KR20150057327A

KR20150057327A - 국소 투여용 안정화된 단백질 조성물 및 이를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20150057327A
Application number: KR1020130140547A
Authority: KR
Inventors: 판카즈 모디
Original assignee: 트랜스더멀 코퍼레이션
Priority date: 2013-11-19
Filing date: 2013-11-19
Publication date: 2015-05-28

Abstract

본 발명은 활성 성분의 국소(topical) 또는 경피 투여를 위한, 또한 투과를 증진시키는 안정화 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 콜라겐, 엘라스틴, 스핑고신 및 세레브로시드를 포함한다. 또한 본 발명은 안정화 조성물 및 활성화제의 유효량을 포함하는 약학 또는 화장품 제형(formulation)뿐만 아니라 활성화제를 국소적으로 또는 경피적으로 투여하는 방법을 제공한다.

Description

국소 투여용 안정화된 단백질 조성물 및 이를 제조하는 방법{STABILIZED PROTEIN COMPOSITIONS FOR TOPICAL ADMINISTRATION AND METHODS OF MAKING SAME}

본 발명은 약학 조성물에서 활성 성분을 안정화시켜 활성 성분의 유효성(availability)을 증진시키면서 연장된 저장 수명(shelf-life)을 제공하는 방법에 관한 것이다.

저장 안정성 및 취급의 편의를 위하여, 단백질성 약학 조성물은 주로 동결건조된(lyophilized)(즉 동결건조된(freeze dried)) 또는 진공 건조된 분말로서 제형화되고(formulated) -10℃ 내지 4℃ 사이의 저온에서 저장된다. 건조 분말은 환자에게 투여되기 전에 적합한 유체, 예컨대 염수(saline) 또는 물로 재구성(reconstituted)된다. 대안적으로, 단백질성 약학 조성물은 단백질 분해를 방지하기 위한 안정화제를 포함하는 수용액 또는 현탁액으로 제형화될 수 있다. 그러나, 많은 단백질들은 안정화시키기 매우 어려우며, 따라서 제형화, 재구성 및/또는 저장 기간 중의 단백질 및/또는 단백질 활성의 손실을 야기한다. 안정성 문제는 단백질 변성, 분해, 이합체화, 및/또는 중합의 결과로서 일어날 수 있다. 다양한 부형제, 예컨대 알부민 및 젤라틴이 약학 조성물 중의 단백질 활성 성분을 시도하고 안정화하기 위해 상이한 성공 정도로 사용되어왔다. 알코올과 같은 동해방지제는 동결건조의 동결 조건 하의 단백질 변성을 감소시키기 위해 사용된다. 안정화제는 표면, 예컨대 약학 조성물이 재구성되는 실험실 유리제품, 용기(vessels), 바이알(vial)의 표면, 또는 약학 조성물을 주사하는 데 사용되는 시린지(syringe)의 내부 표면으로의 단백질 활성 성분의 접착을 감소시킴으로써 작동할 수 있다. 단백질 활성 성분의 표면으로의 접착은 활성 성분의 손실을 야기하고 또한 남아있는 보유 단백질 활성 성분의 변성에 기여할 수 있으며, 이 두 가지 모두는 약학 조성물에 존재하는 활성 성분의 총 활성을 감소시킨다. 안정화제는 또한 활성 성분의 저 희석 용액의 제조에서 일어날 수 있는 활성 성분의 변성을 감소시킬 수 있다. 조성물의 단백질을 안정화시킬 수 있는 것뿐만 아니라, 이상적인 안정화제는 인간 환자에게 주사되는 경우 무시 가능한 정도의 면역원성을 가져야 한다.

순수한 보툴리눔 독소는 매우 불안정하여 약학 조성물을 제조하는 데 제한된실제적 유용성을 가진다. 보툴리눔 독소 복합체, 예컨대 독소 A형 복합체는 표면 변성, 열, 및 알칼리 조건으로 인한 변성에 극히 민감하다. 비활성화된 독소는 면역원성일 수 있는 톡소이드(toxoid) 단백질을 형성한다. 이로 인한 항체는 환자가 독소 주사에 불응성(refractory)이 되도록 할 수 있다. 일반적으로 효소와 같이, 보툴리눔 독소의 생물학적 활성은, 적어도 부분적으로, 이의 3차원 입체구조에 따른다. 추가로, 공지된 배양, 발효 및 정제에 의해 얻어지는 독소 복합체의 약학 조성물 제형을 위해 사용되는 훨씬 낮은 독소 농도로의 희석은, 적합한 안정화제가 존재하지 않는 한 독소의 급속한 무독화(detoxification)를 일으킨다는 것이 공지되어 있다. 독소의 밀리그램 양으로부터의 밀리리터 당 나노그램을 함유하는 용액으로의 희석은, 이러한 큰 희석에 따른 특정 독성의 급속한 손실로 인해 상당한 어려움을 나타낸다. 보툴리눔 독소 제형에서 사용되어온 현재의 안정화제는 동물 유래된 알부민 및 젤라틴이다. 그러나, 이 안정화제는 보툴리눔 독소를 실온에서 저장하기에 충분히 안정화시킬 수 없다. 따라서 보툴리눔 독소의 안정성의 증진과 또한 이의 피부를 통한 투과 촉진에 대한 명확한 필요성이 존재한다.

피부 노화 및 주름을 일으키는 과정은 복잡하다. 주름의 1차 원인은 콜라겐 및 엘라스틴 섬유에 결합하는 자유 라디칼 독성 플라크의 증가이며, 이는 피부의 지지 구조가 비유연적이고 불건강하게 만든다. 웃음 선(Laugh lines), 미소선(smile lines), 눈가 주름(crow's feet) 또는 얼굴 주름은 반복되는 근육 움직임이 일어나는 영역에서 나타난다.

2002년에 FDA는 중등도(moderate) 내지 중증(severe)의 눈썹 사이 찌푸림 선(frown lines)(미간 주름(glabellar lines))의 외양을 일시적으로 향상시키기 위한 보툴리눔 독소 A형(BOTOX® 화장품)을 승인하였다. BOTOX® 화장품은 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 박테리아에 의해 제조된 정제 단백질이다. 독소는 경시적으로 형성된 눈썹 사이 찌푸림 선을 일으키는 근육의 활성을 감소시킨다. BOTOX® 화장품이 몇 가지 경우에 성공적으로 사용되어온 반면, 인후 및 목 영역, 입 주변, 눈 주위, 및 손과 같이 이것이 사용되지 않아야 하는 영역들이 존재한다. 이 영역들에서의 근육이 마비되거나 장애를 갖게 되는 경우, 이것은 말하는 것, 웃는 것, 먹는 것, 삼키는 것, 손 및 손가락의 움직임, 및 보는 것에 어려움을 야기할 수 있다.

BOTOX® 화장품의 현재 제형은 독소 분자가 매우 불안정하기 때문에 재구성 후 4 시간 내에 투여되어야 한다. 이 기간 동안, 재구성된 BOTOX® 화장품은 냉장고(4℃)에 저장된다. 톡소이드로의 독소 분해는 후속 치료에 간섭할 수 있는 톡소이드에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다.

동물 유래의 또는 도너 풀 단백질(donor pool proteins), 예컨대 젤라틴 및 세럼 알부민은 보툴리눔 독소를 안정화시키기에 어느 정도 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나, 보툴리눔 독소를 안정화하는 향상된 방법에 대한 바람이 존재해왔다.

보툴리눔 독소 안정화제와 같은 인간 세럼 알부민에 대해 적합한 대안은 또 다른 단백질 또는 저분자량(비단백질) 화합물일 수 있음이 제안되었다(Carpender et al., Interactions of Stabilizing Additives with Proteins During Freeze-Thawing and Freeze-Drying, International Symposium on Biological Product Freeze-Drying and Formulation, Oct. 24-26 1990; Karger (1992), 225-239). 그러나, 약학 조성물에서 캐리어 및 벌크화제(bulking agents)로 통상적으로 사용되는 많은 물질들은 클로스트리디움계 독소를 함유하는 조성물에서의 알부민 대체물로 적합히지 않음이 증명되었다. 예를 들어, 디사카라이드 셀로비오스는 보툴리눔 독소 안정화제로 적합하지 않음이 밝혀졌다. 인간 세럼 알부민만으로 동결건조된 후의 독성(>75% 내지 >90% 회복)과 비교하여, 알부민 및 염화나트륨와 함께 부형제로 셀로비오스를 사용하는 것은, 이 부형제로의 결정질 보툴리눔 독소 A형을 동결건조한 후의 훨씬 낮은 수준의 독성/효능(10% 회복)을 야기함이 보고되었다. Goodnough et al., Stabilization of Botulinum Toxin Type A During Lyophilization, App & Envir. Micro. 58 (10) 3426-3428 (1992). Schmidt, et al., Endoproteinase Activity of Type A Botulinum Neurotoxin Substrate Requirements and Activation by Serum Albumin, J. of Protein Chemistry, 16 (1), 19-26 (1997).

젤라틴은 일부 단백질 활성 성분 약학 조성물에서 알부민 치환체로 사용되어왔다. 그러나, 이것은 실온에서 보툴리눔 독소의 안정화를 제공하지 않는다.

대안적인 방식으로 안정화 및 전달될 수 있는 보툴리눔 독소 제형을 제공하려는 몇 가지 노력이 시도되어왔다. 예를 들어, 미국 특허 제6,585,993호에서는 1 개월 내지 5 년으로 연장되는 치료 기간에 걸쳐 신경독소를 연속적으로 방출하는 생체적합적(biocompatible) 임플란트가 개시되어 있다. 이러한 임플란트 가능한 시스템이 편두통의 치료와 같은 특정 상황에서 유용할 수 있으나, 이 유형의 임플란트 시스템은 얼굴, 목 또는 손 주름의 치료에 실시 가능하지 않다.

미국 특허 출원 제2004/0247623호에서는 신경독소의 경피 적용를 통한 감각 뉴런 관련 교란자(distorters)의 치료 방법이 제안되었다. 이 적용는 특히 편두통의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 적용은 보툴리눔 독소가 여러 가지 방식을 통해 경피적으로 투여될 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 독소는 경피 패치(patch) 내로 혼입될 수 있거나 전기영동을 통해 투여될 수 있다. 상기 적용은 또한 보툴리눔 독소가 국소(topical) 크림을 사용하여 투여될 수 있음을 시사한다. 상기 출원에서는 이것이 보툴리눔 독소를 생리식염수(normal saline)로 재구성시키고 이후 재구성된 독소를 적합한 크림 또는 베이스와 혼합한 후 이것을 환부(affected area) 상에 마사지함으로써 달성될 수 있음이 교시되어 있다. 이 유형의 적용은, 재구성된 보툴리눔 독소가 매우 짧은 활성 수명(active life)을 가질 것이기 때문에 큰 효과를 가지기 어렵다.

국제 특허 출원 WO 0158472에서는 보툴리눔 독소 및 폴리사카라이드를 포함하는 약학 조성물이 기술되어 있다. 이 출원에서는 폴리사카라이드가 신경독소를 안정화시킨다는 것이 교시되어 있다. 그러나, 상기 논의된 바와 같이, 다른 연구들은 사가라이드가 보툴리눔 독소에 대해 좋지 않은 안정화제임을 보였다.

국제 특허 출원 WO 04/060384에서는 격리제(sequestration agent)를 포함하는 약학적 보툴리눔 독소 조성물이 개시되어 있다. 격리제의 목적은 주사 부위로부터의 보툴리눔 독소의 확산을 방지하는 것이다. 이것은 피부 표면에 도포될 수 있는 안정된 조성물에 대한 필요성을 다루지 않는다.

BOTOX® 화장품이 대부분의 사용자에게서 가는 선(fine lines) 및 주름을 펼 수 있다는 점에는 의심할 여지가 없다. 그러나, 이의 사용과 관련된 몇 가지 단점들이 존재한다. BOTOX® 화장품은 반드시 병원에서 투여되어야 한다. 주사는 고통스러울 수 있고 멍이 들 수 있다. 일부 주사 치료된 환자에게서 부작용(Adverse side effects)이 발생한다. 찌푸림 선의 치료에 대한 대부분의 통상적인 부작용은 늘어진 눈썹(droopy eyelids), 구토, 독감 유사 증상(발열 등), 두통 및 호흡기 감염(respiratory infection)을 포함한다. 덜 빈번한 반응은 얼굴 통증, 주사 부위에서의 발적(redness), 및 다른 부위에서의 근육 약화(muscle weakness)를 포함할 수 있다. 반복적인 치료는 얼굴의 표정이 없게 만드는 얼굴 근육 영구 마비를 일으킬 수 있다.

따라서, 보툴리눔 독소 안정화에 대한 새로운 방법에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이 필요를 다루고 있다. 주사를 수반하지 않는 보툴리눔 독소 투여에 대한 대안적인 방법에 대한 추가 필요성이 존재한다.

본 발명은 실온에서의 저장을 위한 거대 단백질(large protein) 활성 성분을 안정화시키는 방법을 제공함으로써 향상된 조성물에 대한 필요성을 다룬다. 본 발명은 또한 활성 성분의 경피 전달을 위한 안정화 방법을 사용하여 제조된 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 한 바람직한 활성 성분은 보툴리눔 독소(MW150 kD)이다.

본 발명의 한 양태에서, 국소 조성물 중 활성 성분을 안정화하는 방법이 제공된다. 본 방법은 활성 성분을 스핑고신, 세레브로시드, 콜라겐 및 엘라스틴과 혼합하는 단계를 포함한다.

안정화된 활성 단백질 제제 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:

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○ ⅰ. 스핑고신과 세레브로시드를 혼합하는 단계;

○ ⅱ. 단계의 혼합물을 용해시키는 단계:

■ 1. 알코올에;

○ ⅲ. 알코올을 제거하는 단계;

○ ⅳ. 활성 단백질 제제의 수용액을 첨가하여 활성화제 조성물을 형성하는 단계; 및

○ ⅴ. 활성화제 조성물을 가용화된 콜라겐 및 저분자량 엘라스틴의 용액과 혼합하여 안정화된 단백질 조성물을 형성하는 단계.

본 방법의 바람직한 실시양태에서, 스핑고신 및 세레브로시드는 동일한 양으로 혼합된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 알코올은 에탄올이고 이것은 바람직하게는 진공 증발에 의해 제거된다.

추가로 바람직한 실시양태에서, 활성화제 조성물은 미셀(micelles)을 포함한다.

여전히 또 다른 실시양태에서, 가용화된 콜라겐 및 엘라스틴의 용액은 동일한 양의 콜라겐 및 엘라스틴을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 활성 단백질 제제는 보툴리눔 독소, 바람직하게는 보툴리눔 독소 A형, 더욱 바람직하게는 염수 중의 보툴리눔 독소이다.

추가로 바람직한 실시양태에서, 화장품 또는 약학 제형을 제조하는 방법이 제공된다. 본 방법에 따라, 안정화된 조성물은 다른 성분들과 조합되어 국소 투여에 허용 가능한 크림, 로션, 겔, 연고 또는 다른 제형을 형성한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 활성 성분의 경피 전달용 조성물이 제공된다. 조성물은 콜라겐, 엘라스틴 및 세레브로시드와 함께 활성 성분을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 활성 성분은 보툴리눔 독소이다. 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 또는 G형 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 보툴리눔 독소 A형이 사용된다.

바람직한 실시양태에서, 조성물은 약 1 내지 40 wt/wt%의 콜라겐, 약 1 내지 40 wt/wt%의 엘라스틴, 약 0.1 내지 15%의 스핑고신 및 약 0.1 내지 15%의 세레브로시드를 포함한다.

추가로 바람직한 실시양태에서, 조성물은 진피층(dermal layer)을 통한 보툴리눔 독소의 침투를 증진시키는 제제를 포함한다. 이 증진제는 d-리모넨, 알란토인, 풀브산, 미르(myrrh), 히드로퀴논 글리퀸(glyquin), 퀼라야 사포나리아(quillaja saponaria, QTS), 및 아칸토필럼 스쿠아루솜(acanthophyllum squarrusom, ATS)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 국소 투여용 크림, 로션, 겔, 연고 또는 유사 물품으로 제형화된다.

본 발명의 추가 양태에서, 피부를 치료하는 방법이 제공된다. 본 방법은 상기 기술된 조성물을 주름지거나 손상된 피부 영역에 매일 도포하는 단계를 포함한다.

본 발명은 BOTOX® 화장품의 종래 주사에 비하여 많은 장점들을 가진다. 본 발명의 조성물은 인후 및 목, 입 주변, 눈 주위 및 손 위와 같은 영역들에 안전하게 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 장점은 조성물이 크림 또는 로션으로서 제형화될 수 있고 이것이 활성 성분의 활성의 임의 손실 없이 연장된 기간 동안 실온에서 저장될 수 있다는 점이다. 또 다른 장점은 본 발명의 안정화 방법이 안정화제로 인간 세럼 알부민의 사용에 대한 필요성을 제거한다는 것이다. 인간 세럼 알부민이 혈액 유래 생성물이기 때문에, 생성물에서 이를 제거하는 것은 주사를 통해 전달되는 혈인성 질병(blood borne diseases)의 위험을 감소시킨다. 더 나아가, 안정화 방법이 단백질을 안정하게 유지하고 톡소이드 형성의 발생 정도를 감소시키기 때문에, 환자가 보툴리눔 독소에 대한 항체를 형성할 가능성이 낮아진다. 추가로, 본 발명의 방법 및 조성물은 비용 효율적이고 사용하기에 간편하다. 예를 들어, 국소 조성물은 임의의 비용이 큰 병원 방문 없이 집에서 사용될 수 있다. 이는 또한 고통스러운 주사의 필요성을 제거한다. 단일 부위에 1 회 전달되는 하나의 단일한 큰 용량의 보툴리눔 독소보다, 본 발명의 방법 및 조성물은 보툴리눔 독소가 적은 용량으로 매일 투여되어 증진된 안전성 및 감소된 부작용과 함께 효과적인 치료를 제공한다.

본 발명의 방법 및 조성물은 가는 선 및 주름의 감소, 피부의 수분 정도의 증가, 피부 탄력성(elasticity) 및 회복력(resilience) 증가, 피부 견고성(firmness) 증가, 피부 톤, 질감(texture) 및 전체적인 윤기(radiance) 향상, 하안검(bags under the eyes)의 약화, 피부 재생, 화학 스트레스로부터의 손상 방지, 자외선 및 자유 라디칼 손상으로부터의 피부 보호, 및 비정상 색소 침착의 제거를 나타내었다.

거대 단백질은 실온에서 저장하기 위한 제형에서 안정시키기에 어려울 수 있다. 치료용 단백질은 종종 동결건조된 채 저장되고 사용 전에 재구성된다. 대안적으로, 단백질 조성물은 사용 전에 동결이 유지될 수 있다. 본 발명은 단백질을 활성 성분으로 포함하는 치료용 또는 화장품 조성물뿐만 아니라 거대 단백질을 안정화하는 방법도 제공한다. 본 발명의 안정화된 조성물은 실온에서 연장된 기간 동안 저장될 수 있다.

보툴리눔 독소는 약학 또는 화장품 제형 내로 혼입시키기에 비교적 거대한 단백질이다. 보툴리눔 독소 A형 복합체의 분자량은 150 kD이고, 분자의 거대한 크기 때문에 이것은 상당히 깨지기 쉽고 불안정하다. 안정화제 성분은 독소 분자를 변성, 분절(fragment), 또는 이와 달리 해독시키지 않거나 독소 복합체의 분리를 일으키지 않는 방식으로 독소와 상호작용할 수 있어야 한다.

본 발명은 콜라겐을 말초(peripheral) 저분자량 가용성 엘라스틴과 조합하여 사용함으로써 신규 안정화 방법 및 생성물을 제공한다. 스핑고신 및 세레브로시드는 추가 안정화 성분이다. 본 발명에 따라 제형화된 보툴리눔 독소는, 안정하게 유지되고 6 개월의 기간 동안 실온의 제형에서 변성 또는 분절 또는 해독되지 않는다(6 개월의 안정성 데이터 및 임상 데이터로부터 평가된 바와 같음).

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 안정화제" 또는 "1차 안정화제"는 생물학적 구조(즉 3 차원 입체구조) 및/또는 단백질 생물학적 활성을 보존 또는 유지하는데 도움을 주는 제제를 지칭한다. 안정화제는 단백질 또는 폴리사카라이드일 수 있다. 단백질 안정화제의 예는 히드록시에틸 스타치(헤타스타치(hetastarch)), 젤라틴, 콜라겐, 또는 콜라겐을 포함한다. 1차 안정화제는 피험자에게서 면역 반응을 유발하지 않거나 약화된 면역 반응을 유발하는 합성 제제일 수 있다. 추가 안정화제는 또한 약학 조성물을 포함할 수 있다. 이 추가 또는 2차 안정화제는 단독으로 또는 1차 안정화제, 예컨대 단백질 및 폴리사카라이드와의 조합으로 사용될 수 있다. 예시적인 2차 안정화제는, 비산화 아미노산 유도체(예컨대 트립토판 유도체, 예컨대 N아세틸-트립토판("NAT")), 카프릴레이트(즉 나트륨 카프릴레이트), 폴리소르베이트(즉 P80), 아미노산, 및 2가 금속 양이온, 예컨대 아연을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 약학 조성물은 또한 방부제, 예컨대 벤질 알코올, 벤조산, 페놀, 파라벤 및 소르브산 또는 크레졸, 예컨대 M-크레졸을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증진제"는 피부에 의한 활성 단백질 제제의 흡수를 촉진하는 제제를 지칭한다. 증진제의 예는, 알코올, 예컨대 단쇄 알코올, 장쇄 알코올, 또는 폴리알코올, 아민 및 아미드, 예컨대 요소, 아미노산 또는 이들의 에스테르, 아미드, AZONE(R), AZONE(R)의 유도체, 피롤리돈, 또는 피롤리돈의 유도체; 테르펜 및 테르펜의 유도체; 지방산 및 이들의 에스테르; 매크로시클릭 화합물; 텐시드(tensides); 또는 술폭시화물, 예컨대, 데실메틸술폭시드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 리포좀; 트랜스퍼좀(transfersomes); 레시틴 소포(lecithin vesicles); 에토좀(ethosomes); 물; 계면활성제, 예컨대 음이온성, 양이온, 및 비이온성 계면활성제; 폴리올; 및 에센셜 오일(essential oils)이 또한 증진제로서 기능할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "국소"는 피부로의 투여를 지칭하도록 사용된다. 용어 "경피"는 피부의 다른 층 또는 각질층을 통한 침투를 지칭하도록 사용된다. 용어 "경피 전달"은 피부 아래의 근육으로의 활성화제의 전달을 지칭하는 것을 의미한다. 이것은 순환계로의 전신 전달을 지칭하는 것을 의미하지는 않는다.

본 발명의 방법 및 조성물에서, 콜라겐이 안정화제로 사용된다. 본 발명에 따라 보툴리눔 독소를 안정화시키는 것에 추가로, 콜라겐은 조직 아래의 기초의 향상을 돕고 수화에 기여한다. 콜라겐은 임의 침투 증진제의 도움 없이 피부에 침투할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 엘라스틴이 또한 포함된다. 엘라스틴은 결합 조직의 탄성 섬유 내에서 스프링처럼 코일(coil) 및 리코일(recoil)되고 피부, 혈관, 심장, 폐, 장, 건(tendons), 및 인대와 같은 구조에서 탄력성을 제공하는 단백질이다. 엘라스틴은 결합 조직에서 콜라겐과 함께 작용한다. 엘라스틴은 탄력성을 제공하는 반면, 콜라겐은 결합 조직에 경직성(rigidity)을 제공한다. 저분자량 엘라스틴은 오직 임의 침투 증진제의 도움 없이 피부를 침투할 수 있는 엘라스틴 복합체이다. 보툴리눔 독소 A와 함께 콜라겐 및 저분자량 가용성 엘라스틴 복합체는 주름의 외양이 약화되도록 돕는다.

본 발명의 조성물 및 방법은 또한 스핑고신을 포함한다. 스핑고리피드 또는 스핑고신-1-포스페이트는 혈관 신생 및 배발생뿐만 아니라 세포 생장, 분화, 생존, 및 주화성(chemotaxis)의 조절에 수반되는 생물활성 분자로서 인식되어왔다. 연구자들은 섬유아세포에 의한 세포외 기질 생성의 활성화제뿐만 아니라 각질세포에 대한 강력한 화학 유인 물질(chemoattractant)로 스핑고신-1-포스페이트를 식별하였다. 세라마이드 또는 스핑고리피드의 다른 종으로는 (N-아실-스핑고신) 및 디히드로세라마이드(N-아실 스핑가닌)이 있다.

스핑고리피드의 대사물인 갈락토실세라마이드(세레브로시드)가 또한 포함된다. 세레브로시드는 세포 생장, 분화, 생존, 및 주화성의 조절에 중요한 역할을 하는 미엘린계 단백질이다. 세레브로시드 술페이트는 중요한 막 구성성분이다. 세레브로시드는 약염기성 또는 중성 단백질이다.

본 발명에 사용된 안정화제, 말초 저분자량 가용성 엘라스틴(EBP)과의 조합인 콜라겐 및 스핑고신과 세레브로시드의 혼합물은 비독성이고 취급이 용이하다. 이들은 알부민에 대한 효과적인 대안을 제공하고 여전히 엄중한 보툴리눔 독소 함유 약학 조성물 제형 요건을 충족한다.

본 발명의 한 방법에 따라, 안정화된 단백질 조성물은 용매, 예컨대 염수 중에 콜라겐과 저분자량 엘라스틴을 배합함으로써 제조된다. 개별 플라스크에서, 스핑고신 및 세레브로시드는 알코올, 바람직하게는 에탄올에 용해된다. 이후 알코올은, 예를 들어 회전식 진공 증발에 의해 제거된다. 이것은 결과로 플라스크 상에 스핑고신 및 세레브로시드의 코팅을 생성한다. 안정될 단백질을 함유하는 용액이 플라스크에 첨가된다. 이 결과 바람직하게는 스핑고신, 세레브로시드 및 단백질의 미셀이 형성된다. 이 미셀형 조성물은 콜라겐과 엘라스틴의 혼합물에 첨가되고 교반된다. 이 안정된 조성물은 이후 실온에서 저장될 수 있다. 예시적인 조성물의 추가 상세한 설명은 하기 실시예 1에서 확인할 수 있다. 본 발명의 방법은 단백질, 보툴리눔 독소를 안정화하도록 사용된다.

보툴리눔 독소 A형은 약 750 kD 중량의 비독소 단백질과의 비공유 결합인 약 150 kD의 독소 분자로 이루어진다. 비독소 단백질은 독성이 의존하는 2차 및 3차 구조를 보존하거나 안정화시키는 것을 돕는 것으로 여겨진다. 엘라스틴 결합 단백질(EBP)과의 조합인 콜라겐 및 스핑고신과 세레브로시드의 혼합물의 사용에 기초한 본 발명의 안정화 기법은 변성 또는 분절 또는 무독화 없이 복합체의 무결성(integrity)을 유지한다. 따라서, 본 발명은 보툴리눔 독소를 안정화하는 신규한 방법을 제공한다.

추가 장점은 콜라겐, 엘라스틴 및 스핑고미엘린과 같은 단백질들이 비면역원성이라는 점이다.

증진된 안정성을 지니는 것에 추가하여, 본 발명의 조성물은 피부를 통한 흡수를 증진시키는 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 조성물은 국소 조성물, 예컨대 크림, 로션, 겔, 연고, 스프레이 또는 마스크로 제형화될 수 있다. 크림, 로션 또는 겔로서, 그리고 오직 예시적으로만, 약 0.5 ml 내지 약 20 ml 또는 그 이상은, 치료될 영역 및 적어도 어느 정도로는 치료될 고통의 심각도(severity)에 따라, 인간 피험자의 얼굴에 사용될 수 있다. 조성물은 또한 메이크업 제형, 예컨대 파운데이션 또는 립 밤에 포함될 수 있다.

하기 내용은 두꺼운 진피층을 통한 보툴리눔 독소의 흡수/침투를 증진시키기 위해 포함될 수 있다. 이 제제들은 FDA에 의해 인간에 대한 사용에 승인되었고 FDA의 GRAS(generally recognized as safe) 목록에 등재되었다. 이 제제들은 보툴리놈 독소와 화학적으로 상호작용하지 않는다. 이 첨가제들은 피부 층을 통한 보툴리눔 독소의 흡수를 증진시킬뿐만 아니라 또한 이들의 중성 특징 및 항산화 특성으로 인해 안정성 보존을 돕는다.

본 발명의 한 양태에서 d-리모넨이 조성물에 포함되어 진피층을 통한 독소의 침투를 증진시킨다. 리모넨은 0.30%에서 보툴리눔 독소 A형의 피부 투과를 약 4 배 증진시키는 효과적인 증진제로 밝혀졌다.

본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 알란토인이 제조에 포함된다. 알란토인은 새로운 세포 형성을 촉발하고, 손상된 조직을 수축시키며 콜라겐 침투를 촉진하는 물질이다. FDA OTC 패널은 알란토인을 피부 보호제 및 약중성 투과 증진제로 식별하였다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 풀브산이 제조에 포함된다. 풀브산은 저분자량 항산화제이다. 이것은 임의 부작용 없이 경피 경로를 통한 약물의 몸의 흡수를 증진시킨다.

미르는 본 발명의 피부 크림 제조에서의 추가 임의 성분이다. 미르는 염증이 생긴 조직을 누그러뜨리고 피부, 모발, 및 손톱 및 발톱을 재생시키는 것을 돕는, 아라비아산 및 소말리아산 관목으로부터 추출된 검 수지이다.

엘도파크(Eldopaque) 또는 히드로퀴논 글리퀸이 또한 포함될 수 있다. 이것은 경구 피임약, 호르몬 약, 피부의 상해, 또는 단순한 노화로 인한 피부의 어둡게 착색된 부분(또한 기미, 간반(liver spot), 검버섯(age spots), 주근깨로 지칭됨)의 색을 옅게 하는 데 사용된다. 이것은 태양광 또는 자외선 노출로 인한 재발생으로부터 이 반점들을 방지하기 위해 자외선 차단제와 함께 포함될 수 있다.

퀼라야 사포나리아(QTS) 및 아칸토필럼 스쿠아루솜(ATS) 총 사포닌은 또한 포함될 수 있는 2 가지 천연 증진제이다. 이들은 피부 침투 증진제로서 중등도의 활성을 나타낸다. 이 화합물들은 또한 본 발명의 피부 크림 또는 로션에 포함될 수 있다.

증진제는 방법의 다양한 단계들에서 포함될 수 있다. 예를 들어, 이것은 미셀형 조성물이 콜라겐 및 엘라스틴 혼합물에 첨가되는 동시에 안정화된 조성물에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 증진 화합물은 안정화된 조성물의 제형 중에 약학 또는 화장품 제형 내로 도입된다. 국소 도포용 예시적인 제형의 제조는 하기 실시예 3에 기술되어 있다.

본 발명은 인간의 피부를 통해 보툴리눔 독소를 전달할 수 있는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 환자의 피부를 통해 보툴리눔 독소의 투과를 가능하게 하는 증진제를 함유한다. 조성물은 국소 투여에 적합하고 이에 의해 조성물은 피부에 침투하여 아래 근육을 경피적으로 탈신경(denervates)시킨다. 조성물은 피부에 접착적으로 확보된 패치에 제공되어 독소가 피부를 통해 패치로부터 통과하여 아래 근육을 탈신경시킬 수 있다. 보툴리눔 독소 및 증진제를 함유하는 조성물은 인간의 피부에 도포되는 경우 신경 전달 물질 방출과 관련된 몇 가지 유형의 장애를 성공적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 조성물의 국소 투여에 의해 치료될 수 있는 장애의 예시는, 주름, 예컨대 눈썹 주름(brow furrows), 두통, 예컨대 편두통, 두통 통증(headache pain), 경부 근육 긴장 이상(cervical dystonia), 병소(focal) 손 근육 긴장 이상, 신경성 염증, 다한증, 안검 경련(blepharospasm), 사시, 반안 경련(hemifacial spasm), 안검 장애(eyelid disorder), 뇌성마비, 병소 경직(focal spasticity), 림 경직(limb spasticity), 틱(tics), 진전(tremors), 이갈이(bruxism), 치열(anal fissure), 섬유근육통(fibromyalgia), 연하곤란(dysphagia), 유루증(lacrimation), 및 근육 경련으로부터의 고통을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 개시된 조성물은 보툴리눔 독소의 전달을 통한 국부적 고통 경감을 제공한다.

본 발명의 조성물 및 제형은 노화의 징후를 감소시키는 데 유용하다. 임상 시험은 보툴리눔 독소를 함유하는 국소 크림 제형을 사용하여 수행된다. 시험의 상세 사항은 하기 실시예 4에서 찾을 수 있다. 명확히 볼 수 있는 바와 같이, 안정된 보툴리눔 독소 크림의 국소 투여는 노화의 징후를 현저히 감소시킨다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 약학 또는 화장품 제형은 활성화제의 유효량 및 안정화 증진 조성물의 유효량, 및 국소 또는 경피 투여에 적합한 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 함유하여 제공된다. 제형은 피부에 도포하기에 적합한 임의 형태일 수 있다. 예를 들어, 이것은 크림, 로션, 겔, 연고, 페이스트(paste), 또는 용액의 형태를 취할 수 있다. 제형은 리포존(lipozone), 미셀, 또는 마이크로스피어(microspheres)을 포함할 수 있다. 제형은: 안정화제 및 활성 성분에 추가로 물 및 화장품에서 보통 사용되는 다른 첨가제들을 포함하는 화장품 조성물일 수 있다. 예를 들어, 이것은 증점제, 보존제, 유화제, 향수(perfumes), 염료 또는 컬러링(coloring), 채소(vegetable) 또는 미네랄 오일, 방부제, 산성화제 또는 알칼리화제, 비타민, 항UV제, 계면활성제, 용매, pH 안정화제, 및 피부에 효과적인 것으로 공지된 다른 활성 성분들을 포함할 수 있다. 화장품 조성물은 밀크(milk), 크림, 로션, 세럼, 마스크 또는 겔로 제공될 수 있다. 화장품 조성물은 또한 스킨 파운데이션, 립 밤 등으로 제공될 수 있다.

본 명세서가 보툴리눔 독소의 경피 전달에 초첨을 맞추어왔으나, 안정 및 증진 조성물이 다른 활성화제들을 경피적으로 전달하도록 사용될 수 있다는 점은 아주 명백하다. 이러한 방식으로 전달될 수 있는 활성화제의 예는 안드로겐, 안드로스텐디올 및 안드로이속사졸(동화장애용), 테스토스테론 (성선기능저하증, 근육 소모(muscle wasting), 남성 발기부전, 여성의 폐경기 이후 증상), 디히드로테스토스테론(성선기능저하증, 근육 소모), 데히드로에피안드로스테논(dehydroepiandrostenone)(근육 소모, 지방 감소, 피트니스(fitness)); 에스트로겐(폐경기 이후, 산아 조절), 17 베타에스트라디올, 에스트라디올-3,17-디아세테이트, 에스트라디올-3-아세테이트, 에스트라디올-17-아세테이트, 에스트라디올-3,17-발러레이트, 에스트라디올-3-발러레이트, 에스트라디올-17-발러레이트, 에티닐 에스트라디올, 에스트론; 프로게스테론(자궁내막증 방지, 자궁내막암 방지, 습관성 유산 조절, 발정 억제 또는 동기화, 모발 성장 촉진), 프로게스테론(프레그-4-엔-3,20-디온(preg-4-ene-3,20-dione)), 노르에신드론, 노르게스트리에온(norgestrieone), 노르게스타디에논(norgestadienone), 노르게스트렐, 노르게스티메이트, 프로게스토겐 산(progestogenic acid), 디히드로프로게스테롤, 노마게스테롤을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 테스토스테론 호르몬은 이의 임의 통상 형태, 예컨대, 아세테이트, 프로피오네이트, 17-β-시클로펜탄프로피오네이트, 에난타네이트, 이소부티레이트, 운데코네이트(undeconate) 등으로 사용될 수 있다. 마찬가지로, 에스트라디올은 추가로 임의의 공지되거나 새롭게 개발된 형태, 예를 들어, 피발레이트, 프로피오네이트, 시피오네이트, 벤조에이트 및 다른 에스테르 등으로 사용될 수 있다. 다른 약물들, 예컨대 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 백신, 펩티드 유사 GLP, IGF, 헤파린, 히루겐(hirugen), 히룰로스(hirulos), 후리딘(huridine), 볼거리, 홍역 및 풍진 백신, 장티푸스 백신, 간염 A 백신, 간염 B 백신, 단순 헤르페스 바이러스, 박테리아성 톡소이드, 콜레라 독소 B-서브유닛, 인플루엔자 백신 바이러스, 보르데텔라 페르투시스(bordetala pertussis), 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 카나리아 수두(canary pox), 소아마비 백신 바이러스, 열대 말라리아 열원충(plasmodium falciparum), BCG(Bacillus calmette geurin), 폐렴 간균(klebsiella pneumoniae), HIV 외피 당단백질, 소 소마트로핀(bovine somatropine), 에스트로겐, 안드로겐, 인슐린 성장 인자, 인터루킨-Ⅰ, 인터루킨-Ⅱ 및 사이토카인, 소분자 약물, 예컨대 NSAJD, 마취제(narcotics) 등은 본 발명의 조성물을 사용하여 전달될 수 있다.

보툴리눔 독소 A는 본 발명의 방법을 사용하여 안정화될 수 있고 안정화된 독소는 경피로 성공적으로 전달되어 BOTOX® 화장품의 근육내 주사에 의해 얻어지는 것과 유사한 결과를 달성할 수 있다. 제형은 주로 눈 주변 영역 및 이마에서 주름을 감소시키는 것을 목표로 하는 BOTOX® 화장품 주사와는 대조적으로 얼굴 및 목 및 손 도처에 도포될 수 있다.

본 발명은 1 이상의 실시양태에 관하여 기술되었다. 그러나, 당업자에게는 특허 청구 범위에 명시된 바와 같이 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 다수의 변형 및 변경이 가해질 수 있음이 명백할 것이다.

상기 개시 내용은 일반적으로 본 발명을 기술한다. 더욱 완전한 이해는 하기 구체적인 실시예들을 참조함으로써 얻어질 수 있다. 이 실시예들은 오직 예시의 목적으로 기술되었으며 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않았다. 형태의 변화 및 등가물(equivalents)의 치환은 상황이 시사하거나 편의를 제공하도록 고려된다. 특정 용어가 본원에서 사용되었으나, 이러한 용어들은 설명적인 의미로 의도되었으며 제한을 목적으로 하지 않는다.

[ 실시예 ]

하기 실시예들은 예시의 목적을 위해 기술되었으며 본 발명의 범위를 제한하도록 의도하지 않았다.

실시예 1 제조

보툴리눔 독소(BOTOX® 화장품) 바이알을 살균 염수 용액(0.9%)으로 재구성하였다. 바이알을 격렬하게 흔들어 보툴리눔 독소(BOTOX® 화장품)를 용해시켰다. 재구성된 바이알을 냉장 유지하고 재구성 1시간 내로 사용하였다.

50 mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에, 10 mg의 가용성 콜라겐 및 10 mg의 엘라스틴을 배합하였다. 이 혼합물을 연속적으로 교반시키면서 10 mL의 살균 염수 용액(0.9%)에 가용화시켰다. 별개의 50 mL 둥근 바닥 플라스크에, 5 mg의 스핑고신 및 5 mg의 세레브로시드를 배합하였다. 이 혼합물을 순수한 에탄올에 용해시켰다. 알코올을 회전식 진공 증발로 완전히 제거하여 플라스크 벽에 스핑고신 및 세레브로시드의 균일한 코팅을 얻었다. 이 플라스크에 6 mL의 염수(0.9%) 중의 800 유닛의 보툴리눔 독소 용액을 첨가하였다. 플라스크를 선회유동(swirled)시키고 이후 실온에서 5분간 연속적으로 교반시킴으로써 보툴리눔 독소를 스핑고신 및 세레브로시드 미셀 코팅으로 균일하게 코팅하여 분해를 방지하였다. 이 코팅 및 보존된 미셀형 보툴리눔 독소 용액을 이후 콜라겐과 가교결합된 저분자량 엘라스틴의 혼합물을 함유하는 플라스크에 첨가하였다. 용액을 약 5 분간 천천히 교반하고 이후 갈색 유리 바이알에서 실온으로 유지하였다.

실시예 2 SDS - PAGE 및 웨스턴 블롯 분석

보존된 보툴리눔 독소(보톡스) 용액의 안정성을 제로 시점(time zero, 코팅된 안정화된 용액 제조의 후 수 분)에서 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 및 HPLC 분석을 사용하여 표준 분석 기법으로 분석하고 이후 매달 비코팅된 보톡스 용액과 비교하여 분석하였다.

SDS-PAGE를 모든 경우에서 10% 프리캐스트(precast) 트리신 겔을 지닌 BIO-RAD® 미니-셀(mini-cell) 장치(Bio-Rad Laboratories사제, 캘리포니아주 소재)로 환원 조건 하에 수행하였다. 보툴리눔 독소 니트(neat)(염수로 희석된 순수한 샘플)를 안정화된 보툴리눔 독소에 대한 비교물로서 하나의 레인에 로딩하고, 안정화된 보툴리눔 독소를 두번째 레인에 로딩하였다. 두 컬럼 모두를 약 100 유닛의 독소로 로딩하였다. 로딩 버퍼, 탱크 버퍼(tank buffer), 및 분자량 마커는 Bio-Rad Laboratories사에서 구입하였다. 단백질 밴드들을 쿠마시 블루 염색 기법으로 시각화하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔로부터의 단백질 농도(밀도)를 BIO-RAD® 농도계(densitometry) 시스템으로 측정하고 표준 이미징 소프트웨어 분석기로 분석하였다. 보툴리눔 독소 A 밴드, 즉 안정화하지 않은 니트 보툴리눔 독소와 안정화된 보툴리눔 독소의 비교는 안정화된 보툴리눔 독소에서 분해가 일어나지 않는 것이 실온에서 6 개월 동안 지속됨을 나타내었다.

웨스턴 블롯 분석 웨스턴 블롯 분석을 위해, SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리된 단백질을 BIO-RAD® 단백질 블롯 모듈로 60 mm에 대해 25 V에서 니트로셀룰로오스 막에 전달시켰다. 겔로부터 단백질의 완전한 전달 후에, 막 상의 단백질 결합 부위는 60 mm에 대한 5% 탈지우유(skim milk)-TBS(Tris-buffered saline) 중의 실온에서의 인큐베이션에 의해 차단되었다. 이후 막을 4 시간 동안 5% 탈지우유-TBS 중 5 ㎍/ml에서 보툴리눔 독소(지역 대학 생물공학부로부터의 선물)에 대해 생성된 친화도-정제된 MAb와 함께 실온에서 인큐베이트시켰다. TBS 버퍼로의 수 회 세척 후에, 막을 3 시간 동안 5% 탈지우유-TBS 버퍼 중 4 ㎍/ml에서 친화도-정제된 염소 항 마우스(goat anti-mouse) IgG(Sigma-Aldrich, Co.사제)와 함께 실온에서 인큐베이트시켰다. TBS 버퍼로의 4 내지 5 회의 세척 후에, 발색되기까지 막을 TMB[3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘] 막 기질(substrate)(Bio-Rad Laboratories사제)과 함께 인큐베이트시켰다. 이 분석은 6 개월의 기간 후에 실온의 보툴리눔 독소가 안정되고 분해 및 변성되어 이의 효능을 잃지 않음을 나타내었다.

실시예 3 크림 제형화

안정화된 보툴리눔 독소 조성물을 하기 개괄된 바와 같이 국소 투여용 크림으로 제형화하였다.

크림의 총 부피 (400mL)

상(phase) A:

탈이온수 74.7%

테트라 나트륨 EDTA 0.5-0.7%

메틸 파라벤 0.2%

프로필렌 글리콜 3.0%-4.0%

글리세린 3.0%-4.0%

상 B:

세틸 알코올(Ado 1 52 NE) 2.0%

세테아릴 알코올 2.0%

글리세릴 스테아레이트 2.0%

PEG-100 스테아레이트 1-2%

스테아르산 (Emersol 132) 4.5%

소르비탄 팔미테이트 0.5-0.7%

폴리소르베이트-85 1.0%

폴리소르베이트 60 0.5-1%

라놀린 알코올(Ritachol) 1.0%

호호바 오일 0.5-1%

라놀린 1-2%

토코페릴 아세테이트 0.5-1%

디메티콘 200 0.7-1.0%

BHA 0.1%

프로필파라벤 0.1%

디아졸리디닐 요소 0.2%

상 C:

향료(라일락, 자스민) 필요량

알로에 베라(분말) 1.5%-2.0%

CoQ-10 0.5%

레티닐 A 0.03-0.05%

히알루론산(순수함) 1.0-1.5%

탤컴(Talcum) 분말(Ti02) 1.0-1.5%

상 D:

d-리모넨 0.7%

알란토인 0.5%

풀브산 0.5%

퀼라야 사포나리아(QTS) 0.3%

아칸토필럼 스쿠아루솜(ATS) 0.3%

미르 추출물 0.2%

히드로퀴논 글리퀸 4.0%

상 E:

콜라겐 매트릭스 중 안정화된 보툴리눔 독소 800 유닛

절차:

상 A 및 상 B를 개별적으로 교반과 함께 75℃로 가열한다. 상 A를 상 B에 첨가하고 75℃에서 30분 동안 혼합한다. 20-22℃로 냉각하고 상 C, D 및 E를 첨가한 후 균일한 하나의 상이 될 때까지 계속 교반한다.

실시예 4 인간 피험자에서의 임상 연구

안정화된 보툴리눔 독소(보톡스)의 효과를 크림 제형을 사용하여 시험하였다. 주름이 있는 인간 피험자에게 1 개월 또는 그 이상 동안 크림을 도포하였다. 피험자의 얼굴에 크림을 도포하기 전에 및 도포 1 개월 후에 피험자를 촬영하였다.

Allergan사가 자사의 보톡수 주사를 시험하기 위해 수립한 임상지침을 따라 40-75 세 범위의 건강한 피험자(남성 및 여성)에서 안정화된 제형의 효과를 시험하였다.

보툴리눔 독소 A형은 크림 1 mL당 1.7 유닛의 저용량에서 크림의 진피 도포 후에 말초 혈액에 측정 가능한 수준으로 존재하지 않았다. 각 크림 바이알은 30 mL의 크림 중에 50 유닛의 보톡스를 함유하였다. 각 치료(아침 및 취침시에)에서 투여된 신경독소의 권장량은 다른 신경근성 기능 장애가 없는 환자에게서 전신적인, 유해한 임상 효과, 즉 근력 저하를 일으키지 않았다.

임상 연구: 미간 주름의 평가

랜덤화된, 단일 센터(single-center), 이중 맹검의, 플라시보-통제된(보톡스를 제외한 모든 성분을 함유하는 플라시보 크림), 수평 군(parallel-group) 연구를 수행하여, 중등도 내지 중증의 미간 안면 주름 외양의 일시적인 향상에 사용하기 위한 본 발명의 안정화된 보톡스 크림의 효과를 평가하였다. 상기 연구는 최대로 찌푸렸을 때 적어도 중등도의 심각도인 미간 주름을 가진 40 명의 건강한 성인 환자들(40 내지 75 세, 여성 또는 남성)을 등록시켰다. 환자들은 감염 또는 피부 문제(skin problem), 안면 신경 마비(facial nerve palsy) 이력, 뚜렷한 안면 비대칭, 하수증(ptosis), 과도한 피부이완증(dermatochalasis), 깊은 피부 흉터(dermal scarring), 두꺼운 피지 분비성(sebaceous) 피부, 심지어 물리적으로 미간 주금을 펼침으로써 이를 상당히 감소시키는 것에 대한 무능성을 가지거나, 신경근성 장애 또는 신경근성 작용을 방해할 수 있는 다른 장애에 대한 공지된 이력을 갖는 경우 배제되었다. 피험자들은 1 개월 동안 하루 2회(아침에 1회 및 취침시에) 실제 안정화된 보톡스 크림을 도포하도록 요청받았다. 피험자들은 따뜻한 물로 그들의 얼굴을 씻고 철저히 비누칠을 하여 그들의 얼굴에서 임의 땀, 더러움 및 오일을 제거하도록 지시받았다. 이들은 그들의 눈, 이마, 목 주위 또는 주름질 피부 영역에 안정화된 보톡스 크림 또는 플라시보 크림을 제공된 도포기(applicator)로 도포하여 손에 의한 제품의 임의 오염을 피하도록 지시받았다. 모든 피험자들은 연구 시작 전에 자격을 갖춘 피부과 전문의에 의해 검사받은 후 건강하고 연구에 참가하기에 적합하다고 확언받았다. 이들은 연구 시작 전에 전문 사진사에 의해 촬영되었다. 모든 피험자들은 임의 제한 없이 그들의 평소 매일의 일상을 따르도록 요청받았고 그들의 평소 생활 방식으로 생활하도록 요청받았다.

1차 효능 측정은 치료 후 30일째 최대로 찌푸렸을 때의 미간 주름 심각도에 대한 조사원의 등급 부여(rating) 및 치료 후 30일째의 미간 주름의 외양 변화에 대한 피험자의 전반적 평가였다. 조사원 등급 부여에서, 4-점 등급 척도(0=없음(none) Ⅰ=가벼움(mild) 2=중등도 3=중증)을 사용하는 미간 주름의 심각도에 대한 등급 부여를 돕도록 사진 안내서(photoguide)가 각 연구 센터에 제공되었다. 반응자(responder)는 0 또는 1 심각도 등급을 갖는 자로 정의하였다. 미간 주름의 외양 변화에 대한 전반적 평가에 대하여, 피험자는 "비침습성 보톡스 크림을 사용한 치료 직전과 비교하여 당신의 미간 주름의 외양 변화를 어떻게 평가하시겠습니까?"라는 질문에 응답하였다. 피험자 응답의 등급 부여는 +4(완전한 향상, 약 100%) 내지 -4(매우 뚜렷한 악화, 약 100% 악화 또는 그 이상)였다. 반응자는 +2(중등도 향상, 약 50%) 이상의 등급을 갖는 자로 정의하였다.

2차 효능 종점은 기준치로 휴식시에 중등도 또는 중증의 미간 주름 심각도 등급을 나타낸 피험자들에서의 치료 후 30일째 휴식시 미간 주름 심각도에 대한 조사원의 등급 부여였다. 조사원 등급 부여에서, 효과의 판정 기준은 안정화된 보톡스 크림 치료군과 플라시보 치료군 사이에서 30 퍼센트 포인트 차이의 최대로 찌푸렸을 때 없거나 가벼운 정도의 미간 주름 심각도의 조사원 등급 부여를 받은 피험자의 발생 정도였다. 피험자의 등급 부여에 대하여, 효과의 판정 기준은 안정화된 보톡스 크림 치료군과 플라시보 치료군 사이에서 25 퍼센트 포인트 차이의 미간 주름의 외양 변화의 피험자의 전반적 평가에서 +2(중등도 향상) 이상의 점수를 받은 피험자의 발생 정도였다.

조합된 결과를 여기 나타내었다. 중등도 또는 중증의 휴식시 미간 주름 심각도 등급을 받은 40 명의 피험자(20 명의 실제 보톡스 크림 치료군 피험자 및 20 명의 플라시보 크림 치료군 피험자)들이 나타나있다.

평균 나이는 54 세였으며, 40 내지 74 세 범위였다. 이 중에서, 대부분은 <50 세이고 6.0%는 ≥65 세였다. 대부분의 피험자, 80%(32/40)는 여성이고, 백인(Caucasian)은 83.8%였다.

이 연구에서, 최대로 찌푸렸을 때 및 안정시의 미간 주름 심각도에 대한 조사원의 등급 부여에 의해, 그리고 미간 주름의 외양 변화에 대한 피험자의 전반적 평가에 의해 측정된 바와 같이, 미간 주름 심각도는 플라시보 크림 군에 비해 보톡스 크림 군에서 7일 이내로 감소하였다. 10일째에, 80%(16/20)의 피험자들은 조사원의 평가에 의해 최대로 찌푸렸을 때 가벼운 심각도 등급을 달성하였다. 이것은 플라시보 치료된 환자와 비교하여 30일째의 1차 효능 종료일에는 92%로 증가하였다(표 1). 10일째에, 활성 군의 84%의 피험자들은 그들 자신의 외양에서 중등도 또는 그보다 우수한 향상(+2 또는 그 이상)이 있다고 평가하였다. 이것은 3%의 플라시보 치료된 환자에 비하여, 30일째의 1차 효능 종료일에는 93%로 증가하였다. 조사원에 의해 판정된 것과 같이 휴식시 외양에 기초하여, 62%의 피험자들은 11일째에 없음 또는 가벼움의 심각도 등급을 달성하였으며, 30일째의 효능 종료일에는 94%가 달성하였다.

날짜	보톡스-크림	플라시보	차이	p-수치
7	76%	(15/20)	3%	(1/20)	73%	<0.0001
10	80%	(16/20)	3%	(1/20)	77%	<0.0001
20	88%	(18/20)	5%	(1/20)	83%	<0.0001
30	94%	(19/20)	5%	(1/20)	89%	<0.0001

Claims

안정화된 단백질 조성물로서, 상기 조성물은 활성 단백질 제제(active protein agent), 콜라겐, 엘라스틴, 단쇄 알코올, 장쇄 알코올, 또는 폴리알코올, 아민 및 아미드로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 흡수 증진제, 및 계면활성제, 용매 및 안정화제의 조합에 의해 형성되는 인지질 미셀(micelle)에 캡슐화된 1 이상의 활성화제를 포함하고, 상기 단백질 조성물은 실온에서 4주 초과의 기간 동안 안정한 것인 조성물.
제1항에 있어서, 흡수 증진제는 d-리모넨, 알란토인, 풀브산, 미르(myrrh), 히드로퀴논 글리퀸(glyquin), 퀼라야 사포나리아(quillaja saponaria, QTS), 및 아칸토필럼 스쿠아루솜(acanthophyllum squarrusom, ATS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 안정화된 단백질 조성물.
제1항에 있어서, 활성 단백질 제제는 보툴리눔 독소이고 상기 보툴리눔 독소는 실온에서 6 개월 이상 동안 안정한 것인 조성물.
제3항에 있어서, 활성 단백질 제제는 보툴리눔 독소 A형인 조성물.
제1항에 정의된 바와 같은 조성물 및 국소(topical) 투여에 적합한 1 이상의 첨가제를 포함하는 약학 또는 화장품 제형(formulation).
제1항에 따른 약학 또는 화장품 제형으로서:
활성 단백질 제제;
약 1 내지 40중량%의 콜라겐;
약 1 내지 40중량%의 엘라스틴;
약 0.1 내지 15%의 스핑고신 인지질; 및
약 0.1 내지 15%의 세레브로시드 인지질
을 포함하는 제형.
제5항에 있어서, 활성화제는 보툴리눔 독소인 제형.
제7항에 있어서, 보툴리눔 독소는 A형인 제형.
제2항에 있어서, 활성 단백질 제제는 보툴리눔 독소이고 상기 보툴리눔 독소는 실온에서 6 개월 이상 동안 안정한 것인 조성물.
제6항에 있어서, 활성 단백질 제제는 보툴리눔 독소이고 상기 보툴리눔 독소는 실온에서 6 개월 이상 동안 안정한 것인 조성물.
안정화된 활성화제 조성물을 제조하는 방법으로서: ⅰ. 인지질을 용매에 용해시켜 인지질 용액을 제조하는 단계; 및 ⅱ. 상기 인지질 용액을 활성화제와 혼합시켜 인지질 미셀 캡슐화된 활성화제 용액을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
제11항에 있어서, i. 미셀 용액을 용해된 콜라겐 및 엘라스틴의 용액과 배합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 인지질은 스핑고신, 세레브로시드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제13항에 있어서, 스핑고신 및 세레브로시드를 동일한 양으로 사용하는 방법.
제11항에 있어서, 용매는 알코올인 방법.
제15항에 있어서, 알코올은 이소프로판올, 에탄올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제12항에 있어서, 용해된 콜라겐 및 엘라스틴의 용액은 동일한 양의 콜라겐 및 엘라스틴을 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 활성화제는 보툴리눔 독소, 히알루론산, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 아연, 셀레늄, 리코펜, N-아세틸-시스테인, 포도 껍질, 빌베리(Bilberry) 및 녹차의 천연 식물 추출물, 혈관확장제, 호르몬, 성장 인자, 백신 제제, 약물, 치료용 단백질, 소분자, 발한 억제제(antiperspirant agents), 진통제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제18항에 있어서, 활성화제는 히알루론산 및/또는 보툴리눔 독소인 방법.
제11항에 있어서, d-리모넨, 알란토인, 풀브산, 미르, 히드로퀴논, 글리퀸, 퀼라야 사포나리아, 및 아칸토필럼 스쿠아루솜으로 이루어진 군으로부터 선택된 투과 증진 화합물을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 스핑고시드의 농도는 약 0.1 내지 15 wt/wt%이고 세레브로시드의 농도는 약 0.1 내지 15 wt/wt%인 방법.