CN116535505A

CN116535505A - 抗红细胞胞膜抗原的抗体、含有其的试剂和试剂盒及截留或分离红细胞的方法

Info

Publication number: CN116535505A
Application number: CN202210095447.6A
Authority: CN
Inventors: 孟媛; 钟冬梅; 陈晓倩
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-01-26
Filing date: 2022-01-26
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2042-01-26
Also published as: CN116535505B

Abstract

本发明公开了一种抗红细胞胞膜抗原的抗体、含有其的试剂和试剂盒及一种截留或分离红细胞的方法，涉及抗体技术领域。本发明公开的抗红细胞胞膜抗原的抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区。该抗体可以特异性结合红细胞胞膜抗原，可有效截留红细胞，减少了红细胞对检测的干扰。

Description

抗红细胞胞膜抗原的抗体、含有其的试剂和试剂盒及截留或分离红细胞的方法

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗红细胞胞膜抗原的抗体、含有其的试剂和试剂盒及一种截留或分离红细胞的方法。

背景技术

在体外诊断领域，常用的血液样本类型为血清或血浆，由于不存在红细胞等干扰物质，检测结果准确可靠。但是血浆或血清样本通常需要将全血样本经过血液处理步骤得到，常常需要等待较长时间或需要经过繁琐的处理步骤。血清样本采用非抗凝采血管进行采集，至少需要30分钟的血液凝固时间得到血清样本。血浆样本虽然不需要等待凝固，但也需要静置或借助离心机离心5-10分钟，不能采血后马上用于检测，离心力也可能对红细胞造成损害导致溶血现象。但是目前临床上对快速检测的要求越来越高，特别是急诊科、ICU等科室，要求采血后20分钟内即能出具检测报告。因此，利用不用处理的全血进行检测在临床应用上具有切实的需求。

血液的主要成分为血浆、血细胞及遗传物质(染色体和基因)，其主要成分有无机盐、氧、激素、抗体、酶、细胞代谢物等。血红蛋白是红细胞的主要组成部分，血红蛋白本身有颜色，在快速检测中如果使用不处理的全血进行检测，红细胞以及红细胞破裂产生的血红蛋白会对检测带来极大的颜色干扰。为了解决这个问题，可利用特异性的抗红细胞胞膜抗原抗体处理样品垫，使全血样品中的红细胞被样品垫上的抗体捕获而不能流向检测显色区，从而避免了对快速检测的影响。

目前针对抗红细胞胞膜(Erythrocyte membrane)抗原的抗体原料来源少，且对红细胞截留效果也还存在一定缺陷，此外应用中，该抗体的使用量非常大，所以也有降低原料成本的迫切需求。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对上述技术问题，本发明旨在提供一种抗红细胞胞膜抗原的抗体，该抗体可以特异性结合红细胞胞膜抗原，可有效截留红细胞，减少了红细胞对检测的干扰。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗红细胞胞膜抗原的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；

HCDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；

HCDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR1，其包含SEQ ID NO:4或21所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或由其组成。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种抗红细胞胞膜抗原的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为上述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列。

为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种抗红细胞胞膜抗原的抗体，包括重链和/或轻链，所述重链包括上述的重链可变区和上述的重链恒定区；所述轻链包括上述的轻链可变区和上述的轻链恒定区。

为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种载体、一种重组细胞及一种制备上述抗体或其功能性片段的方法。

为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种包含上述抗体或其功能性片段的固相偶联物、试剂及试剂盒。

为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种截留或分离红细胞的方法，所述方法包括用上述的抗体或其功能性片段或上述的固相偶联物、试剂或试剂盒与样本中的红细胞进行结合从而截留或分离红细胞。

为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了一种检测含有红细胞的样本中待测物浓度的方法，所述方法包括上述的截留或分离红细胞的方法。

为了实现上述目的，根据本发明的第八个方面，提供了一种免疫层析试纸，所述免疫层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫或结合垫上包被有上述的抗体或其功能性片段。通过抗体截留红细胞，减少了红细胞对检测的干扰，从而进一步提高了免疫层析试纸检测的灵敏度和特异性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为Anti-EM-8F9mut1、Anti-EM-8F9mut2、Anti-EM-8F9mut3、Anti-EM-8F9mut4的还原性SDS-PAGE的结果。

具体实施方式

本发明提供了一种抗红细胞胞膜抗原的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；

HCDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；

HCDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR1，其包含SEQ ID NO:4或21所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或由其组成。

在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。

在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。

在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。

在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。

在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段还具有以下的框架区：

HFR1氨基酸序列如SEQ ID NO:7或24所示或与其具有至少80％同源性；

HFR2氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示或与其具有至少80％同源性；

HFR3氨基酸序列如SEQ ID NO:9或27所示或与其具有至少80％同源性；

HFR4氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示或与其具有至少80％同源性；

LFR1氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示或与其具有至少80％同源性；

LFR2氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示或与其具有至少80％同源性；

LFR3氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示或与其具有至少80％同源性；

LFR4氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示或与其具有至少80％同源性。

需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其功能性片段的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:4所示的LCDR1及SEQ ID NO:7、9所示的HFR1、HFR3；

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:21所示的LCDR1及SEQ ID NO:7、9所示的HFR1、HFR3；

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:21所示的LCDR1及SEQ ID NO:24、9所示的HFR1、HFR3；

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:21所示的LCDR1及SEQ ID NO:24、27所示的HFR1、HFR3。

另一方面，本发明实施例提供了一种抗红细胞胞膜抗原的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为上述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列，所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列为上述的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列。

在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15、25、28任一所示；

在可选的实施方式中，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16、22任一所示所示。

在可选的实施方式中，所述抗体还包含恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、骆驼、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为小鼠。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列(CH)如SEQ ID NO:17所示，所述轻链恒定区(CL)序列如SEQ ID NO:18所示。

需要说明的是，在其他的实施例中，所述恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ IDNO:17或18)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的VHH、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。

上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

另一方面，本发明提供一种抗红细胞胞膜抗原的抗体，包括重链和/或轻链，所述重链包括上述的重链可变区和上述的重链恒定区；所述轻链包括上述的轻链可变区和上述的轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:19、26、29任一所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20、23任一所示。

另一方面，本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。

另一方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。

另一方面，本发明提供含有上述载体的重组细胞。

另一方面，本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如上所述的重组细胞。

另一方面，本发明提供一种固相偶联物，所述固相偶联物包括上述的抗体或其功能性片段和固相。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段包被所述固相。

在可选的实施方式中，所述固相选自微球、板、柱和膜。

在可选的实施方式中，所述固相选自磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、乳胶、纸、布、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙、玻璃纤维素膜和硝酸纤维素膜。

另一方面，本发明提供一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段或上述的固相偶联物。

在可选的实施方式中，所述试剂为样本预处理液。

在可选的实施方式中，所述样本为含有红细胞的血液样品，例如全血样本。

另一方面，本发明提供一种截留或分离红细胞的方法，所述方法包括用上述的抗体或其功能性片段或上述的固相偶联物或上述的试剂或试剂盒与样本中的红细胞进行结合从而截留或分离红细胞。

在可选的实施方式中，所述方法包括用上述的抗体或其功能性片段包被免疫层析试纸的样品垫或结合垫，使样品中的红细胞被所述的抗体捕获，而不能流向检测线显色，从而避免了对检测的影响。

另一方面，本发明提供一种检测含有红细胞的样本中待测物浓度的方法，所述方法包括上述的截留或分离红细胞的方法，通过截留或者分离待测样本中的红细胞，避免对检测的影响。

另一方面，本发明提供一种免疫层析试纸，所述免疫层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫或结合垫上包被有上述的抗体或其功能性片段。使含有红细胞的待测样本中的红细胞被样品垫上的抗体捕获而不能流向检测显色区，从而避免了对快速检测的影响，提高了所述免疫层析试纸的检测灵敏度和特异性。

在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1Anti-EM 8F9单克隆抗体的制备

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。

1重组质粒的构建

(1)抗体基因制备

从分泌Anti-EM 8F9单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆，各4个克隆送基因测序公司进行测序。

(2)Anti-EM 8F9抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为336bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为351bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

(3)重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM 3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.72kb的Light Chain基因片段和1.43kb的Heavy Chain基因片段。

Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

2稳定细胞株筛选

(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

质粒用超纯水稀释至40ug/100ul，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

利用4％的甲醛稀释人新鲜红细胞，每孔100μL加入酶标板中，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μL/孔，含柠檬酸+醋酸钠+乙酰苯胺+过氧化脲)，加入显色液B液(50μL/孔，含柠檬酸+EDTA·2Na+TMB+浓HCL)，10min；加入终止液(50μL/孔，含EDTA·2Na+浓H₂SO₄)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对红细胞胞膜抗原有活性。

(2)重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50μL、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μL、无菌水补至500μL，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至40ug/100ul，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

3重组抗体生产

(1)细胞扩培

细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

(2)摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用protein A亲和层析柱进行亲和纯化。取6.6μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图所示，在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD，另一条Mr为28KD。

实施例2亲和力及活性优化

实施例1得到的Anti-EM-8F9单克隆抗体虽然具备结合红细胞的能力，但抗体活性不够理想，因而申请人通过对该抗体的轻链CDR及重链CDR进行单点定向突变。即利用计算机进行抗体可变区结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计，根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应，将PCR产物克隆至载体，再按照实施例1所述的方法进行突变抗体的制备。经筛选，得到抗体活性显著提升的单克隆抗体，并命名为：Anti-EM-8F9mut1、Anti-EM-8F9mut2、Anti-EM-8F9mut3、Anti-EM-8F9mut4。

Anti-EM-8F9mut1单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19和20所示。

Anti-EM-8F9mut2单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19和23所示。

Anti-EM-8F9mut3单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:26和23所示。

Anti-EM-8F9mut4单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:29和23所示。

实施例3抗体的性能检测

(1)活性检测

利用4％的甲醛稀释人新鲜红细胞，每孔100uL加入酶标板中，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的上述单克隆抗体，100μl/孔，37℃，30min-60min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液(PBS)清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔，含2.1g/L柠檬酸、12.25g/L柠檬酸、0.07g/L乙酰苯胺和0.5g/L过氧化脲)，加入显色液B液(50μl/孔，含1.05g/L柠檬酸、0.186g/LEDTA·2Na、0.45g/L TMB和0.2ml/L浓HCl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含0.75g/EDTA·2Na和10.2ml/L浓H₂SO₄)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果见下表1。

表1活性数据

样品浓度(ng/ml)	50	25	12.5	6.25	3.125	0
							对照	1.892	1.297	0.696	0.408	0.196	0.041
Anti-EM-8F9mut1	2.363	2.419	2.331	2.001	1.279	0.063
							Anti-EM-8F9mut2	2.319	2.456	2.322	1.964	1.276	0.047
Anti-EM-8F9mut3	2.337	2.431	2.337	1.971	1.288	0.071
							Anti-EM-8F9mut4	2.318	2.395	2.299	1.995	1.305	0.093

(2)性能评价

荧光检测样品垫用上述抗体进行处理，观察NC膜表面颜色变化判断抗体对红细胞的截留情况。实验结果：该组抗体对红细胞具有明显截留效果，且优于对照抗体。

具体见下表2：样品跑膜时间不超过8分钟为基本要求，膜面不能有红色，有红色代表截留效果不好。

表2样品跑膜时间数据

(3)稳定性考核

将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表3为Anti-EM-8F9mut1抗体考核21天的酶免活性检测OD结果。

表3稳定性数据

样品浓度(ng/ml)	12.5	1.5625	0
				4℃，21天样品	2.122	0.691	0.047
-80℃，21天样品	2.154	0.647	0.051
				37℃，21天样品	2.133	0.666	0.057

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本申请涉及的部分氨基酸序列如下所示：

编号	序列片段
		SEQ ID NO:1	NYNMH
SEQ ID NO:2	TIYAGDGDPSYNQKFKG
		SEQ ID NO:3	GGTRAM
SEQ ID NO:4	RSSQTLVHSDGNTYLA
		SEQ ID NO:5	KVSRRFS
SEQ ID NO:6	FQGSHVPF
		SEQ ID NO:21	RSSQTLVHSNGNTYLA

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 抗红细胞胞胞膜的抗体、含其的试剂和试剂盒及截留或分离红细胞的方法

<130> P2022012CN01

<160> 29

<170> PatentIn version 3.3

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<223> 人工序列

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Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

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<223> 人工序列

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<223> 人工序列

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Gln Val Pro Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

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<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

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Asp Val Leu Leu Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

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Asp Gln Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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65 70 75 80

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100 105 110

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<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 17

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

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Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

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Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys

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Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

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Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

245 250 255

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275 280 285

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 18

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

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<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

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Gln Val Pro Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Gln Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

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50 55 60

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Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

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225 230 235 240

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser

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Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp

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Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln

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Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser

290 295 300

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305 310 315 320

Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile

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340 345 350

Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met

355 360 365

Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn

370 375 380

Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 20

Asp Val Leu Leu Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val His Ser

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<212> PRT

<213> Artificial

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<223> 人工序列

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Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ala

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<210> 22

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 22

Asp Val Leu Leu Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val His Ser

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Arg

<210> 23

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 23

Asp Val Leu Leu Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val His Ser

20 25 30

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35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Arg Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

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Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

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195 200 205

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<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 24

Gln Val Pro Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

<210> 25

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 25

Gln Val Pro Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

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<210> 26

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 26

Gln Val Pro Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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115 120 125

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Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

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<210> 27

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 27

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<210> 28

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

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<223> 人工序列

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 29

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Ser Val Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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130 135 140

Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp

180 185 190

Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser

245 250 255

Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp

260 265 270

Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln

275 280 285

Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser

290 295 300

Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro

340 345 350

Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met

355 360 365

Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn

370 375 380

Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn

405 410 415

Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu

420 425 430

His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

435 440 445

Claims

1.一种抗红细胞胞膜抗原的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；

HCDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；

HCDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR1，其包含SEQ ID NO:4或21所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或由其组成。

2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还具有以下的框架区：

HFR2氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示或与其具有至少80％同源性；

HFR4氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示或与其具有至少80％同源性；

LFR1氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示或与其具有至少80％同源性；

LFR2氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示或与其具有至少80％同源性；

LFR3氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示或与其具有至少80％同源性；

LFR4氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示或与其具有至少80％同源性；

可选地，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:4所示的LCDR1及SEQ ID NO:7、9所示的HFR1、HFR3；

可选地，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:21所示的LCDR1及SEQ ID NO:7、9所示的HFR1、HFR3；

可选地，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:21所示的LCDR1及SEQ ID NO:24、9所示的HFR1、HFR3；

可选地，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:21所示的LCDR1及SEQ ID NO:24、27所示的HFR1、HFR3。

3.一种抗红细胞胞膜抗原的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为权利要求1所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列，所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列为权利要求2所述的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列；

可选地，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15、25、28任一所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16、22任一所示。

4.根据权利要求1至3任一所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还包含恒定区；

可选地，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；

可选地，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；

可选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人；

可选地，所述恒定区的种属来源为小鼠；

可选地，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:17所示或与其具有至少80％同源性，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:18所示或与其具有至少80％同源性。

5.根据权利要求1至4任一所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

6.一种抗红细胞胞膜抗原的抗体，包括重链和/或轻链，其特征在于，所述重链包括权利要求3所述的重链可变区和权利要求4所述的重链恒定区；所述轻链包括权利要求3所述的轻链可变区和权利要求4所述的轻链恒定区；

可选地，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:19、26、29任一所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20、23任一所示。

7.一种核酸，其特征在于，其编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段。

8.一种载体，其特征在于，其含有编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段的核酸片段。

9.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求8所述的载体。

10.一种制备权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求9所述的重组细胞。

11.一种固相偶联物，其特征在于，所述固相偶联物包括权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段和固相；

可选地，所述抗体或其功能性片段包被所述固相；

可选地，所述固相选自微球、板、柱和膜；

可选地，所述固相选自磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、乳胶、纸、布、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙、玻璃纤维素膜和硝酸纤维素膜。

12.一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求11所述的固相偶联物；

可选地，所述试剂为样本预处理液；

可选地，所述样本为含有红细胞的血液样品；可选为全血样本。

13.一种截留或分离红细胞的方法，其特征在于，所述方法包括用权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求11所述的固相偶联物或权利要求12所述的试剂或试剂盒与样本中的红细胞进行结合从而截留或分离红细胞；

优选地，所述方法包括用权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段包被免疫层析试纸的样品垫或结合垫，使样品中的红细胞被所述的抗体捕获，而不能流向检测线显色，从而避免了对检测的影响。

14.一种检测含有红细胞的样本中待测物浓度的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求13所述的截留或分离红细胞的方法。

15.一种免疫层析试纸，其特征在于，所述免疫层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫或结合垫上包被有权利要求1-6任一项所述的抗体或其功能性片段。