KR20200040719A

KR20200040719A - 효능 지속시간이 연장된 보툴리눔 독소 조성물

Info

Publication number: KR20200040719A
Application number: KR1020200040686A
Authority: KR
Inventors: 김대익; 서인라
Original assignee: 한국프라임제약주식회사
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2020-04-20
Also published as: KR20190038292A; EP3689368A4; US20210077596A1; WO2019066227A1; EP3689368A1

Abstract

본 발명은 안전성이 증가되고 부작용이 감소된 신규한 보툴리눔 독소 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 보툴리눔 독소에 아연을 첨가하여 제조된다. 보툴리눔 독소 및 아연을 포함하는 본 발명의 조성물을 랫트에 근투여한 결과, 랫트의 생존률이 증가하였을 뿐만아니라 독소 효능의 지속시간이 크게 연장된 것으로 확인되었다.

Description

효능 지속시간이 연장된 보툴리눔 독소 조성물 {A novel botulinum toxin composition having a prolonged period of action}

본 발명은 보툴리눔 독소를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 안전성과 효능이 증가되고 효능 지속시간이 연장된 보툴리눔 독소 조성물에 관한 것이다.

보툴리눔 독소는 혐기성, 그램양성 박테리아인 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)으로부터 생성되며, 강력한 폴리펩티드 신경독이다. 이러한 신경독은 사람 및 동물에서 신경마비 질환을 유발한다. 클로스트리디움 보툴리눔은 토양에서 발견되나, 제대로 살균처리 되지 않고 밀봉된 식품용기 중에서 배양될 수 있다. 보툴리눔 독소는 콜린성 운동뉴런에 대해 높은 친화도가 있으며, 뉴런으로 들어가 아세틸콜린의 시냅스전 방출을 억제하는 것으로 알려졌다. 보툴리눔 독을 섭취하면, 여러 장애, 예를 들어, 보행장애, 연하장애 및 언어장애 증상이 나타나고, 호흡근육의 마비로 인해 죽음에 이를 수 있다. 특히, 보툴리눔 독소 타입A는 치명적이다. 몰량을 기준으로, 보툴리눔 독소 타입A는 디프테리아의 18억배, 시안화나트륨의 6억배, 코브로톡신 (cobrotoxin)의 3천만배, 및 콜레라의 1천2백만배 정도로 치명적이다 (Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, page 63-84(chapter 4) of Natural Toxins II, edited by B.R.Sigh et al., Plenum Press, New York(1976).

보툴리눔 신경독은 혈청형 (serotype) A, B, C1, D, E, F 및 G로 구분된다. 보툴리눔 독소 타입A는 미국 식품의약청에 의해서, 12세 이상 환자에서의 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료에 사용되는 것이 허가되었다. 말초 근육 내 주사된 보툴리눔 독소 타입A의 임상효과는 보통 주사 후 1주 내에 나타난다. 1회 보툴리눔 독소 타입A의 근육 내 주사에 의한 효과의 지속시간은 일반적으로 약 3개월이다. 일반적으로, 보툴리눔 독소 1 유닛 (U)은, 체중이 각각 18 ~ 20 g인 암컷 스위스 웹스터 마우스 (Swiss Webster mice)에 복강 내 주사를 통한 LD₅₀로서 정의할 수 있다.

모든 보툴리눔 독소 혈청형이 신경근 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 여겨지지만, 이들은 상이한 신경분비성 단백질에서 작용한다. 보툴리눔 독소 타입A는 특이적으로 세포내, 소포 (vesicle) 관련 단백질 SNAP-25의 펩티드 결합을 가수분해할 수 있는, 아연 엔도펩티다아제이다. 보툴리눔 독소 타입A는 랫트에서 보툴리눔 독소 타입B 보다 500배 더 강력하다. 또한, 보툴리눔 독소 타입B는 타입A 독소의 영장류 LD₅₀의 약 12배 인, 480 U/kg의 투여량에서 영장류에서 무독성이다. 보툴리눔 독소는 결합된 비-독소 단백질 (non-toxin protein)과 함께 약 150 kD의 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 독소 복합체의 성분이다. 약제학적 조성물 제조에 사용하기에 적합한, 미리 제조 및 정제된 보툴리눔 독소 및 독소 복합체는 메타바이오로직스 (Metabiologics, Inc., U.S.A), 및 리스트 바이오로지컬 래보로토리 (List Biological Laborotories, Inc., Campbell, Califonia; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.)사 등으로부터 입수할 수 있다. 순수한 보툴리눔 독소는 불안정하며, 독소 타입A 복합체와 같은 보툴리눔 독소 복합체는 표면변성, 열 및 알칼리 조건으로 인한 변성에 매우 민감하다.

보툴리눔 독소는 미용 상태, 안검연축, 편측안면 연축, 연축 사경, 경직, 근육긴장이상, 편두통, 요통, 경추 질환, 사시, 다한증 및 과다침분비 등을 포함한 매우 다양한 기능을 갖는 바, 보툴리눔 독소의 의약적 용도에 대한 활발한 연구가 수행되고 있다. 또한, 보툴리눔 독소를 포함하고 안전성 및 안정성이 증대된 제형에 관한 연구도 꾸준히 수행되고 있다. 한국특허공개 제10-2008-0050636호는 보툴리눔 신경독소를 포함하는 치료조성물을 기술하고 있고, 한국특허공개 제10-2007-0110402호는 보툴리눔 독소의 국소적용 및 경피전달을 위한 조성물을 기술하고 있다. 또한, 한국 특허출원 제10-2017-0089798호는 히알루론산 필러와 보툴리눔 독소를 함께 사용하여 독소 효력의 지속시간을 연장한 것을 기술하였다. 한국특허공개 제10-2015-0057327호는 활성 단백질 제제 (active protein agent) 예를 들어, 보툴리눔을 콜라겐, 엘라스틴, 단쇄 알코올, 장쇄 알코올, 또는 폴리알코올, 아민 및 아미드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 흡수증진제와 함께 계면활성제, 용매 및 안정화제의 조합에 의한 인지질 미셀 (micelle)에 캡슐화 하여 장기간 동안 안정화한 것이 기술되어 있다.

이와 같이, 보툴리눔 독소는 극미량으로도 치명적인 독성을 나타내고, 부작용을 초래할 수 있는 바, 본 발명자들은 보툴리눔 독소의 안전성을 증대시키고 활성 지속시간을 연장하면서도 부작용을 감소시키기 위해 부단한 노력을 계속하였다. 그 결과, 놀랍게도 보툴리눔 독소 조성물에 아연을 첨가한 경우 보툴리눔 독소 효능의 지속시간이 연장되고 부작용이 크게 감소한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국특허공개 제 10-2008-0050636호 한국특허출원 제 10-2017-0089798호 한국특허공개 제 10-2015-0057327호

본 발명은 안전성 및 효능이 증가되고 효능 지속시간이 연장된 신규한 보툴리눔 독소 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 보툴리눔 독소 및 아연을 포함하는 보툴리눔 독소 조성물을 제공한다.

본 발명의 실시예에서, 아연 첨가량을 달리하면서 보툴리눔 독소 효능의 지속시간을 관찰하였다. 단계적으로 증가된 양의 아연을 포함하는 보툴리눔 독소 조성물 시료를 제조하고 랫트에 투여한 후, 독소 효능의 지속시간을 확인하였다. 그 결과 첨가되는 아연의 함량이 따라 보툴리눔 독소 효능의 지속시간이 증가된 것이 확인되었다. 보툴리눔 독소 효능의 지속시간 연장을 위해 첨가되는 아연의 양은 보툴리눔 독소 100 유닛 (U)에 대해 바람직하게는 0.001 mM/100U ~ 3.0 mM/100U이며, 더욱 바람직하게는 0.001 mM/100U ~ 0.33 mM/100U이다. 따라서, 보툴리눔 독소 유닛 (U)당 보툴리눔 독소 효능의 지속시간 연장을 위해 첨가되는 아연의 양은 바람직하게는 0.01 μM/U ~ 30 μM/U이며, 더욱 바람직하게는 0.01 μM/U ~ 3.3μM/U이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "보툴리눔 독소 (botulinum toxin)"는 세균 또는 재조합에 의해 생성되는 모든 혈청형 (serotype) 및 이것의 변이체 또는 융합 단백질을 포함하여 약 150 kD의 보툴리눔 독소 단백질 분자를 의미한다. 보툴리눔 독소 혈청형은 예를 들어, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)와 Metabiologics, Inc. (Madison, Wisconsin) 등으로부터 입수할 수 있다. 상기 다른 혈청형의 보툴리눔 독소는 대상 동물, 효능 및 지속기간에 있어 상이하다.

본 발명의 조성물에서 사용되는 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 유도체를 포함한다. 보툴리눔 독소 유도체는 보툴리눔 독소 활성을 갖는 천연 보툴리눔 독소 또는 재조합 원형 보툴리눔 독소의 일부 또는 일부 사슬 상에 하나 이상의 화학적 또는 기능적 변형을 포함하는 유도체 일 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 유도체는 결실, 변형 또는 치환된 하나 이상의 아미노산을 갖는 변형된 독소 일 수 있다. 본 발명에서 보툴리눔 독소는 재조합 펩티드, 융합 단백질, 또는 예를 들어, 상이한 독소 혈청형의 서브유닛 또는 도메인으로부터 제조된 하이브리드 신경독소일 수 있다. 보툴리눔 독소는 또한 독소 활성을 갖는 전체 분자의 일부일 수 있으며, 이것의 조합 또는 컨쥬게이션된 분자, 예를 들어, 융합 단백질의 일부로서 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 보툴리눔 독소의 투여를 필요로 하는 인간 또는 다른 포유동물의 피부, 상피, 피내 (ID, intradermal), 피하 (SC, subcutaneous), 근육 (IM, intramuscular)로 적용될 제품의 형태로 존재하나 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 "필요로 하는"은 약학적 또는 건강상 필요, 예를 들면, 안면 근육 경련을 포함하는 증상을 치료할 필요성, 및 미용적 및 주관적 필요성, 예를 들면, 안면 조직의 외형을 변형시키거나 또는 개선할 필요성을 모두 포함하도록 의도된다. 일반적으로, 조성물은 보툴리눔 독소 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하는 것에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 용액, 에멀젼 (마이크로에멀젼 포함), 현탁액, 크림, 로션, 겔, 분말, 또는 본 발명의 조성물이 이용될 수 있는 피부 또는 기타 조직으로의 적용을 위해 이용되는 다른 고형 또는 액상 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 보툴리눔 독소 외에, 일반적으로 이용되는 다른 성분들, 예를 들어 항균제 (antimicrobial), 보습제 및 수화제, 투과제(penetration agent), 보존제, 유화제 (emulsifier), 천연 또는 합성 오일, 용매, 계면활성제, 디터전트, 겔화제, 연화제 (emollient), 항산화제, 방향제, 충진제 (filler), 증점제 (thickner), 왁스, 탈취제 (odor absorber), 염료, 착색제, 분말, 점도 조절제 및 물을 포함할 수 있으며, 선택적으로 마취제, 항-소양증제(antiitch actives), 식물 추출물, 컨디셔닝제 (conditioning agent), 흑화제 (darkening agent) 또는 미백제 (lightening agent), 글리터 (glitter), 습윤제 (humectant), 운모 (mica), 미네랄, 폴리페놀, 실리톤 또는 그의 유도체, 차광제(sunblock), 비타민, 및 약용식물 (phytomedicinal)을 포함할 수 있다. 보툴리눔 독소는 마비 또는 이완 유발, 수축 경감, 경련의 예방 또는 경감, 선 배출량 (glandular output)의 감소 또는 기타 효과를 얻기 위한 유효량으로, 피하 근육 또는 피부 내 선 구조 (glandular structure)에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 보툴리눔 독소의 유효량이 투여되고 효능이 장시간 유지되도록 적용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유효량 (effective amount)"은 목적하는 근육 마비 또는 다른 생물학적 또는 미용적 효과를 생성하기에 충분하나, 내재적으로 안전한 양, 즉, 심각한 부작용을 방지할 정도로 충분히 낮은 보툴리눔 독소의 양을 의미한다. 목적하는 효과는 예를 들어, 잔주름 (fine lines) 및/또는 주름을 감소시키거나 구각 (corner of the mouth)을 높이는 것과 같은 다른 방식으로 안면의 외형을 조정하거나, 또는 근육 긴장의 전반적인 완화 (general relief)를 목적으로 한 일부 근육의 이완을 포함한다. 본 발명의 조성물은 단일 투여 적용을 위해 적합한 투여량의 보툴리눔 독소를 포함하거나, 또는 투여 부위에서 희석을 위해, 또는 복수 적용으로의 사용을 위해 보다 농축된 것일 수 있다. 보툴리눔 독소는 다리, 어깨, 등 (허리 포함), 액와, 손바닥, 발, 목, 서혜부 (groin), 손등 또는 발등, 팔꿈치, 상완, 무릎, 상지 (upper leg), 둔부, 몸체 (torso), 골반, 또는 보툴리눔 독소의 투여가 바람직한 신체의 기타 부위로 이루어질 수 있다. 보툴리눔 독소의 투여는 또한 신경통의 치료, 편두통 또는 기타 두통의 예방 또는 경감, 여드름의 예방 또는 경감, 근육긴장이상 (dystonia) 또는 근육긴장이상 수축(자각적 또는 임상적)의 예방 또는 경감, 주관적 또는 임상적 다한증과 관련된 증상의 예방 또는 경감, 과다분비 또는 발한의 경감, 면역 반응의 감소 또는 강화, 또는 주사에 의한 보툴리눔 독소의 투여가 제안되거나 또는 수행되는 기타 상태의 치료를 포함하나, 이에 한정되지 않는 기타 상태를 치료하기 위해 수행될 수 있다.

본 발명은 보툴리눔 독소 조성물로서, 안전성이 증가되고, 효능 지속시간이 연장되며, 부작용이 크게 감소된 조성물을 제공한다. 본 발명의 보툴리눔 독소 조성물은 보툴리눔 독소의 투여가 필요한 환자로서 높은 안전성 (safety)이 요구되는 피험자에게 투여될 수 있어, 보툴리눔 독소의 적용도를 넓힐 수 있다.

도 1 내지 도 4는 다른 농도의 아연을 함유하는 보툴리눔 독소 조성물을 랫트에 투여하고, 보툴리눔 독소 효능의 지속시간을 확인한 것이다.

이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위한 것일 뿐, 이들 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예: 아연첨가에 의한 보툴리눔 독소 효능의 증대 확인

보툴리눔 독소의 효능에 아연이온이 어떠한 영향을 미치는지를 분석하기 위해, 보툴리눔 독소를 투여 한 후 근육마비를 측정하였다 (Ron S. Broide et al., Toxicon, 2013, 71; 18 ~ 24). 먼저 다양한 농도의 아연 (ZnCl₂)이 첨가된 보툴리눔 독소 조성물을 준비하였다. 보툴리눔 독소 조성물은 메타바이오로직스사에서 구입한 2.7 x 10⁵LD₅₀ U/㎍ (1 ㎍/㎖) 농도의 보툴리눔 독소를 PBS (Phosphate Buffered Saline)에 희석하여 제조하였다. 상기 제조된 보툴리눔 독소 조성물에 아연 (ZnCl₂, Sigma사로부터 구입)을 다음과 같이 3개 그룹으로 구분된 단계적으로 증가된 양의 아연을 첨가하여 보툴리눔 독소 조성물 시료를 제조하였다. 각 그룹에서 실험에 사용한 아연 첨가량은 다음과 같다: 제1 그룹 - 0.33 mM/100U, 3.33 mM/100U 또는 33.3 mM/100U; 제2 그룹 - 0.03 mM/100U, 0.33 mM/100U 또는 3.3 mM/100U; 제3 그룹 - 0.5 mM/100U, 1 mM/100U 또는 2 mM/100U; 및 제4 그룹 - 0.001 mM/100U, 0.0033 mM/100U, 0.01 mM/100U, 0.03 mM/100U 또는 0.33 mM/100U. 상기 4개 그룹 모두에 대해, 대조군 시료는 독소를 PBS로 희석한 것을 사용하였다. 동물실험을 위해 SD (Sprague-Dawley) 랫트 (오리엔트바이오, 6주령, 암컷, 160 ~ 180g)를 5마리씩 4개 그룹으로 구분하였다. 상기 준비한 보툴리눔 독소 조성물 시료를 각 그룹의 랫트에 대해 각각 30 U/Kg의 농도로 우하지근육내로 100 ㎕씩 투여하였다. 상기 시료를 1회 투여하였으며, 투여 후 60일 가까이 발가락외전지수 (Digit Abduction Score (DAS) assay)를 관찰하였다. 발가락 외전지수는 아래의 표 1 (발가락외전지수 (Digit Abduction Score (DAS) assay))을 기준으로 측정하였다. 그 결과를 각각 도 1, 도 2, 도 3 및 도 4에 나타냈다.

DAS Score	증상
0	정상
1	엄지발가락의 외전이 일어남
2	엄지, 검지 발가락의 외전이 일어남
3	새끼발가락 이외의 발가락의 외전이 일어남
4	5개 발가락이 모두 외전이 일어나 모든 발가락이 모여 있음

도 1에서, 단계적으로 증가된 양 (0.33 mM/100U, 3.33 mM/100U 또는 33.3 mM/100U)의 아연을 첨가하여 보툴리눔 독소 조성물 시료를 제조한 후, 상기 방법으로 보툴리눔 독소 효능의 지속력을 분석하였다 (제1 그룹). 그 결과, 0.33 mM/100U에서는 보툴리눔 독소의 효능을 증대시켰으나, 그 이상의 다른 농도에서는 아연 첨가가 독소의 효능 증대와 무관함을 확인하였다. 도 2에서, 단계적으로 증가된 양 (0.03 mM/100U, 0.33 mM/100U 또는 3.3 mM/100U)의 아연을 첨가하여 보툴리눔 독소 조성물 시료를 제조한 후, 상기 방법으로 보툴리눔 독소 효능의 지속력을 분석하였다 (제2 그룹). 그 결과, 아연 농도 0.03 mM/100U 및 0.33 mM/100U 에서는 첨가된 아연이 보툴리눔 독소의 효능을 증대시켰으나, 3.3 mM/100U에서는 아연첨가가 독소 효능의 증대와 무관하였다.

또한, 도 3에서, 단계적으로 증가된 양 (0.5 mM/100U, 1 mM/100U 또는 2 mM/100U)의 아연을 첨가하여 보툴리눔 독소 조성물 시료를 제조한 후, 상기 방법으로 보툴리눔 독소 효능의 지속력을 분석하였다 (제3 그룹). 그 결과, 아연 농도 0.5 mM/100U, 1 mM/100U 또는 2 mM/100U에서 독소의 효능 증대와 관련이 없는 것으로 나타났다.

또한, 도 4에서, 단계적으로 증가된 양 (0.001 mM/100U, 0.0033 mM/100U, 0.01 mM/100U, 0.03 mM/100U 또는 0.33 mM/100U)의 아연을 첨가하여 보툴리눔 독소 조성물 시료를 제조한 후, 상기 방법으로 보툴리눔 독소 효능의 지속력을 분석하였다 (제4 그룹). 그 결과, 아연 농도 0.001 mM/100U 이상 0.33 mM/100U 이하에서 보툴리눔 독소의 효능이 증대됨을 확인하였다.

본 발명에 따르면 아연첨가에 의해 독소 효능의 지속시간을 현저히 증가시킨 보툴리눔 독소 조성물이 제공된다. 본 발명의 보툴리눔 독소 조성물은 미용 또는 의료 목적, 또는 질환의 예방 또는 치료 목적에서 보툴리눔 독소를 투여하는 것을 필요로 하는 피험자를 위한 다양한 기능의 조성물을 제조하는데 폭넓게 이용될 수 있을 것이다.

Claims

보툴리눔 독소 및 아연을 포함하여, 생체 내에서 증가된 보툴리눔 독소 효능 지속시간을 갖는, 보툴리눔 독소 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 아연이 보툴리눔 독소 유닛 (U)에 대해 0.01 μM/U 내지 30 μM/U의 양으로 포함되는 것인, 보툴리눔 독소 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 아연이 보툴리눔 독소 유닛 (U)에 대해 0.01 μM/U 내지 5 μM/U의 양으로 포함되는 것인, 보툴리눔 독소 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C1, D, E, F 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 보툴리눔 독소 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A인 것인, 보툴리눔 독소 조성물
보툴리눔 독소를 포함하는 조성에 대해 아연을 가하는 것을 포함하여, 생체 내에서 증가된 보툴리눔 독소 효능 지속시간을 갖는 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 아연이 보툴리눔 독소 유닛에 대해 0.01 μM/U 내지 30 μM/U 의 양으로 포함되는 것인, 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 아연이 0.01 μM/U 내지 5 μM/U의 양으로 포함되는 것인, 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C1, D, E, F 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A인 것인, 보툴리눔 독소 조성물을 제조하는 방법.