CN114773433A

CN114773433A - 一种cd25靶向多肽、分子探针及应用

Info

Publication number: CN114773433A
Application number: CN202210714305.3A
Authority: CN
Inventors: 杨志; 刘福涛; 王帅亮; 朱华; 王培�; 王风
Original assignee: Beijing Cancer Hospital
Current assignee: Beijing Cancer Hospital
Priority date: 2022-06-23
Filing date: 2022-06-23
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-06-23
Also published as: CN114773433B; WO2023245852A1

Abstract

本发明属于核医学显像剂领域，涉及一种CD25靶向多肽、分子探针及应用。所述多肽的氨基酸序列如下：i)X1X2X3X4X5；或ii)在i)的N端或C端连接标签形成的氨基酸序列；其中，X1为精氨酸、赖氨酸、组氨酸；X2为苯丙氨酸、酪氨酸、苄基酪氨酸、卤代苯丙氨酸；X3为精氨酸、赖氨酸、组氨酸；X4为苯丙氨酸、酪氨酸、苄基酪氨酸、卤代苯丙氨酸；X5为苯丙氨酸、酪氨酸、苄基酪氨酸、卤代苯丙氨酸。本发明提供的CD25多肽及其核素标记探针具有明显的肿瘤摄取，瘤本比清晰，有效提高了在影像诊断过程中的信噪比，具有较高应用价值。

Description

一种CD25靶向多肽、分子探针及应用

技术领域

本发明属于核医学显像剂领域，具体地，涉及一类可用于靶向CAR-T细胞CD25靶点的多肽类衍生物、分子探针及其制备方法和应用。

背景技术

CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T Cell）治疗，即嵌合抗原受体T细胞疗法，是目前临床肿瘤治疗的研究前沿热点。据Clinical Trials官网统计，世界范围内有数百项的CAR-T临床试验正在开展之中，其中不仅包括以CD19、CD20等为靶点的血液系统肿瘤CAR-T疗法，还包括靶向间皮素（Mesothelin，MSLN）、人表皮生长因子受体-2（HER-2）等靶点的实体瘤CAR-T疗法。

尽管在临床试验中取得了巨大成功，但在部分患者体内，CAR-T细胞的存活和持续扩增能力有限，或者产生过度的克隆性增殖，这对CAR-T的疗效和安全性评价提出了巨大挑战。目前，与CAR-T细胞的增殖和良好的临床反应相关的预测指标和机制尚未完全清楚，并且有研究表明，CAR-T的疗效与患者年龄、早期治疗、p53基因突变、CAR-T细胞数量和其它风险因素并无显著相关性。但在预后良好的绝大部分患者中，回输CAR-T细胞的两周内伴随着CAR-T细胞大量激活扩增的现象。此外，CAR-T治疗的副作用包括细胞因子释放综合征，神经系统毒性以及脱靶效应等，都与CAR-T细胞在体内的激活扩增有关。因此，评价CAR-T细胞的激活与扩增，有望实现对于CAR-T疗效的早期预测，并在指导CAR-T疗法的开发中起到一定的作用。

现阶段临床评价患者对于CAR-T治疗的响应通常采用全血细胞计数和骨髓穿刺活检等手段，往往给患者带来较大的痛苦，且不能充分评价CAR-T细胞在体内的分布情况和激活状态。目前国内外在评价T细胞激活状态的研究中通常采用长半衰期核素如⁸⁹Zr、⁶⁴Cu等标记抗体分子进行免疫显像，显像周期较长，且在CAR-T细胞激活增殖后信号被稀释，因此限制了其应用。

CD25是白介素2（interleukin-2，IL-2）受体的α链，其在未激活的T细胞表面几乎没有表达，但在T细胞经抗原刺激激活之后大量表达。因此，CD25是优异的活化T细胞特异性显像靶点。在目前的研究中，利用各种放射性核素如⁶⁸Ga、¹⁸F标记IL-2分子进行CD25显像是较为成熟的技术。但是由于IL-2是一种生物活性分子，其经静脉注射进入人体后会产生一定的生物学效应，且在注射后可能会给患者带来疼痛、发热等不适感。且由于IL-2分子量相对较大，其在体内的清除速度相对较为缓慢，利用短半衰期核素标记IL-2分子，难以在短时间内获得优质的显像效果。小分子探针具有体内代谢清除快、脏器本底摄取低、生物安全性高、易于进行放射性标记、成本低等优点，设计CD25特异性的小分子探针，对于在体、无创和定量评价T细胞的体内分布及激活状态具有重要意义。

发明内容

为了克服现阶段CAR-T显像探针通常为长半衰期核素标记的各类抗体分子，显像周期较长且存在信号稀释的缺陷，本发明提供了一类靶向CD25多肽、靶向CD25多肽显像剂及其应用。

本发明的第一方面提供一种CD25靶向多肽，所述多肽的氨基酸序列如下：

i) X1X2X3X4X5（SEQ ID NO：1）；或

ii) 在i)的N端或C端连接标签形成的氨基酸序列；

其中，X1为精氨酸、赖氨酸、组氨酸；X2为苯丙氨酸、酪氨酸、苄基酪氨酸、卤代苯丙氨酸；X3为精氨酸、赖氨酸、组氨酸；X4为苯丙氨酸、酪氨酸、苄基酪氨酸、卤代苯丙氨酸；X5为苯丙氨酸、酪氨酸、苄基酪氨酸、卤代苯丙氨酸。

根据本发明一种优选实施方式，所述多肽中至少有一个氨基酸为D型。其余氨基酸残基可以是L-型，也可以是D-型，或者是L-型、D-型的混合。

更优选地，X1、X5为L型，其余氨基酸中至少有一个为D型。

根据本发明一些实施方式，有1-2个氨基酸为D型，其余均为L型。

本发明的CD25靶向多肽中，所述标签通常指保护基，优选为羟基保护基，例如苄基。

本发明的第二方面提供一种分子探针，所述分子探针为具有放射性同位素标记的所述CD25靶向多肽；所述放射性同位素直接标记在所述CD25靶向多肽上，或者通过-L-Ch标记在所述CD25靶向多肽上，其中L为桥接基团，Ch为核素螯合基团。放射性同位素与核素螯合基团结合。

所述分子探针可由包括以下步骤的方法制得：使所述CD25靶向多肽直接或通过共价连接放射性核素或含有放射性核素的基团。

具体地，-L-Ch可共价连接在所述CD25靶向多肽的N端、C端或反应性侧链上。所述反应性侧链是指所述CD25靶向多肽的侧链上的反应性基团，如氨基、羧基。具有类似性质的氨基酸如赖氨酸。根据本发明一种具体实施方式，当X3为赖氨酸时，所述-L-Ch共价连接在X3上。

根据本发明一种优选实施方式，所述桥接基团为寡肽或NH₂-(PEG)_n-COOH，更优选地，所述寡肽的氨基酸数目为1-4，n为1-4的整数。

所述核素螯合基团通常为双功能螯合剂形成的基团，所述双功能螯合剂可选自DOTA、NOTA、NODA、NODAGA、DOTP、TETA、ATSM、PTSM、EDTA、EC、HBEDCC、DTPA、SBAD、BAPEN、Df、DFO、TACN、NO2A/NOTAM、CB-DO2A、Cyclen、NOTA-AA、DO3A、DO3AP、HYNIC、MAS3、MAG3或异腈。

根据本发明，所述放射性核素优选为诊断用放射性核素；具体地，所述诊断用放射性核素为⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、¹⁸F、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、¹¹¹In、⁹⁹mTc、¹¹C、¹²³I、¹²⁵I和¹²⁴I中的至少一种。

本发明的第三方面提供上述分子探针在制备核素成像诊断试剂中的应用。

本发明所述核素成像诊断试剂优选作为CD25高表达的CAR-T细胞疗效评价试剂或治疗追踪试剂。

本发明提供的一种靶向CD25多肽及其核素标记探针对CD25具有高亲和力和特异靶向性，体内外具有高稳定性，具有高的核素标记率和放射性化学纯度，具有快速清除的优良体内代谢性质。本发明提供的CD25多肽及其核素标记探针在CD25高表达的激活的人外周血单核细胞（hPBMC）具有明显的细胞摄取，在CD25高表达的肿瘤模型鼠中肿瘤部位摄取高，瘤本比清晰，有效提高了在影像诊断过程中的信噪比，在CAR-T疗效的早期预测，CAR-T疗法的开发中具有影像学指导意义和应用潜力。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1-1至1-9示出了靶向CD25多肽配体的质谱图。

图2示出了DA-1探针⁶⁸Ga标记前后的Radio-HPLC分析结果。

图3-1至图3-3示出了⁶⁸Ga-DA-3、⁶⁸Ga-DA-4、⁶⁸Ga-DA-6的体内外稳定性结果图。

图4示出了B16F10荷瘤小鼠在接种不同天数后肿瘤组织免疫组织化学染色结果。

图5示出了Karpas299（人大细胞淋巴瘤）的CD25表达流式细胞术检测结果。

图6示出了⁶⁸Ga-DA-1探针在激活前后的hPBMC中的摄取对比。* p < 0.05，** p <0.01，**** p < 0.0001。

图7示出了⁶⁸Ga-DA-1探针应用于皮下接种激活hPBMC小鼠模型的小动物PET/CT动态显像结果，白色箭头指示为hPBMC接种部位。

图8示出了⁶⁸Ga-DA-1探针应用于皮下接种未激活hPBMC小鼠模型的小动物PET/CT动态显像结果，白色箭头指示为hPBMC接种部位。

图9示出了⁶⁸Ga-DA-1探针应用于皮下接种未激活hPBMC小鼠模型的小动物PET/CT动态显像的探针摄取变化对比。

图10示出了⁶⁸Ga-DA-6探针在激活前后的hPBMC中的摄取对比。* p < 0.05，** p <0.01。

图11示出了⁶⁸Ga标记的DA系列探针应用于B16F10荷瘤小鼠的小动物PET/CT显像结果，白色箭头指示为肿瘤位置。

图12示出了⁶⁸Ga标记的DA系列探针应用于Karpas299荷瘤小鼠的小动物PET/CT显像结果，白色箭头指示为肿瘤位置。

图13示出了⁶⁸Ga-DA-4、⁶⁸Ga-DA-6、⁶⁸Ga-DA-7在KM小鼠血液中的药物代谢动力学。

图14示出了⁶⁸Ga-DA-4和⁶⁸Ga-DA-6探针在KM小鼠体内的生物分布。

图15示出了⁶⁸Ga-DA-6探针在Karpas299及U87MG荷瘤鼠的小动物PET显像结果。

图16示出了⁶⁸Ga-DA-6探针在Karpas299及U87MG荷瘤鼠的生物分布。**** p <0.0001。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

靶向CD25多肽配体的合成制备。

表1各多肽配体的结构式、化学式和分子量

。

9种靶向CD25的配体合成路线如下：氨基酸序列从C-端到N-端经过固相合成制得，首先将2-CTC树脂活化，然后连接首位氨基酸，氨基脱Fmoc保护，清洗，缩合偶联第二个氨基酸，重复以上操作依次将多肽链中的不同氨基酸进行偶联，然后偶联PEG桥链，随后将螯合剂偶联到多肽，最后通过裂解液将所构建的CD25靶向多肽切割、经制备型高效液相色谱仪纯化制得目标探针，结构经质谱鉴定。图1-1至1-9示出了靶向CD25多肽配体DA-1、DA-3、DA-4、DA-5、DA-6、DA-7、DA-8、DA-9、DA-10的质谱图。

下面，以DA-1（RFK(GGG-DOTA)FY[OBn]，SEQ ID NO：2）；DA-3（DOTA-(PEG)2-RFKFYE，SEQ ID NO：3）；DA-6（DOTA-(PEG)2-RFrFY，SEQ ID NO：4）的制备为例进行说明，其余多肽按照相同方法制备即可。

实施例1

DA-1 RFK(GGG-DOTA)FY[OBn]的制备；

。

（一）树脂溶胀，将2-CTC树脂（50 mg，0.015mmol~0.15mmol）放入反应管中，加DCM（4 mL），振荡30min。（二）接第一个氨基酸，通过沙芯抽滤掉溶剂，加入2倍摩尔过量的Fmoc-L-Tyr(Bzl)-OH（148 mg，0.30 mmol），加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量DIEA（261μL，1.50mmol），振荡60min。用甲醇封闭。（三）脱保护，去掉甲醇，加20%哌啶DMF溶液（3 mL），5min，去掉再加20%哌啶DMF溶液（3 mL），15min。（四）检测，抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。（五）清洗，DMF（4mL）两次，DCM（4 mL）两次，DMF（4 mL）两次。（六）缩合，加入下一个Fmoc保护氨基酸Fmoc-L-Phe-OH（116 mg，0.30 mmol）两倍过量，TBTU（145 mg，0.45 mmol）三倍过量，DMF（3 mL）溶解，加入反应管，立刻加入DIEA（261μL，1.50 mmol）十倍过量，反应30min。（七）检测，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，无色为阴性反应。（八）清洗，DMF（10mL/g）一次，DCM（10mL/g）两次，DMF（10mL/g）两次。（九）重复三至八步操作，依次连接序列中氨基酸及螯合剂Fmoc-L-Lys(Dde)-OH，Fmoc-D-Phe-OH，Boc-L-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-甘氨酸，Fmoc-甘氨酸，Fmoc-甘氨酸，三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。（十）抽干，按照下列方法洗树脂。DMF（4 mL）两次，甲醇（4 mL）两次，DMF（4 mL）两次，DCM（4 mL）两次，抽干10min。（十一）从树脂上切割多肽，配制切割液（5mL）TFA 95%；水1%；EDT 2%；TIS 2%进行切割。切割时间：120min。（十二）分析提纯：旋干，用高效液相色谱将粗品提纯。（十三）冻干，收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末制得DA-1。MS (m/z)：calc. for C₆₈H₉₄N₁₆O₁₇[M-H]^- 1405.7056，found 1405.40。

实施例2

DA-3 DOTA-(PEG)2-RFKFYE的制备。

。

（一）树脂溶胀：将2-CTC树脂（50 mg，0.015 mmol~0.15 mmol）放入反应管中，加二氯甲烷（4 mL），振荡30 min。（二）首位氨基酸连接：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入2倍摩尔过量的N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-γ-叔丁酯一水物（133 mg，0.30 mmol），加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量DIEA（261 μL，1.50 mmol），振荡60 min，用甲醇封闭。（三）脱保护：抽去甲醇，加20%哌啶DMF溶液（3 mL），搅拌5 min，抽去溶剂后再加20%哌啶DMF溶液（3 mL），搅拌15min。（四）检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105 ℃-110 ℃加热5 min，变深蓝色为阳性反应。（五）清洗：DMF（4 mL）两次，DCM（4 mL）两次，DMF（4mL）两次。（六）缩合：加入2倍当量的Fmoc-O-叔丁基-L-酪氨酸（137.70 mg，0.30 mmol），3倍当量的TBTU（145 mg，0.45 mmol），DMF（3 mL）溶解，加入反应管，立刻加入10倍当量的DIEA（261 μL，1.50 mmol），反应30 min。（七）检测：取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5 min，无色为阴性反应。（八）清洗：DMF（10 mL/g）一次，DCM（10 mL/g）两次，DMF（10 mL/g）两次。（九）重复三至八步操作，依次连接序列中氨基酸及螯合剂Fmoc-L-苯丙氨酸，N-芴甲氧羰基-N’-叔丁氧羰基-L-赖氨酸，Fmoc-L-苯丙氨酸，Fmoc-Pbf-L-精氨酸，Fmoc-9-氨基-4,7-二噁壬酸，三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。（十）抽干，按照下列方法洗树脂。DMF（4 mL）两次，甲醇（4 mL）两次，DMF（4 mL）两次，DCM（4 mL）两次，抽干10 min。（十一）多肽切割：配制5 mL切割液（TFA 95% + 水1% + EDT2% + TIS 2%）进行切割，切割时间为120 min。（十二）分析提纯：旋干，用高效液相色谱将粗品提纯。（十三）冻干：收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末，即得探针DA-3，质谱鉴定：MALDI-TOF calc. for C₆₇H₉₉N₁₅O₂₀[M+H]⁺ 1434.726，found 1434.746。

实施例3

DA-6 DOTA-(PEG)2-RFrFY的制备：

。

（一）树脂溶胀：将2-CTC树脂（50 mg，0.015 mmol~0.15 mmol）放入反应管中，加二氯甲烷（4 mL），振荡30 min。（二）首位氨基酸连接：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入2倍摩尔过量的Fmoc-O-叔丁基-L-酪氨酸（137.70 mg，0.30 mmol），加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量DIEA（261 μL，1.50 mmol），振荡60 min，用甲醇封闭。（三）脱保护：抽去甲醇，加20%哌啶DMF溶液（3 mL），搅拌5 min，抽去溶剂后再加20%哌啶DMF溶液（3 mL），搅拌15 min。（四）检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5 min，变深蓝色为阳性反应。（五）清洗：DMF（4 mL）两次，DCM（4 mL）两次，DMF（4 mL）两次。（六）缩合：加入2倍当量Fmoc-L-苯丙氨酸（116 mg，0.30 mmol），3倍当量的TBTU（145 mg，0.45mmol），DMF（3 mL）溶解，加入反应管，立刻加入10倍当量的DIEA（261 μL，1.50 mmol），反应30 min。（七）检测：取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，无色为阴性反应。（八）清洗：DMF（10 mL/g）一次，DCM（10 mL/g）两次，DMF（10 mL/g）两次。（九）重复三至八步操作，依次连接序列中氨基酸及螯合剂N'-[(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基]-N-芴甲氧羰基-D-精氨酸，Fmoc-L-苯丙氨酸，Fmoc-Pbf-L-精氨酸，Fmoc-9-氨基-4,7-二噁壬酸，三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。（十）抽干，按照下列方法洗树脂。DMF（4 mL）两次，甲醇（4 mL）两次，DMF（4 mL）两次，DCM（4 mL）两次，抽干10 min。（十一）多肽切割：配制5 mL切割液（TFA 95% + 水1% + EDT 2% +TIS 2%）进行切割，切割时间为120 min。（十二）分析提纯：旋干，用高效液相色谱将粗品提纯。（十三）冻干：收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末，即得探针DA-6，质谱鉴定：MALDI-TOF calc. for C₆₂H₉₂N₁₆O₁₇[M+H]⁺ 1333.690，found 1333.695。

实施例4

多肽探针的⁶⁸Ga标记。

DA系列多肽探针的⁶⁸Ga标记采用如下方法：将多肽探针前体溶解于超纯水（1 mg/mL），分装后置于-20 ℃保存。以4 mL的0.05 M的HCl淋洗锗镓发生器，收集后3 mL淋洗液置于4 mL的EP管中，并向其中补充185 μL的NaAc溶液（1 M）。取10 μL多肽探针前体加入体系中，在95 ℃下加热反应15 min。反应结束后，向体系中补充2 mL纯水并抽出，使用预先活化的Sep-Pak Light C18纯化柱进行纯化，并用5 mL纯水冲洗。然后以0.5 mL的80%乙醇淋洗C18纯化柱，并向其中补充5 mL的生理盐水，并经0.2 μm的微孔滤膜过滤后得到可供实验使用的放射性药物。

⁶⁸标记多肽探针的质控：

⁶⁸Ga标记配合物的放射化学纯度使用Radio-HPLC分析验证，以⁶⁸Ga-DA-1为例，图2为DA-1探针前体及最终产品的Radio-HPLC分析结果。DA-1前体的保留时间为13.141 min（蓝色峰），⁶⁸Ga-DA-1的放射峰为13.379 min（红色峰）。

结果显示所有探针的标记率均>90%，经C18纯化柱纯化后，所有放射性药物产品的放射性化学纯度>99%。

实施例5

⁶⁸标记的多肽探针与CD25的亲和力及脂水分配系数测定。

多肽探针的亲和力测定利用Karpas299细胞进行饱和实验来获得：将Karpas299细胞计数后放入48孔板（5 × 10⁵/孔），分别向其中加入固定体积的⁶⁸Ga标记探针，活度依次为0.37 kBq/孔、1.85 kBq/孔、3.7 kBq/孔、18.5 kBq/孔、37 kBq/孔、74 kBq/孔、185 kBq/孔、370 kBq/孔、740 kBq/孔、1850 kBq/孔、37000 kBq/孔、74000 kBq/孔（n = 3），在37 ℃孵育1 h后收集细胞至1.5 mL EP管，离心一次后再用1 mL预冷的PBS清洗两次，最后用200μL的PBS将细胞重悬后转移至计数管，利用γ计数器测定每孔细胞的放射性计数，利用GraphPad Prism 8.3.0软件进行拟合，计算探针的亲和力Kd值。

脂水分配系数测定采用如下方法：取500 μL的正辛醇与490 μL的PBS溶液混合，向其中加入10 μL标记好的探针溶液，然后涡旋混匀，5000 rpm × 3 min离心，分别取正辛醇和水相10 μL，置于计数管，测定其放射性计数。每个样品分别取3个样，每个探针重复测定3次，脂水分配系数采用LogD_7.4来表示。

多肽探针与CD25的亲和力及脂水分配系数测定结果如表2所示，结果显示它们都具有较佳的水溶性，体内主要经由肾脏排泄。此外，亲和力测定结果显示，DA-6探针具有相对较高的亲和力，Kd值约为89.42 nM。

表2 多肽探针与CD25的亲和力及脂水分配系数测定结果

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实施例6

⁶⁸标记DA多肽探针体内外稳定性验证。

取正常KM小鼠，经尾静脉注射18.5 MBq的⁶⁸Ga标记的不同多肽探针，在注射后10min或30 min时间点按压腹部取尿液，然后断头处死收集血液。尿液直接用纯水稀释后取37kBq进行Radio-HPLC测定。血液在5000 rpm离心3 min，收集血浆，然后向200 μL血浆中加入400 μL的无水乙腈，再进行离心后，取上清液进样，进行Radio-HPLC测定。观察探针放射峰的位置，并计算其百分比来评价探针在体内的稳定性。体外稳定性研究主要在生理盐水和5% HSA中进行，将探针与生理盐水和5% HSA分别孵育不同时间。其中，生理盐水组在既定时间可用纯水稀释后直接进行Radio-HPLC分析，而5% HSA组需要先将样品于无水乙腈混合后离心，取上清液进样，进行Radio-HPLC分析。图3-1至图3-3示出了⁶⁸Ga-DA-3、⁶⁸Ga-DA-4、⁶⁸Ga-DA-6的体内外稳定性结果图。实验结果显示探针⁶⁸Ga-DA-3注射后30 min后可见尿液中游离⁶⁸Ga³⁺位置的放射峰显著降低，但产品放射峰已消失不见，出现保留时间相对更早的两个放射峰，而血液中放射峰仍然相对较为杂乱，说明⁶⁸Ga-DA-3在小鼠体内会发生降解。⁶⁸Ga-DA-4和⁶⁸Ga-DA-6在小鼠体内的稳定性都较高，在注射后30 min，产品放射峰的放射性化学纯度礽保持在93%以上，且Radio-HPLC出峰时间未发生显著变化，说明⁶⁸Ga-DA-4和⁶⁸Ga-DA-6在小鼠体内未发生明显降解。

实施例7

荷瘤小鼠免疫组化。

B16F10荷瘤鼠分别在接种肿瘤后第7、14、21天处死，取肿瘤组织，用10%的福尔马林溶液脱水固定，然后进行免疫组织化学实验，方法如下：肿瘤组织脱水后石蜡包埋，石蜡切片经二甲苯脱蜡20 min × 3次；然后将切片在如下梯度浓度的酒精和水中平衡，100%酒精5 min × 2次，95%酒精5 min，90%酒精5 min，85%酒精5 min，75%酒精5 min，蒸馏水1分钟；3%的H₂O₂中浸泡10 min；PBS清洗5 min × 3次；0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中微波抗原修复（450 W，10分钟），时间分配3分钟、3分钟、4分钟，室温下晾凉；PBS清洗5 min × 3次；利用0.5%脱脂奶粉封闭1 h；加入一抗，湿盒孵育4 ℃过夜；次日拿出湿盒，室温复温20min，PBS清洗5 min × 3次；加入二抗，室温下湿盒内孵育20分钟；PBS清洗5 min × 3次；DAB显色，根据情况而定，不要超过3 - 5分钟。放入PBS中终止，并且用蒸馏水洗一次；苏木素复染1分钟，用清水洗净；盐酸-酒精分色数秒（14 mL盐酸/700 mL乙醇）；自来水流水返蓝30 min；梯度酒精脱水（沿复水反方向走一次，数秒即可）；二甲苯透明；中性树胶封片。免疫组织化学染色结果显示（如图4所示），B16F10肿瘤内部CD25表达水平随接种时间延长而逐渐提升，接种后第14天可见局部CD25高水平表达，而在接种后21天可见肿瘤组织高度表达CD25，证明B16F10荷瘤小鼠在评价CD25多肽探针特异性方面的应用价值。由于B16F10肿瘤接种后期肿瘤负荷过大，因此在显像实验中利用CD25阳性表达的Karpas299模型来评价多肽探针的显像效果。

实施例8

在Karpas299细胞中的表达水平测定。

Karpaspas299细胞CD25表达水平通过流式细胞术来测定，其实验流程如下：

1)细胞准备：细胞离心，可用15 mL离心管，1500 r × 5 min，再用5 mL PBS清洗一次。准备1 × 10⁷细胞数量即可满足使用。

2)细胞染色：细胞用PBS重悬为1 × 10⁷/mL的悬液（勿用移液器吹打），取100 μL即1 × 10⁶细胞置于流式管中，分三组，分别加入5 μL的PE Anti-Human CD25抗体、5 μL的PE Mouse IgG1 k同型抗体、以及空白对照，混匀，放置于4 ℃，避光30 min。

3)细胞清洗：加入5 mL的PBS重悬细胞，1500 r × 5 min离心，清洗2次。弃上清时直接倒掉即可，勿用移液器吸取。

4)上机检测：加500 μL的PBS重悬细胞，混匀即可上机检测。注意：非单悬浮细胞需先过滤网。

流式细胞术实验结果显示，Karpas299细胞系的CD25表达阳性率为79.7%，即接近80%的Karpas299细胞的CD25表达阳性率呈强阳性（图5）。

实施例9

⁶⁸探针在hPBMC中的摄取。

DA-1探针实验中hPBMC的激活方式为OKT3 + CD28培养基，PMA（20 ng/mL）+Ionomycin（1 ng/mL），刺激培养8小时，并设置未激活的hPBMC作为对照。将hPBMC计数后分至小管（100 μL PBS，5 × 10⁵/管），向其中加入70 - 100 kBq的⁶⁸Ga-DA-1探针（100 μL），分别孵育30 min和60 min（n = 3），然后离心收集hPBMC，并用冷的PBS清洗2次，收集细胞转移至计数管，用γ计数器计数，设置1%的marker为参比，计算每管细胞对于探针的摄取率（AD%/5 × 10⁵ cell）。如图6所示，⁶⁸Ga-DA-1探针在激活后的hPBMC中的摄取显著高于未激活的hPBMC，在孵育30 min后二者间即可观察到显著性差异（p = 0.01）。在孵育1 h后，两组间的摄取差异进一步增加（p < 0.0001）。此外，⁶⁸Ga-DA-1探针在激活后的hPBMC中的摄取水平在孵育后随时间延长而提升（30 min vs. 60 min，p = 0.003）。

实施例10

⁶⁸Ga-DA-1探针在hPBMC皮下模型中的Micro-PET/CT显像。

将激活和未激活的hPBMC分别与等体积的基质胶混合（200 μL，3 × 10⁶/只），接种至KM小鼠右侧肩部皮下。在接种后20 min时在动物床上进行异氟烷麻醉，经尾静脉注射200 μCi的⁶⁸Ga-DA-1探针，然后在注射后立刻进行动态PET/CT显像，观察⁶⁸Ga-DA-1探针在接种部位的聚集状态。勾画ROI，测量hPBMC接种部位及肌肉组织的SUVmax。如图7所示，在皮下接种激活hPBMC的小鼠PET/CT显像时，从显像开始30 min内能够看到接种部位显著的探针摄取，注射后30 min时接种部位的SUVmax为0.58，且在60 min内接种部位的SUVmax高于肌肉摄取。而在接种未激活hPBMC的小鼠体内（图8），接种部位的SUVmax在注射后60 min内与肌肉摄取基本处于相同水平，在注射探针后30 min，接种部位的SUVmax仅为0.35。此外，接种激活hPBMC的小鼠在显像30 min内靶本比持续增加，在30 min时最高可达1.88。而接种未激活hPBMC的小鼠显像中30 min时靶本比最高仅为1.11（图9）。

实施例11

⁶⁸探针在hPBMC中的摄取。

hPBMC利用含5 μg/mL的PHA-P的RPMI-1640培养液培养48 h刺激激活，并设置未激活的hPBMC作为对照。将hPBMC计数后分至小管（100 μL PBS，5 × 10⁵/管），分别向其中加入74 kBq的⁶⁸Ga-DA-6探针（100 μL），分别孵育30 min和60 min（n = 3），然后离心收集hPBMC，并用冷的PBS清洗2次，收集细胞转移至计数管，用γ计数器计数，设置1%的marker为参比，计算每管细胞对于探针的摄取率（AD%/5 × 10⁵cell）。⁶⁸Ga-DA-6探针在激活后的hPBMC中孵育2 h后可观察到高于未激活hPBMC的摄取（0.60 ± 0.12 AD% vs. 0.35 ±0.04 AD%，p = 0.02）。此外，⁶⁸Ga-DA-6探针在激活后的hPBMC中的摄取水平在孵育后随时间延长而提升（1 h 为0.22 ± 0.07 AD%，p = 0.008）（图10）。

实施例12

⁶⁸标记的多肽探针在B16F10及Karpas299荷瘤小鼠的Micro-PET/CT显像。

取⁶⁸Ga标记的多肽探针，每只B16F10或Karpas299荷瘤鼠经尾静脉注射7.4 MBq的放射性药物，然后在注射后1 h经异氟烷麻醉后行静态PET/CT显像，观察探针在肿瘤部位的聚集情况。勾画ROI，测定肿瘤、肌肉及主要脏器的SUVmax。

利用B16F10荷瘤鼠模型考察了部分多肽探针的体内显像效果，从图11和表3可以看出，探针⁶⁸Ga-DA-4、⁶⁸Ga-DA-5在肿瘤中具有相对最高的摄取，但是其结构中含有赖氨酸，因此可见肾脏摄取显著高于其它探针。但是在将赖氨酸替换为精氨酸后，如⁶⁸Ga-DA-6和⁶⁸Ga-DA-7探针的肾脏SUVmax显著下降，肌肉本底摄取也相对较低，从而使得⁶⁸Ga-DA-6和⁶⁸Ga-DA-7探针显像时能获得较高的瘤本比。

表3 ⁶⁸Ga标记的DA系列探针在B16F10荷瘤小鼠的脏器摄取及瘤本比

。

进一步地，利用Karpas299荷瘤鼠模型评价多个探针的体内显像效果。如图12所示，将赖氨酸替换为精氨酸的探针⁶⁸Ga-DA-6和⁶⁸Ga-DA-7同样可见显著降低的肾脏摄取。并且具有相对更低的本底摄取，靶本比提升，使得PET/CT显像质量优于其他数个探针。⁶⁸Ga-DA-6和⁶⁸Ga-DA-7的瘤本比分别可达3.63和3.86（表4）。

表4 ⁶⁸Ga标记的DA系列探针在Karpas299荷瘤小鼠的脏器摄取及瘤本比

。

实施例13

⁶⁸标记的多肽探针药物代谢动力学。

⁶⁸Ga标记的多肽探针药物代谢动力学研究均采用如下方法：取雌性KM小鼠5只，每只小鼠经尾静脉注射3.7 MBq的放射性药物，分别在注射后1 min，3 min，5 min，10 min，15min，30 min，45 min，1 h，1.5 h，2 h，3 h和4 h经眼眶静脉取血，称重并利用γ计数器测定其放射性计数，设置1%的marker作为参比，计算单克血液的百分注射剂量率，记为%ID/g，利用GraphPad Prism 8.3.0软件作非线性回归拟合，研究其药物代谢动力学特点。实验中共考察了⁶⁸Ga-DA-4、⁶⁸Ga-DA-6和⁶⁸Ga-DA-7共计3个探针的药物代谢动力学。

选取了3个短肽探针DA-4、DA-6、DA-7来考察两种系列探针的血液药物代谢动力学。药物代谢动力学研究表明，3个探针的体内代谢均符合二室模型，如图13所示。通过GraphPad 8.3.0软件进行拟合，得到⁶⁸Ga-DA-4探针的药物代谢动力学二室模型公式如下：Ct = 1.74 + 12.26 × e^-1.01t+ 10.63 × e^-0.03t，其分布相和清除相的半衰期分别为0.69 min和19.91 min。⁶⁸Ga-DA-6探针的药物代谢动力学二室模型公式如下：Ct = 2.83 +14.51 × e^-0.55t + 6.65 × e^-0.04t，其分布相和清除相的半衰期分别为1.26 min和15.64min。⁶⁸Ga-DA-7探针的药物代谢动力学二室模型公式如下：Ct = 1.64 + 12.82 × e^-0.44t +8.01 × e^-0.03t，其分布相和清除相的半衰期分别为1.58 min和20.69 min。药物代谢动力学研究表明，⁶⁸Ga-DA-4、⁶⁸Ga-DA-6和⁶⁸Ga-DA-7探针在体内的分布和清除都非常迅速，符合小分子显像探针的药物代谢动力学特点。

实施例14

⁶⁸标记的多肽探针在KM小鼠的生物分布。

⁶⁸Ga标记探针在KM鼠的生物分布研究采用如下方法：取雌性KM小鼠15只，每只小鼠经尾静脉注射1.11 MBq的放射性药物，分别在注射后5 min，30 min，1 h，2 h及4 h处死，取血液、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、大肠、肌肉、骨及脑等脏器和组织，称重并利用γ计数器测定其放射性计数，设置1%的marker作为参比，计算单克组织百分注射剂量率，记为%ID/g，考察⁶⁸Ga-DA-4和⁶⁸Ga-DA-6和探针在KM小鼠体内的分布特点。

此外，从探针⁶⁸Ga-DA-4和⁶⁸Ga-DA-6探针在2 h内的分布结果来看，短肽探针在KM小鼠体内的代谢特点十分相似，均为经由肾脏快速清除。如图14，探针在血液中清除迅速，⁶⁸Ga-DA-4和⁶⁸Ga-DA-6在注射后30 min血液中的探针摄取即分别下降超过80.4%和88.6%。且在30 min内探针已基本达到分布和清除的平衡阶段，至注射后2 h内各脏器探针摄取水平已基本保持稳定。

实施例15

⁶⁸Ga-DA-6在阳性模型Karpas299及隐性模型U87MG荷瘤小鼠的Micro-PET/CT显像

取Karpas299及U87MG荷瘤小鼠，分别经尾静脉注射7.4 MBq的⁶⁸Ga-DA-6探针，然后在注射后1 h按压小鼠腹部促进排尿，再利用异氟烷麻醉小鼠后行小动物PET/CT显像，利用CT-AC重建方法获得PET图像，勾画感兴趣区，测定肿瘤及肌肉组织的SUVmax等数据，计算瘤本比（tumor-to-muscle ratio，T/M）。Karpas299阻断组小鼠在注射探针前24 h，需预先经尾静脉注射1 mg的Basiliximab。

从注射后1 h时的小动物PET/CT显像视觉分析来看，⁶⁸Ga-DA-6探针在Karpas299荷瘤小鼠的肿瘤部位具有较为显著的摄取（图15），SUVmax为0.29，瘤本比T/M为3.63，而在U87MG荷瘤小鼠的肿瘤中，探针摄取显著降低，SUVmax为0.16。此外，在提前注射Basiliximab进行阻断后，Karpas299荷瘤小鼠肿瘤部位的探针摄取也下降至0.17。

实施例16

⁶⁸Ga-DA-6探针在Karpas299及U87MG荷瘤小鼠的生物分布。

取Karpas299及U87MG荷瘤小鼠，分别经尾静脉注射1.11 MBq的⁶⁸Ga-DA-6探针，然后在注射后1 h处死，取血液、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、大肠、肌肉、骨、脑及肿瘤等脏器和组织，称重并利用γ计数器测定其放射性计数，设置1%的marker作为参比，计算单克组织百分注射剂量率，记为%ID/g，考察⁶⁸Ga-DA-6探针在Karpas299和U87MG荷瘤小鼠体内的分布特点。

如图16所示，在Karpas299荷瘤小鼠体内，⁶⁸Ga-DA-6探针在肿瘤中具有相对较高的摄取，为1.27 ± 0.04 %ID/g，而在U87MG肿瘤中的摄取仅为0.54 ± 0.06 %ID/g（p <0.0001），此外，利用Basiliximab进行阻断后，Karpas299荷瘤小鼠肿瘤中⁶⁸Ga-DA-6探针的摄取也显著下降，仅为0.26 ± 0.02 %ID/g（p < 0.0001）。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 北京肿瘤医院（北京大学肿瘤医院）

<120> 一种CD25靶向多肽、分子探针及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa=精氨酸或赖氨酸或组氨酸

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa=苯丙氨酸或酪氨酸或苄基酪氨酸或卤代苯丙氨酸

<220>

<221> UNSURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa=精氨酸或赖氨酸或组氨酸

<220>

<221> UNSURE

<222> (4)..(5)

<223> Xaa=苯丙氨酸或酪氨酸或苄基酪氨酸或卤代苯丙氨酸

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (3)..(3)

<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Phe Lys Gly Gly Gly Phe Tyr

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Phe Lys Phe Tyr Glu

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<222> (3)..(3)

<223> a3D

<400> 4

Arg Phe Arg Phe Tyr

1 5

Claims

1.一种CD25靶向多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如下：

i) X1X2X3X4X5；或

ii) 在i)的N端或C端连接标签形成的氨基酸序列；

2.根据权利要求1所述的CD25靶向多肽，其中，所述多肽中至少有一个氨基酸为D型。

3.根据权利要求2所述的CD25靶向多肽，其中，X1、X5为L型，其余氨基酸中至少有一个为D型。

4.根据权利要求1所述的CD25靶向多肽，其中，所述标签为保护基。

5.根据权利要求4所述的CD25靶向多肽，其中，所述标签为羟基保护基。

6.一种分子探针，其特征在于，所述分子探针为具有放射性同位素标记的权利要求1-5中任意一项所述的CD25靶向多肽；所述放射性同位素直接标记在所述CD25靶向多肽上，或者通过-L-Ch标记在所述CD25靶向多肽上，其中L为桥接基团，Ch为核素螯合基团。

7.根据权利要求6所述的分子探针，其中，-L-Ch共价连接在所述CD25靶向多肽的N端、C端或反应性侧链上。

8.根据权利要求6或7所述的分子探针，其中，所述桥接基团为寡肽或NH₂-(PEG)_n-COOH，所述寡肽的氨基酸数目为1-4，n为1-4的整数；

所述核素螯合基团为双功能螯合剂形成的基团，所述双功能螯合剂选自DOTA、NOTA、NODA、NODAGA、DOTP、TETA、ATSM、PTSM、EDTA、EC、HBEDCC、DTPA、SBAD、BAPEN、Df、DFO、TACN、NO2A/NOTAM、CB-DO2A、Cyclen、NOTA-AA、DO3A、DO3AP、HYNIC、MAS3、MAG3或异腈；所述放射性核素为诊断用放射性核素；所述诊断用放射性核素为⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、¹⁸F、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、¹¹¹In、^99mTc、¹¹C、¹²³I、¹²⁵I和¹²⁴I中的至少一种。

9.权利要求6-8中任意一项所述的分子探针在制备核素成像诊断试剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述核素成像诊断试剂为CD25高表达的CAR-T细胞疗效评价试剂或治疗追踪试剂。