CN113337463A - 一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞、其制备方法及其应用 - Google Patents

一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于血小板抗体检测技术领域，具体地说，涉及一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞、其制备方法及其应用。所述的抗筛细胞采用如下方法制备得到：1）将已筛选确认抗原谱的3人份O型血小板等体积混合，使用血小板清洗液清洗、离心，弃掉上清，保留血小板沉淀；2）使用血小板载入液将步骤1）的血小板沉淀重悬，调整细胞浓度到（1.0‑2.0）×1010个/ml，振荡；3）振荡后使用血小板清洗液再次清洗，清洗完成后使用血小板保存液重悬沉淀，调整细胞浓度到（2.0‑5.0）×107个/ml，得到适用于血小板抗体检测的抗筛细胞。本方法制备的血小板抗筛细胞可以应用于血小板抗体检测，保存时间长，使用方便，抗原保存效果好。

Description

一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞、其制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于血小板抗体检测技术领域，具体地说，涉及一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞、其制备方法及其应用。
背景技术
血小板抗体是机体对血小板表面或相关抗原免疫产生的，刺激血小板抗体产生的抗原可以是自身的也可以是异体的。血小板抗体有两类，一类主要是针对人类组织相容性抗原（HLA）I类抗原的抗体，即血小板表面相关抗体（PA IgG），一类是针对GP抗原的血小板特异性抗体(PB IgG)。GP抗原和HLA-I类抗原刺激机体产生同种免疫反应，导致的外源性血小板破坏使血小板寿命缩短和功能改变，是血小板输注无效的重要原因，而随着输注次数及量的增加，检出血小板抗体的阳性率增高，发生输注无效及非溶血性输血反应率也增高。
血小板抗原经输血、妊娠及骨髓移植等可刺激机体产生血小板抗体，抗体可致敏血小板并使其破坏，引起血小板减少，导致患者出现淤点、淤斑、出血甚至死亡等严重后果。检测患者血小板抗体可辅助临床采取恰当的预防和治疗措施，为血小板抗体阳性患者进行交叉配型以筛选血小板相容性患者，可显著减少血小板输注无效症的发生。
抗血小板抗体检测试剂盒为各大医院输血科、血站提供了一个简单、快捷的方法来检测患者血液中是否有抗血小板抗体，可辅助临床采取恰当的预防和治疗措施。为抗血小板抗体阳性患者进行交叉配型以筛选血小板相容性供者，从而预防血小板输注无效。目前国内外抗血小板抗体检测主要有免疫细胞化学法、微柱凝胶法及固相凝集法三种。免疫细胞化学法由于需要专用仪器、繁琐、耗时，不适于基层开展，微柱凝胶法容易造成结果误差，而固相凝集法因灵敏度、特异性高而前景较好。
准确、快速、简便的检测和鉴定出血小板抗体对血小板免疫性疾病的诊断、治疗等方面起着重要的作用。目前临床上血小板抗体检测的主要方法是以免疫学方法为主，但因为血小板表面抗原的复杂性和多样性，到目前为止没有商品化的纯抗原销售。在当前的检测中多使用血小板本身作为抗原。然而正常情况下血小板的保存期仅为5-7天，而血小板抗体的检测又依赖于血小板抗原，这就为血小板抗体的检测增加了难度。目前我国尚无商品化的抗筛细胞，以致临床难以开展血小板抗体检测，少数血站应用的国外试剂价格昂贵，检测成本高，增加了患者负担。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞、其制备方法及其应用。本发明所提供的抗筛细胞可用于血小板抗体的检测，保存时间长，使用方便，抗原保存效果好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞，其中，所述的抗筛细胞采用如下方法制备得到：
1）将已筛选确认抗原谱的3人份O型血小板等体积混合，使用血小板清洗液清洗、离心，弃掉上清，保留血小板沉淀；
2）使用血小板载入液将步骤1）的血小板沉淀重悬，调整细胞浓度到（1.0-2.0）×1010个/ml，振荡；
3）振荡后使用血小板清洗液再次清洗，清洗完成后使用血小板保存液重悬沉淀，调整细胞浓度到（2.0-5.0）×107个/ml，得到适用于血小板抗体检测的抗筛细胞。
血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆解脱落下来的小块胞质，是构成人体血液的重要组成成分，在参与血液凝固过程、维持毛细血管的稳定性、器官移植排斥、炎症等生理及病理过程中扮演着重要的角色。正常情况下血小板保存期仅为5-7天，而血小板的抗体检测依赖于血小板抗原，为血小板抗体的检测增加了难度。本发明提供了一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞，可用于血小板抗体的检测，保存时间长，使用方便，抗原保存效果好，为血小板抗体的检测提供了方便。
本发明还提供一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：
1）将已筛选确认抗原谱的3人份O型血小板等体积混合，使用血小板清洗液清洗、离心，弃掉上清，保留血小板沉淀；
2）使用血小板载入液将步骤1）的血小板沉淀重悬，调整细胞浓度到（1.0-2.0）×1010个/ml，振荡；
3）振荡后使用血小板清洗液再次清洗，清洗完成后使用血小板保存液重悬沉淀，调整细胞浓度到（2.0-5.0）×107个/ml，得到适用于血小板抗体检测的抗筛细胞。
进一步地，
所述的血小板清洗液包括：柠檬酸钠5-15mmol/L，氯化钠75-80mmol/L，氯化钾10-20mmol/L，磷酸二氢钠15-25mmol/L，乙酸钠10-20mmol/L，氯化镁10-20mmol/L，硫酸钾3-8mmol/，牛血清白蛋白25-35g/L，蔗糖10-20g/L，海藻糖15-25g/L，葡萄糖15-25g/L，其pH为7.2-7.6；
所述的血小板载入液包括：HEPES 40-60mmol/L，氯化钠75-80mmol/L，氯化钾10-20mmol/L，蔗糖15-25g/L,海藻糖15-25g/L，D-甘露醇10-20g/L，冰醋酸10-20mmol/L，戊二醛0.0020-0.0030%，其pH为6.5-6.8；
所述的血小板保存液包括：HEPES 20-30mmol/L，氯化钠40-50mmol/L，氯化锌1-5mmol/L，氯化钙8-15mmol/l，乙酸钠8-15mmol/L，柠檬酸钠8-10mmol/L，碳酸氢钠20-30mmol/L，硫酸镁3-8mmol/L，海藻糖15-25g/L，葡萄糖10-20g/L，还原型谷胱甘肽5-15mg/L,对氨基苯甲酸10-20mg/L，核黄素1-5mg/L，肌醇1-5mg/L，谷氨酰胺20-30mg/L，维生素C3-8mg/L，木糖醇3-8g/L，牛磺酸15-25mg/L，硫酸新霉素115-125mg/L，氯霉素290-310mg/L，其pH为6.5-7.0。
作为一种优选方案，
所述的血小板清洗液包括：柠檬酸钠10mmol/L，氯化钠77mmol/L，氯化钾15mmol/L磷酸二氢钠20mmol/L，乙酸钠15mmol/L，氯化镁15mmol/L，硫酸钾5.0mmol/，牛血清白蛋白30g/L，蔗糖15g/L，海藻糖20g/L，葡萄糖20g/L，其pH7.4；所述的血小板载入液包括：HEPES50mmol/L，氯化钠77mmol/L，氯化钾15mmol/L，蔗糖20g/L,海藻糖20g/L，D-甘露醇15g/L，冰醋酸15mmol/L，戊二醛0.0025%，其pH6.68；
所述的血小板保存液包括：HEPES 25mmol/L，氯化钠45mmol/L，氯化锌3mmol/L，氯化钙12mmol/l，乙酸钠12mmol/L，柠檬酸钠9.4mmol/L，碳酸氢钠24mmol/L，硫酸镁5.6mmol/L，海藻糖20g/L，葡萄糖15g/L，还原型谷胱甘肽10mg/L,对氨基苯甲酸15mg/L，核黄素2mg/L，肌醇3.5mg/L，谷氨酰胺25mg/L，维生素C 5mg/L，木糖醇5g/L，牛磺酸20mg/L，硫酸新霉素120mg/L，氯霉素300mg/L，其pH6.86。
作为本发明的另一种方案，所述的血小板保存液中，所述的HEPES采用咪唑或磷酸盐缓冲液代替。
进一步地，步骤2）中，所述的振荡为在35-40℃下振荡1-3小时。
进一步地，所述的振荡为在37℃下振荡2小时。
进一步地，步骤1）中所述的清洗为清洗3遍；步骤3）中所述的清洗为清洗2遍。
本发明还提供所述的抗筛细胞在血小板抗体检测中的应用。
本发明还提供所述的抗筛细胞检测血小板抗体的方法，该方法为固相凝集法，其中，检测板的每个U型反应孔中加入的是本发明所述的抗筛细胞。
目前，固相凝集法是比较经典的检测血小板抗体的方法，该方法依赖于血小板抗原，然而正常情况下血小板保存期仅为5-7天，目前我国又尚无商品化的抗筛细胞，从而为血小板抗体的检测增加了难度。本发明所提供的抗筛细胞可作为固相凝集法检测血小板抗体的试剂，该试剂用于血小板抗体的检测时，保存时间长，使用方便，抗原保存效果好，为血小板抗体的检测提供了便利。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
血小板是构成人体血液的重要组成成分，在参与血液凝固过程、维持毛细血管的稳定性、器官移植排斥、炎症等生理及病理过程中扮演着重要的角色。正常情况下血小板保存期仅为5-7天，而血小板的抗体检测依赖于血小板抗原，为血小板抗体的检测增加了难度。本发明提供了一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞，可用于血小板抗体的检测，保存时间长，使用方便，抗原保存效果好，为血小板抗体的检测提供了方便，从而解决了目前血小板抗体的检测依赖于血小板抗原的局限。
附图说明
图1为本发明血小板抗体检测结果判读图。
具体实施方式
以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。
实施例1、制备抗筛细胞
1）将已筛选确认抗原谱的3人份的O型血小板等体积混合，使用血小板清洗液清洗3遍，每次清洗后离心，每次离心后弃掉上清，保留血小板沉淀；
2）使用血小板载入液将步骤1）的血小板沉淀重悬，调整细胞浓度到1.5×1010个/ml，37℃振荡2小时；
3）振荡结束后使用血小板清洗液清洗2遍，清洗完成后使用血小板保存液重悬沉淀，调整细胞浓度到3.0×107个/ml，得到适用于血小板抗体检测的抗筛细胞。
其中，所述的血小板清洗液包括：柠檬酸钠10mmol/L，氯化钠77mmol/L，氯化钾15mmol/L，磷酸二氢钠20mmol/L，乙酸钠15mmol/L，氯化镁15mmol/L，硫酸钾5.0mmol/，牛血清白蛋白30g/L，蔗糖15g/L，海藻糖20g/L，葡萄糖20g/L，其pH为7.4；
所述的血小板载入液包括：HEPES50mmol/L，氯化钠77mmol/L，氯化钾15mmol/L，蔗糖20g/L，海藻糖20g/L，D-甘露醇15g/L，冰醋酸15mmol/L，戊二醛0.0025%，其pH为6.68；
所述的血小板保存液包括：HEPES 25mmol/L，氯化钠45mmol/L，氯化锌3mmol/L，氯化钙12mmol/l，乙酸钠12mmol/L，柠檬酸钠9.4mmol/L，碳酸氢钠24mmol/L，硫酸镁5.6mmol/L，海藻糖20g/L，葡萄糖15g/L，还原型谷胱甘肽10mg/L，对氨基苯甲酸15mg/L，核黄素2mg/L，肌醇3.5mg/L，谷氨酰胺25mg/L，维生素C 5mg/L，木糖醇5g/L，牛磺酸20mg/L，硫酸新霉素120mg/L，氯霉素300mg/L，其pH为6.86。
实施例2、制备抗筛细胞
1）将已筛选确认抗原谱的3人份的O型血小板等体积混合，使用血小板清洗液清洗3遍，每次清洗后离心，每次离心后弃掉上清，保留血小板沉淀；
2）使用血小板载入液将步骤1）的血小板沉淀重悬，调整细胞浓度到1.0×1010个/ml，37℃振荡2小时；
3）振荡结束后使用血小板清洗液清洗2遍，清洗完成后使用血小板保存液重悬沉淀，调整细胞浓度到2.0×107个/ml，得到适用于血小板抗体检测的抗筛细胞。
其中，所述的血小板清洗液包括：柠檬酸钠10mmol/L，氯化钠77mmol/L，氯化钾15mmol/L，磷酸二氢钠20mmol/L，乙酸钠15mmol/L，氯化镁15mmol/L，硫酸钾5.0mmol/，牛血清白蛋白30g/L，蔗糖15g/L，海藻糖20g/L，葡萄糖20g/L，其pH为7.4；
所述的血小板载入液包括：HEPES50mmol/L，氯化钠77mmol/L，氯化钾15mmol/L，蔗糖20g/L，海藻糖20g/L，D-甘露醇15g/L，冰醋酸15mmol/L，戊二醛0.0025%，其pH为6.68；
所述的血小板保存液包括：咪唑20mmol/L，氯化钠45mmol/L，氯化锌3mmol/L，氯化钙12mmol/l，乙酸钠12mmol/L，柠檬酸钠9.4mmol/L，碳酸氢钠24mmol/L，硫酸镁5.6mmol/L，海藻糖20g/L，葡萄糖15g/L，还原型谷胱甘肽10mg/L，对氨基苯甲酸15mg/L，核黄素2mg/L，肌醇3.5mg/L，谷氨酰胺25mg/L，维生素C 5mg/L，木糖醇5g/L，牛磺酸20mg/L，硫酸新霉素120mg/L，氯霉素300mg/L，其pH为6.86。
实施例3、制备抗筛细胞
1）将已筛选确认抗原谱的3人份的O型血小板等体积混合，使用血小板清洗液清洗3遍，每次清洗后离心，每次离心后弃掉上清，保留血小板沉淀；
2）使用血小板载入液将步骤1）的血小板沉淀重悬，调整细胞浓度到2.0×1010个/ml，37℃振荡2小时；
3）振荡结束后使用血小板清洗液清洗2遍，清洗完成后使用血小板保存液重悬沉淀，调整细胞浓度到5.0×107个/ml，得到适用于血小板抗体检测的抗筛细胞。
其中，所述的血小板清洗液包括：柠檬酸钠10mmol/L，氯化钠77mmol/L，氯化钾15mmol/L，磷酸二氢钠20mmol/L，乙酸钠15mmol/L，氯化镁15mmol/L，硫酸钾5.0mmol/，牛血清白蛋白30g/L，蔗糖15g/L，海藻糖20g/L，葡萄糖20g/L，其pH为7.4；
所述的血小板载入液包括：HEPES50mmol/L，氯化钠77mmol/L，氯化钾15mmol/L，蔗糖20g/L，海藻糖20g/L，D-甘露醇15g/L，冰醋酸15mmol/L，戊二醛0.0025%，其pH为6.68；
所述的血小板保存液包括：磷酸盐缓冲液20mmol/L，氯化钠45mmol/L，氯化锌3mmol/L，氯化钙12mmol/l，乙酸钠12mmol/L，柠檬酸钠9.4mmol/L，碳酸氢钠24mmol/L，硫酸镁5.6mmol/L，海藻糖20g/L，葡萄糖15g/L，还原型谷胱甘肽10mg/L，对氨基苯甲酸15mg/L，核黄素2mg/L，肌醇3.5mg/L，谷氨酰胺25mg/L，维生素C 5mg/L，木糖醇5g/L，牛磺酸20mg/L，硫酸新霉素120mg/L，氯霉素300mg/L，其pH为6.86。
实施例4、制备抗筛细胞
1）将已筛选确认抗原谱的3人份的O型血小板等体积混合，使用血小板清洗液清洗3遍，每次清洗后离心，每次离心后弃掉上清，保留血小板沉淀；
2）使用血小板载入液将步骤1）的血小板沉淀重悬，调整细胞浓度到1.6×1010个/ml，37℃振荡2小时；
3）振荡结束后使用血小板清洗液清洗2遍，清洗完成后使用血小板保存液重悬沉淀，调整细胞浓度到3.2×107个/ml，得到适用于血小板抗体检测的抗筛细胞。
其中，所述的血小板清洗液包括：柠檬酸钠5mmol/L，氯化钠75mmol/L，氯化钾10mmol/L，磷酸二氢钠15mmol/L，乙酸钠10mmol/L，氯化镁10mmol/L，硫酸钾3mmol/，牛血清白蛋白25g/L，蔗糖10g/L，海藻糖15g/L，葡萄糖15g/L，其pH为7.2；
所述的血小板载入液包括：HEPES40mmol/L，氯化钠75mmol/L，氯化钾10mmol/L，蔗糖15g/L，海藻糖15g/L，D-甘露醇10g/L，冰醋酸10mmol/L，戊二醛0.0020%，其pH为6.5；
所述的血小板保存液包括：HEPES 20mmol/L，氯化钠40mmol/L，氯化锌1mmol/L，氯化钙8mmol/l，乙酸钠8mmol/L，柠檬酸钠8mmol/L，碳酸氢钠20mmol/L，硫酸镁3mmol/L，海藻糖15g/L，葡萄糖10g/L，还原型谷胱甘肽5mg/L，对氨基苯甲酸10mg/L，核黄素1mg/L，肌醇1mg/L，谷氨酰胺20mg/L，维生素C 3mg/L，木糖醇3g/L，牛磺酸15mg/L，硫酸新霉素115mg/L，氯霉素290mg/L，其pH为6.5。
实施例5、制备抗筛细胞
1）将已筛选确认抗原谱的3人份的O型血小板等体积混合，使用血小板清洗液清洗3遍，每次清洗后离心，每次离心后弃掉上清，保留血小板沉淀；
2）使用血小板载入液将步骤1）的血小板沉淀重悬，调整细胞浓度到1.2×1010个/ml，37℃振荡2小时；
3）振荡结束后使用血小板清洗液清洗2遍，清洗完成后使用血小板保存液重悬沉淀，调整细胞浓度到4.6×107个/ml，得到适用于血小板抗体检测的抗筛细胞。
其中，所述的血小板清洗液包括：柠檬酸钠15mmol/L，氯化钠80mmol/L，氯化钾20mmol/L，磷酸二氢钠25mmol/L，乙酸钠20mmol/L，氯化镁20mmol/L，硫酸钾8mmol/，牛血清白蛋白35g/L，蔗糖20g/L，海藻糖25g/L，葡萄糖25g/L，其pH为7.6；
所述的血小板载入液包括：HEPES60mmol/L，氯化钠80mmol/L，氯化钾20mmol/L，蔗糖25g/L，海藻糖25g/L，D-甘露醇20g/L，冰醋酸20mmol/L，戊二醛0.0030%，其pH为6.8；
所述的血小板保存液包括：HEPES 30mmol/L，氯化钠50mmol/L，氯化锌5mmol/L，氯化钙15mmol/l，乙酸钠15mmol/L，柠檬酸钠10mmol/L，碳酸氢钠30mmol/L，硫酸镁8mmol/L，海藻糖25g/L，葡萄糖20g/L，还原型谷胱甘肽15mg/L，对氨基苯甲酸20mg/L，核黄素5mg/L，肌醇5mg/L，谷氨酰胺30mg/L，维生素C 8mg/L，木糖醇8g/L，牛磺酸25mg/L，硫酸新霉素125mg/L，氯霉素310mg/L，其pH为7.0。
实施例6、血小板抗体检测
上述实施例提供的抗筛细胞能够用于血小板抗体检测。在进行血小板抗体检测时，其方法基于固相凝集法，与目前的固相凝集法所不同的是，检测板的每个U型反应孔中加入的是上述实施例所制得的抗筛细胞。具体步骤如下：
1）备好检测板，可以按照商品化的试剂盒如血小板抗体检测试剂盒（固相凝集法）（荷兰三昆试剂有限公司）的说明书准备好检测板；也可以根据《实用血小板免疫生物学》37.1描述进行自制检测板；
2）在每个U型反应孔中加入抗筛细胞50ul；
3）用平板离心机将反应板以50g离心5分钟，使血小板固定在反应孔底部；
4）倒出反应孔中的液体，并用滴管滴加洗涤工作液清洗3次，洗涤过程中轻摇微孔板然后再轻轻甩掉洗涤液，最后一次洗涤后将反应板倒置于吸水纸上吸干残余液体；
5）立即向每个反应孔中加入2滴（100μL）低离子强度溶液，并分别向相应孔中加入50μL样本、阳性对照及阴性对照；低离子强度溶液将由紫色变为天蓝或青绿色，如仍为紫色则说明可能漏加样本；
6）将反应孔用封口胶封好，轻摇混匀后置于37℃孵育30分钟；
7）取出已孵育完毕的反应板，弃去封口胶。按步骤4）洗涤反应板5-6次；
8）立即加入1滴（50μL）指示剂红细胞，轻轻振荡混匀；
9）将反应板以700g离心1分钟；
10）将检测孔与对照孔的结果进行比较，判读并记录检测结果：
阴阳性结果正常说明本发明制备的抗筛细胞可以用于实验室的血小板抗体检测。
阳性结果：指示剂红细胞平铺在反应孔底部表面；若指示剂红细胞只结合到部分孔底，并且结合的区域比阴性对照大为弱阳性。表明样本中含有血小板抗体。
阴性结果：指示剂红细胞在反应孔底部中央形成红细胞聚集。表明样本中不含血小板抗体。
结果判读图如图1所示。
低离子强度盐溶液为LISS，pH值：6.2-6.8，电导率：3.4-4.8mS/cm；洗涤工作液为PBST清洗液：30mL，10倍浓度PBST，使用时按需求进行稀释。
试验例1、抗原检测及稳定性测试
将本发明实施例1制得的抗筛细胞放置于室温和2～8℃条件下保存，每个月取样进行抗原稳定性研究，检测方法如下：
制备反应板：用PBS缓冲液（8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L）稀释鼠抗人血小板抗体（GeneTex，货号GTX60763）到10μg/mL，按每孔50μL加入酶标板中，37℃包被2h。洗板2次，每孔加入200μL封闭液（含1%BSA的PBS溶液），37℃孵育2h。然后使用洗液洗板3次，拍干。
血小板包被：使用生理盐水将实施例1制得的抗筛细胞按每孔50μL加入反应板，60g离心5min，洗液洗涤3次。
ELISA检测：向酶标板中分别加入抗血小板糖蛋白IIb/IIIa、Ia/IIa、Ib/IX和IV的单克隆抗体（Santa Cruz，货号分别为SC-7310；SC-53502；SC-166420和SC-73643）（1μg/mL，100μL/孔），同时用正常鼠血清作阴性对照，37℃孵育1h。用洗液洗涤5次，加入AP-抗鼠IgG50μL/孔，37℃孵育1h。用洗液洗涤5次，加底物对硝基苯磷酸二钠（PNPP）（50μL/孔）显色30min左右，加入3M NaOH溶液（50μL/孔）终止显色，测量A405值。
检测结果见表1和表2。
Figure 847877DEST_PATH_IMAGE001
从上述检测结果可以看出，本发明的抗筛细胞在室温保存3个月，或冷藏（2～8℃）条件下保存6个月，糖蛋白IIb/IIIa、Ia/IIa、Ib/IX和IV均没有显著变化。
对本发明其他实施例制得的抗筛细胞也进行了上述试验，其获得的结果相似。
试验例2
本试验考察了抗筛细胞制备过程中，血小板载入液和血小板保存液的组成变化对制得的抗筛细胞的影响。
1、血小板载入液
实验组：按照本发明实施例2的方法制得的抗筛细胞；
对照组1：参照实施例2，与实施例2所不同的是将血小板载入液中的戊二醛替换为无水乙醇；
对照组2：参照实施例2，与实施例2所不同的是血小板载入液中不含戊二醛；
对照组3：参照实施例2，与实施例2所不同的是血小板载入液中不含D-甘露醇。
利用不同的表面抗原对应的单克隆抗体（抗血小板糖蛋白IIb/IIIa、Ia/IIa、Ib/IX和IV），采用酶联免疫法（ELISA）测量A405值（检测方法同试验例1），记录各组血小板对应的A405，将实验组和对照组的测量值分别与新鲜机采血小板的测定值进行比较，以检测实验组与对照组血小板抗原的丢失（破坏）情况。结果见下表3所示：
Figure 502981DEST_PATH_IMAGE002
从上述试验结果可以看出，实验组与新鲜机采血小板的结果最为接近，而对照组与新鲜机采血小板的结果有差异。表明对照组抗原丢失。
2、血小板保存液
实验组：按照本发明实施例2的方法制得的抗筛细胞；
对照组4：参照实施例2，与实施例2所不同的是将血小板保存液中不含还原性谷胱甘肽；
对照组5：参照实施例2，与实施例2所不同的是血小板保存液中不含对氨基苯甲酸；
对照组6：参照实施例2，与实施例2所不同的是血小板保存液中不含谷氨酰胺。
利用不同的表面抗原对应的单克隆抗体（抗血小板糖蛋白IIb/IIIa、Ia/IIa、Ib/IX和IV），采用酶联免疫法（ELISA）测量A405值（检测方法同试验例1），记录各组血小板对应的A405，将实验组和对照组的测量值分别与新鲜机采血小板的测定值进行比较，以检测实验组与对照组血小板抗原的丢失（破坏）情况。结果见下表4所示：
Figure 648922DEST_PATH_IMAGE003
从上述试验结果可以看出，实验组与新鲜机采血小板的结果最为接近，而对照组与新鲜机采血小板的结果有差异。表明对照组抗原丢失。

Claims (10)

1.一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞，其特征在于，所述的抗筛细胞采用如下方法制备得到：
1）将已筛选确认抗原谱的3人份O型血小板等体积混合，使用血小板清洗液清洗、离心，弃掉上清，保留血小板沉淀；
2）使用血小板载入液将步骤1）的血小板沉淀重悬，调整细胞浓度到（1.0-2.0）×1010个/ml，振荡；
3）振荡后使用血小板清洗液再次清洗，清洗完成后使用血小板保存液重悬沉淀，调整细胞浓度到（2.0-5.0）×107个/ml，得到适用于血小板抗体检测的抗筛细胞。
2.一种适用于血小板抗体检测的抗筛细胞的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
1）将已筛选确认抗原谱的3人份O型血小板等体积混合，使用血小板清洗液清洗、离心，弃掉上清，保留血小板沉淀；
2）使用血小板载入液将步骤1）的血小板沉淀重悬，调整细胞浓度到（1.0-2.0）×1010个/ml，振荡；
3）振荡后使用血小板清洗液再次清洗，清洗完成后使用血小板保存液重悬沉淀，调整细胞浓度到（2.0-5.0）×107个/ml，得到适用于血小板抗体检测的抗筛细胞。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述的血小板清洗液包括：柠檬酸钠5-15mmol/L，氯化钠75-80mmol/L，氯化钾10-20mmol/L，磷酸二氢钠15-25mmol/L，乙酸钠10-20mmol/L，氯化镁10-20mmol/L，硫酸钾3-8mmol/，牛血清白蛋白25-35g/L，蔗糖10-20g/L，海藻糖15-25g/L，葡萄糖15-25g/L，其pH为7.2-7.6；
所述的血小板载入液包括：HEPES 40-60mmol/L，氯化钠75-80mmol/L，氯化钾10-20mmol/L，蔗糖15-25g/L,海藻糖15-25g/L，D-甘露醇10-20g/L，冰醋酸10-20mmol/L，戊二醛0.0020-0.0030%，其pH为6.5-6.8；
所述的血小板保存液包括：HEPES 20-30mmol/L，氯化钠40-50mmol/L，氯化锌1-5mmol/L，氯化钙8-15mmol/l，乙酸钠8-15mmol/L，柠檬酸钠8-10mmol/L，碳酸氢钠20-30mmol/L，硫酸镁3-8mmol/L，海藻糖15-25g/L，葡萄糖10-20g/L，还原型谷胱甘肽5-15mg/L,对氨基苯甲酸10-20mg/L，核黄素1-5mg/L，肌醇1-5mg/L，谷氨酰胺20-30mg/L，维生素C 3-8mg/L，木糖醇3-8g/L，牛磺酸15-25mg/L，硫酸新霉素115-125mg/L，氯霉素290-310mg/L，其pH为6.5-7.0。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
所述的血小板清洗液包括：柠檬酸钠10mmol/L，氯化钠77mmol/L，氯化钾15mmol/L磷酸二氢钠20mmol/L，乙酸钠15mmol/L，氯化镁15mmol/L，硫酸钾5.0mmol/，牛血清白蛋白30g/L，蔗糖15g/L，海藻糖20g/L，葡萄糖20g/L，其pH7.4；所述的血小板载入液包括：HEPES50mmol/L，氯化钠77mmol/L，氯化钾15mmol/L，蔗糖20g/L,海藻糖20g/L，D-甘露醇15g/L，冰醋酸15mmol/L，戊二醛0.0025%，其pH6.68；
所述的血小板保存液包括：HEPES 25mmol/L，氯化钠45mmol/L，氯化锌3mmol/L，氯化钙12mmol/l，乙酸钠12mmol/L，柠檬酸钠9.4mmol/L，碳酸氢钠24mmol/L，硫酸镁5.6mmol/L，海藻糖20g/L，葡萄糖15g/L，还原型谷胱甘肽10mg/L,对氨基苯甲酸15mg/L，核黄素2mg/L，肌醇3.5mg/L，谷氨酰胺25mg/L，维生素C 5mg/L，木糖醇5g/L，牛磺酸20mg/L，硫酸新霉素120mg/L，氯霉素300mg/L，其pH6.86。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述的血小板保存液中，所述的HEPES采用咪唑或磷酸盐缓冲液代替。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述的振荡为在35-40℃下振荡1-3小时。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的振荡为在37℃下振荡2小时。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述的清洗为清洗3遍；步骤3）中所述的清洗为清洗2遍。
9.权利要求1所述的抗筛细胞在血小板抗体检测中的应用。
10.一种采用权利要求1所述的抗筛细胞检测血小板抗体的方法，该方法为固相凝集法，其特征在于，检测板的每个U型反应孔中加入的是权利要求1所述的抗筛细胞。
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