CN116157146A - 治疗外科手术后疼痛的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗患者的外科手术后疼痛的梭菌神经毒素，所述方法包括在外科手术前多于5天给患者施用梭菌神经毒素，并且其中通过下列方式施用梭菌神经毒素：i)皮内；或ii)鞘内。还提供了相应的治疗方法和梭菌神经毒素的施用剂量。

Description

治疗外科手术后疼痛的方法

发明领域

本发明涉及由外科手术引起的外科手术疼痛(例如外科手术后疼痛)和/或外科手术诱导的焦虑(例如外科手术后焦虑)的治疗。更详细地，本发明提供了治疗方法，该方法包括施用梭菌神经毒素，并且更特别地，涉及使用肉毒梭菌神经毒素治疗外科手术后疼痛和焦虑的方法。

背景

外科手术后疼痛是由外科手术操作引起的不愉快的感觉。外科手术后疼痛可以由外科手术介入、外科手术操作本身、伤口闭合和在外科手术操作期间施加的任何力对组织的损伤引起。外科手术后的外科手术疼痛(例如外科手术后疼痛)也可以源于伴随外科手术的因素。例如，患者可能由于患者定位在外科手术台上的方式而遭受背部疼痛，或者胸部疼痛可能是由于胸部区域中的外科手术介入。全身麻醉后也可能发生咽喉疼痛，因为呼吸管的插入可能引起刺激。然而，最常见的是由外科手术介入切入皮肤和肌肉引起的外科手术后疼痛。

例如，外科手术介入(或更特别地，外科手术切口)可以表示引起疼痛的“有害刺激”。有害刺激(可以引起组织损伤的刺激)可以激活神经递质从伤害性传入末端的释放和神经肽例如物质P和降钙素基因相关肽(CGRP)从感觉末端的释放。然后，有害信息从外周神经系统转导到中枢神经系统，在中枢神经系统中个体感知到疼痛。

外科手术后疼痛可以由外科手术介入部位的炎症和神经组织损伤的组合引起。任何炎症和/或神经组织损伤都是外科手术后疼痛的补充。例如，活化的肥大细胞响应于组织损伤的脱粒可以导致多种物质的释放，包括蛋白酶、细胞因子和5-羟色胺。这些物质可以使初级传入神经元敏化(在较低阈值下激活)以产生疼痛超敏反应。由于组织受到广泛的神经支配，身体的任何区域都易受外科手术引起的神经损伤。

外科手术后焦虑可能需要患者经历身体症状和行为变化，包括但不限于疲劳、集中和睡眠困难以及肌肉紧张。此外，患者可能经历焦虑的情绪症状，包括不安、易怒、难以控制恐惧或担忧、恐惧和恐慌。外科手术后焦虑可能由麻醉、外科手术本身、外科手术后疼痛和/或来自医院环境的压力的影响引起。例如，外科手术患者在外科手术前(例如由于预期外科手术而产生的压力)和外科手术后通常都处于相当高水平的精神、身体和情绪压力下，这种压力表现为焦虑症状。

用于治疗外科手术(例如外科手术后)疼痛的现有方法通常靶向神经递质和肽，并且包括非类固醇抗炎药(NSAIDS)、阿片样物质、局部麻醉阻断剂或其组合使用。然而，这些治疗方法产生多种副作用，并且值得注意的是，通常诱导依赖性(例如成瘾)。另外，这些治疗方法仅提供急性外科手术后疼痛缓解，例如在施用后仅短时间内提供外科手术疼痛缓解，因此需要连续/重复施用(加剧患者对镇痛剂的依赖性/成瘾的问题)。在没有有效地管理急性外科手术后疼痛的情况下，这可能增加患者发展慢性外科手术后疼痛的机会。此类疼痛管理方法(需要连续施用药物)也经常导致耐药性。与用于管理外科手术后疼痛的先前方法相关的其它问题包括需要高剂量的镇痛药施用以提供镇痛效果，其中不良副作用通常随着剂量而增加。

因此，目前治疗外科手术疼痛的方法不适用于(例如，足以)管理/减轻外科手术后疼痛，特别是中度至重度外科手术后疼痛，并且它们也不能提供对患者经历的外科手术后焦虑的适当管理(后者通常需要替代/额外的药物)。因此，越来越需要用于治疗外科手术后疼痛和/或外科手术后焦虑的替代/改善方法。

本发明通过提供用于例如甚至在单次(例如紧急)施用之后长期治疗外科手术后疼痛/焦虑(包括降低慢性外科手术后疼痛的倾向)的方法来解决这些问题中的一个或多个。本发明的优选方面基于以下令人惊讶的观察结果：在使患者经受外科手术之前开始治疗(施用)允许在患者从外科手术中出现时有效的外科手术后疼痛或外科手术后焦虑管理(有利地减轻否则将被感知为一般/局部麻醉剂的作用减轻的外科手术后疼痛或外科手术后焦虑)，并且提供了特别适合于基于梭菌神经毒素的治疗的特别外科手术前施用时间点。

发明概述

更详细地，本发明基于如下令人惊讶的发现：在外科手术前多于5天通过皮内或鞘内施用外科手术前梭菌神经毒素(例如肉毒梭菌神经毒素)治疗外科手术后疼痛并且减轻或抑制外科手术后焦虑。这是完全预料不到的，因为现有技术方法报道了当更接近外科手术时间施用梭菌神经毒素并且通过替代施用途径时的最佳镇痛活性。

有利地，本发明人已经证明，通过皮内或鞘内施用在外科手术前多于5天施用梭菌神经毒素，梭菌神经毒素在早在外科手术后1小时的时间点有效治疗外科手术后疼痛，并且在外科手术后持续管理/治疗外科手术后疼痛数天(甚至数周)，而不需要连续施用并且没有与传统镇痛/麻醉药物相关的副作用。因此，当任何“全身”或“局部”麻醉剂(在外科手术期间使用)的作用消失时，梭菌神经毒素可以提供外科手术后疼痛缓解。换言之，外科手术前(>5天外科手术前)施用有利地允许梭菌神经毒素的镇痛作用在患者在外科手术期间使用的主要麻醉剂/镇痛剂的作用逐渐减少时将以其它方式开始感知外科手术后疼痛或外科手术后焦虑的时间点出现(例如达到最大功效/作用)。因此，外科手术后疼痛可以在其出现之前进行治疗，从而防止患者中任何相关的(潜在显著的)不适和痛苦。如下面更详细描述的，外科手术后疼痛(例如急性中度至重度外科手术后疼痛)的此类早期管理可以有利地减轻慢性外科手术后疼痛的发作。

这与当更接近外科手术时间(或围外科手术期)施用梭菌神经毒素时观察到的治疗形成对比，后者在外科手术后观察到明显的滞后期或“激活期”，直到提供梭菌神经毒素的任何外科手术疼痛治疗效果。

本发明人的另一个令人惊讶的观察结果在于，梭菌神经毒素是特别有效的(例如快速的)外科手术后疼痛/外科手术后焦虑治疗，其中通过皮内施用梭菌神经毒素。实际上，本发明人观察到，当与替代施用途径例如皮下施用和肌内施用相比时，皮内施用可以提供增加的外科手术后疼痛和/或外科手术后焦虑缓解。这是完全预料不到的，因为梭菌神经毒素在其它适应证中通过此类替代施用途径(例如皮下/肌内施用)常规施用，而在功效方面没有任何明显的缺点。

本发明人的另一个有利发现在于梭菌神经毒素能够在施用部位远侧的部位发挥作用。例如，在外科手术介入部位处或附近施用梭菌神经毒素后，本发明人观察到脊髓处的SNARE蛋白裂解(例如SNAP-25蛋白裂解)(并且在外科手术介入部位处或附近的SNARE蛋白裂解最小或没有SNARE蛋白裂解)，这表明梭菌神经毒素通过逆行转运从其施用部位行进至脊髓。这允许梭菌神经毒素在远离可能引起患者不适的损伤部位(例如外科手术介入部位)的部位施用，从而使患者感觉到的任何进一步的疼痛最小化。

详细描述

在一个方面，本发明提供了用于治疗患者的外科手术后疼痛的梭菌神经毒素，所述方法包括在外科手术前多于5天给患者施用梭菌神经毒素，并且其中通过下列方式施用梭菌神经毒素：

i)皮内；或

ii)鞘内。

换言之，本发明的一个方面提供了用于治疗患者的外科手术后疼痛的方法，所述方法包括在外科手术前多于5天给患者施用梭菌神经毒素，并且其中通过下列方式施用梭菌神经毒素：

i)皮内；或

ii)鞘内。

在一个方面，本发明提供了用于治疗外科手术后疼痛的梭菌神经毒素，所述方法包括在外科手术前多于5天给患者施用(例如通过皮内)梭菌神经毒素。换言之，本发明的一个方面提供了治疗外科手术后疼痛的方法，所述方法包括在外科手术前多于5天给患者施用(例如通过皮内)梭菌神经毒素。

在相关观察中，已经发现梭菌神经毒素的预施用(外科手术前)减少或抑制/预防(例如完全预防)患者外科手术后的焦虑(外科手术后焦虑)的发作。因此，本发明提供的另一个令人惊讶的技术效果是由于外科手术前施用梭菌神经毒素而可实现的抗焦虑作用。

因此，本发明的另一个方面提供了用于减轻或抑制外科手术后焦虑的梭菌神经毒素，所述方法包括在外科手术前给患者施用梭菌神经毒素，其中通过下列方式施用梭菌神经毒素：

i)皮内；或

ii)鞘内。

换言之，本发明的一个方面提供了减轻或抑制外科手术后焦虑的方法，所述方法包括在外科手术前给患者施用梭菌神经毒素，其中通过下列方式施用梭菌神经毒素：

i)皮内；或

ii)鞘内。

优选地，用于减轻或抑制外科手术后焦虑的方法包括在外科手术前5天或更多天施用梭菌神经毒素；例如，梭菌神经毒素可以在外科手术前多于5天施用。

本发明的另一方面提供了用于减轻或抑制外科手术后焦虑的梭菌神经毒素，所述方法包括在外科手术前(例如外科手术前5天或更多天)给患者施用(例如通过皮内)梭菌神经毒素。换言之，本发明的一个方面提供了减轻或抑制外科手术后焦虑的方法，所述方法包括在外科手术前给患者施用(例如通过皮内)梭菌神经毒素。

优选地，用于减轻或抑制外科手术后焦虑的方法包括在外科手术前5天或更多天施用梭菌神经毒素；例如，梭菌神经毒素可以在外科手术前多于5天施用。

优选地，可以通过皮内施用梭菌神经毒素。

另外或可选择地，梭菌神经毒素可以通过鞘内施用(例如通过鞘内施用/注射)。

现在描述本发明的多种附加(任选)实施方案。应当注意，以下实施方案中的每一个可以应用于用于本文所述用途的任何方法或梭菌神经毒素。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素的施用不包括肌内施用。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素可以在外科手术前5-50天，例如在外科手术前6-50天，任选地在外科手术前5-40天施用。例如，梭菌神经毒素可以在外科手术前5-30天；优选外科手术前5-20天；更优选外科手术前5-15天施用。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素可以在外科手术前>5天施用(优选在本文所述的用于治疗外科手术后疼痛的方法中)，任选在单次施用步骤中。例如，梭菌神经毒素可以在外科手术前10-20天；在外科手术前14-16天施用(优选在本文所述的用于治疗外科手术后疼痛的方法中)，任选在单个施用步骤中。

梭菌神经毒素可以在外科手术前15天或更多天，优选在外科手术前约15天施用。

在优选的实施方案中，梭菌神经毒素可以在外科手术前>5天至≤15天施用(优选在本文所述的用于治疗外科手术后疼痛的方法中)，任选在单个施用步骤中。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素在外科手术前5天或更多天施用(优选在本文所述的用于治疗外科手术后疼痛的方法中)。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素在外科手术前12天或更多天施用(优选在本文所述的用于治疗外科手术后疼痛的方法中)。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素在外科手术前15天或更多天通过皮内施用。在优选的实施方案中，梭菌神经毒素在外科手术前约15天通过皮内施用。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素在外科手术前15天或更多天通过鞘内施用。在优选的实施方案中，梭菌神经毒素在外科手术前约15天通过鞘内施用。

梭菌神经毒素通过提供镇痛作用来治疗外科手术后疼痛。因此，如本文所用的术语“治疗”旨在包括镇痛治疗。术语“治疗”包括治疗外科手术后疼痛，使得患者不再感知到外科手术疼痛(或与未用梭菌神经毒素治疗的对照患者相比感知到更少的外科手术疼痛)。

类似地，梭菌神经毒素通过提供抗焦虑作用抑制外科手术后焦虑。因此，术语“抑制”包括通过施用梭菌神经毒素提供的抗焦虑作用抑制患者的外科手术后焦虑(例如其症状)。抑制可以与外科手术后疼痛治疗同时提供，并且例如作为外科手术后疼痛治疗的结果。因此，不受任何理论束缚，梭菌神经毒素可以通过梭菌神经毒素的镇痛作用提供抗焦虑作用。梭菌神经毒素可以抑制与用于外科手术的麻醉作用、外科手术本身、外科手术后疼痛和/或压力(例如来自医院环境)相关(或由其引起)的外科手术后焦虑的症状。

因此，梭菌神经毒素可以以治疗有效量或预防有效量(优选预防有效量)施用于个体。“治疗有效量”是当单独或组合施用于个体用于治疗外科手术后疼痛和/或外科手术后焦虑时，足以实现此类外科手术后疼痛和/或外科手术后焦虑的治疗的梭菌神经毒素的任何量。“预防有效量”是当单独或组合施用于个体时抑制或延迟外科手术后疼痛和/或外科手术后焦虑发作的梭菌神经毒素的任何量。在一些实施方案中，预防有效量完全预防外科手术后焦虑的发作。“抑制”发作意指降低外科手术后疼痛和/或外科手术后焦虑的可能性，或完全预防发作。优选地，治疗和/或预防有效量是不导致肌肉麻痹的量。术语“肌肉麻痹”优选是指长期肌肉麻痹，因为短暂的肌肉麻痹可能在施用后发生短时间。

术语“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指哺乳动物个体。在一个实施方案中，“个体”是人、伴侣动物(例如宠物，例如狗、猫和/或兔)、家畜(例如猪、绵羊、牛和/或山羊)和/或马。在优选的实施方案中，个体(患者)是人。

本发明特别涉及外科手术后疼痛，其不同于其它类型的疼痛，例如炎性疼痛和神经性疼痛。在这方面，炎性疼痛通常由感染、刺激物或过度活化的免疫应答引起，并且神经性疼痛通常由神经系统障碍/综合征引起。相反，本发明不涉及由这些刺激引起的疼痛。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素的施用优先于炎性疼痛治疗外科手术后疼痛。在一个实施方案中，梭菌神经毒素的施用治疗最小的炎性疼痛至不治疗炎性疼痛。在一个实施方案中，梭菌神经毒素的施用治疗外科手术后疼痛并且治疗最小的炎性疼痛至不治疗炎性疼痛。

提及“外科手术介入”意指涉及治疗个体的损伤或疾病的医疗程序，其包括使身体的一部分经受切口(任选移除或修复身体的受损部分)。尽管侵入性水平(例如所需外科手术切口的水平)可以在外科手术类型之间不同，但是旨在包括具有一旦外科手术完成就在个体中引起外科手术后疼痛和/或外科手术后焦虑的侵入性水平的外科手术。外科手术后疼痛通常由切开患者的皮肤和/或筋膜和/或肌肉和/或骨骼和/或器官的外科手术切口引起。因此，通常在外科手术介入部位处/或附近经历外科手术疼痛。

外科手术介入可以包括对皮肤和/或筋膜和/或肌肉的切口。优选地，外科手术介入包括对皮肤的切口。

外科手术介入不限于可以由医师进行的外科手术介入，而且还包括例如牙科外科手术介入。外科手术介入的非限制性实例包括阑尾切除术、乳腺活组织检查、隆乳手术或缩乳手术、整容、胆囊切除术、冠状动脉分流术、清创术(例如伤口、烧伤或感染的清创术)、皮肤移植、器官移植和扁桃体切除术。

优选地，“外科手术后”可以指在外科手术后(例如外科手术后)至多一天开始的时间期限。换言之，术语“外科手术后”可以指外科手术后不超过一天开始的时间期限。例如，术语“外科手术后”可以指外科手术后1-20小时；任选外科手术后2-15小时；任选外科手术后5-10小时开始的时间点。此类时间可以表示从时间顺序界面开始的时间期限，在该时间期限，来自施用于患者的外科手术麻醉剂的镇痛作用减小(例如，逐渐减小)，并且因此患者开始感知外科手术疼痛。

此外，术语“外科手术后(post-operative)”可以与术语“外科手术后(post-surgical)”互换使用，因为“外科手术(operative)”在本文中以“外科手术(surgery)”的意义使用。

类似地，术语“外科手术后疼痛”可以指在外科手术后(例如外科手术后)至多一天开始的时间期限内感知到(或更特别地，开始感知到)的外科手术疼痛。换言之，术语“外科手术后疼痛”可以指患者在外科手术后不超过一天开始的时间期限内感知到的外科手术疼痛。例如，术语“外科手术后疼痛”可以指在外科手术后1-20小时；任选在外科手术后2-15小时；任选在外科手术后5-10小时开始的时间期限内感知到的疼痛。

所述时间期限可以为外科手术后1-50周；例如5-45周、10-40周或10-35周。

这与术语“围外科手术期”形成对比，术语“围外科手术期”可以指例如在患者正在经历外科手术的时间(例如患者在外科手术室中的时间)处或附近的时间期限，适合地是在外科手术前至少1小时开始和/或在外科手术后小于1小时结束的时间期限。

本发明的外科手术后治疗可以与围外科手术期和/或外科手术后治疗策略组合以改善功效并且优选增加持续时间或外科手术后疼痛抑制(例如在处于发展外科手术疼痛的高风险的患者中)。

在一个实施方案中，本发明的方法可以包括在围外科手术期和/或外科手术后(优选外科手术后)给患者施用另外的镇痛剂。换言之，可以在外科手术期间(例如在外科手术前至少1小时开始和/或外科手术后小于1小时结束的时间段期间)施用另外的镇痛剂。在一个实施方案中，可以在外科手术后(例如在外科手术后10、20、40或50周)施用另外的镇痛剂。

外科手术后疼痛可以是由从伤害性传入末端释放神经递质和/或从感觉末端释放神经肽例如物质P和降钙素基因相关肽(CGRP)引起的疼痛，例如由有害的外科手术刺激(优选外科手术切口)诱导的疼痛。然后例如有害信息(由有害刺激引起)可以从外周神经系统转导到中枢神经系统，在中枢神经系统中患者感知到外科手术疼痛。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素通过抑制疼痛神经调节剂例如物质P和CGRP的胞吐作用来治疗外科手术疼痛。

外科手术后疼痛可以由外科手术介入部位的炎症或神经组织损伤或其组合引起。任何炎症和/或神经组织损伤都是外科手术后疼痛的补充。例如，活化的肥大细胞响应于组织损伤的脱粒可以导致多种物质的释放，包括蛋白酶、细胞因子和5-羟色胺。这些物质可以使初级传入神经元敏化(在较低阈值下激活)以产生疼痛超敏反应。由于组织受到广泛的神经支配，身体的任何区域可能易受外科手术引起的神经损伤的影响。

换言之，疼痛可以是伤害性疼痛，例如其中外科手术后疼痛由组织损伤引起，并且通过响应于有害刺激的伤害感受器(疼痛受体)的激活来感知。

在一个实施方案中，外科手术后疼痛可以是神经性疼痛(例如由影响体感神经系统的损伤或疾病引起的疼痛)。例如，外科手术后疼痛可以是外周神经病变(也称为外周疼痛)，例如其中疼痛由脑和脊髓外的神经(外周神经)损伤引起。

外科手术后疼痛可能表现为其它类型的疼痛，例如异常性疼痛。异常性疼痛是指“其它疼痛”。它是由通常不疼痛的刺激引起的疼痛。“触觉”异常性疼痛(也称为静态触觉异常性疼痛或机械性异常性疼痛)的患者可能经历触摸疼痛，例如使外科手术切口的(身体)部位置于床上，或穿着接触所述部位的衣服。因此，异常性疼痛被认为是“由于通常不引起疼痛的刺激引起的疼痛”，与痛觉过敏(来自通常引起疼痛的刺激的疼痛增加)相反。

外科手术后疼痛可以优选是急性外科手术后疼痛；例如，一种可能持续小于3个月(外科手术后)的外科手术疼痛。

在一个实施方案中，外科手术后疼痛为慢性外科手术后疼痛；例如，一种可能持续长于三个月(外科手术后)并且可能在组织损伤(例如由于外科手术切口)愈合后继续被感知到的外科手术疼痛。

更详细地，如本文所用的术语“慢性外科手术后疼痛”优选是指在潜在损伤(例如外科手术切口对肌肉的损伤)消退后持续长于3个月的疼痛，例如外科手术后持续长于3个月的疼痛。“慢性外科手术后疼痛”可以例如由急性外科手术后疼痛(例如一种通常持续小于3个月的外科手术疼痛)的治疗不足(或缺乏)发展。外科手术后“急性外科手术疼痛”的不良管理可能增加此类急性外科手术疼痛变成慢性外科手术后疼痛的机会。因此，有利地，通过在早期阶段管理急性外科手术后疼痛(有利地由于外科手术前施用在外科手术后不久提供镇痛功效)，本发明减缓了慢性外科手术后疼痛的发生。

慢性外科手术后疼痛可以在疤痕(在外科手术切口部位形成的疤痕)处或周围感知到。在优选的实施方案中，慢性外科手术后疼痛是慢性瘢痕疼痛。术语“慢性瘢痕疼痛”是指由于组织瘢痕形成而发展的疼痛。“慢性疤痕疼痛”可以由皮肤和/或肌肉组织和/或神经组织的损伤和神经的再生发展而来。

在优选的实施方案中，外科手术后疼痛是在外科手术介入部位处感知的外科手术疼痛和/或在外科手术介入部位近侧部位处感知的外科手术疼痛，优选其中外科手术疼痛在已经通过外科手术介入损伤的组织(例如皮肤、肌肉)内感知。外科手术后疼痛也可以是在已经进行活检的身体内部的组织/器官部位处感知到的外科手术疼痛。

优选地，梭菌神经毒素的施用降低了外科手术后患者的外科手术疼痛感知水平。例如，与在外科手术前(例如外科手术前5天或更多天)未施用梭菌神经毒素的(对照)患者的外科手术疼痛感知水平相比，患者的外科手术疼痛感知水平可以在外科手术后降低。

在一个实施方案中，患者的外科手术后疼痛感知在外科手术后24小时内减少。换言之，梭菌神经毒素的施用可以在外科手术后24小时内降低患者的外科手术后疼痛感知。例如，梭菌神经毒素的施用可以在外科手术后6小时内，优选在外科手术后1小时内减少患者的外科手术后疼痛感知。

患者的外科手术后疼痛感知可以在外科手术后减少至少3天、外科手术后至少6天或外科手术后至少9天；例如，外科手术后至少15天；在另一个实例中，在外科手术后至少30天。在优选的实施方案中，患者的外科手术后疼痛可以在外科手术后减少至多3个月(包括3个月)。

患者的降低的外科手术后疼痛感知可以在外科手术后维持至少5天、外科手术后维持至少7天或外科手术后维持至少9天，优选在外科手术后维持至少9天。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素的施用基本上降低了患者的外科手术后疼痛感知，并且其中降低的外科手术后疼痛感知在外科手术后立即维持24小时。在另一个实施方案中，患者的外科手术后疼痛感知在外科手术后立即显著降低并且维持2天。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后疼痛感知在外科手术后立即维持3天。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后疼痛感知在外科手术后立即维持4天。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后疼痛感知在外科手术后立即维持5天。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后疼痛感知在外科手术后立即维持6天。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后疼痛感知在外科手术后立即维持7天。优选地，基本上所有降低的外科手术后疼痛感知在外科手术后立即维持8天。

在一个实施方案中，在外科手术后立即在限定时间点(如前一段落中所述)观察到的疼痛感知水平降低是在施用梭菌神经毒素后任何时间观察到的疼痛感知最大水平降低的至少50％。例如，在外科手术后立即在限定时间点(如前段落中所述)观察到的疼痛感知水平降低是在施用梭菌神经毒素后任何时间观察到的疼痛感知最大水平降低的至少55％、至少60％、至少65％、至少70％，优选至少75％。

更详细地，提及“降低的”(就外科手术后疼痛而言)优选意指当与未施用梭菌神经毒素(或施用安慰剂)的个体(同样已经进行外科手术)接受的外科手术疼痛水平相比时，施用梭菌神经毒素的个体(例如患者)感知到更低水平的外科手术疼痛。例如，当与未施用梭菌神经毒素(或施用安慰剂)的个体(同样已经进行外科手术)相比时，施用梭菌神经毒素后外科手术疼痛感知的水平可以降低至少15％、25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％或95％。例如，当与未施用梭菌神经毒素(或施用安慰剂)的个体(同样已经进行外科手术)相比时，施用梭菌神经毒素后外科手术疼痛感知的水平可以降低至少75％；优选至少85％；更优选至少95％。

用于评估疼痛感知的多种方式是本领域技术人员已知的。例如，机械性异常性疼痛(静态或动态)的评估常规用于人疼痛研究，如Pogatzki-Zahn等人(Pain Rep.2017Mar；2(2):e588)中所述，其通过引用并入本文。

用于评估个体的疼痛感知的适合的(尽管是非限制性实例)方法包括以下：数值评定量表(NRS)评分；尽管本领域技术人员知道可以另外或可选择地使用的其它方法，例如感觉阈值、疼痛感知阈值、静态机械性异常性疼痛、动态机械性异常性疼痛、时间总和、压力疼痛阈值、条件性疼痛调节和温度阈值。

疼痛感知量度的其它非限制性实例包括：在每个预定时间点SF-36评分从基线的变化；研究期间服用的救援药物的量和距第一次摄入救援药物的时间。这些可以被认为是“探索性”终点或疼痛感知评估量度。

因此，在优选的实施方案中，在施用梭菌神经毒素后，可以通过以下一种或多种评估外科手术后疼痛感知：(a)数值评定量表(NRS)；(b)刺激诱发的NRS；(c)疼痛区域的温度；(d)疼痛区域的大小；(e)镇痛作用开始的时间；(f)峰值镇痛作用；(g)达到镇痛作用峰值的时间；(h)镇痛作用的持续时间；和(i)SF-36生活质量。

本领域技术人员知道此类用于评估疼痛感知的方法。为方便起见，下面提供了数值评定评分和生活质量问卷简表-36的进一步描述。

数值评定量表(NRS)：通常，根据本发明的外科手术疼痛感知使用数值评定量表(NRS)。NRS是用于评估个体外科手术疼痛感知的11分量表。要求个体给出最适合其外科手术疼痛强度的0至10之间的数字。0表示‘完全没有外科手术疼痛’，而上限10表示‘可能的最严重外科手术疼痛’。

NRS可以用于评估外科手术疼痛的许多方面，包括自发性平均外科手术疼痛、自发性最严重外科手术疼痛和自发性当前外科手术疼痛。通过要求个体选择最佳描述个体在一段时间(例如至少6小时、12小时、24小时或至少48小时)内的平均外科手术疼痛(例如感知到的外科手术疼痛)的数字来评估自发平均外科手术疼痛。通过要求个体选择最佳描述个体在指定时间段(例如，至少前6小时、12小时、24小时或前48小时)内最严重的外科手术疼痛的数字来评估自发性最严重外科手术疼痛。通过要求个体选择最佳描述个体在评估时的外科手术疼痛程度的数字来评估自发性当前外科手术疼痛。

NRS还可以用于评估个体响应于多种不同刺激的外科手术疼痛感知。为了评估响应于刺激的外科手术疼痛感知，个体将经受施加到疼痛区域的多种性质的刺激。个体将被询问他们在剂量前和刺激后的当前NRS评分如何。

使用的刺激的实例包括：(i)轻触(其可以通过在施用如本文所述的von Frey细丝后测量径向辐条上疼痛区域表面上的疼痛来评估)；(ii)压力(压力疼痛阈值)，其可以通过要求个体在使用如本文所述的压力痛觉计施加增加的压力时给出NRS评分来评估；和(iii)温度(如本文所述，其可以通过使用施加到疼痛区域的thermode向个体询问温、冷和热刺激的NRS评分来评估)。

优选地，当与未施用梭菌神经毒素的对照患者的NRS评分相比时，施用本文所述的梭菌神经毒素降低了外科手术后患者的NRS评分(例如从评分≥7至评分≤6)。

生活质量问卷简表-36(SF-36)：SF-36生活质量问卷可以用于评估个体的外科手术疼痛感知。SF-36是36-项、个体报告的个体健康调查。SF-36由八个量表评分(活力、身体功能、身体疼痛、一般健康感知、身体角色功能、情绪角色功能、社会角色功能和心理健康)组成。假设每个问题具有相等的权重，则将每个量表直接转换为0-100量表。SF-36中记录的评分越高，则失能越少。

通常在用于治疗外科手术疼痛的临床试验中测试的相关参数是本领域已知的，并且可以由本领域普通技术人员容易地选择。此类参数的实例包括但不限于NRS；刺激诱发的NRS；疼痛区域的温度；疼痛区域的大小；至镇痛作用开始的时间；峰值镇痛作用；达到峰值镇痛作用的时间；镇痛作用的持续时间；和/或SF-36生活质量。用于评估这些参数的方法也是本领域已知的，并且可以由普通技术人员使用常规方法和程序进行。

优选地，当与未施用梭菌神经毒素的对照患者的SF-36评分相比时，施用本文所述的梭菌神经毒素增加患者外科手术后的SF-36评分(例如从≤50的评分至≥50的评分)。

现在转向“外科手术后焦虑”，对其的提及(即外科手术后焦虑)可以指患者经历身体症状和行为变化的病症，包括但不限于疲劳、集中和睡眠困难以及肌肉紧张。此外，患者可能经历焦虑的情绪症状，包括不安、易怒、难以控制恐惧或担忧、恐惧和恐慌。外科手术后焦虑可能由麻醉、外科手术本身、外科手术后疼痛和来自医院环境的压力的影响引起。

因此，在一个实施方案中，外科手术后焦虑是由外科手术后疼痛引起的。

可以将外科手术后焦虑定义为惊恐障碍、恐怖症、创伤后精神紧张性障碍、社交焦虑障碍(社交恐怖症)或广泛性焦虑障碍(GAD)(例如导致你对广泛的情况和问题而不是一种特定事件感到焦虑的长期病症)。

在一个实施方案中，用于减轻或抑制外科手术后焦虑的梭菌神经毒素或包括在外科手术前给患者施用梭菌神经毒素的方法在外科手术前5天或更多天施用，优选其中梭菌神经毒素在外科手术前多于5天施用。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素的施用基本上降低了患者的外科手术后焦虑感知，并且其中所述降低的外科手术后焦虑感知在外科手术后立即维持24小时。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后焦虑感知在外科手术后立即维持2天。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后焦虑感知在外科手术后立即维持3天。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后焦虑感知在外科手术后立即维持4天。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后焦虑感知在外科手术后立即维持5天。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后焦虑感知在外科手术后立即维持6天。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后焦虑感知在外科手术后立即维持7天。在一个实施方案中，基本上所有降低的外科手术后焦虑感知在外科手术后立即维持8天。优选地，基本上所有降低的外科手术后焦虑感知在外科手术后立即维持9天。

优选地，当与未施用梭菌神经毒素的对照患者的症状相比时，施用本文所述的梭菌神经毒素降低外科手术后焦虑症状(例如降低30％、50％、75％或95％)。外科手术后焦虑症状的实例包括不安、易怒、难以控制恐惧或担忧、恐惧和恐慌。

更详细地，提及“降低的”(就外科手术后焦虑而言)优选意指当与未施用梭菌神经毒素(或施用安慰剂)的个体(同样已经进行外科手术)感知到的焦虑水平相比时，施用梭菌神经毒素的个体(例如患者)感知到的焦虑水平更低。例如，当与未施用梭菌神经毒素(或施用安慰剂)的个体(同样已经进行外科手术)相比时，在施用梭菌神经毒素后，焦虑感知水平可以降低至少15％、25％、35％、45％、55％、65％、75％、85％或95％。例如，当与未施用梭菌神经毒素(或施用安慰剂)的个体(同样已经进行外科手术)相比时，在施用梭菌神经毒素后，焦虑感知水平可以降低至少75％；优选至少85％；更优选至少95％。

在一个实施方案中，患者经历的外科手术后焦虑在外科手术后24小时内得到抑制。换言之，梭菌神经毒素的施用可以在外科手术后24小时内减轻或抑制患者的外科手术后焦虑。例如，患者的外科手术后焦虑可以在外科手术后2小时内、外科手术后4小时内或外科手术后24小时内；优选在外科手术后4小时内减轻或抑制。

本发明人已经证明，可以施用梭菌神经毒素以治疗外科手术后疼痛以及抑制外科手术后焦虑。因此，在一个实施方案中，梭菌神经毒素治疗外科手术后疼痛并且减轻或抑制术后焦虑。

总之，本发明通过降低外科手术疼痛和焦虑(否则在外科手术后感知到)的水平，有利地增加了患者的总体“外科手术后健康”，从而改善了患者的生活质量。

因此，在一个实施方案中，梭菌神经毒素的施用促进外科手术后健康。

下文提供了本发明所包括的梭菌神经毒素的进一步细节以及技术背景信息。

梭菌属(Clostridia)中的细菌产生高效且特异性的蛋白毒素，其可毒害它们所递送至的神经元和其它细胞。此类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(C.tetani)(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的神经毒素。

梭菌神经毒素(例如，在自然界中)通过抑制外周神经系统中，特别是在神经肌肉接头处的胆碱能传递而引起肌肉麻痹，因此可能是致命的。在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其通过蛋白水解裂解事件翻译后修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。裂解发生在特定的裂解位点，通常称作活化位点，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链称为重链(H链)，其具有约100kDa的分子量，和轻链(L-链)，其具有约50kDa的分子量。H-链包含N-末端易位组分(HN结构域)和C-末端靶向组分(HC结构域)。裂解位点位于L-链和HN结构域之间。

梭菌神经毒素的作用模式依赖于五个不同的步骤：(1)HC结构域与其靶神经元的细胞膜结合，然后(2)结合的毒素通过内体内化到细胞中，(3)L-链通过HN结构域易位穿过内体膜并且进入胞质溶胶，(4)L-链蛋白水解裂解称作SNARE蛋白的胞内转运蛋白，其提供非细胞毒性蛋白酶功能，和(5)抑制靶细胞的细胞分泌。

非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解裂解称作SNARE蛋白的胞内转运蛋白(例如SNAP-25、VAMP或Syntaxin)起作用-参见Gerald K(2002)“Cell and Molecular Biology”(4thedition)John Wiley&Sons,Inc.。首字母缩略词SNARE源自术语可溶性(Soluble)NSF附着(Attachment)受体(Receptor)，其中NSF意指N-乙基马来酰亚胺敏感(Sensitive)因子(Factor)。SNARE蛋白与细胞内囊泡融合是一体的，并且因此与通过囊泡转运从细胞分泌分子是一体的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，并且对SNARE蛋白表现出高底物特异性。因此，一旦递送至期望的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶则能够抑制从靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L-链蛋白酶是裂解SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。

由于其独特的性质，梭菌神经毒素(例如肉毒梭菌毒素)已经成功地用于广泛的治疗应用，特别是用于运动和自主障碍，以将例如过度活跃的神经末梢的活性恢复到正常水平。到目前为止，已经描述了至少七种抗原性不同的BoNT血清型，即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G(Rossetto,O.等人,“Botulinum neurotoxins:genetic,structural and mechanistic insights.”Nature Reviews Microbiology 12.8(2014):535-549)。

尽管存在这种多样性，BoNT/A仍然是治疗中选择的血清型，具有三种通常可获得的商业制品(

和/>

)，而市场上仅有一种BoNT/B产品

迄今为止，这些BoNT/A和BoNT/B产品(其是从梭菌菌株纯化的毒素)是目前被管理机构批准用于人的仅有的两种BoNT血清型，其应用范围特别是从痉挛状态、膀胱功能障碍或多汗症(对于BoNT/A)(参见例如：https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/112、https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/870、https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/2162，通过引用整体并入本文)到颈肌张力障碍(对于BoNT/B)(参见例如https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/20568，通过引用整体并入本文)。

与通过杀伤其天然靶细胞起作用的细胞毒性蛋白酶(例如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素)相反，梭菌神经毒素是通过瞬时使其天然靶细胞的细胞功能丧失而起作用的非细胞毒性蛋白酶。重要的是，非细胞毒性蛋白酶不杀死其作用的天然靶细胞。除了梭菌神经毒素(例如肉毒梭菌神经毒素，以例如Dysport^TM、Neurobloc^TM和Botox^TM的名称销售)之外，非细胞毒性蛋白酶的一些最熟知的实例包括IgA蛋白酶(参见例如WO99/032272)和安妥酶(antarease)蛋白酶(参见例如WO2011/022357)。

如本文所用的术语“梭菌神经毒素”意指进入神经元并且抑制神经递质释放的任何多肽。该过程包括神经毒素与低或高亲和力受体的结合、神经毒素的摄入、神经毒素的内肽酶部分易位入细胞质以及神经毒素底物的酶促修饰。更特别地，术语“神经毒素”包括由梭菌属(Clostridium)细菌(梭菌神经毒素)产生的进入神经元并且抑制神经递质释放的任何多肽，以及通过重组技术或化学技术产生的此类多肽。优选地，梭菌神经毒素是肉毒梭菌神经毒素(BoNT)。

BoNT血清型A-G可以基于通过特异性中和抗血清的失活来区分，其中通过血清型的这种分类与氨基酸水平的百分比序列同一性相关。基于氨基酸百分比序列同一性，将给定血清型的BoNT蛋白进一步分成不同的亚型。

将BoNT/A神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO：1(UniProt保藏号A5HZZ9)和SEQ ID NO：13，其由作为SEQ ID NO：12提供的核苷酸序列编码。将BoNT/B神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO：2(UniProt保藏号B1INP5)。将BoNT/C神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO：3(UniProt保藏号P18640)。将BoNT/D神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO：4(UniProt保藏号P19321)。将BoNT/E神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO：5(保藏号WP_003372387)。将BoNT/F神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO：6(UniProt保藏号Q57236)或提供为SEQ ID NO：9(UniProt/UniParc保藏号UPI0001DE3DAC)。将BoNT/G神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO：7(保藏号WP_039635782)。将BoNT/D-C神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO：8(保藏号BAM65681)。将BoNT/X神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQ ID NO：11(保藏号BAQ12790.1)。优选地，BoNT为BoNT/A，更优选地为野生型BoNT/A。

如本文所用的术语“H_C结构域”是指分子量为约50kDa的神经毒素重链的功能上不同的区域，其使得神经毒素能够与位于靶细胞表面上的受体结合。H_C结构域由两个结构上不同的亚结构域组成，“H_CN亚结构域”(H_C结构域的N-末端部分)和“H_CC亚结构域”(H_C结构域的C-末端部分，也称作Hcc结构域)，其各自具有约25kDa的分子量。H_CC结构域能够结合梭菌神经毒素蛋白受体。

如本文所用的术语“LH_N结构域”是指与H_C结构域不同的神经毒素区域，并且其由内肽酶结构域(“L”或“轻链”)和负责内肽酶易位到细胞质中的结构域(重链的H_N结构域)组成。内肽酶结构域(“L”或“轻链”)能够裂解SNARE蛋白。

示例性L、H_N、H_CN和H_CC结构域如表1中所示。

表1-示例性L、H_N、H_CN和H_CC结构域

上述鉴定的参比序列应当被视为指导，因为根据亚血清型可能发生适度改变。作为实例，US 2007/0166332(通过引用整体并入本文)引用了略微不同的梭菌属序列。

术语“活化环”是指包含蛋白水解裂解位点的多肽结构域。神经毒素的活化环已经在本领域中描述，例如在WO2016156113(通过引用整体并入本文)中描述。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素由氨基酸序列组成或包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的任一个至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素由氨基酸序列组成或包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素由SEQ ID NO：1(例如BoNT/A)的氨基酸序列组成或包含SEQ ID NO：1(例如BoNT/A)的氨基酸序列。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素为嵌合神经毒素。

本文所用的术语“嵌合神经毒素”是指包含一个或多个源自第一神经毒素的结构域和一个或多个源自第二神经毒素的结构域的神经毒素。例如，嵌合神经毒素可以包含源自第一神经毒素血清型或亚型的LH_N结构域和源自第二神经毒素血清型或亚型的H_C结构域。嵌合神经毒素的另一个实例为包含源自第一神经毒素血清型或亚型的LH_N H_CN结构域和源自第二神经毒素血清型或亚型的H_CC结构域的神经毒素。嵌合神经毒素的另一个实例是包含来自第一神经毒素血清型或亚型的LH_N结构域和来自第二神经毒素血清型或亚型的活化环的神经毒素。嵌合神经毒素的实例提供于WO2017191315和WO2016156113中，两者均通过引用整体并入本文。

例如，嵌合神经毒素可以包含与来自第二神经毒素的H_C结构域共价连接的来自第一神经毒素的LH_N结构域，优选其中所述第一和第二神经毒素不同，其中所述LH_N结构域的C-末端氨基酸残基对应于将所述第一神经毒素中的LH_N和H_C结构域分开的3₁₀螺旋的第一氨基酸残基，并且其中所述H_C结构域的N-末端氨基酸残基相当于将所述第二神经毒素中的LH_N和H_C结构域分开的3₁₀螺旋的第二氨基酸残基。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素为嵌合神经毒素，其包含来自BoNT/B的H_C结构域和来自BoNT/A、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F或BoNT/G的LH_N结构域。

例如，在一个实施方案中，H_C结构域由下列氨基酸序列组成或包含下列氨基酸序列：相当于SEQ ID NO：2(例如BoNT/B)的氨基酸残基860-1291的氨基酸序列，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，并且LH_N结构域由选自如下的氨基酸序列组成或包含选自如下的氨基酸序列：

-SEQ ID NO：1(例如BoNT/A)的氨基酸残基1-872，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

-SEQ ID NO：3的氨基酸残基1-867，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

-SEQ ID NO：4的氨基酸残基1-863，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

-SEQ ID NO：5的氨基酸残基1-846，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

-SEQ ID NO：6的氨基酸残基1-865，或具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％与之序列同一性的序列，

-SEQ ID NO：7的氨基酸残基1-864，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

-SEQ ID NO：8的氨基酸残基1-863，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，和

-SEQ ID NO：9的氨基酸残基1-862，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。

在优选的实施方案中，梭菌神经毒素为包含来自BoNT/B的H_C结构域和来自BoNT/A的LH_N结构域的嵌合神经毒素。

在更优选的实施方案中，H_C结构域由相当于SEQ ID NO：2的氨基酸残基860-1291的氨基酸序列组成或包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基860-1291的氨基酸序列，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且LH_N结构域包含相当于SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-872的氨基酸序列，或与之具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在其中梭菌神经毒包含来自BoNT/B的H_C结构域的实施方案中(例如，其中梭菌神经毒素为BoNT/B，或包含来自BoNT/B的H_C结构域的嵌合神经毒素)，梭菌神经毒素可以在重链氨基酸序列上(例如H_C结构域)具有一个或多个修饰，得到“修饰的重链”，优选其中所述修饰的重链以高于(或低于)天然神经毒素的亲和力结合靶神经细胞。此类H_C结构域中的修饰可以包括可以改变与靶神经细胞的神经节苷脂的结合的H_CC结构域的神经节苷脂结合位点中的氨基酸残基的修饰，和/或可以改变与靶神经细胞的蛋白质受体的结合的H_CC结构域的蛋白质受体结合位点中的氨基酸残基的修饰。此类修饰的神经毒素的实例描述在WO2006027207和WO2006114308中，两者均通过引用整体并入本文。

在重链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰的梭菌神经毒素在本文中称作“修饰的梭菌神经毒素”。

在本发明的修饰的梭菌神经毒素的一个实施方案中，来自BoNT/B的H_CC结构域与所述BoNT血清型的天然H_CC结构域相比被修饰。

在优选的实施方案中，来自BoNT/B神经毒素的H_CC结构域包含至少一个氨基酸残基突变，其与天然BoNT/B H_CC结构域相比增加所述H_CC结构域对人Syt II的结合亲和力。此外，优选地，与天然BoNT/B H_CC结构域相比，所述至少一个氨基酸残基突变使所述H_CC结构域对人Syt II的结合亲和力增加至少50％。

BoNT/B H_CC结构域中的此类适合的氨基酸残基突变已在本领域中描述在WO2013180799和WO2016154534中，两者均通过引用整体并入本文。

特别地，与天然BoNT/B H_CC结构域相比，适于将BoNT/B H_CC结构域对人Syt II的结合亲和力增加至少50％的所述至少一个氨基酸残基突变是选自如下的氨基酸残基取代、添加或缺失：1118M、1183M、1191M、1191I、1191Q、1191T、1199Y、1199F、1199L、1201V、1191C、1191V、1191L、1191Y、1199W、1199E、1199H、1178Y、1178Q、1178A、1178S、1183C、1183P及其任意组合。优选地，所述BoNT/B H_CC结构域中的至少一个氨基酸残基突变由选自如下的两个氨基酸残基取代、添加或缺失组成：1191M和1199L、1191M和1199Y、1191M和1199F、1191Q和1199L、1191Q和1199Y、1191Q和1199F、1191M和1199W、1191M和1178Q、1191C和1199W、191C和1199Y、1191C和1178Q、1191Q和1199W、1191V和1199W、1191V和1199Y或1191V和1178Q。仍然优选地，所述BoNT/B H_CC结构域中的至少一个氨基酸残基突变由三个氨基酸残基取代、添加或缺失组成：1191M、1199W和1178Q。更优选地，所述BoNT/B H_CC结构域中的至少一个氨基酸残基突变由两个氨基酸残基取代、添加或缺失组成：1191M和1199Y。

在更优选的实施方案中，与天然BoNT/B H_CC结构域相比，适于将BoNT/B H_CC结构域对人Syt II的结合亲和力增加至少50％的所述至少一个氨基酸残基突变是选自如下的氨基酸残基取代：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其任意组合。优选地，所述BoNT/B H_CC结构域中的至少一个氨基酸残基突变由选自如下的两个氨基酸残基取代组成：E1191M和S1199L、E1191M和S1199Y、E1191M和S1199F、E1191Q和S1199L、E1191Q和S1199Y、E1191Q和S1199F、E1191M和S1199W、E1191M和W1178Q、E1191C和S1199W、E1191C和S1199Y、E1191C和W1178Q、E1191Q和S1199W、E1191V和S1199W、E1191V和S1199Y、或E1191V和W1178Q。仍然优选地，所述BoNT/B H_CC结构域中的至少一个氨基酸残基突变由三个氨基酸残基取代组成：E1191M、S1199W和W1178Q。更优选地，所述BoNT/B HCC结构域中的至少一个氨基酸残基突变由两个氨基酸残基取代组成：E1191M和S1199Y。

在优选的实施方案中，待修饰的BoNT/B H_CC结构域相当于SEQ ID NO:2的氨基酸残基1082-1291(天然BoNT/B H_CC结构域)，或相当于与之具有至少70％，优选至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以为嵌合的和修饰的，如上所述。例如，在优选的实施方案中，梭菌神经毒素包含(或由以下组成)氨基酸序列SEQ ID NO：10，或与之具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以是嵌合的和修饰的，如上所述。例如，在优选的实施方案中，梭菌神经毒素包含(或由以下组成)氨基酸序列SEQ ID NO：10(例如BoNT/AB_MY)，或与其具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

本发明的梭菌神经毒素可以使用重组技术产生。因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素为重组梭菌神经毒素。

使用此类重组神经毒素可以有利地拓宽在本文所述的方法中使用的梭菌神经毒素的选择，例如基于被认为适合于任何给定外科手术的性质如效力和作用持续时间来选择。适合的(已知的)重组梭菌神经毒素包括修饰的肉毒梭菌神经毒素A(BoNT/A)，当与未修饰的BoNT/A(例如

)相比时，其优选具有更长的作用持续时间。所述作用持续时间可以是至少1.25×、1.5×、1.75×、2.0×或2.25×。修饰的BoNT/A的作用持续时间可以为6至9个月。例如，作用持续时间可以是至少：4.5个月(从开始)、5.0个月、5.5个月、6个月、6.5个月、7.0个月、7.5个月、8.0个月、8.5个月或9.0个月。

适合的修饰的BoNT/A多肽(和编码其的核苷酸序列，如果存在的话)描述在WO2015/004461A1和WO 2017/191315中，两者均通过引用整体并入本文。

更详细地，在一个实施方案中，梭菌神经毒素为修饰的重组BoNT/A神经毒素。在一个实施方案中，修饰的BoNT/A在选自如下的一个或多个氨基酸残基处包含修饰：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274和THR 1277，优选地，其中修饰选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电荷的表面暴露的氨基酸残基；(iv)碱性氨基酸残基的插入；和(v)酸性表面暴露的氨基酸残基的缺失。

当与如SEQ ID NO：1所示的未修饰的BoNT/A相比时，修饰可以是这样一种修饰，其中氨基酸残基编号通过与SEQ ID NO：1比对来确定。由于SEQ ID NO：1(以及相当于本文所述的修饰的BoNT/A多肽的SEQ ID NO)的位置1处甲硫氨酸残基的存在是任选的，因此技术人员在确定氨基酸残基编号时将考虑甲硫氨酸残基的存在/不存在。例如，当SEQ ID NO：1包括甲硫氨酸时，位置编号将如上所定义(例如，Asn 886为SEQ ID NO：1的Asn 886)。可选择的是，当SEQ ID NO：1中不存在甲硫氨酸时，氨基酸残基编号应当-1修饰(例如Asn 886为SEQ ID NO：1的Asn 885)。当本文所述的其它多肽序列的位置1处的甲硫氨酸存在/不存在时，类似的考虑适用，并且技术人员将使用本领域常规技术容易地确定正确的氨基酸残基编号。这同样适用于本文所述的任何其它BoNT(例如，上述嵌合BoNT)。

指示用于修饰的氨基酸残基是表面暴露的氨基酸残基。

修饰的BoNT/A可以由与选自SEQ ID NO：14、16、18和20的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列编码。例如，与选自SEQ ID NO：14、16、18和20的核酸序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的核酸序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以由包含SEQ ID NO：14、16、18或20(或由其组成)的核酸序列编码。修饰的BoNT/A可以包含与选自SEQ ID NO：15、17、19和21的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与选自SEQ ID NO：15、17、19和21的多肽序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含选自SEQ ID NO：15、17、19和21的多肽序列(更优选地由其组成)。

当在修饰的BoNT/A的上下文中使用时，术语“一个或多个氨基酸残基”优选意指至少2、3、4、5、6或7个所示氨基酸残基。因此，修饰的BoNT/A可以在指定的氨基酸残基处包含至少2、3、4、5、6或7个(优选7个)修饰。修饰的BoNT/A可以包含1-30、3-20或5-10个氨基酸修饰。更优选地，当在修饰的BoNT/A的上下文中使用时，术语“一个或多个氨基酸残基”意指所有指示的氨基酸残基。

优选地，除了在指示的氨基酸残基处的一个或多个氨基酸修饰之外，当与SEQ IDNO：1相比时，修饰的BoNT/A不含任何其它氨基酸修饰。

最优选地，修饰的BoNT/A包含在选自以下的一个或多个氨基酸残基处的修饰(更优选由其组成)：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052和GLN 1229。修饰的BoNT/A可以由与SEQ ID NO：14具有至少70％序列同一性的核酸序列编码。例如，与SEQID NO：14具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的核酸序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以由包含SEQ ID NO：14(或由其组成)的核酸编码。修饰的BoNT/A可以包含与SEQ ID NO：15具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，与SEQ ID NO：15具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。优选地，用于本发明的修饰的BoNT/A可以包含SEQ ID NO：15(更优选由其组成)。

修饰可以选自：(i)用碱性氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(ii)用不带电荷的氨基酸残基取代酸性表面暴露的氨基酸残基；(iii)用碱性氨基酸残基取代不带电的表面暴露的氨基酸残基；(iv)碱性氨基酸残基的插入；和(v)酸性表面暴露的氨基酸残基的缺失。

如上所述的修饰产生修饰的BoNT/A，当与相应的未修饰的BoNT/A相比时，所述修饰的BoNT/A具有增加的正表面电荷和增加的等电点。

等电点(pI)是给定蛋白质的特定性质。更详细地，等电点(pI)定义为蛋白质显示净电荷为零时的pH值。pI的增加意味着蛋白质需要更高的pH值以显示零的净电荷。因此，pI的增加表示在给定pH下蛋白质的净正电荷的增加。相反，pI的降低意味着蛋白质需要更低的pH值以显示零的净电荷。因此，pI的降低表示在给定pH下蛋白质的净正电荷的降低。

测定蛋白质pI的方法是本领域已知的，并且是技术人员熟悉的。作为实例，蛋白质的pI可以由蛋白质中存在的每种氨基酸的平均pKa值计算(“计算的pI”)。此类计算可以使用本领域已知的计算机程序进行，例如来自ExPASY的Compute pI/MW Tool(https://web.expasy.org/compute_pi/)，其是根据本发明计算pI的优选方法。应当使用相同的计算技术/程序进行不同分子之间的pI值的比较。在适当的情况下，可以使用等电聚焦技术(“观察的pI”)通过试验确认蛋白质的计算的pI。该技术使用电泳根据其pI分离蛋白质。等电聚焦通常使用具有固定pH梯度的凝胶进行。当施加电场时，蛋白质通过pH梯度迁移，直到其达到其具有零净电荷的pH，该点是蛋白质的pI。由等电聚焦提供的结果本质上通常是相对低分辨率的，因此本发明人认为由计算的pI(如上所述)提供的结果更适合使用。

在整个本说明书中，除非另有说明，否则“pI”是指“计算的pI”。蛋白质的pI可以通过改变其表面上展示的碱性和/或酸性基团的数量来增加或减少。这可以通过修饰蛋白质的一个或多个氨基酸来实现。例如，pI的增加可以通过减少酸性残基的数目或通过增加碱性残基的数目来提供。

本发明的修饰的BoNT/A的pI值可以比未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：1)的pI值高至少0.2、0.4、0.5或1个pI单位。优选地，修饰的BoNT/A可以具有至少6.6，例如至少6.8的pI。

20种标准氨基酸的特性如下表中所示：

氨基酸

侧链

氨基酸

侧链

天冬氨酸

Asp

D

带电荷(酸性)

甲硫氨酸

Met

M

不带电荷(极性)

谷氨酸

Glu

E

带电荷(酸性)

色氨酸

Trp

W

不带电荷(极性)

精氨酸

Arg

R

带电荷(碱性)

半胱氨酸

Cys

C

不带电荷(极性)

赖氨酸

Lys

K

带电荷(碱性)

丙氨酸

Ala

A

不带电荷(疏水性)

组氨酸

His

H

不带电荷(极性)

甘氨酸

Gly

G

不带电荷(疏水性)

天冬酰胺

Asn

N

不带电荷(极性)

缬氨酸

Val

V

不带电荷(疏水性)

谷氨酰胺

Gln

Q

不带电荷(极性)

亮氨酸

Leu

L

不带电荷(疏水性)

丝氨酸

Ser

S

不带电荷(极性)

异亮氨酸

Ile

I

不带电荷(疏水性)

苏氨酸

Thr

T

不带电荷(极性)

脯氨酸

Pro

P

不带电荷(疏水性)

酪氨酸

Tyr

Y

不带电荷(极性)

苯丙氨酸

Phe

F

不带电荷(疏水性)

以下氨基酸被视为带电荷的氨基酸：天冬氨酸(带负电)、谷氨酸(带负电)、精氨酸(带正电)和赖氨酸(带正电)。

在pH 7.4下，天冬氨酸(pKa 3.1)和谷氨酸(pKa 4.1)的侧链具有负电荷，而精氨酸(pKa 12.5)和赖氨酸(pKa 10.8)的侧链具有正电荷。天冬氨酸和谷氨酸称作酸性氨基酸残基。精氨酸和赖氨酸称作碱性氨基酸残基。

以下氨基酸被视为不带电荷的极性(意指它们可以参与氢键合)氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。以下氨基酸被视为不带电荷的疏水性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。

在氨基酸插入中，将另外的氨基酸残基(通常不存在的氨基酸残基)掺入BoNT/A多肽序列中，从而增加所述序列中氨基酸残基的总数。在氨基酸缺失中，从梭菌毒素氨基酸序列中除去氨基酸残基，从而减少所述序列中氨基酸残基的总数。

优选地，修饰是取代，其有利地在修饰的BoNT/A中保持相同数目的氨基酸残基。在氨基酸取代中，形成BoNT/A多肽序列的一部分的氨基酸残基被不同的氨基酸残基替代。如上所述，替代氨基酸残基可以是20种标准氨基酸之一。可选择的是，氨基酸取代中的置换氨基酸可以是非标准氨基酸(不是上述20种标准组的一部分的氨基酸)。作为实例，替代氨基酸可以是碱性非标准氨基酸，例如L-鸟氨酸、L-2-氨基-3-胍基丙酸或者赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的D-异构体)。用于将非标准氨基酸引入蛋白质中的方法是本领域已知的，并且包括使用大肠杆菌(E.coli)营养缺陷型表达宿主的重组蛋白质合成。

在一个实施方案中，取代选自：用碱性氨基酸残基取代酸性氨基酸残基，用不带电荷的氨基酸残基取代酸性氨基酸残基，和用碱性氨基酸残基取代不带电荷的氨基酸残基。在一个实施方案中，其中取代是酸性氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基取代，酸性氨基酸残基被其相应的不带电荷的酰胺氨基酸残基代替(即天冬氨酸被天冬酰胺代替，以及谷氨酸被谷氨酰胺代替)。

优选地，碱性氨基酸残基为赖氨酸残基或精氨酸残基。换言之，取代是用赖氨酸或精氨酸取代。最优选地，修饰是用赖氨酸取代。

在根据本发明的修饰后，修饰的BoNT/A能够与未修饰的BoNT/A(例如SEQ ID NO：1)结合的靶细胞受体结合。

描述了适合的修饰的(重组)BoNT/A神经毒素，例如具有长的作用持续时间，下文描述了适合的修饰的(重组)BoNT/E神经毒素，其可以相对更快地起作用和/或具有更短的作用期限。这再次证明了由本发明的基于梭菌神经毒素的治疗提供的有利的灵活性。例如，对于侵入性较小的外科手术(例如，预期外科手术后疼痛不会长时间存在的情况)，可以采用此类BoNT/E来提供更短的作用持续时间。

BoNT/E(例如rBoNT/E)可以包含与SEQ ID NO：5具有至少70％(优选至少80％；更优选至少90％)的序列同一性的多肽序列，条件是多肽序列包含一个或多个(例如，一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个或八个；优选所有八个)如下氨基酸(其中氨基酸位置编号以BoNT/E蛋白的N-末端甲硫氨酸氨基酸残基开始并且以C-末端氨基酸残基结束)：第177位的甘氨酸、第198位的丝氨酸、第340位的丙氨酸、第773位的亮氨酸、第963位的亮氨酸、第964位的谷氨酰胺、第967位的丙氨酸、第1195位的天冬酰胺。

所述氨基酸可以是相对于野生型BoNT/E多肽序列(例如UniProt Q00496的序列)的取代(例如突变)。例如：位置177处的甘氨酸可以是精氨酸至甘氨酸取代(R177G)；在位置198处的丝氨酸可以是C198S取代；在位置340处的丙氨酸可以是R340A取代；在位置773处的亮氨酸可以是I173L取代；在位置963处的亮氨酸可以是F963L取代；在位置964处的谷氨酰胺可以是E964Q取代；在位置967处的丙氨酸可以是R967A取代；和/或在位置1195处的天冬酰胺可以是插入(例如野生型BoNT/E序列(例如UniProt Q00496的多肽序列)的G1194与N1195之间的插入)。

在一个实施方案中，如上所述，所述一种或多种氨基酸的存在提供了与缺乏所述氨基酸的BoNT/E蛋白相比具有改善的溶解度的BoNT/E蛋白。所述改善的溶解度增加了异源表达系统(例如大肠杆菌表达系统)中蛋白质的收率。

在一个实施方案中，如上所述，所述一种或多种氨基酸的存在提供了与缺乏所述氨基酸的BoNT/E蛋白相比具有改善的效力的BoNT/E蛋白。所述改善的效力可以优选是改善的体内效力(更优选在人个体中改善的体内效力)。

在一个实施方案中，BoNT/E为WO 2014/068317 A1中描述的一个(或由WO 2014/068317A1中所述的核苷酸序列编码)，其通过引用并入本文。

优选地，梭菌神经毒素(例如用于如本文所述的用途)与至少一种药学上可接受的载体一起是药物组合物的一部分。“药学上可接受的载体”在本文中是指与药物组合物的其它成分(特别是与梭菌神经毒素)相容并且对人患者无害的任何组分。药学上可接受的载体可以根据标准药学实践基于所需的施用途径来选择，并且包括但不限于赋形剂、稀释剂、佐剂、抛射剂和盐。

因此，本发明还涉及用于治疗人患者的外科手术后疼痛和/或焦虑的药物组合物，其中所述组合物包含本发明的梭菌神经毒素和至少一种药学上可接受的载体，并且给患者施用的梭菌神经毒素的剂量如上所述。还包括治疗外科手术后疼痛和/或焦虑的相应用途和方法，其包含给人患者施用本发明的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及用于促进外科手术后健康的药物组合物，其中外科手术后健康是减轻外科手术后疼痛和焦虑。

本发明的梭菌神经毒素可以优选配制用于皮内施用。

优选的施用途径是通过皮内施用。优选地，皮内施用意指皮内注射。

优选地，治疗外科手术后疼痛和/或外科手术后焦虑的所述BoNT是纯化的BoNT。如本文所用，术语“纯化的BoNT”是指从天然产生它的梭菌菌株(天然存在的梭菌菌株)纯化或使用重组技术纯化的肉毒梭菌神经毒素。纯化的BoNT/A可以与复合蛋白结合或不含复合蛋白，但优选不含复合蛋白。因此，在一个实施方案中，梭菌神经毒素与BoNT复合蛋白(也称作无毒神经毒素相关蛋白(NAP))结合。换言之，梭菌神经毒素与BoNT复合蛋白联合或组合施用于人患者。因此，在一个实施方案中，梭菌神经毒素与一种或多种BoNT复合蛋白复合。商购的纯化和复合蛋白结合的BoNT/A的实例包括

(与BoNT复合蛋白结合)和/>

(纯化的)。

在另一个实施方案中，梭菌神经毒素不含BoNT复合蛋白(或不与其结合或组合)。换言之，梭菌神经毒素在不与BoNT复合蛋白结合或组合的情况下施用于人患者。

梭菌神经毒素的剂量可以以纳克测量。

本发明的梭菌神经毒素的剂量应理解为活性双链梭菌神经毒素的剂量，即不包括神经毒素可能与之结合的复合蛋白的量。换言之，它是指活性双链梭菌神经毒素的剂量，无论所述神经毒素结合或不结合复合蛋白质施用于患者。如本领域技术人员众所周知的，活性双链梭菌神经毒素能够结合膜(例如细胞膜)受体，将轻链易位到细胞质中并且裂解SNARE蛋白，而复合蛋白不显示这种生物活性(即不是“活性的”)。

另外或可选择地，梭菌神经毒素的剂量可以以梭菌神经毒素的“单位”(U)测量。例如，当施用BoNT/A(或更特别地，例如，

)时，以单位的剂量的测量可能特别适合。/>

实际上，如本领域技术人员众所周知的，梭菌神经毒素的效力与达到LD50(致死剂量50)单位所需的神经毒素的量(例如纳克)相关；一个LD50单位被定义为中位数致死腹膜内剂量(如在小鼠中测量的)。然而，目前市场上的BoNT药物制剂包含不同量的150kD神经毒素，但也包含LD50单位。此外，在这些制剂中，神经毒素可以或可以不与无毒神经毒素结合蛋白(NAP)(也称作复合蛋白)结合(即组合)。为了易于转化(如Field等人,“AbobotulinumtoxinA

OnabotulinumtoxinA/>

andIncobotulinumtoxinA/>

Neurotoxin Content and Potential Implicationsfor Duration of Response in Patients”.Toxins 2018,10(12),535中所报道的)：

-100单位的

(也称作OnabotulinumtoxinA)包含约0.9ng的150kD BoNT/A，以及复合蛋白；

-500单位的

(也称作AbobotulinumtoxinA)包含约2.69ng的150kD BoNT/A，以及复合蛋白；1单位的/>

包含约5.38pg BoNT/A；

-100单位的

(也称作IncobotulinumtoxinA)包含约0.40ng的150kDBoNT/A，不含复合蛋白。

应当注意，转化值可以略有不同。例如，Frevert,2012(“Content of botulinumneurotoxin in

和/>

”；Drugs RD.2010；10(2):67-73)中报道的转化值如下：

-100单位的

(也称作OnabotulinumtoxinA)包含约0.73ng的150kD BoNT/A，以及复合蛋白；

-100单位的

(也称作AbobotulinumtoxinA)包含约0.65ng的150kD BoNT/A，以及复合蛋白；

-100单位的

(也称作IncobotulinumtoxinA)包含约0.44ng的150kDBoNT/A，不含复合蛋白；

-100单位的

(也称作RimabotulinumtoxinB)包含约0.2ng-约1ng的150kD BoNT/B，以及复合蛋白。

梭菌神经毒素的量可以由本领域技术人员根据本领域常规使用的方法测量，以优选地以纳克水平定量蛋白质，所述方法特别包括质谱法，例如同位素稀释质谱法(

等人,Quantification of protein calibrants by amino acid analysis using isotopedilution mass spectrometry,Anal.Biochem.2011,408、124-131)，或荧光测定法(Poras等人,Detection and Quantification of Botulinum Neurotoxin Type A by a NovelRapid In Vitro Fluorimetric Assay,Appl Environ Microbiol.2009年7月；75(13):4382-4390)。

皮内施用可以包括用针(例如30号针)进行皮内注射，优选其中将针(例如30号针)相对于外科手术介入部位(其可以在胁腹上)的皮肤表面以约5°-15°的角度插入皮肤的真皮中。注射深度(相对于皮肤表面的深度)可以为约0.2-0.3(优选约0.25)英寸。

梭菌神经毒素可以在身体上待进行外科手术介入的部位(例如外科手术切口，或接近外科手术切口部位)施用。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素可以在患者的外科手术介入部位(例如在患者的外科手术介入部位的一个或多个施用部位)施用(例如通过皮内注射或鞘内注射)。

梭菌神经毒素可以在一个或多个部位施用，例如在接近外科手术介入部位的一个或多个部位施用。“接近外科手术介入部位”的部位可以位于距外科手术介入部位至多15cm处；例如，距外科手术介入部位至多10cm；优选距外科手术介入部位至多5cm；更优选距外科手术介入部位至多1cm。

在一个实施方案中，在施用后，梭菌神经毒素通过逆行转运行进至脊髓并且在所述脊髓中实现SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)。

在一个实施方案中，当在皮内部位施用梭菌神经毒素时，在施用梭菌神经毒素后，在所述皮内部位处或附近观察到所述梭菌神经毒素的最小SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)或没有观察到所述梭菌神经毒素的SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)。在一个实施方案中，在施用梭菌神经毒素后5-7天进行观察，并且在施用梭菌神经毒素后在所述皮内部位处或附近观察到所述梭菌神经毒素的最小SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)或没有观察到所述梭菌神经毒素的SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)。

在一个实施方案中，当在鞘内部位施用梭菌神经毒素时，在施用梭菌神经毒素后，在所述鞘内部位处或附近观察到所述梭菌神经毒素的最小SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)或没有观察到所述梭菌神经毒素的SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)。在一个实施方案中，在施用梭菌神经毒素后5-7天进行观察，并且在施用梭菌神经毒素后在所述鞘内部位处或其附近观察到所述梭菌神经毒素的最小SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)或没有观察到所述梭菌神经毒素的SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)。

因此，梭菌神经毒素可以在外科手术介入部位的远侧施用以治疗外科手术后疼痛和外科手术后焦虑。

因此，在优选的实施方案中，当外科手术后疼痛由外科手术介入引起时，梭菌神经毒素可以在外科手术介入部位远侧的部位(例如在患者切口部位远侧的一个或多个施用部位)施用(例如通过皮内注射或鞘内注射)。

梭菌神经毒素可以在外科手术介入部位远侧的一个或多个部位施用，例如在距外科手术介入部位至少15cm；距外科手术介入部位至少50cm或距外科手术介入部位至少100cm的部位施用。

本领域技术人员会理解，本发明涉及外科手术前施用，使得提及“在外科手术介入部位处或其近侧”施用是指在外科手术开始后将(例如随后)经受外科手术介入的部位处或其近侧施用。提及“在外科手术介入部位远侧的部位处”施用是指在外科手术开始后将(例如随后)经受外科手术介入的部位远侧施用。

梭菌神经毒素可以在至多15个(优选至多10个)部位(例如外科手术介入部位近侧的部位)施用。此类部位可以横穿外科手术介入部位的周边。

在优选的实施方案中，待施用用于治疗人患者的外科手术疼痛的本发明的梭菌神经毒素的剂量(即治疗剂量)范围为约0.00025ng-约3ng。

在优选的实施方案中，梭菌神经毒素的治疗剂量范围为约0.0003ng-约2ng，优选约0.0004ng-约1.5ng、约0.0005ng-约1ng，仍然优选约0.0006ng-约0.5ng的所述梭菌神经毒素。

例如，包含BoNT/A的梭菌神经毒素的剂量(例如总剂量)优选范围为约1ng-约2ng。

可以给患者施用100-500U的梭菌神经毒素。例如，可以给患者施用150-300U的梭菌神经毒素；优选175-250U；更优选约200U。

可以给患者施用每千克(kg)患者体重80-250皮克(pg)的梭菌神经毒素(例如850-250pg/kg)。例如，可以给患者施用100-200pg/kg、115-175pg/kg或130-150pg/kg。

如上所述，梭菌神经毒素可以在一个或多个施用部位施用，例如在多于一个施用部位施用。在一个实施方案中，给患者每个施用部位施用2.5-30U的梭菌神经毒素；优选地，其中给患者每个施用部位施用20U的梭菌神经毒素。例如，10个施用部位可以接受每个施用部位20U的施用，提供200U的总施用。

可以以每个施用部位10-170pg的总剂量给患者施用梭菌神经毒素。在一个优选的实施方案中，可以每个施用部位以1-14pg/kg(体重)的剂量给患者施用梭菌神经毒素。

在另一个实施方案中，梭菌神经毒素的治疗剂量优选范围为约0.001ng-约2ng。然而，例如，梭菌神经毒素的治疗剂量优选范围为约0.0003ng-约0.05ng。

然而，应当理解，所需的剂量范围取决于梭菌神经毒素的确切性质、特定个体(例如人个体)中的最大耐受剂量、皮肤状况、施用途径、制剂的性质、患者的年龄、患者的体重、患者病症的性质、程度或严重程度、禁忌症(如果有的话)以及主治医师的判断。可以使用用于优化的标准经验例程来调整这些剂量水平的变化。

在一个实施方案中，给患者施用基于单一肉毒梭菌神经毒素血清型(例如BoNT/A)的单一疗法。因此，在一个实施方案中，本发明使用单一肉毒梭菌神经毒素血清型(例如BoNT/A)。

与本发明的多种方法相关的实施方案旨在同样适用于其它方法、梭菌神经毒素，例如改造的梭菌神经毒素(无论是单链还是双链形式)、用途或药物组合物，反之亦然。

序列同源性

可以使用多种序列比对方法中的任一种来确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和杂交方法，例如像区段逼近方法。确定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规方法。全局方法从分子的开始到结束比对序列，并且通过将各个残基对的得分相加并且通过施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括，例如CLUSTAL W，参见例如Julie D.Thompson等人,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity ofProgressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research4673-4680(1994)；和迭代精修，参见例如Osamu Gotoh,Significant Improvement inAccuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement asAssessed by Reference to Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴定由所有输入序列共享的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括，例如匹配框，参见例如Eric Depiereux and Ernest Feytmans,Match-Box:AFundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of SeveralProtein Sequences,8(5)CABIOS 501 -509(1992)；Gibbs采样，参见例如C.E.Lawrence等人,Detecting Subtle Sequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for MultipleAlignment,262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见例如Ivo Van WaIIe等人,Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。

因此，通过常规方法测定序列同一性百分比。参见例如Altschul等人,Bull.Math.Bio.48:603-16,1986，以及Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-19,1992。简言之，使用空位开放罚分10、空位延伸罚分1和如下所示的Henikoff和Henikoff(同上)的“blosum 62”评分矩阵(氨基酸由标准单字母代码表示)比对两个氨基酸序列以优化比对评分。

两个或多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是序列共有的相同位置的数目的函数。因此，％同一性可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数，乘以100。序列同一性％的计算还可以考虑空位的数量，以及需要引入以优化两个或更多个序列的比对的每个空位的长度。序列比较和两个或更多个序列之间的同一性百分比的确定可以使用本领域技术人员熟悉的特定数学算法(例如BLAST)进行。

用于测定序列同一性的比对评分

然后将同一性百分比计算为：

基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些变化优选具有较小的性质，即保守氨基酸取代(参见下文)和不显著影响多肽的折叠或活性的其它取代；小缺失，通常为1至约30个氨基酸；和小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基、至多约20-25个残基的小接头肽或亲和标记物。

保守氨基酸取代

碱性：精氨酸；赖氨酸；组氨酸

酸性：谷氨酸；天冬氨酸

极性：谷氨酰胺；天冬酰胺

疏水性：亮氨酸；异亮氨酸；缬氨酸

芳族：苯丙氨酸；色氨酸；酪氨酸

小：甘氨酸；丙氨酸；丝氨酸；苏氨酸；甲硫氨酸

除20种标准氨基酸之外，非标准氨基酸(例如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。

非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟基乙基高-半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌啶酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域已知用于将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质中的几种方法。例如，可以采用体外系统，其中使用化学氨基酰化的抑制子tRNA抑制无义突变。用于合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是本领域已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译在包含大肠杆菌S30提取物和市售酶和其它试剂的无细胞系统中进行。通过色谱法纯化蛋白质。参见例如Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman等人,Methods Enzymol.202:301,1991；Chung等人,Science 259:806-9,1993；和Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨基酰化的抑制子tRNA在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等人,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法中，在不存在待替代的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)和存在所需的非天然存在的氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸掺入多肽中以替代其天然对应物。参见Koide等人,Biochem.33:7470-6,1994。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化为非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变组合以进一步扩大取代范围(Wynn和Richards,Protein Sci.2:395-403,1993)。

有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本发明多肽的氨基酸残基。

本发明的多肽中的必需氨基酸可以根据本领域已知的程序鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,Science 244:1081-5,1989)。生物相互作用的位点也可以通过结构的物理分析来确定，如通过例如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记的技术结合推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等人,Science 255:306-12,1992；Smith等人,J.Mol.Biol.224:899-904,1992；Wlodaver等人,FEBS Lett.309:59-64,1992。还可以从与本发明多肽的相关组分(例如易位或蛋白酶组分)的同源性分析推断必需氨基酸的身份。

可以使用已知的诱变和筛选方法进行和测试多个氨基酸取代，例如Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)中公开的那些。简言之，这些作者公开了用于同时随机化多肽中的两个或更多个位置，选择功能性多肽，然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置处可允许的取代谱的方法。可以使用的其它方法包括噬菌体展示(例如Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner等人,美国专利号No.5,223,409；Huse,WIPO公布号WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,Gene 46:145,1986；Ner等人,DNA 7:127,1988)。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY,20ED.,John Wiley and Sons,New York(1994)，和Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。

本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实践或测试本公开的实施方案。数值范围包括限定范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列以5’至3’方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基取向从左至右书写。

本文提供的标题不是对本公开的多个方面或实施方案的限制。

氨基酸在本文中使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来提及。本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的字母代码根据IUPACIUB生物化学命名联合委员会(JCBN)定义。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一个核苷酸序列编码。

术语的其它定义可以出现在整个说明书中。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本公开不限于所描述的特别实施方案，并且因此可以改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特别实施方案的目的，并不旨在限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。

在本文中提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的单位的十分之一的每个中间值。在所述范围内的任何所述值或中间值与所述范围内的任何其它所述值或中间值之间的每个更小范围都包含在本公开内。还应当理解，本文中由表述“从a至b”表示的任何数值范围意指从a延伸至b的数值范围(即，包括严格的端点a和b)。

除此之外，术语“约”在本文中应理解为加或减(±)5％，优选±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5％、±0.1％的与其一起使用的数字的数值。

必须注意，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。因此，例如提及“肉毒梭菌神经毒素”包括多种此类候选物质，并且提及“肉毒梭菌神经毒素”包括提及一种或多种梭菌神经毒素及本领域技术人员已知的其等同物等。

提供本文所讨论的出版物仅是因为它们在本申请的提交日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被解释为承认这些出版物构成所附权利要求的现有技术。

附图简述

现在将参考以下附图和实施例仅通过举例的方式描述本发明的实施方案。

图1显示沿着外科手术切口的注射部位的示意图，其中注射了Dysport、盐水或参考化合物Exparel。

图2显示用于运动活动的旷场测试的场地的示意图。

图3显示围外科手术期施用皮内注射盐水、Expare l(对照剂)或不同浓度的Dysport(100、200和400U)对减轻外科手术后疼痛和焦虑的作用。进行Von Frey测定作为外科手术疼痛感知的量度，并且结果显示在(A)中。横切图的水平线(设定为26g)指示未感测到外科手术疼痛的基线(例如，阈值，高于该阈值，个体的外科手术后疼痛可以被认为是治疗的)。当机械灵敏度为0-15g时，疼痛可以定义为中度/重度，当在15-26g之间时，为轻度/中度，当高于26g时，为几乎没有/无疼痛。(B)中显示了猪在围外科手术期皮内施用Exparel或Dysport后接近其处理者所花费的时间(以秒计)。在围外科手术期施用Exparel或Dysport后对痛苦行为进行评分，并且显示在(C)中。

图4显示在围外科手术期皮内注射盐水、Exparel(对照剂)或不同浓度的Dysport(100、200和400U)后，动物在5分钟内行走的平均组总行走距离(以米计)(A)和在旷场装置的中心区域中花费的平均时间百分比(B)。

图5显示在外科手术前15天(A)、5天(B)或1天(C)时，盐水(对照)与BoNT/A(Dysport)皮内施用的Von Frey测定。

图6显示在外科手术前15天(A)、5天(B)或1天(C)皮内施用盐水或Dysport(200U/猪)后猪接近其处理者的潜伏期(以秒计)。对于条形图(A-C)中的每个时间点(天)，左侧的条形图(较浅)显示Dysport处理的结果，右侧的条形图(较深)显示盐水处理的结果。

图7显示在外科手术前15天(A)、5天(B)或1天(C)皮内施用盐水或Dysport后猪的痛苦行为评分。对于条形图(A-C)中的每个时间点(天)，左侧的条形图(较浅)显示Dysport处理的结果，右侧的条形图(较深)显示盐水处理的结果。

图8显示在外科手术前15天(A)、5天(B)或1天(C)皮内施用盐水或Dysport后猪的总步行距离(以米计)。

图9显示在外科手术前15天(A)、5天(B)或1天(C)皮内施用盐水或Dysport后，在5分钟的时间期限内在旷场装置的中心区域中花费的时间的时程(单个值和中值)。

图10显示当通过皮内(A)、皮下(B)或肌内(C)注射施用时，盐水对比BoNT/A(Dysport)的Von Frey测定。对于测试的每种注射途径，每只猪施用总计200U的Dysport。

图11显示当通过皮内(A)、皮下(B)或肌内(C)注射施用盐水或BoNT/A(Dysport)时，猪接近其处理者的潜伏期(以秒计)。对于测试的每种注射途径，每只猪施用总计200U的Dysport。

图12显示当通过皮内(A)、皮下(B)或肌内(C)注射施用盐水或BoNT/A(Dysport)时猪的痛苦行为评分。对于测试的每种注射途径，每只猪施用总计200U的Dysport。

图13显示在皮内、皮下或肌内施用盐水或Dysport后动物在旷场中在5分钟的时间期限内行走的总距离(以米计)的时程(个体值和平均值±SEM)。

图14显示在皮内、皮下或肌内施用盐水或Dysport后在旷场装置的中心区域中花费的时间(百分比)的时程(个体值和平均值±SEM)。

图15显示具有小动脉周围的小神经(A)、竖毛肌中的神经末梢(B)和真皮中的中小型神经(C)的皮肤样品中SNAP-25的免疫组织化学染色。

图16显示未处理时猪脊髓中裂解的SNAP-25的免疫组织化学染色(A)和用DySport处理的猪的同侧角(B)或对侧角(C)中裂解的SNAP-25染色。

图17显示当未处理(A、C)或皮内注射Dysport(B、D)施用时猪脊髓中降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质的表达水平。

图18显示当未处理或皮内注射Dysport施用时，猪脊髓中Iba1(A，B)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(C，D)的表达水平。

图19显示在外科手术前15天皮内施用盐水(对照)或BoNT/A(Dysport)或在外科手术当天(D1)皮内施用Exparel以及当猪在左腿经受外科手术切口时的Von Frey测定(A)，相对于盐水组，使用单因素ANOVA，然后进行Tukey检验：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。Dysport相对于Exparel组，使用单因素ANOVA，然后进行Tukey检验：#p<0.05；##p<0.01；####p<0.0001。$$p<0.01：外科手术后时间点对比第-4天，使用配对T-检验)。(B)显示了在外科手术前15天皮内施用盐水(对照)或BoNT/A(Dysport)皮内施用或在外科手术当天(D1)皮内施用Exparel后，以及当猪在左腿中经受外科手术切口时，猪接近其处理者的潜伏期(以秒计)($$p<0.01：外科手术后时间点对比第-4天，使用配对T-检验。￡￡￡p<0.001：第-16天对比第-4天，使用配对T-检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，治疗组对比盐水组，使用单因素ANOVA，随后Tukey检验)。(C)显示了在外科手术前15天皮内施用盐水(对照)或BoNT/A(Dysport)皮内施用或在外科手术当天(D1)皮内施用Exparel后，以及当猪在左腿中经受外科手术切口时的猪的痛苦行为评分(*p<0.05；**p<0.01和***p<0.001，与盐水组对比，使用单因素ANOVA，然后进行Tukey检验。$$p<0.01，$p<0.05：外科手术后时间点对比第-4天，使用配对T-检验)。

图20显示采集用于免疫组织化学染色的组织样品(福尔马林固定的石蜡包埋的组织)和从脊髓收集组织样品的特定区域的概括。

图21显示在左腿具有外科手术切口的猪的皮肤(A)、肌肉(B)和背根神经节(C)中裂解的SNAP-25的免疫组织化学染色。

图22显示在左腿外科手术切口(A)的猪的脊髓中腰椎L5-L6的同侧背角中裂解的SNAP-25染色和放大视图(B)。

图23显示用于确定裂解的SNAP-25染色强度的分级标度。裂解的SNAP-25染色以1-3的等级分级，其中0级＝无裂解的SNAP-25染色，1级＝低强度裂解的SNAP-25染色，2级＝平均裂解的SNAP-25强度染色，3级＝高强度裂解的SNAP-25染色(A)。图23还显示脊髓的不同区域的染色强度的定量：腰椎L5-L6、L3-L4、L1-L2以及胸部和颈部区域。通过“H-评分”测量染色强度，并且通过阳性脊髓切片的％×背侧角中的染色强度计算(B)。

图24提供了采集的组织样品中裂解的SNAP-25染色的存在、“阳性”或不存在、“阴性”的概括。

序列表

当在任何以下SEQ ID NO中指示初始Met氨基酸残基或相应的初始密码子时，所述残基/密码子为任选的。

SEQ ID NO：1-BoNT/A1，保藏号A5HZZ9，氨基酸序列

SEQ ID NO：2-BoNT/B1，保藏号B1INP5，氨基酸序列

SEQ ID NO：3-BoNT/C1，保藏号P18640，氨基酸序列

SEQ ID NO：4-BoNT/D，保藏号P19321，氨基酸序列

/>

SEQ ID NO：5-BoNT/E1，保藏号WP_003372387，氨基酸序列

SEQ ID NO：6-BoNT/F1，保藏号Q57236，氨基酸序列

SEQ ID NO：7-BoNT/G，保藏号WP_039635782，氨基酸序列

SEQ ID NO：8-BoNT/DC，保藏号BAM65681，氨基酸序列

SEQ ID NO：9-BoNT/F7，氨基酸序列

SEQ ID NO：10-BoNT/AB_MY，氨基酸序列

SEQ ID NO：11-BoNT/X，氨基酸序列(GenBank:BAQ12790.1)

SEQ ID NO：12(未修饰的BoNT/A的核苷酸序列)

SEQ ID NO：13(未修饰的BoNT/A的多肽序列)

SEQ ID NO：14(修饰的BoNT/A“Cat-A”的核苷酸序列)

SEQ ID NO：15(修饰的BoNT/A“Cat-A”的多肽序列)

SEQ ID NO：16(修饰的BoNT/A“Cat-B”的核苷酸序列)

SEQ ID NO：17(修饰的BoNT/A“Cat-B”的多肽序列)

SEQ ID NO：18(修饰的BoNT/A“Cat-C”的核苷酸序列)

SEQ　 ID　 NO：19　(修饰的BoNT/A“Cat-C”的多肽序列)

SEQ ID NO：20(修饰的BoNT/A“Cat-D”的核苷酸序列)

SEQ ID NO：21(修饰的BoNT/A“Cat-D”的多肽序列)

实施例

材料和方法

动物模型

在以下研究中使用重11-13kg的雄性家猪。猪是研究外科手术后疼痛治疗的适合模型，因为猪皮肤在结构、厚度、神经支配、色素沉着、胶原和脂质组成、伤口愈合和免疫应答方面与人皮肤具有相似性。

Dysport的重构

在含有500U的小瓶中提供Dysport。对于给药，用盐水(0.9％NaCl)重构500U的小瓶。随后根据测试剂量用盐水进行稀释，如下：

2.5mL盐水用3mL注射器+21G针头抽取并且转移至Dysport 500U小瓶；浓度为200U/mL＝400U/2mL；将小瓶轻轻涡旋直至材料溶解。将每个小瓶左右倾斜2-3次(以确保溶液均匀性)；使用连接到30G针头的2个1mL注射器向猪给药2mL。该溶液用于400U的给药。

200U/2mL剂量的制备：

如上所述重构Dysport；使用3mL注射器和21G针头抽取2mL重构的Dysport 500U；使用3mL注射器和21G针头抽取2mL盐水；使用vacutainer小瓶混合上述2种溶液；将混合溶液左右倾斜5-6次(以确保溶液均匀性)；使用连接到30G针头的2个1mL注射器向猪给药2mL。

100U/2mL剂量的制备：

如上所述重构Dysport；使用3mL注射器和21G针头抽取2mL重构的Dysport 500U；使用3mL注射器和21G针头抽取2mL盐水；使用vacutainer小瓶混合上述2种溶液；将混合溶液左右倾斜5-6次(以确保溶液均匀性)；使用3mL注射器和21G针头从vacutainer小瓶中抽取2mL制备的溶液；使用3mL注射器和21G针头抽取2mL盐水；使用新的vacutainer混合上述2种溶液；将混合溶液左右倾斜5-6次(以确保溶液均匀性)；使用连接到30G针头的2个1mL注射器向猪给药2mL。

外科手术后疼痛的诱导

用通过面罩递送的异氟烷/氧气混合物麻醉猪。使用Septol和Polydine(Lodo-Vit)溶液清洁切口区域。在左胁腹中朝向猪的尾端和脊柱线侧面3cm处(第1天)制作6-7cm长的皮肤切口，或在左腿中制作7cm长的皮肤切口。然后切割筋膜并且缩回肌肉(Castel等人,Characterization of a porcine model of post-operative pain,Eur.J.Pain.2014,18(4),496-505；通过引用并入本文)。然后用3-0Vicryl线缝合皮下组织。使用连续缝合方法用3-0丝线缝合皮肤。在切口闭合和材料注射后，猪接受抗生素(Marbocyl 10％)。切口区域覆盖有3％的Syntomicine薄层。在外科手术和给药期间(约20分钟)将动物保持在麻醉下。外科手术后，将动物放回围栏进行恢复和观察。

治疗

Dysport的围外科手术期皮内施用

对于围外科手术期施用，在缝合左胁腹中形成的切口后立即注射动物。使用附接到1mL注射器的30G针头将Dysport(测试项目)、盐水(阴性对照)或参考化合物Exparel(阳性对照)通过皮内(或对于Exparel皮下)注射并且注入切口周围的10个部位。以固定的给药体积和固定的给药水平注射每个部位。更详细地，注射(以2cm间隔)左胁腹中7cm水平切口/缝合线的每一侧的4个部位(例如8个部位)，左胁腹中切口/缝合线的每一端的部位也是如此(参见图1)。如下评估以下试验组：

组编号	治疗	动物数量	给药体积	每只动物的给药水平
					1	盐水	6	200μL/注射部位	盐水
2	Exparel	6	20mL	266mg
					3	Dysport	6	200μL/注射部位	100U
4	Dysport	6	200μL/注射部位	200U
					5	Dysport	6	200μL/注射部位	400U

Dysport的皮内围外科手术期施用

对于外科手术前注射，由于在切口前(在猪的左胁腹或左腿中)以2mL的固定总体积注射动物，所以首先将进一步切口的位置纹身。使用附接到1mL注射器的30G针头皮内注射Dysport(测试项目)或盐水(阴性对照)并且注射到切口周围的10个部位。以固定的给药体积和固定的给药水平注射每个部位。在外科手术前15天、5天或1天进行施用。如下评估以下试验组(当在猪的左胁腹中进行切口时)：

如下评估以下试验组(当在猪的左腿中进行切口时)：

通过皮内、肌内或皮下途径施用Dysport

在切口前15天注射动物时，对进一步切口的位置进行纹身。使用附接到1mL注射器的30G针头注射Dysport(测试项目)或盐水(阴性对照)并且注射到切口周围的10个部位。以固定的给药体积和固定的给药水平注射每个部位。通过皮内、皮下或肌内途径进行施用。

如下评估以下试验组：

Von Frey测定

在第1天外科手术后1、2、4和6小时注射Dysport/盐水后，在健康的未外科手术动物中进行Von Frey测定，并且每天一次持续10天。将Von Frey细丝(Ugo Basile,Italy)施加到胁腹或腿部皮肤表面的切口线近侧～0.5cm处。随着细丝的克数增加，胁腹皮肤或腿部皮肤上的力增加。使用的最大力为60g。施加细丝直到动物从刺激中撤出。每根细丝施加3-5次。如果没有实现抽出，则施加更粗的细丝。如果实现抽出，则施加更细的细丝(更粗或更细是指更高/更大或更低/更小的克力)。通过交替细丝粗细，测定并且记录实现抽出反应所需的力。将Von Frey细丝的尺寸和力概述于下表中：

选择标准：如果基线时的胁腹抽出力≥26g(优选60g)，则将动物包括在本研究中。外科手术后，如果胁腹抽出力≤10g，则认为存在疼痛(异常性疼痛)。如果动物不符合该标准，则将其从本研究中排除。由于外科手术前相对低的阈值(≤10g)，因此，一只动物被排除在本研究之外。

如果基线时的腿抽出力≥13g，则将动物包括在研究中。外科手术后，如果腿抽出力≤2g，则认为存在疼痛(异常性疼痛)。如果动物不符合该标准，则将其从本研究中排除。

临近时间测试

在给药猪之前，进行临近时间(AT)测试的研究人员第一次进入围栏。当有人进入其围栏时，猪的正常行为是远离入侵者移动然后接近人。猪与人越熟悉，感觉越舒适，它们接近所花费的时间越短。以秒为单位测量接近进入其围栏的研究人员的潜伏期(截止时间为120秒)。该测试在早晨、早晨喂养后至少1小时(上午6:30)在痛苦行为评分之前和习惯化期间进行。

痛苦行为评分

切口后，动物的行为发生变化。当接近时，动物离开研究人员进入其围栏，倾向于保护切口侧，有时使用发声。这是在这种类型的外科手术后观察到的主要现象，在极少数情况下，动物变得不安或显示出隔离行为。痛苦行为评分为0(正常)至7(非常痛苦)。痛苦行为分数测试在接近时间测试之后立即进行。在早晨期间在其围栏中监测动物的一般行为。痛苦行为评分还允许评估动物的总体健康状态。由对治疗不知情的观察者对动物的行为进行评分，其中总评分是下表中所示的所有部分的总和。

行为评分的评估不是以特定顺序进行的，而是根据动物的总自发行为进行的。

运动活力的旷场试验

旷场是2.5m宽和4.7m长的矩形场所。场所的壁是光滑的并且高1.6m。在测试的早晨，将来自所有组的动物一次一只地单独引入旷场，持续5分钟(5)。使用CCTV摄像机记录动物的运动活力，并且用Anymaze软件(Stoelting Co.)分析。在围栏中进行的行为测试(即接近时间、痛苦行为和Von Frey)结束时进行旷场测试。在每个旷场试验之后，分析以下参数：总步行距离(m)和在区域中心(区域E，参见图2)花费的时间百分比。

痛苦的动物和疼痛中的动物通常走得更接近围栏或旷场装置的壁。没有痛苦的动物不会犹豫进入旷场装置的中心。

实施例1

围外科手术期施用Dysport在外科手术后提供延迟的镇痛和抗焦虑作用(在猪的 左胁腹上切口)

在缝合猪左胁腹上形成的切口后(即围外科手术期)立即向猪皮内注射施用盐水、Exparel(266mg固定剂量)或不同浓度的Dysport。通过von Frey测定测量猪的机械敏感性，作为外科手术后疼痛治疗的评估。当与盐水处理组相比时，Exparel显示持续1小时的镇痛作用，但之后未显示出有效的镇痛活性。施用400U的Dysport在外科手术后2天诱导中度镇痛作用。当给猪施用200U或400U的Dysport时，到外科手术后4天诱导更大的镇痛作用。所有测试的Dysport浓度在外科手术后6天完全抑制外科手术后疼痛。这表明Dysport为治疗外科手术后疼痛提供了有效且延长的镇痛作用。该数据示例在图3A中的条形图中。

测量猪接近其处理者的潜伏期。在切口时给猪皮内注射施用盐水、Exparel或不同浓度的Dysport。到外科手术后2小时，所有治疗组均显示接近其处理者的延迟。到6小时，皮内施用200U或400U的Dysport减少了猪接近其处理者所花费的时间，这些效果在外科手术后持续长达5天，表明外科手术后痛苦和焦虑样反应的潜在降低。用盐水或Exparel处理的猪在接近其处理者方面没有显示任何改善，表明这些处理没有减少外科手术后痛苦和焦虑样反应。该数据示例在图3B中。

测定猪的痛苦行为评分。与盐水和Exparel处理组不同，施用100U、200U或400U的Dysport的猪在外科手术后2天显示其痛苦行为评分降低。该数据示例在图3C中。

旷场测试显示在外科手术前和外科手术后盐水处理后动物行走的总距离之间无差异。用Exparel或Dysport处理在给药后3天不影响总步行距离，表明外科手术后动物的运动功能没有变化。该数据示例在图4A中。用400U DySport处理的动物在旷场装置的中心花费更多时间，不过，这种差异在统计学上无显著性(参见图4B)。

实施例2

当在猪的左胁腹进行外科手术切口时Dysport的外科手术前施用诱导更快的镇痛 作用并且抑制外科手术后痛苦和焦虑样反应的出现

由于围外科手术期施用Dysport显示出诱导镇痛作用的延迟，因此测量了外科手术前施用Dysport的镇痛和抗焦虑作用。在外科手术(在猪的左胁腹中切口)前15天(参见图5A)、5天(参见图5B)或1天(参见图5C)，给猪皮内注射施用盐水或200U的Dysport。通过使用Von Frey测定，当在外科手术前15天施用Dysport时，观察到最快的镇痛作用，其中外科手术后疼痛在外科手术后1天减少。相比之下，当在外科手术前5天施用Dysport时，外科手术后疼痛在外科手术后5天减少。

当在外科手术前15天或5天皮内注射施用Dysport时，猪显示接近其处理者的时间减少(参见图6)。类似地，当在外科手术前15天或5天皮内注射施用Dysport时，猪显示出降低的痛苦行为评分(参见图7)。在外科手术前1天施用Dysport没有诱导有效的抗焦虑作用。这表明在外科手术前15天或5天外科手术前施用Dysport完全防止了外科手术后痛苦和焦虑样反应的出现。

治疗组(在外科手术前15天、5天或1天皮内注射Dysport)均未显示其外科手术后总步行距离的差异(参见图8)，这表明肌肉活动不受影响并且没有毒素的全身扩散。

在外科手术之前和之后，注射盐水的动物在旷场装置中心花费的时间百分比是相似的。在外科手术前15天用Dysport处理的动物在旷场装置的中心花费更多的时间(参见图9A)。当在外科手术前5天或1天施用时，盐水和Dysport处理的动物之间在中心区中花费的时间百分比无差异(参见图9B和图9C)。

实施例3

Dysport的皮内施用提供了减轻外科手术后疼痛和抑制外科手术后焦虑的出现的 有利途径

评估外科手术前15天不同途径的200U Dysport施用(皮内、皮下和肌内注射)在外科手术后诱导镇痛和抗焦虑作用的能力。令人惊奇的是，皮内施用提供了优于可选择途径的结果(实际上，通常观察到仅Dysport皮内施用途径显示快速的镇痛作用(参见图10)。Dysport施用的皮下和肌内途径对镇痛活性作用很小至没有作用。当在外科手术前15天皮内注射施用Dysport时，猪显示出接近其处理者的时间减少和痛苦行为评分降低(参见图11和图12)。这表明皮内施用途径在缓解外科手术后疼痛和防止外科手术后痛苦和焦虑样反应的完全出现方面是有效的。

在所有盐水组中，外科手术后记录的步行距离与外科手术前记录的步行距离相同。此外，用Dysport处理及其施用途径(皮内、皮下或肌内途径)不影响外科手术后的总步行距离(参见图13)。

注射盐水的动物在旷场装置中心花费的时间百分比在外科手术前后是相似的。在不同的施用途径之间，动物在旷场装置中心花费的时间百分比无差异(参见图14)。

实施例4

SNAP-25裂解发生在脊髓的同侧背角中在Dysport注射远侧的位置

为了评估Dysport(皮内注射)的作用机制，对外科手术切口部位(猪的左胁腹)和脊髓处的组织样品进行免疫组织化学。在皮肤样品的神经中未检测到裂解的SNAP-25(参见图15)。出乎意料的是，在脊髓的同侧背角中可见裂解的SNAP-25(参见图16)，表明脊髓中的BoNT/A活性，并且可以通过脊髓中的中心效应提供外科手术后疼痛/焦虑控制。这也突出了Dysport可以通过鞘内施用直接施用到脊髓中。

通过免疫组织化学染色评估脊髓中参与疼痛调节的两种神经肽降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质的表达水平。与未处理的相比，两种神经肽在用Dysport处理的猪的脊髓中均未显示其表达水平的差异(参见图17)。

与未处理的相比，小胶质细胞活化标志物Iba1的表达水平在用Dysport处理的猪的脊髓中降低(参见图18A、B)。类似地，与未处理的相比，用Dysport处理的猪的脊髓中星形胶质细胞活化标志物GFAP的表达水平降低(图18C、D)。

实施例5

当在猪的左腿中进行外科手术切口时Dysport的外科手术前施用诱导快速镇痛作 用并且抑制外科手术后痛苦和焦虑样反应的出现

当对猪进行不同部位的外科手术切口(外科手术切口在左腿而不是左胁腹)时，测量外科手术前施用Dysport的镇痛和抗焦虑作用。在外科手术前15天给猪皮内注射施用盐水或200U的Dysport或在外科手术当天(第1天)向给猪施用Exparel(参见图19A)(左腿的外科手术切口)。通过使用Von Frey测定，观察到快速镇痛作用，其中外科手术后疼痛在外科手术后1天减少，并且在第4天观察到机械性异常性疼痛的持久逆转。

与施用盐水和Exparel相比，当在外科手术前15天皮内注射施用Dysport时，猪(左腿有缝合切口)显示接近其处理者的时间减少(参见图19B)。类似地，与施用盐水和Exparel相比，当在外科手术前15天皮内注射施用Dysport时，猪(左腿有缝合切口)显示出降低的痛苦行为评分(参见图19C)。这表明在外科手术(左腿切口)前15天外科手术前施用Dysport完全防止了外科手术后痛苦和焦虑样反应的出现。

总之，本试验为在外科手术前15天施用Dysport时的快速镇痛和抗焦虑作用提供了进一步的支持。

实施例6

SNAP-25裂解发生在具有左腿外科手术切口的猪的脊髓的同侧背角中

为了评估当在猪的不同部位皮内施用Dysport时是否发生Dysport的相同作用机制，对外科手术切口部位(猪的左腿)和脊髓的不同区域的组织样品进行免疫组织化学(参见图20)。在切开和注射Dysport后5-7天采集的样品上，在皮肤样品的神经中未检测到裂解的SNAP-25(参见图21)。在脊髓的同侧背角中，特别是在腰椎区域L5-L6中可见裂解的SNAP-25(参见图22)，与在左胁腹进行外科手术切口的猪中的发现类似。这些发现指示脊髓中的BoNT/A活性，并且可以通过脊髓中的中心效应提供外科手术后疼痛/焦虑控制。当与在左胁腹进行外科手术切口的猪中裂解的SNAP-25染色相比时，裂解的SNAP-25染色在同侧背角中的定位是不同的。

裂解的SNAP-25染色的强度以1-3的等级分级，其中0级＝无裂解的SNAP-25染色，1级＝低强度裂解的SNAP-25染色，2级＝平均裂解的SNAP-25强度染色，并且3级＝高强度裂解的SNAP-25染色(参见图23A)。基于所述分级系统，与对其左胁腹进行外科手术切口的猪相比，对其左腿进行外科手术切口的猪在同侧背角中具有更低强度的裂解的SNAP-25染色。

定量裂解的SNAP-25染色的强度(参见图23B)。计算H-评分作为裂解的SNAP-25染色强度的量度。通过将阳性脊髓切片％乘以背角中的染色强度来计算H-评分。在用Dysport处理(并且在左腿有外科手术切口)的猪中，与腰椎区域L3-L4和L1-L2以及脊髓的胸部和颈部区域(颈部区域具有裂解的SNAP-25染色的痕迹)相比，在腰椎区域L5-L6的脊髓中观察到裂解的SNAP-25的最高染色(指定2级的裂解的SNAP-25强度染色)。在盐水或Exparel注射的猪中无裂解的SNAP-25染色的证据。

将上述免疫组织化学染色概括在图24中，并且证实在脊髓的局部区域中观察到SNAP-25裂解。局部区域L5-L6、L3-L4和L1-L2以及脊髓的胸部和颈部区域测试为裂解的SNAP-25染色阳性，而其余的组织(包括皮肤，在注射部位)测试为裂解的SNAP-25染色阴性。

上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的多种修饰和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应过度限于此类具体实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的多种修饰旨在落入所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 益普生生物制药有限公司

<120> 治疗外科手术后疼痛的方法

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<150> GB2011055.7

<151> 2020-07-17

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ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260

ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320

agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380

gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440

atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500

cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560

agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620

aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680

cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740

cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800

gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860

gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920

ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980

gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040

ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100

aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160

gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220

gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400

attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580

cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgcaagcaa gatcaacatc 2700

ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760

tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaac gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820

ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acagcattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc caagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000

tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

aataaccgtc tgaataacag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaacatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360

aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420

ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480

atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540

tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600

ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660

gtggttatga agagcaagaa cgaccagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780

ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840

agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888

<210> 13

<211> 1296

<212> PRT

<213> 肉毒梭菌

<400> 13

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

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Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

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Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

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Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

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Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

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Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 14

<211> 3888

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-A"的核苷酸序列

<400> 14

atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60

tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720

cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960

tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200

tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260

ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320

agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380

gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440

atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500

cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560

agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620

aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680

cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740

cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800

gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860

gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920

ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980

gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040

ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100

aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160

gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220

gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400

attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580

cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

ctgcgttacg agagcaagca tctgattgat ctgagccgtt atgctagcaa gatcaacatc 2700

ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760

tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaag gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820

ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acaagattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc aaagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000

tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

aataaccgtc tgaataagag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaagatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360

aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420

ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480

atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540

tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600

ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660

gtggttatga agagcaagaa cgacaagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780

ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840

agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888

<210> 15

<211> 1296

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-A"的多肽序列

<400> 15

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

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Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

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Leu Arg Tyr Glu Ser Lys His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

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Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

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Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Lys Glu

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Leu Asn Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

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Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile

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Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

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Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

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Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

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Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

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Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

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Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

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Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

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Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

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Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

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Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

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Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

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Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

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Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

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Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

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Arg Pro Leu

1295

<210> 16

<211> 3888

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-B"的核苷酸序列

<400> 16

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gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

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gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

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gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

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tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080

ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140

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gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

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aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

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cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640

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tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060

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<210> 17

<211> 1296

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-B"的多肽序列

<400> 17

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

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Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

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Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

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Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

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Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

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Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

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Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

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Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

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Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

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Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

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485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

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Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

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His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Lys Lys Ile Ser Leu Asn Asn

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Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

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980 985 990

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995 1000 1005

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Leu Asn Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

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Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

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Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

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Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

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1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 18

<211> 3888

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-C"的核苷酸序列

<400> 18

atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60

tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120

aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180

ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240

gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300

acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360

agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420

gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480

atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540

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gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660

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cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780

gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840

gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900

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cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560

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ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100

aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160

gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220

gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280

aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340

atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400

attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460

aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520

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<211> 3888

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-D"的核苷酸序列

<400> 20

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ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600

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tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020

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ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acagcattag cctgaacaac 2880

gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940

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aataaccgtc tgaataacag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120

attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaacatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180

cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240

gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300

tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360

aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420

ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480

atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540

tacatcaacg tggtcgtgaa gcgtaaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600

ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctcgtg tccgtcgtct gagccaagtc 3660

gtggttatga agagcaagaa cgaccagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720

gaccgtcgtg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780

ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgcc gtagccgtcg tttgggctgt 3840

agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888

<210> 21

<211> 1296

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的BoNT/A "Cat-D"的多肽序列

<400> 21

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

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Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

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210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

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Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

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275 280 285

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675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

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Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

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Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

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Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Arg

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Arg Val Arg Arg Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Arg Arg Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Arg Ser Arg Arg Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

Claims (29)

1.用于治疗患者的外科手术后疼痛的梭菌神经毒素，所述方法包括在外科手术前多于5天给患者施用梭菌神经毒素，并且其中通过下列方式施用梭菌神经毒素：

i)皮内；或

ii)鞘内。

2.用于治疗患者的外科手术后疼痛的方法，所述方法包括在外科手术前多于5天给患者施用梭菌神经毒素，并且其中通过下列方式施用梭菌神经毒素：

i)皮内；或

ii)鞘内。

3.根据权利要求1的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2的方法，其中在外科手术前6-50天；优选在外科手术前10-20天施用梭菌神经毒素。

4.根据权利要求1或3的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2或3的方法，其中在外科手术前14-16天，优选在外科手术前约15天施用梭菌神经毒素。

5.根据权利要求1、3或4任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-4任一项的方法，其中梭菌神经毒素的施用基本上降低了患者的外科手术后疼痛感知，并且其中降低的外科手术后疼痛感知在外科手术后立即维持24小时。

6.根据权利要求1或3-5任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-5任一项的方法，其中基本上所有降低的外科手术后疼痛感知在外科手术后立即维持3天，在外科手术后立即维持5天，在外科手术后立即维持7天，优选在外科手术后立即维持8天。

7.根据权利要求5或6的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求5或6的方法，其中所述在外科手术后立即的限定时间点观察到的疼痛感知水平的降低是施用梭菌神经毒素后的任何时间观察到的疼痛感知降低的最高水平的至少50％，优选施用梭菌神经毒素后的任何时间观察到的疼痛感知降低的最高水平的至少75％。

8.用于减轻或抑制外科手术后焦虑的梭菌神经毒素，所述方法包括在外科手术前给患者施用梭菌神经毒素，其中通过下列方式施用梭菌神经毒素：

i)皮内；或

ii)鞘内。

9.用于减轻或抑制外科手术后焦虑的方法，所述方法包括在外科手术前给患者施用梭菌神经毒素，其中通过下列方式施用梭菌神经毒素：

i)皮内；或

ii)鞘内。

10.根据权利要求8的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求9的方法，其中在外科手术前5天或更多天施用梭菌神经毒素；优选其中在外科手术前多于5天施用梭菌神经毒素。

11.根据权利要求8或10的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求9或10的方法，其中梭菌神经毒素的施用基本上降低了患者的外科手术后焦虑感知，并且其中所述降低的外科手术后焦虑感知在外科手术后立即维持24小时。

12.根据权利要求11的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求11的方法，其中基本上所有降低的外科手术后焦虑感知在外科手术后立即维持2天，在外科手术后立即维持5天，在外科手术后立即维持7天，优选在外科手术后立即维持9天。

13.根据权利要求1、3-8或10-12任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-12任一项的方法，其中梭菌神经毒素治疗外科手术后疼痛并且减轻或抑制外科手术后焦虑。

14.根据权利要求1、3-8或13任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或13任一项的方法，其中所述外科手术后疼痛由外科手术介入引起，并且其中梭菌神经毒素在外科手术介入部位远侧的部位施用。

15.根据权利要求14的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求14的方法，其中外科手术切口的远侧部位距外科手术介入部位至少15cm、50cm或100cm。

16.根据权利要求1、3-8或10-15任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-15任一项的方法，其中在施用后，梭菌神经毒素通过逆向转运行进至脊髓并且在所述脊髓中实现SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)。

17.根据权利要求1、3-8或10-16任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-16任一项的方法，其中梭菌神经毒素在皮内部位施用，并且其中在施用梭菌神经毒素后，在所述皮内部位处或附近观察到所述梭菌神经毒素的最小SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)或未观察到所述梭菌神经毒素的SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)。

18.根据权利要求1、3-8或10-16任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-16任一项的方法，其中梭菌神经毒素在脊髓的鞘内空间中的部位施用，并且其中在施用梭菌神经毒素后，在所述位点处或附近观察到所述梭菌神经毒素的最小SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)或未观察到所述梭菌神经毒素的SNARE蛋白质裂解(SNAP-25蛋白质裂解)。

19.根据权利要求1、3-8或10-18任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-18任一项的方法，其中外科手术介入包括对皮肤和/或筋膜和/或肌肉的切口，优选其中外科手术介入由对皮肤的切口组成。

20.根据权利要求1、3-8或10-19任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-19任一项的方法，其中梭菌神经毒素为肉毒梭菌神经毒素(BoNT)。

21.根据权利要求1、3-8或10-20任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-20任一项的方法，其中梭菌神经毒素为肉毒梭菌神经毒素血清型A(BoNT/A)。

22.根据权利要求1、3-8或10-21任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-21任一项的方法，其中外科手术后疼痛为急性外科手术后疼痛。

23.根据权利要求1、3-8或10-22任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-22任一项的方法，其中外科手术后疼痛为慢性外科手术后疼痛。

24.根据权利要求1、3-8或10-23任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-23任一项的方法，其中所述用途或所述方法不包括肌内施用梭菌神经毒素。

25.根据权利要求1、3-8或10-24任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-24任一项的方法，其中给患者施用100-500U的梭菌神经毒性；优选其中给患者施用200U的梭菌神经毒素。

26.根据权利要求1、3-8或10-25任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-25任一项的方法，其中给患者施用1-3ng总剂量的梭菌神经毒素。

27.根据权利要求1、3-8或10-26任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-26任一项的方法，其中给患者施用80-250pg的梭菌神经毒素/kg(体重)。

28.根据权利要求1、3-8或10-27任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-27任一项的方法，其中在多于一个施用部位施用梭菌神经毒素；优选其中给患者每个施用部位施用2.5-30U的梭菌神经毒素；更优选，其中给患者每个施用部位施用20U的梭菌神经毒素。

29.根据权利要求1、3-8或10-28任一项的用于所述用途的梭菌神经毒素或根据权利要求2-7或9-28任一项的方法，其中在多于一个施用部位施用梭菌神经毒素；优选其中给患者每个施用部位施用10-170pg的梭菌神经毒素；更优选每个施用部位1-14pg/kg体重。

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