JP2022536991A

JP2022536991A - ボツリヌス神経毒素効果を調節する組成物

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Publication number: JP2022536991A
Application number: JP2021576266A
Authority: JP
Inventors: ドゥサルジャン－マルクル; セシルクロス; ニコラスフロ; ミカエルマシコアン
Original assignee: ファストックスファーマエスエー
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2022-08-22
Also published as: MX2021016106A; IL289139A; CN114269384A; WO2020254690A1; KR20220034795A; EP3753568A1; AU2020298108A1; US20230018920A1; BR112021025907A2; CA3144140A1; EP3986440A1

Abstract

本発明は、ボツリヌス神経毒素組成物の効果を調節する方法、すなわち、ボツリヌス神経毒素組成物の作用の発現を促進し、かつ／又は作用の持続時間を延長し、かつ／又は作用の強度を高める方法であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤をボツリヌス神経毒素組成物に添加することを含む方法に関する。本発明は、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤とボツリヌス神経毒素とを含む組成物、及び美容上又は治療上の状態を治療するためのその使用にも関する。【選択図】図１

Description

本特許出願は、２０１９年６月２１日出願の欧州特許出願１９１８１６３５．４号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤とボツリヌス神経毒素とを含む組成物、並びに様々な治療的及び／又は美容的目的のためのその使用に関する。さらに、組成物及びこの組成物が使用される方法は、ボツリヌス神経毒素の効果を高める、例えば、その作用の発現を加速し、及び／又はその作用の持続時間を延長し、及び／又はその作用の強度を高める結果となる有利な治療法を提供する。

ＢｏＮＴの構造
ボツリヌス神経毒素は、ニューロン伝達を阻害する毒素であり、コリン作動性ニューロンに優先的に作用する。従って、ボツリヌス神経毒素の作用の主な結果の１つは、ニューロン刺激の減少による筋弛緩である。ボツリヌス神経毒素は、嫌気性で胞子を形成する細菌であるクロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、及び、より少ない程度ではあるが、クロストリジウム・ブチリクム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・バラティ（Ｃ．ｂａｒａｔｉ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、及びクロストリジウム・アルゲンチネンス（Ｃ．ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｅ）等の他のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種によって複合体として産生される。Ａ型（ＢｏＮＴ／Ａ）、Ｂ型（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｃ型（ＢｏＮＴ／Ｃ）、Ｄ型（ＢｏＮＴ／Ｄ）、Ｅ型（ＢｏＮＴ／Ｅ）、Ｆ型（ＢｏＮＴ／Ｆ）、Ｇ型（ＢｏＮＴ／Ｇ）、及びＸ型（ＢｏＮＴ／Ｘ）として知られるボツリヌス神経毒素の８つの異なる血清型が確認された。現在、ＢｏＮＴ／Ａ型、ＢｏＮＴ／Ｂ型、ＢｏＮＴ／Ｅ型及びＢｏＮＴ／Ｆ型のサブタイプがそれぞれ８種、８種、１２種及び９種知られている。Ａ型、Ｂ型、Ｅ型及びＦ型はヒトに毒性があるのに対して、Ｃ型、Ｄ型及びＧ型は、例えばトリ、ウマ、ウシ及び霊長類に毒性を示すことが多い。Ｘ型は、１９９５年に日本で乳児ボツリヌス症の症例報告がなされた後、最近になってようやく報告された（Ｚｈａｎｇら、ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、第８巻、１４１３０（２０１７））。

ボツリヌス神経毒素複合体は、２つの成分、つまり、酵素的に活性な神経毒素成分と、ヘマグルチニン及び非ヘマグルチニンタンパク質を含めたコートタンパク質とみなすことができる関連する非毒性細菌タンパク質成分とを含む高分子量タンパク複合体の形態で存在している。ボツリヌス毒素複合体の分子量は、ボツリヌス毒素の血清型によって約３００ｋＤａから約９００ｋＤａまで変わり、非毒性細菌タンパク質成分を欠くボツリヌス神経毒素の分子量は約１５０ｋＤａである。美容的な応用又は治療的なの応用に関しては、コートタンパク質は重要な機能を持たないことが報告されており、神経毒性という特性に寄与しない。神経毒素成分は、既知のボツリヌス神経毒素のすべての血清型について分子量が約１５０ｋＤａである不活性一本鎖前駆体として発現する。この一本鎖前駆体は、タンパク質分解性の切断により活性化され、ジスルフィド結合した２本鎖のタンパク質を生成する。約５０ｋＤａの軽鎖タンパク質は、触媒ドメインを含み、亜鉛含有メタロプロテアーゼであり、亜鉛エンドペプチダーゼとして作用する。約１００ｋＤａの重鎖タンパク質は、転位ドメインと受容体結合ドメインとを含む。この重鎖は、シナプス前のコリン作動性神経終末、特に運動終末板や神経筋接合部のシナプス前部への結合と、神経毒素の細胞内への内部移行（内在化）を媒介する。

ＢｏＮＴの作用機序
ボツリヌス神経毒素の重鎖は、エフェクター組織、通常は神経筋接合部、に到達すると、シナプス前受容体（シナプス小胞２タンパク質）及び特定のガングリオシドとの二重の結合により、コリン作動性ニューロンによる優先的な取り込みを媒介する。その後、ボツリヌス神経毒素は、受容体を介したエンドサイトーシスによって神経細胞内に入ることができ、神経細胞のエンドサイトーシス小胞内に留まる。小胞が酸性化すると、軽鎖は細胞質内に移動し、分割される。軽鎖の毒性部分は、ＢｏＮＴの血清型に応じて、ＳＮＡＲＥタンパク質複合体を形成するタンパク質（すなわち、ＳＮＡＰ－２５、シンタキシン及びＶＡＭＰ）の１つ以上を切断することができる。ＳＮＡＲＥ複合体は通常、小胞と細胞膜との間の膜融合を可能にし、それによって神経伝達物質であるアセチルコリンを細胞外に放出することができる。例えば、神経伝達物質であるアセチルコリンをシナプス間隙で排出することで、神経インパルスが筋肉に伝わり、筋肉に収縮のシグナルが送られる。例えば、ＢｏＮＴ／ＡによってＳＮＡＲＥ複合体を本質的に形成するタンパク質が切断されることによりＳＮＡＲＥ複合体の形成が防がれると、神経伝達物質のエキソサイトーシスが遮断され、特にアセチルコリンの放出が停止する。その結果、神経と筋肉（又は他のエフェクター組織）との間の伝達が遮断される。特に、触媒活性を有するボツリヌス神経毒素の軽鎖は、神経細胞内に数週間残存することができるため、神経伝達を長期的かつ可逆的に阻害することができる。

ＢｏＮＴの医療利用
ボツリヌス神経毒素は、筋肉並びに交感神経系及び副交感神経系の分泌腺等の他のエフェクター組織におけるシナプス前神経終末からのアセチルコリン放出を可逆的に遮断するという天然の性質を持っていることから、ボツリヌス神経毒素は、筋肉（及び他のエフェクター組織）の過剰刺激、及びそれに伴う疼痛を制御するために、多くの分野で重要な治療の選択肢となっている。例えば、ＢｏＮＴ／Ａは、現在、運動障害の分野で、とりわけ痙縮（痙性）及びジストニアの管理に治療的に使用されており、ＢｏＮＴ／Ａはジストニア関連の疼痛を効率的に緩和することがよく知られており、また泌尿器系の障害の分野で、特に過活動膀胱に対して、分泌系の障害の分野で、すなわち多汗症や流涎症（唾液分泌不全）の分野で治療的に使用されている。さらに、ボツリヌス神経毒素は、現在、顔の線を滑らかにしたり、眉間のしわや眼窩周囲の線を軽減したりする等、様々な美容的な適応症で使用されている。

ＢｏＮＴ製剤
ボツリヌス神経毒素は、ＳＮＡＲＥ複合体のタンパク質の切断に関与する類似のメタロプロテアーゼ活性を共有しているにもかかわらず、血清型によって作用の発現（発症）及び／又は持続が異なる場合がある。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｆは２日以内にマウスの後肢に局所的な完全麻痺を引き起こすのに対し、ＢｏＮＴ／Ｅは２４時間以内に同じ効果をもたらす。それにもかかわらず、ＢｏＮＴ／Ａによる神経筋麻痺の持続時間はマウスで２８日であるのに対し、毒素Ｅ及びＦではそれぞれ５日及び８日しかない。ヒトでも、タイムスケールは異なるものの、同様のパターンが観察されている。ＢｏＮＴ－Ａによる麻痺は一般的に１週間以内に観察され、３～４ヶ月続くこともある（Ｄａｖｌｅｔｏｖら、ＴＲＥＮＤＳｉｎＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ２８（２００５）；４４６－４５２頁）。それとは逆に、ＢｏＮＴ－Ｅはヒトにおいて、より早い発現（２４時間）を示すが、持続時間ははるかに短い（１ヶ月未満）（Ｙｏｅｌｉｎら、ＰｌａｓｔＲｅｃｏｎｔｒＳｕｒｇ１４２（２０１８）；８４７ｅ－８５５ｅ頁）。

ＢｏＮＴ／Ａのユニークなプロフィール、及びヒトでの活性のため、ほとんどの注目はＢｏＮＴ／Ａに集まっている。１９９１年以降、いくつかの市販のＡ型のボツリヌス神経毒素が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。ＢｏＮＴ／Ａの利用可能な形態は、とりわけ、Ｂｏｔｏｘ（ボトックス）（登録商標）／Ｖｉｓｔａｂｅｌ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ（アラガン））、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）／Ａｚｚａｌｕｒｅ（登録商標）（ＩｐｓｅｎＢｉｏｐｈａｒｍ（イプセン・バイオファーム））、Ｘｅｏｍｉｎ（ゼオマイン）（登録商標）／Ｂｏｃｏｕｔｕｒｅ（登録商標）（ＭｅｒｚＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（メルツ・ファーマシューティカルズ））である。現在市販されている他のＢｏＮＴ血清型は、唯一、ＢｏＮＴ／ＢＭｙｏｂｌｏｃ（登録商標）／Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ（登録商標）（ＳｏｌｓｔｉｃｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ソルスティス・ニューロサイエンス））があるが、その医療／美容用途は逸話的なものではある。現在、医療のニーズにより良く応えるためには、ＢｏＮＴの特性を向上させることが重要な到達目標となっている。

ＢｏＮＴの制限特性
ＢｏＮＴの作用の発現、作用の持続時間及び作用の強度は、医薬品としてのその実用性を左右する重要な特性である。

作用の発現
美容的な適応症では、ＢｏＮＴ／Ａを注射してから２～３日後には一般にしわの減少が見られるが、完全な遮断（例：しかめっ面による線の現れの防止）には約２～３週間を要する。治療の対象からはより早い発現が求められることが多い。同様に、筋肉障害の治療等のＢｏＮＴ／Ａの治療用途では、ＢｏＮＴ作用のより早い発現は、患者にとって明らかに有益であろう。施術者の立場では、筋麻痺の発現が早ければ、患者のモニタリングが容易になる。理想的には、注射とモニタリングを同じ日に行うべきである。

作用の持続時間
効果を維持しながら注射の間隔を空けるためには、ＢｏＮＴの作用の持続時間を延ばすことが望ましい。まず、患者にとって身体的及び経済的な負担となる注射の回数を制限するためである。また、さらなるＢｏＮＴを用いた治療の有効性を低下させて、その結果、その対象にとっての美容的な又は治療的な選択肢を制限する可能性のある、ＢｏＮＴに対する中和抗体が発生するリスクを制限するためである。このようにしてＢｏＮＴを短い時間間隔で繰り返し注射することは避けられるが、その場合、ＢｏＮＴが対象に作用していない期間が発生し、患者のコンプライアンス上の問題が生じうる。

作用の強度
ＢｏＮＴの作用の強度を向上させることで、美容的な結果を改善し、障害や痛みのある状態を緩和することができる。それにもかかわらず、ＢｏＮＴの注射量を増やすと、注射部位から離れた場所でＢｏＮＴが拡散し、全身毒性を引き起こす可能性がある。ＢｏＮＴの局所的な有効性に比例して全身毒性を増加させることなく、局所的な有効性を高める方法があれば有益である。

改良の必要性
それゆえ、これらの短所を克服することを可能にする組成物が必要であり、特に、ボツリヌス神経毒素のより早い発現及び／又は作用の持続時間の延長及び／又は作用の強度の増強を示すボツリヌス神経毒素を含む組成物が必要である。

ＢｏＮＴ効果の増強
ＢｏＮＴ分子
天然に存在するＢｏＮＴには限界があるため、これらの神経毒素の効果を高めるための最初の戦略は、タンパク質自体を改変することである。現在の組換え技術は、ＢｏＮＴの配列に改変を導入することで、ＢｏＮＴの特性を最適化する可能性を提供する。主なアプローチは、異なるＢｏＮＴからの重鎖と軽鎖とを組み合わせることで、キメラ型の神経毒素を作り出すことである。過去数十年の間に行われた数多くの試みにより、ＢｏＮＴの効果を調節することが実際に可能であることが実証された。しかしながら、キメラの最適化された特性は、親ＢｏＮＴの一方の特性に近いことが多い。例えば、Ｗａｎｇら（ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００８年６月２０日；２８３（２５）：１６９９３－７００２）は、ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｅから作製されるキメラ神経毒素を記載している。注目すべきは、ＡＥキメラ（ＢｏＮＴ／Ａからの軽鎖とＢｏＮＴ／Ｅからの重鎖とを含む）は、作用の強度がわずかに増強され、作用の持続時間がわずかに延長されるが、ＢｏＮＴ／Ａと同様の挙動を示したことである。逆に、ＥＡキメラ（ＢｏＮＴ／Ｅからの軽鎖とＢｏＮＴ／Ａからの重鎖とを含む）は、ＢｏＮＴ／Ｅと似たような挙動を示す。

さらに、神経毒素の標的となりうる組織の範囲を広げるために、ＢｏＮＴ／ＡをＢｏＮＴ／Ｂと組み合わせることを目的とする別のアプローチもある。最近の論文（Ｗａｎｇら、ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２０１２年５月１５日；４４４（１）：５９－６７）及び国際出願（国際公開第２０１７／１９１３１５Ａ１号パンフレット）は、そのようなキメラを記載する。

結論として、これまでのＢｏＮＴタンパク質の分子工学的な試みでは、ＢｏＮＴの特性をわずかにしか調節できないことが判明した。そのため、別のアプローチが模索されている。

ＢｏＮＴの送達
ＢｏＮＴが効果を発揮するためには、ＢｏＮＴは、まず標的細胞、つまりコリン作動性ニューロンに到達しなければならない。そのため、ＢｏＮＴが標的組織に広がるのに要する時間を短縮したり、投与後にシナプスレベルに存在するＢｏＮＴの持続時間及び量を増大させたりすることが、ＢｏＮＴの効果を調節するための興味深い戦略として現れてくる。このようなアプローチは、ＲｅｖａｎｃｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（レバンス・セラピューティクス）によって検討されており、同社は、細胞浸透性ペプチドファミリーに関連するペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａの製剤を開発した。いくつかの特許及び特許出願がこの製剤を記載している（すなわち国際公開第２００２／０７７７３号パンフレット又は国際公開第２００５／１２０５４６号パンフレット）。驚くべきことに、動物モデルでの実験によると、この製剤はＢｏＮＴ／Ａの拡散を制限し、安定性を高めているようである（Ｓｔｏｎｅら、Ｔｏｘｉｃｏｎ．２０１１年８月；５８（２）：１５９－６７）。

臨床試験では、ペプチドを伴わない（非製剤）ＢｏＮＴ／Ａと比較することで、この製剤の有効性の向上を実証することを目的とした。しかしながら、研究者らは、非製剤のＢｏＮＴ／Ａよりも高用量の製剤を使用した（Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、ＤｅｒｍａｔｏｌＳｕｒｇ．２０１７年１１月；４３（１１）：１３２１－１３３１）。このため、その製剤で観察された作用の持続時間の延長は、投与量の増加のみに起因する可能性がある。

最後に、最近のレビュー（Ｈａｌｌｅｔｔ，Ｍ．、Ｔｏｘｉｃｏｎ．２０１５年１２月１日；１０７（００）：６４－６７）は、ＢｏＮＴの取り込みに対する拡散の影響が低いことを強調している。最新の観察結果によると、標的組織へのＢｏＮＴの送達は、（注入の後は）ほとんどが対流によって駆動される。

結論として、ＢｏＮＴの効果を高めるために、ＢｏＮＴの送達を調節する戦略は、限られた可能性しかない可能性がある。従って、この目標を達成するためには、別のアプローチが依然として必要である。

ＢｏＮＴの生物学
ＢｏＮＴの効果を高めるための別の戦略は、ニューロンへのＢｏＮＴの侵入、ニューロンのサイトゾルへの軽鎖の移動（転位置）等、ＢｏＮＴの作用機序と相互作用する他の分子を使用することかもしれない。

異なるＢｏＮＴにもいくつかの共通の作用機序があるため、少なくとも相加的な効果を得るために、例えばＢｏＮＴ／Ｅのより早い作用の発現をＢｏＮＴ／Ａの長い作用の持続時間と組み合わせる等、異なる特徴を持つＢｏＮＴサブタイプを組み合わせてみることは魅力的であった。特に、前臨床実験（Ｍｅｕｎｉｅｒら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２２（２００３）；４５４－４６６頁）は、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ｅの混注（同時注入）により、ｉ）短い作用発現（ＢｏＮＴ／Ｅ単独と同様）、及びｉｉ）低い作用の持続時間（ＢｏＮＴ／Ｅ単独と同様）が誘導されることを示した。同様の結果は、ヒトの足の短指伸筋（ＥＤＢ）にＢｏＮＴ注射が実施されて、ヒトにおいても得られた。驚くべきことに、ＢｏＮＴ／ＡとＢｏＮＴ／Ｅを二重に注入したＥＤＢ筋は、ＢｏＮＴ／Ｅを注入した筋肉と同様の時間経過で機能を回復した（Ｅｌｅｏｐｒａら、ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ２５６（１９９８）；１３５－１３８頁）。これらの結果はすべて、２種のＢｏＮＴを組み合わせても、独立に投与したそれぞれのＢｏＮＴの効果の単なる加算から期待されるような効果は得られないことを示す。現在では、ある種のＢｏＮＴが他のＢｏＮＴに比べて優勢な効果を持つことが理解されており、そのために相加性のあるＢｏＮＴの組み合わせを使用することができない。それゆえ、現在広く使用されているＢｏＮＴ／Ａの薬理学的プロファイルを改善するためには、ＢｏＮＴの混合物は治療の候補とはならない可能性が高い。

ＢｏＮＴの作用機序と相互作用する他の候補は、ＢｏＮＴと同じシナプス前領域を標的とする神経毒素である。このような毒素は、ヘビやクモの神経毒素のように動物界に存在し、運動軸索末端を可逆的に麻痺させ、ＢｏＮＴで観察された結果と同様の結果をもたらすことができる。しかしながら、その大きさ及び作用機序は全く異なり、神経筋接合部の遮断の発現時期及び持続時間が全く異なる。一般に、ＢｏＮＴとは異なり、これらのシナプス前神経毒素は、運動軸索末端の急性かつ迅速な変性を引き起こし、その後、急速に回復する。ここでも、このようなシナプス前神経毒素とＢｏＮＴとの組み合わせの治療上の可能性を想像してみることは魅力的である。意外なことに、ＢｏＮＴ／Ａ又はＢｏＮＴ／Ｂであらかじめ麻痺させた筋肉に、シナプス前神経毒素を注射すると、そのシナプス前神経毒素は、神経伝達の回復を促進する（Ｄｕｒｅｇｏｔｔｉら、Ｔｏｘｉｎｓ７（２０１５）、５３２２－５３３６頁）。

ＢｏＮＴの作用機序と相互作用する他の候補としては、シナプス前ニューロンの活動（活性）を調節する分子が考えられる。注目すべきことに、Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら（ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ．２００９年１１月；３３１（２）：３６１－７１）は、ＴＲＰＶ１チャネルの活性化が、シナプス前ニューロンへのＢｏＮＴの侵入を阻害し、これによりＢｏＮＴの筋弛緩作用を妨げるようであると報告した。ＴＲＰＶ１はシナプス前ニューロンによって発現されるカルシウムチャネルであるが、ＴＲＰＶ１は、この研究では、カプサイシンの使用によって活性化された。明らかにされた原理は興味深いが、観察された効果はＢｏＮＴ効果の阻害のみであり、ＢｏＮＴの作用を増強する分子は記載されていない。

総合すると、これらの結果は、ＢｏＮＴとシナプス前活性分子との組み合わせによる治療上の可能性は非常に限られていることを示す。

興味深いことに、ＢｏＮＴの効果を増強するために、ＢｏＮＴをシナプス後のレベルで作用する分子と組み合わせて使用したという報告はこれまでにない。

国際公開第２０１７／１９１３１５Ａ１号パンフレット国際公開第２００２／０７７７３号パンフレット国際公開第２００５／１２０５４６号パンフレット

Ｚｈａｎｇら、ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、第８巻、１４１３０（２０１７）Ｄａｖｌｅｔｏｖら、ＴＲＥＮＤＳｉｎＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ２８（２００５）；４４６－４５２頁Ｙｏｅｌｉｎら、ＰｌａｓｔＲｅｃｏｎｔｒＳｕｒｇ１４２（２０１８）；８４７ｅ－８５５ｅ頁Ｗａｎｇら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００８年６月２０日；２８３（２５）：１６９９３－７００２Ｗａｎｇら、ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２０１２年５月１５日；４４４（１）：５９－６７Ｓｔｏｎｅら、Ｔｏｘｉｃｏｎ．２０１１年８月；５８（２）：１５９－６７Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、ＤｅｒｍａｔｏｌＳｕｒｇ．２０１７年１１月；４３（１１）：１３２１－１３３１Ｈａｌｌｅｔｔ，Ｍ．、Ｔｏｘｉｃｏｎ．２０１５年１２月１日；１０７（００）：６４－６７Ｍｅｕｎｉｅｒら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２２（２００３）；４５４－４６６頁Ｅｌｅｏｐｒａら、ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ２５６（１９９８）；１３５－１３８頁Ｄｕｒｅｇｏｔｔｉら、Ｔｏｘｉｎｓ７（２０１５）、５３２２－５３３６頁Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ．２００９年１１月；３３１（２）：３６１－７１

本発明者らはこのたび、ＢｏＮＴを、ｉ）骨格筋、ｉｉ）平滑筋、ｉｉｉ）心筋、ｉｖ）分泌腺を標的としたニューロン伝達のシナプス後阻害剤（後シナプス型ニューロン伝達阻害剤、ＰｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＮｅｕｒｏｎａｌＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ、ＰｏＮＴ）と組み合わせることにより、ＢｏＮＴ効果を高める方法を特定した。

その結果、本発明は、ボツリヌス神経毒素組成物の効果を高める方法であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤をボツリヌス神経毒素組成物に添加することを含む方法に関する。

ボツリヌス神経毒素組成物の効果は、ボツリヌス神経毒素の作用の発現（作用の開始）を促進すること、及び／又は作用の持続時間を延長すること、及び／又は作用の強度を高めることによって高めることができる。

別の態様では、本発明は、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）と、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）とを含む組成物を提供する。

本発明の組成物で用いられるＰｏＮＴは、筋肉又は分泌腺等のエフェクター組織によって発現されるシナプス後受容体に特異的に結合するシナプス後低分子及び／又はシナプス後ペプチドである。

本発明の組成物で用いられるボツリヌス神経毒素は、Ａ型、Ｂ型、Ｅ型のボツリヌス神経毒素、又はＡ型、Ｂ型、Ｅ型のボツリヌス神経毒素の重鎖及び軽鎖の組み合わせである。

骨格筋細胞によって発現されるシナプス後受容体は、（α１）_２β１δε ｎＡＣｈｒ、（α１）_２β１δγ ｎＡＣｈｒ、ＲｙＲ１、ＣａＶ１．１及びＮａｖ１．４を含むか又はそれらからなる群から選択される。

平滑筋細胞によって発現されるシナプス後受容体は、Ｍ３ｍＡＣｈｒ、ＲｙＲ２、ＣａＶ１．２及びＮａｖ１．５を含むか又はそれらからなる群から選択される。

心筋細胞によって発現されるシナプス後受容体は、Ｍ２ｍＡＣｈｒ、ＲｙＲ２、ＣａＶ１．１、ＣａＶ１．２及びＮａｖ１．５を含むか又はそれらからなる群から選択される。

分泌腺細胞によって発現されるシナプス後受容体は、Ｍ１ｍＡＣｈＲ、Ｍ３ｍＡＣｈＲ、α_１アドレナリン受容体及びβ１アドレナリン受容体を含むか又はそれらからなる群から選択される。

本発明の組成物は、ＰｏＮＴの迅速な作用の発現をＢｏＮＴの延長された作用の持続時間と組み合わせるだけでなく、ＰｏＮＴがＢｏＮＴの作用の発現、作用の持続時間、及び作用の強度を相乗的に増強する。

すべての実施形態において、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、ボツリヌス神経毒素の遅発性（遅い発現）と適合する。

特定の実施形態では、上記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、速発性シナプス後ペプチド及び／又は速発性シナプス後低分子である。

本発明の組成物はさらに、例えば、しわ、眉間の線等の線、又は溝、美容目的のための筋肉のボリューム（咬筋若しくはふくらはぎ等）、肥厚性瘢痕、及び他の皮膚科学的状態（皮膚の状態）を軽減する等の美容的治療に使用することができる。

本発明の組成物はさらに、例えば、（ｉ）運動障害、ジストニア、頸部ジストニア、痙性斜頸、局所性ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、眼瞼障害、斜視、痙縮、脳性麻痺、限局性痙縮、四肢痙縮、攣縮、片側顔面攣縮、振戦、チック、歯ぎしり（ブラキシズム）、失行症及びすくみ足を含む骨格筋障害、並びに（ｉｉ）これらの障害に伴う疼痛の治療等、治療的処置に使用することができる。

本発明の組成物はさらに、（ｉ）痙攣性発声障害、喉頭性ジストニア、顎口腔性発声障害、舌性ジストニア及び他の音声障害、アカラシア、嚥下障害、食道障害（ｅｓｏｐｈａｇｉａ）、胃不全麻痺、痙攣性結腸炎、神経因性膀胱、過活動膀胱、間質性膀胱炎、良性前立腺肥大症、排尿障害、便失禁、便秘、アニスムス（ａｎｉｓｍｕｓ）、裂肛、子宮痛（月経困難症、性交疼痛症）、膣痛（膣痙、外陰部痛）、骨盤痛、坐骨海綿体筋（持続勃起症）、他の筋緊張障害並びに筋肉群の不随意運動を特徴とする他の障害を含む平滑筋障害、並びに（ｉｉ）これらの障害に伴う疼痛の治療に使用することができる。

本発明の組成物はさらに、心房細動を含む心臓障害の治療に使用することができる。

本発明の組成物はさらに、流涙、多汗症（手、足及び脇の下）、流涎症、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸分泌、皮脂腺の過剰な産生（及びざ瘡等の関連状態）、並びに分泌障害を含む分泌腺障害の治療に使用することができる。

すべての実施形態において、ＰｏＮＴ及びＢｏＮＴは、組み合わせて投与されなければならず、すなわち、同時に、又はシナプスレベルでのそれらの同時有効な存在を可能にするタイムスケジュール内で投与されなければならない。言い換えれば、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）及びボツリヌス神経毒素は、同時に、別々に、又は時間をずらして投与されてもよいが、ただし、ＰｏＮＴ活性の減衰が起こる前にボツリヌス神経毒素が投与され、任意にＰｏＮＴ活性の発現後にボツリヌス神経毒素が投与される。

最後に、本発明は、本発明の方法を実施するキットであって、針及び対応する注射器と、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤と、ボツリヌス神経毒素とを含むキットに関する。

本発明及びその好ましい実施形態は、以下にさらに詳細に説明される。

ＤＡＳアッセイ：５匹のラットのグループに、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、又は５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと０．４～４０μｇ／ｋｇの範囲で増量したμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃペプチドとを組み合わせたものを右前脛骨筋に注射し、最大１０日間、指外転スコア（ＤｉｇｉｔＡｂｄｕｃｔｉｏｎＳｃｏｒｅｓ、ＤＡＳ）を評価した。各時間点での各群のＤＡＳの平均値と平均値の標準誤差が示されている。対照として生理食塩水を左前脛骨筋に注射したラットは、試験期間全体にわたってＤＡＳが０であったため、データはグラフに示されていない。ＤＡＳアッセイ：５匹のラットのグループに、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、８０μｇ／ｋｇのμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃ、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと８０μｇ／ｋｇのμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃを組み合わせたものを右前脛骨筋に注射し、最大１２日間、ＤＡＳを評価した。その後、最初の２つの条件（５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、８０μｇ／ｋｇのμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃ）のデータを加算し、プロットした（「加算」）。対照として生理食塩水を左前脛骨筋に注射したラットは、試験期間全体にわたってＤＡＳが０であったため、データはグラフに示されていない。ＤＡＳアッセイ：１匹のラットのグループに、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと５７μｇ／ｋｇのパンクロニウムを組み合わせたもの、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと８μｇ／ｋｇのα－コノトキシンＭＩペプチドを組み合わせたもの、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと１７μｇ／ｋｇのα－ブンガロトキシンペプチドを組み合わせたものを右前脛骨筋に注射し、最大１２日間、ＤＡＳを評価した。対照として生理食塩水を左前脛骨筋に注射したラットは、試験期間全体にわたってＤＡＳが０であったため、データはグラフに示されていない。ＤＡＳアッセイ：１匹のラットのグループに、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと１．６μｇ／ｋｇのダントロレンとを組み合わせたもの、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと３６μｇ／ｋｇの殺虫毒素ＬａＩＴ１を組み合わせたものを右前脛骨筋に注射し、最大１２日間、ＤＡＳを評価した。対照として生理食塩水を左前脛骨筋に注射したラットは、試験期間全体にわたってＤＡＳが０であったため、データはグラフに示されていない。５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと２５μｇ／ｋｇの野生型μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃペプチド（配列番号５４）又は２５μｇ／ｋｇの変異型μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃペプチド（配列番号９５）のいずれかとの組み合わせの相乗効果を、効果の初期、中期及び後期における曲線下面積（ＡＵＣ）の計算を用いて分析した。ＤＡＳアッセイ：５匹のラットのグループに、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと８３μｇ／ｋｇのアムロジピンを組み合わせたもの、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと８３μｇ／ｋｇのジルチアゼム及び８３μｇ／ｋｇのベラパミルを組み合わせたものを右前脛骨筋に注射し、最大１４日間、ＤＡＳを評価した。対照として生理食塩水を左前脛骨筋に注射したラットは、試験期間全体にわたってＤＡＳが０であったため、データはグラフに示されていない。５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと、ＮＡＣｈＲ受容体を特異的に阻害する低分子（５６．９μｇ／ｋｇのパンクロニウム及び８３μｇ／ｋｇのスキサメトニウム）、ＲＹＲ１受容体を特異的に阻害する低分子（１４μｇ／ｋｇのダントロレン）、又はＣａＶ１．１受容体を特異的に阻害する低分子（８３μｇ／ｋｇのアムロジピン、８３μｇ／ｋｇのジルチアゼム及び８３μｇ／ｋｇのベラパミル）との組み合わせの相乗効果を、曲線下面積（ＡＵＣ）の合計値の計算を用いて解析した。５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと、ＮＡＣｈＲ受容体を特異的に阻害するペプチド（１６．８μｇ／ｋｇのα－ブンガロトキシン、０．８μｇ／ｋｇのα－コノトキシンＭＩ、１９７．９μｇ／ｋｇのワグレリン（ｗａｇｌｅｒｉｎ）－１、３０．９μｇ／ｋｇのαＣ－コノトキシンＰｒＸＡ）、ＲＹＲ１受容体を特異的に阻害するペプチド（３６μｇ／ｋｇのＬａＩＴ１毒素、３２．８μｇ／ｋｇのインペラカルシン（ｉｍｐｅｒａｃａｌｃｉｎ））、ＣａＶ１．１受容体を特異的に阻害するペプチド（２．２μｇ／ｋｇのＵ７－クテニトキシン（ｃｔｅｎｉｔｏｘｉｎ）Ｐｎ１ｂ、２４．８μｇ／ｋｇのω－コノトキシンＴｘＶＩＩ、ａ、１００．６μｇ／ｋｇのＵ６－クテニトキシンＰｎ１ａ、３３．８μｇ／ｋｇのＵ９－クテニトキシンＰｎ１ａ、３９．８μｇ／ｋｇのκ－クテニトキシンＰｎ１及び１２．８μｇ／ｋｇのグラコントリファン（ｇｌａｃｏｎｔｒｙｐｈａｎ）Ｍ）又はＮａｖ１．４受容体を特異的に阻害するペプチド（３２６μｇ／ｋｇのμ－コノトキシンＣｎＩＩＩＣ、２３μｇ／ｋｇのμ－コノトキシンＧＩＩＩｂ、３６．４μｇ／ｋｇのμ－トミトキシン（ｔｈｏｍｉｔｏｘｉｎ）Ｈｍｅ１ａ、３２．５μｇ／ｋｇのμ－コノトキシンＧｖＩＩＪ、２８６．６μｇ／ｋｇのμ－Ｏ－コノトキシンＭｆＶＩＡ、及び３９．８μｇ／ｋｇのμ－トミトキシンＨｍｅ１ｂ）との組み合わせの相乗効果を、曲線下面積（ＡＵＣ）の合計値の計算を用いて解析した。

神経系は、別の細胞との接合部に到達するまで神経の長さに沿って移動する電気インパルス（電気的刺激）によって信号を送る。シナプスとも呼ばれる神経接合部は、２つの神経細胞（ニューロン）の間、又はニューロンと分泌腺細胞又は筋肉細胞（エフェクター）との間で電気的な神経インパルスが伝達される部位である。ニューロン伝達は、シナプス前細胞が神経伝達物質を含むシナプス小胞をシナプス空間に放出し、シナプス後細胞によって発現されるシナプス後受容体がその小胞の内容物を取り込むことを含意する。

組成物
第１の態様では、本発明は、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）と、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）とを含む組成物に関する。

「少なくとも１種」は、単一のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、又は２種、３種、４種、５種又はそれより多いコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤の組み合わせ（すなわち混合物）を意図している。

「コリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）」は、シナプス後細胞の受容体に結合し、コリン作動性ニューロン伝達に干渉することができる化合物を意味する。シナプス後細胞の表面に存在する神経伝達物質の標的受容体、イオンチャネル又は電位依存性受容体に結合することにより、コリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、神経伝達物質（すなわちアセチルコリン）放出の効果を調節することができる。

本発明の目的のために、コリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、シナプス後ペプチドと呼ばれるペプチド性の阻害剤と、シナプス後低分子と呼ばれる非ペプチド性の阻害剤という２つの主なグループに分けることができる。

従って、本発明の組成物では、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、シナプス後ペプチド及び／又はシナプス後低分子である。

シナプス後ペプチド
「シナプス後ペプチド」は、シナプス後のレベル（典型的にはシナプス後細胞の膜）に存在する細胞表面受容体に特異的な親和性を持つ生物学的に活性なペプチドを意味する。本発明の組成物で用いられるシナプス後ペプチドは、クモ、ヘビ、サソリ、イソギンチャク、海産巻貝（ルリガイ類）及び他の動物の毒から単離された天然の神経毒素、又はその機能的な断片／変異体であってもよいし、化学合成によって得られた合成ペプチド又はそれらの誘導体であってもよい。シナプス後ペプチドの「断片又は変異体」は、親ペプチドと同様の生物学的活性を保持するシナプス後ペプチドの任意の部分配列を意味する。つまり、シナプス後ペプチドの機能的な断片／変異体は、その断片又は変異体の元となった未変性の（ネイティブな）シナプス後ペプチドが結合し遮断するものと同一のエフェクター組織又は同じファミリーに属するエフェクター組織に関与する細胞が発現するシナプス後受容体に特異的に結合し遮断することができる。シナプス後ペプチドの変異体は、標的受容体への結合活性及び遮断活性が保持されていれば、未変性のシナプス後ペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有していてもよい。シナプス後ペプチドの機能的断片は、未変性のシナプス後ペプチドの結合活性及び遮断活性を保持する可能な限り短いペプチド配列を包含する。

「シナプス後ペプチドの誘導体」は、未変性の対照物と比較して任意の修飾されたシナプス後ペプチドを意味する。全体的なシナプス後ペプチドの安定性又はその生物学的機能を向上させることができるすべての末端修飾（すなわち、アミド化（Ｃ末端）、アシル化（Ｎ末端））及び内部修飾（例えば、ロイシン又はチロシンをベースにしたモチーフ）が考慮されるべきである。より一般的には、修飾は、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、脂質化、ＰＥＧ化を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

本発明の組成物で用いられるシナプス後ペプチドのバイオアベイラビリティーを向上させるために、本発明の組成物で用いられるシナプス後ペプチドは、１つ以上のカチオン性修飾を含んでいてもよい。

本発明の組成物で用いられるシナプス後ペプチドは、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、及びアミノ酸欠失から選択される少なくとも１種のアミノ酸修飾を含んでいてもよい。

アミノ酸置換では、シナプス後ペプチドの配列の一部を構成するアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基で置き換えられる。置き換えアミノ酸残基は、当該技術分野で周知の２０種類の標準アミノ酸のうちの１つであってもよい。置換は、荷電を帯びているアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、及びリジン）、電荷を帯びていない、極性のアミノ酸（アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、トリプトファン）又は電荷を帯びていない、疎水性のアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、及びグリシン）と考えられるアミノ酸の間で起こってもよい。

あるいは、アミノ酸置換における置き換えアミノ酸は、非標準アミノ酸（上述の２０の標準セットに含まれないアミノ酸）であってもよい。例として、置き換えアミノ酸は、塩基性の非標準アミノ酸、例えば、Ｌ－オルニチン、Ｌ－２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、リジン、アルギニン及びオルニチンのＤ－異性体、４－ヒドロキシプロリン、６－Ｎ－メチルリジン、２－アミノイソ酪酸、イソバリン並びにα－メチルセリンであってもよい。非標準アミノ酸をペプチドに導入する方法は当該技術分野で公知である。限られた数の非保存的なアミノ酸、遺伝コードによってコードされていないアミノ酸、及び非天然のアミノ酸がシナプス後のペプチドのアミノ酸残基に代わって置換してもよい。

アミノ酸挿入では、追加のアミノ酸残基（通常は存在しないアミノ酸残基）がシナプス後ペプチドのアミノ酸配列に組み込まれ、従って、その配列のアミノ酸残基の総数が増加する。

アミノ酸欠失では、シナプス後ペプチドのアミノ酸配列からアミノ酸残基が除去され、従って、その配列中のアミノ酸残基の総数が減少する。

アミノ酸残基の置換、挿入又は欠失によってタンパク質を修飾する方法は、当該技術分野で公知である。

シナプス後ペプチドは、そのサイズに応じて、１～１０個のアミノ酸修飾（例えば、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、又は４個、３個、２個若しくは１個のアミノ酸修飾）を含む。

本発明のシナプス後ペプチドは、天然に存在しないアミノ酸残基を含むこともできる。天然に存在しないアミノ酸としては、ｔｒａｎｓ－３－メチルプロリン、２，４－メタノプロリン、ｃｉｓ－４－ヒドロキシプロリン、ｔｒａｎｓ－４－ヒドロキシ－プロリン、Ｎ－メチルグリシン、アロトレオニン、メチル－トレオニン、ヒドロキシ－エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ－システイン、ニトロ－グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ－ロイシン、ノルバリン、２－アザフェニルアラニン、３－アザフェニル－アラニン、４－アザフェニル－アラニン、及び４－フルオロフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むために、いくつかの方法が当該技術分野で公知である。

天然由来のシナプス後ペプチドは、数十種類の神経毒素の混合物であることが多いため、目的とする結合活性を有するシナプス後ペプチドを単離するには、従来のあらゆる精製プロセスが有用であると思われる。

あるいは、高度に精製されたシナプス後ペプチドが必要な場合には、合成的に製造されたシナプス後ペプチドを使用して、高純度レベルを得てもよい。

すべての実施形態において、本発明の組成物で用いられるシナプス後ペプチドは、約１１０以下のアミノ酸、好ましくは７０以下のアミノ酸、好ましくは５０以下のアミノ酸、好ましくは３５以下のアミノ酸、より好ましくは２５以下のアミノ酸を含むペプチド鎖である。シナプス後ペプチドは、断片でない限り、いかなる場合も７アミノ酸長未満であってはならない。

シナプス後ペプチドの断片を本発明の組成物で用いる場合、それは３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長であることができる。

より好ましい実施形態によれば、本発明の組成物で用いられるシナプス後ペプチドのサイズは、約８０～１０５アミノ酸、好ましくは約５０～８０アミノ酸、好ましくは約４０～６０アミノ酸、より好ましくは約１５～３５アミノ酸の範囲である。

より好ましい実施形態によれば、本発明の組成物で用いられるシナプス後ペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド架橋を含む。

低分子
「シナプス後低分子」は、シナプス後のレベル（典型的にはシナプス後細胞の膜）に存在する細胞表面受容体に特異的な親和性を持つ生物学的に活性な非ペプチド性の化学分子を意味する。シナプス後低分子は、ペプチド結合を持たない点でシナプス後ペプチドとは異なり、その分子量は一般的に１３００ｇ／ｍｏｌ（モル）よりも小さい。好ましくは、本発明の組成物で用いられるシナプス後低分子の分子量は、約８０～１２００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは約１５０～８００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは約３００～６００ｇ／ｍｏｌである。これらの低分子は、自然界（典型的には植物）から抽出されたものであってもよいし、合成されたものであってもよい。低分子は一般にファミリーや関連化合物に分類することができるが、このような分類は必要に応じて本文で詳述される。ファミリー内の低分子の多様体が考慮されることが理解される。

ＢｏＮＴ
「ボツリヌス神経毒素」（ＢｏＮＴ）は、天然に存在するＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型及びＸ型として知られる８種の異なる血清型のボツリヌス神経毒素、並びに修飾型、組換え型、ハイブリッド型、及びキメラ型のボツリヌス神経毒素を意味する。ボツリヌス神経毒素及びボツリヌス毒素の表現は等価であり、互換的に使用することができる。本明細書で用いられる用語「ボツリヌス毒素複合体」又は「毒素複合体」は、（ボツリヌス毒素血清型Ａ～Ｇ、Ｘのいずれかに属する）約１５０ｋＤのボツリヌス毒素タンパク質分子を、潜在的に、関連する内因性の非毒素タンパク質（すなわち、クロストリジウム・ボツリヌム菌によって産生されるヘマグルチニンタンパク質及び非毒素非ヘマグルチニンタンパク質）とともに指している。ただし、ボツリヌス毒素複合体は、１つの単位の毒素複合体としてクロストリジウム・ボツリヌム菌に由来する必要はないことに留意されたい。例えば、ボツリヌス毒素又は修飾ボツリヌス毒素をまず組換え調製し、その後、非毒素タンパク質と組み合わせてもよい。組換えボツリヌス毒素を購入し（例えば、カリフォルニア州キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）のＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（リスト・バイオロジカル・ラボラトリーズ）から）、その後、非毒素タンパク質と組み合わせることもできる。

１つ以上のアミノ酸置換を導入するボツリヌス毒素のコード配列における変異は、改変されたＢｏＮＴと呼ばれる。「改変されたボツリヌス神経毒素」は、ボツリヌス毒素活性を有するが、天然のボツリヌス毒素や組換え未変性のボツリヌス毒素と比較して、いずれかの部分やアミノ酸鎖に１つ以上の化学的又は機能的変化を含む化合物を意味する。例えば、ボツリヌス毒素は、未変性の形態と比較して、少なくとも１つのアミノ酸が欠失、修飾、又は置換された神経毒素である改変された神経毒素であってもよい。例えば、ボツリヌス毒素は、例えばその特性を強化したり、望ましくない副作用を減少させたりする方法で改変されているが、所望のボツリヌス毒素活性を依然として保持しているものであってもよい。また、ボツリヌス毒素は、必要なボツリヌス毒素活性を有することが示されている分子全体の一部であってもよく、そのような場合には、それ自体が使用されてもよいし、例えば、融合タンパク質の組み合わせ又は結合分子の一部として使用されてもよい。その場合、ボツリヌス神経毒素の一部又は断片は、例えば、その毒素の５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）であってもよい。あるいは、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素前駆体の形態であってもよく、この前駆体自体は非毒性であってもよく、例えば、タンパク質分解性の切断時に毒性となる非毒性の亜鉛プロテアーゼであってもよい。

「ハイブリッド及びキメラ」のＢｏＮＴは、異なる血清型又は異なるサブタイプのＢｏＮＴの重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインの混合を指す。ＢｏＮＴの血清型及びサブタイプ内のハイブリッド及びキメラは、ＢｏＮＴ／ＦＡ及びＢｏＮＴ／ＣＤ等の天然のものであってもよいし、ＢｏＮＴの組換え変異体であってもよい。組換えボツリヌス神経毒素は、その軽鎖及び／又は重鎖が、非クロストリジウム種によって組換え的に作られたものであることができる。

好ましい実施形態によれば、本発明の組成物で用いられるボツリヌス神経毒素は、Ａ型、Ｂ型、Ｅ型のもの、又はＡ型、Ｂ型、Ｅ型ボツリヌス神経毒素の重鎖及び軽鎖の組み合わせである。

より好ましい実施形態によれば、本発明の組成物で用いられるボツリヌス神経毒素はＡ型である。

様々なエフェクター組織
すべての実施形態において、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤の選択は、シナプスのタイプに依存し、より詳細には、このシナプスに関与するシナプス後細胞に依存する。

筋肉
運動ニューロンと筋細胞の間のシナプス結合は、神経筋接合部（ＮＭＪ）と呼ばれる。ＮＭＪでは、シナプス後細胞は骨格筋細胞、平滑筋細胞、又は心筋細胞であることができる。

骨格筋細胞
１つの実施形態では、シナプス後細胞が骨格筋細胞である場合、本発明に係る組成物で用いられる少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、骨格筋細胞によって発現される少なくとも１種の受容体に結合し、この受容体は、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）、より好ましくは（α１）_２β１δε又は（α１）_２β１δγ ｎＡＣｈＲ、リアノジン受容体１型（ＲＹＲ１）、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルＣａＶ１．１、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルＣａＶ１．１、及び電位依存性ナトリウムチャネルＮａｖ１．４を含むか又はそれらからなる群から選択される。

本発明に係る組成物の成分として、２種以上のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）が用いられる場合、骨格細胞によって発現され、これらのＰｏＮＴが標的とする受容体は、同じ受容体ファミリーに属してもよいし、複数の異なる受容体ファミリーに属してもよい。

低分子（骨格筋）
この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、骨格筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体に応じて、表１に示すように選択される。

ニコチン性アセチルコリン受容体は、リガンド依存性のカチオンチャネルの１つであり、高速なシナプス伝達を媒介する。哺乳動物には、９種のαサブユニット（α１～７、α９及びα１０）、４種のβサブユニット（β１～４）、並びにγ、δ、及びεのサブユニットの１６種のｎＡＣｈＲサブユニットが存在する。これらのサブユニットのうち５つが結合して、神経筋接合部に存在する筋肉ｎＡＣｈＲサブタイプ（α１β１γδ及びα１β１δε）を形成する。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤が、（α１）_２β１δε又は（α１）_２β１δγ ｎＡＣｈＲに結合するシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、ラパクロニウム、ミバクリウム、アトラクリウム、ドキサクリウム、シサトラクリウム、ベクロニウム、ロクロニウム、パンクロニウム、Ｄ－ツボクラリン、ピペクロニウム、スキサメトニウム、デカメトニウム、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

当該技術分野で公知である（α１）_２β１δε又は（α１）_２β１δγ ｎＡＣｈＲに結合する他の任意の低分子が、本発明の組成物における１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤として使用されてもよい。

より好ましい実施形態では、骨格筋細胞によって発現される標的受容体が（α１）_２β１δε又は（α１）_２β１δγ ｎＡＣｈＲである場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はパンクロニウムである。

リアノジン受容体アイソフォーム－１（ＲｙＲ１）は、興奮－収縮結合に重要な骨格筋の主要なカルシウムチャネルである。それは、筋小胞体（ＳＲ）に存在する６回膜貫通型のホモ四量体タンパク質であり、ＳＲからＣａ^２＋を放出して骨格筋の収縮をもたらす機能を持つ。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がＲｙＲ１に結合するシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、ダントロレン、アズモレン、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

より好ましい実施形態では、骨格筋細胞によって発現される標的受容体がＲｙＲ１である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はダントロレンである。

電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルＣａＶ１．１は、筋肉の横行小管に見出されるチャネルである。骨格筋では、それは、機械的な結合を介して筋小胞体のリアノジン受容体ＲｙＲ１と結合する。骨格筋の膜が脱分極すると、Ｃａｖ１．１は構造変化を起こしてＲｙＲ１をアロステリックに活性化する。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤が、ＣａＶ１．１に結合するシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、ジヒドロピリジン、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エホニジピン、エルゴジピン、フェロジピン、フロルジピン、イガニジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、レブアムロジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、リオジピン、ベラパミル、ガロパミル、ジメジチアプラミン、ジルチアゼム、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

より好ましい実施形態では、骨格筋細胞によって発現される標的受容体がＣａＶ１．１である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はベラパミルである。

シナプス後ペプチド（骨格筋）
この実施形態では、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤がシナプス後ペプチドである場合、そのコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、骨格筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体に応じて、表２に示すように選択される。

ｎＡＣｈＲ（α１β１γδ及びα１β１δε）に結合できるシナプス後ペプチドであって、本発明の組成物に適したものは、アゼミオプシン（配列番号１）、ワグレリン－１（配列番号２若しくは配列番号３）、ＳＹＮ（登録商標）－ＡＫＥ（Ｈ－ｂＡｌａ－Ｐｒｏ－Ｄａｂ－ＮＨＢｎ．２ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ）、α－ブンガロトキシン（配列番号４）、αＣ－コノトキシンＰｒＸＡ（配列番号５）、α－コブラトキシン（配列番号６）、α－コノトキシンＭＩ（配列番号７若しくは配列番号８）、α－コノトキシンＧＩ（配列番号７若しくは配列番号９）、ψ－コノトキシン－ＰｒＩＩＩＥ（配列番号１０）、カンドキシン（配列番号１１若しくは配列番号１２）及びハジトキシン（配列番号１３若しくは配列番号１４）、若しくはそれらの誘導体を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

ワグレリン－１のコンセンサス配列（配列番号２）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ２４３３５、Ｐ５８９３０、Ｐ２４３３５、Ｐ５８９３０。

好ましい実施形態では、ワグレリン－１が本発明の組成物で用いられる場合、ワグレリン－１は配列番号３の配列、又はその誘導体を有する。

α－コノトキシンＭＩ及びα－コノトキシンＧＩのコンセンサス配列（配列番号７）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ０１５１９、Ｐ０１５１９、Ｘ５Ｉ９Ｙ２、Ｐ０１５２０、Ｐ０Ｃ８Ｕ４、Ｐ０ＤＫＰ５、Ｐ０ＤＫＰ８、Ｐ５６９７３、Ｐ０１５２１、Ｐ５６９７３、Ｐ０Ｃ８Ｕ５、Ｐ０Ｃ８Ｕ４、Ｐ０Ｃ１Ｗ１、Ｐ０ＣＡＱ４、Ｐ０ＣＡＱ５、Ｐ５６９７３、Ｄ４ＨＰＦ８、Ｄ４ＨＰＥ４、Ｐ０Ｃ８Ｕ５、Ｐ０Ｃ１Ｗ２、Ｄ４ＨＰＧ９、Ｄ４ＨＰＦ２、Ｐ０Ｃ８Ｖ１、Ｐ２８８７８、Ｐ１５４７１、Ｐ０ＤＫＰ７、Ｄ４ＨＰＦ６、Ｐ０ＤＫＰ７、Ｐ２８８７９。

好ましい実施形態では、α－コノトキシンＭＩ又はα－コノトキシンＧＩが本発明の組成物で用いられる場合、α－コノトキシンＭＩ又はα－コノトキシンＧＩは、配列番号８、配列番号９の配列、又はその誘導体を有する。

カンドキシンのコンセンサス配列（配列番号１１）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ８１７８３、Ｐ１５８１８、Ｄ５Ｊ９Ｐ６、Ｄ５Ｊ９Ｐ８。

好ましい実施形態では、カンドキシンが本発明の組成物で用いられる場合、カンドキシンは、配列番号１２の配列、又はその誘導体を有する。

ハジトキシンのコンセンサス配列（配列番号１３）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ａ８Ｎ２８６、Ｑ９Ｗ７２７、Ｐ８２４６４、Ｄ５Ｊ９Ｐ３、Ｑ７ＺＴ１３、Ｑ８００Ｙ３、Ｑ９ＹＧＩ０。

好ましい実施形態では、ハジトキシンが本発明の組成物で用いられる場合、ハジトキシンは、配列番号１４の配列、又はその誘導体を有する。

さらにより好ましい実施形態では、骨格筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体が（α１）_２β１δε又は（α１）_２β１δγ ｎＡＣｈＲである場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号７、配列番号８を有するα－コノトキシンＭＩ、又はその誘導体である。

ＲｙＲ１に結合できるシナプス後ペプチドであって、本発明の組成物に適したものは、インペラカルシン（配列番号１５若しくは配列番号１６）、ホスホリパーゼＡ２インペラトキシン－１（大サブユニット）（配列番号１７若しくは配列番号１８）、ヘテロムトキシン（大サブユニット）（配列番号１７若しくは配列番号１９）、ホスホリパーゼＡ２（大サブユニット）（配列番号１７若しくは配列番号２０）、ホスホリパーゼＡ２（配列番号１７若しくは配列番号２１）、殺虫毒素ＬａＩＴ１（配列番号２２若しくは配列番号２３）及びφ－リオトキシンＬＷ１ａ（配列番号２２若しくは配列番号２４）、若しくはそれらの誘導体を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

インペラカルシンのコンセンサス配列（配列番号１５）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ５９８６８、Ｐ６０２５２、Ｐ６０２５３、Ａ０Ａ１Ｌ４ＢＪ４２、Ｐ６０２５４、Ｐ０ＤＰＴ１、Ｂ８ＱＧ００、Ｐ０ＤＭ３０、Ａ０Ａ１Ｂ３ＩＪ１９、Ｌ０ＧＢＲ１、Ａ０Ａ１Ｂ３ＩＪ２４、Ａ０Ａ１Ｗ７ＲＡＵ１、Ａ０Ａ２２４Ｘ３Ｘ５、Ａ０Ａ２２４Ｘ３Ｚ６、Ａ０Ａ１Ｖ１ＷＢＮ６。

好ましい実施形態では、インペラカルシンが本発明の組成物で用いられる場合、インペラカルシンは、配列番号１６の配列、又はその誘導体を有する。

ホスホリパーゼＡ２インペラトキシン－１（大サブユニット）、ヘテロムトキシン（大サブユニット）、ホスホリパーゼＡ２（大サブユニット）、及びホスホリパーゼＡ２のコンセンサス配列（配列番号１７）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｑ６Ｔ１７８、Ｑ３ＹＡＵ５、Ｐ５９８８８、Ｈ２ＣＹＰ４、Ｐ０ＤＭＩ６、Ａ０Ａ１Ｌ４ＢＪ５７、Ａ０Ａ１Ｗ７Ｒ９Ｙ９、Ｐ０Ｃ８Ｌ９、Ａ０Ａ１Ｗ７ＲＡ０４、Ａ０Ａ１Ｌ４ＢＪ６４。

好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ２インペラトキシン－１（大サブユニット）、又はヘテロムトキシン（大サブユニット）、又はホスホリパーゼＡ２（大サブユニット）、又はホスホリパーゼＡ２が本発明の組成物で用いられる場合、このホスホリパーゼＡ２インペラトキシン－１（大サブユニット）、又はヘテロムトキシン（大サブユニット）、又はホスホリパーゼＡ２（大サブユニット）、又はホスホリパーゼＡ２は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１の配列、又はそれらの誘導体を有する。

殺虫毒素ＬａＩＴ１及びφ－リオトキシンＬＷ１ａのコンセンサス配列（配列番号２２）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ０Ｃ５Ｆ２、Ｐ０ＤＪ０８。

好ましい実施形態では、殺虫毒素ＬａＩＴ１又はφ－リオトキシンＬＷ１ａが本発明の組成物で用いられる場合、殺虫毒素ＬａＩＴ１又はφ－リオトキシンＬＷ１ａは配列番号２３、配列番号２４の配列、又はそれらの誘導体を有する。

さらにより好ましい実施形態では、骨格筋細胞によって発現される標的受容体がＲｙＲ１である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号２２、配列番号２３を有する殺虫毒素ＬａＩＴ１、又はその誘導体である。

ＣａＶ１．１に結合できるシナプス後ペプチドであって、本発明の組成物に適したものは、カルシセプチン（配列番号２５若しくは配列番号２６）、毒素ＦＳ２（配列番号２５若しくは配列番号２７）、バソタブ（配列番号２８若しくは配列番号２９）、グラコントリファンＭ（配列番号３０若しくは配列番号３１）、ω－コノトキシン－ＴｘＶＩＩ（配列番号３２）、ω－クテニトキシン－Ｃｓ１ａ（配列番号３３若しくは配列番号３４）、Ｕ７－クテニトキシン－Ｐｎ１ｂ（配列番号３５）、Ｕ９－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ（配列番号３６若しくは配列番号３７）、Ｕ６－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ（配列番号３６若しくは配列番号３８）、κ－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ（配列番号３６若しくは配列番号３９）、ω－クテニトキシン－Ｐｒ２ａ（配列番号４０若しくは配列番号４１）、毒素Ｓ４Ｃ８（配列番号４２若しくは配列番号４３）及び毒素Ｃ１０Ｓ２Ｃ２（配列番号４２若しくは配列番号４４）、若しくはそれらの誘導体を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

カルシセプチン及び毒素ＦＳ２のコンセンサス配列（配列番号２５）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ２２９４７、Ｐ０１４１４、Ｐ２５６８４、Ｐ２５６８３。

好ましい実施形態では、カルシセプチン又は毒素ＦＳ２が本発明の組成物で用いられる場合、カルシセプチン又は毒素ＦＳ２は、配列番号２６、配列番号２７の配列、又はそれらの誘導体を有する。

バソタブのコンセンサス配列（配列番号２８）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ８４８４３、Ｃ１ＩＢＺ２、Ａ０Ａ０Ｋ８ＴＰＱ２、Ｃ８ＹＪＢ４、Ｃ８ＹＪＢ３。

好ましい実施形態では、バソタブが本発明の組成物で用いられる場合、バソタブは、配列番号２９の配列、又はその誘導体を有する。

グラコントリファンＭのコンセンサス配列（配列番号３０）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｕ６Ｃ１Ｙ３、Ａ０Ａ０Ｋ８ＴＵ７８、Ａ０Ａ１Ｐ８ＮＶＵ１、Ｆ５Ｃ３Ｔ９、Ａ０Ａ１Ｐ８ＮＶＳ９、Ａ０Ａ１Ｐ８ＮＶＵ０。

好ましい実施形態では、グラコントリファンＭが本発明の組成物で用いられる場合、グラコントリファンＭは、配列番号３１の配列、又はその誘導体を有する。

ω－クテニトキシン－Ｃｓ１ａのコンセンサス配列（配列番号３３）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ８１６９４、Ｂ６ＤＣＰ３、Ｂ６ＤＣＰ１、Ｂ６ＤＣＰ４、Ｂ６ＤＣＮ７。

好ましい実施形態では、ω－クテニトキシン－Ｃｓ１ａが本発明の組成物で用いられる場合、ω－クテニトキシン－Ｃｓ１ａは、配列番号３４の配列、又はその誘導体を有する。

Ｕ９－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、Ｕ６－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、及びκ－クテニトキシン－Ｐｎ１ａのコンセンサス配列（配列番号３６）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｏ７６２００、Ｏ７６２０１、Ｏ７６２０１、Ｐ０Ｃ２Ｓ６、Ｐ８４０００、Ｐ８３８９５、Ｐ３０２８８、Ｐ３７０４５、Ｐ８１７９３。

好ましい実施形態では、Ｕ９－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、又はＵ６－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、又はκ－クテニトキシン－Ｐｎ１ａが本発明の組成物で用いられる場合、このＵ９－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、又はＵ６－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、又はκ－クテニトキシン－Ｐｎ１ａは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９の配列、又はそれらの誘導体を有する。

ω－クテニトキシン－Ｐｒ２ａのコンセンサス配列（配列番号４０）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ８１７９２、Ｐ８３９０２、Ｐ０Ｃ２Ｓ７、Ｐ８４０１１、Ｐ８３９０１。

好ましい実施形態では、ω－クテニトキシン－Ｐｒ２ａが本発明の組成物で用いられる場合、ω－クテニトキシン－Ｐｒ２ａは、配列番号４１の配列、又はその誘導体を有する。

毒素Ｓ４Ｃ８及び毒素Ｃ１０Ｓ２Ｃ２のコンセンサス配列（配列番号４２）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ２２９４７、Ｐ０１４１４、Ｐ２５６８４、Ｐ２５６８３。

好ましい実施形態では、毒素Ｓ４Ｃ８又は毒素Ｃ１０Ｓ２Ｃ２が本発明の組成物で用いられる場合、毒素Ｓ４Ｃ８又は毒素Ｃ１０Ｓ２Ｃ２は、配列番号４３、配列番号４４の配列、又はそれらの誘導体を有する。

さらにより好ましい実施形態では、骨格筋細胞によって発現される標的受容体がＣａＶ１．１である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号３５の配列を有するＵ７－クテニトキシン－Ｐｎ１ｂ、若しくは配列番号２５若しくは配列番号２６の配列を有するカルシセプチン、又はそれらの誘導体である。

Ｎａｖ１．４チャネルは、主に骨格筋線維の筋細胞膜（サルコレンマ）及びＴ細管膜に見出される。このチャネルの孔を通る脱分極電流が骨格筋の活動電位を開始させ、収縮をもたらす。

ミュー－コノトキシン類（μ－コノトキシン類）は、Ｎａｖ１．４チャネルに結合することにより筋活動電位を直接消失させる。ミュー－コノペプチド類は、イモガイ（Ｃｏｎｕｓ）属の海産巻貝の毒から単離される。ミュー－コノペプチドの一次構造は、ジスルフィド架橋で折り畳まれた１５～３０個のアミノ酸によって構成されている。μ－コノトキシン類は、特徴的なＣＣ－Ｘｍ－Ｃ－Ｘｎ－Ｃ－Ｘｐ－ＣＣフレームワークを有し、６つのシステインが３つの可能なジスルフィド結合部（すなわち、ＣｙｓＩ－ＣｙｓＩＶ、ＣｙｓＩＩ－ＣｙｓＶ、ＣｙｓＩＩＩ－ＣｙｓＶＩ）をもたらすことができる。μ－コノトキシン類の３つのループ（ｍ、ｎ、ｐ）内に含まれる残基の数は、いくつかの構造サブグループに分けられる根拠となっている（ｍは５～９個のアミノ酸残基で変わる可能性があり、ｎは３～４個のアミノ酸残基で変わる可能性があり、ｐは３～５個のアミノ酸残基で変わる可能性がある）。

いくつかの実施形態では、ＮａＶ１．４チャネルに結合できるシナプス後ペプチドであって、本発明の組成物に適したものは、μ－コノトキシンＧＩＩＩｂ（配列番号４５若しくは配列番号４６）、μ－コノトキシンＴＩＩＩａ（配列番号４５若しくは配列番号４８）、μ－コノトキシンＰＩＩＩａ（配列番号４５若しくは配列番号４７）、μ－コノトキシンＧｖＩＩＪ（配列番号４９若しくは配列番号５０）、μ－Ｏ－コノトキシンＭｆＶＩＡ（配列番号５１若しくは配列番号５２）、μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃ（配列番号５３、配列番号５４若しくは配列番号９５）、μ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ａ（配列番号５５若しくは配列番号５６）、μ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｂ（配列番号５５若しくは配列番号５７）、μ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｃ（配列番号５５若しくは配列番号５８）、若しくはそれらの誘導体を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

μ－コノトキシンＧＩＩＩｂ、μ－コノトキシンＴＩＩＩＡ、及びμ－コノトキシンＰＩＩＩａのコンセンサス配列（配列番号４５）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ０１５２３、Ｐ０１５２４、Ｐ０５４８２、Ｐ０Ｃ３４９、Ｐ０ＤＫＱ９、Ｐ０ＤＫＱ９、Ｘ５ＩＧＹ９、Ａ０Ａ０Ｋ８ＴＵＢ１、Ｐ０ＣＨ１６、Ｐ５８９２５。

好ましい実施形態では、μ－コノトキシンＧＩＩＩｂ又はμ－コノトキシンＴＩＩＩＡ、又はμ－コノトキシンＰＩＩＩａが本発明の組成物で用いられる場合、μ－コノトキシンＧＩＩＩｂ又はμ－コノトキシンＴＩＩＩＡ、又はμ－コノトキシンＰＩＩＩａは、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４７の配列、又はそれらの誘導体を有する。

μ－コノトキシンＧｖＩＩＪのコンセンサス配列（配列番号４９）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｘ５ＩＷＳ１、Ｘ５ＩＡ０８、Ｑ７１ＫＳ８。

好ましい実施形態では、μ－コノトキシンＧｖＩＩＪが本発明の組成物で用いられる場合、μ－コノトキシンＧｖＩＩＪは、配列番号５０の配列、又はその誘導体を有する。

μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃのコンセンサス配列（配列番号５３）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｃ１Ｊ５Ｍ５、Ｃ１Ｊ５Ｍ６、Ｃ１Ｊ５Ｍ７、Ｉ１ＳＢ０７、Ｐ０ＣＥ７７、Ｑ８６ＤＵ６、Ｐ６０２０７、Ｐ０Ｃ１Ｔ９、Ｐ０Ｃ１Ｕ２、Ｐ０Ｃ１９５、Ｐ０Ｃ１Ｕ１、Ｐ０Ｃ１Ｕ０、Ｐ０ＣＹ７４。

好ましい実施形態では、本発明の組成物で用いられるシナプス後ペプチドは、μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃ又はその変異体である。

より好ましい実施形態では、μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃが本発明の組成物で用いられる場合、μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃは、配列番号５４若しくは配列番号９５の配列、又はそれらの誘導体を有する。

μ－Ｏ－コノトキシンＭｆＶＩＡのコンセンサス配列（配列番号５１）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ０ＤＭ１５、Ａ０Ａ０Ｋ２Ｓ５Ｌ８、Ａ０Ａ０Ｋ２Ｓ５Ｌ９、Ａ０Ａ０Ｋ２Ｓ５Ｎ５、Ａ０Ａ０Ｋ２Ｓ６Ｊ２、Ａ０Ａ０Ｋ２Ｓ５Ｌ０、Ａ０Ａ０Ｋ２Ｓ５Ｍ２、Ａ０Ａ０Ｋ２Ｓ６Ｈ９、Ａ０Ａ０Ｋ２Ｓ５Ｍ９、Ａ０Ａ０Ｋ２Ｓ５Ｍ７、Ｕ６Ｃ１Ｖ９、Ｐ５６７０８、Ｕ６Ｃ２Ｅ４、Ｗ４ＶＳＬ３。

好ましい実施形態では、μ－Ｏ－コノトキシンＭｆＶＩＡが本発明の組成物で用いられる場合、μ－Ｏ－コノトキシンＭｆＶＩＡは、配列番号５２の配列、又はその誘導体を有する。

μ－トミトキシンＨｍｅ１ａ、μ－トミトキシンＨｍｅ１ｂ、及びμ－トミトキシンＨｍｅ１ｃのコンセンサス配列（配列番号５５）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ８５５０５、Ｐ８５５０６、Ｃ０ＨＪＫ５。

好ましい実施形態では、μ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ａ、μ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｂ又はμ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｃが本発明の組成物で用いられる場合、μ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ａ、μ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｂ又はμ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｃは、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８の配列、又はそれらの誘導体を有する。

平滑筋
別の実施形態では、シナプス後細胞が平滑筋細胞である場合、本発明に係る組成物で用いられる少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、平滑筋細胞によって発現される少なくとも１種の受容体に結合し、この受容体は、ムスカリン性アセチルコリン受容体（ｍＡＣｈＲ）、より好ましくはＭ３サブタイプのｍＡＣｈＲ、リアノジン受容体２型（ＲＹＲ２）、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルＣａＶ１．２、及び電位依存性ナトリウムチャネルＮａｖ１．５を含むか又はそれらからなる群から選択される。

本発明に係る組成物の成分として、２種類以上のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）が用いられる場合、平滑筋細胞によって発現され、これらのＰｏＮＴが標的とする受容体は、同じ受容体ファミリーに属してもよいし、複数の異なる受容体ファミリーに属してもよい。

低分子（平滑筋）
この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、平滑筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体に応じて、表３に示すように選択される。

ムスカリン性アセチルコリン受容体は、クラスＡ、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の重要なサブファミリーである。５つのｍＡＣｈＲのサブタイプ（Ｍ１～Ｍ５）があり、これらは、その発現パターン、生理機能、及びＧタンパク質の結合が異なる。３つのサブタイプ（Ｍ１、Ｍ３及びＭ５）は、主にＧｑ／１１ファミリーのＧタンパク質の活性化を介してシグナルを伝達するのに対して、Ｍ２及びＭ４のｍＡＣｈＲは、主にＧｉ／ｏファミリーのＧタンパク質を介してシグナルを伝達する。Ｍ３ｍＡＣｈＲは平滑筋細胞に存在する。さらには、ムスカリンＭ３受容体は、平滑筋組織において副交感神経の収縮反応を媒介する主要な受容体サブタイプであると考えられている。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がｍＡＣｈＲＭ３に結合するシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、アトロピン、スコポラミン、ヒヨスチアミン、イプラトロピウム、トロピカミド、フラボキサート、オキシブチニン、チオトロピウム、シクロペントラート、トルテロジン、プロシクリジン、アクリジニウム、ソリフェナシン、ダリフェナシン、４－ＤＡＭＰ、ＤＡＵ－５８８４、Ｊ－１０４１２９、ザミフェナシン、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

より好ましい実施形態では、平滑筋細胞によって発現される標的受容体がｍＡＣｈＲＭ３である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はダリフェナシンである。

リアノジン受容体アイソフォーム－２（ＲｙＲ２）は、興奮－収縮結合に重要な平滑筋の３つの主要なカルシウムチャネルの１つである。平滑筋のカルシウムスパーク発生に対するＲｙＲ２の寄与はよく説明されている。

より好ましい実施形態では、平滑筋細胞によって発現される標的受容体がＲｙＲ２である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はＪＴＶ５１９である。

電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルＣａＶ１．２は、平滑筋細胞の膜に見出されるカルシウムチャネルである。ＣａＶ１．２は、細胞膜に内在するタンパク質複合体（細胞膜内在性タンパク質複合体）であって、膜の脱分極に応じて細胞内へのＣａ^２＋の流入を媒介し、これにより筋肉の収縮を誘導する。平滑筋細胞では、機械的な結合を介して筋小胞体のリアノジン受容体ＲｙＲ２と結合する。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤が、ＣａＶ１．２に結合するシナプス後低分子である場合、そのシナプス後低分子は、ジヒドロピリジン、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エホニジピン、エルゴジピン、フェロジピン、フロルジピン、イガニジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、レブアムロジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、リオジピン、ベラパミル、ガロパミル、ジメジチアプラミン、ジルチアゼム、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

より好ましい実施形態では、平滑筋細胞によって発現される標的受容体がＣａＶ１．２である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はベラパミルである。

シナプス後ペプチド（平滑筋）
この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がシナプス後ペプチドである場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、平滑筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体に応じて、表４に示すように選択される。

ムスカリン性毒素αのコンセンサス配列（配列番号５９）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ８０４９４、Ｑ９ＰＳＮ１、Ｐ８１０３０、Ｐ８６４１９、Ｐ８０４９５、Ｐ８５０９２、Ｐ２５５１８、Ｐ１７６９６、Ｐ８２４６３、Ｐ６０２３４、Ｐ１８３２８、Ｑ８ＱＧＲ０、Ｐ８１０３１。

ｍＡＣｈＲＭ３に結合できるシナプス後ペプチドであって、本発明の組成物に適したものは、ムスカリン性毒素（配列番号５９若しくは配列番号６０）、又はその誘導体である。

ＲｙＲ２に結合できるシナプス後ペプチドであって、本発明の組成物に適したものは、インペラカルシン（配列番号１５若しくは配列番号１６）、ホスホリパーゼＡ２インペラトキシン－１（大サブユニット）（配列番号１７若しくは配列番号１８）、ヘテロムトキシン（大サブユニット）（配列番号１７若しくは配列番号１９）、ホスホリパーゼＡ２（大サブユニット）（配列番号１７若しくは配列番号２０）、ホスホリパーゼＡ２（配列番号１７若しくは配列番号２１）、殺虫毒素ＬａＩＴ１（配列番号２２若しくは配列番号２３）及びΦ－リオトキシンＬＷ１ａ（配列番号２２若しくは配列番号２４）、若しくはそれらの誘導体を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

好ましい実施形態では、殺虫毒素ＬａＩＴ１又はφ－リオトキシンＬＷ１ａが本発明の組成物で用いられる場合、殺虫毒素ＬａＩＴ１又はφ－リオトキシンＬＷ１ａは、配列番号２３、配列番号２４の配列、又はそれらの誘導体を有する。

さらにより好ましい実施形態では、平滑筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体がＲｙＲ２である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号２２、配列番号２３の配列を有する殺虫毒素ＬａＩＴ１、又はその誘導体である。

ＣａＶ１．２に結合できるシナプス後ペプチドであって、本発明の組成物に適したものは、カルシセプチン（配列番号２５若しくは配列番号２６）、毒素ＦＳ２（配列番号２５若しくは配列番号２７）、バソタブ（配列番号２８若しくは配列番号２９）、グラコントリファンＭ（配列番号３０若しくは配列番号３１）、ω－コノトキシン－ＴｘＶＩＩ（配列番号３２）、ω－クテニトキシン－Ｃｓ１ａ（配列番号３３若しくは配列番号３４）、Ｕ７－クテニトキシン－Ｐｎ１ｂ（配列番号３５）、Ｕ９－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ（配列番号３６若しくは配列番号３７）、Ｕ６－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ（配列番号３６若しくは配列番号３８）、κ－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ（配列番号３６若しくは配列番号３９）、ω－クテニトキシン－Ｐｒ２ａ（配列番号４０若しくは配列番号４１）、毒素Ｓ４Ｃ８（配列番号４２若しくは配列番号４３）、毒素Ｃ１０Ｓ２Ｃ２（配列番号４２若しくは配列番号４４）及びω－テラホトキシン－Ｃｃ１ａ（配列番号６１）、若しくはそれらの誘導体を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

好ましい実施形態では、Ｕ９－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、又はＵ６－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、又はκ－クテニトキシン－Ｐｎ１ａが本発明の組成物で用いられる場合、そのＵ９－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、又はＵ６－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、又はκ－クテニトキシン－Ｐｎ１ａは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９の配列、又はそれらの誘導体を有する。

さらにより好ましい実施形態では、平滑筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体がＣａＶ１．２である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号３５の配列を有するＵ７－クテニトキシン－Ｐｎ１ｂ、若しくは配列番号２５若しくは配列番号２６の配列を有するカルシセプチン、又はそれらの誘導体である。

標的シナプス後受容体ＣａＶ１．２に対するより高い特異性が必要な場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、ω－テラホトキシン－Ｃｃ１ａ（配列番号６１）、又はその誘導体である。

ＮａＶ１．５（ＳＣＮ５Ａ遺伝子によってコードされる）は、ヒトの平滑筋細胞並びに小腸及び結腸のカハール介在細胞（ＩＣＣ）に発現している。ＩＣＣは、機能の中でもとりわけ、消化管のペースメーカーであり、周期的な脱分極（緩徐波）を発生させ、この緩徐波が平滑筋に伝えられ、収縮のための電気的刺激が与えられる。ヒトの消化管平滑筋では、ＮａＶチャネルが緩徐波に対して興奮性であると考えられており、また、ＮａＶ１．５を薬理学的に遮断すると便秘になることから、ヒトの消化管ではＮａＶ１．５が機能的に重要であると考えられている。

ＮａＶ１．５に結合できるシナプス後ペプチドであって、本発明の組成物に適したものは、β－哺乳動物毒素Ｃｓｓ２（配列番号６２若しくは配列番号６３）、α－様毒素ＢｍＫ－Ｍ１（配列番号６４若しくは配列番号６５）、μ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ａ（配列番号５５若しくは配列番号５６）、μ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｂ（配列番号５５若しくは配列番号５７）、μ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｃ（配列番号５５若しくは配列番号５８）、β／κ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ（配列番号６６若しくは配列番号６７）、κ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ（配列番号６８若しくは配列番号６９）、δ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ１（配列番号７０若しくは配列番号７１）、δ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ２（配列番号７０若しくは配列番号７２）及びδ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ３（配列番号７０若しくは配列番号７３）、若しくはそれらの誘導体を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

哺乳動物毒素Ｃｓｓ２のコンセンサス配列（配列番号６２）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ０８９００、Ｐ０１４９５、Ｐ５６６４６、Ｐ６０２６７、Ｐ５９８９７、Ｐ１８９２６、Ｐ５９８９８、Ｐ６０２６６、Ｐ０ＤＬ８３、Ｐ０ＣＨ４１、Ｐ４５６６２、Ｐ４５６６６、Ｑ９５ＷＤ２、Ｐ８００７６、Ｑ７Ｚ１Ｋ９、Ｑ７Ｚ１Ｋ８、Ｑ９ＴＷＬ０、Ｃ０ＨＫ６９。

好ましい実施形態では、β－哺乳動物毒素Ｃｓｓ２が本発明の組成物で用いられる場合、β－哺乳動物毒素Ｃｓｓ２は、配列番号６３の配列、又はその誘導体を有する。

α－様毒素ＢｍＫ－Ｍ１のコンセンサス配列（配列番号６４）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｑ９ＧＱＶ６、Ｐ５９３６０、Ｐ５８４８８、Ｑ６ＩＺＥ０、Ｐ５９３５４、Ｐ０１４８８、Ｇ４ＷＦＱ２、Ｐ０１４８７、Ｐ１７７２８、Ｂ８ＸＧＹ６、Ｑ９Ｎ６８２、Ｐ０１４８３、Ｐ０９９８１、Ｂ６Ａ８Ｓ０、Ｂ６Ａ８Ｒ９、Ｐ５８３２８、Ｐ１５２２７、Ｐ４５６９８、Ｑ９ＮＪＣ８、Ｐ８６４０５、Ｐ５９８９６、Ｅ７Ｄ０８１、Ｅ７Ｄ０８２、Ｐ５５９０２、Ｄ８ＵＷＤ５、Ｄ８ＵＷＤ４、Ｐ０ＤＪＨ８、Ｄ８ＵＷＤ６、Ｐ６０２５７、Ｏ６１７０５、Ｑ９ＮＪＣ５、Ｐ６０２５５、Ｐ０１４８９、Ｐ８４６４６、Ｂ８ＸＧＸ９、Ｐ８３６４４、Ｐ８４６１４。

好ましい実施形態では、α－様毒素ＢｍＫ－Ｍ１が本発明の組成物で用いられる場合、α－様毒素ＢｍＫ－Ｍ１は、配列番号６５の配列、又はその誘導体を有する。

β／κ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａのコンセンサス配列（配列番号６６）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ６２５２０、Ｐ８４８３６、Ｐ８４８３５、Ｂ１Ｐ１Ｃ８、Ｂ１Ｐ１Ｄ０、Ｂ１Ｐ１Ｃ９、Ｐ０ＣＨ５２、Ｐ６０９８０。

好ましい実施形態では、β／κ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａが本発明の組成物で用いられる場合、β／κ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａは、配列番号６７の配列、又はその誘導体を有する。

κ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａのコンセンサス配列（配列番号６８）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ０Ｃ２４７、Ｂ１Ｐ１Ｅ４、Ｂ１Ｐ１Ｈ１、Ｂ１Ｐ１Ａ０。

好ましい実施形態では、κ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａが本発明の組成物で用いられる場合、κ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａは、配列番号６９の配列、又はその誘導体を有する。

δ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ１、δ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ２及びδ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ３のコンセンサス配列（配列番号７０）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｂ１Ｐ１Ｂ７、Ｂ１Ｐ１Ｂ８、Ａ０Ａ４８２ＺＤ０６、Ｂ１Ｐ１Ｂ９。

好ましい実施形態では、δ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ１、又はδ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ２、又はδ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ３が本発明の組成物で用いられる場合、そのδ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ１、又はδ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ２、又はδ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ３は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３の配列、又はそれらの誘導体を有する。

好ましい実施形態では、μ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ａ又はμ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｂ又はμ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｃが本発明の組成物で用いられる場合、そのμ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ａ又はμ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｂ又はμ－トミトキシン－Ｈｍｅ１ｃは、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８の配列、又はそれらの誘導体を有する。

さらにより好ましい実施形態では、平滑筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体がＮａｖ１．５である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列６８若しくは配列番号６９を有するκ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ、若しくは配列番号６２若しくは配列番号６３の配列を有するβ－哺乳動物毒素Ｃｓｓ２、又はそれらの誘導体である。

心筋
別の実施形態では、シナプス後細胞が心筋細胞である場合、本発明に係る組成物で用いられる少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、心筋細胞によって発現される少なくとも１種の受容体に結合し、この受容体は、ムスカリン性アセチルコリン受容体（ｍＡＣｈＲ）、より好ましくはＭ２サブタイプｍＡＣｈＲ、リアノジン受容体２型（ＲＹＲ２）、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルＣａＶ１．１又はＣａＶ１．２、及び電位依存性ナトリウムチャネルＮａｖ１．５を含むか又はそれらからなる群から選択される。

本発明に係る組成物の成分として、２種以上のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）が用いられる場合、心筋細胞によって発現され、これらのＰｏＮＴが標的とする受容体は、同じ受容体ファミリーに属してもよいし、複数の異なる受容体ファミリーに属してもよい。

低分子（心筋）
この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、心筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体に応じて、表５に示すように選択される。

ムスカリン性アセチルコリン受容体Ｍ２は、心筋細胞に存在する。Ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体は、特に内向きカリウム電流の調節を介して心律動を調節する。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がｍＡＣｈＲＭ２に結合するシナプス後低分子である場合、その少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤は、アトロピン、スコポラミン、ヒヨスチアミン、イプラトロピウム、トロピカミド、フラボキサート、オキシブチニン、チオトロピウム、シクロペントラート、トルテロジン、プロシクリジン、アクリジニウム、ＡＦＤＸ１１６、ＡＦＤＸ－３８４、メトクトラミン、オテンゼパド、トリピトラミン、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

より好ましい実施形態では、心筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体がｍＡＣｈＲＭ２である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はトルテロジンである。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がＲｙＲ２に結合するシナプス後低分子である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はＪＴＶ５１９である。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤が、ＣａＶ１．１又はＣａＶ１．２に結合するシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、ジヒドロピリジン、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エホニジピン、エルゴジピン、フェロジピン、フロルジピン、イガニジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、レブアムロジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、リオジピン、ベラパミル、ガロパミル、ジメジチアプラミン、ジルチアゼム、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

より好ましい実施形態では、平滑筋細胞によって発現される標的受容体がＣａＶ１．１又はＣａＶ１．２である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はベラパミルである。

シナプス後ペプチド（心筋）
この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がシナプス後ペプチドである場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、心筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体に応じて、表６に示すように選択される。

ｍＡＣｈＲＭ２に結合できるシナプス後ペプチドであって、本発明の組成物に適したものは、配列番号５９、配列番号６０の配列を有するムスカリン性毒素α、又はその誘導体である。

ＣａＶ１．１又はＣａＶ１．１に結合できるシナプス後ペプチドであって、本発明の組成物に適したものは、カルシセプチン（配列番号２５若しくは配列番号２６）、毒素ＦＳ２（配列番号２５若しくは配列番号２７）、バソタブ（配列番号２８若しくは配列番号２９）、グラコントリファンＭ（配列番号３０若しくは配列番号３１）、ω－コノトキシン－ＴｘＶＩＩ（配列番号３２）、ω－クテニトキシン－Ｃｓ１ａ（配列番号３３若しくは配列番号３４）、Ｕ７－クテニトキシン－Ｐｎ１ｂ（配列番号３５）、Ｕ９－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ（配列番号３６若しくは配列番号３７）、Ｕ６－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ（配列番号３６若しくは配列番号３８）、κ－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ（配列番号３６若しくは配列番号３９）、ω－クテニトキシン－Ｐｒ２ａ（配列番号４０若しくは配列番号４１）、毒素Ｓ４Ｃ８（配列番号４２若しくは配列番号４３）及び毒素Ｃ１０Ｓ２Ｃ２（配列番号４２若しくは配列番号４４）、ω－テラホトキシン－Ｃｃ１ａ（配列番号６１）、若しくはそれらの誘導体を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

好ましい実施形態では、カルシセプチン又は毒素ＦＳ２が本発明の組成物で用いられる場合、カルシセプチン又は毒素ＦＳ２は、配列番号２５、配列番号２６の配列、又はそれらの誘導体を有する。

好ましい実施形態では、バソタブが本発明の組成物で用いられる場合、バソタブは、配列番号２８、配列番号２９の配列、又はそれらの誘導体を有する。

好ましい実施形態では、グラコントリファンＭが本発明の組成物で用いられる場合、グラコントリファンＭは、配列番号３０、配列番号３１の配列、又はそれらの誘導体を有する。

好ましい実施形態では、ω－コノトキシン－ＴｘＶＩＩが本発明の組成物で用いられる場合、ω－コノトキシン－ＴｘＶＩＩは、配列番号３２の配列、又はその誘導体を有する。

好ましい実施形態では、ω－クテニトキシン－Ｃｓ１ａが本発明の組成物で用いられる場合、ω－クテニトキシン－Ｃｓ１ａは、配列番号３３、配列番号３４の配列、又はそれらの誘導体を有する。

好ましい実施形態では、Ｕ９－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、Ｕ６－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、又はκ－クテニトキシン－Ｐｎ１ａが本発明の組成物で用いられる場合、そのＵ９－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、Ｕ６－クテニトキシン－Ｐｎ１ａ、又はκ－クテニトキシン－Ｐｎ１ａは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９の配列、又はそれらの誘導体を有する。

好ましい実施形態では、ω－クテニトキシン－Ｐｒ２ａが本発明の組成物で用いられる場合、ω－クテニトキシン－Ｐｒ２ａは、配列番号４０、配列番号４１の配列、又はそれらの誘導体を有する。

さらにより好ましい実施形態では、心筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体がＣａＶ１．１又はＣａＶ１．２である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号３５を有するＵ７－クテニトキシン－Ｐｎ１ｂ、若しくは配列番号２５若しくは配列番号２６を有するカルシセプチン、又はそれらの誘導体である。

標的シナプス後受容体ＣａＶ１．２に対するより高い特異性が必要な場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号６１を有するω－テラホトキシン－Ｃｃ１ａ、又はその誘導体である。

好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ２インペラトキシン－１（大サブユニット）、又はヘテロムトキシン（大サブユニット）、又はホスホリパーゼＡ２（大サブユニット）、又はホスホリパーゼＡ２が本発明の組成物で用いられる場合、そのホスホリパーゼＡ２インペラトキシン－１（大サブユニット）、又はヘテロムトキシン（大サブユニット）、又はホスホリパーゼＡ２（大サブユニット）、又はホスホリパーゼＡ２は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１の配列、又はそれらの誘導体を有する。

さらにより好ましい実施形態では、心筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体がＲｙＲ２である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号２２、配列番号２３の配列を有する殺虫毒素ＬａＩＴ１、又はその誘導体である。

好ましい実施形態では、本発明の組成物にα－様毒素ＢｍＫ－Ｍ１が使用される場合、α－様毒素ＢｍＫ－Ｍ１は、配列番号６５の配列、又はその誘導体を有する。

より好ましい実施形態では、心筋細胞によって発現される標的シナプス後受容体がＮａｖ１．５である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号６８若しくは配列番号６９を有するκ－テラホトキシン－Ｃｇ１ａ、若しくは配列番号６２若しくは配列番号６３を有するβ－哺乳動物毒素Ｃｓｓ２、又はそれらの誘導体である。

分泌腺細胞
別の実施形態では、シナプス後細胞が分泌腺細胞である場合、本発明に係る組成物で用いられる少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、分泌腺細胞によって発現される少なくとも１種の受容体に結合し、この受容体は、ムスカリン性アセチルコリン受容体（ｍＡＣｈＲ）、より好ましくはＭ１又はＭ３サブタイプのｍＡＣｈＲ、α_１アドレナリン受容体及びβ_１アドレナリン受容体を含むか又はそれらからなる群から選択される。

本発明に係る組成物の成分として、２種以上のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）が用いられる場合、分泌腺細胞によって発現され、これらのＰｏＮＴが標的とする受容体は、同じ受容体ファミリーに属してもよいし、複数の異なる受容体ファミリーに属してもよい。

低分子（分泌腺）
この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、分泌腺細胞によって発現される標的シナプス後受容体に応じて、表７に示すように選択される。

唾液の分泌には、いくつかのムスカリン受容体サブタイプが関与しており、例えば、Ｍ３受容体の単一集団を発現する漿液細胞、並びにＭ１受容体及びＭ３受容体の両方を発現する粘液腺房細胞がある。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤が、ｍＡＣｈＲＭ１又はＭ３に結合するシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、アトロピン、スコポラミン、ヒヨスチアミン、イプラトロピウム、トロピカミド、フラボキサート、オキシブチニン、チオトロピウム、シクロペントラート、トルテロジン、プロシクリジン、アクリジニウム、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

より好ましい実施形態では、分泌腺細胞によって発現される標的シナプス後受容体がｍＡＣｈＲＭ１又はＭ３である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はオキシブチニンである。

Ｍ１又はＭ３ｍＡｃｈＲに対するより高い特異性が必要な場合もある。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤が、ｍＡＣｈＲＭ１に結合するシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、ピレンゼピン、テレンゼピン、ベンズヘキソール、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

より好ましい実施形態では、分泌腺細胞によって発現される標的シナプス後受容体がｍＡＣｈＲＭ１である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子は、ピレンゼピン、ベンズヘキソール、又はそれらの組み合わせである。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がｍＡＣｈＲＭ３に結合するシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、ソリフェナシン、ダリフェナシン、４－ＤＡＭＰ、ＤＡＵ－５８８４、Ｊ－１０４１２９、ザミフェナシン、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

より好ましい実施形態では、分泌腺細胞によって発現される標的シナプス後受容体がｍＡＣｈＲＭ３である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はダリフェナシンである。

アドレナリン受容体（ＡＲ）は、Ｇタンパク質共役型受容体の一種であり、アデニリルシクラーゼと結合する。ＡＲには、４つの一般的なタイプ（α１、α２、β１及びβ２）があり、これらは、異なるエフェクター組織で見出される。唾液腺では、α１アドレナリン受容体が細胞質内のカルシウム濃度（［Ｃａ２^＋］ｉ）の上昇を誘導し、唾液の分泌を刺激する。α１アドレナリン経路は涙腺でも活性化する。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤が、α１－アドレナリン受容体に結合するシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、アルフゾシン、ドキサゾシン、インドラミン、モキシシリト、プラゾシン、シロドシン、タムスロシン、テラゾシン、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

より好ましい実施形態では、分泌腺細胞によって発現される標的シナプス後受容体がα１－アドレナリン受容体である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はシロドシンである。

唾液腺では、β１－アドレナリン受容体が粘性のある分泌物を担っている。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がβ１－アドレナリン受容体に結合するシナプス後低分子である場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、メトプロロール、ネビボロール、ボルチオキセチン、若しくはそれらの組み合わせを含むか又はそれらからなる群から選択される。

より好ましい実施形態では、分泌腺細胞によって発現される標的シナプス後受容体がβ１－アドレナリン受容体である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後低分子はビソプロロールである。

シナプス後ペプチド（分泌腺）
この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤がシナプス後ペプチドである場合、そのニューロン伝達のシナプス阻害剤は、分泌腺細胞によって発現される標的シナプス後受容体に応じて、表８に示すように選択される。

本発明の組成物に適したｍＡＣｈｒＭ１に結合できるシナプス後ペプチドは、ムスカリン性毒素１（配列番号５９若しくは配列番号７４）、ムスカリン性毒素２（配列番号５９若しくは配列番号７５）、ムスカリン性毒素３（配列番号５９若しくは配列番号７６）、ムスカリン性毒素７（配列番号５９若しくは配列番号７７）及びムスカリン性毒素α（配列番号５９若しくは配列番号６０）、若しくはそれらの誘導体を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

ムスカリン性毒素α、ムスカリン性毒素１、ムスカリン性毒素２、ムスカリン性毒素３、及びムスカリン性毒素７のコンセンサス配列（配列番号５９）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ８０４９４、Ｑ９ＰＳＮ１、Ｐ８１０３０、Ｐ８６４１９、Ｐ８０４９５、Ｐ８５０９２、Ｐ２５５１８、Ｐ１７６９６、Ｐ８２４６３、Ｐ６０２３４、Ｐ１８３２８、Ｑ８ＱＧＲ０、Ｐ８１０３１。

より好ましい実施形態では、分泌腺細胞の表面のシナプス後受容体がｍＡＣｈｒＭ１である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号５９、配列番号７７の配列を有するムスカリン性毒素７、又はその誘導体である。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤が、ｍＡＣｈｒＭ３に結合するシナプス後ペプチドである場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号５９、配列番号６０の配列を有するムスカリン性毒素α、又はその誘導体である。

本発明の組成物に適したα１－アドレナリン受容体に結合できるシナプス後ペプチドは、ムスカリン性毒素１（配列番号５９若しくは配列番号７４）、ムスカリン性毒素３（配列番号５９若しくは配列番号７６）、ムスカリン性毒素α（配列番号５９若しくは配列番号６０）、アドレナリン性毒素ρ－エラピトキシン－Ｄｐ１ａ（配列番号７８）、毒素ＡｄＴｘ１（配列番号７９）、若しくはそれらの誘導体を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

ムスカリン性毒素α、ムスカリン性毒素１、ムスカリン性毒素３、アドレナリン毒素ρ－エラピトキシン－Ｄｐ１ａ及び毒素ＡｄＴｘ１のコンセンサス配列（配列番号５９）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｐ８０４９４、Ｑ９ＰＳＮ１、Ｐ８１０３０、Ｐ８６４１９、Ｐ８０４９５、Ｐ８５０９２、Ｐ２５５１８、Ｐ１７６９６、Ｐ８２４６３、Ｐ６０２３４、Ｐ１８３２８、Ｑ８ＱＧＲ０、Ｐ８１０３１。

より好ましい実施形態では、分泌腺細胞の表面の後シナプス受容体がα１－アドレナリン受容体である場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号５９若しくは配列番号７８の配列を有するアドレナリン毒素ρ－エラピトキシン－Ｄｐ１ａ、若しくは配列番号５９若しくは配列番号７９の配列を有する毒素ＡｄＴｘ１、又はそれらの誘導体である。

本発明の組成物に適したβ１－アドレナリン受容体に結合できるシナプス後ペプチドは、β－カルジオトキシン（配列番号８０若しくは配列番号８１）を含むか又はそれらからなる群から選択することができる。

β－カルジオトキシンのコンセンサス配列（配列番号８０）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの以下の受入番号を有するタンパク質の配列に依拠して定義されている：Ｑ６９ＣＫ０、Ｑ５３Ｂ４６、Ｑ２ＶＢＮ８、Ｑ２ＶＢＮ５、Ｑ２ＶＢＮ７、Ｑ２ＶＢＮ４。

この実施形態では、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス阻害剤が、β１－アドレナリン受容体に結合するシナプス後ペプチドである場合、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のシナプス後ペプチドは、配列番号８０、配列番号８１の配列を有するβ－カルジオトキシン、又はその誘導体である。

多重特異的シナプス後阻害剤
他の実施形態では、ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、複数の分子標的を阻害する能力を示す低分子及びペプチドから選択することができる。このような「多重特異的シナプス後阻害剤」は、上述した分子標的（すなわち、ｎＡＣｈＲ（（α１）_２β１δε又は（α１）_２β１δγ）、ｍＡＣｈＲＭ１又はｍＡＣｈＲＭ２又はｍＡＣｈＲＭ３、α１－アドレナリン受容体、β１－アドレナリン受容体、ＲＹＲ１又はＲＹＲ２、ＣａＶ１．１又はＣａＶ１．２、ＮａＶ１．４又はＮａＶ１．５）のうちの少なくとも１つに対して活性を有する。注目すべきは、多重特異性が本発明に有利に働きうることである。例えば、ＮａＶをほぼ阻害する低分子を使用することで、処置又は状態に関連する疼痛を軽減することができる（ＮａＶ１．７が侵害受容に顕著に関与しているため）。

いくつかの実施形態では、多重特異的シナプス後阻害剤は、表９に記載の低分子から選択することができる。

より好ましい実施形態では、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種の多重特異的シナプス後低分子はリドカインである。

他の実施形態では、多重特異的シナプス後阻害剤は、表１０に記載のペプチド、又はそれらの誘導体から選択することができる。

より好ましい実施形態では、本発明の組成物で用いられる少なくとも１種の多重特異的シナプス後ペプチドは、配列番号９１の配列を有するβ／ω－テラホトキシン－Ｔｐ２ａ、又はその誘導体である。

本発明はさらに、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤とボツリヌス神経毒素とを含む本発明の組成物を含む化粧料組成物を提供する。この化粧料組成物は、美容的に許容できる賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。

本発明はさらに、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤とボツリヌス神経毒素とを含む本発明の組成物を含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、担体、塩及び／又は添加剤をさらに含んでもよい。

発明の実施形態及び他の態様
ＢｏＮＴは、分泌腺及び平滑筋のコリン作動性神経筋支配若しくはコリン作動性自律神経支配の阻害又は遮断を含む直接的な作用を有することが報告されている。

本発明の組成物によって、ＢｏＮＴの薬力学的プロファイルを調節するための実験を行うことができる。

速発性ＰｏＮＴ
筋収縮に関連した疼痛を迅速に軽減するためには、速発性であることが特に興味深い場合がある。

驚くべきことに、本発明者らは、本発明の組成物の筋弛緩作用の「初期効果」が、独立して投与された個々の化合物（すなわち、ＢｏＮＴ及びＰｏＮＴ）の「初期効果」よりも強いことを認めた。このように、本発明の組成物には相乗効果がある。「初期効果」は、ＢｏＮＴの効果の前、すなわちＢｏＮＴ投与後最初の２４時間以内に生じる筋弛緩効果を意味する。

好ましい実施形態では、本発明の組成物で用いられるニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）は、速発性（発現が早い）シナプス後ペプチド及び／又は速発性シナプス後低分子である。「速発性」は、例えばＢｏＮＴ／Ａ又はＢｏＮＴ／Ｂ又はＢｏＮＴ／Ｅ等のボツリヌス神経毒素によってもたらされる効果よりも迅速に効果をもたらすＰｏＮＴを意味する。例えば、速発性ＰｏＮＴの効果は、１２時間以内、好ましくは６時間以内、より好ましくは２時間以内、最も好ましくは１時間以内に視覚的に認識することができる。

他の好ましい実施形態では、本発明の組成物で用いられるニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）は、非常に速発性のシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子である。「非常に速発性」は、４５分未満、好ましくは３０分未満、より好ましくは２０分未満、最も好ましくは１０分未満で効果をもたらすＰｏＮＴを意味する。

ＢｏＮＴの作用の持続時間を長くするＰｏＮＴ
さらに驚くべきことに、本発明者らは、ボツリヌス神経毒素組成物に少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子を添加すると、ボツリヌス神経毒素の作用の持続時間が延長されることを発見した。例えば、ＢｏＮＴ／Ａを筋肉内に注射した後の通常の作用の持続時間は、ヒトの場合、典型的には約３～４ヶ月である。ボツリヌス神経毒素の「作用の持続時間の延長」は、ボツリヌス毒素の作用が、例えば、Ａ型のボツリヌス神経毒素の作用よりも長く続くことを意味する。本発明の組成物の作用停止は、ＢｏＮＴのみを含む組成物の作用停止と比較して、例えば、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、又はそれ以上遅くなる。

本発明のこの特定の利点は、所望の効果を達成するために必要な注射の回数を減らすために特に興味深いものとなりうる。別の利点は、２回の注射の間の時間を長くすることによって、本発明の組成物を受ける個体の免疫系による抗ＢｏＮＴ抗体の生成の可能性も低下することである。

強度を高めるＰｏＮＴ
驚くべきことに、本発明者らは、ボツリヌス神経毒素組成物と一緒に、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子を投与することで、ボツリヌス神経毒素の作用の強度が高まることを発見した。「作用の強度」は、特定の用量のＢｏＮＴについて観察可能な最高の筋弛緩効果を意味する。

好ましい実施形態では、本発明の組成物で用いられるニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）は、独立して投与された組成物の個々の化合物の効果よりも、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％高められる相乗効果を示す。

ＢｏＮＴの作用の強度を高めることにより、本発明の組成物は、美容的な結果、及び障害や痛みのある状態の緩和を改善する可能性がある。

ＢｏＮＴの発現を速め、ＢｏＮＴの作用の強度を増加させ、作用の持続時間を増加させる速発性のＰｏＮＴ
速発性である又は非常に速発性であるＰｏＮＴ、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子、のいくつかについては、ボツリヌス神経毒素組成物の作用の発現を促進すること、及び作用の持続時間を延長すること、及び作用の強度を高めることにより、ＢｏＮＴ組成物の効果を調節することが可能である。

迅速かつ持続的な作用発現のための三元組み合わせ
使用目的に応じて、ボツリヌス神経毒素の最大効果が得られる前にＰｏＮＴの作用の持続時間が終了する場合には、本発明の組成物は、中間的な作用の発現を有する第２のＰｏＮＴをさらに含んでいてもよい。「中間的な作用の発現」は、速発性のＰｏＮＴよりもゆっくりと効果をもたらすＰｏＮＴを意味する。その利点は、本発明の組成物の迅速で持続的かつ長期的な最大効果を、これらの効果の時間経過による著しい減少なしに得ることである。

好ましい実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも１種の速発性ＰｏＮＴと、少なくとも１種の中間作用性ＰｏＮＴと、ボツリヌス神経毒素とを含む。

同時投与
すべての実施形態において、少なくとも１種のＰｏＮＴ及びボツリヌス神経毒素は、組み合わせて投与される。用語「組み合わせて」、「併用して」、「同時送達」、及び「一緒に投与」は等価であり、交換可能に使用されてもよい。対象への２種以上の成分の投与という文脈では、２種以上の成分、例えば、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤及びボツリヌス神経毒素組成物の同時投与を指す。

ＰｏＮＴ及びＢｏＮＴの同時投与は、ＰｏＮＴ及びＢｏＮＴが同じ組成物又は同じ容器で組み合わされているか否かによらず、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、若しくは３０分等の短い時間内に、又は６０分、１２０分、２４０分、３６０分、若しくは７２０分等のより長い時間内に、類似又は異なる投与経路を用いて、少なくとも１種のＰｏＮＴとＢｏＮＴを同じ解剖学的部位に投与することとして定義される。

「併用して」という用語の使用は、ＰｏＮＴ及びＢｏＮＴが対象に投与される順序を制限するものではない。

同時注入
本発明の組成物を使用した場合の上述の効果はすべて、少なくとも１種のＰｏＮＴ、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子、及びボツリヌス神経毒素が同時に注入される場合に得られる。

非同時注入
代替の実施形態では、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を最初に注入することができ、その後、ボツリヌス神経毒素を用いた２回目の注入が行われる。この実施形態では、ボツリヌス神経毒素の注入は、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤の作用の持続時間が終了する前に行う必要がある。言い換えれば、ＰｏＮｔ及びボツリヌス神経毒素の非同時注入は行われてもよいが、ただし、ＰｏＮＴ活性の減衰が起こる前にボツリヌス神経毒素が投与され、任意にＰｏＮＴ活性の作用発現後にボツリヌス神経毒素が投与される。

別の代替実施形態では、ボツリヌス神経毒素を最初に注入することができ、その後、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を用いた２回目の注入が行われる。この実施形態では、ボツリヌス神経毒素の効果がプラトーに達する前に、少なくとも１種のニューロン伝達のシナプス後阻害剤が注入される必要がある。

局所投与
ＢｏＮＴの１５０ＫＤａと比較して、本発明の組成物で用いられるＰｏＮＴは低分子量である。美容的治療の文脈では、本発明の組成物の成分のそれぞれについて、異なるタイプの施用法を使用することが興味深いかもしれない。例えば、少なくとも１種のＰｏＮＴは、局所的な施用を用いて送達されてもよい。

別の実施形態では、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を、関心のある標的組織に近い皮膚に局所的に適用することができ、ボツリヌス神経毒素は関心のある標的組織に注入される。この実施形態では、ボツリヌス神経毒素の注入は、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤の作用の持続時間が終了する前に行われる必要がある。

注入スケジュール
ＰｏＮＴが標的組織のシナプスレベルでボツリヌス神経毒素と相互作用できるように、注入スケジュールが、ＰｏＮＴの薬力学的プロファイルに適合していることも必要である。

本発明の第２の目的は、ボツリヌス神経毒素組成物の効果を高める方法であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子をそのボツリヌス神経毒素組成物に添加することを含む方法に関する。

「ボツリヌス神経毒素組成物の効果を高める」は、ボツリヌス神経毒素組成物の作用の発現を促進すること、及び／又は作用の持続時間を延長すること、及び／又は作用の強度を高めることを意味する。

従って、本発明は、ボツリヌス神経毒素組成物の作用の発現を促進する、及び／又は作用の持続時間を延長する、及び／又は作用の強度を高める方法であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子をそのボツリヌス神経毒素組成物に添加することを含む方法に関する。

作用発現
ボツリヌス神経毒素組成物の作用の「発現を促進する」は、ＢｏＮＴ単独で得られるよりも早く筋肉の弛緩を得ることを意味する。

好ましくは、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子を含むボツリヌス神経毒素組成物の作用の発現は、ＢｏＮＴのみを含む（すなわち、コリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を含まない）ボツリヌス神経毒素組成物の作用の持続時間と比較して、５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％早く発生する。

両組成物には同じボツリヌス神経毒素が使用されているので、ＢｏＮＴを単独で含むボツリヌス神経毒素組成物は、比較のための関連する対照として機能する。

持続時間
ボツリヌス神経毒素組成物の作用の「持続時間を延長する」は、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子が、ＢｏＮＴによって誘発された筋弛緩からの回復を遅らせることを意味する。言い換えれば、本発明の組成物の筋肉内注射後の筋弛緩の持続時間は、「長い回復」と考えられてもよい。

好ましくは、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子を含むボツリヌス神経毒素組成物の作用の持続時間は、ＢｏＮＴを単独で含む（すなわち、コリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を含まない）ボツリヌス神経毒素組成物の作用の持続時間と比較して、１０％、２５％、５０％、１００％又はそれ以上延長される。

強度
いくつかの実施形態では、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤の第３の効果は、ボツリヌス毒素の作用の最大強度を増加させることにあってもよい。好ましくは、ボツリヌス神経毒素のみを含有する（すなわち、コリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を含まない）組成物の作用の最大強度と比較して、作用の最大強度が少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％高められる。

この第３の効果は、例えば重度のジストニアの患者のより良い救済を達成するために、特に興味深い可能性がある。別の利点は、本発明の組成物がより低用量のＢｏＮＴで満足のいく効果を得ることができ、従って、（とりわけ、身体の様々な部分に複数の注射を必要とするパーキンソン患者において）ＢｏＮＴの過剰投与に関連する毒性のリスクを低減することができるという事実である。

作用発現、強度及び持続時間
いくつかの実施形態では、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子は、ボツリヌス神経毒素組成物に対して、ボツリヌス神経毒素組成物の作用発現を促進すること、作用の持続時間を延長すること、及び作用の強度を高めることという３つの効果を有する。

本発明の組成物は、美容的又は治療的用途に適した他の成分をさらに含むことができる。

製剤
本発明の第３の目的は、本発明の組成物と、１種以上の皮膚科学的又は薬学的に許容できる担体、例えば、アルブミン、好ましくはヒト血清アルブミン又は組換えヒトアルブミン、非還元性二糖類又は三糖類、非イオン性界面活性剤、及び使用目的に適した任意の他の塩及び／又は添加剤（これらに限定されない）とを含む化粧料粗製物又は医薬品組成物である。

本発明の組成物は、好ましくは、皮下、筋肉内、インプラント及び／又は局所的な投与を可能にする形態にある。筋肉内投与及び皮下投与が好ましい。

対象又は患者（すなわち、特定の治療を必要とするヒト又は他の哺乳動物）への注射（注入）に適した本発明の組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、又は使用前に適切なビヒクルに溶解又は懸濁される乾燥粉末の形態にあってもよい。用語「必要とする」は、薬学的又は健康に関連するニーズ（例えば、ジストニア又は痙縮に関連する状態を治療すること）と、美容的及び主観的なニーズ（例えば、顔のしわの治療等、外観を変更又は改善すること）の両方を含むことを意味する。

シナプス後ペプチドを局所的に送達する場合には、シナプス後ペプチドは、クリーム、フォーム（泡沫）、ゲル、ローション、軟膏（例えば、局所適用用）、又は皮下注射用に製剤化されてもよい。局所的な送達手段としては、経皮的な送達（例えば、粘着パッチ、イオントフォレーシス又は超音波デバイスによる）が挙げられてもよい。

本発明の組成物は、局所的な送達に適している。「局所送達」は、作用部位が組成物の使用（適用）部位にあるか、又はその近くにあることを意味する。非限定的な例として、弛緩させたい筋肉に注射された少なくとも１種のＰｏＮＴとボツリヌス神経毒素とを含む組成物は、筋肉内注射によってその筋肉に局所送達されることになる。

ＰｏＮＴ及びＢｏＮＴの混合
好ましい実施形態では、当該組成物は、ボツリヌス毒素（関連する非毒素タンパク質を含むか、又は関連する非毒素タンパク質を含まない）と、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、及び通常は１種以上の追加の薬学的に許容できる担体又は賦形剤とを混合することによって調製される。最も単純な形態では、当該組成物は、緩衝生理食塩水等の水性の薬学的に許容できる希釈剤を含有してもよい。しかしながら、当該組成物は、それが適用される組織に適合する皮膚科学的又は薬学的に許容できる担体、ビヒクル又は媒体を含む、注射可能な医薬組成物又は化粧料組成物に典型的に見られる他の成分を含有していてもよい。本明細書で用いられる用語「皮膚科学的又は薬学的に許容できる」は、このように記載された組成物又はその成分が、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応等を伴わずに、これらの組織と接触して使用されるか、又は患者一般に使用されるのに適していることを意味する。必要に応じて、本発明の組成物は、いま注目している分野、特に化粧料及び皮膚科で従来から使用されている任意の成分を含んでいてもよい。

骨格筋への投与
本発明の医薬組成物は、以下の筋肉の１つ以上に、又はその近傍に注入するのに適している：例えば、皺眉筋、鼻根筋、後頭前頭筋、鼻筋、口輪筋、口角下制筋、広頸筋、胸骨舌骨筋、前鋸筋、腹直筋、外腹斜筋、大腿筋膜張筋、腕橈骨筋、腸骨筋、大腰筋、恥骨筋、長内転筋、縫工筋、薄筋、外側広筋、大腿直筋、内側広筋、大腿四頭筋の腱、膝蓋、腓腹筋、ヒラメ筋、脛骨、長腓骨筋、前脛骨筋、膝蓋靱帯、腸脛靭帯、小指球筋、母指球筋、尺側手根屈筋、浅指屈筋、長掌筋、橈側手根屈筋、腕橈骨筋、円回内筋、上腕筋、上腕二頭筋、上腕三頭筋、大胸筋、三角筋、僧帽筋、胸鎖乳突筋、咬筋、眼輪筋、側頭筋、帽状腱膜、大円筋、指伸筋、尺側手根伸筋、肘筋、長母指外転筋、足底筋、アキレス腱、ヒラメ筋、大内転筋、大殿筋、中殿筋、広背筋、棘下筋、及びこれらの組み合わせなど。

平滑筋への投与
本発明の組成物の投与に適した平滑筋は、血管壁、胃壁、尿管、腸管、大動脈内（中膜層）、目の虹彩、前立腺、胃腸管、呼吸器管、小動脈、細動脈、生殖器系（両方の性別）、静脈、腎臓の糸球体（メサンギウム細胞と呼ばれる）、膀胱（排尿筋）、子宮、皮膚の立毛筋、毛様体筋、括約筋（食道、肛門）、気管、胆管等のいずれかを含むことができる。

心筋
本発明の医薬組成物は、洞結節（右上肺静脈（ＰＶ）、右下肺静脈）脂肪パッド、房室（ＡＶ）結節（下大静脈－左心房）脂肪パッド等の心外膜脂肪パッド（脂肪体）への注射（注入）に適している。

分泌腺
本発明の医薬組成物は、唾液腺に直接注入して唾液の分泌量を減少させたり、顎下腺（口底の下）や耳下腺（顎の後ろ）に注入したり、手足の掌や腋窩のエクリン汗腺の近傍に注入することができる。

反復的な注入
望ましい結果を達成するためには、複数の注入（注射）及び／又は注入部位が必要な場合がある。本発明の組成物で用いられる少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤及びボツリヌス毒素の頻度及び量は、治療される特定の部位の性質及び位置に基づいて、例えば写真、スキャン、ＭＲＩ、筋電図等を用いて、当業者が決定することができる。

注入手順
本発明の組成物の注入は、注射器（シリンジ）、カテーテル、針及び他の注入手段によって行うことができる。注入は、顔、首、胴体、腕、手、脚、足等（これらに限定されない）、治療が必要な身体の任意の部位に行うことができる。注入は、表皮、真皮、皮下層、脂肪又は筋肉等、特定の部位で位置を選ばずに行うことができる。

経路
本発明の組成物の投与経路及び投与量は、コリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤及び／又はボツリヌス神経毒素の溶解性の特性、並びに治療対象の美容的又は治療的な状態の強度及び範囲等の基準に基づいて選択することができる。

投与量
本発明の注入用組成物において、使用される少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤についての有用な投与量は、治療を受ける患者の体重に対して、約０．０１ｎｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、好ましくは約１～８０μｇ／ｋｇ、より好ましくは約４～５０μｇ／ｋｇである。

少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤の投与量の選択は、各ＰｏＮＴに特有のＬＤ５０（試験集団の５０％を死滅させる致死量の中央値）にも依存する場合がある。この場合、使用される少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤の有用な投与量は、ＬＤ５０の約１％～５０％、好ましくはＬＤ５０の約５％～３０％、より好ましくはＬＤ５０の約１０％～２０％である。

本発明の注入用組成物において、使用されるボツリヌス神経毒素についての有用な用量範囲は、治療のための約１～１０００単位、好ましくは約１００～５００単位、好ましくは約５０～２００単位、より好ましくは約２０～１００単位である。

「単位」は、市販のＡ型ボツリヌス神経毒素１単位と同等の神経筋遮断効果を持つように規格化された活性型ＢｏＮＴの量を意味する。異なるＢｏＮＴ／Ａ製品の単位は同等の効力を持たず、それゆえ交換可能ではないことは周知である。Ａ型毒素のすべての形態は同一の作用機序を持つが、バイアル中の活性１５０ｋＤａ分子の理論的な数／量は製造された製品によって異なり、このばらつきはＬＤ５０（試験集団の５０％を死滅させる致死量の中央値）と相対的な関係を持つ可能性がある。ＬＤ５０は、例えば、１ｍＬあたりの単位で表されることがあり、各企業の製品に独自のものであり、その製品の効力単位を定義している。毒素単位を市販の基準製品に対して較正することが必要な場合もある。

いくつかの実施形態では、ボツリヌス神経毒素は、５～１０００Ｕの総投与量で投与することができる。

いくつかの実施形態では、ボツリヌス神経毒素は、１回の注射につき１Ｕ～５００Ｕ、好ましくは１０Ｕ～１００Ｕ、より好ましくは２０Ｕ～８０Ｕの用量で投与することができる。最も好ましくは、ボツリヌス神経毒素は、１回の注射につき２０Ｕ～５０Ｕの用量で投与することができる。

ボツリヌス神経毒素の投与量は、タンパク質量で表すこともできる。例えば、特定の実施形態では、ボツリヌス神経毒素は、約６ｐｇ～５０ｎｇ、好ましくは１０ｐｇ～４５ｎｇ、好ましくは２０ｐｇ～３０ｎｇ、より好ましくは１００ｐｇ～１５ｎｇ／投与量の量で投与することができる。

剤形
本発明の組成物は、その形態の観点から、溶液、エマルション（マイクロエマルション又はナノエマルションを含む）、懸濁液、ゲル、粉末、又は筋肉及び当該組成物が使用されてもよい他の組織への投与に使用される他の典型的な固体若しくは液体の組成物を含んでもよい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、注射器での注射に適した低粘度の無菌製剤で存在する。本明細書で使用する場合、本発明に係る組成物及び製剤に言及する場合、組成物及び製剤という用語は本質的に交換可能である。本発明の組成物は、注入の前に薬学的に許容できる液体希釈剤を用いて再構成される凍結乾燥粉末の形態にあってもよい。本発明の組成物は、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤及びボツリヌス神経毒素に加えて、このような製品に通常使用される他の成分、例えば、抗菌剤、水和剤、組織増量剤又は組織充填剤、保存剤、乳化剤、天然油又は合成油、溶媒、界面活性剤、洗浄剤、ゲル化剤、抗酸化剤、充填剤、増粘剤、粉末、粘度調整剤及び水、並びに任意に麻酔薬、かゆみ止め、植物抽出物、コンディショニング剤、ミネラル、ポリフェノール、シリコーン又はそれらの誘導体、ビタミン、植物由来の医薬成分等を含有してもよい。

本発明に係る注入用組成物は、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子と、ボツリヌス毒素とが、時間の経過とともに制御された方法で組織内に放出されるように、それらが材料内にカプセル化又はその他の方法で含まれている、制御放出性組成物又は徐放性組成物の形態にあってもよい。ボツリヌス神経毒素及びコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を含む組成物は、マトリクス、リポソーム、ベシクル、マイクロカプセル、ミクロスフェア等の中に含まれていてもよいし、固体の微粒子材料の中に含まれていてもよく、これらはすべて、ボツリヌス毒素の経時的な放出を提供するように選択及び／又は構築される。少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子、とボツリヌス毒素とは、一緒に（すなわち、同じカプセルに）封入されても、別々に（すなわち、別々のカプセルに）封入されてもよい。

局所投与
本発明に係るボツリヌス毒素製剤は、麻痺を生じさせる、弛緩を生じさせる、収縮を緩和する、攣縮を防止若しくは緩和する、腺出力を減少させる、筋収縮による疼痛を緩和する、又は他の所望の効果を得るために有効な量で、皮膚の下にある筋肉、又は皮膚内の腺構造に注入（典型的には注射器を使用）によって送達することができる。このようなボツリヌス毒素の局所送達により、投与量の削減がもたらされ、毒性が低減され、注射剤や移植剤に比べて所望の効果のためのより正確な投与量の最適化が可能になる。

有効量
本発明の組成物は、ボツリヌス毒素の有効量、好ましくは治療上又は美容上の有効量を送達するために投与される。本明細書で使用される用語「有効量」又は「治療上又は美容上の有効量」は、望ましい筋弛緩又は他の生物学的若しくは美容的効果をもたらすのに十分であるが、暗黙のうちに、安全な量、すなわち重篤な副作用を避けるのに十分低い量である、上記で定義されたボツリヌス毒素の量を意味する。望ましい効果としては、例えば、過度の筋緊張を減少させる（ジストニア等の神経筋障害の場合）こと、又はとりわけ顔の小じわ及び／若しくはしわの外観を減少させること、又は目を大きくしたり、口角を上げたり、上唇から扇状に広がる線を滑らかにする等、他の方法で顔の外観を調整すること、又は筋肉の緊張を全般的に和らげることを目的とした特定の骨格筋の弛緩が挙げられる。最後に述べた筋肉の緊張を全般的に和らげる効果は、顔に限らず他の場所でも得られる。さらなる望ましい効果は、平滑筋の弛緩に関連し、その目的は異常な収縮を抑えることである。そのような異常な収縮は、例えば、過活動膀胱等に罹患している患者に起こる。他の望ましい効果は、心筋の神経細胞の刺激を減少させることを含む。心筋細胞への病的な神経細胞の刺激は、心房細動等の心臓病に関係しており、このような刺激を減少させる必要性があるのは尤もである。副次的な望ましい効果は、多汗症又は流涎症のような病的な疾患において、分泌腺の刺激を減少させることに関する。

本発明の組成物は、単回投与の治療として適用するための適切な有効量のボツリヌス毒素を含んでいてもよいし、投与場所で希釈するために、又は複数の適用に使用するために、より濃縮されていてもよい。ボツリヌス毒素は、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子の使用により、しわ、望ましくない顔面の筋肉若しくは他の筋肉の攣縮、多汗症、ざ瘡等の状態、又は筋肉痛若しくは攣縮の緩和が望まれる身体の他の場所の状態等を治療するために、対象に注射で投与することができる。本発明の組成物は、対象の顔面の、顔の小じわ等の小じわ、及び「しかめっ面による線」とも呼ばれる眉間の線の治療に特に適している。ボツリヌス毒素は、筋肉又は他の皮膚関連若しくは他のエフェクター組織構造への注入によって投与される。投与は、例えば、脚、肩、背中（腰を含む）、腋窩、掌、足、首、顔、鼠径部、手足の甲、肘、上腕、膝、大腿部、臀部、胴体、骨盤、又はボツリヌス毒素の投与が望まれる身体の他の部分に行われてもよい。

適応症
美容的
本発明の第４の目的は、必要とする個体においてしわ、眉間の線等の線、又は溝、美容目的のための筋肉のボリューム（咬筋若しくはふくらはぎ等）、肥厚性瘢痕、及び他の皮膚科学的状態を軽減することに使用するための化粧料組成物であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子と、ボツリヌス毒素と、注入用の美容的に許容できる希釈剤とを含む化粧料組成物である。

治療的
本発明の注入用ボツリヌス毒素含有組成物の投与は、シナプス伝達の防止、アセチルコリン放出の防止、又は他の神経伝達物質の放出の防止が治療上の利益をもたらすと考えられるあらゆる状態を含む他の状態を治療するためにも実施されてよい。

例えば、本発明に係る組成物によって治療されてもよい状態としては、限定されないが、ジストニア及び痙縮が含まれる。また、本発明の組成物は、注入によるボツリヌス毒素の投与が提案又は実施されている他の状態、例えば、筋肉の収縮に関連する疼痛、過活動膀胱、鼻炎、副鼻腔炎、ざ瘡、ジストニア、ジストニア性収縮（自覚的か臨床的かを問わない）、多汗症（自覚的か臨床的かを問わない）、及びコリン作動性神経系によって制御される１種以上の分泌腺の分泌過多等の治療に使用されてもよい。

本発明の第５の目的は、運動障害、ジストニア、頸部ジストニア、痙性斜頸、局所性ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、眼瞼障害、斜視、痙縮、脳性麻痺、限局性痙縮、四肢痙縮、攣縮、片側顔面攣縮、振戦、チック、歯ぎしり、失行症及びすくみ足の治療に使用するための医薬組成物であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子と、ボツリヌス毒素と、注入用の薬学的に許容できる希釈剤とを含む医薬組成物である。

上記の治療適応症において、骨格筋細胞がシナプス後細胞である。

本発明の別の目的は、痙攣性発声障害、喉頭性ジストニア、顎口腔性発声障害、舌性ジストニア及び他の音声障害、アカラシア、嚥下障害、食道障害、胃不全麻痺、痙攣性結腸炎、神経因性膀胱、過活動膀胱、間質性膀胱炎、良性前立腺肥大症、排尿障害、便失禁、便秘、アニスムス、裂肛、子宮痛（月経困難症、性交疼痛症）、膣痛（膣痙、外陰部痛）、骨盤痛、坐骨海綿体筋（持続勃起症）、並びに他の筋緊張障害、並びに筋肉群の不随意運動を特徴とする他の障害の治療に使用するための医薬組成物であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子と、ボツリヌス毒素と、注入用の薬学的に許容できる希釈剤とを含む医薬組成物である。

上記の治療適応症において、平滑筋細胞がシナプス後細胞である。

本発明の別の目的は、心房細動の治療に使用するための医薬組成物であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子と、ボツリヌス毒素と、注入用の薬学的に許容できる希釈剤とを含む医薬組成物である。

上記の治療適応症において、心筋細胞がシナプス後細胞である。

本発明の別の目的は、流涙、多汗症（手、足及び脇の下）、流涎症、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸分泌、皮脂腺の過剰な産生（及びざ瘡等の関連状態）並びに他の分泌障害の治療に使用するための医薬組成物であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子と、ボツリヌス毒素と、注入用の薬学的に許容できる希釈剤とを含む医薬組成物である。

上記の治療適応症において、分泌腺細胞がシナプス後細胞である。

これらの意図された使用の特定の実施形態では、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤は、速発性の阻害剤である。

これらの意図された使用のより特定の実施形態では、少なくとも１種のシナプス後阻害剤は、速発性の阻害剤であり、ボツリヌス毒素は、Ａ型、Ｂ型又はＥ型であり、好ましくはＡ型である。

本発明は、治療を必要とする個体を注入用のボツリヌス神経毒素を用いて治療する方法であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子と、ボツリヌス神経毒素とを含む医薬組成物の薬学的有効量を、治療を必要とする個体の部位に投与して、美容的又は治療的効果を達成する工程を含む方法にも関する。本発明は、好ましくは、必要とする対象において、コリン作動性ニューロンの望ましくない活動（活性）及びその潜在的に関連する疼痛に関連する状態を治療することに使用するのに適している。

特定の実施形態では、美容的効果は、しわ、眉間の線等の線、又は溝の軽減、美容目的のための筋肉のボリューム（咬筋又はふくらはぎ等）の軽減、肥厚性瘢痕の軽減、及び他の皮膚科的状態の治療である。

別の特定の実施形態では、治療効果は、運動障害、ジストニア、頸部ジストニア、痙性斜頸、局所性ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、眼瞼障害、斜視、痙縮、脳性麻痺、限局性痙縮、四肢痙縮、攣縮、片側顔面攣縮、振戦、チック、歯ぎしり、失行症及びすくみ足の軽減である。

別の特定の実施形態では、治療効果は、痙攣性発声障害、喉頭性ジストニア、顎口腔性発声障害、舌性ジストニア及び他の音声障害、アカラシア、嚥下障害、食道障害、胃不全麻痺、痙攣性結腸炎、神経因性膀胱、過活動膀胱、間質性膀胱炎、良性前立腺肥大症、排尿障害、便失禁、便秘、アニスムス、裂肛の軽減、子宮痛（月経困難症、性交疼痛症）、膣痛（膣痙、外陰部痛）、骨盤痛、坐骨海綿体筋（持続勃起症）の軽減又は緩和、他の筋緊張障害、及び筋肉群の不随意運動を特徴とする他の障害の軽減である。

別の特定の実施形態では、治療効果は心房細動の軽減である。

別の特定の実施形態では、治療効果は、流涙、多汗症（手、足及び脇の下）、流涎症、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸分泌、皮脂腺の過剰な産生（及びざ瘡等の関連状態）並びに他の分泌障害の軽減である。

治療上のニーズとしては、特定の細胞型の活性を調節しなければならない状態の治療が挙げられる。本発明の組成物は、そのような調節を可能にする。

別の特定の実施形態では、シナプス後細胞が骨格筋細胞である場合、治療すべき状態は、運動障害、ジストニア、頸部ジストニア、痙性斜頸、局所性ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、眼瞼障害、斜視、痙縮、脳性麻痺、限局性痙縮、四肢痙縮、攣縮、片側顔面攣縮、振戦、チック、歯ぎしり、失行症及びすくみ足である。

別の特定の実施形態では、シナプス後細胞が平滑筋細胞である場合、治療すべき状態は、痙攣性発声障害、喉頭性ジストニア、顎口腔性発声障害、舌性ジストニア及び他の音声障害、アカラシア、嚥下障害、食道障害、胃不全麻痺、痙攣性結腸炎、神経因性膀胱、過活動膀胱、間質性膀胱炎、良性前立腺肥大症、排尿障害、便失禁、便秘、アニスムス、裂肛、子宮痛（月経困難症、性交疼痛症）、膣痛（膣痙、外陰部痛）、骨盤痛、坐骨海綿体筋（持続勃起症）、他の筋緊張障害並びに筋肉群の不随意運動を特徴とする他の障害である。

別の特定の実施形態では、シナプス後細胞が心筋細胞である場合、治療すべき状態は心房細動である。

別の特定の実施形態では、シナプス後細胞が分泌腺細胞である場合、治療すべき状態は、流涙、多汗症（手、足及び脇の下）、流涎症、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸分泌、皮脂腺の過剰な産生（及びざ瘡等の関連状態）並びに他の分泌障害である。

本発明は、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤とボツリヌス神経毒素とを含む組成物、又はこの組成物を含む医薬組成物の、
・運動障害、ジストニア、頸部ジストニア、痙性斜頸、局所性ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、眼瞼障害、斜視、痙縮、脳性麻痺、限局性痙縮、四肢痙縮、攣縮、片側顔面攣縮、振戦、チック、歯ぎしり、失行症及びすくみ足、
・痙攣性発声障害、喉頭性ジストニア、顎口腔性発声障害、舌性ジストニア及び他の音声障害、アカラシア、嚥下障害、食道障害、胃不全麻痺、痙攣性結腸炎、神経因性膀胱、過活動膀胱、間質性膀胱炎、良性前立腺肥大症、排尿障害、便失禁、便秘、アニスムス、裂肛、子宮痛（月経困難症、性交疼痛症）、膣痛（膣痙、外陰部痛）、骨盤痛、坐骨海綿体筋（持続勃起症）、他の筋緊張障害並びに筋肉群の不随意運動を特徴とする他の障害、
・心房細動、
・流涙、多汗症（手、足及び脇の下）、流涎症、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸分泌、皮脂腺の過剰な産生（及びざ瘡等の関連状態）並びに他の分泌障害
の治療のための医薬品の製造のための使用にも関する。

本発明の最後の目的は、本発明の方法を実施するためのキットであって、針及び対応する注射器、又はより小さい針及び対応する注射器を含むキットに関する。好ましくは、針は２５～３０ゲージの針である。

当業者は、本発明の組成物の注入部位に応じて、針のサイズを選択することができる。

当該キットは、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ、特に（α１）_２β１δε又は（α１）_２β１δγ）、Ｍ１、Ｍ２又はＭ３ムスカリン性アセチルコリン受容体（ｍＡＣｈＲ）、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネル（ＣａＶ１．１及びＣａＶ１．２）、リアノジン受容体（ＲｙＲ）、特に骨格筋に存在するＲｙＲ１及び平滑筋又は心筋に存在するＲＹＲ２として知られる大コンダクタンスＣａ２^＋放出チャネル、電位依存性Ｎａ^＋（ＮａＶ）チャネル、特にＮａＶ１．４及びＮａｖ１．５等の電位依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ）、α１－又はβ１－アドレナリン受容体に対する結合特異性を有する少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤、すなわちシナプス後ペプチド又はシナプス後低分子と、ボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型、Ｂ型又はＥ型のボツリヌス神経毒素とをさらに含む。この少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤及びボツリヌス毒素は、バイアル中で一緒に混合されるか（凍結乾燥若しくは液体）、又は注入前にすぐに再構成するために２つのチャンバで提示されるか、又は２つの別々のバイアルで再構成され、次々に注入される。

以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態及び態様を説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものとして解釈されるものではない。

注射用ボツリヌス神経毒素組成物
ＢｏＮＴ／Ａ組成物
ＢｏＮＴ／Ａ組成物は、Ａ型ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ／Ａ）を含有する注射用製剤である。乾燥したＢｏＮＴ／Ａを製造者の指示に従って生理食塩水で再構成し、３３％のラット血清を補充する。実験にはＭｅｒｚＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの１５０ＫＤａの活性ボツリヌス毒素ＡＸＥＯＭＩＮ（登録商標）を使用する。ＢｏＮＴ／Ａの試験用量は２．５～５単位／ｋｇで、約１０～２０ｐｇ／ｋｇに相当する。

組み合わせ組成物
組み合わせ組成物は、Ａ型ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ／Ａ）と、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤とを含有する注射剤である。シナプス後ニューロン伝達阻害剤の性質に応じて、組み合わせ組成物の開発には異なるプロトコルが用いられる。

１．２．１シナプス後ペプチドを用いた組み合わせ組成物
乾燥したＢｏＮＴ／Ａを製造者の指示に従って生理食塩水で再構成する。乾燥したシナプス後ペプチドを、ラット血清を添加した生理食塩水で再構成し、ＢｏＮＴ／Ａの再構成溶液に加える。シナプス後ペプチドは、固相ペプチド合成で得るか、又はサプライヤーから購入する（α－ブンガロトキシンはＡｂｃａｍ（アブカム）から購入する）。実験に使用したシナプス後ペプチドの用量は、１～３５０μｇ／ｋｇの範囲である。

１．２．２シナプス後低分子を用いた組み合わせ組成物
乾燥したＢｏＮＴ／Ａを、製造者の指示に従って生理食塩水で再構成する。乾燥したシナプス後低分子を、生理食塩水、又は水、又は水／ＤＭＳＯで再構成し、これにはラットの血清を補充することができる。シナプス後低分子は、最後にＢｏＮＴ／Ａの再構成溶液に加える。シナプス後低分子は、サプライヤーから購入したものである（パンクロニウム、ダントロレン、アムロジピン、ニカルジピン、ベラパミル及びジルチアゼムはＡｂｃａｍから購入した）。実験に使用した低分子の用量は１～１２００μｇ／ｋｇの範囲である。

実験手順
指外転スコア（ＤＡＳ）
動物
実験は、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ（チャールス・リバー）／フランス、又はＪａｎｖｉｅｒＬａｂｓ（ジャンヴィエ・ラボ）／フランス、又はＥｎｖｉｇｏ（エンビゴ）／フランスから入手したＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（スプラーグドーリー）系の成体ラット（２００ｇ又は４００ｇ）を用いて行った。ラットは、使用前に少なくとも１週間、動物施設で自由に餌と水を摂取できるようにして馴化させた。特段の記載がない限り、各条件につき５匹のラットを使用した。他の実験は、上述のように入手して処置したＣＤ－１マウス（２０ｇ）を用いて行った。

動物の体重は、研究のあいだ、０日目、２日目、４日目、７日目、及び実験終了時まで週に１回記録する。

処置
動物に、１００μＬのハミルトンシリンジ（ＨａｍｉｌｔｏｎＳｙｒｉｎｇｅ）に取り付けた３０又は３３ゲージの針を用いて注射した（ラット１匹あたり１０μＬ又は２０μＬ）。実験の初日、注射の前に、齧歯動物を、ＤＡＳ反応が「ゼロ」になるように事前にスクリーニングした。その後、ラットの右前脛骨（ＴＡ）筋に筋肉内（ＩＭ）注射を行った。対照として、左ＴＡ筋には生理食塩水（１０μＬ）を注射した。

指外転スコアアッセイ（ＤＡＳ）
筋麻痺は、Ｂｒｏｉｄｅら（ＴＯＸＩＣＯＮ、２０１３、７１、１８－２４頁）が報告しているように、指外転スコア（ＤＡＳ）アッセイを用いて測定した。動物に対して、化合物注射後の異なる時間点で、指の外転を誘発してＤＡＳ反応を採点し、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、及び１日１回、連続する２日間の連続する２つの測定値が０（ＤＡＳ＝０）になるまで行った。処置について知らされていない２人の別々の観察者により、指の外転の程度を５段階で採点した（０＝正常～４＝指の外転が最大に減少、すなわち足の指が１本も外転しない）。

ラットのＤＡＳ試験で一般的に行われているように、ＤＡＳ反応は、ラットの胴体の周りを掴んで空中に持ち上げ、平らな表面に落下させることをシミュレートすることで誘発した。ラットは通常、反射的に後肢の指を広げて衝撃に備え、ＤＡＳ反応は、直ちに動物をリクライニングさせた状態で上向きにして採点した。

データ解析
上述のように、第１趾の外転消失が認められた場合、ＤＡＳスコアを「１」とした。３趾が結合している場合にＤＡＳスコアを「２」とした。４趾が結合している場合はスコアを「３」とし、右肢の５趾すべてが外転中にまとまっている場合は「４」のスコアをラットに与えた。

各時間点でのＤＡＳ反応を測定し、動態（筋力低下の発現及び効果の持続時間）を評価し、ラットの異なるグループで比較する。

ラットごとに、ＤＡＳ曲線下の面積（ＤＡＳ×時間の単位）を、Ｔ＝０～Ｔ＝２４時間（初期ＡＵＣ）、Ｔ＝２４～Ｔ＝１２０時間（中期ＡＵＣ）、及びＴ＝１２０時間～実験終了時（後期ＡＵＣ）の間で、一連のリーマン和を用いて算出した。

各群とも、作用の発現は平均ＤＡＳ値が１を超えた最初の時間点と定義し、作用の持続時間は平均ＤＡＳ値が１を超えた最後の時間点と定義し、作用のピークは平均ＤＡＳ値の最大値と定義した。

ＢｏＮＴ／Ａと電位依存性ナトリウムチャネルＮａＶ１．４に結合するシナプス後ペプチドとの組み合わせの作用
ＢｏＮＴ／Ａとμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチドとの組み合わせの薬力学的プロファイルをＢｏＮＴ／Ａ単独と比較して決定するために、ラットの右前脛骨（ＴＡ）筋に、０．４～４０μｇ／ｋｇの範囲の用量のμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチドと組み合わせた５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、及び５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ単独を注射した。この実験で使用したμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチドの配列は配列番号５４である。

図１の結果は、ＢｏＮＴ／Ａの作用の発現は注射後１２時間で、作用のピークは７２時間で３であることを示す。作用の持続時間は５日である。

より早い作用の発現
ＢｏＮＴ／Ａとμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチドとの組み合わせを注射すると、ＢｏＮＴ／Ａ単独の場合に比べて、作用の発現が著しく早くなる。作用の発現はμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃの用量に依存し、４０μｇ／ｋｇでは１時間の若干後、２０μｇ／ｋｇでは２時間の若干前、８μｇ／ｋｇでは４時間前後である。

ピークの上昇
作用のピークは、ＢｏＮＴ／Ａ単独の場合の３．４から、最高用量のμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃの存在下では４．０に上昇する。

持続時間の増加
上記組み合わせの作用の持続時間もＢｏＮＴ／Ａ単独の場合より長く、使用したμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃの用量に依存して、８μｇ／ｋｇでは１６８～１９２時間、２０μｇ／ｋｇでは１９２～２１６時間、４０μｇ／ｋｇでは２１６～２４０時間である（これに対して、ＢｏＮＴ／Ａ単独では１２０時間強）。

総合すると、これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａとμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃとの組み合わせにより、ＢｏＮＴ／Ａ単独と比較して、局所的な筋弛緩の発現が早く、筋弛緩効果がより強力になり、持続時間が長くなることを示す。

相乗効果
ＢｏＮＴ／Ａとμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃとを組み合わせたときに見られたＢｏＮＴ／Ａ効果の増強は、組成物の両成分の単なる相加的効果では説明できない。これらの結果は、図２に示されている。

ＢｏＮＴ／Ａとμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチドとの組み合わせの相乗効果を分析するために、この組み合わせをＢｏＮＴ／Ａ単独、及びμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃペプチド単独と比較した。５匹のラットのグループに、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと８０μｇ／ｋｇの用量のμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチドとの組み合わせ、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ単独、又は８０μｇ／ｋｇの用量のμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチドを右前脛骨（ＴＡ）筋に注射した。この実験で使用したμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチドの配列は配列番号５４である。

図２に示す結果は、ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳのピークは、注射後１２時間～２４時間に現れ、注射後７２時間に最大の平均スコア２．８が得られたことを示す。ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳは、４日目に低下し始めた。効果の持続性は、ＢｏＮＴ／Ａ注射後６日目まで認められた。μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチドの発現は、注射後０．５～１時間に観察され、注射後２時間に最大強度３．６が得られた。μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチド単独のＤＡＳは、注射後６時間という早い段階で低下し始めた。論理的には、両方の処置の計算された加算は２つのピークを示し、最初のピークは注射後２時間で、２番目のピークは注射後７２時間であった。注目すべきは、２つのピークの間のスコアは低いレベル（ＤＡＳ＜２）に戻ってくることである。驚くべきことに、ＢｏＮＴ／Ａとμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃとの組み合わせは、２つのピークを示さず、むしろ注射後２～６時間（発現）から１４４～１６８時間（持続）まで、持続的な筋弛緩を示す。ＢｏＮＴ／Ａとシナプス後のμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃとの組み合わせは、両成分の効果の加算よりも大きい、相乗効果を示す。

曲線下面積（ＡＵＣ、単位：ＤＡＳ×時間）を計算すると、相乗効果がよくわかる。

この表は、ＢｏＮＴ／Ａとμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃとの組み合わせの効果が、作用の発現（初期：１２３．４＞１００．８）、強度（中期：２４０＞１８０．３）、及び持続時間（後期：１０３．２＞３）に対して、両成分の効果を加算したものよりも大きいことを明らかにする。

ＢｏＮＴ／Ａとニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）に結合するコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤との組み合わせの作用
この例では、ＢｏＮＴ／Ａ、又はＢｏＮＴ／ＡとすべてｎＡＣｈＲに結合する３種のニューロン伝達のシナプス後阻害剤との組み合わせを注射したラットにおける局所的な筋弛緩の作用発現、強度及び持続時間を比較する。１グループにつき１匹のラットのみを処置した。

パンクロニウム
ＢｏＮＴ／Ａとパンクロニウムとの組み合わせと比較して、ＢｏＮＴ／Ａの作用の発現及び持続時間を判断するために、ラットに５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、又は５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと５７μｇ／ｋｇのパンクロニウムとの組み合わせを注射した。

図３に示す結果は、ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳのピークは、注射後１２時間～２４時間に現れ、７２時間後に最大スコア３．２が得られたことを示す。ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳは４日目に低下し始めた。ＢｏＮＴ／Ａの注射後７日目には、指の外転が完全に回復する。ＢｏＮＴ／Ａとパンクロニウムとの組み合わせの注射では、ＢｏＮＴ／Ａを用いた注射に比べてＤＡＳの発現が早く、発現は注射後５分～１５分で現れた。パンクロニウムの存在下では、ＤＡＳスコアの最大値も４．０に上昇する。最後に、筋弛緩の持続時間は、ＢｏＮＴ／Ａにパンクロニウムを加えることでわずかに増加する。注射後６日目でも指の外転が障害されている（ＤＡＳ＝２）のに対し、ＢｏＮＴ／Ａで処置したラットは回復し始めている（ＤＡＳ＜１）。

これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａとパンクロニウムとの併用により、ＢｏＮＴ／Ａ単独に比べて、局所的な筋弛緩の発現が早く、より強力な筋弛緩効果が得られ、作用の持続時間が長くなることを示す。

α－コノトキシンシナプス後ペプチド
ＢｏＮＴ／Ａとヤキイモ（Ｃｏｎｕｓｍａｇｕｓ）シナプス後ペプチドとの組み合わせと比較して、ＢｏＮＴ／Ａの作用の発現、強度及び持続時間を判断するために、ラットに５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、又は５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと８μｇ／ｋｇの配列番号８のα－コノトキシンＭＩペプチドとの組み合わせを注射した。

図３に示す結果は、ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳのピークは、注射後１２時間～２４時間に現れ、注射後７２時間に最大スコア３．２が得られたことを示す。ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳは４日目に低下し始めた。ＢｏＮＴ／Ａの注射後７日目には、指の外転が完全に回復する。ＢｏＮＴ／Ａとα－コノトキシンＭＩペプチドとの組み合わせの注射では、ＢｏＮＴ／Ａを用いた注射に比べてＤＡＳの発現が早く、発現は注射後２～４時間で現れた。α－コノトキシンＭＩペプチドの存在下では、ＤＡＳスコアの最大値も４．０に上昇する。最後に、筋弛緩の持続時間は、ＢｏＮＴ／Ａにα－コノトキシンＭＩペプチドを加えることで大幅に延長され、注射後１２日経っても指の外転がまだ回復しない。

これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａとα－コノトキシンＭＩペプチドとの併用により、ＢｏＮＴ／Ａ単独と比べて、局所的な筋弛緩の発現が早く、より強力な筋弛緩効果が得られ、作用の持続時間が長くなることを示す。

α－ブンガロトキシン
ＢｏＮＴ／Ａとブンガルス属（Ｂｕｎｇａｒｕｓ）毒素ペプチドとの組み合わせと比較して、ＢｏＮＴ／Ａの作用の発現及び持続時間を判断するために、ラットに５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、又は５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと１７μｇ／ｋｇの配列番号４のα－ブンガロトキシンペプチドとの組み合わせを注射した。

ラットごとに、注射後最初の１０分から１２日（２８８時間）までのいくつかの時間点でＤＡＳを記録した。図３に示す結果は、ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳのピークは、注射後１２時間～２４時間に現れ、注射後７２時間後に最大スコア３．２が得られたことを示す。ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳは４日目に低下し始めた。ＢｏＮＴ／Ａの注射後７日目には、指の外転が完全に回復する。ＢｏＮＴ／Ａとα－ブンガロトキシンとの組み合わせの注射では、ＢｏＮＴ／Ａを用いた注射に比べてＤＡＳの発現が早く、発現は注射後１５分～３０分で現れた。α－ブンガロトキシンの存在下では、ＤＡＳの最大値も４．０まで上昇する。最後に、筋弛緩の持続時間は、ＢｏＮＴ／Ａにα－ブンガロトキシンを加えることで４日間延長する。

これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａとα－ブンガロトキシンとの併用により、ＢｏＮＴ／Ａ単独に比べて、局所的な筋弛緩の発現が早く、より強力な筋弛緩効果が得られ、作用の持続時間が長くなることを示す。

データ全体は、ｎＡＣｈＲを標的としたニューロン伝達のシナプス後阻害剤を使用することにより、ボツリヌス毒素のより早い発現及び／又はより長い効果の持続時間及び／又は効果の増大が得られる可能性があることを示す。

ＢｏＮＴ／Ａとリアノジン受容体（ＲＹＲ１）に結合するコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤との組み合わせの作用
ダントロレン
ＢｏＮＴ／ＡとＲＹＲ１の公知の阻害剤であるダントロレンとの組み合わせと比較して、ＢｏＮＴ／Ａの作用の発現及び持続時間を判断するために、ラットに５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、又は５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと１．６μｇ／ｋｇのダントロレンとを組み合わせたものを注射した。

ラットごとに、注射後最初の１０分から１２日（２８８時間）までのいくつかの時間点でＤＡＳを記録した。図４に示す結果は、ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳのピークは、注射後１２時間～２４時間に現れ、注射後７２時間に最大スコア３．２が得られたことを示す。ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳは４日目に低下し始めた。ＢｏＮＴ／Ａの注射後７日目には、指の外転が完全に回復する。ＢｏＮＴ／Ａとダントロレンとの組み合わせの注射では、ＢｏＮＴ／Ａを用いた注射に比べてＤＡＳの発現が早く、発現は注射後２～４時間で現れた。ダントロレンの存在下では、ＤＡＳの最大値も４．０まで上昇する。最後に、筋弛緩の持続時間は、ＢｏＮＴ／Ａにダントロレンを加えることで大幅に遅れ、注射後１２日経っても指の外転がまだ回復しない。

これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａとダントロレンとの併用により、ＢｏＮＴ／Ａ単独に比べて、局所的な筋弛緩の発現が早く、より強力な筋弛緩効果が得られ、作用の持続時間が長くなることを示す。

殺虫毒素ＬａＩＴ１
ＢｏＮＴ／Ａと殺虫毒素ＬａＩＴ１との組み合わせと比較して、ＢｏＮＴ／Ａの作用の発現及び持続時間を判断するために、ラットに５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、又は５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ及び３６μｇ／ｋｇの配列番号２３のＬａＩＴ１ペプチドを注射した。

ラットごとに、注射後最初の１０分から１２日（２８８時間）までのいくつかの時間点でＤＡＳを記録した。図４に示す結果は、ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳスコアのピークは、注射後１２時間～２４時間に現れ、注射後７２時間に最大スコア３．２が得られたことを示す。ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳは４日目に低下し始めた。ＢｏＮＴ／Ａの注射後７日目には、指の外転が完全に回復する。ＢｏＮＴ／Ａと殺虫毒素ＬａＩＴ１との組み合わせの注射では、ＢｏＮＴ／Ａを用いた注射に比べてＤＡＳの発現が早く、発現は注射後２～６時間で現れた。殺虫毒素ＬａＩＴ１の存在下では、ＤＡＳの最大値も４．０に上昇する。最後に、筋弛緩の持続時間は、ＢｏＮＴ／Ａに殺虫毒素ＬａＩＴ１を加えることで５日遅れる。このようにして、ＢｏＮＴ／Ａのより長い作用の持続時間が得られる。

これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａと殺虫毒素ＬａＩＴ１との併用により、ＢｏＮＴ／Ａに比べて局所的な筋弛緩の発現が早く、より強力な筋弛緩効果が得られ、作用の持続時間が長くなることを示す。

データ全体は、ＲＹＲ１を標的としたニューロン伝達のシナプス後阻害剤を使用することにより、ボツリヌス毒素のより早い発現及び／又はより長い効果の持続時間及び／又は効果の増大が得られる可能性があることを示す。

ＢｏＮＴ／Ａと電位依存性ナトリウムチャネルＮａＶ１．４に結合する２種の密接に関連するコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤との組み合わせの作用
ＢｏＮＴ／Ａとμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチドとの組み合わせの薬力学的プロファイルを、ＢｏＮＴ／Ａとμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃの変異体ペプチドとの組み合わせの薬力学的プロファイルと比較した。この実験で使用した変異体ペプチドは、配列番号５３で定義されたコンセンサス配列と一致する配列（配列番号９５）を有しており、この実験で使用した野生型μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃペプチドの配列は配列番号５４である。この比較のために、ラットに、５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと２５μｇ／ｋｇの各μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃシナプス後ペプチドとを組み合わせたものを右前脛骨（ＴＡ）筋に注射した。対照ラットには５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａを単独で注射した。

結果は、効果の初期、中期及び後期の段階で曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって分析している。各期について、対照（ＢｏＮＴ／Ａ単独）に対するＡＵＣの増加率を比較の目的で提示する。図５に示す最終的な計算結果は、第一に、両方の組み合わせが作用の発現（初期ＡＵＣ）、作用の強度（中期ＡＵＣ）及び作用の持続時間（後期ＡＵＣ）を増加させることができ、すべてのパーセンテージが０％を超えることを示す。第二に、上記結果は、変異型との組み合わせが、野生型のμ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃとの組み合わせと比較してわずかに異なる薬理学的プロファイルを呈することを示す。前者の効果は初期及び後期に顕著であり、ピーク強度への影響はやや小さい。

データ全体は、シナプス後ペプチド阻害剤を、コンセンサス配列を共有するファミリーに分類することの利点を示す。一方で、ファミリー内のペプチドは類似の効果を共通して持つが、他方で、それらのわずかに異なる薬理学的プロファイルは、ドラッグデザインに有利に利用することができる。

ＢｏＮＴ／Ａと電位依存性Ｌ型カルシウムチャネル（Ｃａｖ１．１）に結合するコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤との組み合わせの作用
アムロジピン
ＢｏＮＴ／ＡとＣａｖ１．１の公知の阻害剤であるアムロジピンとの組み合わせと比較して、ＢｏＮＴ／Ａの作用の発現及び持続時間を判断するために、ラットに５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、又は５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと８３μｇ／ｋｇのアムロジピンとを組み合わせたものを注射した。

ラットごとに、注射後最初の１０分から１４日（３３６時間）までのいくつかの時間点でＤＡＳを記録した。図６に示す結果は、ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳのピークは、注射後２４時間～４８時間に現れ、注射後７２時間に最大スコア３．８が得られたことを示す。ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳは、４日目に低下し始めたが、１１日目までスコアは１を超えていた。ＢｏＮＴ／Ａとアムロジピンとの組み合わせの注射では、ＢｏＮＴ／Ａを用いた注射に比べてＤＡＳの発現が早く、発現は注射後２時間～４時間に現れた。アムロジピン存在下では、ＤＡＳの最大値も４．０まで上昇する。最後に、筋弛緩の持続時間は、ＢｏＮＴ／Ａにアムロジピンを加えることで遅れ、指外転スコアは１３日目まで１を超えて維持される。

これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａとアムロジピンとの併用により、ＢｏＮＴ／Ａ単独と比べて、局所的な筋弛緩の発現が早く、より強力な筋弛緩効果が得られ、作用の持続時間が長くなることを示す。

ジルチアゼム
ＢｏＮＴ／ＡとＣａｖ１．１の公知の阻害剤であるジルチアゼムとの組み合わせと比較して、ＢｏＮＴ／Ａの作用の発現及び持続時間を判断するために、ラットに５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、又は５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと８３μｇ／ｋｇのジルチアゼムとを組み合わせたものを注射した。

ラットごとに、注射後最初の１０分から１４日（３３６時間）までのいくつかの時間点でＤＡＳを記録した。図６に示す結果は、ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳのピークは、注射後２４時間～４８時間に現れ、注射後７２時間に最大スコア３．８が得られたことを示す。ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳは、４日目に低下し始めたが、１１日目までスコアは１を超えていた。ＢｏＮＴ／Ａとジルチアゼムとの組み合わせの注射では、ＢｏＮＴ／Ａを用いた注射に比べてＤＡＳの発現が早く、発現は注射後０．５時間～１時間に現れた。ジルチアゼムの存在下では、ＤＡＳの最大値も４．０まで上昇する。最後に、筋弛緩の持続時間は、ＢｏＮＴ／Ａにジルチアゼムを加えることで遅れ、指の外転スコアは１３日目まで１を超えて維持される。

これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａとジルチアゼムとの併用により、ＢｏＮＴ／Ａ単独と比べて、局所的な筋弛緩の発現が早く、より強力な筋弛緩効果が得られ、作用の持続時間が長くなることを示す。

ベラパミル
ＢｏＮＴ／ＡとＣａｖ１．１の公知の阻害剤であるベラパミルとの組み合わせと比較して、ＢｏＮＴ／Ａの作用の発現及び持続時間を判断するために、ラットに５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、又は５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａと８３μｇ／ｋｇのベラパミルとを組み合わせたものを注射した。

ラットごとに、注射後最初の１０分から１４日（３３６時間）までのいくつかの時間点で、ＤＡＳを記録した。図６に示す結果は、ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳのピークは、注射後２４時間～４８時間に現れ、注射後７２時間に最大スコア３．８が得られたことを示す。ＢｏＮＴ／ＡのＤＡＳは、４日目に低下し始めたが、１１日目までスコアは１を超えていた。ＢｏＮＴ／Ａとベラパミルとの組み合わせの注射では、ＢｏＮＴ／Ａを用いた注射に比べてＤＡＳの発現が早く、発現は注射後４～６時間で現れた。ベラパミルの存在下では、ＤＡＳの最大値も４．０まで上昇する。最後に、筋弛緩の持続時間は、ＢｏＮＴに誘発される筋弛緩の持続時間と同程度である。

これらのデータは、ＢｏＮＴ／Ａとベラパミルとの併用により、ＢｏＮＴ／Ａ単独に比べて、局所的な筋弛緩の発現が早く、より強力な筋弛緩効果が得られることを示す。

ＢｏＮＴ／Ａとコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤である低分子との組み合わせの作用：比較
ＢｏＮＴ／Ａとシナプス後阻害剤である低分子との組み合わせと比較して、ＢｏＮＴ／Ａの薬理学的プロファイルを判断するために、ラットに５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、又は５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａを様々な用量のいくつかの低分子と組み合わせたものを注射した。これらの分子は、ｎＡＣｈＲの公知の阻害剤（パンクロニウム、スキサメトニウム）、又はＲＹＲ１の公知の阻害剤（ダントロレン）、又はＣａｖ１．１の公知の阻害剤（アムロジピン、ジルチアゼム、ベラパミル）であった。結果は、実験の過程で曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することで分析している。比較のために、対照（ＢｏＮＴ／Ａ単独）に対するＡＵＣの増加率（％）を提示する。

図７に示す結果は、試験したすべての低分子が、ＢｏＮＴの筋弛緩の効果を高めることができることを示す。とりわけ、ダントロレンとＢｏＮＴとの組み合わせの効果は顕著である。

ＢｏＮＴ／Ａとコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤であるペプチドとの組み合わせの作用：比較
ＢｏＮＴ／Ａとシナプス後阻害剤であるペプチドとの組み合わせと比較して、ＢｏＮＴ／Ａの薬理学的プロファイルを判断するために、ラットに５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａ、又は５Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ａを様々な用量のいくつかのペプチドと組み合わせたものを注射した。これらの分子は、ｎＡＣｈＲの公知の阻害剤（α－ブンガロトキシン、α－コノトキシンＭＩ、ワグレリン－１、αＣ－コノトキシンＰｒＸＡ）、又はＲＹＲ１の公知の阻害剤（ＬａＩＴ１毒素、インペラカルシン）、又はＣａｖ１．１の公知の阻害剤（Ｕ７－クテニトキシンＰｎ１ｂ、ω－コノトキシンＴｘＶＩＩ、Ｕ６－クテニトキシンＰｎ１ａ、Ｕ９－クテニトキシンＰｎ１ａ、κ－クテニトキシンＰｎ１ａ、及びグラコントリファン）、又はＮａｖ１．４の公知の阻害剤（μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃ、μ－コノトキシンＧＩＩＩｂ、μ－トミトキシンＨｍｅ１ａ、μ－コノトキシンＧｖＩＩＪ、μＯ－コノトキシンＭｆＶＩＡ、及びμ－トミトキシンＨｍｅ１ｂ）であった。結果は、実験の過程で曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することで分析している。比較のために、対照（ＢｏＮＴ／Ａ単独）に対するＡＵＣの増加率（％）を提示する。

図８に示す結果は、試験したすべての低分子が、ＢｏＮＴの筋弛緩の効果を高めることができることを示す。とりわけ、α－コノトキシンＭＩとＢｏＮＴとの組み合わせの効果は顕著である。

・複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）
動物
実験は、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ、フランス、又はＪａｎｖｉｅｒＬａｂｓ、フランス、又はＥｎｖｉｇｏ、フランス、から入手したＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ系の成体ラット（２００ｇ）を用いて行った。ラットは、使用前に少なくとも１週間、動物施設で自由に餌と水を摂取できるようにして馴化させた。

動物の体重は、研究のあいだ、実験終了まで毎日記録した。

データ取得及び処置
・処置
動物に、１００μＬのハミルトンシリンジに取り付けた３３ゲージの針を用いて注射した（ラット１匹あたり２０μＬ）。その後、ラットの右前脛骨（ＴＡ）筋に筋肉内（ＩＭ）注射を行った。

・麻酔
ＣＭＡＰ測定のたびに、動物をイソフルランで麻酔する。麻酔前に、動物を３７℃の加熱プレート上に保って体温を制御し、生理食塩水で水分補給を行う（皮下注射による）。

・測定
測定のために、動物を加熱パッドの上に腹臥位にする。ＣＭＡＰ測定用の電極針を以下のように配置する。
・坐骨切痕の両側に模擬電極を皮下に配置する。
・前脛骨筋に沿わせて記録電極を皮下に配置する。
・アキレス腱の横に参照電極を皮下に配置する。
・模擬電極の反対側に接地電極を皮下に配置する。

ＣＭＡＰ測定は、Ｎａｔｕｓ（登録商標）ＵｌｔｒａＰｒｏＳ１００ＥＭＧデバイスを用いた刺激によって実施し記録する。

通常、この測定は、ベースライン測定のために注射の６日前に行い、化合物注射後の異なる時間点（２時間後、１日後、２日後、４日後、７日後、９日後、１１日後、及び１４日後）で行う。

データ解析
測定時には、潜時及び頂点間振幅という２つのパラメータを解析する。潜時は、刺激からＣＭＡＰ反応の発現までの遅延時間で決まる。頂点間振幅は、二相波の最大陰性頂点から最大陽性頂点までを測定する。次に、ＣＭＡＰの振幅は、測定時間の関数としてプロットすることができる。この曲線において、作用の発現は、抑制がベースラインの２０％より大きくなった時間点と定義し、活性の頂点は、最大の抑制（ベースラインのパーセント）と定義し、作用の持続時間は、ベースラインの２０％に回復するのに必要な時間と定義する。

すべてのデータは、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定でグループごとに比較し、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）検定で均質性を比較する。

・神経因性排尿筋過活動のインビボモデル
動物
実験は、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ、フランス、ＪａｎｖｉｅｒＬａｂｓ、フランス、又はＥｎｖｉｇｏ、フランス、から入手したＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ系の成体ラット（２００ｇ）を用いて行った。ラットは、使用前に少なくとも１週間、動物施設で自由に餌と水を摂取できるようにして馴化させた。この期間の後、動物はＴ８－Ｔ９脊髄切除を受けた。動物の体重は、研究のあいだ、実験終了まで毎日記録した。

処置
脊髄切断後１９日目に、神経因性の排尿筋過活動が確立された時点で、動物をイソフルランで麻酔し、膀胱を露出させて空にする。顕微鏡を用いて、溶液を入れたハミルトンシリンジに接続した３０Ｇ針を用いて排尿筋に注射する。注入される量は、膀胱三角を避けて４カ所又は８カ所の注射部位に分配させる。その後、カテーテルを膀胱のドーム内に挿入し、皮下に潜らせて首の後ろに外付けし、肩甲骨の間に縫合する。術後、ラットをゲンタマイシンで処置した。

測定
ラットの膀胱内圧測定は、排尿筋内注射後２４時間、４８時間、７日及び１４日の各時間点で行った。

まず、排尿及び充満のパラメータを分析した：排尿収縮の最大圧力（ミリメートル水銀ｍｍＨｇ）、注入量（膀胱容量：μＬ）、及び排尿効率（注入量に対する排尿量の比率％）。次に、非排尿収縮（充満期の３ｍｍＨｇを超える振幅の収縮）を分析した：振幅（ｍｍＨｇ）、頻度（１分あたりの回数）、及び非排尿期を誘発するための容積の閾値（全充満容積の％）。

データ解析
すべてのデータは、処置群ごとの平均±平均値の標準誤差で表した。外れ値の除外にはグラブス（Ｇｒｕｂｂ）の検定を用いる。各膀胱内圧測定パラメータについて、グループを比較するために分散分析を行い、その集計を可能にした。

・エキソビボ：膀胱モデル
動物
実験は、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ、フランス、ＪａｎｖｉｅｒＬａｂｓ、フランス、又はＥｎｖｉｇｏ、フランス、から入手したＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ系の成体ラット（２００ｇ）を用いて行った。ラットは、使用前に少なくとも１週間、動物施設で自由に餌と水を摂取できるようにして馴化させた。実験当日、ラットをイソフルランで麻酔し、失血させてから組織採取を行った。膀胱を採取して洗浄し、片方の膀胱から約６×２ｍｍの細片を２枚切り出し、カスタム電極組織ホルダーに固定し、通常ＫＨＢを充填してカルボゲンをバブリングしたオルガンバス（臓器槽）で３７℃、ｐＨ７．４の条件で０．５ｇまで収縮させる。膀胱の収縮力はアイソメトリック（等尺性）トランスデューサで測定する。約４５分間の平衡時間の後、１５分ごとにバッファを更新し、ＫＣｌ（通常７０ｍｍｏｌ／Ｌ）を加えて膀胱の完全性を保つ。カルバコール（アセチルコリン受容体を活性化する）の溶液を試験シナプス後受容体に作用させる（通常１０μｍｏｌ／Ｌ）。その後、連続パルスを用いた電界刺激により、排尿筋の収縮を誘発する。この刺激は、細片の両側に数ミリずつ配置した２つの白金電極を用いて生成した。

処置
集中的な洗浄及び安定した収縮を伴う期間の後、処置溶液をバス中に加える。処置液は様々な濃度のＢｏＮＴ／Ａを単独で、又はシナプス後の阻害剤と混合して含む。各細片を、１つの処置液のみにさらし、信号の９０％が消失するまで、又はこの値に達しない場合は６時間、信号を記録する。実験の最後に、カルバコールの最終添加を行い、組織の生存率を評価した。刺激後のカルバコール反応が、刺激前のカルバコール反応の８０％未満であった場合、実験を却下した。

データ解析
結果は、処置を加える直前の初期対照収縮のパーセンテージで表す。データは、個々のデータとして、又は平均値±平均値の標準誤差として表す。各グループの条件で濃度曲線をプロットした。統計解析には、対応のないスチューデントのｔ検定を行った。

Claims

ボツリヌス神経毒素組成物の効果を高める方法であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を前記ボツリヌス神経毒素組成物に添加する工程を含む方法。
前記ボツリヌス神経毒素組成物の効果を高めることが、前記ボツリヌス神経毒素組成物の作用の発現を促進すること、及び／又は作用の持続時間を延長すること、及び／又は作用の強度を高めることである請求項１に記載の方法。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を含む前記ボツリヌス神経毒素組成物の作用の発現が、コリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を含まないボツリヌス神経毒素組成物の作用の発現と比較して、５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％早く起こる請求項１又は請求項２に記載の方法。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を含む前記ボツリヌス神経毒素組成物の作用の持続時間が、コリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を含まないボツリヌス神経毒素組成物の作用の持続時間と比較して、１０％、２５％、５０％、１００％又はそれより長く延長される請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を含む前記ボツリヌス神経毒素組成物の作用の強度が、コリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を含まないボツリヌス神経毒素組成物の作用の最大強度と比較して、少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％高められる請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法を実施するのに適した組成物であって、少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤と、ボツリヌス神経毒素とを含む組成物。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤が、骨格筋細胞によって発現される少なくとも１種の受容体に特異的に結合し、前記受容体が、（α１）_２β１δε ｎＡＣｈｒ、（α１）_２β１δγ ｎＡＣｈｒ、ＲｙＲ１、ＣａＶ１．１及びＮａｖ１．４を含むか又はそれらからなる群から選択される請求項６に記載の組成物。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤が、Ｍ３ｍＡＣｈｒ、ＲｙＲ２、ＣａＶ１．２及びＮａｖ１．５を含むか又はそれらからなる群から選択される、平滑筋細胞によって発現される少なくとも１種の受容体に特異的に結合する請求項６に記載の組成物。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤が、心筋細胞によって発現される少なくとも１種の受容体に特異的に結合し、前記受容体が、Ｍ２ｍＡＣｈｒ、ＲｙＲ２、ＣａＶ１．１、ＣａＶ１．２及びＮａｖ１．５を含むか又はそれらからなる群から選択される請求項６に記載の組成物。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤が、分泌腺細胞によって発現される少なくとも１種の受容体と特異的に結合し、前記受容体が、Ｍ１ｍＡＣｈＲ、Ｍ３ｍＡＣｈＲ、α_１アドレナリン受容体及びβ１アドレナリン受容体を含むか又はそれらからなる群から選択される請求項６に記載の組成物。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤が、シナプス後ペプチド及び／又はシナプス後低分子である請求項６から請求項１０のいずれか１項に記載の組成物。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤が、α－コノトキシンＭＩ、μ－コノトキシンＣｎＩＩＩｃ、若しくはそれらの誘導体、パンクロニウム、ダントロレン、又はそれらの組み合わせである請求項６から請求項１１のいずれか１項に記載の組成物。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤が、速発性シナプス後ペプチド及び／又は速発性シナプス後低分子である請求項６から請求項１２のいずれか１項に記載の組成物。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤が、ボツリヌス神経毒素の遅発性に適合する請求項６から請求項１２のいずれか１項に記載の組成物。
前記ボツリヌス神経毒素が、Ａ型、Ｂ型、Ｅ型、又はＡ型、Ｂ型、Ｅ型ボツリヌス神経毒素の重鎖及び軽鎖の組み合わせである請求項６から請求項１４のいずれか１項に記載の組成物。
しわ、眉間の線等の線、又は溝、美容目的のための筋肉のボリューム（咬筋又はふくらはぎ等）、肥厚性瘢痕及び他の皮膚科学的状態を軽減する等の美容的治療に使用するための請求項６から請求項１５のいずれか１項に記載の組成物。
（ｉ）運動障害、ジストニア、頸部ジストニア、痙性斜頸、局所性ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、眼瞼障害、斜視、痙縮、脳性麻痺、限局性痙縮、四肢痙縮、攣縮、片側顔面攣縮、振戦、チック、歯ぎしり、失行症及びすくみ足を含む骨格筋障害、並びに（ｉｉ）これらの障害に伴う疼痛の治療に使用するための請求項６から請求項１５のいずれか１項に記載の組成物。
（ｉ）痙攣性発声障害、喉頭性ジストニア、顎口腔性発声障害、舌性ジストニア及び他の音声障害、アカラシア、嚥下障害、食道障害、胃不全麻痺、痙攣性結腸炎、神経因性膀胱、過活動膀胱、間質性膀胱炎、良性前立腺肥大症、排尿障害、便失禁、便秘、アニスムス、裂肛、子宮痛（月経困難症、性交疼痛症）、膣痛（膣痙、外陰部痛）、骨盤痛、坐骨海綿体筋（持続勃起症）、他の筋緊張障害並びに筋肉群の不随意運動を特徴とする他の障害を含む平滑筋障害、並びに（ｉｉ）これらの障害に伴う疼痛の治療に使用するための請求項６から請求項１５のいずれか１項に記載の組成物。
心房細動を含む心筋細胞障害の治療に使用するための請求項６から請求項１５のいずれか１項に記載の組成物。
流涙、手、足及び脇の下の多汗症、流涎症、過剰な唾液分泌、過剰な胃腸分泌、皮脂腺の過剰な産生、ざ瘡、並びに分泌障害を含む分泌腺障害の治療に使用するための請求項６から請求項１５のいずれか１項に記載の組成物。
請求項１６から請求項２０のいずれか１項に記載の使用のための請求項６から請求項１５のいずれか１項に記載の組成物であって、コリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤を含まないボツリヌス神経毒素組成物と比較して、作用の発現が促進され、かつ／又は作用の持続時間が延長され、かつ／又は作用の強度が高められる組成物。
前記少なくとも１種のコリン作動性ニューロン伝達のシナプス後阻害剤（ＰｏＮＴ）及びボツリヌス神経毒素が組み合わせて投与されるが、ただしＰｏＮＴ活性の減衰が起こる前に前記ボツリヌス神経毒素が投与される請求項６に記載の組成物。