HU214829B - Eljárás transzkripció iniciálását szabályozó nukleotidszekvencia előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás rekőmbináns nűkleőtidszekvenciaelőállítására, amely szekvencia tartalmaz egy: a transzkripció iniciálását szabályőzó szekvenciát, amelyszekvencia egy prőmótert és azzal kapcsőltan egy GCACTC 9N GAGTGCmőtívűmőt tartalmaz, ahől „N" jelentése a négy b zis, a timin, gűanin,adenin és citőzin valamelyike; és tartalmaz egy „heterőlóg pőlipeptid" elnevezésű pőlipeptidet kódőlószekvenciát, amely szekvencia különbözik a prőmóterrel természeteskörülmények között kapcsőlt szekvenciától; és a kódőló szekvencia a transzkripció iniciálását szabályőzószekvenciától 3'-irányban helyezkedik el egy őlyan helyen, amelyalkalmas körülmények között lehetővé teszi a peptidnek a prőmót rszabályőzása alatt történő expresszálódását. A találmány tárgyátképezik tővábbá eljárásők a találmány szerinti rekőmbinánsnűkleőtidszekvenciákat tartalmazó vektőrők és transzfőrmált sejtekelőállítására, pőlipeptidek előállítására a találmány szerintiszekvenciák alkalmazásával, valamint eljárásők transzkripció-inicializálást szabályőzó szekvenciák előállítására és ilyenszekvenciák hőindűkálhatóvá tételére. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás transzkripció hőindukálható iniciálását szabályozó nukleotidszekvencia előállítására, és a szekvencia alkalmazása polipeptidek rekombináns úton történő előállítására.

A találmány kifejlesztésének kezdetén felmerült technikai probléma egy olyan erős, ha lehetséges, hővel indukálható promoter azonosítása volt, amely a mikroorganizmusok nagy számában, különösen Actinomyceták esetén használható.

Az Actinomyceták a baktériumok egy nagy gazdasági és gyógyászati fontosságú rendje, csak azt említjük, hogy az Actinomyceták körébe tartoznak a Streptomyces és Mycobacterium nemzetségek.

A napjainkban kereskedelmi forgalomban lévő antibiotikumok mintegy 70%-át a Streptomyces nemzetség tagjai termelik, továbbá, bár már nincs arra mód, hogy a Mycobacterium tuberculosis és Mycobacterium leprae által okozott pusztítást leírjuk, nagy érdeklődés kötődik a heterológ antigénnek egy M. bovis BCG törzsben való kifejezéséhez annak érdekében, hogy vakcinaként használható élő polivalens törzset nyerjenek.

A fenti baktériumok genetikáját molekuláris szinten kevéssé tanulmányozták, de genetikai expressziójuk regulációja különbözőnek tűnik attól, mint amit a részletesebben tanulmányozott baktériumok, például az Escherichia coli és Bacillus subtilis esetében leírtak.

Közelebbről az Actinomyceták, amelyek DNS-e G+C-ben gazdag, az Escherichia coli és Bacillus subtilis „promoter” szekvenciákat gyengén vagy egyáltalán nem ismerik fel. Baird és munkatársai [J. Gén. Microbiol., 135, 931-939 (1989)] tanulmányozták Mycobacterium hősokkproteinjeit kódoló géneket, és azt valószínűsítették, hogy két szekvencia, a TTGAG és a TCTCATGT képezi a promoter -35 és -10 régióját, ezek a Mycobacterium tuberculosis 10 kDA hősokkproteinjét kódoló szekvenciától az 5’-vég irányában helyezkednek el.

Valójában a két szekvencia nagymértékű homológiát mutat az E. coli promoter konszenzus-szekvenciával. Továbbá, a különböző Mycobacterium fajokban más hősokkproteineket kódoló gének (például a Mycobacterium leprae 65 kDA proteinjét vagy az M. bovis 64 kDA proteinjét kódoló gének) ugyancsak tartalmaznak egy hasonló típusú szekvenciapárt, azaz TTGCCG és TTTCAT vagy TTGCCG és CTTCAT szekvenciát, és ezek így nagymértékű homológiát mutatnak az E. coli promóterrel és a Mycobacterium tuberculosis 10 kDA „-35 és -10” szekvenciáival.

A fenti közlemény és Thole és munkatársai [Infection and Immunity, 55, 1466-1475 (1987)] közleménye szerint a Mycobacterium hősokkproteinjének génjei transzkripciójáért felelős promoterek -35 és -10 szekvenciákként a páros szekvenciáknak ezt a típusát tartalmazzák. Ezeket a szekvenciákat a következőkben „E. coli típusú -10 és -35 szekvenciák” névvel jelölik. E megállapítás mellett a szerzők ezt a feltételezést nem erősítették meg a szekvenciák térképezésével, így a promoterek azonossága továbbra is bizonytalan maradt.

Nem várt módon arra a felismerésre jutottunk, hogy az E. coli típus -10 Is -35 szekvenciái jelen vannak a

Streptomyces nemzetségben is, de nem játszanak szerepet e nemzetség baktériumaiban a hősokkproteinek transzkripciójának iniciálásában. Megjegyezzük, hogy az előzőekben említett közleményekben Baird és Thole észlelték, hogy a Mycobacteriumban a hősokkproteinek kódolására szolgáló génektől az 5’ irányban lévő szekvenciában egy, a GCACTC 9N GAGTGC szekvenciát tartalmazó palindrom motívum fordul elő. Azonban ennek a motívumnak a pontos szerepét nem azonosították. Thole feltételezi, hogy ez a motívum vagy a hősokkproteint kódoló géntől 5’-vég irányában elhelyezkedő operon transzkripciója terminációjával kapcsolatos, vagy a policisztron messenger transzlációjának szabályozásában van szerepe.

Annak érdekében, hogy egy olyan erős (ha lehetséges, hőindukálható) promótert klónozzuk, amely az Actinomyceták nagy számánál használható, vizsgáltuk a Streptomycesekoen a hősokkot, és egy erősen expresszálódó proteint klónoztunk annak érdekében, hogy promóterét jellemezzük. Valójában a hősokkra adott válaszjelensége, amely proteinek megújulásában nyilvánul meg, egy általános jelenség, így feltételezhető, hogy regulációja a különböző Actinomycetákb&n hasonló, és különösen az, hogy a promoterek konszenzus szekvenciával bírnak, amely alkalmassá teszi őket arra, hogy a törzsek nagy számában legyenek használhatók.

így két funkcionális promótert azonosítottunk és jellemeztünk a Streptomycesekoen, és ezenkívül azonosítani tudtuk az előzőekben említett palindroma funkcióját annak a megfigyelésnek folytán, hogy a fenti promoterek mindegyike tartalmazza a GCACTC 9N GAGTGC motívumot.

A találmány egy rekombináns nukleotidszekvenciára vonatkozik, amelyre az jellemző, hogy tartalmaz:

- egy, a transzkripció iniciálására szolgáló regulátorszekvenciát, ez a regulátorszekvencia a GCACTC 9N GAGTGC motívummal kombináltan egy promótert tartalmaz, az előbbiben „N” a 4 bázis, a timin, guanin, adenin és citozin bármelyikét jelöli;

- egy polipeptidet kódoló szekvenciát, amely polipeptid elnevezése „heterológ polipeptid”, ez eltérő attól, ami a természetben a fenti promóterrel kapcsolatos;

- a fenti kódoló szekvencia a fenti, a transzkripció iniciálására szolgáló regulátorszekvenciától a 3’vég irányában helyezkedik el egy olyan helyen, amely megfelelő körülmények mellett lehetővé teszi, hogy a polipeptid a fenti promoter szabályozása alatt kifejeződjön.

A találmány szerinti rekombináns nukleotidszekvencia képes arra, hogy lehetővé tegye egy heterológ gén kifejeződését az azt tartalmazó sejtben.

A transzkripció iniciálását szabályozó szekvencia, amely a rekombináns nukleotidszekvencia részét képezi egy, a GCACTC 9N GAGTGC motívummal kapcsolt promóterből tevődik össze. Ebben az összefüggésben a „kapcsolt” kifejezés azt jelenti, hogy a GCACTC 9N GAGTGC motívum lehet a promótertől független vagy tartalmazhatja ezt a motívumot - legalább részben - a

HU 214 829 Β promóter. Ez az utóbbi lehetőség magában foglalja azt a helyzetet, amikor a motívum átlapoló a promóter szekvenciával, és azt a helyzetet, amelyben a motívum a promóter szerves részét képezi.

A GCACTC 9N GAGTGC szekvenciával kapcsolt promóterek közül a találmány szempontjából előnyösek azok, amelyek az Actinomycetákoan vannak jelen, különösen azok, amelyek a bakteriális genomban szokásosan a hősokkproteinekkel kapcsolatosak. Az ilyen típusú promóterek példáiként említhetjük a Streptomyces albus 18 kDA (Pl) és 56 kDA (P2) hősokkprotein promótereit, amelyeket a találmány keretein belül azonosítottunk.

A Pl az alábbi szekvenciák valamelyikének megfelelő:

CATTGGCACTCCGCTTGACCGAGTGCTAATCGCGGTCATAGTCTCAGCTCTG 5’ 3’ vagy

GCATTGGCACTCCGCTTGACCGAGTGCTAATCGCGGTCATAGTCTCAGCTCTG 5’ 3’

A P2 az alábbi szekvenciák valamelyikének megfelelő:

GGAGGCCCCTAGCGCCTGCACTCTCCTACCCCGAGTGCTATTATTGGCGTTA 5’ 3’ vagy

GGAGGCCCCTAGCGCCTGCACTCTCCTACCCCGAGTGCTAATTATTGGCGTTA 5’3’

Ezen promóterek mindegyike legfeljebb 4 vagy 5 bázissal lerövidíthető az 5’-végen anélkül, hogy az aktivitását károsan befolyásolná. A promóterek más típusát képezik a Mycobacterium tuberculosis 10 kDA és 65 kDA, a M. bovis 64 kDA és a M. leprae 65 kDA hősokkproteinjeinek promóterei.

A GCACTC 9N GAGTGC motívum kapcsolódása 25 a promóterrel hőindukálható jelleget kölcsönöz a promótemek. Valószínű, hogy ez a szekvencia egy operátor, és hogy egy represszor kötődési helyét képezi, amely így megakadályozza az RNS polimeráznak a promóter -10 és -35 szekvenciáihoz való kötődését.

Abban az esetben, ha a motívum a promótertől elkülönült, előnyösen a promótertől például mintegy 150-200 bázis távolságra helyezkedik el az 5’-vég irányában.

A találmány szerinti rekombináns szekvencia a transzkripció iniciálásának szabályozására szolgáló szekvencián kívül tartalmaz egy „heterológ polipeptid” elnevezésű polipeptidet kódoló szekvenciát, amely szekvencia különbözik attól, amely a promóterrel természetes körülmények között kapcsolatos. így a promóter közvetlen genetikai környezete különbözik attól, amely abban a genomban, amelyből származik, körülveszi. A heterológ polipeptidek típusainak példáiként említhetjük a semlegesítő antigéneket, amelyek felhasználhatók rekombináns élő vakcinák vagy antibiotikumoknak, enzimeknek stb. ellenállást adó polipeptidek termelésére.

A találmány szerinti nukleotidszekvenciában a kódoló szekvencia az említett regulátorszekvenciától a 3 ’vég irányában helyezkedik el. Viszonylagos helyzetük természetesen olyan, hogy a kódoló szekvencia expressziója a promóter szabályozása alatt történik.

A találmány tárgya továbbá a találmány szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó expressziós vektor, például egy plazmid.

A találmány tárgyát képezi a fenti expressziós vektorral transzformált sejt is, amely sejt képes a transzkripció iniciálására szolgáló regulátor szekvenciában alkalmazott promóter felismerése. A transzformált sejtek előnyösen prokarióta sejtek, közelebbről az

Actinomyceták rendjébe tartozó prokarióták, például 20 egy Streptomyces vagy Mycobacterium.

A találmány tárgyát képezi egy polipeptidtermelésre szolgáló eljárás, amely az alábbi lépésekkel jellemezhető:

- egy sejt transzformálása a találmány szerinti expressziós vektorral olyan körülmények főzött, hogy a fenti polipeptid kifejeződése lehetséges legyen, a fenti sejt képes legyen a promóter felismerésére;

- a kifejezett polipeptid kinyerése.

A polipeptid kifejeződését lehetővé tevő körülmé30 nyék a technika állásából ismertek, és a jelen esetben előnyösen hősokk alkalmazását foglalják magukban, amely a kifejeződést indukáló hatással bír. A hősokk állhat a hőmérséklet 37-45 °C, különösen 40-45 °C, például 37 °C vagy 41 °C értékre való emeléséből

Streptomyces, és 42—45 °C értékre való emeléséből Mycobacterium esetén.

Megemlítésre érdemes, hogy a találmány szerinti Pl és P2 promóterek alkalmazása a heterológ proteinnek magas hőmérsékleten, például Streptomyces esetén 40 37 °C és 41 °C közötti hőmérsékleten tartós kifejeződését eredményezik.

A találmány egy másik jellemzője a promóter hőindukálható promóterré való transzformálásának lehetőségében áll, amely transzformálás a GCACTC 9N mo45 tívummal való összekapcsolásának eredménye. Közelebbről, a találmánynak ez a jellemzője egy olyan eljárásra vonatkozik, amelyben a hőindukálható jelleget a promóterre átvisszük úgy, hogy egymás mellé helyezzük egyrészt a GCACTC 9N GAGTGC motívumot tartalma50 zó szekvenciát, másrészt a promótert, a GCACTC 9N GAGTGC motívumot tartalmazó szekvenciát a promótertől az 5’-vég irányában elhelyezkedő módon, vagy a GCACTC 9N GAGTGC motívumot tartalmazó szekvenciát egy olyan helyre inszertáljuk, amely legalább 55 részben a promóterben foglaltatik, ez utóbbi helyet úgy választjuk meg, hogy az említett palindroma egyszerű inszerciója ne zavatja meg a promóter aktivitását.

A GCACTC 9N GAGTGC motívum pontos helyzetét a promóterre való tekintettel kell meghatározni an60 nak érdekében, hogy a hőindukálódó jelleget át tudjuk

HU 214 829 Β vinni, ami az alkalmazott promotertől függően változó. Ez oly módon ellenőrizhető, hogy hősokk alkalmazásakor meghatározzuk egy könnyen meghatározható heterológ gén expresszióját, például egy marker génét, így LacZ génét egy, a vizsgált konstrukcióval transzformáit sejtben. A fenti hőindukálható jelleg azáltal hozható létre, ha a GCACTC 9N GAGTGC motívumot a promotertől az 5’-vég irányában mintegy 150-200 bázisnyi távolságra helyezzük el. Egyes esetekben a GCACTC 9N GAGTGC motívum egy olyan helyre inszertálható, amely legalább részben a promóterben foglaltatik. Ezekben az esetekben az inszerciós helyet úgy kell megválasztani, hogy a motívum egyszerű inszerciója ne zavarja a promoter aktivitását más módon, mint a hőindukálható hatás bevitele következtében. Fontos, hogy ne módosítsuk a promoter -10 és -35 szekvenciáit az inszerció végrehajtásakor. Az így előállított, a transzkripció iniciálására szolgáló regulator szekvencia hőindukálható jellege az előzőekben leírt módszer alkalmazásával ellenőrizhető.

A promóterek tanulmányozása során tanulmányoztuk különböző Streptomyces fajok hősokkra adott választá is. A 90-100, 70 és 56-58 kDA molekulatömegű hősokkproteineken kívül megfigyeltünk egy 16-18 kDA-os proteint, ezen proteinek mindegyikét megvizsgáltuk. Ezt a fehérjét (amelyet HSP18-nak nevezünk) a Streptomyces albus magas szinten termeli, ha a tenyészetet 30 °C-ról 37° C-ra visszük át, és a fenti protein az összproteinnek mintegy 10%-át is kiteheti. A 70 és 90-100 kDA-os proteinek hősokkal történő indukálása tranziens, míg az 56-58 kDA-os és 18 kDAos proteinekké konstitutív, a termelés tartósan fennáll magas hőmérsékleten.

A HSP18 jelölésű fehérjét tisztítottuk és jellemeztük. Tulajdonságai eltérőek a többi hősokkproteinétől. Például, eltekintve attól, hogy viszonylag kisméretű, és magas hőmérsékleten konstitutívan szabályozott, ez a protein egy 9 fölötti izoelektromos ponttal bír. Ez az igen magas izoelektromos pont azonban nem tükröződik aminosav-összetételében (lásd a 2. táblázatot).

Továbbá, ennek a fehérjének az aminosav-összetételét meghatározva meglehetősen alacsony metionintartalomra derült fény, ami nem konzisztens a [³⁵S]metionin beépülési vizsgálat eredményeivel (lásd az l! táblázatban). Ezek a megfigyelések arra engednek következtetni, hogy a HSP18 protein a transzlációt követően módosuláson megy át.

A HSP18 protein nem reagál az E. co/z'-ból származó groEL protein elleni poliklonális antitestekkel, sem a Mycobacterium leprae 65 kDA-os hősokkproteinjére specifikus monoklonális antitestekkel.

A HSP18 proteint kódoló „groEL-Ι” gén transzkripciójának vizsgálata azt mutatta, hogy a HSP18 valójában egy csonkolt protein. A groEL gén valójában egy 56 kDA-os proteint kódol, amely a transzláció után módosul, és egy 18 kDA-os protein jön létre.

A 6. ábrán a groEL-Ι gén részleges szekvenciáját és aminosav-transzlációs termékét mutatjuk be. Ez a szekvencia megerősíti a HSP18 Edman-degradációval meghatározott szekvenciáját. A 6. ábrán bemutatott szekvenciából hiányzik az 56 kDA-os protein karboxil terminálisa. A 18 kDA-os protein szekvenciája ebben a szülőszekvenciában benne foglaltatik, a két szekvencika aminoterminálisa azonos (1. számú aminosav).

A HSP18 legfeljebb a 170. aminosavig terjed,

A 8. ábrán a groEL-Ι gén által kódolt fehérje teljes szekvenciáját mutatjuk be, ez tartalmazza a 6. ábrán bemutatott HSP18 proteint. A találmány tárgyát képező hősokkprotein magában foglalja vagy (i) a 6. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciát, vagy a 8. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciának megfelelő szekvenciát, vagy (ii) egy, az ezzel a szekvenciával legalább 85%-os homológiát mutató szekvenciát, vagy (iii) a (i) vagy (ii) szekvencia egy részét, amely magában foglalja az aminoterminálist, és mintegy a 170. aminosavig terjed, az (iii) polipeptid mintegy 18 kDA molekulatömegű és egy igen bázikus, mintegy 9 értékű izoelektromos ponttal bír.

Az egyéb groEL típusú proteinek funkciójával analóg módon valószínű, hogy a HSP18 lényeges a sejt túlélése szempontjából, és „molekuláris kísérő” szerepét játssza, azaz átmenetileg kötődik a nascens polipeptidekhez, megakadályozva az oldhatatlan proteinek aggregálódását és lehetővé téve a hajtogatódást és a sejtmembránon való transzportot. Az is lehetséges, hogy a HSP 18-nak része van a sejt rezisztenciájában saját antibiotikumával szemben vagy a hőtűrésben.

A találmány egy sajátos megvalósítási módja szerint egy olyan polipeptidre vonatkozik, amely a groEL-1 proteinnek a 8. ábrán bemutatott karboxil-terminális régióját tartalmazza. Az ennek a definíciónak megfelelő egy adott polipeptid tartalmazza a következő aminosav-szekvenciát vagy megfelelő ennek a szekvenciának: Gly His Gly His Gly His Ser His.

Az előzőekben ismertetett aminosav-szekvencia a hősokkproteinek ismert karboxil terminális peptidszekvenciájával összehasonlítva az aminosavak eredeti szekvenciájának megfelelő. Ez a karboxil-terminális szekvencia részese lehet a csonkolt 18 kDA-os protein képződésének.

A találmány különböző sajátosságait az ábrákban mutatjuk be.

Az 1. ábrán a groEL-Ι, groES és groEL-2 gének klónozását mutatjuk be vázlatosan. A pPM1005 és pPM997+Neo plazmidok konstruálására szolgáló helyeket zárójelben mutatjuk.

A 2. ábrán a groEL-2 P2 promoterét és a groES és groEL-Ι Pl promoterét mutatjuk be.

A 3. ábrán Streptomyces albus 440 bázispárból álló Smal fragmentumának szabályozása alatt álló TN5 neogénjét tartalmazó pPM 1005 vektort mutatjuk be. Ez a fragmentum tartalmazza a Pl promótert és a groES gén első 160 bázispárját.

A 4. ábrán Streptomyces albus 800 bázispárból álló BglII/SstI fragmentumának szabályozása alatt álló Tn5 neogénjét tartalmazó pPM997+Neo vektort mutatjuk be. Ez a fragmentum tartalmazza a P2 promótert és a groEL-2 gén első 183 bázispárját.

Az 5. ábrán a groES struktúrgén nukleotidszekvenciáját és a leszármaztatott aminosav-szekvenciát, valamint a groES proteint mutatjuk be.

HU 214 829 Β

A 6. ábrán a HSP18 nukleotidszekvenciáját és az abból levezetett aminosav-szekvenciát mutatjuk be.

A 7. ábrán a groES-EL operon szekvenciáját mutatjuk be promóter szekvenciájával együtt.

A 8. ábrán a groEL-1 gén által kódolt teljes aminosav-szekvenciát mutatjuk be.

A 9. ábrán a teljes groEL-1 gén nukleotidszekvenciáját mutatjuk be.

A következőkben a találmányt példákon keresztül mutatjuk be:

Az alább bemutatott kísérletpéldák kivitelezéséhez a következő mikroorganizmus-törzseket és tápközegeket alkalmaztuk:

az S. albus J1073 törzset, amely a Sáli restrikciós-modifikációs rendszerben detektív [Chater és mtsa: J. Gén. Microbiol., 116, 323 (1980)], beszerezve: „John Innes Culture Colection”-től, tenyésztés YEME-tápközegben, önmagában ismert módon [Hopwood és mtsai: Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. Norwich, UK: The John Innes Foundation (1985)];

S. íividans (klónozási és expressziós kísérletekben, beszerzés: mint fent);

E. coli TG 1-törzs (tenyésztve: sztreptomicinnel és ampicillinnel kiegészített „Luria broth”-ban, mind a törzs, mind a tápközeg kereskedelmi forgalomban általánosan beszerezhető).

1. példa

A pPM997- éspPM1005-vektorok előállítása

A találmány szerinti megoldás megvalósíthatóságának szemléltetését célzó kísérleteinkben a pPM997- és pPM1005-vektorokat alkalmaztuk.

A pPM997-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy az S. albusból származó 800 bp BglII/SStI (amely tartalmazza a P2-promótert és a GroEL2-gén egy részét) először pUC19-vektorba klónoztuk, a vektort előzőleg BarnHIés SStl-enzimekkel hasítottuk. A BamHI- és BglIIhasítóhelyek klónozás szempontjából egymással kompatíbilisek, ligálás után azonban mindkét hasítóhely megszűnik. Az említett klónozási lépés következtében a pUC19-vektorban létrejön egy P2-GroEL2-t tartalmazó Xbal/SStl-fragmens. Ezt a fragmenst ezután a pPM925plazmidba klónoztuk [Smokvina és mtsai: Gene 94 (1990) 53], mely plazmidot előzetesen Xbal- és SStlenzimekkel hasítottunk, ily módon állítottuk elő a pPM997-plazmidot. A neogént tartalmazó BglII/BamHIfragmenst ezután megfelelő orientációban beépítettük a pPM997-plazmidba, és így állítottuk elő a pPM997+neoplazmidot (lásd 4. ábra).

A Pl-neo transzkripciós fúziót tartalmazó plazmid (pPM1005) előállításához a Pl-et és a GroES-részét tartalmazó 440 bp Smal-fragments először Smal-gyel hasított pUC-vektorba klónoztuk, előállítva ily módon a pPM 1001-vektort. Ez a fragmens 272 bp-t tartalmaz a GroES-gén iniciációs kodonjától 5’-irányban. A neo- és ble-géneket tartalmazó BglII-BamHI-emésztéssel előállított pPMl71-fragmenst megfelelő orientációban beépítettük a pPM 1001-plazmidba, melyet előzetesen BamHI-enzimmel hasítottunk. A pPM1005-plazmidot ezután úgy állítottuk elő, hogy a pPM 1001-plazmid plneo-gle-konstrukciót tartalmazó 1,9 kb-os Kpnl/BamHIfragmensét beépítettük a pPM925-vektorba [Smokvina és mtsai: Gene 94 (1990) 53; lásd 3. ábra],

2. példa

A hőmérséklet hatása a proteinszintézisre Streptomyces fajokban különböző Streptomyces fajból hősokk alkalmazása előtt és után (a hőmérsékletnek 30 °C-ról 41 °C-ra történő emelése előtt és után) teljes proteinextraktumot készítettünk. A legnagyobb hősokkproteineket, a 90-100, 70 és 56-58 kDA-os proteint SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó poliakrilamid-gélen végzett elektroforézis) Coomassie-kékkel színezett géljein mutattuk ki. Ezeken kívül egyes fajok esetén egy 18 kDA-os proteinnek megfelelő molekulatömegű csíkot is észleltünk. Ez a protein Streptomyces albus esetén igen erősen indukálódik.

3. példa

A hősokkproteinek immunológiai jellemzői

A gélen lévő proteinek „Western biot” analízisét végeztük el Mycobacterium leprae 65 kDA-os hősokkproteinje elleni monoklonális antitestekkel és E. coli groEL proteinje elleni poliklonális antitestekkel. A proteinek egyike sem reagált a monoklonális antitestekkel, míg a poliklonális antitestekkel csak az 56-58 kDA-os HSP reagált.

4. példa

A hősokkproteinek vizsgálata a Streptomyces albusban

A hősokkra adott választ Streptomyces albusban 30 °C és 41 °C hőmérsékleten nyert összprotein elektroforézisével elemeztük. A proteineket 40 percen át jelöltük P⁵S]-metiomn és a [¹⁴C]-alanin aminosavak alkalmazásával. Négy nagyobb hősokkprotein láthatóvá tétele vált lehetségessé. A HSP90, amely 30 °C hőmérsékleten nem volt kimutatható, a hősokk után jelen lévő összproteinnek mintegy 3%-át képviseli. A HSP70 mennyisége legalább megduplázódott. AHSP56-58 30%-os szaporodást mutatott, és a HSP 18, amely a hősokk előtt nem volt kimutatható, az összproteineknek a sokkot követően mintegy 4-7%-át tette ki.

1. táblázat

A nagyobb hősokkproteinek szintézise mértékének mennyiségi meghatározása f^Cj-alaninnal és f⁵S]-met ioninnal történt jelzést követően A szintézis mértéke (a) 30 °C és 41 °C hőmérsékleten

Protein M(b)	35S/3O °C	35S/41 °C	14C/30 °C	14C/41 °C
90	c	3	-	2,9
70	2,7	6,4	2,3	5,8
56-58	6,8	8,4	6,2	9,0
18	>0,7?	6,9	>0,7?	3,8

HU 214 829 Β (a) Az összoptikai sűrűség (O.D.) százalékában kifejezve, autoradiográfiás mérés alapján.

(b) Látszólagos molekulatömeg kDA-ban kifejezve.

(c) Nem határoztuk meg.

5. példa

Streptomyces albusból származó HSP18 vizsgálata

Streptomyces albus 18 kDA-os proteinjét (HSP18), amely rendkívül bázikus, tisztítottuk, és részben meghatároztuk aminosav-összetételét, amit a 2. táblázatban mutatunk be.

2. táblázat

HSP18 aminosav-összetétele

Asx 12,2, Thr 9,4, Ser 3,2, Glx 10,8, Alá 12,1, Cys 0,0, Met 0,0, Val 9,2, Ile 5,7, Leu 6,8, Tyr 1,3, Phe 1,9, His 0,3, Lys 6,9, Arg 4,5, Gly 11,0, Pro 4,4.

A protein aminoterminálisának és két belső fragmentumának szekvenciáját Edman-degradációval határoztuk meg.

6. példa

Hőindukálható HSP 18 protein tisztítása és génjének klónozása

A HSP18-proteint a következő eljárás szerint tisztítottuk:

S. albus sejtszuszpenziót ultrahanggal kezeltünk, majd a kezelt szuszpenziót lecentrifugáltuk (15 perc, 12000 g), és az így kapott felülúszóból szilárd ammónium-szulfát hozzáadásával kicsaptuk a fehéijéket, az ammónium-szulfátot 51,6 g/100 ml végkoncentrációban alkalmaztuk (ez 4 °C-on 80%-os telítettséget eredményez), majd a csapadékos oldatot 15 percen keresztül 12000 g-vel centrifugáltuk. A centrifugálást követően az üledéket 10 mmol/1 NaCl-dal kiegészített A-pufferben [20 mmol/1 Tris-HCl (pH = 7,5), 2 mmol/1 EDTA, 1% 2-merkapto-etanol] felszuszpendáltuk, majd a kapott ’-G AC-GAC-CCC-T AC-GAGG ’-CTG-CTG-GGG-ATG-CTC-I C

A fenti oligonukleotid próbák 5xSSC-ben, 60 °C hőmérsékleten végzett hibridizálását követően lehetővé vált a Streptomyces albus 1,9 kb Xhol restrikciós fragmentumának jellemzése és klónozása (lásd az 1. ábrán az A klónozást).

Ezt a fragmentumot szekvenáltuk, a fragmentum egy nyílt leolvasási fázist tartalmaz, amely egy, a 430. pozícióban lévő ATG-től a klónozott régión túl terjed, és így egy 50 kDA-nál nagyobb proteint kódol, de a protein aminoterminálisa megfelel a HSP 18 peptidszekvenciából következtetéssel megszabható nukleotidszekvenciának. Az ennek a génnek megfelelő aminosav-szekvencía fentieken kívül erős homológiát mutat teljes hosszában az E. coli groEL hősokkproteinnel és Mycobacterium leprae 65 kDA-os proteinjével (75%-os homológia). Kezdetben ezt a gént „groEL-l”-nek nevezték.

oldatot 4 °C-on dializáltuk a felvevőpufferrel szemben. A dializálás során kapott csapadékot centrifugáíássaí eltávolítottuk (10 perc, 12000 g), majd a felülúszót (összfehéije-tartalom: 700 mg) „DEAE-Bio-Gel-A”oszlopra (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia) vittük fel. Az oszlopot előzőleg dialízis pufferrel ekvilibráltuk. A 18 kDA-protein nem kötődött az oszlopra. Az oszlopon átfolyt frakcióból (amely 50 mg fehérjét tartalmazott) a fehéijéket a fentiek szerint szilárd ammónium-szulfát hozzáadásával kicsaptuk. Centrifugálást követően az üledéket a következő összetételű pufferrel szemben dializáltuk: 20 mmol/1 Tris-HCl, 2 mmol/1 EDTA, 1% 2-merkapto-etanol (pH = 8,2), majd a kapott oldatot kationcserélő oszlopra („Mono-S”, HR 5/5, Pharmacia) vittük, melyet előzőleg ugyanezzel a pufferrel ekvilibráltunk. Az elúciót 0-300 mmol/1 közötti NaCl-gradienssel végeztük, és a 18 kDA-proteint körülbelül 200 mmol/1 NaCl-nál eluálódott. Ily módon 1,5 mg 60%-os tisztaságú 18 kDA-proteint izoltálunk. A 18 kDA-proteint ezután tovább tisztítottuk SDS-PGA-eljárással, majd a fehérjéket nitrocellulóz- vagy „immobilon”-membránra (Amersham) elektroblottoltuk, fémszáraz elektroforézis-egység alkalmazásával („2117 Multiphor II”, LKB). A proteineket 0,1% „Ponceau-S” vörös festékkel (Sigma) festettük meg, 1% ecetsavban. A 18 kDA-proteinnek megfelelő csíkot kivágtuk a gélből és -20 °C-on tároltuk.

A klónozáshoz alkalmazott oligonukleotidok szintézise

Két degenerált, 30 bázisból álló nukleotid hibridizációs próbát szintetizáltunk a fent leírt belső fragmentumok egyikének peptidszekvenciája alapján. A fragmentum szekvenciája a következő:

...D-D-P-Y-E-N-L-G-A-Q...

Az alábbi dezoxioligonukleotid próbákat szintetizáltuk:

C-CTG-GGC-GCC-CA-3 ’ OL1 C T r-GAC-CCG-CGG-GTC-5’ OL2 G A

7. példa > Egy második „ groEL-szeríí ” gén kimutatása

Streptomyces albusban és klónozása Streptomyces albus genomjának hibridizálását végeztük Mycobacterium leprae HSP65 génje 5’-végét alkalmazva hibridizációs próbaként, ez a próba ) Streptomyces albus genomjával végzett hibridizálást követően két jelet ad, egy erőset és egy gyengét, és a jelek megjelenése független a DNS emésztésére alkalmazott enzimtől. A gyenge jel megfelel azoknak a jeleknek, amelyek HSP 18-ból levezetett oligonuk5 leotidokkal nyerhetők, azaz a groEL-Ι génnek. Az erős jel megfelel egy másik elfogadott méretű (65 kDA) „groEL-szerű” proteint kódoló génnek. így két „groELszerű” gén van a Streptomyces albusban.

HU 214 829 Β

8. példa

Streptomyces albus HSP65 hősokkproteinje génjének klónozása

Mycobacterium leprae HSP65 hibridizációs próbához erősen kötődő 1,2 kilobázis méretű Xhol restrikciós fragmentumot klónoztunk (1. ábra, C klónozás).

Meghatároztuk ennek a fragmentumnak a nukleotidszekvenciáját. Az 1,2 kb Xhol fragmentum a fehérje egy belső fragmentumát kódolja, amely fehérje 90%-os homológiát mutat Mycobacterium leprae 65 kDA-os proteinjével, ezenkívül a Streptomyces albus két „groEL-szerű” génje, az 1. és 2. jelölésű gének 80%-os homológiát mutatnak.

9. példa

A ,,groEL-szerű gének transzkripciójának vizsgálata és a promóterek keresése A Streptomyces albus törzs össz-RNS-ét kiextraháltuk a hősokkvizsgálatok során különböző időkben, és „Northern biot” eljárással kezeltük, majd különböző oligonukleotidokkal hibridizáltuk, amelyek szintézise vagy groEL-1 szekvencián, vagy groEL-2 szekvencián alapult, és amelyek a két szekvencián belül kiválasztott régiókra specifikusak voltak. Ugyanazokat a nitrocellulóz szűrőket alkalmaztuk a két klónozott fragmentum összességével megismételt hibridizációkban. Három igen erősen hőindukálható transzkriptumot észleltünk, ezek mérete 2500, 2100 illetve 650 bázis körüli. A 2100 bázis méretű transzkriptum megfelel a groEL-2 transzkriptumnak, a 650 bázisból álló, a groEL-l-től az 5’-vég irányában elhelyezkedő gén kotranszkriptumának, és a 2500 bázisos, a groEL-1 és a groEL-l-től az 5’-vég irányában elhelyezkedő gén kotranszkriptumának. Ezek az eredmények egyrészt azt mutatják, hogy a két gén - a groEL-1 és a groEL-2 - promóterei valóban erős és indukálható - közelebbről hőindukálható - promóterek, és másrészt, hogy a groEL-1 gén promótere nem volt jelen a klónozott 1,9 kb fragmentumon. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az RNS-ek egyike sem kezdődik az 1. ábrán P? jelölésű huroknál, lehetségesnek tartjuk, hogy a szekvencia Mycobacteriumban promóterként szolgálhat.

Valójában ez a hurok két szekvenciát, a TTTGCCGGG és TTTCAT szekvenciákat tartalmazza, amelyeket a promóterre vonatkozó térképadatok hiányában a Mycobacterium 65 kDA-os proteinje promóterének -35 és -10 régióinak tekintenek [lásd például a J. Gén. Microbiol., 135, 931-939. (1989) szakirodalmi helyen]. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a két szekvencia nem képezi Streptomyces albus-ban a groEL-1 gén promóterének részét. A kívánt promóter várhatóan a groEL-1 -gyei operont képező géntől 5’-irányban helyezkedik el. A groEL-l-től az 5’-irányban elhelyezkedő gént azonosítottuk, ez a gén erős homológiát mutat E. coli groES génjével, ahol groEL-1-gyei operont is képez (lásd az 5. ábrán).

10. példa

A két gén, a groEL-1 és a groEL—2 promóter régióinak klónozása

Streptomyces ablus két új, BclI/SacI, illetve BglII/SacI enzimek alkalmazásával hasított fragmentumát (1700 bp, illetve 900 bp) az előzőekben klónozott és fent ismertetett fragmentumok szekvenciáiból kiindulva szintetizált oligonukleotidok, mint hibridizációs próbák alkalmazásával klónoztuk. Ezért ezek részben áthidalják a groEL-1-et és a groEL-2-t hordozó fragmentumot, és minden esetben mintegy 800 bázispámyira terjednek az 5’-vég irányában (az 1. ábrán a B és D klónozások).

A fragmentumokat szekventáltuk, majd a promótereket Sl-nukleáz és reverz transzkriptáz alkalmazásával végzett primer extenzióval végzett térképezéssel jellemeztük. A két gén, a groEL-1 és a groEL-2 promótereinek szekvenciája a fenti jellemzők szerint nem azonos (lásd a 2. ábrát), de jelentős szerkezeti homológiát mutatnak, különösen abban, hogy mindkettő tartalmazza a következő palindróma-szekvenciát:

GCACTC 9N GAGTGC

A két promóter szekvenciája a következő:

Az alábbi szekvenciát egyikének megfelelő Pl:

’-CATTGGCACTCCGCTTGACCGAGTGCTAATCGCGGTCATAGTCTCAGCTCTG-3 ’ vagy ’-GC ATTGGCACTCCGCTTGACCGAGTGCTAATCGCGGTCATAGTCTC AGCTCTG-3 ’ vagy

5-GGAGGCCCCTAGCGCCTGCACTCTCCTACCCCGAGTGCTAATTATTGGCGTTA-3’. 5 ’-GGAGCCCCTAGCGCCTGCACTCTCCTACCCCGAGTGCTAATTATTGGCGTTA-3 ’.

11. példa

A groEL—1 és a groEL—2 promótereinek alkalmazása heterológ gén expresszálására A fenti két promótert Klebsiella Tn5-transzpozon heterológ neogénjének experssziójára használtuk. Ez a gén egy aminoglikozid foszfotranszferázt (APH) kódol, amely neomicin/kanamicin rezisztenciát nyújt. Ezt a gént a két promótertől 3’-irányba klónozzuk (3. és 4. ábra), majd bevisszük Streptomyces albusba és 5.

lividansba. A neogén ekkor erősen expresszálódik, ezt mutatja azon antibiotikumok iránti jelentős mértékű rezisztencia, amelyek rezisztenciáját ez a gén viszi át, továbbá poliakrilamid gélen végzett elektroforézis és anti-APH antitestekkel végzett immun-blott eljárás után láthatóvá tudtuk tenni az APH szintézist nyers extraktumokban. Hangsúlyozni kívánjuk, hogy ezeket az eredményeket integrálódó vektorokkal kaptuk, Strepto60 mycesben, ezért ezekben a vizsgálatokban a vizsgált

HU 214 829 Β

A pPM1005 HindlII-BamHI fragmentumát és a pPM997 Smal-Smal fragmentumát ugyancsak inszertáltuk Mycobacteriumbz. A pPM997 Smal-Smal fragmentuma tartalmazza a neogént, a P2 promotert és a terminátort.

neogénnek és a promótemek genomonként csak egy kópiája van. Valójában, annak érdekében, hogy megítéljük a promoter erősségét, fontos volt, hogy ne növeljük mesterségesen a neo expresszióját a kópiaszám növelésével egy olyan vektor alkalmazása révén, amely nagyszámú kópiában van jelen.

Claims (5)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás transzkripció-iniciálódást szabályozó szekvenciát és heterológ polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns nukleotidszekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy

- egy GCACTC 9N GAGTGC motívummal - ahol „N” jelentése: a 4 bázis, a timin, a guanin, az adenin és a citozin bármelyike - kapcsolt promotert tartalmazó, transzkripció-iniciálódást szabályozó szekvenciát, és

- egy, a fenti promoterrel a természetben kapcsolt polipeptidtől különböző, „heterológ polipeptid” elnevezésű polipeptidet kódoló szekvenciát összekapcsolunk oly módon, hogy a kódoló szekvenciát a transzkripció-iniciálódást szabályozó szekvenciától 3’-irányban olyan pozícióban építjük be, amely pozíció expresszióra alkalmas körülmények között megfelelő a polipeptidnek a promoter szabályozása 10 alatt történő expresszálódásához.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzkripció-iniciálódást szabályozó szekvenciaként szokásosan egy hősokkproteinnel - például Actinomycetákoaxt jelen lévő hősokkproteinnel - kap15 csőit promotert tartalmazó szekvenciát alkalmazunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzkripció-iniciálódást szabályozó szekvenciaként egy GCACTC 9N GAGTGC szekvenciát legalább részben a promoter szekvencián belül tartalmazó

20 promotert magában foglaló szekvenciát alkalmazunk.

4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzkripció-iniciálódást szabályozó szekvenciaként az alábbi szekvenciák bármelyikének megfelelő promotert tartalmazó szekvenciát alkalmazunk:

25 az alábbi szekvenciák bármelyikének megfelelő Plpromótert:

5 ’-C ATTGGCACTCCGCTTGACCGAGTGCTAATCGCGGTCATAGTCTC AGCTCTG-3 ’ vagy

5 ’-GCATTGGC ACTCCGCTTGACCGAGTGCTAATCGCGGTCATAGTCTC AGCTCTG-3 ’ vagy az alábbi szekvenciák bármelyikének megfelelő P2-promótert:

5 '-GGAGGCCCCTAGCGCCTGCACTCTCCTACCCCGAGTGCTATTATTGGCGTTA-3 ’ vagy

5-GGAGGCCCCTAGCGCCTGCACTCTCCTACCCCGAGTGCTAATTATTGGCGTTA-3’.

5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzkripció-iniciálódást szabályozó szekvenciaként a GCACTC 9N GAGTGC motívumot a promóter-szekvenciától elkülönülten tartalmazó szekvenciát alkalmazunk.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzkripció-iniciálódást szabályozó szekvenciaként a GCACTC 9N GAGTGC motívumot a promóterszekvenciától 5’-irányban - például mintegy 150-200 bázisnyira 5’-irányban - tartalmazó szekvenciát alkalmazunk.

7. Eljárás polipeptidet kódoló szekvencia hőindukálható expresszálására alkalmas vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy vektorba egy, az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított - a polipeptid expresszáltatására alkalmas - rekombináns nukleotidszekvenciát építünk.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként píazmidot alkalmazunk.

9. Eljárás transzformált sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárással előállított expressziós vektort a promotert felismerő és a polipeptid expresszálására alkalmas, Actinomyceták rendjében tartozó sejtbejuttatunk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Actinomyceták rendjébe tartozó sejtként Streptomyces vagy Mycobacterium nemzetségbe tartozó sejtet alkalmazunk.

11. Eljárás polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy

- egy, a promotert felismerő, Actinomyceták rendjébe tartozó sejtet a polipeptid expresszálódására alkalmas körülmények között a 7. vagy 8. igénypont szerint előállított expressziós vektorral transzformáljuk, és

- az expresszáit polipeptidet kinyerjük.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expresszió elősegítésére hősokkot alkalmazunk.

13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Actinomyceták rendjébe tartozó sejtként Streptomyces nemzetségbe tartozó sejtet alkalmazunk.

14. Eljárás promoter hőindukálhatóvá alakítására, azzal jellemezve, hogy egy, a GCACTC 9N GAGTGC motívumot tartalmazó szekvenciát és a promotert egymás mellé helyezzük oly módon, hogy a GCACTC 9N GAGTGC motívumot tartalmazó szekvenciát a promótertől az 5’-irányban helyezzük el, vagy a GCACTC

HU 214 829 Β

9N GAGTGC motívumot tartalmazó szekvenciát egy legalább részben - a promóteren belül eső helyre inszertáljuk, amely helyet úgy választunk meg, hogy a szekvencia inszerciója ne zavarja meg a promoter aktivitását.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promóterként Actonomycet ókban, például Streptomyceseko&n vagy Mycobacteriumokoan található promotert alkalmazunk.

16. Eljárás transzkripció iniciálását szabályozó szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy egy promotert a GCACTC 9N GAGTGC motívummal kapcsolunk.

5 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promóterként az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazó promotert alkalmazunk:

az alábbi szekvenciák bármelyikének megfelelő Plpromótert: