KR100219344B1 - 전사 개시 조절 뉴클레오티드 서열 - Google Patents

전사 개시 조절 뉴클레오티드 서열 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이하 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것으로서, -모티브 GCACTC 9N GAGTGC("n"은 4개의 염기 티민, 구아닌, 아데닌 및 시토신 중 임의의 하나를 의미함)과 화합된 프로모터를 포함하는 전사개시의 조절서열;
- 상기 프로모터와 자연상태에서 화합되어 있는 폴리펩타이드와는 상이한 "이종성 폴리펩타이드"를 암호하는 서열;를 포함하며, 상기 암호 서열은, 상기 프로모터의 제어하에 폴리펩타이드를 형질발현시킬 수 있는 위치에서 적당한 조건하에 상기 전사 개시 조절 서열의 다운스트림(downstream)에 위치한다.

Description

전사 개시 조절 뉴클레오티드 서열
- 제1도는 groEL-1, groES 및 groEL-2 유전자의 클로닝을 개략적으로 나타낸 도면이다. 플라스미드 pPM1005와 pPM997+Neo의 작제를 위해 제공되는 부위는 괄호로 나타냈다.
- 제2도는 groEL-2의 P2 프로모터와 groES 및 groEL-1의 P1 프로모터를 나타낸 도면이다.
- 제3도는 스트렙토마이세스 알버스의 440bp의 SmaI 단편의 제어하에 TN5의 neo 유전자를 함유하는 벡터 pPM1005를 나타낸 도면이다. 이 단편은 P1 프로모터와 groES 유전자의 처음 160 염기쌍을 포함한다.
- 제4도는 스트렙토마이세스 알버스의 800bp의 BglII/SstI 단편의 제어하에 Tn5의 neo 유전자를 함유하는 벡터 pPM997+Neo를 나타낸 도면이다. 이 단편은 P2 프로모터와 groEL-2 유전자의 처음 183bp를 포함한다.
- 제5도는 groES 구조 유전자와 GroES 단백질로부터 추정한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
- 제6도는 HSP18 단백질 전구체의 추정된 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다.
- 제7도는 프로모터 서열과 함께 gro es el 오페론의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다.
- 제8도는 groEL-1 유전자에 의해 암호된 완전한 아미노산 서열을 정렬한 것을 나타내는 도면이다.
- 제9도는 완전한 groEL-1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면이다.
본 발명은 전사 개시 조절 뉴클레오티드 서열, 및 재조합법에 의해 폴리펩타이드 제조시 상기 서열을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명 개발시 대두된 기술상의 문제는, 대다수의 미생물, 특히 악티노마이세테스(Actinomycetes)에서 사용될 수 있는 강력한, 그리고 가능하다면 열 유도성의 프로모터를 동정하는 것이었다.
악티노마이세테스는 매우 경제적이고 의학적으로 중요한 박테리아 종류로서, 특히 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 마이코박테륨(Mycobacterium)속을 포함한다.
상기 스트렙토마이세스는 현재 시판되고 있는 항생제의 약 70%를 제조하는데 사용되고 있으며; 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 및 나병균(Mycobacterium leprae)에 의해 야기되는 폐해에 대해서는 더 이상 논하지 않더라도, 백신으로 사용되는 생균 다가 균주를 제조하기 위하여 소 결핵균(M.bovis) BGG 균주에서 이종성 항원을 발현하는데 큰 관심이 집중되고 있다.
상기 박테리아의 유전학은 분자 단계에서 연구가 거의 이루어지지 않은 상태이지만, 유전자 발현의 조절은, 대장균(Escherichia coli) 또는 고초균(Bacillus subtilis)과 같이 더 자세히 연구된 바 있는 박테리아의 경우와는 상이한 것으로 추정된다.
특히, G+C가 과밀한 DNA를 가지고 있는 악티노마이세테스는 대장균과 고초균의 "프로모터" 서열을 거의 또는 전혀 인지하지 못한다. 바이어드 등(Baird et al;J. Gen. Microbiol. 1989, 135, 931-939)은 마이코박테륨에서 열 쇼크 단백질을 암호하는 유전자를 연구하여, TTGAG와 TCTCATGT의 두 서열(결핵균의 10kDa 열 쇼크 단백질을 암호하는 서열의 상류에 위치함)이 상기 프로모터의 -35와 -10 부위를 구성하고 있다는 가정을 내렸다.
실제로, 상기 두 서열은 대장균내 프로모터의 컨센서스(consensus) 서열과 높은 상동성을 나타낸다. 또한, 여러종의 마이코박테륨에서 다른 열 쇼크 단백질(예, 나병균의 65kDa 단백질 또는 소 결핵균의 64kDa 단백질)을 암호하는 유전자의 상류에 위치하고 있는 서열은 동일한 종류의 서열쌍 즉, TTGCCG와 TTTCAT, 또는 TTGCCG와 CTTCAT를 포함하고 있어, 대장균 프로모터 및 결핵균의 10kDa 종의 "-35 및 -10" 서열과 높은 상동성을 나타낸다.
상기 논문과 토올 등(Thole et al.)에 의한 논문(Infection and Immunity, 55, 1987, 1466-1475)에 의하면, 마이코박테륨의 열 쇼크 단백질에 대한 유전자를 전사시키는데 관여하는 프로모터는 -35와 -10 서열로서, 상기 유형의 결합된 서열을 포함한다. 상기 서열은 이후 "대장균 유형의 -10과 -35서열"로서 나타낼 것이다. 그러나, 상기 논문의 저자 등은 매핑에 의해 이 가정을 확인하지 못하였고, 상기 프로모터의 구조는 결과적으로 여전히 불확실한 상태이다.
본원 발명자들은, 놀랍게도 대장균 유형의 -10과 -35 서열이 또한 스트렙토마이세스에도 존재하나, 이러한 종의 박테리아에서는 열 쇼크 단백질 전사를 개시하는 역할을 하지 않음을 밝혀냈다. 전술한 논문에서, 바이어드와 토올은 또한, 마이코박테륨의 열 쇼크 단백질을 암호하는 유전자의 상류 서열에, 서열 GCACTC 9N GAGTGC를 포함하는 회문 모티프(palindromic motif)가 존재하는 것을 관찰하였다. 그러나, 이 모티프의 정확한 역할을 확인하지는 못했다. 토올은 이 모티프가 열 쇼크 단백질을 암호하는 유전자의 상류에 위치한 오페론의 전사의 종결에 관여하거나, 폴리시스트론 메신저(polycistronic messenger)의 해독을 조절하는 것에 관여한다고 가정하고 있다.
다수의 악티노마이세테스에서 사용될 수 있는, 강력한(및, 가능하다면 열유도성의) 프로모터를 클로닝하기 위하여, 본 발명자들은 스트렙토마이세스에 있어서 열 쇼크에 대한 응답을 연구하였으며 이러한 프로모터를 특성규명하기 위해 강력하게 발현되는 단백질을 클로닝했다. 실제로, 새로운 단백질을 나타나게 하는 열 쇼크에 응답 양상은 일반적인 현상으로 나타났다; 따라서 각종 악티노마이세테스에 있어서 그 조절이 유사하며, 특히 이 프로모터는 다수의 균주에서 사용가능한 컨센서스 서열을 가질 것이라는 예상을 할 수 있다.
본원 발명자들은 스트렙토마이세스에서 2개의 작용성 프로모터를 확인하고 특성규명하였으며, 또한 상기 각 프로모터가 모티프 GCACTC 9N GAGTGC를 함유한다는 관찰 결과로서, 상기 회문의 기능을 확인할 수 있었다.
본 발명은 이하 a) 및 b)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
a) 전사 개시 조절 서열, 이 조절 서열은 모티프 GCACTC 9N GAGTGC(이때, "N"은 4염기, 즉 티민, 구아닌, 아데닌 및 시토신 중 임의의 하나를 의미한다)와 함께 프로모터를 포함함; b) 상기 프로모터와 자연 상태에서 결합된 것 이외의 폴리펩타이드("이종 폴리펩타이드")를 암호하는 서열, 이 암호 서열은 적당한 조건하에서, 상기 프로모터의 제어를 받으며 상기 폴리펩타이드가 발현될 수 있도록 하는 부위로, 상기 전사 개시 조절 서열의 하류에 위치함.
본 발명의 재조합 뉴클레오티드 서열은 이를 포함하는 세포내에서 이종 유전자를 발현시킬 수 있다.
재조합 뉴클레오티드 서열의 일부를 형성하는 전사 개시 조절 서열은 상기 모티프 GCACTC 9N GAGTGC와 회합(association)된 상태의 프로모터로 이루어진다. 본 명세서에서, "회합된"이란 용어는 모티프 GCACTC 9N GAGTGC가 상기 프로모터와 별개이거나, 또는 상기 프로모터 내에, 적어도 일부분 포함되어 있을 수도 있음을 의미하는 것이다. 프로모터내에 포함되는 경우에는, 상기 모티프가 프로모터 서열과 중첩한 상태 및 상기 모티프가 상기 프로모터의 전체 부분을 구성하는 상태가 포함된다.
상기 서열 GCACTC 9N GAGTGC와 회합된 프로모터가 본 발명에 있어서 특히 바람직한 것으로, 이는 악티노마이세테스에 존재하는 프로모터, 특히 박테리아 게놈내에서 정상적으로 열 쇼크 단백질과 회합된 프로모터이다. 이러한 유형의 프로모터의 예로는, 본 발명의 프레임워크(framework)내에서 확인된 스트렙토마이세스 알버스(Streptomyces albus)에서의 열 쇼크 단백질 18kDa(P1) 및 56kDa(P2)의 프로모터가 있다.
상기 서열중 하나에 해당하는 P1:
또는
상기 서열중 하나에 해당하는 P2:
또는
상기 각 프로모터는 그 활성에 나쁜 영향을 미치지 않는다면 최대 5' 말단의 4 또는 5 염기까지 단축시킬 수도 있다. 다른 유형의 프로모터로는 결핵균의 10kDa와 65kDa, 소 결핵균의 64kDa 및 나병균의 65kDa에 해당하는 열 쇼크 단백질들의 프로모터가 있다.
상기 프로모터와 GCACTC 9N GAGTGC 모티프의 회합으로 이 프로모터에 열유도성 성질을 제공한다. 아마도 상기 서열은 오퍼레이터(operator)로서 억제인자(repressor)의 결합 부위를 구성함으로써 RNA 폴리머라제가 상기 프로모터의 -10 및 -35 서열에 결합하지 못하게 할 것이다.
상기 모티프가 상기 프로모터와는 별개인 경우, 상기 프로모터의 상류, 예를 들어 약 150 내지 200 염기 상류에 위치하는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 서열은, 전사 개시 조절 서열외에, 소위 "이종 폴리펩타이드"로 불리는 폴리펩타이드(자연상태에서 상기 프로모터와 회합되어 있는 폴리펩타이드와는 다름)를 암호하는 서열을 포함한다. 따라서, 상기 프로모터와 직접적으로 관련있는 유전적 환경은 그것이 유도된 게놈의 환경과 상이하다. 상기 이종 폴리펩타이드 유형의 예로는, 항생제, 효소 등에 내성을 부여하는 재조합 생(生) 백신 또는 폴리펩타이드 생성에 사용할 수 있는 중화 항원을 포함한다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열에 있어서, 암호 서열은 상기 조절 서열의 하류에 위치한다. 이러한 상대적인 위치는 물론, 암호 서열의 발현이 프로모터의 제어하에서 이루어지도록 하는 위치이다.
또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터(예, 플라스미드)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포에 관한 것으로, 이 세포는 전사 개시 조절 서열에 사용되는 프로모터를 인지할 수 있다. 상기 형질전환 세포는 원핵 세포, 더욱 구체적으로는 악티노마이세테스 목(예, 스트렙토마이세스 또는 마이코박테륨)에 속하는 원핵세포가 바람직하다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.
- 상기 폴리펩타이드가 발현될 수 있도록 하는 조건하에서, 본 발명의 발현 벡터에 의해 상기 프로모터를 인지할 수 있는 세포를 형질전환시키는 단계;
- 발현된 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
상기 폴리펩타이드를 발현시키는 조건은 종래 기술로부터 공지되었으며, 본 발명의 경우, 발현을 유도하는 효과를 가진 열 쇼크를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 열 쇼크는 약 37℃에서 45℃까지의 온도 증가, 특히 40℃에서 45℃까지의 온도 증가일 수 있으며, 예를 들면 스트렙토마이세스의 경우 37℃에서 41℃까지며, 마이코박테륨의 경우 42℃에서 45℃까지이다.
본 발명의 프로모터 P1과 P2를 사용하면, 고온, 예를 들면 스트렙토마이세스의 경우 37℃ 내지 41℃에서 이종 단백질의 지속적인 발현이 이루어진다.
본 발명의 다른 특징은, GCACTC 9N GAGTGC 모티프와의 회합 결과, 프로모터를 열유도성 프로모터로 형질전환시키는 가능성에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 특징은, 한쪽에는 GCACTC 9N GAGTGC 모티프를 함유하는 서열과, 다른 한쪽에는 프로모터를 나란히 위치시키거나(상기 GCACTC 9N GAGTGC 모티프를 포함하는 서열은 프로모터의 상류에 위치함); 또는 상기 프로모터 내에 적어도 일부분이 포함되는 부위로서 상기 회문의 간단한 삽입이 프로모터의 활성을 저해하지 않도록 선택된 부위에 GCACTC 9N GAGTGC 모티프 함유 서열을 삽입하는 것을 특징으로 하는, 프로모터에 열유도성을 부여하는 방법에 관한 것이다.
프로모터에 열유도성을 부여할 수 있도록 하기 위해서 프로모터에 대해서 GCACTC 9N GAGTGC 모티프가 위치되어야 하는 정확한 위치는 사용되는 프로모터의 종류에 따라 달라질 수 있다. 이것은, 열 쇼크의 적용시, 쉽게 검출가능한 이종성 유전자(예, LacZ와 같은 유전자 마커)가, 시험하에서 작제에 의해 형질전환된 세포내에서 발현되는 것을 검출함으로써 체크할 수 있다. 상기 프로모터의 약 150 내지 200 염기 상류 부위에 GCACTC 9N GAGTGC 모티프가 위치하면 이러한 열유도성을 부여할 수 있다. 어떤 경우에는, GCACTC 9N GAGTGC 모티프를, 상기 프로모터내에 적어도 일부분이 포함되는 부위에 삽입할 수도 있다. 이러한 경우, 상기 삽입 부위는, 모티프의 단순한 삽입이 열유도 효과의 도입에 의한 것 이외에는 프로모터 활성을 저해하지 않는 부위로 선택하여야 한다. 이러한 삽입시 프로모터의 -10과 -35 서열은 변형되지 않도록 하는 것이 중요하다. 따라서, 생성된 전사 개시 조절 서열의 열유도성은 전술한 방법을 적용함으로써 체크할 수 있다.
프로모터를 연구하면서, 본 발명자들은 여러 스트렙토마이세스 종에 있어서 열 쇼크에 대한 응답을 연구했다. 분자량 90-100, 70 및 56-58kDa를 갖는 주요 열 쇼크 단백질외에도, 시험한 각각의 종에서 16 내지 18kDa의 단백질이 관찰되었다. 이 단백질(일명, HSP18)은 배양물을 30℃에서 37℃로 옮겼을 때 스트렙토마이세스 알버스내에서 아주 높은 레벨로 산출되었으며 총 단백질의 10%까지를 구성할 수 있다. 70 및 90-100kDa 단백질의 열 쇼크에 의한 유도는 일시적인 반면, 56-58kDa 및 18kDa 단백질의 열 쇼크에 의한 유도는 본질적인(constitutive) 것으로서, 고온에서 지속적으로 생성된다.
일명 HSP18이라는 단백질을 정제하여 특성규명했다. 그것의 성질은 다른 열 쇼크 단백질과는 상이했다. 예를 들어, 비교적 작은 사이즈 및 고온에서 본질적으로 조절되는 점 이외에도, 그것은 9 보다 더 높은 등전점을 갖는다. 그러나, 이러한 매우 높은 등전점은 그것의 아미노산 조성에서 반영되지 않는다(표 2 참고).
또한, 아미노산 조성 측정 결과, 메티오닌 함량이 다소 낮게 나타났으며, 이는 /35S/메티오닌 혼입 실험 결과와 일치하지 않는다(표 1 참고). 이러한 관찰은 HSP18 단백질이 해독 이후 변형이 되었음을 제시한다.
HSP18 단백질은 대장균의 GrOEL 단백질에 대한 폴리클로날 항체와 반응하지 않으며, 또한 나병균의 65kDa 열 쇼크 단백질에 특이성 있는 모노클로날 항체와도 반응하지 않는다.
HSP18 단백질을 암호하는 "groEL-1" 유전자의 전사에 대한 연구에 의해, HSP18 단백질이 실제로는 절두형(truncated) 단백질임이 밝혀졌다. groEL-1 유전자는 56kDa 단백질을 사실상 암호하며, 이는 해독 이후 변형되어 18kDa 단백질을 산출한다.
제6도는 groEL-1 유전자의 부분 서열 및 그것의 아미노산 해독 생성물을 나타낸다. 이 서열은 HSP18 단백질의 에드만(Edman) 분해법으로 결정된 서열을 뒷받침하는 것이다. 제6도에서 제시된 서열은 56kDa 단백질의 COOH 말단이 결여되어 있다. 18kDa 단백질의 서열은 상기 모 서열에 포함되어 있으며, 그것의 두 NH2말단은 동일하다(아미노산 1번). HSP18 단백질은 대략 아미노산 170까지 최대로 연장된다.
제8도는 groEL-1 유전자에 의해 암호된 단백질의 완전한 서열을 나타내고 있으며, 이는 제6도에 제시된 서열과 같은 HSP18 단백질을 포함한다.
본 발명은 (i) 제6도에 제시된 아미노산 서열 또는 제8도에 제시된 아미노산 서열에 상응하는 서열, 또는 (ii) 상기 서열과 85% 이상의 상동성을 나타내는 서열, 또는 (iii) NH2말단을 포함하며 대략 아미노산 170까지 연장된 서열 (i) 또는 (ii)의 일부분(폴리펩타이드(iii)은 약 18kDa의 분자량과 약 9의 염기성 등전점을 가짐)을 포함하는 열 쇼크 단백질에 관한 것이다.
GroEL 유형의 다른 단백질의 기능을 유추해 볼때, HSP18은 세포의 생존에 필수적이며 "분자 샤페론(chaperon)"의 역할, 즉 발생 폴리펩타이드에 일시적으로 결합하여 불용성 단백질의 응집을 억제하고 세포막을 통한 운송 및 겹침이 가능하도록 하는 것으로 추정된다. 또한 HSP18은 균주 자체의 항생제에 대한 균주의 내성 또는 열에 대한 내성과 관련되었을 가능성이 있다.
구체적인 특징에 의하면, 본 발명은 제8도에 제시된 GroEL-1 단백질의 COOH 말단 영역을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이에 해당하는 특정 폴리펩타이드는 아미노산 서열(Gly His Gly His Gly Gis Ser His)을 포함하거나 이에 상응하는 것이다.
전술한 아미노산 서열은 COOH 말단의 펩타이드 서열과 비교했을 때 열 쇼크 단백질로 공지된 원래의 아미노산 서열에 상응한다. 이 COOH 말단 서열은 절두형 18kDa 단백질의 형성과 관련이 있을 수 있다.
본 발명의 여러 가지 특징은 첨부된 도면에서도 나타나 있다:
[스트렙토마이세스에 있어서 단백질 합성에 대한 온도의 영향]
열 쇼크(30℃에서 41℃로 온도 상승)를 가하기 이전과 이후에, 스트렙토마이세스의 15개 상이한 종의 완전한 단백질 추출물을 준비했다. 90-100kDa, 70kDa 및 56-58kDa의 주요 열 쇼크 단백질을 SDS-PAGE 겔상에서 검출하고 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하였다. 또한, 18kDa 단백질에 해당하는 분자 밴드도 몇몇 종에서 관찰되었다. 이 단백질은 스트렙토마이세스 알버스에서 매우 강력하게 유도되었다.
[단백질의 면역학적 특성]
나병균의 65kDa 열 쇼크 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 대장균의 GroEL 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 겔상에서 단백질의 "웨스턴 블롯"분석을 실시했다. 상기 모노클로날 항체와 반응하는 단백질은 없었으며 56-58kDa HSP 만이 상가 폴리클로날 항체와 반응했다.
[스트렙토마이세스 알버스에 있어서 열 쇼크 단백질에 대한 연구]
스트렙토마이세스 알버스에 있어서 열 쇼크에 대한 응답은 30℃와 41℃에서 전체 단백질을 전기영동함으로써 분석하였다. 상기 단백질을 40분동안 라벨시켰다. 사용된 아미노산은 /35S/메티오닌과 /14C/알라닌이었다. 4개의 주요 열 쇼크 단백질을 육안 관찰하는 것이 가능했다. 30℃에서 검출할 수 없었던 HSP90은 열 쇼크 이후 총 단백질의 약 3%를 나타냈다. HSP70의 양은 2배 이상이었다. HSP56-58은 30%로 증가하는 것으로 나타났으며, 열 쇼크 이전에는 검출할 수 없었던 HSP18은 열 쇼크 이후 총 단백질의 4 내지 7%를 나타냈다(표 1 참고).
a. 자동 방사능사진을 이용햐여 측정한 총 광학 밀도(O.D.)의 백분율로 표시함
b. 겉보기 분자량(kDa)
c. 검출되지 않음
[스트렙토마이세스 알버스의 HSP18에 대한 연구]
고염기성인 스트렙토마이세스 알버스의 18kDa 단백질(HSP18)을 정제하고 그것의 일부 아미노산 조성을 측정했다(표 2 참고):
상기 단백질의 NH말단 서열과 2개의 내부 단편의 서열을 에드만 분해법(Edman degradation)으로 결정했다.
[올리고뉴클레오티드의 합성]
30 염기로 된 2개의 축퇴성(degenerate) 뉴클레오티드 프로브를 전술한 내부 단편중 하나의 펩타이드 서열을 기준으로 합성했다. 이 단편의 서열은 다음과 같다:
이하의 데옥시올리고뉴클레오티드 프로브를 합성했다:
[열유도성 단백질 HSP18에 대한 유전자의 클로닝]
60℃의 5X SSC내에서 하이브리드화시킨 후, 이 올리고뉴클레오티드 프로브를 특성규명하고 스트렙토마이세스 알버스의 1.9kb XhoI 제한 단편을 클로닝시켰다(제1도의 클로닝 A 참고).
이 서열을 서열 결정하였다; 이는 430 위치의 ATG로부터 50kDa 이상의 단백질을 암호함으로써 클로닝된 영역을 넘어서까지 연장되며, 그 NH2 말단은 HSP18의 펩타이드 서열로부터 추정된 뉴클레오티드 서열에 대응하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함한다. 이 유전자에 상응하는 아미노산 서열은, 또한 대장균의 열 쇼크 단백질 groEL 및 나병균의 65kDa 단백질과 길이 전체에 걸쳐 높은 상동성(75% 상동성)을 나타낸다. 처음으로, 이 유전자를 "groEL-1"로 명명했다.
[스트렙토마이세스 알버스에 있어서 제2"groEL-형" 유전자의 클로닝 및 입증]
스트렙토마이세스 알버스 게놈의 하이브리드화는 나병균의 HSP65에 대한 유전자의 5' 부분을 프로브로서 사용하여 실시했다; 이 프로브는 스트렙토마이세스 알버스의 게놈과 하이브리드화 시킨 후, DNA를 분해하는데 사용되는 효소와는 무관하게 하나는 강력하고 하나는 약한 2개의 시그날을 제공했다. 이러한 약한 시그날은 HSP18로부터 추정된 올리고뉴클레오티드로 수득된 시그날, 즉 groEL-1 유전자에 상응한다. 상기 강력한 시그날은 허용 사이즈(65kDa)의 다른 "GroEL-형" 단백질을 암호하는 유전자에 상응한다. 따라서 스트렙토마이세스 알버스에는 2개의 groEL-형 유전자가 있다.
[스트렙토마이세스 알버스의 열 쇼크 단백질 HSP65에 대한 유전자의 클로닝]
나병균으로부터 유래한 HSP65 프로브에 의해 강력하게 결합된 1.2kb XhoI 제한 단편을 클로닝했다(제1도의 클로닝 C).
이 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정했다. 1.2kb XhoI 단편은 나병균으로부터 유래한 65kDa 단백질과 90% 상동성을 나타내는 단백질의 내부 단편을 암호한다. 또한 스트렙토마이세스 알버스의 2개의 "groEL-형" 유전자 1과 2는 80% 상동성을 나타냈다.
이러한 65kDa 단백질을 암호하는 유전하는 groEL-2로 명명했다.
["groEL-형" 유전자의 전사 연구 및 프로모터의 탐지]
스트렙토마이세스 알버스 균주의 전체 RNA를 열 쇼크 실험 과정중에 여러 시점에서 추출하고 "노던 블롯"법으로 처리한 후, groEL-1 서열 또는 groEL-2 서열을 기준으로 합성되고 이들 두 서열에서 선별된 각 영역에 대해 특이성이 있는 여러 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화하였다. 동일한 니트로셀룰로즈 필터를 사용하여 2개의 클로닝된 단편 전체와 반복해서 하이브리드화했다. 사이즈가 각각 약 2500, 2100 및 650 염기인 3개의 매우 강력한 열 유도성 전사체가 관찰되었다. 2100 염기를 갖는 전사체는 groEL-2 전사체에 해당되었으며, 650 염기를 갖는 전사체는 groEL-1의 상류에 위치한 유전자의 전사체에 해당되었고; 2500 염기를 갖는 전사체는 groEL-1과 groEL-1의 상류에 위치한 유전자의 공-전사체에 해당되었다. 한편, 이러한 결과는, 2개의 유전자 groEL-1과 groEL-2가 실제로 강력하고 유동성인 프로모터, 특히 열 유도성 프로모터를 지니는 반면, groEL-1 프로모터는 1.9kb 단편에서 클로닝되지 않았음을 나타냈다. 특히 이러한 결과는 RNA중 어느 것도, 마이코박테륨에서 프로모터로서 기능할 수 있는 것으로 추정되는 서열인 제1도의 P?로 표시된 루프에서 개시되지 않음을 나타낸다.
실제로, 상기 루프는 상기 프로모터에 대한 매핑 데이타가 없는 상태에서, 각각 마이코박테륨으로부터 유래한 65kDa 단백질 프로모터의 -35 및 -10 영역인 것으로 간주되는 두 서열 즉, TTTGCCGGG 및 TTTCAT를 포함한다(예컨대, J. Gen. Microbiol. (1989), 135, 931-939 참조). 이러한 결과는 상기 두 서열이 스트렙토마이세스 알버스에서 groEL-1 유전자 프로모터의 일부분을 형성하지 않음을 나타낸다.
바람직한 프로모터는 groEL-1과 함께 오페론을 형성하는 유전자의 상류에 위치하는 것으로 예상된다. groEL-1의 상류에 위치한 유전자를 확인한 결과, 이는 groEL-1과 함께 오페론을 형성하는, 대장균의 groES 유전자에 강력한 상동성을 나타내는 유전자이다(제5도 참고).
[두 유전자 groEL-1과 groEL-2의 프로모터 영역의 클로닝]
BcII/ScaI(1700bp)와 BgIII/SacI(900bp)에 의해 가수분해된 스트렙토마이세스 알버스의 DNA의 2개의 신규한 단편을 전술한 바대로 이미 클로닝된 단편의 서열에서 개시되어 합성된 올리고뉴클레오티드로 클로닝하였다. 따라서, 상기 단편은 각각 groEL-1을 함유하는 단편과 groEL-2를 함유하는 단편에 부분적으로 걸쳐져 있으며 각 경우에 있어 약 800bp 정도 상류까지 연장된다(제1도의 클로닝 B 및 D).
이러한 단편을 서열 결정한 후, 프로모터를 S1 뉴클레아제를 사용하여 지도화하고 역 전사효소를 사용하여 프라이머 연장함으로써 특성규명했다. 이렇게 특성규명된 두 유전자 groEL-1 및 groEL-2의 프로모터 서열의 특징은 동일하지 않으나(제2도), 상당한 구조적인 상동성을 나타내며, 특히 둘다 이하의 회문 구조를 보유한다: GCACTC 9N GAGTGC
두 프로모터의 서열은 다음과 같다:
하기 서열중 하나에 해당하는 P1:
[서열 1]
또는
[서열 2]
하기 서열중 하나에 해당하는 P2:
[서열 3]
또는
[서열 4]
[이종 유전자의 발현에 있어 groEL-1 및 groEL-2 프로모터의 사용]
상기 두 프로모터는 크렙실라(Klebsiella)의 트랜스포존(Tn5)의 이종 neo 유전자를 발현하는데 사용했다. 이 유전자는 네오마이신/카나마이신에 대한 내성을 부여하는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(APH)를 암호한다. 이 유전자를 두 프로모터의 하류에 클로닝한 후(제3도 및 제4도), 스트렙토마이세스 알버스 및 또한 에스. 리비단스(S. lividans)내로 도입시켰다. 이 neo 유전자는 그후 상기 항생제에 대한 매우 높은 내성을 갖는 것으로 보아 강력하게 발현되었으며; 또한, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하고 항-APH 항체로 면역-블롯팅한 후 미정제 추출물내에서 APH의 합성을 육안으로 관찰할 수 있었다. 이러한 결과가 통합성 벡터(intergrating vector)를 이용하여 스트렙토마이세스에서 수득되었다는 것이 강조되어야 한다. 따라서, 이러한 실험에서는, 각 게놈마다 연구중인 프로모터 및 neo 유전자의 한 카피(copy)만이 존재한다. 실제로, 상기 프로모터의 강도를 판단하기 위해서, 카피의 수를 증가시키거나 다수의 카피를 산출하는 벡터를 사용함으로써 인위적으로 neo 유전자의 발현을 증가시킬 수 없다는 점이 중요하다.
pPM1005의 HindIII-BamHI 단편과 pPM997의 SmaI-SmaI 단편도 마이코박테륨내에 삽입하였다. 상기 pPM997의 SmaI-SmaI 단편은 neo 유전자, P2 프로모터 및 종결인자(terminator)를 포함한다.

Claims (23)

  1. 모티프 GCACTC 9N GAGTGC(이때, "N"은 4염기 즉, 티민, 구아닌, 아데닌 및 시토신 중 임의의 하나를 의미함)과 회합된 서열을 가진 프로모터를 포함하는 전사 개시 조절 서열; 및 상기 프로모터와 자연 상태에서 회합되어 있는 폴리펩타이드와는 상이한 이종성 폴리펩타이드를 암호하며, 적당한 조건하에서, 상기 폴리펩타이드가 상기 프로모터의 제어를 받으며 발현될 수 있도록 하는 위치로, 상기 전사 개시 조절 서열의 하류에 위치하는 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 열 쇼크 단백질의 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  3. 제1항에 있어서, 상기 GCACTC 9N GAGTGC 서열이 상기 프로모터의 서열내에 적어도 부분적으로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  4. 제1항에 있어서, 상기 모티프 GCACTC 9N GAGTGC가 상기 프로모터 서열의 상류에 위치하는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  5. 제1항에 있어서, 상기 모티프 GCACTC 9N GAGTGC가 프로모터 서열과는 별개의 것임을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  6. 제1항에 따른 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하며 상기 폴리펩타이드를 발현하는 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 플라스미드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  8. 제6항 또는 제7항에 따른 발현 벡터에 의해 형질전환되고, 상기 프로모터를 인지하고 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포.
  9. 제6항 또는 제7항에 따른 발현 벡터를 사용하여, 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 조건하에서, 프로모터를 인지할 수 있는 세포를 형질전환시키는 단계; 및 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 조건에 열 쇼크를 적용시키는 것이 포함됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 세포가 스트렙토마이세스 속의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. (i) 하기에서 제시된 아미노산 서열 중의 하나; 또는 (ii) NH2말단을 포함한 상기 서열 (i)의 일부를 포함하며, 분자량이 약 18kDa이며 등전점이 약 9인 것을 특징으로 하는 열 쇼크 폴리펩타이드;
    또는 서열:
  13. 제12항에 있어서, 아미노산 1번에서 아미노산 170번까지 최대로 연장된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  14. 제12항 또는 제13항의 열 쇼크 단백질을 암호하는 핵산 서열.
  15. 제1항에 있어서, 상기 조절 서열이 스트렙토마이세스내에 존재하는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  16. pPM1005의 HindIII-BamHI 단편 또는 작동가능하게 연결된 pPM997의 SmaI-SmaI 단편내에 포함된 프로모터를 포함하는 전사 개시 조절 서열; 및 상기 프로모터와 자연상태에서 회합되어 있는 폴리펩타이드와는 상이한 이종성 폴리펩타이드를 암호하며, 적당한 조건하에서 상기 폴리펩타이드가 상기 프로모터의 제어를 받으며 발현될 수 있도록 하는 위치로, 상기 전사 개시 조절 서열의 하류에 위치하는 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  17. 제16항에 따른 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 플라스미드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  19. 제17항 또는 제18항에 따른 발현 벡터에 의해 형질전환되고, 상기 프로모터를 인지하며, 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포.
  20. 제17항 또는 제18항에 따른 발현 벡터를 사용하여, 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 조건하에서, 프로모터를 인지할 수 있는 세포를 발현된 형질전환시키는 단계; 및 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 세포가 마이코박테륨 속의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 하기 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 분리체:
    하기 서열 중 하나에 대응하는 P1:
    또는
    하기 서열 중 하나에 대응하는 P2:
    또는
  23. 스트렙토마이세스 알버스로부터 분리된 18kD 열 쇼크 단백질.
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