CN105412916B - 治疗乳腺癌的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供了治疗乳腺癌的组合物，其包含抗癌有效成分以及药学上可接受的载体，其中所述抗癌有效成分优选为胶原酶Ⅱ。本申请还提供了所述组合物在制备用于缓解、治疗或抑制乳腺癌的药物中的用途。上述组合物适用于乳腺内注射或植入、乳腺癌内注射或植入、乳腺癌手术后瘤腔内注射或植入。该抗癌组合物可被制成各种药物剂型，优选为注射剂和植入剂。

Description

治疗乳腺癌的组合物及其用途

技术领域

本申请涉及一种治疗乳腺癌的组合物，具体地，涉及一种包含基质金属蛋白酶的抗癌组合物以及其在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。

背景技术

中国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一，中国抗癌协会公布的统计数字显示，我国近年来乳癌发病率正以每年3％的速度递增，成为城市中死亡率增长最快的癌症，发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势。

乳腺癌已经成为城市女性的第一杀手，在北京、上海、广州等大城市发病率更高。以上海为例，1972年，上海女性的乳腺癌发病率为17/10万，1992年上升到34/10万，2000年，则迅速上升至56.2/10万。也就是说，从1992年～2000年8年间的上升幅度，超过了1972～1992年20年间的上升幅度。2008年已迅速上升至62.5/10万人。北京从1978年开始，乳腺癌已经成为妇女发病率最高的恶性肿瘤，近年来还以每年2.4％的速度上升，现在年发病率已经达到54/10万人。大城市中的乳腺癌发病率，有逐步接近欧美发达国家水平的趋势。

中国主要城市10年来乳腺癌发病率增长了37％，死亡率增长了38.9％，农村死亡率增长了39.7％。相关资料显示，西方妇女乳腺癌的发病人数高峰期为50～55岁，而且随着年龄越长，发病率越高。但中国女性的乳腺癌发病年龄，要比西方女性小10岁左右。

全世界每年约有120万妇女患乳腺癌，50万死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位。中国女性乳腺癌发病率上升，近5年增长三倍。

乳腺癌的治疗方法包括根治性切除术、放疗、化疗和激素抑制。局部乳腺癌的优选治疗是根治性切除术。但大多数病人发现时已属中晚期，丧失了手术的机会。许多病人即使接受早期手术，数年后仍可能局部复发。对于晚期病人而言，放疗、化疗和激素抑制虽有一定的效果，但全世界每年约有50万死于乳腺癌的事实充分说明了探求更有效的治疗方法和药物的必要性和紧迫性。

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解和肿瘤血管生长在肿瘤发生发展、浸润、扩散、转移方面起着重要的作用。科学家一直试图通过抑制或降低负责降解ECM的基质金属蛋白酶(MMPs)活性或表达来实现治疗肿瘤的目的，如使用MMPs抑制剂、抗胶原酶单抗等。但迄今为止此类尝试尚未见临床成功的先例。

另外，也有研究试图通过激活或促进细胞外基质降解以实现治疗肿瘤的目的，但均未能取得理想疗效。

基质金属蛋白酶(MMPs)种类繁多，功能尚不清楚。MMP亚型中的胶原酶至少有5种以上，不同胶原酶之间的关系尚不清楚，与其它MMPs的关系更有待探讨。粗制的胶原酶还含有其它水解酶，因此容易产生其它意想不到的副作用。

因此，需要寻求一种新的能够有效治疗乳腺癌的抗癌组合物以及治疗方法。

发明内容

一方面，本申请提供了一种治疗乳腺癌的组合物，其包含抗癌有效成分以及药学上可接受的载体，其中所述抗癌有效成分包含胶原酶Ⅱ或者胶原酶Ⅱ与其他基质金属蛋白酶的组合。

在优选的实施方案中，抗癌组合物中的有效成分选自胶原酶Ⅱ或者胶原酶Ⅱ与其他基质金属蛋白酶的组合。优选地，所述其他基质金属蛋白酶选自MMP-1、MMP-12或其组合。在更优选的实施方案中，抗癌组合物中的有效成分为胶原酶Ⅱ。

在某些实施方案中，上述抗癌组合物被配制成药学上可接受的剂型，优选为注射剂、缓释剂、植入剂，更优选为缓释植入剂。

另一方面，本申请提供了上述组合物在治疗乳腺癌中的用途。

另一方面，提供了本发明的组合物在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途。

在某些实施方案中，包含本发明抗癌有效成分的药物以注射、灌注或植入的方式给药，优选地，所述药物经局部给药。在优选的实施方案中，所述药物经乳腺内注射、乳腺癌内或癌周注射、或乳腺癌手术后瘤腔内注射给药，优选地经乳腺癌内注射给药。在另一实施方案中，所述药物经乳腺内植入、乳腺癌内或癌周植入、或乳腺癌手术后瘤腔内植入给药，优选地经乳腺癌内植入给药。

在一些实施方案中，本发明的抗癌有效成分，优选为胶原酶Ⅱ的给药剂量为每千克个体体重给予0.01到5,000,000 U。在优选的实施方案中，胶原酶Ⅱ的给药剂量为每千克个体体重给予1到500,000 U。在更优选的实施方案中，胶原酶Ⅱ的给药剂量为10-100,000U/kg个体体重。进一步优选地，胶原酶Ⅱ的给药剂量为10-50,000 U/kg个体体重。

再一方面，提供了治疗乳腺癌的方法，该方法包括将抗癌组合物给予患病个体来治疗乳腺癌。乳腺癌可以是原发性的，也可以是转移癌。在优选的实施方案中，该治疗方法涉及应用外源性的胶原酶Ⅱ，优选的是局部应用胶原酶Ⅱ，局部缓释最为优选。单独应用胶原酶Ⅱ对乳腺癌的生长具有明显的剂量依赖性抑制作用，局部应用作用更加明显。

具体实施方式

本申请提供了一种治疗乳腺癌的组合物，其包含抗癌有效成分以及药学上可接受的载体，其中所述抗癌有效成分包含胶原酶Ⅱ或者胶原酶Ⅱ与其他基质金属蛋白酶的组合。

在优选的实施方案中，上述抗癌组合物包含的抗癌有效成分选自胶原酶Ⅱ或者胶原酶Ⅱ与其他基质金属蛋白酶的组合。优选地，所述其他基质金属蛋白酶选自MMP-1、MMP-12或其组合。在更优选的实施方案中，抗癌组合物中的有效成分为胶原酶Ⅱ，即MMP-8。

本发明所述的“MMP-8”、“MMP-12”和“MMP-1”均为基质金属蛋白酶(MMPs)家族的成员。MMPs是一类对细胞外基质(ECM)有特殊降解作用的蛋白水解酶，能降解细胞外基质的多种成分。到目前为止，已有报道的MMPs有二十多种，根据其蛋白结构和作用底物的特异性可以分为5个亚型：(1)胶原酶(MMP-1,8,13)、(2)明胶酶(MMP-2,9)、(3)间质溶解素(MMP3,10,11)、(4)模型MTMMPs(MMP-14,15,16,17,24,25)和(5)其他亚群(MMP7,12,20,23)。其中，MMP-1又名间质胶原酶(或胶原酶I)，分布广泛，其主要由成纤维细胞分泌，是成纤维细胞型胶原酶，可切割I、Ⅱ、Ⅲ、VII、VIII、X型胶原、明胶、可聚蛋白多糖和细胞粘合素。MMP-13又称为胶原酶Ⅲ，可以优先降解Ⅱ型胶原。MMPs家族的成员众多，不同成员间可能相互调节、激活或抑制，某些成员间的平衡失调在肿瘤发生发展、浸润、扩散、转移及血管生成过程中可能发挥重要的作用。

本发明的“胶原酶Ⅱ”即中性粒细胞胶原酶，又称MMP-8、胶原蛋白酶-2、2型胶原酶、2型胶原蛋白酶或胶原酶-2等。MMP-8(EC3.4.24.34)在SDS-PAGE凝胶电泳中，原酶总蛋白的95％主带为75kDa，APMA激活后主带为58 kDa。胶原酶Ⅱ不仅可以降解多种胶原蛋白，还参与机体免疫及蛋白跨膜运动。除胶原蛋白外，胶原酶Ⅱ对其它细胞外间质及其中的巨噬细胞、免疫细胞、细胞生长因子、血管生长因子可能也有不同程度的直接或间接的降解作用。在本发明的抗癌组合物中，胶原酶Ⅱ可以与其它蛋白酶或适于增加胶原酶Ⅱ活性或辅助肿瘤降解的蛋白酶合并应用。例如，胶原酶Ⅱ可以与其他基质金属蛋白酶或它们的混合物合并应用。

本发明人经过大量研究发现，单独应用胶原酶Ⅱ或应用胶原酶Ⅱ与其他基质金属蛋白酶的组合能够抑制乳腺癌的生长，例如单独应用胶原酶Ⅱ对乳腺癌的生长具有明显的剂量依赖性抑制作用。虽然详细的机理有待进一步研究，但由外源性胶原酶Ⅱ所导致的MMPs家族成员间的平衡失调可能对于治疗乳腺癌发挥重要作用。因此，选择性维护MMPs家族成员间的平衡和破坏其已有的平衡对有效预防和治疗乳腺癌及其它肿瘤将会发挥潜在作用。本发明应用的外源性胶原酶Ⅱ可能在体内的其它蛋白水解酶存在的情况下，降解胶原或结缔组织、肿瘤血管和/或肿瘤细胞基膜，通过对间质的水解作用使肿瘤生长失去支撑和必要的营养。结果，肿瘤的供血减少或停止，导致肿瘤细胞死亡。胶原酶Ⅱ降解蛋白多糖、降解基质胶原的过程以及降解产物不仅能够直接限制肿瘤细胞生长，其可能触发的抗肿瘤免疫反应也可能发挥一定的抗肿瘤作用，因为最新的研究表明胶原酶Ⅱ能够导致白介素6和8等炎症因子的激活。因此认为外源性胶原酶Ⅱ可能会导致机体免疫系统向肿瘤进一步的攻击，有助于减轻或防止乳腺癌的发展和扩散。除此之外，高浓度的胶原酶Ⅱ对肿瘤细胞本身也可能具有直接抑制作用。

本申请所述的“药学上可接受的载体”指不干扰活性成分的生物活性有效性的载体。本申请的药学上可接受的载体可以为固体或液体，包括药学上可接受的赋形剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、稀释剂、封装剂、填充剂等。例如，药学上可接受的缓冲剂进一步包括磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐以及碳酸盐等。

本申请的药物组合物可以呈现为单位剂量形式，并且可以通过任一制药领域公知的方法制备。所有方法都包括将本申请的活性成分与一种或几种药学上可接受的载体结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体、固体载体或二者结合来制备组合物，随后根据需要来定型制备的产物。例如，适于胃肠外给药的组合物可以是包含活性组分的无菌水性或非水性制剂。可以根据已知的方法，使用合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂制备上述制剂。在可接受的载体或溶剂中，可以使用水、林格氏液以及等渗的氯化钠溶液等。

在某些实施方案中，本发明所述的抗癌组合物被配制成药学上或临床上可接受的多种剂型，包括但不限于注射剂、片剂、胶囊、软膏、喷雾剂、贴剂、缓释剂、植入剂等。在优选的实施方案中，所述剂型为缓释剂。更优选地，配制的剂型为缓释植入剂。缓释剂、植入剂、缓释剂植入剂的制备可参考已公开的专利(CN200610201195.1、CN200610201190.9、CN200610201201.3、CN200610201187.7、CN200610201182.4、CN200610201186.2、CN200610201184.3、CN200610201180.5、CN200610201173.5、CN200610201343.X、CN200810304640.6)。此外，已发现静脉内注射胶原酶对试验动物的危害极小。大鼠急性静脉注射的LD-50可达1200U/kg。对小鼠而言，静脉注射的LD-50为400mg/kg体重。已有研究表明，胶原酶的口服水溶液在剂量高到10,000mg/kg体重时仍无毒性。

本发明的“注射剂”是指由药物制成的供注入体内的溶液(包括乳浊液和混悬液)以及供临用前配成溶液或混悬液的粉末或溶液。所述注射剂包括但不限于水溶液注射剂、微球注射剂、凝胶型注射剂、脂质体注射剂、纳米粒注射剂、储库型控释注射剂、无针注射释药系统等。

本发明的“植入剂”一般指将药物与辅料制成的小块状或条状供植入体内的无菌固体制剂。植入剂可采用特制的注射器植入，也可用手术切开植入。本发明的植入剂还包括以液体形式注射于人体、在生理条件下转变为固体或半固体药物贮库的植入剂形式，即注射型原位形成植入剂(injectable in situ forming implants)。

在优选的实施方案中，将本发明的抗癌组合物制备成局部应用的水溶液。可选地，也可以将本发明的抗癌组合物先冷冻干燥，置于安剖瓶中，临用前将其配制成适用于注射的药学上可接受的水溶液，优选含有1-500,000U/ml胶原酶Ⅱ，更优选10-50,000U/ml，进一步优选含有200-10,000U/ml的胶原酶Ⅱ。

在一实施方案中，将冷冻干燥的胶原酶Ⅱ用生理盐水溶解配制，所得溶液的浓度为1-500,000U/ml，优选10-50,000U/ml，更优选200-10,000U/ml。当在4℃以冷冻干燥保存时，酶是稳定的。在开启前将装有冷冻干燥酶的冷小管升温至室温。一般将重新溶解的酶溶液避光存储于2-8℃，当在工作台进行操作使将它们置于冰浴中。可以按照本领域已知的方法来配制本发明的组合物。

优选地，用新鲜蒸馏的去离子无菌水制备用于可注射用溶液的缓冲液。可以使用任何合适的缓冲溶液如磷酸缓冲液、Ringers缓冲液或Tris缓冲液来配制抗癌组合物。优选的缓冲液的pH为生理pH，范围约为6.4到7.6，优选为6.8-7.2。例如，可以使用浓度为约0.1-0.3mol/L、优选0.15-0.25 mol/L的氯化钠来溶解或稀释组合物。再例如，使用柠檬酸盐缓冲液，其浓度为0.01-0.2 mol/L，优选为0.05-0.15 mol/L。

本发明所用的胶原酶Ⅱ可以自制，也可以商购。胶原酶Ⅱ可以是重组的蛋白，也可以是从人及动物组织细胞分离纯化的。由于潜在的免疫问题，胶原酶Ⅱ优选是人类的酶或由重组方法产生的酶。在一实施方案中，胶原酶Ⅱ从Life Technologies公司购得，冷冻干燥的胶原酶Ⅱ的酶活力为342-784U/mg，用无热原的盐水重新溶解至所需的浓度。所有酶的活性都以每mg国际单位表示。一个单位胶原酶活性的可以定义为在钙离子存在时，在温度为37℃以及pH为7.4的条件下，5小时内能从天然胶原释放肽(相当于茚三酮颜色)成1微摩尔L-亮氨酸的胶原酶量。可以按本领域已知的方法确定胶原酶Ⅱ和其它酶的活性。

另一方面，提供了上述组合物在治疗乳腺癌中的用途。

本文所用的“治疗”包括抑制、治愈和减轻乳腺癌或其症状和预防或延缓乳腺癌的转移。

另一方面，提供了本发明的组合物在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途。在优选的实施方案中，所述药物的有效成分选自胶原酶Ⅱ或者胶原酶Ⅱ与其他基质金属蛋白酶的组合，优选地，所述其他基质金属蛋白酶选自MMP-1、MMP-12或其组合。

在优选的实施方案中，本发明的抗癌有效成分、优选为胶原酶Ⅱ的给药剂量为每千克个体体重给予0.01到-5,000,000 U，优选为1到500,000 U，更优选为10到100,000 U，最优选为10到50,000 U，例如为10-4,000U。胶原酶Ⅱ的剂量在实际应用时可以按照医生的要求选用。

给药剂量随患者的年龄、病症的特性、肿瘤大小、给药部位、给药途径及组合物的效力等变化。如上所述，按患者体重计算，给药剂量可为0.01-5,000,000U/kg，优选1-500,000U/kg，更优选10-100,000U/kg。组合物中胶原酶Ⅱ的浓度可为任意的，选自1-500,000U/ml，优选10-50,000U/ml，更优选200-10,000U/ml。组合物的给药体积可以为0.001到100ml,优选0.01到50ml，更优选为0.02到40 ml。根据实际需要，组合物可一次性给药，也可分次给药。例如，瘤内注射可以第一次给药0.01-0.1 ml，以后每天或每周注射。

为了确定合适的剂量，先确定肿瘤的尺寸，因为较大的肿瘤可能需要应用较高浓度的本发明的组合物。例如，对小于1g的肿瘤，可以应用单次灌输的剂量。灌输剂量可以为0.01-5ml，优选地含有10-500,000U/ml的胶原酶Ⅱ。缓慢地将药物注射入肿瘤，如约10-40分钟。如果需要，在此注射后还可进行再次注射。例如，在1周或1个月内，也可重复应用如每周或每月一次。当肿瘤为3到5g时，在第一次注射剂量后还可以再次施用较大剂量的抗癌组合物。例如，第一次施用5-10ml灌注剂量。然后，缓慢地施用第二份20-50ml的相同组合物，例如给药时间为约20-40分钟。如果需要还可以再次给药。例如，可以再次应用这种治疗，如每周或每月给药一次。当肿瘤为5到10g时，在第一次注射剂量后还可以再次施用较大剂量的抗癌组合物。例如，第一次施用10-20ml灌注剂量。然后，缓慢地施用第二份20-50ml的相同组合物，例如给药时间为20-40分钟。如果需要还可以再次给药。例如，可以再次应用这种治疗，如每周或每月给药一次。对于大于15g的肿瘤，第一次给药的灌注剂量可以至多为50-80ml，随后可以应用更大的剂量。

在某些实施方案中，上述药物以注射、灌注或植入的方式给药，任选地，药物可以口服或静脉给药，也可以经动脉、体腔、瘤腔、瘤内给药，例如动脉注射、体腔注射等。

在优选的实施方案中，所述药物经局部给药。将此组合物局部应用于乳腺或乳腺癌内。局部给药包括将药物应用于乳腺和/或癌细胞或肿瘤内或其附近，优选为肿瘤内。局部给药还包括用药物包围乳腺和/或癌性肿瘤或将药物应用于乳腺和/或癌性肿瘤的表面。例如，局部应用治疗有效量的肠胃外组合物的水溶液来治疗乳腺癌。优选地，该量足以降解乳腺肿瘤，治愈或减轻乳腺癌。在一实施方案中，将药物通过直接的乳腺内注射或灌注给药于癌症局部。例如，小容量如约5-10ml或更少的药物通过注射给药。而较大的容量如5ml以上的药物则通过缓慢灌注约10-40分钟给药。

在优选的实施方案中，所述药物经乳腺内注射、乳腺癌内或癌周注射、或乳腺癌手术后瘤腔内注射给药，优选地经乳腺癌内注射给药。例如，注射的组合物的量通常为1-80ml。在另一实施方案中，所述药物经乳腺内植入、乳腺癌内或癌周植入、或乳腺癌手术后瘤腔内植入给药，优选地经乳腺癌内植入给药。

可选地，为了在原发性或转移性肿瘤所在部位获得有效浓度，药物组合物可以经多种途径联合给药，如选择静脉、淋巴管、皮下、肌肉、腔内(如腹腔、胸腔、关节腔内及椎管内)或动脉注射的同时结合局部给药，局部给药可选择局部注射或局部植入。这种多途径联合给药特别适用于实体肿瘤的治疗。最优选的方案是瘤内、瘤周注射的同时结合全身注射。

可以选用其他的方式例如利用不同的药物载体将组合物递送到靶部位。通常，合适的载体将治疗剂递送到其靶点而不会丧失特异性或反应性。优选地，载体能与胶原酶Ⅱ连接且可保持复合物状态直到递送完成。优选地，载体应避免触发导致本发明组合物生物降解或失活。可以应用缓释组合物，例如可以用缓释植入法提供这种制剂，或以微胶囊或吸附于生物可降解聚合物提供这种制剂。在其他实施方案中，可以将抗体应用于本发明的胶原酶Ⅱ脂质体载体系统，如人-鼠(嵌合的)单克隆抗体，以实现对靶部位的特异性定位。还可以将胶原酶Ⅱ包埋在组蛋白、血红细胞(RBC)空胞(ghost)、聚乳酸和其它生物可降解膜或合成的微胶囊，以增加和维持溶解的蛋白酶在乳腺组织中的定向、定位和活性。

另一方面，提供了用本发明的组合物治疗乳腺癌的方法，该方法包括给予患病个体治疗有效量的抗癌活性成分。优选地，所述抗癌活性成分包含胶原酶Ⅱ或者胶原酶Ⅱ与其他基质金属蛋白酶的组合。所述治疗有效量是指能缓解、治愈、抑制或防止乳腺癌或者预防或减轻乳腺癌扩散的量。

在优选的实施方案中，上述抗癌组合物包含的抗癌有效成分选自胶原酶Ⅱ或者胶原酶Ⅱ与其他基质金属蛋白酶的组合。在更优选的实施方案中，抗癌组合物中的有效成分为胶原酶Ⅱ。

在优选的实施方案中，本发明的抗癌有效成分、优选为胶原酶Ⅱ的给药剂量为每千克个体体重给予0.01到5,000,000 U，优选为1到500,000 U，更优选为10-100,000 U。在更优选的实施方案中，胶原酶Ⅱ的给药剂量为10-50,000 U/kg体重，例如为10-4,000U/kg体重。组合物中胶原酶的浓度可以为方便配制而定，可以为任意的。

按接受治疗的个体的情况，用于治疗乳腺癌组合物的体积例如可以为0.001ml到100ml，优选地含有1-500,000U/ml胶原酶Ⅱ，优选为10-50,000U/ml，更优选为200-10,000U/ml。在一实施方案中，药物组合物含有10,000U/ml胶原酶Ⅱ,用于治疗小白鼠乳腺癌，每周瘤内注射一次，每次5ml，共3次。在另一实施方案中，药物组合物含有5,000U/ml胶原酶Ⅱ,用于治疗小白鼠乳腺癌，每3天瘤内注射一次，每次3ml，共3次。这些剂量范围表示估计能有效治疗乳腺癌的组合物各成分的量。但组合物的剂量可以按患者的年龄、肿瘤部位和大小、组合物的效力及给药途径等变化。用于治疗乳腺癌的组合物可以每天、每周或每月注射。

对于转移的乳腺癌，可以通过影像学检测到的或可用手触及到的病变均可按照原发灶一样处理，可以多点注射或先后不同点处理。

本发明抗癌组合物中的有效成分较单一，疗效易于控制和确认；不良反应少。在一些实施方案中，抗癌有效成分以相当低的剂量就能够取得明显的抗癌功效，例如给药剂量为10U-900 U/kg个体体重的胶原酶Ⅱ能够以剂量依赖性方式显著抑制乳腺肿瘤的生长。

本申请所述的“个体”，是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。

本文中，有效成分、活性成分以及活性组分可以交替使用，除非另有所指。本文中的胶原酶Ⅱ也可以与MMP-8互换使用。

本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。

应该理解，在本发明的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。

上述公开内容总体上描述了本发明，通过下面的实施例进一步示例本发明。描述这些实施例仅为说明本发明，而不是限制本发明的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本发明的范围。除非特别指明，本说明书中的实验方法和技术为本领域技术人员所公知的方法和技术。

实施例

以下实施例中使用的实验动物为体重20-26g的雄性昆明小鼠，购自山东鲁抗医药集团中心实验动物室。注射的乳腺癌瘤细胞由山东省医学科学院提供。实验中使用的胶原酶Ⅱ、MMP-12以及MMP-7购自Life Technologies公司。

肿瘤体积的测量方法：用游标卡尺分别测量肿瘤的长径和短径，肿瘤体积的计算公式为：V＝(长径*短径²)/2。

统计学方法：结果以均值±标准误表示。两组数据间采用t-检验分析，多组结果比较采用单因素方差分析Tukey检验(One-way ANOVA Tukey's test)进行分析，P<0.05为差异有显著性。

实施例1 不同剂量的胶原酶体内抑瘤效果比较

将2x10⁵个乳腺癌瘤细胞经皮下注射于小白鼠的季肋部，待肿瘤生长7天后将其分为以下10组(每组6只，见表1)。第1组为对照组，第2-4组为MMP-8(即胶原酶Ⅱ)治疗组，第5-7组为MMP-12治疗组，第8-10组为MMP-7治疗组。药物经瘤内注射，剂量按公斤体重(mg/kg)计算(具体剂量见表1)。每天给药一次，共3次。治疗后第15天测量肿瘤体积大小，比较各组的治疗效果(参见表1)。所用胶原酶Ⅱ(MMP-8)的活力为342U/mg，MMP-12的活力为180U/mg，MMP-7的活力为186U/mg。其他实施例中的MMP-8的活力也均为342U/mg。

表1

试验组(n＝6)	接受的治疗	肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)	P值
				1	对照	1675±287
2	MMP-8,0.03mg/kg	1436±132	<0.05
				3	MMP-8,0.07 mg/kg	1244±74.2	<0.05
4	MMP-8,0.14 mg/kg	814±47.9	<0.001
				5	MMP-12,0.10 mg/kg	1723±112	>0.05
6	MMP-12,0.30 mg/kg	1555±151	>0.05
				7	MMP-12,0.60 mg/kg	1172±141	<0.05
8	MMP-7,0.20 mg/kg	1795±249	>0.05

9	MMP-7,0.40 mg/kg	1675±261	>0.05
				10	MMP-7,0.80 mg/kg	1507±352	>0.05

如表1的结果所示，不同的MMP单独应用时对肿瘤生长的抑制作用差别很大。例如，胶原酶Ⅱ在仅为0.03 mg/kg时，就能够显著抑制肿瘤生长；而MMP-7在高达0.80 mg/kg时仍无明显的抑瘤作用。MMP-12在0.10mg/kg和0.30 mg/kg时不能有效地抑制肿瘤生长，当增加到0.60mg/kg时，对肿瘤产生了显著的抑制作用(P<0.05)，但仍明显低于0.14mg/kg胶原酶Ⅱ的抑瘤效果(P<0.001)。

胶原酶Ⅱ能够显著抑制肿瘤生长，其作用表现出明显的量效关系。例如，0.03 mg/kg胶原酶Ⅱ治疗组的肿瘤体积为1436±132mm³(P<0.05，相比于对照组的肿瘤体积1675±287 mm³)；用0.07 mg/kg胶原酶Ⅱ治疗时，肿瘤体积降到了1244±74.2mm³；0.14 mg/kg胶原酶Ⅱ治疗组的肿瘤体积则进一步降至814±47.9mm³(P<0.001)。

这些数据表明，胶原酶Ⅱ在剂量远远低于其他MMP时就能够产生显著的抑制乳腺肿瘤的作用。

实施例2 胶原酶Ⅱ经不同途径给药时体内抑瘤效果比较

将5x10⁵个乳腺癌瘤细胞经皮下注射于小白鼠季肋部，待肿瘤生长7天后将其分为以下10组(每组6只，见表2)，通过不同途径注射胶原酶Ⅱ。第1组为对照，第2-4组为瘤内注射(it)治疗组，第5-7组为尾静脉注射(iv)治疗组，第8-10组为腹腔注射(ip)治疗组。药物剂量按公斤体重(mg/kg)计算。每天给药一次，共3次。治疗后第15天测量肿瘤体积大小，比较各组的治疗效果(见表2)。

表2

组别(n＝6)	接受治疗	肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)	P值
				1	对照	2279±449
2	0.10 mg/kg，IT	1054±91.8	<0.05
				3	0.30 mg/kg，IT	680±105	<0.01
4	0.90 mg/kg，IT	408±85.0	<0.001
				5	0.10 mg/kg，IV	2211±316	>0.05
6	0.30 mg/kg，IV	2109±272	>0.05
				7	0.90 mg/kg，IV	1802±68.0	<0.05

8	0.10 mg/kg，IP	2449±432	>0.05
				9	0.30 mg/kg，IP	2279±428	>0.05
10	0.90 mg/kg，IP	1871±262	<0.05

如表2的结果所示，胶原酶Ⅱ的给药途径不同，对肿瘤生长的抑制程度有显著差异。瘤内注射胶原酶Ⅱ(组2-4)抑制肿瘤生长的作用最强，比静脉注射组(组5-7)和腹腔注射组(组8-10)的抑制作用强10倍以上。

实施例3 胶原酶Ⅱ经不同途径给药时对肿瘤的抑制效果比较

将2x10⁵个乳腺癌瘤细胞皮下注射于小白鼠的季肋部，待肿瘤生长7天后将其分为以下10组(每组6只，见表3)，通过不同途径注射胶原酶Ⅱ。第1组为对照，第2-4组为瘤内注射(IT)治疗组，第5-7组为瘤周注射(PT)治疗组，第8-10组为皮下注射(SC，距离肿瘤边缘1-2厘米)治疗组。药物的给药剂量按公斤体重(U/kg)计算。每天给药一次，共3次。治疗后第15天测量肿瘤体积大小，比较各组的治疗效果(见表3)。

表3

试验组(n＝6)	接受的治疗	肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)	P值
				1	对照	1438±261
2	IT，100U/kg	479±82.8	<0.05
				3	IT，300U/kg	349±87.2	<0.01
4	IT，900U/kg	218±47.9	<0.001
				5	PT，100U/kg	872±255	<0.05
6	PT，300U/kg	741±185	<0.05
				7	PT，900U/kg	436±137	<0.05
8	SC，100U/kg	1394±240	>0.05
				9	SC，300U/kg	1089±224	>0.05
10	SC，900U/kg	959±172	<0.05

如表3的结果所示，胶原酶Ⅱ给药途径不同，对肿瘤生长的抑制程度有明显差异。瘤内注射组(组2-4)和瘤周注射组(组5-7)在几个不同的剂量(100U/kg,300U/kg和900U/kg)均能显著抑制肿瘤生长，其中瘤内注射组的抑瘤作用最强，并且呈现明显的剂量依赖性。相比之下，皮下注射组(组8-10)在给药剂量为900U/kg才产生有统计学意义的抑瘤作用。

实施例4 胶原酶Ⅱ对不同体积肿瘤的抑制作用比较

将相同性别、相近体重的小白鼠分为以下3组，分别将不同数量的乳腺癌瘤细胞经皮下注射于小白鼠季肋部，其中第1组皮下注射2x10⁵个瘤细胞，第2组皮下注射8x10⁵个瘤细胞，第3组皮下注射4x10⁶个瘤细胞。待肿瘤生长14天后测量瘤体大小，然后将每组动物分成两小组(n＝6)，其中一小组接受600U胶原酶Ⅱ瘤内注射；另一小组注射等量生理盐水。治疗后第10天再次测量肿瘤体积大小，比较肿瘤生长抑制率(见表4)。

表4

表4的数据表明，应用等量的胶原酶Ⅱ对不同体积的肿瘤抑制程度不同。相同剂量下，瘤体越大，肿瘤生长抑制率越低。这表明肿瘤体积越大，实现相同的抑制效果需要的药物剂量越大。

实施例5 胶原酶Ⅱ对不同体积肿瘤的抑制作用比较

将相同性别、相近体重的小白鼠分为以下3组，分别将不同数量的乳腺癌瘤细胞经皮下注射于小白鼠季肋部，其中第1组皮下注射2x10⁵个瘤细胞，第2组皮下注射5x10⁵个瘤细胞，第3组皮下注射2x10⁶个瘤细胞。待肿瘤生长14天后测量瘤体大小，然后每组动物分成两小组(n＝6)，其中一小组接受胶原酶Ⅱ瘤内注射，MMP-8剂量按公斤体重(4000U/kg)计算，经瘤内一次注射；另一组注射等量生理盐水。治疗后第10天测量肿瘤体积大小，比较肿瘤生长抑制率(见表5)。

表5

表5的结果表明，应用等量胶原酶Ⅱ对不同体积的肿瘤抑制程度明显不同。相同给药剂量下，瘤体越小，对肿瘤生长的抑制越显著。

可以理解，尽管本发明以某种形式被说明，但本发明并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本发明要求保护的范围内。

Claims (6)

1.组合物在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途，其中所述组合物包含抗癌有效成分以及药学上可接受的载体，其中所述抗癌有效成分为MMP-12。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物被配制成药学上可接受的剂型。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物被配制为注射剂、缓释剂、植入剂或灌注剂。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物被配制为缓释植入剂。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述药物被配制为经局部给药的剂型。

6.如权利要求5所述的用途，其中所述局部为乳腺癌内或癌周、或乳腺癌手术后的瘤腔内。