TWI730562B - 胜肽及具有其之組合物 - Google Patents

Abstract

本發明關於一種表現生理活性的胜肽及包含此胜肽的組合物。由於本發明的胜肽表現出各種生理活性，例如肌肉鬆弛、改善皮膚皺紋、抑制皮脂分泌等，因此此胜肽可用作肌肉鬆弛藥物組合物中的活性成分，或此胜肽可用作改善皮膚皺紋、抑制皮脂產生或改善粉刺的化妝品中的活性成分。

Description

胜肽及具有其之組合物

本發明係關於一種生理活性的胜肽及一種包括其之組合物，更特別是有關於一種包括具有生理活性的胜肽的組合物(例如藥物組合物或化妝品組合物)，用於肌肉鬆弛或用於改善皮膚皺紋、抑制皮脂產生或改善粉刺。

構成動物神經系統的神經元(即神經細胞)的軸突具有在其他細胞中找不到之獨特的結構。軸突具有從神經細胞體突出的細長、長型結構，因此軸突得以連接到可傳導信息並傳輸物質之目標神經元。

神經肌肉突觸具有特定分化的突觸結構，其軸突末端藉由突觸與骨骼肌細胞連接以將脈衝從神經元傳導至肌肉。指向骨骼肌的軸突係為髓鞘包圍之有髓的軸突，並且隨著軸突靠近肌肉而分支成各種末梢樹突。分支軸突係由髓磷脂所包圍，但髓磷脂不存在於進入肌肉的軸突部位。在這種情況下，分支軸突像構成其他突觸的軸突末端一樣形成末端的燈炮狀終紐(terminal boutons)，且末端的燈炮狀終紐係位於凹陷的肌肉細胞的表面上。這種結構稱為「運動終板(motor endplate)」或「神經肌肉突觸(neuromuscular synapse)」。

與其他突觸一樣，在神經肌肉突觸的軸突末端有許多線粒體和突觸囊泡。神經肌肉突觸的突觸囊泡係包含作為神經遞質的乙醯膽鹼。SNARE分 子對於乙醯膽鹼的釋放係至關重要的，且抑制乙醯膽鹼的釋放作用會導致鬆弛性麻痺(flaccid palsy)。突觸間隙(synaptic clefts)係位於軸突末端和肌肉之間，以及用作突觸後部分的骨骼肌細胞的細胞膜係被壓向肌漿(sarcoplasm)以形成許多褶皺(junctional folds)。由於乙醯膽鹼受體存在於連接褶皺周圍的細胞膜上，故此結構被認為是可擴大受體可與乙醯膽鹼結合的區域。

當神經脈衝傳遞到神經肌肉突觸時，末端細胞膜的電壓感測鈣通道被打開，從而使鈣離子進入鈣通道。因此，突觸囊泡融合到細胞膜上以使囊泡中的乙醯膽鹼游離成突觸間隙(synaptic clefts)。釋放的乙醯膽鹼係結合至肌細胞膜內的乙醯膽鹼受體上，並因此打開鈉通道，從而引起細胞膜的去極化。從神經肌肉突觸開始的脈衝係分佈於肌肉纖維的表面，並傳遞到肌肉細胞的深部。脈衝係被傳遞至三聯體(triads)以打開肌漿網的膜鈣通道，以及游離鈣離子係進入肌漿。鈣離子係結合至肌鈣蛋白C(troponin C)，且因此肌肉開始收縮。當脈衝被中斷時，鈣離子藉由主動運輸返回至肌漿網的運輸池(cisternae)中，從而引起肌肉鬆弛。因此，當抑制來自神經肌肉突觸的乙醯膽鹼的分泌時，在神經肌肉突觸處所產生之脈衝則不會傳遞至肌肉。在這種情況下，由於脈衝係被中斷，因此肌肉得以鬆弛。

同時，面部表情皺紋形成的原因或其機理係取決於表皮肌肉向內拉動皮膚的張力。這種肌肉張力係由於面部肌肉無力和過度的神經元活動所引起的。過度的神經元活動的特徵在於會刺激肌肉纖維之神經傳遞物質的不受控制的過度釋放。結果，用於控制神經傳遞物質釋放的分子使肌肉張力得以鬆弛，有助於去除面部皺紋。因此，需要有效控制神經傳遞物質釋放以治療肌肉痙孿 和減少或消除面部不對稱和/或面部皺紋(特別是面部表情皺紋)的新型活性成分，

已知肉毒桿菌毒素(Botulinum toxin)與肌肉鬆弛作用有關。肉毒桿菌毒素係最常使用於臨床測試和化妝品，用以去除面部皺紋。肉毒桿菌毒素引起SNARE蛋白的功能損傷，並藉由中斷SNARE複合物以抑制神經傳遞物質(即乙醯膽鹼)的分泌而具有肌肉鬆弛作用。

肉毒桿菌毒素係已用作肌肉鬆弛劑(韓國專利公開號2010-0020972)，或已藉由使用肉毒桿菌毒素的肌肉鬆弛作用而用於減少皺紋。然而，由於肉毒桿菌毒素的麻痺作用係為可逆地平均6個月，因此這種治療需要反覆地注射肉毒桿菌毒素。此外，由於肉毒桿菌毒素的大小可被患者的免疫系統所識別，因此肉毒桿菌毒素可能會誘導出對藥物的免疫反應。由於形成抗肉毒桿菌毒素的抗體會導致治療功效顯著地降低，因此這是一個嚴重的問題。因此，需要開發表現出類似於肉毒桿菌毒素的麻痺作用的分子，此分子具有不會誘導出免疫反應之更簡單和穩定的分子結構，並且有效於製造成本方面。

同時，皮脂係產生於皮脂腺中並藉由皮膚的毛孔而釋放，並藉由在皮膚和頭髮表面形成防護膜來保護細菌免受細菌侵襲，從而具有抗菌和抑制細胞生長的作用。當從皮脂腺中分泌的皮脂越來越多時毛孔則會擴大，或當皮脂穿過毛孔時則會產生問題。皮脂積累在這些擴大的毛孔中，且此皮脂係同時纏結死皮細胞、化妝美容廢料或灰塵而進一步積累。纏結的皮脂廢物係藉由接觸空氣中的自由基而被氧化，並因此變成棕色或黑色，從而產生黑頭(black head)。此外，由於皮脂會誘發粉刺，因此需要開發能夠抑制皮脂過多產生的材料。

因此，本發明的目的是提供一種具有例如肌肉鬆弛、改善皮膚皺紋、抑制皮脂產生、或改善粉刺之各種生理活性的胜肽，以及包含此胜肽的藥物或化妝品組合物。

為了達成這些目的，根據本發明的一方面，提供一種包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽。

根據本發明的另一方面，提供一種用於肌肉鬆弛的組合物，其包含作為活性成分之包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽。

根據本發明的一實施例，所述組合物可為藥物組合物或化妝品組合物的形式，但是本發明不限於此。

根據本發明的另一實施例，基於100重量%之用於肌肉鬆弛的組合物，可包含0.001重量%至60重量%的含量的所述胜肽，但是本發明不限於此。

根據本發明的另一實施例，所述組合物可用於預防或治療神經肌肉疾病。在本發明的一較佳實施例中，神經肌肉疾病可包括眼瞼抽搐(eyelid twitching)、斜頸(torticollis)、宮頸肌張力障礙(cervical dystonia)、強直性眼瞼痙孿(tonic blepharospasm)、腋窩多汗症(axillary hyperhidrosis)、肛裂(fissure)、陰道痙孿(colpospasm)、食道弛緩不能(achalasia)、頭痛症(headache disorder)、特發性和神經源性逼尿肌過度活躍(idiopathic and neurogenic detrusor overactivity)、局灶性肌張力障礙(focal dystonia)、顯下頜關節疼痛/疾病 (temporomandibular joint pain/disorder)、糖尿病神經病變(diabetic neuropathy)、聲帶功能障礙(vocal cord dysfunction)、斜視(strabismus)、慢性神經病變(chronic neuropathy)、面部肌肉肥大(facial muscular hypertrophy)、逼尿肌括約肌功能不全(detrusor-sphincter dyssynergia)和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia)，並且頭痛症可為偏頭痛(migraine)，但是本發明不限於此。

根據本發明的另一實施例，此胜肽可抑制乙醯膽鹼的分泌。

根據本發明的另一方面，提供一種化妝品組合物，其包含作為活性成分之具有胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽。

根據本發明的一實施例，化妝品組合物可用於改善皮膚狀況之目的，例如改善皮膚皺紋、抑制皮脂產生或改善粉刺，但是本發明不限於此。

根據本發明的另一實施例，基於100重量%的化妝品組合物，可包含0.001重量%至60重量%的含量的胜肽，但是本發明不限於此。

根據本發明的另一實施例，此胜肽可增加膠原蛋白的表現，但是本發明不限於此。

由於根據本發明之包含胺基酸序列SEQ ID NO：1所示的胜肽具有例如肌肉鬆弛、改善皮膚皺紋、抑制皮脂產生等的生理活性，因此此胜肽可用作在用於肌肉放鬆的組合物中的活性成分，用作用於改善皮膚皺紋的組合物中的活性成分，用作用於抑制皮脂產生的組合物中的活性成分，用作用於抑制黑頭的產生的組合物中的活性成分，或用作用於改善粉刺的組合物中的活性成分。

第1圖係示出當長時間保存時評估包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之高溫穩定性的結果。

第2圖係示出評估包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之高溫穩定性的結果。

第3圖係示出藉由包含胺基酸序列SEQ D NO：1的胜肽之重組syntaxin 1A的分解度。

第4圖係示出藉由包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之內源syntaxin 1A的分解度。

第5A至5B圖係示出包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽對於SNARE複合物的形成之抑制作用。

第6圖係示出包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽對於SNARE複合物的形成的抑制作用。

第7圖係為示出包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽對於乙醯膽鹼的分泌之抑制作用的圖式。

第8A至8B圖係示出包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之肌肉鬆弛作用。

第9A至9C圖及第10圖係示出肉毒桿菌毒素和包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之比較肌肉鬆弛作用的結果。

第11圖係示出確定包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽是否滲透到細胞中的結果。

第12圖係示出驗證包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之組織滲透模式的結果。

第13A至13D圖係示出驗證在毛囊周圍存在包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之組織滲透模式的結果。

第14A至14D圖係示出驗證在皮脂腺周圍存在包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之組織滲透模式的結果。

第15A至15B圖及第16A至16B圖係示出包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之皺紋減少作用。

第17A至17B圖係示出施用包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之膠原蛋白的增加水平。

第18A至18B圖係示出施用包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之彈性蛋白的增加水平。

第19A至19B圖係示出應用包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之纖維連接蛋白的增加水平。

第20A至20B圖係示出使用包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之皮脂腺的數量降低以及與皮脂產生相關的標記物的表現降低的結果。

在下文中，將詳細描述本發明。

1：本發明的胜肽

本發明提供一種胜肽，具有有用的生理活性，舉例而言，例如肌肉鬆弛、皮膚皺紋改善、皮脂產生抑制、或粉刺改善的各種生理活性。

本發明的胜肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：1。根據一實施例，本發明的胜肽可由胺基酸序列SEQ ID NO：1所構成。本發明不限於此。

在本說明書中，術語「胜肽(peptide)」係指一線性分子，其係由胺基酸殘基經由肚鍵彼此結合所形成。胜肽可藉由使用此相關領域中已知的常規生物或化學合成方法來製備，特別是固相合成技術(solid-phase synthesis techniques)。

胜肽可包含具有胺基酸的變體或片段，其具有在不影響其功能性的範圍內由於胺基酸殘基的缺失、插人或取代或其組合而具有不同序列的序列。在整體上不改變胜肽的活性的情況下替換胺基酸是現有技術中已知的。在某些情況下，可藉由磷酸化、硫酸化，丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)等來修飾胜肽。因此，本發明包括一種胜肽，其具有實質上相同於包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之胺基酸序列，以及本發明還包括其變體或活性片段。所述「實質上相同的蛋白質」係指相對於胺基酸序列SEQ ID NO：1之包括具有60%以上、較佳地75%以上、例如80%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上的胺基酸序列的蛋白質，但是本發明不限於此。具有60%以上的胺基酸序列同源性並且表現出相同活性的蛋白質落入本發明的範圍內。此外，本發明的胜肽可進一步包括針對特定目的而製備的靶序列、標籤、標記的殘基或胺基酸序列，以增強胜肽的半衰期或穩定性。

此外，可使用相關領域中熟知的各種方法獲得本發明的胜肽。根據本發明的一實施例，本發明的胜肽可使用多核苦酸重組和蛋白質表現系統來製備，或可使用藉由例如胜肽合成和無細胞蛋白質合成方法等化學合成之體外合成胜肽的方法來製備。

另外，保護基可結合至本發明的胜肽的N-或C-末端，用以實現更高的化學穩定性、增強的藥理特性(半衰期，吸收率、滴定度、功效等)、修飾的 特異性(例如生物活性譜的廣泛範圍)和降低的抗原性。舉例而言，保護基可為乙醯基、芴基甲氧基羰基(fluorenylmethoxycarbonyl group)、甲醯基、棕櫚醯基(palmitoyl group)、肉荳蔻基(myristyl group)、硬脂基(stearyl group)、或聚乙二醇(polyethylene glycol；PEG)。然而，只要保護基可修飾胜肽，特別是可增強胜肽的穩定性，可沒有限制地使用保護基。術語「穩定性」用作包括體內穩定性的含義，其係保護本發明的胜肽免受體內蛋白質切割酶的攻擊並保存穩定性(例如，室溫保存穩定性)。

2：包含本發明的胜肽的藥物組合物

本發明的另一方面提供一種用於肌肉鬆弛的藥物組合物，其包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽。

由於包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽係相同於如「1：本發明的胜肽」部分中所述的胜肽，因此具體描述請參照「1：本發明的胜肽」部分。在下文中，將僅描述藥物組合物的具體構造。

根據本發明的一實施例，本發明的胜肽具有肌肉鬆弛活性，因此可用作肌肉鬆弛組合物的活性成分。因此，本發明提供一種用於肌肉鬆弛的藥物組合物，其包含作為活性成分之包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽。

基於用於肌肉鬆弛的藥物組合物的100重量%，包含胜肽的含量可為0.001重量%至60重量%，例如0.01重量%至50重量%。當用於肌肉鬆弛的藥物組合物中的肚肚的含量小於下限時，可能無法充分表現出此胜肽的肌肉鬆弛作用。另一方面，當胜肽的含量大於上限時，就所添加的胜肽的濃度而言，可能獲得胜肽的相對較低作用。

本發明的藥物組合物可用於預防或治療神經肌肉疾病。在這種情況下，只要此神經肌肉疾病是一種以肌肉鬆弛為目的治療的疾病，本發明的藥物組合物可無限地應用於神經肌肉疾病。

本發明中使用的術語「保護」係指本發明的藥物組合物延遲神經肌肉疾病的發作之所有類型的作用。

本發明中使用的術語「抑制」係指本發明的藥物組合物減少神經肌肉疾病的發作之所有類型的作用。

本發明中使用的術語「治療」係指本發明的藥物組合物改善或改善神經肌肉疾病的症狀之所有類型的作用。

本發明中使用的術語「給藥(administration)」及「施用藥物(administration)」係指使用任何適當的方法將某種物質引入受試者。在這種情況下，可藉由可達到體內靶標的組合物之任何常用給藥途徑來施用本發明的藥物組合物。對本發明的藥物組合物的給藥途徑沒有特別限制，但是可口服地或不經腸胃地施用本發明的藥物組合物。特別地，本發明的藥物組合物可不經腸胃地施用，並且更具體地，可藉由將組合物施用在皮膚上(即，皮膚施用(dermal administration))來施用。特別地，本發明的藥物組合物的給藥可以一天進行一次至四次、一天進行兩次至三次、或一天進行兩次。此外，本發明的藥物組合物的給藥可以進行4週以上、8週以上、4週至12週、或8週至12週的期間。

本發明中使用的術語「神經肌肉疾病」係指發生在周圍神經和肌肉中的疾病。周圍神經是指從顱骨或脊椎的中樞神經系統發散而將例如肌肉或皮膚之類的末端器官連接到中樞神經系統的神經網絡，並將中樞神經系統產生的指令傳遞到例如肌肉等器官的末端，或將例如疼痛感之類的感覺信息傳遞到 中樞神經系統。周圍神經系統的疾病包括周圍神經功能障礙，周圍神經功能障礙係為由周圍神經與肌肉或肌肉本身等相連的神經肌肉突觸引起的疾病。

神經肌肉疾病的非限制性例子包括疾病，例如眼瞼抽搐(eyelid twitching)、斜頸(torticollis)(由於肌肉收縮而使頸部向一側傾斜的不自然的頸部姿勢)、宮頸肌張力障礙(cervical dystonia)、強直性眼瞼痙孿(tonic blepharospasm)、腋窩多汗症(axillary hyperhidrosis)、肛裂(fissure)、陰道痙孿(colpospasm)、食道弛緩不能(achalasia)、頭痛症(headache disorder)、特發性和神經源性逼尿肌過度活躍(idiopathic and neurogenic detrusor overactivity)、局灶性肌張力障礙(focal dystonia)(四肢、顯下頜關節、聲帶等)、顯下頜關節疼痛/疾病(temporomandibular joint pain/disorder)、糖尿病神經病變(diabetic neuropathy)、聲帶功能障礙(vocal cord dysfunction)、斜視(strabismus)、慢性神經病變(chronic neuropathy)、面部肌肉肥大(facial muscular hypertrophy)(咀嚼肌等)、逼尿肌括約肌功能不全(detrusor-sphincter dyssynergia)和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia)等。頭痛症可為偏頭痛(migraine)。

根據本發明的一實施例，本發明的藥物組合物可進一步包括適當的載體、賦形劑或稀釋劑，其通常用於製備藥物組合物。

可用於本發明的藥物組合物中的載體、賦形劑或稀釋劑包括乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨糖醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、木糖醇(xylitol)、赤蘚糖醇(erythritol)、麥芽糖醇(maltitol)、澱粉(starch)、阿拉伯膠(acacia gum)、藻酸鹽(alginate)、明膠(gelatin)、磷酸鈣(calcium phosphate)、矽酸鈣(calcium silicate)、纖維素(cellulose)、甲基纖維素(methyl cellulose)、無定形纖維素(amorphous cellulose)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、水、羥基苯甲酸甲酯(methyl hydrexybenzoate)、羥基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzeate)、滑石粉(talc)、硬脂酸鎂(magnesium stearate)、礦物油(mineral oil)等。

基於使用的常規方法，本發明的藥物組合物可用於配製成例如粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、混懸劑、乳劑、糖漿劑、口服製劑(例如氣霧劑)、外用製劑、栓劑和無菌注射溶液的形式。

配製時，可使用本領域通常使用例如填充劑、增量劑、黏合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑等稀釋劑或賦形劑來製備藥物組合物。口服固體製劑包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑等。可藉由將化合物與例如澱粉、碳酸鈣、蔗糖、或乳糖、明膠等至少一種賦形劑混合來製備這種固體製劑。

此外，除了簡單的賦形劑之外，本文還可使用潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石粉等。用於口服的液相製劑包括混懸劑、內用溶液、乳劑、糖漿劑等。除了通常在本領域中使用的惰性稀釋劑(例如水、液態石蠟)以外，這種液相製劑還可包含各種賦形劑，例如潤濕劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑等。

腸胃外給藥(parenteral administration)的製劑包括無菌水溶液、非水溶劑、懸浮液、乳劑、凍乾製劑、栓劑等。可使用例如丙二醇、聚乙二醇或橄欖油之植物油，或可注射例如油酸乙醋等醋類作為非水溶劑和懸浮液。可將氫化椰油脂酸甘油酯(Witepsol)、聚乙二醇(Macrogol)、妥文61(Tween 61)、可可脂、月桂酸醋、甘油明膠等用作栓劑的基質。

口服固體製劑包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑等。可藉由將本發明的藥物組合物與例如澱粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等至少一種 賦形劑混合來製備這樣的固體製劑。除簡單的賦形劑之外，本文還可使用潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石粉等。

用於口服的液相製劑包括混懸劑、內用溶液、乳劑、糖漿劑等。除了通常在領域中使用的惰性稀釋劑(例如水、液態石蠟)以外，這種液相製劑還可包含各種賦形劑，例如潤濕劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑等。

施用到皮膚上的製劑包括粉劑、乳劑、懸浮液、油、噴霧劑、軟膏、乳膏、凝膠、泡沬或溶液。本發明的藥物製劑可為無水軟膏，並且可包含特別是低黏度石蠟之適合於局部應用並在體溫下呈液態的石蠟，或可包含天然脂肪或部分合成脂肪，例如椰子脂肪酸甘油三酸酷、氫化油(例如氫化花生油或篦麻油)、甘油的部分脂肪酸酯(例如單硬脂酸廿油酯和二硬脂酸甘油酯)、矽氧烷(例如為六甲基二矽氧烷或八甲基三矽氧烷的聚甲基矽氧烷)等。舉例而言，藥物製劑可包含與水性乳膏結合併用於增加水分吸收能力的脂肪醇，以及包含固醇、羊毛蠟、其他乳化劑和/或其他添加劑。

可根據患者的狀況和體重、疾病的嚴重程度、藥物的形式、給藥途徑、及給藥時間，從而改變本發明的藥物組合物中所含之包含胺基酸序列的胜肽的劑量，但在必要時可適當選擇本發明的藥物組合物中所含之包含胺基酸序列的胜肽的劑量。舉例而言，包括胺基酸序列的胜肽可每天以0.0001mg/kg至1,000mg/kg的劑量，特別是0.1mg/kg至1,000mg/kg的劑量施用。此胜肽可每天施用一次，也可每天分幾次施用。然而，本發明的範圍不受藥物組合物的劑量所限制。包含本發明的胺基酸序列的胜肽的劑量可根據給藥途徑、疾病的嚴重程度、患者的性別、體重和年齡等而波動。因此，胜肽的劑量並不意旨以某些方式限制本發明的範圍。

可藉由各種給藥途徑給予哺乳動物(例如小鼠、大鼠、家畜及人類等)施用本發明的藥物組合物。施用藥物的方式可能為預期的。在這種情況下，舉例而言，可藉由所有給藥方式，例如口服、直腸或靜脈內、肌內、皮下、子宮內硬腦膜或腦室內注射來給予此胜肽。

除了包含胺基酸序列的胜肽以外，根據本發明之用於預防、抑制或治療神經肌肉疾病的藥物組合物還可包含一或多種具有改善、減緩或預防神經肌肉疾病的作用的活性成分。

為了改善、減緩或預防神經肌肉疾病，本發明的藥物組合物可單獨使用，或可與手術、激素療法、藥物治療和其他使用生物反應調節劑的療法組合使用。

根據本發明的一實施例，本發明的胜肽係在高溫下是穩定的(參照第1圖及第2圖)、分解參與神經遞質釋放的syntaxin 1A、抑制SNARE複合物的形成(參照第3圖至第6圖)、抑制乙醯膽鹼的分泌(參照第7圖)、具有肌肉鬆弛作用(參照第8A圖至第10圖)、可滲透到細胞中並穿透組織的肌膜與神經元標記物共存從而發揮肌肉鬆弛作用(參照第11圖至第14D圖)。

3：包含本發明的胜肽的化妝品組合物

本發明的另一方面提供一種化妝品組合物，其包含作為活性成分之包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽。

由於包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽係相同於如「1：本發明的胜肽」部分中所述的胜肽，因此具體描述請參照「1：本發明的胜肽」部分。在下文中，將僅描述化妝品組合物的具體構造。

在本發明中，術語「毛孔(pores)」係指小孔，藉由此小孔分泌於面部、前額、鼻子等中的皮脂，以及術語「黑頭(black head)」係指看起來像黑色之退化的皮脂、老化死亡的皮膚細胞等混合物堆積在毛孔中的皮脂，並且污染物係沉積在毛孔周圍。

根據本發明的一實施例，本發明的化妝品組合物可用於改善皮膚狀況的化妝品組合物。術語「改善皮膚狀況」通常可指治療、緩解或減輕由皮膚的內在或外在因素引起的皮膚損害的過程或其效果。舉例而言，此改善可表示此化妝品組合物用於改善皺紋、增強皮膚彈性、使傷口再生、抑制皮脂產生或改善粉刺等，但是本發明不限於此。

根據本發明的一實施例，本發明的胜肽係在高溫下是穩定的(參照第1圖及第2圖)，並且具有改善由於肌肉鬆弛或皮膚成分增加引起的皮膚皺紋的作用(參照第15A圖至第19B圖)。真皮成分可包括膠原蛋白，但是本發明不限於此。

根據本發明的一實施例，本發明的胜肽係在高溫下是穩定的(參照第1圖及第2圖)，以及皮脂腺的數量降低，並且皮脂產生相關標記的表現水平降低(參照第20A至20B圖)。

本發明的化妝品組合物可使用化妝品領域中通常使用的基材、助劑和添加劑以液體或固體形式製備。液體或固體形式的化妝品可例如包括洗面劑、乳霜、沐浴劑等，但是本發明不限於此。舉例而言，化妝品領域中常用的基礎材料、助劑和添加劑包括水、醇類、丙二醇、硬脂酸、甘油、鯨蠟醇、液態石蠟等，但是本發明不特別限於此。

除了包含胺基酸序列的胜肽以外，本發明的化妝品組合物還可包含化妝品組合物中通常使用的成分。舉例而言，化妝品組合物可包含常規的佐劑和載體，例如抗氧化劑、穩定劑、增溶劑、維生素、顏料和香料。

可將本發明的化妝品組合物製成相關領域中通常可獲得的任何製劑。舉例而言，可將化妝品組合物配製為製備溶液、懸浮液、乳液、糊劑、凝膠、乳膏、洗劑、粉劑、湯料、含表面活性劑的清潔劑、油、粉底液、乳液粉底、蠟粉底、噴霧等，但是本發明不限於此。更具體而言，可配製化妝品組合物以製備調色劑、洗劑、滋養霜、按摩霜、香精、眼霜、清潔霜、清潔泡沬、清潔水、包裝劑、噴霧劑、或粉劑。

當本發明化妝品組合物的製劑為糊劑、乳膏或凝膠時，動物油、植物油、蠟、石蠟、澱粉、龍膠(tragacanth)、纖維素衍生物、聚乙二醇、矽氧烷、膨潤土(bentonite)、二氧化矽、滑石粉、氧化鋅等可以用作載體成分。

當本發明的化妝品組合物的製劑為粉末或噴霧劑時，乳糖、滑石粉、二氧化矽、氫氧化鋁、矽酸鈣或聚醯胺粉末可用作載體組分。更具體而言，當所述製劑為噴霧劑時，所述製劑可進一步包含推進劑，例如氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚。

當本發明的化妝品組合物的製劑為乳液時，可使用溶劑、增溶劑或乳化劑作為載體成分。舉例而言，載體成分包括水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇(benzyl alcohol)、苯甲酸苯甲酯(benzyl benzoate)、丙二醇、1,3-丁二醇油、廿油脂族醋(glycerol aliphatic ester)、聚乙二醇或脫水山梨醇(sorbitan)的脂肪酸醋。

當本發明的化妝品組合物的製劑為懸浮液時，例如水、乙醇或丙二醇之液體稀釋劑、例如乙氧基化異硬脂醇(ethoxylated isostearyl alcohol)、聚氧乙烯山梨醇醋(polyoxyethylene sorbitol ester)和聚氧乙烯山梨醇醋(polyoxyethylene sorbitan ester)、微晶纖維素(microcrystalline cellulose)、鋁偏氫氧化物(aluminum metahydroxide)、膨潤土(bentonite)、洋菜膠、龍膠(tragacanth)等懸浮劑可用作載體成分。

當本發明的化妝品組合物的製劑為含表面活性劑的清潔劑時，脂族醇硫酸鹽(aliphatic alcohol sulfate)、脂族醇醚硫酸鹽(aliphatic alcohol ether sulfate)、磺基琥珀酸醋單醋(sulfosuccinate monoester)、咪唑啉鎓衍生物(imidazolinium derivative)、牛磺酸甲酯(methyl taurate)、肌氨酸鹽(sarcosinate)、脂肪酸醯胺醚硫酸鹽(fatty acid amide ether sulfate)、烷基醯胺基甜菜鹼(alkyl amido betaine)、脂族醇(aliphatic alcohol)、脂肪酸甘油酯(fatty acid glyceride)、脂肪酸二乙醇醯胺(fatty acid diethanolamide)、植物油、羊毛脂衍生物(lanolin derivative)、乙氧基化甘油脂肪酸醋(ethoxylated glycerol fatty acid ester)等可用作載體成分。

本發明的化妝品組合物可單獨使用，或可藉由兩次施用來使用，或可與除本發明的化妝品組合物之外的另一種化妝品組合物藉由兩次施用來使用。此外，可根據常規使用方法使用具有優異的皮膚保濕效果和優異的皮膚屏障改善效果之本發明的化妝品組合物，且其使用次數可根據使用者的皮膚狀況或偏好而改變。

當本發明的化妝品組合物為肥皂、含表面活性劑的清潔劑或不含表面活性劑的清潔劑時，可將化妝品組合物塗在皮膚上後擦去，分離或用水洗 滌。作為具體實例，肥皂為液體肥皂、肥皂粉、固體肥皂及油肥皂，含表面活性劑的清潔劑為清潔泡沬、清潔水、清潔毛巾及清潔劑，以及不含表面活性劑的清潔劑為清潔霜、清潔洗劑、清潔水及清潔凝膠，但是本發明不限於此。

4：包含本發明的胜肽的藥物組合物或化妝品組合物的用途

本發明的又一方面提供一種使用由SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列組成之胜肽用於製備肌肉鬆弛的藥物組合物、預防或治療神經肌肉疾病的藥物組合物或改善皮膚狀況之化妝品組合物的用途，所述藥物組合物或化妝品組合物包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽。

由於包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽係相同於如「1：本發明的胜肽」部分中所述的胜肽，因此具體描述請參照「1：本發明的胜肽」部分。在下文中，將僅描述包含胜肽的組合物的用途。

根據本發明的一方面，本發明提供一種用於肌肉鬆弛的方法，其包含將所述胜肽或藥物組合物施用於皮膚或肌肉收縮的皮膚上。應用可包含對皮膚的施用，但是本發明不限於此。

根據本發明的另一方面，本發明提供一種預防、抑制或治療神經肌肉疾病的方法，其包含將所述胜肽或藥物組合物施用於受試者或已發展為神經肌肉疾病的受試者。

藥物組合物係如「2：包含本發明的胜肽的藥物組合物」中所述。

可將有效量的包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的的胜肽或包含此胜肽的藥物組合物施用/給予有需要的受試者。

根據本發明的又一方面，本發明提供一種改善皮膚皺紋的方法，此方法包括將所述胜肽或化妝品組合物施用於皮膚或出現皺紋的皮膚上。

根據本發明的另一個方面，本發明提供一種抑制皮脂產生的方法，此方法包括將所述胜肽或化妝品組合物施用於皮膚上。

根據本發明的又一方面，本發明提供一種改善粉刺的方法，此方法包括將所述胜肽或化妝品組合物施用於皮膚或出現粉刺的皮膚上。

根據本發明，應用可包含在皮膚上的施用，但是本發明不限於此。

化妝品組合物係如「3：包含本發明的胜肽的化妝品組合物」中所述。

可將有效量的包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽或包含此胜肽的化妝品組合物施用於/給予有此需要的受試者。

在下文中，將參考其製備範例、範例和實驗範例詳細描述本發明。

然而，應理解的是，以下製備範例、範例和實驗範例僅為說明本發明的目的，而非意旨於限制本發明的範圍。

製備範例1：具有各種生理活性的新穎胜肽的製備

使用已知方法製備具有胺基酸序列SEQ ID NO：1的新穎胜肽序列「KFLIK」。此新穎胜肽的分子量為647.4Da。

實驗範例1：胜肽的高溫穩定性的評價

1-1：長期保存後的高溫穩定性評價

將具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之本發明的胜肽以1,000ppm的濃度溶解在無菌蒸餾水中，在45℃下儲存7天、14天、28天、60天和75天，然後進行HPLC測定。

結果如第1圖所示，可看出本發明的胜肽的穩定性在45℃條件下維持了最長75天的觀察時間。

1-2：高溫穩定性評價

將本發明的胜肽以1,000ppm的濃度溶解在無菌蒸餾水中，在121℃下加熱15分鐘和30分鐘，然後進行HPLC測定。

結果如第2圖所示，可看出本發明的胜肽的穩定性在最大升溫時間為30分鐘下保持在121℃。

實驗範例2：藉由胜肽確認syntaxin 1A的分解度

可溶性N-乙基馬來醯亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor；SNARE)蛋白參與在細胞中發生的膜融合。參與神經傳遞的神經SNARE(neuronal SNARE)係相關於突觸囊泡與突觸前膜的結合。攜帶神經遞質同時釋放神經遞質的突觸囊泡應與突觸前膜融合，以形成神經傳遞物質釋放通道。在這種情況下，此融合係藉由以蛋白質複合物形式存在的SNARE而產生。更具體而言，此融合係涉及t-SNARE複合物以及附著於囊泡的v-SNARE，其中t-SNARE複合物係為附著於目標細胞膜上的SNAP-25蛋白和syntaxin 1A蛋白的複合物。當SNARE共軛和扭曲過程未完全完成時，細胞膜融合係為失敗的。因此，由於神經傳遞物質沒有被釋放，使得肌肉得以鬆弛。其係驗證本發明的胜肽是否具有分解構成t-SNARE的syntaxin 1A蛋白的能力。

2-1：確認重組syntaxin 1A的分解度

在實驗組中，用1μg的重組syntaxin 1A蛋白(Novus biologicals，美國)和遞增濃度的本發明胜肽(20μM、100μM、及200μM)來處理反應緩衝溶液(50mM HEPES、40mM 2-ME、20μM ZnCl2、pH 7.4)。在陰性控制組(控制組)中，僅用重組syntaxin 1A蛋白處理反應緩衝溶液。所產生之混合物係在37℃的條 件下反應4小時，然後使用syntaxin 1A抗體(Synaptic Systems，德國)進行西方墨點法。

結果確認，當使用本發明的胜肽處理溶液時，相較於未使用本發明的胜肽處理溶液的陰性控制組，本發明的胜肽以濃度依賴方式(concentration-dependent manner)減少了重組syntaxin 1A蛋白的條帶(參照第3圖)。

2-2：確認表現於細胞中的內源syntaxin 1A的分解度

用30μg的SH-SY5Y細胞裂解物和遞增濃度的本發明胜肽(20μM、100μM、及200μM)來處理反應緩衝溶液(50mM HEPES、40mM 2-ME、20μM ZnCl2、pH 7.4)。在陽性控制組(BoNT/C LC)中，使用0.2μM肉毒桿菌神經毒素C型的輕鏈(BoNT/C LC)代替本發明的胜肽，且在陰性控制組(控制組)的條件下僅用30μg的SH-SY5Y細胞裂解物處理樣品。每一個混合物係在37℃下反應4小時。使用syntaxin 1A抗體(Synaptic Systems，德國)對反應混合物進行西方墨點法。

結果確認，當使用本發明的胜肽處理溶液時，本發明的胜肽以濃度依賴性方式減少了重組syntaxin 1A蛋白的條帶，如同用BoNT/C LC處理溶液的陽性控制組(參照第4圖)。

實驗範例2的結論：本發明的胜肽分解重組syntaxin 1A或內源syntaxin 1A，因此不形成SNARE複合物。因此，預期是本發明的胜肽由於神經傳遞物質沒有被釋放而具有肌肉鬆弛作用。

實驗範例3：SNARE複合物的形成之分析

3-1：使用西方墨點法進行分析

確認藉由本發明的胜肽對syntaxin 1A的分解作用是否抑制在細胞中形成的SNARE複合物。更具體而言，在進行西方墨點法後，確定具有預期大小的SNARE複合物之條帶的密度。SH-SY5Y細胞以3×10⁵細胞/孔的密度接種在6孔板中。將細胞培養過夜後，將培養基替換為無血清的DMEM。用遞增濃度(10μM、50μM、及100μM)的本發明胜肽來處理所得之培養液.在陽性控制組的情況下，用0.2Mm BoNT/C LC來處理溶液。在陰性控制組(控制組)中，其樣品係未處理。樣品處理24小時後，收集細胞並獲得裂解物，然後使用syntaxin 1A抗體(Synaptic Systems，德國)進行西方墨點法分析。SNARE複合物的條帶大小為75kDa。

根據西方墨點法結果，係觀察到，當使用本發明的胜肽處理溶液時，SH-SY5Y細胞中SNARE複合物的形成受到抑制，如同使用BoNT/C LC處理溶液的陽性控制組(參照第5A至5B圖)。考量實驗範例2的結果，預期是因為本發明肚肚對syntaxin 1A的分解的效果而抑制了SNARE複合物的形成。

3-2：使用免疫共沉澱法(Co-IP)進行分析

免疫共沉澱法(Coimmunoprecipitation)係用於檢測一蛋白質，其係於非變性條件下與另一特定蛋白質結合。SH-SY5Y細胞以3×10⁵細胞/孔的密度接種在6孔板中。當細胞培養過夜時，將培養基替換為無血清的DMEM。用50μM濃度的本發明的胜肽來處理所得之培養溶液約24小時。在陽性控制組的情況下，用0.2μM BoNT/C LC來處理溶液。在陰性控制組(控制組)中，其樣品係未處理。獲得細胞裂解物，並使用SNAP-25抗體(Synaptic Systems，德國)進行免疫沉澱法(immunoprecipitation)，然後使用SNAP-25抗體和Syntaxin 1A抗體(Synaptic Systems，德國)進行西方墨點法。

結果驗證，藉由使用本發明胜肽的處理抑制SH-SY5Y細胞中SNARE複合物的形成，從而抑制SNAP-25與Syntaxin 1A之間的相互作用(參照第6圖)。在第6圖中，「IP輸人」表示在IP之前獲得的細胞裂解物中發現的Syntaxin 1A蛋白SNAP-25的量，以及「免疫沉澱法：抗SNAP-25」表示藉由處理取得自使用SNAP-25抗體的免疫沉澱法之具有SNAP-25抗體或Syntaxin 1A抗體的產物而獲得的結果。也就是說，在「免疫沉澱法：抗SNAP-25」中，「SNAP-25」套組表示藉由重新檢測藉由SNAP-25抗體沉澱在細胞裂解液中的SNAP-5而獲得的結果，以及「syntaxin 1A」套組表示藉由使用syntaxin 1A抗體檢測SNAP-25抗體在細胞裂解液中沉澱的沉澱物而獲得的結果。係可看出，由於在「syntaxin 1A」套組中未處理樣品的陰性控制組(控制組)中保持一定量的syntaxin 1A，因此SNARE複合物並沒有形成。同樣地，係可看出，由於在本發明的胜肽處理組和BoNT/C LC處理組中syntaxin 1A的量降低，因此抑制了SNARE複合物的形成。

實驗範例3的結論：

係可看出，在使用本發明胜肽的處理期間，SNARE複合物的形成係被抑制的。考量到實驗範例2的結果，還可看出，syntaxin 1A藉由使用本發明胜肽的處理而被分解，從而抑制SNARE複合物的形成。因此，預期是由於SNARE複合物的形成係被抑制的而沒有釋放神經傳遞物質從而使本發明的胜肽具有肌肉鬆弛作用。

實驗範例4：確認胜肽對乙醯膽鹼分泌的抑制作用

確認包含胺基酸序列SEQ ID NO：1之本發明的胜肽是否對乙醯膽鹼分泌具有抑制作用。接種人骨髓神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，並在CO₂培養箱中培養24小時。用無血清培養基代替培養基，並將細胞培養48小時。用遞增濃 度(1μM、10μM、及50μM)之本發明的胜肽處理所得之培養液，然後用50nM的破傷風作為陽性控制組處理。此外，用尼古丁(NIC)加氯化鉀(KCl)作為促進乙醯膽鹼分泌的誘導因子處理培養液，然後培養30分鐘。將培養液用菸鹼和氯化鉀處理但未用本發明的胜肽或破傷風處理的組作為陰性控制組。培養結束後，分離培養基，使用膽鹼/乙醯膽鹼分析試劑盒測定培養基中所含的乙醯膽鹼的分泌水平。

如第7圖所示，確認本發明的胜肽相對於正常組(控制組)分泌的乙醯膽鹼水平以濃度依賴性方式降低了乙醯膽鹼的含量。同樣地，確認當用50μM濃度的本發明的胜肽處理樣品時，本發明的胜肽相較於使用破傷風處理樣品的陽性控制組對乙醯膽鹼分泌具有優異的抑制作用。

實驗範例5：確認對小鼠腳趾肌肉鬆弛的作用

將來自C57BL/6的雌性7週齡小鼠的小腿肌肉施用100μg本發明的胜肽，然後觀察。使用足趾外展評分(digit abduction scoring；DAS)分析確定肌肉鬆弛作用。外展(abduction)係指伸展四肢的運動，以及DAS係藉由測量動物在小腿肌肉中觸發驚嚇反應的能力降低程度而獲得的。DAS被分為分數0到4。在這種情況下，得分越高意味著肌肉鬆弛作用越高(參照第8A圖)。亦即，分數越高意味著藉由例如乙醯膽鹼分泌抑制等的機制更抑制驚嚇反應。分數0表示所有五個腳趾都分開，分數1表示外展期間兩個鼠標腳趾是固定的，分數2表示大腳趾和兩個腳趾沒有分開，分數3表示大腳趾和三個腳趾是固定的，分數4表示所有五個腳趾都是固定的。

請參第8A至8B圖，其示出包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之肌肉鬆弛作用。第8A圖係示出DAS評分。第8B圖係示出使用本發明的胜 肽處理之前及之後的結果，其中S1代表施用之前的結果，S2代表施用3小時的結果，S3代表施用7小時的結果，S4代表施用17小時的結果，S5代表施用25小時的結果，S6代表施用30小時的結果。

如第8B圖所示，在使用本發明的胜肽處理之前發生了驚嚇反應，所有五個腳趾係為分開的，將其給予評分0。另一方面，在注射本發明的胜肽3小時後本發明的胜肽的肌肉鬆弛作用係增加了DAS分數，以及在注射本發明的胜肽17小時後分數係為4。

實驗範例6：胜肽和肉毒桿菌毒素的肌肉鬆弛作用之間的比較

從兩隻C57BL/6雌性7週齡小鼠中的每個小腿肌肉中注射100μg本發明的胜肽和0.6單位的BTX-A型(BoNT-A)，然後進行DAS分析。DAS評分請參照第9A圖所示，施用BoNT-A的控制組請參照第9B圖，施用本發明的胜肽的控制組請參照第9C圖。

如第9A至9C圖及第10圖所示，相較於未給藥組，本發明的胜肽給藥組係在給藥20小時後表示出優異的肌肉鬆弛效果，並且具有類似於BoNT-A的效果。

實驗範例4至6的結論：

由於本發明的胜肽在體外抑制乙醯膽鹼的分泌，並且顯示出類似於肉毒桿菌毒素的體內肌肉鬆弛作用，因此本發明的胜肽可有效地用於改善神經肌肉疾病或改善皺紋。

實驗範例7：確認胜肽向細胞或組織的滲透模式

如下製備用於確認本發明的胜肽向細胞或組織的滲透模式的「羅丹明-發明胜肽(rhodamine-inventive peptide)」共軛物。用100mM的碳酸氫鈉(pH 9.0)製備10mg/mL的本發明溶液的胜肽。使用二甲基甲醯胺製備1mg/mL的NHS-羅丹明(Thermo Scientific，46406)溶液。使溶液混合，使得本發明的胜肽與NHS-羅丹明共軛物的莫耳比為1：10。遮光後，將所得混合物在室溫下倒置反應一個小時。透析反應溶液，然後進行LC/MS以確認若丹明與本發明的胜肽之間的共軛。

7-1：確認胜肽向細胞的滲透

SH-SY5Y細胞以3×10⁵細胞/孔的密度接種在6孔板中。將細胞培養過夜後，將培養基替換為無血清的DMEM。用遞增濃度的用螢光物質(如羅丹明(rhodamine))標記的本發明的胜肽處理培養液4小時。4小時後，將培養液用4%多聚甲醛處理以固定細胞。之後，使用DAPI染色試劑盒(Invitrogen，美國)對細胞進行核染色。使用螢光顯微鏡觀察胜肽向細胞的滲透。藍色代表DAPI染色的細胞核，紅色代表「羅丹明-發明胜肽(rhodamine-inventive peptide)」共軛物。

如第11圖所示，確認了當使用本發明的胜肽處理培養液時，本發明的胜肽滲透到SH-SY5Y細胞中。

7-2：確定胜肽的組織穿透模式

從一隻7周大的SD大鼠的背部脫毛，將羅丹明和本發明的胜肽施用於此大鼠的背部上。一個小時後，犧牲大鼠以進行分析。收集皮膚組織的施加部分，並在福爾馬林中固定一天。從固定的組織中製備石蠟塊，並將其切成薄片，然後使用神經元標記物TrkB Ab(Cell Signaling，美國)進行免疫組織化學染色。之後，使用DAPI染色試劑盒(Invitrogen，美國)對細胞進行核染色。使用螢光顯微鏡觀察胜肽向細胞的滲透。藍色代表被DAPI染色的細胞核，紅色代表「羅丹明-發明胜肽(rhodamine-inventive peptide)」共軛物，綠色代表TrkB(神經纖維標記物)。

根據所獲得的結果，確認了當使用本發明的胜肽處理皮膚時，本發明的胜肽滲透到皮膚組織的肌膜，如第12圖所示。還確認了本發明的胜肽與神經元標記物共定位。當觀察第12圖的放大圖時，確認了本發明的胜肽與毛囊或皮脂腺周圍的神經元共定位(參照第13A至13D圖及第14A至14D圖)。

如第13A至13D圖所示，其係驗證在毛囊周圍存在包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之組織滲透模式的結果。第13A圖中藍色代表為DAPI，第13B圖中綠色代表為FITC_神經細胞，第13C圖中紅色代表為本發明一實施例的胜肽，第13D圖代表為合併的圖。

如第14A至14D圖所示，其係驗證在皮脂腺周圍存在包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之組織滲透模式的結果。第14A圖中藍色代表為DAPI，第14B圖中綠色代表為FITC_神經細胞，第14C圖中紅色代表為本發明一實施例的胜肽，第14D圖代表為合併的圖。

實驗範例7的結論：

本發明的胜肽可滲入細胞、滲入皮膚組織的肌膜、並與肌膜中的神經元標記物共定位。因此，預期是本發明的胜肽參與神經元的神經傳遞物質的傳輸之SNARE複合物的形成，從而表現出肌肉鬆弛作用。

實驗範例8：確認胜肽的皺紋改善作用(皮膚成分的表現增加)

將包含4,000ppm的本發明胜肽的脂質體溶液每夭兩次施用於7週齡無毛小鼠的背部，總共12週。用肉眼觀察所施加的部分後，皮膚組織係被收集並被固定在福爾馬林中。從固定的組織製備石蠟塊，並進行切片以製備組織玻片。

8-1：確認皺紋減少作用

在施用了12週包含本發明的胜肽的脂質體溶液之小鼠的組中，用肉眼觀察小鼠並在顯微鏡下觀察。結果，相較於僅施用脂質體溶液的控制組，觀察到所有小鼠中的皺紋隨著肌肉鬆弛作用而顯著地減少(參照第15A至15B圖及第16A至16B圖)。

如第15A至15B圖及第16A至16B圖所示，其係示出包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之皺紋減少作用。第15A及16A圖代表為脂質體溶液組的結果，第15B及16B圖代表為施用本發明一實施例的胜肽的脂質體溶液的結果。

8-2：評價膠原蛋白的表現水平

使用Masson的Trichrome染色試劑盒(Abcam，美國)對組織玻片進行染色，然後使用光學顯微鏡進行觀察。

經確認，相較於僅施用脂質體溶液的控制組，在施用了12週包含本發明的胜肽的脂質體溶液之小鼠的組中膠原蛋白的表現水平係增加(參照第17A至17B圖)。

如第17A至17B圖所示，其係示出施用包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之膠原蛋白的增加水平，其中第17A圖代表為脂質體控制組的結果，第17B圖代表為施用本發明一實施例的胜肽的脂質體溶液的結果。

8-3：評價彈性蛋白和纖維連接蛋白(fibronectin)的表現水平

使用彈性蛋白抗體和纖維連接蛋白抗體(Cell Signaling，美國)對組織玻片進行免疫組織化學染色，然後使用DAPI染色試劑盒(Invitrogen，美國)進行核染色。使用螢光顯微鏡觀察染色的組織玻片。

經確認，相較於僅施用脂質體溶液的控制組，在施用了12週包含本發明的胜肽的脂質體溶液之小鼠的組中彈性蛋白和纖維連接蛋白的表現水平係增加(參照第18A至18B圖及第19A至19B圖)。

如第18A至18B圖所示，其係示出施用包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之彈性蛋白的增加水平。第18A圖代表為脂質體控制組的結果，第18B圖代表為施用本發明一實施例的胜肽的脂質體溶液的結果。

如第19A至19B圖所示，其係示出應用包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的胜肽之纖維連接蛋白的增加水平。第19A圖代表為脂質體控制組的結果，第19B圖代表為施用本發明一實施例的胜肽的脂質體溶液的結果。

實驗範例9：確認胜肽對皮脂產生的抑制作用

將包含4,000ppm之本發明的胜肽的脂質體溶液每天兩次施用於7週齡無毛小鼠的背部，總共12週。用肉眼觀察所施加的部分後，皮膚組織係被收集並被固定在福爾馬林中。從固定的組織製備石蠟塊，並進行切片以製備組織玻片。使用作為皮脂產生相關標記物的脂肪酸合成醃抗體(Cell Signaling，美國)對組織玻片進行免疫組織化學染色，並使用光學顯微鏡觀察染色的組織玻片。

其係確認了，相較於僅使用脂質體溶液的控制組，在施用12週包含本發明的胜肽的脂質體溶液的小鼠組中皮脂腺的數量降低以及皮脂產生相關標記物的表現水平降低(參照第20A至20B圖)。第20A圖係示出藉由施用12週不包含胜肽的脂質體而獲得的結果，第20B圖係示出藉由施用12週包含4,000ppm的胜肽的脂質體而獲得的結果。就這一點而言，可看出，當應用胜肽脂質體時，呈現棕色的免疫染色部分的顏色褪色且免疫染色部分的數量降低。

製備範例2：化妝品製劑的製備

2-1：精華液的製備

下述表1中係列出基於含量(重量份)使用本發明的勝狀製備精華液。

2-2：調色劑的製備

下述表2中係列出製備包含本發明的胜肽作為活性成分的調色劑。

2-3：滋養霜的製備

基於下述表3中所列出的組成來製備包含作為活性成分的本發明胜肽的滋養霜。

2-4：洗劑的製備

基於下述表4中所列出的組成來製備包含作為活性成分的本發明胜肽的洗劑。

製備範例3：藥物組合物的製備

3-1：粉劑製備

混合各成分，然後裝入密封包裝中以製備粉劑。

3-2：片劑的製備

混合各組分，然後根據常規的製備片劑的方法壓片以製備片劑。

3-3：膠囊的製備

混合各成分，然後裝入明膠膠囊中，按照常規的製備膠囊的方法來製備膠囊。

3-4：藥丸的製備

混合各成分，然後按照常規方法進行處理以製備藥丸，從而以每藥丸總共4g的含量包含這些成分。

3-5：顆粒劑的製備

發明胜肽 150mg

混合組分，然後向其中加入100mg的30%乙醇。將得到的混合物在60℃下乾燥以形成顆粒，然後將其填充到包裝中。

Claims (10)

1. 一種使用由SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列組成之一胜肽用於製備一肌肉鬆弛的藥物組合物的用途。
2. 如申請專利範圍第1項所述之使用該胜肽用於製備該肌肉鬆弛的藥物組合物的用途，其中基於100重量%之用於該肌肉鬆弛的藥物組合物，包含0.001重量%至60重量%的含量的所述胜肽。
3. 一種使用由SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列組成之一胜肽製備用於預防或治療一神經肌肉疾病之藥物組合物的用途。
4. 如申請專利範圍第3項所述之使用該胜肽製備用於預防或治療該神經肌肉疾病之藥物組合物的用途，其中所述神經肌肉疾病包括選自以下的任意一種：眼瞼抽搐(eyelid twitching)、斜頸(torticollis)、宮頸肌張力障礙(ceryical dystonia)、強直性眼瞼痙攣(tonic blepharospasm)、腋窩多汗症(axillary hyperhidrosis)、肛裂(fissure)、陰道痙攣(colpospasm)、食道弛緩不能(achalasia)、頭痛症(headache disorder)、特發性和神經源性逼尿肌過度活躍(idiopathic and neurogenic detrusor overactivity)、局灶性肌張力障礙(focal dystonia)、顳下頜關節疼痛/疾病(temporomandibular joint pain/disorder)、糖尿病神經病變(diabetic neuropathy)、聲帶功能障礙(vocal cord dysfunction)、斜視(strabismus)、慢性神經病變(chronic neuropathy)、面部肌肉肥大(facial muscular hypertrophy)、逼尿肌 括約肌功能不全(detrusor-sphincter dyssynergia)和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia)。
5. 如申請專利範圍第4項所述之使用該胜肽製備用於預防或治療該神經肌肉疾病之藥物組合物的用途，其中所述頭痛症係為偏頭痛(migraine)。
6. 如申請專利範圍第1項所述之使用該胜肽用於製備該肌肉鬆弛的藥物組合物的用途，其中所述胜肽抑制乙醯膽鹼的分泌。
7. 一種使用由SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列組成之一胜肽製備用於改善一皮膚狀況的一化妝品組合物的用途。
8. 如申請專利範圍第7項所述之使用該胜肽製備用於改善該皮膚狀況的該化妝品組合物的用途，用於改善皮膚皺紋、抑制皮脂產生、或改善粉刺。
9. 如申請專利範圍第7項所述之使用該胜肽製備用於改善該皮膚狀況的該化妝品組合物，其中基於所述化妝品組合物的100重量%，包含0.001重量%至60重量%的含量的所述胜肽。
10. 如申請專利範圍第7項所述之使用該胜肽製備用於改善該皮膚狀況的該化妝品組合物的用途，其中所述胜肽係增加膠原蛋白的表現。

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