CN114269384A - 调节肉毒杆菌神经毒素作用的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种调节肉毒杆菌神经毒素组合物的作用的方法，即加速肉毒杆菌神经毒素组合物起效和/或延长肉毒杆菌神经毒素组合物作用持续时间和/或增强肉毒杆菌神经毒素组合物的作用强度，所述方法包括向所述肉毒杆菌神经毒素组合物中添加至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂。本发明还涉及包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和肉毒杆菌神经毒素的组合物，以及它们用于处理美容状况或治疗性状况的用途。

Description

调节肉毒杆菌神经毒素作用的组合物
本专利申请要求于2019年6月21日提交的欧洲专利申请EP EP19181635.4的优先权权益，其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和肉毒杆菌神经毒素的组合物，以及所述组合物用于各种治疗和/或美容目的的用途。此外，所述组合物和使用这些组合物的方法提供了有利的治疗，导致肉毒杆菌神经毒素作用的增强，例如加速其起效和/或延长其作用持续时间和/或增强其作用强度。
背景技术
BoNT的结构
肉毒杆菌神经毒素是损害神经元传递的毒素，其优先作用于胆碱能神经元；因此，肉毒杆菌神经毒素作用的主要后果之一是由于神经元刺激减少而导致的肌肉松弛。肉毒杆菌神经毒素是由厌氧产孢细菌肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)产生的复合物，并在较小程度上由其他梭菌属产生，例如丁酸梭状芽孢杆菌(C.butyricum)、巴氏梭状芽孢杆菌(C.barati)、产孢梭状芽孢杆菌(C.sporogenes)和阿根廷梭状芽孢杆菌(C.argentinense)。鉴定出八种不同血清型的肉毒杆菌神经毒素，分别为A型(BoNT/A)、B型(BoNT/B)、C型(BoNT/C)、D型(BoNT/D)、E型(BoNT/E)、F型(BoNT/F)、G型(BoNT/G)和X型(BoNT/X)。目前分别有8种已知的BoNT/A亚型、8种已知的BoNT/B亚型、12种已知的BoNT/E亚型和9种已知的BoNT/F亚型。A型、B型、E型和F型对人类有毒，而C型、D型和G型更通常在例如鸟类、马、牛和灵长类动物中引起毒性。在1995年日本婴儿肉毒杆菌中毒的病例报告后，最近才描述了X型(Zhang et al.,Nature Communications,volume 8,14130(2017))。
肉毒杆菌神经毒素复合物以包含两种成分的高分子量蛋白质复合物的形式存在；即具有酶活性的神经毒素成分和相关的无毒细菌蛋白质成分，所述无毒细菌蛋白质成分可视为包括血凝素蛋白和非血凝素蛋白的外壳蛋白。肉毒杆菌毒素复合物的分子量在不同的肉毒杆菌毒素血清型之间不同，为约300kDa到约900kDa不等；不包含所述无毒细菌蛋白质成分的肉毒杆菌神经毒素的分子量为约150kDa。关于美容或治疗的应用，据报道外壳蛋白没有显著的功能，也不会产生神经毒性。所述神经毒素成分表达为无活性的单链前体，其分子量在所有已知的肉毒杆菌神经毒素血清型中为约150kDa。这种单链前体被蛋白水解裂解激活，生成二硫键连接的双链蛋白。约50kDa的轻链蛋白包含催化结构域，是一种含锌金属蛋白酶，并且充当锌内肽酶。约100kDa的重链蛋白包含易位结构域和受体结合结构域。所述重链介导与突触前胆碱能神经末梢的结合，特别是与运动终板或神经肌肉接头的突触前部分的结合，以及介导所述神经毒素内化到细胞中。
BoNT的作用机制
当到达效应组织(通常是神经肌肉接头)时，肉毒杆菌神经毒素重链介导由胆碱能神经元的优先摄取，这要归功于它与突触前受体(突触囊泡2蛋白)和具体神经节苷脂的双重结合。随后，肉毒杆菌神经毒素可以通过受体介导的内吞作用进入神经元细胞，并停留在神经元细胞的内吞囊泡内。囊泡酸化后，轻链转移到细胞质中并分裂。取决于BoNT血清型，轻链毒性部分能够裂解一种或多种形成SNARE蛋白复合物的蛋白质(即SNAP-25、突触融合蛋白和VAMP)。SNARE复合物通常能够使囊泡和质膜之间的膜融合，从而允许神经递质乙酰胆碱离开细胞。例如，通过释放突触间隙中的神经递质乙酰胆碱，将神经冲动传递到肌肉，这是肌肉收缩的信号。由于通过例如BoNT/A裂解形成所述复合物所必须的蛋白质阻止了SNARE复合物的形成，神经递质胞吐作用被阻断，特别是乙酰胆碱释放被阻止。因此，神经和肌肉(或其他效应组织)之间的传递被阻断。特别是，具有催化活性的肉毒杆菌神经毒素轻链能够在神经元细胞中持续数周，从而可以长期但可逆地抑制神经传递。
BoNT的医疗用途
肉毒杆菌神经毒素的天然特性是可逆地阻止乙酰胆碱从肌肉和其他效应组织(例如正交感神经和副交感神经系统中的分泌腺)中的突触前神经末梢释放，使其成为众多领域中控制肌肉(和其他效应组织)的过度刺激和相关疼痛的重要治疗选择。例如，BoNT/A目前在以下领域被用于治疗：运动障碍，特别是用于治疗痉挛和肌张力障碍，其中BoNT/A被详细描述为有效缓解肌张力障碍相关的疼痛；泌尿系统病症，特别是膀胱过度反应；分泌病症，即多汗症和流涎。此外，肉毒杆菌神经毒素目前用于各种美容适应症，例如平滑面部纹路或减少眉间纹、皱眉纹和眶周纹。
BoNT药物
尽管肉毒杆菌神经毒素在参与SNARE复合物蛋白的裂解时具有相似的金属蛋白酶活性，但根据它们的血清型，其可能具有不同的起效和/或作用持续时间。例如，BoNT/A和BoNT/F在2天内诱导小鼠后腿的完全局部麻痹，而BoNT/E在24小时内就可产生相同的作用。然而，BoNT/A诱导的神经肌肉麻痹在小鼠中的持续时间为28天，而E型毒素和F型毒素的持续时间仅分别为5天和8天。在人类中也观察到了类似的模式，尽管时间尺度不同：通常在一周内观察到BoNT-A的麻痹作用，并且所述麻痹作用可持续3个月到4个月(Davletov etal.,TRENDS in Neurosciences 28(2005)；pp.446-452)。与之相反，BoNT-E在人类中起效更快(24小时)，但持续时间更短(少于1个月)(Yoelin et al.,Plast Recontr Surg 142(2018)；pp.847e-855e)。
BoNT/A因其独特的特征和在人体内的活性，一直是关注的焦点。自1991年以来，美国食品和药物管理局(FDA)批准了几种商用的A型肉毒杆菌神经毒素。BoNT/A的可用形式包括
Figure BDA0003509450730000031
(Allergan)、
Figure BDA0003509450730000032
(Ipsen Biopharm)和
Figure BDA0003509450730000033
(Merz Pharmaceuticals)等。目前唯一可商用的其他BoNT血清型是BoNT/B
Figure BDA0003509450730000034
(Solstice Neurosciences)；不过，它的医学/美容用途只是传闻。时至今日，改进BoNT特性仍然是一个重要的目标，以便更好地满足医疗需求。
BoNT的限制性特性
BoNT的起效、作用持续时间和作用强度是影响其作为药物效用的关键特性。
起效
在美容适应症中，通常可以在注射BoNT/A的2天到3天后观察到皱纹的减少，而完全阻断(例如防止皱眉)需要大约2周至3周。接受治疗的受试者通常需要更快的起效。类似地，在BoNT/A的治疗用途(例如肌肉障碍的治疗)中，BoNT的更快起效显然对患者有益。从医生的角度来看，肌肉麻痹发生得更快将有助于对患者的监测：理想情况下，注射和监测应在同一天进行。
作用持续时间
延长BoNT的作用持续时间有利于在保持作用的同时间隔注射。首先要限制对患者造成身体和经济负担的注射次数。还要限制产生针对BoNT的中和抗体的风险，这可能会降低基于BoNT的进一步治疗的疗效，从而限制受试者的美容或治疗选择。因此避免密切重复注射BoNT，但这会导致BoNT在受试者体内不活跃的时期，从而导致患者依从性问题。
作用强度
增强BoNT的作用强度可以改善美容效果并减轻致残和疼痛状况。然而，增加BoNT的注射剂量可能会导致远离注射部位的BoNT扩散从而导致全身毒性。一种增加BoNT局部疗效而不相应增加其全身毒性的方法将是有益的。
改进的需要
因此，需要一种能够克服这些缺点的组合物，特别是需要一种包含肉毒杆菌神经毒素的组合物，所述组合物表现出更快的肉毒杆菌神经毒素的起效和/或延长的肉毒杆菌神经毒素作用持续时间和/或增强的肉毒杆菌神经毒素作用强度。
增强BoNT作用
BoNT分子
由于天然存在的BoNT具有局限性，因此增强这些神经毒素作用的第一个策略是修饰蛋白质本身；目前的重组技术提供了通过对BoNT序列进行修饰来优化其特性的可能性。主要方法包括结合来自不同BoNT的重链和轻链，从而产生嵌合神经毒素。过去几十年的无数尝试表明，BoNT作用的调节确实是可行的；然而，嵌合体的优化特性通常是接近母体BoNT之一的特性。例如，Wang等人(J Biol Chem.2008Jun 20；283(25)：16993-7002)描述了由BoNT/A和BoNT/E制成的嵌合神经毒素。值得注意的是，AE嵌合体(包含来自BoNT/A的轻链和来自BoNT/E的重链)的表现与BoNT/A相似，尽管表现出略微增强的作用强度和略微延长的作用持续时间。相反，EA嵌合体(包含来自BoNT/E的轻链和来自BoNT/A的重链)的表现与BoNT/E相似。
此外，替代方法旨在将BoNT/A与BoNT/B结合起来，以扩大神经毒素可能靶向的组织范围。最近的文献(Wang et al.,Biochem J.2012May 15；444(1)：59-67)和国际申请(WO2017/191315 A1)描述了这种嵌合体。
总之，先前对BoNT蛋白进行分子工程的尝试结果只是轻微地调节了BoNT的特性。因此要寻求替代方法。
BoNT递送
为了发挥其作用，首先BoNT必须到达靶细胞，即胆碱能神经元。因此，缩短BoNT扩散到靶组织所需的时间，或增加施用后存在于突触水平中的BoNT的持续时间和量，似乎是调节BoNT作用的有趣策略。Revance Therapeutics已经探索了此类方法，该公司开发了包含与细胞穿透肽家族相关的肽的BoNT/A制剂。几项专利和专利申请描述了这种制剂(即WO2002/07773或WO 2005/120546)。引人注目的是，根据动物模型实验，所述制剂似乎限制了BoNT/A的扩散并增强了BoNT/A的稳定性(Stone,et al.,Toxicon.2011Aug；58(2)：159-67)。
临床试验旨在通过将该制剂与不涉及肽的BoNT/A(未配制的)进行比较来证明该制剂的增强功效。然而，研究人员使用了比未配制的BoNT/A更高剂量的所述制剂(Carruthers et al.,Dermatol Surg.2017Nov；43(11)：1321-1331)；因此，在使用所述制剂时观察到的作用持续时间的延长可能仅归因于剂量的增加。
最后，最近的一篇综述(Hallett,M.,Toxicon.2015December 1；107(0 0)：64–67)强调了扩散作用对BoNT摄取的低影响。根据最新观察结果，BoNT向靶组织的递送主要由对流(注射后)驱动的。
总之，旨在调节BoNT递送的策略在增强BoNT作用方面的潜力可能有限。因此，仍然需要替代方法来实现这一目标。
BoNT生物学
另一种增强BoNT作用的策略可能是使用与BoNT作用机制(例如BoNT进入神经元、轻链易位到神经元细胞溶质等)相互作用的其他分子。
由于不同的BoNT具有一些共同的作用机制，因此尝试将具有不同特性的BoNT亚型组合起来很有吸引力，例如将BoNT/E的更快起效与BoNT/A的更长作用持续时间相结合，以便至少获得相加作用。值得注意的是，临床前实验(Meunier et al.,Molecular andCellular Neuroscience 22(2003)；pp.454-466)表明BoNT/A和BoNT/E的共同注射可诱导：i)短时起效(类似于单独的BoNT/E)，和ii)短作用持续时间(类似于单独的BoNT/E)。在人体中获得了类似的结果，其中在人体足部的趾短伸肌(EDB)肌肉中进行了BoNT注射。引人注目的是，BoNT/A和BoNT/E双注射的EDB肌肉恢复其功能的时间过程与注射BoNT/E的肌肉相似(Eleopra et al.,Neuroscience Letters 256(1998)；pp.135-138)。所有这些结果表明，两种BoNT的组合不能提供所预期的单独施用每种BoNT的作用相加的作用。现在可以理解，与其他BoNT相比，一些BoNT具有主导作用，因此阻止了具有附加特性的BoNT组合的使用。因此，BoNT的混合物不太可能成为改进目前广泛使用的BoNT/A药理学特征的治疗候选物。
与BoNT作用机制相互作用的其他候选物是神经毒素，所述神经毒素靶向与BoNT靶向相同的突触前区域。这种毒素存在于动物界，例如蛇神经毒素和蜘蛛神经毒素，它们可以可逆地麻痹运动轴突末梢，其结果与在BoNT中观察到的类似。然而，它们的尺寸和作用机制完全不同，导致神经肌肉接头阻滞的起效和持续时间完全不同。通常，与BoNT不同的是，这些突触前神经毒素会导致运动轴突末梢的急性快速退化，然后迅速恢复。同样，人们很容易想象这种突触前神经毒素和BoNT组合的治疗潜力。令人惊讶的是，当将突触前神经毒素注射到先前用BoNT/A或BoNT/B麻痹的肌肉中时，其会加速神经传递的恢复(Duregotti etal.,Toxins 7(2015),pp.5322-5336)。
与BoNT作用机制相互作用的其他候选物可以是调节突触前神经元活性的分子。值得注意的是，Thyagarajan等人(J Pharmacol Exp Ther.2009Nov；331(2)：361-71)报道了TRPV1通道的激活似乎会抑制BoNT进入突触前神经元，从而阻止BoNT的肌肉松弛作用；TRPV1是一种由突触前神经元表达的钙通道，通过使用辣椒素在本研究中被激活。尽管所表明的原理很有趣，但唯一观察到的作用是对BoNT作用的抑制：没有描述增强BoNT作用的分子。
总之，这些结果表明BoNT和突触前活性分子之间组合的治疗潜力非常有限。
有趣的是，迄今为止还没有将BoNT与作用于突触后水平的分子结合使用以增强BoNT作用的报道。
发明内容
发明人现在已经鉴定了一种通过将BoNT与神经元传递的突触后抑制剂(PoNT)结合来增强BoNT作用的方法，所述神经元传递的突触后抑制剂靶向i)骨骼肌、ii)平滑肌、iii)心肌、iv)分泌腺。
因此，本发明涉及一种用于增强肉毒杆菌神经毒素组合物的作用的方法，所述方法包括向所述肉毒杆菌神经毒素组合物中添加至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂。
肉毒杆菌神经毒素组合物的作用可以通过加速肉毒杆菌神经毒素的起效和/或延长肉毒杆菌神经毒素组合物的作用持续时间和/或增强肉毒杆菌神经毒素组合物的作用强度来增强。
在另一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(PoNT)和肉毒杆菌神经毒素(BoNT)。
本发明的所述组合物中使用的PoNT是突触后小分子和/或突触后肽，其特异性结合由效应组织(如肌肉或分泌腺)表达的突触后受体。
本发明的所述组合物中使用的肉毒杆菌神经毒素是A型肉毒杆菌神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、E型肉毒杆菌神经毒素或A型肉毒杆菌神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、E型肉毒杆菌神经毒素的重链和轻链的组合。
骨骼肌细胞表达的突触后受体选自包括以下或由以下组成的组：(α1)2β1δεnAChr、(α1)2β1δγnAChr、RyR1、CaV1.1和Nav1.4。
平滑肌细胞表达的突触后受体选自包括以下或由以下组成的组：M3 mAChrs、RyR2、CaV1.2和Nav1.5。
心肌细胞表达的突触后受体选自包括以下或由以下组成的组：M2 mAChr、RyR2、CaV1.1、CaV1.2和Nav1.5。
分泌腺细胞表达的突触后受体选自包括以下或由以下组成的组：M1 mAChR、M3mAChR、α1肾上腺素受体和β1肾上腺素受体。
本发明的所述组合物不仅结合了PoNT的快速起效与BoNT的延长的作用持续时间，而且PoNT协同增强BoNT的起效、作用持续时间和作用强度。
在所有实施方案中，所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂与肉毒杆菌神经毒素的延迟起效相容。
在具体实施方案中，所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂是快速起效的突触后肽和/或快速起效的突触后小分子。
本发明的所述组合物还可用于美容处理，例如减少皱纹(wrinkle)、细纹(如眉间纹)、或凹沟(furrow)、出于美容目的减少肌肉体积(如咬肌或腓肠)、减少肥厚性疤痕和其他皮肤状况。
本发明的所述组合物还可用于治疗性治疗，例如治疗(i)骨骼肌病症，包括运动障碍、肌张力障碍、颈部肌张力障碍、痉挛性斜颈、局灶性肌张力障碍、手部局灶性肌张力障碍、睑痉挛、眼睑障碍、斜视、痉挛(spasticity)、脑瘫、局灶性痉挛、肢体痉挛、肌痉挛(spasm)、半面痉挛、震颤、抽搐、磨牙症、失用症和步态僵硬以及(ii)与这些病症相关的疼痛。
本发明的所述组合物还可用于治疗(i)平滑肌病症，包括痉挛性发声困难、喉部肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、舌肌张力障碍和其他发声障碍、贲门失弛缓症、吞咽困难、食道疼痛(esophagia)、胃轻瘫、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、膀胱过度反应(overreactivebladder)、间质性膀胱炎、良性前列腺增生、泌尿功能障碍、大便失禁、便秘、盆底失弛缓(anismus)、肛裂、子宫疼痛(痛经、性交困难)、阴道疼痛(阴道痉挛、外阴痛)、盆腔疼痛、坐骨海绵体肌(阴茎异常勃起)、其他肌张力障碍和其他以肌肉群不自主运动为特征的病症，以及(ii)与这些病症相关的疼痛。
本发明的所述组合物还可用于治疗包括心房颤动的心脏病症。
本发明的所述组合物还可用于治疗分泌腺病症，包括流泪、多汗症(手、足和腋窝)、流涎、唾液分泌过多、胃肠道分泌物过多、皮脂腺分泌过多(以及相关病症如痤疮)和分泌病症。
在所有实施方案中，所述PoNT和所述BoNT必须组合施用，即同时施用或在允许它们在突触水平同时有效存的时间计划内施用。换言之，所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(PoNT)和肉毒杆菌神经毒素可以同时、分开或错开时间施用，条件是在PoNT活性发生衰减之前施用所述肉毒杆菌神经毒素，并且任选地，在PoNT起效后施用所述肉毒杆菌神经毒素。
最后，本发明涉及一种实施本发明所述方法的试剂盒，所述试剂盒包括针头和相应的注射器、至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和肉毒杆菌神经毒素。
下面将更详细地描述本发明及其优选实施方案。
附图说明
图1：DAS分析-使用5U/kg的BoNT/A，或5U/kg的BoNT/A与增加量范围为0.4μg/kg至40μg/kg的μ-芋螺毒素(conotoxin)CnIIIc肽的组合对大鼠进行右胫骨前肌注射，每组5只大鼠；并进行长达10天的趾伸展评分(DAS)评估。显示了在每个时间点的组的平均DAS和平均值标准差。左胫前肌注射生理盐水作为对照的大鼠在整个研究期间的DAS为0，因此数据未显示在图表中。
图2：DAS分析-使用5U/kg的BoNT/A、80μg/kg的μ-芋螺毒素CnIIIc、5U/kg的BoNT/A与80μg/kg的μ-芋螺毒素CnIIIc的组合对大鼠进行右胫骨前肌注射，每组5只大鼠；并进行长达12天的DAS评估。然后，将前两种条件(5U/kg BoNT/A、80μg/kgμ-芋螺毒素CnIIIc)的数据相加并作图(“相加”)。左胫前肌注射生理盐水作为对照的大鼠在整个研究期间的DAS为0，因此数据未显示在图表中。
图3：DAS分析-使用5U/kg的BoNT/A、5U/kg的BoNT/A与57μg/kg的泮库溴铵(pancuronium)的组合、5U/kg的BoNT/A与8μg/kg的α-芋螺毒素MI肽的组合、5U/kg的BoNT/A与17μg/kg的α-银环蛇毒素(bungarotoxin)肽的组合对大鼠进行右胫骨前肌注射，每组1只大鼠；并进行长达12天的DAS评估。左胫前肌注射生理盐水作为对照的大鼠在整个研究期间的DAS为0，因此数据未显示在图表中。
图4：DAS分析-使用5U/kg的BoNT/A、5U/kg的BoNT/A与1.6μg/kg的丹曲林的组合、5U/kg的BoNT/A与36μg/kg杀虫毒素LaIT1的组合对大鼠进行右胫骨前肌注射，每组1只大鼠；并进行长达12天的DAS评估。左胫前肌注射生理盐水作为对照的大鼠在整个研究期间的DAS为0，因此数据未显示在图表中。
图5：通过使用在作用的早期、中期和晚期的曲线下面积(AUC)的计算，对5U/kg的BoNT/A与25μg/kg的野生型μ-芋螺毒素CnIIIc肽(SEQ ID NO：54)的组合或5U/kg的BoNT/A与25μg/kg的μ-芋螺毒素CnIIIc肽(SEQ ID NO：95)的变体的组合的协同效应进行分析。
图6：DAS分析-使用5U/kg的BoNT/A、5U/kg的BoNT/A与83μg/kg的氨氯地平的组合、5U/kg的BoNT/A与83μg/kg的地尔硫卓和83μg/kg的维拉帕米的组合对大鼠进行右胫骨前肌注射，每组5只大鼠；并进行长达14天的DAS评估。左胫前肌注射生理盐水作为对照的大鼠在整个研究期间的DAS为0，因此数据未显示在图表中。
图7：通过使用总曲线下面积(AUC)的计算，对5U/kg的BoNT/A分别与下列小分子的组合的协同效应进行分析：特异性抑制NAChR受体的小分子(56.9μg/kg的泮库溴铵和83μg/kg的琥珀酰胆碱)、特异性抑制RYR1受体的小分子(14μg/kg的丹曲林)或特异性抑制CaV1.1的小分子(83μg/kg的氨氯地平、83μg/kg的地尔硫卓和83μg/kg的维拉帕米)。
图8：通过使用总曲线下面积(AUC)的计算，对5U/kg的BoNT/A分别与下列肽的组合的协同效应进行分析：特异性抑制NAChR受体的肽(16.8μg/kg的α-银环蛇毒素、0.8μg/kg的α-芋螺毒素MI、197.9μg/kg的Waglerin-1、30.9μg/kg的αC-芋螺毒素PrXA)、特异性抑制RYR1受体的肽(36μg/kg的LaIT1毒素、32.8μg/kg的Imperacalcin)、特异性抑制CaV1.1受体的肽(2.2μg/kg的U7-Ctenitoxin Pn1b、24.8μg/kg的ω-芋螺毒素TxVII、a、100.6μg/kg的U6-Ctenitoxin Pn1a、33.8μg/kg的U9-Ctenitoxin Pn1a、39.8μg/kg的κ-Ctenitoxin Pn1和12.8μg/kg Glacontryphan M)或特异性抑制Nav1.4受体的肽(32 6μg/kg的μ-芋螺毒素CnIIIC、23μg/kg的μ-芋螺毒素GIIIb、36.4μg/kg的μ-Thomitoxin Hme1a、32.5μg/kg的μ-芋螺毒素GvIIJ、286.6μg/kg的μ-O-芋螺毒素MfVIA和39.8μg/kg的μ-Thomitoxin Hme1b)。
具体实施方式
神经系统通过电脉冲发送信号，电脉冲沿着整个神经传递，直到它到达与另一个细胞的接头。神经元接头，也称为突触，是两个神经细胞(神经元)之间或神经元与分泌腺细胞或肌肉细胞(效应器)之间传递神经电脉冲的部位。神经元传递是指突触前细胞将含有神经递质的突触囊泡释放到突触间隙，并通过突触后细胞表达的突触后受体捕获囊泡的内容物。
组合物
在第一方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(PoNT)和肉毒杆菌神经毒素(BoNT)。
“至少一种”是指单一的胆碱能神经元传递的突触后抑制剂或2种、3种、4种、5种或更多种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的组合(即混合物)。
“胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(PoNT)”是指可以结合突触后细胞受体并干扰胆碱能神经元传递的化合物。通过与突触后细胞表面存在的神经递质、离子通道或电压门控受体的靶受体结合，神经元胆碱能传递的突触后抑制剂可以调节神经递质(即乙酰胆碱)释放的作用。
就本发明的目的而言，胆碱能神经元传递的突触后抑制剂可分为两大类：肽性质的抑制剂，称为突触后肽，和非肽性质的抑制剂，称为突触后小分子。
因此，在本发明的组合物中，至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂是突触后肽和/或突触后小分子。
突触后肽
“突触后肽”是指对位于突触后水平(通常位于突触后细胞膜)的细胞表面受体具有特异性亲和力的生物活性肽。在本发明的组合物中使用的突触后肽可以是从蜘蛛、蛇、蝎子、海葵、海蜗牛和其他动物的毒液中分离的天然神经毒素或其功能片段/变体，或通过化学合成获得的合成肽或其衍生物。突触后肽的“片段或变体”是指保留与亲本肽相似的生物学活性的突触后肽的任何子序列。换言之，突触后肽的功能片段/变体可以特异性结合并阻断由与效应组织有关的细胞表达的突触后受体，所述突触后受体与衍生出所述片段或变体的天然突触后肽所结合和阻断的突触后受体相同或属于同一家族。在保留与靶受体结合和阻断靶受体的活性的前提下，突触后肽的变体可具有与天然突触后肽的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性。突触后肽的功能片段包括保留了天然突触后肽的结合和阻断活性的尽可能最短的肽序列。
“突触后肽衍生物”是指与其天然对应物相比的任何修饰的突触后肽。所有可以提高突触后肽整体稳定性或其生物学功能的末端(即酰胺化(C-末端)、酰化(N-末端))和内部修饰(例如基于亮氨酸或酪氨酸的基序)都应予以考虑。更通常地，修饰可以选自包括以下或由以下组成的组：磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂化、聚乙二醇化。
为了提高突触后肽的生物利用度，本发明组合物中使用的突触后肽可以包括一种或多种阳离子修饰。
本发明组合物中使用的突触后肽可包括至少一种氨基酸修饰，所述氨基酸修饰选自氨基酸取代、氨基酸插入和氨基酸缺失。
在氨基酸取代中，形成突触后肽序列的一部分的氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。替代氨基酸残基可以是本领域公知的20种标准氨基酸之一。所述取代可发生在被认为是带电的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和赖氨酸)，不带电的极性氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸)或不带电的疏水性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸)之间。
或者，氨基酸取代中的所述替代氨基酸可以是非标准氨基酸(不是上述20个标准氨基酸的一部分的氨基酸)。例如，所述替代氨基酸可以是碱性非标准氨基酸，例如L-鸟氨酸、L-2-氨基-3-胍基丙酸、赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的D-异构体、4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸。将非标准氨基酸引入肽的方法是本领域已知的。有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代突触后肽的氨基酸残基。
在氨基酸插入中，将额外的氨基酸残基(通常不存在的氨基酸残基)结合到突触后肽氨基酸序列中，从而增加所述序列中氨基酸残基的总数。
在氨基酸缺失中，从突触后肽氨基酸序列中去除一个氨基酸残基，从而减少所述序列中氨基酸残基的总数。
通过氨基酸残基的取代、插入或缺失修饰蛋白质的方法是本领域已知的。
根据突触后肽的尺寸，所述突触后肽包含1个至10个氨基酸修饰(例如，1个至9个、1个至8个、1个至7个、1个至6个、1个至5个、或4个、3个、2个或1个氨基酸修饰)。
本发明的所述突触后肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌可酸、叔亮氨酸、戊氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。几种将非天然存在的氨基酸残基结合到蛋白质中的方法是本领域已知的。
由于天然来源的突触后肽通常是几十种神经毒素的混合物，所以任何常规纯化方法都可用于分离具有预期结合活性的突触后肽。
或者，当需要高度纯化的突触后肽时，可以使用合成的突触后肽以获得高纯度。
在所有实施方案中，用于本发明所述组合物的突触后肽是肽链，所述肽链包含约110个氨基酸或更少、优选70个氨基酸或更少、优选50个氨基酸或更少、优选35个氨基酸或更少、更优选25个氨基酸的氨基酸或更少。在任何情况下，突触后肽的长度都不能少于7个氨基酸，除非它是一个片段。
当突触后肽片段用于本发明的组合物时，所述片段的长度可以是3个、4个、5个、6个氨基酸。
根据一个更优选的实施方案，用于本发明所述组合物的所述突触后肽的大小范围为约80个至105个氨基酸，优选为约50个至80个氨基酸，优选为约40个至60个氨基酸，更优选为约15个至35个氨基酸。
根据一个更优选的实施方案，用于本发明范围的所述组合物的突触后肽包含至少一个二硫键。
小分子
“突触后小分子”是指对位于突触后水平(通常位于突触后细胞膜)的细胞表面受体具有特定亲和力的生物活性的非肽化学分子。突触后小分子与突触后肽的不同之处在于它们不表现出任何肽键，并且它们的分子量通常低于1300g/mol。优选地，用于本发明所述组合物的突触后小分子的分子量为约80g/mol至1200g/mol，优选为约150g/mol至800g/mol，更优选为约300g/mol至600g/mol。这些小分子可以是从自然界(通常是植物)中提取的，也可以是合成的。小分子一般可分为家族或相关化合物；本文将在需要时详细介绍这种分类。可以理解的是，要考虑家族内的小分子变体。
BoNT
“肉毒杆菌神经毒素”(BoNT)是指天然存在的八种不同血清型的被称为A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型和X型肉毒杆菌神经毒素，以及修饰、重组、杂合和嵌合的肉毒杆菌神经毒素。肉毒杆菌神经毒素和肉毒杆菌毒素的表述是等效的，并且可以互换使用。本文所用的术语“肉毒杆菌毒素复合物”或“毒素复合物”是指约150kD的肉毒杆菌毒素蛋白分子(属于肉毒杆菌毒素血清型A-G、X中的任一种)，可能与相关的内源性非毒素蛋白(即，由肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)一起。然而，请注意，肉毒杆菌毒素复合物不需要为来源于肉毒杆菌的单一的毒素复合物肉毒杆菌。例如，可以先重组制备肉毒杆菌毒素或修饰的肉毒杆菌毒素，然后与非毒素蛋白结合。也可以购买重组肉毒杆菌毒素(例如，购自List Biological Laboratories，Campbell，CA)，然后与非毒素蛋白质结合。
在BoNT的编码序列中引入一个或多个氨基酸取代的突变被称为修饰的BoNT。“修饰的”肉毒杆菌神经毒素是指一种化合物，所述化合物具有肉毒杆菌毒素活性，但相对于天然存在的或重组的天然肉毒杆菌毒素，在任何部分或任何氨基酸链上包含一种或多种化学改变或功能改变。例如，所述肉毒杆菌毒素可以是修饰的神经毒素，所述修饰的神经毒素是与天然形式相比，具有至少一个氨基酸缺失、氨基酸修饰或氨基酸取代的神经毒素。例如，所述肉毒杆菌毒素可以是以例如增强其特性或减少不需要的副作用的方式进行修饰的，但仍保留所需肉毒杆菌毒素活性的肉毒杆菌毒素。所述肉毒杆菌毒素也可以是已被证明具有必要的肉毒杆菌毒素活性的整体分子的一部分，并且在这种情况下可以单独使用或作为组合或缀合分子的一部分使用，例如融合蛋白。在这种情况下，所述肉毒杆菌神经毒素的所述部分或片段可以是，例如所述毒素的50kDa的轻链(LC)。或者，所述肉毒杆菌毒素可以以肉毒杆菌毒素前体的形式存在，其本身可以是无毒的，例如在蛋白水解裂解时变得有毒的无毒锌蛋白酶。
“杂合和嵌合”BoNT是指不同血清型或不同亚型的BoNT的重链结构域和轻链结构域的混合。BoNT血清型和亚型内的杂合和嵌合可以是天然的，例如BoNT/FA和BoNT/CD，或BoNT的重组变体。重组肉毒杆菌神经毒素可以具有由非梭菌属重组制备的轻链和/或重链。
根据一个优选的实施方案，用于本发明所述组合物中的肉毒杆菌神经毒素是A型、B型、E型肉毒杆菌神经毒素或A型、B型、E型肉毒杆菌神经毒素的重链和轻链的组合。
根据一个更优选的实施方案，用于本发明所述组合物中的肉毒杆菌神经毒素是A型肉毒杆菌神经毒素。
各种效应组织
在所有实施方案中，所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的选择取决于突触类型，更具体地，取决于涉及该突触的突触后细胞。
肌肉
运动神经元和肌肉细胞之间的突触连接称为神经肌肉接头(NMJ)。在NMJ中，所述突触后细胞可以是骨骼肌细胞、平滑肌细胞或心肌细胞。
骨骼肌细胞
在一个实施方案中，当所述突触后细胞是骨骼肌细胞时，根据本发明的所述组合物中使用的至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂结合至少一种由骨骼肌细胞表达的受体，所述受体选自包括以下或由以下组成的组：烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)，更优选(α1)2β1δεmAChR或(α1)2β1δγnAChRs、兰尼碱(ryanodine)受体1型(RYR1)、电压依赖性L型钙通道CaV 1.1和电压门控钠通道Nav1.4。
当两种或更多种胆碱能神经元传递(PoNT)的突触后抑制剂用作根据本发明的所述组合物中的成分时，由骨骼细胞表达并由这些PoNT靶向的受体可以属于相同的受体家族或属于几个不同的受体家族。
小分子(骨骼)
在这个实施方案中，当至少一种神经元传递的突触抑制剂为突触后小分子时，其根据表1所列的骨骼肌细胞表达的靶突触后受体进行选择。
表1：突触后小分子并且骨骼肌细胞作为突触后细胞
Figure BDA0003509450730000171
Figure BDA0003509450730000181
作为配体门控阳离子通道的成员，烟碱型乙酰胆碱受体介导快速突触传递。在哺乳动物中，有16种不同的nAChR亚基：九种不同的α亚基(α1-α7、α9和α10)、四种β亚基(β1-β4)以及γ、δ和ε亚基。这些亚基中的五个结合形成的肌肉nAChR亚型(α1β1γδ和α1β1δε)，它们存在于神经肌肉接头处。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合(α1)2β1δεnAChR或(α1)2β1δγnAChR的突触后小分子时，其选自包括以下或由以下组成的组：瑞库溴铵、米库溴胺、阿曲库铵、多沙库铵、顺阿曲库铵、维库溴铵、罗库溴铵、泮库溴铵、D-筒箭毒碱、哌库溴铵、琥珀酰胆碱、十烃季铵或它们的组合。
本领域已知的结合(α1)2β1δεnAChR或(α1)2β1δγnAChR的任何其他小分子可用作本发明所述组合物的一种神经元传递的突触抑制剂。
在更优选的实施方案中，当骨骼肌细胞表达的靶受体是(α1)2β1δεnAChR或(α1)2β1δγnAChR时，用于本发明所述组合物的至少一种突触后小分子是泮库溴铵。
兰尼碱(Ryanodine)受体同种型-1(RyR1)是骨骼肌中对兴奋-收缩耦联很重要的主要钙通道。它是一种位于肌质网(SR)中的六跨膜同型四聚体蛋白，其功能是从SR释放Ca2+以产生骨骼肌收缩。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合RyR1的突触后小分子时，其选自包括丹曲林、阿珠莫林的组或由丹曲林、阿珠莫林组成的组。
在更优选的实施方案中，当骨骼肌细胞表达的靶受体是RyR1时，用于本发明所述组合物的至少一种突触后小分子是丹曲林。
电压依赖性L型钙通道(CaV 1.1)是一种发现于肌肉横管中的通道。在骨骼肌中，它通过机械连接与肌质网中的兰尼碱受体RyR1结合。在骨骼肌膜去极化后，Cav1.1发生构象变化，从而变构激活RyR1。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合CaV 1.1的突触后小分子时，其选自包括以下或由以下组成的组：二氢吡啶、氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、依福地平、依高地平、非洛地平、氟地平、伊加地平、伊拉地平、拉西地平、乐卡地平、左旋氨氯地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平、利奥地平、维拉帕米、戈洛帕米、氟桂利嗪、地尔硫卓或它们的组合。
在一个更优选的实施方案中，当骨骼肌细胞表达的靶受体是CaV 1.1时，用于本发明所述组合物的至少一种突触后小分子是维拉帕米。
突触后肽(骨骼)
在这个实施方案中，当所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂为突触后肽时，其根据表2所列的骨骼肌细胞表达的靶突触后受体进行选择。
表2：突触后肽并且骨骼肌细胞作为突触后细胞
Figure BDA0003509450730000191
Figure BDA0003509450730000201
能够结合nAChR(α1β1γδ和α1β1δε)并且适用于本发明所述组合物的突触后肽可以选自包括以下或由以下所组成的组：azemiopsin(SEQ ID NO：1)、wagglerin-1(SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3)、SYN@-AKE(H-bAla-Pro-Dab-NHBn.2CH3CO2H)、α-银环蛇毒素(SEQ IDNO：4)、αC-芋螺毒素PrXA(SEQ ID NO：5)、α-眼镜蛇毒素(SEQ ID NO：6)、α-芋螺毒素MI(SEQID NO：7或SEQ ID NO：8)、α-芋螺毒素GI(SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9)、Ψ-芋螺毒素-PrIIIE(SEQ ID NO：10)、candoxin(SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12)和haditoxin(SEQ IDNO：13或SEQ ID NO：14)，或它们的衍生物。
Wagglerin-1的共有序列(SEQ ID NO：2)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P24335、P58930、P24335、P58930。
在一个优选的实施方案中，当将wagglerin-1用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：3或其衍生物。
α-芋螺毒素MI和α-芋螺毒素GI的共有序列(SEQ ID NO：7)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P01519、P01519、X5I9Y2、P01520、P0C8U4、P0DKP5、P0DKP8、P56973、P01521、P56973、P0C8U5、P0C8U4、P0C1W1、P0CAQ4、P0CAQ5、P56973、D4HPF8、D4HPE4、P0C8U5、P0C1W2、D4HPG9、D4HPF2、P0C8V1、P28878、P15471、P0DKP7、D4HPF6、P0DKP7、P28879。
在一个优选的实施方案中，当将α-芋螺毒素MI和α-芋螺毒素GI用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或其衍生物。
candoxin的共有序列(SEQ ID NO：11)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P81783、P15818、D5J9P6、D5J9P8。
在一个优选的实施方案中，当将candoxin用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：12或其衍生物。
haditoxin的共有序列(SEQ ID NO：13)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：A8N286、Q9W727、P82464、D5J9P3、Q7ZT13、Q800Y3、Q9YGI0。
在一个优选的实施方案中，当将haditoxin用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO14或其衍生物。
在一个甚至更优选的实施方案中，当骨骼肌细胞表达的所述靶突触后受体是(α1)2β1δεnAChR或(α1)2β1δγnAChR时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的α-芋螺毒素MI，或其衍生物。
能够结合RyR1并且适用于本发明所述组合物的突触后肽可以选自包括以下或由以下组成的组：imperacalcin(SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16)磷脂酶A2 imperatoxin-1(大亚基)(SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18)、heteromtoxin(大亚基)(SEQ ID NO：17或SEQID NO：19)、磷脂酶A2(大亚基)(SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：20)、磷脂酶A2(SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21)、杀虫毒素LaIT1(SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23)和φ-liotoxin LW1a(SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24)，或它们的衍生物。
imperacalcin(SEQ ID NO：15)的共有序列是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P59868、P60252、P60253、A0A1L4BJ42、P60254、P0DPT1、B8QG00、P0DM30、A0A1B3IJ19、L0GBR1、A0A1B3IJ24、A0A1W7RAU1、A0A224X3X5、A0A224X3Z6、A0A1V1WBN6。
在一个优选的实施方案中，当将imperacalcin用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：16或其衍生物。
磷脂酶A2 imperatoxin-1(大亚基)、heteromtoxin(大亚基)、磷脂酶A2(大亚基)和磷脂酶A2的共有序列(SEQ ID NO：17)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：Q6T178、Q3YAU5、P59888、H2CYP4、P0DMI6、A0A1L4BJ57、A0A1W7R9Y9、P0C8L9、A0A1W7RA04、A0A1L4BJ64。
在一个优选的实施方案中，当将磷脂酶A2 imperatoxin-1(大亚基)，或heteromtoxin(大亚基)，或磷脂酶A2(大亚基)，或磷脂酶A2用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或它们的衍生物。
杀虫毒素LaIT1和φ-liotoxin LW1a的共有序列(SEQ ID NO：22)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P0C5F2、P0DJ08。
在一个优选的实施方案中，当将杀虫毒素LaIT1或φ-liotoxin LW1a用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或它们的衍生物。
在一个甚至更优选的实施方案中，当骨骼肌细胞表达的所述靶受体是RyR1时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的杀虫毒素LaIT1，或其衍生物。
能够结合CaV 1.1并且适用于本发明所述组合物的突触后肽可以选自包括以下或由以下组成的组：calciseptine(SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26)、毒素FS2(SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27)、vasotab(SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29)、glacontryphan M(SEQ IDNO：30或SEQ ID NO：31)、ω-芋螺毒素-TxVII(SEQ ID NO：32)、ω-ctenitoxin-Cs1a(SEQID NO：33或SEQ ID NO：34)、U7-ctenitoxin-Pn1b(SEQ ID NO：35)、U9-ctenitoxin-Pn1a(SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37)、U6-ctenitoxin-Pn1a(SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38)、κ-ctenitoxin-Pn1a(SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：39)、ω-ctenitoxin-Pr2a(SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41)、毒素S4C8(SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43)和毒素C10S2C2(SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：44)或它们的衍生物。
calciseptine和毒素FS2的共有序列(SEQ ID NO：25)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P22947、P01414、P25684、P25683。
在一个优选的实施方案中，当将calciseptine或毒素FS2用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或它们的衍生物。
vasotab的共有序列(SEQ ID NO：28)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P84843、C1IBZ2、A0A0K8TPQ2、C8YJB4、C8YJB3。
在一个优选的实施方案中，当将vasotab用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：29或其衍生物。
glacontryphan M的共有序列(SEQ ID NO：30)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：U6C1Y3、A0A0K8TU78、A0A1P8NVU1、F5C3T9、A0A1P8NVS9、A0A1P8NVU0。
在一个优选的实施方案中，当将glacontryphan M用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：31或其衍生物。
ω-ctenitoxin-Cs1a的共有序列(SEQ ID NO：33)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P81694、B6DCP3、B6DCP1、B6DCP4、B6DCN7。
在一个优选的实施方案中，当将ω-ctenitoxin-Cs1a用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：34或其衍生物。
U9-ctenitoxin-Pn1a、U6-ctenitoxin-Pn1a和κ-ctenitoxin-Pn1a的共有序列(SEQ ID NO：36)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：O76200、O76201、O76201、P0C2S6、P84000、P83895、P30288、P37045、P81793。
在一个优选的实施方案中，当将U9-ctenitoxin-Pn1a，或U6-ctenitoxin-Pn1a，或κ-ctenitoxin-Pn1a用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39，或它们的衍生物。
ω-ctenitoxin-Pr2a的共有序列(SEQ ID NO：40)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P81792、P83902、P0C2S7、P84011、P83901。
在一个优选的实施方案中，当将ω-ctenitoxin-Pr2a用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：41或其衍生物。
毒素S4C8和毒素C10S2C2的共有序列(SEQ ID NO：42)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P22947、P01414、P25684、P25683。
在一个优选的实施方案中，当将毒素S4C8或毒素C10S2C2用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44或它们的衍生物。
在一个甚至更优选的实施方案中，当骨骼肌细胞表达的所述靶受体是CaV 1.1时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO：35的U7-ctenitoxin-Pn1b，或具有序列SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的calciseptine，或它们的衍生物。
Nav 1.4通道主要存在于骨骼肌纤维的肌膜和T管膜中。通过通道孔隙的去极化电流引发骨骼肌动作电位并导致收缩。
Mu-芋螺毒素(μ-芋螺毒素)通过与Nav 1.4通道结合直接消除肌肉动作电位。Mu-芋螺肽是从芋螺(Conus)属的海洋锥形蜗牛的毒液中分离出来的。mu-芋螺肽的一级结构是由15-30个氨基酸通过二硫键折叠而成。所述μ-芋螺毒素具有特征性的CC-Xm-C-Xn-C-Xp-CC框架，其中六个半胱氨酸可以产生三种可能的二硫键连接(即CysI-CysIV、CysII-CysV、CysIII-CysVI)。μ-芋螺毒素的三个环(m、n、p)中包含的残基数量是将其分为几个结构亚组的基础(m可以为从5个至9个氨基酸残基不等，n可以为从3个至4个氨基酸残基不等，以及p可以为从3个至5个氨基酸残基不等)。
在一些实施方案中，能够结合NaV 1.4通道并适用于本发明所述组合物的突触后肽可以选自包括以下或由以下组成的组：μ-芋螺毒素GIIIb(SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46)、μ-芋螺毒素TIIIa(SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：48)、μ-芋螺毒素PIIIa(SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47)、μ-芋螺毒素GvIIJ(SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50)、μ-O-芋螺毒素MfVIA(SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52)、μ-芋螺毒素CnIIIc(SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54或SEQID NO：95)、μ-thomitoxin-Hme1a(SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56)、μ-thomitoxin-Hme1b(SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：57)、μ-thomitoxin-Hme1c(SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58)，或它们的衍生物。
μ-芋螺毒素GIIIb、μ-芋螺毒素TIIIA和μ-芋螺毒素PIIIa的共有序列(SEQ ID NO：45)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P01523、P01524、P05482、P0C349、P0DKQ9、P0DKQ9、X5IGY9、A0A0K8TUB1、P0CH16、P58925。
在一个优选的实施方案中，当将μ-芋螺毒素GIIIb或μ-芋螺毒素TIIIA或μ-芋螺毒素PIIIa用于本发明的所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：47，或它们的衍生物。
μ-芋螺毒素GvIIJ的共有序列(SEQ ID NO：49)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：X5IWS1、X5IA08、Q71KS8。
在一个优选的实施方案中，当将μ-芋螺毒素GvIIJ用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：50，或其衍生物。
μ-芋螺毒素CnIIIc的共有序列(SEQ ID NO：53)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：C1J5M5、C1J5M6、C1J5M7、I1SB07、P0CE77、Q86DU6、P60207、P0C1T9、P0C1U2、P0C195、P0C1U1、P0C1U0、P0CY74。
在一个优选的实施方案中，用于本发明所述组合物中的所述突触后肽是μ-芋螺毒素CnIIIc或其变体。
在一个更优选的实施方案中，μ-芋螺毒素CnIIIc被用于本发明所述组合物中，它具有序列SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：95，或其衍生物。
μ-O-芋螺毒素MfVIA的共有序列(SEQ ID NO：51)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P0DM15、A0A0K2S5L8、A0A0K2S5L9、A0A0K2S5N5、A0A0K2S6J2、A0A0K2S5L0、A0A0K2S5M2、A0A0K2S6H9、A0A0K2S5M9、A0A0K2S5M7、U6C1V9、P56708、U6C2E4、W4VSL3。
在一个优选的实施方案中，当将μ-O-芋螺毒素MfVIA用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：52，或其衍生物。
μ-thomitoxin Hme1a、μ-thomitoxin Hme1b和μ-thomitoxin Hme1c的共有序列(SEQ ID NO：55)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P85505、P85506、C0HJK5。
在一个优选的实施方案中，当将μ-thomitoxin Hme1a、μ-thomitoxin Hme1b或μ-thomitoxin Hme1c用于本发明的组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58或它们的衍生物。
平滑肌
在另一个实施方案中，当所述突触后细胞是平滑肌细胞时，用于根据本发明的所述组合物的所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂与至少一种由平滑肌细胞表达的受体相结合，所述受体选自包括以下或由以下组成的组：毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChR)，并且更优选为M3亚型mAChR、兰尼碱受体2型(RYR2)、电压依赖性L型钙通道CaV1.2和电压门控钠通道Nav1.5。
当两种或更多种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(PoNT)用作根据本发明的所述组合物中的成分时，由平滑肌细胞表达并被这些PoNT靶向的受体可以属于相同的受体家族或属于几个不同的受体家族。
小分子(平滑)
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂为突触后小分子时，其根据表3所列的平滑肌细胞表达的靶突触后受体进行选择。
表3：突触后小分子并且平滑肌细胞作为突触后细胞
Figure BDA0003509450730000271
Figure BDA0003509450730000281
毒蕈碱乙酰胆碱受体是A类G蛋白偶联受体(GPCR)的重要亚家族。mAChR有五种亚型(M1-M5)，它们在表达模式、生理功能和G蛋白偶联方面有所不同。三种亚型(M1、M3和M5)主要通过G蛋白的Gq/11家族的激活传递信号，而M2和M4 mAChR主要通过G蛋白的Gi/o家族传递信号。M3 mAChR存在于平滑肌细胞中。此外，毒蕈碱M3受体被认为是介导平滑肌组织中副交感神经收缩反应的主要受体亚型。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合mAChR M3的突触后小分子时，其选自包括以下或由以下组成的组：阿托品、东莨菪碱、莨菪碱、异丙托铵、托吡卡胺、黄酮哌酯、奥昔布宁、噻托溴铵、环戊通、托特罗定、普环啶、阿地溴铵、索利那新、达非那新、4-DAMP、DAU-5884、J-104129、扎非那新或它们的组合。
在更优选的实施方案中，当所述平滑肌细胞表达的靶受体是mAChR M3时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后小分子是达非那新。
兰尼碱受体同种型-2(RyR2)是平滑肌中对兴奋-收缩偶联起重要作用的三个主要钙通道之一。RyR2对产生平滑肌钙火花的贡献得到了很好的说明。
在一个更优选的实施方案中，当所述平滑肌细胞表达的靶受体是RyR2时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后小分子是JTV519。
电压依赖性L型钙通道CaV 1.2是一种存在于平滑肌细胞膜中的钙通道。CaV1.2是一种完整的细胞膜蛋白复合物，它介导Ca2+流入细胞以响应膜去极化，从而诱导肌肉收缩。在平滑肌细胞中，它通过机械连接与肌质网的兰尼碱受体RyR2结合。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合CaV 1.2的突触后小分子时，其选自包括以下或由以下组成的组：二氢吡啶、氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、依福地平、依高地平、非洛地平、氟地平、伊加地平、伊拉地平、拉西地平、乐卡地平、左旋氨氯地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平、利奥地平、维拉帕米、戈洛帕米、氟桂利嗪、地尔硫卓或它们的组合。
在一个更优选的实施方案中，当所述平滑肌细胞表达的靶受体是CaV 1.2时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后小分子是维拉帕米。
突触后肽(平滑肌)
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂为突触后肽时，其根据表4所列的平滑肌细胞表达的所述靶突触后受体进行选择。
表4：突触后肽并且平滑肌细胞作为突触后细胞
Figure BDA0003509450730000301
Figure BDA0003509450730000311
毒蕈碱毒素α的共有序列(SEQ ID NO：59)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P80494、Q9PSN1、P81030、P86419、P80495、P85092、P25518、P17696、P82463、P60234、P18328、Q8QGR0、P81031。
能够结合mAChR M3并且适用于本发明所述组合物的突触后肽是毒蕈碱毒素α(SEQID NO：59或SEQ ID NO：60)或其衍生物。
能够结合RyR2并适用于本发明所述组合物的突触后肽可以选自包括以下或由以下组成的组：imperacalcin(SEQ ID NO：15或16)、磷脂酶A2 imperatoxin-1(大亚基)(SEQID NO：17或SEQ ID NO：18)、heteromtoxin(大亚基)(SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19)、磷脂酶A2(大亚基)(SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：20)、磷脂酶A2(SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：21)、杀虫毒素LaIT1(SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23)和Phi-liotoxin LW1a(SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24)，或它们的衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将imperacalcin用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：16，或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将磷脂酶A2 imperatoxin-1(大亚基)，或heteromtoxin(大亚基)，或磷脂酶A2(大亚基)，或磷脂酶A2用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或它们的衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将杀虫毒素LaIT1或φ-liotoxin LW1a用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或它们的衍生物。
在一个甚至更优选的实施方案中，当由平滑肌细胞表达的所述靶突触后受体是RyR2时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO：22、SEQID NO：23的杀虫毒素LaIT1或其衍生物。
能够结合CaV 1.2并且适用于本发明所述组合物的突触后肽可以选自包括以下或由以下组成的组：calciseptine(SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26)、毒素FS2(SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27)、vasotab(SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29)、glacontryphan M(SEQ IDNO：30或SEQ ID NO：31)、ω-芋螺毒素-TxVII(SEQ ID NO：32)、ω-ctenitoxin-Cs1a(SEQID NO：33或SEQ ID NO：34)、U7-ctenitoxin-Pn1b(SEQ ID NO：35)、U9-ctenitoxin-Pn1a(SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37)、U6-ctenitoxin-Pn1a(SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38)、κ-ctenitoxin-Pn1a(SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：39)、ω-ctenitoxin-Pr2a(SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41)、毒素S4C8(SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43)、毒素C10S2C2(SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：44)和ω-theraphotoxin-Ccla(SEQ ID NO：61)或它们的衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将calciseptine或毒素FS2用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或它们的衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将vasotab用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：29，或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将glacontryphan M用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：31，或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将ω-ctenitoxin-Cs1a用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：34，或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将U9-ctenitoxin-Pn1a，或U6-ctenitoxin-Pn1a，或κ-ctenitoxin-Pn1a用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39，或它们的衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将ω-ctenitoxin-Pr2a用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：41，或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将毒素S4C8或毒素C10S2C2用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44或它们的衍生物。
在一个甚至更优选的实施方案中，当由平滑肌细胞表达的所述靶突触后受体是CaV1.2时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO：35的U7-ctenitoxin-Pn1b或具有序列SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的calciseptine，或它们的衍生物。
当需要对所述靶突触后受体CaV1.2具有更高特异性时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是ω-theraphotoxin-Cc1a(SEQ ID NO：61)，或其衍生物。
NaV1.5(由SCN5A基因编码)在人平滑肌细胞以及小肠和结肠的Cajal间质细胞(ICC)中表达。除其他功能外，ICC是胃肠起搏器，其产生传递至平滑肌的周期性去极化(慢波)，为收缩提供电刺激。在人类胃肠道平滑肌中，NaV通道似乎对慢波具有兴奋性，并且NaV1.5在人类胃肠道中具有功能相关性，因为NaV1.5的药理学阻断与便秘有关。
能够结合NaV1.5并适用于本发明所述组合物的突触后肽可以选自包括以下或由以下组成的组：β-哺乳类毒素Css2(SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63)、α-样毒素BmK-M1(SEQID NO：64或SEQ ID NO：65)、μ-thomitoxin-Hme1a(SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56)、μ-thomitoxin-Hme1b(SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：57)、μ-thomitoxin-Hme1c(SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58)、β/κ-theraphotoxin-Cg1a(SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67)、κ-theraphotoxin-Cg1a(SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69)、δ-theraphotoxin-Cg1a 1(SEQ IDNO：70或SEQ ID NO：71)、δ-theraphotoxin-Cg1a 2(SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72)和δ-theraphotoxin-Cg1a 3(SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：73)，或它们的衍生物。
β-哺乳类毒素Css2的共有序列(SEQ ID NO：62)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P08900、P01495、P56646、P60267、P59897、P18926、P59898、P60266、P0DL83、P0CH41、P45662、P45666、Q95WD2、P80076、Q7Z1K9、Q7Z1K8、Q9TWL0、C0HK69。
在一个优选的实施方案中，当将β-哺乳类毒素Css2用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：63，或其衍生物。
α-样毒素BmK-M1的共有序列(SEQ ID NO：64)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：Q9GQV6、P59360、P58488、Q6IZE0、P59354、P01488、G4WFQ2、P01487、P17728、B8XGY6、Q9N682、P01483、P09981、B6A8S0、B6A8R9、P58328、P15227、P45698、Q9NJC8、P86405、P59896、E7D081、E7D082、P55902、D8UWD5、D8UWD4、P0DJH8、D8UWD6、P60257、O61705、Q9NJC5、P60255、P01489、P84646、B8XGX9、P83644、P84614。
在一个优选的实施方案中，当将α-样毒素BmK-M1用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：65，或其衍生物。
β/κ-theraphotoxin-Cg1a的共有序列(SEQ ID NO：66)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P62520、P84836、P84835、B1P1C8、B1P1D0、B1P1C9、P0CH52、P60980。
在一个优选的实施方案中，当将β/κ-theraphotoxin-Cg1a用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：67，或其衍生物。
κ-theraphotoxin-Cg1a的共有序列(SEQ ID NO：68)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P0C247、B1P1E4、B1P1H1、B1P1A0。
在一个优选的实施方案中，当将κ-theraphotoxin-Cg1a用于本发明的组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：69，或其衍生物。
δ-theraphotoxin-Cg1a 1、δ-theraphotoxin-Cg1a 2和δ-theraphotoxin-Cg1a 3的共有序列(SEQ ID NO：70)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：B1P1B7、B1P1B8、A0A482ZD06、B1P1B9。
在一个优选的实施方案中，当将δ-theraphotoxin-Cg1a 1或δ-theraphotoxin-Cg1a 2或δ-theraphotoxin-Cg1a 3用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73，或它们的衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将μ-thomitoxin-Hme1a或μ-thomitoxin-Hme1b或μ-thomitoxin-Hme1c用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58，或它们的衍生物。
在一个甚至更优选的实施方案中，当平滑肌细胞表达的所述靶突触后受体是Nav1.5时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列68或SEQ ID NO：69的κ-theraphotoxin-Cg1a，或具有序列SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63的β-哺乳动物毒素Css2，或它们的衍生物。
心肌
在另一个实施方案中，当所述突触后细胞是心肌细胞时，用于根据本发明的所述组合物中的所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂与至少一种由心肌细胞表达的受体结合，所述受体选自包括以下或由以下组成的组：毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChR)，并且更优选为M2亚型mAChR、兰尼碱受体2型(RYR2)、电压依赖性L型钙通道CaV 1.1或CaV1.2、以及电压门控钠通道Nav1.5。
当两种或更多种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(PoNT)用作根据本发明的所述组合物中的成分时，由心肌细胞表达并被这些PoNT靶向的受体可以属于相同的受体家族或属于几个不同的受体家族。
小分子(心脏)
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂为突触后小分子时，其根据表5所列的心肌细胞表达的靶突触后受体进行选择。
表5：突触后小分子并且心肌细胞作为突触后细胞
Figure BDA0003509450730000351
Figure BDA0003509450730000361
毒蕈碱乙酰胆碱受体M2存在于心肌细胞中。特别地，M2毒蕈碱乙酰胆碱受体通过调节内向钾电流来调节心律。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合mAChR M2的突触后小分子时，其选自包括以下或由以下组成的组：阿托品、东莨菪碱、莨菪碱、异丙托铵、托吡卡胺、黄酮哌酯、奥昔布宁、噻托溴铵、环戊通、托特罗定、普环啶、阿地溴铵、AFDX116、AFDX-384、美索曲明、奥腾折帕、tripitramine或它们的组合。
在一个更优选的实施方案中，当心肌细胞表达的所述靶突触后受体是mAChR M2时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后小分子是托特罗定。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合RyR2的突触后小分子时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后小分子是JTV519。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合CaV 1.1或CaV 1.2的突触后小分子时，其选自包括以下或由以下组成的组：二氢吡啶、氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、氯维地平、依福地平、依高地平、非洛地平、氟地平、伊加地平、伊拉地平、拉西地平、乐卡地平、左旋氨氯地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、普拉地平、利奥地平、维拉帕米、戈洛帕米、氟桂利嗪、地尔硫卓或它们的组合。
在一个更优选的实施方案中，当所述由平滑肌细胞表达的靶受体是CaV 1.1或CaV1.2时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后小分子是维拉帕米。
突触后肽(心脏)
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂为突触后肽时，其根据表6所列的心肌细胞表达的靶突触后受体进行选择。
表6：突触后肽并且心肌细胞作为突触后细胞
Figure BDA0003509450730000371
Figure BDA0003509450730000381
能够结合mAChR M2并适用于本发明所述组合物的突触后肽是具有序列SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：60的毒蕈碱毒素α或其衍生物。
能够结合CaV 1.1或CaV 1.2并适用于本发明所述组合物的突触后肽可选自包括以下或由以下组成的组：calciseptine(SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26)、毒素FS2(SEQ IDNO：25或SEQ ID NO：27)、vasotab(SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29)、glacontryphan M(SEQID NO：30或SEQ ID NO：31)、ω-芋螺毒素-TxVII(SEQ ID NO：32)、ω-ctenitoxin-Cs1a(SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34)、U7-ctenitoxin-Pn1b(SEQ ID NO：35)、U9-ctenitoxin-Pn1a(SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37)、U6-ctenitoxin-Pn1a(SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38)、κ-ctenitoxin-Pn1a(SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：39)、ω-ctenitoxin-Pr2a(SEQ IDNO：40或SEQ ID NO：41)、毒素S4C8(SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43)、毒素C10S2C2(SEQ IDNO：42或SEQ ID NO：44)和ω-theraphotoxin-Ccla(SEQ ID NO：61)或它们的衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将calciseptine或毒素FS2用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将vasotab用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将glacontryphan M用于本发明的组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将ω-芋螺毒素-TxVII用于本发明的组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：32或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将ω-ctenitoxin-Cs1a用于本发明的组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将U9-ctenitoxin-Pn1a、U6-ctenitoxin-Pn1a或κ-ctenitoxin-Pn1a用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39，或它们的衍生物
在一个优选的实施方案中，当将ω-ctenitoxin-Pr2a用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或其衍生物
在一个优选的实施方案中，当将毒素S4C8或毒素C10S2C2用于本发明的组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44或它们的衍生物。
在一个甚至更优选的实施方案中，当所述由心肌细胞表达的靶突触后受体是CaV1.1或CaV1.2时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ IDNO：35的U7-ctenitoxin-Pn1b，或具有序列SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的calciseptine，或它们的衍生物。
当需要对所述靶突触后受体CaV1.2具有更高的特异性时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO：61的ω-theraphotoxin-Cc1a，或其衍生物。
能够结合RyR2并且适用于本发明所述组合物的突触后肽可以选自包括以下或由以下组成的组：imperacalcin(SEQ ID NO：15或16)、磷脂酶A2 imperatoxin-1(大亚基)(SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18)、heteromtoxin(大亚基)(SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19)、磷脂酶A2(大亚基)(SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：20)、磷脂酶A2(SEQ ID NO：17或SEQID NO：21)、杀虫毒素LaIT1(SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23)和Phi-liotoxin LW1a(SEQ IDNO：22或SEQ ID NO：24)，或它们的衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将imperacalcin用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：16，或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将磷脂酶A2 imperatoxin-1(大亚基)，或heteromtoxin(大亚基)，或磷脂酶A2(大亚基)，或磷脂酶A2用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或它们的衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将杀虫毒素LaIT1或φ-liotoxin LW1a用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或它们的衍生物。
在一个甚至更优选的实施方案中，当所述由心肌细胞表达的靶突触后受体是RyR2时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23的杀虫毒素LaIT1或其衍生物。
能够结合NaV1.5并适用于本发明的组合物的突触后肽可以选自包括以下或由以下组成的组：β-哺乳类毒素Css2(SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63)、α-样毒素BmK-M1(SEQ IDNO：64或SEQ ID NO：65)、μ-thomitoxin-Hme1a(SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56)、μ-thomitoxin-Hme1b(SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：57)、μ-thomitoxin-Hme1c(SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58)、β/κ-theraphotoxin-Cg1a(SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67)、κ-theraphotoxin-Cg1a(SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69)、δ-theraphotoxin-Cg1a 1(SEQ IDNO：70或SEQ ID NO：71)、δ-theraphotoxin-Cg1a 2(SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72)和δ-theraphotoxin-Cg1a 3(SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：73)，或它们的衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将β-哺乳类毒素Css2用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：63，或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将α-样毒素BmK-M1用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：65，或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将μ-thomitoxin-Hme1a或μ-thomitoxin-Hme1b或μ-thomitoxin-Hme1c用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58，或它们的衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将β/κ-theraphotoxin-Cg1a用于本发明所述组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：67，或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将κ-theraphotoxin-Cg1a用于本发明的组合物中时，它具有序列SEQ ID NO：69，或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，当将δ-theraphotoxin-Cg1a 1或δ-theraphotoxin-Cg1a 2或δ-theraphotoxin-Cg1a 3用于本发明所述组合物中时，其具有序列SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73，或它们的衍生物。
在一个更优选的实施方案中，当所述由心肌细胞表达的靶突触后受体是Nav1.5时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO：68或SEQ IDNO：69的κ-theraphotoxin-Cg1a，或具有序列SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63的β-哺乳动物毒素Css2，或其衍生物。
分泌腺细胞
在另一个实施方案中，当所述突触后细胞是分泌腺细胞时，用于根据本发明的所述组合物中的所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂与至少一种由分泌腺细胞表达的受体结合，所述受体选自包括以下或由以下组成的组：毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChR)，并且更优选为M1或M3亚型mAChR、α1肾上腺素能受体和β1肾上腺素能受体。
当两种或更多种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(PoNT)用作根据本发明的所述组合物中的成分时，由分泌腺细胞表达并被这些PoNT靶向的受体可以属于相同的受体家族或属于几个不同的受体家族。
小分子(分泌腺)
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂为突触后小分子时，其根据表7所列的分泌腺细胞表达的靶突触后受体进行选择。
表7：突触后小分子并且分泌腺细胞作为突触后细胞
Figure BDA0003509450730000421
Figure BDA0003509450730000431
几种毒蕈碱受体亚型涉及唾液分泌、表达单一M3受体群的浆液细胞和同时表达M1和M3受体的粘液腺泡细胞。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合mAChR M1或mAChR M3的突触后小分子时，其选自包括以下或由以下组成的组：阿托品、东莨菪碱、莨菪碱、异丙托铵、托吡卡胺、黄酮哌酯、奥昔布宁、噻托溴铵、环戊通、托特罗定、普环啶、阿地溴铵或它们的组合。
在一个更优选的实施方案中，当所述分泌腺细胞表达的靶突触后受体是mAChR M1或mAChR M3时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后小分子是奥昔布宁。
可能需要针对M1或M3 mAchR的更高特异性。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合mAChR M1的突触后小分子时，其选自包括以下或由以下组成的组：哌仑西平、替仑西平、苯海索或它们的组合。
在一个更优选的实施方案中，当所述分泌腺细胞表达的靶突触后受体是mAChR M1时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后小分子是哌仑西平、苯海索或它们的组合。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合mAChR M3的突触后小分子时，其选自包括以下或由以下组成的组：索利那新、达非那新、4-DAMP、DAU-5884、J-104129、扎非那新或它们的组合。
在一个更优选的实施方案中，当所述分泌腺细胞表达的靶突触后受体是mAChR M3时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后小分子是达非那新。
肾上腺素能受体(AR)是一类G蛋白偶联受体，与腺苷酸环化酶结合。AR包括四种常见类型(α1、α2、β1和β2)，它们存在于不同的效应组织中。在唾液腺中，α1-肾上腺素能受体诱导细胞溶质中钙([Ca2+]i)浓度的增加并刺激唾液分泌。α1-肾上腺素能通路在泪腺中也很活跃。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合α1-肾上腺素能受体的突触后小分子时，其选自包括以下或由以下组成的组：阿夫唑嗪、多沙唑嗪、吲哚拉明、百里胺、哌唑嗪、西洛多辛、坦索罗辛、特拉唑嗪或它们的组合。
在更优选的实施方案中，当分泌腺细胞表达的所述靶突触后受体是β1-肾上腺素能受体时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后小分子是西洛多辛。
在唾液腺中，β1-肾上腺素能受体负责粘性分泌物。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合β1-肾上腺素能受体的突触后小分子时，其选自包括以下或由以下组成的组：醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、美托洛尔、奈比洛尔、沃替西汀或它们的组合。
在更优选的实施方案中，当所述分泌腺细胞表达的靶突触后受体是β1-肾上腺素能受体时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后小分子是比索洛尔。
突触后肽(分泌腺)
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂为突触后肽时，其根据表8所列的分泌腺细胞表达的靶突触后受体进行选择。
表8：突触后肽并且分泌腺细胞作为突触后细胞
Figure BDA0003509450730000451
适用于本发明所述组合物的能够结合mAChr M1的突触后肽可选自包括以下或由以下组成的组：毒蕈碱毒素1(SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:74)、毒蕈碱毒素2(SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:75)、毒蕈碱毒素3(SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:76)、毒蕈碱毒素7(SEQ IDNO:59或SEQ ID NO:77)和毒蕈碱毒素α(SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60)，或它们的衍生物。
毒蕈碱毒素α、毒蕈碱毒素1、毒蕈碱毒素2、毒蕈碱毒素3和毒蕈碱毒素7的共有序列(SEQ ID NO:59)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P80494、Q9PSN1、P81030、P86419、P80495、P85092、P25518、P17696、P82463、P60234、P18328、Q8QGR0、P81031。
在一个更优选的实施方案中，当分泌腺细胞表面上的所述突触后受体是mAChr M1时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO：59、SEQ IDNO：77的毒蕈碱毒素7，或其衍生物。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合mAChr M3的突触后肽时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60的毒蕈碱毒素α，或其衍生物。
适用于本发明所述组合物的能够结合α1-肾上腺素能受体的突触后肽可选自包括以下或由以下组成的组：毒蕈碱毒素1(SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：74)、毒蕈碱毒素3(SEQID NO：59或SEQ ID NO:76)、毒蕈碱毒素α(SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60)、肾上腺素能毒素ρ-elapitoxin-Dp1a(SEQ ID NO:78)、毒素AdTx1(SEQ ID NO：79)或它们的衍生物。
毒蕈碱毒素α、毒蕈碱毒素1、毒蕈碱毒素3、肾上腺素能毒素ρ-elapitoxin-Dp1a和毒素AdTx1的共有序列(SEQ ID NO:59)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：P80494、Q9PSN1、P81030、P86419、P80495、P85092、P25518、P17696、P82463、P60234、P18328、Q8QGR0、P81031。
在更优选的实施方案中，当分泌腺细胞表面上的所述突触后受体是α1-肾上腺素能受体时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：78的肾上腺素能毒素ρ-elapitoxin-Dp1a，或具有序列SEQ ID NO：59或SEQ IDNO：79的毒素AdTx1，或它们的衍生物。
适用于本发明所述组合物的能够结合β1-肾上腺素能受体的突触后肽可以选自包括β-心脏毒素(SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:81)或由β-心脏毒素(SEQ ID NO:80或SEQ IDNO:81)组成的组。
β-心脏毒素的共有序列(SEQ ID NO:80)是根据Uniprot数据库中具有以下登录号的蛋白质序列定义的：Q69CK0、Q53B46、Q2VBN8、Q2VBN5、Q2VBN7、Q2VBN4。
在这个实施方案中，当所述至少一种神经元传递的突触抑制剂是结合β1-肾上腺素能受体的突触后肽时，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后肽是具有序列SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81的β-心脏毒素，或其衍生物。
多特异性突触后抑制剂
在其他实施方案中，神经元传递的突触后抑制剂可以选自表现出抑制多个分子靶标的能力的小分子和肽。此类“多特异性突触后抑制剂”对至少一种上述分子靶标(即nAChR((α1)2β1δε或(α1)2β1δγ)、mAChR M1或mAChR M2或mAChR M3、α1-肾上腺素能受体、β1-肾上腺素能受体、RYR1或RYR2、CaV1.1或CaV1.2、NaV1.4或NaV1.5)具有活性。值得注意的是，多特异性对本发明可能是有利的：例如，使用主要抑制NaV的小分子可以减少与手术或病症相关的疼痛(因为NaV1.7与痛觉显著相关)。
在一些实施方案中，多特异性突触后抑制剂可以选自表9中列出的小分子。
表9：多特异性突触后小分子
Figure BDA0003509450730000471
Figure BDA0003509450730000481
在一个更优选的实施方案中，用于本发明所述组合物的所述至少一种突触后多特异性小分子是利多卡因。
在其他实施方案中，多特异性突触后抑制剂可以选自表10中列出的肽或其衍生物。
表10：多特异性突触后肽
Figure BDA0003509450730000491
在一个更优选的实施方案中，用于本发明所述组合物中的所述至少一种突触后多特异性肽是具有序列SEQ ID NO：91的β/ω-theraphotoxin-Tp2a，或其衍生物。
本发明还提供了一种美容组合物，所述美容组合物包含本发明的所述组合物，所述组合物包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和肉毒杆菌神经毒素。所述美容组合物还可包含美容上可接受的赋形剂或稀释剂。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的所述组合物，所述组合物包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和肉毒杆菌神经毒素。所述药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体、盐和/或添加剂。
本发明的实施方案和其他方面
据报道，BoNT具有包括抑制或阻断分泌腺和平滑肌的胆碱能神经肌肉的神经支配或胆碱能自主的神经支配的直接作用。
本发明的所述组合物能够进行实验以调节BoNT的药效学特征。
快速起效的PoNT
快速起效对于快速缓解与肌肉收缩相关的疼痛可能特别有吸引力。
令人惊讶的是，发明人观察到本发明所述组合物的肌肉松弛的“早期作用”强于单独施用单个化合物(即BoNT和PoNT)的“早期作用”。因此，所述组合物具有协同效应。“早期作用”是指在BoNT作用之前(即在施用BoNT后的第一个24小时内)产生的肌肉松弛作用。
在优选的实施方案中，用于本发明所述组合物中的所述神经传递的突触后抑制剂(PoNT)是快速起效的突触后肽和/或快速起效的突触后小分子。“快速起效”是指比由例如肉毒杆菌神经毒素(例如BoNT/A或BoNT/B或BoNT/E)产生作用更快的PoNT。例如，快速起效PoNT的作用可以在12小时内可见，优选在6小时内可见，更优选在2小时内可见，最优选在1小时内可见。
在其他优选的实施方案中，用于本发明所述组合物中的所述突触后神经传递抑制剂(PoNT)是一种非常快速起效的突触后肽或小分子。“非常快速起效”是指在少于45分钟、优选少于30分钟、更优选少于20分钟和最优选少于10分钟内产生作用的PoNT。
增加BoNT作用持续时间的PoNT
更令人惊讶的是，发明人发现将至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)，添加到肉毒杆菌神经毒素组合物中延长了肉毒杆菌神经毒素的作用持续时间。例如，在肌肉内注射后，在人体中BoNT/A作用的一般持续时间通常为约3个月至4个月。“延长肉毒杆菌神经毒素的作用持续时间”是指肉毒杆菌毒素的作用持续时间长于例如A型肉毒杆菌神经毒素的作用持续时间。与仅包含BoNT的组合物的作用的停止相比，本发明所述组合物的作用的停止发生在例如1周后、2周后、3周后、1个月后、2个月后或更长时间后。
本发明的这一具体优点对于减少达到所需效果所需的注射次数可能特别有吸引力。另一个优点是通过增加两次注射之间的时间，接受本发明所述组合物的个体的免疫系统产生抗BoNT抗体的可能性也降低了。
增加强度的PoNT
令人惊讶的是，发明人发现将至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)，连同肉毒杆菌神经毒素组合物一起施用，增强了肉毒杆菌神经毒素的作用强度。“作用强度”是指对于具体剂量的BoNT可观察到的最高肌肉松弛作用。
在优选的实施方案中，用于本发明所述组合物中的所述突触后神经传递抑制剂(PoNT)显示出协同作用，即比单独施用所述组合物的单个化合物的作用增强至少10％，优选至少25％，更优选至少50％
通过增强BoNT的作用强度，本发明所述组合物可以改善美容效果并减轻致残状况和疼痛状况。
减缓BoNT起效、增加BoNT作用强度、并增加作用持续时间的快速起效的PoNT
对于一些快速或非常快速起效的PoNT，即突触后肽或突触后小分子，可以通过加速肉毒杆菌神经毒素组合物起效和延长肉毒杆菌神经毒素组合物作用持续时间以及增强肉毒杆菌神经毒素组合物的作用强度来调节BoNT组合物的作用。
三重组合以获得快速而持久的起效
根据预期用途，如果PoNT的作用持续时间在获得肉毒杆菌神经毒素最大作用之前结束，则本发明所述组合物可以进一步包含中间起效的第二PoNT。“中间起效”是指比快速起效的PoNT产生作用更慢的PoNT。优点是获得本发明所述组合物的快速、持续和延长的最大作用，而这些作用不会随着时间的推移而显著降低。
在一个优选的实施方案中，本发明所述组合物包含至少一种快速起效的PoNT、至少一种中间起效的PoNT和肉毒杆菌神经毒素。
同时施用
在所有实施方案中，所述至少一种PoNT和所述肉毒杆菌神经毒素是组合施用的。术语“组合(in combination)”、“与……组合”、“共同递送”和“一起施用”是等效的并且可以互换使用。在向受试者施用两种或更多种组分的情况下，是指同时施用两种或更多种组分，例如至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和所述肉毒杆菌神经毒素组合物。
将PoNT和BoNT的同时施用定义为在短时间(例如5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟或30分钟)内或在更长的时间(例如60分钟、120分钟、240分钟、360分钟或720分钟)内，使用相似或不同的施用途径在相同的组织部位施用至少一种PoNT和BoNT，其中PoNT和BoNT在同一组合物中或同一容器中组合，或不在同一组合物中或同一容器中。
术语“与……组合”的使用不限制对受试者施用PoNT和BoNT的顺序。
同时注射
当同时注射所述至少一种PoNT(即突触后肽或突触后小分子)和所述肉毒杆菌神经毒素时，可以获得使用本发明所述组合物的所有上述效果。
非同时注射
在一个替代实施方案中，可以首先注射所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂，然后用肉毒杆菌神经毒素进行第二次注射。在该实施方案中，所述肉毒杆菌神经毒素的注射必须在所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的作用持续时间结束之前进行。换言之，可以不同时注射PoNt和肉毒杆菌神经毒素，条件是在PoNT活性衰减发生之前施用所述肉毒杆菌神经毒素，并且任选地在PoNT活性开始之后施用所述肉毒杆菌神经毒素。
在另一个替代实施方案中，可以首先注射所述肉毒杆菌神经毒素，然后用所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂进行第二次注射。在该实施方案中，必须在所述肉毒杆菌神经毒素作用达到其稳定期之前注射所述至少一种神经元传递的突触后抑制剂。
局部施用
与150KDa的BoNT相比，用于本发明所述组合物中的所述PoNT具有低分子量。在美容处理的情况下，对本发明所述组合物的每种组分使用不同类型的应用可能是有吸引力的。例如，可以使用局部应用来递送至少一种PoNT。
在另一个实施方案中，可以将所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂局部应用在靠近目标靶组织的皮肤上，并且在目标靶组织处注射所述肉毒杆菌神经毒素。在该实施方案中，所述肉毒杆菌神经毒素的注射必须在所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的作用持续时间结束之前进行。
注射方案
注射方案还必须适应所述PoNT的药效学特征，以便所述PoNT可以在靶组织的突触水平上与所述肉毒杆菌神经毒素相互作用。
本发明的第二个目的涉及一种增强肉毒杆菌神经毒素组合物的作用的方法，所述方法包括向所述肉毒杆菌神经毒素组合物中添加至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂，即突触后肽或突触后小分子。
“增强肉毒杆菌神经毒素组合物的作用”是指加速肉毒杆菌神经毒素组合物的起效和/或延长肉毒杆菌神经毒素组合物的作用持续时间和/或增强肉毒杆菌神经毒素组合物的作用强度。
因此，本发明涉及一种用于加速肉毒杆菌神经毒素组合物的起效和/或延长肉毒杆菌神经毒素组合物的作用持续时间和/或增强肉毒杆菌神经毒素组合物的作用强度的方法，所述方法包括向所述肉毒杆菌神经毒素组合物中添加至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂，即突触后肽或突触后小分子。
起效
“加速肉毒杆菌神经毒素组合物起效”是指比单独使用BoNT更快地获得肌肉松弛。
优选地，与仅包含BoNT(即不包含任何胆碱能神经元传递的突触后抑制剂)的肉毒杆菌神经毒素组合物的作用持续时间相比，包含所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)的所述肉毒杆菌神经毒素组合物的起效会提前50％，优选提前75％，更优选提前90％发生。
由于在两种组合物中都使用了相同的肉毒杆菌神经毒素，因此将仅包含BoNT的肉毒杆菌神经毒素组合物用作比较的相关对照。
持续时间
“延长肉毒杆菌神经毒素组合物的作用持续时间”是指所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)减缓了BoNT诱导的肌肉松弛的恢复。换言之，肌肉内注射本发明所述组合物后肌肉松弛的持续时间可以被认为是“长期恢复”。
优选地，与仅包含BoNT(即不包含任何胆碱能神经元传递的突触后抑制剂)的肉毒杆菌神经毒素组合物的作用持续时间相比，包含所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)的所述肉毒杆菌神经毒素组合物的作用持续时间延长了10％、25％、50％、100％或更多。
由于在两种组合物中都使用了相同的肉毒杆菌神经毒素，因此将仅包含BoNT的肉毒杆菌神经毒素组合物用作比较的相关对照。
强度
在一些实施方案中，所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的第三个作用可以在于增加所述肉毒杆菌毒素的最大作用强度。优选地，与仅包含肉毒杆菌神经毒素(即不包含任何胆碱能神经元传递的突触后抑制剂)的组合物的最大作用强度相比，所述最大作用强度增强了至少2％，优选至少5％，更优选至少10％。
由于在两种组合物中都使用了相同的肉毒杆菌神经毒素，因此将仅包含BoNT的肉毒杆菌神经毒素组合物用作比较的相关对照。
这第三个作用对于更好地缓解患者(例如在严重的肌张力障碍中)的症状可能特别有吸引力。另一个优点是本发明所述组合物可以以较低剂量的BoNT达到令人满意的效果，从而降低了BoNT过量相关毒性的风险(尤其是在需要在身体不同部位进行多次注射的帕金森患者中)。
起效、强度和持续时间
在一些实施方案中，所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)对肉毒杆菌神经毒素组合物具有三种作用：加速肉毒杆菌神经毒素组合物的起效和延长肉毒杆菌神经毒素组合物的作用持续时间以及增强肉毒杆菌神经毒素组合物的作用强度。
本发明所述组合物还可以包含其他适用于美容或治疗用途的组分。
制剂
本发明的第三个目的是一种美容组合物或药物组合物，所述美容组合物或药物组合物包含本发明所述组合物和一种或多种皮肤学或药学上可接受的载体，例如但不限于白蛋白，优选人血清白蛋白或重组人白蛋白、非还原性二糖或非还原性三糖、非离子表面活性剂和任何其他适用于预期用途的盐和/或添加剂。
本发明所述组合物优选地为允许皮下、肌内、植入和/或局部施用的形式。优选为肌内和皮下施用。
适合注射到受试者或患者(即需要具体治疗的人或其他哺乳动物)中的本发明的组合物可以为溶液、悬浮液、乳液或干粉的形式，在使用前溶解或悬浮在合适的媒介物中。术语“需要(in need)”是指包括药物或健康相关的需要(例如，治疗与肌张力障碍或痉挛相关的病症)，以及美容和主观的需要(例如，改变或改善外观，例如治疗面部皱纹)。
当要局部递送突触后肽时，它可以配制成霜剂、泡沫剂、凝胶剂、洗剂或软膏剂(例如用于局部应用)，或用于皮下注射。局部递送方式可以包括经皮递送(例如通过贴片、离子电渗疗法或超声装置)。
本发明所述组合物适用于局部递送。“局部递送”是指作用部位在所述组合物的应用部位或靠近所述组合物的应用部位。作为非限制性实例，将包含至少一种PoNT和肉毒杆菌神经毒素的组合物注射到待松弛的肌肉中是通过肌内注射将所述组合物局部递送至该肌肉中。
PoNT和BoNT的混合
在优选的实施方案中，所述组合物的制备是通过将所述肉毒杆菌毒素(含有相关非毒素蛋白或不含相关非毒素蛋白)与所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂混合，并且通常还与一种或多种额外的药物可接受的载体或赋形剂混合。在它们最简单的形式中，它们可以包含水性的药学上可接受的稀释剂，例如缓冲盐水。然而，所述组合物可以包含通常存在于可注射药物或药妆组合物中的其他成分，包括与其将要应用的组织相容的皮肤学或药学上可接受的载体、媒介物或介质。如本文所用，术语“皮肤学或药学上可接受的”是指如此描述的组合物或其组分适合用于与这些组织接触使用或适合用于一般患者而没有过度毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等等。在适当的情况下，本发明的组合物可包括所考虑的领域中，特别是美容和皮肤学中常规使用的任何成分。
施用到骨骼肌
本发明所述药物组合物适用于注射到以下一种或多种肌肉或其附近，例如皱眉肌、降眉间肌、枕额肌、鼻肌、口轮匝肌、降口角肌、颈阔肌、胸骨舌骨肌、前锯肌、腹直肌、腹外斜肌、阔筋膜张肌、肱桡肌、髂肌、腰大肌、耻骨肌、长内收肌、缝匠肌、股薄肌(gracillis)、股外侧肌、股直肌、股内侧肌、股四头肌腱、髌骨、腓肠肌、比目鱼肌、胫骨、腓骨长肌、胫骨前肌、髌韧带、髂胫束、小鱼际肌、鱼际肌、尺侧腕屈肌、指浅屈肌、掌长肌、桡侧腕屈肌(flexor carpi radials)、肱桡肌、旋前圆肌、肱肌、肱二头肌、肱三头肌、胸大肌、三角肌、斜方肌、胸锁乳突肌、咬肌、眼轮匝肌、颞肌、颅顶腱膜、大圆肌、指伸肌、尺侧腕伸肌、肘肌、外展拇长肌(abductor policis longus)、跖肌、跟腱(calcanel tendon)、比目鱼肌、大收肌、臀大肌、臀中肌、背阔肌、冈下肌及它们的组合等等。
施用到平滑肌
适用于施用本发明所述组合物的平滑肌可包括以下的任何一种：血管壁、胃壁、输尿管、肠、主动脉(中膜层)、眼睛虹膜、前列腺、胃肠道、呼吸道、小动脉(small arteries)、细动脉(arterioles)、生殖道(两性)、静脉、肾小球(称为系膜细胞)、膀胱(逼尿肌)、子宫、皮肤竖毛肌、睫状肌、括约肌(食道、肛门)、气管、胆管等等。
心脏的本发明的所述药物组合物适用于注射到心外膜脂肪垫，例如窦房结(右上肺静脉(PV)和右下肺静脉)脂肪垫和房室(AV)结(下腔静脉-左心房)脂肪垫。
分泌腺
本发明的所述药物组合物可以直接注射到唾液腺中以减少唾液的产生，或者直接注射到下颌下腺(口腔底部以下)和腮腺(颌后)，或直接注射到手掌、足掌和腋窝的外泌汗腺附近。
重复注射
可能需要一次以上的注射和/或一个以上的注射部位才能达到预期的效果。用于本发明所述组合物中的所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和所述肉毒杆菌毒素的频率和量可由技术人员基于所治疗的具体部位的性质和位置，使用例如照片、扫描、MRI、肌电图等来确定。
注射过程
本发明所述组合物的注射可以通过注射器、导管、针头和其他注射方式进行。所述注射可以在需要治疗的身体的任何部位进行，包括但不限于面部、颈部、躯干、手臂、手、腿和脚。可以注射到具体部位的任何位置，例如表皮、真皮层、皮下层、脂肪或肌肉。
途径
本发明所述组合物的施用途径和剂量可以根据标准选择，例如所述胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和/或所述肉毒杆菌神经毒素的溶解特性以及所处理的美容状况或治疗性状况的强度和范围。
剂量
在本发明的可注射组合物中，所用的所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的有效剂量为待治疗患者的体重的约0.01ng/kg至500μg/kg、优选约1μg/kg至80μg/kg、更优选约4μg/kg至50μg/kg。
所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的剂量选择也可依赖于LD50(杀死50％的测试群体的中位致死剂量)，这对每个PoNT都是特定的。在这种情况下，所用的所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的有效剂量为LD50的约1％至50％、优选为LD50的约5％至30％、更优选为LD50的约10％至20％。
在本发明的可注射组合物中，所用的所述肉毒杆菌神经毒素的有效剂量范围是待处理的约1至1000单位(Unit)、优选约100至500单位、优选约50至200单位、更优选约20至100单位。
“单位”是指活性BoNT的量，其标准化为具有与市售A型肉毒杆菌神经毒素单位等效的神经肌肉阻断作用。众所周知，不同BoNT/A产品的单位不具有等效效力，因此是不可互换的。虽然所有形式的A型毒素具有相同的作用机制，但一小瓶中活性150kDa分子的理论数量/量因制成品而异，并且这种变化可能与LD50(杀死50％的测试群体的中位致死剂量)有关。例如，LD50可以以每毫升单位表示，并且对于每个公司产品都是专有的，以定义这些产品的效力单位。可能需要根据商业对照品校准毒素单位。
在一些实施方案中，所述肉毒杆菌神经毒素可以以5U至1000U的总剂量施用。
在一些实施方案中，所述肉毒杆菌神经毒素可以以每次1U至500U、优选10U至100U、更优选20U至80U的注射剂量施用。最优选地，所述肉毒杆菌神经毒素可以以每次20U至50U的注射剂量施用。
肉毒杆菌神经毒素的剂量也可以用蛋白质的量来表示。例如，在某些实施方案中，所述肉毒杆菌神经毒素可以以每剂约6pg至50ng、优选10pg至45ng、优选20pg至30ng、更优选100pg至15ng的量施用。
制剂
就它们的形式而言，本发明所述组合物可以包含溶液、乳液(包括微乳液或纳米乳液)、悬浮液、凝胶、粉末或其他典型的可施用于肌肉和所述组合物可用的其他组织的固体组合物或液体组合物。在优选的实施方案中，本发明所述组合物以适合用注射器注射的低粘度、无菌制剂的形式存在。如本文所用，当提及根据本发明的所述组合物和制剂时，术语组合物和制剂基本上是可互换的。本发明所述组合物可以是冻干粉末的形式，其在注射前使用药学上可接受的液体稀释剂重新配制。除了至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和肉毒杆菌神经毒素之外，本发明所述组合物可以包含通常用于此类产品的其他成分，例如抗菌剂、水合剂、组织膨胀剂或组织填充剂、防腐剂、乳化剂、天然或合成油、溶剂、表面活性剂、去污剂、胶凝剂、抗氧化剂、填充剂、增稠剂、粉末、粘度控制剂和水，并且任选地包含麻醉剂、止痒活性剂、植物提取物、调理剂、矿物质、多酚、硅酮或其衍生物、维生素和植物药物。
根据本发明的所述可注射组合物可以是控释组合物或缓释组合物的形式，其包含包封在或以其他方式包含在材料中的至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)，以及肉毒杆菌毒素，使得它们随着时间以受控方式在组织内释放。包含肉毒杆菌神经毒素和胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的所述组合物可以包含在基质、脂质体、囊泡、微囊、微球等中，或包含在固体颗粒材料中，所有这些都被选择和/或构建以提供所述肉毒杆菌毒素随时间的释放。所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)和肉毒杆菌毒素可以一起包封(即，在同一胶囊中)或分开包封(即，在单独的胶囊中)。
局部施用
根据本发明的肉毒杆菌毒素制剂可以通过注射(通常使用注射器)以有效量递送至皮肤下面的肌肉或皮肤内的腺体结构以产生麻痹、产生松弛、减轻收缩、预防或减轻痉挛，减少腺体产出，减轻由于肌肉收缩引起的疼痛，或其他所需效果。相对于可注射或可植入材料，以这种方式局部递送所述肉毒杆菌毒素可以减少剂量、降低毒性并允许更精确的剂量优化以获得所需效果。
有效量
施用本发明所述组合物以递送有效量、优选治疗或美容有效量的所述肉毒杆菌毒素。如本文所用，术语“有效量”或“治疗或美容有效量”是指足以产生所需的肌肉松弛或其他生物学或美容效果但绝对安全的量(即低到足以避免严重副作用的量)的如上定义的肉毒杆菌毒素的量。所需的效果包括使某些骨骼肌松弛，目的在于例如，降低过度的肌肉张力(在神经肌肉病症如肌张力障碍的情况下)或减少细纹和/或皱褶的出现，特别是在面部，或以其他方式调整面部外观，例如括大眼睛、抬起嘴角、平滑从上唇向外散开的纹路，或总体缓解肌肉紧张。最后提到的效果，总体缓解肌肉紧张，可以在面部或其他部位实现。其他所需效果与平滑肌的松弛有关，目的是减少异常收缩；例如，这种异常收缩出现在患有膀胱过度活动症的患者身上。其他所需的效果包括减少对心肌的神经元刺激。心肌细胞的病理性神经元刺激与心脏病症如心房颤动有关，因此有必要减少这些刺激。附加的所需效果涉及在诸如多汗症或流涎等病症中减少分泌腺刺激。
本发明所述组合物可以包含适当有效量的所述肉毒杆菌毒素，用作单剂量治疗应用，或者可以更浓缩，用于在施用地点稀释或用于多次应用。通过使用所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)，肉毒杆菌毒素可以通过注射施用于受试者以治疗诸如皱纹、不良的面部肌肉或其他肌肉痉挛、多汗症、痤疮或身体其他部位的需要缓解肌肉疼痛或痉挛的病症。本发明所述组合物特别适用于治疗受试者面部的细纹，例如面部细纹和眉间纹，也称为“皱眉纹”。所述肉毒杆菌毒素通过注射施用到肌肉或其他皮肤相关的或其他效应组织结构。例如，可以施用到腿部、肩部、背部(包括下背部)、腋窝、手掌、脚部、颈部、面部、腹股沟、手背或脚背、肘部、上臂、膝盖、大腿、臀部、躯干、骨盆或任何其他需要施用所述肉毒杆菌毒素的身体部位。
适应症
美容
本发明的第四个目的是一种美容组合物，其用于在有需要的个体中减少皱纹(wrinkle)、细纹如眉间纹或凹沟(furrow)、出于美容目的减少肌肉体积(如咬肌或腓肠)、减少肥厚性疤痕和其他皮肤状况，所述组合物包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)和肉毒杆菌毒素，以及美容上可接受的注射用稀释剂。
治疗性
本发明的可注射含肉毒杆菌毒素组合物的施用也可用于治疗其他病症，包括预防突触传递或防止乙酰胆碱释放或防止其他神经递质释放的任何病症，可以产生治疗效果。
例如，可以通过根据本发明的所述组合物治疗的病症包括但不限于肌张力障碍和痉挛。本发明所述组合物还可用于治疗已经建议或进行了通过注射施用肉毒杆菌毒素的其他病症，例如与肌肉收缩有关的疼痛、膀胱过度活动症、鼻炎、鼻窦炎、痤疮、肌张力障碍、肌张力障碍性收缩(无论是主观的还是临床的)、多汗症(无论是主观的还是临床的)以及由胆碱能神经系统控制的一个或多个分泌腺的分泌过多。
本发明的第五个目的是一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗运动障碍、肌张力障碍、颈部肌张力障碍、痉挛性斜颈、局灶性肌张力障碍、手部局灶性肌张力障碍、睑痉挛、眼睑障碍、斜视、痉挛(spasticity)、脑瘫、局灶性痉挛、肢体痉挛、肌痉挛(spasm)、半面痉挛、震颤、抽搐、磨牙症、失用症和步态僵硬，所述组合物包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)和肉毒杆菌毒素，以及注射用药学上可接受的稀释剂。
在上述治疗适应症中，骨骼肌细胞为突触后细胞。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗痉挛性发声困难、喉部肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、舌肌张力障碍和其他发声障碍、贲门失弛缓症、吞咽困难、食道疼痛(esophagia)、胃轻瘫、痉挛性结肠炎、神经源性、膀胱过度反应(overreactive bladder)、间质性膀胱炎、良性前列腺增生、泌尿功能障碍、大便失禁、便秘、盆底失弛缓(anismus)、肛裂、子宫疼痛(痛经、性交困难)、阴道疼痛(阴道痉挛、外阴痛)、盆腔疼痛、坐骨海绵体肌(阴茎异常勃起)、其他肌张力障碍和其他以肌肉群的不自主运动为特征的病症，所述组合物包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)和肉毒杆菌毒素，以及注射用药学上可接受的稀释剂。
在上述治疗适应症中，平滑肌细胞为突触后细胞。
本发明的另一个目的是一种用于治疗心房颤动的药物组合物，所述组合物包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)和肉毒杆菌毒素，以及注射用药学上可接受的稀释剂。
在上述治疗适应症中，心肌细胞为突触后细胞。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗流泪、多汗症(手、足和腋窝)、流涎、唾液分泌过多、胃肠道分泌物过多、皮脂腺分泌过多(以及相关病症如痤疮)和其他分泌病症，所述组合物包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)和肉毒杆菌毒素，以及注射用药学上可接受的稀释剂。
在上述治疗适应症中，分泌腺细胞为突触后细胞。
在这些预期用途的具体实施方案中，所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂是快速起效抑制剂。
在这些预期用途的更具体的实施方案中，所述至少一种突触后抑制剂是快速起效抑制剂并且所述肉毒杆菌毒素是A型、B型或E型肉毒杆菌毒素，优选A型肉毒杆菌毒素。
本发明还涉及一种用于治疗需要用可注射肉毒杆菌神经毒素治疗的个体的方法，所述方法包括向需要治疗的个体的部位施用药物有效剂量的药物组合物以达到美容或治疗效果，所述药物组合物包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)和肉毒杆菌神经毒素。本发明优选适用于在有需要的受试者中治疗与胆碱能神经元的不需要的活性相关的病症及其潜在相关的疼痛。
在具体实施方案中，所述美容效果是减少皱纹、细纹如眉间纹或凹沟，出于美容目的减少(例如咬肌或腓肠)的肌肉体积，减少肥厚性疤痕和治疗其他皮肤状况。
在另一个具体实施方案中，所述治疗效果是减少运动障碍、肌张力障碍、颈部肌张力障碍、痉挛性斜颈、局部性肌张力障碍、手部局灶性肌张力障碍、睑痉挛、眼睑障碍、斜视、痉挛(spasticity)、脑瘫、局灶性痉挛、肢体痉挛、肌痉挛(spasm)、半面痉挛、震颤、抽搐、磨牙症、失用症和步态僵硬。
在另一个具体实施方案中，所述治疗效果是减少痉挛性发声困难、喉部肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、舌肌张力障碍和其他发声障碍、贲门失弛缓症、吞咽困难、食道疼痛(esophagia)、胃轻瘫、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、膀胱过度反应、间质性膀胱炎、良性前列腺增生、泌尿功能障碍、大便失禁、便秘、盆底失弛缓(anismus)、肛裂、子宫疼痛(痛经、性交困难)、阴道疼痛(阴道痉挛、外阴痛)、盆腔疼痛、坐骨海绵肌体(阴茎异常勃起)、其他肌张力障碍和其他以肌肉群的不自主运动为特征的病症。
在另一个具体实施方案中，所述治疗效果是减少心房颤动。
在另一个具体实施方案中，所述治疗效果是减少流泪、多汗症(手、足和腋窝)、流涎、唾液分泌过多、胃肠道分泌物过多、皮脂腺分泌过多(以及相关病症如痤疮)和其他分泌病症。
所述治疗需要包括治疗必须调节其中特定细胞类型的活性的病症。本发明所述组合物使这种调节成为可能。
在另一个具体实施方案中，当所述突触后细胞是骨骼肌细胞时，待治疗的病症是运动障碍、肌张力障碍、颈部肌张力障碍、痉挛性斜颈、局灶性肌张力障碍、手部局灶性肌张力障碍、睑痉挛、眼睑障碍、斜视、痉挛、脑瘫、局灶性痉挛、肢体痉挛、肌痉挛、半面痉挛、震颤、抽搐、磨牙症、失用症和步态僵硬。
在另一个具体实施方案中，当所述突触后细胞是平滑肌细胞时，待治疗的病症是痉挛性发声困难、喉部肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、舌肌张力障碍和其他发声障碍、贲门失弛缓症、吞咽困难、食道疼痛(esophagia)、胃轻瘫、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、膀胱过度反应、间质性膀胱炎、良性前列腺增生、泌尿功能障碍、大便失禁、便秘、盆底失弛缓(anismus)、肛裂、子宫疼痛(痛经、性交困难)、阴道疼痛(阴道痉挛、外阴痛)、盆腔疼痛、坐骨海绵体肌(阴茎异常勃起)、其他肌张力障碍和其他以肌肉群不自主运动为特征的病症。
在另一个具体实施方案中，当所述突触后细胞是心肌细胞时，待治疗的病症是心房颤动。
在另一个具体实施方案中，当所述突触后细胞是分泌腺细胞时，待治疗的病症是流泪、多汗症(手、足和腋窝)、流涎、唾液分泌过多、胃肠道分泌物过多、皮脂腺分泌过多(以及相关病症如痤疮)和其他分泌病症。
本发明还涉及包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和肉毒杆菌神经毒素的组合物或包含所述组合物的药物组合物在制备用于以下治疗的药物中的用途：
-运动障碍、肌张力障碍、颈部肌张力障碍、痉挛性斜颈、局灶性肌张力障碍、手部局灶性肌张力障碍、睑痉挛、眼睑障碍、斜视、痉挛(spasticity)、脑瘫、局灶性痉挛、肢体痉挛、肌痉挛(spasm)、半面痉挛、震颤、抽搐、磨牙症、失用症和步态僵硬，
-痉挛性发声困难、喉部肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、舌肌张力障碍和其他发声障碍、贲门失弛缓症、吞咽困难、食道疼痛(esophagia)、胃轻瘫、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、膀胱过度反应、间质性膀胱炎、良性前列腺增生、泌尿功能障碍、大便失禁、便秘、盆底失弛缓(anismus)、肛裂、子宫疼痛(痛经、性交困难)、阴道疼痛(阴道痉挛、外阴痛)、盆腔疼痛、坐骨海绵肌(阴茎异常勃起)、其他肌张力障碍和其他以肌肉群不自主运动为特征的病症，
-心房颤动，
-流泪、多汗症(手、足和腋窝)、流涎、唾液分泌过多、胃肠道分泌物过多、皮脂腺分泌过多(以及相关病症如痤疮)和其他分泌病症。
本发明的最后一个目的涉及一种用于实施本发明所述方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括针头及其相应的注射器，或者较小的针头和相应的注射器。优选地，针头是25号至30号的针头。
本领域技术人员能够根据本发明所述组合物的注射部位选择针头的尺寸。
所述试剂盒还包括至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂(即突触后肽或突触后小分子)以及肉毒杆菌神经毒素(优选A型、B型或E型肉毒杆菌神经毒素)，所述胆碱能神经元传递的突触后抑制剂对以下各项具有结合特异性：烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR，特别是(α1)2β1δε或(α1)2β1δγ)，M1、M2或M3毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChR)，电压依赖性L型钙通道(CaV 1.1和CaV1.2)，称为兰尼碱受体(RyR)的大电导Ca2+释放通道(特别是存在于骨骼肌中的RyR1或存在于平滑肌或心肌中的RYR2)，电压门控钠通道(VGSC，例如电压门控Na+(NaV)通道，特别是NaV1.4和Nav1.5)，α1-肾上腺素能受体或β1-肾上腺素能受体。所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和所述肉毒杆菌毒素是在小瓶中混合在一起的(冻干的或液体的)，或者放置在两个腔室中在注射前即时重新配制，或放置在两个单独的小瓶中相继地重新配制并注射。
提供以下实施例以说明本发明的某些优选实施方案和方面，而不应解释为限制其范围。
实施例
可注射肉毒杆菌神经毒素组合物
BoNT/A组合物
BoNT/A组合物是一种包含A型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)的可注射制剂。根据制造商的说明书在生理盐水溶液中重新配制干的BoNT/A，并补充33％的大鼠血清。将来自Merz Pharmaceuticals的150KDa活性肉毒杆菌毒素A XEOMIN@用于实验。BoNT/A的测试剂量为2.5单位/kg至5单位/kg，相当于大约10pg/kg至20pg/kg。
联合组合物
联合组合物是一种包含A型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)和至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的可注射制剂。根据突触后神经传递抑制剂的性质，使用不同的方案来开发联合组合物。
1.2.1具有突触后肽的联合组合物
根据制造商的说明书在生理盐水溶液中重新配置干的BoNT/A。干的突触后肽在补充有大鼠血清的生理盐水中重新配置，并将其添加到BoNT/A重新配置的溶液中。突触后肽通过固相肽合成获得或从供应商处购买(α-银环蛇毒素购自Abcam)。用于实验的突触后肽的剂量范围为1μg/kg至350μg/kg。
1.2.2具有突触后小分子的联合组合物
根据制造商的说明书在生理盐水溶液中重新配制干的BoNT/A。干的突触后小分子在生理盐水、或水、或水/DMSO中重新配制，并可补充大鼠血清；最后将突触后小分子添加到BoNT/A重新配制的溶液中。突触后小分子购自供应商(泮库溴铵、丹曲林、氨氯地平、尼卡地平、维拉帕米和地尔硫卓购自Abcam)。用于实验的小分子剂量范围为1μg/kg至1200μg/kg。
实验步骤
·趾伸展评分(DAS)
动物
使用从Charles River/法国或Janvier Labs/法国或Envigo/法国获得的成年Sprague-Dawley大鼠(200g或400g)进行实验。大鼠在使用前适应至少一周，在动物设施中自由进食和饮水。除非另有说明，每个条件采用5只大鼠。使用如上所述获得和处理的CD-1小鼠(20g)进行其他实验。
在整个研究中的第0、2、4、7天记录动物的体重，并且每周记录一次，直到实验结束。
处理
使用连接到100μL Hamilton注射器的30号或33号针头给动物注射(每只大鼠10μL或20μL)。在实验的第一天，在注射之前，对啮齿动物进行了“零”DAS反应的预筛选。然后，对大鼠右胫骨前(TA)肌进行肌内(IM)注射。左TA肌注射盐水溶液(10μL)作为对照。
趾伸展评分分析(DAS)
使用Broide等人(TOXICON,2013,71,pp.18-24)报告的趾伸展评分(DAS)分析测量肌肉麻痹。在化合物注射后的不同时间点通过引发趾伸展对动物的DAS反应进行评分：5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、6个小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天并且每天一次，直到连续两天的两次连续测量等于零(DAS＝0)。由两名对处理不知情的独立观察者对不同程度的趾伸展进行评分(0＝正常趾伸展至4＝最大限度的趾伸展减少，即没有一个脚趾可以伸展)。
正如在大鼠DAS研究中通常所做的那样，DAS反应的诱导是通过抓住大鼠的躯干周围、将其升高到空中并模拟跌落到平面。大鼠通常会条件反射性地展开后爪脚趾来应对冲击，当动物面朝上半卧时，DAS反应会立即被评分。
数据分析
如上所述，当观察到第1个脚趾失去伸展时，DAS评分为“1”。当三个脚趾连在一起时，DAS评分为“2”。当四个脚趾连在一起时，评分为“3”，当右爪的所有五个脚趾在伸展期间连在一起时，大鼠的评分为“4”。
在不同组大鼠中测量每个时间点的DAS反应，评估和比较动力学(肌肉减弱的开始和效力的持续时间)。
对于每只大鼠，DAS曲线下面积(以DAS*小时为单位)采用T＝0至T＝24小时之间(早期AUC)、T＝24小时至T＝120小时之间(中等AUC)、T＝120小时至实验结束之间(晚期AUC)的一系列Riemann和来计算。
对于每组，起效定义为平均DAS>1的第一次；作用持续时间定义为平均DAS>1的最后一个时间点；作用峰值定义为最大平均DAS值。
BoNT/A与结合电压门控钠通道NaV1.4的突触后肽的组合的作用
为了确定与单独的BoNT/A的药效学特征相比的BoNT/A与μ-芋螺毒素CnIIIc突触后肽的组合的药效学特征，使用5U/kg的BoNT/A与剂量范围为0.4μg/kg至40μg/kg的μ-芋螺毒素CnIIIc突触后肽的组合以及单独使用5U/kg的BoNT/A对大鼠右胫骨前(TA)肌进行注射。用于本实验的μ-芋螺毒素CnIIIc突触后肽的序列是SEQ ID NO：54。
图1的结果显示，BoNT/A在注射12小时后开始起效，在72小时达到3的作用峰值。作用持续时间为5天。
更快速的起效
与单独注射BoNT/A相比，注射BoNT/A和μ-芋螺毒素CnIIIc突触后肽的组合导致明显更短的起效。起效取决于μ-芋螺毒素CnIIIc的剂量：在40μg/kg时，仅1小时后起效；在20μg/kg时，仅2小时前起效，以及在8μg/kg时，约4小时起效。
峰值增加
在最高剂量的μ-芋螺毒素CnIIIc存在下，作用峰值从单独使用BoNT/A的3.4增加到4.0。
持续时间增加
所述组合的作用持续时间也比单独使用BoNT/A更长，并且取决于所使用的μ-芋螺毒素CnIIIc的剂量：在8μg/kg时，持续时间在168小时至192之间；在20μg/kg时，持续时间在192小时至216小时之间以及在40μg/kg时，持续时间在216小时至240小时之间(而单独使用BoNT/A时，持续时间仅超过120小时)。
总之，这些数据表明，与单独使用BoNT/A相比，使用BoNT/A和μ-芋螺毒素CnIIIc的组合可以使局部肌肉松弛起效更快、肌肉松弛作用更有效和持续时间延长。
协同作用
当BoNT/A与μ-芋螺毒素CnIIIc组合时观察到的BoNT/A效应增强不能仅通过组合物的两种组分的相加效应来解释。这些结果如图2所示。
为了分析BoNT/A和μ-芋螺毒素CnIIIc突触后肽的组合的协同效应，将所述组合与单独使用BoNT/A和单独使用μ-芋螺毒素CnIIIc肽进行了比较。使用5U/kg的BoNT/A与剂量为80μg/kg的μ-芋螺毒素CnIIIc突触后肽的组合、单独的5U/kg的BoNT/A或剂量为80μg/kg的μ-芋螺毒素CnIIIc突触后肽对大鼠右胫骨前(TA)肌进行注射，每组5只大鼠。用于本实验的μ-芋螺毒素CnIIIc突触后肽的序列是SEQ ID NO:54。
结果如图2所示，表明BoNT/A的DAS峰值出现在12小时至24小时之间，注射后72小时的最大平均评分为2.8。BoNT/A的DAS在第4天开始下降。可观察到作用的持续时间直到BoNT/A注射后6天。注射后0.5小时至1小时可观察到μ-芋螺毒素CnIIIc突触后肽的起效，注射后2小时的最大强度为3.6。单独使用μ-芋螺毒素CnIIIc肽的DAS早在注射后6小时就开始下降。从逻辑上讲，两种处理的计算相加显示出两个峰值，第一个在注射后2小时，第二个在注射后72小时；值得注意的是，两个峰值之间的分数回到了低水平(DAS＜2)。引人注目的是，BoNT/A与μ-芋螺毒素CnIIIc的组合没有显示出两个峰值，而是在注射后2小时-6小时(起效)到144小时-168小时(持续时间)出现持续的肌肉松弛。所述BoNT/A与突触后μ-芋螺毒素CnIIIc的组合不仅仅是两种成分作用的相加，还表现出协同作用。
曲线下面积的计算(以DAS*小时为单位的AUC)说明了协同效应：
Figure BDA0003509450730000691
表11：曲线下面积(来自图2)
该表表明BoNT/A和μ-芋螺毒素CnIIIc的组合对起效(早期：123.4>100.8)、作用强度(中期：240>180.3)和作用持续时间(晚期：103.2>3)的影响大于两种成分的叠加作用。
BoNT/A与结合烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的组合的作用
这个实施例比较了注射BoNT/A或BoNT/A与三种结合nAChR的神经元传递的突触后抑制剂的组合的大鼠局部肌肉松弛的起效、强度和持续时间。每组仅处理一只大鼠。
泮库溴铵
为了确定BoNT/A与BoNT/A和泮库溴铵的组合相比的起效和作用持续时间，使用5U/kg的BoNT/A或5U/kg的BoNT/A和57μg/kg的泮库溴铵的组合对大鼠进行注射。
结果如图3所示，表明BoNT/A的DAS峰值出现在12小时至24小时，注射后72小时的最高评分为3.2。BoNT/A的DAS在第4天开始下降。在BoNT/A注射后7天，趾伸展完全恢复。与注射BoNT/A相比，注射BoNT/A和泮库溴铵的组合导致在DAS中起效更快速；起效出现在注射后5分钟至15分钟。在存在泮库溴铵的情况下，最大DAS评分也增加到4.0。最后，在BoNT/A中加入泮库溴铵会略微延长肌肉松弛的持续时间；注射后6天，趾伸展仍然受损(DAS＝2)，而BoNT/A处理的大鼠的趾伸展开始恢复(DAS＜1)。
这些数据表明，与使用单独的BoNT/A相比，使用BoNT/A与泮库溴铵的组合的局部肌松弛作用使起效更快速、肌肉松弛作用更有效以及作用持续时间更长。
α-芋螺毒素突触后肽
为了确定与BoNT/A和海蜗牛(Conus magus)突触后肽的组合相比，BoNT/A的起效、作用强度和作用持续时间，使用5U/kg的BoNT/A或5U/kg的BoNT/A和8μg/kg的SEQ ID NO:8的α-芋螺毒素MI肽的组合对大鼠进行注射。
结果如图3所示，表明BoNT/A的DAS峰值出现在12小时至24小时，注射后72小时的最高评分为3.2。BoNT/A的DAS在第4天开始下降。在BoNT/A注射后7天，趾伸展完全恢复。与注射BoNT/A相比，注射BoNT/A和α-芋螺毒素MI肽的组合导致在DAS中起效更快速；起效出现在注射后2小时至4小时。在存在α-芋螺毒素MI肽的情况下，最大DAS评分也增加到4.0。最后，在BoNT/A中加入α-芋螺毒素MI肽可极大延长肌肉松弛的持续时间；注射后12天，趾伸展仍未恢复。
这些数据表明，与单独使用BoNT/A相比，使用BoNT/A和α-芋螺毒素MI肽的组合使局部肌肉松弛起效更快速、肌肉松弛作用更有效以及作用持续时间更长。
α-银环蛇毒素
为了确定BoNT/A与BoNT/A与环蛇毒素肽的组合相比的起效和作用持续时间，使用5U/kg的BoNT/A或5U/kg的BoNT/A与17μg/kg的SEQ ID NO:4的α-银环蛇毒素肽对大鼠进行注射。
在注射后的前10分钟至12天(288小时)的多个时间点记录每只大鼠的DAS。结果如图3所示，表明BoNT/A的DAS峰值出现在12小时至24小时，注射后72小时的最高评分为3.2。BoNT/A的DAS从第4天开始下降。在BoNT/A注射后7天，趾伸展完全恢复。与注射BoNT/A相比，注射BoNT/A和α-银环蛇毒素的组合导致在DAS中起效更快速；起效出现在注射后15分钟至30分钟。在存在α-银环蛇毒素的情况下，最大DAS也增加到4.0。最后，在BoNT/A中添加α-银环蛇毒素可将肌肉松弛的持续时间延长4天。
这些数据表明，与使用单独的BoNT/A相比，使用BoNT/A和α-银环蛇毒素的组合使局部肌肉松弛起效更快速、肌肉松弛作用更有效和作用持续时间更长。
总体数据表明，通过使用靶向nAChR的神经元传递的突触后抑制剂可以获得更快速的肉毒杆菌毒素起效和/或更长的肉毒杆菌毒素作用持续时间和/或增强的肉毒杆菌毒素作用。
BoNT/A与结合兰尼碱受体(RYR1)的胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的组合的作用
丹曲林
为了确定BoNT/A与BoNT/A和丹曲林(一种已知的RYR1抑制剂)的组合相比的起效和作用持续时间，使用5U/kg的BoNT/A或5U/kg的BoNT/A与1.6μg/kg的丹曲林的组合对大鼠进行注射。
在注射后的前10分钟至12天(288小时)的多个时间点记录每只大鼠的DAS。结果如图4所示，表明BoNT/A的DAS峰值出现在12小时至24小时，注射后72小时的最高评分为3.2。BoNT/A的DAS在第4天开始下降。在BoNT/A注射后7天，趾伸展完全恢复。与注射BoNT/A相比，注射BoNT/A和丹曲林的组合导致在DAS中起效更快速；起效出现在注射后2小时至4小时。在存在丹曲林的情况下，最大DAS也增加到4.0。最后，在BoNT/A中加入丹曲林会大大延长肌肉松弛的持续时间；注射后12天，趾伸展仍未恢复。
这些数据表明，与使用单独的BoNT/A相比，使用BoNT/A和丹曲林的组合使局部肌肉松弛起效更快速、肌肉松弛作用更有效和作用持续时间更长。
杀虫毒素LaIT1
为了确定BoNT/A与BoNT/A和杀虫毒素LaIT1的组合相比的起效和作用持续时间，使用5U/kg的BoNT/A或5U/kg的BoNT/A和36μg/kg的SEQ ID NO:23的LaIT1肽对大鼠进行注射。
在注射后的前10分钟至12天(288小时)的多个时间点记录每只大鼠的DAS。结果如图4所示，表明BoNT/A的DAS峰值出现在12小时至24小时，注射后72小时的最高评分为3.2。BoNT/A的DAS在第4天开始下降。在BoNT/A注射后7天，趾伸展完全恢复。与注射BoNT/A相比，注射BoNT/A和杀虫毒素LaIT1的组合导致在DAS中起效更快速；起效出现在注射后2小时至6小时。在杀虫毒素LaIT1存在的情况下，最大DAS也增加到4.0。最后，通过在BoNT/A中添加杀虫毒素LaIT1将肌肉松弛的持续时间延长了5天。因此，获得了更长的BoNT/A作用持续时间。
这些数据表明，与使用BoNT/A相比，使用BoNT/A和杀虫毒素LaIT1的组合使局部肌肉松弛起效更快速、肌肉松弛作用更有效和作用持续时间更长。
总体数据表明，通过使用靶向RYR1的神经元传递的突触后抑制剂可以获得更快速的肉毒杆菌毒素起效和/或更长的肉毒杆菌毒素作用持续时间和/或增强的肉毒杆菌毒素作用。
BoNT/A和两种密切相关的与电压门控钠通道NaV1.4结合的胆碱能神经元传递突触后抑制剂的组合的作用
将BoNT/A和μ-芋螺毒素CnIIIc突触后肽的组合的药效学特征与BoNT/A和μ-芋螺毒素CnIIIc肽的变体的组合的药效学特征进行了比较。用于本实验中的所述肽的变体具有与由SEQ ID NO:53定义的共有序列相匹配的序列(SEQ ID NO:95)；用于本实验的野生型μ-芋螺毒素CnIIIc肽的序列是SEQ ID NO:54。为了进行比较，将5U/kg的BoNT/A分别与25μg/kg的每个μ-芋螺毒素CnIIIc突触后肽组合使用，对大鼠进行右胫骨前(TA)肌注射；对照大鼠仅注射5U/kg的BoNT/A。
通过计算作用早期、中期和晚期的曲线下面积(AUC)对结果进行了分析；对于每个阶段，出于比较的目的，提供了相对于对照(单独使用BoNT/A)的AUC增加百分比。最终的计算结果如图5所示，首先证明了两种组合都能够增加起效(早期AUC)、作用强度(中期AUC)和作用持续时间(晚期AUC)，所有百分比均高于0％。其次，结果表明，与具有野生型μ-芋螺毒素CnIIIc的组合相比，所述变体的组合表现出略微不同的药理学特征：前者的作用在早期和晚期更明显，而对峰值强度的影响较少。
总体数据说明了将突触后肽抑制剂分类为共享共有序列的家族的优势。一方面，一个家族中的肽具有相似的作用；另一方面，它们略微不同的药理学特征可以有助于用于药物设计。
BoNT/A与结合电压依赖性L型钙通道(Cav1.1)的胆碱能神经元传递的突触后抑制剂组合的作用
氨氯地平
为了确定BoNT/A与BoNT/A和氨氯地平(一种已知的Cav1.1抑制剂)的组合相比的起效和作用持续时间，使用5U/kg的BoNT/A或5U/kg的BoNT/A和83μg/kg的氨氯地平的组合对大鼠进行注射。
在注射后的前10分钟至14天(336小时)的多个时间点记录每只大鼠的DAS。结果如图6所示，表明BoNT/A的DAS峰值出现在24小时至48小时，注射后72小时的最高评分为3.8。BoNT/A的DAS在第4天开始下降；直到第11天，所述评分都在1以上。与注射BoNT/A相比，注射BoNT/A和氨氯地平的组合导致在DAS中起效更快速；起效出现在注射后2小时至4小时。在存在氨氯地平的情况下，最大DAS也增加到4.0。最后，在BoNT/A中添加氨氯地平会延长肌肉松弛的持续时间；趾伸展评分保持在1以上直到第13天。
这些数据表明，与使用单独的BoNT/A相比，使用BoNT/A和氨氯地平的组合使局部肌肉松弛起效更快速、肌肉松弛作用更有效和作用持续时间更长。
地尔硫卓
为了确定BoNT/A与BoNT/A和地尔硫卓(一种已知的Cav1.1抑制剂)的组合相比的起效和作用持续时间，使用5U/kg的BoNT/A或5U/kg的BoNT/A和83μg/kg的地尔硫卓的组合对大鼠进行注射。
在注射后的前10分钟至14天(336小时)的多个时间点记录每只大鼠的DAS。结果如图6所示，表明BoNT/A的DAS峰值出现在24小时至48小时，注射后72小时最高评分为3.8。BoNT/A的DAS在第4天开始下降；直到第11天，所述评分都在1以上。与注射BoNT/A相比，注射BoNT/A和地尔硫卓的组合导致在DAS中起效更快速；起效出现在注射后0.5小时至1小时。在存在地尔硫卓的情况下，最大DAS也增加到4.0。最后，在BoNT/A中加入地尔硫卓会延长肌肉松弛的持续时间；趾伸展评分保持在1以上，直到第13天。
这些数据表明，与使用单独的BoNT/A相比，使用BoNT/A和地尔硫卓的组合使局部肌肉松弛起效更快速、肌肉松弛作用更有效和作用持续时间更长。
维拉帕米
为了确定BoNT/A与BoNT/A和维拉帕米(一种已知的Cav1.1抑制剂)的组合相比的起效和作用持续时间，使用5U/kg的BoNT/A或5U/kg的BoNT/A和83μg/kg的维拉帕米的组合对大鼠进行注射。
在注射后的前10分钟至14天(336小时)的多个时间点记录每只大鼠的DAS。结果如图6所示，表明BoNT/A的DAS峰值出现在24小时至48小时，注射后72小时最高评分为3.8。BoNT/A的DAS在第4天开始下降；直到第11天，所述评分都在1以上。与注射BoNT/A相比，注射BoNT/A和维拉帕米的组合导致在DAS中起效更快速；起效出现在注射后4小时至6小时。在存在维拉帕米的情况下，最大DAS也增加到4.0。最后，其肌肉松弛的持续时间与BoNT诱导的肌松弛的持续时间相当。
这些数据表明，与使用单独的BoNT/A相比，使用BoNT/A和维拉帕米的组合使局部肌肉松弛起效更快速、肌肉松弛作用更有效。BoNT/A与胆碱能神经元传递的突触后抑制剂小分子的组合的作用：比较
为了确定BoNT/A与BoNT/A和作为突触后抑制剂的小分子的组合相比的药理学特征，使用5U/kg的BoNT/A或5U/kg的BoNT/A与不同剂量的几种小分子的组合对大鼠进行注射。这些分子是已知的nAChR(泮库溴铵、琥珀胆碱)或RYR1(丹曲林)或Cav1.1(氨氯地平、地尔硫卓、维拉帕米)的抑制剂。通过计算实验过程中的曲线下面积(AUC)来对结果进行分析；出于比较的目的，提供了相对于对照(单独使用BoNT/A)的AUC增加百分比。
结果如图7所示，表明所有测试的小分子都能够增强BoNT肌肉松弛的效果。丹曲林与BoNT组合使用的效果尤为显著。
BoNT/A与胆碱能神经元传递的突触后抑制剂肽组合的作用：比较
为了确定BoNT/A与BoNT/A和作为突触后抑制剂的肽的组合相比的药理学特征，使用5U/kg的BoNT/A或5U/kg的BoNT/A与各种剂量的几种肽的组合对大鼠进行注射。这些分子是已知的nAChR(α-银环蛇毒素、α-芋螺毒素MI、Waglerin-1、αC-芋螺毒素PrXA)或RYR1(LaIT1毒素、Imperacalcin)或Cav1.1(U7-Ctenitoxin Pn1b、ω-conotoxin TxVII、U6-Ctenitoxin Pn1a、U9-Ctenitoxin Pn1a、κ-Ctenitoxin Pn1a和Glacontryphan)或Nav1.4(μ-芋螺毒素CnIIIc、μ-芋螺毒素GIIIb、μ-Thomitoxin Hme1a、μ-芋螺毒素GvIIJ、μO-芋螺毒素MfVIA和μ-Thomitoxin Hme1b)的抑制剂。通过计算实验过程中的曲线下面积(AUC)来对结果进行分析；出于比较的目的，提供了相对于对照(单独使用BoNT/A)的AUC增加百分比。
结果如图8所示，表明所有测试的小分子都能够增强BoNT肌肉松弛的效果。α-芋螺毒素MI和BoNT组合使用的效果尤为显著。
·复合肌肉动作电位(CMAP)
动物
使用从Charles River(法国)或Janvier Labs(法国)或Envigo(法国)获得的成年Sprague-Dawley大鼠(200g)进行实验。大鼠在使用前适应至少一周，在动物设施中自由进食和饮水。
在整个研究过程中每天记录动物的体重，直到实验结束。
数据采集和处理
-处理
使用连接到100μL Hamilton注射器的33号针头注射动物(每只大鼠20μL)。然后，对大鼠右胫骨前(TA)肌进行肌内(IM)注射。
-麻醉
在每次CMAP测量中用异氟醚麻醉动物。将动物保持在37℃的加热板上以控制体温并在麻醉前用生理盐水溶液(通过皮下注射)补充水分。
-测量
将动物以俯卧位放置在加热垫上进行测量。用于CMAP测量的电极针放置如下：
-模拟电极皮下放置于坐骨切迹两侧。
-记录电极皮下放置于与胫骨前肌对齐的位置。
-参考电极皮下放置于跟腱旁边。
-接地电极皮下放置于模拟电极的对侧。
CMAP测量是通过使用
Figure BDA0003509450730000761
UltraPro S100 EMG装置进行刺激来实现和记录的。
通常，该测量在注射前6天实现以用于基线测量，并在复合物注射后的不同时间点实现：2小时、1天、2天、4天、7天、9天、11天、14天。
数据分析
在测量过程中分析了两个参数：潜伏期和峰间幅值。潜伏期由从刺激到CMAP反应开始的延迟决定。峰间幅值的测量是从双相波的最大负峰值到最大正峰值。然后可以根据测量时间绘制CMAP幅度。在这条曲线上，起效定义为当抑制大于基线的20％时；活性峰值定义为最大抑制(基线百分比)；作用持续时间定义为恢复到基线的20％所需的时间。
使用Student t检验逐组比较所有数据，并使用Fisher检验比较同质性。
·神经源性逼尿肌过度活动的体内模型
动物
使用从Charles River(法国)或Janvier Labs(法国)或Envigo(法国)获得的成年Sprague-Dawley大鼠(200g)进行实验。大鼠在使用前适应至少一周，在动物设施中自由进食和饮水。在此之后，对动物进行T8-T9脊髓横切。在整个研究过程中每天记录动物的体重，直到实验结束。
处理
在脊髓横切术后第19天，当神经源性逼尿肌过度活跃时，用异氟醚麻醉动物，使其膀胱暴露并排空。使用显微镜，使用30G的针头对逼尿肌进行注射，所述针头与装有溶液的Hamilton注射器相连。注射剂量分布在避开三角区的4个或8个注射部位。然后将导管插入膀胱圆顶，在皮下贯穿，外伸至颈部后方并在肩胛骨之间缝合。术后，用庆大霉素处理大鼠。
测量
在逼尿肌内注射后的不同时间点(24小时、48小时、7天和14天)对大鼠进行膀胱测压。
首先，分析了排尿参数和充盈参数：排尿收缩的最大压力(毫米汞柱mmHg)、输注体积(以μL为单位的膀胱容量)和排尿效率(排尿体积与输注体积的百分比)。然后，分析非排尿收缩(在充盈阶段幅度>3mmHg的收缩)：幅度(mmHg)、频率(每分钟数)和引起非排尿阶段的体积阈值(占总充盈体积的百分比)。
数据分析
所有数据均表示为每个处理组平均值的平均值+/-标准差。Grubb检验用于排除异常值。对每个膀胱测压参数进行方差分析以比较不同组以允许它们集合。
·离体：膀胱模型
动物
使用从Charles River(法国)或Janvier Labs(法国)或Envigo(法国)获得的成年Sprague-Dawley大鼠(200g)进行实验。大鼠在使用前适应至少一周，在动物设施中自由进食和饮水。在实验当天，用异氟醚麻醉大鼠并在收集组织前放血。收集并清理膀胱，从一个膀胱上切下两条约6×2mm的条带，固定在定制的电极组织支架上，并在器官浴槽中拉紧至0.5g，所述器官浴槽通常充满KHB并于37℃、pH 7.4用混合氧起泡。用等距传感器测量膀胱收缩力。在大约45分钟的平衡期后，每15分钟更新一次缓冲液，通过施加KCl(通常为70mmol/L)来验证膀胱的完整性。将卡巴胆碱(其激活乙酰胆碱受体)溶液用于测试突触后受体(通常为10μmol/L)。随后，用训练脉冲进行电场刺激，诱发逼尿肌的收缩。这种刺激是通过使用两个铂电极产生的，所述铂电极放置在条带的每侧的几毫米处。
处理
在经过密集的洗涤和一段稳定的收缩期后，将处理溶液添加到浴槽中。处理包含各种浓度的BoNT/A，单独或与突触后抑制剂混合。每个条带仅进行一次处理并记录信号，直到90％的信号被消除，如果未达到此值，则记录6小时的信号。在实验结束时，最后添加卡巴胆碱以评估组织的活力。当刺激后卡巴胆碱反应小于刺激前卡巴胆碱反应的80％时，实验作废。
数据分析
结果表示为仅在添加处理之前的初始对照收缩的百分比。数据表示为单个数据或平均值的平均值+/-标准差。针对每组条件绘制浓度曲线。对于统计分析，进行了未配对的Student t检验。
序列表
<110> 法斯托克斯制药有限公司
<120> 调节肉毒杆菌神经毒素作用的组合物
<130> FTP-B-0001-PCT1
<160> 95
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Azemiopsin
<400> 1
Asp Asn Trp Trp Pro Lys Pro Pro His Gln Gly Pro Arg Pro Pro Arg
1 5 10 15
Pro Arg Pro Lys Pro
20
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Wagglerin-1的共有序列（Consensus sequence for Wagglerin-1）
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸（Xaa can be any naturally occurringamino acid）
<400> 2
Gly Gly Lys Pro Asp Leu Arg Pro Cys Xaa Pro Pro Cys His Tyr Ile
1 5 10 15
Pro Arg Pro Lys Pro Arg
20
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> Wagglerin-1
<400> 3
Gly Gly Lys Pro Asp Leu Arg Pro Cys His Pro Pro Cys His Tyr Ile
1 5 10 15
Pro Arg Pro Lys Pro Arg
20
<210> 4
<211> 74
<212> PRT
<213> α-银环蛇毒素（ alpha-bungarotoxin）
<400> 4
Ile Val Cys His Thr Thr Ala Thr Ser Pro Ile Ser Ala Val Thr Cys
1 5 10 15
Pro Pro Gly Glu Asn Leu Cys Tyr Arg Lys Met Trp Cys Asp Ala Phe
20 25 30
Cys Ser Ser Arg Gly Lys Val Val Glu Leu Gly Cys Ala Ala Thr Cys
35 40 45
Pro Ser Lys Lys Pro Tyr Glu Glu Val Thr Cys Cys Ser Thr Asp Lys
50 55 60
Cys Asn Pro His Pro Lys Gln Arg Pro Gly
65 70
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> αC-芋螺毒素PrXA（alphaC-Conotoxin PrXA）
<400> 5
Thr Tyr Gly Ile Tyr Asp Ala Lys Pro Pro Phe Ser Cys Ala Gly Leu
1 5 10 15
Arg Gly Gly Cys Val Leu Pro Pro Asn Leu Arg Pro Lys Phe Lys Glu
20 25 30
<210> 6
<211> 71
<212> PRT
<213> α-眼镜蛇毒素（alpha-cobratoxin）
<400> 6
Ile Arg Cys Phe Ile Thr Pro Asp Ile Thr Ser Lys Asp Cys Pro Asn
1 5 10 15
Gly His Val Cys Tyr Thr Lys Thr Trp Cys Asp Ala Phe Cys Ser Ile
20 25 30
Arg Gly Lys Arg Val Asp Leu Gly Cys Ala Ala Thr Cys Pro Thr Val
35 40 45
Lys Thr Gly Val Asp Ile Gln Cys Cys Ser Thr Asp Asn Cys Asn Pro
50 55 60
Phe Pro Thr Arg Lys Arg Pro
65 70
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> α-芋螺毒素GI或α-芋螺毒素MI的共有序列（Consensus sequence for alpha-conotoxin GI or alpha-conotoxin MI）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=不存在或G（ X=absent or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=不存在或D或N或S或R（ X=absent or D or N or S or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=不存在或G（X=absent or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X=不存在或E或R或Y或I（X=absent or E or R or Y or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=N或H（ X=N or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=G或A（X=G or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=不存在或G或A（X=absent or G or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=R或K或P（X=R or K or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X=H或Y或N或K（X=H or Y or N or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=Y或F（X=Y or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X=S或N或K或D（X=S or N or K or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=不存在或G（X=absent or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=不存在或K或R（X=absent or K or R）
<400> 7
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Cys Xaa Pro Ala Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Cys Xaa Xaa
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> α-芋螺毒素MI（alpha-Conotoxin MI）
<400> 8
Gly Arg Cys Cys His Pro Ala Cys Gly Lys Asn Tyr Ser Cys
1 5 10
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> α-芋螺毒素GI（alpha-Conotoxin GI）
<400> 9
Glu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Gly Arg His Tyr Ser Cys
1 5 10
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> ψ-芋螺毒素-PrIIIE（Psi-conotoxin-PrIIIE）
<400> 10
Ala Ala Arg Cys Cys Thr Tyr His Gly Ser Cys Leu Lys Glu Lys Cys
1 5 10 15
Arg Arg Lys Tyr Cys Cys
20
<210> 11
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Candoxin的共有序列（Consensus sequence for Candoxin）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=M或I（ X=M or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=N或H或Q（X=N or H or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=D或N（X=D or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=A或P（X=A or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X=A或S（X=A or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=S或G（X=S or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X=G或E（X=G or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X=K或I（ X=K or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=R或S（X=R or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=E或T（X=E or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X=A或T（X=A or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> X=L或N（X=L or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> X=T或I（X=T or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (64)..(64)
<223> X=D或E（X=D or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(67)
<223> X=不存在或I（X=absent or I）
<400> 11
Xaa Lys Cys Lys Ile Cys Xaa Phe Xaa Thr Cys Arg Xaa Gly Glu Leu
1 5 10 15
Lys Val Cys Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Tyr Cys Phe Lys Glu Ser Trp Xaa
20 25 30
Xaa Ala Arg Gly Thr Arg Ile Glu Arg Gly Cys Xaa Ala Thr Cys Pro
35 40 45
Lys Gly Ser Val Tyr Gly Xaa Tyr Val Leu Cys Cys Thr Xaa Asp Xaa
50 55 60
Cys Asn Xaa
65
<210> 12
<211> 66
<212> PRT
<213> Candoxin
<400> 12
Met Lys Cys Lys Ile Cys Asn Phe Asp Thr Cys Arg Ala Gly Glu Leu
1 5 10 15
Lys Val Cys Ala Ser Gly Glu Lys Tyr Cys Phe Lys Glu Ser Trp Arg
20 25 30
Glu Ala Arg Gly Thr Arg Ile Glu Arg Gly Cys Ala Ala Thr Cys Pro
35 40 45
Lys Gly Ser Val Tyr Gly Leu Tyr Val Leu Cys Cys Thr Thr Asp Asp
50 55 60
Cys Asn
65
<210> 13
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Haditoxin的共有序列（Consensus sequence for Haditoxin）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=T或K（X=T or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=K或I或L或T（X=K or I or L or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X=Y或F（X=Y or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=H或D（X=H or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=Q或L或D（X=Q or L or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=S或T或L（X=S or T or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=T或R（X=T or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=T或N（X=T or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=P或S（X=P or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=E或K（X=E or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X=I或L（X=I or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=P或G或R（X=P or G or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=D或H（X=D or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=G或W或M或V（X=G or W or M or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> X=Y或F（X=Y or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> X=S或I或N（X=S or I or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> X=W或L（X=W or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=I或A（X=I or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=D或Y或A（X=D or Y or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=G or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=R或N或G（X=R or N or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=E或D或V（X=E or D or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X=G或V或E（X=G or V or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X=R或K（X=R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> X=E或K（X=E or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> X=T或S（X=T or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X=F或L（X=F or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> X=E或D（X=E or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> X=L或I（X=L or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> X=T或R或K（X=T or R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> X=P或S或Y（X=P or S or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> X=N或T（X=N or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> X=K或I（X=K or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> X=V或I（X=V or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> X=R或T（X=R or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> X=K或N（X=K or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> X=Q或D或A（X=Q or D or A）
<400> 13
Xaa Xaa Cys Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Thr Glu Xaa
1 5 10 15
Cys Xaa Xaa Ser Xaa Tyr Phe Cys Xaa Lys Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Arg Gly Cys Xaa Xaa Thr Cys Pro Xaa Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Tyr Xaa Tyr Cys Cys Xaa Arg Asp Xaa Cys Asn
50 55 60
Xaa
65
<210> 14
<211> 65
<212> PRT
<213> Haditoxin
<400> 14
Thr Lys Cys Tyr Asn His Gln Ser Thr Thr Pro Glu Thr Thr Glu Ile
1 5 10 15
Cys Pro Asp Ser Gly Tyr Phe Cys Tyr Lys Ser Ser Trp Ile Asp Gly
20 25 30
Arg Glu Gly Arg Ile Glu Arg Gly Cys Thr Phe Thr Cys Pro Glu Leu
35 40 45
Thr Pro Asn Gly Lys Tyr Val Tyr Cys Cys Arg Arg Asp Lys Cys Asn
50 55 60
Gln
65
<210> 15
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Imperacalcin的共有序列（Consensus sequence for Imperacalcin）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=G或A或K或R（X=G or A or K or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=D或N或S（X=D or N or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X=L或I或K（X=L or I or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=P或A或K或E（X=P or A or K or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=H或 N或K（X=H or N or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=L或R（X=L or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=K或Q或R（X=K or Q or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=R或L或I（X=R or L or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=K或R（X=K or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=A或E或K或N或T（X=A or E or K or N or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=D或N或T（X=D or N or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X=N或K或R（X=N or K or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=D或E或Q（X=D or E or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=G或S（X=G or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=K或N（X=K or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X=K或S或N（X=K or S or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X=K或S或V（X=K or S or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X=T或A或R（X=T or A or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> X=N或Q或I（X=N or Q or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> X=A或P或I（X=A or P or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> X=E或S（X=E or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=K或Q（X=K or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=R或K（X=R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=R或E（X=R or E）
<400> 15
Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10 15
Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Arg Arg Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
20 25 30
Xaa
<210> 16
<211> 33
<212> PRT
<213> Imperacalcin
<400> 16
Gly Asp Cys Leu Pro His Leu Lys Arg Cys Lys Ala Asp Asn Asp Cys
1 5 10 15
Cys Gly Lys Lys Cys Lys Arg Arg Gly Thr Asn Ala Glu Lys Arg Cys
20 25 30
Arg
<210> 17
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 磷脂酶A2（大亚基）或磷脂酶A2 imperatoxin-1（大亚基）或heteromtoxin（大亚基）的共有序列（Consensus for Phospholipase A2 (large subunit) or Phospholipase
A2 imperatoxin-1 or Heteromtoxin (large subunit)）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=T或I（X=T or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=M或V或I（X=M or V or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=W或L（X=W or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=S或A（X=S or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=N或S（X=N or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=E或K（X=E or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=I或T或A或E（X=I or T or A or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X=N或D或S（X=N or D or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X=Y或I或G或E（X=Y or I or G or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=T或S或I或G（X=T or S or I or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=D或E（X=D or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X=Y或W或L（X=Y or W or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X=F或W（X=F or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X=S或K或Y或N或D（X=S or K or Y or N or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> X=N或K（X=N or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X=L或V（X=L or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> X=S或R或L或I（X=S or R or L or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=T或E或D（X=T or E or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> X=S或N（X=S or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> X=P或A或G（X=P or A or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> X=A或S（X=A or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X=E或Q或K（X=E or Q or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X=T或S（X=T or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> X=G或N（X=G or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> X=T或K（X=T or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> X=E或T（X=E or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> X=K或I或T或A或V（X=K or I or T or A or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> X=Y或F（X=Y or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(60)
<223> X=K或E或D（X=K or E or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (63)..(63)
<223> X=S或A或T或D或E或K或V（X=S or A or T or D or E or K or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (64)..(64)
<223> X=A或T或V或K（X=A or T or V or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> X=E或Q或K或D或G（X=E or Q or K or D or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (67)..(67)
<223> X=K或Q或N（X=K or Q or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (70)..(70)
<223> X=R或K或S或D（X=R or K or S or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (71)..(71)
<223> X=D或N或S（X=D or N or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (72)..(72)
<223> X=V或I（X=V or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> X=R或H或T或P或S或D（X=R or H or T or P or S or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (75)..(75)
<223> X=I或P或G或V或T或Y或F（X=I or P or G or V or T or Y or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> X=L或M或F或I或W（X=L or M or F or I or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> X=E或A或T或S（X=E or A or T or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (78)..(78)
<223> X=G或Q或R或S或K（X=G or Q or R or S or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (79)..(79)
<223> X=K或P（X=K or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (80)..(80)
<223> X=A或P（X=A or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> X=A或V或I（X=A or V or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> X=A或F或G或S（X=A or F or G or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> X=A或T或F或M（X=A or T or F or M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> X=V或I（X=V or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> X=R或K（X=R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> X=K或Y或F或M（X=K or Y or F or M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (87)..(87)
<223> X=T或L或I或V（X=T or L or I or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (90)..(90)
<223> X=D或G或E或T或N（X=D or G or E or T or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (97)..(97)
<223> X=F或Y（X=F or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (98)..(98)
<223> X=N或S（X=N or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(99)
<223> X=V或L（X=V or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (100)..(100)
<223> X=K或Q（X=K or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (102)..(102)
<223> X=P或S或E（X=P or S or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (103)..(103)
<223> X=S或A或N或G（X=S or A or N or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (104)..(104)
<223> X=G或Q或E或A（X=G or Q or E or A）
<400> 17
Xaa Xaa Xaa Gly Thr Lys Trp Cys Gly Xaa Gly Xaa Xaa Ala Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Leu Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Cys Cys Arg Xaa
20 25 30
His Asp His Cys Asp Xaa Ile Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Lys Tyr Xaa Leu
35 40 45
Xaa Asn Xaa Gly Xaa Xaa Thr Met Met Asn Cys Xaa Cys Glu Xaa Xaa
50 55 60
Phe Xaa Xaa Cys Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Xaa Leu Tyr Gly Asn Gly Cys
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
100
<210> 18
<211> 104
<212> PRT
<213> 磷脂酶A2 imperatoxin-1大亚基（Phospholipase A2 imperatoxin-1 largesubunit）
<400> 18
Thr Met Trp Gly Thr Lys Trp Cys Gly Ser Gly Asn Glu Ala Thr Asp
1 5 10 15
Ile Ser Glu Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Leu Asp Ser Cys Cys Arg Thr
20 25 30
His Asp His Cys Asp Asn Ile Pro Ser Gly Gln Thr Lys Tyr Gly Leu
35 40 45
Thr Asn Glu Gly Lys Tyr Thr Met Met Asn Cys Lys Cys Glu Thr Ala
50 55 60
Phe Glu Gln Cys Leu Arg Asn Val Thr Gly Gly Met Glu Gly Pro Ala
65 70 75 80
Ala Gly Phe Val Arg Lys Thr Tyr Phe Asp Leu Tyr Gly Asn Gly Cys
85 90 95
Tyr Asn Val Gln Cys Pro Ser Gln
100
<210> 19
<211> 104
<212> PRT
<213> Heteromtoxin大亚基（Heteromtoxin large subunit）
<400> 19
Thr Val Trp Gly Thr Lys Trp Cys Gly Ser Gly Asn Glu Ala Thr Ser
1 5 10 15
Gly Ile Asp Leu Gly Tyr Phe Lys Asn Leu Asp Ser Cys Cys Arg Thr
20 25 30
His Asp His Cys Asp Asn Ile Pro Ala Gly Glu Thr Lys Tyr Gly Leu
35 40 45
Thr Asn Glu Gly Ile Tyr Thr Met Met Asn Cys Lys Cys Glu Ser Val
50 55 60
Phe Lys Gln Cys Leu Lys Asp Val Thr Gly Val Phe Glu Gly Pro Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Val Arg Lys Ile Tyr Phe Asp Leu Tyr Gly Asn Gly Cys
85 90 95
Tyr Ser Val Gln Cys Pro Ala Gly
100
<210> 20
<211> 103
<212> PRT
<213> 磷脂酶A2大亚基（Phospholipase A2 large subunit）
<400> 20
Thr Met Trp Gly Thr Lys Trp Cys Gly Ser Gly Asn Lys Ala Ile Asn
1 5 10 15
Tyr Thr Asp Leu Gly Tyr Phe Ser Asn Leu Asp Ser Cys Cys Arg Thr
20 25 30
His Asp His Cys Asp Asn Ile Ala Ala Gly Glu Thr Lys Tyr Gly Leu
35 40 45
Thr Asn Glu Gly Lys Tyr Thr Met Met Asn Cys Lys Cys Glu Ala Thr
50 55 60
Phe Gln Gln Cys Leu Arg Asp Val His Gly Pro Leu Glu Gly Lys Ala
65 70 75 80
Ala Phe Thr Ile Arg Lys Leu Tyr Phe Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Cys
85 90 95
Phe Asn Val Gln Cys Pro Ser
100
<210> 21
<211> 104
<212> PRT
<213> 磷脂酶A2（Phospholipase A2）
<400> 21
Thr Met Trp Gly Thr Lys Trp Cys Gly Ser Gly Asn Glu Ala Ile Asn
1 5 10 15
Tyr Thr Asp Leu Gly Tyr Phe Ser Asn Leu Asp Ser Cys Cys Arg Thr
20 25 30
His Asp His Cys Asp Ser Ile Pro Ala Gly Glu Thr Lys Tyr Gly Leu
35 40 45
Thr Asn Glu Gly Lys Tyr Thr Met Met Asn Cys Lys Cys Glu Ser Ala
50 55 60
Phe Glu Lys Cys Leu Arg Asp Val Arg Gly Ile Leu Glu Gly Lys Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Val Arg Lys Thr Tyr Phe Asp Leu Tyr Gly Asn Gly Cys
85 90 95
Phe Asn Val Lys Cys Pro Ser Gly
100
<210> 22
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 杀虫毒素LaIT1和φ-liotoxin LW1a的共有序列（Consensus sequnce forInsecticidal Toxin LaIT1 or
Phi-Liotoxin-Lw1a）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=T或S（X=T or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=Q或K（X=Q or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=K或N（X=K or N）
<400> 22
Asp Phe Pro Leu Ser Lys Glu Tyr Glu Xaa Cys Val Arg Pro Arg Lys
1 5 10 15
Cys Xaa Pro Pro Leu Lys Cys Asn Lys Ala Gln Ile Cys Val Asp Pro
20 25 30
Xaa Lys Gly Trp
35
<210> 23
<211> 36
<212> PRT
<213> 杀虫毒素LaIT1（Insecticidal Toxin LaIT1）
<400> 23
Asp Phe Pro Leu Ser Lys Glu Tyr Glu Thr Cys Val Arg Pro Arg Lys
1 5 10 15
Cys Gln Pro Pro Leu Lys Cys Asn Lys Ala Gln Ile Cys Val Asp Pro
20 25 30
Lys Lys Gly Trp
35
<210> 24
<211> 36
<212> PRT
<213> φ-liotoxin LW1a（Phi-Liotoxin-Lw1a）
<400> 24
Asp Phe Pro Leu Ser Lys Glu Tyr Glu Ser Cys Val Arg Pro Arg Lys
1 5 10 15
Cys Lys Pro Pro Leu Lys Cys Asn Lys Ala Gln Ile Cys Val Asp Pro
20 25 30
Asn Lys Gly Trp
35
<210> 25
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Calciseptine和毒素FS2的共有序列（Consensus sequence for Calciseptineor Toxin FS2）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=I或Sor T（X=I or Sor T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=A或S（X=A or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=S或L（X=S or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=L或Q（X=L or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=P或A（X=P or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=R或K（X=R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=A或T（X=A or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X=T或S（X=T or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=V或E（X=V or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=E或G（X=E or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=T或S（X=T or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=Q或H或S（X=Q or H or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=R或P（X=R or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=E或Q或D（X=E or Q or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X=E或D（X=E or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> X=E或A（X=E or A）
<400> 25
Arg Ile Cys Tyr Xaa His Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Lys Xaa
1 5 10 15
Cys Xaa Xaa Asn Xaa Cys Tyr Lys Met Phe Ile Arg Thr Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Tyr Ile Ser Xaa Arg Gly Cys Gly Cys Pro Thr Ala Met Trp Pro Tyr
35 40 45
Gln Thr Xaa Cys Cys Lys Gly Asp Arg Cys Asn Lys
50 55 60
<210> 26
<211> 60
<212> PRT
<213> Calsiseptine
<400> 26
Arg Ile Cys Tyr Ile His Lys Ala Ser Leu Pro Arg Ala Thr Lys Thr
1 5 10 15
Cys Val Glu Asn Thr Cys Tyr Lys Met Phe Ile Arg Thr Gln Arg Glu
20 25 30
Tyr Ile Ser Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Thr Ala Met Trp Pro Tyr
35 40 45
Gln Thr Glu Cys Cys Lys Gly Asp Arg Cys Asn Lys
50 55 60
<210> 27
<211> 60
<212> PRT
<213> 毒素FS2（Toxin FS2）
<400> 27
Arg Ile Cys Tyr Ser His Lys Ala Ser Leu Pro Arg Ala Thr Lys Thr
1 5 10 15
Cys Val Glu Asn Thr Cys Tyr Lys Met Phe Ile Arg Thr His Arg Gln
20 25 30
Tyr Ile Ser Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Thr Ala Met Trp Pro Tyr
35 40 45
Gln Thr Glu Cys Cys Lys Gly Asp Arg Cys Asn Lys
50 55 60
<210> 28
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Vasotab的共有序列（Consensus sequence for Vasotab）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=E或D或N（X=E or D or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=R或T（X=R or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=I或V（X=I or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=A或S（X=A or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=Y或F（X=Y or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=R或T（X=R or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=G或A（X=G or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=S或G（X=S or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X=N或D（X=N or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> X=A或S（X=A or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> X=D或A（X=D or A）
<400> 28
Asp Xaa Cys Pro Xaa Xaa Cys Thr Xaa Asp Xaa Xaa Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Thr Pro Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Asn Arg Thr Phe Xaa Asn Gln
20 25 30
Cys Xaa Leu Xaa Xaa His Asn Cys Leu Asn Lys Gly Xaa Thr Tyr Asp
35 40 45
Lys Leu His Asp Gly Glu Cys Lys
50 55
<210> 29
<211> 56
<212> PRT
<213> Vasotab
<400> 29
Asp Glu Cys Pro Arg Ile Cys Thr Ala Asp Tyr Arg Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Thr Pro Ser Gly Gly Arg Arg Ser Ala Asn Arg Thr Phe Gly Asn Gln
20 25 30
Cys Ser Leu Asn Ala His Asn Cys Leu Asn Lys Gly Asp Thr Tyr Asp
35 40 45
Lys Leu His Asp Gly Glu Cys Lys
50 55
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> glacontryphan M的共有序列（Consensus sequence for Glacontryphan M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=N或R或I或H（X=N or R or I or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=E或R（X=E or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=S或N（X=S or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X=E或G（X=E or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=H或R或K或Q（X=H or R or K or Q）
<400> 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Pro Trp Xaa Pro Trp Cys Gly
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> Glacontryphan M
<400> 31
Asn Glu Ser Glu Cys Pro Trp His Pro Trp Cys Gly
1 5 10
<210> 32
<211> 26
<212> PRT
<213> ω-芋螺毒素-TxVII（omega-conotoxin-TxVII）
<400> 32
Cys Lys Gln Ala Asp Glu Pro Cys Asp Val Phe Ser Leu Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ile Cys Leu Gly Val Cys Met Trp
20 25
<210> 33
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ω-ctenitoxin-Cs1a的共有序列（Consensus sequence for Omega-ctenitoxin-Cs1a）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=S或D（X=S or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=E或H（X=E or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=N或S（X=N or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=D或N（X=D or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=N或G（X=N or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=K或G（X=K or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X=G或H（X=G or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X=L或Y（X=L or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> X=S或T（X=S or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=F或V（X=F or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=D或V（X=D or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=D或T（X=D or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=E或Q或H（X=E or Q or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> X=Q或E（X=Q or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> X=P或E或G（X=P or E or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X=A或F（X=A or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> X=R或T（X=R or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> X=M或P（X=M or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> X=G或H或R（X=G or H or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> X=Q或K（X=Q or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> X=I或A（X=I or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> X=T或L（X=T or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> X=G或V（X=G or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> X=L或V（X=L or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> X=N或G（X=N or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> X=I或F（X=I or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(60)
<223> X=F或G（X=F or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (61)..(61)
<223> X=R或K（X=R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> X=G或K（X=G or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (63)..(63)
<223> X=L或I（X=L or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> X=K或G（X=K or G）
<400> 33
Xaa Cys Ile Pro Lys His Xaa Glu Cys Thr Xaa Xaa Lys His Xaa Cys
1 5 10 15
Cys Arg Xaa Xaa Leu Phe Lys Xaa Lys Cys Gln Cys Xaa Thr Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Ser Gly Xaa Xaa Thr Glu Arg Cys Xaa Cys Gly Xaa Pro Xaa
35 40 45
Xaa His Xaa Ala Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe
50 55 60
Xaa
65
<210> 34
<211> 65
<212> PRT
<213> ω-ctenitoxin-Cs1a（omega-ctenitoxin-Cs1a）
<400> 34
Ser Cys Ile Pro Lys His Glu Glu Cys Thr Asn Asp Lys His Asn Cys
1 5 10 15
Cys Arg Lys Gly Leu Phe Lys Leu Lys Cys Gln Cys Ser Thr Phe Asp
20 25 30
Asp Glu Ser Gly Gln Pro Thr Glu Arg Cys Ala Cys Gly Arg Pro Met
35 40 45
Gly His Gln Ala Ile Glu Thr Gly Leu Asn Ile Phe Arg Gly Leu Phe
50 55 60
Lys
65
<210> 35
<211> 19
<212> PRT
<213> U7-ctenitoxin-Pn1b
<400> 35
Gly Cys Ile Gly Arg Asn Glu Ser Gln Lys Lys Asp Asn Val Tyr Lys
1 5 10 15
Phe Lys Glu
<210> 36
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> κ-ctenitoxin-Pn1a或U9-ctenitoxin-Pn1a或U6-ctenitoxin-Pn1a和的共有序列（Consensus sequence for Kappa-ctenitoxin-Pn1a or
U9-ctenitoxin-Pn1a or U6-ctenitoxin-Pn1a）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=E或A或G或S或K或N（X=E or A or G or S or K or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=不存在或I（X=absent or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=A或G或D或K或E（X=A or G or D or K or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=V或L或A或D（X=V or L or A or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=Y或W（X=Y or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=E或K或G（X=E or K or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=R或K或S或E（X=R or K or S or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=G或N或D或K或T或W（X=G or N or D or K or T or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=K或H或S或N或W或Y（X=K or H or S or N or W or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=不存在或G或P（X=absent or G or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X=不存在或Y或A或V或G或E（X=absent or Y or A or V or G or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=K或S或N或R或L或T（X=K or S or N or R or L or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X=R或P或T或K（X=R or P or T or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=E或D或N或V或R或K（X=E or D or N or V or R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X=不存在或G（X=absent or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=不存在或Y或V（X=absent or Y or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X=不存在或N（X=absent or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X=不存在或G（X=absent or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X=不存在或Y（X=absent or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> X=E或D或N或K或S或G（X=E or D or N or K or S or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> X=P或A或T或G（X=P or A or T or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> X=K或I或M或R或Q（X=K or I or M or R or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=N或D或S或T（X=N or D or S or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=不存在或I或L或M（X=absent or I or L or M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=不存在或V或A或I或M或G（X=absent or V or A or I or M or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=M或G或A（X=M or G or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X=不存在或D或G或S或T或N（X=absent or D or G or S or T or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X=N或R或T（X=N or R or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> X=T或I或K或N或E（X=T or I or K or N or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> X=K或R或E或T（X=K or R or E or T）
<400> 36
Xaa Cys Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Cys Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa
35 40
<210> 37
<211> 36
<212> PRT
<213> U9-ctenitoxin-Pn1a
<400> 37
Gly Cys Ala Asp Ala Tyr Lys Ser Cys Asn His Pro Arg Thr Cys Cys
1 5 10 15
Asp Gly Tyr Asn Gly Tyr Lys Arg Ala Cys Ile Cys Ser Gly Ser Asn
20 25 30
Cys Lys Cys Lys
35
<210> 38
<211> 34
<212> PRT
<213> U6-ctenitoxin-Pn1a
<400> 38
Ala Cys Ala Asp Val Tyr Lys Glu Cys Trp Tyr Pro Glu Lys Pro Cys
1 5 10 15
Cys Lys Asp Arg Ala Cys Gln Cys Thr Leu Gly Met Thr Cys Lys Cys
20 25 30
Lys Ala
<210> 39
<211> 40
<212> PRT
<213> κ-ctenitoxin-Pn1a（Kappa-ctenitoxin-Pn1a）
<400> 39
Ala Glu Cys Ala Ala Val Tyr Glu Arg Cys Gly Lys Gly Tyr Lys Arg
1 5 10 15
Cys Cys Glu Glu Arg Pro Cys Lys Cys Asn Ile Val Met Asp Asn Cys
20 25 30
Thr Cys Lys Lys Phe Ile Ser Glu
35 40
<210> 40
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ω-ctenitoxin-Pr2a的共有序列（Consensus sequence for Omega-ctenitoxin-Pr2a）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=A或G（X=A or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=I或L（X=I or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X=P或A或D（X=P or A or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=R或I（X=R or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=E或K（X=E or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=I或T（X=I or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=T或K（X=T or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X=G或D（X=G or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=D或G（X=D or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=Q或V（X=Q or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X=P或F（X=P or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> X=G或D（X=G or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> X=S或W（X=S or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> X=不存在或F（X=absent or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=不存在或G（X=absent or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=不存在或G（X=absent or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=S或K（X=S or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=L或W（X=L or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=G或H或Q（X=G or H or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X=I或P（X=I or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X=F或V（X=F or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> X=K或G（X=K or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> X=H或Y（X=H or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X=A或T或G（X=A or T or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X=N或L（X=N or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> X=K或Q（X=K or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> X=F或V（X=F or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> X=N或D或A（X=N or D or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> X=R或H（X=R or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> X=K或Q（X=K or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> X=E或K（X=E or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> X=K或P（X=K or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> X=K或N（X=K or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> X=A或V（X=A or V）
<400> 40
Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Cys Xaa Asp Asp Cys Glu Cys Cys
1 5 10 15
Xaa Cys Xaa Asn Xaa Cys Tyr Cys Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ser Cys Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Cys
35 40 45
Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Lys Cys Xaa Xaa Xaa
50 55
<210> 41
<211> 55
<212> PRT
<213> ω-ctenitoxin-Pr2a（omega-ctenitoxin-Pr2a）
<400> 41
Ala Cys Ile Pro Arg Gly Glu Ile Cys Thr Asp Asp Cys Glu Cys Cys
1 5 10 15
Gly Cys Asp Asn Glu Cys Tyr Cys Pro Ile Gly Ser Ser Leu Gly Ile
20 25 30
Phe Lys Cys Ser Cys Ala His Ala Asn Lys Tyr Phe Cys Asn Arg Lys
35 40 45
Lys Glu Lys Cys Lys Lys Ala
50 55
<210> 42
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 毒素C10S2C2和毒素S4C8的共有序列（Consensus sequence for ToxinC10S2C2 or Toxin S4C8）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=I或S或T（X=I or S or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=A或S（X=A or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=S或L（X=S or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=L或Q（X=L or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=P或A（X=P or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=R或K（X=R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=A或T（X=A or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X=T或S（X=T or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=V或E（X=V or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=E或G（X=E or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=T或S（X=T or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=Q或H或S（X=Q or H or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=R或P（X=R or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=E或Q或D（X=E or Q or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X=E或D（X=E or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> X=E或A（X=E or A）
<400> 42
Arg Ile Cys Tyr Xaa His Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Lys Xaa
1 5 10 15
Cys Xaa Xaa Asn Xaa Cys Tyr Lys Met Phe Ile Arg Thr Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Tyr Ile Ser Xaa Arg Gly Cys Gly Cys Pro Thr Ala Met Trp Pro Tyr
35 40 45
Gln Thr Xaa Cys Cys Lys Gly Asp Arg Cys Asn Lys
50 55 60
<210> 43
<211> 60
<212> PRT
<213> 毒素S4C8（Toxin S4C8）
<400> 43
Arg Ile Cys Tyr Thr His Lys Ser Leu Gln Ala Lys Thr Thr Lys Ser
1 5 10 15
Cys Glu Gly Asn Thr Cys Tyr Lys Met Phe Ile Arg Thr Ser Arg Glu
20 25 30
Tyr Ile Ser Glu Arg Gly Cys Gly Cys Pro Thr Ala Met Trp Pro Tyr
35 40 45
Gln Thr Glu Cys Cys Lys Gly Asp Arg Cys Asn Lys
50 55 60
<210> 44
<211> 60
<212> PRT
<213> 毒素C10S2C2（Toxin C10S2C2）
<400> 44
Arg Ile Cys Tyr Ser His Lys Ala Ser Leu Pro Arg Ala Thr Lys Thr
1 5 10 15
Cys Val Glu Asn Ser Cys Tyr Lys Met Phe Ile Arg Thr Ser Pro Asp
20 25 30
Tyr Ile Ser Asp Arg Gly Cys Gly Cys Pro Thr Ala Met Trp Pro Tyr
35 40 45
Gln Thr Ala Cys Cys Lys Gly Asp Arg Cys Asn Lys
50 55 60
<210> 45
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> μ-芋螺毒素GIIIb或μ-芋螺毒素TIIIA或μ-芋螺毒素PIIIa的共有序列（Consensus sequence for mu-conotoxin GIIIb or mu-conotoxin TIIIA
or mu-conotoxin PIIIa）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=不存在或R或E或Q（X=absent or R or E or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=R或H（X=R or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=D或G或V或L（X=D or G or V or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=T或K或N或G（X=T or K or N or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=P或G或Y或F（X=P or G or Y or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=K或R或E或Q或M（X=K or R or E or Q or M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=K或G或S（X=K or G or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=K或S或R（X=K or S or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=D或S（X=D or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=Q或R或E或H或A（X=Q or R or E or H or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X=K或R（X=K or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=P或N（X=P or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=Q或M或L或K或S或H（X=Q or M or L or K or S or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X=R或K或H或Q或Y（X=R or K or H or Q or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X=不存在或A（X=absent or A）
<400> 45
Xaa Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Arg Xaa Cys
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Cys Xaa
20
<210> 46
<211> 22
<212> PRT
<213> μ-芋螺毒素GIIIb（mu-conotoxin GIIIb）
<400> 46
Arg Asp Cys Cys Thr Pro Pro Arg Lys Cys Lys Asp Arg Arg Cys Lys
1 5 10 15
Pro Met Lys Cys Cys Ala
20
<210> 47
<211> 22
<212> PRT
<213> μ-芋螺毒素PIIIa（mu-conotoxin PIIIa）
<400> 47
Gln Arg Leu Cys Cys Gly Phe Pro Lys Ser Cys Arg Ser Arg Gln Cys
1 5 10 15
Lys Pro His Arg Cys Cys
20
<210> 48
<211> 22
<212> PRT
<213> μ-芋螺毒素TIIIA（mu-conotoxin TIIIA）
<400> 48
Arg His Gly Cys Cys Lys Gly Pro Lys Gly Cys Ser Ser Arg Glu Cys
1 5 10 15
Arg Pro Gln His Cys Cys
20
<210> 49
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> μ-芋螺毒素GvIIJ的共有序列（Consensus sequence for mu-ConotoxinGvIIJ）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=G或D或W（X=G or D or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=D或K（X=D or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=P或A（X=P or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=G或E（X=G or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=A或D（X=A or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=T或A（X=T or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=K或T（X=K or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X=R或K或Y（X=R or K or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X=Y或R或K（X=Y or R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=F或L或M（X=F or L or M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X=D或N（X=D or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X=C或Q或K（X=C or Q or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> X=Y或A（X=Y or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X=T或S或N（X=T or S or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> X=K或G或W（X=K or G or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> X=T或K（X=T or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=K或T或L（X=K or T or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=D或G或R（X=D or G or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=不存在或K（X=absent or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=不存在或S（X=absent or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=不存在或S（X=absent or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X=不存在或A（X=absent or A）
<400> 49
Xaa Trp Cys Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly Xaa Leu Xaa Leu Xaa
1 5 10 15
Cys Cys Ser Gly Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa
35
<210> 50
<211> 35
<212> PRT
<213> μ-芋螺毒素GvIIJ（mu-conotoxin GvIIJ）
<400> 50
Gly Trp Cys Gly Asp Pro Gly Ala Thr Cys Gly Lys Leu Arg Leu Tyr
1 5 10 15
Cys Cys Ser Gly Phe Cys Asp Cys Tyr Thr Lys Thr Cys Lys Asp Lys
20 25 30
Ser Ser Ala
35
<210> 51
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> μO-芋螺毒素MfVIA的共有序列（Consensus sequence for MuO-conotoxinMfVIA）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=D或A（X=D or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X=Q或R或S（X=Q or R or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=E或K或A（X=E or K or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=K或L（X=K or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=E或D（X=E or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=I或P（X=I or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X=I或F（X=I or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=L或I（X=L or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X=G或S（X=G or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X=F或V或S（X=F or V or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=V或I或G（X=V or I or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=Y或D（X=Y or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X=P或L或I（X=P or L or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> X=P或H或L（X=P or H or L）
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸（Xaa can be any naturally occurringamino acid）
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸（Xaa can be any naturally occurringamino acid）
<400> 51
Arg Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Tyr Cys Xaa Val Pro Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Cys Cys Xaa Gly Leu Ile Cys Gly Xaa Phe Xaa Cys Xaa
20 25 30
<210> 52
<211> 32
<212> PRT
<213> μO-芋螺毒素MfVIA（muO-conotoxin MfVIA）
<400> 52
Arg Asp Cys Gln Glu Lys Trp Glu Tyr Cys Ile Val Pro Ile Leu Gly
1 5 10 15
Phe Val Tyr Cys Cys Pro Gly Leu Ile Cys Gly Pro Phe Val Cys Val
20 25 30
<210> 53
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> μ-芋螺毒素CnIIIc的共有序列（Consensus sequence for mu-conotoxinCnIIIc）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=不存在或V或I（X=absent or V or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=不存在或T或G或V（X=absent or T or G or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=不存在或D或E或Q或G或L或焦谷氨酸盐(pGlu)（X=absent or D or E or Qor G or L or pyroglutamate (pGlu)）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X=不存在或R或G或N或Y（X=absent or R or G or N or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=K或N或D或E或G或Q（X=K or N or D or E or G or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=不存在或K或P（X=absent or K or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=不存在或K（X=absent or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=不存在或G或P（X=absent or G or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=不存在或N（X=absent or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=不存在或G或V或E（X=absent or G or V or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=不存在或K或P或R或Q（X=absent or K or P or R or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X=不存在或R或K或N或M（X=absent or R or K or N or M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=不存在或E或G或A或L或M（X=absent or E or G or A or L or M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X=不存在或S或F（X=absent or S or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=G或S或T或N（X=G or S or T or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=R或K（X=R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X=R或K或E（X=R or K or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X=D或G或N或I（X=D or G or N or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X=H或N（X=H or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> X=S或A（X=S or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X=R或Q（X=R or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> X=不存在或R（X=absent or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=不存在或Q（X=absent or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=不存在或Q（X=absent or Q）
<400> 53
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Trp Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 54
<211> 22
<212> PRT
<213> μ-芋螺毒素CnIIIc（mu-conotoxin CnIIIc）
<400> 54
Glx Gly Cys Cys Asn Gly Pro Lys Gly Cys Ser Ser Lys Trp Cys Arg
1 5 10 15
Asp His Ala Arg Cys Cys
20
<210> 55
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> μ-thomitoxin Hme1a或μ-thomitoxin Hme1b或μ-thomitoxin Hme1c的共有序列（Consensus sequence for Mu-thomitoxin-Hme1a or Mu-thomitoxin-Hme1b
or Mu-thomitoxin-Hme1c）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X=P或A（X=P or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=Y或S或K（X=Y or S or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=G或F或N（X=G or F or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=K或G（X=K or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=T或E（X=T or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=E或A（X=E or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=F或W（X=F or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=W或F（X=W or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=P或E（X=P or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X=W或S（X=W or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=A或T或G（X=A or T or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X=G或A（X=G or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=K或I或L（X=K or I or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X=不存在或S（X=absent or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> X=L或W或Y（X=L or W or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X=N或V或S（X=N or V or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> X=V或F或I（X=V or F or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> X=W或F或K（X=W or F or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> X=S或T或R（X=S or T or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=M或S或N（X=M or S or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=T或K或L（X=T or K or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=L或F或K（X=L or F or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=S或M或I（X=S or M or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X=T或R或V（X=T or R or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X=不存在或R（X=absent or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> X=不存在或N或V（X=absent or N or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> X=不存在或F或W（X=absent or F or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> X=不存在或G（X=absent or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> X=不存在或K（X=absent or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> X=不存在或D（X=absent or D）
<400> 55
Gly Cys Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Ser Gly Xaa Xaa
1 5 10 15
Cys Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35 40
<210> 56
<211> 37
<212> PRT
<213> μ-thomitoxin Hme1a（mu-thomitoxin-Hme1a）
<400> 56
Gly Cys Ile Pro Tyr Gly Lys Thr Cys Glu Phe Trp Ser Gly Pro Trp
1 5 10 15
Cys Cys Ala Gly Lys Cys Lys Leu Asn Val Trp Ser Met Thr Leu Ser
20 25 30
Cys Thr Arg Asn Phe
35
<210> 57
<211> 40
<212> PRT
<213> μ-thomitoxin Hme1b（mu-thomitoxin-Hme1b）
<400> 57
Gly Cys Ile Pro Ser Phe Gly Glu Cys Ala Trp Phe Ser Gly Glu Ser
1 5 10 15
Cys Cys Thr Gly Ile Cys Lys Trp Val Phe Phe Thr Ser Lys Phe Met
20 25 30
Cys Arg Arg Val Trp Gly Lys Asp
35 40
<210> 58
<211> 35
<212> PRT
<213> μ-thomitoxin Hme1c（mu-thomitoxin-Hme1c）
<400> 58
Gly Cys Ile Ala Lys Asn Lys Glu Cys Ala Trp Phe Ser Gly Glu Trp
1 5 10 15
Cys Cys Gly Ala Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Ile Lys Arg Asn Leu Lys
20 25 30
Ile Cys Val
35
<210> 59
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 毒蕈碱毒素α或毒蕈碱毒素1或肾上腺素能毒素ρ-elapitoxin-Dp1a或毒素AdTx1或毒蕈碱毒素2或毒蕈碱毒素7或毒蕈碱毒素3的共有序列（Consensus sequence forMuscarinic toxin alpha or Muscarinic toxin
1 or Adrenergic toxin rho-elapitoxin-Dp1a or Toxin AdTx1 or
Muscarinic toxin 2 or Muscarinic toxin 7 or Muscarinic toxin 3）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=T或K（X=T or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=S或K或E或T（X=S or K or E or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=K或D或N（X=K or D or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=S或T（X=S or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=F或W或G（X=F or W or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=G或F（X=G or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=I或V或P（X=I or V or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X=T或S（X=T or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=E或Q（X=E or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X=N或D（X=N or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=D或A或P（X=D or A or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X=L或V（X=L or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X=K或I（X=K or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> X=K或R（X=K or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> X=W或R（X=W or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> X=Y或H或Q（X=Y or H or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=Y或M（X=Y or M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=L或I或V（X=L or I or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=N或V或S或T或I（X=N or V or S or T or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=H或P（X=H or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=R或K或G（X=R or K or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X=Y或I或M或R或N（X=Y or I or M or R or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X=S或T或Y（X=S or T or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> X=D或E或K（X=D or E or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> X=I或S或K或F（X=I or S or K or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> X=T或I（X=T or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> X=W或R或K（X=W or R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X=A或T或V（X=A or T or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> X=K或I（X=K or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> X=P或A或V（X=P or A or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> X=T或E或D（X=T or E or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> X=N或Y（X=N or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> X=不存在或V（X=absent or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> X=R或Y或N（X=R or Y or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> X=E或D（X=E or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> X=T或S或V或P（X=T or S or V or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> X=H或R或E或N（X=H or R or E or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(60)
<223> X=E或N或K或G或S（X=E or N or K or G or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> X=D或E（X=D or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> X=E或N或L或K或D（X=E or N or L or K or D）
<400> 59
Leu Thr Cys Val Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Cys Pro Xaa Gly Gln Asn Xaa Cys Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Cys Xaa Ala Thr Cys Pro Xaa
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Cys Cys Xaa Thr Xaa Lys Cys
50 55 60
Asn Xaa
65
<210> 60
<211> 66
<212> PRT
<213> 毒蕈碱毒素α（Muscarinic toxin alpha）
<400> 60
Leu Thr Cys Val Thr Ser Lys Ser Ile Phe Gly Ile Thr Thr Glu Asn
1 5 10 15
Cys Pro Asp Gly Gln Asn Leu Cys Phe Lys Lys Trp Tyr Tyr Leu Asn
20 25 30
His Arg Tyr Ser Asp Ile Thr Trp Gly Cys Ala Ala Thr Cys Pro Lys
35 40 45
Pro Thr Asn Val Arg Glu Thr Ile His Cys Cys Glu Thr Asp Lys Cys
50 55 60
Asn Glu
65
<210> 61
<211> 39
<212> PRT
<213> ω-theraphotoxin-Cc1a（omega-theraphotoxin-Cc1a）
<400> 61
Gly Val Asp Lys Glu Gly Cys Lys Tyr Met Phe Gly Ser Cys Gly Lys
1 5 10 15
Ser Asp Asp Cys Cys Pro Lys Leu Ala Cys Lys Arg Thr Phe Asn Tyr
20 25 30
Cys Ala Trp Asp Gly Ser Val
35
<210> 62
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> β-哺乳类毒素Css2的共有序列（Consensus sequence for beta-mammal toxinCss2）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=L或I（X=L or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=S或D或N或E（X=S or D or N or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=K或S或H或L或Y（X=K or S or H or L or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=S或N或Y或H或G（X=S or N or Y or H or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=T或D（X=T or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X=Y或F（X=Y or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=E或A或T（X=E or A or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X=L或F或Y或A（X=L or F or Y or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=D或E（X=D or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X=L或K或V（X=L or K or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=K或R（X=K or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=Q或L或A（X=Q or L or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=Q或G或R（X=Q or G or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=Y或H（X=Y or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=G或Y（X=G or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X=K或Q（X=K or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X=不存在或S或G（X=absent or S or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> X=S或A（X=S or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> X=G或H（X=G or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> X=A或G（X=A or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> X=T或N（X=T or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> X=H或Q（X=H or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> X=V或I（X=V or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> X=W或R（X=W or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (61)..(61)
<223> X=P或K（X=P or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> X=N或K（X=N or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (64)..(64)
<223> X=T或R或K（X=T or R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> X=N或S或T或R或Y（X=N or S or T or R or Y）
<400> 62
Lys Glu Gly Tyr Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Cys Lys Xaa Xaa Cys
1 5 10 15
Xaa Lys Leu Gly Xaa Asn Asp Tyr Cys Xaa Arg Glu Cys Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Cys Tyr Ala Phe Xaa Cys Trp Cys
35 40 45
Xaa Xaa Leu Tyr Glu Gln Ala Xaa Val Xaa Pro Leu Xaa Xaa Lys Xaa
50 55 60
Cys Xaa
65
<210> 63
<211> 66
<212> PRT
<213> β-哺乳类毒素Css2（beta-mammal toxin Css2）
<400> 63
Lys Glu Gly Tyr Leu Val Ser Lys Ser Thr Gly Cys Lys Tyr Glu Cys
1 5 10 15
Leu Lys Leu Gly Asp Asn Asp Tyr Cys Leu Arg Glu Cys Lys Gln Gln
20 25 30
Tyr Gly Lys Ser Ser Gly Gly Tyr Cys Tyr Ala Phe Ala Cys Trp Cys
35 40 45
Thr His Leu Tyr Glu Gln Ala Val Val Trp Pro Leu Pro Asn Lys Thr
50 55 60
Cys Asn
65
<210> 64
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> α-样毒素BmK-M1的共有序列（Consensus sequence for alpha-like toxinBmK-M1）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=V或G或A（X=V or G or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=R或S（X=R or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X=A或G（X=A or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=K或Q或D或L（X=K or Q or D or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=P或N或D（X=P or N or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=H或E或Y或K（X=H or E or Y or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=V或A（X=V or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=E或T或H或F或G或D（X=E or T or H or F or G or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X=A或F或Y或M或G或L（X=A or F or Y or M or G or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X=R或K或Q或D或T或N或G或I或L或S或A（X=R or K or Q or D or T or N or Gor I or L or S or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X=不存在或A或P（X=absent or A or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X=不存在或F或K（X=absent or F or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=N或S或D或G或T（X=N or S or D or G or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X=E或S或A或D或Q或G（X=E or S or A or D or Q or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X=Y或G或H或D或F（X=Y or G or H or D or F）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X=D或N或E或K或G或T（X=D or N or E or K or G or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> X=L或V或E（X=L or V or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=K或E或D（X=K or E or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> X=N或D（X=N or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=K或T或S或E（X=K or T or S or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X=S或I（X=S or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> X=Q或N或E（X=Q or N or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> X=W或I（X=W or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> X=V或S或L或A或G或Q或F或I（X=V or S or L or A or G or Q or F or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X=K或R或T或I或P或Q（X=K or R or T or I or P or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X=Y或W或H（X=Y or W or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> X=N或D（X=N or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> X=G或A（X=G or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> X=W或Y或X（X=W or Y or X）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> X=K或I或E或Y（X=K or I or E or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> X=E或D或A或K或Q（X=E or D or A or K or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> X=D或N（X=D or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> X=N或D或K或S或R或E（X=N or D or K or S or R or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(60)
<223> X=R或K（X=R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (61)..(61)
<223> X=V或I（X=V or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> X=P或E或W（X=P or E or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (64)..(64)
<223> X=K或N或R（X=K or N or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> X=H或R或Q（X=H or R or Q）
<400> 64
Xaa Xaa Asp Xaa Tyr Ile Ala Xaa Xaa Xaa Asn Cys Xaa Tyr Xaa Cys
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Asn Xaa Xaa Cys Thr Xaa Xaa Gly
20 25 30
Ala Xaa Xaa Gly Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Cys
35 40 45
Xaa Cys Xaa Xaa Leu Pro Xaa Xaa Val Pro Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa
50 55 60
Cys Xaa
65
<210> 65
<211> 64
<212> PRT
<213> α-样毒素BmK-M1（alpha-like toxin BmK-M1）
<400> 65
Val Arg Asp Ala Tyr Ile Ala Lys Pro His Asn Cys Val Tyr Glu Cys
1 5 10 15
Ala Arg Asn Glu Tyr Cys Asn Asp Leu Cys Thr Lys Asn Gly Ala Lys
20 25 30
Ser Gly Tyr Cys Gln Trp Val Gly Lys Tyr Gly Asn Gly Cys Trp Cys
35 40 45
Ile Glu Leu Pro Asp Asn Val Pro Ile Arg Val Pro Gly Lys Cys His
50 55 60
<210> 66
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> β/κ-theraphotoxin-Cg1a的共有序列（Consensus sequence for beta/kappa-theraphotoxin-Cg1a）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X=D或E或G或A（X=D or E or G or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X=G或R（X=G or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=E或Q或A（X=E or Q or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X=G或Q（X=G or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X=G或E或K（X=G or E or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X=F或Y（X=F or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=W或M（X=W or M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X=W或R（X=W or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=G或K（X=G or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=R或S或A或N（X=R or S or A or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X=G或D或S（X=G or D or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=不存在或K（X=absent or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X=P或N（X=P or N）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X=P或A或T或D（X=P or A or T or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X=K或P或S（X=K or P or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=G或K或D（X=G or K or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X=Y或L（X=Y or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X=A或V或D或E（X=A or V or D or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X=K或P或S（X=K or P or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> X=T或K或R（X=T or K or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> X=G或K或R（X=G or K or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> X=W或L（X=W or L）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=A或N或V（X=A or N or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X=V或F或L或W（X=V or F or L or W）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> X=E或P或K或N或A（X=E or P or K or N or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X=A或M或S或P（X=A or M or S or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X=P或W（X=P or W）
<400> 66
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Cys Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ser Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Cys Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa
35
<210> 67
<211> 36
<212> PRT
<213> β/κ-theraphotoxin-Cg1a（beta/kappa-theraphotoxin-Cg1a）
<400> 67
Asp Gly Glu Cys Gly Gly Phe Trp Trp Lys Cys Gly Arg Gly Lys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Cys Lys Gly Tyr Ala Cys Ser Lys Thr Trp Gly Trp Cys Ala
20 25 30
Val Glu Ala Pro
35
<210> 68
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> κ-theraphotoxin-Cg1a的共有序列（Consensus sequence for kappa-theraphotoxin-Cg1a）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X=R或K（X=R or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X=S或T（X=S or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=D或H（X=D or H）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=G或L（X=G or L）
<400> 68
Glu Cys Xaa Lys Met Phe Gly Gly Cys Xaa Val Xaa Ser Asp Cys Cys
1 5 10 15
Ala His Leu Gly Cys Lys Pro Thr Leu Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Xaa
20 25 30
Thr Phe
<210> 69
<211> 34
<212> PRT
<213> κ-theraphotoxin-Cg1a（kappa-theraphotoxin-Cg1a）
<400> 69
Glu Cys Arg Lys Met Phe Gly Gly Cys Ser Val Asp Ser Asp Cys Cys
1 5 10 15
Ala His Leu Gly Cys Lys Pro Thr Leu Lys Tyr Cys Ala Trp Asp Gly
20 25 30
Thr Phe
<210> 70
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> δ-theraphotoxin-Cg1a1、δ-theraphotoxin-Cg1a2、δ-theraphotoxin-Cg1a3的共有序列（Consensus sequence for delta-theraphotoxin-Cg1a 1, 2 and 3）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X=S或G（X=S or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X=L或V（X=L or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X=A或P或V（X=A or P or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> X=T或I（X=T or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> X=I或M（X=I or M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> X=不存在或E（X=absent or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> X=不存在或E（X=absent or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X=A或E或G（X=A or E or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X=Q或Y或T（X=Q or Y or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> X=F或M（X=F or M）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> X=W或S（X=W or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> X=K或P（X=K or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> X=G或S（X=G or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> X=E或T（X=E or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X=G或E（X=G or E）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X=不存在或K（X=absent or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> X=P或K（X=P or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> X=A或T或D（X=A or T or D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> X=N或G（X=N or G）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> X=F或Y（X=F or Y）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> X=A或S（X=A or S）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> X=K或Q（X=K or Q）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (55)..(55)
<223> X=I或P（X=I or P）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (56)..(56)
<223> X=G或A（X=G or A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> X=L或I（X=L or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> X=Y或K（X=Y or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> X=L或W（X=L or W）
<400> 70
Met Lys Thr Ser Ile Leu Phe Val Ile Phe Xaa Leu Ala Leu Xaa Phe
1 5 10 15
Ala Leu Ser Xaa Ala Xaa Glu Xaa Glu Xaa Xaa Glu Thr Asp Arg Xaa
20 25 30
Cys Gly Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Cys Cys
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ile Trp Ser Pro
50 55 60
<210> 71
<211> 62
<212> PRT
<213> δ-theraphotoxin-Cg1a 1（delta-theraphotoxin-Cg1a 1）
<400> 71
Met Lys Thr Ser Ile Leu Phe Val Ile Phe Ser Leu Ala Leu Leu Phe
1 5 10 15
Ala Leu Ser Ala Ala Thr Glu Ile Glu Glu Thr Asp Arg Ala Cys Gly
20 25 30
Gln Phe Trp Trp Lys Cys Gly Glu Gly Lys Pro Pro Cys Cys Ala Asn
35 40 45
Phe Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys Ile Trp Ser Pro
50 55 60
<210> 72
<211> 62
<212> PRT
<213> δ-theraphotoxin-Cg1a 2（delta-theraphotoxin-Cg1a 2）
<400> 72
Met Lys Thr Ser Ile Leu Phe Val Ile Phe Ser Leu Ala Leu Leu Phe
1 5 10 15
Ala Leu Ser Ala Ala Thr Glu Ile Glu Glu Thr Asp Arg Ala Cys Gly
20 25 30
Gln Phe Trp Trp Lys Cys Gly Glu Gly Lys Pro Pro Cys Cys Ala Asn
35 40 45
Phe Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys Ile Trp Ser Pro
50 55 60
<210> 73
<211> 62
<212> PRT
<213> δ-theraphotoxin-Cg1a 3（delta-theraphotoxin-Cg1a 3）
<400> 73
Met Lys Thr Ser Ile Leu Phe Val Ile Phe Ser Leu Ala Leu Val Phe
1 5 10 15
Ala Leu Ser Pro Ala Thr Glu Ile Glu Glu Thr Asp Arg Ala Cys Gly
20 25 30
Gln Phe Trp Trp Lys Cys Gly Glu Gly Lys Pro Pro Cys Cys Ala Asn
35 40 45
Phe Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys Ile Trp Ser Pro
50 55 60
<210> 74
<211> 66
<212> PRT
<213> 毒蕈碱毒素1（Muscarinic toxin 1）
<400> 74
Leu Thr Cys Val Thr Ser Lys Ser Ile Phe Gly Ile Thr Thr Glu Asn
1 5 10 15
Cys Pro Asp Gly Gln Asn Leu Cys Phe Lys Lys Trp Tyr Tyr Ile Val
20 25 30
Pro Arg Tyr Ser Asp Ile Thr Trp Gly Cys Ala Ala Thr Cys Pro Lys
35 40 45
Pro Thr Asn Val Arg Glu Thr Ile Arg Cys Cys Glu Thr Asp Lys Cys
50 55 60
Asn Glu
65
<210> 75
<211> 65
<212> PRT
<213> 毒蕈碱毒素2（Muscarinic toxin 2）
<400> 75
Leu Thr Cys Val Thr Thr Lys Ser Ile Gly Gly Val Thr Thr Glu Asp
1 5 10 15
Cys Pro Ala Gly Gln Asn Val Cys Phe Lys Arg Trp His Tyr Val Thr
20 25 30
Pro Lys Asn Tyr Asp Ile Ile Lys Gly Cys Ala Ala Thr Cys Pro Lys
35 40 45
Val Asp Asn Asn Asp Pro Ile Arg Cys Cys Gly Thr Asp Lys Cys Asn
50 55 60
Asp
65
<210> 76
<211> 65
<212> PRT
<213> 毒蕈碱毒素3（Muscarinic toxin 3）
<400> 76
Leu Thr Cys Val Thr Lys Asn Thr Ile Phe Gly Ile Thr Thr Glu Asn
1 5 10 15
Cys Pro Ala Gly Gln Asn Leu Cys Phe Lys Arg Trp His Tyr Val Ile
20 25 30
Pro Arg Tyr Thr Glu Ile Thr Arg Gly Cys Ala Ala Thr Cys Pro Ile
35 40 45
Pro Glu Asn Tyr Asp Ser Ile His Cys Cys Lys Thr Asp Lys Cys Asn
50 55 60
Glu
65
<210> 77
<211> 65
<212> PRT
<213> 毒蕈碱毒素7（Muscarinic toxin 7）
<400> 77
Leu Thr Cys Val Lys Ser Asn Ser Ile Trp Phe Pro Thr Ser Glu Asp
1 5 10 15
Cys Pro Asp Gly Gln Asn Leu Cys Phe Lys Arg Trp Gln Tyr Ile Ser
20 25 30
Pro Arg Met Tyr Asp Phe Thr Arg Gly Cys Ala Ala Thr Cys Pro Lys
35 40 45
Ala Glu Tyr Arg Asp Val Ile Asn Cys Cys Gly Thr Asp Lys Cys Asn
50 55 60
Lys
65
<210> 78
<211> 65
<212> PRT
<213> 肾上腺素能毒素ρ-elapitoxin-Dp1a（Adrenergic toxin rho-elapitoxin-Dp1a）
<400> 78
Leu Thr Cys Val Thr Ser Lys Ser Ile Phe Gly Ile Thr Thr Glu Asp
1 5 10 15
Cys Pro Asp Gly Gln Asn Leu Cys Phe Lys Arg Arg His Tyr Val Val
20 25 30
Pro Lys Ile Tyr Asp Ile Thr Arg Gly Cys Val Ala Thr Cys Pro Ile
35 40 45
Pro Glu Asn Tyr Asp Ser Ile His Cys Cys Lys Thr Asp Lys Cys Asn
50 55 60
Glu
65
<210> 79
<211> 65
<212> PRT
<213> 毒素AdTx1（Toxin AdTx1）
<400> 79
Leu Thr Cys Val Thr Ser Lys Ser Ile Phe Gly Ile Thr Thr Glu Asp
1 5 10 15
Cys Pro Asp Gly Gln Asn Leu Cys Phe Lys Arg Arg His Tyr Val Val
20 25 30
Pro Lys Ile Tyr Asp Ser Thr Arg Gly Cys Ala Ala Thr Cys Pro Ile
35 40 45
Pro Glu Asn Tyr Asp Ser Ile His Cys Cys Lys Thr Asp Lys Cys Asn
50 55 60
Glu
65
<210> 80
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> β-心脏毒素的共有序列（Consensus sequence for beta-cardiotoxin）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=T或K（X=T or K）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> X=K或R（X=K or R）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> X=V或I（X=V or I）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> X=I或T（X=I or T）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> X=E或V（X=E or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> X=L或V（X=L or V）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> X=N或D（X=N or D）
<400> 80
Arg Lys Cys Leu Asn Thr Pro Leu Pro Leu Ile Tyr Xaa Thr Cys Pro
1 5 10 15
Ile Gly Gln Asp Xaa Cys Xaa Lys Met Thr Ile Lys Lys Leu Pro Ser
20 25 30
Lys Tyr Asp Val Ile Arg Gly Cys Xaa Asp Ile Cys Pro Lys Ser Ser
35 40 45
Ala Asp Val Xaa Val Xaa Cys Cys Asp Thr Asn Lys Cys Xaa Lys
50 55 60
<210> 81
<211> 63
<212> PRT
<213> β-心脏毒素（beta-cardiotoxin）
<400> 81
Arg Lys Cys Leu Asn Thr Pro Leu Pro Leu Ile Tyr Thr Thr Cys Pro
1 5 10 15
Ile Gly Gln Asp Lys Cys Val Lys Met Thr Ile Lys Lys Leu Pro Ser
20 25 30
Lys Tyr Asp Val Ile Arg Gly Cys Ile Asp Ile Cys Pro Lys Ser Ser
35 40 45
Ala Asp Val Glu Val Leu Cys Cys Asp Thr Asn Lys Cys Asn Lys
50 55 60
<210> 82
<211> 76
<212> PRT
<213> ω-漏斗网蛛毒素-IIIA（omega-agatoxin-IIIA）
<400> 82
Ser Cys Ile Asp Ile Gly Gly Asp Cys Asp Gly Glu Lys Asp Asp Cys
1 5 10 15
Gln Cys Cys Arg Arg Asn Gly Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Leu Phe Gly
20 25 30
Tyr Leu Lys Ser Gly Cys Lys Cys Val Val Gly Thr Ser Ala Glu Phe
35 40 45
Gln Gly Ile Cys Arg Arg Lys Ala Arg Gln Cys Tyr Asn Ser Asp Pro
50 55 60
Asp Lys Cys Glu Ser His Asn Lys Pro Lys Arg Arg
65 70 75
<210> 83
<211> 60
<212> PRT
<213> 钙阻蛋白（calcicludine）
<400> 83
Trp Gln Pro Pro Trp Tyr Cys Lys Glu Pro Val Arg Ile Gly Ser Cys
1 5 10 15
Lys Lys Gln Phe Ser Ser Phe Tyr Phe Lys Trp Thr Ala Lys Lys Cys
20 25 30
Leu Pro Phe Leu Phe Ser Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Arg Phe Gln
35 40 45
Thr Ile Gly Glu Cys Arg Lys Lys Cys Leu Gly Lys
50 55 60
<210> 84
<211> 74
<212> PRT
<213> ω-filistatoxin-Kh1a（omega-filistatoxin-Kh1a）
<400> 84
Ala Glu Cys Leu Met Ile Gly Asp Thr Ser Cys Val Pro Arg Leu Gly
1 5 10 15
Arg Arg Cys Cys Tyr Gly Ala Trp Cys Tyr Cys Asp Gln Gln Leu Ser
20 25 30
Cys Arg Arg Val Gly Arg Lys Arg Glu Cys Gly Trp Val Glu Val Asn
35 40 45
Cys Lys Cys Gly Trp Ser Trp Ser Gln Arg Ile Asp Asp Trp Arg Ala
50 55 60
Asp Tyr Ser Cys Lys Cys Pro Glu Asp Gln
65 70
<210> 85
<211> 29
<212> PRT
<213> β-theraphotoxin-Gr1a（beta-theraphotoxin-Gr1a）
<400> 85
Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Lys Arg Lys Cys Cys
1 5 10 15
Glu Asp Met Val Cys Gln Leu Trp Cys Lys Lys Arg Leu
20 25
<210> 86
<211> 29
<212> PRT
<213> β-theraphotoxin-Gr1b（beta-theraphotoxin-Gr1b）
<400> 86
Tyr Cys Gln Lys Trp Leu Trp Thr Cys Asp Ser Glu Arg Lys Cys Cys
1 5 10 15
Glu Asp Met Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Lys Arg Leu
20 25
<210> 87
<211> 31
<212> PRT
<213> κ-theraphotoxin-Gr2c（kappa-theraphotoxin-Gr2c）
<400> 87
Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Glu Glu Arg Lys Cys Cys
1 5 10 15
Glu Gly Leu Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Lys Lys Ile Glu Trp
20 25 30
<210> 88
<211> 82
<212> PRT
<213> M-theraphotoxin-Gr1a
<400> 88
Met Lys Thr Ser Val Val Phe Val Ile Ala Gly Leu Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Val Cys Tyr Ala Ser Glu Leu Lys Glu Gln Ser Ser Val Asn Glu
20 25 30
Val Leu Ser Thr Ile Phe His Phe Glu Gln Pro Glu Glu Arg Gly Cys
35 40 45
Leu Glu Phe Trp Trp Lys Cys Asn Pro Asn Asp Asp Lys Cys Cys Arg
50 55 60
Pro Lys Leu Lys Cys Ser Lys Leu Phe Lys Leu Cys Asn Phe Ser Phe
65 70 75 80
Gly Lys
<210> 89
<211> 28
<212> PRT
<213> 太卡毒素、α-神经毒素样组件Taicatoxin, alpha-neurotoxin-likecomponent
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸（Xaa can be any naturally occurringamino acid）
<400> 89
Arg Arg Cys Phe Ile Thr Pro Asn Val Arg Ser Glu Arg Cys Pro Pro
1 5 10 15
Gly Gln Glu Val Cys Phe Thr Lys Thr Xaa Asp Gly
20 25
<210> 90
<211> 35
<212> PRT
<213> β/ω-theraphotoxin-Tp1a（beta/omega-theraphotoxin-Tp1a）
<400> 90
Glu Cys Arg Tyr Trp Leu Gly Gly Cys Ser Ala Gly Gln Thr Cys Cys
1 5 10 15
Lys His Leu Val Cys Ser Arg Arg His Gly Trp Cys Val Trp Asp Gly
20 25 30
Thr Phe Ser
35
<210> 91
<211> 30
<212> PRT
<213> β/ω-theraphotoxin-Tp2a（beta/omega-theraphotoxin-Tp2a）
<400> 91
Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Glu Arg Lys Cys Cys
1 5 10 15
Glu Gly Met Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Lys Lys Leu Trp
20 25 30
<210> 92
<211> 29
<212> PRT
<213> β/ω-theraphotoxin-Cg2a（beta/kappa-theraphotoxin-Cg2a）
<400> 92
Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Lys Arg Ala Cys Cys
1 5 10 15
Glu Gly Leu Arg Cys Lys Leu Trp Cys Arg Lys Ile Ile
20 25
<210> 93
<211> 35
<212> PRT
<213> μ-theraphotoxin-Hhn1b (1-2-3)（Mu-theraphotoxin-Hhn1b (1-2-3)）
<400> 93
Glu Cys Leu Gly Phe Gly Lys Gly Cys Asn Pro Ser Asn Asp Gln Cys
1 5 10 15
Cys Lys Ser Ser Asn Leu Val Cys Ser Arg Lys His Arg Trp Cys Lys
20 25 30
Tyr Glu Ile
35
<210> 94
<211> 35
<212> PRT
<213> μ-theraphotoxin-Hhn1a（Mu-theraphotoxin-Hhn1a）
<400> 94
Glu Cys Leu Gly Phe Gly Lys Gly Cys Asn Pro Ser Asn Asp Gln Cys
1 5 10 15
Cys Lys Ser Ala Asn Leu Val Cys Ser Arg Lys His Arg Trp Cys Lys
20 25 30
Tyr Glu Ile
35
<210> 95
<211> 21
<212> PRT
<213> μ-芋螺毒素-CnIIIc（mu-conotoxin CnIIIc）
<400> 95
Glx Cys Cys Asp Gly Pro Lys Gly Cys Ser Ser Lys Trp Cys Arg Asp
1 5 10 15
His Ala Arg Cys Cys
20

Claims (22)

1.一种增强肉毒杆菌神经毒素组合物的作用的方法，所述方法包括向所述肉毒杆菌神经毒素组合物中添加至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中增强所述肉毒杆菌神经毒素组合物的作用是加速所述肉毒杆菌神经毒素组合物的起效和/或延长所述肉毒杆菌神经毒素组合物的作用持续时间和/或增强所述肉毒杆菌神经毒素组合物的作用强度。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，与不包含任何胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的肉毒杆菌神经毒素组合物的起效相比，包含所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的所述肉毒杆菌神经毒素组合物的起效会提前50％，优选提前75％，更优选提前90％发生。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，与不包含任何胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的肉毒杆菌神经毒素组合物的作用持续时间相比，包含所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的所述肉毒杆菌神经毒素组合物的作用持续时间延长了10％、25％、50％、100％或更多。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，与不包含任何胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的肉毒杆菌神经毒素组合物的最大作用强度相比，包含所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的所述肉毒杆菌神经毒素组合物的作用强度增强了至少2％，优选至少5％，更优选至少10％。
6.一种适用于实施权利要求1至5中任一项所述方法的组合物，所述组合物包含至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂和肉毒杆菌神经毒素。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂特异性结合至少一种由骨骼肌细胞表达的受体，所述受体选自包括以下的组或由以下组成的组：(α1)2β1δεnAChr、(α1)2β1δγnAChr、RyR1、CaV1.1和Nav1.4。
8.如权利要求6所述的组合物，其中所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂特异性结合至少一种由平滑肌细胞表达的受体，所述受体选自包括以下的组或由以下组成的组：M3 mAChr、RyR2、CaV1.2和Nav1.5。
9.如权利要求6所述的组合物，其中所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂特异性结合至少一种由心肌细胞表达的受体，所述受体选自包括以下的组或由以下组成的组：M2 mAChr、RyR2、CaV1.1、CaV1.2和Nav1.5。
10.如权利要求6所述的组合物，其中所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂特异性结合至少一种由分泌腺细胞表达的受体，所述受体选自包括以下的组或由以下组成的组：M1 mAChR、M3 mAChR、α1肾上腺素受体和β1肾上腺素受体。
11.如权利要求6至10中任一项所述的组合物，其中所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂是突触后肽和/或突触后小分子。
12.如权利要求6至11中任一项所述的组合物，其中所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂是α-芋螺毒素MI或其衍生物、μ-芋螺毒素CnIIIc或其衍生物、泮库溴铵、丹曲林或它们的组合。
13.如权利要求6至12中任一项所述的组合物，其中所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂是快速起效的突触后肽和/或快速起效的突触后小分子。
14.如权利要求6至12中任一项所述的组合物，其中所述至少一种胆碱能神经元传递的突触后抑制剂与肉毒杆菌神经毒素的延迟起效相容。
15.如权利要求6至14中任一项所述的组合物，其中所述肉毒杆菌神经毒素是A型肉毒杆菌神经毒素，B型肉毒杆菌神经毒素，E型肉毒杆菌神经毒素，或A型肉毒杆菌神经毒素、B型肉毒杆菌神经毒素、E型肉毒杆菌神经毒素的重链和轻链的组合。
16.如权利要求6至15中任一项所述的组合物，用于美容处理，例如减少皱纹、细纹如眉间纹、或凹沟，出于美容目的减少肌肉体积(如咬肌或腓肠)，减少肥厚性疤痕和其他皮肤状况。
17.如权利要求6至15中任一项所述的组合物，用于以下治疗：(i)骨骼肌病症，包括运动障碍、肌张力障碍、颈部肌张力障碍、痉挛性斜颈、局灶性肌张力障碍、手部局灶性肌张力障碍、睑痉挛、眼睑障碍、斜视、痉挛、脑瘫、局灶性痉挛、肢体痉挛、肌痉挛、半面痉挛、震颤、抽搐、磨牙症、失用症和步态僵硬以及(ii)与这些病症相关的疼痛。
18.如权利要求6至15中任一项所述的组合物，用于以下治疗：(i)平滑肌病症，包括痉挛性发声困难、喉部肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、舌肌张力障碍和其他发声障碍、贲门失弛缓症、吞咽困难、食道疼痛、胃轻瘫、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、膀胱过度反应、间质性膀胱炎、良性前列腺增生、泌尿功能障碍、大便失禁、便秘、盆底失弛缓、肛裂、子宫疼痛(痛经、性交困难)、阴道疼痛(阴道痉挛、外阴痛)、盆腔疼痛、坐骨海绵体肌(阴茎异常勃起)、其他肌张力障碍和其他以肌肉群的不自主运动为特征的病症，以及(ii)与这些病症相关的疼痛。
19.如权利要求6至15中任一项所述的组合物，用于治疗包括心房颤动的心肌细胞病症。
20.如权利要求6至15中任一项所述的组合物，用于治疗分泌腺病症，所述分泌腺病症包括流泪，手、足和腋窝的多汗症，流涎，唾液分泌过多，胃肠道分泌物过多，皮脂腺分泌过多，痤疮，和分泌病症。
21.如权利要求6至15中任一项所述的组合物，用于如权利要求16至20中所公开的用途，其中，与不包含任何胆碱能神经元传递的突触后抑制剂的肉毒杆菌神经毒素组合物相比，加速了所述起效和/或延长了所述作用持续时间和/或增强了所述作用强度。
22.如权利要求6所述的组合物，其中将所述至少一种胆碱能神经元传递(PoNT)的突触后抑制剂和所述肉毒杆菌神经毒素组合施用，条件是在PoNT活性发生衰减之前施用所述肉毒杆菌神经毒素。
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