CN101914546A - 文昌鱼糖类模式识别分子Bjfcn1基因及其应用 - Google Patents
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本发明涉及文昌鱼糖类模式识别分子Bjfcn1基因及其编码的蛋白PBjfcn1，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。本发明通过兼并引物扩增和RACE全长扩增的方法，从文昌鱼总RNA中克隆得到Bjfcn1基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码的蛋白PBjfcn1的氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。本发明的糖类模式识别蛋白初步验证能较为广泛结合细菌表面的多糖，并且有明显的细菌结合、细菌凝集作用，可发展为天然的抑菌活性物质以及制备治疗感染性疾病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及文昌鱼糖类模式识别分子Bjfcn1基因及其编码的蛋白PBjfcn1，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。
背景技术
文昌鱼(Branchiostoma Japonicum)属于脊索动物门(Chordate)，头索动物亚门(Cephalochordate)，是现存和脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物，近年来，对文昌鱼免疫系统的研究引起了广泛的重视，其中发现了不少具有重要意义的免疫基因。
纤维胶凝蛋白(Ficolin)最初作为一种转化生长因子-β1(TGF-β1)，是从猪的子宫内膜中分离得到的。它是近年来所发现的天然免疫中一种重要的“一线防御”分子，也是继胶原凝素(Collectin)之后的又一种重要的糖类模式识别分子，与胶凝素超家族中的典型代表甘露聚糖结合凝集素(MBL)在结构和功能上相类似，均具有凝集素活性。Ficolin含有胶原样结构域(Collagen-like Domain，CLR)和纤维蛋白原样结构域(Fibrinogen-like Domain，FBG)，而FBG是病原微生物表面寡聚糖样结构的结合部位。研究表明，Ficolin家族中的某些成员与病原微生物表面相应的糖基配体结合后，通过补体活化的凝集素途径和调理吞噬作用在天然免疫中发挥着免疫效应。
迄今，已在人类中发现了3种Ficolin分子，分别是L-ficolin、H-ficolin和M-ficolin。前两者主要存在于血清中，后者则为表达于肺和单核细胞膜表面。L-ficolin每条肽链的相对分子量为35kD，包括4个功能区，即含13个氨基酸的N末端区；带有Gly-Xaa-Yaa三聚体重复序列(Gly为甘氨酸，Xaa和Yaa为任意氨基酸)的胶原样区；一个由9个氨基酸组成的颈区及长达209个氨基酸的C末端区。C末端区与MBL的糖类识别区(Carbohydrate-recognition Domain，CRD)十分相像，其独立卷曲而形成球形的FBG区。3种Ficolin都能结合GlcNAC，但L-ficolin对甘露糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖无明显的亲和性。与Ficolin结合的糖类配体都是病原微生物表面常见的结构成份，主要是脂多糖(LPS)和甘露糖样结构。近期又有研究称，L-ficolin对A型H1N1流感病毒感染小鼠有一定保护作用，揭示L-ficolin可作为抗流感病毒的新型候选制剂。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新的文昌鱼糖类模式识别分子Bjfcn1基因及其编码的糖类模式识别蛋白PBjfcn1。
本发明的另一个目的在于提供文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1的表达方法。
本发明的再一个目的在于提供该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。
本发明通过兼并引物扩增和RACE全长扩增的方法，从文昌鱼总RNA中克隆得到文昌鱼糖类模式识别分子Bjfcn1基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
由文昌鱼糖类模式识别分子Bjfcn1基因编码的糖类模式识别蛋白PBjfcn1，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。该蛋白的等电点为5.62，分子量为45.926KDa。
文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1是通过重组表达载体pETSUMO-Bjfcn1，在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的，具体包括以下步骤：
1)重组表达载体pETSUMO-Bjfcn1的构建；
2)将重组表达载体pETSUMO-Bjfcn1转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)；
3)对转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)进行培养；
4)文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1的提取和纯化。
所述的表达载体pETSUMO-Bjfcn1是以SUMO(Small Ubiquitin-like Modifier)蛋白为分子融合伴体，该系统使重组蛋白在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。
本发明所选择的文昌鱼属于中国青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)，采自山东省青岛市沙子口水域。
本发明通过兼并引物扩增从文昌鱼的cDNA一链中克隆得到了部分目标片段，并对该片段进行了扩增，得到了目标基因序列的全长克隆，命名为Bjfcn1，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码422个氨基酸，其氨基酸序列如序列表<400>2序列所示，含有24个氨基酸的信号肽，去除信号肽的成熟蛋白等电点为5.62，分子量为43.418KDa。
本发明通过设计一对引物，将Bjfcn1基因的成熟蛋白编码序列克隆到原核融合表达载体pETSUMO上，构建重组表达质粒pETSUMO-Bjfcn1并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此重组表达载体以T7为启动子，SUMO为分子融合伴体，能帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，其C端有6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。该重组蛋白编码518个氨基酸，等电点为6.21，分子量为57.625KDa。通过对培养时间、诱导时间和温度等条件的摸索和优化，重组蛋白PBjfcn1的表达量较高，大部分处于可溶状态。
本发明还摸索和优化了重组蛋白PBjfcn1的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni-NTAAgarose亲和色谱层析，得到纯度较高的目标蛋白。
本发明的表达质粒复制方法：参照SBjbrook(SBjbrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，通过CaCl2的方法，将质粒转化E.coli.DH5α或BL21(DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的2×YT培养基培养转化菌株，用Omega公司试剂盒提取质粒。
本发明的文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1初步验证，能较为广泛结合细菌表面的多糖，并且有明显的细菌结合、细菌凝集作用，可开发为天然的抑菌活性物质以及制备治疗感染性疾病的药物。
附图说明
图1为本发明所述的文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1与其它物种Ficolin家族成员蛋白的序列比较结果。其中，Hm表示人类；Mm表示小鼠；Xe表示爪蟾；As表示海鞘。用于进化分析的序列包括以下这些：Hm_FCN_1(NP_001994)；Hm_FCN_2(NP_004099)；Hm_FCN_3(NP_003656)；Mm_FCN_A(NP_032021)；Mm_FCN_B(NP_034320)；Xe_FCN_1(NP_001082604)；Xe_FCN_3(NP_001079138)；Xe_FCN_4(NP_001079139)；As_FCN_1(BAB60704)；As_FCN_3(BAB60706)；As_FCN_1(BAB60707)。
图2为扩增得到的Bjfcn1基因全长片段。其中，1表示DNA分子量标准(DL2000)；2表示PCR扩增得到的产物。
图3为Bjfcn1基因的重组表达载体pETSUMO-Bjfcn1的构建流程图。
图4为构建重组表达载体时，Bjfcn1基因用限制性酶HindIII、Xho I酶切后的电泳图。其中，1表示DNA分子量标准(DL2000)；2表示酶切后的Bjfcn1基因片段。
图5为构建重组表达载体时，pETSUMO载体用限制性酶HindIII、Xho I酶切后的电泳图。其中，1表示酶切前的pETSUMO质粒；2、3表示酶切后的pETSUMO质粒。
图6为文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1经诱导表达后的蛋白电泳图。其中，1表示未经诱导的PBjfcn1菌体总蛋白；2表示经IPTG诱导的PBjfcn1菌体总蛋白；3表示诱导菌超声沉淀总蛋白；4表示诱导菌超声上清总蛋白；M表示蛋白分子量标准。
图7为文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1经Ni柱纯化后的蛋白电泳图。其中，1表示蛋白分子量标准；2表示纯化的文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1。
图8表示文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1的红细胞凝集活性实验。
图9表示文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1与细菌结合及凝集实验。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：文昌鱼总RNA的提取和Bjfcn1部分片段的扩增
取文昌鱼全鱼，采用Trizol试剂法提取总RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白质，获得文昌鱼总RNA。取1μg总RNA，按照TOYOBO公司的First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTraAce-α-TM(code No.FSK-100)说明书操作，进行逆转录合成第一链。取2μl cDNA一链产物，以根据其他ficolin家族基因设计的兼并引物5′PCR Primer：5′-ACAGCCAGTGGAGTCTACCCACTTG-3′和3′PCR Primer：5′-TCAGGGAGTAATACCAGCCTTTCCA-3′为引物，进行PCR扩增Bjfcn1的部分片段582bp。将扩增得到的目标片段连接到pGEX T easy vector(promega)后，转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。Blast同源分析表明，获得的这个片段含有FBG结构域，属于Ficolin家族成员。
实施例2：RACE扩增Bjfcn1基因5′和3′末端
按照Invitrogen的GeneRacerTM Kit进行RNA的去磷酸化RACE、脱帽反应、RNA oligo的连接及mRNA的逆转录，从而合成cDNA一链，采用Takara的LA Taq聚合酶，按照GeneRacerTM Kit的反应体系进行PCR扩增。其中，根据实施例1扩增得到的Bjfcn1部分片段，设计进行5′RACE扩增的基因特异的外套引物为5′-gene-specific primer：5′-TCATCCCAGTCCATCAGGTCAAAC-3′，内巢引物为5′-nested primer：5′-TGTTCCCGAAGCCCTGTTTGTAC-3′；3′RACE扩增的基因特异的外套引物为5′-gene-specific primer：5′-GGAGGAGTACAAACAGGGCTTCG-3′；内巢引物为5′-nested primer：5′-ACGAGAACATCCACCTCCTGACTG-3′。将扩增得到的目标片段连接到pGEX T easy vector(promega)后，转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序，并与实施例1得到的目标片段进行拼接，得到Bjfcn1基因的全长序列，长度为2583bp，编码422个氨基酸的BjFCN1蛋白。
实施例3：Bjfcn1全长序列的扩增及序列分析
根据实施例2拼接得到的Bjfcn1序列，设计引物5′-TGCGTCCAAGAAGCTGTTCCCA-3′和5′-TGATTTTGTGGATAACTGGGTGTGA-3′，采用Takara的LA Taq聚合酶扩增Bjfcn1的ORF框基因，扩增得到的1405bp片段的电泳图谱如图2所示。将扩增得到的目标片段连接到pGEX T easy vector(promega)后，转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。Blast同源分析表明，获得了Bjfcn1基因的全长序列。
实施例4：重组Bjfcn1表达质粒的构建
依据Bjfcn1基因的两端序列合成一对引物，其中，上游引物含HindIII切割位点，下游引物含Xho I切割位点。
上游引物(P1)：5’-ccc AAGCTT cATGCGGGACCAGCAGATGGCTTTC-3’
保护碱基 HindIII Bjfcn1基因序列
下游引物(P2)：5’-ccg CTCGAG TTGTGGCCTGATTTTCATAG-3’
保护碱基 Xho I Bjfcn1基因序列
以含有Bjfcn1基因的pGEX质粒为模板，P1、P2为引物，进行PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在1211bp左右。将所获得的PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pETSUMO上，得到重组表达载体pETSUMO-Bjfcn1(其构建过程如图3所示)。重组表达载体pETSUMO-Bjfcn1中的外源基因经测序鉴定正确。
实施例5：文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1的表达
将重组表达载体pETSUMO-BjFCN1转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌超声裂解上清液，经SDS-PAGE电泳分析表明，菌株经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件DNA TOOLS6.0预测的理论值产生部分误差，蛋白电泳得到PBjfcn1的分子量为64KDa。对培养时间、诱导浓度、温度等条件的摸索得出，基因工程菌的培养条件为：将单菌落接种于30ml含有100mg/L氨苄青霉素抗性2×YT液体培养基中，37℃、250rpm培养过夜；取过夜培养物按1∶100的比例接种于含有氨卞青霉素的2×YT培养基中，37℃、250rpm培养至OD600＝0.6，加入终浓度为0.2mM的IPTG，18℃、250rpm诱导培养过夜后，离心，收集菌体。经SDS-PAGE电泳分析表明：在该培养条件下，重组蛋白PBjfcn1的表达量占菌体总蛋白的50％以上，处于可溶状态。
实施例6：文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1的纯化
将总菌体用TBS溶液(50mM Tris.Cl，150mM NaCl，pH7.5)进行洗涤，再用适量的TBS溶液悬浮，超声处理后，裂解上清液进行亲和色谱层析纯化，通过SDS-PAGE分析重组蛋白的表达和层析的结果。从SDS-PAGE结果可以得出：重组蛋白PBjfcn1能被Ni-NTAAgarose亲和柱吸附，用100mM咪唑洗柱时，能把目标蛋白PBjfcn1洗脱下来。收集得到目标蛋白的洗脱峰后，经凝胶柱除去蛋白中的咪唑，并用蛋白超滤柱(Millipore)进行浓缩，得到成份单一且浓度较高的文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1(如图7所示)。
实施例7：文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1的红细胞凝集活性分析
取鼠新鲜血液，2000rpm离心10min除去血浆，加10倍体积的TBS溶液充分洗涤，然后1000rpm离心3min，去上清，重复三次，最后经2500rpm离心3min，配成2％(V/V)的红细胞悬浮液。活力测定在96孔V型血凝板中进行，先在各孔中加入的2％(V/V)的TBS红细胞悬浮液，再往其中加重组蛋白PBjfcn1样品，以及不同浓度的Ca2+、EDTA蛋白溶液，同时以SUMO单体蛋白为阴性对照。温和混匀，在室温下放置1～2h，肉眼观察。加入SUMO的红细胞不发生凝集则在管底沉积，而加入重组蛋白PBjfcn1和Ca2+的孔中则发生了凝集，红细胞之间形成一似网络扩散的红斑块(如图8所示)。
实施例8：文昌鱼糖类模式识别蛋白PBjfcn1的细菌结合及凝集活性分析
各菌体细胞用TBS-Ca2+缓冲液(TBS缓冲液中加入10mM CaCl2)调节OD600浓度至2.0，与适量重组蛋白PBjfcn1混匀，并在4℃摇床中孵育过夜。之后，各菌体用TBS-Ca2+缓冲液洗涤非特异结合蛋白，再各加入30μl SDS-PAGE样品缓冲液，于100℃煮样15min。最后通过SDS-PAGE和Western Blot进行检测(如图9A所示)。重组蛋白PBjfcn1与各菌体均有明显的结合作用。
各菌体细胞用TBS缓冲液调节OD600浓度至3.0，然后与50μl的FITC混匀，于室温暗室中荧光标记1小时，之后用TBS-Ca2+缓冲液洗涤4次。各标记混合物加入适量含有Ca2+的重组蛋白PBjfcn1，以SUMO单体蛋白为阴性对照，于室温下孵育1小时。最后用荧光显微镜进行镜检(如图9B所示)。重组蛋白PBjfcn1能明显凝集大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌以及金黄色葡萄球菌。
Claims (8)
1.通过兼并引物扩增和RACE全长扩增的方法，从文昌鱼总RNA中克隆得到的文昌鱼糖类模式识别分子Bjfcn1基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
2.由权利要求1所述的文昌鱼糖类模式识别分子Bjfcn1基因编码的糖类模式识别蛋白PBjfcn1，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。
3.权利要求2所述的糖类模式识别蛋白PBjfcn1的表达方法，其特征在于：通过重组表达载体pETSUMO-Bjfcn1，在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。
4.根据权利要求3所述的表达方法，包括以下步骤：
1)重组表达载体pETSUMO-Bjfcn1的构建；
2)将重组表达载体pETSUMO-Bjfcn1转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)；
3)对转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)进行培养；
4)糖类模式识别蛋白PBjfcn1的提取和纯化。
5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，在步骤1)中所述的重组表达载体pETSUMO-Bjfcn1的构建包括以下步骤：
a)依据权利要求1所述的Bjfcn1基因的两端序列合成一对引物，其中，上游引物P1为5’-cccAAGCTTcATGCGGGACCAGCAGATGGCTTTC-3’，含有HindIII切割位点；下游引物P2为5’-ccgCTCGAGTTGTGGCCTGATTTTCATAG-3’，含有Xho I切割位点；
b)以含有Bjfcn1基因的pGEM T easy vector质粒为模板，以P1、P2为引物，进行PCR扩增；
c)将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pETSUMO上，得到重组表达载体pETSUMO-Bjfcn1。
6.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，步骤3)的培养条件为：将单菌落接种于30ml含有100mg/L氨苄青霉素抗性2×YT液体培养基中，37℃、250rpm培养过夜；取过夜培养物按1∶100的比例接种于含有氨卞青霉素的2×YT培养基中，37℃、250rpm培养至OD600＝0.6，加入终浓度为0.2mM的IPTG，18℃、250rpm诱导培养过夜后离心收集菌体。
7.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于：在步骤4)中，将总菌体用Tris缓冲液洗涤后，再悬浮，超声处理后，高速离心，裂解上清液经Ni-NTA Agarose亲和色谱层析纯化，收集目标蛋白的洗脱峰。
8.权利要求2所述的糖类模式识别蛋白PBifcn1在制备治疗感染性疾病药物中的应用。
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