KR20040023708A - 노화 방지 및 상처 치유를 위한 화합물 - Google Patents

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KR20040023708A
KR20040023708A KR10-2004-7001607A KR20047001607A KR20040023708A KR 20040023708 A KR20040023708 A KR 20040023708A KR 20047001607 A KR20047001607 A KR 20047001607A KR 20040023708 A KR20040023708 A KR 20040023708A
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스티븐 쿼크
소하일 말리크
줄리 엠. 빌라누에바
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킴벌리-클라크 월드와이드, 인크.
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Abstract

본 발명은 건강한 피부의 발생을 촉진시키고 상처를 치료하는 데 유용한 매트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinase) 저해제를 제공한다. 이러한 저해제는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 전구효소 형태의 절단 영역과 관련된 서열을 갖는 펩티드이다. 본 발명의 펩티드 저해제는 치유 및 건강한 피부 발생을 촉진시키고, 흉터 및 주름을 방지하며, 치유 효과를 개선하는 치료 조성물, 로션, 크림, 피부 커버링 (covering) 및 상처 드레싱 (dressing)으로 제제화할 수 있다.

Description

노화 방지 및 상처 치유를 위한 화합물 {Anti-Aging and Wound Healing Compounds}
본 출원은 2001년 8월 16일 출원된 미국 가출원 제60/312,726호를 우선권으로 주장하는, 2002년 5월 21일 출원된 미국 특허 출원 제10/153,185호 및 2001년 12월 21일 출원된 미국 특허 출원 제10/032,376호의 일부 계속 출원이며, 상기 문헌들은 그의 전체 개시내용이 본 명세서에 참고로 포함된다.
피부의 상태는 습도, 자외광, 화장용 조성물, 노화, 질병, 스트레스 및 식습관 등의 인자에 의해 항상 영향받는다. 그 결과, 다양한 피부 트러블이 발생할 수 있다. 또한, 피부는 나이가 들어감에 따라 생기는 주름에 의해 설명되는 것처럼 탄력이 줄어들게 된다. 노화는 일반적으로 피부의 두께 감소 및 전반적인 분해와 관련이 있다. 피부가 자연적으로 노화됨에 따라, 피부를 공급하는 세포 및 혈관의수는 감소한다. 또한, 피부-표피 연결부가 얇아지면 이 연결부의 기계적 내성이 약해진다. 그 결과, 연장자들은 기계적 외상이 생기거나 질병이 진행하는 경우에 수포 (blister) 형성에 대해 보다 민감하다 [문헌 [Oikarinen, (1990) "The Aging of Skin: Chronoaging Versus Photoaging", Photodermatal. Photoimmunol. Photomed., Vol. 7, pp 3-4] 참조].
피부는 그의 탄력을 유지하는 역할을 하는 엘라스틴 섬유의 정교한 망상 조직을 포함한다. 이러한 탄성 섬유계는 햇빛에 과도하게 노출되면 과형성되고, 조직이 붕괴하게 되어 결국에는 파열된다. 이러한 과정은 광선탄력섬유증 (actinic elastosis)으로 알려져 있으며, 신체의 노출 부위에서 주름, 변색 및 이완의 주요한 원인이다. 새로운 섬유아세포, 내피 세포 및 각질세포가 형성됨에 따라, 피부는 스스로 회복할 수 있다. 그러나, 피부는 노화가 진행함에 따라 이러한 능력을 상실하게 된다. 따라서, 조기 노화된 피부의 성장 및 회복을 촉진시킬 수 있는 물질이 필요하다.
상처 치유는 또한 몇몇 세포 유형의 세포 증식 및 이동의 증가에 의해 촉진된다. 상처 치유에 관련된 메카니즘은 흔히 지혈, 염증, 증식 및 성숙의 4 단계로 나뉜다. 염증반응 동안, 백혈구가 축적되어 박테리아를 공격하고, 혈관벽 투과성이 증가하여 부종 (swelling)이 생긴다. 감염이 발생하지 않는다면, 백혈구의 수는 감소한다. 단핵구는 백혈구를 대신한다. 대식세포 및 림프구는 성장 인자 (사이토카인), 및 다수의 화학 물질, 예를 들어 히스타민, 세로토닌 및 프로스타글란딘을 방출한다. 이들 물질은 상처 치유 과정의 조절을 돕는다. 증식 단계에서,새로운 섬유아세포, 내피 세포 및 각질세포가 발생하고, 결합 조직이 형성되고, 새로운 혈관이 성장하며, 손상 조직이 재생된다. 섬유아세포는 약 1주일 후에 우성으로 되고, 염증은 감소되며, 상처 부위 근처 조직의 강도는 빠르게 증가한다. 성숙 단계 동안, 콜라겐이 침착되어 흉터 조직이 형성된다. 이러한 성숙 단계는 장시간 계속될 수 있으며, 이 동안 다양한 유형의 조직이 재생된다. 피부 및 관련 조직을 최적으로 치유하기 위해서는 각종 비타민, 미량 원소 및 영양소뿐 아니라, 산소 공급도 충분해야 한다.
만성 상처 또는 무통성의 치유하지 않은 상처는 감염, 이물질 또는 독성 자극제의 존재, 화상, 장시간에 걸쳐 피부에 가해진 압력 및 순환 장애로 인한 불량한 혈액 공급을 비롯한 여러가지 원인들에 의해 생길 수 있다. 만성 상처에서, 조직 항상성 및 상처 주변이 손상된 결과, 치유가 개시되지 못하며, 치유가 개시되더라도 이후 중단된다. 만성 상처에서 치유 실패의 원인이 되는 인자로는 조직 괴사, 탈수증, 만성 상처 부종, 섬유성 경화 및 미소 혈관 질병이 있다.
만성 상처를 치유하지 못하는 주요 원인들 중 하나는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)라 부르는 프로테이나제의 한 종류가 새로 형성된 상처층을 파괴하기 때문이다 [Vaalamo et al., 1997; Weckroth et al., 1996; DiColandrea et al., 1998; Moses et al., 1996]. 이러한 매트릭스 메탈로프로테이나제는 통상적으로 매트릭스 메탈로프로테이나제와의 매우 특이적인 저해성 복합체를 형성하는 4종의 메탈로프로테이나제 조직 저해제 (TIMP1-4)의 작용으로 인해 상처층을 파괴하지 못한다 [Olson et al., 1997; Taylor et al., 1996; Howard et al., 1991]. 즉, 각각의 TIMP는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 특정 하위군만을 억제할 뿐이다. 만성 상처에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제 대 TIMP의 비율이 높아서, 대부분의 매트릭스 메탈로프로테이나제는 저해되지 않는다 [Vaalamo et al., 1996; Saariallzo-Kere, 1998]. 실제로, 상승된 프로테이나제 수준에서는 TIMP 분자 그 자체가 가수분해될 수 있다. 단독으로 모든 유형의 매트릭스 메탈로프로테이나제를 저해하는 자연 발생적인 TIMP 분자는 존재하지 않는다.
소분자 저해제 [Levy et al., 1998; Wojtowicz-Praga et al., 1997; Duivenvoorden, et al., 1997], 펩티드류 저해제 [Odake et al., 1994] 및 항-MMP 항체 (Su et al., 1995)의 모두를 비롯해서 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성을 조절하는 많은 방법이 제안되어 왔다. 그러나, 상처 치유 및 노화 작용 반전을 위한 이상적인 조성물은 메탈로프로테이나제를 최적으로 억제할뿐 아니라, 손상된 조직의 성장 및 재생을 자극하는 것이어야 한다.
<발명의 개요>
본 발명은 노화 방지 및 상처 치유제로 유용한 펩티드 함유 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩티드는 메탈로프로테이나제를 저해할뿐 아니라, 섬유아세포, 내피 세포 및 각질세포를 비롯한 여러 세포 유형에서 세포 증식 및 이동을 자극할 수도 있다. 다양한 국소 로션, 드레싱 및 조성물뿐만 아니라, 노화 작용을 반전시키고 상처를 치유하는 본 발명의 펩티드를 사용하는 방법이 고려된다.
따라서, 본 발명은 매트릭스 메탈로프로테이나제의 펩티드 저해제에 관한 것이다. 이러한 펩티드 저해제는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 2개의 구형 도메인에 걸쳐 있는 연결 영역과 동일하거나 또는 그와 관련된 아미노산 서열을 갖는다. 매트릭스 메탈로프로테이나제-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-3, 매트릭스 메탈로프로테이나제-4, 매트릭스 메탈로프로테이나제-4, 매트릭스 메탈로프로테이나제-5, 매트릭스 메탈로프로테이나제-6, 매트릭스 메탈로프로테이나제-7, 매트릭스 메탈로프로테이나제-8, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 매트릭스 메탈로프로테이나제-10, 매트릭스 메탈로프로테이나제-11, 매트릭스 메탈로프로테이나제-12 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-13을 비롯한 여러 유형의 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 그의 서열이 공지되어 있다. 본 발명은 본 발명의 매트릭스 메탈로프로테이나제들 중 어떤 것의 연결 영역에서 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 저해제를 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 저해제는 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 서열의 약 70번 아미노산 내지 약 120번 아미노산의 임의의 영역 (서열 14) 및 다른 모든 매트릭스 메탈로프로테이나제의 유사 영역으로부터 유도된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 화학식 I, 화학식 II 및 화학식 III 중 어느 하나의 펩티드를 제공하며, 이 펩티드는 매트릭스 메탈로프로테이나제-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-3, 매트릭스 메탈로프로테이나제-4, 매트릭스 메탈로프로테이나제-4, 매트릭스 메탈로프로테이나제-5, 매트릭스 메탈로프로테이나제-6, 매트릭스 메탈로프로테이나제-7, 매트릭스 메탈로프로테이나제-8, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 매트릭스 메탈로프로테이나제-10, 매트릭스 메탈로프로테이나제-11, 매트릭스 메탈로프로테이나제-12 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-13의 활성을 저해할 수 있다.
상기 식에서,
Xaa1, Xaa4및 Xaa6은 각각 개별적으로 비극성 아미노산이고;
Xaa2는 염기성 아미노산이고;
Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
Xaa5는 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
Xaa7은 산성 아미노산이고;
Xaa8은 지방족 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
Xaa9는 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 염기성 아미노산이고;
Xaa10은 극성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa11은 극성 아미노산 또는 방향족 아미노산이고;
Xaa12는 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 지방족 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa13은 방향족 아미노산, 지방족 아미노산, 극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
Xaa14는 방향족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
Xaa15는 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
Xaa16은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa17은 염기성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
Xaa18은 비극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이며;
Xaa19는 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 매트릭스 메탈로프로테이나제-2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-3, 매트릭스 메탈로프로테이나제-7, 매트릭스 메탈로프로테이나제-8 또는 매트릭스 메탈로프로테이나제-9의 활성을 저해할 수 있다.
비극성 아미노산은 예를 들어 메티오닌, 글리신 또는 프롤린일 수 있다. 염기성 아미노산은 예를 들어 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산,오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노페닐알라닌 또는 2,4-디아미노부티르산일 수 있다. 본 발명의 시스테인-유사 아미노산은 예를 들어 시스테인, 호모시스테인, 페니실라민 또는 β-메틸 시스테인을 포함한다.
지방족 아미노산은 예를 들어 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산을 포함한다. 산성 아미노산은 예를 들어 아스파라긴산 또는 글루탐산을 포함한다. 극성 아미노산은 예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드, 호모세린, 또는 메티오닌, 글리신 또는 프롤린과 같은 비극성 아미노산을 포함한다. 본 발명의 방향족 아미노산은 예를 들어 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐알라닌일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 IV의 펩티드 (서열 18)를 제공하며, 이 펩티드는 메탈로프로테이나제, 예를 들어 매트릭스 메탈로프로테이나제-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-3, 매트릭스 메탈로프로테이나제-4, 매트릭스 메탈로프로테이나제-4, 매트릭스 메탈로프로테이나제-5, 매트릭스 메탈로프로테이나제-6, 매트릭스 메탈로프로테이나제-7, 매트릭스 메탈로프로테이나제-8, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 매트릭스 메탈로프로테이나제-10, 매트릭스메탈로프로테이나제-11, 매트릭스 메탈로프로테이나제-12 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-13의 활성을 저해할 수 있다.
상기 식에서,
Xaaa는 프롤린이고; Xaab는 글루타민 또는 글루탐산이고; Xaac는 쓰레오닌이고; Xaad는 글리신이고; Xaae는 아스파라긴산 또는 글루탐산이고; Xaaf는 루이신이고; Xaag는 아스파라긴산이고; Xaah는 글루타민 또는 세린이고; Xaai는 아스파라긴 또는 알라닌이고; Xaaj는 쓰레오닌이고; Xaak는 이소루이신 또는 루이신이고; XaaL은 글루탐산 또는 리신이고; Xaam은 쓰레오닌 또는 알라닌이고; Xaan은 메티오닌이고; Xaao는 아르기닌이며; Xaap는 리신 또는 쓰레오닌이고;
Xaa1은 프롤린이고; Xaa2는 아르기닌이고; Xaa3은 시스테인이고; Xaa4는 글리신이고; Xaa5는 발린 또는 아스파라긴이고; Xaa6은 프롤린이고; Xaa7은 아스파라긴산이고; Xaa8은 발린 또는 루이신이고; Xaa9는 알라닌 또는 글리신이고; Xaa10은 아스파라긴 또는 아르기닌이고; Xaa11은 티로신 또는 페닐알라닌이고; Xaa12는 아스파라긴 또는 글루타민이고; Xaa13은 페닐알라닌 또는 쓰레오닌이고; Xaa14는 페닐알라닌이고; Xaa15는 프롤린 또는 글루탐산이고; Xaa16은 아르기닌 또는 글리신이고; Xaa17은 리신 또는 아스파라긴산이고; Xaa18은 프롤린 또는 루이신이며; Xaa19는 리신이다.
바람직한 펩티드는 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 또는 매트릭스 메탈로프로테이나제-9를 저해할 수 있다.
본 발명의 펩티드 저해제가 유도될 수 있는 연결 영역은 예를 들어 서열 14의 약 70번 위치 내지 약 120번 위치 범위의 아미노산 서열 및 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제의 유사 영역을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 저해제는 서열 14의 약 77번 위치 내지 약 110번 위치 범위의 아미노산 서열 또는 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제의 유사 영역을 갖는다. 본 발명의 펩티드 저해제의 몇몇 예로는 아미노산 서열인 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 또는 서열 13을 포함하는 것을 들 수 있다.
본 발명의 펩티드는 여러 매트릭스 메탈로프로테이나제에 대해 다양한 친화성을 갖는다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 저해제는 약 1.0 μM 내지 약 500.0 μM의 ki로 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해할 수 있다. 다른 실시양태에서, 펩티드 저해제는 약 1.0 μM 내지 약 400.0 μM의 ki로 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 저해제는 약 1.0 μM 내지 약 50.0 μM의 ki로 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해할 수 있다.
본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 상처 치료 및 피부 로션이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해할 수 있는 치료 유효량의 하기 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III 또는 IV의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 상처를 치료하는 방법 또는 노화 작용을 반전시키는 방법을 추가로 제공한다.
<화학식 I>
<화학식 II>
<화학식 III>
<화학식 IV>
(서열 21)
상기 식에서,
Xaa1, Xaa4및 Xaa6은 각각 개별적으로 비극성 아미노산이고;
Xaa2는 염기성 아미노산이고;
Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
Xaa5는 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
Xaa7은 산성 아미노산이고;
Xaa8은 지방족 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
Xaa9는 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 염기성 아미노산이고;
Xaa10은 극성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa11은 극성 아미노산 또는 방향족 아미노산이고;
Xaa12는 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 지방족 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa13은 방향족 아미노산, 지방족 아미노산, 극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
Xaa14는 방향족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
Xaa15는 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
Xaa16은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa17은 염기성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
Xaa18은 비극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이며;
Xaa19는 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
Xaaa는 프롤린이고; Xaab는 글루타민 또는 글루탐산이고; Xaac는 쓰레오닌이고; Xaad는 글리신이고; Xaae는 아스파라긴산 또는 글루탐산이고; Xaaf는 루이신이고; Xaag는 아스파라긴산이고; Xaah는 글루타민 또는 세린이고; Xaai는 아스파라긴 또는 알라닌이고; Xaaj는 쓰레오닌이고; Xaak는 이소루이신 또는 루이신이고; XaaL은 글루탐산 또는 리신이고; Xaam은 쓰레오닌 또는 알라닌이고; Xaan은 메티오닌이고; Xaao는 아르기닌이며; Xaap는 리신 또는 쓰레오닌이다.
본 발명의 펩티드에서 비극성 아미노산은, 예를 들어 메티오닌, 글리신 또는 프롤린일 수 있다. 염기성 아미노산은, 예를 들어 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산일 수 있다. 시스테인-유사 아미노산은 예를 들어 시스테인, 호모시스테인, 페니실라민 또는 β-메틸 시스테인일 수 있다. 지방족 아미노산은 예를들어 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산을 포함한다. 산성 아미노산은 예를 들어 아스파라긴산 또는 글루탐산을 포함한다. 극성 아미노산은 예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드, 호모세린, 또는 메티오닌, 글리신 또는 프롤린과 같은 비극성 아미노산일 수 있다. 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐알라닌일 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 또는 서열 13의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 상처 치료 방법 또는 노화 작용 개선 방법을 제공한다.
본 발명은 상처를 치유하고 피부의 노화 작용을 반전시키는 데 유용한 매트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinase) 저해제를 포함하는 제제에 관한 것이다. 본 발명의 저해제는 전구효소 (proenzyme) 형태의 매트릭스 메탈로프로테이나제의 절단 부위와 관련된 서열을 포함하는 펩티드이다.
도 1은 선택적 MMP 전구효소의 절단 스패닝 영역의 CLUSTAL X (버젼 1.8) 다중 서열 정렬을 제공한다. 도 1A는 보존된 잔기를 강조하는 정렬을 제공하고, 여기서 '*'는 서열 사이의 완전 동일성을 나타내고, ':'은 9개중 7개가 보존된 위치를 나타내고, '.'은 대부분 보존적 치환으로 80％ 넘게 동일한 위치를 나타낸다. 도1B는 이종 서열의 위치를 굵은 글씨로 나타낸다.
도 2는 pro-MMP-1 (단백질 데이타뱅크 파일 1FBL.ENT)의 구조를 제공한다. 표 1에 제시된 서열 2 내지 10의 부분은 2개의 대형 도메인 사이의 짧은 영역에 걸쳐 있다. 활성화 동안 이 영역은 절단된다.
도 3은 MMP-9의 3차원 모델을 제공한다. 활성 프로테이나제의 N-말단부를 생성하는 절단 영역은 크로스-해칭 (cross-hatch)으로 제시되어 있다. 2개의 아연 이온은 구형으로 도시되어 있다. 절단 도메인 펩티드는 전구효소내의 그의 정상 위치의 근처에서 MMP에 결합할 수 있다. (또한 촉매성 아연 근처에서) 이러한 결합은 활성 부위의 일부를 입체적으로 차단한다. 이러한 차단은 기질 결합을 방지한다.
도 4는 19-mer (서열 11) 절단 도메인 펩티드에 의한 MMP-9 활성의 저해를 도시한다. FRET 분석 전에 MMP-9를 19-mer (서열 11) 펩티드와 혼합하였다. 19-mer (서열 11) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 원), 0.01 mM (개방 원), 0.03 mM (폐쇄 사각형), 0.06 mM (개방 사각형), 0.125 mM (폐쇄 삼각형), 0.25 mM (개방 삼각형), 0.5 mM (×), 1 mM (폐쇄 역삼각형), 2 mM (개방 역삼각형).
도 5는 10-mer (서열 13) 절단 도메인 펩티드에 의한 MMP-9 활성의 저해를 도시한다. FRET 분석 전에 MMP-9를 10-mer (서열 13) 펩티드와 혼합하였다. 10-mer (서열 13) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 삼각형), 0.25 mM (개방 삼각형), 0.5 mM (개방 역삼각형), 1.0 mM (폐쇄 역삼각형), 2.0 mM (×).
도 6은 9-mer (서열 12) 절단 도메인 펩티드에 의한 MMP-9 활성의 저해를 도시한다. FRET 분석 전에 MMP-9를 9-mer (서열 12) 펩티드와 혼합하였다. 9-mer (서열 12) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 삼각형), 0.25 mM (개방 삼각형), 0.5 mM (개방 역삼각형), 1.0 mM (폐쇄 역삼각형), 2.0 mM (×).
도 7은 19-mer (서열 11) 절단 도메인 펩티드에 의한 MMP-9 활성의 저해를 도시한다. 형광 콜라겐 분석 전에 MMP-9를 19-mer (서열 11) 펩티드와 혼합하였다. 19-mer (서열 11) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 원), 0.06 mM (개방 다이아몬드), 0.1 mM (개방 사각형), 0.25 mM (개방 원), 0.5 mM (×).
도 8은 보다 긴 시간 과정 동안 19-mer (서열 11) 절단 도메인 펩티드에 의해 MMP-9 활성을 저해하는 것을 도시한다. 형광 콜라겐 분석 전에 MMP-9를 19-mer (서열 11) 펩티드와 혼합하였다. 19-mer (서열 11) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 원), 0.06 mM (개방 다이아몬드), 0.1 mM (개방 사각형), 0.25 mM (개방 원), 0.5 mM (×).
도 9는 보다 긴 시간 과정 동안 10-mer (서열 13) 절단 도메인 펩티드에 의해 MMP-9 활성을 저해하는 것을 도시한다. 형광 콜라겐 분석 전에 MMP-9를 10-mer (서열 13) 펩티드와 혼합하였다. 10-mer (서열 13) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (개방 원), 0.1 mM (개방 다이아몬드), 0.2 mM (개방 사각형), 0.4 mM (×).
도 10은 보다 긴 시간 과정 동안 9-mer (서열 12) 절단 도메인 펩티드에 의해 MMP-9 활성을 저해하는 것을 도시한다. 형광 콜라겐 분석 전에 MMP-9를 9-mer(서열 12) 펩티드와 혼합하였다. 9-mer (서열 12) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 원), 0.06 mM (개방 다이아몬드), 0.1 mM (개방 사각형), 0.25 mM (개방 원), 0.5 mM (×).
도 11은 전형적인 스플라이싱 반응의 HPLC 용출 프로필을 제공한다. 화살표는 제1 피크 (pro-MMP-9 피크)의 면적이 반응의 진행에 따라 감소하는 반면, 2개의 제2 피크 (각각 성숙 MMP-9 및 N-말단 절단 생성물)의 면적은 증가하는 것을 나타낸다.
도 12은 스트로밀리신에 의한 pro-MMP-9의 N-말단 및 C-말단 도메인으로의 전환을 도시한다. pro-MMP-9를 0 (폐쇄 원), 0.5 μM (개방 사각형) 또는 1.0 μM (폐쇄 사각형) 19-mer (서열 11) 펩티드의 존재하에 스트로밀리신과 반응시켰다. 제시된 시간에서, 분액을 제거하고, HPLC 처리하였다. pro-MMP 피크 면적을 합하여 0 시점의 샘플의 경우 100 퍼센트가 되도록 하였다. 개방 원은 스트로밀리신 또는 19-mer (서열 11) 펩티드의 부재하에 완충액 중에서 인큐베이션된 pro-MMP를 나타낸다.
도 13A는 19-mer (서열 11) 저해제 펩티드와 MMP-9의 상호작용에 대한 등온 적정 열량측정 분석을 제공한다. 각각의 피크는 주입 및 후속 결합 반응에 의해 생성된 열을 나타낸다. 도 13B는 도 13A의 각 주입 피크의 값을 시간에 대해 적분하여 생성된 결합 등온선을 제공한다.
도 14는 19-mer (서열 11) 저해제 펩티드와 MMP-2의 상호작용에 대한 등온 적정 열량측정 분석을 제공한다. 도 14A는 25℃에서 19-mer (서열 11)(1 mM)를 20mM 카코딜레이트 (pH 6.8), 10 mM NaCl 중 MMP-2 (20 μM)로 적정한 것에 대한 등온 열량측정의 원시 데이타를 제공한다. 각 피크는 주입 및 후속 결합 반응에 의해 생성된 열을 도시한다. 도 14B는 도 14A의 각 주입 피크의 값을 시간에 대해 적분하여 생성된 결합 등온선을 제공한다.
도 15는 19-mer (서열 11) 펩티드가 고정된 MMP-9의 표면에서 흐르는 경우에 생성된 표면 플라즈몬 공명 결합 등온선을 제공한다.
도 16은 피부 모델에서 2가지 농도의 펩티드로의 처리 후 생존 세포의 비율(％)을 양성 대조군과 비교하여 나타낸 막대 그래프를 제공한다. 인산염 완충 염수 (PBS)로 처리된 제1 샘플은 100％ 생존율을 나타내는 세포수를 정하기 위해 사용되는 양성 대조군이다. 제2 샘플은 세포가 1％ Triton-X100에 노출된 경우의 음성 대조군이며, 이는 당해 분석법이 세포 사멸을 검출할 수 있음을 제시한다. 다음 3개의 샘플은 500 μM의 농도로 사용된 19-mer (서열 11), 10-mer (서열 13) 및 9-mer (서열 12) 펩티드이다. 마지막 3개의 샘플은 2 mM의 농도로 사용된 19-mer (서열 11), 10-mer (서열 13) 및 9-mer (서열 12) 펩티드이다. 제시된 데이타는 3회 시험의 평균을 나타낸다.
도 17은 db/db 당뇨병 마우스에서 시간에 따른 상처 치유를 그래프로 도시한다. 이 그래프는 생리 식염수 (개방 원) 또는 20 ㎍/mL 19-mer 펩티드 (서열 11)(폐쇄 원)로 처리된 마우스에 대한 상대적 평균 상처 면적 대 상처 후 경과 일수를 도시한다. 제시된 데이타는 10마리의 대상 동물로부터 유도된 평균 상대적 상처 직경을 나타낸다.
도 18은 19-mer (서열 11)의 존재 및 부재하에 정상 인간의 피부 섬유아세포 (Clonetics, CC-2509)의 증식을 그래프로 나타낸다. 세포 성장을 490 nm에서의 광학 밀도 (OD) 측정에 의해 3가지 다른 농도에서 검출하였다. 바 (bar) 표지된 "19mer6"은 1 x10-6M 농도의 19mer (서열 19) 존재하의 세포 성장을 반영한다. 바 표지된 "19mer5"는 1 x10-5M 농도의 19mer (서열 11) 존재하의 세포 성장을 반영한다. 바 표지된 "19mer4"는 1 x10-4M 농도의 19mer (서열 11) 존재하의 세포 성장을 반영한다. "대조군" 세포는 펩티드를 첨가하지 않고 성장시켰다.
도 19는 19-mer 펩티드 (서열 11)의 존재 및 부재하의 정상 인간 각질세포의 증식을 그래프로 나타낸다. 설명한 바와 같이, 19-mer 펩티드 (서열 11)는 각질세포의 성장을 투여량 의존적인 방식으로 증가시켰다. 첨가된 19-mer 펩티드가 없는 대조군 세포는 가장 낮은 세포 밀도를 나타냈다. 1 ×10-5M 만큼 적은 19-mer (서열 11, 도 19에서 표지된 19mer5)를 수용하는 세포는 19-mer 펩티드를 수용하지 않은 세포보다 유의하게 더 큰 세포 밀도 (P > 0.01)를 나타냈다. 1 ×10-4M의 19-mer (도 19에서 표지된 "19mer4")를 보유하는 세포는 훨씬 더 큰 세포 성장 (P > 0.001)을 나타냈다. 그러나, 1 ×10-6M의 19-mer (도 19에서 표지된 "19mer6")를 수용하는 세포는 통계적으로 유의하지 않은 것으로 밝혀진 소량의 세포 증식 (P > 0.05)만을 나타냈다.
도 20은 정상 인간의 피부 섬유아세포 (NHDF)의 이동 분석에 사용되는 48-웰 주화성 챔버 (Neuroprobe, Inc.)를 도시한 것이다.
도 21A 및 B는 정상 인간의 피부 섬유아세포 (NHDF)의 이동을 나타낸다. 도 21A는 이동 분석에서 NHDF가 존재하지 않는 8 ㎛ 공극 (원형인것으로 보임)을 갖는 막을 나타낸다 (배율 300배). 도 21B는 양성 대조군 화합물 (1.25 ㎍/mL 혈장 피브로넥틴)의 첨가로 인한 NHDF 이동 후의 막을 나타낸다. 이 사진은 300배 확대 촬영한 것이다. NHDF의 핵은 보라색으로 염색되었다. 일부 NHDF는 막을 통해 이동하였지만, 다른 것들은 8 ㎛ 공극내에 포획된 것으로 보인다.
도 22는 정상 인간의 피부 섬유아세포 (NHDF) 이동율 (％)을 19-mer 펩티드 (서열 11)의 다양한 농도에서 양성 대조군 (혈장 피브로넥틴)에 노출되었을 때의 NHDF 이동율에 상대적으로 나타낸 막대 그래프를 제공한다. 어떤 주화성 물질은 매우 좁은 범위의 활성 농도를 갖기 때문에, 초기 실험에서는 10배 희석된 19-mer 희석액을 사용하였다. 3가지 개별 실험의 평균이 나타나 있다 (100 ㎍/mL 데이타는 6회 실험의 평균임). 1,000 ㎍/mL 및 100 ㎍/mL 농도의 19-mer 펩티드 (서열 11)는 섬유아세포에 대해 주화성이었다 (각각 양성 대조군의 55 ±3％ 및 46 ±3％임). 100 ㎍/mL 미만 농도의 19-mer (서열 11)를 사용하는 섬유아세포 이동 실험은 음성 대조군보다 약 2배 높을뿐이었으며, 유의한 것으로 고려되지 않았다.
도 23은 정상 인간의 피부 섬유아세포 (NHDF)의 이동율을 19-mer 펩티드 (서열 11) 및 그의 유도체의 여러 농도에서 양성 대조군에 노출시켰을 때의 NHDF 이동율에 상대적으로 나타낸 막대 그래프를 제공한다. 100 ㎍/mL에서, 아세틸화된 19-mer (서열 11) 펩티드 (Ac-19-mer)는 19-mer와 대략 동일한 정도로 NHDF 이동을 개시하였지만, 더 높은 농도에서 Ac-19-mer는 효과적이지 않았다. 9-mer (서열 12) 및 10-mer (서열 13) 펩티드는 1,000 ㎍/mL에서만 NHDF 이동을 개시하였다. 흥미롭게도, 14-mer TMRKPRCGNPDVAN (서열 19) 및 17-mer TLKAMRKPRCGNPDVAN (서열 20) 펩티드는 임의의 농도에서 NHDF에 대해 주화성이 아니었다 (데이타는 나타내지 않음). 14-mer TMRKPRCGNPDVAN (서열 19) 및 17-mer TLKAMRKPRCGNPDVAN (서열 20)의 펩티드 서열은 MMP 효소로부터 유도되었으며, 단지 N-말단에 대해 약간 더 아래쪽에서 시작한다. 따라서, 펩티드의 아미노산 서열은 NHDF 이동을 유도하는 데 있어서 중요하다.
도 24는 19-mer 펩티드 (서열 11)의 첨가가 인간 피부 섬유아세포에서 콜라겐 생산을 증가시켰음을 설명하는 막대 그래프를 제공한다. 첨가된 19-mer (서열 11) 펩티드가 없는 대조군 인간 피부 섬유아세포는 매우 적은 양의 콜라겐만을 생산하였다. 이와는 달리, 1 ×10-6M 만큼 적은 19-mer (서열 11, 도 24에서 표지된 19mer6) 또는 1 ×10-5M 만큼 적은 19-mer (서열 11, 도 24에서 표지된 19mer5)를 보유하는 세포는 19-mer 펩티드를 수용하지 않는 세포보다 유의하게 훨씬 높은 세포 밀도 (P > 0. 001)를 나타냈다.
본 발명은 피부 노화 작용을 중화시키고 상처 치유를 촉진시키는 데 유용한 매트릭스 메탈로프로테이나제 저해제를 제공한다. 일반적으로, 본 발명의 저해제및 조성물은 상처 치유를 촉진시키고, 흉터를 방지하고, 피부 색조를 향상시키고, 주름을 감소시키며, 매끄럽고 건강한 피부의 발생을 자극한다.
매트릭스 메탈로프로테이나제는 불활성 전구효소로서 생체내에서 생성된다. 전구효소의 단백질분해성 절단은 성숙 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성화 및 형성을 야기한다. 절단된 펩티드 서열은 단백질의 극단의 아미노 말단에서 발견되는 아미노산 약 100개 내지 110개 길이의 전구효소 리더 서열이다. 본 발명에 따르면, 이들 전구효소 리더 펩티드는 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성 부위를 차단하고 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해할 수 있다. 매트릭스 메탈로프로테이나제 전구효소 리더 펩티드의 투여는 세포외 매트릭스의 파괴 속도를 늦추며, 상처 치유 속도를 보다 빠르게 한다.
대부분의 저해 기법은 매트릭스 메탈로프로테이나제의 효소 활성을 유기 소분자로 억제하는 것을 포함한다. 이들 화합물은 종종 신체에 독성이고 천연 발생 분자가 아니다. 활성화된 매트릭스 메탈로프로테이나제를 억제하기 위한 천연 펩티드의 사용은 독성 부작용 없이 고도의 프로테이나제 제어를 제공한다. 소분자 억제 기법과 달리, 본 발명의 펩티드는 개별 또는 모든 매트릭스 메탈로프로테이나제 종류의 활성화를 동시에 저해하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 피부 또는 상처 부위에 자유롭게 도입하거나, 피부 커버링 또는 상처 드레싱에 적용시키거나 또는 이들에 의해 전달할 수 있다.
본 발명은 만성 상처를 치유하고 노화 작용을 줄이기 위해 프로테이나제 활성 수준을 고도로 제어한다. 예를 들어, 일정량의 프로테이나제 수준이 만성 상처의 치유 동안 필요하기 때문에 [Agren et al., 1999], 당업자라면 프로테이나제 활성을 단지 부분적으로만 저해하도록 선택할 수 있다. 적용되는 저해제 펩티드의 유형 및 양을 조절함으로써 매트릭스 메탈로프로테이나제 저해 정도를 조절할 수 있다.
펩티드
본 발명에 따라, 절단 부위의 영역에서 매트릭스 메탈로프로테이나제 전구효소 리더와 관련된 서열을 갖는 펩티드는 상처를 치유하고 건강한 피부의 발생을 촉진시키는 데 유용하다. 이러한 펩티드는 많은 유형의 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해하며, 섬유아세포 및 각질세포의 세포 성장 및 이동을 촉진시킨다.
매트릭스 메탈로프로테이나제 전구효소 리더가 절단되는 위치는 전구효소 아미노산 서열의 대략 110번 아미노산 위치이다. 본 발명의 펩티드 저해제는 전구효소 아미노산 70번 위치 내지 대략 아미노산 120번 위치 내의 임의의 영역과 관련된 서열을 보유한다. 이러한 펩티드는 다수 유형의 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해할 것이다. 본 발명의 펩티드는 또한 전구효소 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성화를 억제할 뿐만 아니라, 성숙 매트릭스 메탈로프로테이나제의 효소 활성을 억제할 수 있다. 각종 매트릭스 메탈로프로테이나제에서 보다 보존적인 서열, 예를 들어 절단 영역의 N-말단측 방향의 서열을 함유하는 펩티드를 사용하여, 각종 매트릭스 메탈로프로테이나제에 대해 일반적으로 유효한 저해제를 제공할 수 있다. 그러나, 보다 덜 보존적인 서열, 예를 들어 절단 영역의 C-말단측 방향의서열을 함유하는 펩티드를 사용하여, 개별 매트릭스 메탈로프로테이나제에 특이적인 저해제를 제공할 수 있다.
따라서, 매트릭스 메탈로프로테이나제의 저해제로서의 매트릭스 메탈로프로테이나제의 임의의 전구효소 리더 영역으로부터의 서열을 보유하는 펩티드 뿐만 아니라, 매트릭스 메탈로프로테이나제내에 자연적으로 존재하는 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환된 변이체 펩티드가 본 발명에 의해 고려된다. 상이한 서열을 보유하는 펩티드의 혼합물이 또한 고려된다.
일반적으로, 펩티드, 펩티드 변이체, 펩티드 유도체, 및 이들 펩티드의 혼합물을, 상처 치유, 피부 재생을 최적화하거나, 흉터를 방지하거나 또는 주름을 제거 또는 방지하는 방식으로 제조하여 사용한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 제제는 치유 및 노화 방지가 촉진되는 한 보다 낮거나 보다 높은 수준의 저해가 달성되도록 변형시킬 수 있다.
펩티드 저해제의 크기는 변화시킬 수 있다. 일반적으로, 단지 약 5개의 아미노산의 펩티드는 너무 작아 최적의 저해를 제공할 수 없다. 그러나, 약 8개 내지 9개보다 많은 아미노산의 펩티드는 저해를 제공하기에 충분히 길다. 따라서, 전체 길이가 중요한 것은 아니지만, 본 발명에는 흔히 아미노산 8개보다 더 긴 펩티드가 사용된다. 본 발명에 사용되는 다른 펩티드는 아미노산 9개보다 더 길다. 본 발명에 사용되는 또 다른 펩티드는 아미노산 9개보다 더 길다. 본 발명에 사용되는 또 다른 펩티드는 아미노산 10개 보다 더 길다. 또한, 아미노산 약 15개보다 더 긴 펩티드가 본 발명에서 사용된다. 펩티드 크기에 대한 특정한 상한은 없다.그러나, 일반적으로 보다 긴 펩티드보다 보다 짧은 펩티드를 제조하는 것이 저렴하다. 따라서, 본 발명의 펩티드 저해제는 일반적으로 약 100개 아미노산보다 짧다. 본 발명에 사용되는 많은 펩티드 저해제는 아미노산 약 50개보다 짧다. 본 발명에 사용되는 다른 펩티드 저해제는 아미노산 약 30개보다 더 짧다. 또한, 아미노산 약 25개보다 더 짧은 펩티드가 사용될 수도 있다. 유사하게, 아미노산 약 23개보다 더 짧은 펩티드가 본 발명에 사용되기도 한다. 본 발명을 실시하는 데 유용한 펩티드의 예는 아미노산 19개를 갖는 서열 11을 포함한다.
전구효소의 약 70번 아미노산 위치 내지 약 120번 아미노산 위치의 여러 대표적인 매트릭스 메탈로프로테이나제의 서열은 하기 표 1에 제공된다.
표 1에 기재된 펩티드 및 서열 1, 11, 12 및 13의 펩티드 각각이 본 발명의 펩티드 저해제로서 고려된다. 또한, 서열 1 내지 13 중 하나를 포함하는 펩티드의 펩티드 변이체 및 유도체가 또한 펩티드 저해제로서 유용하다. 이러한 펩티드 변이체 및 유도체는 당해 펩티드 변이체 및 유도체가 매트릭스 메탈로프로테이나제를 저해할 수 있는 한 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 다른 변형을 보유할 수 있다.
단리된 펩티드의 아미노산 잔기는 유전자 코딩된 L-아미노산, 천연 발생 비-유전자 코딩된 L-아미노산, 합성 L-아미노산 또는 상기한 것들 중 하나의 D-거울상이성질체일 수 있다. 20개의 유전자 코딩된 L-아미노산 및 통상의 비코딩된 아미노산에 대해 본원에 사용된 아미노산 표기법은 통상적이며, 표 2에 제시되어 있다.
본 발명의 범주 내에 포함되는 펩티드는 이들 변이체 또는 유도체 펩티드가 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해하거나, 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 성장을 자극하거나 또는 섬유아세포의 세포 이동을 자극하는 능력을 보유하는 한 유사한 화학적 및(또는) 물리적 특성의 아미노산으로 치환된 하나 이상의 아미노산을 보유할 수 있다.
서로에 대해 치환가능한 아미노산은 일반적으로 유사한 군 또는 하위군내에 존재한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 아미노산은 3개의 주요 군으로 분류할 수 있다: 주로 아미노산 측쇄의 특성에 따라 친수성 아미노산, 소수성 아미노산 및 시스테인-유사 아미노산. 이들 주요 군은 하위군으로 추가로 분류할 수 있다. 친수성 아미노산은 산성, 염기성 또는 극성 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하고, 소수성 아미노산은 방향족 또는 비극성 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다. 비극성 아미노산은 특히 지방족 아미노산을 포함하는 것으로 추가로 세분할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 아미노산의 종류의 정의는 다음과 같다:
"소수성 아미노산"은 생리적 pH에서 하전되지 않으며 수용액에 의해 반발되는 측쇄를 갖는 아미노산을 의미한다. 유전자 코딩된 소수성 아미노산의 예는 Ile, Leu 및 Val을 포함한다. 비-유전자 코딩된 소수성 아미노산의 예는 t-BuA를 포함한다.
"방향족 아미노산"은 공액결합된 π-전자계를 보유하는 하나 이상의 환을 함유하는 측쇄 (방향족 기)를 보유하는 소수성 아미노산을 의미한다. 방향족 기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 히드록실, 술포닐, 니트로 및 아미노 기 등과 같은 치환기로 추가로 치환될 수 있다. 유전자 코딩된 방향족 아미노산의 예는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판을 포함한다. 통상적으로 직면하는 비-유전자 코딩된 방향족 아미노산은 페닐글리신, 2-나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다.
"비극성 아미노산"은 생리적 pH에서 하전되지 않고 극성이 아닌 측쇄를 갖는 소수성 아미노산을 의미한다. 유전자 코딩된 비극성 아미노산의 예는 글리신, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 비코딩된 비극성 아미노산은 Cha를 포함한다.
"지방족 아미노산"은 포화 또는 불포화 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 탄화수소 측쇄를 갖는 비극성 아미노산을 의미한다. 유전자 코딩된 지방족 아미노산의 예는 Ala, Leu, Val 및 Ile를 포함한다. 비코딩된 지방족 아미노산의 예는 Nle를 포함한다.
"친수성 아미노산"은 수용액에 의해 유인되는 측쇄를 갖는 아미노산을 의미한다. 유전자 코딩된 친수성 아미노산의 예는 Ser 및 Lys를 포함한다. 비코딩된 친수성 아미노산의 예는 Cit 및 hCys를 포함한다.
"산성 아미노산"은 pK 값이 7 미만인 측쇄를 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 산성 아미노산은 전형적으로 수소 이온의 손실로 인해 생리적 pH에서 음으로 하전된 측쇄를 갖는다. 유전자 코딩된 산성 아미노산의 예는 아스파라긴산 (아스파르테이트) 및 글루탐산 (글루타메이트)을 포함한다.
"염기성 아미노산"은 측쇄의 pK 값이 7보다 큰 친수성 아미노산을 의미한다. 염기성 아미노산은 통상적으로 히드로늄 이온과의 결합으로 인해 생리적 pH에서 양으로 하전된 측쇄를 갖는다. 유전자 코딩된 염기성 아미노산의 예는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 비-유전자 코딩된 염기성 아미노산의 예는 비-시클릭 아미노산인 오르니틴, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산 및 호모아르기닌을 포함한다.
"극성 아미노산"은 생리적 pH에서 하전되지 않은 측쇄를 보유하지만, 2개의 원자에 의해 공유되는 전자쌍이 원자 중 하나에 의해 보다 밀접하게 보유되는 결합을 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 유전자 코딩된 극성 아미노산의 예는 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 비-유전자 코딩된 극성 아미노산의 예는 시트룰린, N-아세틸 리신 및 메티오닌 술폭시드를 포함한다.
"시스테인-유사 아미노산"은 또 다른 아미노산 잔기의 측쇄와 공유 결합, 예를 들어 디술피드 결합을 형성할 수 있는 측쇄를 갖는 아미노산을 의미한다. 전형적으로, 시스테인-유사 아미노산은 일반적으로 하나 이상의 티올 (SH) 기를 함유하는 측쇄를 갖는다. 유전자 코딩된 시스테인-유사 아미노산의 예는 시스테인을 포함한다. 비-유전자 코딩된 시스테인-유사 아미노산의 예는 호모시스테인 및 페니실라민을 포함한다.
당업자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 상기 분류는 절대적이지 않다. 수개의 아미노산은 하나 이상의 특성을 나타내고, 따라서 하나 이상의 카테고리에 포함될 수 있다. 예를 들어, 티로신은 방향족 환 및 극성 히드록실 기를 모두 갖는다. 따라서, 티로신은 이중 특성을 보유하며 방향족 및 극성 카테고리 둘 다에 포함될 수 있다. 유사하게는, 시스테인은 디술피드 결합을 형성할 수 있는 것 이외에 비극성 특성을 보유한다. 따라서, 소수성 또는 비극성 아미노산으로 엄격하게 분류되는 것은 아니지만, 많은 경우에서 시스테인은 펩티드에 소수성을 부여하기 위해 사용할 수 있다.
유전자 코딩되지 않고 본 발명의 펩티드 및 펩티드 유사체에서 존재하거나 아미노산을 치환할 수 있는 특정의 통상적으로 직면하는 아미노산은 비제한적으로 β-알라닌 (b-Ala) 및 기타 오메가-아미노산, 예를 들어 3-아미노프로피온산 (Dap), 2,3-디아미노프로피온산 (Dpr), 4-아미노부티르산 등; α-아미노이소부티르산 (Aib); ε-아미노헥산산 (Aha); δ-아미노발레르산 (Ava); 메틸글리신 (MeGly); 오르니틴 (Orn); 시트룰린 (Cit); t-부틸알라닌 (t-BuA); t-부틸글리신 (t-BuG); N-메틸이소루이신 (MeIle), 페닐글리신 (Phg); 시클로헥실알라닌 (Cha); 노르루이신 (Nle); 2-나프틸알라닌 (2-Nal); 4-클로로페닐알라닌 (Phe(4-Cl)); 2-플루오로페닐알라닌 (Phe(2-F)); 3-플루오로페닐알라닌 (Phe(3-F)); 4-플루오로페닐알라닌 (Phe(4-F)); 페니실라민 (Pen); 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산 (Tic); β-2-티에닐알라닌 (Thi); 메티오닌 술폭시드 (MSO); 호모아르기닌 (hArg); N-아세틸 리신 (AcLys); 2,3-디아미노부티르산 (Dab); 2,3-디아미노부티르산 (Dbu); p-아미노페닐알라닌 (Phe(pNH2)); N-메틸 발린 (MeVal); 호모시스테인 (hCys) 및 호모세린 (hSer)을 포함한다. 이들 아미노산은 또한 상기 정의된 카테고리에 해당된다.
상기한 유전자 코딩된 아미노산 및 비코딩된 아미노산의 분류는 하기 표 3에 요약되어 있다. 표 3은 단지 예시 목적을 위한 것이지 본원에 기재된 펩티드 및 펩티드 유사체를 포함할 수 있는 아미노산 잔기의 전체 목록을 의미하지 않는 것으로 이해된다. 본원에 기재된 펩티드 및 펩티드 유사체를 제조하는데 유용한 다른 아미노산 잔기는 문헌 [참조예: Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Inc., 및 본원에 인용된 참고문헌]에서 찾아볼 수 있다. 본원에 구체적으로 언급되지 않은 아미노산은 구체적으로 확인된 아미노산에 비해 공지된 거동 및(또는) 그들의 특징적인 화학적 및(또는) 물리적 특성을 기초로 하여 상기한 카테고리로 편리하게 분류할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 펩티드 변이체가 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해하는 능력을 보유하는 한 변이체 또는 유도체 펩티드를 제조하기 위해 유사하게 분류된 아미노산에 의해 치환된 임의의 아미노산을 가질 수 있다.
한 실시양태에 있어서, 본 발명의 펩티드 저해제는 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 펩티드 중 임의의 하나를 포함한다.
<화학식 I>
<화학식 II>
<화학식 III>
상기 식에서,
Xaa1, Xaa4및 Xaa6은 개별적으로 각각 비극성 아미노산, 예를 들어 메티오닌, 글리신 또는 프롤린이고;
Xaa2는 염기성 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산이고;
Xaa3은 시스테인-유사 아미노산, 예를 들어 시스테인, 호모시스테인, 페니실라민 또는 β-메틸 시스테인이고;
Xaa5는 극성 또는 지방족 아미노산, 예를 들어 극성 아미노, 예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산이고;
Xaa7은 산성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴산 또는 글루탐산이고;
Xaa8은 지방족 또는 극성 아미노산, 예를 들어 지방족 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, 메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신, 또는 α-아미노이소부티르산, 또는 극성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린이고;
Xaa9는 지방족, 비극성 또는 염기성 아미노산, 예를 들어 지방족 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산, 비극성 아미노산, 예를 들어 메티오닌, 글리신 또는 프롤린, 또는 염기성 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산이고;
Xaa10은 극성, 산성, 염기성 또는 비극성 아미노산, 예를 들어 극성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 산성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴산 또는 글루탐산, 염기성 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산, 또는 비극성 아미노산, 예를 들어 메티오닌, 글리신 또는 프롤린이고;
Xaa11은 극성 또는 방향족 아미노산, 예를 들어 극성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 방향족 아미노산, 예를 들어 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐알라닌이고;
Xaa12는 극성, 염기성, 지방족 또는 비극성 아미노산, 예를 들어 극성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 염기성 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산, 또는 비극성 아미노산, 예를 들어 메티오닌, 글리신 또는 프롤린이고;
Xaa13은 방향족, 지방족, 극성 또는 산성 아미노산, 예를 들어 방향족 아미노산, 예를 들어 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐알라닌, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산, 또는 극성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 산성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴산 또는 글루탐산이고;
Xaa14는 방향족, 비극성 또는 극성 아미노산, 예를 들어 방향족 아미노산, 예를 들어 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐 알라닌, 또는 비극성 아미노산, 예를 들어 메티오닌, 글리신 또는 프롤린, 또는 극성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린이고;
Xaa15는 비극성 또는 산성 아미노산, 예를 들어 비극성 아미노산, 예를 들어 메티오닌, 글리신 또는 프롤린, 또는 산성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴산 또는 글루탐산이고;
Xaa16은 염기성, 극성 또는 비극성 아미노산, 예를 들어 염기성 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산; 또는 극성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 비극성 아미노산, 예를 들어 메티오닌, 글리신 또는 프롤린이고;
Xaa17은 염기성, 극성, 지방족, 비극성 또는 산성 아미노산, 예를 들어 염기성 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산, 또는 극성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산, 또는 비극성 아미노산, 예를 들어 메티오닌, 글리신 또는 프롤린, 산성 아미노산, 예를 들어 아스파라긴산 또는 글루탐산이고;
Xaa18은 비극성 또는 지방족 아미노산, 예를 들어 비극성 아미노산, 예를 들어 메티오닌, 글리신 또는 프롤린, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산이고;
Xaa19는 염기성 또는 지방족 아미노산, 예를 들어 염기성 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, β-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, 3-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산이다.
특정한 실시양태에 있어서:
Xaa1은 프롤린이고,
Xaa2는 아르기닌이고,
Xaa3은 시스테인이고,
Xaa4는 글리신이고,
Xaa5는 발린 또는 아스파라긴이고,
Xaa6은 프롤린이고,
Xaa7은 아스파라긴산이고,
Xaa8은 발린, 루이신, 또는 세린이고,
Xaa9는 알라닌, 글리신 또는 히스티딘이고,
Xaa10은 아스파라긴, 아스파라긴산, 히스티딘, 아르기닌, 글루타민 또는 글리신이고,
Xaa11은 티로신 또는 페닐알라닌이고,
Xaa12는 아스파라긴, 세린, 아르기닌, 글루타민, 발린 또는 메티오닌이고,
Xaa13은 페닐알라닌, 발린, 루이신, 쓰레오닌, 세린, 또는 글루탐산이고,
Xaa14는 페닐알라닌, 메티오닌 또는 쓰레오닌이고,
Xaa15는 프롤린 또는 글루탐산이고,
Xaa16은 아르기닌, 아스파라긴 또는 글리신이고,
Xaa17은 리신, 쓰레오닌, 세린, 이소루이신, 메티오닌, 글리신, 아스파라긴산 또는 아스파라긴이고,
Xaa18은 프롤린 또는 루이신이고,
Xaa19는 리신, 발린 또는 아르기닌이다.
본 발명의 바람직한 펩티드는 또한 서열 1 내지 13에 의해 정의된 서열을 포함한다. 예를 들어, 서열 11 (PRCGNPDVANYNFFPRKPK)의 19개 아미노산 펩티드가 바람직하다. 이 펩티드 (서열 11)는 MMP-2의 절단 부위에 걸친다. 서열 11 펩티드의 절반을 나타내는 2개의 보다 작은 펩티드 (PRCGNPDVA (서열 12) 및 NYNFFPRKPK (서열 13))이 또한 바람직한 펩티드이다. 모든 3개의 펩티드는 MMP-9 활성 및 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제 효소를 다양한 정도로 저해한다.
매트릭스 메탈로프로테이나제 절단 영역의 서열과 동일한 서열을 갖는 단일펩티드를 사용하여, 단일 또는 단지 수개의 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해할 수 있다. 이러한 단일 펩티드의 제제는 하나 이상, 그러나 일반적으로 모두는 아닌 매트릭스 메탈로프로테이나제를 저해할 것이다. 이러한 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성의 부분적인 저해는 치유를 촉진할 수 있다. 달리, 2개 이상의 펩티드를 조합하여 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성의 보다 완전한 저해를 제공할 수 있는 2개 이상의 매트릭스 메탈로프로테이나제를 표적화할 수 있다.
당업자는 본원에 제공된 교시와 함께 입수가능한 교시를 이용하여 억제의 목적하는 질 및 양을 달성하기 위해 적합한 펩티드 저해제 또는 펩티드 저해제들의 조합물을 고안할 수 있다. 억제의 "질"은 저해되는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 유형을 의미한다. 상이한 매트릭스 메탈로프로테이나제는 다소 상이한 기질 및 활성 부위를 보유할 수 있다. 억제의 "양"은 모든 매트릭스 메탈로프로테이나제로부터의 전체적인 저해량을 의미한다. 사용되는 펩티드 저해제의 유형 및 양을 조절함으로써, 저해의 질 및 양을 조절할 수 있다. 당업자는 용이하게 본 발명에 의해 제공된 펩티드를 변형시키고 제공된 매트릭스 메탈로프로테이나제가 저해되는 유형 및 정도를 관찰할 수 있다.
예를 들어, 당업자는 도 1에 제시된 펩티드 서열을 비교하고 정렬하고 목적하는 저해의 질 및 양을 달성하도록 펩티드 저해제를 고안할 수 있다. 예로써 제공된 한 실시양태에서, 3개의 상처 부위 매트릭스 메탈로프로테이나제, mmp2, mmp9 및 mmp1에 대한 정렬된 아미노산 서열을 비교하여, 서열에서의 상동 영역 및 변이영역을 확인한다.
이들 서열 정렬에 있어서, 굵은 글씨는 MMP-2 또는 MMP-9에서는 발견되지 않으며 MMP-1에서 발견되는 아미노산을 나타내고, 밑줄은 MMP-1에서 및 단지 MMP-2 또는 MMP-9에서만 발견되는 아미노산을 나타낸다.
한 실시양태에 있어서, 만성 상처를 치유하기 위해서는 MMP-2 및 9를 저해하되 비교적 비조절된 MMP-1의 수준을 유지하는 것이 바람직하다. 상기한 서열 정렬을 기초로 하여, 당업자는 MMP2 및 MMP9 전구효소 서열에서는 발견되지만 MMP1 전구효소 서열에서는 발견되지 않는 아미노산을 갖는 펩티드를 고안하여, MMP-2 및 9를 저해하되 MMP-1은 저해하지 않는 펩티드를 제조할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학식 IV에 의해 제공된다.
<화학식 IV>
(서열 18)
상기 식에서,
Xaaa는 프롤린이고; Xaab는 글루타민 또는 글루탐산이고; Xaac는 쓰레오닌이고; Xaad는 글리신이고; Xaae는 아스파라긴산 또는 글루탐산이고; Xaaf는 루이신이고; Xaag는 아스파라긴산이고; Xaah는 글루타민 또는 세린이고; Xaai는 아스파라긴 또는 알라닌이고; Xaaj는 쓰레오닌이고; Xaak는 이소루이신 또는 루이신, 바람직하게는 이소루이신이고; XaaL은 글루탐산 또는 리신, 바람직하게는 글루탐산이고; Xaam은 쓰레오닌 또는 알라닌이고; Xaan은 메티오닌이고; Xaao는 아르기닌이며; Xaap는 리신 또는 쓰레오닌이고;
Xaa1은 프롤린이고; Xaa2는 아르기닌이고; Xaa3은 시스테인이고; Xaa4는 글리신이고; Xaa5는 발린 또는 아스파라긴, 바람직하게는 아스파라긴이고; Xaa6은 프롤린이고; Xaa7은 아스파라긴산이고; Xaa8은 발린 또는 루이신, 바람직하게는 루이신이고; Xaa9는 알라닌 또는 글리신, 바람직하게는 글리신이고; Xaa10은 아스파라긴 또는 아르기닌이고; Xaa11은 티로신 또는 페닐알라닌, 바람직하게는 티로신이고; Xaa12는 아스파라긴 또는 글루타민이고; Xaa13은 페닐알라닌 또는 쓰레오닌이고; Xaa14는 페닐알라닌이고; Xaa15는 프롤린 또는 글루탐산, 바람직하게는 프롤린이고; Xaa16은 아르기닌 또는 글리신, 바람직하게는 아르기닌이고; Xaa17은 리신 또는 아스파라긴산이고; Xaa18은 프롤린 또는 루이신, 바람직하게는 루이신이며; Xaa19는 리신이다.
펩티드 변형
본 발명은 펩티드 저해제를 변형시켜 그들을 안정화시키고, 그들의 취입 및 흡수를 촉진시키고 당업자에게 공지된 펩티드의 임의의 다른 특징 또는 특성을 개선시키는 것을 고려한다. 예를 들어, 펩티드 저해제를 고리화시킬 수 있고, 펩티드 저해제 상의 전하를 중성화시킬 수 있고, 펩티드를 다른 화학적 잔기에 결합시킬 수 있다.
펩티드를 당업자가 이용가능한 임의의 방법에 의해 고리화시킬 수 있다. 예를 들어, N-말단부 및 C-말단부를 공지된 방법에 의해 축합시켜 펩티드 결합을 형성시킬 수 있다. 펩티드내의 아미노산의 측쇄에 존재하는 관능기를 또한 연결하여 본 발명의 펩티드를 고리화시킬 수 있다. 예를 들어, 공유 결합을 형성할 수 있는 관능 기는 -COOH와 -OH; -COOH와 -NH2; 및 -COOH와 -SH를 포함한다. 펩티드를 고리화시키는데 사용할 수 있는 아미노산의 쌍은 Asp와 Lys; Glu와 Lys; Asp와 Arg; Glu와 Arg; Asp와 Ser; Glu와 Ser; Asp와 Thr; Glu와 Thr; Asp와 Cys; 및 Glu와 Cys를 포함한다. 다른 아미노산 잔기와 공유 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기의 다른 예는 시스테인-유사 아미노산, 예를 들어 Cys, hCys, β-메틸-Cys 및 Pen을 포함하고, 이들은 다른 아미노산과 디술피드 가교를 형성할 수 있다. 바람직한 시스테인-유사 아미노산 잔기는 Cys 및 Pen을 포함한다. 펩티드의 고리화에 사용할 수 있는 아미노산의 다른 쌍은 당업자에게 자명할 것이다.
펩티드를 고리화시키는데 사용되는 기는 아미노산일 필요는 없다. 펩티드의아미노 말단과 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기의 예는 카르복실산 및 에스테르를 포함한다. 펩티드의 카르복실 말단과 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기의 예는 -OH, -SH, -NH2및 -NHR (여기서, R은 (C1-C6) 알킬, (C1-C6) 알케닐 및 (C1-C6) 알키닐임)을 포함한다.
상기 상호결합을 형성하기에 적합한 관능기를 갖는 2개의 측쇄 사이의 각종 반응 뿐만 아니라 상기 상호결합을 형성하는데 적합한 반응 조건은 당업자에게 자명할 것이다. 펩티드를 고리화시키는데 사용되는 바람직한 반응 조건은 일반적으로 펩티드를 분해하거나 달리 손상시키지 않을 정도로 충분히 온화하다. 경우에 따라 각종 관능성을 보호하기에 적합한 기가 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 [참조예: Greene & Wuts, 1991, 2nd ed., John Wiley & Sons, NY], 이러한 보호된 분자를 제조하기 위한 각종 반응식도 마찬가지이다.
한 실시양태에 있어서, N-말단부 및 C-말단부에서의 전하는 효과적으로 제거된다. 이는 당업자가 이용가능한 임의의 방법에 의해, 예를 들어 N-말단을 아세틸화시키고 C-말단을 아미드화시킴으로써 수행할 수 있다.
시클릭 펩티드를 제조하고 다른 방법으로 펩티드를 변형시키는 방법이 당해 분야에 익히 공지되어 있다 [참조예: 전반적 개관용- Spatola, 1983, Vega Data 1(3); Spatola, 1983, "Peptide Backbone Modification" In: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins (Weinstein, ed.), Marcel Dekker, New York, p. 267 (전반적 개관용); Morley, 1980, Trends Pharm. Sci.1:463-468; Hudson et al., 1979, Int. J. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2NH-, -CH2CH2-); Spatola et al., 1986, Life Sci. 38:1243-1249 (-CH2-S); Hann, 1982, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1:307-314 (-CH=CH-, 시스 및 트랜스); Almquist et al., 1980, J. Med. Chem. 23:1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White et al., Tetrahedron. Lett. 23:2533 (-COCH2-); 유럽 특허원 EP 45665 (1982) CA:97:39405 (-CH(OH)CH2-); Holladay et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-); 및 Hruby, 1982, Life Sci. 31:189-199 (-CH2-S-)].
상처 치유 및 노화 방지
본 발명의 펩티드는 상처를 치유하고 피부 노화 작용을 개선시키는 데 사용될 수 있으며, 만성 상처 치유에 있어서 특히 유리하다. 각 펩티드, 펩티드 변이체, 펩티드 유도체 및 이들의 혼합물 (예, 상이한 서열들을 포함하는 것들)을 제제로 조합하여 상처 치유를 촉진시키고, 노화와 관련된 피부 문제를 예방하거나 치료할 수 있다. 최적의 치유 및 피부 재생은 어떤 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성을 필요로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 제제가 반드시 매트릭스 메탈로프로테이나제의 최대 유도를 촉진시키는 것은 아니다. 대신, 펩티드 저해제 제제의 활성을 필요에 따라 변화시켜 치유를 최적화하고 건강한 피부 발생을 촉진시킨다. 치유 및 건강한 피부 발생이 촉진되도록 저해제 펩티드의 유형, 함량 및 양을 변화시킴으로써 더 낮거나 더 높은 저해 수준을 달성할 수 있다.
건강한 피부의 발생을 촉진시키고(시키거나) 상처를 치료하기 위해, 본 발명의 펩티드를 당업자에 의해 선택되는 임의의 방식으로 피부 또는 상처에 도입한다. 예를 들어, 펩티드는 치료 유효량의 1종 이상의 펩티드 및 제약상 담체를 포함하는 치료 조성물로 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 크림제, 스프레이제, 포말제, 겔제 또는 임의의 다른 투여 형태로 피부 또는 상처에 도입될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 커버링 또는 드레싱 재료로 함침되거나, 공유 부착되거나 또는 연결된 치료 유효량의 1종 이상의 펩티드를 포함하는 피부 커버링 또는 드레싱으로 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, 피부 커버링 또는 드레싱은 펩티드 저해제의 방출을 허용한다. 본 발명의 펩티드 저해제는 조절되지 않은 방식 또는 조절된 방식으로 방출될 수 있다. 따라서, 본 발명의 피부 커버링 또는 상처 드레싱은 펩티드 저해제를 상처 부위로 느리게 또는 일정하게 방출시킨다. 피부 커버링 및 드레싱 재료는 붕대, 거즈, 무균 포장재료, 하이드로겔, 하이드로콜로이드 및 유사 재료를 비롯한, 당업계에서 사용되는 임의의 물질일 수 있다.
본 발명의 펩티드의 치료 유효량은 매트릭스 메탈로프로테이나제를, 건강한 피부 발생 및(또는) 상처 치유를 촉진시키는 데 필요한 정도로 저해하는 펩티드의 양이다. 예를 들어, 치료 또는 약제 조성물 중에 존재하는 경우, 본 발명의 펩티드의 양은 조성물의 약 0.001 중량％ 내지 약 35 중량％ 범위일 수 있다. 펩티드는 조성물의 약 0.5 중량％ 내지 약 20 중량％를 차지할 수 있다. 또는, 펩티드는 조성물의 약 1.0 중량％ 내지 약 10 중량％를 차지한다. 펩티드 저해제의 치료 유효량은 물론 투여 경로에 따라 달라진다. 예를 들어, 정맥내 투여의 경우 체중 kg당 30 ㎍ 내지 112,000 ㎍의 치료량이 효과적일 수 있다. 그러나, 건강한 피부 발생 또는 상처 치료에 필요한 펩티드 저해제의 양은 투여 경로뿐만 아니라, 치료될 증상의 특성, 환자의 연령 및 증상에 따라 달라질 것이며, 결국 주치의 또는 임상의에 의해 고려될 것이다.
투여량 및 투여 방법은 치료될 피부 또는 조직의 위치 및(또는) 상처의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 펩티드 및 펩티드 컨쥬게이트의 유용한 투여량은 이들의 시험관내 활성과 본원에 기술된 동물 모델에서의 생체내 활성을 상호관련시킴으로써 결정할 수 있다. 상기 화합물은 단위 투여 형태 당 펩티드 약 0.001 ㎍ 내지 약 10 mg, 유리하게는 약 0.01 ㎍ 내지 약 5 mg, 보다 유리하게는 약 0.10 ㎍ 내지 약 1 mg, 훨씬 더 유리하게는 약 1.0 ㎍ 내지 500 ㎍을 포함하는 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 바람직한 투여량은 단일 투여, 분할 투여 또는 연속 주입으로 제공될 수 있다. 또한, 원하는 투여량을 적절한 간격, 예를 들어 하루에 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 분할 투여로 투여할 수도 있다. 당업자라면 본원에 제공된 교시를 이용하는 이용가능한 정보로부터 효과적인 제제를 쉽게 제조 및 투여할 수 있다.
본 발명의 펩티드 저해제는 제약 조성물로 제제화시켜 포유동물 숙주, 예를 들어 인간 환자에게 선택된 투여 경로, 즉 경구 또는 비경구, 정맥내, 근육내, 국소적 또는 피하 경로에 적합한 다양한 투여 형태로 투여할 수 있다.
따라서, 본 발명의 펩티드 저해제는 전신 투여, 예를 들어 주입 또는 주사에 의해 정맥내 또는 복강내 투여될 수 있다. 펩티드 저해제 용액은 수중에서 임의로무독성 계면활성제와 혼합하여 제조할 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴, 및 이들의 혼합물 및 오일 중에서 제조할 수도 있다. 통상의 저장 및 사용 조건하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하는 예방제를 포함한다.
주사, 주입 또는 국소 도포에 적합한 약제 투여 형태로는 무균 수용액제 또는 수분산액제, 또는 무균 주사용 또는 주입용 용액제 또는 분산액제의 즉석 제조에 적합한, 임의로 리포좀내에 캡슐화된 활성 성분을 포함하는 무균 분말제가 포함될 수 있다. 모든 경우에서, 최종적인 투여 형태는 무균적이고, 유동성이며, 제조 및 저장 조건하에 안정해야 한다. 액상 담체 또는 비히클은 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성유, 무독성 글리세릴 에스테르 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 리포좀을 형성하거나, 분산액의 경우 소정의 입도를 유지하거나 또는 계면활성제를 사용하여 유지할 수 있다. 미생물의 작용은 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 및 티메로살 등에 의해 방지할 수 있다. 어떤 경우, 당업자는 등장성 물질, 예를 들어 슈가, 완충제 또는 염화 나트륨을 포함시키는 선택을 할 수 있다. 주사용 조성물의 흡수는 조성물 중에 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 지연시킬 수 있다.
무균 주사용 용액제는 필요한 양의 펩티드 또는 펩티드 컨쥬게이트를 상기 언급한 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 후, 필요에 따라 여과멸균하여 제조한다. 무균 주사용 용액제의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이며, 이러한 기술에 의해 활성 성분에 더하여 상기 무균 여과 용액제 중에 존재하는 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 얻는다.
어떤 경우, 본 발명의 펩티드 저해제를 또한 제약상 허용되는 비히클, 예를 들어 불활성 희석제 또는 흡수가능한 식용 담체와의 조합으로 경구 투여할 수도 있다. 본 발명의 펩티드 저해제를 경질 또는 연질 쉘 (shell)의 젤라틴 캅셀내에 넣거나, 정제로 압착하거나 또는 환자의 규정식 음식물에 직접 포함시킬 수 있다. 경구 치료 투여의 경우, 펩티드 저해제는 1종 이상의 부형제와 조합되어 섭취가능한 정제, 구강용 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭서제, 현탁액제, 시럽제 및 웨이퍼제 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 활성 화합물을 0.1％ 이상 포함한다. 물론, 조성물 및 제제의 비율(％)은 달라질 수 있으며, 주어진 단위 투여 형태의 중량의 약 2％ 내지 약 60％인 것이 편리할 수 있다. 치료적으로 유용한 상기 조성물 중 활성 화합물의 양은 효과적인 투여 수준이 달성되는 양이다.
또한, 정제, 트로키제, 환제 및 캡슐제 등은 트라가칸쓰 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴 등의 결합제; 디칼슘 포스페이트 등의 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분 및 알긴산 등의 붕해제; 스테아르산 마그네슘 등의 윤활제; 및 수크로스, 프룩토스, 락토스 또는 아스파탐 등의 감미제를 포함할 수도 있으며, 박하, 윈터그린 오일 또는 체리향이 첨가될 수도 있다. 단위 투여 형태가 캡슐제인 경우,이 단위 투여 형태는 상기 유형의 물질 이외에도 액상 담체, 예를 들어 식물성유 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 기타 다양한 물질이 코팅으로 존재하거나, 또는 제공되어 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐제를 젤라틴, 왁스, 셸락 (shellac) 또는 슈가 등으로 코팅할 수 있다. 시럽제 또는 엘릭서제는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스 또는 프룩토스, 보존제로서 메틸 및 프로필 파라벤, 염료 및 체리향 또는 오렌지향 등의 향미제를 포함할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태를 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 제약상 허용되는 것이어야 하며 사용된 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 펩티드 저해제는 지속-방출형 제제 및 장치내에 혼입될 수 있다.
유용한 고상 담체로는 미분 고체, 예를 들어 탈크, 점토, 미세결정질 셀룰로스, 실리카 및 알루미나 등이 포함된다. 유용한 액상 담체로는 물, 알콜 또는 글리콜 또는 물-알콜/글리콜 혼합물을 들 수 있으며, 여기에 임의로 무독성 계면활성제를 사용하여 본 발명의 화합물을 유효 수준으로 용해 또는 분산시킬 수 있다. 보조제, 예를 들어 향 및 추가의 항균제를 첨가하여 주어진 용도를 위한 특성을 최적화할 수 있다.
또한, 증점제, 예를 들어 합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알콜, 개질된 셀룰로스 또는 개질된 광물 물질을 액상 담체와 함께 사용하여 사용자의 피부에 직접 사용되는, 도포가능한 페이스트, 겔, 연고 및 비누 등을 제조할 수도 있다.
일반적으로, 본 발명의 펩티드는 상처 치료 및 건강한 피부 발생의 촉진을 위해 국소 투여된다. 활성 펩티드는 분무제, 포말제, 분말제, 크림제, 젤리제, 페이스트제, 좌제 또는 용액제로 임의의 수단에 의해 선택된 조직에 직접 또는 간접적으로 국소 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 페이스트라는 용어는 크림제 및 기타 점성의 도포가능한 조성물을 포함하는 의미로 사용되어야 하며, 흔히 피부에 직접 적용되거나, 붕대 또는 드레싱에 도포된다. 본 발명의 펩티드는 피부 커버링 (covering) 또는 상처 드레싱 재료에 공유 부착되거나, 안정하게 흡수되거나 또는 도포될 수 있다. 수술 후 치유를 촉진시키기 위해, 본 발명의 활성 펩티드를 표적 조직 또는 인공보철 장치 또는 이식가능한 방출 조절 장치에 직접 이용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 다른 작용제들과 함께 또는 다른 작용제 없이 에어로졸, 포말제 또는 분무제로 피부 또는 상처에 직접 투여될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 왁스, 오일, 유화제 물, 및(또는) 물의 존재하에 겔을 형성하는 실질적으로 수-불용성인 물질 중 상기 펩티드의 에멀젼을 포함할 수 있는 제제로 투여될 수 있다. 이 제제는 도포할 수 있으며 에멀젼의 크림 농도를 갖지만, 겔이 에멀젼을 안정시키기 때문에 통상의 멸균 방법, 예를 들어 증기 멸균법으로 처리하는 경우에 분해되지 않는다는 점에서 바람직한 에멀젼 특성을 제공한다. 또한, 상기 제제는 물이 에멀젼 및 겔의 둘 다에 보유되기 때문에 통상의 겔보다 더 우수한 수분 보유 특성을 나타낸다.
또한, 상기 제제는 본 발명의 크림제 또는 로션제가 건조되는 속도를 늦추기 위해 크림제 또는 로션제 중 물의 증기 분압을 감소시키는 습윤제 (humectant)를포함할 수도 있다. 적합한 습윤제는 큰 수혼화성을 가지며, 일반적으로 피부에 적용하기에 적합하다. 폴리올은 이러한 목적에 특히 적합하며, 적합한 폴리올의 예로는 모노프로필렌 글리콜 또는 글리세린 (글리세롤)이 포함될 수 있다. 폴리올은 제제 전체 중에 20％ 내지 50％ (중량)의 비율로 존재할 수 있다. 또는, 상기 범위는 30％ 내지 40％이다. 또한, 이러한 비교적 높은 비율의 폴리올은, 상기 페이스트가 임의의 정도로 건조되는 경우, 글리세린이 중합체에 대한 가소제로서 작용할 수 있기 때문에 생성된 페이스트가 연성 및 가요성인 상태로 존재할 수 있도록 보장한다. 예를 들어, 페이스트를 붕대에 도포하는 경우, 페이스트가 수분을 상실했을 때, 그 결과 붕대를 절단하지 않아도 페이스트를 피부에서 쉽게 제거할 수 있다. 폴리올은 또한 피부 또는 상처, 특히 감염 상처와 접촉하는 경우에 페이스트 중 박테리아의 증식을 방지하는 작용을 하는 이점이 있다.
상기 제제는 기타 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 성분으로는 산화 아연, 이키타몰 (ichthammol), 칼라민, 은 술파디아진, 클로르헥시딘 아세테이트, 콜 타르, 클로르헥시딘 글루코네이트, 살리실산, 메트로니다졸 또는 다른 항박테리아제 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 또한, 크림제에 혼입하기에 적합한 다른 성분들이 존재할 수도 있다.
상기 성분들은 이로운 양으로 포함될 수 있고, 예를 들어 산화 아연이 약 15 중량％ 이하 첨가될 수 있으며; 통상적으로는 6％ 내지 10％의 산화 아연이 가능하게는 이키타몰 (0 중량％ 내지 3 중량％) 및(또는) 칼라민 (0 중량％ 내지 15 중량％) 등의 다른 성분과의 조합으로 사용된다. 이키타몰 또는 칼라민은 단독으로 사용될 수도 있다. 클로르헥시딘 아세테이트는 1 중량％ 이하의 농도로 사용될 수 있으며, 0.5 중량％가 통상적이다.
에멀젼에 사용되는 왁스의 한 예는 글리세릴 모노스테아레이트, 또는 크로다 유니버셜 리미티드 (Croda Universal Ltd.)사에서 상표명 CITHROL GMS/AS/NA로 시판되는, 글리세릴 모노스테아레이트와 PEG100 스테아레이트의 조합물이다. 이러한 조합물은 왁스 및 특히 왁스와 상용성인 유화제 (PEG100 스테아레이트) 둘 다를 제공하여 수중 에멀젼을 형성한다. 에멀젼의 안정성을 증가시키기 위해 제2 유화제, 예를 들어 크로다 유니버셜 리미티드 (Croda Universal Ltd.)사에서 제공하는 CITHROL 1 OMS와 같은 PEG20 스테아레이트를 제제 중에 포함시킬 수 있다. 크림제 중 유화제의 총 농도는 통상적으로 3％ 내지 15％의 범위이다. 2가지 유화제가 사용되는 경우, 한 유화제는 다른 유화제보다 훨씬 높은 농도로 존재할 수 있다.
수-불용성 물질은 제제 중의 물과 함께 겔을 형성한다. 따라서, 상기 물질은 친수성이지만, 물에 많은 정도로 용해되는 것은 아니다. 이 물질은 중합체 물질, 예를 들어 흡수성의 비-수용성 중합체일 수 있다. 그러나, 물과 함께 겔을 형성하며 승온에서 안정한 비-중합체 물질, 예컨대 점토, 예를 들어 카올린 또는 벤토나이트를 사용할 수도 있다. 본 발명에 사용되는 몇몇 중합체는 초흡수성 중합체, 예를 들어 WO-92/16245에 개시된 초흡수성 중합체이며, 부분적으로 가교결합되어 3차원 구조를 형성시킨 친수성 셀룰로스 유도체를 포함한다. 가교결합된 적합한 셀룰로스 유도체는 알킬기가 탄소 원자를 1개 내지 6개 포함하는 히드록시 저급 알킬 셀룰로스의 유도체, 예를 들어 히드록시에틸 셀룰로스 또는 히드록시프로필셀룰로스, 또는 카르복시-셀룰로스, 예를 들어 카르복시메틸 히드록시에틸 셀룰로스 또는 카르복시메틸 셀룰로스의 유도체를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 중합체의 예는 아크조 케미칼스 비.브이. (Akzo Chemicals B.V.)사에서 상표명 아쿠셀 (AKUCELL) X181로 제공하는 부분적으로 가교결합된 소듐 카르복시메틸셀룰로스 중합체이다. 이 중합체는 물을 그 자신의 중량에 비해 10배 이상 흡수할 수 있다는 점에서 초흡수성 중합체이다. 중합체의 가교결합 구조는 중합체가 수중에 용해되는 것을 방지하지만, 물은 중합체의 3차원 구조내에 쉽게 흡수 및 보유되어 겔을 형성한다. 물은 용액보다는 겔에서 더 느리게 상실되며, 이는 크림 제제의 건조를 늦추거나 방지하는 데 있어서 유리하다. 제제 중의 중합체 함량은 통상적으로 10％ 미만, 예를 들어 약 0.5 중량％ 내지 약 5.0 중량％의 범위 또는 약 1.0 중량％ 내지 약 2 중량％의 범위이다.
제제는 멸균할 수 있으며, 최종 생성물의 원하는 유동성을 제공하기 위해서는 제제의 성분을 중합체 함량에 따라 선택해야 한다. 즉, 생성물을 멸균해야 하는 경우, 멸균에 앞서 비교적 높은 점성/탄성의 생성물을 제공하는 제제를 선택해야 한다. 제제의 여러 성분을 멸균하지 않아도 되는 경우, 상기 성분을 첨가하지 전에 제제를 멸균할 수 있거나, 각 성분을 별도로 멸균할 수 있다. 이어서, 멸균 조건하에 멸균된 각 성분을 혼합함으로써 제제를 제조할 수 있다. 성분들을 별도로 멸균한 다음 함께 혼합하는 경우, 중합체 함량을 조절하여 원하는 유동성을 갖는 최종 생성물을 제공할 수 있다. 에멀젼 함량은 제제의 취급성 및 촉감을 결정하며, 에멀젼 함량이 높으면 도포성 및 크림 특성이 증가한다.
제제는 튜브, 조 (tub) 또는 기타 적합한 저장 용기 형태로 포장되거나, 기재상에 도포된 다음 포장될 수 있다. 적합한 기재로는 필름 드레싱을 비롯한 드레싱, 및 붕대가 포함된다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 이를 한정하기 위한 것은 아니다.
실시예 1: 펩티드 저해제
주 재료
모든 펩티드는 시그마 제노시스, 인크. (Sigma-Genosys, Inc.)사에 의해 합성된 것이다. 방출된 펩티드는 이 회사에 의해 RP-HPLC를 거쳐 95％ 초과의 균일도로 정제되었다. 용출된 피크의 물질을 푸울링하여 탈염시키고, 동결건조하였다. 질량 분광법 분석에 의해 펩티드의 분자량 및 순도를 확인하였다. 다른 언급이 없다면, 모든 화학물질은 시그마 케미컬 코포레이션 (Sigma Chemical Corp.)사 또는 플루카 케미컬 컴퍼니 (Fluka Chemical Co.)사로부터 구입하였다. 활성 MMP-9 효소는 칼바이오켐 (Calbiochem.)사로부터 구입하였다.
분자 모델링
분자 모델링에서는 2가지 시각화 프로그램, 즉 스위스 (Swiss) PDB 뷰어 (Viewer)(Guex and Peitsch, 1997) 및 라스몰 (Rasmol)(Sayle and Milner-White, 1995)을 이용하였다. 모델 연구는 컴팩 (Compaq) PC 운영체체인 윈도우즈 (Windows) 95, 및 실리콘 그래픽스, 인크. (Silicon Graphics, Inc.)사의 옥테인(Octane) UNIX 워크스테이션에서 수행하였다. 또한, 몰레큘라 시뮬레이션즈, 인크. (Molecular Simulations, Inc.)사의 세리우스2 (Cerius2) 분자 패키지를 상기 옥테인에서 이용하였다. 다음과 같은 3차원 구조 파일을 프로테인 데이타뱅크 (Protein Databank)로부터 다운로드하였다 (파일이름, 참고문헌): MMP-1 (1FBL, Li et al., 1995), MMP-2 (1GEN, Libson et al., 1995), MMP-8 (1JA0, 1JAN, Grams, et al., 1995; Reinemer et al., 1994), MMP-9 (1MMQ, Browner et al., 1995), TIMP-2/MT-1 MMP 복합체 (1BUV, Fernandez-Catalan et al., 1998), TIMP-2 (1BR9, Tuuttila et al., 1998), 및 TIMP-1/MMP 복합체 (1UEA, Gomis-Ruth et al., 1997; Huang et al., 1996; Becker et al., 1995). 상기 파일은 단백질의 3차원 구조를 분석하기 위해 사용되었으며, 1차 서열 데이타의 공급원이다.
저해 분석
2가지 효소 분석을 수행하였다. 제1 분석은 MMP-9에 의한 플루오레세인화 콜라겐의 효소 가수분해를 시간의 함수로 측정하였다. 5 μM 농도의 플루오레세인화 콜라겐 (Molecular Probes, Inc.)을 반응 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 mM NaN3)에 가하고, 스펙트로실 (Spectrosil) 석영 형광계 큐벳에 넣었다. 0.1 μM 농도의 MMP를 다양한 양의 펩티드와 혼합하고, 결합을 수행하기 위해 25 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이 단백질 혼합물을 콜라겐 기질에 가하고, 빠르게 혼합하였다. 520 nm에서의 형광 방출 강도를 쉬마드주 (Shimadzu) RF5301 형광계 (Lakowicz, 1983)에서 시간의 함수 (여기 파장 495nm)로 측정하였다. 상기 플루오레세인 방출 분석을 이용하여 문헌 [Segel (1993)]에 따라 하기 기울기를 갖는 딕슨 (Dixon) 그래프 (1/v 대 [I])에 의해 펩티드 저해제([I])의 저해 상수 (Ki)를 결정하였다:
기울기 = Km / (Vmax Ki [S])(1)
상기 식에서, Km은 미카엘리스 (Michaelis) 상수이고, Vmax는 최대 반응 속도이며, [S]는 기질 농도이다.
제2 분석은 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 기술을 이용하였다. 7개의 아미노산으로 된 기질 펩티드 (Calbiochem)를 카르복실 말단의 디니트로페닐 수용체 및 아미노 말단의 2-아미노벤조-안트라닐로일 (Abz) 잔기 공여자에 연결하였다. MMP-9에 의해 상기 기질을 절단하여 형광 생성물 (365 nm 여기, 450 nm 방출)을 유리시켰다. 5 μM 농도의 펩티드를 반응 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 mM NaN3)에 가하고, 1％ BSA로 미리 차단된 흑색 96-웰 미량역가 플레이트의 웰에 넣었다. 0.1 μM 농도의 MMP를 다양한 양의 9-mer (서열 12), 10-mer (서열 13) 또는 19-mer (서열 11) 펩티드와 혼합하고, 결합을 수행하기 위해 25 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이 단백질 혼합물을 형광 펩티드 기질에 가하고, 빠르게 혼합하였다. 다이넥스 (Dynex) MFX 형광 미량역가 플레이트 판독기를 사용하여 형광 강도를 시간의 함수로 측정하였다. 형광 강도는, Abz 함유 비-FRET 펩티드를 사용하여 표준 그래프를 생성시킨 결과, 절단된 펩티드의 몰수와 관련되었다. 저해 상수는 상기와 같은 그래프로부터 유도되었다. 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제 효소는 특정 기질인 FRET 펩티드 (모두 Calbiochem에서 구입)를 사용하여 유사한 방식으로 시험하였다.
항-활성화 분석
이 분석은 성숙 매트릭스 메탈로프로테이나제로 전환되는 전구효소의 양을 측정한다. 전구효소 pro-MMP-9 (100 ㎍)를 PBS 중 스트로밀리신 0.5 ㎍과 혼합하였다. 반응물을 35 ℃에서 인큐베이션하였다. 80분의 시간 과정에서 반응물로부터 분액을 취하였다. 각 분액을 EDTA와 1 mM의 최종 농도로 혼합하고, 바이오셀렉트 (BioSelect) 125 HPLC 컬럼에 주입하고, PBS 중 크로마토그래피하였다. 0 (주입) 시점은 약 750초 후 컬럼으로부터 용출하는 단일 피크였다. 이 피크의 크기는 시간의 함수로서 감소하며, 2개의 새로운 피크가 나타났다. 제1 피크는 약 800초 시점에서 용출하며, 성숙 형태의 MMP-9를 나타낸다. 제2 피크는 약 1,100초 시점에서 용출하며, N-말단의 pro-도메인 단편에 상응한다. 피크 면적은 용출 프로필을 통합하여 결정하였으며, 면적 변화 (％)를 그래프로 작성하였다.
등온 적정 열량측정법
마이크로칼, 인크. (MicroCal, Inc.)사의 VP-ITC 기기를 사용하여 등온 적정 열량측정법 (ITC)을 수행하였다. 적정은 (0.5 mM 내지 2.0 mM 농도 범위의) 저해제 펩티드 용액 5 ㎕를 교반된 반응 세포 1.4 mL에 주입하여 수행하였다. MMP-9는 세포에서 50 μM 내지 80 μM의 농도 범위로 존재하였다. 저해제 및 효소 둘 다는 20 mM 소듐 카코딜레이트 (pH 5.5 내지 7.0), 40 mM NaCl 또는 20 mM Tris-HCl (pH는 7.0 내지 7.5임), 40 mM NaCl 중에 존재하였다. 적정을 20 ℃ 내지 40 ℃에서수행하였다. 적정 실험의 전형적인 조건은 10초의 주입 시간에 이어서, 총 40회의 주입 동안 주입 사이마다 240초의 간격을 두는 것이었다. 저해제 펩티드를 완충액으로 블랭크 (blank) 적정하는 것은 희석 및 혼합시의 열을 보정하기 위해 수행하였다.
여러 결합 부위의 독립 세트는 결합 실험의 평가를 위한 가장 일반적인 모델이다. 열의 총량에 대하여 분석 용액을 하기 식에 의해 결정하였다 (Freire et al., 1990):
상기 식에서, Q는 열의 총량이고, V는 세포 부피이고, △H는 엔탈피이고, M은 거대분자 농도이고 (세포내 결합 대응물), n은 결합 화학량론이고, L은 리간드 농도이며 (주사기내 결합 대응물), K는 결합 상수이다. 오리진 (Origin) 버전 5 (MicroCal, Inc.)를 사용하여 데이타를 상기 모델에 대해 핏팅하였다.
표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance)
비아코어 (BiaCore)-X 표면 플라스몬 공명 (SPR) 장치 (BiaCore, Inc.)를 사용하여 19-mer (서열 11) 펩티드 (P)와 MMP-9 사이의 상호작용을 측정하였다. 이 실험에서, 10분 동안 분 당 10 ㎕의 유속의 50 mM N-히드록시숙신이미드, 0.2 M N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드로 카르복시메틸 덱스트란 센서 칩 (CM-5, Lofas et al., 1993)을 활성화하였다. 75 ng/㎕ 농도의 MMP-9를 활성화 표면에 10분 동안 분 당 10 ㎕의 유속으로 연결하였다. 최종 표면은 1 M에탄올아민-HCl을 센서 표면에 5분 동안 분 당 10 ㎕의 속도로 흐르게 하여 실활화하였다. 19-mer (서열 11) 펩티드를 센서 표면에 분 당 20 ㎕의 속도 및 10 nM 내지 50 nM 범위의 농도로 흐르게 하였다. 결합 등온선의 결합상 및 분리상은 속도 상수를 모델링하기에 앞서 자동화 FFT 루틴 (routine)에 의해 고르게 하였다. 결합 등온선은 정방향 (ka) 및 역방향 (kd) 속도 상수를 하기 식에 동시에 핏팅하여 평가하였다:
(3)
(Karlsson and Falt, 1997) 상기 식에서, [P], [MMP-9] 및 [P~MMP-9]는 각각 유리 펩티드, 유리 MMP-9 및 복합체의 농도이다. 평형 친화도 상수 (KA)는 하기와 같이 정의된다:
(4)
상기 방정식 3은 SPR 신호 (Morton et al., 1995) 측면에서 아래와 같이 적절하게 표현된다:
(5)
상기 식에서, R은 시간 t에서의 SPR 신호 (반응 단위는 RU임)이고, Rmax는 최대 MMP-9 결합 용량 (RU 단위)이며, C는 킬레이트 펩티드 농도이다. 동적 분석 (O'Shannessy et al., 1993)은 마이크로칼, 인크. (Microcal, Inc.)사의 오리진 (Origin)을 사용하여 수행하였다.
생존율 분석
매트테크 코포레이션 (MatTek Corp.)사의 피부 모델 에피덤 (Epiderm)을 사용하여 9-mer (서열 12), 10-mer (서열 13) 및 19-mer (서열 11) 펩티드의 상대적인 독성을 분석하였다. 각 피부 샘플 용기를 배양 배지에서 37 ℃의 온도 및 5％ C02조건하에 2시간 동안 예비인큐베이션한 다음, 펩티드를 첨가하였다. 샘플 용기를 신선한 배지를 포함하는 6 웰 플레이트로 옮겼다. 모든 펩티드를 PBS 중에 10 mM의 최종 농도로 용해시키고, 각 펩티드 용액 100 ㎕를 에피덤 (Epiderm) 샘플 용기의 표면에 피펫팅하였다. 37 ℃의 온도 및 5％ CO2조건하에 12시간 동안 인큐베이션을 지속하였다. 인큐베이션 기간 후, 샘플 용기를 PBS로 3회 세척하고, 웰 당 MTT 분석 배지 300 ㎕를 포함하는 (MTT 농도는 1 mg/mL임) 24 웰 플레이트로 옮겼다. 열량측정 분석을 3시간 동안 진행시켰다 (37 ℃ 및 5％ CO2조건에서 인큐베이션함). 이어서, 샘플 용기를, 웰 당 이소프로판올 2 mL를 포함하는 24 웰 배양 플레이트로 옮겼다. 유색 침전물의 추출은 실온에서 4시간의 기간 동안 일어났다. 각 샘플에서 흡광도 판독값은 570 nm 및 650 nm에서 구하였다. PBS 대조군에 대한 각 샘플의 생존율(％)은 하기와 같이 계산하였다:
통상적으로, 펩티드 샘플은 3회 반복 분석하였다.
결과
매트릭스 메탈로프로테이나제-2의 서열 (서열 14)을 하기에 제공하여 매트릭스 메탈로프로테이나제의 각종 도메인 및 영역의 결정을 용이하게 하였다.
9 개의 MMP 아미노산 서열의 절단 영역의 확고한 쌍쌍 정렬을 프로그램 클루스탈 (CLUSTAL (등록상표)) (Higgins et al., 1992)을 사용하여 계산하였다. 이 정렬은 활성화 프로테이나제 절단 부위 측면인 보존 및 비-보존 아미노산 모두의 위치를 지정하였다. 활성화 절단 부위에 대한 N-말단 아미노산 임의의 수, 뿐만 아니라 아미노산 C-말단 수를 정렬을 위해 가려냈다. 도 1에 나타낸 MMP 서열의 정렬 (표 1)은 모든 MMP 활성화 영역이 통계적으로 유의한 방식으로 정렬될 수 있다는 것을 나타냈다. 정렬을 위해 선택한 영역은 아미노산 70 내지 120에 대략적으로 상응하며, 신호 서열의 평균 MMP 구조는 아미노산 1 내지 20으로 추정되고, 프로펩티드 도메인은 아미노산 21 내지 100으로 추정되고, 성숙한 활성 효소는 아미노산 101 내지 말단으로 추정되었다. 연구를 위해 선택한 19-mer (서열 11) 서열을 정렬 영역내에 포함시켰다. 특히, 19-mer (서열 11)는 MMP-2의 아미노산 100 내지 118에 상응하였다.
MMP 서열의 정렬은 활성화 도메인의 중앙 영역인 PRCGVPDV (서열 1)가 매우 보존적이고, 이 영역 측면에 높은 정도의 서열 다양화가 있다는 것을 나타냈다. 서열 이질성을 사용하여 (이 정렬에 기초하여) 아미노산을 간단히 선택하여 특정 MMP 효소, 또는 MMP의 조합을 저해하는 펩티드 서열을 디자인할 수 있다. 또한, 효능을 조절하기 위해 특정 펩티드의 길이를 다양화할 수 있다.
proMMP-1의 3 차원 구조를 도 2에 제공하며, 이는 표 1 및 도 1에 나타낸 활성화 영역 각각이 2개의 큰 구형 도메인을 서로 연결하는 다리를 구성한다는 것을 나타냈다. 프로펩티드 도메인을 활성 효소 도메인에 연결시키는 구조화되지 않은 짧은 도메인으로서 절단 영역을 지정하였다. 이 서열은 활성화 단계의 부분으로서 두 개로 절단되었다. 이 서열은 또한 시험관내 HgCl2매개 활성화에 민감한 영역이었다.
활성화는 성숙한 효소 활성 부위를 덮지 않는 입체 블록 (프로펩티드 도메인임)을 제거하였다. N-말단 끝은 촉매 아연 이온에 근접하며, 이 촉매 아연 이온은 효소 활성에 일반적으로 요구되었다. 활성 MMP-9의 구조를 고상 볼로 나타낸 아연 이온과 함께 도 3에 나타냈다. 제2 아연은 구조적 이온인데, 즉 단백질 안정성에 기여하지만 촉매성에는 기여하지 않았다. 19-mer (서열 11) 펩티드의 C-말단 절반은 효소의 아미노 극말단이고, 마지막 루프 (cross-hatching)의 오르막 부위로서 도 3의 좌측에 나타냈다. 활성화된 MMP 표면에 대한 활성화 도메인 펩티드의 모델링은 펩티드 (특히, 더 긴 N-말단 영역이 포함되는 경우)가 활성 부위 영역과 상호작용할 수 있다는 것을 나타내며, 기질이 활성 부위에 접근하는 것을 차단하였다. 이 방식으로 블로킹 기질은 미니 pro-도메인 또는 효소 "캡 (cap)"으로서 작용할 수 있었다.
효소가 단편으로 단백질가수분해될 수 있고, 이들 단편이 재구성되어 활성 효소를 재생할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 각종 펩티드 도메인은 재조립되고, 비-공유 분자간 힘으로 함께 유지되었다. 이러한 펩티드-단백질 상호작용의 전형적인 예는 리보뉴클레아제 S-펩티드/리보뉴클레아제 S-단백질 상호작용을 포함한다 (Levit and Berger, 1976). 리보뉴클레아제 S-펩티드는 S-단백질에 그의 적절한 위치로 결합하고, 생성된 복합체는 RNASE-S의 효소 활성을 복구하였다.
본 발명에 따라, 활성화 도메인 펩티드는 불활성 복합체를 형성하는 pro-MMP에 존재하는 부위에서 활성화된 MMP에 재결합할 수 있다. 이러한 결합을 측정하였다 (하기 참조). 또한, 19-mer (서열 11) 펩티드는 촉매화를 그의 시스테인 잔기를 통해 아연을 리간드할 수 있으며, 또한 촉매작용을 방지한다.
MMP 효소 활성의 저해
제1 저해 연구는 MMP-2 절단 도메인 영역으로부터 유도된 19 아미노산 펩티드 (서열 11)로 수행하였다. 이 펩티드를 최고 정도의 보존성을 나타내는 CLUSTAL 정렬의 영역으로부터 선택하였다. 선택된 19-mer (서열 11)는 N-말단이 엄격히 보존성이지만, C-말단 부분에서는 높은 정도의 다양성을 나타냈다. 이 펩티드의 N-말단 및 C-말단 절반을 나타내는 2개의 더 작은 펩티드를 또한 시험하였다. 상기 2개의 절반들은 펩티드를 보존성 N-말단 부분 (9-mer (서열 12) ) 및 비-보존성 C-말단 부분 (10-mer (서열 13))으로 대략적으로 나눈다. 이로서 저해의 전체 효능 및 선택성을 시험할 수 있었다.
19-mer: PRCGNPDVANYNFFPRKPK (서열 11)
9-mer: PRCGNPDVA (서열 12)
10-mer: NYNFFPRKPK (서열 13)
3 종의 펩티드 모두는 형광 기초 분석에서 MMP-9를 저해할 수 있었다. 연구된 모든 경우에, 19-mer (서열 11)는 2 종의 절반 펩티드보다 더 양호한 효소 저해제였다. 9-mer (서열 12)는 C-말단 10-mer (서열 13) 펩티드보다 더 효과적인 저해제였다. 이들 결과는 시스테인이 아연 리간드로서 작용하기 때문에 필요할 수 있거나 또는 N-말단 영역이 효소 활성 부위의 입체 차단을 수행하는 데 요구된다는 것을 나타낸다. 이 가설은 보다 N-말단인 서열 (잔기 100 이전의 아미노산을 의미함)을 함유하는 저해제 펩티드를 생성하여 시험할 수 있었다. 19-mer (서열 11)로 적정된 MMP-9의 전형적인 저해 그래프를 도 4에 나타냈다.
10-mer (서열 13) 및 9-mer (서열 12) 펩티드로 수행하는 유사한 저해 분석을 도 5 및 6에 각각 나타냈다. 각각의 펩티드는 FRET-기초 분석에서 MMP-9를 저해할 수 있으며, 저해 상수 (Ki) 범위는 45.2 내지 327.7 μM이었다 (표 4 참조). 기질 (FRET 펩티드 또는 플루오레세인화된 콜라겐)의 선택은 하기와 같은 일관된경향으로 3 종의 펩티드의 상대적인 저해에서 거의 차이가 없었다: 19-mer (서열 11) > 9-mer (서열 12) > 10-mer (서열 13). MMP-9를 펩티드로 적정하는 전형적인 반응 그래프를 도 7 내지 9에 나타냈다.
저해 상수는 콜라겐 기질에 대해 전체적으로 약간 더 낮았으며, 범위는 콜라겐의 경우 30.3 내지 221.3 μM이고, FRET-펩티드의 경우 45.2 내지 327.7 μM이었다. 이들 데이타는 콜라겐 기질을 사용하는 경우 펩티드가 다소 더 효과적인 저해제임을 나타내며, 이는 저해제 펩티드가 활성 부위를 차단하고, 콜라겐이 FRET-펩티드 기질보다 상당히 더 크기 때문에 효소 활성 부위에 대한 접근을 차단하기에 더 용이하다는 것을 시사한다. 더 작은 FRET-펩티드 기질은 저해제 펩티드의 존재하에서 조차도 활성 부위에 접근이 더 용이할 수 있다.
전형적인 효소 분석 (도 4 내지 7에 나타냄)을 30 내지 40 분 동안 전형적으로 수행하였다. 연장된 시간 분석은 19-mer (서열 11)가 콜라겐의 MMP-9 촉매 가수분해를 1,000 분 넘게 유효하게 억제한다는 것을 나타냈다 (도 8). 10-mer (서열 13) 펩티드 (도 9)는 9-mer (서열 12) 펩티드 (도 10)보다 긴 시간대에서 콜라겐의 파괴를 방지하는데 덜 효과적이었다. 19-mer (서열 11) 펩티드는 다시 최고 정도의 저해를 나타냈다.
유사한 효소 연구를 다른 MMP 효소에 수행하여 19-mer (서열 11) 펩티드의 효과를 시험하였다. 이들 분석은 특정 MMP 절단 부위를 FRET 펩티드의 서열에 도입시킨 FRET 펩티드를 사용하였다. 19-mer (서열 11) 펩티드는 다중 MMP를 강하게 저해할 수 있었다. 각종 MMP에 대한 19-mer (서열 11) 펩티드의 효과는 다음과 같으며 저해 상수의 범위가 3.1 μM (MMP-2) 내지 41.1 μM (MMP-1)이었다: MMP-2 > MMP-3 > MMP-8 > MMP-7 > MMP-9 > MMP-1. 이들 데이타를 하기 표 4에 요약하였다.
저해제 데이타의 요약
펩티드 효소 기질 Ki (μM)
19-mer (서열 11) MMP-9 콜라겐 30.3
9-mer (서열 12) MMP-9 콜라겐 185.9
10-mer (서열 13) MMP-9 콜라겐 221.3
19-mer (서열 11) MMP-9 FRET 펩티드 45.2
9-mer (서열 12) MMP-9 FRET 펩티드 232.8
10-mer (서열 13) MMP-9 FRET 펩티드 327.7
19-mer (서열 11) MMP-1 FRET 펩티드 41.1
19-mer (서열 11) MMP-2 FRET 펩티드 3.1
19-mer (서열 11) MMP-3 FRET 펩티드 6.4
19-mer (서열 11) MMP-7 FRET 펩티드 22.8
19-mer (서열 11) MMP-8 FRET 펩티드 12.5
19-mer (서열 11) 펩티드의 항 스플라이싱 활성:
MMP는 불활성 전구효소 형태로 생합성적으로 생성된다. 전구효소의 단백질가수분해 절단은 흔히 막 결합 MMP의 별도의 종류에 의해 MMP 활성화를 나타낸다. 전구효소 리더 서열은 아미노산 약 100개 길이 (MMP마다 다소 다름)이고, 단백질의 아미노 극말단에 존재한다. 전구효소 활성화의 저해는 만성 상처에서 MMP 효소 활성을 낮추는 효과적인 방법일 수 있다. 이들 효소가 기능할 수 없는 경우, ECM 분해 속도가 감소될 것이고, 이는 만성 상처를 더 빠른 속도로 치유할 수 있다.
분명하게, 활성화 도메인 펩티드 (19-mer (서열 11), 9-mer (서열 12), 및 10-mer (서열 13))는 각종 MMP의 효소 활성을 억제하였다. 이 활성 이외에도, 19-mer (서열 11) 펩티드는 MMP-9의 pro (불활성) 형태의 활성화를 차단하였다. 따라서, 19-mer (서열 11) 펩티드는 이미 활성화된 MMP를 저해하거나 또는 신규 합성된pro-MMP의 활성화를 차단함으로써 피부 및 만성 상처 삼출물내의 전체 MMP 활성 수준을 저하시킬 수 있다.
도 11은 전형적인 스플라이싱 분석을 나타낸다. 약 700초에서 용출되는 제1 피크는 pro-MMP-9이었다. 스플라이싱 반응이 진행되면서, 이 피크는 세기가 감소되고 (하향 화살표로 표시함), 2개의 새로운 피크가 나타났다. 약 800초에서 용출되는 제1 신규 피크는 성숙된 활성 MMP-9이었다. 약 1,050초에서 용출되는 제2 신규 피크는 전구도메인이었다. 스플라이싱 반응이 진행되면서 이들 2개의 피크의 세기가 증가하였다 (상향 화살표로 표시함). 반응이 완료된 때에, 잔류하는 탐지가능한 pro-MMP-9가 없었다. 표준 스플라이싱 반응을 19-mer (서열 11) 펩티드로 적정하여 pro-MMP-9의 전구도메인 및 활성 효소로의 전환을 방지하였다. 도 12는 이 적정의 결과를 나타낸다. 스플라이싱은 마이크로몰의 19-mer (서열 11) 펩티드를 사용하여 투여량 의존 방식으로 억제할 수 있다.
등온 적정 열량측정법
열량측정법을 사용하여 19-mer (서열 11) 펩티드가 활성 MMP-9와 안정한 비-공유 복합체를 형성하였는지를 결정하였다. 이들 데이타는 효소 저해의 메카니즘 및 19-mer (서열 11) 펩티드의 항 활성화 특성에 대한 이해를 제공한다. 도 13은 19-mer (서열 11) MMP 저해제와 MMP-9 사이의 상호작용에 대한 등온 열량측정 실험을 나타낸다. 펩티드를 20 mM 카코딜레이트 (pH 6.8), 20 mM NaCl 중에 최종 농도 1 mM로 용해시켰다. MMP-9를 동일한 완충액 중에 최종 농도 20 μM에서 투석하였다. 일련의 표준 주입을 상기와 같이 수행하였다. MMP-9와 19-mer (서열 11) 사이의 상호작용 결과는 하기와 같았다:
화학량론: 0.975 ±0.02
H (kcal/mol): -26.1 ±1.45
S (cal mol-1K-1): -11.6 ±2.2
KA(M-1): 1.65 ×106±4.5 ×104
상기 결과는 19-mer (서열 11) 펩티드와 MMP-9 사이의 상호작용이 엔탈피상 유도되며, 즉H가 음성임을 나타낸다. 음의 값의S에 의해 증명되는 바와 같이, 반응은 엔트로피상 유리하지 않았다. 그러나, 엔탈피 용어는 용어 TS보다 크기가 더 크고, 따라서 전체 자유 에너지 (G)는 음성이다.
MMP-2를 사용하는 19-mer (서열 11) 반응을 관찰하였으며, 이는 엔탈피상 유도되고 엔트로피상 유리하지 않은 것으로 나타났다. MMP-2를 사용하여 19-mer (서열 11)을 적정함으로써 도 14에 나타낸 등온 열량측정 분석을 수행하였다. 하기 값을 이들 실험으로부터 얻었다.
화학량론: 0.99 ±0.03
H (kcal/mol): -15.4 ±2.05
S (cal mol-1K-1): -21.1 ±1.8
KA(M-1): 2.40 ×106±3.7 ×104
따라서, 결합 반응은 엔트로피상 유리하지 않다. 이는 아마도 결합시에 배열상의 엔트로피 손실로 인한 것으로 보인다. 완전 유연성인 펩티드가 다수의 높은 자유도를 보유한다는 것을 유의한다. 모든 결합 반응에서, 펩티드 대 MMP 화학량론이 1:1이며, 이는 단일 19-mer (서열 11) 펩티드가 단일 MMP 분자와 상호작용한다는 것을 나타낸다.
표면 플라즈몬 공명
MMP-9에 대한 19-mer (서열 11)의 결합은 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술을 이용하여 동적으로 연구하였다. 제조자에 의해 추천된 표준 화학적 방법에 따라 비아코어 인크. (BIACore, Inc.) CM-5 칩의 표면에 활성 MMP-9를 연결함으로써 센서 칩을 제조하였다. 19-mer (서열 11)를 비아코어-X (등록상표) 기기에서 MMP-9 표면상에 흐르게 하고, 결합 및 해리를 실시간으로 모니터링하였다. 전형적인 결합 등온선을 도 15에 나타냈다. 결합 단계 (30초 내지 430초)가 단일 결합 부위 모델에 최적이고, 결합 속도 상수 (ka)는 2.2 ×104M-1s-1이었다. 해리 단계 (440초 내지 700초)가 유사하게 적합하고, 해리 속도 상수 (kd)는 4.1 ×10-3s-1이었다. 계산된 평형 결합 상수(Ka= ka/kd) 5.3 ×106은 열역학 데이타와 거의 일치하였다. 모델링되지 않은 해리 단계의 개시에서 약 100개의 반응 단위의 큰 운반 효과가 관찰되었다. 따라서, MMP-9에 대한 19-mer (서열 11) 펩티드의 결합은 동적 및 열역학적으로 유리하였다.
생존율 분석
다수의 소분자 MMP 저해제와는 달리, 이 연구의 3 종의 펩티드는 에피덤 (EpiDerm) 피부 모델에 투여할 때 세포에 비-독성이었다. 도 16은 2가지 농도 (500 μM 및 2 mM)의 펩티드가 PBS 대조군에 비해 생존율을 단지 약간 감소시킴을 나타낸다. 펩티드의 전체 평균 생존율은 97.6％ (19-mer (서열 11)), 89.6％ (10-mer (서열 13)) 및 95.8％ (9-mer (서열 12))이었다. 이 결과는 만성 상처 치유에 대한 상기 펩티드 치료 방법이 포유동물 세포에 비독성임을 나타낸다. 도 16에 도시한 데이타는 3개 샘플의 평균이다. 생존율의 표준 편차 범위는 상기 연구에서 2.2 내지 3.7이고, 투여 또는 펩티드 동일성에 대해 상관관계를 보이지 않았다. 생존율은 더 높은 펩티드 농도에서 약간 더 낮았다.
이들 결과는 펩티드가 에피덤 (등록상표) 피부 모델에 비-독성이고, 이 펩티드가 MMP와 결합 복합체를 형성하는데 있어서 동적 및 엔트로피상 유리하고, 효소 활성을 저해하고 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성화를 차단함을 나타냈다.
실시예 2: 펩티드 저해제에 의한 상처 치유
방법
4 mm 생검용 펀치로 C57BL6/KsJ db/db 마우스에 상처를 냈다. 마우스를 잭슨 래버러토리즈 (Jackson Laboratories)로부터 입수하였으며, 마우스는 상처생성 프로토콜 개시전 3개월 내지 7개월령이었다. 상처를 내기에 앞서 모든 마우스를 마취시켰다. 근원 구조로부터 피부를 떼어내고 단리된 피부를 통해 펀치를 밀어넣어서 각 동물의 등부위 상단에 2개의 상처를 냈다. 전형적으로, 평균 깊이가 1.7mm이고 측면 길이가 1.3 mm 내지 2.2 mm인 상처를 냈다. 상처 생성 과정 동안 근육은 포함되지 않았다. 상처 생성 직후 상처를 생리 식염수 (비-처리 대조군 역할) 또는 20 ㎍/ml 19-mer 펩티드 (서열 11) 5 ㎕로 처리하였다.
상처를 매일 디지털 사진 촬영을 하고, 사진들을 컴퓨터로 통합하여 상처 면적을 결정하였다. 모든 상처 치료 및 후속 데이타 분석을 맹검 방식으로 수행하였다 [예컨대, Brown et al., 1994 참조]. 상처 생성 시점 (0일)의 상처 면적을 모든 상처에 대해 상대값 1로 임의로 설정하여, n일의 상처 면적을 0일의 상처 면적으로 나누어 후속 상처 면적을 상대적인 상처 면적으로 전환시켰다.
결과:
도 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 19-mer 펩티드 (상처 생성 시간, 0일)의 단일 투여를 이용하여 당뇨병 마우스 모델에서 상처가 완전히 아무는 시간을 크게 가속하였다. 상처 생성 9일후 19-mer 펩티드로 처리한 평균 상처는 염수 처리 대조군의 14일에 비해 평균 상처에 가까웠다. 또한, 19-mer 펩티드 (서열 11)로 처리한 상처는 상처생성 1 일 후에 상처 염증의 감소를 나타냈다. 또한, 19-mer 펩티드 (서열 11) 처리된 상처가 염수 처리된 대조군 상처보다 더 신속하게 단축 과정을 시작한다 (5 일 대 8 일)는 것을 관찰하였다.
실시예 3: 펩티드 저해제에 의한 섬유아세포 성장의 자극
이 실시예는 본 발명의 펩티드가 섬유아세포 증식을 자극한다는 것을 보여주는 데이타를 제공한다.
재료 및 방법
인간 피부 섬유아세포 세포주 (Clonetics, Walkersville, MD, 정상 인간의 피부 섬유아세포, 신생아, 카탈로그 번호 CC-2509)를 본 발명의 펩티드에 노출시키면 세포 증식이 자극되는지를 확인하기 위해 상기 세포주를 시험하였다. 대조군으로 혈청 무함유 배지를 사용하여 96-웰 분석 시스템에서 19-mer 펩티드 (서열 11)에 대한 인간 피부 섬유아세포주의 증식 반응을 측정하였다. 0.5 g/L의 19-mer 펩티드 (서열 11)를 포함하는 원액 용액을 수중에서 제조한 다음, 혈청 무함유 둘베코스 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로 희석시켜 1 ×10-4M, 1 ×10-5M 및 1 ×10-6M 농도의 펩티드를 포함하는 용액을 제조하였다. 세포를 96 웰 플레이트에 10％ 송아지 태아 혈청 (FBS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 함유 DMEM 100 ㎕ 중 세포수 1 ×103개의 농도로 시딩(seed)하였다. 플레이트를 습윤된 5％ CO2분위기하에 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 흡출해내고, 웰을 혈청 무함유 DMEM 100 ㎕로 2회 씻어냈다. 최종 세정물을 흡출해내고, 1 ×10-4M, 1 ×10-5M 및 1 ×10-6M 농도의 19-mer (서열 11) 용액 100 ㎕를 20개의 웰에 가하였다. 또한, 대조군으로 비히클 (혈청 무함유 DMEM) 100 ㎕를 10개의 웰에 가하였다. 모든 웰을 습윤된 5％ C02분위기하에 37 ℃에서 28시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 셀 타이터 96 아쿠오스 원 솔루션 (Cell Titer 96 Aqueous One Solution) 20 ㎕를 모든 웰에 가하였다. 플레이트를 서서히 회전시키고, 다시인큐베이터에 45분 동안 넣고, 분광광도계 흡광도를 490 nm에서 판독하였다. 1-원 ANOVA를 사용하여 결과를 통계적으로 분석하였다.
결과:
도 18에 나타낸 바와 같이, 19-mer 펩티드 (서열 11)를 첨가하자 섬유아세포의 성장이 투여량 의존적인 방식으로 증가하였다. 19-mer 펩티드를 첨가하지 않은 대조군은 가장 낮은 세포 밀도를 나타냈다. 1 ×10-5M 만큼 적은 19-mer (서열 11, 도 18에서 표지된 19mer5)를 보유하는 세포는 19-mer 펩티드를 수용하지 않은 세포보다 유의하게 더 큰 세포 밀도 (P > 0.01)를 나타냈다. 1 ×10-4M의 19-mer (도 18에서 표지된 "19mer4")를 보유하는 세포는 훨씬 더 큰 세포 성장을 나타냈다 (P > 0.001). 그러나, 1 ×10-6M의 19-mer (도 18에서 표지된 "19mer6")를 보유하는 세포는 통계적으로 매우 유의하지 않은 것으로 밝혀진 소량의 세포 증식을 나타냈다 (P < 0.05).
이와 같이, 세포 성장에 있어서 통계적으로 유의한 차이가 대조군 세포와 19-mer 펩티드 (서열 11)로 처리된 세포 사이에서 관찰되었다. 통계적으로 유의한 이러한 차이를 기초로, 19-mer 펩티드 (서열 11)는 섬유아세포에 대한 양호한 세포 증식제인 것으로 보인다.
실시예 4: 펩티드 저해제에 의한 각질세포 성장의 자극
이 실시예는 본 발명의 펩티드가 각질세포 증식을 자극하는 것을 보여주는 데이타를 제공한다.
재료 및 방법
클로네틱스 (Clonetics)사로부터의 인간 피부 각질세포 세포주 (Walkersville, MD, 정상 인간의 상피 각질세포, 신생아, 카탈로그 번호 cc-2503)를 19-mer (서열 11)에 노출시켜 이 펩티드가 각질세포의 증식을 자극할 수 있는지를 확인하였다. 19-mer 펩티드 (서열 11)에 대한 상기 인간 피부 각질세포의 증식 반응은 대조군으로 각질세포 기초의 배지 (KBM, Clonetics, 카탈로그 번호 CC-3103)를 사용하여 96-웰 분석 시스템에서 측정하였다. 0.5 g/L의 19-mer 펩티드를 포함하는 원액 용액을 수중에서 제조한 다음, KBM으로 희석시켜 1 ×10-4M, 1 ×10-5M 및 1 ×10-6M 농도의 펩티드를 포함하는 용액을 제조하였다. 세포를 96 웰 플레이트에 KBM 100 ㎕ 중 세포수 2.5 ×103개의 농도로 시딩하였다. 플레이트를 습윤된 5％ C02분위기하에 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1 ×10-4M, 1 ×10-5M 또는 1 ×10-6M 농도의 19-mer (서열 11) 용액 100 ㎕를 10개의 웰 각각에 가하였다. 또한, 대조군으로 비히클 KBM 100 ㎕를 10개의 웰에 가하였다. 플레이트를 습윤된 5％ C02분위기하에 37 ℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 셀 타이터 96 아쿠오스 원 솔루션 (Cell Titer 96 Aqueous One Solution) 20 ㎕를 모든 웰에 가하였다. 플레이트를 서서히 회전시키고, 다시 인큐베이터에 3시간 동안 넣었다. 각 웰의 분광광도계 흡광도를 490 nm에서 판독하였다. 1-원 ANOVA를 사용하여 결과를 통계적으로 분석하였다.
결과
도 19에서 볼 수 있는 바와 같이, 19-mer 펩티드 (서열 11)를 첨가하자 각질세포의 성장이 투여량 의존적인 방식으로 증가하였다. 19-mer 펩티드를 첨가하지 않은 대조군 세포는 가장 낮은 세포 밀도를 나타냈다. 1 ×10-5M 만큼 적은 19-mer (서열 11, 도 19에서 표지된 19mer5)를 보유하는 세포는 19-mer 펩티드를 수용하지 않은 세포보다 유의하게 더 큰 세포 밀도 (P > 0.01)를 나타냈다. 1 ×10-4M의 19-mer (도 19에서 표지된 "19mer4")를 보유하는 세포는 훨씬 더 큰 세포 성장을 나타냈다 (P > 0.001). 그러나, 1 ×10-6M의 19-mer (도 19에서 표지된 "19mer6")를 보유하는 세포는 통계적으로 유의하지 않은 것으로 밝혀진 소량의 세포 증식만을 나타냈다 (P > 0.05).
이와 같이, 대조군 세포와 19-mer 펩티드 (서열 11)로 처리된 각질세포 사이에서 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다. 따라서, 19-mer 펩티드 (서열 11)는 각질세포에 대한 양호한 세포 증식제인 것으로 보인다.
실시예 5: 펩티드 저해제는 섬유아세포 이동을 자극한다.
이 실시예는 본 발명의 펩티드가 섬유아세포 이동을 자극할 수 있음을 보여주는 데이타를 제공한다.
재료 및 방법
정상의 인간 피부 섬유아세포 (NHDF)를 바이오휘태커 (Biowhittaker) (Walkersville, MD)사로부터 얻고, T75 플라스크내 인슐린, hFGF-b, GA-1000 및 송아지 태아 혈청 (10 mL) 함유 FBM 배지 (500 mL, Biowhittaker)에서 12회 이하의 계대배양 동안 증식시켰다. 이동 분석을 위해, NHDF를 행크 (Hank's) 완충 염 용액 (HBSS) 10 mL로 1회 세척하였다. EDTA 중 트립신 (0.25％) 3 mL를 T75 플라스크에 5분 동안만 가하여 플라스크에서 NHDF를 제거하였다. 트립신 용액 중 NHDF를 첨가된 보충물이 없는 FBM 7 mL에 가하였다. NHDF를 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. NHDF를 FBM 10 mL에 재현탁시켜 계수하였다. NHDF를 5분 더 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. NHDF를 보충물이 없는 FBM mL 당 세포수 1 ×106개로 재현탁시켰다. 완전 배지는 섬유아세포 성장 인자 및 혈청 (이들은 둘 다 섬유아세포의 이동을 개시함)을 포함하기 때문에, 이동 분석에서 FBM 배지만을 사용하는 것이 중요하다.
펩티드는 에모리 유니버시티 (Emory University)의 마이크로케미컬 퍼실리티 (Microchemical Facility) 또는 시그마제네시스 (SigmaGenesis)사에 의해 합성 및 정제하였다. 모든 펩티드를 HPLC 이후 질량 분광법에 의해 분석하여 순도를 평가하였다. 펩티드 약 0.5 내지 2.0 mg을 사용하여 각 이동 분석을 위한 신선한 원액 용액 (PBS 중 5 mg/mL)을 제조하였다. PBS 중 펩티드 원액 용액을 사용하여 이동 분석을 위해 FBM (보충물 없음) 중 더 희석된 용액 (1 mg/mL, 100 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 1 ㎍/mL, 100 ng/mL, 10 ng/mL)을 제조하였다.
8 mm 공극을 갖는 폴리비닐피롤리돈-무함유 폴리카르보네이트 막 (Neuroprobe, Inc., Gaithersburg, MD)을 90％ 에탄올로 15분 동안 세척하고, 탈염수로 4회 씻어냈다. 이어서, 막을, 5 ㎍/mL 젤라틴 수용액을 포함하는 유리 접시에 놓았다. 유리 접시를 약 90 ℃의 수조에 1시간 동안 넣었다. 막을 젤라틴 용액에서 꺼내어, 37 ℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 건조하였다.
48-웰 주화성 챔버 (Neuroprobe, Inc., Gaithersburg, MD)(도 20 참조)를 이동 분석에서 사용하였다. 각 시험 용액 28 ㎕를 챔버의 바닥 웰에 4회 가하였다. 젤라틴-처리된 막을 바닥 웰의 상부에 조심스럽게 놓았다. 이어서, 카스켓 (gasket) 및 챔버 상부를 막의 상부에 조심스럽게 놓았다. 이 장치를 6개의 수나사를 사용하여 단단하게 조였다. 측정된 세포 밀도 (mL 당 세포수 2 ×105개)를 포함하는 NHDF 용액은 mL 당 세포수 1 ×106개의 용액 320 ㎕를 FBM (보충물 없음) 1.28 mL에 가하여 제조하였다. NHDF mL 당 세포수 2 ×105개의 용액 50 ㎕를 챔버내 각 웰의 상부에 가하였다. 챔버를 37 ℃/5％ C02조건하에 인큐베이터에 3시간 넣어 두었다. 챔버를 꺼내고, 수나사를 풀러내고, 챔버를 종이 타월 위에 뒤집어 놓았다. 챔버의 바닥 부분을 제거하자, 막을 통해 이동한 NHDF가 접하는 막이 드러났다. 막을 주의하면서 제거하였다. 막을 통해 이동하지 않은 세포는, 막의 한 측면을 PBS로 습윤화하고 세포 스크레이퍼 (scraper)(Neuroprobe, Inc.)를 사용하여 막으로부터 떼내었다. 막을 메탄올로 고정시키고, 디프-퀵 (Diff-Quik) 염색 용액 I 및 II를 사용하여 염색하였다. NHDF의 핵은 보라색으로 염색되었다. 삼나무목재 액침 오일 및 커버 슬립을 사용하여 막을 유리 슬라이드 위에 올려놓았다.상이한 챔버에 상응하는 3개의 부위 각각에 대하여 3개의 각 필드 상의 세포를 자이스 (Zeiss) 광학 현미경 (25X 대물렌즈 x 10X 접안렌즈 x 1.25X)을 사용하여 계수하였다. 음성 대조군에서 이동한 NHDF의 평균 수를 실험 (펩티드) 데이타 및 양성 대조군 데이타로부터 감산하였다. 이후, 데이타를 혈장 피브로넥틴 양성 대조군 (1.25 ㎍/mL)에 비해 이동된 NHDF의 비율로 나타내었으며, 하기와 같이 정의된다:
결과
섬유아세포 (NHDF) 이동에 사용된 막은 도 21A (상부)에 나타낸 바와 같이 8 ㎛ 공극을 가졌다. 화학유인물질 용액은 막을 통한 섬유아세포의 이동을 신호화하였다. 섬유아세포가 막을 통해 이동한다면, 섬유아세포는 화학유인물질 쪽의 막에 부착하게 된다. 도 21B (하부)에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포의 핵을 보라색으로 염색하고, 눈으로 계수하였다. 총 세포 계수에는 공극 내부 (공극은 어두운 보라색을 띠는 것으로 보임)에 포획된 세포가 포함되었다. 양성 대조군으로 인한 NHDF의 이동은 필드 당 27 내지 60 NHDF 범위의 세포수를 나타냈다. NHDF 이동 분석에 사용된 양성 대조군은 혈장 피브로넥틴 (FBM 배지 중 용해된 1.25 ㎍/mL)이었다. 피브로넥틴은 상처 수복 동안 ECM의 구성을 보조하는 분자이다. 섬유아세포의 α4β1인테그린 수용체에 결합하는 피브로넥틴은 매우 좁은 농도 범위 (0.8 내지 1.6 ㎍/mL)에서 주화성이다 [Postlethwaite, A.E.; Kang, A.H. "Fibroblast Chemoattractants" in Methods of Enzymology, vol. 163, Academic Press: New York, 1988, pp. 694-707]. 음성 대조군 (보충물이 없는 FBM 배지) 세포수는 필드 당 1 내지 7 NHDF (양성 대조군의 10％ 미만)이었다 (도 22 참조).
여러 농도의 19-mer 펩티드를 NHDF 이동 분석에서 사용하였다. 혈장 피브로넥틴이 NHDF에 대해 주화성인 농도 범위는 좁기 때문에, 펩티드의 10배 희석액을 사용하여 넓은 범위의 농도를 조사할 수 있었다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 상당한 수의 NHDF가 막을 통해 0.1 mg/mL 초과의 19-mer 농도로 이동하였다 (1,000 ㎍/mL 및 100 ㎍/mL의 경우 각각 55％ ±3％ 및 46％ ±3％임). 100 ㎍/mL 미만의 19-mer 농도는 약간만 주화성이었다. 이러한 농도의 19-mer가 약 20％의 NHDF 이동 (이는 음성 대조군의 NHDF 이동의 약 2배에 불과함)을 유도하였기 때문에, 상기 데이타는 유의한 것으로 고려되지 않았다. 2가지 상이한 시판 공급원에서 제조된 19-mer 원액에 의해 유도된 이동에 있어서 차이는 없었다 (데이타는 나타내지 않음).
19-mer 서열의 여러 변이체를 합성 및 정제하여 아미노산 서열 변화가 섬유아세포 이동에 영향을 주었는지를 결정하였다. 다음과 같은 펩티드를 시험하였다: 9-mer PRCGNPDVA (서열 12), 10-mer NYNFFPRKPK (서열 13), 14-mer TMRKPRCGNPDVAN (서열 19) 및 17-mer TLKAMRKPRCGNPDVAN (서열 20). 14-mer 및 17-mer 펩티드 서열은 각각 MMP-2 및 MMP-9의 보다 N-말단 쪽의 서열을 토대로 한다. 9-mer (서열 12) 및 10-mer (서열 13) 펩티드는 MMP 활성을 저해한다. 또한, 19-mer (서열 11)펩티드는 각각 N 말단 및 C 말단에서 보호성 아세틸기 및 아미드기 (Ac-19-mer)를 사용하여 합성하여 이들 기의 부가가 섬유아세포 이동에 대한 효과를 변화시키는지를 결정하였다. Ac-19-mer는 도 23에 나타낸 바와 같이 100 (44 ±3％) 및 1,000 (40±6％) ㎍/mL 둘 다에서 섬유아세포에 대해 주화성이었다. 10-mer (서열 13) 펩티드는 1,000 ㎍/mL (30 ±2％)에서 주화성이었지만, 100 ㎍/mL (11 ±0％, 도 22에 나타낸 바와 같은 음성 대조군의 순서)에서는 주화성이 아니었다. 9-mer (서열 12)는 1,000 ㎍/mL (32 ±2％)에서 주화성이었지만, 100 ㎍/mL (16 ±0％)에서는 주화성이 아니었다. 흥미롭게도, 아미노산을 9-mer의 N-말단에 부가한 결과 NHDF 이동은 없었다. 14-mer TMRKPRCGNPDVAN (서열 19) 및 17-mer TLKAMRKPRCGNPDVAN (서열 20)은 1,000 ㎍/mL 내지 10 ng/mL 범위의 농도에서 NHDF 이동을 유도하지 않았다 (데이타는 나타내지 않음). 여러 펩티드들은 NHDF 이동이 많이 다르기 때문에, 아미노산 서열은 NHDF 이동의 활성화에 있어서 중요할 수 있다.
섬유아세포가 상처 부위로 이동하는 것은 적절한 치유에서 중요하다. 19-mer 펩티드 (100 ㎍/mL 이상) 및 Ac-19-mer, 9-mer 및 10-mer 유도체의 주화성 특성은 NHDF 이동 분석을 이용하여 입증하였다. 9-mer 및 10-mer는 둘 다 NHDF 이동을 대략 동일한 정도로 유도하기 때문에, 특정 아미노산이 활성화에 있어서 중요한지를 평가하는 것은 어렵다. 흥미롭게도, 14-mer TMRKPRCGNPDVAN (서열 19) 및 17-mer TLKAMRKPRCGNPDVAN (서열 20)은 섬유아세포 이동성에 효과를 나타내지 않는다. 19-mer 화학유인의 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않지만, 펩티드의 아미노산 서열은 섬유아세포의 활성화에 있어서 중요하다.
실시예 6: 펩티드 저해제는 호중구 이동을 자극하지 않는다.
이 실시예는 본 발명의 펩티드가 호중구 이동을 자극하지 않음을 보여주는 데이타를 제공한다.
재료 및 방법
펩티드는 에모리 유니버시티 (Emory University)의 마이크로케미컬 퍼실리티 (Microchemical Facility) 또는 시그마제네시스 (SigmaGenesis)사에 의해 합성 및 정제하였다. 모든 펩티드를 HPLC 이후 질량 분광법에 의해 분석하여 순도를 평가하였다. 펩티드 약 0.5 내지 2.0 mg을 사용하여 각 이동 분석을 위한 신선한 원액 용액 (HBSS/HSA 중 5 mg/mL)을 제조하였다. 펩티드 원액 용액을 사용하여 분석을 위해 HBSS/HSA 중 더 희석된 용액 (1 mg/mL, 100 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 1 ㎍/mL, 100 ng/mL 및 10 ng/mL)을 제조하였다.
혈액/EDTA 혼합물 (약 20 mL)을 50 mL 팰콘 (Falcon) 튜브 중 히스토페이크 (Histopaque; 등록상표) 1119 (하층, 18 mL) 및 1077 (상층, 7 mL)의 2개의 층 상부에 놓음으로써 호중구를 인간 혈액 (EDTA 함유 바큐테이너 (Vacutainer; 등록상표) 튜브내에 수집)으로부터 단리하였다. 튜브를 1,800 rpm에서 30분 동안 (중단 없음) 원심분리하였다. 회전 후 (상층에서 하층 순서로) 혈장, 1077, 1119 및 적혈구 세포의 4개 층이 튜브내에 나타났다. 혈장과 1077 층 사이의 연막 (buffy coat)은 림프구, 단핵구 및 다소의 혈소판을 포함하였다. 혈장 층, 연막, 및 1077 층의 대부분을 제거해서 버렸다. 호중구를 포함하는 1119 층을 제거하여 깨끗한50 mL 튜브에 넣었다. 둘베코 (Dulbecco's) 인산염 완충 염수 (DPBS)를 가하여 부피를 50 mL로 하였다. 세포를 2,100 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 세포를 DPBS 10 mL에 재현탁시키고, 15 mL 튜브로 옮기고, 2,000 rpm에서 10분 동안 재원심분리하였다. 이 과정을 반복하여 세포를 두번째 세척하였다. 상청액을 제거한 다음, 냉각 무균수 6 mL를 각 상청액 15 mL에 가하여 적혈구 세포를 용해시켰다. 세포를 수중에서 30초 동안만 혼합하였다. 이어서, 냉각된 2％ 무균 염수 6 mL를 가하였다. 세포를 2,000 rpm에서 10분 동안 재원심분리하였다. 적색 상청액 (적혈구 세포 유래의 헤모글로빈 함유)을 제거하였다. 상기 적혈구 세포 용해 과정을 2회 더 반복하여 모든 적혈구 세포를 제거하였다. 대부분의 적혈구 세포를 제거한 다음, 트립판 블루를 사용하여 계수하기 위해 호중구를 HBSS/HSA 10 mL에 재현탁시켰다. 세포를 원심분리하고, HBSS/HSA 중에 1.25 ×106세포/mL의 농도로 재현탁시켰다.
24-웰 트랜스웰 플레이트 (막에 대한 공극 크기는 3 ㎛임)를 사용하여 호중구 이동 분석을 2회 수행하였다. 트랜스웰 막을 HBSS/HSA (0.04％ 내지 0.4％) 20 ㎕ 내지 40 ㎕로 미리 습윤시켰다. 주화성 용액 (500 ㎕)을 각 웰의 바닥에 가하였다. 호중구 (1.25 ×106세포/mL 용액 200 ㎕)를 트랜스웰 상의 막에 가하였다. 이어서, 트랜스웰을 주화성 용액에 넣었다. 플레이트를 인큐베이터 (37 ℃, 5％ CO2)에 1시간 동안 넣어 두었다. 막을 통해 이동한 세포를 트립판 블루를 사용하여 계수하였다.
결과
호중구 이동 실험에서, 단리된 호중구는 약 95％가 생존하였다. 이 실험에서, 호중구를 HBSS/0.4％ HSA 중에 재현탁시켰다. IL-8 (HBSS/0.4％ HSA 완충액 중 10 nM)을 호중구 이동에서 양성 대조군으로 사용하였다. 사용된 19-mer의 농도는 1 mg/mL, 100 ㎍/mL, 10 ㎍/mL 및 1 ㎍/mL이었다.
표 5의 제2 컬럼은 제1 실험으로부터의 결과를 기술한다. 음성 대조군 및 양성 대조군은 각각 HBSS/HSA 및 IL-8이었다.
각 주화성 기질에 대한 호중구 이동(％)
주화성 기질 호중구 이동(％) 실험 1 호중구 이동(％) 실험 2
HBSS/HSA* 29％ 0％
10 nM IL-8 81％ 51％
1 mg/mL 19-mer 23％ 4％
100 ㎍/mL 19-mer 29％ 0％
10 ㎍/mL 19-mer 22％ -
1 ㎍/mL 19-mer 32％ -
*HSA 농도는 실험 1의 경우 0.4％이고, 실험 2의 경우 0.04％임.
19-mer 펩티드 (서열 11)는 음성 대조군과 유사한 호중구 이동을 유도하였다. IL-8을 첨가하자, 첨가된 호중구의 81％가 막을 통해 이동하였다. 양성 대조군은 상당히 이동하였으며, 음성 대조군 (29％)은 다소 높아 보였다. 따라서, 제2 실험에서, HSA의 양은 0.04％로 10배 감소하였다. 표 5의 세번째 컬럼에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군은 0％ 호중구 이동으로 크게 감소하였다. 또한, IL-8 양성 대조군은 감소하긴 했지만, 여전히 다량의 호중구 이동 (51％)을 나타냈다. 제1 실험에서와 같이, 19-mer는 호중구 이동에 대한 효과를 나타내지 않았다.
섬유아세포의 상처 부위로의 이동은 적절한 치료에 있어서 중요하다. 19-mer 펩티드 (서열 11)의 주화성은 NHDF 이동 분석을 이용하여 입증하였다. 그러나, 19-mer는 호중구의 이동에 효과가 없는 것으로 보였다. 아마도, 섬유아세포에는 고유하지만 호중구에는 고유하지 않은 수용체가 19-mer 인식, 결합 및 주화성 신호전달에 관여하는 것으로 보인다.
실시예 7: 콜라겐 생산의 자극
인간 피부 섬유아세포 세포주 (Clonetics, Walkersville, MD, 정상 인간의 피부 섬유아세포, 신생아, 카탈로그 번호 CC-2509)에서 콜라겐 생산에 대한 19mer 펩티드 (서열 11)의 자극 반응을, 판베라 (Panvera)(Madison, WI)사에서 판매하는 다까라 바이오메디칼스 (Takara Biomedicals) EIA 분석 키트 (TAK MK101)를 사용하여 측정하였다. 세포를 먼저 96-웰 분석 시스템에서 10％ 송아지 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 둘베코스 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM)를 사용하여 성장시켰으며, 상기 배지 및 혈청은 모두 시그마 케미컬 컴파니 (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO)사에서 구입하였다. 혈청 무함유 DMEM을 대조군으로 사용하였다. 0.5 g/L의 19-mer 펩티드 (서열 11)를 포함하는 원액 용액을 수중에서 제조한 다음, 혈청 무함유 DMEM으로 희석하여 1 ×10-5M 및 1 ×10-6M의 펩티드 함유 용액을 제조하였다. 세포를 96 웰 플레이트에서 10％ 송아지 태아 혈청 (FBS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 함유 DMEM 100 ㎕ 중 세포수 5 ×103개의 농도로 시딩하였다. 플레이트를 습윤된 5％ C02분위기하에 37 ℃에서 24시간동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 흡출해내고, 웰을 혈청 무함유 DMEM 100 ㎕로 2회 씻어냈다. 최종 세정물을 흡출해내고, 1 ×10-5M 또는 1 ×10-6M 농도의 19-mer (서열 11) 용액 100 ㎕를 웰 (각 농도에서 n = 2)에 가하였다. 또한, 대조군으로 비히클 (혈청 무함유 DMEM) 100 ㎕를 4개의 웰에 가하였다. 모든 웰을 습윤된 5％ CO2분위기하에 37 ℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
96-웰 플레이트의 각 웰로부터의 상청액 추천량 20 ㎕를 사용하여 분석을 수행하였다. 표준 완충액 및 정지 용액을 새로 제조한 다음, 분석을 수행하였다. 미리 항체로 코팅된 96 웰 플레이트 (키트내에 공급)를 사용하여 항체-POD 컨쥬게이트 용액 (키트내에 공급) 100 ㎕를 웰에 가하였다. (섬유아세포를 포함하는 다른 96-웰 플레이트로부터의) 표준 용액 및 시험 용액 각각 20 ㎕를 적절한 웰에 가하였다. 플레이트를 서서히 혼합하고, 밀봉하고, 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 각 웰을 주의하면서 PBS 완충액 (400 ㎕)으로 4회 세척하였다. 임의의 액체에 의한 세척이 끝날 즈음, 모든 웰을 완전히 비웠다. 기질 용액 (완충액 중 과산화수소 및 테트라메틸벤지딘, 키트내에 공급) 100 ㎕를 각 웰에 가하고, 플레이트를 15분 동안 인큐베이션하였다. 이 시점에서, 정지 용액 (새로 제조된 1 N H2SO4) 100 ㎕를 기질과 동일한 순서로 각 웰에 가하였다. 플레이트를 서서히 혼합하고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 결과는 1-원 ANOVA를 사용하여 통계적으로 분석하였다.
결과:
도 24 및 표 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 19-mer 펩티드 (서열 11)를 첨가하자, 사용된 2가지 농도 둘 다에서 콜라겐 생산이 증가하였다. 19-mer 펩티드 (서열 11)가 첨가되지 않은 대조군 세포는 가장 적은 양의 콜라겐을 포함하였다. 10-5M 및 10-6M의 농도에서, 19mer 펩티드 (서열 11)는 통계적으로 유의한 양 (P < 0.001)의 콜라겐을 생산하였다. 이러한 결과는 19mer 펩티드 (서열 11)가 콜라겐 생산을 자극한다는 것을 암시한다.
데이타 요약
군 포인트 수 평균 표준 편차 평균의 표준 오차 중앙값
19mer5 2 0.8365 0.02051 0.01450 0.8365
19mer6 2 0.8315 0.01202 0.008500 0.8315
대조군 4 0.7388 0.01431 0.007157 0.7330
<참고문헌>
하기 참고문헌 및 본 명세서에 인용된 임의의 다른 참고문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims (73)

  1. 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 15, 서열 16 또는 서열 17을 포함하며 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase)-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 섬유아세포 또는 각질세포에 대한 화학유인물질인 펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 섬유아세포에서 콜라겐 생산을 자극할 수 있는 펩티드.
  4. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 치료 유효량의 하기 화학식 I의 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
    <화학식 I>
    상기 식에서,
    Xaa1, Xaa4및 Xaa6은 각각 개별적으로 비극성 아미노산이고;
    Xaa2는 염기성 아미노산이고;
    Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
    Xaa5는 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    Xaa7은 산성 아미노산이고;
    Xaa8은 지방족 아미노산 또는 극성 아미노산이며;
    Xaa9는 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 염기성 아미노산이다.
  5. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 치료 유효량의 하기 화학식 II의 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
    <화학식 II>
    상기 식에서,
    Xaa10은 극성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa11은 극성 아미노산 또는 방향족 아미노산이고;
    Xaa12는 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 지방족 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa13은 방향족 아미노산, 지방족 아미노산, 극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa14는 방향족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa15는 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa16은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa17은 염기성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa18은 비극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이며;
    Xaa19는 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다.
  6. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 치료 유효량의 하기 화학식 III의 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
    <화학식 III>
    상기 식에서,
    Xaa1, Xaa4및 Xaa6은 각각 개별적으로 비극성 아미노산이고;
    Xaa2는 염기성 아미노산이고;
    Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
    Xaa5는 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    Xaa7은 산성 아미노산이고;
    Xaa8은 지방족 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa9는 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 염기성 아미노산이고;
    Xaa10은 극성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa11은 극성 아미노산 또는 방향족 아미노산이고;
    Xaa12는 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 지방족 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa13은 방향족 아미노산, 지방족 아미노산, 극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa14는 방향족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa15는 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa16은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa17은 염기성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa18은 비극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이며;
    Xaa19는 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다.
  7. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 치료 유효량의 하기 화학식 IV의 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
    <화학식 IV>
    (서열 18)
    상기 식에서,
    Xaaa는 프롤린이고; Xaab는 글루타민 또는 글루탐산이고; Xaac는 쓰레오닌이고; Xaad는 글리신이고; Xaae는 아스파라긴산 또는 글루탐산이고; Xaaf는 루이신이고; Xaag는 아스파라긴산이고; Xaah는 글루타민 또는 세린이고; Xaai는 아스파라긴 또는 알라닌이고; Xaaj는 쓰레오닌이고; Xaak는 이소루이신 또는 루이신이고; XaaL은 글루탐산 또는 리신이고; Xaam은 쓰레오닌 또는 알라닌이고; Xaan은 메티오닌이고; Xaao는 아르기닌이며; Xaap는 리신 또는 쓰레오닌이고;
    Xaa1은 프롤린이고; Xaa2는 아르기닌이고; Xaa3은 시스테인이고; Xaa4는 글리신이고; Xaa5는 발린 또는 아스파라긴이고; Xaa6은 프롤린이고; Xaa7은 아스파라긴산이고; Xaa8은 발린 또는 루이신이고; Xaa9는 알라닌 또는 글리신이고; Xaa10은 아스파라긴 또는 아르기닌이고; Xaa11은 티로신 또는 페닐알라닌이고; Xaa12는 아스파라긴 또는 글루타민이고; Xaa13은 페닐알라닌 또는 쓰레오닌이고; Xaa14는 페닐알라닌이고; Xaa15는 프롤린 또는 글루탐산이고; Xaa16은 아르기닌 또는 글리신이고; Xaa17은 리신 또는 아스파라긴산이고; Xaa18은 프롤린 또는 루이신이며; Xaa19는 리신이다.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비극성 아미노산이 메티오닌, 글리신 또는 프롤린인 조성물.
  9. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 염기성 아미노산이 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산인 조성물.
  10. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인-유사 아미노산이 시스테인, 호모시스테인, 페니실라민 또는 β-메틸 시스테인인 조성물.
  11. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 지방족 아미노산이 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산인 조성물.
  12. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산인 조성물.
  13. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 아미노산이 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드, 호모세린, 또는 메티오닌, 글리신 또는 프롤린과 같은 비극성 아미노산인 조성물.
  14. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 방향족 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐알라닌인 조성물.
  15. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 매트릭스 메탈로프로테이나제-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제-3, 매트릭스 메탈로프로테이나제-4, 매트릭스 메탈로프로테이나제-5, 매트릭스 메탈로프로테이나제-6, 매트릭스 메탈로프로테이나제-7, 매트릭스 메탈로프로테이나제-8, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 매트릭스 메탈로프로테이나제-10, 매트릭스 메탈로프로테이나제-11, 매트릭스 메탈로프로테이나제-12 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-13 중 어느 하나의 프로테이나제 활성을 억제할 수 있는 것인 조성물.
  16. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포 또는 각질세포에 대한 화학유인물질인 조성물.
  17. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포에서 콜라겐 생산을 자극할 수 있는 것인 조성물.
  18. 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 또는 서열 13을 포함하는 치료 유효량의 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 펩티드가 매트릭스 메탈로프로테이나제-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-3, 매트릭스 메탈로프로테이나제-4, 매트릭스 메탈로프로테이나제-5, 매트릭스 메탈로프로테이나제-6, 매트릭스 메탈로프로테이나제-7, 매트릭스 메탈로프로테이나제-8, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 매트릭스 메탈로프로테이나제-10, 매트릭스 메탈로프로테이나제-11, 매트릭스 메탈로프로테이나제-12 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 13 중 어느 하나의 프로테이나제 활성을 억제할 수 있는 것인 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 성장을 자극할 수 있는 것인 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포 또는 각질세포에 대한 화학유인물질인 조성물.
  22. 제18항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포에서 콜라겐 생산을 자극할 수 있는 것인 조성물.
  23. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 하기 화학식 I의 펩티드를 포함하는 상처 드레싱 (dressing).
    <화학식 I>
    상기 식에서,
    Xaa1, Xaa4및 Xaa6은 각각 개별적으로 비극성 아미노산이고;
    Xaa2는 염기성 아미노산이고;
    Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
    Xaa5는 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    Xaa7은 산성 아미노산이고;
    Xaa8은 지방족 아미노산 또는 극성 아미노산이며;
    Xaa9는 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 염기성 아미노산이다.
  24. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 하기 화학식 II의 펩티드를 포함하는 상처 드레싱.
    <화학식 II>
    상기 식에서,
    Xaa10은 극성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa11은 극성 아미노산 또는 방향족 아미노산이고;
    Xaa12는 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 지방족 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa13은 방향족 아미노산, 지방족 아미노산, 극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa14는 방향족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa15는 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa16은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa17은 염기성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa18은 비극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이며;
    Xaa19는 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다.
  25. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 하기 화학식 III의 펩티드를 포함하는 상처 드레싱.
    <화학식 III>
    상기 식에서,
    Xaa1, Xaa4및 Xaa6은 각각 개별적으로 비극성 아미노산이고;
    Xaa2는 염기성 아미노산이고;
    Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
    Xaa5는 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    Xaa7은 산성 아미노산이고;
    Xaa8은 지방족 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa9는 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 염기성 아미노산이고;
    Xaa10은 극성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa11은 극성 아미노산 또는 방향족 아미노산이고;
    Xaa12는 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 지방족 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa13은 방향족 아미노산, 지방족 아미노산, 극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa14는 방향족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa15는 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa16은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa17은 염기성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa18은 비극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이며;
    Xaa19는 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다.
  26. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 하기 화학식 IV의 펩티드를 포함하는 상처 드레싱.
    <화학식 IV>
    (서열 18)
    상기 식에서,
    Xaaa는 프롤린이고; Xaab는 글루타민 또는 글루탐산이고; Xaac는 쓰레오닌이고; Xaad는 글리신이고; Xaae는 아스파라긴산 또는 글루탐산이고; Xaaf는 루이신이고; Xaag는 아스파라긴산이고; Xaah는 글루타민 또는 세린이고; Xaai는 아스파라긴 또는 알라닌이고; Xaaj는 쓰레오닌이고; Xaak는 이소루이신 또는 루이신이고; XaaL은 글루탐산 또는 리신이고; Xaam은 쓰레오닌 또는 알라닌이고; Xaan은 메티오닌이고; Xaao는 아르기닌이며; Xaap는 리신 또는 쓰레오닌이고;
    Xaa1은 프롤린이고; Xaa2는 아르기닌이고; Xaa3은 시스테인이고; Xaa4는 글리신이고; Xaa5는 발린 또는 아스파라긴이고; Xaa6은 프롤린이고; Xaa7은 아스파라긴산이고; Xaa8은 발린 또는 루이신이고; Xaa9는 알라닌 또는 글리신이고; Xaa10은 아스파라긴 또는 아르기닌이고; Xaa11은 티로신 또는 페닐알라닌이고; Xaa12는 아스파라긴 또는 글루타민이고; Xaa13은 페닐알라닌 또는 쓰레오닌이고; Xaa14는 페닐알라닌이고; Xaa15는 프롤린 또는 글루탐산이고; Xaa16은 아르기닌 또는 글리신이고; Xaa17은 리신 또는 아스파라긴산이고; Xaa18은 프롤린 또는 루이신이며; Xaa19는 리신이다.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 비극성 아미노산이 메티오닌, 글리신 또는 프롤린인 상처 드레싱.
  28. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 염기성 아미노산이 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노페닐알라닌, 및 2,4-디아미노부티르산인 상처 드레싱.
  29. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인-유사 아미노산이 시스테인, 호모시스테인, 페니실라민 또는 β-메틸 시스테인인 상처 드레싱.
  30. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 지방족 아미노산이 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산인 상처 드레싱.
  31. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산인 상처 드레싱.
  32. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 아미노산이 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드, 호모세린, 또는 메티오닌, 글리신 또는 프롤린과 같은 비극성 아미노산인 상처 드레싱.
  33. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있으며, 방향족 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐알라닌인 상처 드레싱.
  34. 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 또는 서열 13을 포함하며 매트릭스 메탈로프로테이나제를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 펩티드를 포함하는 상처 드레싱.
  35. 제23항 내지 제26항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 성장을 자극할 수 있는 것인 상처 드레싱.
  36. 제23항 내지 제26항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포 또는 각질세포에 대한 화학유인물질인 상처 드레싱.
  37. 제23항 내지 제26항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포에서 콜라겐 생산을 자극할 수 있는 것인 상처 드레싱.
  38. 제23항 내지 제26항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상처 치유를 촉진시키거나, 흉터를 방지하거나, 피부 색조를 향상시키거나, 주름을 감소시키거나 또는 매끄럽고 건강한 피부의 발생을 자극하는 상처 드레싱.
  39. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 하기 화학식 I의 펩티드를 포함하는, 노화 작용의 감소를 위한 피부 처리용 로션.
    <화학식 I>
    상기 식에서,
    Xaa1, Xaa4및 Xaa6은 각각 개별적으로 비극성 아미노산이고;
    Xaa2는 염기성 아미노산이고;
    Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
    Xaa5는 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    Xaa7은 산성 아미노산이고;
    Xaa8은 지방족 아미노산 또는 극성 아미노산이며;
    Xaa9는 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 염기성 아미노산이다.
  40. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 하기 화학식 II의 펩티드를 포함하는, 노화 작용의 감소를 위한 피부 처리용 로션.
    <화학식 II>
    상기 식에서,
    Xaa10은 극성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa11은 극성 아미노산 또는 방향족 아미노산이고;
    Xaa12는 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 지방족 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa13은 방향족 아미노산, 지방족 아미노산, 극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa14는 방향족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa15는 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa16은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa17은 염기성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa18은 비극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이며;
    Xaa19는 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다.
  41. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 하기 화학식 III의 펩티드를 포함하는, 노화 작용의 감소를 위한 피부 처리용 로션.
    <화학식 III>
    상기 식에서,
    Xaa1, Xaa4및 Xaa6은 각각 개별적으로 비극성 아미노산이고;
    Xaa2는 염기성 아미노산이고;
    Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
    Xaa5는 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    Xaa7은 산성 아미노산이고;
    Xaa8은 지방족 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa9는 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 염기성 아미노산이고;
    Xaa10은 극성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa11은 극성 아미노산 또는 방향족 아미노산이고;
    Xaa12는 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 지방족 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa13은 방향족 아미노산, 지방족 아미노산, 극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa14는 방향족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa15는 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa16은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa17은 염기성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa18은 비극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이며;
    Xaa19는 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다.
  42. 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 하기 화학식 IV의 펩티드를 포함하는, 노화 작용의 감소를 위한 피부 처리용 로션.
    <화학식 IV>
    (서열 18)
    상기 식에서,
    Xaaa는 프롤린이고; Xaab는 글루타민 또는 글루탐산이고; Xaac는 쓰레오닌이고; Xaad는 글리신이고; Xaae는 아스파라긴산 또는 글루탐산이고; Xaaf는 루이신이고; Xaag는 아스파라긴산이고; Xaah는 글루타민 또는 세린이고; Xaai는 아스파라긴 또는 알라닌이고; Xaaj는 쓰레오닌이고; Xaak는 이소루이신 또는 루이신이고; XaaL은 글루탐산 또는 리신이고; Xaam은 쓰레오닌 또는 알라닌이고; Xaan은 메티오닌이고; Xaao는 아르기닌이며; Xaap는 리신 또는 쓰레오닌이고;
    Xaa1은 프롤린이고; Xaa2는 아르기닌이고; Xaa3은 시스테인이고; Xaa4는 글리신이고; Xaa5는 발린 또는 아스파라긴이고; Xaa6은 프롤린이고; Xaa7은 아스파라긴산이고; Xaa8은 발린 또는 루이신이고; Xaa9는 알라닌 또는 글리신이고; Xaa10은 아스파라긴 또는 아르기닌이고; Xaa11은 티로신 또는 페닐알라닌이고; Xaa12는 아스파라긴 또는 글루타민이고; Xaa13은 페닐알라닌 또는 쓰레오닌이고; Xaa14는 페닐알라닌이고; Xaa15는 프롤린 또는 글루탐산이고; Xaa16은 아르기닌 또는 글리신이고; Xaa17은 리신 또는 아스파라긴산이고; Xaa18은 프롤린 또는 루이신이며; Xaa19는 리신이다.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 비극성 아미노산이 메티오닌, 글리신 또는 프롤린인 로션.
  44. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 염기성 아미노산이 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산인 로션.
  45. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인-유사 아미노산이 시스테인, 호모시스테인, 페니실라민 또는 β-메틸 시스테인인 로션.
  46. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 지방족 아미노산이 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산인 로션.
  47. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산인 로션.
  48. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 아미노산이 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드, 호모세린, 또는 메티오닌, 글리신 또는 프롤린과 같은 비극성 아미노산인 로션.
  49. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 방향족 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐 알라닌인 로션.
  50. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 드레싱이 피부 색조를 향상시키거나, 주름을 감소시키거나 또는 매끄럽고 건강한 피부의 발생을 자극하는 것인 로션.
  51. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 성장을 자극할 수 있는 것인 로션.
  52. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포 또는 각질세포에 대한 화학유인물질인 로션.
  53. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포에서 콜라겐 생산을 자극할 수 있는 것인 로션.
  54. 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 또는 서열 13을 포함하며 매트릭스 메탈로프로테이나제를 저해할 수 있는 펩티드를 포함하는 로션.
  55. 제54항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 것인 로션.
  56. 제54항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포 또는 각질세포에 대한 화학유인물질인 로션.
  57. 제54항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포에서 콜라겐 생산을 자극할 수 있는 것인 로션.
  58. 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 성장을 촉진시킬 수 있는 치료 유효량의 하기 화학식 I의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 건강한 피부의 발생을 촉진시키는 방법.
    <화학식 I>
    상기 식에서,
    Xaa1, Xaa4및 Xaa6은 각각 개별적으로 비극성 아미노산이고;
    Xaa2는 염기성 아미노산이고;
    Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
    Xaa5는 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    Xaa7은 산성 아미노산이고;
    Xaa8은 지방족 아미노산 또는 극성 아미노산이며;
    Xaa9는 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 염기성 아미노산이다.
  59. 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 성장을 촉진시킬 수 있는 치료 유효량의 하기 화학식 II의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 건강한 피부의 발생을 촉진시키는 방법.
    <화학식 II>
    상기 식에서,
    Xaa10은 극성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa11은 극성 아미노산 또는 방향족 아미노산이고;
    Xaa12는 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 지방족 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa13은 방향족 아미노산, 지방족 아미노산, 극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa14는 방향족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa15는 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa16은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa17은 염기성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa18은 비극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이며;
    Xaa19는 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다.
  60. 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 성장을 촉진시킬 수 있는 치료 유효량의 하기 화학식 III의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 건강한 피부의 발생을 촉진시키는 방법.
    <화학식 III>
    상기 식에서,
    Xaa1, Xaa4및 Xaa6은 각각 개별적으로 비극성 아미노산이고;
    Xaa2는 염기성 아미노산이고;
    Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
    Xaa5는 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이고;
    Xaa7은 산성 아미노산이고;
    Xaa8은 지방족 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa9는 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 염기성 아미노산이고;
    Xaa10은 극성 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa11은 극성 아미노산 또는 방향족 아미노산이고;
    Xaa12는 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 지방족 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa13은 방향족 아미노산, 지방족 아미노산, 극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa14는 방향족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 극성 아미노산이고;
    Xaa15는 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa16은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이고;
    Xaa17은 염기성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 아미노산, 비극성 아미노산 또는 산성 아미노산이고;
    Xaa18은 비극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이며;
    Xaa19는 염기성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다.
  61. 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해하거나 섬유아세포 또는 각질세포의 성장을 촉진시킬 수 있는 치료 유효량의 하기 화학식 IV의 펩티드를 투여하는것을 포함하는, 건강한 피부의 발생을 촉진시키는 방법.
    <화학식 IV>
    (서열 18)
    상기 식에서,
    Xaaa는 프롤린이고; Xaab는 글루타민 또는 글루탐산이고; Xaac는 쓰레오닌이고; Xaad는 글리신이고; Xaae는 아스파라긴산 또는 글루탐산이고; Xaaf는 루이신이고; Xaag는 아스파라긴산이고; Xaah는 글루타민 또는 세린이고; Xaai는 아스파라긴 또는 알라닌이고; Xaaj는 쓰레오닌이고; Xaak는 이소루이신 또는 루이신이고; XaaL은 글루탐산 또는 리신이고; Xaam은 쓰레오닌 또는 알라닌이고; Xaan은 메티오닌이고; Xaao는 아르기닌이며; Xaap는 리신 또는 쓰레오닌이고;
    Xaa1은 프롤린이고; Xaa2는 아르기닌이고; Xaa3은 시스테인이고; Xaa4는 글리신이고; Xaa5는 발린 또는 아스파라긴이고; Xaa6은 프롤린이고; Xaa7은 아스파라긴산이고; Xaa8은 발린 또는 루이신이고; Xaa9는 알라닌 또는 글리신이고; Xaa10은 아스파라긴 또는 아르기닌이고; Xaa11은 티로신 또는 페닐알라닌이고; Xaa12는 아스파라긴 또는 글루타민이고; Xaa13은 페닐알라닌 또는 쓰레오닌이고; Xaa14는 페닐알라닌이고; Xaa15는 프롤린 또는 글루탐산이고; Xaa16은 아르기닌 또는 글리신이고; Xaa17은 리신 또는 아스파라긴산이고; Xaa18은 프롤린 또는 루이신이며; Xaa19는 리신이다.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상처 치유를 촉진시키거나, 흉터를 방지하거나, 피부 색조를 향상시키거나, 주름을 감소시키거나 또는 매끄럽고 건강한 피부의 발생을 자극하는 방법.
  63. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 또는 서열 13을 포함하는 것인 방법.
  64. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 비극성 아미노산이 메티오닌, 글리신 또는 프롤린인 방법.
  65. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 염기성 아미노산이 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산인 방법.
  66. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인-유사 아미노산이 시스테인, 호모시스테인, 페니실라민 또는 β-메틸 시스테인인 방법.
  67. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 지방족 아미노산이 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, t-부틸알라닌, N-메틸이소루이신, 노르루이신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산인 방법.
  68. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 아미노산이 아스파라긴산 또는 글루탐산인 방법.
  69. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 극성 아미노산이 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드, 호모세린, 또는 메티오닌, 글리신 또는 프롤린과 같은 비극성 아미노산인 방법.
  70. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 방향족 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐알라닌인 방법.
  71. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포 또는 각질세포의 세포 증식을 자극할 수 있는 것인 방법.
  72. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포 또는 각질세포에 대한 화학유인물질인 방법.
  73. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 섬유아세포에서 콜라겐 생산을 자극할 수 있는 것인 방법.
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