KR100944318B1 - 항암 및 상처 치유용 화합물 - Google Patents

항암 및 상처 치유용 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항종양제로서 및 상처 치유용으로 유용한 매트릭스 메탈로프로테이나제의 억제제를 제공한다. 상기 억제제는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 전구효소의 절단 부위와 관련된 서열을 갖는 펩티드이다. 본 발명의 펩티드는 혈관 내피 성장 인자의 발현을 억제하고 치유를 촉진하는 치료 조성물, 로션제, 크림제, 피부 커버링 및 상처 드레싱으로 제제화시킬 수 있다.
항종양제, 상처 치유, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 전구효소, 혈관 내피 성장 인자, 발현 억제

Description

항암 및 상처 치유용 화합물 {Anti-Cancer and Wound Healing Compounds}
본원은 2001년 8월 16일자로 출원된 미국 가특허원 제60/312,726호를 우선권으로 주장하는, 2002년 5월 21일자로 출원된 미국 특허원 제10/153,185호 및 2001년 12월 21일자로 출원된 미국 특허원 제10/032,376호의 부분 연속 출원이며, 이들 두 특허원의 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다.
본 발명은 상처 치유용 및 항종양제로서 유용한 매트릭스 메탈로프로테이나제의 억제제를 함유하는 제제에 관한 것이다. 상기 억제제는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 전구효소의 절단 부위와 관련된 서열을 갖는 펩티드이다.
혈관형성 또는 체내에서 신생 혈관을 생성하는 과정은 손상, 발작 및 종양 형성에 대한 다수의 생물학적 반응에서의 주요한 단계이다. 혈관형성 자극시, 내피 세포는 세포 주기로 재진입하고, 이동하고, 세포 주기로부터 빠져나와 후속적으로 다시 분화하여 그들의 조직 환경에 기능적으로 적응된 신생 혈관을 형성한다. 혈관형성을 겪는 내피 세포는 기초를 이루는 기저막을 손상하고, 이동하여, 혈관주위 기질에 돌출하는 모세혈관 발아를 형성한다 [Ausprunk, et al., Microvasc. Rev., 14:51-65 (1977)]. 대부분의 세포에서 혈관신생은 과도한 혈관 형성을 억제 하도록 협력하여 작동하는 일련의 산소-민감성 단백질에 의한 엄격한 제어하에 존재한다.
혈관형성의 주요 단백질 조절인자는 혈관 성장의 강력한 자극인자인 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)이다. 혈관 내피 성장 인자는 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 23 kDa 서브유니트를 갖는 이량체성 당단백질이다. 혈관 내피 성장 인자는 세포내 칼슘의 이동, 플라스미노겐 활성화제의 유도, 플라스미노겐 활성화제 억제제-1의 합성, 내피 세포에서의 헥소스 수송의 자극 및 시험관내에서의 단핵구 이동의 촉진에 영향을 미치는 것으로 간주된다. 별개의 mRNA 스플라이스변이체에 의해 코딩되는 4개의 VEGF 이소형태는 또한 내피 세포에서 유사분열을 자극할 수 있는 것으로 보인다. 각각의 이소형태는 세포 표면 프로테오글리칸에 대해 상이한 친화성을 가지며, 이는 VEGF에 대한 저친화성 수용체로서 거동한다. VEGF의 121개 및 165개 아미노산 이소형태 (VEGF121 및 VEGF165)는 가용성 형태로 분비되는 한편, 189개 및 206개 아미노산 잔기의 이소형태는 결합된 세포 표면에 잔류하여 헤파린에 대한 강력한 친화성을 보유한다.
혈관 내피 성장 인자에 대한 2종의 고친화성 수용체는 특성규명되어 있다. 이들은 VEGFR-1/Flt-1 (fms-유사 티로신 키나제-1) 및 VEGFR-2/Kdr/Flk-1 (키나제 삽입물 도메인 함유 수용체/태아 간 키나제-1)이다. 이러한 수용체는 PDGF-수용체 계열인 것으로 분류되지만, 이들은 그들의 세포외 도메인 내에 5개의 면역글로불린-유사 루프가 아닌 7개의 면역글로불린-유사 루프를 보유하며, 이들은 이러한 계열에서 통상적으로 관찰되는 것보다 긴 키나제 삽입물을 보유한다. VEGF 수용체의 발현은 주로 혈관 내피 세포에서 발생하지만, 일부는 단핵구 및 흑색종 세포 상에 존재할 수 있다. 단지 내피 세포만이 VEGF에 반응하여 증식하는 것으로 보고되어 있으며, 상이한 공급원으로부터의 내피 세포는 상이한 반응을 나타낼 수 있다.
VEGF 발현의 패턴은 정상 혈관계의 발생 및 유지 및 종양 혈관형성에서의 그의 관련을 제시한다. 마우스 발생 동안, 성교후 (p.c.) 총 7.5일 동안 내배엽은 VEGF를 발현시키고, 뇌실 신경외배엽은 모세혈관 내성장기에서 VEGF를 생성시킨다 [참조: Breier, et al., Development, 114:521-523 (1992)]. 메추라기 발생 2일째, 난황낭 및 완전 배아의 혈관신생 부위는 VEGF의 발현을 나타낸다. 또한, 성숙한 마우스에서의 유창 내피에 인접한 상피 세포는 지속적인 VEGF 발현을 나타내며, 이는 이러한 특정 내피 표현형 및 기능의 유지에서서의 역할을 제시한다.
종양 세포는 종종 정상 세포보다 3배 내지 10배 더 높은 수준으로 VEGF를 발현시킨다. 종양 성장 및 전이는 또한 혈관형성 의존성인 것으로 제시되어 있다 [Folkman, et al., J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992)]. 따라서, VEGF의 발현 및(또는) 활성을 억제할 수 있는 제제에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 항혈관형성 조성물, 및 혈관 내피 성장 인자 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법 및 조성물은 각종 치료 용도에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 고형 종양을 비롯한 암을 치료하는데 사용할 수 있다. 당해 조성물 및 방법은 또한 상처, 수술적 절개, 만성 상처, 심장 질환, 발작 등을 비롯한 조직 손상을 치료하는데 유용한 것으로 제시되어 있다. 본 발명의 펩티드는 메탈로프로테이나제를 억제할 뿐만 아니라, 혈관 내피 성장 인자의 발현을 감소시킨다. 각종 국소용 로션제, 드레싱, 및 비경구 및 비-비경구 투여된 조성물 뿐만 아니라, 종양 성장 및 발생을 억제하기 위해 펩티드를 사용하는 방법이 고려된다.
따라서, 본 발명은 매트릭스 메탈로프로테이나제의 펩티드 억제제에 관한 것이다. 이들 펩티드 억제제는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 2개의 구상 도메인에 미치는 연결 영역과 동일하거나 그에 관련된 아미노산 서열을 보유한다. 매트릭스 메탈로프로테이나제-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-3, 매트릭스 메탈로프로테이나제-4, 매트릭스 메탈로프로테이나제-5, 매트릭스 메탈로프로테이나제-6, 매트릭스 메탈로프로테이나제-7, 매트릭스 메탈로프로테이나제-8, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 매트릭스 메탈로프로테이나제-10, 매트릭스 메탈로프로테이나제-11, 매트릭스 메탈로프로테이나제-12 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-13을 비롯한 수가지 유형의 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 그들의 서열이 공지되어 있다. 본 발명은 임의의 매트릭스 메탈로프로테이나제의 연결 영역으로부터의 아미노산 서열을 갖는 억제제를 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 억제제는 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 서열 (서열 14)의 대략 아미노산 70번 내지 대략 아미노산 120번의 임의의 영역 및 모든 다른 매트릭스 메탈로프로테 이나제의 유사 영역으로부터 취출된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 임의의 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III의 펩티드를 제공한다:
<화학식 I>
Figure 112009026809884-pat00001
<화학식 II>
Figure 112009026809884-pat00002
<화학식 III>
Figure 112009026809884-pat00003
상기 식에서,
Xaa1, Xaa4 및 Xaa6은 독립적으로 각각 비극성 아미노산이고;
Xaa2는 염기성 아미노산이고;
Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
Xaa5는 극성 또는 지방족 아미노산이고;
Xaa7은 산성 아미노산이고;
Xaa8은 지방족 또는 극성 아미노산이고;
Xaa9는 지방족, 비극성 또는 염기성 아미노산이고;
Xaa10은 극성, 산성, 염기성 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa11은 극성 또는 방향족 아미노산이고;
Xaa12는 극성, 염기성, 지방족 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa13은 방향족, 지방족, 극성 또는 산성 아미노산이고;
Xaa14는 방향족, 비극성 또는 극성 아미노산이고;
Xaa15는 비극성 또는 산성 아미노산이고;
Xaa16은 염기성, 극성 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa17은 염기성, 극성, 지방족, 비극성 또는 산성 아미노산이고;
Xaa18은 비극성 또는 지방족 아미노산이고;
Xaa19는 염기성 또는 지방족 아미노산이고;
여기서, 펩티드는 매트릭스 메탈로프로테이나제-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-3, 매트릭스 메탈로프로테이나제-4, 매트릭스 메탈로프로테이나제-5, 매트릭스 메탈로프로테이나제-6, 매트릭스 메탈로프로테이나제-7, 매트릭스 메탈로프로테이나제-8, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 매트릭스 메탈로프로테이나제-10, 매트릭스 메탈로프로테이나제-11, 매트릭스 메탈로프로테이나제-12 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-13의 활성을 억제할 수 있다. 특정한 실시양태에 있어서, 펩티드는 매트릭스 메탈로프로테이나제-2, 매트릭스 메탈로프 로테이나제-3, 매트릭스 메탈로프로테이나제-7, 매트릭스 메탈로프로테이나제-8 또는 매트릭스 메탈로프로테이나제-9의 활성을 억제할 수 있다.
비극성 아미노산은, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린일 수 있다. 염기성 아미노산은, 예를 들어, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노페닐알라닌 또는 2,4-디아미노부티르산일 수 있다. 본 발명의 시스테인-유사 아미노산은, 예를 들어, 시스테인, 호모시스테인, 페니실라민 또는 β-메틸 시스테인을 포함한다.
지방족 아미노산은, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소류신, 노르류신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산을 포함한다. 산성 아미노산은, 예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산을 포함한다. 극성 아미노산은, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린을 포함하고, 비극성 아미노산은, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린을 포함한다. 본 발명의 방향족 아미노산은, 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐 알라닌일 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 IV의 펩티드 (서열 18)를 제공한다:
<화학식 IV>
Figure 112009026809884-pat00004
상기 식에서,
Xaaa는 프롤린이고; Xaa1은 프롤린이고;
Xaab는 글루타민 또는 글루탐산이고; Xaa2는 아르기닌이고;
Xaac는 트레오닌이고; Xaa3은 시스테인이고;
Xaad는 글리신이고; Xaa4는 글리신이고;
Xaae는 아스파르트산 또는 글루탐산이고; Xaa5는 발린 또는 아스파라긴이고;
Xaaf는 류신이고; Xaa6은 프롤린이고;
Xaag는 아스파르트산이고; Xaa7은 아스파르트산이고;
Xaah는 글루타민 또는 세린이고; Xaa8은 발린 또는 류신이고;
Xaai는 아스파라긴 또는 알라닌이고; Xaa9는 알라닌 또는 글리신이고;
Xaaj는 트레오닌이고; Xaa10은 아스파라긴 또는 아르기닌이고;
Xaak는 이소류신 또는 류신이고; Xaa11은 티로신 또는 페닐알라닌이고;
XaaL은 글루탐산 또는 리신이고; Xaa12는 아스파라긴 또는 글루타민이고;
Xaam은 트레오닌 또는 알라닌이고; Xaa13은 페닐알라닌 또는 트레오닌이고;
Xaan은 메티오닌이고; Xaa14는 페닐알라닌이고;
Xaao는 아르기닌이고; Xaa15는 프롤린 또는 글루탐산이고;
Xaap는 리신 또는 트레오닌이고; Xaa16은 아르기닌 또는 글리신이고;
Xaa17은 리신 또는 아스파르트산이고; Xaa18은 프롤린 또는 류신이고;
Xaa19는 리신이고;
여기서, 펩티드는 메탈로프로테이나제의 활성을 억제할 수 있다. 예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테이나제는 매트릭스 메탈로프로테이나제-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-3, 매트릭스 메탈로프로테이나제-4, 매트릭스 메탈로프로테이나제-5, 매트릭스 메탈로프로테이나제-6, 매트릭스 메탈로프로테이나제-7, 매트릭스 메탈로프로테이나제-8, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9, 매트릭스 메탈로프로테이나제-10, 매트릭스 메탈로프로테이나제-11, 매트릭스 메탈로프로테이나제-12 또는 매트릭스 메탈로프로테이나제-13일 수 있다. 바람직한 펩티드는 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 또는 매트릭스 메탈로프로테이나제-9를 억제한다.
본 발명의 펩티드 억제제가 유도될 수 있는 영역은, 예를 들어, 서열 14의 대략 70번 위치 내지 대략 120번 위치에 이르는 아미노산 서열, 및 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제의 유사 영역일 수 있다. 특정한 실시양태에 있어서, 본 발명의 펩티드 억제제는 서열 14의 대략 77번 위치 내지 대략 110번 위치에 이르는 아미노산 서열, 및 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제의 유사 영역을 보유한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 펩티드 억제제의 예는 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 또는 서열 13의 아미노산 서열을 함유하는 것들을 포함한다.
본 발명의 펩티드는 상이한 매트릭스 메탈로프로테이나제에 대해 다양한 친화성을 보유한다. 예를 들어, 한 실시양태에 있어서, 펩티드 억제제는 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 약 1.0 μM 내지 약 500.0 μM의 ki로 억제할 수 있다. 또 다른 실시양태에 있어서, 펩티드 억제제는 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 약 1.0 μM 내지 약 400.0 μM의 ki로 억제할 수 있다. 또 다른 실시양태에 있어서, 펩티드 억제제는 매트릭스 메탈로프로테이나제-2를 약 1.0 μM 내지 약 50.0 μM의 ki로 억제할 수 있다.
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 혈관 내피 성장 인자의 발현을 감소시킬 수 있는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 각종 암, 종양 및 기타 질환을 치료하는데 유용하다.
본 발명은 또한 혈관 내피 성장 인자에 대한 유전자를 포함하는 세포를 유효량의 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III 또는 화학식 IV의 펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 혈관 내피 성장 인자의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다:
<화학식 I>
Figure 112009026809884-pat00005
<화학식 II>
Figure 112009026809884-pat00006
<화학식 III>
Figure 112009026809884-pat00007
<화학식 IV>
Figure 112009026809884-pat00008
(서열 21)
상기 식에서,
Xaa1, Xaa4 및 Xaa6은 독립적으로 각각 비극성 아미노산이고;
Xaa2는 염기성 아미노산이고;
Xaa3은 시스테인-유사 아미노산이고;
Xaa5는 극성 또는 지방족 아미노산이고;
Xaa7은 산성 아미노산이고;
Xaa8은 지방족 또는 극성 아미노산이고;
Xaa9는 지방족, 비극성 또는 염기성 아미노산이고;
Xaa10은 극성, 산성, 염기성 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa11은 극성 또는 방향족 아미노산이고;
Xaa12는 극성, 염기성, 지방족 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa13은 방향족, 지방족, 극성 또는 산성 아미노산이고;
Xaa14는 방향족, 비극성 또는 극성 아미노산이고;
Xaa15는 비극성 또는 산성 아미노산이고;
Xaa16은 염기성, 극성 또는 비극성 아미노산이고;
Xaa17은 염기성, 극성, 지방족, 비극성 또는 산성 아미노산이고;
Xaa18은 비극성 또는 지방족 아미노산이고;
Xaa19는 염기성 또는 지방족 아미노산이고;
Xaaa는 프롤린이고;
Xaab는 글루타민 또는 글루탐산이고;
Xaac는 트레오닌이고;
Xaad는 글리신이고;
Xaae는 아스파르트산 또는 글루탐산이고;
Xaaf는 류신이고;
Xaag는 아스파르트산이고;
Xaah는 글루타민 또는 세린이고;
Xaai는 아스파라긴 또는 알라닌이고;
Xaaj는 트레오닌이고;
Xaak는 이소류신 또는 류신이고;
XaaL은 글루탐산 또는 리신이고;
Xaam은 트레오닌 또는 알라닌이고;
Xaan은 메티오닌이고;
Xaao는 아르기닌이고;
Xaap는 리신 또는 트레오닌이고;
여기서, 펩티드는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명의 펩티드에 있어서 비극성 아미노산은, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린일 수 있다. 염기성 아미노산은, 예를 들어, 히스티딘, 리신, 아르 기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노페닐알라닌 또는 2,4-디아미노부티르산일 수 있다. 시스테인-유사 아미노산은, 예를 들어, 시스테인, 호모시스테인, 페니실라민 또는 β-메틸 시스테인일 수 있다. 지방족 아미노산은, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소류신, 노르류신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산일 수 있다. 산성 아미노산은, 예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산일 수 있다. 극성 아미노산은, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린일 수 있고, 비극성 아미노산은, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린일 수 있다. 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐 알라닌이다.
또 다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 치료 유효량의 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 또는 서열 13의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 상처를 치료하거나 종양의 성장 및(또는) 발생을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 펩티드에 대한 잠재적인 임상적 유용성의 다른 분야는 과도한 혈관형성에 의해 특성규명되는 장애를 포함한다. 이러한 질환의 예는 황반 변성 및 당뇨병성 망막증이다.
본 발명은 혈관 내피 성장 인자의 발현을 저하시키고, 종양의 성장 및 발생을 억제하고, 상처 치유를 촉진하는데 유용한 매트릭스 메탈로프로테이나제의 억제제를 제공한다.
매트릭스 메탈로프로테이나제는 불활성 전구효소로서 생체내에서 생성된다. 전구효소의 단백질분해성 절단은 성숙 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성화 및 형성을 야기한다. 절단된 펩티드 서열은 단백질의 극단의 아미노 말단에서 발견되는 길이가 대략 100 내지 110개 아미노산의 전구효소 리더 서열이다. 본 발명에 따르면, 이들 전구효소 리더 펩티드는 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성 부위를 차단하고 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 억제할 수 있다. 매트릭스 메탈로프로테이나제 전구효소 리더 펩티드의 투여는 세포외 매트릭스 파괴율을 감소시키고 상처 치유의 보다 신속한 속도를 제공한다.
대부분의 억제 기법은 매트릭스 메탈로프로테이나제의 효소 활성을 유기 소분자로 억제하는 것을 포함한다. 이들 화합물은 종종 신체에 독성이고 천연 발생 분자가 아니다. 활성화된 매트릭스 메탈로프로테이나제를 억제하기 위한 천연 펩티드의 사용은 독성 부작용없이 고도의 프로테이나제 제어를 제공한다. 소분자 억제 기법과 달리, 본 발명의 펩티드는 개별적 또는 전체 매트릭스 메탈로프로테이나제 부류의 활성화를 동시에 억제하기 위해 사용할 수 있다. 당해 펩티드는 포유동물에게 자유롭게 투여하고, 종양에 주사하고, 피부 상에 도입하고, 상처 환경에 적 용시킬 수 있거나, 이들은 피부 커버링 또는 상처 드레싱에 부착시키거나 이에 의해 전달할 수 있다.
본 발명은 만성 상처를 치유하고 노화의 영향을 경감시키기 위한 프로테이나제 활성의 수준에 대한 고도의 제어를 제공한다. 예를 들어, 일정량의 프로테이나제 활성이 만성 상처 치유 동안 필요하기 때문에 (Agren et al., 1999), 당해 분야의 기술 중 하나를 선택하여 단지 부분적으로 프로테이나제 활성을 억제할 수 있다. 적용되는 억제제 펩티드의 유형 및 양을 조절하기 위해, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제 정도를 제어할 수 있다.
펩티드 억제제
본 발명에 따르면, 절단 부위의 영역에서 매트릭스 메탈로프로테이나제 전구효소 리더와 관련된 서열을 갖는 펩티드는 다수 유형의 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 억제할 것이다. 절단 위치는 전구효소 아미노산 서열의 대략 110번 위치 아미노산에 존재한다. 본 발명의 펩티드 억제제는 전구효소 아미노산 70번 위치 내지 대략 아미노산 120번 위치 내의 임의의 영역과 관련된 서열을 보유한다. 이러한 펩티드는 다수 유형의 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 억제할 것이다. 본 발명의 펩티드는 또한 전구효소 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성화를 억제할 뿐만 아니라, 성숙 매트릭스 메탈로프로테이나제의 효소 활성을 억제할 수 있다. 각종 매트릭스 메탈로프로테이나제에서 보다 보존적인 서열, 예를 들어, 절단 영역의 N-말단측 방향의 서열을 함유하는 펩티드를 사용하여, 각종 매트릭스 메탈로프로테이나제에 대해 일반적으로 유효한 억제제를 제공할 수 있다. 그러나, 보다 덜 보존적인 서열, 예를 들어, 절단 영역의 C-말단측 방향의 서열을 함유하는 펩티드를 사용하여, 개별적 매트릭스 메탈로프로테이나제에 특이적인 억제제를 제공할 수 있다.
따라서, 매트릭스 메탈로프로테이나제의 억제제로서의 매트릭스 메탈로프로테이나제의 임의의 전구효소 리더 영역으로부터의 서열을 보유하는 펩티드 뿐만 아니라, 매트릭스 메탈로프로테이나제 내에 천연적으로 존재하는 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 치환된 변형 펩티드가 본 발명에 의해 고려된다. 상이한 서열을 보유하는 펩티드의 혼합물이 또한 고려된다.
일반적으로, 펩티드, 펩티드 변이체, 펩티드 유도체, 및 이들 펩티드의 혼합물을, 종양 형성 억제를 최적화하거나, 종양 감소를 최적화하거나, 상처 치유를 최적화하거나 건강한 조직의 재생을 최적화하는 방식으로 제조하여 사용한다. 따라서, 본 발명의 펩티드의 조성물 및 제제는 종양 발생이 억제되고 치유가 촉진되는 한 보다 낮거나 보다 높은 수준의 억제가 달성되도록 변형시킬 수 있다.
펩티드 억제제의 크기는 변화시킬 수 있다. 일반적으로, 단지 약 5개의 아미노산의 펩티드는 너무 작아 최적의 억제를 제공할 수 없다. 그러나, 약 8개 내지 9개보다 많은 아미노산의 펩티드는 억제를 제공하기에 충분히 길다. 따라서, 전체 길이가 중요하지 않더라도, 약 8개보다 긴 아미노산의 펩티드가 바람직하다. 바람직한 펩티드는 또한 약 9개 아미노산보다 길거나, 약 10개 아미노산보다 길거나, 심지어 약 15개 아미노산보다 길 수 있다.
펩티드 크기에 대한 특정한 상한은 없다. 그러나, 일반적으로 보다 긴 펩티 드보다 보다 짧은 펩티드를 제조하는 것이 저비용이다. 따라서, 본 발명의 펩티드 억제제는 일반적으로 약 100개 아미노산보다 짧을 수 있다. 바람직한 펩티드 억제제는 약 50개 아미노산보다 짧거나, 약 30개 아미노산보다 짧거나, 약 25개 아미노산보다 짧을 수 있다. 특정한 실시양태에 있어서, 펩티드는 약 23개 아미노산보다 짧다. 본 발명의 펩티드의 예는 19개 아미노산을 갖는 서열 11의 펩티드이다.
대략 전구효소 아미노산 70번 위치 내지 대략 아미노산 120번 위치의 수가지 대표적인 매트릭스 메탈로프로테이나제의 서열을 표 1에 제공한다.
Figure 112009026809884-pat00009
표 1에 기재된 펩티드 및 서열 1, 11, 12 및 13의 펩티드 각각이 본 발명의 펩티드 억제제로서 고려된다. 또한, 서열 1 내지 13 중 하나의 펩티드의 펩티드 변이체 및 유도체가 또한 펩티드 억제제로서 유용하다. 이러한 펩티드 변이체 및 유도체는 당해 펩티드 변이체 및 유도체가 매트릭스 메탈로프로테이나제를 억제할 수 있는 한 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 다른 변형을 보유할 수 있다.
단리된 펩티드의 아미노산 잔기는 유전자 코딩된 L-아미노산, 천연 발생된 비-유전자 코딩된 L-아미노산, 합성 L-아미노산 또는 상기한 것들 중 하나의 D-에난티오머일 수 있다. 20개의 유전자 코딩된 L-아미노산 및 통상의 비코딩된 아미노산에 대해 본원에 사용된 아미노산 표기법은 통상적이며, 표 2에 제시되어 있다.
아미노산 1문자 기호 통상의 약자
알라닌 A Ala
아르기닌 R Arg
아스파라긴 N Asn
아스파르트산 D Asp
시스테인 C Cys
글루타민 Q Gln
글루탐산 E Glu
글리신 G Gly
히스티딘 H His
이소류신 I Ile
류신 L Leu
리신 K Lys
메티오닌 M Met
페닐알라닌 F Phe
프롤린 P Pro
세린 S Ser
트레오닌 T Thr
트립토판 W Trp
티로신 Y Tyr
발린 V Val
β-알라닌 bAla
2,3-디아미노프로피온산 Dpr
α-아미노이소부티르산 Aib
N-메틸글리신 (사르코신) MeGly
오르니틴 Orn
시트룰린 Cit
t-부틸알라닌 t-BuA
t-부틸글리신 t-BuG
N-메틸이소류신 MeIle
페닐글리신 Phg
시클로헥실알라닌 Cha
노르류신 Nle
나프틸알라닌 Nal
피리딜알라닌
3-벤조티에닐 알라닌
아미노산 1문자 기호 통상의 약자
4-클로로페닐알라닌 Phe(4-Cl)
2-플루오로페닐알라닌 Phe(2-F)
3-플루오로페닐알라닌 Phe(3-F)
4-플루오로페닐알라닌 Phe(4-F)
페니실라민 Pen
1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산 Tic
β-2-티에닐알라닌 Thi
메티오닌 술폭시드 MSO
호모아르기닌 hArg
N-아세틸 리신 AcLys
2,4-디아미노부티르산 Dbu
ρ-아미노페닐알라닌 Phe(pNH2)
N-메틸발린 MeVal
호모시스테인 hCys
호모세린 hSer
ε-아미노 헥산산 Aha
δ-아미노 발레르산 Ava
2,3-디아미노부티르산 Dab
본 발명의 범주 내에 포함되는 펩티드는 이들 변이체 또는 유도체 펩티드가 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 억제하기 위한 능력을 보유하는 한 유사한 화학적 및(또는) 물리적 특성의 아미노산으로 치환된 하나 이상의 아미노산을 보유할 수 있다.
서로에 대해 치환가능한 아미노산은 일반적으로 유사한 부류 또는 아부류 내에 존재한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 아미노산은 3개의 주부류로 분류할 수 있다: 주로 아미노산 측쇄의 특성에 따라 친수성 아미노산, 소수성 아미노산 및 시스테인-유사 아미노산. 이들 주부류는 추가로 아부류로 분류할 수 있다. 친수성 아미노산은 산성, 염기성 또는 극성 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하고, 소수성 아미노산은 방향족 또는 비극성 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다. 비극성 아미노산은 이들 중 지방족 아미노산을 포함하는 것으로 추가로 세분할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 아미노산의 부류의 정의는 다음과 같다:
"소수성 아미노산"은 생리적 pH에서 하전되지 않으며 수용액에 의해 반발되는 측쇄를 갖는 아미노산을 의미한다. 유전자 코딩된 소수성 아미노산의 예는 Ile, Leu 및 Val을 포함한다. 비-유전자 코딩된 소수성 아미노산의 예는 t-BuA를 포함한다.
"방향족 아미노산"은 공액된 π-전자계를 보유하는 하나 이상의 환을 함유하는 측쇄 (방향족 기)를 보유하는 소수성 아미노산을 의미한다. 방향족 기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 히드록실, 술포닐, 니트로 및 아미노 기 등과 같은 치환기로 추가로 치환될 수 있다. 유전자 코딩된 방향족 아미노산의 예는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판을 포함한다. 통상적으로 직면하는 비-유전자 코딩된 방향족 아미노산은 페닐글리신, 2-나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다.
"비극성 아미노산"은 생리적 pH에서 하전되지 않고 극성이지 않은 측쇄를 갖는 소수성 아미노산을 의미한다. 유전자 코딩된 비극성 아미노산의 예는 글리신, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 비코딩된 비극성 아미노산은 Cha를 포함한다.
"지방족 아미노산"은 포화 또는 불포화 직쇄, 분지화 또는 시클릭 탄화수소 측쇄를 갖는 비극성 아미노산을 의미한다. 유전자 코딩된 지방족 아미노산의 예는 Ala, Leu, Val 및 Ile를 포함한다. 비코딩된 지방족 아미노산의 예는 Nle를 포함한다.
"친수성 아미노산"은 수용액에 의해 견인되는 측쇄를 갖는 아미노산을 의미한다. 유전자 코딩된 친수성 아미노산의 예는 Ser 및 Lys를 포함한다. 비코딩된 친수성 아미노산의 예는 Cit 및 hCys를 의미한다.
"산성 아미노산"은 pK 값이 7 미만인 측쇄를 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 산성 아미노산은 전형적으로 수소 이온의 손실로 인해 생리적 pH에서 음으로 하전된 측쇄를 갖는다. 유전자 코딩된 산성 아미노산의 예는 아스파르트산 (아스파르트산염) 및 글루탐산 (글루탐산염)을 포함한다.
"염기성 아미노산"은 pK 값이 7보다 큰 친수성 아미노산을 의미한다. 염기성 아미노산은 히드로늄 이온과의 결합으로 인해 생리적 pH에서 양으로 하전된 측쇄를 갖는다. 유전자 코딩된 염기성 아미노산의 예는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 비-유전자 코딩된 염기성 아미노산의 예는 비-시클릭 아미노산인 오르니틴, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산 및 호모아르기닌을 포함한다.
"극성 아미노산"은 생리적 pH에서 하전되지 않은 측쇄를 보유하지만, 2개의 원자에 의해 공유되는 전자의 쌍이 원자 중 하나에 의해 보다 밀접하게 보유되는 결합을 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 유전자 코딩된 극성 아미노산의 예는 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 비-유전자 코딩된 극성 아미노산의 예는 시트룰린, N-아세틸 리신 및 메티오닌 술폭시드를 포함한다.
"시스테인-유사 아미노산"은 또 다른 아미노산 잔기의 측쇄와 공유 결합, 예를 들어, 디술피드 결합을 형성할 수 있는 측쇄를 갖는 아미노산을 의미한다. 전형적으로, 시스테인-유사 아미노산은 일반적으로 하나 이상의 티올 (SH) 기를 함유하는 측쇄를 갖는다. 유전자 코딩된 시스테인-유사 아미노산의 예는 호모시스테인 및 페니실라민을 포함한다.
당업자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 상기 분류는 절대적이지 않다. 수가지 아미노산은 하나 이상의 특성을 나타내고, 따라서 하나 이상의 카테고리에 포함될 수 있다. 예를 들어, 티로신은 방향족 환 및 극성 히드록실 기를 모두 갖는다. 따라서, 티로신은 이중 특성을 보유하며 방향족 및 극성 카테고리 둘 다에 포함될 수 있다. 유사하게는, 티로신은 디술피드 결합을 형성할 수 있는 것 이외에 비극성 특성을 보유한다. 따라서, 소수성 또는 비극성 아미노산으로 엄격하게 분류되지 않는 반면, 다수의 경우에 시스테인은 펩티드에 소수성을 제공하기 위해 사용할 수 있다.
유전자 코딩되지 않고 본 발명의 펩티드 및 펩티드 유사체에서 존재하거나 아미노산을 치환할 수 있는 특정의 통상적으로 직면하는 아미노산은 비제한적으로 β-알라닌 (b-Ala) 및 기타 오메가-아미노산, 예를 들어, 3-아미노프로피온산 (Dap), 2,3-디아미노프로피온산 (Dpr), 4-아미노이소부티르산 등; α-아미노이소부티르산 (Aib); ε-아미노헥산산 (Aha); δ-아미노발레르산 (Ava); 메틸글리신 (MeGly); 오르니틴 (Orn); 시트룰린 (Cit); t-부틸알라닌 (t-BuA); t-부틸글리신 (t-BuG); N-메틸이소류신 (MeIle), 페닐글리신 (Phg); 시클로헥실알라닌 (Cha); 노르류신 (Nle); 2-나프틸알라닌 (2-Nal); 4-클로로페닐알라닌 (Phe(4-Cl)); 2-플루오로페닐알라닌 (Phe(2-F)); 3-플루오로페닐알라닌 (Phe(3-F)); 4-플루오로페닐알라닌 (Phe(4-F)); 페니실라민 (Pen); 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산 (Tic); P-2-티에닐알라닌 (Thi); 메티오닌 술폭시드 (MSO); 호모아르기닌 (hArg); N-아세틸 리신 (AcLys); 2,3-디아미노부티르산 (Dab); 2,3-디아미노부티르산 (Dbu); p-아미노페닐알라닌 (Phe(pNH2)); N-메틸 발린 (MeVal); 호모시스테인 (hCys) 및 호모세린 (hSer)을 포함한다. 이들 아미노산은 또한 위에서 정의된 카테고리에 해당된다.
상기한 유전자 코딩된 아미노산 및 비코딩된 아미노산의 분류는 하기 표 3에 요약되어 있다. 표 3은 단지 예시 목적을 위한 것이지 본원에 기재된 펩티드 및 펩티드 유사체를 포함할 수 있는 아미노산 잔기의 포괄적인 목록인 것으로 주장하지 않는 것으로 이해된다. 본원에 기재된 펩티드 및 펩티드 유사체를 제조하는데 유용한 다른 아미노산 잔기는 문헌 [참조예: Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Inc. 및 본원에 인용된 참고문헌]에서 찾아볼 수 있다. 본원에 구체적으로 언급되지 않은 아미노산은 구체적으로 확인된 아미노산과 비교된 공지된 거동 및(또는) 그들의 특징적인 화학적 및(또는) 물리적 특성을 기초로 하여 상기한 카테고리로 편리하게 분류할 수 있다.
분류 유전자 코딩된 아미노산 비-유전자 코딩된 아미노산
소수성
방향족 F, Y, W Phg, Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe(2-F), Phe(3-F), Phe(4-F), 피리딜 Ala, 벤조티에닐 Ala
비극성 M, G, P
지방족 A, V, L, I t-BuA, t-BuG, MeIle, Nle, MeVal, Cha, bAla, MeGly, Aib
친수성
산성 D, E
염기성 H, K, R Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH2), DBU, A2, BU
극성 Q, N, S, T, Y Cit, AcLys, MSO, hSer
시스테인-유사 C Pen, hCys, β-메틸 Cys
본 발명의 펩티드는 펩티드 변이체가 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 억제하는 능력을 보유하는 한 변이체 또는 유도체 펩티드를 제조하기 위해 유사하게 분류된 아미노산에 의해 치환된 임의의 아미노산을 가질 수 있다.
한 실시양태에 있어서, 본 발명의 펩티드 억제제는 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 펩티드 중 임의의 하나를 포함한다.
<화학식 I>
Figure 112009026809884-pat00010
<화학식 II>
Figure 112009026809884-pat00011
<화학식 III>
Figure 112009026809884-pat00012
상기 식에서,
Xaa1, Xaa4 및 Xaa6은 독립적으로 각각 비극성 아미노산, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린이고;
Xaa2는 염기성 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산이고;
Xaa3은 시스테인-유사 아미노산, 예를 들어, 시스테인, 호모시스테인, 페니실라민 또는 β-메틸 시스테인이고;
Xaa5는 극성 또는 지방족 아미노산, 예를 들어, 극성 아미노산, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소류신, 노르류신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산이고;
Xaa7은 산성 아미노산, 예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산이고;
Xaa8은 지방족 또는 극성 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, 메틸이소류신, 노르류신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신, 또는 α-아미노이소부티르산, 또는 극성 아미노산, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린이고;
Xaa9는 지방족, 비극성 또는 염기성 아미노산, 예를 들어, 지방족 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소류신, 노르류신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산, 비극성 아미노산, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린, 또는 염기성 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산이고;
Xaa10은 극성, 산성, 염기성 또는 비극성 아미노산, 예를 들어, 극성 아미노산, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 산성 아미노산, 예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산, 염기성 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산, 또는 비극성 아미노산, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린이고;
Xaa11은 극성 또는 방향족 아미노산, 예를 들어, 극성 아미노산, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 방향족 아미노산, 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐 알라닌이고;
Xaa12는 극성, 염기성, 지방족 또는 비극성 아미노산, 예를 들어, 극성 아미노산, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 염기성 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소류신, 노르류신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산, 또는 비극성 아미노산, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린이고;
Xaa13은 방향족, 지방족, 극성 또는 산성 아미노산, 예를 들어, 방향족 아미노산, 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐 알라닌, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소류신, 노르류신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산, 또는 극성 아미노산, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 산성 아미노산, 예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산이고;
Xaa14는 방향족, 비극성 또는 극성 아미노산, 예를 들어, 방향족 아미노산, 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 페닐글리신, 나프틸알라닌, β-2-티에닐알라닌, 1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 피리딜알라닌 또는 3-벤조티에닐 알라닌, 또는 비극성 아미노산, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린, 또는 극성 아미노산, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린이고;
Xaa15는 비극성 또는 산성 아미노산, 예를 들어, 비극성 아미노산, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린, 또는 산성 아미노산, 예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산이고;
Xaa16은 염기성, 극성 또는 비극성 아미노산, 예를 들어, 염기성 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산; 또는 극성 아미노산, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 비극성 아미노산, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린이고;
Xaa17은 염기성, 극성, 지방족, 비극성 또는 산성 아미노산, 예를 들어, 염기성 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, ρ-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산, 또는 극성 아미노산, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시트룰린, N-아세틸 리신, 메티오닌 술폭시드 또는 호모세린, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소류신, 노르류신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산, 또는 비극성 아미노산, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린, 산성 아미노산, 예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산이고;
Xaa18은 비극성 또는 지방족 아미노산, 예를 들어, 비극성 아미노산, 예를 들어, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소류신, 노르류신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, β-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산이고;
Xaa19는 염기성 또는 지방족 아미노산, 예를 들어, 염기성 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 호모아르기닌, β-아미노-페닐알라닌 및 2,4-디아미노부티르산, 또는 지방족 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, t-부틸알라닌, t-부틸알라닌, N-메틸이소류신, 노르류신, N-메틸발린, 시클로헥실알라닌, 3-알라닌, N-메틸글리신 또는 α-아미노이소부티르산이다.
특정한 실시양태에 있어서:
Xaa1은 프롤린이고,
Xaa2는 아르기닌이고,
Xaa3은 시스테인이고,
Xaa4는 글리신이고,
Xaa5는 발린 또는 아스파라긴이고,
Xaa6은 프롤린이고,
Xaa7은 아스파르트산이고,
Xaa8은 발린, 류신, 또는 세린이고,
Xaa9는 알라닌, 글리신 또는 히스티딘이고,
Xaa10은 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 아르기닌, 글루타민 또는 글리신이고,
Xaa11은 티로신 또는 페닐알라닌이고,
Xaa12는 아스파라긴, 세린, 아르기닌, 글루타민, 발린 또는 메티오닌이고,
Xaa13은 페닐알라닌, 발린, 류신, 트레오닌, 세린, 또는 글루탐산이고,
Xaa14는 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트레오닌이고,
Xaa15는 프롤린 또는 글루탐산이고,
Xaa16은 아르기닌, 아스파라긴 또는 글리신이고,
Xaa17은 리신, 트레오닌, 세린, 이소류신, 메티오닌, 글리신, 아스파르트산 또는 아스파라긴이고,
Xaa18은 프롤린 또는 류신이고,
Xaa19는 리신, 발린 또는 아르기닌이다.
본 발명의 바람직한 펩티드는 또한 서열 1 내지 13에 의해 정의된 서열을 포함한다. 바람직한 펩티드의 일례는 서열 11 (PRCGNPDVANYNFFPRKPK)의 19개 아미노산 펩티드이다. 이들 펩티드 (서열 11)는 MMP-2의 절단 부위에 걸친다. 서열 11 펩티드의 대략 절반을 나타내는 2개의 보다 작은 펩티드 (PRCGNPDVA (서열 12) 및 NYNFFPRKPK (서열 13))이 또한 바람직한 펩티드이다. 모든 3개의 펩티드는 MMP-9 활성 및 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제 효소를 다양한 정도로 억제한다.
매트릭스 메탈로프로테이나제 절단 영역의 서열과 동일한 서열을 갖는 단일 펩티드를 사용하여, 단일 또는 단지 수개의 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 억제할 수 있다. 이러한 단일 펩티드의 제제는 하나 이상, 그러나 일반적으로 모두는 아닌 매트릭스 메탈로프로테이나제를 억제할 것이다. 이러한 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성의 부분적인 억제는 치유를 촉진할 수 있다. 달리, 2개 이상의 펩티드를 결합하여 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성의 보다 완전한 억제를 제공할 수 있는 2개 이상의 매트릭스 메탈로프로테이나제를 표적화할 수 있다.
당업자는 본원에 제공된 교시와 함께 입수가능한 교시를 이용하여 억제의 목적하는 질 및 양을 달성하기 위해 적합한 펩티드 억제제 또는 펩티드 억제제들의 배합물을 고안할 수 있다. 억제의 "질"은 억제되는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 유형을 의미한다. 상이한 매트릭스 메탈로프로테이나제는 다소 상이한 기질 및 활성 부위를 보유할 수 있다. 억제의 "양"은 모든 매트릭스 메탈로프로테이나제로부터의 전체적인 억제량을 의미한다. 사용되는 펩티드 억제제의 유형 및 양을 조절함으로써, 억제의 질 및 양을 조절할 수 있다. 당업자는 용이하게 본 발명에 의해 제공된 펩티드를 변형시키고 제공된 매트릭스 메탈로프로테이나제가 억제되는 유형 및 정도를 관찰할 수 있다.
예를 들어, 당업자는 도 1에 제시된 펩티드 서열을 비교하고 정렬하고 목적하는 억제의 질 및 양을 달성하도록 펩티드 억제제를 고안할 수 있다. 예로써 제공된 한 실시양태에 있어서, 3개의 상처 부위 매트릭스 메탈로프로테이나제, mmp2, mmp9 및 mmp1에 대한 정렬된 아미노산 서열을 비교하여, 서열에서의 상동 영역 및 변이 영역을 확인한다.
Figure 112009026809884-pat00013
이들 서열 정렬에 있어서, 볼드체는 MMP-2 또는 MMP-9에서는 발견되지 않으며 MMP-1에서 발견되는 아미노산을 나타내고, 밑줄은 MMP-1에서 및 단지 MMP-2 또는 MMP-9에서만 발견되는 아미노산을 나타낸다.
한 실시양태에 있어서, MMP-2 및 9를 억제하지만, 종양 발생을 억제하거나 만성 상처를 치유하기 위해 비교적 비조절된 MMP-1의 수준을 유지하는 것이 바람직하다. 상기한 서열 정렬을 기초로 하여, 당업자는 MMP2 및 MMP9 전구효소 서열에서는 발견되지만 MMP1 전구효소 서열에서는 발견되지 않는 아미노산을 갖는 펩티드를 고안하여, MMP-2 및 9를 억제할 수 있는 반면, MMP-1을 억제되지 않은 상태로 두는 펩티드를 제조할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학식 IV에 의해 제공된다.
<화학식 IV>
Figure 112009026809884-pat00014
(서열 18)
상기 식에서,
Xaaa는 프롤린이고; Xaa1은 프롤린이고;
Xaab는 글루타민 또는 글루탐산이고; Xaa2는 아르기닌이고;
Xaac는 트레오닌이고; Xaa3은 시스테인이고;
Xaad는 글리신이고; Xaa4는 글리신이고;
Xaae는 아스파르트산 또는 글루탐산이고; Xaa5는 발린 또는 아스파라긴, 바람직하게는 아스파라긴이고;
Xaaf는 류신이고; Xaa6은 프롤린이고;
Xaag는 아스파르트산이고; Xaa7은 아스파르트산이고;
Xaah는 글루타민 또는 세린이고; Xaa8은 발린 또는 류신, 바람직하게는 류신이고;
Xaai는 아스파라긴 또는 알라닌이고; Xaa9는 알라닌 또는 글리신, 바람직하게는 글리신이고;
Xaaj는 트레오닌이고; Xaa10은 아스파라긴 또는 아르기닌이고;
Xaak는 이소류신 또는 류신, 바람직하게는 이소류신이고; Xaa11은 티로신 또는 페닐알라닌, 바람직하게는 티로신이고;
XaaL은 글루탐산 또는 리신, 바람직하게는 글루탐산이고; Xaa12는 아스파라긴 또는 글루타민이고;
Xaam은 트레오닌 또는 알라닌이고; Xaa13은 페닐알라닌 또는 트레오닌이고;
Xaan은 메티오닌이고; Xaa14는 페닐알라닌이고;
Xaao는 아르기닌이고; Xaa15는 프롤린 또는 글루탐산, 바람직하게는 프롤린이고;
Xaap는 리신 또는 트레오닌이고; Xaa16은 아르기닌 또는 글리신, 바람직하게는 아르기닌이고;
Xaa17은 리신 또는 아스파르트산이고; Xaa18은 프롤린 또는 류신, 바람직하게는 류신이고;
Xaa19는 리신이다.
펩티드 변형
본 발명은 펩티드 억제제를 변형시켜 그들을 안정화시키고, 그들의 취입 및 흡수를 촉진시키고 당업자에게 공지된 펩티드의 임의의 다른 특징 또는 특성을 개선시키는 것을 고려한다. 예를 들어, 펩티드 억제제를 고리화시킬 수 있고, 펩티드 억제제 상의 전하를 중성화시킬 수 있고, 펩티드를 다른 화학적 잔기에 결합시킬 수 있다.
펩티드를 당업자가 이용가능한 임의의 방법에 의해 고리화시킬 수 있다. 예를 들어, N-말단부 및 C-말단부를 공지된 방법에 의해 축합시켜 펩티드 결합을 형성시킬 수 있다. 펩티드 내의 아미노산의 측쇄에 존재하는 관능기를 또한 연결하여 본 발명의 펩티드를 고리화시킬 수 있다. 예를 들어, 공유 결합을 형성할 수 있는 관능 기는 -COOH와 -OH; -COOH와 -NH2; 및 -COOH와 -SH를 포함한다. 펩티드를 고리화시키는데 사용할 수 있는 아미노산의 쌍은 Asp와 Lys; Glu와 Lys; Asp와 Arg; Glu와 Arg; Asp와 Ser; Glu와 Ser; Asp와 Thr; Glu와 Thr; Asp와 Cys; 및 Glu와 Cys를 포함한다. 다른 아미노산 잔기와 공유 결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기의 다른 예는 시스테인-유사 아미노산, 예를 들어, Cys, hCys, β-메틸-Cys 및 Pen을 포함하고, 이들은 다른 아미노산과 디술피드 가교를 형성할 수 있다. 시스테인-유사 아미노산 잔기의 예는 Cys 및 Pen을 포함한다. 펩티드의 고리화에 사용할 수 있는 아미노산의 다른 쌍은 당업자에게 자명할 것이다.
펩티드를 고리화시키는데 사용되는 기는 아미노산일 필요는 없다. 펩티드의 아미노 말단과 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기의 예는 카르복실산 및 에스테르를 포함한다. 펩티드의 카르복실 말단과 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기의 예는 -OH, -SH, -NH2 및 -NHR (여기서, R은 (C1-C6) 알킬, (C1-C6) 알케닐 및 (C1-C6) 알키닐임)을 포함한다.
상기 상호결합을 형성하기에 적합한 관능기를 갖는 2개의 측쇄 사이의 각종 반응 뿐만 아니라 상기 상호결합을 형성하는데 적합한 반응 조건은 당업자에게 자명할 것이다. 펩티드를 고리화시키는데 사용되는 반응 조건은 일반적으로 펩티드를 분해하거나 달리 손상시키지 않을 정도로 충분히 온화하다. 경우에 따라 각종 관능성을 보호하기에 적합한 기가 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 [참조예: Greene & Wuts, 1991, 2nd ed., John Wiley & Sons, NY], 이러한 보호된 분자를 제조하기 위한 각종 반응식도 마찬가지이다.
한 실시양태에 있어서, N-말단부 및 C-말단부에서의 전하는 효과적으로 제거된다. 이는 당업자가 이용가능한 임의의 방법에 의해, 예를 들어, N-말단을 아세틸화시키고 C-말단을 아미드화시킴으로써 수행할 수 있다.
시클릭 펩티드를 제조하고 다른 방법으로 펩티드를 변형시키는 방법이 당해 분야에 익히 공지되어 있다 [참조예: 전반적 개관용- Spatola, 1983, Vega Data 1(3); Spatola, 1983, "Peptide Backbone Modification" In: Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Petides and Proteins (Weinstein, ed.), Marcel Dekker, New York, p. 267 (전반적 개관용); Morley, 1980, Trends Pharm. Sci. 1:463-468; Hudson et al., 1979, Int. J. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2NH-, -CH2CH2-); Spatola et al., 1986, Life Sci. 38:1243-1249 (-CH2-S); Hann, 1982, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1:307-314 (-CH=CH-, 시스 및 트랜스); Almquist et al., 1980, J. Med. Chem. 23:1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White et al., Tetrahedron. Lett. 23:2533 (-COCH2-); 유럽 특허원 EP 45665 (1982) CA:97:39405 (-CH(OH)CH2-); Holladay et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-); 및 Hruby, 1982, Life Sci. 31:189-199 (-CH2-S-)].
항혈관형성 및 상처 치유 유용성
본 발명에 따르면, 본원에 제공된 펩티드는 상처 치유에 대해 및 항혈관형성제로서 유용하다. 항혈관형성제로서, 당해 펩티드를 사용하여 부적당한 혈관형성과 관련된 임의의 질환을 치료할 수 있다. 예를 들어, 부적당한 혈관형성과 관련된 질환은 암, 종양, 특정한 눈 질환 등을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "암 또는 종양"은 암종, 육종 및 암육종을 비롯한 임의의 종양성 장애를 의미한다. 암 및 종양은 전이성, 비-전이성, 혈관형성성, 비-혈관형성성, 경성 또는 연성일 수 있다.
특정 유형의 암은 비제한적으로 신경교종, 신경교육종, 역형성 성상세포종, 수모세포종, 폐암, 소세포 폐 암종, 자궁경부 암종, 결장암, 직장암, 척삭종, 인후암, 카포시 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 결직장암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 간 암종, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 고환 종양, 윌름 종양, 유잉 종양, 방광 암종, 혈관육종, 내피육종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두선육종, 낭선육종, 기관지 암종, 수질 암종, 비만세포종, 중피종, 활막종, 흑색종, 평활근종, 횡문근종, 신경모세포종, 망막모세포종, 핍지교종, 청신경종, 혈관모세포종, 수막종, 송과체종, 상의세포종, 두개인두종, 상피 암종, 배아 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 섬유육종, 점액종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 백혈병, 및 이들 원발성 종양에 대해 속발적인 전이성 병변을 포함한다. 일반적으로, 육아종을 비롯한 임의의 종양성 병변은 본 발명에 따라 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 용어 "암"은 또한 암 유지 작용, 예를 들어, 종양 혈관형성, 및 종양 내피 세포를 포함한다.
본 발명의 펩티드는 또한 과도한 혈관형성을 특징으로 하는 기타 장애를 치료하는데 유용하다. 혈관형성에 의해 매개되는 질환의 일례는 눈의 신생혈관성 질환이다. 이러한 질환은 신생 혈관의 망막 또는 각막과 같은 눈의 구조물로의 침습을 특징으로 한다. 이는 실명의 가장 흔한 원인이고 약 20종의 눈 질환과 관련된다. 연령-관련 황반 변성에 있어서, 관련된 시력 문제점은 망막 색소 상피 아래의 섬유혈관 조직의 증식을 갖는 브루흐 막에서의 결함을 통한 맥락막 모세혈관의 내성장에 의해 유발된다. 혈관형성 손상은 또한 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부반응, 신생혈관성 녹내장 및 수정체 후방 섬유증식증과 관련된다. 각막 혈관신생과 관련된 다른 질환은 비제한적으로 유행성 각결막염, 비타민 A 결핍증, 콘택즈 렌즈 과도착용 증후군, 아토피성 각막염, 상윤부 각결막염, 건성 익상편 각막염, 쇼그렌 증후군, 주사성 여드름, 플렉틴성 각결막염, 매독, 마이코박테리아 감염, 지질 변성, 화학 화상, 세균성 궤양, 진균성 궤양, 단순 포진 감염, 대상 포진 감염, 원충류 감염, 카포시 육종, 무렌 궤양, 테리엔 변연 변성, 변연성 각질용해증, 류마티스성 관절염, 전신성 낭창, 다발성 동맥염, 외상, 베게너 육아종증, 공막염, 스티븐 존슨 증후군, 유천포창, 방사상 각막절개술 및 각막 이식 거부반응을 포함한다.
망막/맥락막 혈관신생과 관련된 질환은 비제한적으로 당뇨병성 망막증, 황반 변성, 겸상 적혈구 빈혈증, 사르코이드증, 매독, 탄성섬유 가황색종, 파제트병, 정맥 폐색증, 동맥 폐색증, 경동맥 폐색성 질환, 만성 포도막염/유리체염, 마이코박테리아 감염, 라임병, 전신성 홍반성 낭창, 미숙아 망막증, 일스병, 베체트병, 망막염 또는 맥락막염 유발 감염, 추정되는 눈 히스토플라스마증, 베스트병, 근시, 안와, 스타르가르트병, 평면부염, 만성 망막 박리, 고점도 증후군, 톡소플라스마증, 외상 및 레이저후 합병증을 포함한다. 기타 질환은 비제한적으로 피부홍조와 관련된 질환 (각의 혈관신생) 및 모든 형태의 증식성 초자체 망막증을 비롯한 섬유혈관 또는 섬유 조직의 비정상 증식에 의해 유발되는 질환을 포함한다.
황반 변성에 있어서, 황반 (가장 높은 시력을 제공하는 망막부) 아래의 진행성 맥락막 혈관형성은 시력을 방해한다. 당뇨병성 망막증에 있어서, 망막 내 혈관형성은 시력을 방해한다. 황반 변성 및 당뇨병성 망막증에서 혈관 성장을 개시하는 내부 자극은 현재 알려져 있지 않지만, VEGF가 주요한 혈관형성 유도인자인 것으로 간주된다 [Lopez, P. F. et al., (1996) Invest. Ophthalmol. Visual Science 37, 855-868; Kliffen, M. et al. (1997) Br. J. Ophthalmol. 81, 154-162; Kvanta, A. et al. (1996) Invest. Ophthalmol. Visual Science 37, 1929-1934; Paques et al. (1997) Diabetes & Metabolism 23:125-130]. 따라서, 본 발명의 펩티드 억제제는 VEGF 발현의 억제제로서 황반 변성 및 기타 질환에서의 혈관형성을 감소시키는데 유용할 수 있다.
혈관형성이 관련되는 것으로 간주되는 또 다른 질환은 류마티스성 관절염이다. 관절의 활막 내층에 존재하는 혈관은 혈관형성을 겪는다. 내피 세포 방출 인자 및 반응성 산소 종은 신생 혈관 네트워크를 형성하는 것 이외에 판누스 성장 및 연골 파괴를 유도한다. 혈관형성과 관련된 인자는 류마티스성 관절염의 만성적 염증 상태를 활성적으로 일으키고, 유지시키는 것을 원조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 펩티드를 사용하여 종양 성장 및 발생을 억제하고, 눈 질환을 치료하고, 만성 상처를 치유할 수 있다. 개별적 펩티드, 펩티드 변이체, 펩티드 유도체 및 상이한 서열을 갖는 펩티드들의 혼합물을 제제로 혼합하여 상처 치유를 촉진하고, 혈관형성 억제하고(하거나) 종양 성장 및(또는) 발생을 억제할 수 있다. 최적의 치유, 혈관형성 억제 및 종양 억제는 상당한 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성을 필요로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 제제는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 최대 억제를 반드시 촉진시키지는 않는다. 대신에, 펩티드 억제제 제제의 활성은 필요한 경우에 치유를 최적화시키고 혈관형성 또는 종양 성장 및 발생을 억제하도록 변형시킨다. 억제의 보다 낮거나 보다 높은 수준은 억제제 펩티드의 유형, 함량 및 양을 변화시킴으로써 혈관형성이 억제되고 치유 및 종양 파괴가 촉진되도록 하여 달성할 수 있다.
종양 발생 및 혈관형성을 억제하고, 종양 파괴를 촉진시키고, 눈 질환을 치료하고 상처 치유를 원조하기 위해, 본 발명의 펩티드를 당업자에 의해 선택된 방법으로 포유동물에게 투여한다. 예를 들어, 펩티드를 치료 유효량의 하나 이상의 펩티드 및 제약학적 담체를 함유하는 치료 조성물로 제제화시킬 수 있다. 이러한 조성물은 경구, 비경구 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 본 발명의 펩티드의 주사가능한 액제 또는 현탁제를 제조할 수 있다. 경구적으로 투여할 수 있거나 종양 또는 상처 부위에 이식할 수 있는 서방성 제제를 이용할 수 있다. 펩티드는 편리한 위치, 예를 들어, 종양 부근에 또는 암성이거나 암 또는 종양 형성에 감수성인 것으로 간주되는 기관 내에 이식되는 약물 전달 장치로 투여할 수 있다. 조성물은 크림, 스프레이, 폼, 겔로서 또는 임의의 다른 제제 형태로 피부 상에 또는 눈 또는 상처에 유입할 수 있다.
또 다른 실시양태에 있어서, 본 발명의 펩티드는 치료 장치, 약물 전달 장치, 피부 커버링 또는 드레싱 재료에 함침되거나, 공유 부착되거나, 달리 결합된 치료 유효량의 하나 이상의 펩티드를 함유하는 커버링 또는 드레싱으로 제제화시킬 수 있다. 한 실시양태에 있어서, 약물 전달 장치, 피부 커버링 또는 드레싱은 펩티드 억제제의 방출을 가능하게 한다. 펩티드 억제제의 방출은 비제어되거나 제어된 방법으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약물 방출 장치, 피부 커버링 또는 상처 드레싱은 펩티드의 조직으로의 지속성 또는 지효성 방출을 제공할 수 있다. 피부 커버링 및 드레싱 재료는 붕대, 거즈, 멸균 랩핑, 히드로겔, 히드로콜로이드 및 유사한 재료를 포함한 당해 분야에 사용되는 임의의 재료일 수 있다.
한 실시양태에 있어서, 본 발명의 펩티드의 치료 유효량은 건강한 피부 생성 및(또는) 상처 치유를 촉진시키는데 필요한 정도로 매트릭스 메탈로프로테이나제를 억제하는 펩티드의 양이다. 또 다른 실시양태에 있어서, 본 발명의 펩티드의 치료 유효량은 VEGF 발현을 억제하는 펩티드의 양이다. VEGF 발현이 억제되는 정도는 달라질 수 있다. 특정한 실시양태에 있어서, VEGF 발현이 억제되는 정도는 혈관형성 또는 충분한 혈관신생 또는 충분한 혈관 형성의 발생을 억제하기에 충분하다.
예를 들어, 치료 또는 제약 조성물에 존재하는 경우에, 본 발명의 펩티드의 양은 조성물의 중량 기준으로 약 0.001％ 내지 약 75％의 범위로 존재할 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 조성물의 약 0.5％ 내지 약 60중량％를 구성할 수 있다. 또 다른 예에서, 펩티드는 조성물의 약 1.0％ 내지 약 50중량％를 구성한다.
치료 유효량의 펩티드 억제제는 투여 경로에 따라 필수적으로 달라진다. 예를 들어, 체중 kg당 30 내지 112,000 ㎍의 치료량은 정맥내 투여에 유효할 수 있다. 그러나, 종양 억제 또는 파괴 또는 상처 치료에 필요한 펩티드 억제제는 투여 경로 뿐만 아니라 치료할 상태의 특성 및 환자의 연령 및 상태에 따라 달라질 것이고, 궁극적으로 주치의 또는 임상의의 판단으로 달라질 것이다.
투여량 및 투여 방법은 치료할 피부 또는 조직의 위치에 따라 및(또는) 종양(들)의 크기 또는 상처의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 펩티드 및 펩티드 접합체의 유용한 투여량은 그들의 시험관내 활성, 및 본원에 기재된 동물 모델에서의 생체내 활성을 상호관련시킴으로써 결정할 수 있다. 화합물은, 예를 들어, 단위 투여량 형태 당 펩티드를 약 0.001 ㎍ 내지 약 10 mg, 편리하게는 약 0.01 ㎍ 내지 약 5 mg, 보다 편리하게는 약 0.10 ㎍ 내지 약 1 mg, 및 보다 더 편리하게는 1.0 ㎍ 내지 500 ㎍ 함유하는 단위 투여 형태로 투여할 수 있다. 목적하는 투여량은 단일 투여량으로, 분할된 투여량으로 또는 연속 주입으로 제공할 수 있다. 목적하는 투여량은 또한 적합한 간격, 예를 들어, 하루에 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 분할-투여량으로 투여할 수도 있다. 당업자는 본원에 제공된 교시를 이용하여 입수가능한 정보로부터 유효한 제제를 용이하게 제조하고 투여할 수 있다.
본 발명의 펩티드 억제제는 제약 조성물로 제제화시켜 포유동물 숙주, 예를 들어, 인간 환자에게 선택된 투여 경로, 즉 경구 또는 비경구, 정맥내, 근육내, 국소적 또는 피하 경로에 적합한 다양한 투여 형태로 투여할 수 있다.
따라서, 펩티드 억제제는 전신 투여, 예를 들어 주입 또는 주사에 의해 정맥내 또는 복강내 투여될 수 있다. 펩티드 억제제는, 예를 들어, 국소 영역으로 주사 또는 주입시키거나, 또는 환부로 약물 전달 장치를 이식시킴으로써 국소 투여될 수도 있다. 펩티드 억제제 액제는 수중에서 임의로 무독성 계면활성제와 혼합하여 제조할 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴, 및 이들의 혼합물 및 오일 중에서 제조할 수도 있다. 통상의 저장 및 사용 조건하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하는 예방제를 포함한다.
주사, 주입 또는 국소 도포에 적합한 약제 투여 형태로는 무균 수용성 액제 또는 분산제, 또는 무균 주사용 또는 주입용 액제 또는 분산제의 즉석 제조에 적합한, 임의로 리포좀내에 캡슐화된 활성 성분을 포함하는 무균 산제가 포함될 수 있다. 모든 경우에서, 최종적인 투여 형태는 제조 및 저장 조건하에 무균적이고, 유동성이며, 안정해야 한다. 액상 담체 또는 비히클은, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 무독성 글리세릴 에스테르 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 리포좀을 형성하거나, 분산제의 경우 소정의 입도를 유지하거나 또는 계면활성제를 사용하여 유지할 수 있다. 미생물의 작용은 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 및 티메로살 등에 의해 억제할 수 있다. 특정한 경우, 당업자는 등장화제, 예를 들어 당, 완충제 또는 염화나트륨을 포함하도록 선택할 수 있다. 주사용 조성물의 흡수는 조성물 중에 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 지연시킬 수 있다.
무균 주사용 액제는 필요한 양의 펩티드 또는 펩티드 접합제를 상기 언급한 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 후, 필요에 따라 여과 멸균하여 제조한다. 무균 주사용 액제의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이며, 이러한 기술에 의해 활성 성분에 더하여 상기 무균 여과 액제 중에 존재하는 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 얻는다.
특정한 경우, 펩티드 억제제를 또한 제약상 허용되는 비히클, 예를 들어 불활성 희석제 또는 흡수가능한 식용 담체와 함께 경구 투여할 수도 있다. 이들을 경질 또는 연질 쉘의 젤라틴 캡슐 내에 넣거나, 정제로 압착하거나 또는 환자의 규정식 음식물에 직접 혼입할 수 있다. 경구 치료 투여의 경우, 펩티드 억제제는 1종 이상의 부형제와 조합되어 섭취가능한 정제, 구강용 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭서제, 현탁액제, 시럽제 및 웨이퍼제 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 활성 화합물을 0.1％ 이상 포함한다. 물론, 조성물 및 제제의 비율은 달라질 수 있으며, 주어진 단위 투여 형태의 중량의 약 2％ 내지 약 60％인 것이 편리할 수 있다. 치료적으로 유용한 상기 조성물 중 활성 화합물의 양은 효과적인 투여 수준이 달성되는 양이다.
또한, 정제, 트로키제, 환제 및 캡슐제 등은 트라가칸트 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴 등의 결합제; 인산이칼슘 등의 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분 및 알긴산 등의 붕해제; 스테아르산 마그네슘 등의 윤활제; 및 수크로스, 프룩토스, 락토스 또는 아스파르탐 등의 감미제를 포함할 수도 있으며, 박하, 동록유 또는 체리향이 첨가될 수도 있다. 단위 투여 형태가 캡슐제인 경우, 이 단위 투여 형태는 상기 유형의 물질 이외에도 액상 담체, 예를 들어 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 기타 다양한 물질이 코팅물로서 존재하거나, 또는 고체 단위 투여 형태의 물리적 형태를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐제를 젤라틴, 왁스, 셸락 또는 당 등으로 코팅할 수 있다. 시럽제 또는 엘릭서제는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스 또는 프룩토스, 보존제로서 메틸 및 프로필 파라벤, 염료 및 체리향 또는 오렌지향 등의 향미제를 포함할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태를 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 제약상 허용되는 것이어야 하며 사용된 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 펩티드 억제제는 지속-방출형 제제 및 장치내에 혼입될 수 있다.
유용한 고상 담체로는 미분 고체, 예를 들어 탈크, 점토, 미세결정질 셀룰로오스, 실리카 및 알루미나 등이 포함된다. 유용한 액상 담체로는 물, 알콜 또는 글리콜 또는 물-알콜/글리콜 혼합물을 들 수 있으며, 여기에 임의로 무독성 계면활성제를 사용하여 본 발명의 화합물을 유효 수준으로 용해 또는 분산시킬 수 있다. 보조제, 예를 들어 향미제 및 추가의 항균제를 첨가하여 주어진 용도를 위한 특성을 최적화할 수 있다.
또한, 증점제, 예를 들어, 합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알콜, 개질된 셀룰로오스 또는 개질된 광물 물질을 액상 담체와 함께 사용하여 사용자의 피부에 직접 사용되는, 도포가능한 페이스트, 겔, 연고 및 비누 등을 제조할 수도 있다.
일반적으로, 본 발명의 펩티드는 상처 치료 및 건강한 피부 생성의 촉진을 위해 국소 투여된다. 활성 펩티드는 스프레이제, 폼제, 산제, 크림제, 젤리제, 페이스트제, 좌제 또는 액제로 임의의 수단에 의해 선택된 조직에 직접 또는 간접적으로 국소 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 페이스트라는 용어는 크림제 및 기타 점성의 도포가능한 조성물을 포함하는 의미로 사용되어야 하며, 흔히 피부에 직접 적용되거나, 붕대 또는 드레싱에 도포된다. 본 발명의 펩티드는 피부 커버링 또는 상처 드레싱 재료에 공유 부착되거나, 안정하게 흡착되거나 또는 도포될 수 있다. 수술 후 치유를 촉진시키기 위해, 활성 펩티드를 표적 조직 또는 이식가능한 보철 장치에 직접 이용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 다른 작용제들과 함께 에어로졸제, 폼제 또는 스프레이제로 피부 또는 상처에 직접 투여될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 왁스, 오일, 유화제, 물, 및(또는) 물의 존재하에 겔을 형성하는 실질적으로 수-불용성인 물질 중 상기 펩티드의 에멀젼을 포함할 수 있는 제제로 투여될 수 있다. 당해 제제는 도포가능하며 에멀젼의 크림 농도를 갖지만, 겔이 에멀젼을 안정시키기 때문에 통상의 멸균 방법, 예를 들어 증기 멸균법으로 처리하는 경우에 분해되지 않는다는 점에서 바람직한 에멀젼 특성을 제공한다. 또한, 상기 제제는 물이 에멀젼 및 겔의 둘 다에 보유되기 때문에 통상의 겔보다 더 우수한 수분 보유 특성을 나타낸다.
또한, 상기 제제는 본 발명의 크림제 또는 로션제가 건조되는 속도를 늦추기 위해 크림제 또는 로션제 중 물의 증기 분압을 감소시키는 습윤제를 포함할 수도 있다. 적합한 습윤제는 큰 수혼화성을 가지며, 일반적으로 피부에 적용하기에 적합하다. 폴리올은 이러한 목적에 특히 적합하며, 적합한 폴리올의 예로는 모노프로필렌 글리콜 또는 글리세린 (글리세롤)이 포함될 수 있다. 폴리올은 제제 전체 중에 20％ 내지 50％ (중량)의 비율로 존재할 수 있다. 또는, 상기 범위는, 예를 들어, 30％ 내지 40％일 수 있다. 또한, 이러한 비교적 높은 비율의 폴리올은, 상기 페이스트가 임의의 정도로 건조되는 경우, 글리세린이 중합체에 대한 가소제로서 작용할 수 있기 때문에 생성된 페이스트가 연성 및 가요성인 상태로 존재할 수 있도록 보장한다. 예를 들어, 페이스트를 붕대에 도포하는 경우, 페이스트가 수분을 상실했을 때, 그 결과 붕대를 절단하지 않아도 페이스트를 피부에서 쉽게 제거할 수 있다. 폴리올은 또한 피부 또는 상처, 특히 감염 상처와 접촉하는 경우에 페이스트 중 박테리아의 증식을 방지하는 작용을 하는 이점이 있다.
상기 제제는 기타 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 성분으로는 산화아연, 이크타몰, 칼라민, 은 술파디아진, 클로르헥시딘 아세테이트, 콜 타르, 클로르헥시딘 글루코네이트, 살리실산, 메트로니다졸 또는 다른 항균제 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 또한, 크림제에 혼입하기에 적합한 다른 성분들이 존재할 수도 있다.
다른 성분들은 국소 제형 중에 이로운 양으로 포함될 수 있고, 예를 들어 산화아연이 약 15 중량％ 이하 첨가될 수 있으며; 통상적으로는 6％ 내지 10％의 산화아연이 가능하게는 이키타몰 (0 중량％ 내지 3 중량％) 및(또는) 칼라민 (0 중량％ 내지 15 중량％) 등의 다른 성분과의 조합으로 사용된다. 이키타몰 또는 칼라민은 단독으로 사용될 수도 있다. 클로르헥시딘 아세테이트는 1 중량％ 이하의 농도로 사용될 수 있으며, 0.5 중량％가 통상적이다.
본 발명의 에멀젼에 사용되는 왁스의 일례는 글리세릴 모노스테아레이트, 또는 크로다 유니버셜 리미티드 (Croda Universal Ltd.)사에서 상표명 CITHROL GMS/AS/NA로 시판되는, 글리세릴 모노스테아레이트와 PEG100 스테아레이트의 배합물이다. 이러한 배합물은 왁스 및 특히 왁스와 상용성인 유화제 (PEG100 스테아레이트) 둘 다를 제공하여 수중 에멀젼을 형성한다. 에멀젼의 안정성을 증가시키기 위해 제2 유화제, 예를 들어 크로다 유니버셜 리미티드사에서 제공하는 CITHROL 1OMS와 같은 PEG20 스테아레이트를 제제 중에 포함시킬 수 있다. 크림제 중 유화제의 총 농도는 통상적으로 3％ 내지 15％의 범위이다. 2가지 유화제가 사용되는 경우, 한 유화제는 다른 유화제보다 훨씬 높은 농도로 존재할 수 있다.
수-불용성 물질은 제제 중의 물과 함께 겔을 형성한다. 따라서, 상기 물질은 친수성이지만, 물에 많은 정도로 용해되는 것은 아니다. 이 물질은 흡수성의 비-수용성 중합체인 중합체 물질일 수 있다. 그러나, 물과 함께 겔을 형성하며 승온에서 안정한 비-중합체 물질, 예를 들어, 점토, 예를 들어, 카올린 또는 벤토나이트를 사용할 수도 있다. 본 발명에 사용되는 몇몇 중합체는 초흡수성 중합체, 예를 들어 WO-92/16245에 개시된 초흡수성 중합체이며, 부분적으로 가교결합되어 3차원 구조를 형성시킨 친수성 셀룰로오스 유도체를 포함한다. 가교결합된 적합한 셀룰로오스 유도체는 알킬기가 탄소 원자를 1개 내지 6개 포함하는 히드록시 저급 알킬 셀룰로오스의 유도체, 예를 들어 히드록시에틸 셀룰로오스 또는 히드록시프로필 셀룰로오스, 또는 카르복시-셀룰로오스, 예를 들어 카르복시메틸 히드록시에틸 셀룰로오스 또는 카르복시메틸 셀룰로오스의 유도체를 포함한다. 중합체의 예는 악조 케미칼스 비.브이. (Akzo Chemicals B.V.)사에서 상표명 아쿠셀 (AKUCELL) X181로 제공하는 부분적으로 가교결합된 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스이다. 이러한 중합체는 물을 그 자신의 중량에 비해 10배 이상 흡수할 수 있다는 점에서 초흡수성 중합체이다. 중합체의 가교결합 구조는 중합체가 수중에 용해되는 것을 방지하지만, 물은 중합체의 3차원 구조내에 쉽게 흡수 및 보유되어 겔을 형성한다. 물은 용액보다는 겔에서 더 느리게 상실되며, 이는 크림 제제의 건조를 늦추거나 방지하는 데 있어서 유리하다. 제제 중의 중합체 함량은 통상적으로 10 중량％ 미만, 예를 들어 약 0.5 중량％ 내지 약 5.0 중량％의 범위 또는 약 1.0 중량％ 내지 약 2 중량％의 범위이다.
제제는 멸균할 수 있으며, 최종 생성물의 원하는 유동성을 제공하기 위해서는 제제의 성분을 중합체 함량을 변화시킴으로써 선택해야 한다. 즉, 생성물을 멸균해야 하는 경우, 멸균에 앞서 비교적 높은 점성/탄성의 생성물을 제공하는 제제를 선택해야 한다. 제제의 특정한 성분을 멸균하지 않아야 하는 경우, 상기 성분을 첨가하기 전에 제제를 멸균할 수 있거나, 각 성분을 별도로 멸균할 수 있다. 이어서, 제제에 각각의 멸균 성분을 혼입시키는 멸균 조건을 사용하여 제제를 제조할 수 있다. 성분들을 별도로 멸균한 다음 함께 혼합하는 경우, 중합체 함량을 조절하여 원하는 유동성을 갖는 최종 생성물을 제공할 수 있다. 에멀젼 함량은 제제의 취급성 및 촉감을 결정하며, 에멀젼 함량이 높으면 도포성 및 크림 특성이 증가한다.
제제는 튜브, 조 (tub) 또는 기타 적합한 저장 용기 형태로 포장되거나, 기재 상에 도포된 다음 포장될 수 있다. 적합한 기재로는 필름 드레싱을 비롯한 드레싱, 및 붕대가 포함된다.
본 발명은 본 발명을 실행하는 특정 방식을 설명하는 하기 실시예로 추가로 설명되지만, 이 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니며 본 발명의 범위는 부속된 청구의 범위에 의해 한정된다.
실시예 1: 매트릭스 메탈로프로테이나제의 펩티드 억제제
일반적 재료
모든 펩티드는 시그마 제노시스, 인크. (Sigma-Genosys, Inc.)사에 의해 합성된 것이다. 방출된 펩티드는 이 회사에 의해 RP-HPLC를 거쳐 95％ 초과의 균일도로 정제되었다. 용출된 피크의 물질을 풀링하여 탈염시키고, 동결건조하였다. 질량 분광법 분석에 의해 펩티드의 분자량 및 순도를 확인하였다. 다른 언급이 없다면, 모든 화학물질은 시그마 케미컬 코포레이션 (Sigma Chemical Corp.)사 또는 플루카 케미컬 컴퍼니 (Fluka Chemical Co.)사로부터 구입하였다. 활성 MMP-9 효소는 칼바이오켐 (Calbiochem.)사로부터 구입하였다.
분자 모델링
분자 모델링에서는 2가지 시각화 프로그램, 즉 스위스 (Swiss) PDB 뷰어 (Viewer)(Guex and Peitsch, 1997) 및 라스몰 (Rasmol)(Sayle and Milner-White, 1995)을 이용하였다. 모델 연구는 컴팩 (Compaq) PC 운영체체인 윈도우즈 (Windows) 95, 및 실리콘 그래픽스, 인크. (Silicon Graphics, Inc.)사의 옥테인 (Octane) UNIX 워크스테이션에서 수행하였다. 또한, 몰레큘라 시뮬레이션즈, 인크. (Molecular Simulations, Inc.)사의 세리우스2 (Cerius2) 분자 패키지를 상기 옥테인에서 이용하였다. 다음과 같은 3차원 구조 파일을 프로테인 데이터뱅크 (Protein Databank)로부터 다운로드하였다 (파일명, 참고문헌): MMP-1 (1FBL, Li et al., 1995), MMP-2 (1GEN, Libson et al., 1995), MMP-8 (1JA0, 1JAN, Grams, et al., 1995; Reinemer et al., 1994), MMP-9 (1MMQ, Browner et al., 1995), TIMP-2/MT-1 MMP 복합체 (1BUV, Fernandez-Catalan et al., 1998), TIMP-2 (1BR9, Tuuttila et al., 1998), 및 TIMP-1/MMP 복합체 (1UEA, Gomis-Ruth et al., 1997; Huang et al., 1996; Becker et al., 1995). 상기 파일은 단백질의 3차원 구조를 분석하기 위해 사용되었으며, 1차 서열 데이터의 공급원이다.
억제 분석
2가지 효소 분석을 수행하였다. 제1 분석은 MMP-9에 의한 형광화된 콜라겐의 효소 가수분해를 시간의 함수로 측정하였다. 5 μM 농도의 형광화된 콜라겐 (Molecular Probes, Inc.)을 반응 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 mM NaN3)에 가하고, 스펙트로실 (등록상표, Spectrosil) 석영 형광계 큐벳에 넣었다. 0.1 μM 농도의 MMP를 다양한 양의 펩티드와 혼합하고, 결합을 수행하기 위해 25℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이 단백질 혼합물을 콜라겐 기질에 가하고, 빠르게 혼합하였다. 520 nm에서의 형광 방출 강도를 쉬마드주 (Shimadzu) RF5301 형광계 (Lakowicz, 1983)에서 시간의 함수 (여기 파장 495 nm)로 측정하였다. 상기 형광 방출 분석을 이용하여 문헌 [Segel (1993)]에 따라 하기 기울기를 갖는 딕슨 (Dixon) 그래프 (1/v 대 [I])에 의해 펩티드 억제제([I])의 억제 상수 (Ki)를 결정하였다:
Figure 112009026809884-pat00015
상기 식에서, Km은 미카엘리스 (Michaelis) 상수이고, Vmax는 최대 반응 속도이며, [S]는 기질 농도이다.
제2 분석은 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 기술을 이용하였다. 7개의 아미노산으로 된 기질 펩티드 (Calbiochem)를 카르복실 말단의 디니트로페닐 수용체 및 아미노 말단의 2-아미노벤조-안트라닐로일 (Abz) 잔기 공여자에 연결하였다. MMP-9에 의해 상기 기질을 절단하여 형광 생성물 (365 nm 여기, 450 nm 방출)을 유리시켰다. 5 μM 농도의 펩티드를 반응 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 mM NaN3)에 가하고, 1％ BSA로 미리 차단된 흑색 96-웰 미량역가 플레이트의 웰에 넣었다. 0.1 μM 농도의 MMP를 다양한 양의 9-mer (서열 12), 10-mer (서열 13) 또는 19-mer (서열 11) 펩티드와 혼합하고, 결합을 수행하기 위해 25℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이 단백질 혼합물을 형광 펩티드 기질에 가하고, 빠르게 혼합하였다. 다이넥스 (Dynex) MFX 형광 미량역가 플레이트 판독기를 사용하여 형광 강도를 시간의 함수로 측정하였다. 형광 강도는, Abz 함유 비-FRET 펩티드를 사용하여 표준 그래프를 생성시킨 결과, 절단된 펩티드의 몰수와 관련되었다. 억제 상수는 상기와 같은 그래프로부터 유도되었다. 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제 효소는 특정 기질인 FRET 펩티드 (모두 Calbiochem에서 구입)를 사용하여 유사한 방식으로 시험하였다.
항-활성화 분석
이 분석은 성숙 매트릭스 메탈로프로테이나제로 전환되는 전구효소의 양을 측정한다. 전구효소 프로-MMP-9 (100 ㎍)를 PBS 중 스트로밀리신 0.5 ㎍과 혼합하였다. 반응물을 35℃에서 인큐베이션하였다. 80분의 시간 과정에서 반응물로부터 분액을 취하였다. 각 분액을 EDTA와 1 mM의 최종 농도로 혼합하고, 바이오셀렉트 (BioSelect) 125 HPLC 컬럼에 주입하고, PBS 중 크로마토그래피하였다. 영점 (주입) 시점은 약 750초 후 컬럼으로부터 용출하는 단일 피크였다. 이 피크의 크기는 시간의 함수로서 감소하며, 2개의 새로운 피크가 나타났다. 제1 피크는 약 800초 시점에서 용출하며, 성숙 형태의 MMP-9를 나타낸다. 제2 피크는 약 1,100초 시점에서 용출하며, N-말단의 프로도메인 단편에 상응한다. 피크 면적은 용출 프로필을 통합하여 결정하였으며, 면적 변화율을 그래프로 작성하였다.
등온 적정 열량측정
마이크로칼, 인크. (MicroCal, Inc.)사의 VP-ITC 기기를 사용하여 등온 적정 열량측정 (ITC)을 수행하였다. 적정은 (0.5 mM 내지 2.0 mM의 농도 범위의) 억제제 펩티드 용액 5 ㎕를 교반된 반응 세포 1.4 mL에 주입하여 수행하였다. MMP-9는 세포에서 50 μM 내지 80 μM의 농도 범위로 존재하였다. 억제제 및 효소 둘 다는 20 mM 나트륨 카코딜레이트 (pH 5.5 내지 7.0), 40 mM NaCl 또는 20 mM Tris-HCl (pH는 7.0 내지 7.5임), 40 mM NaCl 중에 존재하였다. 적정을 20℃ 내지 40℃에서 수행하였다. 적정 실험의 전형적인 조건은 10초의 주입 시간에 이어서, 총 40 회의 주입 동안 주입 사이마다 240초의 간격을 두는 것이었다. 억제제 펩티드를 완충액으로 블랭크 적정하는 것은 희석 및 혼합시의 열을 보정하기 위해 수행하였다.
여러 결합 부위의 독립 세트는 결합 실험의 평가를 위한 가장 일반적인 모델이다. 열의 총량에 대한 분석 용액은 하기 식에 의해 결정하였다 (Freire et al., 1990):
Figure 112009026809884-pat00016
상기 식에서, Q는 열의 총량이고, V는 세포 부피이고,
Figure 112009026809884-pat00017
H는 엔탈피이고, M은 거대분자 농도이고 (세포내 결합 대응물), n은 결합 화학량론이고, L은 리간드 농도이며 (주사기 내 결합 대응물), K는 결합 상수이다. 오리진 (Origin) 버젼 5 (MicroCal, Inc.)를 사용하여 데이터를 상기 모델에 대해 핏팅하였다.
표면 플라즈몬 공명
비아코어 (BiaCore)-X 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 장치 (BiaCore, Inc.)를 사용하여 19-mer (서열 11) 펩티드 (P)와 MMP-9 사이의 상호작용을 측정하였다. 이 실험에서, 10분 동안 분 당 10 ㎕의 유속의 50 mM N-히드록시숙신이미드, 0.2 M N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드로 카르복시메틸 덱스트란 센서 칩 (CM-5, Lofas et al., 1993)을 활성화하였다. 75 ng/㎕ 농도의 MMP-9를 활성화 표면에 10분 동안 분 당 10 ㎕의 유속으로 연결하였다. 최종 표면은 1 M 에탄올아민-HCl을 센서 표면에 5분 동안 분 당 10 ㎕의 속도로 유출시켜 불활성시켰다. 19-mer (서열 11) 펩티드를 센서 표면에 분 당 20 ㎕의 속도 및 10 nM 내지 50 nM 범위의 농도로 흐르게 하였다. 결합 등온선의 결합상 및 해리상은 속도 상수를 모델 링하기에 앞서 자동화 FFT 루틴에 의해 고르게 하였다. 결합 등온선은 정방향 (ka) 및 역방향 (kd) 속도 상수를 하기 식 (Karlsson and Falt, 1997)에 동시에 핏팅하여 평가하였다:
Figure 112009026809884-pat00018
상기 식에서, [P], [MMP-9] 및 [P~MMP-9]는 각각 유리 펩티드, 유리 MMP-9 및 복합체의 농도이다. 평형 친화도 상수 (KA)는 하기와 같이 정의된다:
Figure 112009026809884-pat00019
상기 수학식 3은 SPR 신호 (Morton et al., 1995) 측면에서 아래와 같이 적절하게 표현된다:
Figure 112009026809884-pat00020
상기 식에서, R은 시간 t에서의 SPR 신호 (반응 단위는 RU임)이고, Rmax는 최대 MMP-9 결합 용량 (RU 단위)이며, C는 킬레이트 펩티드 농도이다. 동적 분석 (O'Shannessy et al., 1993)은 마이크로칼, 인크.사의 오리진 (Origin)을 사용하여 수행하였다.
생존율 분석
매트테크 코포레이션 (MatTek Corp.)사의 피부 모델 에피덤 (등록상표, Epiderm)을 사용하여 9-mer (서열 12), 10-mer (서열 13) 및 19-mer (서열 11) 펩티드의 상대적인 독성을 분석하였다. 각 피부 샘플 용기를 배양 배지에서 37℃의 온도 및 5％ C02 조건하에 2시간 동안 예비인큐베이션한 다음, 펩티드를 첨가하였다. 샘플 용기를 신선한 배지를 포함하는 6웰 플레이트로 옮겼다. 모든 펩티드를 PBS 중에 10 mM의 최종 농도로 용해시키고, 각 펩티드 용액 100 ㎕를 에피덤 샘플 용기의 표면에 피펫팅하였다. 37℃의 온도 및 5％ CO2 조건하에 12시간 동안 인큐베이션을 지속하였다. 인큐베이션 기간 후, 샘플 용기를 PBS로 3회 세척하고, 웰 당 MTT 분석 배지 300 ㎕를 포함하는 (MTT 농도는 1 mg/mL임) 24웰 플레이트로 옮겼다. 열량측정 분석을 3시간 동안 진행시켰다 (37℃ 및 5％ CO2 조건에서 인큐베이션함). 이어서, 샘플 용기를, 웰 당 이소프로판올 2 mL를 포함하는 24웰 배양 플레이트로 옮겼다. 유색 침전물의 추출은 실온에서 4시간의 기간 동안 일어났다. 각 샘플에서 흡광도 판독값은 570 nm 및 650 nm에서 구하였다. PBS 대조군에 대한 각 샘플의 생존율(％)은 하기와 같이 계산하였다:
Figure 112009026809884-pat00021
통상적으로, 펩티드 샘플은 3회 반복 분석하였다.
결과
매트릭스 메탈로프로테이나제-2의 서열 (서열 14)을 하기에 제공하여 매트릭스 메탈로프로테이나제 중의 각종 도메인 및 영역의 한정을 용이하게 하였다.
Figure 112009026809884-pat00022
9개의 MMP 아미노산 서열의 절단 영역의 확고한 쌍쌍 정렬을 프로그램 클루스탈 (CLUSTAL (등록상표)) (Higgins et al., 1992)을 사용하여 계산하였다. 이 정렬은 활성화 단백질분해효소 절단 부위를 플랭킹하는 보존 및 비-보존 아미노산 모두의 위치를 지정하였다. 활성화 절단 부위에 대한 N-말단 아미노산 임의의 수, 뿐만 아니라 아미노산 C-말단 수를 정렬을 위해 가려냈다. 도 1에 나타낸 MMP 서열의 정렬 (표 1)은 모든 MMP 활성화 영역이 통계적으로 유의한 방식으로 정렬될 수 있다는 것을 나타냈다. 정렬을 위해 선택한 영역은 아미노산 70 내지 120에 개략적으로 상응하며, 신호 서열의 평균 MMP 구조는 아미노산 1 내지 20으로 추정되 고, 프로펩티드 도메인은 아미노산 21번 내지 100번으로 추정되고, 성숙한 활성 효소는 아미노산 101번 내지 말단으로 추정되었다. 연구를 위해 선택한 19-mer (서열 11) 서열을 정렬 영역 내에 포함시켰다. 놀랍게도, 19-mer (서열 11)는 MMP-2 중의 아미노산 100 내지 118에 상응하였다.
MMP 서열의 정렬은 활성화 도메인의 중앙 영역인 PRCGVPDV (서열 1)가 매우 보존적이고, 이 영역을 플랭킹하는 보다 정도의 서열 변이가 존재한다는 것을 나타냈다. 서열 이질성을 사용하여 (이 정렬에 기초하여) 아미노산을 간단히 선택하여 특정 MMP 효소, 또는 MMP의 조합을 억제하는 펩티드 서열을 디자인할 수 있다. 또한, 효능을 조정하기 위해 특정 펩티드의 길이를 변화시킬 수 있다.
프로-MMP-1의 3차원 구조를 도 2에 제공하며, 이는 표 1 및 도 1에 나타낸 활성화 영역 각각이 2개의 큰 구형 도메인을 서로 연결하는 가교를 구성한다는 것을 나타냈다. 프로펩티드 도메인을 활성 효소 도메인에 연결시키는 구조가 없는 짧은 도메인으로서 절단 영역을 지정하였다. 이 서열은 활성화 단계의 부분으로서 2개로 절단되었다. 이 서열은 또한 시험관내 HgCl2 조정 활성화에 민감한 영역이었다.
활성화는 성숙한 효소 활성 부위를 덮지 않는 입체 블록 (프로펩티드 도메인임)을 제거하였다. N-말단 끝은 촉매성 아연 이온에 근접하며, 이 촉매성 아연 이온은 효소 활성에 절대적으로 요구되었다. 활성 MMP-9의 구조를 고상 볼으로서 도시된 아연 이온과 함께 도 3에 나타냈다. 제2 아연은 구조적 이온인데, 즉 단백질 안정성에 기여하지만 촉매화에는 기여하지 않았다. 19-mer (서열 11) 펩티드의 C-말단 절반은 결국 효소의 아미노 극말단이고, 마지막 루프의 오르막 부위로서 도 3의 좌측에 나타냈다. 활성화된 MMP 표면에 대한 활성화 도메인 펩티드의 모델링은 펩티드 (특히, 더 긴 N-말단 영역이 포함되는 경우)가 활성 부위 영역과 상호작용할 수 있다는 것을 나타냈다. 사실상 블로킹 기질은 활성 부위에 접근하였다. 이 방식으로 블로킹 기질은 미니 프로-도메인 또는 효소 "캡 (cap)"으로서 작용할 수 있었다.
효소가 단편으로 단백질가수분해될 수 있고, 이들 단편이 재구성되어 활성 효소를 재생할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 각종 펩티드 도메인은 재조립되고, 비-공유 분자간 힘으로 함께 유지되었다. 이러한 펩티드-단백질 상호작용의 전통적인 실례는 리보뉴클레아제 S-펩티드/리보뉴클레아제 S-단백질 상호작용을 포함한다 (Levit and Berger, 1976). 리보뉴클레아제 S-펩티드는 S-단백질에 그의 적절한 위치로 결합하고, 생성된 복합체는 RNASE-S의 효소 활성을 복구하였다.
본 발명에 따라 활성화 도메인 펩티드는 불활성 복합체를 형성하며 프로-MMP에서 발생하는 영역 중의 활성화된 MMP에 재결합할 수 있다. 이러한 결합을 측정하였다 (하기 참조). 또한, 19-mer (서열 11) 펩티드는 촉매화를 다시 차단하며 그의 시스테인 잔기를 통해 아연을 리간딩할 수 있다.
MMP 효소 활성의 억제
제1 억제 연구는 MMP-2 절단 도메인 영역으로부터 유도된 19 아미노산 펩티드 (서열 11)로 수행하였다. 이 펩티드를 최고 정도의 보존성을 나타내는 클루스 탈 정렬의 영역으로부터 선택하였다. 선택된 19-mer (서열 11)는 엄격히 N-말단이 보존성이지만, C-말단 부분에 높은 정도의 변이성을 나타냈다. 이 펩티드의 N-말단 및 C-말단 절반을 나타내는 2종의 더 작은 펩티드를 또한 시험하였다. 2개의 절반은 대략 펩티드를 보존성 N-말단 부분 (9-mer (서열 12)) 및 비-보존성 C-말단 부분 (10-mer (서열 13))으로 나누어졌다. 이는 억제의 전체 효능 및 선택성을 시험할 수 있게 할 것이다.
19-mer: PRCGNPDVANYNFFPRKPK (서열 11)
9-mer: PRCGNPDVA (서열 12)
10-mer: NYNFFPRKPK (서열 13)
3종의 펩티드 모두는 형광 기초 분석에서 MMP-9를 억제할 수 있었다. 연구된 모든 경우에, 19-mer (서열 11)는 2종의 절반 펩티드보다 더 양호한 억제제였다. 9-mer (서열 12)는 C-말단 10-mer (서열 13) 펩티드보다 더 유효한 억제제였다. 이들 결과는 시스테인이 아연 리간드로서 작용하기 때문에 필요할 수 있거나 또는 N-말단 영역이 효소 활성 부위의 입체 블로킹에 영향을 주는데 요구된다는 것을 나타냈다. 이 가설은 더욱 N-말단인 서열 (잔기 100번 이전의 아미노산을 의미함)을 함유하는 억제제 펩티드를 생성하여 시험할 수 있었다. 19-mer (서열 11)로 적정된 MMP-9의 전형적인 억제 플롯을 도 4에 나타냈다.
10-mer (서열 13) 및 9-mer (서열 12) 펩티드로 수행하는 유사한 억제 분석을 도 5 및 6에 각각 나타냈다. 각각의 펩티드는 FRET-기초 분석에서 MMP-9를 억제할 수 있으며, 억제제 상수 (Ki) 범위는 45.2 내지 327.7 μM이었다 (표 4 참조 ). 기질 (FRET 펩티드 또는 형광화된 콜라겐)의 선택은 하기와 같은 일관된 경향으로 3종의 펩티드의 상대적인 억제를 거의 차이나지 않게 하였다: 19-mer (서열 11) > 9-mer (서열 12) > 10-mer (서열 13). MMP-9를 펩티드로 적정하는 전형적인 반응 플롯을 도 7 내지 9에 나타냈다.
억제제 상수는 콜라겐 기질에 대해 전부 다소 더 낮으며, 범위가 콜라겐의 경우 30.3 내지 221.3 μM이고, FRET-펩티드의 경우 45.2 내지 327.7 μM이었다. 이들 데이터는 콜라겐 기질을 사용하는 경우 펩티드가 다소 더 유효한 억제제인 것을 나타내며, 이는 억제제 펩티드가 활성 부위를 블로킹하고, 콜라겐이 FRET-펩티드 기질보다 유의하게 더 크기 때문에 효소 활성 부위에 대한 접근을 차단하기에 더 용이하다는 것을 제시하고 있다. 더 작은 FRET-펩티드 기질은 억제제 펩티드 존재에서조차도 활성 부위에 접근이 더 용이할 수 있다.
전형적인 효소 분석 (도 4 내지 7에 나타냄)을 30 내지 40분 동안 전형적으로 수행하였다. 연장된 시간 분석은 19-mer (서열 11)가 콜라겐의 MMP-9 촉매 가수분해를 1000분 넘게 유효하게 억제한다는 것을 나타냈다 (도 8). 10-mer (서열 13) 펩티드 (도 9)는 9-mer (서열 12) 펩티드 (도 10)보다 장시간 대에서 콜라겐의 파괴에 덜 유효하였다. 19-mer (서열 11) 펩티드는 다시 최고 정도의 억제를 나타냈다.
유사한 효소 연구를 다른 MMP 효소에 수행하여 19-mer (서열 11) 펩티드의 유효성을 시험하였다. 이들 분석은 특정 MMP 절단 부위를 FRET 펩티드의 서열에 도입시킨 FRET 펩티드를 사용하였다. 19-mer (서열 11) 펩티드는 다중 MMP를 유효 하게 억제할 수 있었다. 각종 MMP에 대한 19-mer (서열 11) 펩티드의 유효성은 하기와 같으며 억제제 상수의 범위가 3.1 μM (MMP-2) 내지 41.1 μM (MMP-1)이었다: MMP-2 > MMP-3 > MMP-8 > MMP-7 > MMP-9 > MMP-1. 이들 데이터를 하기 표 4에 요약하였다.
억제제 데이터의 요약
펩티드 효소 기질 Ki (μM)
19-mer (서열 11) MMP-9 콜라겐 30.3
9-mer (서열 12) MMP-9 콜라겐 185.9
10-mer (서열 13) MMP-9 콜라겐 221.3
19-mer (서열 11) MMP-9 FRET 펩티드 45.2
9-mer (서열 12) MMP-9 FRET 펩티드 232.8
10-mer (서열 13) MMP-9 FRET 펩티드 327.7
19-mer (서열 11) MMP-1 FRET 펩티드 41.1
19-mer (서열 11) MMP-2 FRET 펩티드 3.1
19-mer (서열 11) MMP-3 FRET 펩티드 6.4
19-mer (서열 11) MMP-7 FRET 펩티드 22.8
19-mer (서열 11) MMP-8 FRET 펩티드 12.5
19- mer (서열 11) 펩티드의 항- 스플라이싱 활성:
MMP는 불활성 전구효소 형태로 생합성적으로 생성된다. 막 결합 MMP의 개별적인 분류에 의해 종종 전구효소의 단백질가수분해 절단은 MMP 활성화를 야기한다. 전구효소 선도 서열은 길이가 약 100개 아미노산 (MMP 마다 다소 다름)이고, 단백질의 아미노 극말단에서 발견된다. 전구효소 활성화의 억제는 만성 상처에서 MMP 효소 활성을 낮추는 효과적인 방법일 수 있다. 이들 효소가 기능할 수 없는 경우 ECM 분해 속도가 감소되어, 이는 또한 만성 상처 치유의 더 빠른 속도를 야기할 수 있다.
명확히 활성화 도메인 펩티드 (19-mer (서열 11), 9-mer (서열 12), 및 10-mer (서열 13))는 각종 MMP의 효소 활성을 억제하였다. 이 활성 이외에, 19-mer (서열 11) 펩티드는 MMP-9의 전구 (불활성) 형태의 활성화를 억제하였다. 따라서, 19-mer (서열 11) 펩티드는 이미 활성화된 MMP를 억제하거나 또는 신규 합성된 프로-MMP의 활성화를 차단하여 피부 중의 및 만성 상처 삼출물 내의 전체적인 MMP 활성 수준을 저하시킬 수 있다.
도 11은 전형적인 스플라이싱 분석을 나타냈다. 약 700초에서 용출되는 제1 피크는 프로-MMP-9이었다. 스플라이싱 반응이 진행되면서, 이 피크는 세기가 감소되고 (하향 화살표로 표시함), 2개의 신규 피크가 나타났다. 약 800초에서 용출되는 제1 신규 피크는 성숙된 활성 MMP-9이었다. 약 1050초에서 용출되는 제2 신규 피크는 프로도메인이었다. 스플라이싱 반응이 진행되면서 이들 2개의 피크의 세기는 증가하였다 (상향 화살표로 표시함). 반응이 완료된 때에, 잔존하는 탐지가능한 프로-MMP-9가 없었다. 표준 스플라이싱 반응을 19-mer (서열 11) 펩티드로 적정하는 것은 프로-MMP-9에서 프로도메인 및 활성 효소로의 전환을 차단하였다. 도 12는 이 적정의 결과를 나타냈다. 스플라이싱은 마이크로몰의 19-mer (서열 11) 펩티드를 사용하여 투여량 의존 방식으로 억제될 수 있다.
등온 적정 열량측정법
19-mer (서열 11) 펩티드가 활성 MMP-9와 안정한 비-공유 복합체를 형성하는지를 결정하기 위해 열량측정법을 이용하였다. 이들 데이터는 효소 억제의 메카니즘 및 19-mer (서열 11) 펩티드의 항 활성화 특성의 이해를 제공한다. 도 13은 19-mer (서열 11) MMP 억제제와 MMP-9 사이의 상호작용에 대한 등온 열량측정 실험을 나타냈다. 펩티드를 20 mM 카코딜레이트 (pH 6.8), 20 mM NaCl에 최종 농도 1 mM로 용해시켰다. MMP-9를 동일한 완충액 내로 최종 농도 20 μM에서 투석시켰다. 일련의 표준 주입을 상기와 같이 수행하였다. MMP-9와 19-mer (서열 11) 사이의 상호작용 결과는 하기와 같았다:
화학량론: 0.975 ±0.02
Figure 112009026809884-pat00023
H (kcal/mol): -26.1 ±1.45
Figure 112009026809884-pat00024
S (cal mol-1 K-1): -11.6 ±2.2
KA (M-1): 1.65 x 106 ±4.5 x 104
이들 결과는 19-mer (서열 11) 펩티드와 MMP-9 사이의 상호작용이 엔탈피적으로 구동되고,
Figure 112009026809884-pat00025
H가 음성임을 나타냈다.
Figure 112009026809884-pat00026
S가 음성 값인 증명으로 인해 이 반응은 엔트로피적으로 적합하지 않았다. 그러나, 엔탈피 용어는 용어 T
Figure 112009026809884-pat00027
S보다 크기가 더 크고, 따라서 전체적인 자유 에너지 (
Figure 112009026809884-pat00028
G)는 음성이었다.
MMP-2를 사용하는 19-mer (서열 11) 반응을 관찰하고, 이 반응은 엘탈피적으로 구동되고 엔트로피적으로 바람직하지 않는 것으로 발견되었다. MMP-2를 사용하는 19-mer (서열 11)의 적정으로 도 14에 나타낸 등온 열량측정 분석을 수행하였다. 하기 값을 이들 실험으로부터 얻었다.
화학량론: 0.99 ±0.03
Figure 112009026809884-pat00029
H (kcal/mol): -15.4 ±2.05
Figure 112009026809884-pat00030
S (cal mol-1 K-1): -21.1 ±1.8
KA (M-1): 2.40 x 106 ±3.7 x 104
따라서, 결합 반응은 엔트로피적으로 바람직하지 않았다. 이는 결합시에 입체배열 엔트로피의 손실로부터 아마 발생한다. 완전히 유연한 펩티드가 높은 정도의 자유로움을 가진다는 것을 유의한다. 모든 결합 경우에서, 펩티드 대 MMP 화학량론이 1:1이며, 이는 단일 19-mer (서열 11) 펩티드가 단일 MMP 분자와 상호작용한다는 것을 나타냈다.
표면 플라즈몬 공명
MMP-9에 대한 19-mer (서열 11)의 결합은 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술을 사용하여 역학적으로 연구하였다. 제조자에 의해 추천된 표준 화학에 따라 비아코어 인코포레이션 CM-5 칩의 표면에 활성 MMP-9를 속박시킴으로써 센서 칩을 제조하였다. 19-mer (서열 11)를 비아코어-X (등록상표) 기기 중에서 MMP-9 표면 상으로 유출시키고, 결합 및 해리를 실시간으로 모니터링하였다. 전형적인 결합 등온선을 도 15에 나타냈다. 회합 단계 (30 내지 430초)가 단일 결합 부위 모델에 최적이고, 회합 속도 상수 (ka)가 2.2 X 104 M-1s-1이었다. 해리 단계 (440 내지 700초)를 유사하게 피팅한 결과, 해리 속도 상수 (kd)가 4.1 x 10-3 s-1이었다. 계산된 평형 회합 상수(Ka = ka/kd) 5.3 X 106은 동역학 데이터와 거의 일치하였다. 모델링되지 않은 해리 단계의 개시에서 약 100개의 반응 유니트의 벌크 운반 영향이 관찰되었다. 따라서, MMP-9에 대한 19-mer (서열 11) 펩티드의 결합은 동역학 및 열역학적으로 바람직하였다.
생존율 분석
다수의 소분자 MMP 억제제와는 달리, 이 연구의 3종의 펩티드는 에피뎀 피부 모델 상에 투여할 때 세포에 무독성이었다. 도 16은 2가지 농도 (500 μM 및 2 mM)에서의 펩티드가 PBS 대조군에 비해 단지 약간의 생존율 감소를 야기한다는 것을 나타냈다. 펩티드의 총 평균 생존율은 97.6％ (19-mer (서열 11)), 89.6％ (10-mer (서열 13)) 및 95.8％ (9-mer (서열 12))이었다. 이들 결과는 만성 상처 치유에 대한 이 펩티드 치료 연구가 포유류 세포에 무독성이라는 것을 나타냈다. 도 16에 플롯팅한 데이터는 3개 1벌인 샘플의 평균이다. 생존율의 표준 편차 범위는 연구에서 2.2 내지 3.7이고, 투여 또는 펩티드 동일성에 대해 상호관계를 보이지 않았다. 생존율은 더 높은 펩티드 농도에서 약각 더 낮았다.
이들 결과는 에피뎀 (등록상표) 피부 모델에 무독성이고, 이 펩티드가 MMP와 결합 복합체를 형성하기에 동역학 및 에트로피적으로 바람직하고, 효소 활성을 억제하고 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성화를 차단한다는 것을 나타냈다.
실시예 2: 펩티드 억제제에 의한 상처 치유
방법
4 mm 생검 펀치로 C57BL6/KsJ db/db 마우스의 상처를 만들었다. 잭슨 (Jackson) 실험실로부터 입수한 마우스는 상처생성 프로토콜 착수 전에 3 내지 7개월령이었다. 모든 마우스를 상처생성 전에 마취시켰다. 근원 구조로부터 피부를 떼어내고 단리된 피부를 통해 펀치를 밀어넣어서 동물 각각의 등 상단에 2개의 상처를 만들었다. 전형적으로, 평균 깊이가 1.7 mm이고 범위가 1.3 내지 2.2 mm인 상처를 만들었다. 상처생성 코스 동안 근육은 포함되지 않았다. 상처생성 직후 상처를 일반 염수 (비-처리 대조군으로서 제공함) 또는 20 ㎍/ml 19-mer 펩티드 (서열 11) 5 ㎕로 처리하였다.
각각의 날에 상처를 디지털 사진 촬영을 하고, 상처 부위를 사진들의 컴퓨터 통합으로 결정하였다. 모든 상처 처리 및 차후 데이터 분석을 맹검 방식으로 수행하였다 (참조예: Brown et al., 1994). 상처생성 시간 (0일)의 상처 부위를 모든 상처에 대해 상대값 1로 임의로 설정하여, 0일의 상처 부위로 그 날의 상처 부위를 나누어서 차후 상처 부위를 상대적인 상처 부위로 전환시켰다.
결과:
도 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 19-mer 펩티드 (상처생성 시간, 0일)의 단일 투여 사용은 당뇨병 마우스 모델에서 완전 상처 종결 시간을 매우 가속시켰다. 상처생성 9일 후의 19-mer 펩티드로 처리한 평균 상처는 염수 처리 대조군의 14일의 평균 상처에 가까웠다. 또한, 19-mer 펩티드 (서열 11)로 처리한 상처는 상처생성 1일 후에 상처 염증의 감소를 나타냈다. 또한, 19-mer 펩티드 (서열 11) 처리된 상처가 염수 처리된 대조군 상처보다 더 신속하게 단축 과정을 개시한다 (5일 대 8일)는 것을 관찰하였다.
실시예 3: 펩티드 억제제는 VEGF 발현을 억제한다.
본 실시예에서 19-mer (서열 11) 펩티드는 혈관형성을 자극시켜 상처 치유 수단으로서 혈관을 수립하거나, 또는 혈관 형성을 방해하는 항-혈관형성 특성을 갖는지 여부를 확인 시험하였다. 완전 및 기본 배지에서 성장시킨 인간 신생아 피부 섬유모세포 (NHDF)에 19-mer (서열 11) 펩티드, 또는 그의 서브유니트를 투여하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 이어서 VEGF 프라이머 및 대조군으로서 β-액틴에 대한 프라이머를 사용하며 세포 샘플에 대해 수행하였다. 19-mer (서열 11)가 상처 치유 수단으로서 혈관형성을 촉진하는 경우, VEGF의 발현 수준은 증가될 것이다. 그러나, 19-mer (서열 11)가 혈관형성을 유도하지 않은 경우, 처리되지 않은 음성 대조군과 비교할 때 VEGF의 수준은 감소될 것이다. 또한, VEGF 발현을 자극시키기 위해 양성 대조군으로 제공되는 염화코발트 (CoCl2)로 세포를 처리하였다.
재료 및 방법
RT-PCR을 위한 프라이머 사용은 하기와 같다:
β-액틴에 대한 PCR 프라이머 (Hs. 288061)
베타 액틴 코딩 가닥-20 nt
5'-AGT CGG TTG GAG CGA GCA TC-3' (서열 19)
베타 액틴 비-코딩 가닥-20 nt
5'-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3' (서열 20)
VEGF에 대한 PCR 프라이머 (Hs. 334842)
VEGF 코딩 가닥-20 nt
5'-GCC ACC ACA CCA TCA CCA TC-3' (서열 22)
VEGF 비-코딩 가닥-20 nt
5'-CCC AAA GCA CAG CAA TGT CC-3' (서열 23)
19-mer (서열 11)의 혈관형성 특성을 시험관내 시험하기 위해 정상 인간 신생아 피부 섬유모세포 (NHDF, 메릴랜드주 워커스빌 소재의 바이오화이타커 (Biowhittaker))를 T25 플라스크 중에서 인슐린, hFGF-β, GA-1000, 및 소 태아 혈청 (10 mL)을 함유한 완전 FBM 배지 (500 mL, 바이오화이타커)에서 증식시켰다. 또한, cFBM 중에서 60％ 합류로 성장시킨 후에 섬유모세포를 시험하고, 배지를 단지 GA-1000을 함유한 FBM (500 mL, 바이오화이타커)로 이동시켰다. 19-mer (서열 11) 펩티드 및 대조 제제를 도입시키기 전에 이들 세포를 이어서 24시간 동안 기본 배지 중에서 성장시켰다.
펩티드를 시그마제네시스 (SigmaGenesis)로 합성하고, 정제하고, 순도를 HPLC로 평가한 후에 질량 분광측정기로 분석하였다. 펩티드 약 20 mg을 사용하여 농도가 PBS 중에서 10 mg/mL인 새로운 원액을 제조하고, 각각의 T25 플라스크 중의 섬유모세포에 투여시에 이 원액 200 ㎕를 사용하였다. 75％ 합류에 도달한 후에 섬유모세포에 투여하고, 37℃/5％ C02에서 밤새 인큐베이션하였다.
이러한 펩티드 억제제의 존재하에 인큐베이션한 후에 페놀-무함유 총 RNA 단리 키트 (텍사스주 오스틴 소재의 암비온 (Ambion))를 사용하며 RNA를 섬유모세포로부터 추출하였다. 섬유모세포로부터 RNA를 추출하기 위해 이 키트로부터의 용해 완충액 750 ㎕를 각각의 T25 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 이어서 작은 세포 스크래퍼로 스크랩핑하고, 미량 원심분리기 튜브에 수집하였다. 총 RNA를 제조자 프로토콜에 따라 세포로부터 추출하였다.
RNA를 cDNA로 전환시키기 위해, 뉴저지주 몬트발 소재의 제니스피어 (Genisphere)로부터의 3DNA 발현 정렬 탐색 키트 부분을 사용하였다. 사용하는 과정은 하기와 같다: 상술한 바와 같이 단리한 총 RNA 3 ㎕를 RT 프라이머 (0.2 pmol) (Cy5 (등록상표) RT 프라이머 올리고 0.067 pmol/ml) 3 ㎕ 및 DEPC 처리된 물 (암비온) 4 ㎕와 합하였다. 이 혼합물을 10분 동안 80℃로 가열하고, 10분 동안 빙상에 두고, 이어서 원심분리하였다. 또다른 튜브에서 하기 제제를 합하였다: 5X RT 완충액 4 ㎕, dNTP 믹스 1 ㎕, DEPC 처리된 물 (암비온) 4 ㎕, 및 역전사효소 (200 유니트/ml) 1 ㎕. RNA 및 프라이머 혼합물 10 ㎕를 역전사효소 용액 10 ㎕와 합하여 반응 혼합물 20 ㎕를 제조하였다. 반응 혼합물을 42℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이 반응의 생성물은 PCR용 cDNA이었다.
프라이머 2세트를 PCR에 사용하였다. 대조 프라이머 세트는 β-액틴 (Hs. 288061) 코딩 가닥 프라이머: 5'-AGT CGG TTG GAG CGA GCA TC-3' (서열 19)] 및 β-액틴 (Hs. 288061) 비-코딩 가닥 프라이머 5'-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3' (서열 20)를 포함하였다. VEGF 프라이머 세트 (Hs. 334842)는 VEGF 코딩 가닥 5'-GCC ACC ACA CCA TCA CCA TC-3' (서열 22) 및 VEGF 비-코딩 가닥 프라이머 5'-CCC AAA GCA CAG CAA TGT CC-3' (서열 23)을 포함하였다. β-액틴 RNA가 대부분의 세포 유형에 상당한 양으로 존재하기 때문에 β-액틴 프라이머 세트를 보편적인 대조군으로서 사용하였다. 사용되는 분석에서 β-액틴 RNA는 약 300 bp의 RT-PCR 밴드를 발생시키는 반면, VEGF RNA는 약 760 bp의 RT-PCR 밴드를 발생시켰다.
하기 성분을 각각의 PCR 반응을 위해 합하였다: cDNA 2 ㎕, PCR 등급수 38 ㎕, 10 X 어드밴티지 (Advantage (등록상표)) 2 PCR 완충액 (클론테크 (Clonetech)) 5 ㎕, 50 X 어드밴티지 (등록상표) 2 dNTP 믹스 (클론테크) 1 ㎕, β-액틴 프라이머 (1 X) 1 ㎕, VEGF 프라이머 (1 X) 2 ㎕, 어드밴티지 (등록상표) 중합효소 믹스 (클론테크) 1 ㎕. 이 PCR 반응 혼합물을 함유한 튜브를 와동시키고, 스핀 다운시키고, 이어서 써모사이클러 내에 배치하였다. 써모사이클러를 고온 개시 (95℃, 5분), 이어서 95℃ (30초), 65℃ (1분), 68℃ (3분)의 일련의 다양한 주기 (15-25), 및 10분 동안 68℃에서의 최종 마무리 단계로 프로그래밍하였다. PCR 반응이 완료되었을 때, 시각화를 위해 반응 믹스 10 ㎕를 2％ 아가로스 겔 상에서 주행시켰다. 밴드의 세기는 VEGF 유전자 및 β-액틴의 발현 수준에 정비례하였다.
VEGF 발현의 관찰된 변화를 추가로 확인하기 위해 퀀티킨 (Quantikine (등록상표)) 인간 VEGF 면역분석 (미네소타주 소재의 R&D 시스템즈 (Systems))을 이용하여 19-mer (서열 11)로 처리한 cFBM 중에 성장시킨 섬유모세포 배지를 시험하고, 밤새 인큐베이션하였다. 분비된 VEGF의 탐지가능한 수준이 세포 배양 상등액에 존재하는 경우 이 면역분석은 색 변화를 생성한다. 이 면역분석을 사용하며 양성 키트 대조군을 정확하게 작동시켰고, 색 변화를 제공하였다. 그러나, CoCl2 양성 대조군으로부터 상등액 샘플, 음성 대조군 및 19-mer (서열 11) 처리 세포는 어떠한 탐지가능한 VEGF 활성을 나타내지 않았다. 이는 배지 중의 VEGF 농도가 낮은 것과 연관된다고 여겨서 상등액을 다음에 센트리콘 (Centricon (등록상표)) 필터 장치 (미콘 (Micon)) 상에서 농축하고, 쿠안티킨 (등록상표) 분석을 더 농축된 상등액으로 다시 수행하였다. 분석은 다시 동일한 음성 결과를 나타냈다.
결과
섬유모 (NHDF) 세포는 상처 치유의 증식기 동안 통상적으로 관찰되기 때문에 본 실시예에서 사용하는 것이 이상적이었다. 처리하지 않은 섬유모세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 모든 세포를 인큐베이터 중에서 동일한 조건 (37℃/5％ CO2) 하에 보관하였다. 처리된 샘플의 경우, cFBM 5 mL와 함께 배지를 이동시키는 동안에 19-mer (서열 11) 펩티드 200 ㎕를 T25 플라스크에 첨가하였다. 이것을 샘플 채취 전에 밤새 인큐베이션하였다. 이들 실험에 대해 양성 대조군으로서 작용시키 위해, NHDF 세포를 100 μM 염화코발트 (CoCl2) 5 ㎕로 4시간 동안 처리하였다. 염화코발트는 VEGF의 발현을 유도하거나 또는 상향조절하는 것으로 공지되어 있지만 시간에 따라 세포에 독성이었다.
19-mer (서열 11) 펩티드로 처리하는 경우 표준 조건 하에 cFBM 중에서 성장시킨 섬유모세포는 RT-PCR에 의해 나타나는 바와 같이 VEGF 발현 수준을 유의하게 저하시켰다. 이들 수준은 실질적으로 음성 대조군에서조차 관찰되는 VEGF 발현 수준 미만이었다. VEGF 밴드는 거의 19-mer (서열 11) 펩티드-처리 세포의 PCR RT-생성물을 함유한 2％ 아가로스 겔 사진에서 거의 보이지 않았다 (도 18). 대조적으로, 음성 대조군은 희미하지만 용이하게 식별가능한 밴드를 나타냈다 (도 18). 염화코발트를 사용한 것은 RT-PCR에 의해 관찰하였을 때 음성 대조군에 비해 VEGF 발현에서 예상된 상향조절을 제공하였다.
또한, 도 19 및 20은 19-mer (서열 11) 펩티드가 10 mg/ml 19-mer (서열 11) 200 ㎕를 사용한 섬유모세포 중에서 모든 VEGF 발현을 실질적으로 억제한다는 것을 나타낸다.
19-mer (서열 11) 대 음성 대조군의 발현 수준을 비교하고 계산하기 위해, 이미지퀀트 (ImageQuant) (몰레큘러 다이나믹스 (Molecular Dynamics), 아머샴 파마시아 (Amersham Pharmacia))라는 프로그램을 사용하여 밴드의 발현 수준을 정량하였다. 이 프로그램을 사용하여 중요한 밴드 주위에 박스를 그리고, 전체 배경을 빼고, 이어서 음성 대조군과 비교하였다. 음성 대조군, CoCl2 및 19-mer (서열 11)에 대해 계산하였다. 이들 3종의 샘플에 대한 발현 수준을 하기 표 5에 열거하였다.
정량화된 발현 수준
음성 대조군 CoCl2 19-mer
β-액틴 61358 69519 83909
VEGF 42923 119094 1
교정된 VEGF 42923 105113 0.7312
비율 1 1.3546 1.703 x 10-5
표 5에 나타낸 바와 같이, CoCl2는 VEGF의 발현을 상향조절하는 반면 19-mer (서열 11)의 발현 수준은 심지어 음성 대조군의 것 미만으로 극적으로 하향조절되었다. 샘플 채취용인 신규한 전체 RNA를 획득하기 위해 상이한 T25 플라스크로부터 상이한 날에 cFBM 중에 성장시킨 NHDF 세포를 사용하여 이 실험을 수회 반복하였다. 그 결과들은 매우 반복적이었고, 처리하지 않은 음성 대조군과 처리한 세포를 비교하는 경우 항상 19-mer (서열 11) 처리한 섬유모세포에서 VEGF의 하향조절이 나타났다.
실시예 2에 나타낸 바와 같이, 19-mer (서열 11) 펩티드의 사용은 시험된 당뇨병 마우스 모델에서 완전한 상처 폐쇄 시간을 매우 가속시켰다. 혈관형성이 상처 치유, 배아 발생 및 종양 형성 동안 성숙한 동물에서 정상적으로 발생되지 않았다. 놀랍게도, 이러한 19-mer (서열 11) 펩티드는 혈관형성 특성을 나타내지 않는 대신에 VEGF 발현을 감소시키는 것으로 공지된 음성 대조 화합물을 사용하는 것에 비해 VEGF의 수준을 유의하게 저하시켰다.
종양 및 다른 혈관신생 질환의 조절에서 혈관형성을 억제하기 위해 항-혈관형성 펩티드 및 분자를 최근 사용하고 있다. 2종의 효능있는 단백질인 엔도스타틴 (Endostatin (등록상표)) 및 안지오스타틴 (Angiostatin (등록상표))을 종양 성장 조절에 사용하였다 (Kim, Y. et al. EndostatinTM blocks VEGF-mediated signaling via direct interaction with KDR/FlK-1. J Biol Chem 2002; May 23). 또한, 19-mer (서열 11) 펩티드는 VEGF 혈관형성 유전자의 발현을 하향조절하기 때문에 혈관 형성을 저하시킬 수 있다.
참고문헌:
하기 참고문헌 및 본원에 언급된 임의의 다른 참고문헌은 참고로 본원에 인용되어 있다.
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Figure 112009026809884-pat00032
Figure 112009026809884-pat00033
Figure 112009026809884-pat00034
도 1은 선택적 MMP 전구효소의 절단 스패닝 영역의 CLUSTAL X (버젼 1.8) 다중 서열 정렬을 제공한다. 도 1a는 보존된 잔기를 강조하는 정렬을 제공하고, 여기서 '*'는 서열 사이의 완전 동일성을 나타내고, ':'은 7/9 보존된 위치를 나타내고, '.'은 대부분 보존된 치환부와 80％ 이상 동일한 위치를 나타낸다. 도 1b는 볼드체의 이종성의 위치를 나타낸다.
도 2는 프로-MMP-1 (단백질 데이터뱅크 파일 1FBL.ENT)의 구조를 제공한다. 표 1에 제시된 서열 2-10의 부분은 2개의 대형 도메인 사이의 짧은 영역에 걸쳐 있다. 활성화 동안 이 영역은 절단된다.
도 3은 MMP-9의 3차원 모델을 제공한다. 활성 프로테이나제의 N-말단부를 생성하는 절단 영역은 크로스-해칭으로 제시되어 있다. 2개의 아연 이온은 구체로서 도시되어 있다. 절단 도메인 펩티드는 전구효소 내의 그의 정상 위치의 근처에서 MMP에 결합할 수 있다. (또한 촉매성 아연 근처에서) 이러한 결합은 활성 부위의 일부를 입체적으로 차단한다. 이러한 차단은 기질 결합을 억제한다.
도 4는 19-mer (서열 11) 절단 도메인 펩티드에 의한 MMP-9 활성의 억제를 도시한다. FRET 분석 전에 MMP-9를 19-mer (서열 11) 펩티드와 혼합하였다. 19-mer (서열 11) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 원형), 0.01 mM (개방 원형), 0.03 mM (폐쇄 사각형), 0.06 mM (개방 사각형), 0.125 mM (폐쇄 삼각형), 0.25 mM (개방 삼각형), 0.5 mM (×), 1 mM (폐쇄 역삼각형), 2 mM (개방 역삼각 형).
도 5는 10-mer (서열 13) 절단 도메인 펩티드에 의한 MMP-9 활성의 억제를 도시한다. FRET 분석 전에 MMP-9를 10-mer (서열 13) 펩티드와 혼합하였다. 10-mer (서열 13) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 삼각형), 0.25 mM (개방 삼각형), 0.5 mM (개방 역삼각형), 1.0 mM (폐쇄 역삼각형), 2.0 mM (×).
도 6은 9-mer (서열 12) 절단 도메인 펩티드에 의한 MMP-9 활성의 억제를 도시한다. FRET 분석 전에 MMP-9를 9-mer (서열 12) 펩티드와 혼합하였다. 9-mer (서열 12) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 삼각형), 0.25 mM (개방 삼각형), 0.5 mM (개방 역삼각형), 1.0 mM (폐쇄 역삼각형), 2.0 mM (×).
도 7은 19-mer (서열 11) 절단 도메인 펩티드에 의한 MMP-9 활성의 억제를 도시한다. 형광 콜라겐 분석 전에 MMP-9를 19-mer (서열 11) 펩티드와 혼합하였다. 19-mer (서열 11) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 원형), 0.06 mM (개방 다이아몬드형), 0.1 mM (개방 사각형), 0.25 mM (개방 원형), 0.5 mM (×).
도 8은 19-mer (서열 11) 절단 도메인 펩티드에 의한 MMP-9 활성의 보다 긴 시간 경과 억제를 도시한다. 형광 콜라겐 분석 전에 MMP-9를 19-mer (서열 11) 펩티드와 혼합하였다. 19-mer (서열 11) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 원형), 0.06 mM (개방 다이아몬드형), 0.1 mM (개방 사각형), 0.25 mM (개방 원형), 0.5 mM (×).
도 9는 10-mer (서열 13) 절단 도메인 펩티드에 의한 MMP-9 활성의 보다 긴 시간 경과 억제를 도시한다. 형광 콜라겐 분석 전에 MMP-9를 10-mer (서열 13) 펩티드와 혼합하였다. 10-mer (서열 13) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (개방 원형), 0.1 mM (개방 다이아몬드형), 0.2 mM (개방 사각형), 0.4 mM (×).
도 10은 9-mer (서열 12) 절단 도메인 펩티드에 의한 MMP-9 활성의 보다 긴 시간 경과 억제를 도시한다. 형광 콜라겐 분석 전에 MMP-9를 9-mer (서열 12) 펩티드와 혼합하였다. 9-mer (서열 12) 펩티드의 농도는 다음과 같았다: 0 mM (폐쇄 원형), 0.06 mM (개방 다이아몬드형), 0.1 mM (개방 사각형), 0.25 mM (개방 원형), 0.5 mM (×).
도 11은 전형적인 스플라이싱 반응의 HPLC 용출 프로파일을 제공한다. 화살표는 제1 피크 (프로-MMP-9 피크)의 면적은 반응의 진행에 따라 감소하는 반면, 제2의 2개의 피크 (각각 성숙 MMP-9 및 N-말단 절단 산물)의 면적은 증가하는 것을 나타낸다.
도 12은 스트로밀리신에 의한 프로-MMP-9의 N-말단 및 C-말단 도메인으로의 전환을 도시한다. 프로-MMP-9는 제로 (폐쇄 원형), 0.5 μM (개방 사각형) 또는 1.0 μM (폐쇄 사각형) 19-mer (서열 11) 펩티드의 존재하에 스트로밀리신과 반응시켰다. 제시된 시간에서, 분액을 제거하고, HPLC에 적용시켰다. 프로-MMP 피크 면적을 적분하여 영점 시간 샘플에 대해 100 퍼센트가 되도록 하였다. 개방 원형은 스트로밀리신 또는 19-mer (서열 11) 펩티드의 부재하에 완충액 중에서 인큐베이션된 프로-MMP를 제시한다.
도 13a는 19-mer (서열 11) 억제제 펩티드와 MMP-9와의 상호작용의 등온 적 정 열량측정 분석을 제공한다. 각각의 피크는 주입 및 후속적인 결합 반응에 의해 생성된 열을 도시한다. 도 13b는 시간에 대한 도 13a로부터의 각각의 주입 피크의 값을 적분하여 생성된 결합 등온선을 제공한다.
도 14는 19-mer (서열 11) 억제제 펩티드와 MMP-2와의 상호작용의 등온 적정 열량측정 분석을 제공한다. 도 14a는 25℃의 20 mM 카코딜레이트 (pH 6.8), 10 mM NaCl 중에서 19-mer (서열 11) (1 mM)의 MMP-2 (20 μM)로의 적정에 대한 미처리 등온 열량측정 데이터를 제공한다. 각각의 피크는 주입 및 후속적인 결합 반응에 의해 생성된 열을 도시한다. 도 14b는 시간에 대한 도 14a로부터의 각각의 주입 피크의 값을 적분하여 생성된 결합 등온선을 제공한다.
도 15는 19-mer (서열 11) 펩티드가 고정화 MMP-9의 표면을 거쳐 유출되는 경우에 생성된 표면 플라즈몬 공명 결합 등온선을 제공한다.
도 16은 2가지 농도의 펩티드로의 처리 후 피부 모델에서 양성 대조군과 비교하여 생존 세포의 백분율을 제시하는 막대 그래프를 제공한다. 인산염 완충 식염수 (PBS)로 처리된 제1 샘플을 100％ 생존율을 나타내는 세포 계수를 확립하기 위해 사용되는 양성 대조군이다. 제2 샘플은 세포가 1％ Triton-X100에 노출된 경우의 음성 대조군이며, 이는 당해 분석법이 세포 괴사를 검출할 수 있음을 제시한다. 다음 3가지 샘플은 500 μM의 농도로 사용된 19-mer (서열 11), 10-mer (서열 13) 및 9-mer (서열 12) 펩티드이다. 마지막 3가지 샘플은 2 mM의 농도로 사용된 19-mer (서열 11), 10-mer (서열 13) 및 9-mer (서열 12) 펩티드이다.
도 17은 db/db 당뇨병 마우스에서의 경시적 상처 치유를 그래프로 도시한다. 플롯은 표준 식염수 (개방 원형) 또는 20 ㎍/mL 19-mer 펩티드 (서열 11) (폐쇄 원형)로 처리된 마우스에 대한 상대적 평균 상처 면적 대 손상후 일수를 도시한다. 제시된 데이터는 10마리의 대상체 동물로부터 유래된 평균 상대적 상처 직경을 나타낸다.
도 18은 19-mer (서열 11) 펩티드가 비처리된 세포와 비교하여 VEGF 발현을 상당히 억제하거나 저하시키는 것을 도시한다. 당해 도면은 19-mer (서열 11) 펩티드 및 VEGF 발현을 자극하거나 억제하는 것으로 공지된 제제로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 함유하는 2％ 아가로스 겔의 사진을 제공한다. 레인 1은 DNA 마커를 제공한다. 레인 2는 비처리된 섬유모세포 (음성 대조군)의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 3은 VEGF 발현을 자극하는 것으로 공지되어 양성 대조군으로서 사용된 500 μM 염화코발트 (CoCl2) 5㎕로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 4는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 발현을 증가시키는 것으로 제시된 저산소증-유도가능한 인자-1 알파의 산소-의존성 분해 도메인 (ODD)으로부터 유래된 펩티드로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 5는 저산소증-유도가능한 인자-1 알파의 산소-의존성 분해 도메인 (ODD)으로부터 유래된 펩티드를 섬유모세포 내로 수송하기 위한 TAP Express (등록상표, Gene Therapy Systems, CA) 시스템으로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 6은 10 mg/ml 19-mer (서열 11) 200㎕로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 제공한다. 도시된 바와 같이, 음성 대조군 (비처리 섬유모세포)은 약하지만 용이하게 식별가능한 VEGF 밴드를 생성하였다. 염화코발트의 사용은 음성 대조군과 비교하여 증가된 VEGF 발현을 제공하였다. 그러나, 경이로운 결과는 19-mer (서열 11) 펩티드로 처리된 섬유모세포에서의 VEGF 발현의 완전한 억제였다.
도 19는 19-mer (서열 11) 펩티드가 비처리된 세포와 비교하여 VEGF 발현을 상당히 억제하거나 저하시킨다는 것을 추가로 도시한다. 당해 도면은 19-mer (서열 11) 펩티드 및 VEGF 발현을 자극하거나 억제하는 것으로 공지된 제제로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 함유하는 2％ 아가로스 겔의 사진을 제공한다. 레인 1은 DNA 마커를 제공한다. 레인 2 및 3은 비처리된 섬유모세포 (음성 대조군) 상에서의 이중 실험으로부터의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 4 및 5는 VEGF 발현을 자극하는 것으로 공지되어 양성 대조군으로서 사용된 100 μM 염화코발트 (CoCl2) 5㎕로 처리된 섬유모세포 상에서의 이중 실험으로부터의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 6 및 7은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 발현을 증가시키는 것으로 제시된 저산소증-유도가능한 인자-1 알파의 산소-의존성 분해 도메인 (ODD)으로부터 유래된 펩티드로 처리된 섬유모세포 상에서의 이중 실험으로부터의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 8 및 9는 10 mg/ml 19-mer (서열 11) 200㎕로 처리된 섬유모세포 상에서의 이중 실험으로부터의 PCR RT-산물을 제공한다. 도시된 바와 같이, 19-mer (서열 11) 펩티드는 또한 섬유모세포에서의 VEGF 발현을 완전히 억제하였다.
도 20은 19-mer (서열 11) 펩티드가 비처리된 세포와 비교하여 VEGF 발현을 상당히 억제하거나 저하시키는 것을 도시한다. 당해 도면은 19-mer (서열 11) 펩 티드 및 VEGF 발현을 자극하거나 억제하는 것으로 공지된 제제로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 함유하는 2％ 아가로스 겔의 사진을 제공한다. 레인 1은 DNA 마커를 제공한다. 레인 2는 VEGF 발현을 자극하는 것으로 공지되어 VEGF, β-액틴 및 GAPDH에 대한 프라이머로 이루어진 프라이머 믹스와 함께 양성 대조군으로서 사용된 100 μM 염화코발트 (CoCl2) 5㎕로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 3은 비처리된 섬유모세포 (음성 대조군)로부터의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 4는 VEGF 발현을 자극하는 것으로 공지되어 양성 대조군으로서 사용된 100 μM 염화코발트 (CoCl2) 5㎕로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 5는 저산소증-유도가능한 인자-1 알파의 산소-의존성 분해 도메인 (ODD)으로부터 유래된 펩티드를 섬유모세포 내로 수송하기 위한 TAP Express (등록상표, Gene Therapy Systems, CA) 시스템으로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 6은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 발현을 증가시키는 것으로 제시된 저산소증-유도가능한 인자-1 알파의 산소-의존성 분해 도메인 (ODD)으로부터 유래된 펩티드로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 7은 저산소증-유도가능한 인자-1 알파의 산소-의존성 분해 도메인 (ODD)으로부터 유래된 단백질을 섬유모세포 내로 수송하기 위한 시스템인 BioPorter (등록상표) Protein Delivery (BP) Reagent (Gene Therapy Systems, CA)로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 제공한다. 레인 8은 10 mg/ml 19-mer (서열 11) 200㎕로 처리된 섬유모세포의 PCR RT-산물을 제공한다. 도시된 바와 같이, 19-mer (서열 11) 펩티드는 또한 섬유모 세포에서의 VEGF 발현의 완전한 억제를 제공하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Quirk, Stephen Weart, Ilona f. <120> Anti-Cancer and Wound Healing Compounds <130> 17950 <150> US 10/032,376 <151> 2001-12-21 <150> US 60/312,726 <151> 2001-08-16 <160> 23 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val 1 5 <210> 2 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Gln Thr Gly Asp Leu Asp Gln Asn 1 5 10 15 Thr Ile Glu Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Val Ala 20 25 30 Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Asp 35 40 <210> 3 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Asp Asn 1 5 10 15 Thr Leu Asp Val Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly 20 25 30 Glu Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Lys Met Asn Leu 35 40 45 Thr Tyr 50 <210> 4 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gln Lys Phe Phe Gly Leu Pro Glu Thr Gly Lys Leu Ser Pro Arg 1 5 10 15 Val Met 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Glu Thr Val Asp Asp Ala Phe 130 135 140 Ala Arg Ala Phe Gln Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Arg Phe Ser 145 150 155 160 Arg Ile His Asp Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Asn Phe Gly Arg Trp 165 170 175 Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala 180 185 190 His Ala Phe Ala Pro Gly Thr Gly Val Gly Gly Asp Ser His Phe Asp 195 200 205 Asp Asp Glu Leu Trp Thr Leu Gly Glu Gly Gln Val Val Arg Val Lys 210 215 220 Tyr Gly Asn Ala Asp Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Leu Phe Asn 225 230 235 240 Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys Thr Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly Phe 245 250 255 Leu Trp Cys Ser Thr Thr Tyr Asn Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr Gly 260 265 270 Phe Cys Pro His Glu Ala Leu Phe Thr Met Gly Gly Asn Ala Glu Gly 275 280 285 Gln Pro Cys Lys Phe Pro Phe Arg Phe Gln Gly Thr Ser Tyr Asp Ser 290 295 300 Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr 305 310 315 320 Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala 325 330 335 Met Ser Thr Val Gly Gly Asn Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe Pro 340 345 350 Phe Thr Phe Leu Gly Asn Lys Tyr Glu Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg 355 360 365 Ser Asp Gly Lys Met Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Asp Asp 370 375 380 Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val 385 390 395 400 Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Met Gly Leu Glu His Ser Gln Asp 405 410 415 Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg 420 425 430 Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Glu Leu Tyr Gly Ala Ser 435 440 445 Pro Asp Ile Asp Leu Gly Thr Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Val 450 455 460 Thr Pro Glu Ile Cys Lys Gln Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gln 465 470 475 480 Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr 485 490 495 Val Thr Pro Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe 500 505 510 Trp Pro Glu Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln 515 520 525 Glu Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser 530 535 540 Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys 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Gly Asp Leu Lys Trp 35 40 <210> 17 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu 1 5 10 15 Thr Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala 20 25 30 Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp 35 40 <210> 18 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide capable of inhibiting the activity of a metalloproteinase <221> SITE <222> 2 <223> Xaa = glutamine or glutamic acid <221> SITE <222> 5 <223> Xaa = aspartic acid or glutamic acid <221> SITE <222> 8 <223> Xaa = glutamine or serine <221> SITE <222> 9 <223> Xaa = asparagine or alanine <221> SITE <222> 11 <223> Xaa = isoleucine or leucine <221> SITE <222> (12)...(12) <223> Xaa = glutamic acid or lysine <221> SITE <222> (13)...(13) <223> Xaa = threonine or alanine <221> SITE <222> (16)...(16) <223> Xaa = lysine or threonine <221> SITE <222> (21)...(21) <223> Xaa = valine or asparagine <221> SITE <222> (24)...(24) <223> Xaa = valine or leucine 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inhibiting the activity of a metalloproteinase <221> SITE <222> 2 <223> Xaa = glutamine or glutamic acid <221> SITE <222> 5 <223> Xaa = aspartic acid or glutamic acid <221> SITE <222> 8 <223> Xaa = glutamic acid or serine <221> SITE <222> 9 <223> Xaa = asparagine or alanine <221> SITE <222> 11 <223> Xaa = isoleucine or leucine <221> SITE <222> (12)...(12) <223> Xaa = glutamic acid or lysine <221> SITE <222> (13)...(13) <223> Xaa = threonine or alanine <221> SITE <222> (16)...(16) <223> Xaa = lysine or threonine <221> SITE <222> (17)...(17) <223> Xaa = any apolar amino acid <221> SITE <222> (18)...(18) <223> Xaa = any basic amino acid <221> SITE <222> (19)...(19) <223> Xaa = any cysteine-like amino acid <221> SITE <222> (20)...(20) <223> Xaa = any apolar amino acid <221> SITE <222> (21)...(21) <223> Xaa = any polor or aliphatic amino acid <221> SITE <222> (22)...(22) <223> Xaa = any apolar amino acid <221> SITE <222> (23)...(23) <223> Xaa = any acidic amino acid <221> SITE <222> 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Leu Asp Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Met Arg Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa 35 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gccaccacac catcaccatc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 cccaaagcac agcaatgtcc 20

Claims (9)

  1. 혈관 내피 성장 인자에 대한 유전자를 포함하는 세포를
    서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 및 서열 13으로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 가지며 혈관 내피 성장 인자의 발현을 억제할 수 있는 유효량의 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 유효량의 혈관 내피 성장 인자 발현 억제용 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는,
    혈관 내피 성장 인자의 발현을 감소시키는 시험관내 방법.
  2. 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 및 서열 13으로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 가지며 혈관 내피 성장 인자에 대한 유전자를 포함하는 세포에서 혈관 내피 성장 인자의 발현을 감소시킬 수 있는 유효량의 펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 포유동물의 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장 또는 눈의 신생혈관성 질환 치료용 조성물.
  3. 삭제
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