BR112019015848A2 - Constructo de dna, vetor, célula, planta, e, método de controle da expressão de um polipeptídeo heterólogo em uma célula - Google Patents

Abstract

a invenção refere-se, em geral, às composições (incluindo constructos, vetores, e células) e aos métodos de uso de tais composições para controle de expressão gênica. mais especificamente, a invenção refere-se ao uso de sequências de motivo-r e/ou de sequências uorf para controlar expressão gênica.

Description

CONSTRUCTO DE DNA, VETOR, CÉLULA, PLANTA, E, MÉTODO DE CONTROLE DA EXPRESSÃO DE UM POLIPEPTÍDEO HETERÓLOGO EM UMA CÉLULA

REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS [001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade ao

Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos de número 62/453.807, depositado em 2 de Fevereiro de 2017, cujo conteúdo é aqui incorporado em sua totalidade como referência.

DECLARAÇÃO RELACIONADA À PESQUISA FEDERALMENTE PATROCINADA [002] Esta invenção foi realizada com o suporte do governo sob o número de subsídio 5R01 GM069594-11 concedido pelo “National Institute of Health”. O governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção.

LISTA DE SEQUÊNCIAS [003] Este pedido está sendo eletronicamente depositado via EFSWeb e inclui uma Lista de Sequências eletronicamente submetida no formato .txt. O arquivo .txt contém uma lista de sequências intitulada “2018-0202_5667-00424_ST25.txt” criada em 2 de Fevereiro de 2018 e é de tamanho de 155.230 bytes. A Lista de Sequências contida neste arquivo .txt é parte do relatório descritivo e é por meio deste aqui incorporada em sua totalidade como referência.

INTRODUÇÃO [004] O controle de doença de planta tem sido um esforço para a humanidade desde o advento da agricultura. O conhecimento obtido mediante estudos de mecanismos imunes das plantas tem resultado no desenvolvimento de estratégias para modificação de culturas agrícolas resistentes mediante a expressão ectópica dos próprios genes de defesa das plantas, como o regulador imune mestre NPR1. Entretanto, a resistência intensificada está,

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2/130 com frequência, associada com uma significativa penalidade de valor adaptativo tomando o produto indesejável para aplicação agrícola.

[005] Para atender à demanda de produção de alimentos causada pela explosão da população mundial e ao mesmo tempo o desejo de limitar a poluição de pesticidas no meio ambiente, novas estratégias precisam ser desenvolvidas para controlar as doenças de culturas agrícolas. Como uma alternativa aos tradicionais métodos de cultivo e de controle químico, os estudos dos mecanismos imunes das plantas têm tornado possível a modificação da resistência mediante a expressão ectópica dos próprios genes concedentes de resistência das plantas. A primeira linha de defesa ativa em plantas envolve o reconhecimento de padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs, Microbial-Associated Molecular Patterns) ou de padrões moleculares associados a danos (DAMPs, Damage-Associated Molecular Patterns) pelos receptores reconhecedores de padrões (PRRs, PatternRecognizing Receptors) do hospedeiro e é conhecida como imunidade disparada por padrões (PTI, Pattern-Triggered Immunity). Tem sido mostrado que a expressão ectópica de PRRs para MAMPs, o sinal DAMP, eATP, e a liberação in vivo das moléculas DAMP, oligogalacturonídeos, intensificam a resistência em plantas transgênicas. Além da resistência basal mediada por PRR, os genomas das plantas também codificam centenas de receptores imunes intracelulares de ligação a nucleotídeos ricos em repetição de leucina (NB-LRR, Nucleotide-Binding and Leucine-Rich Repeat) (também conhecidos como “proteínas-R”) para detectar a presença de efetores específicos para patógenos distribuídos dentro das células das plantas. Genes R individuais ou empilhados têm sido transformados em plantas para conferir imunidade disparada por efetores (ETI, Effector-Triggered Immunity). Além dos genes PRR e R, NPR1 é outro gene favorito usado na modificação de resistência da planta porque diferentemente das proteínas-R que são ativadas por efetores específicos para patógenos, NPR1 é um regulador positivo de

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3/130 resistência de amplo espectro induzida por um sinal imune geral de planta, ácido salicrlico. Enquanto que as proteínas-R apenas funcionam dentro da mesma família de plantas, a superexpressão do Arabidopsis NPR1 (A/NPR1) podería intensificar a resistência em diversas famílias de plantas como arroz, trigo, tomateiro e algodão contra uma variedade de patógenos.

[006] Entretanto, um grande desafio na modificação da resistência às doenças é superar as perdas de valor adaptativo associadas. Na ausência de células imunes especializadas, a indução imune em plantas envolve a mudança das atividades relacionadas ao crescimento para as atividades relacionadas à defesa. As plantas normalmente evitam a autoimunidade pelo controle rigoroso de transcrição, exportação nuclear de mRNA e degradação ativa de proteínas de defesa. O controle transcricional tem sido usado atualmente predominantemente para modificar a resistência às doenças. Permanece, por conseguinte, uma necessidade na técnica de novas composições e de novos métodos que permitem a expressão estringente, induzida por patógenos, de proteínas de defesa, de modo que possam ser minimizadas as perdas de valor adaptativo associadas de expressão de proteínas de defesa.

SUMÁRIO [007] Em um aspecto, são providos constructos de DNA. Os constructos de DNA podem incluir um promotor heterólogo funcionalmente ligado a um polinucleotídeo de DNA codificante de um transcrito de RNA incluindo uma sequência regulatória 5’ localizada 5’ a um sítio de inserção, em que a sequência regulatória 5’ inclui uma sequência de motivo-R. Opcionalmente, os constructos de DNA podem incluir, adicionalmente, um polinucleotídeo uORF codificante de qualquer um dos polipeptídeos uORF de SEQ ID NOs: 1-38 na Tabela 1, ou uma variante dos mesmos. Altemativamente, os constructos de DNA podem incluir um promotor heterólogo funcionalmente ligado a um polinucleotídeo de DNA codificante

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4/130 de um transcrito de RNA incluindo uma sequência regulatória 5’ localizada 5’ a um sítio de inserção, em que a sequência regulatória 5’ inclui um polinucleotídeo uOFR codificante de qualquer um dos polipeptídeos uORF de SEQ ID NOs: 1-38 na Tabela 1 ou uma variante dos mesmos.

[008] Em outro aspecto, são providos vetores, células, e plantas incluindo qualquer um dos constructos aqui descritos.

[009] Em uma aspecto adicional, são providos métodos para controle da expressão de um polipeptídeo heterólogo em uma células. Os métodos podem incluir a introdução de qualquer um dos constructos ou vetores aqui descritos para dentro da célula. Preferivelmente, os constructos e vetores incluem uma sequência codificante heteróloga que codifica um polipeptídeo heterólogo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0010] Figuras 1A-1E mostram atividades traducionais durante PTI induzida por elfl8. Figura IA, Esquema do repórter 35S:uORFstbfi-LUC. O repórter é uma fusão entre o TBF1 éxonl (uORFl/2 e a sequência dos 73 aminoácidos N-terminais) e o gene de luciferase de vagalume (LUC) expressado constitutivamente pelo promotor 35S de CaMV. R, motivo-R. Figura 1B, Tradução do repórter 35S:uORFstbfi-LUC em tipo selvagem (WT, Wild Type) e efr-1 em resposta ao tratamento com elfl8. Média ± e.p.m. (erro padrão da média) (n = 9) após normalização em relação àquela no tempo 0. Figuras 1C, 1D, Perfilamento polissomal de atividade traducional global (Figura 1C) e de atividade traducional de TBF1 mRNA calculadas como razões de mRNA polissomal/mRNA total (Figura ID) em WT e efr-1 em resposta ao tratamento com elfl8. Letras minúsculas indicam as frações em perfilamento polissomal. Figura 1E, Esquema da construção de bibliotecas de RS e de RF usando plantas uORFstbfi-LUC/WT. RS, RNA-seq; RF, ribosome footprint (footprint ribossomal). RNase I e Alkaline (Alcalino) são dois métodos de geração de fragmentos de RNA.

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5/130 [0011] Figuras 2A-2J mostram análises globais de transcriptoma (RSfc), de translatoma (RFfc) e de eficiência traducional (Translational Efficiency) (TEfc) após o tratamento com elfl8 e a identificação de novos reguladores de PTI com base em TEfc. Figura 2A, Histograma de logjRSfc e logzRFfc. μ e δ são média e desvio padrão, respectivamente, de logzRSfc e logiRFfc. Figura 2B, Coeficiente de correlação de Pearson r foi mostrado entre RS e RF como logjRPKM para genes expressados com RPKM em CDS > 1 dentro de quer Mock (Simulado) quer elfl8. Figuras 2C, 2D, Relações entre RSfc e RFfc (Figura 2C) e entre RSfc e TEfc (Figura 2D), dn, down (diminuído(a), reprimido(a)); nc, no change (sem alteração). Figura 2E, diagramas de Venn mostrando sobreposições entre RSfc e TEfc. Figura 2F, alterações em RS e TE em conhecidos ou homólogos de componentes conhecidos das vias de sinalização de PTI mediada por Pep de padrão molecular associado ao dano e ao etileno. A via foi modificada a partir de Zipfel¹⁷. Em caixas retangulares: Preto, RS-alterado; Vermelho, TE-up (TE aumentada); Verde, TE-down (TE diminuída). Figura 2G, Resistência induzida por elfl8 ao Psm ES4326. Média ± e.p.m. de 12 réplicas biológicas de 2 experimentos. Figura 2H, Esquema de sistema de LUC (luciferase) dupla. Teste, sequência líder 5’ (incluindo UTR) ou 3’ UTR do gene testado; LUC, luciferase de vagalume; RLUC, luciferase de Renilla, Ter, terminador. Figura 21, Ensaio Dual-LUC de EIN4 UTRs em TE após tratamento com elfl8 em N. benthamiana. EV, empty vector (vetor vazio). Média ± e.p.m. (n = 4). Figura 2J, alterações em EIN4 TE após tratamento com elfl8 calculadas como razões de mRNA polissomal/mRNA total. Média ± d.p. (desvio padrão) de 2 experimentos com 3 réplicas técnicas. Consulte as Figuras 10A-10C.

[0012] Figuras 3A-3G mostram os efeitos de motivo-R sobre as alterações em TE durante a indução de PTI. Figura 3A, motivo-R consenso (SEQ ID NO: 481). Figura 3B, Confirmação de indução de TE de genes contendo o motivo-R em resposta a elfl8. Sequências líderes 5’ de 20 genes

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6/130 endógenos foram inseridas como sequências de “Teste”. Figuras 3C, 3D, Efeitos das mutações de deleção de motivo-R (AR) sobre as atividades traducionais basais (Figura 3C) e sobre a responsividade traducional a elfl8 (Figura 3D). Figura 3E, Ganho de responsividade a elfl8 com a inclusão de repetições GA, G[A]₃, G[A]ô e G[A]_n (comprimento total de 120 nt) na 5’ UTR do repórter de luciferase dupla (diial-LUC). Figuras 3F, 3G, Contribuições de motivo-R e uORFs para atividade traducional basal de TBF1 (Figura 3F) e a resposta traducional a elfl8 (Figura 3G). Média ± e.p.m. de razões de atividades LUC/RLUC em N. benthamiana (n = 3 para as Figuras 3B, 3D-G ou 3 experimentos com 3 réplicas técnicas para a Figura 3C) normalizadas em relação às sequências líderes 5 ’ Mock (Simuladas) (Figuras 3B, 3D, 3E, 3G) ou sequências líderes 5’ WT (Figuras 3C, 3F). Consulte as Figuras 12A-12L.

[0013] Figuras 4A-4H mostram que o motivo-R controla a responsividade traducional à indução de PTI mediante a interação com PAB. Figura 4A, Efeitos da coexpressão de PAB2 sobre a tradução de genes contendo o motivo-R. Média ± e.p.m. de razões de atividades LUC/RLUC (n = 4) após normalizadas em relação ao controle YFP. Figura 4B, isolamento de RNA de PAB2 sintetizada in vitro. 0,2 nmol de RNAs com repetições GA, G[A]₃, G[A]ô e G[A]_n e poli(A)-RNA (120 nt) foram biotinilados. Esferas, controle sem as sondas de RNA. Figura 4C, Ligação de G[A]_n RNA com quantidades crescentes de PAB2. Figura 4D, isolamento de G[A]_n RNA de PAB2 sintetizado in vivo após indução de PTI. YFP, proteína de controle negativo. ou “+” significa PAB2 de tecido simuladamente tratado (Mock) ou PAB2 de tecido tratado com elfl8, respectivamente. Figura 4E, alterações em TBF1 TE no mutante pab2 pab4 (pab2/4) após tratamento com elfl8 calculadas como razões de mRNA polissomal/mRNA total (média ± d.p., n = 3). Figuras 4F, 4G, Resistência induzida por elfl8 a Psm ES4326 em plantas pab2 pab4 e pab2 pab8 (Figura 4F, média ± e.p.m., n = 8), em transformantes

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 13/191 /130 primários superexpres sores de PAB2 no background mutante pab2 pab8 (OEPAB2) (Figura 4G, média ± e.p.m., n = 8 para controle e efr-1, e 17 e 13 para linhagens OE-PAB2 com tratamento Mock (Simulado) e com tratamento com elfl8, respectivamente). Controle, plantas transgênicas expressoras de YFP no background WT. Tanto o controle quanto OE-PAB2 foram selecionados para resistência ao herbicida Basta® e adicionalmente confirmados por PCR. Figura 4H, Modelo de trabalho para funções opostas à atividade de PAB na regulação de tradução basal e induzida por elfl8 mediante interações diferenciais com o motivo-R. Consulte as Figuras 13A-13C.

[0014] Figuras 5A-5E mostram as atividades traducionais durante PTI induzida por elfl8, com relação às Figuras 1A-1E. Figura 5A, Tradução do repórter 35S:uORFstbfi-LUC em tipo selvagem (WT) após tratamento Mock (Simulado) e tratamento com elfl8. Média ± e.p.m. (n = 12) após normalização em relação à atividade de LUC no tempo 0. Figuras 5B, 5C, Níveis de transcritos do repórter 35S:uORFstbfi-LUC em WT após tratamento Mock (Simulado) e tratamento com elfl8 (Figura 5B) e em WT ou efr-1 após tratamento com elfl8 (Figura 5C). Níveis de transcritos são expressados como alterações em vezes normalizadas em relação ao tempo 0. Média ± d.p. (n = 3). Figuras 5D, 5E, Perfilamento polissomal de atividade traducional global (Figura 5D) e de atividade traducional de TBF1 mRNA calculadas como razões de mRNA polissomal/mRNA total (Figura 5E) em resposta ao tratamento Mock (Simulado) e ao tratamento com elfl8 em WT. Letras minúsculas indicam as frações em perfilamento polissomal.

[0015] Figuras 6A-6C mostram o aprimoramento realizado no protocolo de construção de biblioteca. Figura 6A, Adição de 5’-deadenilase e RecJf para remover o excesso de linker 5’-pré-adenililado. Fragmentos de mRNA de RS e de RF foram selecionados por tamanho e desfosforilados pelo tratamento com PNK, seguido por ligação de linker 5’-pré-adenililado. O método original usava purificação em gel para remover o excesso de linker.

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No método novo (fundo rosa), 5’-deadenilase foi usada para remover o grupo pré-adenililado (Ap) do linker não ligado permitindo a clivagem por RecJf. A amostra resultante pôde, então, ser diretamente usada para transcrição reversa. Figura 6B, Os métodos original (Original) e novo (Novo) para remover o excesso de linker foram comparados. Marcadores de RNA sintéticos de 26 nt e 34 nt foram usados para ligação ao linker. Os marcadores de RNA sem o linker foram usados como controles. A seta indica o excesso de linkers, escada de DNA, 10-pb. Figura 6C, Transcrição Reversa (RT, Reverse Transcription') mostrou o aprimoramento do método novo em comparação com o método original. Metade da mistura de ligação (O) foi purificada em gel para remover o excesso de linkers antes da RT (carregado 2x). A outra metade (N) foi tratada com 5’-deadenilase e RecJf, e diretamente usada como molde para RT (carregado Ix). Os iniciadores de RT foram carregados como controle. A seta indica o excesso de iniciadores de RT.

[0016] Figuras 7A-7H mostram a qualidade e a reprodutibilidade das bibliotecas de RS e de RF, com relação às Figuras 2A-2J. Figura 7A, Perfil por BioAnalyzer mostrou alta qualidade das bibliotecas de RS e de RF. Adicionalmente aos padrões internos (35 pb e 10.380 pb), um pico único de -170 pb está presente nas bibliotecas de RS e de RF para tratamento Mock (Simulado) e tratamento com elfl8 com ambas as réplicas biológicas (Repl/2). Figura 7B, Distribuição de comprimentos de leituras totais das 4 bibliotecas de RS e 4 bibliotecas de RF. Figura 7C, Fração de leituras de 30 nt nas leituras totais das 4 bibliotecas de RS e 4 bibliotecas de RF. Dados são mostrados como média ± e.p.m. (n = 4) da percentagem de leituras com alinhamento-5’ para A (framel, fase 1), U (frame2, fase 2) e G (frame3, fase 3) do códon de iniciação. Figura 7D, Densidade de leitura ao longo de 5’ UTR, CDS e 3’UTR das leituras totais das 4 bibliotecas de RS e 4 bibliotecas de RF. Genes expressados com RPKM em CDS > 1 e comprimento de UTR > 1 nt foram usados para diagramas em caixa. A linha superior, a linha do meio,

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9/130 e a linha inferior da caixa indicam os percentis 25, 50 e 75, respectivamente. Figura 7E, Resolução de nucleotídeo da cobertura ao redor dos códons de iniciação e de terminação usando o 15° nucleotídeo das leituras de 30-nt de RF. Figura 7F, Correlação entre duas réplicas (Repl/2) de amostras de RS e de RF. Dados são mostrados como a correlação de logzRPKM em CDS para os genes expressados com RPKM em CDS > 1. Coeficiente de correlação de Pearson r é mostrado. Figuras 7G, 7H, Clusterização hierárquica mostrando a reprodutibilidade entre RS (Figura 7G) e RF (Figura 7H) dentro de duas réplicas (Repl/2). Cor mais escura significa correlação maior.

[0017] Figuras 8A-8C mostram um fluxograma e métodos estatísticos para análises de alterações em transcriptoma, translatoma, e TE. Figura 8A, Fluxograma para processamento e atribuição de leituras. Figura 8B, Métodos e critérios estatísticos para análises de alterações em transcriptoma (RSfc), translatoma (RFfc) e TE (TEfc). Figura 8C, Definição de mudança na razão (ratio shift) de mORF/uORF entre tratamento Mock (Simulado) e tratamento com elfl8.

[0018] Figuras 9A-9C mostram análises adicionais dos dados de RS, RF e TE. Figura 9A, Distribuição normal de loggTE para tratamento Mock (Simulado) e tratamento com elfl8. Figura 9B, Alterações em TE no gene TBF1 endógeno. Cobertura de leitura foi normalizada em relação às leituras singularmente mapeadas com IGB. TEs para TBF1 éxon 2 em tratamento Mock (Simulado) e tratamento com elfl8 foram determinadas para calcular TEfc. Figura 9C, Correlação entre TEfc e comprimento de éxon, comprimento de 5’ UTR, comprimento de 3’ UTR e composição de GC.

[0019] Figuras 10A-10C mostram as respostas de PTI em mutantes de reguladores novos, com relação às Figuras 2A-2J. Figura 10A, Ativação de MAPK. Plântulas ein4-l, eicbp.b e erf7 de 12 dias de idade foram tratadas com solução de elfl8 1 μΜ e coletadas nos instantes de tempo indicados para análise de imunotransferência usando o anticorpo fosfoespecífico contra

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MAPK3 e MAPK6. Figura 10B, Deposição de calose. Plantas de 3 semanas de idade foram infiltradas com solução de elf 18 1 μΜ ou Mock (Simulado). As folhas foram coradas 20 horas mais tarde em azul de anilina seguido por microscopia confocal. Figura 10C, Efeitos de EIN4 UTRs sobre as razões de LU&RLUC mRNA após tratamento com elfl8 no ensaio transiente realizado em N. benthamiana. EV, empty vector (vetor vazio). Média ± d.p. (2 experimentos com 3 réplicas técnicas).

[0020] Figuras 11A-11F mostram o controle traducional mediado por uORF. Figuras 11 A, 11B, Fluxogramas de etapas usadas para identificar as uORFs preditas (Figura 11 A) e traduzidas (Figura 11B). Figura 11C, Densidade de leitura de uORF e de mORF. Para aqueles genes com leituras atribuídas à uORF e com RPKM em sua mORF > 1, logiRPKMs para uORFs individuais e mORFs são representados graficamente para tratamento Mock (Simulado) e tratamento com elfl8, respectivamente, r, Coeficiente de correlação de Pearson. Figura 11 D, Histograma de mudança (shift') em mORF/uORF após tratamento com elfl8. A razão de mORF/uORF para elfl8 dividida por aquela para Mock (Simulado) foi definida como valor de mudança (shift value). Dados são mostrados como a distribuição de log2 (transformação de valores de mudança). uORFs com mudança (shift) significativa determinada pelo escore-z estão coloridas e cujos números são mostrados. Figura 11E, Histograma de mudança (shift) em mORF/uORF após estresse hipóxico¹¹. Figura 11F, Diagramas de Venn mostrando as uORFs sobrepostas com ribo-shift significativo em respostas ao tratamento com elfl8 e ao tratamento hipóxico.

[0021] Figuras 12A-12L mostram o controle traducional mediado por motivo-R em resposta à indução por elfl8, com relação às Figuras 3A-3G. Figura 12A, Efeitos das sequências líderes 5’ contendo o motivo-R sobre as atividades traducionais basais após a normalização em relação ao mRNA (média ± e.p.m., n = 3). Figura 12B, Efeitos de deleções de motivo-R (AR)

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11/130 sobre a abundância de mRNA (média ± d.p., 2 experimentos com 3 réplicas técnicas). Figuras 12C-F, Efeitos de deleção de motivo-R e de mutações de substituição pontual em motivo-R sobre a tradução basal (Figuras 12C, 12E; média ± e.p.m., n = 4) e os níveis de mRNA (Figuras 12D, 12F, média ± d.p., 2 experimentos com 3 réplicas técnicas) para IAA18 e BET10 (Figuras 12C, 12D) e TBF1 (Figuras 12E, 12F). Figura 12G, Níveis de mRNA em WT e mutantes com deleção de motivo-R com e sem tratamento com elfl8. Média ± d.p. de 3 réplicas biológicas com 3 réplicas técnicas). Figura 12H, Efeitos de deleções de motivo-R (AR) sobre a responsividade traducional a elfl8 medida usando o ensaio dual-LUC (Média ± e.p.m., n = 3). Figura 121, Efeitos das repetições GA, G[A]s, G[A]ô e G[A]_n sobre os níveis de mRNA quando inseridas em 5’ UTR do repórter em ensaio transiente realizado em N. benthamiana. Média ± d.p. de 2 experimentos com 3 réplicas técnicas. Figuras 12J, 12K, Efeitos da deleção de motivo-R e/ou das mutações em uORF sobre a abundância de TBF1 mRNA (Figura 12J) e a responsividade transcricional ao tratamento Mock (Simulado) e ao tratamento com elfl8 (Figura 12K). Média ± d.p. de 2 experimentos com 3 réplicas técnicas após normalização em relação a WT (Figura 12J) ou WT com tratamento Mock (Simulado) (Figura 12K). Figura 12L, Contribuições de motivo-R e de uORFs para a resposta traducional de TBF1 a elfl8 em plantas Arabidopsis transgênicas. 1, 2, e 3 representam linhagens transgênicas individuais testadas. Média ± e.p.m. de 2 experimentos com 3 réplicas técnicas após normalização em relação a Mock (Simulado).

[0022] Figuras 13A-13C mostram os efeitos de PABs sobre a transcrição de mRNA e os fenótipos associados à PTI, com relação às Figuras 4A-4H. Figura 13A, Influência da coexpressão de PAB2 sobre a abundância de mRNA. Dados são média ± d.p. (3 réplicas biológicas com 3 réplicas técnicas). Figura 13B, Inibição do crescimento de plântula induzida por elfl8 em WT, efr-1, pab2 pab4 (pdb2/4) e pab2 pab8 (pab2/8) (média ± e.p.m., n =

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5). Figura 13C, Ativação de MAPK em plântulas WT, pab2/4, pab2/8 e efr-1 após tratamento com elfl8 medida por imunotransferência usando um anticorpo fosfoespecífico contra MAPK3 e MAPK6.

[0023] Figuras 14A-14D mostram as funções de GCN2 em PTI em plantas. Figuras 14A-14D, Efeitos da mutação gcn2 sobre a fosforilação de eIF2a induzida por elfl8 (Figura 14A), indução traducional (Figura 14B, média ± e.p.m. de atividade de LUC, n = 8) e transcrição do repórter uORFstbfi-LUC (Figura 14C, média ± d.p. de LUC mRNA, n = 3), e resistência a Psm ES4326 (Figura 14D, média ± e.p.m., n = 8).

[0024] Figuras 15A-15H mostram a caracterização de controle traducional mediado por uORFstbfi e de regulação transcricional mediada por promotor TBF1. Figura 15 A, Esquema dos constructos usados para estudar as atividades traducionais de WT uORFstbfi ou mutante uorfsTBFi (ATG para CTG). Figuras 15B-15D, Atividade de luciferase de vagalume sintetizada em citosol (Figura 15B; LUC; quimioluminescência com pseudocor); fluorescência de GFPer sintetizada em retículo endoplasmático (ER, Endoplasmic Reticulum) (Figura 15C; sob UV); e morte celular induzida por superexpressão de fusão de TBF1-YFP (Figura 15D; descolorida com etanol) após expressão transiente em N. benthamiana durante 2 dias (Figuras 15B, 15C) e 3 dias (Figura 15D), respectivamente. Figura 15E, Esquema do sistema de luciferase dupla {dual-LUC). RLUC, luciferase de Renilla. Figura 15F, Alterações na tradução do repórter em plantas Arabidopsis transgênicas hospedando o constructo de luciferase dupla em resposta a Mock (Simulado), Psm ES4326, Pst DC3000, Pst DC3000 hrcC~ (Pst hrcC~), elfl8 e flg22. Média ± e.p.m. das razões de atividade LUC/RLUC normalizadas em relação ao tratamento Mock (Simulado) em cada instante de tempo (n = 3). Figura 15G, Níveis de LUC/RLUC mRNA em (Figura 15F). Figura 15H, Níveis de TBF1 mRNA endógeno. UBQ5, controle interno. Média ± d.p. de LUC/RLUC mRNA normalizado em relação ao tratamento Mock (Simulado) em cada

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13/130 instante de tempo de 2 experimentos com 3 réplicas técnicas. Consulte as Figuras 19A-19N.

[0025] Figuras 16A-16I mostram os efeitos de transcrição controlada e de tradução controlada de sncl sobre a defesa e o valor adaptativo em Arabidopsis. Figuras 16A, 16B, Efeitos da transcrição controlada e da tradução controlada de sncl sobre crescimento vegetativo (Figura 16A) e crescimento reprodutivo (Figura 16B). sncl, o mutante contendo o alelo sncl1 autoativado. #1 e #2, duas linhagens transgênicas independentes contendo TBFlp:uORFsTBFi-sncl. Figuras 16C, 16D, crescimento de Psm ES4326 em WT, sncl, #1 e #2 após inoculação por aspersão (Figura 16C) ou por infiltração (Figura 16D). Média ± e.p.m. (n = 12 e 24 de três experimentos no Dia 0 e no Dia 3, respectivamente). Figuras 16E, 16F, crescimento de Hpa Noco2. Fotografias (Figura 16E) e esporos Hpa foram coletados das plantas infectadas (Figura 16F) 7 dpi. Média ± e.p.m. (n = 12). Figuras 16G-16I, Análises de raio da roseta (Figura 16G), peso de polpa (Figura 16H) e peso de sementes total (Figura 161). Média ± e.p.m. As letras, acima, indicam as diferenças de significância (P < 0,05). Consulte as Figuras 21A-21H para 4 linhagens juntas.

[0026] Figuras 17A-171 mostram os efeitos de transcrição controlada e de tradução controlada de AtNPRl sobre a defesa e o valor adaptativo em arroz. Figura 17A, Sintomas representativos observados após inoculação de Xoo em plantas transgênicas TI AtNPRl crescidas no campo. Figura 17B, Quantificação de comprimento de lesão em folha (Figura 17A). Figuras 17C, 17D, Sintomas representativos observados após inoculação de Xoc (Figura 17C) e de M. oryzae (Figura 17D) em plantas T2 crescidas na câmara de crescimento. Figuras 17E, 17F, Quantificação de comprimento de lesão em folha (Figuras 17C, 17D). Figuras 17G-17I, Parâmetros de valor adaptativo de arroz transgênico TI AtNPRl sob condições de campo, incluindo altura da planta (Figura 17G) e rendimento de grãos determinado pelo número de grãos

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14/130 por planta (Figura 17H), e pelo peso de 1.000 grãos (Figura 171). WT, Oryza sativa cultivar ZH11 recipiente. Média ± e.p.m. Letras diferentes, acima, indicam as diferenças de significância (P < 0,05). Consulte as Figuras 24A24D e 25A-25L para 4 linhagens juntas e para mais parâmetros de valor adaptativo.

[0027] Figuras 18A-18D mostram a conservação de sequências de peptídeo e de nucleotídeos uORF2tbfi em espécies de plantas. Figura 18A, Esquema da estrutura de TBF1 mRNA. A sequência líder 5’ contém duas uORFs, uORFl e uORF2. CDS, sequência codificante. Figuras 18B-18D, Alinhamento de sequências de nucleotídeos uORF2 (Figura 18B) (SEQ ID NOS: 482-490) e alinhamento (Figura 18C) (SEQ ID NOS: 491-499) e filogenia (Figura 18D) de sequências de peptídeo uORF2 em diferentes espécies de plantas. Os tripletos correspondentes codificantes dos aminoácidos conservados dentre estas espécies estão sublinhados (fundo preto), resíduos similares (fundo cinza) e resíduos faltantes (hifens) foram identificados usando Clustlw2. At (Arabidopsis thaliana; AT4G36988), Pv (Phaseolus vulgaris; XP_007155927), Gm (Glycine max; XP_006600987), Gr (Gossypium raimondii; CO115325), Nb (Nicotiana benthamiana; CK286574), Ca (Cicer arietinum; XP_004509145), Pd (Phoenix dactylifera; XP_008797266), Ma (Musa acuminata subsp. Malaccensis; XP_009410098), Os (Oryza sativa; Os09g28354).

[0028] Figuras 19A-19N mostram a caracterização de uORFstbfi e de uORFsbziPii em controle traducional, com referência às Figuras 15A-15H. Figura 19A, Localização subcelular da fusão LUC-YFP (Figura 19A) e de GFPer (Figura 19B). SP (Signal Peptidé), peptídeo de sinal de quitinase básica de Arabidopsis; HDEL, ER sinal de retenção. Figuras 19C-19E, Níveis de mRNA de LUC em (Figura 15B; n = 3), GFPer em (Figura 15C; n = 4), e TBFl-YFP em (Figura 15D; n = 3) 2 dpi antes da morte celular em plantas expressoras de TBF1. Média ± d.p. Figura 19F, Esquemas das sequências

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15/130 líderes 5’ usadas no estudo das atividades traducionais de WT uORFsbzipn, mutante uorf2abzipn (ATG para CTG) ou uorf2bbzipn (ATG para TAG). Figuras 19G-19I, Controle traducional mediado por uORFsbzipn de LUC sintetizada em citosol (Figura 19G; quimioluminescência com pseudocor); GFPer sintetizada em ER (Retículo Endoplasmático) (Figura 19H; fluorescência sob UV); e morte celular induzida por superexpressão de TBF1 (Figura 191; descolorida usando etanol) após expressão transiente em N. benthamiana durante 2 dias (Figuras 19G, 19H) e 3 dias (Figura 191), respectivamente. Figuras 19J-19L, Níveis de mRNA de LUC em (Figura 19G), GFPer em (Figura 19H), e TBFl-YFP em (Figura 191) de 2 experimentos com 3 réplicas técnicas. Média ± d.p. Figura 19M, Alterações em TE em LUC controladas pela sequência líder 5’ contendo WT uORFsbzipn, mutante uorf2abzipn ou uorf2bbzipn em resposta a elfl8 em N. benthamiana. Média ± e.p.m. das razões de atividade de LUC/RLUC (n = 4). Figura 19N, Alterações em LUC/RLUC mRNA em (Figura 19M). Média ± d.p. de LUC/RLUC mRNA normalizada com relação ao tratamento Mock (Simulado) de 2 experimentos com 3 réplicas técnicas.

[0029] A Figura 20 mostra três fenótipos desenvolventes observados em transformantes primários de Arabidopsis expressores de sncl. Imagens representativas dos três fenótipos desenvolventes observados em linhagens transgênicas de Arabidopsis TI (isto é, a primeira geração) contendo 35S:uorfsTBFi-sncl, 35S:uORFsTBFi-sncl, TBFlp:uorfsTBFi-sncl e TBFlp:uORFsTBFi-sncl (acima). Teste exato de Fisher foi usado para a análise estatística dois a dois (abaixo). Letras diferentes em “Total” indicam diferentes significâncias entre Tipo III e Tipo I+Tipo II (P < 0,01).

[0030] As Figuras 21A-21I mostram os efeitos de transcrição controlada e de tradução controlada de sncl sobre a defesa e o valor adaptativo em Arabidopsis, com relação às Figuras 16A-16I. Figuras 21 A, 21B, crescimento de Psm ES4326 em WT, sncl, linhagens transgênicas #1-4

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16/130 após inoculação por aspersão (Figura 21A; n = 8) ou por infiltração (Figura 2IB; n = 12e24de três experimentos no Dia 0 e no Dia 3 respectivamente). Média ± e.p.m. Figura 21C, crescimento de Hpa Noco2 conforme medido pela contagem de esporos no 7^o dpi. Média ± e.p.m. (n = 12). Figuras 21D21G, Análises e raio da planta (Figura 21 D), peso de polpa (Figura 21E), número de srliquas (Figura 21F) e peso de sementes total (Figura 21G). Média ± e.p.m. Figuras 21H, 211, Níveis relativos de proteína sncl induzida por Psm ES4326 (Figura 21H; números, abaixo, imunotransferências) e de mRNA (Figura 211). Média ± d.p. de 2 experimentos com 3 réplicas técnicas (Figura 211). #1-4, quatro linhagens transgênicas independentes contendo TBFlp:uORFsTBFi-sncl com #1 e #2 mostradas nas Figuras 16A-16I. hpi, horas após infecção por Psm ES4326; CBB, Coomassie Brilliant Blue (Azul Brilhante Coomassie). Letras diferentes acima dos gráficos de barras indicam diferenças de significância (P < 0,05).

[0031] As Figuras 22A-22C mostram a funcionalidade de uORFstbfi em arroz. Figuras 22A, 22B, Atividade de LUC (Figura 22A) e níveis de mRNA (Figura 22B) em três linhagens primárias transgênicas de arroz independentes (chamadas “T0” em pesquisa de arroz) contendo 35S:uorfsrBFiLUC e 35S:uORFstbfi-LUC. Média ± e.p.m. de atividades de LUC (RLU, Relative Light Unit, unidade de luz relativa) de 3 réplicas biológicas; e média ± e.p.m. de níveis de LUC mRNA de 3 réplicas técnicas após normalização em relação à linhagem 35S:uorfsTBFi-LUC #1. Figura 22C, Fenótipos representativos de doença imitadora de lesão (LMD, Lesion Mimic Disease) (acima) e percentagem de plantas transgênicas de arroz AtNPRl mostrando LMD na segunda geração (Tl) crescida na câmara de crescimento (abaixo).

[0032] As Figuras 23A-23E mostram os efeitos de transcrição controlada e de tradução controlada de AtNPRl sobre a defesa em arroz T0, com relação às Figuras 17 A-171. Figuras 23A-23D, Medições de comprimento de lesão após infecção por Xoo cepa PXO347 em

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17/130 transformantes primários (TO) para 35S:uorfsTBFi-AtNPRl (Figura 23A), 35S:uORFsTBFi-AtNPRl (Figura 23B), TBFlp:uorfsTBFi-AtNPRl (Figura 23C) e TBFlp:uORFsTBFi-AtNPRl (Figura 23D). Linhagens adicionalmente analisadas em TI e T2 estão dentro de círculo. Figura 23E, Comprimentos médios de lesão de folha WT, Oryza sativa cultivar ZH11 recipiente. Média ± e.p.m. Letras diferentes, acima, indicam as diferenças de significância (P < 0,05).

[0033] As Figuras 24A-24E mostram os efeitos de transcrição controlada e de tradução controlada de AtNPRl sobre a defesa em arroz Tl, com relação às Figuras 17A-171. Figuras 24A, 24B, Sintomas representativos observados em plantas transgênicas de arroz Tl AtNPRl crescidas na estufa (Figura 24A) após inoculação de Xoo e as correspondentes medições de comprimento de lesão em folha (Figura 24B). PCR foi realizada para detectar a presença (+) ou a ausência (-) do gene transgênico. Figura 24C, Quantificação de comprimento de lesão em folha de 4 linhagens para inoculação de Xoo em plantas transgênicas de arroz Tl AtNPRl crescidas no campo. Média ± e.p.m. Letras diferentes, acima, indicam as diferenças de significância (P < 0,05). Figuras 24D, 24E, Níveis relativos de AtNPRl mRNA (Figura 24D) e de proteína (Figura 24E; números, abaixo, imunotransferências) em resposta à infecção por Xoo. Média ± d.p. (Figura 24D; n = 3 réplicas técnicas).

[0034] As Figuras 25A-25L mostram os efeitos de transcrição controlada e de tradução controlada de AtNPRl sobre o valor adaptativo de arroz Tl sob condições de campo, com relação às Figuras 17A-17I. Letras diferentes, acima, indicam as diferenças de significância dentre os constructos (P < 0,05).

DESCRIÇÃO DETALHADA [0035] Os inventores têm demonstrado que após desafio com patógenos, as plantas apenas reprogramam as atividades transcricionais delas,

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18/130 mas também rápida e transientemente induzem a tradução de reguladores imunes-chave, como o fator de transcrição TBF1 (Pajerowska-Mukhtar, K.M. et al. Curr. Biol. 22, 103-112 (2012)). Aqui, nos Exemplos não limitadores, os inventores realizaram um perfilamento de translatoma global em Arabidopsis exposta ao padrão molecular associado a micróbios (MAMP, Microbe-Associated Molecular Pattern), elf 18. Os inventores mostram não apenas uma carência de correlação entre tradução e transcrição durante esta resposta de imunidade disparada por padrões (PTI, Pattern-Triggered Immunity), mas os estudos deles também revelam um controle de tradução mais rigoroso que controle de transcrição. Além disso, investigação adicional de genes com eficiência traducional (TE, Translational Efficiency) alterada tem levado os inventores a descobrirem vários novos elementos-m imunorresponsivos que podem ser usados para rigorosamente controlar a expressão de proteína em, por exemplo, uma maneira induzível. Os novos elementos-m imunorresponsivos incluem as sequências de “motivo-R”, Fase de Leitura Aberta a Montante (“Upstream Open Reading Frame” (uORF)), e região 5’ não traduzida (UTR, 5’ UnTranslated Region). Foi descoberto que as sequências de motivo-R estão elevadamente enriquecidas na 5’ UTR de transcritos com TE aumentada (TE-up) em resposta à indução de PIT e definem uma nova sequência consenso de mRNA consistindo predominantemente em purinas. As sequências uORF foram também definidas na 5’ UTR de transcritos com TE alterada e foi descoberto que são independentes de elementos-m controladores da tradução de transcritos imunorresponsivos. As sequências de motivo-R e uORF podem ser usadas separadamente ou em combinação, como na sequência regulatória 5’ de comprimento completo de genes com TE alterada, para rigorosamente controlar a tradução de transcritos de RNA em uma maneira imunorresponsiva ou induzível.

[0036] Os inventores consideram que os novos elementos-m

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19/130 imunorresponsivos podem ser usados para controlar mais estringentemente a expressão de proteínas em células em várias aplicações. Um uso potencial destes novos elementos-cri é em novos constructos para o controle de doenças de plantas. Para esta finalidade, os inventores têm também demonstrado que a região 5’ UTR do gene TBF1 podería ser usada para intensificar a resistência às doenças em plantas pela provisão de controle mais rigoroso da tradução de proteínas de defesa enquanto que também minimiza a penalidade de valor adaptativo associada com a expressão de proteínas de defesa. Consulte, por exemplo, o Exemplo 2. TBF1 é um importante fator de transcrição para a mudança de crescimento-para-defesa da planta após indução imune ((Pajerowska-Mukhtar, K.M. et al. Curr. Biol. 22, 103-112 (2012)). A tradução de TBF1 é normalmente rigorosamente suprimida por duas uORFs dentro da região 5’ na ausência de desafio de patógenos.

[0037] Além das uORFs de TBF1, os inventores consideram que os elementos-m imunorresponsivos adicionais aqui revelados podem ser usados para controlar a expressão de proteínas de defesa para não apenas minimizar os efeitos adversos de resistência intensificada sobre o crescimento e o desenvolvimento da planta, mas também ajudar a proteger o meio ambiente mediante a redução do uso de pesticidas que são uma principal fonte de poluição. Tomar induzível a resistência de amplo espectro a patógenos, pode também diminuir a pressão seletiva para patógenos resistentes.

[0038] Embora a provisão de resistência intensificada em plantas é um uso potencial para as composições e os métodos aqui descritos(as), os inventores também reconhecem que tais composições e métodos podem ser usados(as) em outras aplicações de planta e de não planta. Por exemplo, a presença ubíqua de sequências uORF em mRNAs de organismos variando desde levedura (13% de todo o mRNA) a humanos (49% de todo o mRNA) sugere utilidade potencialmente ampla destas características de mRNA no controle de expressão transgênica.

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20/130 [0039] Em um aspecto da presente invenção, são providos constructos. Como aqui usado, o termo “constructo” refere-se aos polinucleotídeos recombinantes incluindo, sem limitação, DNA e RNA, que podem ser de fita simples ou de fita dupla e podem representar a fita senso ou a fita antissenso. Polinucleotídeos recombinantes são polinucleotídeos formados por métodos de laboratório que incluem sequências de polinucleotídeos derivadas de pelo menos duas fontes naturais diferentes ou podem ser sintéticas. Os constructos, portanto, podem incluir modificações novas em genes endógenos introduzidas, por exemplo, por tecnologias de editoração do genoma. Os constructos podem também incluir polinucleotídeos recombinantes criados usando, por exemplo, metodologias de DNA recombinante.

[0040] Como aqui usados, os termos “polinucleotídeo”, “sequência de polinucleotídeo”, “ácido nucleico” e “sequência de ácido nucleico” referemse a um nucleotídeo, oligonucleotídeo, polinucleotídeo (cujos termos podem ser usados intercambiavelmente), ou qualquer fragmento dos mesmos. Estas frases referem-se também ao DNA ou RNA de origem natural ou sintética (que pode ser de fita simples ou de fita dupla e podem representar a fita senso ou a fita antissenso).

[0041] Os constructos aqui providos podem ser preparados por métodos disponíveis para aquelas pessoas versadas na técnica. Notavelmente cada um dos constructos reivindicados são moléculas recombinantes e como tais não ocorrem na natureza. Geralmente, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos de laboratório utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas e de DNA recombinante que são bem conhecidas e comumente utilizadas na técnica. Técnicas padrão disponíveis para aquelas pessoas versadas na técnica podem ser usadas para clonagem, isolamento, amplificação e purificação de DNA e de RNA. Tais técnica são detalhadamente explicadas na literatura.

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21/130 [0042] Os constructos de DNA da presente invenção podem incluir um promotor heterólogo funcionalmente ligado a um polinucleotídeo de DNA codificante de um transcrito de RNA incluindo uma sequência regulatória 5’ localizada a um sítio de inserção, em que a sequência regulatória 5’ inclui uma sequência de motivo-R. Heterólogo, como aqui usado, simplesmente indica que o promotor, a sequência regulatória 5’ e o sítio de inserção ou a sequência codificante inserida no sítio de inserção não são todos nativamente encontrados juntos.

[0043] Um “sítio de inserção” é uma sequência de polinucleotídeo que permite a incorporação de outro polinucleotídeo de interesse. Sítios de inserção exemplificadores podem incluir, sem limitação, polinucleotídeos incluindo sequências reconhecidas por uma ou mais enzimas de restrição (isto é, sítio de multiclonagem (MCS, Multicloning Site)), polinucleotídeos incluindo sequências reconhecidas por sistemas de recombinação sítioespecífica como o sistema de recombinação de fago λ (isto é, a tecnologia de “Clonagem Gateway”), o sistema FLP/FRT, e o sistema Cre/lox ou polinucleotídeos incluindo sequências que podem ser reconhecidas pelo sistema CRISPR/Cas. O sítio de inserção pode incluir uma sequência codificante heteróloga que codifica um polipeptídeo heterólogo.

[0044] Uma “sequência regulatória 5’” é uma sequência de polinucleotídeo que quando expressada em uma célula pode, quando DNA, ser transcrita e pode ou não, quando RNA, ser traduzida. Por exemplo, uma sequência regulatória 5 ’ pode incluir sequências de polinucleotídeos que não são traduzidas (isto é, sequências de motivo-R) mas controlam, por exemplo, a tradução de uma fase de leitura aberta a jusante (isto é, sequência codificante heteróloga). Uma sequência regulatória 5’ pode também incluir uma fase de leitura aberta (isto é, uORF) que é traduzida e pode controlar a tradução de uma fase de leitura aberta a jusante (isto é, sequência codificante heteróloga). De acordo com a presente invenção, a sequência regulatória 5’

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22/130 está localizada 5’ a um sítio de inserção.

[0045] Os inventores descobriram uma sequência consenso que é significativamente enriquecida na região 5’ dos transcritos com TE aumentada (TE-up) durante a indução de PTI. Visto que a sequência consenso contém quase exclusivamente purinas, eles nomearam-na de um “motivo-R” de acordo com o código de nucleotídeos da IUPAC. Como aqui usada, uma “sequência de motivo-R” é uma sequência de RNA que (1) inclui a sequência consenso (G/A/C)(A/G/C)(A/G/C/U)(A/G/C/U)(A/G/C)(A/G)(A/G/C)(A/G)( A/G/C/U) (A/G/C/U)(A/G/C)(A/C/U)(G/A/C)(A)(A/G/U) (Consulte, por exemplo, a Figura 3A, SEQ ID NO: 481) ou (2) inclui 10, 11, 12, 13, 14, 15,

16, 17, 18, 19, ou 20 nucleotídeos incluindo os nucleotídeos G e A em qualquer razão de 2OG:1A a 1G:2OA. Nos Exemplos, os inventores demonstram que sequências de motivo-R compreendendo 15 nucleotídeos com repetições G[Ah, G[A]eou G[A]_n (sequências de RNA compreendidas de variadas repetições GA tendo variados números de nucleotídeos A) foram suficientes para responsividade a elfl8. Uma sequência de motivo-R pode alterar a tradução de um transcrito de RNA em uma maneira imunorresponsiva em uma célula quando presente na região regulatória 5 ’ do transcrito. Uma sequência de motivo-R pode também ser uma sequência de DNA codificante de uma tal sequência de RNA. Em algumas modalidades, a sequência de motivo-R pode ter 40%, 60%, 80%, 90%, ou 95% de identidade de sequência com as sequências de motivo-R identificadas acima. A sequência de motivo-R pode incluir qualquer uma das sequências de SEQ ID NOs: 113-293 na Tabela 2, um polinucleotídeo de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,

17, 18, 19, ou 20 nucleotídeos em comprimento compreendendo os nucleotídeos G e A em qualquer razão de 19G:1A a 1G:19A, ou uma variante do mesmo.

[0046] Com relação às sequências de polinucleotídeos (isto é, motivoR, uORF, ou sequências de polinucleotídeo regulatórias 5’), uma “variante”,

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23/130 um(a) “mutante”, ou um “derivado” pode ser definido(a) como uma sequência de polinucleotídeo tendo pelo menos 50% de identidade de sequência com o polinucleotídeo específico ao longo de um determinado comprimento de uma das sequências de polinucleotídeos usando blastn na ferramenta “BLAST 2 Sequences” disponível no website do “National Center for Biotechnology Information”. Um tal par de polinucleotídeos pode mostrar, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% ou mais de identidade de sequência ao longo de um determinado comprimento definido.

[0047] Com relação às sequências de polinucleotídeo, os termos “percentagem de identidade” e “% de identidade” e “% de identidade de sequência” referem-se à percentagem de igualdades de resíduos entre pelo menos duas sequências de polinucleotídeo alinhadas usando um algoritmo padronizado. Um tal algoritmo pode inserir, em uma maneira padronizada e reproduzível, lacunas {.gaps) nas sequências sendo comparadas com o propósito de otimizar o alinhamento entre as duas sequências, e por conseguinte alcançar uma comparação mais significativa das duas sequências. A percentagem de identidade de sequência para um polinucleotídeo pode ser determinada como entendido na técnica (Consulte, por exemplo, Patente U.S. n° 7.396.664, que é aqui incorporada em sua totalidade como referência). Um conjunto de algoritmos de comparação de sequências comumente usado e livremente disponível é provido pela “Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)” do “National Center for Biotechnology Information (NCBI)”, que está disponível em várias fontes, incluindo o NCBI, Bethesda, Md., como seu website. O conjunto de programas de computador BLAST inclui vários programas de análise de sequências incluindo “Wos/n” que é usado para alinhar uma sequência de polinucleotídeo conhecida com outras sequências de

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24/130 polinucleotídeos de uma variedade de bases de dados. Também está disponível uma ferramenta chamada “BLAST 2 Sequences” que é usada para comparação par-a-par direta de duas sequências de nucleotídeos. A ferramenta “BLAST 2 Sequences” pode ser acessada e usada interativamente no website de NCBI. A ferramenta “BLAST 2 Sequences” pode ser usada para ambos blastn e blastp (discutidos acima).

[0048] Com relação às sequências de polinucleotídeos, a percentagem de identidade pode ser medida ao longo do comprimento de uma sequência de polinucleotídeo definida inteira, por exemplo, como definida por uma SEQ ID número específica, ou pode ser medida ao longo de um comprimento mais curto, por exemplo, ao longo do comprimento de um fragmento obtido de uma sequência definida, maior, por exemplo, um fragmento de pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 70, pelo menos 100, ou pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Tais comprimentos são apenas exemplificadores, e é entendido que qualquer comprimento de fragmento confirmado pelas sequências aqui mostradas, nas tabelas, figuras, ou Lista de Sequências, pode ser usado para descrever um comprimento ao longo do qual a percentagem de identidade pode ser medida.

[0049] Polinucleotídeos homólogos aos polinucleotídeos aqui descritos são também providos. Aquelas pessoas versadas na técnica também entendem que a degeneração do código genético e uma variedade de polinucleotídeos podem codificar o mesmo polipeptídeo. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos (isto é, os polinucleotídeos uORF) podem estar códon-otimizados para a expressão em uma célula específica. Embora sequências de polinucleotídeos específicas que são encontradas em plantas sejam aqui reveladas, podem ser usadas quaisquer sequências de polinucleotídeos que codificam uma forma desejada dos polipeptídeos aqui descritos. Portanto sequências de ocorrência não natural podem ser usadas,

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Estas podem ser desejáveis, por exemplo, para intensificar a expressão em sistemas de expressão heterólogos de polipeptídeos ou de proteínas. Programas de computador para gerar sequências codificantes degeneradas estão disponíveis e podem ser usados para este propósito. Lápis, papel, o código genético, e uma mão humana podem também ser usados para gerar as sequências codificantes degeneradas.

[0050] Em algumas modalidades, a sequência regulatória 5’ carece de uma sequência TBF1 uORF. Uma “sequência TBF1 uORF” refere-se a uma fase de leitura aberta a montante residindo na região 5’ UTR do gene TBF1. O gene TBF1 é um fator de transcrição de planta importante em respostas imunes de planta. As sequências TBF1 uORF foram identificadas na Publicação de Patente U.S. n° 2015/0113685. Em algumas modalidades, a sequência regulatória 5’ pode carecer de polinucleotídeos codificantes de SEQ ID NO: 102 da publicação US2015/0113685 (Met Vai Vai Vai Phe Ile Phe Phe Leu His His Gin He Phe Pro) ou variante aqui descrita e/ou polinucleotídeos codificantes de SEQ ID NO: 103 da publicação US2015/0113685 (Met Glu Glu Thr Lys Arg Asn Ser Asp Leu Leu Arg Ser Arg Vai Phe Leu Ser Gly Phe Tyr Cys Trp Asp Trp Glu Phe Leu Thr Ala Leu Leu Leu Phe Ser Cys) ou variantes aqui descritas.

[0051] A sequência regulatória 5’ pode incluir pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais sequências de motivo-R. Em algumas modalidades, a sequência regulatória 5’ inclui entre 5 e 25 sequências de motivo-R ou qualquer faixa dentro da mesma. Dentro da sequência regulatória 5’, cada sequência de motivo-R pode estar separada por pelo menos 0, 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, ou mais bases.

[0052] A sequência regulatória 5’ pode incluir um polinucleotídeo uORF codificante de qualquer um dos polipeptídeos uORF de SEQ ID NOS: 1-38 na Tabela 1 ou uma variante dos mesmos. Em algumas modalidades, a

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26/130 sequência regulatória 5’ inclui qualquer um dos polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 39-76 na Tabela 1 ou uma variante dos mesmos. Em algumas modalidades, a sequência regulatória 5’ inclui qualquer um dos polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 77-112 na Tabela 1, SEQ ID NOs: 294-474 na Tabela 2, ou uma variante dos mesmos.

[0053] Os polipeptídeos aqui revelados (isto é, os polipeptídeos uORF) podem incluir polipeptídeos “variantes”, “mutantes”, e “derivados dos mesmos”. Como aqui usado o termo “de tipo selvagem, (wild-type, WT)” é um termo da técnica entendido pelas pessoas versadas e significa a forma típica de um polipeptídeo como ele ocorre na natureza diferente das formas variantes ou mutantes. Como aqui usado, uma “variante”, um(a) “mutante”, ou um “derivado” refere-se a uma molécula de polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos que difere de uma molécula de proteína ou de polipeptídeo de referência. Uma variante ou mutante pode ter uma ou mais inserções, deleções, ou substituições de um resíduo de aminoácido com relação a uma molécula de referência. Uma variante ou mutante pode incluir um fragmento de uma molécula de referência. Por exemplo, um polipeptídeo variante ou mutante de polipeptídeo uORF pode ter uma ou mais inserções, deleções, ou substituições de pelo menos um resíduo de aminoácido com relação ao polipeptídeo “de tipo selvagem” uORF. As sequências de polipeptídeos dos polipeptídeos uORF “de tipo selvagem” de Arabidopsis são apresentadas na Tabela 1. Estas sequências podem ser usadas como sequências de referência.

[0054] Os polipeptídeos aqui providos podem ser polipeptídeos de comprimento completo ou podem ser fragmentos do polipeptídeo de comprimento completo. Como aqui usado, um “fragmento” é uma porção de uma sequência de aminoácidos que é idêntica em sequência a, mas mais curta em comprimento do que, uma sequência de referência. Um fragmento pode compreender até o comprimento completo da sequência de referência, menos

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 33/191 /130 pelo menos um resíduo de aminoácido. Por exemplo, um fragmento pode compreender de 5 a 1.000 resíduos de aminoácidos contíguos de um polipeptídeo de referência, respectivamente. Em algumas modalidades, um fragmento pode compreender pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, ou 500 resíduos de aminoácidos contíguos de um polipeptídeo de referência. Os fragmentos podem ser preferivelmente selecionados de determinadas regiões de uma molécula. O termo “pelo menos um fragmento” abrange o polipeptídeo de comprimento completo. Um fragmento de um polipeptídeo uORF pode compreender ou consistir essencialmente em uma porção contígua de uma sequência de aminoácidos do polipeptídeo uORF de comprimento completo (Consulte a SEQ ID NOs. na Tabela 1). Um fragmento pode incluir um truncamento N-terminal, um truncamento C-terminal, ou ambos truncamentos com relação ao polipeptídeo uORF de comprimento completo.

[0055] Uma “deleção” em um polipeptídeo refere-se a uma alteração na sequência de aminoácidos resultando na ausência de um ou mais resíduos de aminoácidos. Uma deleção pode remover pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, ou mais resíduos de aminoácidos. Um deleção pode incluir uma deleção interna e/ou uma deleção terminal (por exemplo, um truncamento Nterminal, um truncamento C-terminal ou ambos de um polipeptídeo de referência).

[0056] “Inserções” e “adições” em um polipeptídeo referem-se às alterações em uma sequência de aminoácidos resultando na adição de um ou mais resíduos de aminoácidos. Uma inserção ou adição pode referir-se a 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, ou mais resíduos de aminoácidos. Uma variante de um polipeptídeo YTHDF pode ter inserções Nterminais, inserções C-terminais, inserções internas, ou qualquer combinação de inserções N-terminais, inserções C-terminais, e inserções internas.

[0057] As sequências de aminoácidos dos(as) variantes, mutantes, ou

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28/130 derivados de polipeptídeo, como aqui considerados (as), podem incluir substituições conservativas de aminoácidos com relação a uma sequência de aminoácidos de referência. Por exemplo, um polipeptídeo variante, mutante, ou derivado pode incluir substituições conservativas de aminoácidos com relação à molécula de referência. “Substituições conservativas de aminoácidos” são aquelas substituições que são uma substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente na qual é predito que a substituição interfere o mínimo nas propriedades do polipeptídeo de referência. Em outras palavras, substituições conservativas de aminoácidos substancialmente conservam a estrutura e a função do polipeptídeo de referência. As substituições conservativas de aminoácidos geralmente mantêm: (a) a estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha beta ou helicoidal alfa, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio da substituição, e/ou (c) o volume da cadeia lateral.

[0058] Os constructos de DNA da presente invenção podem também incluir um promotor heterólogo funcionalmente ligado a um polinucleotídeo de DNA codificante de um transcrito de RNA incluindo uma sequência regulatória 5’ localizada 5’ a um sítio de inserção, em que a sequência regulatória 5’ inclui um polinucleotídeo uORF codificante de qualquer um dos polipeptídeos uORF de SEQ ID NOs: 1-38 na Tabela 1 ou uma variante dos mesmos. Em algumas modalidades, a sequência regulatória 5’ incluída no constructo de DNA inclui qualquer um dos polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 39-76 na Tabela 1 ou uma variante dos mesmos. Em algumas modalidades, a sequência regulatória 5’ incluída no constructo de DNA inclui qualquer um dos polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 77-112 na Tabela 1, SEQ ID NOs: 294474 na Tabela 2, ou uma variante dos mesmos.

[0059] Os constructos da presente invenção podem incluir um sítio de inserção incluindo uma sequência codificante heteróloga que codifica um

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29/130 polipeptídeo heterólogo. Em algumas modalidades, a expressão dos constructos da presente invenção em uma célula produz um transcrito incluindo a sequência codificante heteróloga e uma sequência regulatória 5’. Uma “sequência codificante heteróloga” é uma região de um constructo que é um segmento identificável (ou segmentos identificáveis) que não é encontrado em associação com o constructo maior na natureza. Quando a região codificante heteróloga codifica um gene ou uma porção de um gene, o gene pode estar flanqueado por DNA que não flanqueia o DNA genético no genoma do organismo-fonte. Em outro exemplo, uma região codificante heteróloga é um constructo no qual a própria sequência codificante não é encontrada na natureza.

[0060] Um “polipeptídeo heterólogo”, “polipeptídeo” ou “proteína” ou “peptídeo” podem ser usados intercambiavelmente para se referirem a um polímero de aminoácidos. Um “polipeptídeo”, como aqui considerado, tipicamente compreende um polímero de aminoácidos de ocorrência natural (por exemplo, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, e valina). O polipeptídeo heterólogo pode incluir, sem limitação, um polipeptídeo de resistência a patógenos de planta, um polipeptídeo terapêutico, um fator de transcrição, uma proteína CAS (isto é Cas9), um polipeptídeo repórter, um polipeptídeo que confere resistência a fármacos ou a agroquímicos, ou um polipeptídeo que está envolvido no crescimento ou no desenvolvimento de plantas.

[0061] Como aqui usado, um “polipeptídeo de resistência a patógenos de planta” refere-se a qualquer polipeptídeo, que quando expressando dentro de uma planta, toma a planta mais resistente a patógenos incluindo, sem limitação, patógenos virais, bacterianos, fúngicos, oomicetos, fitoplasmas, e nematódeos. Os polipeptídeos de resistência a patógenos de planta são

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30/130 conhecidos na técnica e podem incluir, sem limitação, Receptores Reconhecedores de Padrões (PRRs, Pattern Recognition Receptors) para MAMPs, receptores imunes intracelulares de ligação a nucleotídeos ricos em repetição de leucina (NB-LRR) (também conhecidos como “proteínas-R”), snc-1, NPR1 como Arabidopsis NPR1 (Á/NPR1), ou fatores de transcrição relacionados à defesa como TBF1, TGAs, WRKYs, e MYCs. NPR1 é um regulador positivo da resistência de amplo espectro induzida por um sinal imune geral de planta, ácido salicílico. Enquanto que as proteínas-R apenas funcionam dentro da mesma família de plantas, a superexpressão do Arabidopsis NPR1 (AtNPRl) poderia intensificar a resistência em diversas famílias de plantas como arroz, trigo, tomateiro e algodão contra uma variedade de patógenos. O Arabidopsis sncl-1 (para simplificar, snc-1, aqui) é um mutante pontual autoativado do receptor SNC1 imune NB-LRR.

[0062] Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo pode ser um polipeptídeo terapêutico, uma enzima industrial ou outro produto de proteína útil. Os polipeptídeos terapêuticos exemplificadores são resumidos, por exemplo, em Leader et al., Nature Review-Drug Discovery 7:21-39 (2008). Os polipeptídeos terapêuticos incluem mas não são limitados a enzimas, anticorpos, hormônios, citocinas, ligantes, inibidores competitivos e podem ser polipeptídeos modificados ou de ocorrência natural. Os polipeptídeos terapêuticos podem incluir, sem limitação, Insulina, Acetato de Pranlintida, Hormônio de Crescimento (GH, Growth Hormone), Somatotropina, Mecasermina, Rinfabato Mecasermina, Fator VIII, Fator IX, Antitrombina III (AT-ΠΙ), Proteína-C, beta-Glico-cerebrosidase, Alglicosidase-alfa, Laronidase, Idursulfase, Galsulfase, Agalsidase-beta, Inibidor de alfa-1-Proteinase, Lactase, Enzimas Pancreáticas (lipase, amilase, protease), Adenosina-deaminase, imunoglobulinas, Albumina Humana, Eritropoietina, Darbepoetina-alfa, Filgrastim, Pegfilgrastim, Sargramostim, Oprelvecina, Hormônio Estimulante de Folículo (FSH, Follicle-Stimulating

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Hormone) Humano, Gonadotropina Coriônica Humana (HCG, Human Chorionic Gonadotropin), Lutropina-alfa, Interferon-alta Tipo I, Interferonalfa2a, Interferon-alfa2b, Interferon-alfa3, Interferon-betala, Interferonbetalb, Interferon-gamalb, Aldesleucina, Alteplase, Reteplase, Tenecteplase, Urocinase, Fator Vila, Drotrecogina-alfa, Calcitonina de Salmão, Teriparatida, Exenatida, Octreotida, Dibotermina-alfa, Proteína Morfogênica Óssea Recombinante Humana 7 (rhBMP, Recombinant Human Bone Morphogenic Protein), Acetato de Histrelina, Palifermina, Becaplermina, Tripsina, Nesiritida, Toxina Botulínica Tipo A, Toxina Botulínica Tipo B, Colagenase, Desoxirribonuclease Humana I, Domase-alfa, Hialuronidase (bovina, ovina), Hialuronidase (recombinante humana, Papaína, LAsparaginase, Rasburicase, Lepirudina, Bivalirudina, Estreptocinase, Anistreplase, Bevacizumabe, Cetuximabe, Panitumumabe, Alentuzumabe, Rituximabe, Trastuzumabe, Abatacepte, Anacinra, Adalimumabe, Etanercepte, Infliximabe, Alefacepte, Efalizumabe, Natalizumabe, Eculizumabe, Globulina Antitimócito (coelho), Basiliximabe, Daclizumabe, Muromonabe-CD3, Omalizumabe, Palivizumabe, Enfuvirtide, Abciximabe, Pegvisomanto, Fab Imune Polivalente Anti-Crotalidae (ovino), Fab de Soro Imune Antidigoxina (ovino), Ranibizumabe, Denileucina diftitox, Ibritumomabe tiuxetana, Gentuzumabe ozogamicina, Tositumomabe, Antígeno de Superfície de Hepatite B (HBsAg, Hepatitis B Surface Antigen), Vacina contra HPV, OspA, Imunoglobulina G98 Rhophylac Anti-FatorRhesus (Rh), Derivado de Proteína Recombinante Purificada (RPPD, Recombinant Purified Protein Derivative), Glucagon, Hormônio Liberador de Hormônio de Crescimento (GHRH, Growth Hormone Releasing Hormone), Secretina, Hormônio Estimulante da Tireoide (TSH, Thyroid Stimulating Hormone), Tirotropina, Capromabe Pendetide, Satumomabe Pendetida, Arcitumomabe, Nofetumomabe, Apcitida, Pentetato de Inciromabe, Fanolesomabe-Tecnécio, Antigenos de HIV, Antigenos de Hepatite.

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32/130 [0063] Os constructos da presente invenção podem incluir um promotor heterólogo. Os termos “promotor heterólogo”, “promotor”, “região promotora”, ou “sequência promotora” referem-se, em geral, às regiões regulatórias transcricionais no lado 5’ ou 3’ do sítio de inserção, ou dentro da região codificante da sequência codificante heteróloga, ou dentro de introns. Tipicamente, um promotor é uma região regulatória de DNA capaz de ligação à RNA-polimerase em uma célula e capaz de iniciação de transcrição de uma sequência codificante a jusante (direção 3’). A típica região promotora 5’ está ligada à sua terminação 3’ pelo sítio de transcrição e estende-se a montante (direção 5’) para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários(as) para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do nível basal. Dentro da sequência promotora está um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido pelo mapeamento com nuclease Sl), e também domínios de ligação de proteína (sequências consenso) responsáveis pela ligação de RNA-polimerase. O promotor heterólogo pode ser o promotor endógeno de um gene endógeno modificado para incluir as sequências heterólogas de motivo-R, uORF, e/ou sequência regulatória 5’ (isto é, separadamente ou em combinação) aqui descritas usando, por exemplo, tecnologias de editoração de genoma. O promotor heterólogo pode estar nativamente associado com a 5’ UTR recomendada, mas pode estar funcionalmente conectado a uma sequência codificante heteróloga.

[0064] Em algumas modalidades, o sítio de inserção (incluindo ou não uma sequência codificante heteróloga) está funcionalmente conectado ao promotor. Como aqui usado, um polinucleotídeo está “funcionalmente conectado” (“funcionalmente ligado”) quando ele é posto em relação funcional com uma segunda sequência de polinucleotídeo. Por exemplo, um promotor está funcionalmente ligado a um sítio de inserção ou sequência codificante heteróloga dentro do sítio de inserção se o promotor está conectado à sequência codificante ou ao sítio de inserção de modo que ele

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33/130 pode afetar a transcrição da sequência codificante. Em várias modalidades, os polinucleotídeos podem estar funcionalmente ligados a pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 10 promotores.

[0065] Os promotores úteis na prática da presente invenção incluem, mas não são limitados a, promotores constitutivos, induzíveis, temporariamente regulados, desenvolvimentalmente regulados, quimicamente regulados, tecido-preferidos e tecido-específicos. Os promotores adequados para expressão em plantas incluem, sem limitação, o promotor TBF1 de qualquer espécie de planta incluindo Arabidopsis, o promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor, ubiquitina, promotor constitutivo críptico tCUP, o promotor Rsyn7, promotores induzíveis por patógenos, o promotor In2-2 de mais, o promotor PR-la de tabaco, promotores induzíveis por glicocorticoides, promotores induzíveis por estrogênios e promotores induzíveis por tetraciclina e reprimíveis por tetraciclina. Outros promotores incluem as sequências promotoras T3, T7 e SP6, que são com frequência usadas para transcrição in vitro de RNA. Em células de mamíferos, os promotores típicos incluem, sem limitação, promotores do vírus de sarcoma de Rous (RSV, Rous Sarcoma Virus'), do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1, Human Immunodeficiency Virus), do citomegalovírus (CMV, Cytomegalovirus), do vírus SV40, e semelhantes e também o promotor fator de alongamento transcricional EF-Ια ou promotor ubiquitina. Aquelas pessoas versadas na técnica estão familiarizadas com uma ampla variedade de promotores adicionais para uso em vários tipos de células. Em algumas modalidades, o promotor heterólogo inclui um promotor de planta. Em algumas modalidades, o promotor heterólogo inclui um promotor de planta induzível por um patógeno de planta ou por um indutor químico. O promotor heterólogo pode ser um promotor semente-específico ou fruta-específico.

[0066] Os constructos de DNA da presente invenção podem incluir

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34/130 um promotor heterólogo funcionalmente ligado a um polinucleotídeo de DNA codificante de um transcrito de RNA compreendendo uma sequência regulatória 5’ localizada 5’ a uma sequência codificante heteróloga que codifica um polipeptídeo ÁtNPR compreendendo a SEQ ID NO: 475, em que a sequência regulatória 5’ compreende a SEQ ID NO: 476 (uORFstbfi)· Em algumas modalidades, o promotor heterólogo de tais constructos pode incluir a SEQ ID NO: 477 (promotor 35S) ou a SEQ ID NO: 478 (TBFlp). Em algumas modalidades, tais constructos de DNA podem incluir a SEQ ID NO: 479 (35S:uORFs_TBFi-AtNPRl) ou a SEQ ID NO: 480 (TBF1_P:uORFs_TbfiAtNPRl).

[0067] São providos vetores incluindo qualquer um dos constructos aqui descritos. O termo “vetor” é pretendido para se referir a um polinucleotídeo capaz de transportar outro polinucleotídeo ao qual está ligado. Em algumas modalidades, o vetor pode ser um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular à qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vector é um vetor viral (por exemplo, retrovirus defectivos em replicação, vírus do herpes simples defective em replicação, lentivírus defectivos em replicação, adenovirus defectivos em replicação e vírus adenoassociados defectivos em replicação), no qual segmentos de polinucleotídeo adicionais podem ser ligados dentro do genoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira para dentro da qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores podem estar integrados dentro do genoma de uma célula hospedeira após introdução para dentro da célula hospedeira, e, com isso, são replicados juntamente com o genoma da célula hospedeira, como alguns vetores virais ou transposons. Minicromossomos de plantas são também incluídos como vetores. Os vetores podem compreender elementos genéticos, como aqueles que conferem resistência a determinados fármacos

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35/130 ou produtos químicos.

[0068] São providas células incluindo qualquer um dos constructos ou vetores aqui descritos. “Células” adequadas que podem ser usadas de acordo com a presente invenção incluem células eucarióticas. Células eucarióticas adequadas incluem, sem limitação, células de plantas, células fúngicas, e células de animais como células de organismos modelos populares incluindo, mas não limitados a, Arabidopsis thaliana. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de planta como, sem limitação, uma célula de planta de milho, uma célula de planta de feijão, uma célula de planta de arroz, uma célula de planta de soja, uma célula de planta de algodão, uma célula de planta de tabaco, uma célula de tamareira, uma célula de trigo, uma célula de tomateiro, uma célula de bananeira, uma célula de planta de batata, uma célula de pimenteira, uma célula de planta de musgo, uma célula de planta de salsa, uma célula de planta cítrica, uma célula de planta de maçã, uma célula de morangueiro, uma célula de planta de colza, uma célula de planta de repolho, uma célula de planta de mandioca, e uma célula de cafeeiro.

[0069] São providas plantas incluindo qualquer um(a) dos(as) constructos de DNA, vetores, ou células aqui descritos(as). As plantas podem ser transgênicas ou transientemente transformadas com os constructos de DNA ou vetores aqui descritos. Em algumas modalidades, a planta pode incluir, sem limitação, uma planta de milho, uma planta de feijão, uma planta de arroz, uma planta de soja, uma planta de algodão, uma planta de tabaco, uma planta de tamareira, uma planta de trigo, um tomateiro, uma bananeira, uma planta de batata, uma pimenteira, uma planta de musgo, uma planta de salsa, uma planta cítrica, uma planta de maçã, um morangueiro, uma planta de colza, uma planta de repolho, uma planta de mandioca, e um cafeeiro.

[0070] São providos métodos para controle da expressão de um polipeptídeo heterólogo em uma célula. Os métodos podem incluir introduzir qualquer um dos constructos ou vetores aqui descritos para dentro da célula.

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Preferivelmente, os constructos e vetores incluem uma sequência codificante heteróloga que codifica um polipeptídeo heterólogo. Como aqui usado, “introduzir” descreve um processo pelo qual polinucleotídeos exógenos (por exemplo, DNA ou RNA) são introduzidos para dentro de uma célula recipiente. Métodos de introduzir polinucleotídeos para dentro de uma célula são conhecidos na técnica e podem incluir, sem limitação, métodos de microinjeção, transformação, e transfecção. Transformação ou transfecção podem ocorrer sob condições naturais ou artificiais de acordo com vários métodos bem conhecidos na técnica, e podem basear-se em qualquer método para a inserção de sequências de ácidos nucleicos estranhas para dentro de uma célula hospedeira. O método para transformação ou transfecção é selecionado com base no tipo de célula hospedeira sendo transformada e pode incluir, mas não é limitado a, método de imersão floral, transformação mediada por Agrobacterium, infecção por bacteriófago ou infecção viral, eletroporação, choque térmico, lipofecção, e bombardeio de partículas. Microinjeção de polinucleotídeos pode também ser usada para introduzir polinucleotídeos e/ou proteínas para dentro de células.

[0071] Métodos de transferência de gene viral e não viral convencionais podem ser usados para introduzir polinucleotídeos para dentro de células ou de tecidos-alvo. Sistemas de distribuição de polinucleotídeo não viral incluem DNAs plasmidiais, RNA, ácido nucleico nu, e ácido nucleico complexado com um veículo de distribuição, como um lipossoma. Métodos de distribuição não viral de ácidos nucleicos incluem o método de imersão floral, transformação mediada por Agrobacterium, lipofecção, nucleofecção, microinjeção, biolística, virossomas, lipossomas, imunolipossomas, conjugados de policátion ou lipídio:ácido nucleico, DNA nu, virions artificiais, e absorção de DNA intensificada por agente. Lipofecção é descrita por exemplo, em Patentes U.S. n°s 5.049.386, 4.946.787; e 4.897.355) e reagentes de lipofecção são vendidos comercialmente (por exemplo,

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Transfectam™ e Lipofectin™). Lipídios catiônicos e neutros que são adequados para lipofecção de polinucleotídeos por reconhecimento de receptor eficiente incluem aqueles de Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024. Distribuição pode ser para células (por exemplo administração in vitro ou ex vivo) ou para tecidos-alvo (por exemplo administração in vivo).

[0072] Os métodos podem também incluir, ainda, etapas adicionais usadas na produção de polipeptídeos recombinantes. Por exemplo, os métodos podem incluir purificar o polipeptídeo heterólogo da célula. O termo “purificar” refere-se ao processo de garantir que o polipeptídeo heterólogo esteja substancial ou essencialmente isento de componentes celulares e de outras impurezas. A purificação de polipeptídeos é tipicamente realizada usando técnicas de biologia molecular e de química analítica como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta eficiência. Métodos de purificar proteína são bem conhecidos por aquelas pessoas versadas na técnica. Um polipeptídeo heterólogo “purificado” significa que o polipeptídeo heterólogo é pelo menos 85% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, e com a máxima preferência pelo menos 99% puro.

[0073] Os métodos podem também incluir a etapa de formular o polipeptídeo heterólogo como um agente terapêutico para administração a um sujeito. Como aqui usado, o termo “sujeito” e “paciente” são usados intercambiavelmente e referem-se tanto aos animais humanos quanto aos animais não humanos. O termo “animais não humanos” da revelação inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelhas, cão, gato, cavalo, vaca, camundongos, frangos, anfíbios, répteis, e semelhantes. Preferivelmente, o sujeito é um paciente humano. Mais preferivelmente, o sujeito é um paciente humano que necessita do polipeptídeo heterólogo.

[0074] A presente revelação não é limitada aos detalhes específicos de

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38/130 construção, disposição de componentes, ou etapas de método aqui descritos. As composições e os métodos aqui revelados(as) são capazes de ser feitos(as), praticados (as), usados(as), realizados(as) e/ou formados(as) em várias maneiras que serão evidentes para uma pessoa versada na técnica considerando-se a revelação que segue. A fraseologia e a terminologia aqui usadas são para apenas o propósito de descrição e não devem ser consideradas como limitadoras do escopo das reivindicações. Indicadores ordinais, como primeira, segunda, e terceira, como usados na descrição e nas reivindicações referem-se a várias estruturas ou etapas de método, não se destinam a serem interpretados para indicar quaisquer estruturas ou etapas específicas, ou qualquer ordem ou configuração específica para tais estruturas ou etapas. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada salvo indicação em contrário aqui ou diferentemente claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um dos ou de todos os exemplos, ou de linguagem exemplificadora (por exemplo, “como”) aqui provido(a), é pretendido meramente para facilitar a revelação e não implica qualquer limitação do escopo da revelação a não ser que seja reivindicado de outra maneira. Nenhuma linguagem no relatório descritivo, e nenhumas estruturas mostradas nos desenhos, devem ser interpretadas como indicando que qualquer elemento não reivindicado é essencial para a prática do assunto revelado. O uso aqui dos termos “incluindo”, “compreendendo”, ou “tendo”, e variações dos mesmos, destina-se a abranger os elementos listados posteriormente e equivalentes dos mesmos, e também elementos adicionais. Modalidades citadas como “incluindo”, “compreendendo”, ou “tendo” determinados elementos são também consideradas como “consistindo essencialmente naqueles” e “consistindo naqueles” determinados elementos.

[0075] Citações aqui de faixas de valores são meramente pretendidas para servirem como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado caindo dentro da faixa, salvo indicação em contrário aqui,

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39/130 e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente aqui citado. Por exemplo, se uma faixa de concentrações é declarada como de 1% a 50%, é pretendido que os valores como de 2% a 40%, de 10% a 30%, ou de 1% a 3%, etc., estejam expressamente enumerados neste relatório descritivo. Estes são apenas exemplos do que é especificamente pretendido, e todas as possíveis combinações de valores numéricos entre e incluindo o valor mais baixo e o valor mais alto enumerados são para serem considerados como sendo expressamente declarados nesta revelação. O uso da palavra “cerca de” para descrever uma quantidade ou faixa de quantidades citada específica destina-se a indicar que valores muito próximos da quantidade citada estão incluídos naquela quantidade, como valores que poderíam ou naturalmente seriam considerados devido às tolerâncias de fabricação, ao erro instrumental e humano na realização das medições, e semelhantes. Todas as percentagem referindo-se às quantidades são em peso salvo indicação em contrário.

[0076] Não se admite que qualquer referência, incluindo qualquer documento de patente ou de não patente citado neste relatório descritivo, constitua a técnica anterior. Em particular, será entendido, salvo declaração em contrário, que referência a qualquer documento aqui não constitui uma admissão de que qualquer um destes documentos forme parte do conhecimento geral comum na técnica nos Estados Unidos ou em qualquer outro país. Qualquer discussão das referências declara o que seus autores afirmam, e o requerente reserva-se o direito de desafiar a acurácia e a pertinência de qualquer um dos documentos aqui citados. Todas as referências aqui citadas são completamente incorporadas como referências em suas totalidades, salvo explicitamente indicado em contrário. A presente revelação deve prevalecer em qualquer caso no qual haja quaisquer disparidades entre quaisquer definições e/ou descrição encontradas nas referências citadas.

[0077] Salvo especificado ou indicado em contrário pelo contexto, os

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40/130 termos “um”, “uma”, “o” e “a” significam “um(a) ou mais”. Por exemplo, “uma proteína” ou “um RNA” deve ser interpretado com o significado de “uma ou mais proteínas” ou “um ou mais RNAs”, respectivamente. Como aqui usados, “cerca de”, “aproximadamente”, “substancialmente”, e “significativamente” devem ser entendidos pelas pessoas comumente versadas na técnica e variarão em alguma extensão dependo do contexto no qual são usados. Se houver usos destes termos que não são claros para as pessoas versadas na técnica dado o contexto no qual são usados, “cerca de” e “aproximadamente” significarão mais ou menos <10% do termo específico e “substancialmente” e “significativamente” significarão mais ou menos >10% do termo específico.

[0078] Os seguintes exemplos destinam-se apenas para serem ilustrativos e não se destinam para serem limitadores do escopo da invenção ou das reivindicações anexadas.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Revelação de reprogramação traducional como uma camada fundamental de regulação imune em plantas [0079] Na ausência de células imunes especializadas, é bem entendida a necessidade das plantas para reprogramarem a transcrição com o propósito de transição das atividades relacionadas ao crescimento para as atividades relacionadas à defesa^{1, 2}. Entretanto, pouco se sabe sobre as alterações traducionais que ocorrem durante a indução imune. Com o uso de Ribosome Footprinting (RF), realizamos o perfilamento de translatoma global em Arabidopsis exposta ao padrão molecular associado a micróbios (MAMP, Microbe-Associated Molecular Pattern), elf 18. Descobrimos que durante a imunidade disparada por padrões (PTI, Pattern-Triggered Immunity), a tradução foi rigorosamente regulada e fracamente correlacionada com a transcrição. A identificação de genes com eficiência traducional (TE, Translational Efficiency) alterada resultou na descoberta de novos reguladores

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41/130 desta resposta imune. Investigação adicional destes genes mostrou que as características da sequência de mRNA, ao invés da abundância da sequência de mRNA, são os determinantes majoritários das alterações em TE observadas. Nas sequências líderes 5’ de transcritos com TE aumentada, descobrimos uma sequência consenso de mRNA elevadamente enriquecida, motivo-R, consistindo predominantemente em purinas. Mostramos que o motivo-R regula a tradução em resposta à indução de PTI mediante a interação com proteínas ligantes de poli(A). Portanto, este estudo provê não apenas forte evidência, mas também um mecanismo molecular para a reprogramação traducional global durante PTI em plantas.

Resultados [0080] Após o desafio com patógenos, a primeira linha de defesa ativa tanto em plantas quanto em animais envolve o reconhecimento de padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs) pelos receptores reconhecedores de padrões (PRRs), como o Arabidopsis FLS2 para a flagelina bacteriana (epítopo flg22) e EFR para o fator de alongamento de tradução bacteriana EF-Tu (epítopos elfl8 e elf26)³. Em plantas, a ativação de PRRs resulta em imunidade disparada por padrões (PTI) distinguida por uma série de alterações celulares, incluindo uma explosão oxidativa, ativação de MAPK, biossíntese de etileno, transcrição de genes de defesa e resistência intensificada aos patógenos⁴. As alterações transcricionais associadas à PTI têm sido estudadas extensivamente mediante tanto abordagens genéticas moleculares quanto perfilamento de expressão de genoma completo⁵'⁷. Entretanto nosso relatório prévio mostrou que adicionalmente ao controle transcricional, a tradução de um fator de transcrição (TF, Transcription Factor) imune-chave, TBF1, é rapidamente induzida durante a resposta de defesa¹. A tradução de TBF1 é regulada por duas fases de leitura abertas a montante (uORFs, Upstream Open Reading Frames) dentro do TBF1 mRNA. O efeito inibitório das uORFs sobre a tradução da ORF majoritária (mORF) a

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42/130 jusante de TBF1 foi rapidamente aliviado após indução imune. Similar ao TBF1, foi descoberto que a tradução do TF imune de Caenorhabditis elegans, ZIP-2, é regulada por 3 uORFs⁸, sugerindo que a desrepressão da tradução de mRNAs pré-existentes de TFs imunes-chave pode ser uma estratégia comum para a resposta rápida ao desafio com patógenos. Além da tradução de TBF1 mediada por uORF, também tem sido mostrado que a perturbação de uma aspartil-tRNA-sintetase por ácido β-aminobutírico (BABA), um aminoácido não proteinogênico, inicia a resistência de amplo espectro às doenças em plantas⁹. Estes estudos sugerem o controle traducional como uma etapa regulatória majoritária em respostas imunes.

[0081] Para monitorar as alterações traducionais durante as respostas imunes em plantas, geramos uma linhagem transgênica repórter Arabidopsis 35S:uORFstbfi-LUC (Figura IA). Descobrimos que no background de tipo selvagem (WT, Wild Type), a atividade repórter foi responsiva ao MAMP, elfl8, com indução de pico ocorrendo uma hora pós-infiltração (hpi) (Figura 1B e Figura 5A), independente das alterações transcricionais (Figura 5B). Esta indução traducional foi comprometida no mutante efr-1, defective no receptor de elfl8, EFR⁵ (Figura 1B e Figura 5C), indicando que o elfl8 regula a tradução de repórter 35S:uORFstbfi-LUC mediante a ativação de seu receptor de superfície celular. Consistente com o estudo de repórter, o perfilamento polissomal mostrou que na ausência de alterações na atividade traducional total (Figura 1C e Figura 5D), o TBF1 mRNA endógeno teve um aumento significativo em associação com as frações polissomais após o tratamento com elfl8 em WT, mas não no mutante efr-1 (Figura 1D e Figura 5E).

[0082] Usando condições otimizadas com o repórter 35S:uORFstbfiLUC, coletamos tecidos de folha de planta tratados quer simuladamente (Mock) quer com elfl8 para gerar bibliotecas para ribosome footprinting-seq (RF-Mock (Simulado) versus RF-elfl8) e RNA-seq (RS-Mock (Simulado)

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43/130 versus RS-elfl8) (Figura IE) baseadas em um protocolo modificado a partir de métodos previamente publicados¹⁰'¹³ (todas as partes das Figuras 6-8, Tabela A). A estratégia de status traducional global, que envolve a contagem de fragmentos de mRNA capturados pelo ribossomo mediante sequenciamento (Ribo-seq) versus medição de mRNA disponível usando RNA-seq, foi usada para determinar a eficiência traducional (TE, Translational Efficiency) de mRNA. Esta estratégia tem sido previamente aplicada para estudar a síntese de proteínas sob diferentes condições fisiológicas, como respostas da planta à luz, à hipóxia, à estiagem e ao etileno¹¹'¹⁴.

Tabela A: Leituras após cada processamento

RS-Mock RS-elfl8 RF-Mock	RF-elfl8
Nfimerobrafòde Repl 47.065.199 58,742,659 133.768.593 ||||||||||||||||||||||||BibÍÍÍÍlÍÍ:ÍÍIÍIlBÍIÍÍiÍÍBÍOÓBÍBiÍiiiÍiÍÍBÍÍÍÍIÍÍ||	116.236.853 iiiiiililllii

Leitura aprovadas Repl Rep2	ΙΙΙΪΙΙΙΙΙΪΙΐΙ	llilllliflll		63.096.238 ίίίκΛ
Rep2	lllliBiiiiii	ΙΙΐΙΪΪΙΪίΙΐΙΙ	lliBiifiiiii	liSliliiii

[0083] Descobrimos que após o tratamento com elfl8, 943 e 676 genes foram transcricionalmente induzidos (RSup) e reprimidos (RSdn), respectivamente, baseado em análise diferencial de alteração em vezes no transcriptoma (RSfc; Figura 8B). Enriquecimento de termos de Ontologia Gênica (GO, Gene Ontology) para genes RSup incluiu resposta de defesa e resposta imune (Tabela B), enquanto que nenhum enriquecimento de termos de GO foi descoberto para genes RSdn. Em paralelo, análise de diferenciação do translatoma (RFfc) descobriu 523 genes com tradução aumentada (RFup) e 43 genes mostrando tradução diminuída (RFdn) após tratamento com elfl8 (Figura 8B). A faixa de alterações em vezes de RF (0,177 a 40,5) foi muito mais estreita do que aquela das alterações em vezes de RS (0,0232 a 160), sugerindo que a tradução é mais rigorosamente regulada do que a transcrição

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44/130 durante PTI (valor de p = 3,22E-83; Figura 2A). Então calculamos os valores de TE de acordo com uma fórmula previamente relatada¹⁵ (Figuras 8B e 9B), usando o TBF1 endógeno como um controle positivo. TE de TBF1 foi determinada pela contagem de leituras para seu éxon2 para distinguir das leituras para o repórter 35S:uORFstbfi-LUC contendo o éxonl do gene TBF1. Consistente com o ensaio com repórter LUC e os dados de fracionamento polissomal (Figuras 5A a 5E), a TE para TBF1 endógeno foi também aumentada após o tratamento com elfl8 em nossa análise traducional (Figura 9C).

Tabela B: Análise de enriquecimento de termos de GO para genes suprarregulados RS___ [Termo de GO | Frequência Observada | Valor de p €50:0009743 resposta ao estímulo de carboidrato 8,40%· 2.02E4G

31.50 ^31

G0:0010033 resposta à substância orgânica 14,40% 1.57E-24

GG:0006952 resposta de defesa 10,50% 1.77E-20

G0:0002376 processo de sistema imune 5.80% 273E-16

G0:0051707 resposta a outro organismo 7,70% 142Ε-14

GO:OÜ45W_ÍW^—5,18% W* (30:0051704 processo de multiorganismos 7,80% 4.14E-14

7,90%

G0:0009620 resposta a fungo 3,80%' 5.78E-12 [0084] Em contraste com a forte correlação entre os níveis de transcrição e de tradução observados dentro da mesma amostra (valores de correlação de Pearson r = 0,91 para Mock (Simulado) e 0,89 para elfl8; Figura 2B), as alterações em vezes (elfl8/Mock (Simulado)) em transcrição e tradução foram fracamente correlacionadas (r = 0,41; Figura 2C), indicando que a indução de PIT envolve uma mudança (shift) significativa em TE global. Dentre aqueles mRNAs com TE mudada, 448 tiveram TEfc aumentada e 389 genes apresentaram TEfc diminuída (Izl > 1,5). Não foi descoberta correlação entre TEfc e comprimento de mRNA ou composição de GC (Figura 9D). Mais importante, foi descoberta pequena correlação entre as

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45/130 alterações em TE e a abundância de mRNA (r = 0,19; Figuras 2D e 2E), consistente com os estudos realizados em outros sistemas^13,15. Portanto, tanto a transcrição quanto a TE estão envolvidas no controle da produção de proteínas durante PTI. Nossos resultados sugerem que as características de mRNA, sem considerar a abundância de mRNA, podem ser os determinantes majoritários de TE.

[0085] Dentre os genes com TE aumentada (z > 1.5) após tratamento com elfl8, descobrimos enriquecimento moderado de geles ligados às vias de sinalização de receptores de superfície celular (Tabela C). A carência de enriquecimento de termos de GO imuno-relacionados é consistente com o fato de que os genes com TE alterada não foram, em sua maioria, transcricionalmente regulados e, por conseguinte, provavelmente não têm sido identificados como “relacionados à defesa” em estudos prévios, que têm principalmente focalizado as alterações transcricionais. Entretanto, por inspeção manual da lista de genes com TE alterada, descobrimos quer um componente conhecido quer um homólogo de um componente conhecido de quase cada etapa das vias de sinalização de PTI mediada por Pep de padrão molecular associado ao dano e ao etileno^7,16,17 (Figuras 2D e 2F).

Tabela C: Enriquecimento de termos de GO encontrados em genes com TE aumentada (TE-up) em resposta ao tratamento com elf!8__

Termo de GO | Frequência Observada | Valor dep

GO:(MX)7 í sinal ligado ao receptor de superfície celular 2.80% 5JQÍ&E-G3:

GO;O0i6310 fasforilação 7,813¾ 7₊05B-()3i [0086] Para demonstrar que a medição de TE em um método eficaz para descobrir genes novos envolvidos na via de sinalização de elfl8, testamos mutantes de cinco genes com TE alterada para a resistência induzida por elfl8 contra Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm

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ES4326). EIN4 e ERSI, que pertencem à família de genes relacionados ao receptor de etileno de Arabidopsis^, e EICBP.B, que codifica uma proteína de ligação de calmodulina induzida por etileno, mostraram TE aumentada após tratamento com elfl8. WEI7, envolvido no aumento de auxina mediado por etileno¹⁹, e ERF7, um homólogo do gene de fator de transcrição (TF) responsivo ao etileno, ERF1²⁰, mostraram TE diminuída em resposta ao tratamento com elfl8. Descobrimos que o pré-tratamento com elfl8 induziu resistência a Psm ES4326 em WT mas não em efr-1 \ dentre os cinco mutantes testados, ersl-10 e wei7-4 mostraram responsividade ao elfl8 similar ao WT, enquanto que ein4-l, erf7, e eicbp.b apresentaram insensibilidade à resistência induzida por elfl8 contra Psm ES4326 (Figura 2G). O fenótipo mutante de ein4-l, erf7, e eicbp.b foi improvavelmente devido a um defeito em atividade de MAPK3/6 ou deposição de calose porque foi descoberto que ambos estão intactos nestes mutantes (Figuras 10A e 10B).

[0087] Com o uso de um sistema de luciferase dupla (dual-LUC) que permite o cálculo de TE usando uma luciferase de Renilla de referência (RLUC, Reference Renilla Luciferase) conduzido pelo mesmo promotor constitutivo 35S que o do gene de teste (Figura 2H), descobrimos que 3’ UTR de EIN4 foi responsável pelo aumento de TE induzido por elfl8 (Figura 21 e Figura 10C). Além disso, confirmamos que o aumento de TE induzido por elfl8 em EIN4 foi dependente do receptor de elfl8, EFR (Figura 2J). Em contraste ao EIN4, ERF7 e EICBP.B são conhecidos por estarem envolvidos na resposta geral ao etileno e, por conseguinte, podem funcionar em uma via de etileno específica para defesa. A descoberta de EIN4, ERF7 e EICBP.B como novos componentes de PTI baseados nas alterações de TE deles sugere que pode haver mais reguladores novos de PTI a serem descobertos na lista de genes com TE alterada, e enfatiza a utilidade desta abordagem.

[0088] Para determinar os mecanismos potenciais que governam a tradução específica para PTI, estudamos as características de sequência de

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47/130 mRNA daqueles transcritos com alterações em TE disparadas por elfl8. Com base em nosso estudo prévio de TBF1, cuja tradução é regulada por duas uORFs¹, primeiro pesquisamos a presença de uORFs (Figuras 11A e 11B). Além de TBF1, uORFs têm estado associadas aos genes de funções celulares diferentes tanto em plantas²¹ quanto em animais²². Para investigar o controle traducional mediado por uORF em resposta ao tratamento com elfl8, a razão entre RF RPKM de mORFs e suas uORFs cognatas foi calculada para todos os genes contendo uORF a partir de tratamento Mock (Simulado) e de tratamento com elfl8. Descobrimos nenhuma correlação total direta nem inversa entre as leituras de uORFs e de mORFs (r = 0,23-0,26), indicando que uma uORF pode ter um efeito neutro, positivo ou negativo sobre a tradução de sua mORF a jusante (Figura 11C). Detectamos 152 uORFs pertencendo a 150 genes mostrando uma ribo-shift up (isto é, razão aumentada de mORF/uORF) e 132 uORFs pertencendo a 126 genes mostrando uma riboshift down (isto é, razão diminuída de mORF/uORF) em resposta ao tratamento com elfl8 (Figura 11D). Curiosamente, estes genes com ribo-shift induzida por elfl8 coincidem um pouco com aqueles encontrado em resposta à hipóxia¹¹ (Figuras 1 IE e 11F), sugerindo que a tradução mediada por uORF pode ser sinal-específica. Então focalizamos aqueles genes com TEfc alterada em resposta ao tratamento com elfl8 e descobrimos 36 deles contendo pelo menos uma uORF com ribo-shift significativa em resposta ao tratamento com elfl8. Para estes 36 genes, o antagonismo entre a tradução mediada por uORF e a tradução mediada por mORF pode explicar as alterações em TE observadas em resposta ao tratamento com elfl8, conforme observado para TBF1. As sequências 5 ’ UTR e uORF em vários genes com TE são mostradas na Tabela 1.

Tabela 1: Sequências de UTR e uORF com TE ________________

ID do Transcrito

Alias

Nome Completo

Característica

Escore

Sequência

Sequência de Peptídeo

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AT1G12580 .1	PEPKR1	Cinase 1 relacionada à fosfoenolpiruvatocarboxilase	5’ UTR	TEup	GAGAGAGGAC TGGGTCTGGTC TCTTCGCTGCA ACCTATAGCTG TTGTTTGCTCT TCGACGGGATT CTCACTACTCT TTTGCCAAAAA AAAGAGATCG GAGGTTCCGA AGGTGAATGC AGCTTGCGATT TCATAGAAAA GAAGATTCGTT TGCTGGATTAG GCTTATTTGTG TATCATAGCTT TGAGGTTTTAA CTGAGATTTAT TGATAGTGGA ACTTAGGTTTT CGAGAGGTGT GAACAGTTGG GTAT (SEQ ID NO: 77)
AT1G12580 .1	PEPKR1	Cinase 1 relacionada à fosfoenolpiruvatocarboxilase	AT1G1258O.1_ 1	Ribo-shift Up	ATGCAGCTTGC GATTTCATAG (SEQ ID NO: 39)	MQLAIS* (SEQ ID NO: 1)
AT1G16700 .1		Ferredoxina alfahelicoidal	5’ UTR	TEdown	AAATTAAGAG ACATCTGATCG AATTTTGTTCC GACGACCGTG AATCACCAGC AAAGGATTCG TGTCAATGTTC TTGTGAGATCG AACTTTCTCTG GGTTCGTGCAG AAGCTTTGCTT TTTTGAGTATC GCGTTTAAGGC ACATCGAAGA AGAGAGACCC TAATTTGATAT TTTGAGTTCTA TCG (SEQ ID NO: 78)
AT1G16700 .1		Ferredoxina alfahelicoidal	AT1G167OO.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGTTCTTGTG A (SEQ ID NO: 40)	MFL* (SEQ ID NO: 2)

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AT1G19270	DAI	DAI	5’ UTR	TEdown	CGTGGGGAAC GTTTTTTCCTG GAAGAAGAAG AAGAAGAGCT CAACAAGCTC AACGACCAAA AAACTTCGGA CACGAAGACT TTTTAATTCAT TTCTCCTCTTT TGTTTTTTTCG TTCCAAAATAT TCGATACTCTC GATCTCTTCTT CGTGATCCTCA TTAAATAAAA ATACGATTTTT ATTCTTTTTTT GTGAGTGCAC CAAATTTTTTG ACTTTGGATTA GCGTAGAATTC AAGCACATTCT GGGTTTATTCG TGTATGAGTAG ACATTGATTTT GTCAAAGTTGC
.1					ATTCTTTTATA TAAAAAAAGT TTAATTTCCTT TTTTCTTTTCTT TTCTCTTTTTTT TTTTTTTCCCC CATGTTATAGA TTCTTCCCCAA ATTTTGAAGAA AGGAGAGAAC TAAAGAGTCCT TTTTGAGATTC TTTTGCTGCTT CCCTTGCTTGA TTAGATCATTT TTGTGATTCTG GATTTTGTGGG GGTTTCGTGAA GCTTATTGGGA TCTTATCTGAT TCAGGATTTTC TCAAGGCTGC ATTGCCGTATG AGCAGATAGT TTTATTTAGGC ATT (SEQ ID NO: 79)
AT1G19270	DAI	DAI	AT1G19270.1	Ribo-shift	ATGAGCAGAT	MSR*
.1	3	Down	AG (SEQ ID NO:	(SEQ ID
				41)	NO: 3)

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AT1G30330 .1

ARF6

Fator 6 de resposta às auxinas

5’ UTR

TEdown

CTTCTTCTTCT GATTCTCATTT CAAATAAGAG AGAGAGAGAG AGAAGTAAGT AAAACTTTAGC AGAGAGAAGA ATAAACAAAT AATTATAGCAC CGTCACGTCGC CGCCGTATTTC GTTACCGGAA AAAAAAAATC ATTCTTCAACA TAAAAATAAA AACAGTCTCTT TCTTTCTATCT TTGTCTATCTT TGATTATTCTC TGTGTACCCAT GTTCTGCAACA GTTGAGCAAG TGCATGCCCCA TATCTCTCTGT TTCTCATTTCC CGATCTTTGCA TTAATCATATA CTTCGCCTGAG ATCTCGATTAA GCCAGCTTATA GAAGAAGAAA CGGCACCAGC TTCTGTCGTTT TAGTTAGCTCG AGATCTGTGTT TCTTTTTTTCTT GGCTTCTGAGC TTTTGGCGGTG GTGGGTTTTTC TGGAGAAACC CAAACGACTA TCAAAGTTTTG TTTTTTACAAT TTTAAGTGGGA GTTATGAGTGG GGTGGATTAA GTAAGTTACA AGTATGAAGG AGTTGAAGATT CGAAGAAGCG GTTTTGAAGTC GGCGAGACCA AGATTGCGAG CTTATTTGGCT GATGATTTATT TCAGGGAAGA AGAAATAAAT CTGTTTTTTTT AGGGTTTTTAG ATTTGGTTGGT GAATGGGTGG GAGGTGGAGG GAAACAGTTA AAAAAGTTAT

GCTTTTAGTGT CTCTTCTTCAT AATTACATTTG

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AT1G30330 .1	ARF6	Fator 6 de resposta às auxinas	ATlG30330.1_ 1	Ribo-shift Up	ATGTTCTGCAA CAGTTGA (SEQ ID NO: 42)	MFCNS* (SEQ ID NO: 4)
AT1G30330 .1	ARF6	Fator 6 de resposta às auxinas	ATlG30330.1_ 3	Ribo-shift Down	ATGAGTGGGG TGGATTAA (SEQ ID NO: 43)	MSGVD* (SEQ ID NO: 5)
AT1G48300 .1			5’ UTR	TEup	CGAGATGCGG CGAGGAGAAA GAGAAGGTTA AGGTT (SEQ ID NO: 81)
AT1G48300 .1			ATlG48300.1_ 1	Ribo-shift Up	ATGCGGCGAG GAGAAAGAGA AGGTTAA (SEQ ID NO: 44)	MRRGER EG* (SEQ ID NO: 6)
AT1G59700 .1	GSTU16	Glutationa-Stransferase TAU 16	5’ UTR	TEdown	ATTGTGTGGTG ACAAGCAACA CATGATATGTC CGTTTAGAAAC AGACAAAATA AGAAGAAGAA GAAAGAGTCG TGGAGGATTCT TCATTCTTCCT CATCCTCTTCT TCACCGATTCA TTAGAAACCA AATTACAAAA AAAAACGTCT ATACACAAAA AAACAA (SEQ ID NO: 82)
AT1G59700 .1	GSTU16	Glutationa-Stransferase TAU 16	AT1G597OO.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGATATGTCC GTTTAGAAAC AGACAAAATA AGAAGAAGAA GAAAGAGTCG TGGAGGATTCT TCATTCTTCCT CATCCTCTTCT TCACCGATTCA TTAG (SEQ ID NO: 45)	MICPFRN RQNKKK KKESWRI LHSSSSSS SPIH* (SEQ ID NO: 7)
AT1G59990 .1	RH22	Proteína da família de DEA(D/H)-boxRNA-helicases	5’ UTR	TEdown	AGTGAGCTAA TGAAGAGAGA GACTGAAACA GAGGTTTCTTA CTTTCTTCTCT GTATCTCTCAT ATTTTGCTTAA ACCCTAAAAC CCTTTTTGGAT TAGGTTTTCTC CAAATCTTATC CGCCGTGATA AAATCTGATTG CTTTTTTTCTTC ATGAAAGTTTG ATTTGTGAAAC TCG (SEQ ID NO: 83)

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AT1G59990 .1	RH22	Proteína da família de DEA(D/H)-boxRNA-helicases	AT1G5999O.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGAAGAGAG AGACTGAAAC AGAGGTTTCTT ACTTTCTTCTC TGTATCTCTCA TATTTTGCTTA AACCCTAA (SEQ ID NO: 46)	MKRETE TEVSYFL LCISHILL KP* (SEQ ID NO: 8)
AT1G72390 .1			5’ UTR	TEup	CCTTTCTCTTC CGATCGCATCT TCTTCAAAAAT TTCCCACCTGT GTTTCACAAAT TCCATGTTTAT GAATTCTTCAT TGCTCTATTCT TAGTCACCTTT GATTTCTCTCG CTTTCTATCCG ATCCAATTGTT TGATGATCTTC TCTGTAACAAG CTCATAAGGTT TGAGCTTCATC TCTCTGGAGAG AATCC (SEQ ID NO: 84)
AT1G72390 .1			AT1G7239O.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGTTTATGAA TTCTTCATTGC TCTATTCTTAG (SEQ ID NO: 47)	MFMNSS LLYS* (SEQ ID NO: 9)

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AT2G34630 .1	GPS1	Geranil-difosfatosintase 1	5’ UTR	TEup	AAGCGAACAA GTCTTTGCCTC TTTGGTTTACT TTCCTCTGTTT TCGATCCATTT AGAAAATGTT ATTCACGAGG AGTGTTGCTCG GATTTCTTCTA AGTTTCTGAGA AACCGTAGCTT CTATGGCTCCT CTCAATCTCTC GCCTCTCATCG GTTCGCAATCA TTCCCGATCAG GGTCACTCTTG TTCTGACTCTC CACACAAGTA GGGTTACGTTT GCAGAACAAC TTATTCATTGA AATCTCCGGTT TTTGGTGGATT TAGTCATCAAC TCTATCACCAG AGTAGCTCCTT GGTTGAGGAG GAGCTTGACCC ATTTTCGCTTG TTGCCGATGAG CTGTCACTTCT TAGTAATAAGT TGAGAGAG (SEQ ID NO: 85)
					ATGAGCTGTCA	MSCHFL
AT2G34630	GPS1	Geranil-difosfato-	AT2G34630.1	Ribo-shift	CTTCTTAGTAA
.1	sintase 1	2	Up	TAAGTTGA (SEQ ID NO: 48)	VIS* (SEQ ID NO: 10)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 60/191

54/130

AT2G35510 .1	SRO1	Similar a RCD-one1	5’ UTR	TEup	CAAGAGTAGA CCGCCGACTTA GATTTTTTCGC CGACGAGAGA ATATATATAAA TGGCTCGTCTT TTTCCAAACGA TTTCTTCTTCTT CGTCGTCGCCG GTTTAGGGTTT CCGTTGCTGTA GCAATTTTCTC TCGCTTCTCTC TCCCCTTTTAC AGTTTCTCTTA TATTGCTCTTG CCTTGCGTCCA ATCTCAAGAGT TCATAAGAGTT GACATTTGTGA ACATCGAAGA AATACGGTGA CGTTTCTTCTC TGATTACTTTT TGCCAACATG AATACTAATGT ATTTATCAACA AGTGCTACAG CCTGTTTTTTT CGAAGCTGTTG GTGAGTTCCCA TCCTTAGTACT GCTAGACAGTT CGGTGTGTTAG TTGACTTTATA TTCAAGGTTAT AGGTTTAGTGT TGTTAGTAGAG AAAA (SEQ ID NO: 86)
					ATGGCTCGTCT TTTTCCAAACG ATTTCTTCTTC	MARLFP NDFFFFV VAGLGFP LL* (SEQ ID NO: 11)
AT2G35510	SRO1	Similar a RCD-one-	AT2G35510.1_	Ribo-shift	TTCGTCGTCGC
.1	1	1	Up	CGGTTTAGGGT TTCCGTTGCTG TAG (SEQ ID NO: 49)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 61/191

55/130

AT2G42950 .1		Proteína da família de proteínas like CorA de transporte de magnésio	5’ UTR	TEdown	ACATTCATCTC TCTCTCTCAGT CAAATTGTTGT TTTCTTTCTTC GAATCGGTGC AGAAAATTCA GGGAAGTTCT GGGGAAGGTT GTTGCGTTTGA CTCCTTTGGCT TAGTTTTCTTT CGAATTCCGTG CTTCCTGATGA TCTTACGTGAA ATTGCAGCCTA AAATTTCGAG ATTGTTTTTTT TACTCAGAAA ACGAGATTTG ACTGATATGA ATCGAAAATCT GTGATTTAAAG TGAAGC (SEQ ID NO: 87)
AT2G42950 .1		Proteína da família de proteínas like CorA de transporte de magnésio	AT2G42950.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGATCTTACG TGAAATTGCA GCCTAA (SEQ ID NO: 50)	MILREIA A* (SEQ ID NO: 12)
AT2G47210 .1		Proteína da família de fatores de transcrição like myb	5’ UTR	TEdown	AAACTGCTGA CCGATCCCAA AGGTTGAAAG ATTCTTTGGCG CTAAAAAATC CCCAGTTCCCA AATCGGCGTCC TCGTTTGAAAC CCTAATTCCTG AATCGAAGCA GATCCTGATCG AATCGAAGGT GTTCGAATGAT AGCTACCCAGT AAATTCAGAA CCCTAATTAAC A (SEQ ID NO: 88)
AT2G47210 .1		Proteína da família de fatores de transcrição like myb	AT2G47210.1_ 1	Ribo-shift Up	ATGATAGCTAC CCAGTAA (SEQ ID NO: 51)	MIATQ* (SEQ ID NO: 13)
AT3G02570 .1	ΡΜΠ	Manose-6-fosfatoisomerase, tipo I	5’ UTR	TEup	GTAAAGAGAA AAGCTTTGAGT CTTCCATTGAC ATGGGCGCTTA GCTTATGCTTG AGATATTTTGT TTTTACCTCCG AGAAACGGAT TTAGATTCGTA ATCGTGAGTTT TTTGGTGTA (SEQ ID NO: 89)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 62/191

56/130

AT3G02570 .1	ΡΜΠ	Manose-6-fosfatoisomerase, tipo I	AT3G02570.1_ 2	Ribo-shift Down	ATGCTTGAGAT ATTTTGTTTTT ACCTCCGAGA AACGGATTTA GATTCGTAA (SEQ ID NO: 52)	MLEIFCF YLRETDL DS* (SEQ ID NO: 14)
AT3G03070 .1		Relacionado à NADH-ubiquinona- óxidorredutase	5’ UTR	TEdown	AAATAAATGC GTTGTTTGGTA CAGCTTCACGA ACAATCTCTCT CTCGATAGATT CTTCTTACCTC TGAATTTCTCG TTGTTGGAACA (SEQ ID NO: 90)
AT3G03070 .1		Relacionado à NADH-ubiquinona- óxidorredutase	AT3G03070.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGCGTTGTTT GGTACAGCTTC ACGAACAATC TCTCTCTCGAT AG (SEQ ID NO: 53)	MRCLVQ LHEQSLS R* (SEQ ID NO: 15)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 63/191

57/130

AT3G15030	TCP4	Fator de transcrição	5’ UTR	TEdown	AGATTTTTTTT TTAAACAAAG AATGGAAAAA AATGAATAAA TTTGGGAAAC GAGGAAGCTT TGGTTACCCAA AAAAGAAAGA AAGAAAAAAT AAAAAAAAAT AAAAAGAAAA GCTTTCTCTGG GTTTTTCTTGA TTGGTCAATTA CACATCTCCCT TTCTCTCTTCT CTCTCTCACCT TCGCTTGCTTT GCTTGCTTCAT CTCTTTGGTCT CCTTCTTGCGT TTTCTATTTAC TACACAGACC AAACAATAGA
.1		4 da família TCP			GAGAGACTTT AAGCTATAGA AAAAAAGAGA GAGATTCTCTC AAATATGGGTT AGTCCACAATT TTCACTAAACC TCTTCTTCTTA GGATTGTTTTT AGGGTTAGGG TTTTGAGGTGA GGAGAGCAAG TATGCGGGAG TTTCATCCTTT TTGAGTTACTC TGGATTCCTCA CCCTCTAACGA CGACCACCGTC GCCGCCGCCG CCGCCGTCTCG ACGAATATGCT CTACCA (SEQ ID NO: 91)
AT3G15030	TCP4	Fator de transcrição	AT3G15030.1_	Ribo-shift	ATGGGTTAG	MG* (SEQ
.1		4 da família TCP	2	Down	(SEQ ID NO: 54)	ID NO: 16)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 64/191

58/130

AT3G18140 .1		Proteína da superfamília like transducina/repetiçã o WD40	5’ UTR	TEup	ATGAGAAAAG CTTGGTAAAA ACCCTATTTTT CTTCTTCTCTT CAATTTACAGT TCTCTGCACCT TTTTCTTTCCC CTGTTTTTTGA TCCTCAATCAC CAAACCCTAG CTTGTTCTTCT GTTGATTATTT CGAAAAGGGG GTTTGTTTGTT TTCTGGGAATC AGCAAAAATC ACGAAATGGT TGGTTTAATAT TTCAATCGGGA TAAAATCGATC GAAA (SEQ ID NO: 92)
AT3G18140 .1		Proteína da superfamília like transducina/repetiçã o WD40	AT3G18140.1_ 2	Ribo-shift Down	ATGGTTGGTTT AATATTTCAAT CGGGATAA (SEQ ID NO: 55)	MVGLIFQ SG* (SEQ ID NO: 17)
AT3G55020 .1		Proteína da superfamília domínio Ypt/RabGAP de gyplp	5’ UTR	TEup	GTCACACATGT AATAAACCTTG GTCGACAATCT CGCCCTTTCCA TGTGATTTCTC CACTTCCTCTC TCTCTCTACTG CAACTTCCTCC TCCTGCTTCAA CTTCATTCGGG TAATGATGAA CTAGCGTAGA GATTTGGATCT TCTTCTTCGTC CTCTCACCAAC TCTTCACCGGT TAGATCTCTTT TTCACGCTAAC GA (SEQ ID NO: 93)
AT3G55020 .1		Proteína da superfamília domínio Ypt/RabGAP de gyplp	AT3G55020.1_ 2	Ribo-shift Up	ATGTGA (SEQ ID NO: 56)	M* (SEQ ID NO: 18)
AT3G56010 .1			5’ UTR	TEup	GTGTTTAGCTT CTTCACTACCA CACAGAAACA GAGTTTCCGTC TTTCATCTTCC TCCATATGCGT CGCTCTTAAAA ACCTAATTCAC A (SEQ ID NO: 94)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 65/191

59/130

AT3G56010 .1			AT3G56010.1_ 1	Ribo-shift Up	ATGCGTCGCTC TTAA (SEQ ID NO: 57)	MRRS* (SEQ ID NO: 19)
AT3G63340 .1		Proteína da família de proteínas fosfatases 2C	5’ UTR	TEdown	TCTTCTTCTTC GTTTTCAGGCG GGTGGAGGAG CTCAGAGCCTT CCAGAGGTAA CCAACCTTTTA TTACCGACAA GATTCTGCCAC ACAATTATTAC ATATTTTTGTT CCCATGAAGC AATTGTTCCTT TCAAGCATGTT TACGAGCAAA AGAGTGAAAG GGTAGCTTGAT TTTTGTCTACT CTAGCTTCATT TTCTGGCGATC TTTACTTGAGA TTTAAACATTT TGCTCTCGGAT TGATAATAAA GAAGAATTTG GAATATCAGT AGGTTTGGTTA GGACTCTCGG ATTCTGTTGTC GGTTAGATATT TGTTTTGTTTA ATCCCTAGATT TAGCAGAGAA ATCCCTCAAAT CTCACACAATC CATGTAAGGA AGAAG (SEQ ID NO: 95)
AT3G63340 .1		Proteína da família de proteínas fosfatases 2C	AT3G63340.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGAAGCAAT TGTTCCTTTCA AGCATGTTTAC GAGCAAAAGA GTGAAAGGGT AG (SEQ ID NO: 58)	MKQLFLS SMFTSKR VKG* (SEQ ID NO: 20)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 66/191

60/130

AT4G11110 .1	SPA2	SPA1-relacionada 2	5’ UTR	TEup	CTTACTTAAAC ACAGTCAAATT CATTTTCTGCC TTAGAAAAGA TTTTTATCGAA AATCGACGTTT TTGAAAAAAC TCAAATTATCG TCGTTTTGTTC TCAGATTTCTT CTGCTCTCTTC TTCTTCTCCTT CTTCTTCGTTC CACCGCCTCTG TTGCTTTATCT TCTTCTTCCTT CCTTCGATTGT TGATTACGTCG GTGGATCTTTG TTCTCCTCTGT GTTGTTTTCAT TGCTAGATTTC GTCAATGATTG GCTTCTCACGA TTCGATTTTTC CGGCTCCTGTT CTTAATTTCCT CTGAGAGA (SEQ ID NO: 96)
					ATGATTGGCTT CTCACGATTCG	MIGFSRF
AT4G11110	SPA2	SPA1-relacionada 2	AT4G11110.1_	Ribo-shift	ATTTTTCCGGC	DFSGSCS
.1	1	Up	TCCTGTTCTTA	* (SEQ ID
					A (SEQ ID NO: 59)	NO: 21)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 67/191

61/130

AT4G17840 .1			5’ UTR	TEup	ATCAAAATCA ATGATCAAGG TAACGTAGTCA AGTTCAATTAC TCTTTGTCAAA TTTAAGTGGTC TCTATTACTAA ACTATACACA ACCGTTAGATC AAATAATTCTC TACCATCCAAC GGTCCAAAGT CTCCACTTCTA TTTATTACAAT AAAATGAGAA AATAAAAACG CGCGGTCACC GATTCTCTCTC GCTCTCTCTGT TACTAAATGA AGAAGAGAAT CTCTCCGGCGA GATCACCGGC GTTATTCCGAT AATTTCGCCTG AGAGTTGTCGC ATGTTATAA (SEQ ID NO: 97)
AT4G17840 .1			AT4G17840.1_ 4	Ribo-shift Up	ATGTTATAA (SEQ ID NO: 60)	ML* (SEQ ID NO: 22)
AT4G18570 .1		Proteína da superfamília de proteínas like com repetições de tetratricopeptídeos (TPR)	5’ UTR	TEdown	ATTTTTATTAC TCTCTCAAGTA GTCTCATCTTC TTCTTAATCCA AAGGCCCAAA CTTTGAATCAT CACTATCACTC TCTCTCTCTCT CTCTATCTCTC AAGAACTGCA CGGACAACGA CATGCTTTTAA TTTCCATGCAA ATCTCTCCTTT CTTCTCAAGTC ATTTTTGAAAA TCAATCAAAA AACTGAAACTT GGTGGAGCTTT TATCATTCACT CATCA (SEQ ID NO: 98)
AT4G18570 .1		Proteína da superfamília de proteínas like com repetições de tetratricopeptídeos (TPR)	AT4G18570.1_ 1	Ribo-shift Up	ATGCTTTTAAT TTCCATGCAAA TCTCTCCTTTC TTCTCAAGTCA TTTTTGA (SEQ ID NO: 61)	MLLISMQ ISPFFSSH F* (SEQ ID NO: 23)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 68/191

62/130

AT4G23740 .1		Proteína da família de proteínas quinases com repetições ricas em leucina	5’ UTR	TEup	CTTTCACCCAC TTTAATATGCC AAAAAATAAG AACAAAATTA TATCCGTTGCT TGAAAATCAC AAGCTCTTCTT AACTTCACAA GTGCTTCAATG GCGGTTCTTCA CATTATCTTCA CTGCGTAATTG AAGAAGTTGTT CTCTCTTCCTC TTAATTTCGAG TTGTGTTCTTA AAAAACTCCA GAGCTGATTCG ATTCTCGAGAA GAAACTAAGC CGACAATAAA GTTCAGATCTG GAAAAAAGCG AGCTCCAGATT ACAAAAAGAA ACAGCTCGTTT TTTTCACTTTC AAAAAA (SEQ ID NO: 99)
AT4G23740 .1		Proteína da família de proteínas quinases com repetições ricas em leucina	AT4G23740.1_ 1	Ribo-shift Up	ATGCCAAAAA ATAAGAACAA AATTATATCCG TTGCTTGA (SEQ ID NO: 62)	MPKNKN KIISVA* (SEQ ID NO: 24)
AT4G23740 .1		Proteína da família de proteínas quinases com repetições ricas em leucina	AT4G23740.1_ 2	Ribo-shift Down	ATGGCGGTTCT TCACATTATCT TCACTGCGTAA (SEQ ID NO: 63)	MAVLHII fta* (SEQ ID NO: 25)
AT4G24750 .1		Rodanase/proteína da superfamília de fosfatases que controlam o ciclo celular	5’ UTR	TEdown	GAGTCTGGTTC GAAAAGACTG CTTCAATGAAG CCAAAACTATC CAATAACTCG AAATTGACTAC TCTTTTCTTTT GTCTCTGTTGT TGATTCGCAAA GGCGAAGATT ATCCATCTTCT CAGTTACTCCT ACTGGAACCA AAAGCTCAGA ACCTTAAAAC (SEQ ID NO: 100)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 69/191

63/130

AT4G24750 .1		Rodanase/proteína da superfamília de fosfatases que controlam o ciclo celular	AT4G24750.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGAAGCCAA AACTATCCAAT AACTCGAAATT GACTACTCTTT TCTTTTGTCTC TGTTGTTGA (SEQ ID NO: 64)	MKPKLS NNSKLTT LFFCLCC * (SEQ ID NO: 26)
AT4G26080 .1	AtABIl	Proteína da família de proteínas fosfatases 2C	5’ UTR	TEdown	GAAGCAATTG TTGCATTAGCC TACCCATTTCC TCCTTCTTTCT CTCTTCTATCT GTGAACAAGG CACATTAGAA CTCTTCTTTTC AACTTTTTTAG GTGTATATAGA TGAATCTAGA AATAGTTTTAT AGTTGGAAATT AATTGAAGAG AGAGAGATAT TACTACACCAA TCTTTTCAAGA GGTCCTAACG AATTACCCACA ATCCAGGAAA CCCTTATTGAA ATTCAATTCAT TTCTTTCTTTCT GTGTTTGTGAT TTTCCCGGGAA ATATTTTTGGG TATATGTCTCT CTGTTTTTGCT TTCCTTTTTCA TAGGAGTCAT GTGTTTCTTCT TGTCTTCCTAG CTTCTTCTAAT AAAGTCCTTCT CTTGTGAAAAT CTCTCGAATTT TCATTTTTGTT CCATTGGAGCT ATCTTATAGAT CACAACCAGA GAAAAAGATC AAATCTTTACC GTTA (SEQ ID NO: 101)
AT4G26080 .1	AtABIl	Proteína da família de proteínas fosfatases 2C	AT4G26080.1_ 3	Ribo-shift Down	ATGTGTTTCTT CTTGTCTTCCT AG (SEQ ID NO: 65)	MCFFLSS * (SEQ ID NO: 27)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 70/191

64/130

AT4G32660 .1	AME3	Proteína da superfamília de proteínas quinases	5’ UTR	TEup	AATTGGTGGAT GTCGTCGCGGT TCGACCCCAA GGGATTTGGCC GGTAAAATTAT TGGGAGTTGTC TTTCTCTTGCA CTCTCTCTAGT TCCAAACCCTA GCAATTCCTCT GTTTTCACCAT TTTCGGAGATT ATCACCTTCTC CCCGATTCGCC GCCTTGTGATT ACATCTACGTA AAGAGTTTCTG GTAGAAATTTT CCCTCTTTTAG CTGCAGATTGG CATCAGATTCC GTTCTGGATGT GTCGGTGATCG ATTTTCCGCGT CGGTG (SEQ ID NO: 102)
AT4G32660 .1	AME3	Proteína da superfamília de proteínas quinases	AT4G32660.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGTCGTCGCG GTTCGACCCCA AGGGATTTGG CCGGTAA (SEQ ID NO: 66)	MSSRFDP KGFGR* (SEQ ID NO: 28)
AT4G32800 .1		Proteína da superfamília de proteínas de ligação ao DNA do tipo integrase	5’ UTR	TEdown	ATTTCATAAAT CATAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GTTTGGAAAC ATTCCAAAACC AGAACTCGAT ATTATTTCACC AAAGAATGAT AGAAACAAGA ACTATCTTTTT ATAAAACTCTT TACACCCCAA AAGAAAATGT CTCACTCGTTT TGCCTTATAAT ATTTCTTTCAA CAACAACCCA AATCTACAAA AAATCCCAAT AAAAAAAAAC TTCAGTCTGTT TGACATTTTGT CGAACACTTG GACGGCATCA CAAAAAGCTC TAAACTTTCTG ACTACCA (SEQ ID NO: 103)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 71/191

65/130

AT4G32800 .1		Proteína da superfamília de proteínas de ligação ao DNA do tipo integrase	AT4G32800.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGATAGAAA CAAGAACTAT CTTTTTATAA (SEQ ID NO: 67)	MIETRTIF L* (SEQ ID NO: 29)
AT4G34460 .1	ELK4	Subunidade beta-1 de proteína ligadora deGTP	5’ UTR	TEdown	GACCCTCTTCT CTCTCTCTAGC TAGTCTCAGGT CAGAGAAGCC ATCATCAACAT TCAACAAGAG AGCCGTGTTTG TGTCTTGACTG ATTCTTCTCTC AAGCTTTTTTA ATCTCTCTCTC TTTTCCCACGT AATTCCCCCAA ATCCATTCTTT CTAGGGTTCGA TCTCCCTCTCT CAATCATGAA CCTTCTTCTCT TCTAGACCCCA CAAAGTTTCCC CCTTTTATTTG ATCGGCGACG GAGAAGCCTA AGTCTGATCCC GGA (SEQ ID NO: 104)
AT4G34460 .1	ELK4	Subunidade beta-1 de proteína ligadora deGTP	AT4G34460.1_ 1	Ribo-shift Up	ATGAACCTTCT TCTCTTCTAG (SEQ ID NO: 68)	MNLLLF* (SEQ ID NO: 30)
AT4G37925 .1	NdhM	subunidade NDH-M de complexo NAD(P)H:plastoqui nona-desidrogenase	5’ UTR	TEup	ATGGTTCTGTA ACCGGACAAC ATCTCAAAACT TGTTCTGTTTT TTTTTTTTCATT TCTTAGACAGA AAA (SEQ ID NO: 105)
AT4G37925 .1	NdhM	subunidade NDH-M de complexo NAD(P)H:plastoqui nona-desidrogenase		AT4G3792 5.1_1	Ribo-shift Down ATGGTTCTGTA A (SEQ ID NO: 69)	MVL* (SEQ ID NO: 31)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 72/191

66/130

AT4G38950 .1		Proteína da família de proteínas motoras de ligação aos microtúbulos que se ligam ao ATP	5’ UTR	TEdown	AAGAACAAAC AACTACCAAA CTTGTAGGCAG TAGCAGGAGG AAGTGGGTGG GATTAACATTG TCATTTCTCTC TCTTTTTCTTTT ACAAATCTTTC CGTTTTGTTTT CTTTTGGTTTT CCGGTGAGCA CTGTTGTGTTT CCAATTCCGGC ACTCTTTAGGG TTCCCTTTCAG AAGAAAACTT CACATTGTTGT TTCTCTCAACC GTGACATCTTG GATTACTACTT CTGACTACTTT CCTTTTTCATG TGCCCCAAAA GATAATAGTTA CTTTTTCAAAA TCTGGTTTTGT TGTTTGGGTTT GTGTCATTCAT TGATAAAGTC ACTAATGGAG AAGTACAAAA CAATTGCAAA ATTTCGAATCT GTGTTGTCATT GCTGAATTCTG TAGTGGATGTT TGCTTGCAGTT TAGAGCTTCGG AGTGCGAAGA GTGAGACACA AGAGGATTCTT TCTGGAACCGC ATTATTCCCTT TAGAGGAGGA AGAAGAAGAC AACTCACTCAC AAGGAAAACA AAGGTTCCTCT GGTTACTCTGA AATATTCAAAC CAATGGTGAG CAATTGGTAGC ACTTGCTAAAG AAG (SEQ ID NO: 106)
AT4G38950 .1		Proteína da família de proteínas motoras de ligação aos microtúbulos que se ligam ao ATP	AT4G38950.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGTGCCCCAA AAGATAA (SEQ ID NO: 70)	MCPKR* (SEQ ID NO: 32)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 73/191 /130

AT5G11790 .1	NDL2	N-MYC infrarregulada-like 2	5’ UTR	TEdown	AAACACAAAA AAACGAAGAT AGCCATCGTTT TGGTGAGAGA AGAGAGAAGA GAGAAGAAGA AGGCCATGGA AAGATAATAC TCTGCTTTTTT TTTAGAAATAT ACAGAGGAAA TAAAGAGAGA GAGAAGGAG (SEQ ID NO: 107)
AT5G11790 .1	NDL2	N-MYC infrarregulada-like 2	AT5G11790.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGGAAAGAT AA (SEQ ID NO: 71)	MER* (SEQ ID NO: 33)
AT5G14930 .1	SAG101	gene associado à senescência 101	5’ UTR	TEdown	TATGGACTCTC GTTCTCAGACA TTTATTTCTCT CAGTCTTACAA TATAAATTTTC ATTCTTACCAT CCATAATTTTG TATTGTCTTCT CCACAGATCTA TTCCAGCTCAC GCC (SEQ ID NO: 108)
AT5G14930 .1	SAG101	gene associado à senescência 101	AT5G14930.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGGACTCTCG TTCTCAGACAT TTATTTCTCTC AGTCTTACAAT ATAA (SEQ ID NO: 72)	MDSRSQ TFISLSLT I* (SEQ ID NO: 34)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 74/191

68/130

AT5G15950 .1

Proteína da família adenosilmetioninadescarboxilase

TEdown

ACAATATCAC AAACTCGTTTG CTCTTTTCATC ATTACTAAATC ATAAGCGGCT CTCAAGTTCTT TAGGGTTTCGA GTTTTCTCAAT CTCCTACCTGA TTAAGGTTAAT TTCTTATCTTG GATCAATAAC AAGAGAATTA TAACTCCGGAT TGTAATCAATA TTCCTCTACAT AAAAAGCGTG AATGAGATTAT GATGGAATCG AAAGCTGGTA ATAAGAAGTC AAGCAGCAAT AGTTCCTTATG TTACGAAGCA CCCCTTGGTTA CAGCATTGAA GACGTTCGTCC TTTCGGTGGAA TCAAGAAATTC AAATCTTCTGT CTACTCCAACT GCGCTAAGAG GCCTTCCTGAG TACTAGCCAGT TCCCTCCATAG CTTTTCAATTA CAACAATCTCC TTTTCTCAAAG CTCTGGTTCCC CAAATCCTCTC GTCTTTTGTTT GCCCTCACAAC AACAACAACA ACGCAGAG (SEQ ID NO: 109)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 75/191

69/130

AT5G15950 .1		Proteína da família adenosilmetioninadescarboxilase	AT5G15950.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGATGGAAT CGAAAGCTGG TAATAAGAAG TCAAGCAGCA ATAGTTCCTTA TGTTACGAAGC ACCCCTTGGTT ACAGCATTGA AGACGTTCGTC CTTTCGGTGGA ATCAAGAAAT TCAAATCTTCT GTCTACTCCAA CTGCGCTAAG AGGCCTTCCTG A (SEQ ID NO: 73)	MMESKA GNKKSSS NSSLCYE APLGYSI EDVRPFG GIKKFKS SVYSNCA KRPS* (SEQ ID NO: 35)
AT5G49980 .1	AFB5	proteína F-box 5 de sinalização de auxina	5’ UTR	TEdown	AAAAAATAAT CCCCAAATAAT GGAGACGAAG TGGAGAGAGA AAGCTCCCACT CTCTCACACCC CAAAGCTTCTT CTTCTTCTTCC TCTTCTTCCTC TTCCTCTTCTC TAATCTGAATC CAAAGCCTCTC TCTTT (SEQ ID NO: 110)
AT5G49980 .1	AFB5	proteína F-box 5 de sinalização de auxina	AT5G49980.1_ 1	Ribo-shift Down	ATGGAGACGA AGTGGAGAGA GAAAGCTCCC ACTCTCTCACA CCCCAAAGCTT CTTCTTCTTCT TCCTCTTCTTC CTCTTCCTCTT CTCTAATCTGA (SEQ ID NO: 74)	METKWR EKAPTLS HPKASSS ssssssss SLI* (SEQ ID NO: 36)
AT5G57460 .1			5’ UTR	TEup	GAAGATCTCAT TTCTCTTTCTC CTTTTCTTCTC CGACGATTCTT CTCAGTTCTCA GATCTGATCGA TTTCTTCATCA GATGTTTCAAT CTAACCATTGA GATTGAATAGT CACCATTAGTA GAAGCTTCGA GATCAATTTCG AATCGGGATC (SEQ ID NO: 111)
AT5G57460 .1			AT5G57460.1_ 1	Ribo-shift Up	ATGTTTCAATC TAACCATTGA (SEQ ID NO: 75)	MFQSNH* (SEQ ID NO: 37)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 76/191

70/130

AT5G61010 .1

EXO70E 2 proteína E2 da família de subunidade exo70 do complexo exocisto

5’ UTR

TEdown

TCTTTCCCTTC TTCTTCCCCAA TAATCTCGCTG AAACTCTCTTG CTCTTGCTTCT AAAAATCTGTT CTTTGAGACTT TGATCACACA GTTATCAAAAT CATAATCTCTT CTTTCCTGGTT

TTCTTCTTCTT CCCGTTTCACG GTACGTTTACT CTGTTCGATCA CCGAGTGTATG ATAAAATGTTT CTGTGAAATCA AATAACATATC ACTTTCTAATA AACATCAAAA TTTCTCCTTTTT TACAGAAACA AGAAGTTTTTT TGGGAAAGCC GTTGACTTGAC TTTTTCTTTGG GGTGTTGTGTG GGAGCTTATA GTATGGTACCA TAAGTGGGAG CTTATAGTTTG GGGTGTTGTGT GGGAGCTTAT AGTATGAGGA AAAATGTTAG ATTTGAAGAAT GCTTCACTGAT TTTTTACCATA AGTATGTCAAC TGGATTAAGCT TAAGTAGTAAT GGTTTTTACTA TGTTCATGTGG GGATTTCTCTT CCTCTCTGTTT ACTTCATTCCG AGATGACTTG AGATTTTTTCA AAGTATAGTTC TTGGAGTTAAG CTTACCTAGTA ATCACTTTATA TAACATCCCTT CGTTTACATTT GTGCTTTCACC TGGAAACACTT TAGACTTTTCT CTCTTCTGCCG TGTGTATTTAG TTGTCTAGTCA AATTTAAGTTG AGTTTAGGCTC TAGTCTTTGGT TTTGGTT (SEQ ID NO: 112)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 77/191

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AT5G61010	ΕΧΟ70Ε	proteína E2 da família de	AT5G61010.1_	Ribo-shift	ATGTCAACTGG ATTAAGCTTAA GTAGTAATGGT TTTTACTATGT TCATGTGGGG	MSTGLSL SSNGFYY VHVGISL PLCLLHS
.1	2	subunidade exo70 do complexo exocisto	3	Down	ATTTCTCTTCC TCTCTGTTTAC TTCATTCCGAG ATGACTTGA (SEQ ID NO: 76)	EMT* (SEQ ID NO: 38)

[0089] Para adicionalmente descobrir novas características de sequências de mRNA para o controle traducional mediado por elfl8, uma pesquisa de motivos enriquecidos foi realizada em sequências líderes 5’ (isto é, sequências a montante do códon de iniciação de mORF) e 3’ UTRs de genes com TE alterada. Uma sequência consenso significativamente enriquecida nas sequências líderes 5’ de transcritos com TE aumentada (7Eup) foi identificada (38,2%, valor-E = l,2e-141) (Tabela 2). Visto que este elemento contém quase exclusivamente purinas (Figura 3A), nomeamos-o de “motivo-R” de acordo com o Código de Ambiguidade de Nucleotídeos da IUPAC (TUPAC Nucleotide Ambiguity Code). Não foi descoberta sequência consenso primária nas 3’ UTRs dos transcritos com TE aumentada (TE-up), ou em quer nas sequências líderes 5’ quer nas 3’ UTRs dos transcritos com TE diminuída (TE-dowri). Usamos a ferramenta FIMO no software integrado MEME²³ para descobrir ocorrências de motivo-R de 15 nt em sequências líderes 5’ de todos os transcritos de Arabidopsis e descobrimos o motivo-R em 17,7% dos transcritos, que estavam enriquecidos de termos de GO: resposta ao estímulo e regulação biológica.

Tabela 2: TE-Up com motivos-R

ID do gene	Álias	Nome Completo	Sequência do Motivo	Sequência 5’ UTR
AT3G5 6460		proteína da família de álcooldesidrogenase com domínio de ligação ao zinco e com domínio GroES-like	GAAAGAGAGAGAG AG (SEQ ID NO: 113)	CAAATCCATCTCATATGCTTACGATAA CGTCCCATTGCCAAGCTGGTTCTTTCA CTCTTCAGGAGAAAGAGAGAGAGAGA GAGAGAGAGAGAGAGAGTTATCAGA GATAGCAAAA (SEQ ID NO: 294)

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AT3G5 7870	SCE1A	enzima de conjugação de SUMO-1	GAGAGAGAGAGAG AG (SEQ ID NO: 114)	GATAGAGATTGGAGAGCGAGCGAGAC AAATCAGAAGAGAGAGATTTAGATAT TGTAGAGTGAGATTCTAAAGAGAGAG AGAGAGAGAGAT (SEQ ID NO: 295)
AT1G2 0670		proteína contendo bromodomínio de ligação ao DNA	GAGAGAGAGAGAG AG (SEQ ID NO: 115)	AGGAGGAGAAAGAGAAAGGGGGAAG AGAGGAGAGAGAGAGAGAGAAAGAG ATTAGAGAGAGAAAGAAGAGAAGAG GAGAGAGAAAAAA (SEQ ID NO: 296)
AT1G2 1270	WAK2	quinase associada à parede 2	GAGAAAGAAAGAG AG (SEQ ID NO: 116)	AGGAGATTAGCGAAAACTCAAAACAG GAACAAAGTTAAAAGAGTGAGAGAG AAAGAAAGAGAGAAG (SEQ ID NO: 297)
AT3G0 5490	RALFL 22	ralf-like 22	AAGAGAGAAAGAG AG (SEQ ID NO: 117)	GTTGTCTTCAGCTGTGTACAGAATCAA GTTTCCAAGAGAGAAAGAGAGTAAAA GCAAATTAACAAAGGAAGACTCTGAT TCACCGAGAAGGTTTTGGCTTAAAG (SEQ ID NO: 298)
AT2G4 6030	UBC6	enzima de conjugação de ubiquitina 6	GAAGAAGAAGAAG AG (SEQ ID NO: 118)	ATTTTGGAATCTTTCTCTCTCTCTCTCT CTAAAACCAGATTCTTAATAGAAGAA GAAGAAGAAGAAGAGGAAAGGAGAA ATCTGCC (SEQ ID NO: 299)
AT4G2 8730	GrxC5	Proteína da família glutaredoxina	GAAGAAGAAGAAG AA (SEQ ID NO: 119)	ACGTCACGAGACAAATTAGCATAGCA CGCAAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG CTCCAAGAATCTGTCGCAGAAATCGC C (SEQ ID NO: 300)
AT2G1 7660		Proteína da família de proteína 4 que interage com a proteína RPM1 (RIN4)	GAAGAAGAAGAAG AA (SEQ ID NO: 120)	AAACAAAACCATCTGACTTATCAACA ACAACAAGAGGACGAAGAAGAAGAA GAAGATTGTTACTTTCTTGATCGATA (SEQ ID NO: 301)
AT1G6 4150		Família de proteína não distinguida (UPF0016)	GAAGAAGAAGAAG AA (SEQ ID NO: 121)	TCAGAACAACACAGAGCCAAAGGTTT TTTGCTCGCAGTAAAGAAGAATCACA CTGTGAAGAAGAAGAAGAAGCGAAA TACAAAATCCTCAGGAAAGAA (SEQ ID NO: 302)
AT1G5 3850	PAE1	subunidade-alfa- E1 do proteassoma 20S	GGAAGAGAAGAAG AA (SEQ ID NO: 122)	CGTCTTTGAAAGCTAAAAAGAGAGCA AAAGCTTCTGTTTATTCTCCGATTCGC AGATCAATTAGCTGGGTTTTGATTCCG TTGTGCGAAGGACTTTAAGAGGTTTTG CAGATCGAAATCGGAAGAGAAGAAG AAG (SEQ ID NO: 303)
AT3G2 4520	HSFC1	fator de transcrição de choque térmico Cl	AACAGAGAAAGAG AG (SEQ ID NO: 123)	GTCAAGCAGCTTAAATCATCTATGACT TAAAATTATAATTAAGAAAAAACAAT GCCTAAATATGCATATATTTCAAATGT ATCACATAACTTGTGACATAAGAAAA TATAAACAAAACAAAAAGGGCAAAA AAGACCTGAAAGCTTAGAGGCACACC TGCATAGGTCCCACAGTTCACTCGTGA CACCGTAAAAGGCAAAACACGAACCC GCCACGTTATCACAAAAAGCAAGCCA CGTCAATATAGTCTCACTGTCAACTAC ACTTAACTTACTATTTTCACATCTCAT TTTCCTATCTTTATATAAACCCTCCAG GCTCCTCTTTAATTTCTTTACCACCAC CAACAACAAACATATAAACCATAAGG AAAACAGAGAAAGAGAGAG (SEQ ID NO: 304)
AT3G4 6100	HRS1	Histidil-tRNAsintetase 1	GAAGCAGAAAGAG AG (SEQ ID NO: 124)	TCTTTCTTTTGCTAATTCTCTATCTCAC TCAGCTGAAGCAGAAAGAGAG (SEQ ID NO: 305)

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AT1G6 7230	LINC1	proteína “little nuclei 1” (núcleo pequeno 1)	AGAAGAGAGAGAG AG (SEQ ID NO: 125)	ACAATAAAGGTTTCCAGCACAGAGAA GAGAGAGAGAGATTGCTTAGGAAACG TTGTCGGACTTGAAACCAGTTTCGGTA CCGGAATTTAGAAACTCCGTTCAAAT CCGGAGCCAATCTCTAAAGGATAAAG CTTCCAACTTTATCCATTAATTGGAGA AAATTCTCAGAGAGACTGAAGTCGAC AAAGTCAGAGGGTTTCGTTTTTTGGCT TCTGGGTTTTTTATTTCAAGTGTTCAA TTTCCGAATTAGGTAAGAAAGTTAGG TTTTGAGATCTGTGCGAATTGTGAGAG (SEQ ID NO: 306)
AT1G6 1690		ligação de fosfoinositídeo	GGAGGAGAAGAAG AA (SEQ ID NO: 126)	CTTTTACATTTCCGGTAAGATCAAAAT CAAAACCAAGTTCGTTTCGCGGCGGA GGAGAAGAAGAATCAGACGGGAAA (SEQ ID NO: 307)
AT5G2 8919			AAAAGAAAGAAAG AA (SEQ ID NO: 127)	TTAAATTAGAGAAAAAAACGCAGACG ACTAAAAGATATTCACACACAAAAAA GAAAGAAAGAAGAAAAATTAGCTCAC AAAATAACAACAATATAATTAATACC CAAAAAAGAAAAAAAACTAACTGAGT CCATGTTGAATAGATCTCCTATAGATG TAAGGAAATACTCGGCTTCTACATCTT AATTAAGCATTACTTCCTATTTCTAAA TAGATAGGAAGATTCAAGAGCTTCTC TCCCAGACGTGATTTTTGAGACAGCCT TTTCATCAATTTTTTCTGGCACCGGTA GAGCGTTAGCTCGTCGGTGCCAGGAG CTAGCTTCTTCTCACCGGTTTCCTCCC ATAAGCTCTCTCATCGGTTTCTCTGTT TTTTGTTTCGTGTTGTTTCGTCTCTTTT CCCTCCTATTAGATCCATAAAGCTTCA TTACCGCACAACCTTCGAAACTACTCC CATCTGGTATTAGCTCTTCTCTTACCT TGTTCGCGATTCTCGTGGATCCCTCTC CTCGGCTTTCCTTAAAGTCAAGATCAG CAACTCTTTGGTCCTCA (SEQ ID NO: 308)
AT2G0 3390		proteína contendo o motivo uvrB/uvrC	GAAAAAGAAAGAA AA (SEQ ID NO: 128)	AACGAAAAAGAAAGAAAAATCTGTG AGGACGAAAACTCTCCGTCGTTCCGG CGAGTTTCTCCAGTGATCGGCAAAGT CTTTCCGGCATCTATTGAATTTCTCTA AACCAATTAGAATATTATCGGTCTTGA TAAAATAAA (SEQ ID NO: 309)
AT1G1 2500		Proteína da família de transportadores de nucleotídeoaçúcar	AAAAGAAAGAAAG AA (SEQ ID NO: 129)	AAAACTCACACTTTCTCTCTCTCTCTC TAGAAAAAGAAAGAAAGAAGAAAAA CTTATTGTTATTCCCATTTCGCCCCTAT CCGAAAA (SEQ ID NO: 310)
AT1G5 5840		proteína da família de proteínas transferidoras de fosfatidilinositol Sec 14p-like	AAGAGAGAAGAAG AA (SEQ ID NO: 130)	AGAAACATCATGATATGATATTTTTCT CAAGTCTTTTGGTGTTGGAGAAGAAG AGAGAAGAAGAACTTGGTTTCTCTCT CTAAAAGTTTATTGCTTGGCTCCATAA AAAGTGCACCTTTTTCTCTCTTTTCTTT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT CTCACTTCTCCTCGGATGCACTATTGT CCGTGAGATCAGAGATTCACCCTCTTT AGATTTTGCGCAGAAACTTTTGCCCAC AATTTTGTATTCGTCAAATCTGAGCTG AGATCTCTAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO: 311)

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AT1G4 8300			CGAGGAGAAAGAG AA (SEQ ID NO: 131)	CGAGATGCGGCGAGGAGAAAGAGAA GGTTAAGGTT (SEQ ID NO: 312)
AT IGO 4690	KV- BETA1	subunidade-beta-1 do canal de potássio	TAAAGAGAGAGAG AG (SEQ ID NO: 132)	GTTCTTCTTCATTCATTACAACAAACT CTTTGAGACCTAAAGAGAGAGAGAGC GATAGTGAGATTTAGATCAACAGATT TGAATCGATTTCTGAAAAC (SEQ ID NO: 313)
AT IGO 2000	GAE2	UDP-Dglicuronato-4epimerase 2	AAAGGAAAGAAAG AA (SEQ ID NO: 133)	AGAAAGGAAAGGAAAGAAAGAAAAC AAAAGGAGTCCAAGAAACCAGAAGA TTGTCTCCCGACGCCATTATCCTTCAC CCTCGGAGCTTTTCTTGAAGCAGGGAT TCTTCTAATCATTAATCCCTACTTCTTT CTTTCTTTTTTGTTTGTTCTCCTTTGAG ATCTATCTAGTACTAGTAGTAAAACCC CCTCCCCTCCATTGAATTTGAATTGAA TTGAATCTCTGGGAATCAAATCTTTG (SEQ ID NO: 314)
AT5G5 0430	UBC33	enzima de conjugação de ubiquitina 33	CACGGAGAAAGAG AA (SEQ ID NO: 134)	TTTTGATATTTCGACACTCTCTCTTTCC TCTCTCCTTGTCTCTGTACCGCGTCGA AATATGAGAAACGAATGATTTGATCA TCAATCAACGAGAAACACACACGGAG AAAGAGAATCTCAAATTAGCTCCAGC TCCTGATCGATTCCGATTTTCACAATT CTTTCCTTGGATCTGCTCTTACCTTGTC ACGATTTCACTTCCCTGTGTTTTTGAT TTATACTTGGTCATCCAATAACGAAAC TTTGATCAAACTGGAACTACAGTTTAT TGGAACTCCCTGAAGCATTTAG (SEQ ID NO: 315)
AT2G2 6590	RPN13	partícula regulatória não- ATPase 13	GAAAGAAAAAAAA AA (SEQ ID NO: 135)	AATTGAAAGAAAAAAAAAAACGAGA AGCGTTTTCTTTCTCTCCAAAATCCAT TACTCGCGAACTTTCCTCTGCTAAGTG TTCACTAGAAAGAGGTGGTGATT (SEQ ID NO: 316)
AT2G2 1230		Proteína da família de fatores de transcrição de zíper de leucina básica (bZIP)	CACAGAGAGAGAG AG (SEQ ID NO: 136)	TGGATGATTGCTGCTTTGGTCAACGTT TCAAAAGAATCGTTTTTTCTTTTAGTT CCTTCCTTCTTTCGCTATTTTCGCCATT GATTGCTGAAGAAAACACAGAGAGAG AGAGATTCACTTCCCCATTTCAGAAA ATCAAA (SEQ ID NO: 317)
AT2G0 4865		Proteína da família de proteínas com domínios móveis de planta, like aminotransferase	AAAGAAAAGAGAG AA (SEQ ID NO: 137)	ATGCTGACACAGATATTTATTTTTGCC TCTTATAACGAAAAAAGCAAAATAAA AGAAAAGAGAGAAGAGAAAAGCATT ATCCCTTACGACGAGGAAGCCGTCGT TTTGAGGGTTCGTACAAATCCTGAGAT CTTCCTTCAAACTCTTTCTTTGTCTCCT TTTTTATCTCACTCCGTCGTCGTTTTGA TTCTTTCAAAGTTCTTCATCCTCTGTTC CGCGCTGTTTTCTGGTGAGTGTTGATT CTG (SEQ ID NO: 318)
AT5G2 4165			GAGAAAGAAAGAA AA (SEQ ID NO: 138)	AGAAAAATCAGAGAAAGAAAGAAAA CAGAGCAATTACTTGAAGAATCCATA GGAAGCTGAAG (SEQ ID NO: 319)

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AT3G1 9553		Proteína da família de aminoácidopermease	CAGAGAAAGAGAG AG (SEQ ID NO: 139)	AATAACAACTATACAATGATATTTTTG ATCAAACGTCATTTTCCAATCTTTGAA TCTGAGATGATAACTTGTTCAGCTTAA TCTTTCCAGTCAATTTCATCTCCTTCC AATTTTGAAGGGTTCATCAGAGAAAG AGAGAGCCATTCAGAGATCCATTGTA CCAAGCTCACTTCGATCTACAGAATC ACCGAGAGCTCTCTGTCTCTCTGTCGG TGATATTTGTTTG (SEQ ID NO: 320)
AT2G3 2970			GGAGGAGGAAGAG AA (SEQ ID NO: 140)	AACGTGCTCCGGTGAAGATTAAAAAC CGACGAGACCCTGGCGCCATCACAAC TACGCAATCTCATTCCTCCGTCTTCTT CGGCTTTCAAATTTACCATTTTACCCT TCTCTTTCCCTGAGACGTCTTCTTTGG AAATATTCTTCTCTTCTTCCATTCCAA TGATTTTGAGGTTAATTGGAAATTAGA GTGCAAAATTGGGATTTAGATGGGGA TTGCTGATGAATCTAAATGTGTTTTCC CCTTGACGAGTCTCCAGATCGGAGAC TTGCAATCATATCTTTCTGATCTCAGT ATTTTCCTGGGAAATAAAAGTAAAAA GATTTACATATTGGTGGATAACCGGC CATGGTTGAATCCTGGCACCAGATCT GCTCATTTTTGGCAACTAATGGTCACA AAGACTCTCCCCTTTTGCAAACACGA AACTTCGAGGGGAGAAGAAAAATCAG AATCAGGACAGGGAGAAGAAAAAGT CGAAGCAGGAGGAGGAAGAGAAGCC TAAAGAGGCTTGTTCTCAGCCCCAGC CGGACGATAAAAAA (SEQ ID NO: 321)
AT2G1 8230	PPa2	pirofosforilase 2	AGAAGAAAGAAAG AA (SEQ ID NO: 141)	AAAACTCTACTGTAACTGCAAAATCTT GTTGTTTTCTTAAACGAAGAGAGAAG AAAGAAAGAAAAAAACGTTACGGATT CTCTGCTTCGGTTTCGCGATTGAAGCT TGAGATTTCATCTTGAACATCCGAT (SEQ ID NO: 322)
AT4G1 4420		relacionado à proteína indutora de lesão like HR	GAAAAAAAAAAAA AA (SEQ ID NO: 142)	AAAATCTCACCTTTTTGACCCCAAAAA TTTCTAAATATTTCAAAATCAGCCTCT TCGTTTTCTTTCTCCTCCTGTCTGTTGA TTTAAAGACCCAAATCTGACGCTTCTC TCTCTCTTTCTGGTATCTGCGTTTGATT CGGAGAAGAAAAAAAAAAAAAAGGC AAAGAGAGAGCTTCA (SEQ ID NO: 323)
AT3G2 5470		relacionado à hemolisina bacteriana	GAAGAAGATAGAG AA (SEQ ID NO: 143)	ACAACCCTAGAACAAAAAAAGTATCC CATTTGTCATTTGTCAATTGTCATTAG CAAGAACAGGAAGAAGATAGAGAAC AGAGCTCTTCGATCTTTTTTCCTCCAA GGAAGAAGTAGAAAG (SEQ ID NO: 324)
AT5G1 7530		proteína da família de fosfoglicosaminamutases	CAAAGAGAAACAG AA (SEQ ID NO: 144)	ACACAATCGAAGTCGAACTCTCAGGA TTCAATCTTGATACCAAAGAGAAACA GAAATAAACTAACATCATCGCTACTG TCGCCTATAATCTTGTGAGCTCTTTAT CGTCTTCAATGGAAGTTCGATGATGTA AAAACTCAAATAAGAGTGATTCTAGA ATGGGAAATTTTCTATAGAAAGGAAA GGTTTTCCAAAACTTTAATGTAGTACA GAGCTGCTACCGACAAAATAAGCAGT TTAAGACACGATACCAAAGAGAACCT GACCTGTTC (SEQ ID NO: 325)

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AT3G0 6550	RWA2	proteína da família de 0acetiltrasferases	GAACGAAAGAGAG AA (SEQ ID NO: 145)	AATTGTTTTGAGGTAGCAGCTGCAAA CCGCTCAAACAGTTGCGCATTAGGCA TTACACAGTTCCACTCGTTCCTTTTGA AGCTTATCTGTGTGACTCTAATCTGTT ACTATAATAGGAACGAAAGAGAGAAC TAGGATCTATACTTGCTCCAACCTTGC TTTGTTTCTCTTCTGCGATTTATCTCTA GATCTACTAGATCTGGACAAGGAGCG AAGCGAATTGCTGGCAAATTTTAGTTT TGGAGTTTTGAAACCCGACGATTATC GCGCTTGATCGTTGCTTCTCTGATCGG AA (SEQ ID NO: 326)
AT4G3 4090			GAGAAAGATAGAG AG (SEQ ID NO: 146)	CTGAATTACGAAAATTCTGTGAGGTT GAGGAAGCAGAGTGAAGAGAAAGAT AGAGAGATAAGAAGAAGCC (SEQ ID NO: 327)
AT4G2 9190	0ZF2	Proteína da família tipo dedo de zinco C-x8-Cx5-C-x3-H	AACAAAAAAAAAG AA (SEQ ID NO: 147)	AACACAAACAAAAAAAAAGAACTCTT TCGTCGACTAATGTGATTTATTGTTCA CCGGAGTATTAAAGAAG (SEQ ID NO: 328)
AT4G1 7615	SCABP 5	proteína 1 calcineurina Blike	AAAGGAAAAAGAA AA (SEQ ID NO: 148)	AAAGGAAAAAGAAAAATAAATAATC GATCTCAACCGTCCGATCATCCATCTT GCCATCACCGTTCACCAATCTTCTTCG TCTCCTCTCTCTTTCTCTCTTTTTGCTG TTTCTAGCTCCTCTCTCTCTGGATCTC GCCGGCGAACCGTTTCTCTTGGGTGTA AACAGTAGCAATCAAGCTATAGAATC TCAGATATCGCTGAATTAGCTGTTGGA TTTTATCCGCCTTTTCTTCGTTATCCGG GGCTCGGGTATAAGGTTTCATCGTCTT ATTTCATCTGTAA (SEQ ID NO: 329)
AT3G2 2420	ZIK3	quinase 2 sem lisina (K)	GCAGAAGAAGAAG AG (SEQ ID NO: 149)	ACTTGTTTCCTTATATATTCTTCTCCCT TTAAACATTTAATCTTTTCCTCTTCTAC CATCTCCACAAATTCCAAACATCTCTC TCTCTTTCTCTCTCACACACAAAATTG CAGAAGAAGAAGAGTC (SEQ ID NO: 330)
AT3G0 9210	PTAC13	proteína plastidial transcricionalmen te ativa 13	AAAAGAAAAACAG AG (SEQ ID NO: 150)	AACGGAATTTTCCCAAAAGAAAAACA GAGA (SEQ ID NO: 331)
AT2G2 5610		proteína ATPase, complexo F0/V0, subunidade C	CAAAGAGATAGAG AG (SEQ ID NO: 151)	AAATCAAATTCATTCATATCAAAGAG ATAGAGAGAAA (SEQ ID NO: 332)
AT1G1 3000		Proteína de função desconhecida (DUF707)	AAAAGAAAAAAAA AA (SEQ ID NO: 152)	AAAAGAAAAAAAAAAATCTCAGTCAA GTTCGTCCGAAAGTTTTCAACGACGA CGGCTTTTTAGAGATTTGATTCGTTTC ACTCTTCTGGGTATTGATTTTCTTCCTT AAATTTGCATCCTTTTTAACGTTTATC CAACGATCTTGCTCCGTTACTGAAACT CTGTTTCTCCGTTGCTTCTCTCGTCTCA TTTATTGTTCGTAACGTGATTTTACTA CTTCTGTTACTCGAGTAGAGATTACCC TTCTTATGTCCGAATCTGATTCGTCGT CTTTAAGCTTTGTCTTCTCCCAATTAG CTCAAAGTTCGTAACTTTGTTTACTTG CCAATAAGAAATTTCCAGAGACTGAA GTTTCCATTGAATGTATTGTTCTTGGA GAACTTAACCGGATTCAGGAC (SEQ ID NO: 333)

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AT5G1 3440		Subunidade ferroenxofre de ubiquinolcitocromo-Credutase	AAAGAAGAAAAAA AA (SEQ ID NO: 153)	CTCGAAGACTATTAAAGGAATATCCG CAAAGAAGAAAAAAAAACATTTTTTT GGTAAAGGACTAATCTTTTTGTTTGCA TCGGCCATCTCTAACCTTACGATTGTG TGTTCTTGCTTTGAGCGAAACCCTAGA ATCGGTCTTAACCCATTTGAGCAGAG (SEQ ID NO: 334)
AT3G0 5840	ATSK12	Proteína da superfamília de proteínas quinases	AAAGGAGATAAAG AG (SEQ ID NO: 154)	ACATTAGCTTCCTCATTTTTATTCTTAT TATTATTATTCATCAGACCAACAACAA AAAGGAGATAAAGAGAAGAGGATTC ATCATCATCAATCAATCCTTCATTTTA TGGATCTACTCATATCTTGATTCTTCC TTCTATCTCTCCCTTTTCTTCCATCTCT TTTTCTCTGGGTTTCCCCGGATTGAGT TTTTTAATCTCTGATTGACAGATTTGA AGAGCGTGACAAAGGAAGAATCTTTT ATTAAAACAAATTCTTCTGTTTTAATC TTGGG (SEQ ID NO: 335)
AT1G4 7250	PAF2	subunidade-alfa- F2 do proteassoma 20S	GAACAAGAAGAAG AA (SEQ ID NO: 155)	AAACGAAAAGCTTTTGAAGAACAGAG GAACAAGAAGAAGAAAG (SEQ ID NO: 336)
AT1G2 1460	SWEET 1	proteína da família de nodulina MtN3	ACAAGAAAAAAAG AA (SEQ ID NO: 156)	AGCTCATATTCTCTCACTTTCTCTCTC AGCTTACGAACAAGAAAAAAAGAAG AATCTTTAGCCACCTTTGAGATCAAAA G (SEQ ID NO: 337)
AT4G2 7450		proteína com domínios YGL e LRDR induzida por alumínio	GGAAAAGAAGAAA AA (SEQ ID NO: 157)	ATCCAAAACGTTTTTCCTTCCCACAGG AAAAGAAGAAAAACAGACAGCGGAG GACTAAAACAACTAGCCACAACACAA CGCTTCAAATATATATTACTCTGCCAC TTTCTTCAATCTTCCTTCAAAGATTCTT ATTACAGCGACACACAACTCTTTTCCA TTTAGATTTTTGATTTTTTTTGGTTCTC TAAAGGAGGAGAGAA (SEQ ID NO: 338)
AT3G6 1460	BRH1	RING-H2 brassinosteroideresponsiva	GGAAAAAAAACAG AG (SEQ ID NO: 158)	AACTTTTTCAAAAAAAGGAAAAAAAA CAGAGCTCACTCATTATTATCTCTCTA AAAACCCTAGCTTTCTCC (SEQ ID NO: 339)
AT2G3 5060	KUP11	captação de K+ permease 11	FGCAGAGAAAGAG AA (SEQ ID NO: 159)	AATCAGCTGCAGAGAAAGAGAAGTCA AAACGCAGCTCTCTCTTGCGTTTTCTT CCTTTCTCCTTTCTCAATTCCCCAGAG AACAACATAACTCTGTAAAAGGGAAA CTCTATTTTGTTCTGAATCAAAAGTAG TTTTAA (SEQ ID NO: 340)
AT1G5 3730	SRF6	“STRUBBELIGreceptor family 6”	TAGAGAGAGGAAG AA (SEQ ID NO: 160)	ATTTCTCTTTCTTTCTTAAGCTTTTTCA CAAGACTAGACTTTAGCTTATCGTTCT AGAGAGAGGAAGAAG (SEQ ID NO: 341)
AT5G0 2250	RNR1	proteína da família de Ribonuclease II/R	AACACAGAGAGAG AA (SEQ ID NO: 161)	ATAGAATTTCTCGTTTTTATCACCCGC TTCATTTGCCTTTCTATCGCCACAAGA ACACAGAGAGAGAACGATTAGCCCAG TTCCGATATCGTTCGGTGGCTTCTTCA TCTGAAGCTACG (SEQ ID NO: 342)
AT4G1 3520	SMAP1	proteína ácida pequena 1	GAAGAAGAAAACG AA (SEQ ID NO: 162)	GACAGTCAGTCACTGTAACATTTTAG ATCTTTCCCGAAGAAGAAAACGAAGA AGAGACGAAGAGAGAA (SEQ ID NO: 343)

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AT1G5 3230	TCP3	“TEOSINTE BRANCHED 1, cycloidea and PCF transcription factor 3”	GACAAAAGAAGAG AA (SEQ ID NO: 163)	CAGAAACAGAGACAAATTCTAAAAAA GAAACAATCTTTAGACAAAAGAAGAG AAATTTAGTCATGGGTTAGTCTGCAA AATTCAATTACGTCTTCTTCTTCTTCTT CTTCTTCATCTTTGATTTGTTGGCGTGT TTAGGGTTTGGGATTTGGAGGAGAGG CAAAATGTTGAATTAAATAAATCGAA CGACTCTGGATTCCTCGGCGGTTAACG ACCGCCGTCGCCGCCGCCGTCATAAT CCAACCACCACCACCATCAACGACCT TGAATTTCCACAATATGCTTCATCA (SEQ ID NO: 344)
AT5G4 6860	VAM3	proteína da família Sintaxina/tSNARE	CCAGGAAAAAAAG AG (SEQ ID NO: 164)	ACAACTTTATCTCAGCTTTTTCTTCTC AATTAAAATCAGTTTGGGATTTTTTCG AAAACGCTTTTCAATCTTCGTCTATCT GTCTCCACGATCCACGCCTTGACCTTC GTTTTTTTTTTCTCAGAGATTAGAGAA AACTCCGATAACCAATTTCTCAATCTT TTTGTAGATCCAATTTTTCCAGGAAAA AAAGAGGTTTCGCGAAGAAG (SEQ ID NO: 345)
AT4G3 7830		relacionado a citocromo-Coxidase	TGCAGAGAAAAAG AA (SEQ ID NO: 165)	AGTGAGTCACATAACCCTCTTGGAAA GAGTCTCAACACTTGCAGAGAAAAAG AACAAGGAAGATCCCGGAAA (SEQ ID NO: 346)
AT3G1 4205		Proteína da família de fosfoinositideofosfatases	CAAAAAAAAAAAA AG (SEQ ID NO: 166)	TTAAACCCAGAAATCACCAAAAAAAA AAAAAGTACATTTCCTTTTTTTTTGTT CTTAAATTTTTCTGTGGTTCCGGTCAC CGCAGCTCTGTCATCATCTTCTTCTTC TTCATTTACCAATCTGAAATCTACTCA GATTCTTTGTGATTTTCTCCTTAAAAT CTCGATCTGTATCGTACAGTGACTTGT GAAATTAGGATCGTTGTGTCTGTGTTT TCTGGTTACAGTTTGTAAAATTTGAAT ATTTGTGTGTGAAGTCAGATTCAGTTT CGTGAGCTGTTCGGATTTGGTTTGGGG GTATATATATAGCGTTGTGTGATCTAT TTGGGGGGTTTTGGTTTCCCTTTTTTTC TCTCTTGTGAATTCGTTTATTGTTGTAT CGTCGGCCCGAGTTTATCGGAACTCC GGGTCTGACGTGAGTTTTCCAA (SEQ ID NO: 347)
AT5G3 8700			GAAACAAAAAAAA AA (SEQ ID NO: 167)	ATTCATCACCACAATCACCTGAAGAG CCAAAGCAGCAAAAGAAACAAAAAA AAAACAAGAAGTGAAGTCAGATCTCG AAAAAGAGTTTACGAATCC (SEQ ID NO: 348)
AT2G1 8670		proteína da superfamília RING/U-box	AAAAAAAGAGGAG AA (SEQ ID NO: 168)	AAACGTTACTGTCACTAAATGAAATC TATTTTTCTTTCTTAAATTTTGCTCTGA CAAATATTTTTGATTGCGTCATTTTCT ACTTTGGAAATGTCTTTGATTTAGCAT TTCAGTTCGCTCAAAACATCAAATCTT ACCTTCTTTAGCTTTCACATTAGATTC TGGTAATTATTAGCACAAAAAAAAGA TAAGCCAGAATACGAAACAACCAAAA AAAGAGGAGAATTCTTTTTTTTTTTTT TCTTTCCG (SEQ ID NO: 349)
AT1G4 5000		proteína da família de ATPase tipoAAA	AAAACAGAAAAAA AG (SEQ ID NO: 169)	CTCAAGAAAACAAAATTACTTTAAAA CAGAAAAAAAGTTGATAAATTGCTTC AGTGTCAAATTCTGAGATCTGTAAAA G (SEQ ID NO: 350)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 85/191

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AT1G2 0650	ASG5	Proteína da superfamília de proteínas quinases	AGAGAAGAAACAG AG (SEQ ID NO: 170)	TAAAATAAATGAGAAGAACAAAAATT CAGTTGTTAAAATCAAAGTAGTGTCTC TACCGTGATTTTTATTTTTTTCTATATA CTGTTTAAACCTCAGTTTTTTTGTTGTT GTTATAAGATCCTTGTCATTTTTTGTC GTGATTAGATGTAATTTGTATAATTTT AGTAACTCTTCAGTTTTTTTTTGTTTTA AAAATATATTTTCTCTCTCTCTGTCTTC CTGCAATCTATCGCCGGCCGATTCAAT AATTTCGCTTTACTCTGCCAAAAAAGT TTGTTCTTTTGTTTTCTGGGATTATCCA AAGAGAAGAAACAGAGGAAATCAAT CTCTTTTTTAGTTTCAGACCCTAAATC CTAGGTTTTGAAGTTTTGTTTCTTTAG TAATTTTGTCAGGTTTTGTGTCTGGTG TTGGGATTTTTCGGAGCTTGGTTTCTT GAACCAGCTCCATTTTCTAAAAATTCC TTCTTTAAATCCCCATTGTTGTAAGTC TTAAAGAAAAAAGAAG (SEQ ID NO: 351)
AT4G2 9070		Proteína da família de Fosfolipase A2	GAAAAAAAAAACG AA (SEQ ID NO: 171)	GTCATTTGCTAAGGAAAAAAAAAACG AAAACGTGTGTCTGTCTCTTCTCGTAG CGTCTCTCAAGCTCAG (SEQ ID NO: 352)
AT4G2 6410		Proteína conservada não distinguida UCP022280	GAAAGAAGGAGAA AA (SEQ ID NO: 172)	AAAACCAACTTCTAATTTGGAATCAA ATTGAACCGAATCGAACCGGTTGAAG TTGAAAGAAGGAGAAAAGGCGTTGTC TCCGTGCGAGAAAGGCAAATCGGAGA CG (SEQ ID NO: 353)
AT4G0 3420		Proteína de função desconhecida (DUF789)	ACAGAAAAAAAAG AA (SEQ ID NO: 173)	TTTTTTATTTTCTTGACAAGTCTGCATT TTTCTCCTCTGTTTTGGAATTTTCTCGT TTCTGGTTTTCCGATCATAAAAAACAA ACAAAACTACCGTAAAATAGGCTCTC TCCACAGAAAAAAAAGAAGACTTTTC TTTCATTCTTCTGCAAGTAACTGAGCA GATTTCGGTTTTTTCTTCTTCAAATTG ATATTTTTAAAGTTATAAAAATTTCTT GTCCATAATTTCCGTTTTCCTTAAATT CAGCTGTCCTAACGTCAAATCTCAGA CACTCGCTTGCGTGTCTCCCTCTCTTA AACTCTCTCTTTCTCTTTCTCTTTTGGT TTCTGGGTTATTTCAAAGAAAAGAAT CAAGAAACCCCTCTTTCTCTCTTACAA GAATCCCATC (SEQ ID NO: 354)
AT2G3 1410			CAAAGAAGAGAAG AA (SEQ ID NO: 174)	AAAACCTCACAGCCACACAAAGAAGA GAAGAA (SEQ ID NO: 355)
AT4G3 3030	SQD1	sulfoquinovosildi acilglicerol 1	GGGAGAAGAGAAG AG (SEQ ID NO: 175)	ATATCTGTCTCATCTCATCTCTCATCG TTCCGGGAGAAGAGAAGAGAGACCCA TCCCTCACTTCAAAGTTCAAAGTCTCG AAGGATCTTCTCCAACTCTCTCTAAAC AAGATTCCAAATTTTCAAAGGTGAAT TTGTTTGATAGAATCAAGAACAAACC TTTAAA (SEQ ID NO: 356)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 86/191

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AT3G5 2470		Proteína da família de glicoproteinas ricas em hidroxipolina abundante na embriogênese tardia (LEA, “Late Embryogenesis Abundant”)	TAGAGAGAGAGAA AG (SEQ ID NO: 176)	ATATTTCTTCCCATCGTCACTAGTCAC GACCACACAAACAAAAAAAATATAAC ATTTAGAGAGAGAGAAAGGTACAGCA GTGGCAAACTCGTAAATAAAGA (SEQ ID NO: 357)
AT1G2 3900	Gamma- ADR	gama-adaptina 1	GAAGAAAAAAACG AG (SEQ ID NO: 177)	AATTATGGTTTACGAAGACTGAGAAG AAAAAAACGAGCATCGTCCATCGAGA TCCAAATCCTCAGTTTCATTTTCATCT CTCTCTCTCGTATTGATCAGCTACTCG AAACTCCGGTAACGGATTTTCACAAT CCCGGCGGCGAAACTCTTCTTCCCGGC TAAGTTTTCATTTTCTTCAGATTCCTC GTAAAGTTGCCGGTGGACCAAGGTCC AACTCTTGAACACCCCAAATC (SEQ ID NO: 358)
AT IGO 2610		proteína da superfamília dedo de zinco RING/FYVE/PH D	CAAGAAAAAACAG AG (SEQ ID NO: 178)	CATTCATTTGTTCTTTCTTCAGAGAAA AACAAAAAACAGAGCATTTTTTTTGG TCAAGAGCAAGAAAAAACAGAGCAT ACTTTTGCAAAAAGCAGAGCTTGGAG CGCTTTCTTGTCATCTAAAATTCAAAG GCAGAGACG (SEQ ID NO: 359)
AT5G4 8220		Proteína da família barril TIM do tipo aldolase	GCGAGAGACAGAG AG (SEQ ID NO: 179)	GTTTGGAAATAACGTGTAAGTAGGAC CCACTTTTGTGATTATCCGCCGCACAG AAGTCTCTCCTCCACTCCACAAATAGC ATTCCCGGCGAGAGACAGAGAGCGAA GAAGAAGACTCAAACCAAAAAAAAA A (SEQ ID NO: 360)
AT3G6 1070	ΡΕΧ11Ε	peroxina 1 IE	GAAAGAAATAAAA AG (SEQ ID NO: 180)	ATCGACGGTTAGAAATGAAACGATTA GGAGATTAGATCGTTGAACAAAACGA CGTGTTTTGGTCTATTTATAAAGAAAG AAATAAAAAGGAGAGATGACCAAAC ACGCCTTTATCATAGTTTCTATCTCCG ATGACACAAAACGAGGAAGATTATTT GACATTTTAAGTAAGAACAGCTAGCT TTGCCATCTCCCTAAAGGCAATAAATC TCGGATCCACTTTCACGATATTTTGAT ATTTTTTCTATTTATAATCTTTCTGGGT TTTGAGTCTTTTGAAGGCTGAATTGCT CTGAAATCTCAATTGTATAATCATCTC CTGGGTCGTCGTTATCGTGATCATCTA GAAAGC (SEQ ID NO: 361)
AT2G4 5170	ATG8E	AUTOFAGIA 8E	GACGAAAAGAAAA AG (SEQ ID NO: 181)	ATCCAATCATAGACGAAAAGAAAAAG GTTCCTTTTTTTGACTTTGTATCCGTAG ATCATCTTCTTCTTCTTCTTCCAGAGTT TTATCCTTATCCGTTCCATCAAATTCT CTCTCTAAGCAAAG (SEQ ID NO: 362)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 87/191

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AT1G5 3380		Proteína de planta de função desconhecida (DUF641)	TAAAGAAACAGAG AG (SEQ ID NO: 182)	GTTTCTCATCTCCAGCTCTCATTTTCTC TCTCATCTTCAACCTTAACTCTCTTTTC TCTCTACTCTTTCTTTGGACGAATCTG TCTATTGTTTGTAAGTTTTCAAGGAAG GTAAAGAAACAGAGAGATCTAACTTC GTCTGCAGGGTTTAAGCAGAGGTTGG TTTGTGGATTCTTCGATTTCTTCTTCAG ATTTAGTCTACAATGAAGTGAGAATTT CTAAAGATAAACAAAGAAAAACTTGA GACTTTAGCAAG (SEQ ID NO: 363)
AT5G0 7240	IQD24	domínio-IQ 24	CAAAAACAAAAAG AA (SEQ ID NO: 183)	AATTGTCTCTTCTTTTCTTTTTGTACTT GTCAAAAACAAAAAGAACAACAAAA AAAATCTCAACCGTAGAAAATTCCGA CAAGAGTTCAGTTCATACAATGAACT AAGT (SEQ ID NO: 364)
AT4G3 0010			AAAAAGGAAGAAG AG (SEQ ID NO: 184)	ATCTTCGGAAAGTCTCATTTCTCGATC CCCAATTCGTGGATTAGGGTTAAAAG AACCATTTTTATTCTCGTCGCGCAACA ACAAATCCAGATCGAAAAAGGAAGA AGAGATCGAA (SEQ ID NO: 365)
AT5G0 2480		proteína da superfamília de chaperonas HSP20-like	GAAGAAGAATAAA AA (SEQ ID NO: 185)	TAATCCAATCTTCTTCTTACATAAACA CCTCTCCTCCCCCACCGTTTCCAAAAG AGAGAAGCTTTCTCACTAACACCAAA AACAAGTCTTTGAAGAAGAATAAAAA GATTGGATTTTGATAAGTTTAGTGAAA ATGGGGGAGCTTTTGTGTTCTTCACTG TGGAACCCGTCACGATTCATTGTTGCT TCTCTCAAAAGGTATTTTCTGGGTTTA GCTTCTTAGAGGTTCTTCGTTCTTAAA GGTCTGTTTTTTTTTAGGTTGTGATAC TTTGAATGTAAAAAAGGGAAGATTTT TAGTTTCGATATGTATATCTCTCGGAT GGGTTTGAGTCGGAGTTTCCCGCCGCT TTTTGGGGGATTTCGGGAAATTCTAGG GTTAGGGTTGGATATTGTCTTCCTCTA GCAGTCTCTGCCACTTTTAAAATCTCT TCATCTTTCTTTGAGAGTGAAAGAGGT TTTTTTATTTGTTTGTGTCTTCCTGGGA ATCGAGATTCTGGATCTTAATCAATAT GTGGGTTAATTGGGAGATCTGGGATT TGGGAGATCTTGTGGTGGATTGAAGA AAAAGCAAGGTTGTAGATTTTGAAAA (SEQ ID NO: 366)
AT3G0 9860			TGACGAGAGAGAG AG (SEQ ID NO: 186)	GGTAGAAAGAAAGGATTTTTATTTAT CCAGAATCAATCGCCGGAGAAGAAGA TAAACACAGAGAGTGACGAGAGAGA GAGTGAAA (SEQ ID NO: 367)
AT2G3 0530			GAAACAGAGAGAG AT (SEQ ID NO: 187)	CCTGTCTAGCGTTGACGACACCAAAA TTGAAAATTTGGCATCATTTGCGAAAC AGAGAGAGATCCATTCAATTCCAAAA GGATTCTCTTTTGGGAAAACCCTAAAT CGACCCACCAAATTTGGAGACTGTGA TTGAGCATGAGCGTCAGAAGTTG (SEQ ID NO: 368)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 88/191

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AT4G3 5860	GB2	ligante-GTP 2	AGATGAGAAGGAG AA (SEQ ID NO: 188)	ATTAGATCCCTTTAATTTTAGTAATTA AGTAAAAAGATTATAAAAGATGAGAA GGAGAAGATAGCTTCTTCATCGAGAA ACCTCGAAATCAAAAAGCACGTCGGT GACTTGTACTCTTCAATCTCTTCTTCCT CTCTTTCACATCTCCTTCTCTCGAACC CATCGACCTGCGCTAATTCATCATCGA CCTTGCTCAAATTCATCAACC (SEQ ID NO: 369)
AT3G5 3990		Proteína da superfamília adeninanucleotídeo-alfahidrolases-like	TGAGAAGAAAAAA AG (SEQ ID NO: 189)	AACTTCCAAATCCTTTATATAACTTCT CACAAGTCACCACCATTTCTCTCTAGA AAATATCAGAAAAACAAAACCATCTC AAAGTTTCTTGAGAAGAAAAAAAGGG TCAAGAAAG (SEQ ID NO: 370)
AT3G1 7650	YSL5	YELLOW STRIPE like 5	CAGAGAAAACAAG AG (SEQ ID NO: 190)	GAGTCCAAGTTGACTCCTTCGAGCTTT GATTCTCGTTCCAATAATACTTCCTCC ACCATCTCTCCTCCTCTCGTTAGATCT AAGAAACAGAGAAAACAAGAGAGAT AGA (SEQ ID NO: 371)
AT1G6 9530	EXPAI	expansina Al	AAAAAGAAAAAAG AA (SEQ ID NO: 191)	CCAATTCTAAACCAAACAACAGATTC TCATAATCATCTCTTCTTTTTTCCTCTT TACGAAAAGAAGAAAGATCAAACCTT CCAAGTAATCATTTTCTTTCTCTCTCTC ACACACACACATTCACTAGTTTTAGCT TCACAAAATGTGATCTAACTTCATTTA CCTATATGCAGGTTTACACAAAAAGA AAAAAGAACG (SEQ ID NO: 372)
AT1G7 0600		Proteína da superfamília de proteínas ribossomais L18e/L15	CGCAAAGAGAGAA AG (SEQ ID NO: 192)	CTAGCCGCAAAGAGAGAAAGGGAGG GAGGAGAGTGTAGCAGATCGGCGAAA (SEQ ID NO: 373)
AT3G4 9140		Proteína da superfamília repetição do pentatricopeptíde o (PPR)	TAGAGAGAGCGAG AG (SEQ ID NO: 193)	GTCCAGCTTCTGAGCTCAGAGATAGA GAGAGCGAGAGGTTAGAGATAACAGT AGTTTTACCG (SEQ ID NO: 374)
AT3G2 2290		Proteína transportadora de vesículas do reticulo endoplasmático	GAGACGGAAAAAG AG (SEQ ID NO: 194)	AAATTGATAACTTCTAATAAATGGAG GGTGCAATTAATAAATAAGGAGAGAC GGAAAAAGAGACGCCGTTGAAACACC GCAAAACAGAGAAGCGCCTTTTGATT GTCTCTCTCCCGGAGATCTCTCTTTCT CTTCTTCTCCATCCTTCTTCTCTCGGCG CGCGCTTCATCCCCACCACCTTCGAAT TCGTGCCCTTTGAGGGAAGCTGCTAG G (SEQ ID NO: 375)
AT3G1 3520	ATAGP 12	arabinogalactanaproteína 12	CAAAGAGAAGAAC AA (SEQ ID NO: 195)	ATTTTATAGAGACGTCTCTGGAAAAA ACATTCCCAAAATTGGCTTATAAATAC TTTCAAAACCACAAGGCCACAACTCA TCATTCGCACCAAAGAGAAGAACAAA ACATCATCATATATTCTATTGACTAGA TTAATTTCTTCTAAGTGCAAAAGAGG AGAA (SEQ ID NO: 376)
AT1G5 3850	PAE1	subunidade-alfa- E1 do proteassoma 20S	AAAAGAGAGCAAA AG (SEQ ID NO: 196)	CGTCTTTGAAAGCTAAAAAGAGAGCA AAAGCTTCTGTTTATTCTCCGATTCGC AGATCAATTAGCTGGGTTTTGATTCCG TTGTGCGAAGGACTTTAAGAGGTTTTG CAGATCGAAATCGGAAGAGAAGAAG AAG (SEQ ID NO: 377)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 89/191

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AT1G2 2200		Proteína transportadora de vesículas do reticulo endoplasmático	CGAGAAAATAGAG AG (SEQ ID NO: 197)	TCCGTGATTCTTCTCTTTAGCTTATTTT TGGGGAAGACAATTCCGAGAAAATAG AGAGTAGAGAGATCCTAAAGAGTCAA AAGAGGTCAGGTGATTGATTAACCCG TTGAATAATCTCCTTCTCCCGTTGAAT CGGGTCGAAATAGTTGAACTTTAAGC CAAACCCTAGCTTGAGGAGGAAGAGG A (SEQ ID NO: 378)
AT4G3 3520	PAA1	ATPase do tipo-P 1	GGAAAAAAGAAAG AT (SEQ ID NO: 198)	AAACAAACGCAGGAGGCCTGGAAAA AAGAAAGATAACGGGACTCGAGAGAT TGAGATTACGGAGCCACCCACTTTC (SEQ ID NO: 379)
AT2G1 5560		Endonuclease ou glicosil-hidrolase putativa	GAAGAAGATCGAG AA (SEQ ID NO: 199)	TATATGCTTTCTCTGGACAAACGCAAA AACTTTTGTAGAACCCTAAAAATTCCC AAAATCCGTCGGAGAAGAAGATCGAG AAGAATCAACAACTAATCTGAAGAAT TTTCCAAATTCCGTCTTCGTATCGTCT ACGAGATCCTTATCTCTCCCCTGAATC TGGAACCTTTG (SEQ ID NO: 380)
AT1G7 1980		Proteína da família dedo de zinco RING/-Ubox associada à protease (PA, “ProteaseAssociated”)	CAAAAAAAAAAAG AT (SEQ ID NO: 200)	AACAAAACTCGAATCAGAGAATTCCA GATATTACTTACATAAGACAATTTTAG CAATTAGCTTTCAAATCTCATCTCTTT ATTCTCTCTCTCTATCTCTTCTCCTCAA GAACCCTAAAAATCTCCAGAAAAAAG ATCCCAAATTTCGTATTTCAACGATCT GAATCTCTCTCTCTTTCGGGTTTATTTT GTTTCCCGATATGGTTTAGAATTTGTG ATTTAAATGGAAGCTGACGTGTCAAT TTCCTGAAAAAACCCTTATCGCGAAA TTTTCCAGATTACCAAAAAAAAAAAG ATTGAAACTTTTTTCGATTTGTTTGAA GAAGAAGCACGGTAGGAACGACGAC G (SEQ ID NO: 381)
AT1G5 1950	IAA18	proteína 18 induzível por ácido indol-3acético	GAAAAAAGATAAG AA (SEQ ID NO: 201)	AGAGAGAGAGAGAACACAAAGTGGG AAAAAAGATAAGAACCCACCATAAAG TTTTAACATTTTTCCCTTCAAAAGGCG AAAGCTTTTGATTTGTATAAAAGTCCC ACTTAATCACCTCTCTAGCTTCTCATT CCATTTCCATCTCCTCTCTTTTGTTTTC TAAGTTGCTTCAAGAGTTTTGGATAGT GTAGCAGAGAGATTTTAACTAATGGG TTTATAAAATTTTGTTCTTTTGCGTGA ACAAGTTGTCAACTTCTAGACAGATTT TCTTTTTGAAGTGTTTTCTTGTCGAAA TTCTTCTTCTTTTGGTCAAAGAACGCA AGATTCTTCTGTAGTTCCTCTAAAAAA AATCCTA (SEQ ID NO: 382)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 90/191

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AT3G5 8030		proteína da superfamília RING/U-box	AAAAAAAAGGGCG AA (SEQ ID NO: 202)	CGTCCTTCTTATCATTATAATCATCTTT TTAATCAAAAAAGGTTTGCACATAAC ATAAGCTTTTTTCTTTCTCTCTTAATCA GAAAACAATCTTGTCTCACAAAAATA TAATTAATGATTCTAAATTTCCCTAAC CGTCCGATCACAAAAGATCGTGATCA TCGCGTGGAAACTTTAGACCAATCTTT TCCCTAAACCGGACCGTACCAGATTC CTTCTCTCTCTCTCTGCTTAGAGAGTT TTAGGTTCGTTTTCCCACTTAAGCCAA ATTGGACAAGATTTGGACGTTTCTGTA TCTCTCTTAAAGCTAAAAAAAAGGGC GAATTTTTCCATGGCGTTGTCGGAGTT TCAGCTAGCTCTGAGCTTGGTGGTCTT GTTCTTCTAGCTGATTTGATCGAAACC CCATGTTCTTATGATTTTACACGACCT AATCCAAAACTCCAGAGCACACGGAG ACGGAGTACATATTGTTCAGCGCAAG TGAAAGCAAGAGCCTTTTTGTCTATTG (SEQ ID NO: 383)
AT3G5 6010			CACACAGAAACAG AG (SEQ ID NO: 203)	GTGTTTAGCTTCTTCACTACCACACAG AAACAGAGTTTCCGTCTTTCATCTTCC TCCATATGCGTCGCTCTTAAAAACCTA ATTCACA (SEQ ID NO: 384)
AT5G2 0165			TAGAGAAAACGAG AA (SEQ ID NO: 204)	AAAGGAAGAAAGGGGTAGAATTGGA AATATGTAGAGAAAACGAGAATAACT CTGACGCGAACGTTTCTCTCCTCCGTC TCTCGATCCCTCTCTTGACGTCTCGCT GATCTGTTTTGCTAAGATTCAAGCTTC AAAACCCTAATTTCTCTAGCCATTAGC ATCGATTTCAGCTCAACTTCAGATTCA AGGAAACAATTATTAGCTTCTCAAGT GCTTCAGTGATCCGATACA (SEQ ID NO: 385)
AT4G2 1445			CACCGAGAAAGAA AA (SEQ ID NO: 205)	GTTATCCTCATCTAGTCATCTTCACCC TCTAACTCACCGAGAAAGAAAAGTAA AGAGAGTTTGGTGTCACT (SEQ ID NO: 386)
AT3G0 2530		proteína da família de chaperoninas TCP-l/cpn60	ATAAAAGAGAGAG AA (SEQ ID NO: 206)	GAGCCCTCACTTGACAGAACTCAGAA ATTTGAAAGAGAAATAAAAGAGAGA GAAGCTCCCAGAGAAGAAAAGCCCTA AAAGCCCCACTCCTCTTTCCAGTTTCT TTTGATCTCTCAGCATCGAAA (SEQ ID NO: 387)
AT1G4 3700	VIP1	proteína 1 interagente com VIRE2	CGGGAAAAAAAAA AA (SEQ ID NO: 207)	CTTTGGTCCTACTTAGTACTTACCTGC CCCTCTCGACAAAATTTCTTTTGTACT TTCACATTTCTCTGTAATAAACTCGGT AGGTTTGCGAAAACCTCGCCGCCGGG AAAAAAAAAAATCA (SEQ ID NO: 388)
AT4G3 2600		proteína da superfamília RING/U-box	AACACAAAAAAAA AA (SEQ ID NO: 208)	AATCTCCCCTTGGTTGATCGGTGAACA CAAAAAAAAAAATCTAAAATAATCGC AAAATACATTTGAAGAAGCTACACGA TCAACAACAGCAAAGGATTTCGATTG TTGAAAAAGTTGACTCTTCTTAATTTG ATTCGTTGTCTTGGTTTCTGGGTTTTCT TCTTCTTCTTCTGCGGCGCTCTCCAAT TTTACACCTTGCGACCAGCGAGAAAA GAAACAAATTTCACCCCCATTGAAGA AGGACCTTTGGTTAAGCTCCATGGTGT GGTATGCGCAAAGTGGACAATACCTA G (SEQ ID NO: 389)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 91/191

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AT1G5 6580	SVB	Proteína de função desconhecida, DUF538	CCAAAAAAAACAG AG (SEQ ID NO: 209)	TAAGAGACAGAGAGATCTTAACACAA AACAAAGCAAACACCAAAAAAAACA GAG (SEQ ID NO: 390)
AT5G4 3010	RPT4A	partícula reguladora triploA ATPase A4	GAAGCAGATACAG AA (SEQ ID NO: 210)	AAACCCATTGCTCAAGAAAACTTTTC AGACAGATTTGTTTCGAGAAAAGATC GCTTGCTTGGCTTTTCAGGATAATCTG AGATCTATCTGTAGAAGAAGCAGATA CAGAATTCAGAAACG (SEQ ID NO: 391)
AT3G0 1640	GLCAK	glicuronoquinase G	AAAAGAAAGTAAA AA (SEQ ID NO: 211)	AAAAAAAGAAAGTAAAAAACGCGTC AGGGAAGAGAAG (SEQ ID NO: 392)
AT5G1 7770	CBR1	NADH:citocromo -B5-redutase 1	AAGGGAAAGAGAC AA (SEQ ID NO: 212)	AATAATGTGTTGCAAAAGAGGCAAAC TATACAACGTGAAAGTGGTAGGTCTA CCAGATCCCATACCCTCATTTTAATGG CGGAGATTACAAGGGAAAGAGACAA CTCCAATTCAAAGCTCTGATTTTTTCC ACCAATCCCCATTTTTTCCCTTTTACA ATTCTTAAGCTAGTTTTATACTTTTCTT CTTCCTTTCATTTGGGTTAAGAGAAGC C (SEQ ID NO: 393)
AT4G1 7840			AAATGAAGAAGAG AA (SEQ ID NO: 213)	ATCAAAATCAATGATCAAGGTAACGT AGTCAAGTTCAATTACTCTTTGTCAAA TTTAAGTGGTCTCTATTACTAAACTAT ACACAACCGTTAGATCAAATAATTCT CTACCATCCAACGGTCCAAAGTCTCC ACTTCTATTTATTACAATAAAATGAGA AAATAAAAACGCGCGGTCACCGATTC TCTCTCGCTCTCTCTGTTACTAAATGA AGAAGAGAATCTCTCCGGCGAGATCA CCGGCGTTATTCCGATAATTTCGCCTG AGAGTTGTCGCATGTTATAA (SEQ ID NO: 394)
AT4G3 0960	SNRK3. 14	proteína 3 interagente com S0S3	ACGGCAAAAGGAG AA (SEQ ID NO: 214)	ATCCGACGGCAAAAGGAGAATTAAGA TTTTTAACTTTAAACGAGAGTTTCGTT TATTTACTCAAAAATTTACTTCTGAAA TCTCTATTTGAATTTCGGGGAAAAAA ATCCTAAGTAAGGGAATGCAGAGAGA TGGTCGGAGTATCGCCGGTGAAGACT AAGCTGTGTGATCGGTTTAACCGATCC GTCGGCGGCAGGAATTGCCACCGGAA ACACGTCGAGGACGGGTGATCCAGTT TTCTAAACTCTCGTCTCTCGAATTCTT CGAAGATATCGAAAAACTGTAAATCT TTTTTTTCTTCTACTTTTTTACAAAATT CTCTAATCATCGTTGTAAAGTAAAAA ACC (SEQ ID NO: 395)
AT4G1 6580		Proteína da família de proteínas fosfatases 2C	GAAGGAGGTGAAA AG (SEQ ID NO: 215)	TTCTTTCGTGAAATTTGTCATCTCTTCT TTCAGAAACTTATCTGGATTCTAGCCA ATTTCTGTTGTGACTTTGACATTATCT TCTCCAGAAGGAGGTGAAAAGAGAAT TTGTGGGTCCTGGTAAGTTCCGAATTC GTATTTGATTGAGCTCTGAGTTTCAAG GGTTTGTGTTGGATCAATCTTTAGATT CGTTGGTGAAAGCGTTTAAATCGACG AAAAAAGTGATGCTTTGGAAGATATG ATCTTCTCTATCTCTGGTTATTACTGG GTTTCGAGATTCTTGTGCTTAAG (SEQ ID NO: 396)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 92/191

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AT4G1 2830		proteína da superfamília de alfa/betahidrolases	AAAGAACAAAAAA AA (SEQ ID NO: 216)	TAAACCACCAATTCTCTCATCCGTACC AAAGAACAAAAAAAAGATAAA (SEQ ID NO: 397)
AT4G1 0040	CYTC-2	ligante de citocromo C-2	AAAAAAAAATCAG AA (SEQ ID NO: 217)	ACTTCTCATAAAAAAGGTCATTTCAA AAAAAAATCAGAAACCGTCAAAAAGC CACCGTTGATATTTCTTCCTTGTTGCTT CTTCA (SEQ ID NO: 398)
AT3G0 6670			AGAAGAAAATAAA AG (SEQ ID NO: 218)	CTCCTCTCTCTTCTCTCTTCTTTCGCGT TTCGAAGGTTGGGGAAAGCTTTCGCA GAAGAAAATAAAAGCTAGAGAGAGA ATGTCAATGTTTTTTTGATGCTCCGTC TGGCAATTAGGGTTTCTTTTTTCTTTG ATTTCGTCCCCTTCGAGAACTGAATCT CCCGCCTATATCGACGCCGTCTAATTC CTATCATTTCTCGTTGCTCCAAAACCC TAACTTTACTACCGTCGGTCATTATTT TCACTTTCTCGGCTCGATTTGGTGTTG GAGGTTGGTAATCAGTT (SEQ ID NO: 399)
AT2G2 9700	PHI	homólogo 1 de pleckstrina	TAGGAAGACGAAG AA (SEQ ID NO: 219)	CGAGCGACCAAAACGCAGAGTTTTGA CAGCAATTGAGTGGATACCGAATCAC AATAATACAGAAAGACATTAAAAGCA ACAAGGAATCGCGCGATTGGGGGCAG TTGGAGAGACGAACAAGTCGTGGTGA GATTTTAGGAAGACGAAGAAG (SEQ ID NO: 400)
AT2G2 0740		Proteína da família de tetraspaninas	AACAGACGAAGAG AA (SEQ ID NO: 220)	AAGTATCAAAAAAATTACAACTTTAC GATTTGCTTAGAAAGGAGAAGACATC TGGAGCAACAGGATTTACAAAAGTTA TTATCTTTATCGATTTCTCTTCTTCCTA GACCCAACAGACGAAGAGAATTTGTT GTTGGTTGTCTCTGGTCTCTTCGTCTA GGTTTTTTTTGGGTTATTAAAG (SEQ ID NO: 401)
AT5G4 0930	TOM204	translocase de membrana externa 20-4	GAAGAAGAATCAA AA (SEQ ID NO: 221)	CTTAAATTATCGTTTGTGACGGAAGA AGAATCAAAACAATTAATCGCGAGGC TTGAGAATCAATCA (SEQ ID NO: 402)
AT5G2 1274	CAM6	calmodulina 6	AAAAAAAGGTAAG AA (SEQ ID NO: 222)	AGAGAGGCAAATAATATATTCAGTAG CAAAAAAAAAATCTGGGATTTCTAAA AAAAGGTAAGAAGGAAA (SEQ ID NO: 403)
AT4G2 3740		Proteína da família de proteínas quinases com repetições ricas em leucina	GCCAAAAAATAAG AA (SEQ ID NO: 223)	CTTTCACCCACTTTAATATGCCAAAAA ATAAGAACAAAATTATATCCGTTGCTT GAAAATCACAAGCTCTTCTTAACTTCA CAAGTGCTTCAATGGCGGTTCTTCACA TTATCTTCACTGCGTAATTGAAGAAGT TGTTCTCTCTTCCTCTTAATTTCGAGTT GTGTTCTTAAAAAACTCCAGAGCTGA TTCGATTCTCGAGAAGAAACTAAGCC GACAATAAAGTTCAGATCTGGAAAAA AGCGAGCTCCAGATTACAAAAAGAAA CAGCTCGTTTTTTTCACTTTCAAAAAA (SEQ ID NO: 404)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 93/191

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AT4G2 2820		proteína da família dedo de zinco A20/AN1 like	CCAGAAGAAAGAG AT (SEQ ID NO: 224)	TAGTTACGTGTTTCTGTTTTTCTCTAAT TTTTCTCTTGTTGTTCTCGATTAACGA AAAAGACTTGTCGTTCTCAATTCTTAT CGATTTAAGAACAAATCATCTAACGA AGATTACTTCCGAAGATCAGAAACAA ACACAAACTGTGAATCGTTGTTTGTTA ATTCTCTTTAAAATCGCCAGAAGAAA GAGATCTCCGTTTTCTACAGAAGAAA AGCAAGAGAGTAAGA (SEQ ID NO: 405)
AT4G2 2820		proteína da família dedo de zinco A20/AN1 like	AGAAAAGCAAGAG AG (SEQ ID NO: 225)	TAGTTACGTGTTTCTGTTTTTCTCTAAT TTTTCTCTTGTTGTTCTCGATTAACGA AAAAGACTTGTCGTTCTCAATTCTTAT CGATTTAAGAACAAATCATCTAACGA AGATTACTTCCGAAGATCAGAAACAA ACACAAACTGTGAATCGTTGTTTGTTA ATTCTCTTTAAAATCGCCAGAAGAAA GAGATCTCCGTTTTCTACAGAAGAAA AGCAAGAGAGTAAGA (SEQ ID NO: 406)
AT2G3 0170		Proteína da família de proteínas fosfatases 2C	GAACGAGAGAGCA AG (SEQ ID NO: 226)	GAGAACGAGAGAGCAAGCCATTGCAG GAAATGGCGATTCCAGTGACGAGAAT GATGGTTCCTCACGCAATACCATCGCT TCGTCTCTCACATCCAAACCCTAGTCG CGTTGACTTCCTCTGTCGCTGTGCTCC ATCAGAAATCCAACCACTTCGGCCTG AACTCTCTTTATCTGTCGGAATTCACG CAATCCCTCATCCAGATAAGTGTCGA AATTATATAGGTAGAGAAAGGTGGTG AAGATGCTTTCTTTGTAAGTAGTTATA GAGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 407)
AT5G4 7120	ΒΠ	inibidor BAX-1	AGCAAAAAAAACG AA (SEQ ID NO: 227)	AATATTTTCATTAATCGATTCTCAAAG TCAAGCAAAAAAAACGAAACA (SEQ ID NO: 408)
AT5G4 1990	WNK8	quinase sem lisina (K)8	GATAAAAGAGAAG AG (SEQ ID NO: 228)	CCTTTCATTGATTTCATCATCATCATC ATCCTTCGTTTTTTCTCTATCGATCTAG CAGATTCTTTCGGGGACCAAAATCAA AATCATGGTGGATCATCAATGGAAGG ATTTAATCGGATAAAAGAGAAGAGAC GGAATCACGACGGGAGAAGAGATCG GGAAATCGGAAAATCGGAGATGATGG GGATTTCTTTCGCCGCCAAACTCCGTT TCCGATCTCGATTTCGAACTTCTTCAA TCGATTCTTATTGCTTCGCTCGTGAGG CTTTCTCCGATTGTATCTCCTCCGTCC ATTTCTTCTTCTTATAACCTTTTTCTTT GTAATAACCTCCGTCCTCTTCAGCTTT CTTTCTTTTCATCTTCAATCTCACCTTA AATTCTCCACTTTTTTCTTCTTCTCCTT CTGTTCTCGATTGCTTTGTTTGTTGTGT TGTGCATACATAT (SEQ ID NO: 409)
AT3G6 2600	ERDJ3B	proteína da família choque térmico DNAJ	AAAACAAGTAGAG AG (SEQ ID NO: 229)	AATCGTTTCCACGAAAACAAGTAGAG AGAGTGATTCGAGTTTTCCAATCATAA AAATCAGCGAAGAAGATCTTCGTTCT TGTTCATTCTGTGAGGTTTCATTGTTA AAATCGAAACGAATCTCAGGTTGGAG TAATCCTTGGGAGAGATCCGATTTCCG TTTCC (SEQ ID NO: 410)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 94/191

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AT3G5 2060		proteína da família “Core-2/Ibranching” beta- 1,6-N- acetilglicosaminilt ransferase	TAAATAGAGAGAG AA (SEQ ID NO: 230)	GAAAAAACCGTATCTCATTATTATATA AATAGAGAGAGAACAGCCCCACGTAA ACAAATAGCGATAGAGCAACTGTGTC GATTGTCCCAAATAATTTTAAAAATA ATTTCACGTGTCCCCATTTTGCTGACG TCATTATTCCCCTTTTTCCTTTTTATTG TCACATCAGAATTTTTTCTAACTCATT CATTTCAATCAATCTTCTTCTTCTTCTT CTTCTTCTTCCTCAGAGAAATTCTGTG TTGTTGTATACAGAGAG (SEQ ID NO: 411)
AT5G0 6060		proteína da superfamília dobra Rossmann ligante de NAD(P)	PCCACAAAAAGAG AG (SEQ ID NO: 231)	ACTCACACATCCACAAAAAGAGAGTT AGAGATTCCAAGGAGGAGAGTGCGTG AGCGTGACA (SEQ ID NO: 412)
AT1G1 4210		Proteína da família ribonuclease T2	AAGAAACACAGAG AG (SEQ ID NO: 232)	AAGAAACACAGAGAGCAAAACAC (SEQ ID NO: 413)
AT2G2 6690		Proteína da superfamília facilitadora maior	AGAAGAAACTAAG AA (SEQ ID NO: 233)	GCTTCTGTGGCTAACAAAGAGCAAAC AAACACTTAGAAGAAACTAAGAATAC TCTCATCAAGGCGATATAGAAAAAA (SEQ ID NO: 414)
AT2G0 5840	PAA2	subunidade PAA2 do proteassoma 20S	TGAAGACAAAGAA AG (SEQ ID NO: 234)	TTTTTTTTTGGGTTCTGTCTTGAAGAC AAAGAAAGCTTTCTTCTATAATACATC TTTCTCTACAGATCACACAGAAGCAA AAATTCCATCTCCGATTTCGGAAGAG AGTTGTTCTCTTCTCTGAGAAGAAGAA G (SEQ ID NO: 415)
AT1G1 2580	PEPKR1	Cinase 1 relacionada à fosfoenolpiruvato -carboxilase	TGCCAAAAAAAAG AG (SEQ ID NO: 235)	GAGAGAGGACTGGGTCTGGTCTCTTC GCTGCAACCTATAGCTGTTGTTTGCTC TTCGACGGGATTCTCACTACTCTTTTG CCAAAAAAAAGAGATCGGAGGTTCCG AAGGTGAATGCAGCTTGCGATTTCAT AGAAAAGAAGATTCGTTTGCTGGATT AGGCTTATTTGTGTATCATAGCTTTGA GGTTTTAACTGAGATTTATTGATAGTG GAACTTAGGTTTTCGAGAGGTGTGAA CAGTTGGGTAT (SEQ ID NO: 416)
AT5G0 5080	UBC22	enzima de conjugação de ubiquitina 22	GAGAGAGGTAGCG AG (SEQ ID NO: 236)	AAAATAAACATTTGTCTCTATTTCTCT TATAAAAATTCAATAATTGAACCTCCT CTCTCTCTCTCTCTTCTCTCCCTTCTTC TTCTCCGATTTCGACTTTGAATCATTT CTTCGAGAGAGGTAGCGAGAAAGGGA TCGCCTTTTCTCACTCTCTGCGGATTC TCAATTTTGGGCAAGAAGGCAAGAAC AGTTTTTATCGCAATTGAGTCTTGAAG ACCACAAGGATTTGATCACATTGGTG CTTCTGCCTGTTTATCTGAGTTTGAGG ACAAGAACTTCTGGGGCGTTTATAATT TGCC (SEQ ID NO: 417)
AT2G3 0270		Proteína de função desconhecida (DUF567)	GCCGCAAAAAAAA AA (SEQ ID NO: 237)	ATCTTTGGCTTCTACATCCAATTATTT ACTTGCTTAATTTTATTCATCTGAATT ATTTTTTGGTGTAAGAAGAATGTTTCG CCGCAAAAAAAAAAATCTGATCCGAC ATCATTAGAACAAAAAAAAACATTGG CGTTGAATATAAGCTGCTTCTCTTGTT CTTCTTCTACCTTACGCTTCTGACTGTT ATTAGAGACTATGTAA (SEQ ID NO: 418)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 95/191

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AT2G2 7030	CAM5	calmodulina 5	GACAAAGACGGAG AT (SEQ ID NO: 238)	ACACACACCAACGTTGATTCTTCTTCT TCTTCTTCTTCTCTCTTTCTCATCTAAA CCAAAAAATGGCAGATCAGCTCACCG ATGATCAGATCTCTGAGTTCAAGGAA GCTTTTAGCCTTTTCGACAAAGACGGA GATGGTTCTTCTCTCTCAGATCTTTCC TCTTTTGTATAATTTTCATTCATAATA GACTCACTTGCGTTTTTTTTGGTGTTTT GAGTATCACTTAGTCTTGGCTTTAGGA ATTTGATGCTCTTCGTTGTCCATAAAA TCTCTGGATATTCACATTAACATTAAA CGCGAGATTTGATGATATCTTTATCGT TCGTTGATTATAAATTATAATCGCAAT CGGATCTATCTCGATAATAATCTCTAA CTTAATCGTGTTTTAGTCTTCCAGATT TTACTAATTGTGATTAGAATTGACACA AATCTTAGAATTCAATAATCGAAGTA GATTACATTGACATTTGTAGATTTTTT GTTTAATTGATTCAGTTATTTGAGTAG GTTACAATGAAATTTGAAGATTTTGTG TTCATTTGATACAGTTGTTAGAGTAAC TAAAATGAAATTTGAAGATTTTGTGTG TTATTAGAGTAAATTACAATGAAAAT TTGAAGATTTGGTGTTAAAATCTGTTA CTGATTTGAGAGAAATGTGTGGTTTTG TGTTTAGGTTGCATCACAACGAAAGA GCTAGGAACAGTG (SEQ ID NO: 419)
AT1G1 2470		ligante de íon de zinco	TTAAGAGAGGAAG AA (SEQ ID NO: 239)	GATTTCATAAACCACGACTGACTTCTC CTGCTCGCCGATCAGATCTCCGACGA AGTTTTTGATTAAGAGAGGAAGAAG (SEQ ID NO: 420)
AT1G6 9530	EXPA1	expansina Al	ACGAAAAGAAGAA AG (SEQ ID NO: 240)	CCAATTCTAAACCAAACAACAGATTC TCATAATCATCTCTTCTTTTTTCCTCTT TACGAAAAGAAGAAAGATCAAACCTT CCAAGTAATCATTTTCTTTCTCTCTCTC ACACACACACATTCACTAGTTTTAGCT TCACAAAATGTGATCTAACTTCATTTA CCTATATGCAGGTTTACACAAAAAGA AAAAAGAACG (SEQ ID NO: 421)
AT1G1 4280	PKS2	substrato de fitocromo-quinase 2	CACAAAAAGAAAC AA (SEQ ID NO: 241)	AAGAAATAGTAATACACAAAAAGAA ACAAA (SEQ ID NO: 422)
AT1G1 3560	ATAAP TI	aminoálcoolfosfotransferase 1	GGAAGAAACGCAA AG (SEQ ID NO: 242)	GGGAACGCGGAAGAAACGCAAAGCC CTCTCCTTTTGCTTCTGGTCCTCTCGTC CCGTTTCGCCGCTCTCTATAGGGGCAA GTGAGAGGTTACTGTCTCTTTCTTCTT TCAGACACTCGAGACGAGAAAGGCTC GTATCTGATTTTACCGCCACCGGACCA TCTGTGATAGACAATA (SEQ ID NO: 423)
AT5G1 6650		Proteína da superfamília domínio DnaJ de chaperona	TGAACGGAAAAAG AA (SEQ ID NO: 243)	ACGAAAACTCATAAAGCCAAAGCCTT TCTTCTTCTTCTTTTCTTCCGATTATTC CCAAACACAAAAATACTGCTGAGGAA AAGCAATCCACACGATTCGATTCAAA GTTTTCATTTTTTCTCTAAAAGTTTGG ATTTTGATTTCGTTGCTGAACGGAAAA AGAATCAGCTCCTTTCAGTTTAGGGTT TTGGGTTTCTGTTTGGTCTCTATCAGA TGATGTGTGAGGAGATTCTTCCTCTGT TTGTGTCTGTTTCAG (SEQ ID NO: 424)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 96/191

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AT IGO 9690		Proteína da família proteína de tradução SH3like	GCACGAGGAGGAA AA (SEQ ID NO: 244)	TTTCTTCGGCGATCTAGGGTTTTAGTT GTCGCACGAGGAGGAAAA (SEQ ID NO: 425)
AT3G4 6110		Domínio de função desconhecida (DUF966)	TGAGAAGAAGAAC AA (SEQ ID NO: 245)	CTCATTCTCAAATCTCTCATTGTGTGT CTGTGACTATCTCTCTATACAATTCAA ACTCTTCAAGATTACTTCCTCTTCACT TTGAGAAGAAGAACAAACCAACAAAT CTCCAAAATACACCGAACAACATTA (SEQ ID NO: 426)
AT1G7 2550		proteína da família subunidade-beta de tRNA-sintetase	CACTCAGAAGAAG AA (SEQ ID NO: 246)	TAACGGTGAAAAATCGTCATCTACTTC TTCTTGAAACCCTAGTTCCAAAATCTG CACACACACTCAGAAGAAGAAGACGT CATCTCTCTATCTCTGTCTTTCTGCTAA TTTCACGAAGAATCTGAGAAT (SEQ ID NO: 427)
AT5G5 3280	PDV1	divisão plastidial 1	CCTGAAGAAGAAG AA (SEQ ID NO: 247)	ACAATTAAAGTGAGAATTTTCCTGAA GAAGAAGAACTTTTGCTTTTTTTCTGG GTTTGCTTTTTTGTTGTGTCAATGAA (SEQ ID NO: 428)
AT5G4 2070			ACAGAGGAAAGAA AA (SEQ ID NO: 248)	ATTTTGTTTTGCGTTTCTGAATTTGTG GCCATTATCTTCTCACACTCTCTTCTCT TAGCTCACAGAGGAAAGAAAA (SEQ ID NO: 429)
AT4G3 2180	PANK2	pantotenatoquinase 2	ΓΑΑΤΑΑΑΑΑΑΑΑΑ AA (SEQ ID NO: 249)	GTTGGTGATCCGATTTTTCTGGGTTTG GTTGGGTTCCTTTTTTATTTTTTAATAA AAAAAAAAA (SEQ ID NO: 430)
AT2G1 8040	ΡΙΝΙ AT	peptidil-prolilcis/transisomerase, Proteína 1 interagente com NIMA	GAAGGAGAAGAAA GA (SEQ ID NO: 250)	AATCGTCGATAATCATTAGGGTAAAG CAAAAATAGTGAAGCAGAGCCGCAAA AACACTTTTCCCAAAATCAACGAAGA TAGATTCAGATCGGAAGCGAAAGAAC GATTCGGTCTCCTCCACAGATCGAAC ATCGAAGGAGAAGAAAGACCATCATC ACAACAAGCATCGAAAGAAGAGCAA G (SEQ ID NO: 431)
AT5G1 6970	ATAER	alquenal-redutase	GAAACCGAAGAAG AA (SEQ ID NO: 251)	TAAAAGCAGCGGCGTCATCGAGAGAA ACCGAAGAAGAAGCAGTAACAAATTT GGTGAAGTCACGAGAATCAACG (SEQ ID NO: 432)
AT5G0 9410	EICBP. B	proteína ligante de calmodulina induzida por etileno	AAACCACAAGAAG AG (SEQ ID NO: 252)	ATGAATTAGGAATCTGTGATTATGAT AACGGAGTCTGAAGCCTAGACTCGAA ACCACAAGAAGAGA (SEQ ID NO: 433)
AT5G0 5360			AAAAAAAATTGAA AA (SEQ ID NO: 253)	AATTGATCGCACTGTCAAACCAAAAA AAATTGAAAACCCTAAATTGGTTGA (SEQ ID NO: 434)
AT4G2 3740		Proteína da família de proteínas quinases com repetições ricas em leucina	TACAAAAAGAAAC AG (SEQ ID NO: 254)	CTTTCACCCACTTTAATATGCCAAAAA ATAAGAACAAAATTATATCCGTTGCTT GAAAATCACAAGCTCTTCTTAACTTCA CAAGTGCTTCAATGGCGGTTCTTCACA TTATCTTCACTGCGTAATTGAAGAAGT TGTTCTCTCTTCCTCTTAATTTCGAGTT GTGTTCTTAAAAAACTCCAGAGCTGA TTCGATTCTCGAGAAGAAACTAAGCC GACAATAAAGTTCAGATCTGGAAAAA AGCGAGCTCCAGATTACAAAAAGAAA CAGCTCGTTTTTTTCACTTTCAAAAAA (SEQ ID NO: 435)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 97/191

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AT3G4 7560		proteína da superfamília de alfa/betahidrolases	CAAACAAAGTAAA AA (SEQ ID NO: 255)	TTATCTTTCTCAACGCACGCCTTACCA TTAAGGAGACCCAAATTTCCTGCAAC AAACAAAGTAAAAAAGTTGAGA (SEQ ID NO: 436)
AT3G1 3740		Proteína da família ribonuclease III	TCGGAAAAAGCAG AG (SEQ ID NO: 256)	TATTTTCGTGCTCGGAAAAAGCAGAG TAAAGCTTTAAAAA (SEQ ID NO: 437)
AT3G5 8030		proteína da superfamília RING/U-box	AAGTGAAAGCAAG AG (SEQ ID NO: 257)	AAAAAAGGGCGAATTTTTCCATGGCG TTGTCGGAGTTTCAGCTAGCTCTGAGC TTGGTGGTCTTGTTCTTCTAGCTGATT TGATCGAAACCCCATGTTCTTATGATT TTACACGACCTAATCCAAAACTCCAG GTCCTTGATTGATTCTTCTCTCTCTCCA GCTCCAGATTCTTCTGATTTCTTTTGTT ATCATTTGTTTTTGTAAGATTTGTATC CGTTTTTGGGTTTTGCTTAGCTGATTC TTGCTGGATCGAGAGTTGAATAACTCT GCTTTTCTTCAATCTGGTTTTTTTTTTT TGTTTCATAGAGGAGAAAGGTTGTGG ATTTCTCAGGTGGGGATTTGAGAATTA GGGTTTTCTGATTGGGGGTTTTCTTAT TGATGTTACCTTCACCAAATTGTTGTC GGAGATCTAGATTTGGTTCAGTTATGG AATAATGGCTCGTCTCTTGCCATCTCT ATTCGTAATTAGCATCTTCTTCTTCAT CCAAAGACTCCTCCTTTCTTCGTTAAT CCATCGCCAGCTATTGAATCTGAAGC AAATCTGAGAATCTACCGAACTCACG CACCTGTATATTGCTTACACGATACAG AGCACACGGAGACGGAGTACATATTG TTCAGCGCAAGTGAAAGCAAGAGCCT TTTTGTCTATTG (SEQ ID NO: 438)
AT3G0 7230		relacionado à proteína responsiva a ferimento	ΓΑΤΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ AA (SEQ ID NO: 258)	ATACTCGTATCTTGTAGCAGCCACTAA AGCAAAATTCTGAGATCGAAAAAGCT ATATAAAAAAAAAAAACTGCTTCCGT TTCATCGATTTTGTCCAGATCTTCCCC TTCTTCCGGTAATCGAAGCTTACGAGA TAGTTGAGTGAAG (SEQ ID NO: 439)
AT3G0 5840	ATSK12	Proteína da superfamília de proteínas quinases	GTGACAAAGGAAG AA (SEQ ID NO: 259)	ACATTAGCTTCCTCATTTTTATTCTTAT TATTATTATTCATCAGACCAACAACAA AAAGGAGATAAAGAGAAGAGGATTC ATCATCATCAATCAATCCTTCATTTTA TGGATCTACTCATATCTTGATTCTTCC TTCTATCTCTCCCTTTTCTTCCATCTCT TTTTCTCTGGGTTTCCCCGGATTGAGT TTTTTAATCTCTGATTGACAGATTTGA AGAGCGTGACAAAGGAAGAATCTTTT ATTAAAACAAATTCTTCTGTTTTAATC TTGGG (SEQ ID NO: 440)
AT3G0 1770	BET 10	proteína com bromodomínio e domínio extraterminal 10	GAAGGGAGGGCAG AG (SEQ ID NO: 260)	TTAGGGACGGGACACTAGAGAAGGGA GGGCAGAGAGCGATTTTGTTCTCTCTC TACTTCTCGGTCGTCTTCTTCGTCTCC ACTCTAGGGTTTTACTCTATCTTCTTCT TCATCATCATCTTCTACACCAATCTCT AGCGTTAATCTGTTTCTGCTGGAGAAG ATTTACGCTTGTTCCTCGGTTCTCTTA CTTCTGCTCCGGTTCGATCGCTTGCTA AGTGTTTCGAGTTGGTTCGCACTTCGG TGGGCGATATC (SEQ ID NO: 441)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 98/191

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AT3G1 2300			GGAGAAGCAGGAA AA (SEQ ID NO: 261)	CAAGTCTACGAGCTTCTTCTTCTCGGA ATCGGAGAAGCAGGAAAATTCCGGAG GAGCAGGAAG (SEQ ID NO: 442)
AT1G5 3380		Proteína de planta de função desconhecida (DUF641)	GATAAACAAAGAA AA (SEQ ID NO: 262)	GTTTCTCATCTCCAGCTCTCATTTTCTC TCTCATCTTCAACCTTAACTCTCTTTTC TCTCTACTCTTTCTTTGGACGAATCTG TCTATTGTTTGTAAGTTTTCAAGGAAG GTAAAGAAACAGAGAGATCTAACTTC GTCTGCAGGGTTTAAGCAGAGGTTGG TTTGTGGATTCTTCGATTTCTTCTTCAG ATTTAGTCTACAATGAAGTGAGAATTT CTAAAGATAAACAAAGAAAAACTTGA GACTTTAGCAAG (SEQ ID NO: 443)
AT1G2 5440		proteína dedo de zinco tipo B-box com domínio CCT	FGCAGAGAGCAAA AG (SEQ ID NO: 263)	ACTGACACAAAAGGGAATGCGCTTCA TGCGGGTCATCCTCTTAATCTCAAACT CTCTAGGACTACACTAAATCTAACTTT TTGCAGAGAGCAAAAGATTCAATAAT TGAGATTGATCTCAAAACCAAAGCTC TCGTGCTCTTGTCGTTGATGTTGGTTG TGTAGACTTTGTATACA (SEQ ID NO: 444)
AT3G2 6950			AAAAGAAACGATG AG (SEQ ID NO: 264)	ATCCAAAGCTCTGATGTAAGAAACTC TACACTTGTTCGAGTTTCGGAGAAAA GAAACGATGAGGAAGAG (SEQ ID NO: 445)
AT2G0 6025		Proteína da superfamília acilCoA-Naciltransferases (NAT)	AAAGAAAGCTGAG AA (SEQ ID NO: 265)	ATACAATTCCAACAAAACCACAAAGA CGACTCTCTTCAGAGAGTTTTGAGAG GGTGAGAGAGCCGTGCTCGGCGTTGT TAGAAAGAAAGCTGAGAATTGCAACT GCTTACAAGAGCAATGTCGACAAGCT GATCAAGAGTCTCTTGGATTTGTGCTT CTGTACTTCTTAAGAGGAAGGTCCCG CAAGATACCATCTTCTCAAAAGTCCA ATCAATCTACGCTTTTCAATTCGCCAC GTCACAGAATCCTGACCGTTAGATAC AAACGCGCCAACTCGTCAAACTTTGC TTTCTGGTACGGCGGCG (SEQ ID NO: 446)
AT5G4 3460		relacionado à proteína indutora de lesão like HR	CGCCGAAACGAAG AA (SEQ ID NO: 266)	GAAATGTTAATAAATAAACCTAAACC AATAGAACCGCAGTTTTTCCTCCTCGC CGAAACGAAGAAGATTCTCCTTCTCTC CGTCAGACAAATCTACGAACAAGCGA GCCTGAGCTTAAGACCAAACTCATAG AG (SEQ ID NO: 447)
AT2G0 1720		Riboforina I	AGAGAGAAGTGAG AG (SEQ ID NO: 267)	CGTAACTAATCCCTAAATCAAGAGAG AAGTGAGAGACACTGAGACTTTGTAG TTGACCGGATCATTCTCACTTCGCCGG CCGACGTTCTTCCTTCCGCCGTCGGTA TCTATATTTACGATCCACGATCTCTCT TGCTGTTTCTGTCTTCATCGTGACGAA A (SEQ ID NO: 448)
AT5G4 1050		Proteína da família de extensinas e alérgeno Ole el de pólen de oliveira	AAGAAAAAAACTG AA (SEQ ID NO: 268)	CATCTCTTTGTGCCTCTCTTTACTCATC TCTTTTTCCACAAGAGTCTTGAGTTTT ATAAAAAAGACAAGCTTGAAGCTTTG TTTGAATGGAGTTACTGTTTGATCTTT GTTTGTTCTTTTGTCTTTAACCACTTGG CCCATTCTTTGTCTGTTTCTTTCATCAA CCACATAAACAAAAAGGAAACCTCAT CTGTAAACAAGTGTTTATCCAAGGAT AAAGAAAAAAACTGAAACTTGTGAAC (SEQ ID NO: 449)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 99/191

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AT1G7 6020		Proteína da superfamília de tiorredoxinas	GAGAAAAAGTGTG AG (SEQ ID NO: 269)	GAGAAAAAGTGTGAGTCAGAGAATA (SEQ ID NO: 450)
AT1G5 8270	ZW9	proteína da família TRAFlike	AATATAGAAAAAG AA (SEQ ID NO: 270)	ACAAACACAAAATATAGAAAAAGAA ATA (SEQ ID NO: 451)
AT1G1 9000		Proteína da superfamília homeodomíniolike	GACGCAAAGGGCA AA (SEQ ID NO: 271)	AGATCCACTCACACCTCGTCTCCTAAT CTGTACGGTTCTTATTTCGAAAGGGTA AAAACCAAAAGCGACGCAAAGGGCA AAATCGGAAAAAGTGTTTTATTT (SEQ ID NO: 452)
AT1G1 2580	PEPKR1	Cinase 1 relacionada à fosfoenolpiruvato -carboxilase	CATAGAAAAGAAG AT (SEQ ID NO: 272)	GAGAGAGGACTGGGTCTGGTCTCTTC GCTGCAACCTATAGCTGTTGTTTGCTC TTCGACGGGATTCTCACTACTCTTTTG CCAAAAAAAAGAGATCGGAGGTTCCG AAGGTGAATGCAGCTTGCGATTTCAT AGAAAAGAAGATTCGTTTGCTGGATT AGGCTTATTTGTGTATCATAGCTTTGA GGTTTTAACTGAGATTTATTGATAGTG GAACTTAGGTTTTCGAGAGGTGTGAA CAGTTGGGTAT (SEQ ID NO: 453)
AT5G3 8980			ACCACAGAAAAAC AA (SEQ ID NO: 273)	AATCACTCCTCAAGCAAATCACTCCTC ACACCACAGAAAAACAAATAATTGAA GAA (SEQ ID NO: 454)
AT3G1 4870		Proteína de planta de função desconhecida (DUF641)	GAACAACAAACAA AA (SEQ ID NO: 274)	ACTCTAAAGCCTTTTTCCCCTCTTCTC ATTCTCGAGCTCCGGACTTGTCTTGAA ACCGTGAAGGAATCTGTATCTTTTGTA TGTTACCCATTTTATTGTCGTTAAGAA TCAATTTAGAGGCAAAACGCCGAGAG GTTTGCCCGGGAGAGTGTTTTTACATC GATCAGGGTTTAAGCAGAGGTTGGTT TGTCATTTCGCCAGTTTGCTTCTTCAA ATTCACTCTACGATGAAGTGAGAACA ACAAACAAAACATAGATAAGATAGAG ACCTTGGAACTGTTGGAAG (SEQ ID NO: 455)
AT1G4 9975			GACATAAAACAAG AA (SEQ ID NO: 275)	AAGAGACATAAAACAAGAATCTTATC TTCTGGTCAAGAGAGAG (SEQ ID NO: 456)
AT1G1 4920	RGA2	proteína da família de fatores de transcrição da família GRAS	GAGTGAAAAAACA AA (SEQ ID NO: 276)	ATAACCTTCCTCTCTATTTTTACAATTT ATTTTGTTATTAGAAGTGGTAGTGGAG TGAAAAAACAAATCCTAAGCAGTCCT AACCGATCCCCGAAGCTAAAGATTCT TCACCTTCCCAAATAAAGCAAAACCT AGATCCGACATTGAAGGAAAAACCTT TTAGATCCATCTCTGAAAAAAAACCA ACC (SEQ ID NO: 457)
AT5G5 1020	CRL	folha enrugada	GAAACAAGTAGAG AT (SEQ ID NO: 277)	AACCTTACTCCTCCTCCTCTTCCTCTTT CTCTAATCGGCAAAATTTTCTGCTCCT GAGAAACAAGTAGAGATACTAAAGAT GGAATCTTTGAACTAAATTCGAAACC TTTTA (SEQ ID NO: 458)
AT4G2 7990	YLMG1 -2	proteína da família YGGT	CACCGAGGAACAA AG (SEQ ID NO: 278)	ACAACATTCTGAGGAGTGAGTAATCT CCGGCACCGAGGAACAAAG (SEQ ID NO: 459)
AT5G1 7630		Proteína da família de transportadores de nucleotídeo/açúca r	AACCGAAACCAAG AG (SEQ ID NO: 279)	AGAGCTTTCAAAAAATTGTTGTACTTC CCAACGGATCTCTGACGTTTGGTCCAG AGCCGACGACGACCCACAACCGAAAC CAAGAGCTATCTCTTTTTCCTCTTCTCT CTCTCCTTCTCTACCTGCGTTCGTGCTT AAACA (SEQ ID NO: 460)

Petição 870190094209, de 20/09/2019, pág. 100/191

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AT2G2 7260		Proteína da família de glicoproteinas ricas em hidroxipolina abundante na embriogênese tardia (LEA)	AAAACAAATCAAA AG (SEQ ID NO: 280)	ACATTTCCTTTTAAATTAAATTGCGTT AATTTCTCACTTCCCTTTACTTCTTCTT CTTCACCATCACAAACATCTTCGTCTC TTGAAGATTCCAAAAAAAACAAATCA AAAGCT (SEQ ID NO: 461)
AT2G0 2040	PTR2-B	transportador de peptideo 2	AAGTAAAATAAAA AG (SEQ ID NO: 281)	AAGTCGCCGGGAAAAGTAAAATAAAA AGCCGTCACGTCTCCGATAAATAATA GAGTATCGTTAGATAGGTAGCTTCAA CGTAAGGAATCTAAATTGGTTCAGCT CAAAAAACGAAAACG (SEQ ID NO: 462)
AT1G7 5040	PR5	gene relacionado à patogênese 5	GACACACACAAAA AA (SEQ ID NO: 282)	ATCATCATCACCCACAGCACAGAGAC ACACACAAAAAACCCATAAAAAAAT (SEQ ID NO: 463)
AT2G3 0170		Proteína da família de proteínas fosfatases 2C	GAGAAAGGTGGTG AA (SEQ ID NO: 283)	GAGAACGAGAGAGCAAGCCATTGCAG GAAATGGCGATTCCAGTGACGAGAAT GATGGTTCCTCACGCAATACCATCGCT TCGTCTCTCACATCCAAACCCTAGTCG CGTTGACTTCCTCTGTCGCTGTGCTCC ATCAGAAATCCAACCACTTCGGCCTG AACTCTCTTTATCTGTCGGAATTCACG CAATCCCTCATCCAGATAAGTGTCGA AATTATATAGGTAGAGAAAGGTGGTG AAGATGCTTTCTTTGTAAGTAGTTATA GAGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 464)
AT5G4 2300	UBL5	proteína like ubiquitina 5	CGGAGGAATAGAA AA (SEQ ID NO: 284)	ACGAGCCTTAACGCGTAGAATCTTCC CGTACTTTACTTTTCCGGAGGAATAGA AAATTGGGGGCTAGGGTTCGCAATTG TAGTTTTCGAGCGAAGAAG (SEQ ID NO: 465)
AT3G6 2830	UXS2	proteína da superfamília dobra Rossmann ligante de NAD(P)	TAATAAGAGTGAA AA (SEQ ID NO: 285)	TCTCGTAATAAGAGTGAAAAACAAGC CTTAACCTGTAAACGCTTACGCTAGTT AAATACACAACAAAGACCGATTCGCT TTTCACTCTCTCGTTCAAGATCTAGAA TTCAATTTGTGAGGTTTGGAG (SEQ ID NO: 466)
AT IGO 6190		fator de terminação Rho	CAAGGAAAAGGCA AT (SEQ ID NO: 286)	GAGAGTCGACAAGGAAAAGGCAATG CAAGAAGAAGCTTAAATCTCTCTTCTC TGCTCCTGAAGTCTGTTC (SEQ ID NO: 467)
AT1G4 7420	SDH5	succinatodesidrogenase 5	TCGGAAAAATCAG AA (SEQ ID NO: 287)	GCGTTGGTTCTCTTCTTCAAAACAAGC TCTCTCTGTCCCTCTCTGTCTCTCTCTT TGGGTAATCGGAAAAATCAGAAAA (SEQ ID NO: 468)
AT IGO 6360		Proteína da família de ácidograxodessaturases	CTCAAAGAAAAAC AA (SEQ ID NO: 288)	ATACAAATCATAACTCAAAGAAAAAC AACCCCTCAACGGTCG (SEQ ID NO: 469)
AT5G0 4280	RZ-lc	proteína da família ligante de RNA (com motivos RRM/RBD/RNP) com domínio like dedo de zinco de retrovirus	AGGCGAAGGAAAC AA (SEQ ID NO: 289)	ACCACCACCATTTTAGGGTTTCTTCGT GCCATTGATATTTTGAGAGGCGAAGG AAACAATACGATTCAGAGAGAGACGA GTGAAA (SEQ ID NO: 470)

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AT1G1 8440		Proteína da família peptidiltRNA-hidrolase	TCCCCAGAAGAAA AG (SEQ ID NO: 290)	CTAATTCCCCAGAAGAAAAG (SEQ ID NO: 471)
AT5G4 7570			CCTGAAAAGAGCG AA (SEQ ID NO: 291)	TGACTGCGTCTTTCTTCTCTCTCTATCT GTAATTTGATTGGATTTTGGATCGAAA CCTGAAAAGAGCGAAA (SEQ ID NO: 472)
AT2G2 6590	RPN13	partícula regulatória não- ATPase 13	GAAAGAGGTGGTG AT (SEQ ID NO: 292)	AATTGAAAGAAAAAAAAAAACGAGA AGCGTTTTCTTTCTCTCCAAAATCCAT TACTCGCGAACTTTCCTCTGCTAAGTG TTCACTAGAAAGAGGTGGTGATT (SEQ ID NO: 473)
AT4G3 6990	TBF1		ACATACACACAAA AATAAAAAAGAC (SEQ ID NO: 293)	TCTAGAAACAGCATCCGTTTTTATAAT TTAATTTTCTTACAAAGGTAGGACCAA CATTTGTGATCTATAAATCTTCCTACT ACGTTATATAGAGACCCTTCGACATA ACACTTAACTCGTTTATATATTTGTTT TACTTGTTTTGCACATACACACAAAAA TAAAAAAGACTTTATATTTATTTACTT TTTAATCACACGGATTAGCTCCGGCG AAGTATGGTCGTCGTCTTCATCTTCTT CCTCCATCATCAGATTTTTCCTTAAAT GGAAGAAACCAAACGAAACTCCGATC TTCTCCGTTCTCGTGTTTTCCTCTCTGG CTTTTATTGCTGGGATTGGGAATTTCT CACCGCTCTCTTGCTTTTTAGTTGCTG ATTCTTTTTCCTTCGACTTTCTATTTCC AATCTTTCTTCTTCTCTTTGTGTATTAG ATTATTTTTAGTTTTATTTTTCTGTGGT AAAATAAAAAAAGTTCGCCGGAG (SEQ ID NO: 474)

[0090] Para examinar o efeito de motivo-R sobre a tradução induzida por elf 18, testamos sequências líderes 5’ de 20 genes com TE aumentada (TEup) contendo motivo-R usando o sistema de luciferase dupla Çdual-LUC). Consistente com a conhecida importância delas no controle da tradução²⁴, as sequências líderes 5’ diferentes mostraram atividades traducionais basais diferentes após normalização em relação aos níveis de mRNA (Figura 12A). Em 15 das 20 sequências líderes 5’ testadas, o aumento de TE mediado por elfl8 foi confirmado (Figura 3B). Então geramos repórteres mutantes de deleção de motivo-R e descobrimos que 11 deles mostraram TE aumentada embora apenas dois apresentaram TE diminuída comparados com os correspondentes controles WT deles (Figura 3C e Figura 12B). As alterações traducionais observadas nestes mutantes de deleção, foram improvavelmente devido ao encurtamento dos transcritos porque efeitos similares foram observados quando os motivos-R em IAA8, BET10 e TBF1 foram mutados

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96/130 mediante substituições de pares de multibases (Figuras 12C-F). Estes resultados sugerem uma função predominantemente negativa do motivo-R em atividade traducional basal. Subsequentemente examinamos os repórteres mutantes de deleção de motivo-R para a responsividade à indução por elfl8 e descobrimos que seis têm respostas abolidas ou diminuídas em comparação com os controles (Figura 3D e Figuras 12G e 12H), indicando que a liberação da repressão mediada por motivo-R pode ser um mecanismo de ativação destes genes durante PTI. Para demonstrar que o motivo-R é suficiente para a responsividade a elfl8, repetições de GA, G[A]s, G[A]ô e G[A]_n mista, que são padrões de sequências centrais descobertos em motivos-R de genes endógenos, foram inseridas na sequência líder 5’ do repórter. Descobrimos que a tradução de repórteres resultantes de fato tomou-se responsiva à indução por elfl8 (Figura 3E e Figura 121). Entretanto, o motivo-R em alguns genes pode ter uma função mais ou menos complexa na regulação da tradução porque a deleção do motivo-R nestes genes não afetou a tradução deles após tratamento com elfl8 (Figura 12H). Outras características de sequência de mRNA nestes transcritos podem influenciar a atividade do motivo-R.

[0091] A relação entre o motivo-R e as uORFs durante a tradução mediada por PTI foi então convenientemente estudada em TBF1 por causa das características que descobrimos em seu transcrito (Figura IA). A avaliação da TE usando o sistema de luciferase dupla (dual-LUC) mostrou que a deleção de motivo-R não teve efeito significativo sobre a tradução basal de TBF1, em contraste com o mutante uORFstbfi (mutação de ATG para CTG em ambos os códons de iniciação de uORFs; Figura 3F e Figura 12J). Entretanto, ambos os repórteres mutantes de motivo-R e de uORFs mostraram respostas comprometidas ao elf!8 em análise de expressão transiente e também em plantas transgênicas (Figura 3G e Figura 12K, L). Os efeitos pareceram ser aditivos, sugerindo que o motivo-R e as uORFs controlam a tradução mediante mecanismos diferentes.

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97/130 [0092] Hipotetizamos que o mecanismo pelo qual o motivo-R afeta a tradução é provavelmente mediante a associação com as proteínas ligantes de poli(A) (PABs, Poly(A)-Binding Proteins) porque tem sido mostrado que estas proteínas ligam-se não apenas às caudas poli(A) de transcritos para intensificar a tradução, mas também à sequências ricas em A localizadas nas próprias sequências líderes 5’ delas para inibir a tradução^{25, 26}. Para testar nossa hipótese, examinamos a função de PABs de classe II (isto é, PAB2, PAB4 e PAB8), que são as PABs majoritárias em plantas com base em dados genéticos²⁷. Coexpressamos PAB2 com três genes individuais dependentes de motivo-R, ZIK3, BET10, e SK2, e com um gene independente de motivo-R, SAC2, como um controle. Descobrimos que todos os três genes dependentes de motivo-R, mas não o controle, tiveram TE mais baixa quando PAB2 foi coexpressada, e que esta inibição pôde ser superada pela deleção do motivo-R (Figura 4A e Figura 13A). Este efeito de PAB2 é provavelmente mediante uma interação física direta com o motivo-R porque em um ensaio de ligação in vitro, PAB2 apresentou afinidades comparáveis às repetições G[A]s, G[A]ô e G[A]_n com relação a poli(A) (Figuras 4B e 4C). Além disso, PAB2 sintetizada por planta pôde ser isolada usando uma sonda de G[A]_n RNA (Figura 4D). Surpreendentemente, PAB2 das plantas induzidas por elfl8 pareceu ligar-se à sonda mais firmemente do que o controle simuladamente (Mock) tratado, sugerindo que a desrepressão disparada por elfl8 foi improvavelmente mediante a dissociação de PAB2. E sabido que PAB2 muda sua atividade mediante fosforilação²⁸, pode podería ter ocorrido após o tratamento com elfl8.

[0093] A seguir examinamos os fenótipos dos mutantes duplos pab2 pab4 e pab2 pab8 (o mutante triplo é inviável)²⁹. Para separar os efeitos de mutantes sobre a tradução geral, focalizamos nossa caracterização na sensibilidade ao elfl8. Primeiro mostramos que o aumento de TE disparado por elfl8 no TBF1 endógeno foi comprometido no mutante duplo pab2 pab4

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98/130 conforme medido por fracionamento do polissomo (Figura 4E). Então realizamos um teste de resistência a Psm ES4326 com ou sem pré-tratamento com elfl8. Em comparação com WT, os mutantes duplos tiveram resistência basal significativamente elevada a Psm ES4326, mas resistência reduzida ao patógeno após o tratamento com elfl8 (Figura 4F). Esta insensibilidade ao elfl8 foi resgatada pela transformação de PAB2 no background mutante duplo pab2 pab8 (Figura 4G). PABs não são apenas essenciais para a resistência induzida por elfl8 contra Psm ES4326 mas também críticas para a transição de crescimento para defesa porque nos mutantes pab2 pab4 e pab2 pab8, o efeito inibitório de elfl8 sobre o crescimento de planta foi diminuído (Figura 13B). Estes dados confirmam nossa hipótese de que as PABs desempenham uma função negativa na tradução de background, mas uma função positiva na tradução induzida por elfl8 (Figura 4H). Permanece para ser testado se as atividades de PABs são reguladas pelos componentes da conhecida via de sinalização PTI, como MAPK3/6. A detecção de atividade de MAPK3/6 nos mutantes pab2 pab4 e pab2 pab8, não obstante mais baixa em pab2 pab4 (Figura 13C), sugere que as PABs poderíam funcionar a jusante de MAPK3/6, possivelmente como substratos, ou em uma via independente.

[0094] Os mecanismos moleculares pelos quais qualquer hospedeiro, incluindo Arabidopsis, ativa a tradução imuno-relacionada são predominantemente desconhecidos. Além da tradução mediada por uORF de TFs imunes-chave, como TBF1 em Arabidopsis¹ e ZIP-2 em C. elegans³, identificamos o motivo-R nos transcritos com TE aumentada (TE-up) mediada por elfl8. Tanto as uORFs quanto o motivo-R normalmente inibem a tradução de genes PTI-associados (todas as partes da Figura 3). Após indução imune, a inibição é aliviada permitindo a acumulação rápida de proteínas de defesa. Em levedura, a inibição de uORF na tradução de GCN4 é removida durante a inanição, quando a acumulação de tRNA não alterado ativa GCN2 para fosforilar e inativar o fator de iniciação de tradução eIF2a³⁰.

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Surpreendentemente, descobrimos que apenas quinase eIF2a conhecida em plantas, GCN2³¹, é requerida para a fosforilação de eIF2a induzida por elfl8, mas não para a tradução de TBF1 induzida por elfl8 ou a resistência a bactérias induzida por elfl8 (Figuras 14A-14D), sugerindo um mecanismo alternativo na reprogramação traducional imuno-induzida em plantas.

[0095] O efeito inibitório de motivos-R sobre a tradução é provavelmente mediado pelas proteínas PAB, porque a mutação de quer motivo-R quer PABs resultou em uma redução na responsividade à indução por elfl8 (todas as partes das Figuras 3 e 4). Tem sido relatado que as PABs podem ser pós-traducionalmente modificadas e reguladas por interactores, que influenciam as atividades de PABs na tradução²⁸. Investigação adicional será necessária para esclarecer os mecanismos regulatórios de motivos-R e entender as funções de PABs em diferentes mecanismos de tradução, como a atividade traducional mediada por sítios internos de entrada no ribossomo (IRES, Internal Ribosome Entry Sites) observada em levedura³². Curiosamente, o motivo-R é também predominante em mRNAs de outros organismos, incluindo o p53 mRNA humano, sugerindo que um mecanismo regulatório conservado pode ser compartilhado entre as espécies.

Métodos

Crescimento, transformação, e tratamento de plantas [0096] Plantas foram crescidas em solo p(Metro Mix 360) a 22°C sob ciclos de luz/escuridão de 12h/12h com umidade relativa de 55%. efr-1⁵, ersl10 (um mutante fraco de ganho de função)³³, ein4-l (um mutante de ganho de função)¹⁸, wei7-4 (um mutante de perda de função)¹⁹, eicbp.b (camta 1-3·, SALK_108806)³⁴, pab2 pab4¹⁹ e pab2 pab8¹⁹ foram previamente descritos. efr7 (SALK_205018) e gcn2 (GABI_862B02) foram do “Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)”. As plantas transgênicas foram geradas usando o método de imersão floral³⁵.

Construção da biblioteca de Ribo-seq

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100/130 [0097] Folhas de ~24 plantas de 3 semanas de idade (2 folhas/planta; ~l,0 g) foram coletadas. O tecido foi rapidamente congelado e moído em nitrogênio líquido. Foram adicionados 5 mL de solução tampão fria de extração de polissomos [PEB (Polysome Extraction Buffer)·. Tris pH 9,0 200 mM, KC1 200 mM, MgCl₂ 35 mM, EGTA 25 mM, DTT 5 mM, 1 mM fluoreto de fenilmetanossulfonila (PMSF, PhenylMethaneSulfonylFluoride), ciclo-heximida 50 pg/mL, cloranfenicol 50 pg/mL, Brij-35 1% (v/v), Igepal CA630 1% (v/v), Tween 20 1% (v/v), Triton X-100 1% (v/v), Desoxilato de sódio (DOC) 1%, éter polioxietileno-10-tridecílico (PET) 1% (v/v)]. Após descongelamento sobre gelo durante 10 min, o lisado foi centrifugado a 4°C/16.000 g durante 2 min. O sobrenadante foi transferido para tubo Falcon® de filtro de 10 pm e centrifugado a 4°C/7.000 g durante 1 min. O sobrenadante foi então transferido para um tubo de 2 mL e centrifugado a 4°C/16.000 g durante 15 min e esta etapa foi repetida mais uma vez. 0,25 mL de lisado foi reservado para extração de RNA total para preparação da biblioteca de RNA-seq. Outro 1 mL de lisado foi disposto em camada sobre o topo de almofada de sacarose de 0,9 mL [Tris-HCl pH 9,0 400 mM, KC1 200 mM, MgCl₂ 35 mM, sacarose 1,75 M, DTT 5 mM, cloranfenicol 50 pg/mL, ciclo-heximida 50 pg/mL] em um tubo de ultracentrífuga (#349623, Beckman). As amostras foram então centrifugadas a 4°C/70.000 rpm durante 4h em um rotor TLA 100.1. O pélete foi lavado duas vezes com água fria, ressuspenso em 300 pL de solução tampão de digestão por RNase I [Tris-HCl pH 7,4 20 mM, KC1 140 mM, MgCl₂ 35 mM, ciclo-heximida 50 pg/mL, cloranfenicol 50 pg/mL]¹¹ e então transferido para um tubo novo para centrifugação breve. O sobrenadante foi então transferido para outro tubo novo ao qual foram adicionados 10 pL de RNase I (100 U/pL) antes da incubação durante 60 min a 25°C. 15 pL de “SUPERase-In” (20 U/pL) foram então adicionados para interromper a reação. As etapas subsequentes incluindo a recuperação de ribossomo, purificação de fragmento de footprint,

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101/130 tratamento com PNK e ligação de linker foram realizadas como previamente relatado¹⁰. 2,5 pL de 5’-deadenilase (NEB) foram então adicionados ao sistema de ligação e incubados a 30°C durante Ih. 2,5 pL de RecJf exonuclease (NEB) foram subsequentemente adicionados para incubação durante Ih a 37°C. As enzimas foram inativadas a 70°C durante 20 min e 10 pL das amostras foram colhidos como molde para transcrição reversa. As etapas restantes para a construção da biblioteca foram realizadas de acordo com o protocolo relatado¹⁰, com a exceção do uso de oligos biotinilados, rRNAl e rRNA2, para Arabidopsis de acordo com outro método relatado¹¹.

Construção da biblioteca de RNA-seq [0098] 0,75 mL de “TRIzol® LS” (Ambion) foi adicionado a 0,25 mL de lisado reservado da construção da biblioteca de Ribo-seq, do qual RNA total foi extraído, quantificado e qualificado usando Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc). 50-75 pg de RNA total foram usados para a purificação de mRNA com “Dynabeads® Oligo (dT)2s” (Invitrogen). 20 pL do poli(A)mRNA purificado foram misturados com 20 pL de solução tampão de fragmentação 2x (EDTA 2 mM, NaiCOs 10 mM, NaHCOs 90 mM) e incubados durante 40 min a 95 °C antes do esfriamento sobre gelo. 500 pL de água fria, 1,5 pL de “GlycoBlue” e 60 pL de acetato de sódio 3 M frio foram então adicionados às amostras e misturados Subsequentemente, 600 pL de isopropanol foram adicionados antes da precipitação a -80°C durante pelo menos 30 min. As amostras foram então centrifugadas a 4°C/15.000 g durante 30 min para remover todo o líquido e secadas com ar durante 10 min antes da ressuspensão em 5 pL de Tris pH 8 10 rnM. As etapas restantes foram as mesmas que para a preparação da biblioteca de Ribo-seq.

Plasmídeos [0099] Para construir o repórter 35S:uORFstbfi-LUC, o promotor 35S e o TBF1 éxonl, incluindo o motivo-R, uORFl-uORF2 e a sequência codificante dos primeiros 73 aminoácidos de TBF1, foram amplificados a

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102/130 partir de p35S:uORFl-uORF2-GUS¹ usando os iniciadores Reporter-F/R (F, Direto/R, Reverso), e ligados a pGWB235³⁶ via recombinação Gateway. O constructo 35S:ccdB cassette-LUC-NOS foi gerado pela fusão de fragmentos de PCR do promotor 35S de pMDC140³⁷, do cassete ccdB e do terminador NOS de pRNAi-LIC³⁸ e LUC de pGWB235³⁶. O 35S:ccdB cassette-LUCNOS foi então inserido em pCAMBIA1300 via PstI e EcoRI e chamado de pGX301 para clonagem de sequências líderes 5’ mediante a substituição do cassete ccbB flanqueado com Ápal³⁸. Similarmente, o construto terminador 35S:RLUC-HA-rbs foi preparado mediante a fusão de fragmentos de PCR de 35S de pMDC140³⁷, RLUC de pmirGLO (Promega, E133O) e terminador rbs de pCRG3301³⁹. O fragmento 35S:RLUC-HA-rbs flanqueado com EcoRI foi inserido em pTZ-57rt (Thermo Fisher, Kl 213) via clonagem TA para gerar pGX125. Sequências líderes 5’ foram amplificadas a partir de DNA genômico de Arabidopsis (Col-0) ou sintetizadas por “Bio Basics” (New York, EUA) e inseridas em pGX301 seguido pela transferência de 35S:RLUC-HA-rbs de pGX125 via EcoRI. EFR, PAB2, PAB4 e PAB8 foram amplificados a partir de U21686, C104970, U10212 e U15101 (de ABRC), respectivamente, e fundidos com a terminação-N de EGFP por PCR. Os fragmentos de fusão foram então inseridos entre o promotor 35S e o terminador rbs para gerar 35S:EFR-EGFP (pGX664), 35S:EFR (pGX665), e 35S:PAB2-EGFP (pGX694).

Ensaio de repórter LUC (luciferase) e ensaio de luciferase dupla (dualLUC) [00100] Para registrar a atividade de repórter 35S:uORFstbfi-LUC, plantas Arabidopsis de 3 semanas de idade foram borrifadas com luciferina 1 mM 12h antes da infiltração com quer elfl8 10 μΜ (sintetizado por GenScript) quer MgCk 10 mM como Mock (Simulado). A atividade de luciferase foi registrada em uma caixa equipada com câmera CCD (Lightshade Company) com cada tempo de exposição de 20 min. Para o

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103 / 130 ensaio de luciferase dupla (dual-LUC), plantas N. benthamiana foram crescidas a 22°C sob ciclo de luz/escuridão de 12h/12h. Os constructos de luciferase dupla (diial-LUC) foram transformados para dentro da cepa GV3101 de Agrobacterium, que foi cultivada de um dia para outro a 28°C em LB suplementado com canamicina (50 mg/L), gentamicina (50 mg/L) e rifampicina (25 mg/L). As células foram então centrifugadas a 2.600 g durante 5 min, ressuspensas em solução tampão de infiltração [ácido 2-(Nmorfolino)etanossulfônico (MES, 2-(N-Morpholino)EthaneSulfonic acid) 10 mM, MgCL 10 mM, acetossiringona 200 μΜ], ajustada para DOôoonm = 0,1, e incubadas à temperatura ambiente durante 4h adicionais antes da infiltração usando seringas de 1 mL sem agulha. Para a indução por elfl8, solução de MgCL 10 mM (Mock (Simulado)) ou solução de elfl8 10 μΜ foi infiltrada 20h após o constructo de luciferase dupla (diial-LUC) e EFR-EGFP terem sido coinfiltrados na razão de 1:1, e as amostras foram coletadas 2h após o tratamento. Para o ensaio de coexpressão de PAB2-EGFP, Agrobacterium contendo um constructo de luciferase dupla foi misturado com Agrobacterium contendo o constructo de PAB2-EGFP na razão de 1:5. Discos de folha foram coletados, moídos em nitrogênio líquido e lisados com solução tampão PLB (Promega, E1910). O lisado foi centrifugado a 15.000 g durante 1 min, do qual 10 pL foram usados para medir as atividades de LUC e de RLUC usando o leitor de placas Victor3 (PerkinElmer). A 25°C, os substratos para LUC e RLUC foram adicionados usando o injetor automático e após agitação durante 3 s e atraso de 3 s, os sinais foram capturados durante 3 s e registrados como CPS (contagens por segundo).

Inibição de crescimento induzida por elfl8 e resistência a Psm ES4326 induzida por elfl8 [00101] Para o ensaio de inibição de crescimento induzida por elfl8, sementes foram esterilizadas com solução de PPM 2% (Plant Cell Technology) a 4°C durante 3 dias e semeadas sobre meio MS (sais basais MS

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1/2, sacarose 1%, e ágar 0,8%) com ou sem elf 18 100 nM. Plântulas de 10 dias de idade foram pesadas com 10 plântulas por amostra. For resistência induzida por elf8 a Psm ES4326, elfl8 1 μΜ ou Mock (Simulado) (MgCElO mM) foi infiltrado em plantas crescidas em solo de 3 semanas de idade 1 dia antes da infecção por Psm ES4326 (DOôoonm = 0,001) da mesma folha. Foi determinado o escore do crescimento bacteriano 3 dias após a infecção.

Ativação de MAPK induzida por elfl8 e deposição de calose induzida por elfl8 [00102] Para a ativação de MAPK, plântulas de 12 dias de idade crescidas em meio MS foram inundadas com solução de elfl8 1 μΜ e 25 plântulas foram coletadas nos instantes de tempo indicados. Proteína foi extraída com solução tampão co-IP [Tris, pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 0,1% (v/v), Nonidet P-40 0,2% (v/v), coquetel de inibidores de protease (Roche), coquetel de inibidores de fosfatase “phos-stop” (Roche)]. Para a deposição de calose, plântulas de 3 semanas de idade crescidas em solo foram infiltradas com elfl8 1 μΜ. Após 20h de incubação, as folhas foram coletadas, descoloridas em etanol 100% com agitação suave durante 4h e reidratadas em água durante 30 min antes de serem coradas em azul de anilina 0,01% (p/v) em K3PO4 pH 12 0,01 M cobertas com folha de alumínio durante 24h com agitação suave. A deposição de calose foi observada com [microscópio] confocal invertido Zeiss-510 usando laser de 405 nm para excitação e filtro de 420-480 nm para emissão.

Isolamento de RNA de proteínas PAB sintetizadas in vitro e in vivo [00103] PAB2-EGFP foi amplificada a partir de pGX694. GA, G[A]₃, e G[A]ô foram sintetizados usando Bio Basics (New York, EUA) enquanto que poli(A) e G[A]_n foram sintetizados por IDT (www.idtdna.com/site). As transcrição e tradução in vitro foram realizadas com sistema de tradução de germe de trigo de acordo com as instruções do fabricante (BioSieg, Japão). Para preparar sondas de RNA marcadas com biotina, 2 μΕ de biotina-16-UTP

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105 / 130 mM (11388908910, Roche) foram adicionados ao sistema de transcrição. DNase I foi então usada para remover o DNA molde. 0,2 nmol de RNA marcado com biotina foi conjugado com 50 pL de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (65001, Thermo Fisher) de acordo com a instrução do fabricante. PAB2-EGFP sintetizada in vitro foi incubada com RNA marcado com biotina na solução tampão glicerol-co-IP [Tris, pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2,5 mM, glicerol 10% (v/v), PMSF 1 mM, inibidor Super-In RNase 20 U/mL, coquetel de inibidores de protease (Roche)]. Para realizar o experimento de isolamento in vivo, PAB2-EGFP foi coexpressada com elf 18-receptor EFR (pGX665) durante 40h em N. benthamiana que foi então simuladamente tratada (Mock) ou tratada com elf 18 durante 2h. Proteína foi extraída com solução tampão glicerol-co-IP e usada no ensaio de isolamento a 4°C durante 4h.

Perfílamento polissomal [00104] 0,6 g de tecido de Arabidopsis foi moído em nitrogênio líquido com 2 mL de solução tampão PEB fria. 1 mL de lisado bruto foi carregado em 10,8 mL de gradiente de sacarose 15%-60% e centrifugado a 4°C durante lOh (35.000 rpm, rotor SW 41 Ti). O registro da absorbância a 254 nm (A254) e o fracionamento foram realizados como previamente descrito⁴⁰. RNA polissomal foi isolado por peletização de polissomos e a TE foi calculada como a razão de RNA polissomal/RNA total como previamente descrito.

Reação em cadeia da polimerase e transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) [00105] ~50 mg de tecido de folha foram usados para a extração de

RNA total usando TRIzol seguindo a instrução (Ambion). Após o tratamento com DNase I (Ambion), transcrição reversa foi realizada seguindo a instrução de “SuperScript® III Reverse Transcriptase” (Invitrogen) usando oligo (dT). PCR em tempo foi realizada usando “FastStart Universal SYBR Green Master” (Roche).

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Análises por bioinformática e análises estatísticas [00106] Os métodos estatísticos e de processamento de leituras foram conduzidos seguindo os critérios apresentados na Figura 8 e na Tabela 0 [sic]. Geralmente, Bowtie2 foi usado para alinhar as leituras ao genoma de Arabidopsis TAIR10⁴¹. A atribuição das leituras foi realizada usando HTseq⁴². As alterações em transcriptoma e translatoma foram calculadas usando DESeq2⁴³. As alterações em vezes em transcriptoma (RSfc) para os genes codificantes de proteína foram determinadas usando as leituras atribuídas ao éxon pelo gene. As alterações em vezes em translatoma (RFfc) para os genes codificantes de proteína foram medidas usando as leituras atribuídas à CDS pelo gene. TE foi calculada pela combinação das leituras para todos os genes que passaram com RPKM > 1 em limiar de CDS em duas réplicas biológicas e normalização de Ribo-seq RPKM com relação a RNA-seq RPKM conforme relatado¹⁵. Os critérios usados para a predição de uORF são mostrados na Figura 11 e foram realizados usando “systemPipeR” (github.com/tgirke/systemPipeR). A ferramenta on-line MEME²³ foi usada para pesquisar as sequências líderes 5’ fita-específicas para consensos enriquecidos comparadas com as sequências líderes 5’ de genoma inteiro com parâmetros padrão. O gráfico de densidade foi apresentado usando IGB⁴⁴. A pesquisa de motivo-R de transcriptoma inteiro foi realizada usando a ferramenta FIMO no conjunto de programas de computador MEME²³. A razão LUC/RLUC foi primeiro testada para a distribuição normal usando o teste de Shapiro-Wilk. Teste-t de Student de dois lados foi usado para comparação entre duas amostras. ANOVA unidimensional bilateral ou ANOVA bidimensional bilateral foi usada para mais que duas amostras, teste de Tukey foi usado para comparações múltiplas. “GraphPad Prism 6” foi usado para todas as análises estatísticas. A não ser que seja especificamente declarado, o tamanho de amostra n significa réplica biológica e o experimento tem sido realizado três vezes com resultados similares. *P < 0,05, **p < 0.01,

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107 / 130 ***P < 0,001, e ****P < 0,0001 indicam aumentos significativos; ns, não significativo; < 0,001 indica um decréscimo significativo.

REFERÊNCIAS PARA O EXEMPLO 1

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Exemplo 2-A: Estratégia amplamente aplicável para intensificação de resistência às doenças de plantas com mínima penalidade de valor adaptativo usando controle traducional mediado por uQRF [00107] O controle de doença de planta tem sido um esforço para a humanidade desde o advento da agricultura^{1, 2}. Estudos de mecanismos imunes de planta tem resultado em estratégias de modificação de culturas agrícolas resistentes mediante a transcrição ectópica dos próprios genes de defesa das plantas, como o gene regulador imune mestre NPR1³. Entretanto, a resistência intensificada obtida mediante tais estratégias está, com frequência, associada com penalidades significativas para o valor adaptativo⁴'⁹, tornando os produtos resultantes indesejáveis para aplicações agrícolas. Para remediar este problema, almejamos mecanismos mais estringentes de expressão de proteínas de defesa. Com base em nossa última descoberta de que a tradução de reguladores imunes-chave, como TBF1¹⁰, é rápida e transientemente induzida após desafio com patógenos (manuscrito acompanhante), desenvolvemos o “cassete-TBFl” consistindo não apenas em promotor imune-induzível mas também em duas fases de leitura aberta a montante responsivas a patógenos (uORFstbfi) do gene TBF1. Demonstramos que a inclusão do controle traducional mediado por uORFstbfi sobre a produção de sncl (um receptor imune autoativado) em Arabidopsis e AtNPRl em arroz permite-nos modificar a resistência de amplo espectro a doenças sem comprometer o valor adaptativo da planta no laboratório ou no campo. Esta nova estratégia amplamente aplicável pode resultar em uso reduzido de pesticidas e aliviar a pressão seletiva por patógenos resistentes.

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112/130 [00108] Para atender à demanda de produção de alimentos causada pela explosão da população mundial enquanto que, ao mesmo tempo, limitando a poluição de pesticidas, novas estratégias precisam ser desenvolvidas para controlar as doenças de culturas agrícolas². Como uma alternativa aos tradicionais métodos de cultivo e químico, os estudos dos mecanismos imunes das plantas têm tomado possível a modificação da resistência mediante a expressão ectópica dos próprios genes concedentes de resistência das plantas^{11, 12}. A primeira linha de defesa ativa em plantas envolve o reconhecimento de padrões moleculares associados a micróbios/danos (M/DAMPs Microbial/Damage-Associated Molecular Patterns) pelos receptores reconhecedores de padrões (PRRs, PatternRecognizing Receptors) do hospedeiro, e é conhecida como imunidade disparada por padrões (PTI, Pattern-Triggered Immunity)¹³. Tem sido mostrado que todos a expressão ectópica de PRRs para MAMPs^14,15, o sinal DAMP, eATP⁵, e também a liberação in vivo das moléculas DAMP, oligogalacturonídeos¹⁶, intensificam a resistência em plantas transgênicas. Além da resistência basal mediada por PRR, os genomas das plantas codificam centenas de receptores imunes intracelulares de ligação a nucleotídeos ricos em repetição de leucina (NB-LRR, Nucleotide-Binding and Leucine-Rich Repeat) (também conhecidos como “proteínas-R”) para detectar a presença de efetores de patógenos distribuídos dentro das células das plantas¹⁷. Genes R individuais ou empilhados têm sido transformados em plantas para conferir imunidade disparada por efetores (ETI, EffectorTriggered Immunity)^{13, 19}. Além dos genes PRR e R, NPR1 é outro gene favorito usado na modificação de resistência de planta¹¹. Diferente dos receptores imunes que são ativados por MAMPs específicos e efetores de patógeno, NPR1 é um regulador positivo para resistência de amplo espectro induzida por um sinal imune geral de planta, ácido salicílico³. A superexpressão do Arabidopsis NPR1 (AtNPRl) poderia intensificar a

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113/130 resistência em diversas famílias de plantas como arroz²⁰'²², trigo²³, tomateiro²⁴, e algodão²⁵ contra uma variedade de patógenos.

[00109] Entretanto, um grande desafio na modificação da resistência às doenças é superar as perdas de valor adaptativo associadas⁴'⁹. Na ausência de células imunes especializadas, a indução imune em plantas envolve a mudança das atividades relacionadas ao crescimento para as atividades relacionadas à defesa^{10, 26}. As plantas normalmente evitam a autoimunidade pelo controle rigoroso de transcrição, exportação nuclear de mRNA e degradação ativa de proteínas de defesa²⁷. Entretanto, apenas o controle transcricional tem sido usado predominantemente até agora para modificar a resistência às doenças^{4, 28}. Com base em nossa análise de translatoma global (manuscrito acompanhante), descobrimos que a tradução é uma camada fundamental de regulação durante a indução imune que pode ser explorada para permitir expressão mais estringente, induzida por patógenos, de proteínas de defesa.

[00110] Para testar nossa hipótese de que o controle mais rígido de tradução de proteína de defesa pode minimizar as penalidades de valor adaptativo associadas com intensificada resistência às doenças, usamos o promotor TBF1 (TBFlp) e a sequência líder 5’ (antes do códon de iniciação para TBF1), que chamamos de “cassete-TBFl”. TBF1 é um importante fator de transcrição para a mudança da planta de crescimento para defesa sob indução imune¹⁰. A tradução de TBF1 é normalmente suprimida por duas uORFs dentro da sequência líder 5’¹⁰. Análise por BLAST mostrou que uORF2tbfi, a característica principal de mRNA que confere a supressão traducional (manuscrito acompanhante e referência¹⁰), está conservada em várias espécies de plantas (> 50% de identidade) (Figuras 18A-D), sugerindo um mecanismo de controle evolucionariamente conservado e um uso potencial de cassete-TBFl para regular a produção de proteínas de defesa em espécies de plantas diferentes de Arabidopsis.

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114/130 [00111] Para explorar a aplicação de uORFstbfi, primeiro testamos sua capacidade para controlar ambas as proteínas sintetizadas no citosol e no retículo endoplasmático (ER) (Target, “Alvo”) usando a luciferase de vagalume (LUC, Figura 19A) e a GFPer (Figura 19B), respectivamente, como substitutos (proxies') sob o controle de uORFstbfi de tipo selvagem (WT, Wild-Type) (35S:uORFstbfi-LUC/GFPer) ou de uma uorfsTBFi mutante (35S:uorfsTBFi-LUC/GFPER) na qual os códons de iniciação ATG para ambas uORFs foram alterados para CTG (Figura 15A). A expressão transiente em Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) mostrou que uORFstbfi pôde predominantemente suprimir tanto LUC sintetizada em citosol quanto GFPer sintetizada em ER sem afetar significativamente os níveis de mRNA (Figuras 15B, 15C e Figuras 19C, 19D). Esta supressão traducional mediada por uORFstbfi foi suficientemente forte para prevenir morte celular induzida por superexpressão de TBF1 (TBF1-YFP) observada em 35S:uorfsTBFi-TBFlYFP (Figura 15D e Figura 19E). Uma atividade de repressão similar foi observada em outra uORF conservada, uORF2bbzipn do gene bZIPll responsivo à sacarose²⁹ (Figuras 19F-L). Entretanto, diferente de uORFstbfi, a repressão mediada por uORF2bbzipn não pôde ser aliviada pelo sinal de MAMP elfl8 (Figuras 19M, 19N). Estes resultados confirmam a utilidade potencial de uORFstbfi em prover controle estringente de proteínas de defesa sintetizadas em citosol e em ER especificamente para modificar resistência às doenças.

[00112] Para monitorar o efeito de uORFstbfi sobre a eficiência traducional (TE, Translational Efficiency), um sistema de luciferase dupla (dual-LUC) foi construído para calcular a razão entre a atividade de LUC e a atividade de luciferase de Renilla de controle (RLUC) (Figura 15E). Submetemos as plantas transgênicas hospedando este repórter de luciferase dupla (dual-LUC) para infecção pelos patógenos bacterianos Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326), Ps pv. tomato (Pst) DC3000,

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115/130 e o mutante correspondente do sistema de secreção de tipo III Pst DC3000 hrcC~, e também para os tratamentos pelos sinais de MAMP, elfl8 e flg22. A indução rápida na TE de repórter dentro de Ih dos desafios com ambos os patógenos e os tratamentos com MAMP sugere que ela é provavelmente parte de PTI, que não envolve efetores bacterianos de tipo III (Figura 15F). Os aumentos transientes em tradução não foram correlacionados com alterações significativas em níveis de mRNA (Figura 15G). Em paralelo, examinamos os níveis de TBF1 mRNA endógeno do TBFlp e descobrimos que foram elevados em instantes de tempo mais tardios do que os aumentos traducionais observados usando o repórter (Figura 15H). Isto sugere que em resposta ao desafio com patógenos, a indução traducional pode preceder a reprogramação transcricional em plantas.

[00113] Para modificar as plantas resistentes usando o cassete-TBFl, selecionamos duas candidatas de Arabidopsis, sncl-1³⁰ e NPR1²⁰. A Arabidopsis sncl-1 (para simplificação, sncl daqui em diante) é um mutante pontual autoativado do receptor imune NB-LRR SNC1. Mesmo que as plantas mutantes sncl tenham resistência constitutivamente elevada a vários patógenos, o crescimento delas é significativamente retardado³⁰. Um tal efeito de crescimento é também prevalecente em plantas transgênicas ectopicamente expressando o WT SNC1 quer pelo promotor 35S quer pelo seu promotor nativo^{31, 32}, limitando a utilidade de SNC1, e talvez de outros genes R, na modificação de plantas resistentes. Para superar a penalidade de valor adaptativo associada com o mutante sncl, colocamos-o sob o controle de uORFstbfi conduzido quer pelo promotor 35S quer pelo TBFlp para criar 35S:uORFsTBFi-sncl e TBFlp:uORFsTBFi-sncl, respectivamente. Como controles, também geramos 35S:uorfsTBFi-sncl e TBFlp:uorfsTBFi-sncl, em que os códons de iniciação das uORFs foram mutados. A primeira geração de Arabidopsis transgênica (Tl) com estes quatro constructos apresentou três fenótipos desenvolvimentais diferentes: plantas do Tipo I foram pequenas em

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116/130 diâmetro da roseta, anãs e com clorose (amarelecimento); plantas do Tipo II foram mais saudáveis mas ainda anãs e com mais ramos; e plantas do Tipo III foram indistinguíveis das plantas de tipo selvagem WT (Figura 20). Descobrimos que a regulação de quer transcrição quer tradução de sncl significativamente aprimorou o crescimento das plantas conforme julgado pela percentagem aumentada de plantas do Tipo III. A percentagem mais alta de plantas do Tipo III foi descoberta em transformantes TBF1p:uORFstbfisncl, nos quais sncl foi regulado pelo cassete-TBFl em ambos os níveis transcricional e traducional. A ausência de plantas do Tipo I nestes transformantes demonstrou claramente a estringência do cassete-TBFl (Figura 20).

[00114] Propagamos os transformantes para obter homozigotos para o transgene. Para as linhagens TBFlp:uorfsTBFi-sncl e 35S:uORFsTBFi-sncl, a maioria das plantas do Tipo III em TI mostrou o fenótipo do Tipo II como homozigotos, provavelmente devido à duplicação da dosagem de transgene. Em contraste, a maioria das plantas do Tipo III coletadas dos transformantes TBFlp:uORFsTBFi-sncl manteve o fenótipo de crescimento normal delas como homozigotos. Então selecionamos quatro linhagens TBF1p:uORFstbfisncl independentes para testes adicionais de resistência às doenças e de valor adaptativo com base na aparência similar delas às plantas WT (Figuras 16A, 16B). Primeiro mostramos que estas linhagens transgênicas de fato tinham resistência elevada a Psm ES4326, próxima ao nível observado no mutante sncl quer por inoculação por borrifo quer por infiltração (Figuras 16C, 16D e Figuras 21A, 21B). Também apresentaram resistência intensificada a Hyaloperonospora arabidopsidis Noco2 (Hpa Noco2), um patógeno oomiceto que causa míldio penugento em Arabidopsis (Figuras 16E, 16F e Figura 21C). Entretanto, em contraste com sncl, estas linhagens transgênicas mostraram quase o mesmo valor adaptativo que o das plantas WT, conforme determinado pelos raio da roseta, peso de polpa, número de síliquas (cápsula

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117/130 da semente) e peso de sementes total por planta (Figuras 16G-I e Figuras 21D-G). Após desafio com Psm ES4326, detectamos aumentos significativos na proteína sncl dentro de 2 hpi em todas as quatro linhagens transgênicas TBFlp:uORFsTBFi-sncl, mas não em WT ou sncl (Figura 21H). Comparação com as alterações relativamente moderadas em níveis de sncl mRNA (Figura 211) sugere que estes aumentos na proteína sncl foram mais provavelmente devido à indução traducional. Estes dados provêm uma prova de conceito de que a adição de controle traducional induzível por patógeno é uma maneira eficaz para intensificar a resistência da planta sem perdas de valor adaptativo. [00115] Este resultado em encorajou-nos para aplicar o cassete-TBFl para modificar a resistência em arroz, que não é apenas um organismo modelo para monocotiledôneas, mas também uma das culturas agrícolas alimentares básicas mais importantes no mundo. Primeiro mostramos que o controle traducional mediado por Arabidopsis uORFstbfi é funcional em arroz pela transformação de 35S:uORFstbfi-LUC e 35S:uorfsTBFi-LUC usadas em Figura 15B no arroz (Oryza sativa) cultivar ZH11. Os resultados demonstraram claramente que a Arabidopsis uORFstbfi pôde suprimir a tradução do repórter em arroz sem influenciar significativamente os níveis de mRNA (Figuras 22A, 22B).

[00116] Para modificar a resistência intensificada em arroz, escolhemos o gene Arabidopsis NPR1 (AtNPRl)³, que tem sido mostrado que confere resistência de amplo espectro às doenças em uma variedade de plantas, incluindo arroz²⁰'²². Entretanto, tem sido mostrado que as plantas de arroz superexpressoras de AtNPRl pelo promotor ubiquitina de mais, têm crescimento retardado e tamanho de semente diminuído quando crescidas na estufa ²¹. Adicionalmente, também desenvolvemos o denominado fenótipo de doença imitadora de lesão (LMD, Lesion Mimic Disease) sob determinadas condições ambientais, como baixa luz na câmara de crescimento^{8, 21}. Para remediar o problema de valor adaptativo, expressamos o gene de fusão

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AtNPRl-EGFP sob os seguintes quatro sistemas reguladores: 35S:uorfsrBFiAtNPRl-EGFP, 35S:uORFs_Tbfi-AtNPRl-EGFP, TBFlp:uorfs_TBFi-AtNPRlEGFP and TBFlp:uORFstbfi-AtNPRl-EGFP. Estes quatro constructos foram atribuídos com códigos diferentes para teste cego de fenótipos de resistência e de valor adaptativo. Sob as condições da câmara de crescimento, quer o controle transcricional mediado por TBFlp quer o controle traducional mediado por uORFstbfi decresceu enormemente a proporção e a severidade de plantas de arroz com LMD (Figura 22C). Entretanto, os melhores resultados foram obtidos usando o cassete-TBFl com ambos os controles transcricional e traducional. A seguir, testamos a resistência ao patógeno bacteriano Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), o agente causador da queima bacteriana do arroz, na primeira geração (TO em pesquisa de arroz; Figuras 23a-e) e na segunda geração (Tl; Figuras 24A, 24B) de transformantes sob as condições de estufa onde LMD não foi observada mesmo para 35S:uorfsTBFi-AtNPRl. Não surpreendentemente, as plantas 35S:uorfsTBFi-AtNPRl apresentaram o nível mais alto de resistência a Xoo, devido às transcrição e tradução constitutivas de AtNPRl. Entretanto, níveis similares de resistência também foram observados em plantas com controle transcricional ou com controle traducional ou com ambos os controles (Figuras 24A, 24B). De forma fascinante, estes resultados de resistência foram fielmente reproduzidos no campo (Figuras 17A, 17B e Figura 24C). Em resposta ao desafio com Xoo, as linhagens transgênicas com uORFstbfi funcional apresentaram aumentos de proteína AtNPRl que alcançou o valor máximo a cerca de 2 hpi, mesmo na ausência de alterações significativas em níveis de mRNA (por exemplo, 35S:uORFstbfi-AtNPRl em Figura 24d, e). [00117] Para determinar o espectro da resistência mediada por AtNPRl, inoculamos a terceira geração de plantas transgênicas de arroz (T2) com Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xoc) e Magnaporthe oryzae (M. oryzae), os patógenos causadores da estria bacteriana da folha de arroz e da

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119/130 brusone (doença fúngica), respectivamente. Observamos padrões similares de resistência intensificada contra Xoc e M. oryzae em câmaras de crescimento projetadas para estes patógenos controlados (Figuras 17C-F) como para Xoo, confirmando o amplo espectro de resistência mediada por AtNPRl. A ausência de variação significativa dentre as diferentes linhagens transgênicas sugere que todas elas têm níveis saturados de AtNPRl que confere resistência.

[00118] Então realizamos testes detalhados de valor adaptativo nestas plantas transgênicas no campo. Consistente com um relatório prévio sobre a expressão ectópica do homólogo de arroz NPR1 (OsNHl) pelo promotor 35S³³, não foi observada LMD óbvia em nenhumas das plantas transgênicas de arroz AtNPRl crescidas no campo. Entretanto, transcrição e tradução constitutivas de AtNPRl em plantas 35S:uorfsTBFi-AtNPRl claramente tiveram penalidades de valor adaptativo em comprimento e largura da folha mais alta do colmo, número de ramos secundários, altura da planta, e número e peso de grãos (Figuras 17G-I e Figura 25). A adição de controle transcricional e/ou traducional de AtNPRl significativamente reduziu as perdas relativas a estes atributos agronomicamente importantes, com os benefícios de uORFstbfi realçados em altura da planta, comprimento/largura da folha mais alta do colmo, e número de grãos por planta (Figuras 17G, 17H e Figuras 25E, 25F). Como já observado em experimentos em estufa, a combinação de ambos os controles transcricional e traducional apresentou o melhor desempenho na eliminação de qualquer perda de valor adaptativo em rendimento conforme determinada por dois atributos: número de grãos por planta, e peso de 1.000 grãos (Figuras 17H, 171), mesmo que estas plantas tenham níveis similares de resistência às doenças.

[00119] Com o uso do cassete-TBFl, estabelecemos uma nova estratégia de controle de doenças de plantas, que causam perda de 26% na produção de culturas agrícolas por ano em todo o mundo¹ e perda de 30-40%

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120/130 em países em desenvolvimento². Além de TBF1, elementos-cz\ de mRNA mais imunorresponsivos e também reguladores /ran.s-atuantes tomar-se-ão disponíveis mediante análises de translatoma global. Nosso próprio estudo de footprint ribossomal da resposta de PTI já tem revelado as funções de características de mRNA como uORFs e uma sequência de consenso de mRNA “motivo-R” que conferem responsividade traducional à indução de PTI (manuscrito acompanhante). Este estudo de translatoma também mostrou que as atividades traducionais são, em geral, mais estringentemente controladas que a transcrição, enfatizando ainda mais a importância da regulação da tradução no equilíbrio entre defesa e valor adaptativo. Com o uso de mecanismos reguladores transcricional e traducional imuno-induzíveis para controlar a expressão de proteínas de defesa pode-se não apenas minimizar os efeitos adversos de resistência intensificada sobre os crescimento e desenvolvimento da planta, mas também ajudar a proteger o meio ambiente mediante demanda reduzida de pesticidas, a maior fonte de poluição. Além disso, esta resistência induzível de amplo espectro pode ser mais difícil de superar por um patógeno do que a resistência de “gene-paragene” constitutivamente expressada. A presença ubíqua de uORFs em mRNAs de organismos variando desde levedura (13% de todo o mRNA)³⁴ até humanos (49% de todo o mRNA)³⁵ sugere a utilidade potencialmente ampla destas características de mRNA para o controle preciso de expressão transgênica.

Métodos

Crescimento, transformação, e infecção patogênica de Arabidopsis [00120] O acesso Col-0 de Arabidopsis foi usado em todos os experimentos. As plantas foram crescidas em solo (“Metro Mix 360”) a 22°C com umidade relativa (UR) de 55% e sob ciclos de luz/escuridão de 12h/12h para ensaio de crescimento bacteriano e medições de raio da planta e peso de polpa ou sob ciclos de luz/escuridão de 16h/8h para medições de peso de

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121/130 semente e número de srliquas. Método de imersão floral³⁶ foi usado para gerar plantas transgênicas. A linhagem repórter BGL2:GUS^3Q foi usada para transformação sncl -relacionada. Para infecção, bactérias foram primeiro crescidas na placa de meio de cultura “King’s Broth” a 28°C durante 2 dias antes de serem ressuspensas em solução de MgCE 10 mM para infiltração. A seleção de antibiótico para Psm ES4326 foi 100 pg/mL de estreptomicina, para Pst DC3000 foi 25 pg/mL de rifampicina, e para Pst DC3000 hrcC~ foi 25 pg/mL de rifampicina e 30 pg/mL de cloranfenicol. Para inoculação por borrifo, Psm ES4326 foi transferida para “King’s Broth” líquido com 100 pg/mL de estreptomicina, crescida durante outras 8 a 12h para DOôoonm = 0,6 a 1,0 e borrifada à DOôoonm = 0,4 em MgCE 10 mM com 0,02% de “Silwet L77”. Amostras de folhas infectadas foram coletadas no dia 0 (4 réplicas biológicas com 3 discos de folha cada) e no dia 3 (8 réplicas com 3 discos de folha cada). Para infecção por Hpa Noco2, plantas de 12 dias de idade crescidas sob ciclos de luz/escuridão de 12h/12h com UR de 95% foram borrifadas com 4xl0⁴ esporos/mL e incubadas durante 7 dias. Os esporos foram coletados por suspensão das plantas infectadas em 1 mL de água e contados em um hemocitômetro sob um microscópio.

Expressão transiente em N. benthamiana [00121] Plantas N. benthamiana foram crescidas a 22°C sob ciclos de luz/escuridão de 12h/12h antes de serem usadas para expressão transiente mediada por Agrobacterium. Agrobacterium GV3101 transformada com cada constructo foi crescida em LB com canamicina (50 pg/mL), gentamicina (50 pg/mL) e rifampicina (25 pg/mL) a 28°C de um dia para outro. Células foram ressuspensas na solução tampão de infiltração [ácido 2-(Nmorfolino)etanossulfônico (MES) 10 mM, MgCE 10 mM, acetossiringona 200 μΜ] à DOôoonm = 0,1 e incubadas à temperatura ambiente durante 4h antes da infiltração. Para indução de elfl8 em N. benthamiana, a Agrobacterium hospedando o constructo expressor de receptor de elfl8 (pGX664) foi

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122/130 coinfiltrado com a Agrobacterium contendo o constructo de teste em razão de 1:1. 20h Mais tarde, as mesmas folhas foram infiltradas com solução de MgCL 10 mM (Mock (Simulado)) ou com solução de elfl8 10 μΜ antes da coleta de discos de folha 2h mais tarde.

Ensaio de luciferase dupla (dual-LUC) [00122] A solução de MgCh (10 mM), de Psm ES4326 (DOeoonm = 0,02), de Pst DC3000 (D0₆oonm = 0,02), de Pst DC3000 hrcC~ (D0₆oonm = 0,02), de elfl8 (10 μΜ) ou de flg22 (10 μΜ), foi infiltrada. Discos de folha foram coletados nos instantes de tempo indicados. As atividades de LUC e de RLUC foram medidas como CPS (contagens por segundo) usando o leitor de placa Victor3 (PerkinElmer) de acordo com com o kit da Promega (El910).

Reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) [00123] -100 mg de tecido de folha foram coletados para extração de

RNA total com “TRIzol” (Ambion). Tratamento com DNase I (Ambion) foi realizado antes da transcrição reversa com “SuperScript® III Reverse Transcriptase” (Invitrogen) usando oligo (dT). Real-time PCR em tempo real foi realizada usando “FastStart Universal SYBR Green Master” (Roche).

Crescimento, transformação, e infecção patogênica de arroz [00124] Para observação do fenótipo de LMD, arroz foi crescido em estuda durante 6 semanas e movido para uma câmara de crescimento durante 3 semanas (ciclos de luz/escuridão de 12h/12h, 28°C e UR de 90%). Para o teste de valor adaptativo, arroz foi crescido durante a estação de crescimento de arroz normal (de Novembro de 2015 a Maio de 2016) sob condições de campo em Lingshui, Hainan (latitude 18° N). Transformação mediada por Agrobacterium no Oryza sativa cultivar ZH11 foi usada para obter plantas transgênicas de arroz³⁷. Para a infecção por Xoo na estufa (realizada no ano 2016), arroz foi crescido durante 3 semanas a partir de 2 de Fevereiro e inoculado em 23 de Fevereiro com a coleta de dados em 8 de Março. Para a infecção por Xoo no campo (realizada no ano 2016), arroz foi crescido em 10

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123/130 de Maio nas Estações Experimentais da Universidade Agrícola Huazhong, Wuhan, China (latitude 31° N) e inoculado em 20 de Julho com a coleta de dados em 4 de Agosto. Cepas PXO347 e PXO99 de Xoo foram crescidas em meio de ágar com nutrientes (0,1% de extrato de levedura, 0,3% de extrato de carne bovina, 0,5% de polipeptona, e 1% de sacarose) a 28°C durante 2 dias antes da ressuspensão em água estéril e diluição para DOôoonm = 0,5 para inoculação. 5 a 10 Folhas de cada planta foram inoculadas pelo Leaf-Clipping Method (método de corte de ponta de folha usando tesoura infectada com suspensão de patógeno) no estágio de iniciação (desenvolvimento de panícula)³⁸. O escore da doença foi determinado pela medição do comprimento da lesão no 14° dia pós-inoculação (dpi). PCR foi realizada usando o iniciador arroz-F (iniciador direto) e o iniciador arroz-R (iniciador reverso) para identificação de plantas transgênicas AtNPRl. Foram determinados os escores de ambas as plantas TI positivas e negativas para PCR. Para a infecção por Xoc na câmara de crescimento (realizada no ano 2016), arroz foi crescido em 20 de Outubro e inoculado em 15 de Novembro com a coleta de dados em 29 de Novembro. Cepa RH3 de Xoc foi crescida em meio de ágar com nutrientes (0,1% de extrato de levedura, 0,3% de extrato de carne bovina, 0,5% de polipeptona, e 1% de sacarose) a 28°C durante 2 dias antes da ressuspensão em água estéril e diluição para DOôoonm = 0,5 para inoculação. 5 a 10 Folhas de cada planta foram inoculadas pelo método de penetração, usando uma seringa sem agulha, no estágio de broto lateral da base do caule³⁸. O escore da doença foi determinado pela medição do comprimento da lesão no 14° dpi. Para a infecção por M. oryzae na câmara de crescimento (realizada no ano 2016), arroz foi crescido em 15 de Outubro e inoculado em 16 de Novembro com coleta de dados em 23 de Novembro. Isolado RB22 de M. oryzae foi cultivado em meio de ágar com tomatefarinha-de-aveia (OTA, Oatmeal Tomato Agar) (40 g de aveia, 150 mL de suco de tomate, 20 g de ágar para 1 L de meio de cultura) a 28°C. 10 pL da

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124/130 suspensão de conídios (5,Ox 10⁵ esporos/mL) contendo 0,05% de Tween-20 foram gotejados nos pontos pré-lesionados sobre 5 a 10 folhas de arroz completamente expandidas e então envolvidos com fita de celofane. As plantas foram mantidas na escuridão em UR de 90% durante um dia e foram crescidas sob ciclos de luz/escuridão de 12h/12h com UR de 90%. O escore da doença foi determinado por medição do comprimento da lesão no 7^o dpi. Para Xoc e M. oryzae, 3 linhagens transgênicas independentes para cada constructo foram testadas, com os dados de 2 linhagens mostrados na Figura

17. Para a infecção por Xoo e o valor adaptativo, 4 linhagens transgênica independentes para cada constructo foram testadas, com os dados de duas linhagens mostrados na Figura 17 e de todas as quatro linhagens em todas as partes das Figuras 24 e 25.

Imunotransferência [00125] Tecido de Arabidopsis (100 mg) infectado por Psm ES4326 (DOôoonm = 0,02) foi coletado e lisado em 200 pL de solução tampão de lise [Tris, pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 0,1%, Nonidet P-40 0,2%, coquetel de inibidores de protease (Roche, 1 comprimido para 10 mL)] antes da centrifugação a 12.000 rpm do sobrenadante. O mesmo protocolo foi usado para extrair as proteínas do arroz infectado por Xoo (PXO99, à DOôoonm = 0.5) usando uma solução tampão de lise muito pouco diferente [Tris-HCl, pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, EDTA 2 mM, Triton X100 0,1 %, coquetel de inibidores de protease (Roche, 1 comprimido para 10 mL)].

Construção de plasmídeo [00126] O promotor 35 S com intensificadores duplicados foi amplificado a partir de pRNAi-LIC³⁹ e flanqueado com os sítios PstI e Xbal usando os iniciadores P1/P2. O terminador NOS foi amplificado a partir de pRNAi-LIC e flanqueado com os sítios KpnÁ e EcoRl usando os iniciadores P3/P4. Cassete Gateway com sequências adaptadoras de LIC (Ligation

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Independent Cloning, clonagem independente de ligação) foi amplificado e flanqueado com os sítios KpnÁ e AflU usando os iniciadores P5/P6/P7 (o fragmento de PCR por P5/P6 foi usado como molde para P5/P7) a partir de pDEST375 (GenBank: KC614689.1). O terminador NOS, o promotor 35S =, e o cassete Gateway foram sequencialmente ligados ao pCAMBIA1300 (GenBank: AF234296.1) via KpnlIEcoRI, PsfUXbcA e Kpnl/AflU, respectivamente. O plasmídeo resultante foi usado como um plasmídeo intermediário. As sequências líderes 5’ de TBF1 (a montante do códon de iniciação ATG de TBF1) com WT uORFs (de tipo selvagem) e uorfs mutantes foram amplificadas com P8/P9 e P8/P10 a partir dos plasmídeos previamente publicados¹⁰ contendo uORFl-uORF2-GUS e uorfl-uorf2-GUS, respectivamente, e clonados no plasmídeo intermediário via XbaHKpnl. Os plasmídeos resultantes foram chamados depGX179 (35S:uORFstbfiGateway-NOS) e pGX180 (35S:uorfsTBFi-Gateway-NOS). TBFlp foi amplificado a partir do DNA genômico de Arabidopsis e flanqueado com HindlII/AscI usando os iniciadores Pll/Pl, e a sequência líder 5’ de TBF1 foi amplificada a partir de pGX180 e flanqueada com Ascl/Kpnl usando os iniciadores P8/P13. O promotor TBF1 (P11/P12) e a sequência líder 5’ de TBF1 5’ (P8/P13) foram digeridos com Asei, ligados, e usados como molde para PCR e introdução de Hindül/Kpnl usando o iniciador P11/P8. O promotor 35S em pGX179 foi substituído pelo promotor TBF1 para produzir pGXl (TBFlp:uORFsTBFi-Gateway-NOS). O promotor TBF1 foi amplificado a partir do DNA genômico de Arabidopsis e flanqueado com HindIII/Spel usando os iniciadores P14/P15 e ligado no pGX179, que foi cortado com Hindlll/Xbal, para gerar pGX181 (TBFlp:uorfsTBFi-Gateway-NOS). LUC, GFPer e sncl foram amplificados a partir de pGWB235⁴⁰, GFP-HDEL⁴¹ e o DNA genômico mutante de sncl, respectivamente. TBF1-YFP e NPR1-EGFP foram fusionados juntos mediante PCR, clonados via clonagem independente de ligação³⁹. EFR foi amplificado a partir de U21686 (TAIR), fusionado com

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EGFP e controlado pelo promotor 35S. A sequência líder 5’ de bZIPll (contendo uORFsbzipn) foi amplificada a partir de DNA genômico de Arabidopsis com G904/G905. Os códons de iniciação (ATG) para uORF2a e uORF2b na sequência líder 5’ foram mutados para CTG e TAG, respectivamente, para gerar uorf2abzipn e uorf2bbzipn por PCR usando iniciadores contendo mutações pontuais.

Análises estatísticas [00127] Distribuição normal foi testada usando o teste de ShapiroWilk. ANOVA unidimensional bilateral junta com o teste de Tukey foi usada para comparações múltiplas. A não ser que seja especificamente declarado, o tamanho de amostra n significa réplica biológica. Os experimentos têm sido realizados três vezes com resultados similares para estudo de Arabidopsis. “GraphPad Prism 6” foi usado para todas as análises estatísticas.

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41. Xu, G. et al. Plant ERD2-like proteins function as endoplasmic reticulum luminal protein receptors and participate in programmed cell death during innate immunity. Plant J. 72, 57-69 (2012).

Claims (34)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Constructo de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor heterólogo funcionalmente ligado a um polinucleotídeo de DNA codificante de um transcrito de RNA compreendendo uma sequência regulatória 5’ localizada 5’ a um sítio de inserção, em que a sequência regulatória 5’ compreende uma sequência de motivo-R.
2. 2. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência regulatória 5’ carece de uma sequência TBF1 uORF.
3. 3. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sequência regulatória 5’ compreende pelo menos duas sequências de motivo-R.
4. 4. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sequência regulatória 5’ compreende entre 5 e 25 sequências de motivo-R.
5. 5. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as sequências de motivo-R estão separadas por 0 nucleotídeos.
6. 6. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o motivo-R compreende qualquer uma das sequências de SEQ ID NOs: 113-293, um polinucleotídeo de 15 nucleotídeos em comprimento compreendendo nucleotídeos G e A em qualquer razão de 1G:1A a 1G:14A, ou uma variante do mesmo.
7. 7. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sequência regulatória 5’ compreende adicionalmente um polinucleotídeo uORF

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   2/6 codificante de qualquer um dos polipeptideos uORF de SEQ ID NOs: 1-38, ou uma variante dos mesmos.
8. 8. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sequência regulatória 5’ compreende qualquer um dos polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 39-76 ou uma variante dos mesmos
9. 9. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a sequência regulatória 5’ compreende qualquer um dos polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 77-112, SEQ ID NOs: 294-474, ou uma variante dos mesmos.
10. 10. Constructo de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor heterólogo funcionalmente ligado a um polinucleotídeo de DNA codificante de um transcrito de RNA compreendendo uma sequência regulatória 5’ localizada 5’ a um sítio de inserção, em que a sequência regulatória 5’ compreende um polinucleotídeo uORF codificante de qualquer um dos polipeptideos uORF de SEQ ID NOs: 1-38 ou uma variante dos mesmos.
11. 11. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a sequência regulatória 5’ compreende qualquer um dos polinucleotídeos de SEQ ID NOS: 39-76, ou uma variante dos mesmos.
12. 12. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a sequência regulatória 5’ compreende qualquer um dos polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 77-112, SEQ ID NOs: 294-474, ou uma variante dos mesmos.
13. 13. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o sítio de inserção compreende uma sequência codificante heteróloga que codifica um polipeptídeo heterólogo.

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    3/6
14. 14. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo compreende um polipeptídeo de resistência a patógeno de planta.
15. 15. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de resistência a patógeno de planta é selecionado do grupo consistindo em snc-1 e NPR1.
16. 16. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o promotor heterólogo compreende um promotor de planta.
17. 17. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o promotor heterólogo compreende um promotor de planta induzível por um patógeno de planta ou por um indutor químico.
18. 18. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o constructo de DNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

    17.
19. 19. Vetor de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um plasmídeo.
20. 20. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o constructo de DNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 ou o vetor como definido na reivindicação 18 ou 19.
21. 21. Célula de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de planta.
22. 22. Célula de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a célula é selecionada do grupo consistindo em uma célula de planta de milho, uma célula de planta de feijão, uma célula de planta de arroz, uma célula de planta de soja, uma célula de planta de algodão, uma célula de planta de tabaco, uma célula de tamareira, uma célula de trigo, uma célula de tomateiro, uma célula de bananeira, uma célula de planta de batata, uma

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    4/6 célula de pimenteira, uma célula de planta de musgo, uma célula de planta de salsa, uma célula de planta cítrica, uma célula de planta de maçã, uma célula de morangueiro, uma célula de planta de colza, uma célula de planta de repolho, uma célula de planta de mandioca, e uma célula de cafeeiro.
23. 23. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende qualquer um(a) dos(as) constructos de DNA, vetores, ou células como definidos(as) em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.
24. 24. Planta de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo em uma planta de milho, uma planta de feijão, uma planta de arroz, uma planta de soja, uma planta de algodão, uma planta de tabaco, uma planta de tamareira, uma planta de trigo, um tomateiro, uma bananeira, uma planta de batata, uma pimenteira, uma planta de musgo, uma planta de salsa, uma planta cítrica, uma planta de maçã, um morangueiro, uma planta de colza, uma planta de repolho, uma planta de mandioca, e um cafeeiro.
25. 25. Método de controle da expressão de um polipeptídeo heterólogo em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir na célula o constructo como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 17, ou o vetor como definido na reivindicação 18 ou 19.
26. 26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de planta.
27. 27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a célula é selecionada do grupo consistindo em uma célula de planta de milho, uma célula de planta de feijão, uma célula de planta de arroz, uma célula de planta de soja, uma célula de planta de algodão, uma célula de planta de tabaco, uma célula de tamareira, uma célula de trigo, uma célula de tomateiro, uma célula de bananeira, uma célula de planta de batata, uma célula de pimenteira, uma célula de planta de musgo, uma célula de planta de salsa, uma célula de planta cítrica, uma célula de planta de maçã, uma célula

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    5/6 de morangueiro, uma célula de planta de colza, uma célula de planta de repolho, uma célula de planta de mandioca, e uma célula de cafeeiro.
28. 28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente purificar o polipeptídeo heterólogo da célula.
29. 29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente formular o polipeptídeo heterólogo como um agente terapêutico para administração a um sujeito.
30. 30. Constructo de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor heterólogo funcionalmente ligado a um polinucleotídeo de DNA codificante de um transcrito de RNA compreendendo uma sequência regulatória 5’ localizada 5’ a uma sequência codificante heteróloga que codifica um polipeptídeo Á/NPR compreendendo a SEQ ID NO: 475, em que a sequência regulatória 5’ compreende a SEQ ID NO: 476 {uORFstbfi)·
31. 31. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o promotor heterólogo compreende a SEQ ID NO: 477 (promotor 35S) ou a SEQ ID NO: 478 (TBFlp).
32. 32. Constructo de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, caracterizado pelo fato de que o constructo de DNA compreende a SEQ ID NO: 479 (35S:iiORFsTBFi-AtNPRT) ou a SEQ ID NO: 480 (TBFlp:uORFs_TBFi-AtNPRl).
33. 33. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende qualquer um dos constructos de DNA como definidos nas reivindicações 30 a 32.
34. 34. Planta de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo em uma planta de milho, uma planta de feijão, uma planta de arroz, uma planta de soja, uma planta de algodão, uma planta de tabaco, uma planta de tamareira, uma planta

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    6/6 de trigo, um tomateiro, uma bananeira, uma planta de batata, uma pimenteira, uma planta de musgo, uma planta de salsa, uma planta cítrica, uma planta de maçã, um morangueiro, uma planta de colza, uma planta de repolho, uma planta de mandioca, e um cafeeiro.