片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制，例如一些病毒载体或转座子。植物微型染色体也作为载体被包括。载体可携带遗传元件，例如赋予某些药物或化学物质抗性的遗传元件。
提供了包括本文所述的任何构建体或载体的细胞。可根据本发明使用的合适的“细胞”包括真核细胞。合适的真核细胞包括但不限于：植物细胞、真菌细胞，和动物细胞，例如来自流行的模式生物的细胞，包括但不限于拟南芥(Arabidopsis thaliana)。在一些实施方案中，细胞是植物细胞，例如但不限于：玉米植物细胞、豆类植物细胞、水稻植物细胞、大豆植物细胞、棉花植物细胞、烟草植物细胞、椰枣细胞、小麦细胞、番茄细胞、香蕉植物细胞、马铃薯植物细胞、胡椒植物细胞、苔藓植物细胞、欧芹植物细胞、柑橘植物细胞、苹果植物细胞、草莓植物细胞、油菜籽植物细胞、卷心菜植物细胞、木薯植物细胞，和咖啡植物细胞。
提供了包括本文所述的任何DNA构建体、载体，或细胞的植物。植物可以是转基因的或可用本文所述的DNA构建体或载体瞬时转化。在一些实施方案中，植物可包括但不限于玉米植物、豆类植物、水稻植物、大豆植物、棉花植物、烟草植物、枣椰植物、小麦植物、番茄植物、香蕉植物、马铃薯植物、胡椒植物、苔藓植物、欧芹植物、柑橘植物、苹果植物、草莓植物、油菜籽植物、卷心菜植物、木薯植物，和咖啡植物。
提供了用于控制细胞中异源多肽表达的方法。该方法可包括将本文所述的任何一种构建体或载体引入细胞中。优选地，构建体和载体包括编码异源多肽的异源编码序列。本文中所使用的术语“引入”描述了将外源多核苷酸(例如DNA或RNA)引入受体细胞的过程。将多核苷酸引入细胞的方法是本领域已知的，并且可包括但不限于：显微注射、转化，和转染方法。转化或转染可根据本领域熟知的各种方法在天然或人工条件下发生，并且可以依赖于任何已知的、将外来核酸序列插入宿主细胞的方法。基于被转化的宿主细胞的类型选择转化或转染的方法，并且可以包括但不限于：花浸法、农杆菌介导的转化、噬菌体或病毒感染、电穿孔、热休克、脂质转染，和粒子轰击。也可利用微量注射多核苷酸将多核苷酸和/或蛋白质引入细胞中。
可将常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法用于将多核苷酸引入细胞或靶组织中。非病毒多核苷酸递送系统包括DNA质粒、RNA、裸核酸，和与递送载体复合(complexed)的核酸，例如脂质体。非病毒递送核酸的方法包括：花浸法、农杆菌介导的转化、脂质转染、核转染、显微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子，和药剂增强的DNA摄取(agent-enhanced uptake of DNA)。脂转染在例如美国专利No.5,049,386、4,946,787，和4,897,355中描述；脂质转染试剂为可商购的(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。适用于多核苷酸的有效的受体识别脂质转染(receptor-recognition lipofection)的阳离子脂质和中性脂质包括Felgner，WO 91/17424；WO 91/16024。递送可以是递送到细胞(例如体外或离体施用)或递送到靶组织(例如体内施用)。
该方法还可以进一步包括用于重组地产生多肽的其他步骤。例如，该方法可包括从细胞中纯化异源多肽。术语“纯化”是指确保异源多肽实质上(substantially)或基本上(essentially)不含细胞组分和其他杂质的过程。多肽的纯化通常使用分子生物学和分析化学技术进行，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。纯化蛋白质的方法是本领域技术人员所公知的。“纯化的”异源多肽意指异源多肽的纯度至少为85％，更优选为至少95％，最优选为至少99％。
该方法还可包括将异源多肽配制成治疗剂，以向对象给药的步骤。在本文中所使用的术语“对象”和“患者”在本文中可互换使用，并且指人类和非人动物。本公开中的术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如：非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、小鼠、鸡、两栖动物，爬行动物等。优选地，对象是人类患者。更优选地，对象是需要异源多肽的人类患者。
本公开不限于本文所述的构造、组件布置，或方法步骤的具体细节。本文公开的组合物和方法能够以各种方式制备、实践、使用、实施和/或形成，这些方式对于本领域技术人员而言根据下面的公开内容是显而易见的。本文所使用的措辞和术语仅用于描述的目的，不应视为限制权利要求的范围。在说明书和权利要求中所使用的诸如第一、第二，和第三的顺序指示符指代各种结构或方法步骤，其并不意味着被解释为指示任何特定的结构或步骤，或为实现这样的结构或步骤的任何特定的顺序或配置。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在促进本公开，并不意味着对本公开的范围的任何限制。不应将任何说明书中的用语及附图中的结构解释为表示任何未要求保护的要素对于所公开的主题的实施是必不可少的。本文中的术语“包括”、“包含”，或“具有”及其变体的用途旨在涵盖其后列出的元素及其等同物，以及另外的元素。“包括”、“包含”，或“具有”特定元素的实施方案也被认为是“基本上由这些特定元素组成”和“由这些特定元素组成”。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作一种简写方法，该简写方法个别地提及落入该范围内的每个单独值，并且每个单独值如同其在本文中被个别地引用一样并入本说明书中。例如，如果将浓度范围表示为1％至50％，则意图在本说明书中明确列举诸如2％至40％、10％至30％，或1％至3％等的值。这些仅是具体意图的实例，并且认为在本公开中明确地陈述了在所列举的最低值和最高值之间，并包括所列举的最低值和最高值的所有可能的数值组合。使用“约”来描述特定的所述量或量的范围意味着表示非常接近所述量的值(例如在测量中由于制造公差及仪器和人为误差等而可能或自然会考虑的值)包括在该量中。除非另有说明，否则所有涉及量的百分比均以重量百分比计。
不承认任何参考文献，包括本说明书中引用的任何非专利或专利文献，构成现有技术。特别地，应理解：除非另有说明，否则本文中对任何文件的引用并不构成承认任何这些文件构成美国或任何其他国家的本领域公知常识的一部分。除非另有明确说明，否则对参考文献的任何讨论均为陈述其作者所声称的内容，并且申请人保留质疑本文引用的任何文献的准确性和相关性的权利。本文引用的所有参考文献均以引用的方式完全并入本文。如果在引用的参考文献中找到的任何定义和/或描述之间存在任何差异，则应以本公开为准。
除非上下文另有说明或指出，否则术语“一”、“该”，和“所述”意指“一个或多个”。例如，“一种蛋白质”或“一种RNA”应分别解释为“一种或多种蛋白质”或“一种或多种RNA”。本领域普通技术人员将理解本文中所使用的“约”、“大概”、“实质上”和“显著地”，并且它们在某种程度上将根据使用环境而变化。如果对于本领域普通技术人员而言，这些术语的使用在使用它们的上下文中是不明确的，则“约”和“大约”将表示特定术语的加减≤10％，且“实质上”和“显著地”将表示特定术语的加减>10％。
以下实施例仅用于说明，并不意味着对本发明或所附权利要求的范围的限制。
实施例
实施例1：揭示作为植物免疫调节的基本层面的全局翻译重编程
在没有专门的免疫细胞的情况下，植物重编程转录，以便从生长相关活动转变为防御的需求是已公知的1,2。然而，我们对免疫诱导期间发生的翻译变化知之甚少。使用核糖体足迹法(RF)，我们对暴露于微生物相关分子模式(MAMP)elf18的拟南芥进行了全局翻译图谱分析。我们发现，在由此产生的模式触发的免疫(PTI)过程中，翻译被严格调控并且与转录的相关性很差。对具有改变的翻译效率(TE)的基因的辨认导致发现这种免疫应答的新型调节因子。对这些基因的进一步研究表明，mRNA序列的特征(features)，而非丰度，是观察到的TE变化的主要决定因素。在具有增加的TE的转录物的5'前导序列中，我们发现了高度富集的mRNA共有序列，R基序，其主要由嘌呤组成。我们发现R基序通过与poly(A)结合蛋白的相互作用来调节响应于PTI诱导的翻译。因此，该研究不仅提供了植物PTI期间全局翻译重编程的有力的证据，而且提供了其分子机制。
结果
在病原体攻击后，植物和动物的第一线主动防御涉及通过模式识别受体(PRR)识别微生物相关分子模式(MAMP)，例如拟南芥(Arabidopsis)FLS2用于识别细菌鞭毛蛋白(表位flg22)，以及EFR用于识别细菌翻译延伸因子EF-Tu(表位elf18和elf26)3。在植物中，PRR的激活导致模式触发的免疫(PTI)，其特征为一系列的细胞变化，包括氧化爆发(oxdiativeburst)、MAPK活化、乙烯生物合成、防御基因转录和增强的对病原体的抗性4。通过分子遗传学方法和全基因组表达谱分析5-7，已经对PTI相关的转录变化进行了广泛的研究。然而，我们之前的报告显示，除了转录控制外，在防御反应期间还迅速诱导关键的免疫转录因子(TF)TBF1的翻译1。TBF1翻译受TBF1 mRNA内的两个上游开放阅读框(uORF)调节。在免疫诱导后，uORF对TBF1下游的主要ORF(mORF)的翻译的抑制作用迅速减轻。与TBF1类似，发现秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)免疫TF，ZIP-2，的翻译受3个uORF的调节8，这表明对关键的免疫TF的预先存在的mRNA的去抑制翻译(de-repressing translation)可能是对病原体攻击的快速反应的常见策略。除了uORF介导的TBF1翻译外，还证明了一种非蛋白质氨基酸，β-氨基丁酸(BABA)，对天冬氨酰-tRNA合成酶的扰动可以引发植物的广谱抗病性9。这些研究表明翻译控制是免疫应答的主要调节步骤。
为了监测植物免疫应答期间的翻译变化，我们生成了拟南芥35S:uORFsTBF1-LUC报告基因的转基因系(transgenic line)(图1A)。我们发现在野生型(WT)背景中，报告基因的活性响应于MAMP和elf18，在浸润后一小时(hpi)发生峰值诱导(peak induction)(图1B和图5A)，与转录变化无关(图5B)。这种翻译诱导在efr-1突变体中受到损害(compromised)，elf18受体EFR有缺陷5(图1B和图5C)，表明elf18通过其细胞表面受体的活性调节35S:uORFsTBF1-LUC报告基因的翻译。与报告基因的研究一致，多聚核糖体图谱分析显示，在没有总体翻译活性变化的情况下(图1C和图5D)，内源性TBF1 mRNA在WT中进行elf18处理后与多聚核糖体部分(polysomal fraction)的相关性显著增加，但在efr-1突变体中则没有(图1D和图5E)。
使用针对35S:uORFsTBF1-LUC报告基因优化的条件，我们收集用Mock或elf18处理的植物叶组织，以根据对先前公开的方法10-13(图6-8的所有部分、表A)进行修改所产生的方案产生核糖体足迹-seq(RF-Mock对RF-elf18)和RNA-seq(RS-Mock对RS-elf18)的库(图1E)。使用全局翻译状态评估策略(global translational status evaluation strategy)确定mRNA翻译效率(TE)，所述全局翻译状态评估策略涉及通过测序(Ribo-seq)对应(versus)使用RNA-seq测量可用的mRNA，以对核糖体捕获的mRNA片段进行计数。该策略先前已应用于研究不同生理条件下的蛋白质合成，例如植物对光、缺氧、干旱和乙烯的反应11-14。
表A：每次处理后的读数
RS-Mock RS-elf18 RF-Mock RF-elf18
原始读数 Rep1 47,065,199 58,742,659 133,768,593 116,236,853
Rep2 47,592,232 58,270,271 113,653,155 125,304,695
超过的读数(passed reads) Rep1 27,486,543 26,884,242 42,718,923 51,033,470
Rep2 18,843,216 26,721,006 51,905,987 63,096,238
独特的映射(unique mapped) Rep1 15,576,608 11,988,097 16,809,599 24,748,709
Rep2 8,463,878 15,824,810 24,866,878 20,900,174
基于转录组中倍数变化的差异分析(RSfc；图8B)，我们发现在elf18处理后，943个和676个基因分别被转录诱导(RSup)和抑制(RSdn)。RSup基因所富集的基因本体(GO)条目(terms)包括防御反应和免疫应答(表B)，而RSdn基因未发现GO条目富集。同时，对翻译谱(RFfc)的差异分析发现在elf18处理后，523个基因具有增加的翻译(RFup)，43个基因显示翻译减少(RFdn)(图8B)。RF倍数变化的范围(0.177至40.5)比RS倍数变化的范围(0.0232至160)窄得多，表明在PTI期间的翻译比转录的调控更为严格(p值＝3.22E-83；图2A)。然后，我们使用内源性TBF1作为阳性对照，根据先前报道的公式15计算TE值(图8B和9B)。TBF1的TE通过对其外显子2的读数进行计数，以区别于包含TBF1基因的外显子1的35S:uORFsTBF1-LUC报告基因的读数。与LUC报告基因测定和多聚核糖体分离(polysome fractionation)数据一致(图5A和5E)，在我们的翻译分析中，elf18处理后内源性TBF1的TE也增加(图9C)。
表B：RS上调基因的GO条目富集分析
GO条目 观察到的频率 P值
GO:0010200响应甲壳素 7.80％ 9.80E-46
GO:0009743响应碳水化合物刺激 8.40％ 2.02E-40
GO:0050896响应刺激 31.50％ 8.69E-31
GO:0010033响应有机物 14.40％ 1.57E-24
GO:0042221响应化学刺激 18.80％ 1.45E-22
GO:0006952防御反应 10.50％ 1.77E-20
GO:0006950响应压力 18.90％ 9.80E-19
GO:0002376免疫系统过程 5.80％ 2.73E-16
GO:0006955免疫反应 5.20％ 1.03E-14
GO:0051707响应其它生物 7.70％ 1.42E-14
GO:0045087先天免疫反应 5.10％ 2.58E-14
GO:0051704多生物过程 7.80％ 4.14E-14
GO:0009607响应生物刺激 7.90％ 5.72E-14
GO:0009620响应真菌 3.80％ 5.78E-12
与在同一样品中观察到的转录和翻译水平之间的强相关性相比(Mock的皮尔逊相关值r＝0.91，elf18的的皮尔逊相关值r＝0.89；图2B)，转录和翻译中的倍数变化(elf18/Mock)的相关性差(r＝0.41；图2C)，表明PTI的诱导涉及全局TE的显著移位(shift)。在TE移位的mRNA中，448个具有增加的TEfc，389个基因显示出降低的TEfc(|z|≥1.5)。在TEfc和mRNA长度或GC组成之间未发现相关性(图9D)。更重要的是，TE变化与mRNA丰度之间几乎没有相关性(r＝0.19；图2D和2E)，与在其它系统中进行的研究13,15一致。因此，转录和TE都参与控制PTI期间的蛋白质产生。我们的结果表明除了丰度之外，mRNA的特征可能是TE的主要决定因素。
在elf18处理后具有增加的TE(z≥1.5)的基因中，我们发现与细胞表面受体信号传导途径相关的基因的中度富集(表C)。免疫相关的GO条目的富集的缺乏与大多数TE改变的基因不受转录调控，因此在以前的研究中不太可能被鉴定为“与防御有关”的这一事实是一致的；这些以前的研究中主要集中在转录变化上。然而，通过人工检查TE改变的基因列表，我们发现了乙烯相关和损伤相关的分子模式Pep介导的PTI信号通路的几乎每一步的已知成分或已知成分的同源物7,16,17(图2D和2F)。
表C：响应于elf18处理的TE上移基因中发现的GO条目富集
GO条目 观察到的频率 P值
GO:0050896响应刺激 23.50％ 9.77E-04
GO:0006464蛋白质修饰过程 10.60％ 3.43E-03
GO:0007166细胞表面受体连接信号(linked signal) 2.80％ 5.08E-03
GO:0009416响应光刺激 5.30％ 5.08E-03
GO:0007165信号传导 8.40％ 5.53E-03
GO:0006468蛋白质磷酸化 7.80％ 6.49E-03
GO:0016310磷酸化 7.80％ 7.95E-03
GO:0016070RNA代谢过程 5.90％ 8.88E-03
为了证明TE测量是揭示elf18信号传导途径中涉及的新基因的有效方法，我们测试了5个TE改变的基因的突变体对Pseudomonas syringae pv.maculicola ES4326(PsmES4326)的elf18诱导的抗性。属于拟南芥乙烯受体相关基因家族的EIN4和ERS118和编码乙烯诱导的钙调蛋白结合蛋白的EICBP.B在elf18处理后显示出增加的TE。参与乙烯介导的生长素增加的WEI719和乙烯反应性TF基因ERF1的同源物ERF720显示出响应于elf18处理的TE减少。我们发现，用elf18的预处理诱导了对WT而非erf-1中的Psm ES4326的抗性；在测试的5个突变体中，ers1-10和wei7-4显示与WT类似的、对elf18的响应性，而ein4-1、erf7，和eicbp.b显示出对elf18诱导的对Psm ES4326的抗性的不敏感(图2G)。ein4-1、erf7，和eicbp.b的突变表型不太可能是由于MAPK3/6活性缺陷或胼胝质沉积，因为发现这两者在在这些突变体中都是未受损伤的(图10A和10B)。
使用双荧光素酶系统，我们发现EIN4的3'UTR导致elf18诱导的TE增加(图2I和图10C)；该双荧光素酶系统允许使用海肾荧光素酶(RLUC)参照来计算TE；该海肾荧光素酶(RLUC)参照被与测试基因的的35S组成型启动子相同的35S组成型启动子所驱动。此外，我们证实EIN4中elf18诱导的的TE增加依赖于elf18受体EFR(图2J)。与EIN4相反，ERF7和EICBP.B参与一般的乙烯反应，并因此可能在防御特异性乙烯途径中起作用的这一点是不为人所知的。基于其TE改变，发现作为新的PTI组分的EIN4、ERF7和EICBP.B表明：在TE改变的基因列表中可能存在更多新的PTI调节因子，并强调了这一方法的实用性。
为了确定控制PTI特异性翻译的潜在机制，我们研究了具有elf18触发的TE变化的那些转录物的mRNA序列特征。根据我们之前对TBF1(TBF1的翻译受两个uORFs的调控1)的研究，我们首先对uORF的存在进行搜索(图11A和11B)。除TBF1外，uORF还与植物21和动物22中不同细胞功能的基因相关。为了研究响应于elf18处理的uORF介导的翻译控制，计算来自Mock和elf18处理的所有含uORF的基因的mORF的RF RPKM与其关联(cognate)uORF的比例。我们发现来自uORF和mORF的RF读数之间没有直接或反向整体相关性(r＝0.23～0.26)，表明uORF对其下游mORF的翻译具有中性、正面，或负面影响(图11C)。我们检测到为响应elf18，属于150个基因的152个uORF显示出核糖上移(ribo-shift up)(即增加的mORF/uORF比例),以及属于126个基因的和132个uORF显示出核糖下移(ribo-shift down)(即降低的mORF/uORF比例)(图11D)。有趣的是，具有elf18诱导的核糖移位(ribo-shift)的这些基因与响应缺氧11的基因几乎没有重叠(图11E和11F)，表明uORF介导的翻译可能是信号特异性的。然后，我们关注那些响应elf18处理的、TEfc改变的基因，发现其中36个含有至少一个uORF，其具有显著的响应于elf18处理的核糖移位。对于这36个基因，uORF翻译和mORF翻译之间的拮抗作用可以解释所观察到的、响应elf18的TE变化，如对TBF1所观察到的。几种TE基因中的5'UTR和uORF序列示于表1中。
表1：TE UTR和uORF序列
为了进一步发现用于elf18介导的翻译控制的新mRNA序列特征，在5'前导序列(即mORF起始密码子上游的序列)和TE改变的基因的3'UTR中进行了富集的基序搜索。识别出在TE上移转录物的5'前导序列中显著富集的共有序列(38.2％，E值＝1.2e-141)(表2)。由于该元素几乎只含有嘌呤(图3A)，我们根据IUPAC核苷酸歧义代码(IUPAC nucleotideambiguity code)将其命名为“R基序”。在TE上移转录物的3'UTR中或在TE下移转录物的5'前导序列或3'UTR中未发现一级序列共有序列。我们使用MEME套件中的FIMO工具23在所有拟南芥转录物的5'前导序列中寻找15nt的R基序的出现，并在17.7％的转录物中发现R基序，其富含GO条目：对刺激的响应和生物调节。
表2：具有R基序的TE上移
为了检验R基序对elf18诱导的翻译的影响，我们使用双荧光素酶系统测试了含有20个R基序的TE-up基因的5'前导序列。与它们在控制翻译中的已知重要性24一致，不同的5'前导序列在标准化至mRNA水平后显示出独特的基础翻译活性(basal translationalactivities)(图12A)。在所测试的20个5'前导序列中的15个中证实了elf18介导的TE增加(图3B)。我们随后生成R基序缺失突变体报告基因(R-motif deletion mutantreporters)，并发现其中11个显示TE增加，而只有两个相比其相应的WT对照显示出减少的TE(图3C和图12B)。在这些缺失突变体中观察到的翻译变化不太可能是由于转录物的缩短，因为当IAA8、BET10和TBF1中的R基序通过多碱基对取代突变时观察到类似的效果(图12C-F)。这些结果表明R基序在基础翻译活性中的主要的负面作用。我们随后检查了R基序缺失突变体报告基因对elf18诱导的反应性，发现6个与对照相比具有消除的或减少的反应(图3D和图12G和12H)，表明释放R基序介导的抑制可能是PTI期间的这些基因的激活机制。为了证明R基序足以响应elf18，将重复的GA、G[A]3、G[A]6和混合G[A]n插入到报告基因的5'前导序列中；该重复的GA、G[A]3、G[A]6和混合G[A]n是在内源基因的R基序中发现的核心序列模式。我们发现所得到的报告基因的翻译确实对elf18诱导产生了响应(图3E和图12I)。然而，一些基因中的R基序可能在对翻译的调节中具有更不复杂或更复杂的作用，因为删除这些基因中的R基序不会影响它们在elf18处理时的翻译(图12H)。这些转录物中的其他mRNA序列特征可能影响R基序活性。
然后在TBF 1中方便地研究了在PTI介导的翻译期间R基序和uORF之间的关系，因为在其转录物中同时发现了这两种特征(图1A)。使用双荧光素酶系统的TE评估显示，与uORFsTBF1突变体(两种uORF的起始密码子的ATG至CTG突变；图3F和图12J)相比，R基序的缺失对TBF1的基础翻译没有显著影响。然而，R基序和uORF突变体报告基因在瞬时表达分析以及转基因植物中都表现出对elf18的、受损的响应(图3G和图12K，L)。效果似乎是相加的，表明R基序和uORF通过不同的机制控制翻译。
我们假设R基序影响翻译的机制可能是通过与poly(A)结合蛋白(PABs)的结合，因为已经显示这些蛋白不仅与转录物的poly(A)尾结合以促进翻译，而且还与位于其自身的5'前导序列中的富含A的序列结合以抑制翻译25,26。为了检验我们的假设，我们检验了II类PAB(即PAB2、PAB4和PAB8)，它们是基于遗传数据的植物中的主要PAB27。我们将PAB2与三个单独的R基序依赖性基因(R-motif-dependent genes)ZIK3、BET10和SK2共表达，并将PAB2与一个R基序非依赖性基因(R-motif-independent gene)，SAC2，共表达作为对照。我们发现，当与PAB2共表达时，所有的三个R基序依赖性基因，但非对照，具有较低的TE，并且通过删除R基序可以克服这种抑制(图4A和图13A)。这种PAB2效应可能是通过与R基序的直接物理相互作用，因为在体外结合测定中，PAB2与GA、G[A]3、G[A]6和G[A]n重复的亲和性与PAB2和poly(A)的亲和性相近(图4B和4C)。此外，可以使用G[A]n RNA探针下拉植物合成的PAB2(图4D)。令人惊讶的是，来自elf18诱导的植物的PAB2似乎比mock处理的对照更紧密地结合探针，表明不太可能通过PAB2的解离发生elf18触发的去抑制(derepression)。已知PAB2通过磷酸化切换其活性28，其可能在进行elf18处理时发生。
我们接下来检查了pab2 pab4和pab2 pab8双突变体的表型(三重突变体是不可存活的)29。为了区分突变对一般翻译的作用，我们将我们的表征(characterization)集中在对elf18的敏感性上。我们首先示出通过核糖体分离的测量，pab2 pab4双突变体中内源性TBF1的elf18触发的TE增加受损(图4E)。然后，我们对有和没有elf18预处理的Psm ES4326进行了耐药性测试。与WT相比，在elf18处理后，双突变体具有显著升高的对Psm ES4326的基础抗性，但是对病原体的抗性降低(图4F)。通过将PAB2转化为pab2 pab8双突变体背景来拯救对elf18的这种不敏感性(图4G)。PAB不仅对elf18诱导的对Psm ES4326的抗性是必需的，而且对于生长-防御转换也是关键的，因为在pab2 pab4和pab2 pab8突变体中，elf18对植物生长的抑制作用减弱(图13B)。这些数据支持我们的假设，即PAB在背景翻译中起消极作用，但在elf18诱导的翻译中起积极作用(图4H)。PAB的活性是否受已知的PTI信号传导途径(例如MAPK3/6)的组分调节仍有待测试。在pab2 pab4和pab2 pab8突变体中检测到MAPK3/6活性，尽管在pab2 pab4中的活性较低(图13C)，表明PAB可以在MAPK3/6的下游起作用：其可能作为底物或在独立途径中起作用。
包括拟南芥在内的任何宿主激活免疫相关的翻译的分子机制在很大程度上是未知的。除了uORF介导的关键免疫TF(例如拟南芥中的TBF1和秀丽隐杆线虫中的ZIP-28)的翻译，我们在elf18介导的TE-up转录物中识别了R基序。uORF和R基序通常都抑制PTI相关基因的翻译(图3的所有部分)。免疫诱导后，抑制作用减弱，允许防御蛋白的快速积累。在酵母中，在饥饿期间去除对GCN4翻译的uORF抑制，此时不带电荷的tRNA的积累激活GCN2，以磷酸化翻译起始因子eIF2α及使翻译起始因子eIF2α失活30。令人惊讶的是，我们发现植物中唯一已知的eIF2α激酶GCN231是elf18诱导的eIF2α磷酸化所必需的，但并非elf18诱导的TBF1翻译或对细菌的抗性(图14A-14D)所必须的；这表明植物中的免疫诱导的翻译重编程(translational reprogramming)的替代机制。
R基序对翻译的抑制作用可能由PAB蛋白介导，因为使基序或PAB突变导致对elf18诱导的响应性的降低(图3和图4的所有部分)。据报道，PAB可以被翻译后修饰并受到相互作用蛋白(interactors)的调控，这会影响PAB在翻译中的活性28。需要进一步研究以剖析R基序的调控机制，并理解PAB在不同翻译机制中的作用，所述翻译机制为，例如，在酵母中观察到的内部核糖体进入位点(IRES)介导的翻译活性32。有趣的是，R基序在来自其它生物的mRNA(包括人类p53 mRNA)中也很普遍，这表明保守的调控机制可能在不同物种之间共享。
方法
植物生长、转化和处理
使植物在土壤(Metro Mix 360)上，于22℃、12/12h光/暗循环，和55％相对湿度下生长。先前描述过efr-15、ers1-10(一种弱的功能获得突变(gain-of-function mutant))33、ein4-1(一种功能获得突变)18、wei7-4(一种功能缺失突变(loss-of-function mutant))19、eicbp.b(camta 1-3；SALK_108806)34、pab2 pab429和pab2 pab829。efr7(SALK_205018)和gcn2(GABI_862B02)来自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological ResourceCenter，ABRC)。使用花浸法35产生转基因植物。
Ribo-seq库构件
收集来自～24颗3周龄植物(2片叶子/植物；～1.0g)的叶子。将组织快速冷冻并在液氮中研磨。加入5毫升冷多聚核糖体提取缓冲液[PEB；200mM Tris pH 9.0，200mM KCl，35mM MgCl2，25mM EGTA，5mM DTT，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，50μg/ml环己酰亚胺，50μg/ml氯霉素，1％(v/v)Brij-35，1％(v/v)Igepal CA630，1％(v/v)吐温20，1％(v/v)Triton X-100，1％脱氧胆酸钠(DOC)，1％(v/v)聚氧乙烯10十三烷基醚(PTE)]。在冰上解冻10分钟后，将裂解物在4℃/16,000g下离心2分钟。将上清液转移至40μm过滤falcon管中，并以4℃/7,000g离心1分钟。然后将上清液转移到2ml管中，以4℃/16,000g离心15分钟，并重复该步骤一次。保存0.25ml裂解物用于总RNA提取以制备RNA-seq库。在超速离心管中(#349623，Beckman)将另外1ml裂解物层叠在0.9ml蔗糖垫[400mM Tris·HCl pH 9.0，200mM KCl，35mM MgCl2，1.75M蔗糖，5mM DTT，50μg/ml氯霉素，50μg/ml环己酰亚胺]之上。然后将样品在TLA100.1转子中以4℃/70,000rpm离心4小时。将沉淀物(pellet)用冷水洗涤两次，重悬于300μl RNaseI消化缓冲液[20mM Tris·HCl pH 7.4，140mM KCl，35mM MgCl2，50μg/ml环己酰亚胺，50μg/ml氯霉素]11中，然后转移至用于短暂离心的新管。然后将上清液转移到另一个新管中，其中加入10μl RNaseI(100U/μl)，并在25℃温育60分钟。然后加入15μlSUPERase-In(20U/μl)以终止反应。如先前所报道10的那样进行随后的步骤，包括核糖体回收、足迹片段纯化(footprint fragment purification)、PNK处理和接头连接。然后将2.5μl的5′去腺苷化酶(deadenylase)(NEB)加入到连接系统中并在30℃下孵育1小时。随后加入2.5μlRecJf核酸外切酶(NEB)，并在37℃温育1小时。将酶在70℃下灭活20分钟，并将10μl的样品作为逆转录的模板。库构件的其余步骤按照报告的方法10进行，除了根据另一种报道的方法11，使用生物素化的寡核苷酸rRNA1和rRNA2对拟南芥进行库构建的其余步骤。
RNA-seq库构建
将0.75mlLS(Ambion)加入到从Ribo-seq库构建中保存的0.25ml裂解物中，使用Nanodrop(Thermo Fisher Scientific Inc)从中提取，定量和鉴定总RNA。使用Oligo(dT)25(Invitrogen)和50-75μg总RNA用于mRNA纯化。将20μl纯化的poly(A)mRNA与20μl2×片段化缓冲液(2mM EDTA，10mM Na2CO3，90mM NaHCO3)混合，并在95℃下孵育40分钟，然后在冰上冷却。然后将500μl冷水、1.5μl GlycoBlue和60μl冷3M乙酸钠加入样品中并混合。随后，加入600μl异丙醇，然后在-80℃下沉淀至少30分钟。然后将样品以4℃/15,000g离心30分钟以除去所有液体并空气干燥10分钟，然后再悬浮于5μl的10mM TrispH8中。其余步骤与Ribo-seq库制备相同。
质粒
为了构建35S:uORFsTBF1-LUC报告基因，使用Reporter-F/R引物，从p35S:uORF1-uORF2-GUS1扩增35S启动子和TBF1外显子1，包括R基序、uORF1-uORF2和TBF1的前73个氨基酸的编码序列，然后通过Gateway重组连接到pGWB23536中。通过融合来自pMDC14037的35S启动子的PCR片段、来自pRNAi-LIC38的ccdB盒和NOS终止子以及来自pGWB23536的LUC，构建35S:ccdB盒-LUC-NOS构建体。然后通过PstI和EcoRI将35S:ccdB盒-LUC-NOS插入pCAMBIA1300中，并命名为pGX301，以通过置换ApaI侧接的ccdB盒(ApaI-flanked ccdBcassette)来克隆5'前导序列38。类似地，通过融合来自pMDC14037的35S的PCR片段、来自pmirGLO(Promega，E1330)的RLUC和来自pCRG3301的rbs终止子来制备35S:RLUC-HA-rbs终止子构建体39。将被EcoRI侧接的35S:RLUC-HA-rbs片段通过TA克隆插入pTZ-57rt(Thermofisher，K1213)以产生pGX125。从拟南芥(Col-0)基因组DNA扩增5'前导序列或由BioBasics(纽约，美国)合成5'前导序列，并插入pGX301，然后通过EcoRI从pGX125转移35S:RLUC-HA-rbs。分别从U21686、C104970、U10212和U15101(来自ABRC)扩增EFR、PAB2、PAB4和PAB8，并通过PCR与EGFP的N末端融合。然后将融合片段插入35S启动子和rbs终止子之间，以产生35S:EFR-EGFP(pGX664)、35S:EFR(pGX665)，和35S:PAB2-EGFP(pGX694)。
LUC报告基因测定和双荧光素酶测定
为了记录35S:uORFsTBF1-LUC报告基因活性，在用10μMelf18(GenScript合成)或10mM MgCl2作为Mock浸润(infiltration)之前12小时用1mM荧光素喷洒3周龄的拟南芥植物。在装有CCD相机的盒子(Lightshade公司)中记录荧光素酶活性，每次暴露时间为20分钟。对于双荧光素酶测定，本塞姆氏烟草(N.benthamiana)植物在22℃和12/12h光/暗循环下生长。将双荧光素酶构建体转化到农杆菌(Agrobacterium)菌株GV3101中，将其在28℃下，在提供有卡那霉素(50mg/l)、庆大霉素(50mg/l)和利福平(25mg/l)的LB中培养过夜。然后将细胞以2,600g离心5分钟，重悬浮于浸润缓冲液[10mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、10mM MgCl2、200μM乙酰丁香酮]中，调节至OD600nm＝0.1，在室温下再孵育4小时，然后使用1ml无针注射器进行浸润。对于elf18诱导，在双荧光素酶构建体和EFR-EGFP以1：1的比例共浸润(co-infiltrated)后20小时渗入10mM MgCl2(mock)溶液或10μM的elf18，并在处理后2小时收集样品。对于PAB2-EGFP共表达测定，将含有双荧光素酶构建体的土壤杆菌(Agrobacterium)与含有PAB2-EGFP构建体的土壤杆菌以1：5的比例混合。收集叶盘，在液氮中研磨并用PLB缓冲液(Promega，E1910)裂解。将裂解物以15,000g离心1分钟，使用Victor3板读数器(PerkinElmer)将其中10μl用于测量LUC和RLUC活性。在25℃下，使用自动注射器添加LUC和RLUC的底物，并且在3秒振荡和3秒延迟后，捕获信号3秒并记录为CPS(每秒计数)。
elf18诱导的生长抑制和对Psm ES4326的抗性
对于elf18诱导的生长抑制测定，将种子在2％PPM溶液(Plant Cell Technology)中于4℃灭菌3天，并在有或没有100nM elf18的MS培养基(1/2MS基础盐，1％蔗糖和0.8％琼脂)上播种。将10日龄幼苗称重，每个样品10个幼苗。对于elf18诱导的对Psm ES4326的抗性，在用Psm ES4326(OD600nm＝0.001)感染相同的叶片前1天，将1μM的elf18或Mock(10mMMgCl2)渗入3周龄土壤生长的植物中。感染后3天对细菌生长进行评分。
Elf18诱导的MAPK活化和胼胝质沉积(callose deposition)
对于MAPK活化，将在MS培养基上生长的12日龄幼苗用1μM的elf18溶液淹没(flooded)，并在指定的时间点收集25个幼苗。用co-IP缓冲液[50mM Tris，pH 7.5，150mMNaCl，0.1％(v/v)Triton X-100，0.2％(v/v)Nonidet P-40，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)，phos-stop磷酸酶抑制剂鸡尾酒(phos-stop phosphatase inhibitor cocktail)(Roche)]提取蛋白质。对于胼胝质沉积，用1μM的elf18渗入3周龄的土壤生长的植物。温育20小时后，收集叶子，在100％乙醇中轻轻摇动4小时以脱色，在水中再水化30分钟，然后在用铝箔覆盖的0.01M K3PO4 pH 12中的0.01％(w v)苯胺蓝中温和摇晃24小时以染色。使用Zeiss-510倒置共聚焦(inverted confocal)，用405nm的激光进行激发，用420-480nm的滤光片进行发射，以观察胼胝质沉积。
体外和体内合成的PAB蛋白的RNA下拉
从pGX694扩增PAB2-EGFP。使用Bio Basics(New York，USA)合成GA、G[A]3和G[A]6，而通过IDT(www.idtdna.com/site)合成poly(A)和G[A]n。根据制造商的说明书(BioSieg，Japan)，用小麦胚芽翻译系统进行体外转录和翻译。为了制备生物素标记的RNA探针，将2μl的10mM生物素-16-UTP(11388908910，Roche)加入到转录系统中。然后使用DNase I去除DNA模板。根据制造商的说明，将0.2nmol生物素标记的RNA与50μl链霉抗生物素蛋白磁珠(65001，Thermo Fisher)缀合。将体外合成的PAB2-EGFP与生物素标记的RNA在甘油-co-IP缓冲液[50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，2.5mM EDTA，10％(v/v)甘油，1mM PMSF，20U/mLSuper-In RNase抑制剂，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)]中孵育。为了进行体内下拉实验，将PAB2-EGFP与elf18受体EFR(pGX665)在本塞姆氏烟草中共表达40小时，然后用Mock或elf18处理2小时。用甘油-co-IP缓冲液提取蛋白质，并在4℃下的下拉测定中使用4小时。
多聚核糖体分析
将0.6g拟南芥组织在液氮中用2ml的冷PEB缓冲液研磨。将1ml粗裂解物上样至10.8ml的15％-60％蔗糖梯度，并在4℃下离心10小时(35,000rpm，SW 41Ti转子)。如之前所描述的40进行A254吸光度记录和分离。通过沉淀(pelleting)多聚核糖体分离多聚RNA，并如前所述将TE计算为多聚核糖体/总mRNA的比例。
实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)
按照说明书(Ambion)，使用TRIzol将约50mg叶组织用于总RNA提取。在DNase I(Ambion)处理后，使用oligo(dT)，按照SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)的说明进行逆转录。使用FastStart Universal SYBR Green Master(Roche)进行实时PCR。
生物信息学和统计分析
按照图8和表0中所示的标准进行读数处理和统计学方法。通常，Bowtie2用于比对(align)拟南芥TAIR10基因组的读数41。使用HT-seq42实现读数分配(read assignment)。使用DESeq243计算转录组(transcriptome)和翻译组(translatome)变化。使用基因指定给外显子的读数确定蛋白质编码基因的转录组倍数变化(RSfc)。使用基因分配给CDS的读数测量蛋白质编码基因的翻译组倍数变化(RFfc)。如所报道15的那样，在两个生物学重复中，将在CDS阈值中超过RPKM≥1的所有基因的读数组合，并将Ribo-seq RPKM标准化为RNA-seqRPKM来计算TE。用于uORF预测的标准如图11所示，并使用systemPipeR(github.com/tgirke/systemPipeR)执行。MEME在线工具23用于搜索链特异性5'前导序列，以获得与具有默认参数的全基因组5'前导序列相比的富集的共有序列。使用IGB44呈现密度图。使用MEME套件23中的FIMO工具进行全转录组R基序搜索。首先使用Shapiro-Wilk测试，测试LUC/RLUC比例的正态分布。将双侧学生t检验用于两个样本之间的比较。将双侧单向ANOVA或双向ANOVA用于两个以上的样品，将Tukey测试用于多重比较。将GraphPad Prism 6用于所有统计分析。除非特别说明，否则样品大小n表示生物学重复，并且已经进行了三次实验，结果相似。*P<0.05、**P<0.01，***P<0.001、****P<0.0001表示显著增加；ns：没有意义；P<0.001表示显著下降。
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实施例2-使用uORF介导的翻译控制，以最小的健康度惩罚增强植物抗病性的广泛 适用的策略
自农业出现以来，人类一直在尽力控制植物病害1,2。对植物免疫机制的研究已经引起通过植物自身的防御基因(例如主免疫调节基因NPR13)的异位转录，以工程抗性作物的策略。然而，通过这种策略获得的增强的抗性通常与显著的健康度惩罚4-9相关，使得所获得的产物不适合农业应用。为了解决这个问题，我们寻求更严格的表达防御蛋白的机制。根据我们的最新发现，即关键免疫调节因子(如TBF110)的翻译在病原体攻击后被快速和瞬时地诱导(见附稿)，我们开发了“TBF1-盒”，其由TBF1基因的免疫诱导性启动子(immune-inducible promoter)和两种病原体-响应上游开放阅读框(uORFsTBF1)组成。我们证明了在拟南芥中的snc1(自激活免疫受体)和水稻中的AtNPR1的生产中包含uORFsTBF1介导的转录控制使我们能够在不损害实验室或田间植物的健康度的情况下工程广谱抗病性。这种广泛适用的新策略可能会减少农药的使用，并减少抗性病原体的选择压力。
为了满足世界人口爆炸造成的粮食生产需求，同时限制农药污染，必须制定新的策略来控制作物病害2。作为传统的化学方法和育种方法的替代方法，对植物免疫机制的研究使得通过对植物自身的抗性赋予基因11,12的异位表达来工程抗性成为可能。植物中主动防御的第一线涉及通过宿主的模式识别受体(PRR)识别微生物/损伤相关的分子模式(M/DAMPs)，并被称为模式触发的免疫反应(PTI)13。已经显示，MAMP的PRR的异位表达14,15和DAMP信号eATP5的PRR的异位表达，以及DAMP分子、寡聚半乳糖醛酸苷16的体内释放均增强转基因植物的抗性。除PRR介导的基础抗性外，植物基因组还编码数百种细胞内核苷酸结合和富含亮氨酸重复(NB-LRR)免疫受体(也称为“R蛋白”)，以检测在植物细胞内传递的病原体效应物的存在17。已将单个或堆叠的R基因转化到植物中以赋予效应子触发的免疫(ETI)18,19。除PRR和R基因外，NPR1是另一种用于工程植物抗性的基因11。与由特定MAMP和病原体效应子激活的免疫受体不同，NPR1是由一种普遍的植物免疫信号，水杨酸，诱导的广谱抗性的正调节因子3。拟南芥NPR1(AtNPR1)的过表达可增强多种植物家族(例如水稻20-22、小麦23、番茄24，和棉花25)对多种病原体的抗性。
然而，工程抗病性的主要挑战是克服相关的健康度成本4-9。在没有专门的免疫细胞的情况下，植物的免疫诱导涉及从生长相关的活动转变为防御10,26。植物通常通过严格控制转录、mRNA核输出和防御蛋白降解来避免自身免疫27。然而，到目前为止，只有转录控制在工程抗病性方面得到了普遍使用4,28。基于我们的全局翻译图谱分析(见附稿)，我们发现翻译是免疫诱导过程中的一个基本调控层，可以对其进行探索，以允许更严格的病原体诱导性的防御蛋白表达。
为了验证我们的假设，即更严格地控制防御蛋白质翻译可以使与增强的抗病性相关的健康度惩罚最小化，我们使用TBF1启动子(TBF1p)和5'前导序列(在TBF1的起始密码子之前)；我们将其命名为“TBF1盒”。TBF1是免疫诱导后的植物生长-防御转换的重要转录因子10。TBF1的翻译通常被5'前导序列中的两个uORF抑制10。BLAST分析显示uORF2TBF1在几种植物物种中为保守的(conserved)(>50％同一性)(图18A-D)；uORF2TBF1为赋予翻译抑制的主要mRNA特征(附稿和参考文献10)。这表明进化上保守的控制机制，以及潜在的通过使用TBF1盒来调节拟南芥以外的植物物种中的防御蛋白质的产生。
为了探索uORFsTBF1的应用，我们首先分别使用萤火虫荧光素酶(LUC，图19A)和GFPER(图19B)作为在野生型(WT)uORFsTBF1(35S:uORFsTBF1-LUC/GFPER)或突变体uorfsTBF1(35S:uorfsTBF1-LUC/GFPER)的控制下的代理(proxies)，测试其控制细胞质合成蛋白质(cytosol-sythesized proteins)和ER合成蛋白质(“靶”)的能力；在野生型(WT)uORFsTBF1(35S:uORFsTBF1-LUC/GFPER)和突变体uorfsTBF1(35S:uorfsTBF1-LUC/GFPER)中，两种uORF的ATG起始密码子变为CTG(图15A)。本塞姆氏烟草(N.benthamiana)中的瞬时表达显示uORFsTBF1可以在很大程度上抑制细胞质质合成的LUC和ER合成的GFPER而不显著影响mRNA水平(图15B、15C和图19C、19D)。这种uORFsTBF1介导的翻译抑制足够严格，以防止在35S:uorfsTBF1-TBF1-YFP中观察到的TBF1过表达(TBF1-YFP)诱导的细胞死亡(图15D和图19E)。在蔗糖响应性bZIP11基因的另一个保守的uORF(uORF2bbZIP11)中观察到类似的抑制活性29(图19F-L)。然而，与uORFsTBF1不同，MAMP信号elf18无法缓解uORF2bbZIP11介导的抑制(图19M、19N)。这些结果支持uORFsTBF1在提供对特别地用于工程抗病性的细胞质的合成防御蛋白和ER合成防御蛋白的严格控制中的潜在用途。
为了监测uORFsTBF1对翻译效率(TE)的影响，构建双荧光素酶系统，以计算LUC活性与海肾荧光素酶(RLUC)对照活性之比(图15E)。我们使含有这种双荧光素酶报告基因的转基因植物受到细菌病原体Pseudomonas syringae pv.maculicola ES4326(Psm ES4326)、Ps pv.tomato(Pst)DC3000，以及III型分泌系统Pst DC3000 hrcC-的相应突变体的感染，以及受到MAMP信号elf18和flg22的处理。在受到病原体攻击和MAMP处理的1小时内，报告基因TE的快速诱导表明它可能是PTI的一部分，其不涉及细菌III型效应物(图15F)。翻译的瞬时增加与mRNA水平的显著变化无关(图15G)。同时，我们检测了来自TBF1p的内源性TBF1mRNA的水平，并发现它们在比使用报告基因观察到的翻译增加更晚的时间点升高(图15H)。这表明：响应病原体攻击，植物中的翻译诱导(translational induction)可能先于转录重编程。
为了使用TBF1盒工程抗性植物，我们从拟南芥中挑选了两个候选者：snc1-130和NPR120。拟南芥snc1-1(为简单起见，此处起称为snc1)是NB-LRR免疫受体SNC1的自激活点突变体。尽管snc1突变植物对各种病原体具有组成型升高的抗性，但它们的生长显著地迟缓30。这种生长缺陷在通过35S启动子或其天然启动子异位表达WT SNC1的转基因植物中也是普遍的31,32，限制了SNC1和可能的其它R基因在工程抗性植物中的效用。为了克服与snc1突变体相关的健康度损失，我们将其置于由35S启动子或TBF1p驱动的uORFsTBF1的控制下，以分别产生35S:uORFsTBF1-snc1和TBF1p:uORFsTBF1-snc1。作为对照，我们还生成了35S:uorfsTBF1-snc1和TBF1p:uorfsTBF1-snc1，其中uORF的起始密码子被突变。具有这四种构建体的第一代转基因拟南芥(T1)显示出三种不同的发育表型：I型植物的莲座(rosette)直径小，矮小且具有萎黄病(黄化)；II型植物更健康，但仍然矮小，枝条更多；而III型植物无法区分于WT(图20)。根据III型植物的增加的百分比来判断，我们发现对snc1的转录或翻译的调控显著改善了植物生长。在TBF1p：uORFsTBF1-snc1转化体中发现III型植物的百分比最高，而在TBF1p：uORFsTBF1-snc1转化体中，snc1的转录和翻译水平均受TBF1盒调控。在这些转化体中，I型植物的缺席清楚地证明了TBF1盒的严格性(图20)。
我们繁殖转化体以获得转基因的纯合子。对于TBF1p:uorfsTBF1-snc1和35S:uORFsTBF1-snc1系，T1中的大多数III型植物显示出作为纯合子的II型表型，可能是由于转基因剂量加倍。与此相对，从TBF1p:uORFsTBF1-snc1转化体收集的大多数III型植物保持其作为纯合子的正常生长表型。然后我们选择了四个独立的TBF1p:uORFsTBF1-snc1系，以进行基于它们与WT植物的外观的相似度的进一步的抗病和健康度测试(图16A、16B)。我们首先示出这些转基因系确实具有对Psm ES4326的升高的抗性，其接近通过喷雾接种(sprayinoculation)或浸润在snc1突变体中观察到的水平(图16C、16D和图21A、21B)。它们还显示出增强的对Hyaloperonospora arabidopsidis Noco2(Hpa Noco2)的抗性，Hyaloperonospora arabidopsidis Noco2(Hpa Noco2)是一种在拟南芥中引起霜霉病的卵菌病原体(图16E、16F和图21C)。然而，与snc1相比，这些转基因品系显示出与WT几乎相同的健康度，该健康度通过莲座半径、鲜重、长角果(种子荚)数量和每株植物的总种子重量所确定(图16G-I和图21D-G)。在Psm ES4326攻击后，我们在2hpi内，在所有四种TBF1p:uORFsTBF1-snc1转基因系中检测到snc1蛋白的显著增加，但在并未在WT或snc1中检测到(图21H)。与snc1的mRNA水平的相对适度的变化的比较(图21I)表明snc1蛋白的这些增加很可能是由于翻译诱导。这些数据为“添加病原体诱导性的翻译控制是增强植物抗性而无健康度成本的有效方法”提供了概念验证。
拟南芥的这一结果鼓励我们将TBF1盒应用于工程水稻的抗性；水稻不仅是单子叶植物的模式生物，而且是世界上最重要的主要作物之一。我们首先示出拟南芥uORFsTBF1介导的翻译控制在水稻中通过将图15B中所使用的35S:uORFsTBF1-LUC和35S:uorfsTBF1-LUC转化到水稻(Oryza sativa)栽培品种ZH11中而起作用。这些结果清楚地证明拟南芥uORFsTBF1可以抑制水稻中的报告基因的翻译而不显著影响mRNA水平(图22A、22B)。
为了工程水稻种提高的抗性，我们选择了拟南芥NPR1(AtNPR1)基因3，该基因已被证明可以在包括水稻在内的多种植物中赋予广谱抗病性20-22。然而，在温室中生长时，通过玉米泛素启动子(maize ubiquitin promoter)过量表达AtNPR1的水稻植物已显示出生长迟缓和种子大小减少21。此外，他们还在某些环境条件下(例如生长室中的弱光)产生了所谓的类病变病(lesion mimic disease,LMD)表型8,21。为了解决健康度问题，我们在以下四种调控系统下表达了AtNPR1-EGFP融合基因：35S:uorfsTBF1-AtNPR1-EGFP、35S:uORFsTBF1-AtNPR1-EGFP、TBF1p:uorfsTBF1-AtNPR1-EGFP和TBF1p:uORFsTBF1-AtNPR1-EGFP。为这四种构建体指定用于抗性和健康度表型的盲测试的不同代码。在生长室条件下，TBF1p介导的转录控制或uORFsTBF1介导的翻译控制大大降低了具有LMD的水稻植物的比例和严重性(图22C)。然而，使用具有转录控制和翻译控制的TBF1盒获得了最好的结果。接下来，在温室条件下的第一代(水稻研究中的T0；图23a-e)和第二代(T1；图24A、24B)转化体中，我们测试了对细菌病原体水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo))，一种水稻枯萎病的致病因子，的抗性；在该温室条件中，即使35S:uorfsTBF1-AtNPR1也没有观察到LMD。不出所料，由于AtNPR1的组成型转录和翻译，35S:uorfsTBF1-AtNPR1植物表现出对Xoo的最高水平的抗性。然而，在具有转录控制或翻译控制或同时具有转录和翻译控制的植物中也观察到相似水平的抗性(图24A、24B)。令人兴奋的是，这些抗性结果在田间(field)得到忠实的再现(图17A、17B和图24C)。响应于Xoo攻击，具有功能性uORFsTBF1的转基因系甚至在mRNA水平没有显著变化的情况下显示瞬时AtNPR1蛋白质增加，其在2hpi前后达到峰值(例如，图24d、e中的35S:uORFsTBF1-AtNPR1)。
为了确定AtNPR1介导的抗性的范围，我们用水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzicola(Xoc))和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae(M.oryzae))接种第三代转基因水稻植物(T2)；水稻细菌性条斑病菌和稻瘟病菌分别是水稻细菌性条斑病和真菌爆发的致病病原体。我们在指定用于这些受控病原体的生长室中观察到对Xoc和M.oryzae的增强抗性，其模式(pattern)与Xoo类似(图17C-F)，证明了AtNPR1介导的抗性的广谱性。不同转基因系之间缺乏显著差异，表明它们在赋予抗性时都具有饱和水平的AtNPR1。
然后，我们对田间的这些转基因植物进行了详细的健康度测试。与先前关于通过35S启动子进行水稻NPR1同源物(OsNH1)的异位表达的报道一致33，在任何田间生长的AtNPR1转基因水稻植物中都未观察到明显的LMD。然而，在35S:uorfsTBF1-AtNPR1植物中的AtNPR1的组成型转录和翻译明显地具有旗叶长度和宽度、次级分枝数、株高和谷粒数量和重量的健康度惩罚(图17G-1和图25)。添加AtNPR1的转录或/和翻译控制显著降低了这些农业上重要的性状的损失，并在株高、旗叶长度/宽度，和每株植物的谷粒数量方面突出地显示出uORFsTBF1的益处(图17G、17H和图25E、25F)。正如在温室实验中已经观察到的那样，转录控制和翻译控制的组合在消除产量的健康度成本方面表现最佳，产量的健康度成本由两个性状决定：每株植物的谷粒数量和1000谷粒重量(图17H、17I)，尽管这些植物具有相似的抗病水平。
使用TBF1盒，我们制定了控制植物病害的新策略；植物病害在全球每年造成26％的作物减产1，在发展中国家造成30-40％的作物减产2。除TBF1外，将通过全局翻译图谱分析获得更多免疫应答mRNA顺式元件以及反式作用调节因子(trans-acting regulators)。我们自己对PTI反应的核糖体足迹研究已经揭示了mRNA特征(如uORF和mRNA共有序列“R基序”)在赋予对PTI诱导的翻译反应性中的功能(见附稿)。这项翻译谱研究还表明：翻译活动通常比转录更严格地被控制，进一步强调了对翻译的调控在平衡防御和健康度方面的重要性。利用免疫诱导性的转录和翻译调控机制来控制防御蛋白的表达不仅可以最大限度地减少增强的抗性对植物生长和发育的不利影响，还可以通过减少对农药(一种主要污染源)的需求来帮助保护环境。此外，这种诱导性的广谱抗性可能比组成型表达的“基因对基因(gene-for-gene)”抗性更难以被病原体克服。uORF在从酵母(占所有mRNA的13％)34到人类(占所有mRNA的49％)35的生物体的mRNA中的普遍存在表明这些mRNA特征在精确控制转基因表达中的潜在广泛用途。
方法
拟南芥的生长、转化，和病原体感染
将拟南芥Col-0种质(accession)用于所有实验。植物在土壤(Metro Mix 360)上，在22℃、55％相对湿度(RH)，和12/12h光/暗循环下生长，以用于细菌生长测定和植物半径和鲜重的测量或用于种子重量和长角果数量测量的16/8h光/暗循环。花浸法36用于产生转基因植物。BGL2：GUS报告基因系30用于snc1相关转化。对于感染，首先让细菌在King'sBroth培养基平板上于28℃生长2天，然后再悬浮于10mM的MgCl2溶液中以进行浸润。用于Psm ES4326的抗生素选择是100μg/ml的链霉素，用于Pst DC3000的抗生素选择是125μg/ml的利福平，用于Pst DC3000 hrcC-的抗生素选择是25μg/ml的利福平和30μg/ml的氯霉素。在喷雾接种中，将Psm ES4326转移至含有100μg/ml的链霉素的液体King's Broth中，再另外生长8至12小时，直至OD600nm＝0.6至1.0，并在OD600nm＝0.4，在含有0.02％的Silwet L-77的10mM MgCl2下进行喷雾。在第0天(4个生物学重复，每个3片叶盘)和第3天(8个重复，每个3片叶盘)收集感染的叶子样品。对于Hpa Noco2感染，对在12/12h光/暗循环和95％RH下生长的12日龄植物用4×104孢子/ml进行喷雾，并孵育7天。通过将感染的植物悬浮在1ml的水中收集孢子，并在显微镜下在血细胞计数器中计数。
本塞姆氏烟草中的瞬时表达
在12/12h光/暗循环和22℃下种植本塞姆氏烟草植物，然后将其用于农杆菌介导的瞬时表达。用每个构建体转化的农杆菌GV3101在含有卡那霉素(50μg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)和利福平(25μg/ml)的LB中于28℃生长过夜。在OD600nm＝0.1时，将细胞重悬于浸润缓冲液(infiltration buffer)[10mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、10mM的MgCl2、200μM的乙酰丁香酮]中，并在室温下孵育4小时，然后浸润。对于本塞姆氏烟草中的elf18诱导，将含有表达elf18受体的构建体的农杆菌(pGX664)与携带测试构建体的农杆菌以1：1的比例共同过滤。20小时后，在叶盘收集2小时之前，用10mM的MgCl2(Mock)溶液或10μM的elf18浸润相同的叶子。
双荧光素酶测定
浸润(infiltrate)MgCl2溶液(10mM)、Psm ES4326(OD600nm＝0.02)、Pst DC3000(OD600nm＝0.02)、Pst DC3000 hrcC-(OD600nm＝0.02)、elf18(10μM)或flg22(10μM)。在指定的时间点收集叶盘。根据Promega的试剂盒(E1910)，使用Victor3板读数器(PerkinElmer)以CPS(每秒计数)测量LUC和RLUC活性。
实时聚合酶链反应(PCR)
收集～100mg叶组织，用TRIzol(Ambion)进行总RNA提取。在使用oligo(dT)用SuperIII逆转录酶(Invitrogen)逆转录之前进行DNase I(Ambion)处理。使用FastStart Universal SYBR Green Master(Roche)进行实时PCR。
水稻生长、转化和病原体感染
对于LMD表型观察，将水稻在温室中生长6周并移至生长室中3周(12/12h光/暗循环，28℃和90％RH)。在健康度测试中，水稻在正常水稻生长季节(2015年11月至2016年5月)在海南陵水(纬度：18°N)的田间条件下生长。通过农杆菌介导的、向水稻(Oryza sativa)栽培品种ZH11的转化，获得转基因水稻植物37。对于温室中的Xoo感染(2016年进行)，水稻从2月2日开始生长3周，于2月23日接种，并于3月8日收集数据。对于田间的Xoo感染(2016年进行)，水稻于5月10日在中国武汉华中农业大学实验站(纬度：31°N)种植，7月20日接种，并于8月4日收集数据。令Xoo菌株PXO347和PXO99在营养琼脂培养基(0.1％酵母提取物、0.3％牛肉提取物、0.5％多聚蛋白胨，和1％蔗糖)上，在28℃下生长2天，然后再悬浮于无菌水中并稀释至OD600nm＝0.5以接种。在孕穗(穗发育)阶段通过剪叶法接种每株植物的5至10片叶子38。通过测量接种后14天(dpi)的病变长度对疾病进行评分。使用引物水稻F和水稻R进行PCR以识别AtNPR1转基因植物。对PCR阳性和阴性的T1代植物进行评分。对于生长室中的Xoc感染(在2016年进行)，水稻于10月20日生长，于11月15日接种，并于数11月29日进行数据收集。Xoc菌株RH3在营养琼脂培养基(0.1％酵母提取物、0.3％牛肉提取物、0.5％多聚蛋白胨，和1％蔗糖)在28℃下生长2天，然后再悬浮于无菌水中并稀释至OD600nm＝0.5，以进行接种。在分蘖阶段，使用无针注射器，通过穿透法(penetration method)接种每株植物的5至10片叶子38。通过测量14dpi时的病变长度对疾病进行评分。对于生长室中的稻瘟病菌(M.oryzae)感染(在2016年进行)，水稻于10月15日生长，11月16日接种，并于11月23日进行数据收集。在燕麦番茄琼脂(OTA)培养基(每1L培养基40g燕麦、150ml番茄汁、20g琼脂)，28℃下，培养稻瘟病菌分离株RB22。将10μl含有0.05％Tween-20的分生孢子悬浮液(5.0×105孢子/ml)滴加到5～10个完全展开的稻叶上的压伤区域(press-injured spots)，然后用透明胶带胶带包裹。将植物在90％RH的黑暗中保持一天，并在90％RH的12/12h光/暗循环下生长。通过测量7dpi时的病变长度对疾病进行评分。对于Xoc和M.oryzae，测试了每种构建体的3个独立转基因系，图17中示出了2个系的数据。对于Xoo感染和健康度，测试了每个构建体的4个独立转基因系，图17中示出了2个系的数据，图24和25的所有部分示出了所有的4个系的数据。
免疫印迹
收集被Psm ES4326(OD600nm＝0.02)感染的拟南芥组织(100mg)，并在200μl裂解缓冲液[50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，0.1％Triton X-100，0.2％Nonidet P-40，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏，每片用于10mL)]中裂解，然后以12,000rpm离心，获得上清液。使用相同的方法，使用略微不同的裂解缓冲液[50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1mM DTT，1mMPMSF，2mM EDTA，0.1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche，1片，每片用于10mL)]，从Xoo(PXO99，OD600nm＝0.5)感染的水稻中提取蛋白质。
质粒构建
从pRNAi-LIC扩增具有重复的增强子的35S启动子39，并使用引物P1/P2与PstI和XbaI位点侧接。从pRNAi-LIC扩增NOS终止子，并使用引物P3/P4与KpnI和EcoRI位点侧接。使用来自pDEST375(GenBank：KC614689.1)的引物P5/P6/P7(P5/P6的PCR片段用作P5/P7的模板)扩增具有LIC衔接子序列的Gateway盒并与KpnI和AflII位点侧接。NOS终止子、35S启动子和Gateway盒分别通过KpnI/EcoRI、PstI/XbaI和KpnI/AflII顺序连接到pCAMBIA1300(GenBank：AF234296.1)中。所得质粒用作过渡质粒(intermediate plasmid)。使用来自分别带有uORF1-uORF2-GUS和uorf1-uorf2-GUS的、先前发表的质粒10的P8/P9和P8/P10扩增具有WT uORF和突变体uorf的TBF1的5'前导序列(TBF1的ATG起始密码子的上游)，并通过XbaI/KpnI克隆到过渡质粒中。将得到的质粒命名为pGX179(35S:uORFsTBF1-Gateway-NOS)和pGX180(35S:uorfsTBF1-Gateway-NOS)。从拟南芥基因组DNA扩增TBF1p，并使用引物P11/P1与HindIII/AscI侧接，且从pGX180扩增TBF1 5'前导序列，并使用引物P8/P13与AscI/KpnI侧接。用AscI消化TBF1启动子(P11/P12)和TBF1 5'前导序列(P8/P13)，连接(ligated)，并用作PCR的模板，以及使用引物P11/P8引入HindIII/KpnI。pGX179中的35S启动子被TBF1启动子取代以产生pGX1(TBF1p:uORFsTBF1-Gateway-NOS)。从拟南芥基因组DNA扩增TBF1启动子，并用引物P14/P15与HindIII/SpeI侧接，然后连接到用HindIII/XbaI切割的pGX179中，以产生pGX181(TBF1p:uorfsTBF1-Gateway-NOS)。分别从pGWB23540、GFP-HDEL41和snc1突变基因组DNA扩增LUC、GFPER和snc1。通过PCR将TBF1-YFP和NPR1-EGFP融合在一起，通过不需要连接的克隆(ligation independent cloning)进行克隆39。EFR扩增自U21686(TAIR)，与EGFP融合并由35S启动子控制。用G904/G905从拟南芥基因组DNA扩增bZIP11的5'前导序列(包含uORFsbZIP11)。将5'前导序列中的uORF2a和uORF2b的起始密码子(ATG)分别突变为CTG和TAG，以使用含有点突变的引物，通过PCR产生uorf2abZIP11和uorf2bbZIP11。
统计分析
使用Shapiro-Wilk检验测试正态分布。使用双侧单因素ANOVA与Tukey检验共同用于多重比较。除非特别说明，否则样品大小n表示生物学重复。对拟南芥研究进行了三次实验，结果相似。GraphPad Prism 6用于所有统计分析。
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序列表
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董欣年
乔治·格林
胥国勇
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<150> US 62/453,807
<151> 2017-02-02
<160> 499
<170> PatentIn Version 3.5
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atgagcagat ag 12
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
atgttctgca acagttga 18
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
atgagtgggg tggattaa 18
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
atgcggcgag gagaaagaga aggttaa 27
<210> 45
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
atgatatgtc cgtttagaaa cagacaaaat aagaagaaga agaaagagtc gtggaggatt 60
cttcattctt cctcatcctc ttcttcaccg attcattag 99
<210> 46
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
atgaagagag agactgaaac agaggtttct tactttcttc tctgtatctc tcatattttg 60
cttaaaccct aa 72
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
atgtttatga attcttcatt gctctattct tag 33
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
atgagctgtc acttcttagt aataagttga 30
<210> 49
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
atggctcgtc tttttccaaa cgatttcttc ttcttcgtcg tcgccggttt agggtttccg 60
ttgctgtag 69
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
atgatcttac gtgaaattgc agcctaa 27
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
atgatagcta cccagtaa 18
<210> 52
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
atgcttgaga tattttgttt ttacctccga gaaacggatt tagattcgta a 51
<210> 53
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
atgcgttgtt tggtacagct tcacgaacaa tctctctctc gatag 45
<210> 54
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
atgggttag 9
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
atggttggtt taatatttca atcgggataa 30
<210> 56
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
atgtga 6
<210> 57
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
atgcgtcgct cttaa 15
<210> 58
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
atgaagcaat tgttcctttc aagcatgttt acgagcaaaa gagtgaaagg gtag 54
<210> 59
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
atgattggct tctcacgatt cgatttttcc ggctcctgtt cttaa 45
<210> 60
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
atgttataa 9
<210> 61
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
atgcttttaa tttccatgca aatctctcct ttcttctcaa gtcatttttg a 51
<210> 62
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
atgccaaaaa ataagaacaa aattatatcc gttgcttga 39
<210> 63
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
atggcggttc ttcacattat cttcactgcg taa 33
<210> 64
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
atgaagccaa aactatccaa taactcgaaa ttgactactc ttttcttttg tctctgttgt 60
tga 63
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
atgtgtttct tcttgtcttc ctag 24
<210> 66
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
atgtcgtcgc ggttcgaccc caagggattt ggccggtaa 39
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
atgatagaaa caagaactat ctttttataa 30
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
atgaaccttc ttctcttcta g 21
<210> 69
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
atggttctgt aa 12
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
atgtgcccca aaagataa 18
<210> 71
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
atggaaagat aa 12
<210> 72
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
atggactctc gttctcagac atttatttct ctcagtctta caatataa 48
<210> 73
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
atgatggaat cgaaagctgg taataagaag tcaagcagca atagttcctt atgttacgaa 60
gcaccccttg gttacagcat tgaagacgtt cgtcctttcg gtggaatcaa gaaattcaaa 120
tcttctgtct actccaactg cgctaagagg ccttcctga 159
<210> 74
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
atggagacga agtggagaga gaaagctccc actctctcac accccaaagc ttcttcttct 60
tcttcctctt cttcctcttc ctcttctcta atctga 96
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
atgtttcaat ctaaccattg a 21
<210> 76
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
atgtcaactg gattaagctt aagtagtaat ggtttttact atgttcatgt ggggatttct 60
cttcctctct gtttacttca ttccgagatg acttga 96
<210> 77
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
gagagaggac tgggtctggt ctcttcgctg caacctatag ctgttgtttg ctcttcgacg 60
ggattctcac tactcttttg ccaaaaaaaa gagatcggag gttccgaagg tgaatgcagc 120
ttgcgatttc atagaaaaga agattcgttt gctggattag gcttatttgt gtatcatagc 180
tttgaggttt taactgagat ttattgatag tggaacttag gttttcgaga ggtgtgaaca 240
gttgggtat 249
<210> 78
<211> 184
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
aaattaagag acatctgatc gaattttgtt ccgacgaccg tgaatcacca gcaaaggatt 60
cgtgtcaatg ttcttgtgag atcgaacttt ctctgggttc gtgcagaagc tttgcttttt 120
tgagtatcgc gtttaaggca catcgaagaa gagagaccct aatttgatat tttgagttct 180
atcg 184
<210> 79
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
cgtggggaac gttttttcct ggaagaagaa gaagaagagc tcaacaagct caacgaccaa 60
aaaacttcgg acacgaagac tttttaattc atttctcctc ttttgttttt ttcgttccaa 120
aatattcgat actctcgatc tcttcttcgt gatcctcatt aaataaaaat acgattttta 180
ttcttttttt gtgagtgcac caaatttttt gactttggat tagcgtagaa ttcaagcaca 240
ttctgggttt attcgtgtat gagtagacat tgattttgtc aaagttgcat tcttttatat 300
aaaaaaagtt taatttcctt ttttcttttc ttttctcttt tttttttttt tcccccatgt 360
tatagattct tccccaaatt ttgaagaaag gagagaacta aagagtcctt tttgagattc 420
ttttgctgct tcccttgctt gattagatca tttttgtgat tctggatttt gtgggggttt 480
cgtgaagctt attgggatct tatctgattc aggattttct caaggctgca ttgccgtatg 540
agcagatagt tttatttagg catt 564
<210> 80
<211> 802
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
cttcttcttc tgattctcat ttcaaataag agagagagag agagaagtaa gtaaaacttt 60
agcagagaga agaataaaca aataattata gcaccgtcac gtcgccgccg tatttcgtta 120
ccggaaaaaa aaaatcattc ttcaacataa aaataaaaac agtctctttc tttctatctt 180
tgtctatctt tgattattct ctgtgtaccc atgttctgca acagttgagc aagtgcatgc 240
cccatatctc tctgtttctc atttcccgat ctttgcatta atcatatact tcgcctgaga 300
tctcgattaa gccagcttat agaagaagaa acggcaccag cttctgtcgt tttagttagc 360
tcgagatctg tgtttctttt tttcttggct tctgagcttt tggcggtggt gggtttttct 420
ggagaaaccc aaacgactat caaagttttg ttttttacaa ttttaagtgg gagttatgag 480
tggggtggat taagtaagtt acaagtatga aggagttgaa gattcgaaga agcggttttg 540
aagtcggcga gaccaagatt gcgagcttat ttggctgatg atttatttca gggaagaaga 600
aataaatctg ttttttttag ggtttttaga tttggttggt gaatgggtgg gaggtggagg 660
gaaacagtta aaaaagttat gcttttagtg tctcttcttc ataattacat ttgggcatct 720
tgaaatcttt ggatctttga agaaacaaag ttgtgttttt ttttttgttc tttgttgttt 780
gctttttaag ttagaataaa aa 802
<210> 81
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
cgagatgcgg cgaggagaaa gagaaggtta aggtt 35
<210> 82
<211> 163
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
attgtgtggt gacaagcaac acatgatatg tccgtttaga aacagacaaa ataagaagaa 60
gaagaaagag tcgtggagga ttcttcattc ttcctcatcc tcttcttcac cgattcatta 120
gaaaccaaat tacaaaaaaa aacgtctata cacaaaaaaa caa 163
<210> 83
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
agtgagctaa tgaagagaga gactgaaaca gaggtttctt actttcttct ctgtatctct 60
catattttgc ttaaacccta aaaccctttt tggattaggt tttctccaaa tcttatccgc 120
cgtgataaaa tctgattgct ttttttcttc atgaaagttt gatttgtgaa actcg 175
<210> 84
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
cctttctctt ccgatcgcat cttcttcaaa aatttcccac ctgtgtttca caaattccat 60
gtttatgaat tcttcattgc tctattctta gtcacctttg atttctctcg ctttctatcc 120
gatccaattg tttgatgatc ttctctgtaa caagctcata aggtttgagc ttcatctctc 180
tggagagaat cc 192
<210> 85
<211> 365
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
aagcgaacaa gtctttgcct ctttggttta ctttcctctg ttttcgatcc atttagaaaa 60
tgttattcac gaggagtgtt gctcggattt cttctaagtt tctgagaaac cgtagcttct 120
atggctcctc tcaatctctc gcctctcatc ggttcgcaat cattcccgat cagggtcact 180
cttgttctga ctctccacac aagtagggtt acgtttgcag aacaacttat tcattgaaat 240
ctccggtttt tggtggattt agtcatcaac tctatcacca gagtagctcc ttggttgagg 300
aggagcttga cccattttcg cttgttgccg atgagctgtc acttcttagt aataagttga 360
gagag 365
<210> 86
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
caagagtaga ccgccgactt agattttttc gccgacgaga gaatatatat aaatggctcg 60
tctttttcca aacgatttct tcttcttcgt cgtcgccggt ttagggtttc cgttgctgta 120
gcaattttct ctcgcttctc tctccccttt tacagtttct cttatattgc tcttgccttg 180
cgtccaatct caagagttca taagagttga catttgtgaa catcgaagaa atacggtgac 240
gtttcttctc tgattacttt ttgccaacat gaatactaat gtatttatca acaagtgcta 300
cagcctgttt ttttcgaagc tgttggtgag ttcccatcct tagtactgct agacagttcg 360
gtgtgttagt tgactttata ttcaaggtta taggtttagt gttgttagta gagaaaa 417
<210> 87
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
acattcatct ctctctctca gtcaaattgt tgttttcttt cttcgaatcg gtgcagaaaa 60
ttcagggaag ttctggggaa ggttgttgcg tttgactcct ttggcttagt tttctttcga 120
attccgtgct tcctgatgat cttacgtgaa attgcagcct aaaatttcga gattgttttt 180
tttactcaga aaacgagatt tgactgatat gaatcgaaaa tctgtgattt aaagtgaagc 240
<210> 88
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
aaactgctga ccgatcccaa aggttgaaag attctttggc gctaaaaaat ccccagttcc 60
caaatcggcg tcctcgtttg aaaccctaat tcctgaatcg aagcagatcc tgatcgaatc 120
gaaggtgttc gaatgatagc tacccagtaa attcagaacc ctaattaaca 170
<210> 89
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
gtaaagagaa aagctttgag tcttccattg acatgggcgc ttagcttatg cttgagatat 60
tttgttttta cctccgagaa acggatttag attcgtaatc gtgagttttt tggtgta 117
<210> 90
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
aaataaatgc gttgtttggt acagcttcac gaacaatctc tctctcgata gattcttctt 60
acctctgaat ttctcgttgt tggaaca 87
<210> 91
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 91
agattttttt tttaaacaaa gaatggaaaa aaatgaataa atttgggaaa cgaggaagct 60
ttggttaccc aaaaaagaaa gaaagaaaaa ataaaaaaaa ataaaaagaa aagctttctc 120
tgggtttttc ttgattggtc aattacacat ctccctttct ctcttctctc tctcaccttc 180
gcttgctttg cttgcttcat ctctttggtc tccttcttgc gttttctatt tactacacag 240
accaaacaat agagagagac tttaagctat agaaaaaaag agagagattc tctcaaatat 300
gggttagtcc acaattttca ctaaacctct tcttcttagg attgttttta gggttagggt 360
tttgaggtga ggagagcaag tatgcgggag tttcatcctt tttgagttac tctggattcc 420
tcaccctcta acgacgacca ccgtcgccgc cgccgccgcc gtctcgacga atatgctcta 480
cca 483
<210> 92
<211> 218
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 92
atgagaaaag cttggtaaaa accctatttt tcttcttctc ttcaatttac agttctctgc 60
acctttttct ttcccctgtt ttttgatcct caatcaccaa accctagctt gttcttctgt 120
tgattatttc gaaaaggggg tttgtttgtt ttctgggaat cagcaaaaat cacgaaatgg 180
ttggtttaat atttcaatcg ggataaaatc gatcgaaa 218
<210> 93
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 93
gtcacacatg taataaacct tggtcgacaa tctcgccctt tccatgtgat ttctccactt 60
cctctctctc tctactgcaa cttcctcctc ctgcttcaac ttcattcggg taatgatgaa 120
ctagcgtaga gatttggatc ttcttcttcg tcctctcacc aactcttcac cggttagatc 180
tctttttcac gctaacga 198
<210> 94
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 94
gtgtttagct tcttcactac cacacagaaa cagagtttcc gtctttcatc ttcctccata 60
tgcgtcgctc ttaaaaacct aattcaca 88
<210> 95
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 95
tcttcttctt cgttttcagg cgggtggagg agctcagagc cttccagagg taaccaacct 60
tttattaccg acaagattct gccacacaat tattacatat ttttgttccc atgaagcaat 120
tgttcctttc aagcatgttt acgagcaaaa gagtgaaagg gtagcttgat ttttgtctac 180
tctagcttca ttttctggcg atctttactt gagatttaaa cattttgctc tcggattgat 240
aataaagaag aatttggaat atcagtaggt ttggttagga ctctcggatt ctgttgtcgg 300
ttagatattt gttttgttta atccctagat ttagcagaga aatccctcaa atctcacaca 360
atccatgtaa ggaagaag 378
<210> 96
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 96
cttacttaaa cacagtcaaa ttcattttct gccttagaaa agatttttat cgaaaatcga 60
cgtttttgaa aaaactcaaa ttatcgtcgt tttgttctca gatttcttct gctctcttct 120
tcttctcctt cttcttcgtt ccaccgcctc tgttgcttta tcttcttctt ccttccttcg 180
attgttgatt acgtcggtgg atctttgttc tcctctgtgt tgttttcatt gctagatttc 240
gtcaatgatt ggcttctcac gattcgattt ttccggctcc tgttcttaat ttcctctgag 300
aga 303
<210> 97
<211> 285
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
atcaaaatca atgatcaagg taacgtagtc aagttcaatt actctttgtc aaatttaagt 60
ggtctctatt actaaactat acacaaccgt tagatcaaat aattctctac catccaacgg 120
tccaaagtct ccacttctat ttattacaat aaaatgagaa aataaaaacg cgcggtcacc 180
gattctctct cgctctctct gttactaaat gaagaagaga atctctccgg cgagatcacc 240
ggcgttattc cgataatttc gcctgagagt tgtcgcatgt tataa 285
<210> 98
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
atttttatta ctctctcaag tagtctcatc ttcttcttaa tccaaaggcc caaactttga 60
atcatcacta tcactctctc tctctctctc tatctctcaa gaactgcacg gacaacgaca 120
tgcttttaat ttccatgcaa atctctcctt tcttctcaag tcatttttga aaatcaatca 180
aaaaactgaa acttggtgga gcttttatca ttcactcatc a 221
<210> 99
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 99
ctttcaccca ctttaatatg ccaaaaaata agaacaaaat tatatccgtt gcttgaaaat 60
cacaagctct tcttaacttc acaagtgctt caatggcggt tcttcacatt atcttcactg 120
cgtaattgaa gaagttgttc tctcttcctc ttaatttcga gttgtgttct taaaaaactc 180
cagagctgat tcgattctcg agaagaaact aagccgacaa taaagttcag atctggaaaa 240
aagcgagctc cagattacaa aaagaaacag ctcgtttttt tcactttcaa aaaa 294
<210> 100
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
gagtctggtt cgaaaagact gcttcaatga agccaaaact atccaataac tcgaaattga 60
ctactctttt cttttgtctc tgttgttgat tcgcaaaggc gaagattatc catcttctca 120
gttactccta ctggaaccaa aagctcagaa ccttaaaac 159
<210> 101
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
gaagcaattg ttgcattagc ctacccattt cctccttctt tctctcttct atctgtgaac 60
aaggcacatt agaactcttc ttttcaactt ttttaggtgt atatagatga atctagaaat 120
agttttatag ttggaaatta attgaagaga gagagatatt actacaccaa tcttttcaag 180
aggtcctaac gaattaccca caatccagga aacccttatt gaaattcaat tcatttcttt 240
ctttctgtgt ttgtgatttt cccgggaaat atttttgggt atatgtctct ctgtttttgc 300
tttccttttt cataggagtc atgtgtttct tcttgtcttc ctagcttctt ctaataaagt 360
ccttctcttg tgaaaatctc tcgaattttc atttttgttc cattggagct atcttataga 420
tcacaaccag agaaaaagat caaatcttta ccgtta 456
<210> 102
<211> 268
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
aattggtgga tgtcgtcgcg gttcgacccc aagggatttg gccggtaaaa ttattgggag 60
ttgtctttct cttgcactct ctctagttcc aaaccctagc aattcctctg ttttcaccat 120
tttcggagat tatcaccttc tccccgattc gccgccttgt gattacatct acgtaaagag 180
tttctggtag aaattttccc tcttttagct gcagattggc atcagattcc gttctggatg 240
tgtcggtgat cgattttccg cgtcggtg 268
<210> 103
<211> 288
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
atttcataaa tcatagagag agagagagag agagagagag agtttggaaa cattccaaaa 60
ccagaactcg atattatttc accaaagaat gatagaaaca agaactatct ttttataaaa 120
ctctttacac cccaaaagaa aatgtctcac tcgttttgcc ttataatatt tctttcaaca 180
acaacccaaa tctacaaaaa atcccaataa aaaaaaactt cagtctgttt gacattttgt 240
cgaacacttg gacggcatca caaaaagctc taaactttct gactacca 288
<210> 104
<211> 262
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
gaccctcttc tctctctcta gctagtctca ggtcagagaa gccatcatca acattcaaca 60
agagagccgt gtttgtgtct tgactgattc ttctctcaag cttttttaat ctctctctct 120
tttcccacgt aattccccca aatccattct ttctagggtt cgatctccct ctctcaatca 180
tgaaccttct tctcttctag accccacaaa gtttccccct tttatttgat cggcgacgga 240
gaagcctaag tctgatcccg ga 262
<210> 105
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 105
atggttctgt aaccggacaa catctcaaaa cttgttctgt tttttttttt tcatttctta 60
gacagaaaa 69
<210> 106
<211> 581
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
aagaacaaac aactaccaaa cttgtaggca gtagcaggag gaagtgggtg ggattaacat 60
tgtcatttct ctctcttttt cttttacaaa tctttccgtt ttgttttctt ttggttttcc 120
ggtgagcact gttgtgtttc caattccggc actctttagg gttccctttc agaagaaaac 180
ttcacattgt tgtttctctc aaccgtgaca tcttggatta ctacttctga ctactttcct 240
ttttcatgtg ccccaaaaga taatagttac tttttcaaaa tctggttttg ttgtttgggt 300
ttgtgtcatt cattgataaa gtcactaatg gagaagtaca aaacaattgc aaaatttcga 360
atctgtgttg tcattgctga attctgtagt ggatgtttgc ttgcagttta gagcttcgga 420
gtgcgaagag tgagacacaa gaggattctt tctggaaccg cattattccc tttagaggag 480
gaagaagaag acaactcact cacaaggaaa acaaaggttc ctctggttac tctgaaatat 540
tcaaaccaat ggtgagcaat tggtagcact tgctaaagaa g 581
<210> 107
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 107
aaacacaaaa aaacgaagat agccatcgtt ttggtgagag aagagagaag agagaagaag 60
aaggccatgg aaagataata ctctgctttt tttttagaaa tatacagagg aaataaagag 120
agagagaagg ag 132
<210> 108
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 108
tatggactct cgttctcaga catttatttc tctcagtctt acaatataaa ttttcattct 60
taccatccat aattttgtat tgtcttctcc acagatctat tccagctcac gcc 113
<210> 109
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 109
acaatatcac aaactcgttt gctcttttca tcattactaa atcataagcg gctctcaagt 60
tctttagggt ttcgagtttt ctcaatctcc tacctgatta aggttaattt cttatcttgg 120
atcaataaca agagaattat aactccggat tgtaatcaat attcctctac ataaaaagcg 180
tgaatgagat tatgatggaa tcgaaagctg gtaataagaa gtcaagcagc aatagttcct 240
tatgttacga agcacccctt ggttacagca ttgaagacgt tcgtcctttc ggtggaatca 300
agaaattcaa atcttctgtc tactccaact gcgctaagag gccttcctga gtactagcca 360
gttccctcca tagcttttca attacaacaa tctccttttc tcaaagctct ggttccccaa 420
atcctctcgt cttttgtttg ccctcacaac aacaacaaca acgcagag 468
<210> 110
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 110
aaaaaataat ccccaaataa tggagacgaa gtggagagag aaagctccca ctctctcaca 60
ccccaaagct tcttcttctt cttcctcttc ttcctcttcc tcttctctaa tctgaatcca 120
aagcctctct cttt 134
<210> 111
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 111
gaagatctca tttctctttc tccttttctt ctccgacgat tcttctcagt tctcagatct 60
gatcgatttc ttcatcagat gtttcaatct aaccattgag attgaatagt caccattagt 120
agaagcttcg agatcaattt cgaatcggga tc 152
<210> 112
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 112
tctttccctt cttcttcccc aataatctcg ctgaaactct cttgctcttg cttctaaaaa 60
tctgttcttt gagactttga tcacacagtt atcaaaatca taatctcttc tttcctggtt 120
tttttttttt tcttcttctt cttcccgttt cacggtacgt ttactctgtt cgatcaccga 180
gtgtatgata aaatgtttct gtgaaatcaa ataacatatc actttctaat aaacatcaaa 240
atttctcctt ttttacagaa acaagaagtt tttttgggaa agccgttgac ttgacttttt 300
ctttggggtg ttgtgtggga gcttatagta tggtaccata agtgggagct tatagtttgg 360
ggtgttgtgt gggagcttat agtatgagga aaaatgttag atttgaagaa tgcttcactg 420
attttttacc ataagtatgt caactggatt aagcttaagt agtaatggtt tttactatgt 480
tcatgtgggg atttctcttc ctctctgttt acttcattcc gagatgactt gagatttttt 540
caaagtatag ttcttggagt taagcttacc tagtaatcac tttatataac atcccttcgt 600
ttacatttgt gctttcacct ggaaacactt tagacttttc tctcttctgc cgtgtgtatt 660
tagttgtcta gtcaaattta agttgagttt aggctctagt ctttggtttt ggtt 714
<210> 113
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 113
gaaagagaga gagag 15
<210> 114
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 114
gagagagaga gagag 15
<210> 115
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 115
gagagagaga gagag 15
<210> 116
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 116
gagaaagaaa gagag 15
<210> 117
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 117
aagagagaaa gagag 15
<210> 118
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 118
gaagaagaag aagag 15
<210> 119
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 119
gaagaagaag aagaa 15
<210> 120
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 120
gaagaagaag aagaa 15
<210> 121
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 121
gaagaagaag aagaa 15
<210> 122
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 122
ggaagagaag aagaa 15
<210> 123
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 123
aacagagaaa gagag 15
<210> 124
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 124
gaagcagaaa gagag 15
<210> 125
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 125
agaagagaga gagag 15
<210> 126
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 126
ggaggagaag aagaa 15
<210> 127
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 127
aaaagaaaga aagaa 15
<210> 128
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 128
gaaaaagaaa gaaaa 15
<210> 129
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 129
aaaagaaaga aagaa 15
<210> 130
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 130
aagagagaag aagaa 15
<210> 131
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 131
cgaggagaaa gagaa 15
<210> 132
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 132
taaagagaga gagag 15
<210> 133
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 133
aaaggaaaga aagaa 15
<210> 134
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 134
cacggagaaa gagaa 15
<210> 135
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 135
gaaagaaaaa aaaaa 15
<210> 136
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 136
cacagagaga gagag 15
<210> 137
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 137
aaagaaaaga gagaa 15
<210> 138
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 138
gagaaagaaa gaaaa 15
<210> 139
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 139
cagagaaaga gagag 15
<210> 140
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 140
ggaggaggaa gagaa 15
<210> 141
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 141
agaagaaaga aagaa 15
<210> 142
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 142
gaaaaaaaaa aaaaa 15
<210> 143
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 143
gaagaagata gagaa 15
<210> 144
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 144
caaagagaaa cagaa 15
<210> 145
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 145
gaacgaaaga gagaa 15
<210> 146
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 146
gagaaagata gagag 15
<210> 147
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 147
aacaaaaaaa aagaa 15
<210> 148
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 148
aaaggaaaaa gaaaa 15
<210> 149
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 149
gcagaagaag aagag 15
<210> 150
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 150
aaaagaaaaa cagag 15
<210> 151
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 151
caaagagata gagag 15
<210> 152
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 152
aaaagaaaaa aaaaa 15
<210> 153
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 153
aaagaagaaa aaaaa 15
<210> 154
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 154
aaaggagata aagag 15
<210> 155
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 155
gaacaagaag aagaa 15
<210> 156
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 156
acaagaaaaa aagaa 15
<210> 157
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 157
ggaaaagaag aaaaa 15
<210> 158
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 158
ggaaaaaaaa cagag 15
<210> 159
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 159
tgcagagaaa gagaa 15
<210> 160
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 160
tagagagagg aagaa 15
<210> 161
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 161
aacacagaga gagaa 15
<210> 162
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 162
gaagaagaaa acgaa 15
<210> 163
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 163
gacaaaagaa gagaa 15
<210> 164
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 164
ccaggaaaaa aagag 15
<210> 165
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 165
tgcagagaaa aagaa 15
<210> 166
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 166
caaaaaaaaa aaaag 15
<210> 167
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 167
gaaacaaaaa aaaaa 15
<210> 168
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 168
aaaaaaagag gagaa 15
<210> 169
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 169
aaaacagaaa aaaag 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 170
agagaagaaa cagag 15
<210> 171
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 171
gaaaaaaaaa acgaa 15
<210> 172
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 172
gaaagaagga gaaaa 15
<210> 173
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 173
acagaaaaaa aagaa 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 174
caaagaagag aagaa 15
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<211> 15
<212> DNA
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<400> 175
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<211> 15
<212> DNA
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<400> 176
tagagagaga gaaag 15
<210> 177
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 177
gaagaaaaaa acgag 15
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<211> 15
<212> DNA
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<400> 178
caagaaaaaa cagag 15
<210> 179
<211> 15
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<213> 拟南芥
<400> 179
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<210> 180
<211> 15
<212> DNA
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<400> 180
gaaagaaata aaaag 15
<210> 181
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 181
gacgaaaaga aaaag 15
<210> 182
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 182
taaagaaaca gagag 15
<210> 183
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 183
caaaaacaaa aagaa 15
<210> 184
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 184
aaaaaggaag aagag 15
<210> 185
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 185
gaagaagaat aaaaa 15
<210> 186
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 186
tgacgagaga gagag 15
<210> 187
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 187
gaaacagaga gagat 15
<210> 188
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 188
agatgagaag gagaa 15
<210> 189
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 189
tgagaagaaa aaaag 15
<210> 190
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 190
cagagaaaac aagag 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 191
aaaaagaaaa aagaa 15
<210> 192
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 192
cgcaaagaga gaaag 15
<210> 193
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 193
tagagagagc gagag 15
<210> 194
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 194
gagacggaaa aagag 15
<210> 195
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 195
caaagagaag aacaa 15
<210> 196
<211> 15
<212> DNA
<213> 拟南芥
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aaaagagagc aaaag 15
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<400> 294
caaatccatc tcatatgctt acgataacgt cccattgcca agctggttct ttcactcttc 60
aggagaaaga gagagagaga gagagagaga gagagagtta tcagagatag caaaa 115
<210> 295
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 295
gatagagatt ggagagcgag cgagacaaat cagaagagag agatttagat attgtagagt 60
gagattctaa agagagagag agagagagat 90
<210> 296
<211> 88
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 296
aggaggagaa agagaaaggg ggaagagagg agagagagag agagaaagag attagagaga 60
gaaagaagag aagaggagag agaaaaaa 88
<210> 297
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 297
aggagattag cgaaaactca aaacaggaac aaagttaaaa gagtgagaga gaaagaaaga 60
gagaag 66
<210> 298
<211> 104
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 298
gttgtcttca gctgtgtaca gaatcaagtt tccaagagag aaagagagta aaagcaaatt 60
aacaaaggaa gactctgatt caccgagaag gttttggctt aaag 104
<210> 299
<211> 86
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 299
attttggaat ctttctctct ctctctctct aaaaccagat tcttaataga agaagaagaa 60
gaagaagagg aaaggagaaa tctgcc 86
<210> 300
<211> 78
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 300
acgtcacgag acaaattagc atagcacgca aagaagaaga agaagaagaa gctccaagaa 60
tctgtcgcag aaatcgcc 78
<210> 301
<211> 77
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 301
aaacaaaacc atctgactta tcaacaacaa caagaggacg aagaagaaga agaagattgt 60
tactttcttg atcgata 77
<210> 302
<211> 98
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 302
tcagaacaac acagagccaa aggttttttg ctcgcagtaa agaagaatca cactgtgaag 60
aagaagaaga agcgaaatac aaaatcctca ggaaagaa 98
<210> 303
<211> 135
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 303
cgtctttgaa agctaaaaag agagcaaaag cttctgttta ttctccgatt cgcagatcaa 60
ttagctgggt tttgattccg ttgtgcgaag gactttaaga ggttttgcag atcgaaatcg 120
gaagagaaga agaag 135
<210> 304
<211> 389
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 304
gtcaagcagc ttaaatcatc tatgacttaa aattataatt aagaaaaaac aatgcctaaa 60
tatgcatata tttcaaatgt atcacataac ttgtgacata agaaaatata aacaaaacaa 120
aaagggcaaa aaagacctga aagcttagag gcacacctgc ataggtccca cagttcactc 180
gtgacaccgt aaaaggcaaa acacgaaccc gccacgttat cacaaaaagc aagccacgtc 240
aatatagtct cactgtcaac tacacttaac ttactatttt cacatctcat tttcctatct 300
ttatataaac cctccaggct cctctttaat ttctttacca ccaccaacaa caaacatata 360
aaccataagg aaaacagaga aagagagag 389
<210> 305
<211> 49
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 305
tctttctttt gctaattctc tatctcactc agctgaagca gaaagagag 49
<210> 306
<211> 291
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 306
acaataaagg tttccagcac agagaagaga gagagagatt gcttaggaaa cgttgtcgga 60
cttgaaacca gtttcggtac cggaatttag aaactccgtt caaatccgga gccaatctct 120
aaaggataaa gcttccaact ttatccatta attggagaaa attctcagag agactgaagt 180
cgacaaagtc agagggtttc gttttttggc ttctgggttt tttatttcaa gtgttcaatt 240
tccgaattag gtaagaaagt taggttttga gatctgtgcg aattgtgaga g 291
<210> 307
<211> 77
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 307
cttttacatt tccggtaaga tcaaaatcaa aaccaagttc gtttcgcggc ggaggagaag 60
aagaatcaga cgggaaa 77
<210> 308
<211> 551
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 308
ttaaattaga gaaaaaaacg cagacgacta aaagatattc acacacaaaa aagaaagaaa 60
gaagaaaaat tagctcacaa aataacaaca atataattaa tacccaaaaa agaaaaaaaa 120
ctaactgagt ccatgttgaa tagatctcct atagatgtaa ggaaatactc ggcttctaca 180
tcttaattaa gcattacttc ctatttctaa atagatagga agattcaaga gcttctctcc 240
cagacgtgat ttttgagaca gccttttcat caattttttc tggcaccggt agagcgttag 300
ctcgtcggtg ccaggagcta gcttcttctc accggtttcc tcccataagc tctctcatcg 360
gtttctctgt tttttgtttc gtgttgtttc gtctcttttc cctcctatta gatccataaa 420
gcttcattac cgcacaacct tcgaaactac tcccatctgg tattagctct tctcttacct 480
tgttcgcgat tctcgtggat ccctctcctc ggctttcctt aaagtcaaga tcagcaactc 540
tttggtcctc a 551
<210> 309
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 309
aacgaaaaag aaagaaaaat ctgtgaggac gaaaactctc cgtcgttccg gcgagtttct 60
ccagtgatcg gcaaagtctt tccggcatct attgaatttc tctaaaccaa ttagaatatt 120
atcggtcttg ataaaataaa 140
<210> 310
<211> 87
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 310
aaaactcaca ctttctctct ctctctctag aaaaagaaag aaagaagaaa aacttattgt 60
tattcccatt tcgcccctat ccgaaaa 87
<210> 311
<211> 289
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 311
agaaacatca tgatatgata tttttctcaa gtcttttggt gttggagaag aagagagaag 60
aagaacttgg tttctctctc taaaagttta ttgcttggct ccataaaaag tgcacctttt 120
tctctctttt ctttctctct ctctctctct ctctctctct ctctcacttc tcctcggatg 180
cactattgtc cgtgagatca gagattcacc ctctttagat tttgcgcaga aacttttgcc 240
cacaattttg tattcgtcaa atctgagctg agatctctag agtgagaaa 289
<210> 312
<211> 35
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 312
cgagatgcgg cgaggagaaa gagaaggtta aggtt 35
<210> 313
<211> 98
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 313
gttcttcttc attcattaca acaaactctt tgagacctaa agagagagag agcgatagtg 60
agatttagat caacagattt gaatcgattt ctgaaaac 98
<210> 314
<211> 240
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 314
agaaaggaaa ggaaagaaag aaaacaaaag gagtccaaga aaccagaaga ttgtctcccg 60
acgccattat ccttcaccct cggagctttt cttgaagcag ggattcttct aatcattaat 120
ccctacttct ttctttcttt tttgtttgtt ctcctttgag atctatctag tactagtagt 180
aaaaccccct cccctccatt gaatttgaat tgaattgaat ctctgggaat caaatctttg 240
<210> 315
<211> 291
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 315
ttttgatatt tcgacactct ctctttcctc tctccttgtc tctgtaccgc gtcgaaatat 60
gagaaacgaa tgatttgatc atcaatcaac gagaaacaca cacggagaaa gagaatctca 120
aattagctcc agctcctgat cgattccgat tttcacaatt ctttccttgg atctgctctt 180
accttgtcac gatttcactt ccctgtgttt ttgatttata cttggtcatc caataacgaa 240
actttgatca aactggaact acagtttatt ggaactccct gaagcattta g 291
<210> 316
<211> 102
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 316
aattgaaaga aaaaaaaaaa cgagaagcgt tttctttctc tccaaaatcc attactcgcg 60
aactttcctc tgctaagtgt tcactagaaa gaggtggtga tt 102
<210> 317
<211> 140
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 317
tggatgattg ctgctttggt caacgtttca aaagaatcgt tttttctttt agttccttcc 60
ttctttcgct attttcgcca ttgattgctg aagaaaacac agagagagag agattcactt 120
ccccatttca gaaaatcaaa 140
<210> 318
<211> 245
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 318
atgctgacac agatatttat ttttgcctct tataacgaaa aaagcaaaat aaaagaaaag 60
agagaagaga aaagcattat cccttacgac gaggaagccg tcgttttgag ggttcgtaca 120
aatcctgaga tcttccttca aactctttct ttgtctcctt ttttatctca ctccgtcgtc 180
gttttgattc tttcaaagtt cttcatcctc tgttccgcgc tgttttctgg tgagtgttga 240
ttctg 245
<210> 319
<211> 62
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 319
agaaaaatca gagaaagaaa gaaaacagag caattacttg aagaatccat aggaagctga 60
ag 62
<210> 320
<211> 226
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 320
aataacaact atacaatgat atttttgatc aaacgtcatt ttccaatctt tgaatctgag 60
atgataactt gttcagctta atctttccag tcaatttcat ctccttccaa ttttgaaggg 120
ttcatcagag aaagagagag ccattcagag atccattgta ccaagctcac ttcgatctac 180
agaatcaccg agagctctct gtctctctgt cggtgatatt tgtttg 226
<210> 321
<211> 540
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 321
aacgtgctcc ggtgaagatt aaaaaccgac gagaccctgg cgccatcaca actacgcaat 60
ctcattcctc cgtcttcttc ggctttcaaa tttaccattt tacccttctc tttccctgag 120
acgtcttctt tggaaatatt cttctcttct tccattccaa tgattttgag gttaattgga 180
aattagagtg caaaattggg atttagatgg ggattgctga tgaatctaaa tgtgttttcc 240
ccttgacgag tctccagatc ggagacttgc aatcatatct ttctgatctc agtattttcc 300
tgggaaataa aagtaaaaag atttacatat tggtggataa ccggccatgg ttgaatcctg 360
gcaccagatc tgctcatttt tggcaactaa tggtcacaaa gactctcccc ttttgcaaac 420
acgaaacttc gaggggagaa gaaaaatcag aatcaggaca gggagaagaa aaagtcgaag 480
caggaggagg aagagaagcc taaagaggct tgttctcagc cccagccgga cgataaaaaa 540
<210> 322
<211> 131
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 322
aaaactctac tgtaactgca aaatcttgtt gttttcttaa acgaagagag aagaaagaaa 60
gaaaaaaacg ttacggattc tctgcttcgg tttcgcgatt gaagcttgag atttcatctt 120
gaacatccga t 131
<210> 323
<211> 177
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 323
aaaatctcac ctttttgacc ccaaaaattt ctaaatattt caaaatcagc ctcttcgttt 60
tctttctcct cctgtctgtt gatttaaaga cccaaatctg acgcttctct ctctctttct 120
ggtatctgcg tttgattcgg agaagaaaaa aaaaaaaaag gcaaagagag agcttca 177
<210> 324
<211> 120
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 324
acaaccctag aacaaaaaaa gtatcccatt tgtcatttgt caattgtcat tagcaagaac 60
aggaagaaga tagagaacag agctcttcga tcttttttcc tccaaggaag aagtagaaag 120
<210> 325
<211> 272
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 325
acacaatcga agtcgaactc tcaggattca atcttgatac caaagagaaa cagaaataaa 60
ctaacatcat cgctactgtc gcctataatc ttgtgagctc tttatcgtct tcaatggaag 120
ttcgatgatg taaaaactca aataagagtg attctagaat gggaaatttt ctatagaaag 180
gaaaggtttt ccaaaacttt aatgtagtac agagctgcta ccgacaaaat aagcagttta 240
agacacgata ccaaagagaa cctgacctgt tc 272
<210> 326
<211> 295
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 326
aattgttttg aggtagcagc tgcaaaccgc tcaaacagtt gcgcattagg cattacacag 60
ttccactcgt tccttttgaa gcttatctgt gtgactctaa tctgttacta taataggaac 120
gaaagagaga actaggatct atacttgctc caaccttgct ttgtttctct tctgcgattt 180
atctctagat ctactagatc tggacaagga gcgaagcgaa ttgctggcaa attttagttt 240
tggagttttg aaacccgacg attatcgcgc ttgatcgttg cttctctgat cggaa 295
<210> 327
<211> 70
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 327
ctgaattacg aaaattctgt gaggttgagg aagcagagtg aagagaaaga tagagagata 60
agaagaagcc 70
<210> 328
<211> 70
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 328
aacacaaaca aaaaaaaaga actctttcgt cgactaatgt gatttattgt tcaccggagt 60
attaaagaag 70
<210> 329
<211> 282
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 329
aaaggaaaaa gaaaaataaa taatcgatct caaccgtccg atcatccatc ttgccatcac 60
cgttcaccaa tcttcttcgt ctcctctctc tttctctctt tttgctgttt ctagctcctc 120
tctctctgga tctcgccggc gaaccgtttc tcttgggtgt aaacagtagc aatcaagcta 180
tagaatctca gatatcgctg aattagctgt tggattttat ccgccttttc ttcgttatcc 240
ggggctcggg tataaggttt catcgtctta tttcatctgt aa 282
<210> 330
<211> 126
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 330
acttgtttcc ttatatattc ttctcccttt aaacatttaa tcttttcctc ttctaccatc 60
tccacaaatt ccaaacatct ctctctcttt ctctctcaca cacaaaattg cagaagaaga 120
agagtc 126
<210> 331
<211> 30
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 331
aacggaattt tcccaaaaga aaaacagaga 30
<210> 332
<211> 37
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 332
aaatcaaatt cattcatatc aaagagatag agagaaa 37
<210> 333
<211> 398
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 333
aaaagaaaaa aaaaaatctc agtcaagttc gtccgaaagt tttcaacgac gacggctttt 60
tagagatttg attcgtttca ctcttctggg tattgatttt cttccttaaa tttgcatcct 120
ttttaacgtt tatccaacga tcttgctccg ttactgaaac tctgtttctc cgttgcttct 180
ctcgtctcat ttattgttcg taacgtgatt ttactacttc tgttactcga gtagagatta 240
cccttcttat gtccgaatct gattcgtcgt ctttaagctt tgtcttctcc caattagctc 300
aaagttcgta actttgttta cttgccaata agaaatttcc agagactgaa gtttccattg 360
aatgtattgt tcttggagaa cttaaccgga ttcaggac 398
<210> 334
<211> 159
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 334
ctcgaagact attaaaggaa tatccgcaaa gaagaaaaaa aaacattttt ttggtaaagg 60
actaatcttt ttgtttgcat cggccatctc taaccttacg attgtgtgtt cttgctttga 120
gcgaaaccct agaatcggtc ttaacccatt tgagcagag 159
<210> 335
<211> 274
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 335
acattagctt cctcattttt attcttatta ttattattca tcagaccaac aacaaaaagg 60
agataaagag aagaggattc atcatcatca atcaatcctt cattttatgg atctactcat 120
atcttgattc ttccttctat ctctcccttt tcttccatct ctttttctct gggtttcccc 180
ggattgagtt ttttaatctc tgattgacag atttgaagag cgtgacaaag gaagaatctt 240
ttattaaaac aaattcttct gttttaatct tggg 274
<210> 336
<211> 43
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 336
aaacgaaaag cttttgaaga acagaggaac aagaagaaga aag 43
<210> 337
<211> 80
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 337
agctcatatt ctctcacttt ctctctcagc ttacgaacaa gaaaaaaaga agaatcttta 60
gccacctttg agatcaaaag 80
<210> 338
<211> 203
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 338
atccaaaacg tttttccttc ccacaggaaa agaagaaaaa cagacagcgg aggactaaaa 60
caactagcca caacacaacg cttcaaatat atattactct gccactttct tcaatcttcc 120
ttcaaagatt cttattacag cgacacacaa ctcttttcca tttagatttt tgattttttt 180
tggttctcta aaggaggaga gaa 203
<210> 339
<211> 71
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 339
aactttttca aaaaaaggaa aaaaaacaga gctcactcat tattatctct ctaaaaaccc 60
tagctttctc c 71
<210> 340
<211> 139
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 340
aatcagctgc agagaaagag aagtcaaaac gcagctctct cttgcgtttt cttcctttct 60
cctttctcaa ttccccagag aacaacataa ctctgtaaaa gggaaactct attttgttct 120
gaatcaaaag tagttttaa 139
<210> 341
<211> 70
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 341
atttctcttt ctttcttaag ctttttcaca agactagact ttagcttatc gttctagaga 60
gaggaagaag 70
<210> 342
<211> 119
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 342
atagaatttc tcgtttttat cacccgcttc atttgccttt ctatcgccac aagaacacag 60
agagagaacg attagcccag ttccgatatc gttcggtggc ttcttcatct gaagctacg 119
<210> 343
<211> 68
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 343
gacagtcagt cactgtaaca ttttagatct ttcccgaaga agaaaacgaa gaagagacga 60
agagagaa 68
<210> 344
<211> 290
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 344
cagaaacaga gacaaattct aaaaaagaaa caatctttag acaaaagaag agaaatttag 60
tcatgggtta gtctgcaaaa ttcaattacg tcttcttctt cttcttcttc ttcatctttg 120
atttgttggc gtgtttaggg tttgggattt ggaggagagg caaaatgttg aattaaataa 180
atcgaacgac tctggattcc tcggcggtta acgaccgccg tcgccgccgc cgtcataatc 240
caaccaccac caccatcaac gaccttgaat ttccacaata tgcttcatca 290
<210> 345
<211> 209
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 345
acaactttat ctcagctttt tcttctcaat taaaatcagt ttgggatttt ttcgaaaacg 60
cttttcaatc ttcgtctatc tgtctccacg atccacgcct tgaccttcgt tttttttttc 120
tcagagatta gagaaaactc cgataaccaa tttctcaatc tttttgtaga tccaattttt 180
ccaggaaaaa aagaggtttc gcgaagaag 209
<210> 346
<211> 72
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 346
agtgagtcac ataaccctct tggaaagagt ctcaacactt gcagagaaaa agaacaagga 60
agatcccgga aa 72
<210> 347
<211> 427
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 347
ttaaacccag aaatcaccaa aaaaaaaaaa agtacatttc cttttttttt gttcttaaat 60
ttttctgtgg ttccggtcac cgcagctctg tcatcatctt cttcttcttc atttaccaat 120
ctgaaatcta ctcagattct ttgtgatttt ctccttaaaa tctcgatctg tatcgtacag 180
tgacttgtga aattaggatc gttgtgtctg tgttttctgg ttacagtttg taaaatttga 240
atatttgtgt gtgaagtcag attcagtttc gtgagctgtt cggatttggt ttgggggtat 300
atatatagcg ttgtgtgatc tatttggggg gttttggttt cccttttttt ctctcttgtg 360
aattcgttta ttgttgtatc gtcggcccga gtttatcgga actccgggtc tgacgtgagt 420
tttccaa 427
<210> 348
<211> 96
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 348
attcatcacc acaatcacct gaagagccaa agcagcaaaa gaaacaaaaa aaaaacaaga 60
agtgaagtca gatctcgaaa aagagtttac gaatcc 96
<210> 349
<211> 249
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 349
aaacgttact gtcactaaat gaaatctatt tttctttctt aaattttgct ctgacaaata 60
tttttgattg cgtcattttc tactttggaa atgtctttga tttagcattt cagttcgctc 120
aaaacatcaa atcttacctt ctttagcttt cacattagat tctggtaatt attagcacaa 180
aaaaaagata agccagaata cgaaacaacc aaaaaaagag gagaattctt tttttttttt 240
ttctttccg 249
<210> 350
<211> 79
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 350
ctcaagaaaa caaaattact ttaaaacaga aaaaaagttg ataaattgct tcagtgtcaa 60
attctgagat ctgtaaaag 79
<210> 351
<211> 504
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 351
taaaataaat gagaagaaca aaaattcagt tgttaaaatc aaagtagtgt ctctaccgtg 60
atttttattt ttttctatat actgtttaaa cctcagtttt tttgttgttg ttataagatc 120
cttgtcattt tttgtcgtga ttagatgtaa tttgtataat tttagtaact cttcagtttt 180
tttttgtttt aaaaatatat tttctctctc tctgtcttcc tgcaatctat cgccggccga 240
ttcaataatt tcgctttact ctgccaaaaa agtttgttct tttgttttct gggattatcc 300
aaagagaaga aacagaggaa atcaatctct tttttagttt cagaccctaa atcctaggtt 360
ttgaagtttt gtttctttag taattttgtc aggttttgtg tctggtgttg ggatttttcg 420
gagcttggtt tcttgaacca gctccatttt ctaaaaattc cttctttaaa tccccattgt 480
tgtaagtctt aaagaaaaaa gaag 504
<210> 352
<211> 69
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 352
gtcatttgct aaggaaaaaa aaaacgaaaa cgtgtgtctg tctcttctcg tagcgtctct 60
caagctcag 69
<210> 353
<211> 106
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 353
aaaaccaact tctaatttgg aatcaaattg aaccgaatcg aaccggttga agttgaaaga 60
aggagaaaag gcgttgtctc cgtgcgagaa aggcaaatcg gagacg 106
<210> 354
<211> 387
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 354
ttttttattt tcttgacaag tctgcatttt tctcctctgt tttggaattt tctcgtttct 60
ggttttccga tcataaaaaa caaacaaaac taccgtaaaa taggctctct ccacagaaaa 120
aaaagaagac ttttctttca ttcttctgca agtaactgag cagatttcgg ttttttcttc 180
ttcaaattga tatttttaaa gttataaaaa tttcttgtcc ataatttccg ttttccttaa 240
attcagctgt cctaacgtca aatctcagac actcgcttgc gtgtctccct ctcttaaact 300
ctctctttct ctttctcttt tggtttctgg gttatttcaa agaaaagaat caagaaaccc 360
ctctttctct cttacaagaa tcccatc 387
<210> 355
<211> 32
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 355
aaaacctcac agccacacaa agaagagaag aa 32
<210> 356
<211> 165
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 356
atatctgtct catctcatct ctcatcgttc cgggagaaga gaagagagac ccatccctca 60
cttcaaagtt caaagtctcg aaggatcttc tccaactctc tctaaacaag attccaaatt 120
ttcaaaggtg aatttgtttg atagaatcaa gaacaaacct ttaaa 165
<210> 357
<211> 101
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 357
atatttcttc ccatcgtcac tagtcacgac cacacaaaca aaaaaaatat aacatttaga 60
gagagagaaa ggtacagcag tggcaaactc gtaaataaag a 101
<210> 358
<211> 233
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 358
aattatggtt tacgaagact gagaagaaaa aaacgagcat cgtccatcga gatccaaatc 60
ctcagtttca ttttcatctc tctctctcgt attgatcagc tactcgaaac tccggtaacg 120
gattttcaca atcccggcgg cgaaactctt cttcccggct aagttttcat tttcttcaga 180
ttcctcgtaa agttgccggt ggaccaaggt ccaactcttg aacaccccaa atc 233
<210> 359
<211> 140
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 359
cattcatttg ttctttcttc agagaaaaac aaaaaacaga gcattttttt tggtcaagag 60
caagaaaaaa cagagcatac ttttgcaaaa agcagagctt ggagcgcttt cttgtcatct 120
aaaattcaaa ggcagagacg 140
<210> 360
<211> 132
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 360
gtttggaaat aacgtgtaag taggacccac ttttgtgatt atccgccgca cagaagtctc 60
tcctccactc cacaaatagc attcccggcg agagacagag agcgaagaag aagactcaaa 120
ccaaaaaaaa aa 132
<210> 361
<211> 352
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 361
atcgacggtt agaaatgaaa cgattaggag attagatcgt tgaacaaaac gacgtgtttt 60
ggtctattta taaagaaaga aataaaaagg agagatgacc aaacacgcct ttatcatagt 120
ttctatctcc gatgacacaa aacgaggaag attatttgac attttaagta agaacagcta 180
gctttgccat ctccctaaag gcaataaatc tcggatccac tttcacgata ttttgatatt 240
ttttctattt ataatctttc tgggttttga gtcttttgaa ggctgaattg ctctgaaatc 300
tcaattgtat aatcatctcc tgggtcgtcg ttatcgtgat catctagaaa gc 352
<210> 362
<211> 123
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 362
atccaatcat agacgaaaag aaaaaggttc ctttttttga ctttgtatcc gtagatcatc 60
ttcttcttct tcttccagag ttttatcctt atccgttcca tcaaattctc tctctaagca 120
aag 123
<210> 363
<211> 255
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 363
gtttctcatc tccagctctc attttctctc tcatcttcaa ccttaactct cttttctctc 60
tactctttct ttggacgaat ctgtctattg tttgtaagtt ttcaaggaag gtaaagaaac 120
agagagatct aacttcgtct gcagggttta agcagaggtt ggtttgtgga ttcttcgatt 180
tcttcttcag atttagtcta caatgaagtg agaatttcta aagataaaca aagaaaaact 240
tgagacttta gcaag 255
<210> 364
<211> 109
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 364
aattgtctct tcttttcttt ttgtacttgt caaaaacaaa aagaacaaca aaaaaaatct 60
caaccgtaga aaattccgac aagagttcag ttcatacaat gaactaagt 109
<210> 365
<211> 115
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 365
atcttcggaa agtctcattt ctcgatcccc aattcgtgga ttagggttaa aagaaccatt 60
tttattctcg tcgcgcaaca acaaatccag atcgaaaaag gaagaagaga tcgaa 115
<210> 366
<211> 589
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 366
taatccaatc ttcttcttac ataaacacct ctcctccccc accgtttcca aaagagagaa 60
gctttctcac taacaccaaa aacaagtctt tgaagaagaa taaaaagatt ggattttgat 120
aagtttagtg aaaatggggg agcttttgtg ttcttcactg tggaacccgt cacgattcat 180
tgttgcttct ctcaaaaggt attttctggg tttagcttct tagaggttct tcgttcttaa 240
aggtctgttt ttttttaggt tgtgatactt tgaatgtaaa aaagggaaga tttttagttt 300
cgatatgtat atctctcgga tgggtttgag tcggagtttc ccgccgcttt ttgggggatt 360
tcgggaaatt ctagggttag ggttggatat tgtcttcctc tagcagtctc tgccactttt 420
aaaatctctt catctttctt tgagagtgaa agaggttttt ttatttgttt gtgtcttcct 480
gggaatcgag attctggatc ttaatcaata tgtgggttaa ttgggagatc tgggatttgg 540
gagatcttgt ggtggattga agaaaaagca aggttgtaga ttttgaaaa 589
<210> 367
<211> 85
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 367
ggtagaaaga aaggattttt atttatccag aatcaatcgc cggagaagaa gataaacaca 60
gagagtgacg agagagagag tgaaa 85
<210> 368
<211> 155
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 368
cctgtctagc gttgacgaca ccaaaattga aaatttggca tcatttgcga aacagagaga 60
gatccattca attccaaaag gattctcttt tgggaaaacc ctaaatcgac ccaccaaatt 120
tggagactgt gattgagcat gagcgtcaga agttg 155
<210> 369
<211> 208
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 369
attagatccc tttaatttta gtaattaagt aaaaagatta taaaagatga gaaggagaag 60
atagcttctt catcgagaaa cctcgaaatc aaaaagcacg tcggtgactt gtactcttca 120
atctcttctt cctctctttc acatctcctt ctctcgaacc catcgacctg cgctaattca 180
tcatcgacct tgctcaaatt catcaacc 208
<210> 370
<211> 115
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 370
aacttccaaa tcctttatat aacttctcac aagtcaccac catttctctc tagaaaatat 60
cagaaaaaca aaaccatctc aaagtttctt gagaagaaaa aaagggtcaa gaaag 115
<210> 371
<211> 109
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 371
gagtccaagt tgactccttc gagctttgat tctcgttcca ataatacttc ctccaccatc 60
tctcctcctc tcgttagatc taagaaacag agaaaacaag agagataga 109
<210> 372
<211> 198
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 372
ccaattctaa accaaacaac agattctcat aatcatctct tcttttttcc tctttacgaa 60
aagaagaaag atcaaacctt ccaagtaatc attttctttc tctctctcac acacacacat 120
tcactagttt tagcttcaca aaatgtgatc taacttcatt tacctatatg caggtttaca 180
caaaaagaaa aaagaacg 198
<210> 373
<211> 51
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 373
ctagccgcaa agagagaaag ggagggagga gagtgtagca gatcggcgaa a 51
<210> 374
<211> 62
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 374
gtccagcttc tgagctcaga gatagagaga gcgagaggtt agagataaca gtagttttac 60
cg 62
<210> 375
<211> 213
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 375
aaattgataa cttctaataa atggagggtg caattaataa ataaggagag acggaaaaag 60
agacgccgtt gaaacaccgc aaaacagaga agcgcctttt gattgtctct ctcccggaga 120
tctctctttc tcttcttctc catccttctt ctctcggcgc gcgcttcatc cccaccacct 180
tcgaattcgt gccctttgag ggaagctgct agg 213
<210> 376
<211> 162
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 376
attttataga gacgtctctg gaaaaaacat tcccaaaatt ggcttataaa tactttcaaa 60
accacaaggc cacaactcat cattcgcacc aaagagaaga acaaaacatc atcatatatt 120
ctattgacta gattaatttc ttctaagtgc aaaagaggag aa 162
<210> 377
<211> 135
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 377
cgtctttgaa agctaaaaag agagcaaaag cttctgttta ttctccgatt cgcagatcaa 60
ttagctgggt tttgattccg ttgtgcgaag gactttaaga ggttttgcag atcgaaatcg 120
gaagagaaga agaag 135
<210> 378
<211> 186
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 378
tccgtgattc ttctctttag cttatttttg gggaagacaa ttccgagaaa atagagagta 60
gagagatcct aaagagtcaa aagaggtcag gtgattgatt aacccgttga ataatctcct 120
tctcccgttg aatcgggtcg aaatagttga actttaagcc aaaccctagc ttgaggagga 180
agagga 186
<210> 379
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 379
aaacaaacgc aggaggcctg gaaaaaagaa agataacggg actcgagaga ttgagattac 60
ggagccaccc actttc 76
<210> 380
<211> 171
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 380
tatatgcttt ctctggacaa acgcaaaaac ttttgtagaa ccctaaaaat tcccaaaatc 60
cgtcggagaa gaagatcgag aagaatcaac aactaatctg aagaattttc caaattccgt 120
cttcgtatcg tctacgagat ccttatctct cccctgaatc tggaaccttt g 171
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 381
aacaaaactc gaatcagaga attccagata ttacttacat aagacaattt tagcaattag 60
ctttcaaatc tcatctcttt attctctctc tctatctctt ctcctcaaga accctaaaaa 120
tctccagaaa aaagatccca aatttcgtat ttcaacgatc tgaatctctc tctctttcgg 180
gtttattttg tttcccgata tggtttagaa tttgtgattt aaatggaagc tgacgtgtca 240
atttcctgaa aaaaccctta tcgcgaaatt ttccagatta ccaaaaaaaa aaagattgaa 300
acttttttcg atttgtttga agaagaagca cggtaggaac gacgacg 347
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 382
agagagagag agaacacaaa gtgggaaaaa agataagaac ccaccataaa gttttaacat 60
ttttcccttc aaaaggcgaa agcttttgat ttgtataaaa gtcccactta atcacctctc 120
tagcttctca ttccatttcc atctcctctc ttttgttttc taagttgctt caagagtttt 180
ggatagtgta gcagagagat tttaactaat gggtttataa aattttgttc ttttgcgtga 240
acaagttgtc aacttctaga cagattttct ttttgaagtg ttttcttgtc gaaattcttc 300
ttcttttggt caaagaacgc aagattcttc tgtagttcct ctaaaaaaaa tccta 355
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<212> DNA
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<400> 383
cgtccttctt atcattataa tcatcttttt aatcaaaaaa ggtttgcaca taacataagc 60
ttttttcttt ctctcttaat cagaaaacaa tcttgtctca caaaaatata attaatgatt 120
ctaaatttcc ctaaccgtcc gatcacaaaa gatcgtgatc atcgcgtgga aactttagac 180
caatcttttc cctaaaccgg accgtaccag attccttctc tctctctctg cttagagagt 240
tttaggttcg ttttcccact taagccaaat tggacaagat ttggacgttt ctgtatctct 300
cttaaagcta aaaaaaaggg cgaatttttc catggcgttg tcggagtttc agctagctct 360
gagcttggtg gtcttgttct tctagctgat ttgatcgaaa ccccatgttc ttatgatttt 420
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gtgaaagcaa gagccttttt gtctattg 508
<210> 384
<211> 88
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 384
gtgtttagct tcttcactac cacacagaaa cagagtttcc gtctttcatc ttcctccata 60
tgcgtcgctc ttaaaaacct aattcaca 88
<210> 385
<211> 231
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 385
aaaggaagaa aggggtagaa ttggaaatat gtagagaaaa cgagaataac tctgacgcga 60
acgtttctct cctccgtctc tcgatccctc tcttgacgtc tcgctgatct gttttgctaa 120
gattcaagct tcaaaaccct aatttctcta gccattagca tcgatttcag ctcaacttca 180
gattcaagga aacaattatt agcttctcaa gtgcttcagt gatccgatac a 231
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<212> DNA
<213> 拟南芥
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gttatcctca tctagtcatc ttcaccctct aactcaccga gaaagaaaag taaagagagt 60
ttggtgtcac t 71
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 387
gagccctcac ttgacagaac tcagaaattt gaaagagaaa taaaagagag agaagctccc 60
agagaagaaa agccctaaaa gccccactcc tctttccagt ttcttttgat ctctcagcat 120
cgaaa 125
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<211> 121
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 388
ctttggtcct acttagtact tacctgcccc tctcgacaaa atttcttttg tactttcaca 60
tttctctgta ataaactcgg taggtttgcg aaaacctcgc cgccgggaaa aaaaaaaatc 120
a 121
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<211> 293
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 389
aatctcccct tggttgatcg gtgaacacaa aaaaaaaaat ctaaaataat cgcaaaatac 60
atttgaagaa gctacacgat caacaacagc aaaggatttc gattgttgaa aaagttgact 120
cttcttaatt tgattcgttg tcttggtttc tgggttttct tcttcttctt ctgcggcgct 180
ctccaatttt acaccttgcg accagcgaga aaagaaacaa atttcacccc cattgaagaa 240
ggacctttgg ttaagctcca tggtgtggta tgcgcaaagt ggacaatacc tag 293
<210> 390
<211> 54
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 390
taagagacag agagatctta acacaaaaca aagcaaacac caaaaaaaac agag 54
<210> 391
<211> 120
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 391
aaacccattg ctcaagaaaa cttttcagac agatttgttt cgagaaaaga tcgcttgctt 60
ggcttttcag gataatctga gatctatctg tagaagaagc agatacagaa ttcagaaacg 120
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 392
aaaaaaagaa agtaaaaaac gcgtcaggga agagaag 37
<210> 393
<211> 214
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 393
aataatgtgt tgcaaaagag gcaaactata caacgtgaaa gtggtaggtc taccagatcc 60
cataccctca ttttaatggc ggagattaca agggaaagag acaactccaa ttcaaagctc 120
tgattttttc caccaatccc cattttttcc cttttacaat tcttaagcta gttttatact 180
tttcttcttc ctttcatttg ggttaagaga agcc 214
<210> 394
<211> 285
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 394
atcaaaatca atgatcaagg taacgtagtc aagttcaatt actctttgtc aaatttaagt 60
ggtctctatt actaaactat acacaaccgt tagatcaaat aattctctac catccaacgg 120
tccaaagtct ccacttctat ttattacaat aaaatgagaa aataaaaacg cgcggtcacc 180
gattctctct cgctctctct gttactaaat gaagaagaga atctctccgg cgagatcacc 240
ggcgttattc cgataatttc gcctgagagt tgtcgcatgt tataa 285
<210> 395
<211> 347
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 395
atccgacggc aaaaggagaa ttaagatttt taactttaaa cgagagtttc gtttatttac 60
tcaaaaattt acttctgaaa tctctatttg aatttcgggg aaaaaaatcc taagtaaggg 120
aatgcagaga gatggtcgga gtatcgccgg tgaagactaa gctgtgtgat cggtttaacc 180
gatccgtcgg cggcaggaat tgccaccgga aacacgtcga ggacgggtga tccagttttc 240
taaactctcg tctctcgaat tcttcgaaga tatcgaaaaa ctgtaaatct tttttttctt 300
ctactttttt acaaaattct ctaatcatcg ttgtaaagta aaaaacc 347
<210> 396
<211> 291
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 396
ttctttcgtg aaatttgtca tctcttcttt cagaaactta tctggattct agccaatttc 60
tgttgtgact ttgacattat cttctccaga aggaggtgaa aagagaattt gtgggtcctg 120
gtaagttccg aattcgtatt tgattgagct ctgagtttca agggtttgtg ttggatcaat 180
ctttagattc gttggtgaaa gcgtttaaat cgacgaaaaa agtgatgctt tggaagatat 240
gatcttctct atctctggtt attactgggt ttcgagattc ttgtgcttaa g 291
<210> 397
<211> 48
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 397
taaaccacca attctctcat ccgtaccaaa gaacaaaaaa aagataaa 48
<210> 398
<211> 85
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 398
acttctcata aaaaaggtca tttcaaaaaa aaatcagaaa ccgtcaaaaa gccaccgttg 60
atatttcttc cttgttgctt cttca 85
<210> 399
<211> 285
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 399
ctcctctctc ttctctcttc tttcgcgttt cgaaggttgg ggaaagcttt cgcagaagaa 60
aataaaagct agagagagaa tgtcaatgtt tttttgatgc tccgtctggc aattagggtt 120
tcttttttct ttgatttcgt ccccttcgag aactgaatct cccgcctata tcgacgccgt 180
ctaattccta tcatttctcg ttgctccaaa accctaactt tactaccgtc ggtcattatt 240
ttcactttct cggctcgatt tggtgttgga ggttggtaat cagtt 285
<210> 400
<211> 151
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 400
cgagcgacca aaacgcagag ttttgacagc aattgagtgg ataccgaatc acaataatac 60
agaaagacat taaaagcaac aaggaatcgc gcgattgggg gcagttggag agacgaacaa 120
gtcgtggtga gattttagga agacgaagaa g 151
<210> 401
<211> 181
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 401
aagtatcaaa aaaattacaa ctttacgatt tgcttagaaa ggagaagaca tctggagcaa 60
caggatttac aaaagttatt atctttatcg atttctcttc ttcctagacc caacagacga 120
agagaatttg ttgttggttg tctctggtct cttcgtctag gttttttttg ggttattaaa 180
g 181
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 402
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caatca 66
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 403
agagaggcaa ataatatatt cagtagcaaa aaaaaaatct gggatttcta aaaaaaggta 60
agaaggaaa 69
<210> 404
<211> 294
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 404
ctttcaccca ctttaatatg ccaaaaaata agaacaaaat tatatccgtt gcttgaaaat 60
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 405
tagttacgtg tttctgtttt tctctaattt ttctcttgtt gttctcgatt aacgaaaaag 60
acttgtcgtt ctcaattctt atcgatttaa gaacaaatca tctaacgaag attacttccg 120
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gaagaaagag atctccgttt tctacagaag aaaagcaaga gagtaaga 228
<210> 406
<211> 228
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 406
tagttacgtg tttctgtttt tctctaattt ttctcttgtt gttctcgatt aacgaaaaag 60
acttgtcgtt ctcaattctt atcgatttaa gaacaaatca tctaacgaag attacttccg 120
aagatcagaa acaaacacaa actgtgaatc gttgtttgtt aattctcttt aaaatcgcca 180
gaagaaagag atctccgttt tctacagaag aaaagcaaga gagtaaga 228
<210> 407
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 407
gagaacgaga gagcaagcca ttgcaggaaa tggcgattcc agtgacgaga atgatggttc 60
ctcacgcaat accatcgctt cgtctctcac atccaaaccc tagtcgcgtt gacttcctct 120
gtcgctgtgc tccatcagaa atccaaccac ttcggcctga actctcttta tctgtcggaa 180
ttcacgcaat ccctcatcca gataagtgtc gaaattatat aggtagagaa aggtggtgaa 240
gatgctttct ttgtaagtag ttatagaggt ggagtc 276
<210> 408
<211> 48
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 408
aatattttca ttaatcgatt ctcaaagtca agcaaaaaaa acgaaaca 48
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<211> 444
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 409
cctttcattg atttcatcat catcatcatc cttcgttttt tctctatcga tctagcagat 60
tctttcgggg accaaaatca aaatcatggt ggatcatcaa tggaaggatt taatcggata 120
aaagagaaga gacggaatca cgacgggaga agagatcggg aaatcggaaa atcggagatg 180
atggggattt ctttcgccgc caaactccgt ttccgatctc gatttcgaac ttcttcaatc 240
gattcttatt gcttcgctcg tgaggctttc tccgattgta tctcctccgt ccatttcttc 300
ttcttataac ctttttcttt gtaataacct ccgtcctctt cagctttctt tcttttcatc 360
ttcaatctca ccttaaattc tccacttttt tcttcttctc cttctgttct cgattgcttt 420
gtttgttgtg ttgtgcatac atat 444
<210> 410
<211> 164
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 410
aatcgtttcc acgaaaacaa gtagagagag tgattcgagt tttccaatca taaaaatcag 60
cgaagaagat cttcgttctt gttcattctg tgaggtttca ttgttaaaat cgaaacgaat 120
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<210> 411
<211> 259
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 411
gaaaaaaccg tatctcatta ttatataaat agagagagaa cagccccacg taaacaaata 60
gcgatagagc aactgtgtcg attgtcccaa ataattttaa aaataatttc acgtgtcccc 120
attttgctga cgtcattatt cccctttttc ctttttattg tcacatcaga attttttcta 180
actcattcat ttcaatcaat cttcttcttc ttcttcttct tcttcctcag agaaattctg 240
tgttgttgta tacagagag 259
<210> 412
<211> 61
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 412
actcacacat ccacaaaaag agagttagag attccaagga ggagagtgcg tgagcgtgac 60
a 61
<210> 413
<211> 23
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 413
aagaaacaca gagagcaaaa cac 23
<210> 414
<211> 77
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 414
gcttctgtgg ctaacaaaga gcaaacaaac acttagaaga aactaagaat actctcatca 60
aggcgatata gaaaaaa 77
<210> 415
<211> 134
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 415
tttttttttg ggttctgtct tgaagacaaa gaaagctttc ttctataata catctttctc 60
tacagatcac acagaagcaa aaattccatc tccgatttcg gaagagagtt gttctcttct 120
ctgagaagaa gaag 134
<210> 416
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<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 416
gagagaggac tgggtctggt ctcttcgctg caacctatag ctgttgtttg ctcttcgacg 60
ggattctcac tactcttttg ccaaaaaaaa gagatcggag gttccgaagg tgaatgcagc 120
ttgcgatttc atagaaaaga agattcgttt gctggattag gcttatttgt gtatcatagc 180
tttgaggttt taactgagat ttattgatag tggaacttag gttttcgaga ggtgtgaaca 240
gttgggtat 249
<210> 417
<211> 299
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 417
aaaataaaca tttgtctcta tttctcttat aaaaattcaa taattgaacc tcctctctct 60
ctctctcttc tctcccttct tcttctccga tttcgacttt gaatcatttc ttcgagagag 120
gtagcgagaa agggatcgcc ttttctcact ctctgcggat tctcaatttt gggcaagaag 180
gcaagaacag tttttatcgc aattgagtct tgaagaccac aaggatttga tcacattggt 240
gcttctgcct gtttatctga gtttgaggac aagaacttct ggggcgttta taatttgcc 299
<210> 418
<211> 204
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 418
atctttggct tctacatcca attatttact tgcttaattt tattcatctg aattattttt 60
tggtgtaaga agaatgtttc gccgcaaaaa aaaaaatctg atccgacatc attagaacaa 120
aaaaaaacat tggcgttgaa tataagctgc ttctcttgtt cttcttctac cttacgcttc 180
tgactgttat tagagactat gtaa 204
<210> 419
<211> 712
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 419
acacacacca acgttgattc ttcttcttct tcttcttctc tctttctcat ctaaaccaaa 60
aaatggcaga tcagctcacc gatgatcaga tctctgagtt caaggaagct tttagccttt 120
tcgacaaaga cggagatggt tcttctctct cagatctttc ctcttttgta taattttcat 180
tcataataga ctcacttgcg ttttttttgg tgttttgagt atcacttagt cttggcttta 240
ggaatttgat gctcttcgtt gtccataaaa tctctggata ttcacattaa cattaaacgc 300
gagatttgat gatatcttta tcgttcgttg attataaatt ataatcgcaa tcggatctat 360
ctcgataata atctctaact taatcgtgtt ttagtcttcc agattttact aattgtgatt 420
agaattgaca caaatcttag aattcaataa tcgaagtaga ttacattgac atttgtagat 480
tttttgttta attgattcag ttatttgagt aggttacaat gaaatttgaa gattttgtgt 540
tcatttgata cagttgttag agtaactaaa atgaaatttg aagattttgt gtgttattag 600
agtaaattac aatgaaaatt tgaagatttg gtgttaaaat ctgttactga tttgagagaa 660
atgtgtggtt ttgtgtttag gttgcatcac aacgaaagag ctaggaacag tg 712
<210> 420
<211> 78
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 420
gatttcataa accacgactg acttctcctg ctcgccgatc agatctccga cgaagttttt 60
gattaagaga ggaagaag 78
<210> 421
<211> 198
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 421
ccaattctaa accaaacaac agattctcat aatcatctct tcttttttcc tctttacgaa 60
aagaagaaag atcaaacctt ccaagtaatc attttctttc tctctctcac acacacacat 120
tcactagttt tagcttcaca aaatgtgatc taacttcatt tacctatatg caggtttaca 180
caaaaagaaa aaagaacg 198
<210> 422
<211> 30
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 422
aagaaatagt aatacacaaa aagaaacaaa 30
<210> 423
<211> 176
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 423
gggaacgcgg aagaaacgca aagccctctc cttttgcttc tggtcctctc gtcccgtttc 60
gccgctctct ataggggcaa gtgagaggtt actgtctctt tcttctttca gacactcgag 120
acgagaaagg ctcgtatctg attttaccgc caccggacca tctgtgatag acaata 176
<210> 424
<211> 256
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 424
acgaaaactc ataaagccaa agcctttctt cttcttcttt tcttccgatt attcccaaac 60
acaaaaatac tgctgaggaa aagcaatcca cacgattcga ttcaaagttt tcattttttc 120
tctaaaagtt tggattttga tttcgttgct gaacggaaaa agaatcagct cctttcagtt 180
tagggttttg ggtttctgtt tggtctctat cagatgatgt gtgaggagat tcttcctctg 240
tttgtgtctg tttcag 256
<210> 425
<211> 45
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 425
tttcttcggc gatctagggt tttagttgtc gcacgaggag gaaaa 45
<210> 426
<211> 132
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 426
ctcattctca aatctctcat tgtgtgtctg tgactatctc tctatacaat tcaaactctt 60
caagattact tcctcttcac tttgagaaga agaacaaacc aacaaatctc caaaatacac 120
cgaacaacat ta 132
<210> 427
<211> 129
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 427
taacggtgaa aaatcgtcat ctacttcttc ttgaaaccct agttccaaaa tctgcacaca 60
cactcagaag aagaagacgt catctctcta tctctgtctt tctgctaatt tcacgaagaa 120
tctgagaat 129
<210> 428
<211> 79
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 428
acaattaaag tgagaatttt cctgaagaag aagaactttt gctttttttc tgggtttgct 60
tttttgttgt gtcaatgaa 79
<210> 429
<211> 76
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 429
attttgtttt gcgtttctga atttgtggcc attatcttct cacactctct tctcttagct 60
cacagaggaa agaaaa 76
<210> 430
<211> 64
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 430
gttggtgatc cgatttttct gggtttggtt gggttccttt tttatttttt aataaaaaaa 60
aaaa 64
<210> 431
<211> 182
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 431
aatcgtcgat aatcattagg gtaaagcaaa aatagtgaag cagagccgca aaaacacttt 60
tcccaaaatc aacgaagata gattcagatc ggaagcgaaa gaacgattcg gtctcctcca 120
cagatcgaac atcgaaggag aagaaagacc atcatcacaa caagcatcga aagaagagca 180
ag 182
<210> 432
<211> 74
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 432
taaaagcagc ggcgtcatcg agagaaaccg aagaagaagc agtaacaaat ttggtgaagt 60
cacgagaatc aacg 74
<210> 433
<211> 66
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 433
atgaattagg aatctgtgat tatgataacg gagtctgaag cctagactcg aaaccacaag 60
aagaga 66
<210> 434
<211> 51
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 434
aattgatcgc actgtcaaac caaaaaaaat tgaaaaccct aaattggttg a 51
<210> 435
<211> 294
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 435
ctttcaccca ctttaatatg ccaaaaaata agaacaaaat tatatccgtt gcttgaaaat 60
cacaagctct tcttaacttc acaagtgctt caatggcggt tcttcacatt atcttcactg 120
cgtaattgaa gaagttgttc tctcttcctc ttaatttcga gttgtgttct taaaaaactc 180
cagagctgat tcgattctcg agaagaaact aagccgacaa taaagttcag atctggaaaa 240
aagcgagctc cagattacaa aaagaaacag ctcgtttttt tcactttcaa aaaa 294
<210> 436
<211> 75
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 436
ttatctttct caacgcacgc cttaccatta aggagaccca aatttcctgc aacaaacaaa 60
gtaaaaaagt tgaga 75
<210> 437
<211> 40
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 437
tattttcgtg ctcggaaaaa gcagagtaaa gctttaaaaa 40
<210> 438
<211> 656
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 438
aaaaaagggc gaatttttcc atggcgttgt cggagtttca gctagctctg agcttggtgg 60
tcttgttctt ctagctgatt tgatcgaaac cccatgttct tatgatttta cacgacctaa 120
tccaaaactc caggtccttg attgattctt ctctctctcc agctccagat tcttctgatt 180
tcttttgtta tcatttgttt ttgtaagatt tgtatccgtt tttgggtttt gcttagctga 240
ttcttgctgg atcgagagtt gaataactct gcttttcttc aatctggttt tttttttttg 300
tttcatagag gagaaaggtt gtggatttct caggtgggga tttgagaatt agggttttct 360
gattgggggt tttcttattg atgttacctt caccaaattg ttgtcggaga tctagatttg 420
gttcagttat ggaataatgg ctcgtctctt gccatctcta ttcgtaatta gcatcttctt 480
cttcatccaa agactcctcc tttcttcgtt aatccatcgc cagctattga atctgaagca 540
aatctgagaa tctaccgaac tcacgcacct gtatattgct tacacgatac agagcacacg 600
gagacggagt acatattgtt cagcgcaagt gaaagcaaga gcctttttgt ctattg 656
<210> 439
<211> 146
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 439
atactcgtat cttgtagcag ccactaaagc aaaattctga gatcgaaaaa gctatataaa 60
aaaaaaaaac tgcttccgtt tcatcgattt tgtccagatc ttccccttct tccggtaatc 120
gaagcttacg agatagttga gtgaag 146
<210> 440
<211> 274
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 440
acattagctt cctcattttt attcttatta ttattattca tcagaccaac aacaaaaagg 60
agataaagag aagaggattc atcatcatca atcaatcctt cattttatgg atctactcat 120
atcttgattc ttccttctat ctctcccttt tcttccatct ctttttctct gggtttcccc 180
ggattgagtt ttttaatctc tgattgacag atttgaagag cgtgacaaag gaagaatctt 240
ttattaaaac aaattcttct gttttaatct tggg 274
<210> 441
<211> 254
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 441
ttagggacgg gacactagag aagggagggc agagagcgat tttgttctct ctctacttct 60
cggtcgtctt cttcgtctcc actctagggt tttactctat cttcttcttc atcatcatct 120
tctacaccaa tctctagcgt taatctgttt ctgctggaga agatttacgc ttgttcctcg 180
gttctcttac ttctgctccg gttcgatcgc ttgctaagtg tttcgagttg gttcgcactt 240
cggtgggcga tatc 254
<210> 442
<211> 63
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 442
caagtctacg agcttcttct tctcggaatc ggagaagcag gaaaattccg gaggagcagg 60
aag 63
<210> 443
<211> 255
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 443
gtttctcatc tccagctctc attttctctc tcatcttcaa ccttaactct cttttctctc 60
tactctttct ttggacgaat ctgtctattg tttgtaagtt ttcaaggaag gtaaagaaac 120
agagagatct aacttcgtct gcagggttta agcagaggtt ggtttgtgga ttcttcgatt 180
tcttcttcag atttagtcta caatgaagtg agaatttcta aagataaaca aagaaaaact 240
tgagacttta gcaag 255
<210> 444
<211> 176
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 444
actgacacaa aagggaatgc gcttcatgcg ggtcatcctc ttaatctcaa actctctagg 60
actacactaa atctaacttt ttgcagagag caaaagattc aataattgag attgatctca 120
aaaccaaagc tctcgtgctc ttgtcgttga tgttggttgt gtagactttg tataca 176
<210> 445
<211> 69
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 445
atccaaagct ctgatgtaag aaactctaca cttgttcgag tttcggagaa aagaaacgat 60
gaggaagag 69
<210> 446
<211> 305
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 446
atacaattcc aacaaaacca caaagacgac tctcttcaga gagttttgag agggtgagag 60
agccgtgctc ggcgttgtta gaaagaaagc tgagaattgc aactgcttac aagagcaatg 120
tcgacaagct gatcaagagt ctcttggatt tgtgcttctg tacttcttaa gaggaaggtc 180
ccgcaagata ccatcttctc aaaagtccaa tcaatctacg cttttcaatt cgccacgtca 240
cagaatcctg accgttagat acaaacgcgc caactcgtca aactttgctt tctggtacgg 300
cggcg 305
<210> 447
<211> 134
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 447
gaaatgttaa taaataaacc taaaccaata gaaccgcagt ttttcctcct cgccgaaacg 60
aagaagattc tccttctctc cgtcagacaa atctacgaac aagcgagcct gagcttaaga 120
ccaaactcat agag 134
<210> 448
<211> 161
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 448
cgtaactaat ccctaaatca agagagaagt gagagacact gagactttgt agttgaccgg 60
atcattctca cttcgccggc cgacgttctt ccttccgccg tcggtatcta tatttacgat 120
ccacgatctc tcttgctgtt tctgtcttca tcgtgacgaa a 161
<210> 449
<211> 242
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 449
catctctttg tgcctctctt tactcatctc tttttccaca agagtcttga gttttataaa 60
aaagacaagc ttgaagcttt gtttgaatgg agttactgtt tgatctttgt ttgttctttt 120
gtctttaacc acttggccca ttctttgtct gtttctttca tcaaccacat aaacaaaaag 180
gaaacctcat ctgtaaacaa gtgtttatcc aaggataaag aaaaaaactg aaacttgtga 240
ac 242
<210> 450
<211> 25
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 450
gagaaaaagt gtgagtcaga gaata 25
<210> 451
<211> 28
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 451
acaaacacaa aatatagaaa aagaaata 28
<210> 452
<211> 102
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 452
agatccactc acacctcgtc tcctaatctg tacggttctt atttcgaaag ggtaaaaacc 60
aaaagcgacg caaagggcaa aatcggaaaa agtgttttat tt 102
<210> 453
<211> 249
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 453
gagagaggac tgggtctggt ctcttcgctg caacctatag ctgttgtttg ctcttcgacg 60
ggattctcac tactcttttg ccaaaaaaaa gagatcggag gttccgaagg tgaatgcagc 120
ttgcgatttc atagaaaaga agattcgttt gctggattag gcttatttgt gtatcatagc 180
tttgaggttt taactgagat ttattgatag tggaacttag gttttcgaga ggtgtgaaca 240
gttgggtat 249
<210> 454
<211> 56
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 454
aatcactcct caagcaaatc actcctcaca ccacagaaaa acaaataatt gaagaa 56
<210> 455
<211> 285
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 455
actctaaagc ctttttcccc tcttctcatt ctcgagctcc ggacttgtct tgaaaccgtg 60
aaggaatctg tatcttttgt atgttaccca ttttattgtc gttaagaatc aatttagagg 120
caaaacgccg agaggtttgc ccgggagagt gtttttacat cgatcagggt ttaagcagag 180
gttggtttgt catttcgcca gtttgcttct tcaaattcac tctacgatga agtgagaaca 240
acaaacaaaa catagataag atagagacct tggaactgtt ggaag 285
<210> 456
<211> 43
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 456
aagagacata aaacaagaat cttatcttct ggtcaagaga gag 43
<210> 457
<211> 188
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 457
ataaccttcc tctctatttt tacaatttat tttgttatta gaagtggtag tggagtgaaa 60
aaacaaatcc taagcagtcc taaccgatcc ccgaagctaa agattcttca ccttcccaaa 120
taaagcaaaa cctagatccg acattgaagg aaaaaccttt tagatccatc tctgaaaaaa 180
aaccaacc 188
<210> 458
<211> 112
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 458
aaccttactc ctcctcctct tcctctttct ctaatcggca aaattttctg ctcctgagaa 60
acaagtagag atactaaaga tggaatcttt gaactaaatt cgaaaccttt ta 112
<210> 459
<211> 45
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 459
acaacattct gaggagtgag taatctccgg caccgaggaa caaag 45
<210> 460
<211> 141
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 460
agagctttca aaaaattgtt gtacttccca acggatctct gacgtttggt ccagagccga 60
cgacgaccca caaccgaaac caagagctat ctctttttcc tcttctctct ctccttctct 120
acctgcgttc gtgcttaaac a 141
<210> 461
<211> 114
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 461
acatttcctt ttaaattaaa ttgcgttaat ttctcacttc cctttacttc ttcttcttca 60
ccatcacaaa catcttcgtc tcttgaagat tccaaaaaaa acaaatcaaa agct 114
<210> 462
<211> 119
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 462
aagtcgccgg gaaaagtaaa ataaaaagcc gtcacgtctc cgataaataa tagagtatcg 60
ttagataggt agcttcaacg taaggaatct aaattggttc agctcaaaaa acgaaaacg 119
<210> 463
<211> 51
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 463
atcatcatca cccacagcac agagacacac acaaaaaacc cataaaaaaa t 51
<210> 464
<211> 276
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 464
gagaacgaga gagcaagcca ttgcaggaaa tggcgattcc agtgacgaga atgatggttc 60
ctcacgcaat accatcgctt cgtctctcac atccaaaccc tagtcgcgtt gacttcctct 120
gtcgctgtgc tccatcagaa atccaaccac ttcggcctga actctcttta tctgtcggaa 180
ttcacgcaat ccctcatcca gataagtgtc gaaattatat aggtagagaa aggtggtgaa 240
gatgctttct ttgtaagtag ttatagaggt ggagtc 276
<210> 465
<211> 98
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 465
acgagcctta acgcgtagaa tcttcccgta ctttactttt ccggaggaat agaaaattgg 60
gggctagggt tcgcaattgt agttttcgag cgaagaag 98
<210> 466
<211> 127
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 466
tctcgtaata agagtgaaaa acaagcctta acctgtaaac gcttacgcta gttaaataca 60
caacaaagac cgattcgctt ttcactctct cgttcaagat ctagaattca atttgtgagg 120
tttggag 127
<210> 467
<211> 70
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 467
gagagtcgac aaggaaaagg caatgcaaga agaagcttaa atctctcttc tctgctcctg 60
aagtctgttc 70
<210> 468
<211> 79
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 468
gcgttggttc tcttcttcaa aacaagctct ctctgtccct ctctgtctct ctctttgggt 60
aatcggaaaa atcagaaaa 79
<210> 469
<211> 42
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 469
atacaaatca taactcaaag aaaaacaacc cctcaacggt cg 42
<210> 470
<211> 85
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 470
accaccacca ttttagggtt tcttcgtgcc attgatattt tgagaggcga aggaaacaat 60
acgattcaga gagagacgag tgaaa 85
<210> 471
<211> 20
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 471
ctaattcccc agaagaaaag 20
<210> 472
<211> 71
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 472
tgactgcgtc tttcttctct ctctatctgt aatttgattg gattttggat cgaaacctga 60
aaagagcgaa a 71
<210> 473
<211> 102
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 473
aattgaaaga aaaaaaaaaa cgagaagcgt tttctttctc tccaaaatcc attactcgcg 60
aactttcctc tgctaagtgt tcactagaaa gaggtggtga tt 102
<210> 474
<211> 483
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 474
tctagaaaca gcatccgttt ttataattta attttcttac aaaggtagga ccaacatttg 60
tgatctataa atcttcctac tacgttatat agagaccctt cgacataaca cttaactcgt 120
ttatatattt gttttacttg ttttgcacat acacacaaaa ataaaaaaga ctttatattt 180
atttactttt taatcacacg gattagctcc ggcgaagtat ggtcgtcgtc ttcatcttct 240
tcctccatca tcagattttt ccttaaatgg aagaaaccaa acgaaactcc gatcttctcc 300
gttctcgtgt tttcctctct ggcttttatt gctgggattg ggaatttctc accgctctct 360
tgctttttag ttgctgattc tttttccttc gactttctat ttccaatctt tcttcttctc 420
tttgtgtatt agattatttt tagttttatt tttctgtggt aaaataaaaa aagttcgccg 480
gag 483
<210> 475
<211> 593
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 475
Met Asp Thr Thr Ile Asp Gly Phe Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Phe Val Ala Thr Asp Asn Thr Asp Ser Ser Ile Val Tyr Leu
20 25 30
Ala Ala Glu Gln Val Leu Thr Gly Pro Asp Val Ser Ala Leu Gln Leu
35 40 45
Leu Ser Asn Ser Phe Glu Ser Val Phe Asp Ser Pro Asp Asp Phe Tyr
50 55 60
Ser Asp Ala Lys Leu Val Leu Ser Asp Gly Arg Glu Val Ser Phe His
65 70 75 80
Arg Cys Val Leu Ser Ala Arg Ser Ser Phe Phe Lys Ser Ala Leu Ala
85 90 95
Ala Ala Lys Lys Glu Lys Asp Ser Asn Asn Thr Ala Ala Val Lys Leu
100 105 110
Glu Leu Lys Glu Ile Ala Lys Asp Tyr Glu Val Gly Phe Asp Ser Val
115 120 125
Val Thr Val Leu Ala Tyr Val Tyr Ser Ser Arg Val Arg Pro Pro Pro
130 135 140
Lys Gly Val Ser Glu Cys Ala Asp Glu Asn Cys Cys His Val Ala Cys
145 150 155 160
Arg Pro Ala Val Asp Phe Met Leu Glu Val Leu Tyr Leu Ala Phe Ile
165 170 175
Phe Lys Ile Pro Glu Leu Ile Thr Leu Tyr Gln Arg His Leu Leu Asp
180 185 190
Val Val Asp Lys Val Val Ile Glu Asp Thr Leu Val Ile Leu Lys Leu
195 200 205
Ala Asn Ile Cys Gly Lys Ala Cys Met Lys Leu Leu Asp Arg Cys Lys
210 215 220
Glu Ile Ile Val Lys Ser Asn Val Asp Met Val Ser Leu Glu Lys Ser
225 230 235 240
Leu Pro Glu Glu Leu Val Lys Glu Ile Ile Asp Arg Arg Lys Glu Leu
245 250 255
Gly Leu Glu Val Pro Lys Val Lys Lys His Val Ser Asn Val His Lys
260 265 270
Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ile Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Lys Glu
275 280 285
Asp His Thr Asn Leu Asp Asp Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Val Ala
290 295 300
Tyr Cys Asn Val Lys Thr Ala Thr Asp Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ala
305 310 315 320
Asp Val Asn His Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Val Ala
325 330 335
Ala Met Arg Lys Glu Pro Gln Leu Ile Leu Ser Leu Leu Glu Lys Gly
340 345 350
Ala Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Glu Gly Arg Thr Ala Leu Met Ile
355 360 365
Ala Lys Gln Ala Thr Met Ala Val Glu Cys Asn Asn Ile Pro Glu Gln
370 375 380
Cys Lys His Ser Leu Lys Gly Arg Leu Cys Val Glu Ile Leu Glu Gln
385 390 395 400
Glu Asp Lys Arg Glu Gln Ile Pro Arg Asp Val Pro Pro Ser Phe Ala
405 410 415
Val Ala Ala Asp Glu Leu Lys Met Thr Leu Leu Asp Leu Glu Asn Arg
420 425 430
Val Ala Leu Ala Gln Arg Leu Phe Pro Thr Glu Ala Gln Ala Ala Met
435 440 445
Glu Ile Ala Glu Met Lys Gly Thr Cys Glu Phe Ile Val Thr Ser Leu
450 455 460
Glu Pro Asp Arg Leu Thr Gly Thr Lys Arg Thr Ser Pro Gly Val Lys
465 470 475 480
Ile Ala Pro Phe Arg Ile Leu Glu Glu His Gln Ser Arg Leu Lys Ala
485 490 495
Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser
500 505 510
Ala Val Leu Asp Gln Ile Met Asn Cys Glu Asp Leu Thr Gln Leu Ala
515 520 525
Cys Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Lys Arg Leu Gln Lys Lys Gln Arg
530 535 540
Tyr Met Glu Ile Gln Glu Thr Leu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asp Asn
545 550 555 560
Leu Glu Leu Gly Asn Ser Ser Leu Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser
565 570 575
Lys Ser Thr Gly Gly Lys Arg Ser Asn Arg Lys Leu Ser His Arg Arg
580 585 590
Arg
<210> 476
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 476
tctagaaaca gcatccgttt ttataattta attttcttac aaaggtagga ccaacatttg 60
tgatctataa atcttcctac tacgttatat agagaccctt cgacataaca cttaactcgt 120
ttatatattt gttttacttg ttttgcacat acacacaaaa ataaaaaaga ctttatattt 180
atttactttt taatcacacg gattagctcc ggcgaagtat ggtcgtcgtc ttcatcttct 240
tcctccatca tcagattttt ccttaaatgg aagaaaccaa acgaaactcc gatcttctcc 300
gttctcgtgt tttcctctct ggcttttatt gctgggattg ggaatttctc accgctctct 360
tgctttttag ttgctgattc tttttccttc gactttctat ttccaatctt tcttcttctc 420
tttgtgtatt agattatttt tagttttatt tttctgtggt aaaataaaaa aagttcgccg 480
gag 483
<210> 477
<211> 769
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 477
aagcttgcat gcctgcaggt caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat 60
atcaaagata cagtctcaga agaccagagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata 120
tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcga aaggacagta 180
gaaaaggaag atggcttcta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa 240
gatgcctcta ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggaa catcgtggaa 300
aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatgg tcaacatggt 360
ggagcacgac actctcgtct actccaagaa tatcaaagat acagtctcag aagaccagag 420
ggctattgag acttttcaac aaagggtaat atcgggaaac ctcctcggat tccattgccc 480
agctatctgt cacttcatcg aaaggacagt agaaaaggaa gatggcttct acaaatgcca 540
tcattgcgat aaaggaaagg ctatcgttca agatgcctct accgacagtg gtcccaaaga 600
tggaccccca cccacgagga acatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa 660
gcaagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc 720
ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagg 769
<210> 478
<211> 3071
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 478
cgacgactag tttacagaga atttggaccg tccgatgtaa agcgaaaata gatctaggtt 60
ttccacgtgt cccctatttt aatgaaacct tctgattcat gtagaagttt tactcaattt 120
aatatttttt agtatgtagt tttgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtttttatg gctccacacc 180
aacttttaaa atggtagaag catgttgcat gtgatcgagt aaaaagccaa taatgagatt 240
cagaaaaata aaaattactt atatagtttt ttagagaaaa aattgtattt tgtttaaagc 300
cttaatccgg ttgttgaaag agctgtgtca cgagttaaaa atattttctt ttcatttttt 360
aagtaattag tttataatgc aaaaatggtt tttatttatt tgtcttcgct tatagaactg 420
caaattgaga gagaaaaaaa tgaattagtg gtggtgacca aacattcagg aagctgtgat 480
tgatcatttg tttttgaggt gagtgtagtg gcaacgtatg acgttaacat atggcgtaca 540
taataattac atgaacttaa tcataataat catattgcat ttaattcata tatcatatcc 600
cattagttgg accacttgat ttgaggtcat gagaagaaca tttatgtttt ttttagtttg 660
aatcggagtg atcactaaaa actagatact gaaaattttc aaactaaaat catattaatc 720
ttcaaaaaat gtgaaatcta aaaaaaaaaa aaattttaac gcgttcattg tagccaagta 780
gccaagtatt gttaaagtag tagtaaaaga agtttagctt taagtgatat aatttgacac 840
aaatcctact tagatatgga taataggata tagcttcatg tatattttta tcgttgcttc 900
tgtaacccca aaatgtgttg atataagcat ttgaatattc gtatgtataa tgttttcttt 960
tcaccgtaaa acatattaca atgttagttt atattggatt ttgaatgtgt ttatgaacag 1020
tttttgtcga ctcaaaagtt aagatgagaa tatggaagaa agtaaagttt aaaagtcatg 1080
atgggaacaa ggaatggaac tcaaacattc taatactcaa caaacgcaat tatattatta 1140
ccatgactca tctttcaagt tccatcaaaa agattcgtgg aaaataatag acttacgttt 1200
caaatccatg tttctttctt tataacaaaa aaaatggatg tttcttgacg cgtgtcgaga 1260
gtactcacca ttactctgac ttcagtgagt ttggtcaagt ggtctttttt tttctcatgt 1320
caccaaaggt ccaaacccta gaaattagtt cgaactttcc atagaagaac tgaataaatg 1380
gtccaaaatt gttttaaaaa ggacctaagc cattagttca ttgaattcga gttaatgggt 1440
gaagattttt atgataacga aagtcggagt aattatgctt ttggtccgat agttttctaa 1500
tttgttttct ttccattttt tttttttcaa atactacata ctatataaga tagtggtttg 1560
tgttaatgtc atcgatgtgt taccatccgc attatattaa ttatttatcc caacataaag 1620
tcagaatctg taatttcttt gttataaaat acagtaaatg gttccgttta agctgttaga 1680
tgatttttga gtaaaaacta atgtaaaaaa aacaaaaaaa aaacaatgta gttcataata 1740
catgcatgtt ttaaagaagt ttcttgttta ctatcaactt gaatagtatt tcacgaagtc 1800
aaaattgttc attccgactt ttctatgtgg agaaaaaaaa ttctatcatt gtgcacaatt 1860
taacagaatg taatttcttg taaaagaaga ggaaacaatt cgctgttagt aaatgtgaag 1920
tatagaagtc taaaatgaga tacctcaact agcttgaatt aagaaaaaaa acaaaaactc 1980
tatcgacatg aaaaaggtcg caaatattta tcatttatca atgccaaagg agtatttggt 2040
tcacaaaata ctgaatcatt tatatagata tataattagc tctaaattct actataactt 2100
gcaaaataag tatactgact caattatata gcgtttaaaa atagacgatt tgtatgatga 2160
ggtccatata tatggagatg tgcatgcaac tatcgacatt ttcacacgtt gatatcgtct 2220
ttctccaatg gagacttgaa tttgtgtaaa ctatgaatac tcgtctctct aagacctttt 2280
ttcttcaacc atgccaacta tttaggtaag attttactgt ctttgattga tattaaatac 2340
ttagccgtgg cgttatcaat gaatgataat aaaaatgcgg ataaaagcca aaggtgttgg 2400
aaataaatcc aagaatgaag acgtagatgt cgatgggtat tttaagaact tgaatttgtc 2460
acgactcaca cgttaaaata tattatccga attgtttagt ctaaagacac acatatattg 2520
aaaaagaaaa ggtaaatgaa gctcattggt gcctaaatgt gaaatgaagc cgaaatgtgt 2580
taggtgaaca catttaaata tacaaaaaga aatataatag aaacaaaact aattaacaaa 2640
gtcgcaattt gtattgtata aaatatcttt ccgtctcccg tcatatttga aaaaaaaaaa 2700
attacaaatc tgttaatttt aaaactttct agaaaaacac aagtatataa ttttctcttt 2760
tcgtgcgtgt ttgttttaaa ataacattgt tttgattggc gactcaacat attttagcat 2820
ttacatattt ctgcatatat taaatgattt ataaactcaa ctatagatta aaatataatt 2880
tgacatctaa taattttaac aataatataa aatatgagat ttataaatta cgaatataaa 2940
tattcaaggg agagaaaaag tagaacataa ttcaaaagat aagacttttt agactttttt 3000
aacaatattt ttgatggata aaaattattc aaaagagaag aaagtaagaa gaaaagatgt 3060
ttctgagaat t 3071
<210> 479
<211> 3807
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 479
aagcttgcat gcctgcaggt caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat 60
atcaaagata cagtctcaga agaccagagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata 120
tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcga aaggacagta 180
gaaaaggaag atggcttcta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa 240
gatgcctcta ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggaa catcgtggaa 300
aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatgg tcaacatggt 360
ggagcacgac actctcgtct actccaagaa tatcaaagat acagtctcag aagaccagag 420
ggctattgag acttttcaac aaagggtaat atcgggaaac ctcctcggat tccattgccc 480
agctatctgt cacttcatcg aaaggacagt agaaaaggaa gatggcttct acaaatgcca 540
tcattgcgat aaaggaaagg ctatcgttca agatgcctct accgacagtg gtcccaaaga 600
tggaccccca cccacgagga acatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa 660
gcaagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc 720
ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagaggc cggtctagaa 780
acagcatccg ttatttaatt tcttacaaag gtaggaccaa catttgtgat ctataaatct 840
tcctactacg ttatatagag acccttcgac ataacactta actcgtttat atatttgttt 900
tacttgtttt gcacatacac acaaaaataa aaaagacttt atatttattt actttttaat 960
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atttttcctt aaatggaaga aaccaaacga aactccgatc ttctccgttc tcgtgttttc 1080
ctctctggct tttattgctg ggattgggaa tttctcaccg ctctcttgct ttttagttgc 1140
tgattctttt tccttcgact ttctatttcc aatctttctt cttctctttg tgtattagat 1200
tatttttagt tttatttttc tgtggtaaaa taaaaaaagt tcgccggagg gtaccttcga 1260
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agcactagtt tcgtcgctac cgataacacc gactcctcta ttgtttatct ggccgccgaa 1380
caagtactca ccggacctga tgtatctgct ctgcaattgc tctccaacag cttcgaatcc 1440
gtctttgact cgccggatga tttctacagc gacgctaagc ttgttctctc cgacggccgg 1500
gaagtttctt tccaccggtg cgttttgtca gcgagaagct ctttcttcaa gagcgcttta 1560
gccgccgcta agaaggagaa agactccaac aacaccgccg ccgtgaagct cgagcttaag 1620
gagattgcca aggattacga agtcggtttc gattcggttg tgactgtttt ggcttatgtt 1680
tacagcagca gagtgagacc gccgcctaaa ggagtttctg aatgcgcaga cgagaattgc 1740
tgccacgtgg cttgccggcc ggcggtggat ttcatgttgg aggttctcta tttggctttc 1800
atcttcaaga tccctgaatt aattactctc tatcagaggc acttattgga cgttgtagac 1860
aaagttgtta tagaggacac attggttata ctcaagcttg ctaatatatg tggtaaagct 1920
tgtatgaagc tattggatag atgtaaagag attattgtca agtctaatgt agatatggtt 1980
agtcttgaaa agtcattgcc ggaagagctt gttaaagaga taattgatag acgtaaagag 2040
cttggtttgg aggtacctaa agtaaagaaa catgtctcga atgtacataa ggcacttgac 2100
tcggatgata ttgagttagt caagttgctt ttgaaagagg atcacaccaa tctagatgat 2160
gcgtgtgctc ttcatttcgc tgttgcatat tgcaatgtga agaccgcaac agatctttta 2220
aaacttgatc ttgccgatgt caaccatagg aatccgaggg gatatacggt gcttcatgtt 2280
gctgcgatgc ggaaggagcc acaattgata ctatctctat tggaaaaagg tgcaagtgca 2340
tcagaagcaa ctttggaagg tagaaccgca ctcatgatcg caaaacaagc cactatggcg 2400
gttgaatgta ataatatccc ggagcaatgc aagcattctc tcaaaggccg actatgtgta 2460
gaaatactag agcaagaaga caaacgagaa caaattccta gagatgttcc tccctctttt 2520
gcagtggcgg ccgatgaatt gaagatgacg ctgctcgatc ttgaaaatag agttgcactt 2580
gctcaacgtc tttttccaac ggaagcacaa gctgcaatgg agatcgccga aatgaaggga 2640
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tcaccgggtg taaagatagc acctttcaga atcctagaag agcatcaaag tagactaaaa 2760
gcgctttcta aaaccgtgga actcgggaaa cgattcttcc cgcgctgttc ggcagtgctc 2820
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gagaaacgac tacaaaagaa gcaaaggtac atggaaatac aagagacact aaagaaggcc 2940
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tcgaaatcaa ccggtggaaa gaggtctaac cgtaaactct ctcatcgtcg tcggtaccca 3060
gctttcttgt acaaagtggt gatatcaatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 3120
gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 3180
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ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 3300
ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 3360
ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 3420
gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 3480
aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 3540
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atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 3660
ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 3720
cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 3780
ctcggcatgg acgagctgta caagtaa 3807
<210> 480
<211> 6091
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 480
cgacgactag tttacagaga atttggaccg tccgatgtaa agcgaaaata gatctaggtt 60
ttccacgtgt cccctatttt aatgaaacct tctgattcat gtagaagttt tactcaattt 120
aatatttttt agtatgtagt tttgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtttttatg gctccacacc 180
aacttttaaa atggtagaag catgttgcat gtgatcgagt aaaaagccaa taatgagatt 240
cagaaaaata aaaattactt atatagtttt ttagagaaaa aattgtattt tgtttaaagc 300
cttaatccgg ttgttgaaag agctgtgtca cgagttaaaa atattttctt ttcatttttt 360
aagtaattag tttataatgc aaaaatggtt tttatttatt tgtcttcgct tatagaactg 420
caaattgaga gagaaaaaaa tgaattagtg gtggtgacca aacattcagg aagctgtgat 480
tgatcatttg tttttgaggt gagtgtagtg gcaacgtatg acgttaacat atggcgtaca 540
taataattac atgaacttaa tcataataat catattgcat ttaattcata tatcatatcc 600
cattagttgg accacttgat ttgaggtcat gagaagaaca tttatgtttt ttttagtttg 660
aatcggagtg atcactaaaa actagatact gaaaattttc aaactaaaat catattaatc 720
ttcaaaaaat gtgaaatcta aaaaaaaaaa aaattttaac gcgttcattg tagccaagta 780
gccaagtatt gttaaagtag tagtaaaaga agtttagctt taagtgatat aatttgacac 840
aaatcctact tagatatgga taataggata tagcttcatg tatattttta tcgttgcttc 900
tgtaacccca aaatgtgttg atataagcat ttgaatattc gtatgtataa tgttttcttt 960
tcaccgtaaa acatattaca atgttagttt atattggatt ttgaatgtgt ttatgaacag 1020
tttttgtcga ctcaaaagtt aagatgagaa tatggaagaa agtaaagttt aaaagtcatg 1080
atgggaacaa ggaatggaac tcaaacattc taatactcaa caaacgcaat tatattatta 1140
ccatgactca tctttcaagt tccatcaaaa agattcgtgg aaaataatag acttacgttt 1200
caaatccatg tttctttctt tataacaaaa aaaatggatg tttcttgacg cgtgtcgaga 1260
gtactcacca ttactctgac ttcagtgagt ttggtcaagt ggtctttttt tttctcatgt 1320
caccaaaggt ccaaacccta gaaattagtt cgaactttcc atagaagaac tgaataaatg 1380
gtccaaaatt gttttaaaaa ggacctaagc cattagttca ttgaattcga gttaatgggt 1440
gaagattttt atgataacga aagtcggagt aattatgctt ttggtccgat agttttctaa 1500
tttgttttct ttccattttt tttttttcaa atactacata ctatataaga tagtggtttg 1560
tgttaatgtc atcgatgtgt taccatccgc attatattaa ttatttatcc caacataaag 1620
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tgatttttga gtaaaaacta atgtaaaaaa aacaaaaaaa aaacaatgta gttcataata 1740
catgcatgtt ttaaagaagt ttcttgttta ctatcaactt gaatagtatt tcacgaagtc 1800
aaaattgttc attccgactt ttctatgtgg agaaaaaaaa ttctatcatt gtgcacaatt 1860
taacagaatg taatttcttg taaaagaaga ggaaacaatt cgctgttagt aaatgtgaag 1920
tatagaagtc taaaatgaga tacctcaact agcttgaatt aagaaaaaaa acaaaaactc 1980
tatcgacatg aaaaaggtcg caaatattta tcatttatca atgccaaagg agtatttggt 2040
tcacaaaata ctgaatcatt tatatagata tataattagc tctaaattct actataactt 2100
gcaaaataag tatactgact caattatata gcgtttaaaa atagacgatt tgtatgatga 2160
ggtccatata tatggagatg tgcatgcaac tatcgacatt ttcacacgtt gatatcgtct 2220
ttctccaatg gagacttgaa tttgtgtaaa ctatgaatac tcgtctctct aagacctttt 2280
ttcttcaacc atgccaacta tttaggtaag attttactgt ctttgattga tattaaatac 2340
ttagccgtgg cgttatcaat gaatgataat aaaaatgcgg ataaaagcca aaggtgttgg 2400
aaataaatcc aagaatgaag acgtagatgt cgatgggtat tttaagaact tgaatttgtc 2460
acgactcaca cgttaaaata tattatccga attgtttagt ctaaagacac acatatattg 2520
aaaaagaaaa ggtaaatgaa gctcattggt gcctaaatgt gaaatgaagc cgaaatgtgt 2580
taggtgaaca catttaaata tacaaaaaga aatataatag aaacaaaact aattaacaaa 2640
gtcgcaattt gtattgtata aaatatcttt ccgtctcccg tcatatttga aaaaaaaaaa 2700
attacaaatc tgttaatttt aaaactttct agaaaaacac aagtatataa ttttctcttt 2760
tcgtgcgtgt ttgttttaaa ataacattgt tttgattggc gactcaacat attttagcat 2820
ttacatattt ctgcatatat taaatgattt ataaactcaa ctatagatta aaatataatt 2880
tgacatctaa taattttaac aataatataa aatatgagat ttataaatta cgaatataaa 2940
tattcaaggg agagaaaaag tagaacataa ttcaaaagat aagacttttt agactttttt 3000
aacaatattt ttgatggata aaaattattc aaaagagaag aaagtaagaa gaaaagatgt 3060
ttctgagaat ttctagggcg cgccttctta caaaggtagg accaacattt gtgatctata 3120
aatcttccta ctacgttata tagagaccct tcgacataac acttaactcg tttatatatt 3180
tgttttactt gttttgcaca tacacacaaa aataaaaaag actttatatt tatttacttt 3240
ttaatcacac ggattagctc cggcgaagta tggtcgtcgt cttcatcttc ttcctccatc 3300
atcagatttt tccttaaatg gaagaaacca aacgaaactc cgatcttctc cgttctcgtg 3360
ttttcctctc tggcttttat tgctgggatt gggaatttct caccgctctc ttgcttttta 3420
gttgctgatt ctttttcctt cgactttcta tttccaatct ttcttcttct ctttgtgtat 3480
tagattattt ttagttttat ttttctgtgg taaaataaaa aaagttcgcc ggagggtacc 3540
ttcgacgaca agaccgacca tggacaccac cattgatgga ttcgccgatt cttatgaaat 3600
cagcagcact agtttcgtcg ctaccgataa caccgactcc tctattgttt atctggccgc 3660
cgaacaagta ctcaccggac ctgatgtatc tgctctgcaa ttgctctcca acagcttcga 3720
atccgtcttt gactcgccgg atgatttcta cagcgacgct aagcttgttc tctccgacgg 3780
ccgggaagtt tctttccacc ggtgcgtttt gtcagcgaga agctctttct tcaagagcgc 3840
tttagccgcc gctaagaagg agaaagactc caacaacacc gccgccgtga agctcgagct 3900
taaggagatt gccaaggatt acgaagtcgg tttcgattcg gttgtgactg ttttggctta 3960
tgtttacagc agcagagtga gaccgccgcc taaaggagtt tctgaatgcg cagacgagaa 4020
ttgctgccac gtggcttgcc ggccggcggt ggatttcatg ttggaggttc tctatttggc 4080
tttcatcttc aagatccctg aattaattac tctctatcag aggcacttat tggacgttgt 4140
agacaaagtt gttatagagg acacattggt tatactcaag cttgctaata tatgtggtaa 4200
agcttgtatg aagctattgg atagatgtaa agagattatt gtcaagtcta atgtagatat 4260
ggttagtctt gaaaagtcat tgccggaaga gcttgttaaa gagataattg atagacgtaa 4320
agagcttggt ttggaggtac ctaaagtaaa gaaacatgtc tcgaatgtac ataaggcact 4380
tgactcggat gatattgagt tagtcaagtt gcttttgaaa gaggatcaca ccaatctaga 4440
tgatgcgtgt gctcttcatt tcgctgttgc atattgcaat gtgaagaccg caacagatct 4500
tttaaaactt gatcttgccg atgtcaacca taggaatccg aggggatata cggtgcttca 4560
tgttgctgcg atgcggaagg agccacaatt gatactatct ctattggaaa aaggtgcaag 4620
tgcatcagaa gcaactttgg aaggtagaac cgcactcatg atcgcaaaac aagccactat 4680
ggcggttgaa tgtaataata tcccggagca atgcaagcat tctctcaaag gccgactatg 4740
tgtagaaata ctagagcaag aagacaaacg agaacaaatt cctagagatg ttcctccctc 4800
ttttgcagtg gcggccgatg aattgaagat gacgctgctc gatcttgaaa atagagttgc 4860
acttgctcaa cgtctttttc caacggaagc acaagctgca atggagatcg ccgaaatgaa 4920
gggaacatgt gagttcatag tgactagcct cgagcctgac cgtctcactg gtacgaagag 4980
aacatcaccg ggtgtaaaga tagcaccttt cagaatccta gaagagcatc aaagtagact 5040
aaaagcgctt tctaaaaccg tggaactcgg gaaacgattc ttcccgcgct gttcggcagt 5100
gctcgaccag attatgaact gtgaggactt gactcaactg gcttgcggag aagacgacac 5160
tgctgagaaa cgactacaaa agaagcaaag gtacatggaa atacaagaga cactaaagaa 5220
ggcctttagt gaggacaatt tggaattagg aaattcgtcc ctgacagatt cgacttcttc 5280
cacatcgaaa tcaaccggtg gaaagaggtc taaccgtaaa ctctctcatc gtcgtcggta 5340
cccagctttc ttgtacaaag tggtgatatc aatggtgagc aagggcgagg agctgttcac 5400
cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt 5460
gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac 5520
caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca 5580
gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc 5640
cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg 5700
cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga 5760
cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa 5820
cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca 5880
caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg 5940
cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa 6000
agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat 6060
cactctcggc atggacgagc tgtacaagta a 6091
<210> 481
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> n 为 a、 c、 g，或 u
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> n 为 a、 c、 g，或 u
<400> 481
vvnnvrvrnn vbvad 15
<210> 482
<211> 111
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 482
atggaagaaa ccaaacgaaa ctccgatctt ctccgttctc gtgttttcct ctctggcttt 60
tattgctggg attgggaatt tctcaccgct ctcttgcttt ttagttgctg a 111
<210> 483
<211> 80
<212> DNA
<213> 菜豆（Phaseolus vulgaris）
<400> 483
atggattctg atcgtcccag aaactctacc ttgtttcact ctcgcttctt tctcttcggt 60
ttctattgct gggactggga 80
<210> 484
<211> 80
<212> DNA
<213> 大豆（Glycine max）
<400> 484
atggcttcta aaacccctac cttattccac tctcgtttct tcctcttcgg cttctattgc 60
tgggactggg aatttctcac 80
<210> 485
<211> 123
<212> DNA
<213> 雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）
<400> 485
atggaaactg atacgatcaa accctgcgat aacgtcgttc attctcgatt cttccgttct 60
ggattttatt gctggggttg ggaattcttg actgctctgc ttctctttag ttgttctgcc 120
taa 123
<210> 486
<211> 135
<212> DNA
<213> 本塞姆氏烟草（Nicotiana benthamiana）
<400> 486
atggaagaaa ctaagatcat aatcaatcgc cccaaaaaca accttgttca ttctatggtt 60
tttctattcg gtttctatgt ttgggattgg gaattcctga ctgccctttt gcttttcagt 120
tattgcttct tctaa 135
<210> 487
<211> 171
<212> DNA
<213> 鹰嘴豆（Cicer arietinum）
<400> 487
atggatttta attgtaacaa aaataaacct tactcttctt cttcttcttc ttcttcttct 60
tcttcttatt tttttttttc ttcttttcat tttcgctttt tcctctttgg tttttattgc 120
tgggattggg aattcttaac tgctcttctc cttttcagtt ttttttctta a 171
<210> 488
<211> 135
<212> DNA
<213> 椰枣（Phoenix dactylifera）
<400> 488
atggaaggaa aggggggcga gggattcgga atcggagcaa gaggcgatgg gtgctgccgc 60
tgggtgatca tcagcgggtt ctactgctgg ggctgggagt tcttgactgc tctcctgctc 120
ttctcgtgcc gctga 135
<210> 489
<211> 147
<212> DNA
<213> 小果野芭蕉（Musa acuminata subsp malaccensis）
<400> 489
atggaagaag agagaccgat aggtgttgca gggaggagcg acgttgatgg cggcctcggt 60
ctgggttgct cccacagggt gatcatcacc ggtttctact gctggggttg ggagttcttg 120
accgctctcc tcgtcttcgc gttttga 147
<210> 490
<211> 117
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa）
<400> 490
atgggagtag aggcgggcgg cggctgcggt gggagggcgg tagtcaccgg attctacgtc 60
tggggctggg agttcctcac cgccctcctg ctcttctcgg ccaccacctc ctactag 117
<210> 491
<211> 36
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 491
Met Glu Glu Thr Lys Arg Asn Ser Asp Leu Leu Arg Ser Arg Val Phe
1 5 10 15
Leu Ser Gly Phe Tyr Cys Trp Asp Trp Glu Phe Leu Thr Ala Leu Leu
20 25 30
Leu Phe Ser Cys
35
<210> 492
<211> 39
<212> PRT
<213> 菜豆
<400> 492
Met Asp Ser Asp Arg Pro Arg Asn Ser Thr Leu Phe His Ser Arg Phe
1 5 10 15
Phe Leu Phe Gly Phe Tyr Cys Trp Asp Trp Glu Phe Leu Thr Ala Leu
20 25 30
Leu Leu Phe Ser Ser Ser Ser
35
<210> 493
<211> 36
<212> PRT
<213> 大豆
<400> 493
Met Ala Ser Lys Thr Pro Thr Leu Phe His Ser Arg Phe Phe Leu Phe
1 5 10 15
Gly Phe Tyr Cys Trp Asp Trp Glu Phe Leu Thr Ala Leu Leu Leu Phe
20 25 30
Ser Ser Ser Ser
35
<210> 494
<211> 40
<212> PRT
<213> 雷蒙德氏棉
<400> 494
Met Glu Thr Asp Thr Ile Lys Pro Cys Asp Asn Val Val His Ser Arg
1 5 10 15
Phe Phe Arg Ser Gly Phe Tyr Cys Trp Gly Trp Glu Phe Leu Thr Ala
20 25 30
Leu Leu Leu Phe Ser Cys Ser Ala
35 40
<210> 495
<211> 44
<212> PRT
<213> 本塞姆氏烟草
<400> 495
Met Glu Glu Thr Lys Ile Ile Ile Asn Arg Pro Lys Asn Asn Leu Val
1 5 10 15
His Ser Met Val Phe Leu Phe Gly Phe Tyr Val Trp Asp Trp Glu Phe
20 25 30
Leu Thr Ala Leu Leu Leu Phe Ser Tyr Cys Phe Phe
35 40
<210> 496
<211> 56
<212> PRT
<213> 鹰嘴豆
<400> 496
Met Asp Phe Asn Cys Asn Lys Asn Lys Pro Tyr Ser Ser Ser Ser Ser
1 5 10 15
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Phe Phe Phe Ser Ser Phe His Phe Arg
20 25 30
Phe Phe Leu Phe Gly Phe Tyr Cys Trp Asp Trp Glu Phe Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Leu Leu Phe Ser Phe Phe Ser
50 55
<210> 497
<211> 44
<212> PRT
<213> 椰枣
<400> 497
Met Glu Gly Lys Gly Gly Glu Gly Phe Gly Ile Gly Ala Arg Gly Asp
1 5 10 15
Gly Cys Cys Arg Trp Val Ile Ile Ser Gly Phe Tyr Cys Trp Gly Trp
20 25 30
Glu Phe Leu Thr Ala Leu Leu Leu Phe Ser Cys Arg
35 40
<210> 498
<211> 48
<212> PRT
<213> 小果野芭蕉
<400> 498
Met Glu Glu Glu Arg Pro Ile Gly Val Ala Gly Arg Ser Asp Val Asp
1 5 10 15
Gly Gly Leu Gly Leu Gly Cys Ser His Arg Val Ile Ile Thr Gly Phe
20 25 30
Tyr Cys Trp Gly Trp Glu Phe Leu Thr Ala Leu Leu Val Phe Ala Phe
35 40 45
<210> 499
<211> 38
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 499
Met Gly Val Glu Ala Gly Gly Gly Cys Gly Gly Arg Ala Val Val Thr
1 5 10 15
Gly Phe Tyr Val Trp Gly Trp Glu Phe Leu Thr Ala Leu Leu Leu Phe
20 25 30
Ser Ala Thr Thr Ser Tyr
35

Claims (34)

1.一种DNA构建体，其包含异源启动子，所述异源启动子可操作地连接到编码RNA转录物的DNA多核苷酸，所述RNA转录物包含位于插入位点的5'端的5'调节序列，其中所述5'调节序列包含R基序序列。
2.根据权利要求1所述的DNA构建体，其中所述的5’调节序列缺乏TBF1 uORF序列。
3.根据前述任一权利要求所述的DNA构建体，其中所述5'调节序列包含至少两个R基序序列。
4.根据前述任一权利要求所述的DNA构建体，其中所述5'调节序列包含5至25个R基序序列。
5.根据前述任一权利要求所述的DNA构建体，其中所述R基序序列被0个核苷酸分开。
6.根据前述任一权利要求所述的DNA构建体，其中所述R基序包括SEQ ID NO：113-293的任一序列、包含从1G：1A至1G：14A的任何比例的G和A核苷酸的、15个核苷酸长的多核苷酸，或其变体中的任意一个。
7.根据前述任一权利要求所述的DNA构建体，其中所述的5'调节序列还包含编码SEQID NO：1-38的任何一种uORF多肽的uORF多核苷酸,或其变体。
8.根据前述任一权利要求所述的DNA构建体，其中所述的5'调节序列包含SEQ ID NO：39-76的任何一种多核苷酸或其变体。
9.根据前述任一权利要求所述的DNA构建体，其中所述的5'调节序列包含SEQ ID NO：77-112、SEQ ID NO:294-474的任何一种多核苷酸，或其变体。
10.一种DNA构建体，其包含异源启动子，所述异源启动子可操作地连接到编码RNA转录物的DNA多核苷酸，所述RNA转录物包含位于插入位点的5'端的5'调节序列，其中所述5'调节序列包含编码SEQ ID NO：1-38的任何uORF多肽的uORF多核苷酸，或其变体。
11.根据权利要求10所述的DNA构建体，其中所述的5'调节序列包含SEQ ID NO：39-76的任何一种多核苷酸，或其变体。
12.根据权利要求10或11所述的DNA构建体，其中所述的5'调节序列包含SEQ ID NO：77-112、SEQ ID NO:294-474的任何一种多核苷酸，或其变体。
13.根据前述任一权利要求所述的DNA构建体，其中所述插入位点包含编码异源多肽的异源编码序列。
14.根据前述任一权利要求所述的DNA构建体，其中前述异源多肽包含植物病原体抗性多肽。
15.根据权利要求13所述的DNA构建体，其中所述植物病原体抗性多肽选自snc-1和NPR1组成的组中。
16.根据前述任一权利要求所述的DNA构建体，其中所述的异源启动子包括植物启动子。
17.根据前述任一权利要求所述的DNA构建体，其中所述的异源启动子包括可被植物病原体或化学诱导剂诱导的植物启动子。
18.一种包含权利要求1-17中任一项所述的DNA构建体的载体。
19.根据权利要求18所述的载体，其中所述载体包含质粒。
20.一种包含权利要求1-17中任一项所述的DNA构建体或权利要求18-19中任一项所述的载体的细胞。
21.根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞为植物细胞。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞选自由玉米植物细胞、豆类植物细胞、水稻植物细胞、大豆植物细胞、棉花植物细胞、烟草植物细胞、椰枣细胞、小麦细胞、番茄细胞、香蕉植物细胞、马铃薯植物细胞、胡椒植物细胞、苔藓植物细胞、欧芹植物细胞、柑橘植物细胞、苹果植物细胞、草莓植物细胞、油菜籽植物细胞、卷心菜植物细胞、木薯植物细胞，和咖啡植物细胞所组成的组。
23.一种植物，其包含权利要求1-22的所述的DNA构建体、载体，或细胞中的任何一种。
24.根据权利要求23的植物，其中所述植物选自由玉米植物、豆类植物、水稻植物、大豆植物、棉花植物、烟草植物、枣椰植物、小麦植物、番茄植物、香蕉植物、马铃薯植物、胡椒植物、苔藓植物、欧芹植物、柑橘植物、苹果植物、草莓植物、油菜籽植物、卷心菜植物、木薯植物，和咖啡植物所组成的组。
25.一种控制异源多肽在细胞中表达的方法，包括将权利要求13-17中任一项所述的构建体或权利要求18-19中所述的载体引入细胞中。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞为植物细胞。
27.根据权利要求26的方法，其中所述细胞选自由玉米植物细胞、豆类植物细胞、水稻植物细胞、大豆植物细胞、棉花植物细胞、烟草植物细胞、椰枣细胞、小麦细胞、番茄细胞、香蕉植物细胞、马铃薯植物细胞、胡椒植物细胞、苔藓植物细胞、欧芹植物细胞、柑橘植物细胞、苹果植物细胞、草莓植物细胞、油菜籽植物细胞、卷心菜植物细胞、木薯植物细胞，和咖啡植物细胞所组成的组。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其进一步包括从所述细胞纯化所述异源多肽。
29.根据权利要求28所述的方法，其进一步包括将所述异源多肽配制为用于施用于对象的治疗剂。
30.一种DNA构建体，其包含可操作地连接到编码RNA转录物的DNA多核苷酸的异源启动子，所述RNA转录物包含5'调节序列，所述5'调节序列位于编码包含SEQ ID NO：475的AtNPR多肽的异源编码序列的5'端上，其中所述5'调节序列包含SEQ ID NO：476(uORFsTBF1)。
31.根据权利要求30所述的DNA构建体，其中所述异源启动子包含SEQ ID NO：477(35S启动子)或SEQ ID NO：478(TBF1p)。
32.根据权利要求30-32中任一项所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体包含SEQ IDNO：479(35S:uORFsTBF1-AtNPR1)或SEQ ID NO：480(TBF1p:uORFsTBF1-AtNPR1)。
33.一种植物，其包含权利要求30-32中任一项所述的DNA构建体。
34.根据权利要求34所述的植物，其中所述植物选自由玉米植物、豆类植物、水稻植物、大豆植物、棉花植物、烟草植物、枣椰植物、小麦植物、番茄植物、香蕉植物、马铃薯植物、胡椒植物、苔藓植物、欧芹植物、柑橘植物、苹果植物、草莓植物、油菜籽植物、卷心菜植物、木薯植物，和咖啡植物所组成的组。
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